KR20070092767A - 시노비올린 활성 조절 작용의 검출 방법 - Google Patents

시노비올린 활성 조절 작용의 검출 방법 Download PDF

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모토지 코구시
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Abstract

본 발명은, 프로릴 4 수산화 효소(proryl 4-hydroxylase)의 활성을 조절하는 작용을 평가하는 방법 및 이를 이용한 스크리닝 방법을 제공하며 섬유증 (fibrosis) 또는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)의 치료 및/또는 예방에 유 용한 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 시노비올린(synoviolin)에 의한 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛(proryl 4-hydroxylase α subunit, P4HA1)의 유비퀴틴화 활성을 조절하는 작용을 검출하기 위한 방법 및 이를 기초로 하여 시노비올린에 의한 P4HA1의 유비퀴틴화 활성을 조절하는 작용을 가지는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 이러한 스크리닝 방법으로 발견한 화합물은 프로릴 4 수산화 효소의 비정상적인 활성으로 인해 초래되는 섬유증이나 류마티스성 관절염 등의 질병을 치료 및 예방하는 데 유용할 것이다.
시노비올린

Description

시노비올린 활성 조절 작용의 검출 방법{METHOD OF DETECTING EFFECT OF CONTROLLING SYNOVIOLIN ACTIVITY}
본 발명은, 시노비올린(synobiorin) 활성을 조절하는 작용을 검출하기 위한 방법 및 섬유증(fibrosis)이나 류마티즘(rheumatism)의 치료 또는 예방에 유용한 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
시노비올린(Synoviolin)은 류마티즘 환자 유래의 활세포(synovial cell)에 존재하는 막 단백질로서 발견된 단백질이다(WO 02/052007 참조). 유전자 변이 동 물을 이용한 연구에 의하면 뼈·관절의 발생 및 관절염의 증세에 이러한 인자가 직접 관여하는 것으로 알려져 있으며, 결과적으로 시노비올린은 정상적인 뼈 형성 또 는 수족의 발달에 기여하는 활성을 가지는 단백질로 여겨지고 있다. 또한, 단백질 구조 예측 시스템에 의하여 시노비올린에 RING 핑거 모티프가 존재함을 확인하였 고, 이 모티프가 단백질의 분해에 관여하는 E3 유비퀴틴(ubiquitin) 단백질 결합효 소(ligase)상에 존재한다는 것이 알려졌다. 실제로, 시노비올린이 RING 핑거 형 E3 유비퀴틴 단백질 리가제의 특징인 자가유비퀴틴화(autoubiquitination) 활성을 가지는 것이 입증되었다(WO 02/052007 참조).
뼈·관절의 발생 및 관절염에 있어서 시노비올린의 기능 즉, 세포 내에서 시 노비올린이 어떠한 신호전달 경로와 관련되어 있는지를 밝히려면, 시노비올린과 결 합하는 인자의 탐색이 유력한 방법 중 하나이다. 특히, 시노비올린의 기질 단백질 을 동정하는 것은 시노비올린이 관여하는 세포 내 신호전달 경로를 분명히 하기 위 한 중요한 과제이다.
시노비올린과 결합하는 단백질(synoviorin-binding protein), 그 중에서도 시노비올린의 기질 단백질을 동정하는 것은 뼈·관절의 발생 및 관절염에 있어서 시노비올린의 기능을 밝히는데 유용할 뿐만 아니라 이를 이용한 새로운 관절염의 진단 및 치료법 개발에도 유용하다. 그러나, 아직까지 시노비올린의 기질이 동정 되어 있지 않기 때문에 결과적으로 시노비올린과 그 기질과의 상호작용에 영향을 주는 물질 또한 확인되지 않았다.
한편, 콜라겐은 하기와 같은 특징을 가지는 중요한 생체 구성 성분이다; 1) 결합 조직의 주성분이며; 2)삼중 나사 구조의 도메인을 1개 이상 가지는; 3)초분자 집합체를 형성; 및 4)세포외 매트릭스를 구성한다.
콜라겐의 주요한 역할 중 하나는 세포의 교통편으로써 조직의 구조를 형성하 는 기능이다. 또한 콜라겐은 세포의 이동(migration), 분화(differentiation), 증 식(proliferation) 및 대사 기능(metabolic function)에도 영향을 주고 있으며, 이 러한 콜라겐을 생합성하는 세포로 잘 알려져 있는 것이 바로 섬유아세포 (fibroblast)이다. 우선, 프리프로콜라겐(preprocollagen)이 세포 내에서 합성되 어 조면 소포체(rough-surfaced endoplasmic reticulum)에서 프로콜라겐 (procollagen)으로 전환된다. 이러한 프로콜라겐의 N 말단 및 C 말단에는 프로펩 티드(propeptide)가 결합하고 있으며, 프로펩티드는 세포로부터 분비되기 직전에 프로콜라겐 펩티다제(procollagen peptidase)에 의해 절단되어 프로콜라겐이 트로 포콜라겐(tropocollagen)으로 전환된다. 이처럼 분비된 트로포콜라겐은 콜라겐 섬 유(fiber)의 기본 성분이 되며, 분비 후의 트로포콜라겐이 서로 연결되어 콜라겐 섬유 다발(collagen fiber bundle)을 형성하게 된다.
프로릴 4 수산화 효소(Proryl 4-hydroxylase)는 콜라겐 합성에 필수적인 효 소이다. 프로릴 4 수산화 효소의 구조는 잘 알려져 있으며 구체적으로 프로릴 4 수산화 효소는, 각각 2개의 α서브유닛(subunit)과 β서브유닛(subunit)의 집합체로 구성된 4량체 구조를 가지고 있다. 특히, α서브유닛은 프롤린(proline)의 수산화 반응을 촉매하는 기능을, 그리고 β서브유닛은 이황화탄소 이성질화효소(disulfide isomerase) 활성을 가지는 것으로 생각되고 있다. 프로릴 4 수산화 효소를 구성하는 α서브유닛을 P4HA1라고 기재하였다. 프로릴 4 수산화 효소는 프로콜라겐의 아미노산 -X-Pro-Gly 서열상에 존재하는 프롤린 잔기를 히드록실화함으로써 안정된 콜라겐 삼중 나사 구조를 형성시킨다고 보고되었다(Pihlajanicmi, T., et. al., J. Hepatol., 13, S2-7, 1991).
더 나아가, 프로릴 4 수산화 효소는 히드록실화되어 있지 않은 프로콜라겐에 결합함으로써 소포체로부터 이의 분비를 막는 기능을 가지는 것으로 보고되었고 (Walmsley, A. R., et.al., J. Biol. Chem., 274, 14884-14892, 1999), 이처럼 히 드록실화되어 있지 않은 프로콜라겐은 미성숙 프로콜라겐이 된다. 따라서, 프로릴 4 수산화 효소는 생체 내에서 콜라겐의 품질관리를 담당하고 있다고 생각되어 진 다.
콜라겐(Collagen)은 생체의 중요한 구성요소인 것과 동시에 섬유증 (fibrosis)과 같은 병적인 생체 반응의 원인이기도 하다. 예를 들어, 폐, 간, 또 는 신장 등의 조직에 있어서 콜라겐의 축적은 각 장기의 섬유증의 원인이 된다. 류마티즘이나 변형성 골관절염의 관절에 있어서는 연골(cartilage)이나 활세포 (synovial cell)의 콜라겐을 포함한 세포외 매트릭스에서의 이상이 관찰되었다(KUWANA Masataka, Molecular Medicine, 38, 900-907, 2001).
따라서, 콜라겐의 생합성을 제어함으로써 이러한 질병을 치료할 수 있는 가 능성을 시시하고 있는데, 예를 들면 스트레스 단백질인 HSP47(heat shock protein 47)의 활성 저해를 통하여 콜라겐의 생합성을 조절하는 것으로 이러한 질병의 치료 가 가능하다는 일이 보고되고 있다(Kivirikko, K. I., Ann. Med., 25, 113-126, 1993). 프로릴 4 수산화 효소 및 이 효소에 의하여 생합성된 콜라겐은 섬유증 및 관절염의 진단이나 치료법의 개발에 있어서 중요한 대상이 될 것이다. 그러나, 프 로릴 4 수산화 효소의 활성 조절 기작은 아직까지 분명하지는 않다.
류마티스성 관절염(이하, RA 또는 류마티즘이라고 기재함)은 관절의 활막조직(articular synovial membrane)에 있어서의 비정상적인 증식으로 인하여 발생하는 일반적인 만성 염증성 질환이다. 활세포(synovial cell)는 관절의 활막에 1-6 개의 표피층을 형성하는 섬유아세포와 같은 세포이며, 활액(synovial fluid)에 프로 테오글리칸(proteoglycan) 및 히알론산(hyaluronic acid)을 공급한다고 알려져 있다. RA 환자의 관절에서는 활막 조직의 증식(결과적으로 다층 구조를 초래함) 및 활세포의 다른 조직으로의 침윤(invasion)과 같은 증상이 관찰되었다. 또한, RA 환자의 혈청에서는 자신의 IgG의 Fc영역에 대한 자가항체가 존재하였다. 결과적으로, 류마티즘은 자가면역 질환의 하나로서 생각되고 있으며, 그 병인에 대해서는 아직까지 확인되지 않고 있다.
본 발명은 프로릴 4 수산화 효소(proryl 4-hydroxylase)의 활성 조절 메카니 즘을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로릴 4 수산화 효소의 활성을 조절하는 작용을 평가하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 평가방법을 이용하여 해당 작용을 가지는 화합물을 스 크리닝하는 방법을 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 류마티스성 관절염이나 섬유증의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 시노비올린(synoviorin)과 결합하는 단백질을 동정하기 위하 여 효모 투 하이브리드법(yeast two-hybrid method)을 이용하였고, 구체적으로 시 노비올린을 미끼(bait)로서 이용해 사람 연골 유래의 cDNA 라이브러리를 효모 투 하이브리드 시스템(MATCHMAKER Two Hybrid System, Clontech사)에 의해 스크리닝하 였다. 그 결과, 프로릴 4 수산화 효소α 서브유닛(Prolyl 4-Hydroxylase α subunit, P4HA1)을 얻었으며, 이어 GST 풀다운 분석에 의하여 P4HA1와 시노비올린 과의 결합을 확인하였다.
더 나아가, 본 발명자들은 P4HA1이 시노비올린(synoviorin)의 유비퀴틴리가제(ubiquitin ligase) 활성에 의하여 유비퀴틴화됨을 확인하였다. 즉, P4HA1은 시 노비올린 유비퀴틴리가제(E3)의 기질 폴리펩티드인 것이 확인되었다. 시노비올린은 P4HA1의 유비퀴틴화를 통한 프로테아솜(proteasome)에 의해 P4HA1의 분해를 유도한다. 또한, 프로릴 4 수산화 효소는 콜라겐 합성에 있어서의 중요한 효소 중 하나이다. 따라서, 시노비올린은 프로릴 4 수산화 효소 활성을 제어함으로써 개체 의 발달이나 뼈·관절의 발생 및 관절염의 발병에 관여할 가능성이 있다고 생각되 었다.
이를 근거로 하여, 본 발명자들은 시노비올린과 P4HA1의 상호작용을 평가하 기 위한 방법을 확립하였고, 이러한 방법을 이용하여 해당 작용을 가지는 물질의 스크리닝이 가능한 것을 찾아내어 본 발명을 완성하였다.
특히, 본 발명은 시노비올린의 유비퀴틴화 작용에 있어서 시험 화합물의 조 절 활성을 검출하는 하기의 기재된 방법과 관련되어 있다. 또한, 상기 방법을 이 용한 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 가지는 화합물의 스크리닝 방법과도 관련되어 있다.
본 발명은 하기의 [1] 내지 [53]를 제공한다:
[1] 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 시험 화합물을 이용한 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 방법:
(a) 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질을 시험 화합물의 존재하에서 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계;
(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질을 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후 기질의 유비 퀴틴화 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 기질의 유비퀴틴화 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 유비퀴틴화 레벨과 다를 때, 시험 화합물의 시노비올린에 의한 기질의 유비퀴틴화 작용을 조절 하는 활성을 검출하는 단계(이때, 상기 기질은 프롤린 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
[2] 상기 [1]의 방법에 있어서, 하기 성분의 공존에 의하여 제공된 기질의 유비퀴 틴화가 가능한 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(i) 유비퀴틴 활성화 효소;
(ii) 유비퀴틴 전이효소;
(iii) 유비퀴틴; 및
(iv) 아데노신 3 인산.
[3] 상기 [1]의 방법에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질을 발현하는 세포 내에서 유비퀴틴화에 의해 제공된 기질의 유비퀴틴화를 가능케 하는 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
[4] 상기 [1]의 방법에 있어서, 기질의 유비퀴틴화 레벨을 하기의 (A) 내지 (C) 레벨을 지표로서 측정하는 것을 포함하는 방법:
(A) 유비퀴틴화된 기질의 레벨;
*(B) 유비퀴틴화되지 않았던 기질의 레벨; 및
(C) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛의 생물학적 활성의 레벨.
[5] 상기 [1]의 방법에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화 될 수 있는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드; 및
(e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아 미노산 서열을 가지며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드.
[6] 상기 [1]의 방법에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 2에 기재 된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩 티드;
(D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드; 및
(E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아 미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티 드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드.
[7] 하기의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는, 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 가지는 시험 화합물의 스크리닝 방법:
(a) [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 방법에 따라 시험 화합물의 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 단계; 및
(b) 대조군과 비교하여 기질의 유비퀴틴화 레벨에 차이가 있는 시험 화합물 을 선택하는 단계.
[8] 상기 [7]의 방법에 의하여 얻을 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 시노비올린에 의한 기질의 유비퀴틴화 조절제.
[9] 하기의 (1) 및 (2) 성분을 포함하는, 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하 는 활성을 검출하는 키트:
(1) 시노비올린 또는 그의 유사체; 및
(2) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체.
[10] 상기 [9]의 키트에 있어서, 하기의 (3) 내지 (6) 성분을 추가적으로 포함하는 키트:
(3) 유비퀴틴 활성화 효소;
(4) 유비퀴틴 전이효소;
(5) 유비퀴틴; 및
(6) 아데노신 3 인산.
[11] 시노비올린 또는 그의 유사체 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체를 발현하는 세포; 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체의 유비퀴틴화 레벨을 측정하는 방법을 포함하는 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하기 위한 키트.
[12] 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 시험 화합물을 이용한 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 방법:
(a) 시험 화합물의 존재하에서 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계;
(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후 시노비올린과 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배 양한 후 시험 화합물을 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후, 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 결합 레벨과 다를 때, 시험 화합물의 시노비올린에 의한 기질의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성이 검출되는 단계(이때, 상기 기질은 프롤린 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
[13] 상기 [12]의 방법에 있어서, 시노비올린 및 기질 중 어느 하나가 고체상 (solid phase)에 결합하는, 또는 고체상에 결합 가능한 표지를 포함하는 것을 특징 으로 하는 방법.
[14] 상기 [12]의 방법에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴 리펩티드이며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드; 및
*(e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 포함하며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드.
[15] 상기 [12]의 방법에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드;
(D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드; 및
(E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 포함하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 와 결합하는 폴리펩티드.
[16] 하기의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는, 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절 하는 활성을 가지는 시험 화합물의 스크리닝 방법:
(a) [12] 내지 [15] 중 어느 하나의 방법에 따라, 시험 화합물을 이용한 시 노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 단계; 및
(b) 대조군과 비교하여 시노비올린과 기질의 결합 레벨에 차이가 있는 시험 화합물을 선택하는 단계.
[17] 상기 [16]의 방법에 의하여 얻을 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 시노비올린에 의한 기질의 유비퀴틴화 조절제.
또한, 본 발명자들은 섬유증의 치료 또는 예방에 유용한 화합물의 스크리닝 이 가능한 것을 찾아내어 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 하기에 기재된 스 크리닝 방법, 상기 방법을 이용한 키트 및 상기 방법에 따라 얻을 수 있는 화합물 을 유효 성분으로 포함하는, 섬유증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물에 관 한 것이다.
[18] 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 화 합물의 스크리닝 방법:
(a) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을 시험 화합물의 존재하에서 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계;
(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나를 시험 화합물과 접촉한 후 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후 기질의 유비 퀴틴화 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 기질의 유비퀴틴화 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 유비퀴틴화 레벨보다 낮은 시험 화합물을 섬유증 치료 또는 예방하기 위한 화합물로서 선택하는 단계(이때, 상기 기질은 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
[19] 상기 [18]의 방법에 있어서, 하기 성분의 공존에 의하여 제공된 기질의 유비 퀴틴화가 가능한 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(i) 유비퀴틴 활성화 효소;
(ii) 유비퀴틴 전이효소;
(iii) 유비퀴틴; 및
(iv) 아데노신 3 인산.
[20] 상기 [18]의 방법에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질을 발현하는 세포 내에서 유비퀴틴화에 의해 제공된 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
[21] 상기 [18]의 방법에 있어서, 기질의 유비퀴틴화 레벨을 하기의 (A) 내지 (C) 레벨을 지표로서 측정하는 방법:
(A) 유비퀴틴화된 기질의 레벨;
(B) 유비퀴틴화되지 않았던 기질의 레벨; 및
(C) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛의 생물학적 활성의 레벨.
[22] 상기 [18]의 방법에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유 사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드; 및
(e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드.
[23] 상기 [18]의 방법에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 적어도 하나의 아미노 산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기 재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리 펩티드;
(D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드; 및
(E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드.
[24] [18] 내지 [23] 중 어느 하나의 방법에 따라 선택할 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 섬유증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
[25] 하기의 (1) 및 (2) 성분을 포함하는, 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 화 합물의 스크리닝을 위한 키트:
*(1) 시노비올린 또는 그의 유사체; 및
(2) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체.
[26] 상기 [25]의 키트에 있어서, 하기의 (3) 내지 (6) 성분을 추가적으로 포함하는 키트:
(3) 유비퀴틴 활성화 효소;
(4) 유비퀴틴 전이효소;
(5) 유비퀴틴; 및
*(6) 아데노신 3 인산.
[27] 시노비올린 또는 그의 유사체 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체를 발현하는 세포; 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체의 유비퀴틴화 레벨을 측정하기 위한 방법을 포함하는 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 시험 화합물의 스크리닝을 위한 키트.
[28] 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 화 합물의 스크리닝 방법:
(a) 시험 화합물의 존재하에서 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계;
(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후 시노비올린과 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물을 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 결합 레벨보다 낮은 시험 화합물을 섬유증 치료 또는 예방하기 위한 화합물로서 선택하는 단계(이때, 상기 기질은 프롤린 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
[29] 상기 [28]의 방법에 있어서, 시노비올린 및 기질 중 하나가 고체상(solid phase)에 결합하거나 또는 고체상에 결합 가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
[30] 상기 [28]의 방법에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소α서브유닛 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
*(c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴 리펩티드이며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드; 및
(e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드.
[31] 상기 [28]의 방법에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드;
(D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드; 및
(E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드.
[32] [28] 내지 [31] 중 어느 하나의 방법에 따라 선택할 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 섬유증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
또한, 본 발명자들은 류마티스성 관절염의 치료 또는 예방에 유용한 화합물 의 스크리닝이 가능한 것을 찾아내어 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 하기 에 기재된 스크리닝 방법, 상기 방법을 이용한 키트 및 상기 방법에 따라 얻을 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는 만성 류마티스성 관절염의 치료 및/또는 예 방을 위한 의약 조성물에 관한 것이다.
[33] 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방 하기 위한 화합물의 스크리닝 방법:
(a) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을 시험 화합물의 존재하에서 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계;
(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후 기질의 유비 퀴틴화 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 기질의 유비퀴틴화 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 유비퀴틴화 레벨보다 낮은 시험 화합물을 류마티스성 관절염 치료 또는 예방하기 위한 화합물로서 선택하는 단계(이때, 상기 기질은 프롤린 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
[34] 상기 [33]의 방법에 있어서, 하기 성분의 공존에 의하여 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(i) 유비퀴틴 활성화 효소;
(ii) 유비퀴틴 전이효소;
(iii) 유비퀴틴; 및
(iv) 아데노신 3 인산.
[35] 상기 [33]의 방법에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질을 발현하는 세포 내에서 유비퀴틴화에 의해 제공된 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
[36] 상기 [33]의 방법에 있어서, 기질의 유비퀴틴화 레벨을 하기의 (A) 내지 (C) 중 어느 하나의 레벨을 지표로서 측정하는 방법:
(A) 유비퀴틴화된 기질의 레벨;
(B) 유비퀴틴화되지 않았던 기질의 레벨; 및
(C) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛의 생물학적 활성의 레벨.
[37] 상기 [33]의 방법에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드; 및
(e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드.
[38] 상기 [33]의 방법에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티 드;
(D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드; 및
(E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드.
[39] [33] 내지 [38] 중 어느 하나의 방법에 따라 선택할 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 류마티스성 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
[40] 하기의 (1) 및 (2) 성분을 포함하는, 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방 하기 위한 화합물의 스크리닝을 위한 키트:
(1) 시노비올린 또는 그의 유사체; 및
(2) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체.
[41] 상기 [39]의 키트에 있어서, 하기의 (3) 내지 (6) 성분을 추가적으로 포함하 는 키트:
(3) 유비퀴틴 활성화 효소;
(4) 유비퀴틴 전이효소;
(5) 유비퀴틴; 및
(6) 아데노신 3 인산.
[43] 시노비올린 또는 그의 유사체 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체를 발현하는 세포; 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체의 유비퀴틴화 레벨을 측정하는 방법을 포함하는, 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 시험 화합물의 스크리닝을 위한 키트.
[43] 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방 하기 위한 화합물의 스크리닝 방법:
(a) 시험 화합물의 존재하에서 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계;
(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후 시노비올린과 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물을 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질의 결합 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질의 결합 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 결합 레벨보다 낮은 시험 화합물을 류마티스성 관절염 치료 또는 예방하기 위한 화합물로서 선택하는 단계(이때, 상기 기질은 프롤린 4 수산화 효소 α 서브유닛 또는 그의 유사체이다).
[44] 상기 [43]의 방법에 있어서, 시노비올린 또는 기질 중 어느 하나가 고체상에 결합하거나 또는 고체상에 결합 가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
[45] 상기 [43]의 방법에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해, 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드; 및
(e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드.
[46] 상기 [43]의 방법에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드;
(D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드; 및
(E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드.
[47] [43] 내지 [46] 중 어느 하나의 방법에 따라 선택할 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 류마티스성 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 방법을 이용하여 시험 화합물의 스크리닝을 실시하여, 서열번호 5를 포함하는 폴리펩티드를 동정하였다. 즉, 본 발명은 하기 에 기재된 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴 리펩티드를 유효 성분으로 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
[48] 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
[49] 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩 티드가 상기 [1]의 방법에서 시험 화합물로 사용되었을 때, 기질의 유비퀴틴화 레 벨이 폴리펩티드 부재하에서 측정된 유비퀴틴화 결합 레벨보다 낮은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
[50] 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 폴리 펩티드가 상기 [12]의 방법에서 시험 화합물로서 이용되었을 때, 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질의 결합 레벨이 폴리펩티드 부재하에서 측정된 결합 레벨보다 낮은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
[51] [48] 내지 [50] 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
[52] [48] 내지 [50] 중 어느 하나의 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는, 섬유증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
[53] [48] 내지 [50] 중 어느 하나의 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는, 류마티스성 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
본 발명은 프로릴 4 수산화 효소의 활성이 시노비올린에 의한 프로릴 수산화 효소 α서브유닛의 유비퀴틴화에 의해 제어되는 신규한 발견을 기반으로 한다. 즉, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 시험 화합물을 이용한 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을 시험 화합물의 존재하에서 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계;
(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 어느 하나의 단계 후 기질의 유비퀴 틴화 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 기질의 유비퀴틴화 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 유비퀴틴화 레벨과 다를 때, 시험 화합물의 시노비올린에 의한 기질의 유비퀴틴화 작용을 조절 하는 활성이 검출되는 단계(이때, 상기 기질은 프롤린 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
유비퀴틴화(Ubiquitination)란 적어도 1개의 유비퀴틴이 결합하는 것을 의미한다. 또한, 유비퀴틴화 레벨(Ubiquitination level)이란 결합한 유비퀴틴의 수 또는 유비퀴틴이 결합한 장소의 수, 또는 양쪽 모두를 의미한다. 즉, 어떤 폴리펩티드의 특정한 부분에 결합한 유비퀴틴의 수를 측정함으로써 유비퀴틴화 레벨을 평가할 수 있다. 더 나아가, 어떤 폴리펩티드의 여러 부위가 유비퀴틴화되는 경우에는 유비퀴틴화된 부위의 수를 측정하여 유비퀴틴화 레벨을 평가할 수도 있다.
유비퀴틴화 레벨을 측정하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들면, 유비퀴틴에 결합하는 친화성 물질을 이용하여 유비퀴틴화 레벨을 측정할 수 있으며 이러한 친화성 물질로는 항-유비퀴틴 항체(anti-ubiquitin)를 이용할 수가 있다. 특히, 유비퀴틴을 특이적으로 인식해 결합하는 단일 클론 항체가 시판되고 있다. 유비퀴틴 에 대한 친화성 물질을 표지해 두면 기질에 결합한 표지 물질의 레벨에 따라 유비퀴틴화 레벨을 분명히 할 수 있다. 또한, 미리 표지한 유비퀴틴을 제공함으로써 기질 폴리펩티드에 결합한 유비퀴틴의 양을 표지 물질의 레벨에 따라 측정할 수도 있다.
항체나 유비퀴틴의 표지로는 일반적으로 이용되는 표지 기술이 사용되었다. 구체적으로, 방사활성물질, 효소활성물질, 형광활성물질 및 발광물질 등이 표지로서 이용될 수 있다. 또한, 표지 물질을 간접적으로 항체나 유비퀴틴에 결합시키기 위해서 결합성 태그(binding tag)를 이용할 수도 있다. 예를 들면, 비오틴화한 항체나 유비퀴틴에는 아비딘화한 표지 물질을 결합할 수가 있다. 더 나아가, 결합성 태그를 도입한 유비퀴틴을 이용하여 유비퀴틴화된 기질을 포착할 수도 있다. 이렇게 포착된 기질 폴리펩티드의 레벨을 측정함으로써 유비퀴틴화 레벨을 평가할 수 있으며, 그 방법으로는 기질 폴리펩티드에 대한 표지 항체를 이용하여 유비퀴틴화 레벨이 측정된다. 또한, 유비퀴틴화 레벨의 측정을 위하여 하기와 같은 표지 유비퀴틴이 시판되고 있다.
(1) 형광결합 유비퀴틴(Fluorescein-binding ubiquitin)：형광 물질인 fluorescein를 결합한 유비퀴틴으로 형광도(fluorescence intensity)를 지표로하여 유비퀴틴화 레벨을 측정할 수가 있다.
(2) 비오틴화 유비퀴틴(Biotinylated ubiquitin)：결합성 리간드인 비오틴으로 표지된 유비퀴틴으로써 비오틴화 유비퀴틴으로 유비퀴틴화 된 기질 폴리펩티드는 아비딘 컬럼에 의해 포착될 수 있다. 또는, 아비딘화 된 효소나 형광물질 등을 이용하여 유비퀴틴화 레벨을 측정할 수도 있다.
(3) (His) 6-유비퀴틴：히스티딘 태그로 표지한 유비퀴틴으로 히스티딘 태그는 니켈 컬럼에 의해 포착될 수 있다. 즉, 유비퀴틴화 된 기질을 유비퀴틴을 통한 컬럼으로 포착될 수 있다. 또는, 항히스티딘 태그 항체를 이용하여 간접적으로 표지할 수도 있다.
유비퀴틴화 레벨을 측정할 경우에는 기질(substrate)을 고체상화(solid-phase)하는 것이 유리하다. 예를 들면, 미리 기질을 고체상에 결합하게 할 수 있다. 구체적으로, 비드(beas)나 반응 용기의 내벽에 화학적으로 기질을 공유결합 시키거나 물리적으로 흡착시킬 수 있다. 이러한 비드나 반응 용기로는 폴리스티렌 등을 이용할 수 있으며 기질의 화학적인 결합을 위해서 아미노기나 카르복실기 등의 기능기를 도입한 폴리스티렌 유도체가 널리 알려져 있다.
또한, 상기의 결합 친화성 물질로 표지한 유비퀴틴을 이용하여 유비퀴틴화된 기질은 유비퀴틴을 이용하여 간접적으로 포착될 수도 있다. 이와 달리, 기질에 대한 항체나, 결합 친화성 물질을 도입한 기질은 고체상에 포착될 수도 있다. 어쨌든, 고체상화된 기질은 고체상에 비결합한 성분과 분리되어 유비퀴틴화 레벨이 측정된다. 유비퀴틴이나 기질 자체가 표지되지 않은 경우에는 유비퀴틴이나 기질에 대한 친화성 물질을 이용하여 표지 물질을 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 유비퀴틴에 대한 항체의 이용이다. 최종적으로, 고체상에 포착된 표지(또는 결합되지 않은 표지)의 레벨을 측정하여 유비퀴틴화 레벨을 결정할 수가 있다. 이러한 유비퀴틴화 레벨의 측정결과를 통해 유비퀴틴화된 기질의 양을 분명히 할 수가 있다. 또 는, 유비퀴틴화 레벨의 측정에 의하여 유비퀴틴화되지 않은 기질의 양을 분명히 할 수도 있다.
더 나아가, P4HA1의 유비퀴틴화에 의해 프로릴 4 수산화 효소(proryl 4-hydroxylase)의 생물학적 활성이 제어되고 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 프로릴 4 수산화 효소의 생물학적 활성의 레벨을 지표로서 유비퀴틴화 레벨을 측정할 수 있다. 프로릴 4 수산화 효소의 생물학적 활성의 레벨은 예를 들면, 트리튬 방출 에세이(Tritium release assay; Methods Enzymol., 82, 246-259, 1982) 등의 방법에 의하여 측정될 수 있다.
시노비올린(또는 그의 유사체), 기질 및 시험물질을 접촉시키는 순서는 임의적으로 가능하다. 즉, 본 발명은 하기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 임의의 순서로 시노비올린(또는 그의 유사체), 기질 및 시험물질을 접촉시키는 단계를 포함한다. 시험물질의 존재하에서 상기 세 가지 성분을 배양하는 경우(a), 시노비올린(또는 그의 유사체)의 유비퀴틴화 반응에 의한 시험물질의 작용을 평가할 수 있다. 또한, 시노 비오린(또는 그의 유사체) 및 기질 중 어느 하나가 사험물질과 접촉한 후, 유비퀴틴화가 가능한 조건을 제공해 줄 수도 있다(a'). 이 경우에는, 시노비올린에 의한 유비퀴틴 리가제의 활성 또는 기질의 유비퀴틴화되는 기능 중 어느 하나에 시험물질의 작용이 평가된다. 더 나아가, 유비퀴틴화가 가능한 조건을 제공한 후, 시험물질을 접촉시킴으로써(a'') 유비퀴틴화된 기질에 대한 시험물질의 작용을 평가할 수도 있다.
본 발명에서는 P4HA1 또는 그의 유사체가 기질로서 이용된다. P4HA1는 4량 체 구조의 프로릴 4 수산화 효소를 구성하는 서브유닛(subunit)의 하나이다. α서브유닛은 프롤린(proline)의 수산화 반응을 촉매하는 기능을 가지는 것으로 고려되어지고 있다. 한편, 그의 유사체는 P4HA1와 구조적인 유사성을 가지며 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드이다. 예를 들면, 본 발명에 있어서 P4HA1 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함한다:
(a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 2에 기재의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
*(c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드; 및
(e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드.
서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서 변 이를 포함한 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 당업자에 의해 공지된 방 법으로 분리할 수 있다(Jikken Igaku; 실험 의학 별책·유전자 공학 핸드북, p246- 251, Yodosha 사, 1991). 예를 들면, 상동성을 가진 유전자를 포함한 라이브러리를 대상으로 서열번호 1을 포함하는 염기 서열(또는 그 단편)을 프로브로서 스크리닝하면, 상동성이 높은 염기 서열을 가진 DNA를 클로닝 할 수 있다. 이러한 라이브러리로는 서열번호 1의 염기 서열에 있어서 무작위로 첨가된 변이를 가진 유전자 라이브러리 및 사람 이외의 종으로부터 유래하는 cDNA 라이브러리 등을 들 수 있다.
주어진 염기 서열에 있어서 무작위로 변이를 첨가하는 방법으로는 예를 들면, 아초산(nitrous acid)을 DNA에 처리하는 염기쌍 치환이 알려져 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79, 7258-7260, 1982). 이 방법은 변이를 도입하고 싶은 단편(segment)을 아초산으로 처리함으로써 특정 단편 내에서 무작위로 염기쌍의 치환을 도입할 수가 있다. 또한, 목적으로 하는 변이를 임의의 장소에 도입하는 기술로는 gapped duplex 법 등이 있다(Methods Enzymol., 154, 350-367, 1987). 변이를 도입해야 할 유전자를 클로닝 한 환형 이중 가닥의 벡터를 단일 가닥으로 전환하여 목적으로 하는 부위에 변이를 포함하는 합성 올리고 뉴클레오티드를 하이브리다이즈 시킨다. 이어, 제한 효소에 의해 절단된 선상화 시킨 벡터로부터 유래된 상보적인 단일 가닥의 DNA를 상기의 환형 단일가닥의 벡터에 annealing시키고,상기 벡터와 합성 뉴클레오티드와의 간격(gap)을 DNA 폴리머라제를 이용하여 연결함으로써 완전한 이중가닥의 환형 벡터를 얻는다.
변형되는 아미노산의 수는 전형적으로 50개의 아미노산 이내이며, 바람직하 게는 30개의 아미노산 이내이며, 보다 더 바람직하게는 5개의 아미노산 이내(예를 들면, 1개의 아미노산) 또는 몇 개의 아미노산이다. 아미노산을 인위적으로 치환하는 경우, 유사한 성질을 아미노산에 치환하면 본래의 단백질 활성이 유지되기 쉽다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 단백질은 상기 아미노산 치환에 첨가된 보존적 치환을 포함하는 폴리펩티드 및 P4HA1(서열번호 2)와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 포함한다. 보존적 치환은 단백질의 활성에 중요한 도메인의 아미노산을 치환하는 경우 등에 있어서 중요하다고 생각된다. 이러한 아미노산의 보존적 치환은 당업자에게 잘 알려져 있다.
보존적 치환에 적합한 아미노산 그룹으로는 예를 들면, 알칼리성 아미노산(예를 들면, 리진, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 아미노산(예를 들면, 아스파라긴산 및 글루타민산), 비가전극성 아미노산(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 스레오닌, 타이로신 및 시스테인), 비극성 아미노산(예를 들면, 알라닌, 바린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 페닐 알라닌, 메티오닌 및 트립토판), β-분기 아미노산(예를 들면, 스레오닌, 바린 및 이소로이신) 및 방향족 아미노산(예를 들면, 타이로신, 페닐 알라닌, 트리프트판 및 히스티딘) 등을 들 수 있다.
또한, 비보존적 치환에 의하여 단백질의 활성 등을 보다 상승(예를 들면, 항상적 활성화 단백질 등) 또는 하강(예를 들면, dominant negative 등)시키는 일도 생각할 수 있다.
서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해, 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드는 인위적으 로 합성된 또는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드를 포함한다. 여기서「복수의 아미노산」이란, 전형적으로 50개의 아미노산 이내이며, 바람직하게는 30개의 아미노산 이내이며, 보다 더 바람직하게는 5개의 아미노산 이내(예를 들면, 1개의 아미노 산)이며, 몇 개의 아미노산이다. 일반적으로, 진핵생물의 유전자는 인터페론 유전자 등으로 알려져 있듯이 다형성(polymorphism)을 가진다. 이러한 다형성으로 인해 발생하는 염기 서열의 변화에 의하여, 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가되는 경우가 있다. 이와 같이 자연적으로 발생한 폴리펩티드이며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 적어도 하나의 아미노산이 치 환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드는 본 발명에 이용될 수 있다.
또한, 다형성에 의해 염기 서열에는 변화가 있어도 아미노산 서열에는 변화가 없는 경우도 있다. 이러한 염기 서열의 변이는 침묵 변이(silent mutation)로 불린다. 침묵 변이를 가지는 염기 서열로부터 구성되는 유전자도 본 발명에 이용 될 수 있다. 또한, 여기서 말하는 다형성(polymorphism)이란, 집단 내에서 어떤 유전자가 개체간에 다른 염기 서열을 가지는 것을 말한다. 다형성은 발견되어지는 서로 다른 유전자간의 비율과는 무관하다.
덧붙여, P4HA1 또는 그의 유사체 단백질을 얻는 방법으로 하이브리다이제이션을 이용하는 방법을 들 수 있다. 즉, 서열번호 1에 기재된 P4HA1를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 단편을 프로브로 이용하여 하이브리다이즈 할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 분리하는 것이다. 하이브리다이제이션을 엄격한 조건하에서 실시하면, 염기 서열로는 상동성이 높은 폴리뉴클레오티드가 선택되어 결과적으로 분리된 단백질에는 P4HA1 또는 그의 유사체인 단백질이 포함될 가능성이 높아지게 된다. 상동성이 높은 염기 서열이란 예를 들어, 70% 이상, 바람직하지는 90% 이상의 동일성을 나타내는 것이다.
또한, 엄격한 조건이란, 구체적으로 예를 들면 6×SSC, 40% 포름아미드, 25℃에서의 하이브리다이제이션 및 1×SSC를 이용하여 55℃에서 세정하는 조건을 포함한다. 엄격도(stringency)는 소금 농도, 포름아미드의 농도 및 온도의 조건에 의존적이지만, 당업자이면 이러한 조건을 근간으로 필요로하는 엄격도를 얻을 수 있도록 설정하는 것이 당연하다.
하이브리다이제이션을 이용하여 예를 들면, 사람 이외의 동물 종에서의 P4HA1의 유사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 분리하는 것은 가능하다. 사람 이외의 동물 종 즉, 마우스, 래트, 토끼, 돼지 또는 염소 등의 동물 종으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드에 코딩되는 P4HA1의 유사체는 본 발명에 있어서 기능적으로 동등한 단백질을 구성한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 어떠한 종도 가능하다. 즉, cDNA, 게놈 DNA 또는 합성에 의해 얻을 수도 있다. 또한, 본 발명의 단백질을 코딩할 수 있는 한, 유전 암호의 퇴화성에 근거해 임의의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드가 포 함된다.
사람 P4HA1(서열번호 2)에 변이를 도입하여 얻은 단백질이나, 상기와 같은 하이브리다이제이션 기술 등을 이용해 분리한 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백 질은 통상, 사람 P4HA1(서열번호 2)와 아미노산 서열과 높은 상동성을 가진다. 높은 상동성이란, 적어도 30% 이상, 바람직하지는 50% 이상, 보다 더 바람직하지는 80% 이상(예를 들면, 95% 이상)의 서열상의 동일성을 의미한다. 염기 서열이나 아 미노산 서열의 상동성은 인터넷을 이용한 homology 검색 사이트를 이용해 확인할 수 있다[예를 들면, 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)에서의 FASTA, BLAST, PSI-BLAST 및 SSEARCH 등의 상동성 검색을 이용할 수 있다{예를 들면, 일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ)의 웹 사이트의 상동성 검색(Search and Analysis)의 페이지; http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html}. 또한, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BLAST를 이용해 확인할 수 있다(예를 들면, NCBI의 홈 페이지의 웹 사이트의 BLAST의 페이지; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-10, 1990; Altschul, S. F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 266, 460-480, 1996; 및 Altschul, S. F. et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997)].
본 발명에서는 시노비올린 또는 그의 유사체가 유비퀴틴리가제(E3)로서 이용된다. 시노비올린은 RING 핑거 모티프를 가지는 폴리펩티드이며, 그 아미노산 서열(서열번호 4) 및 해당 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열(서열번호 3)은 이미 확인되었다. 한편, 그의 유사체란, 시노비올린과 구조적인 유사성을 가지며, P4HA1를 유비퀴틴화할 수 있는 폴리펩티드이다. 본 발명에 있어서 시노비올린 또 는 그의 유사체는 예를 들면, 하기의 (A) 내지 (E)에 기재된 폴리펩티드를 이용할 수 있다:
(A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 있어서 적어도 하나의 아미노산 이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재 된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩 티드;
(D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드; 및
(E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아 미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티 드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드.
기존의 아미노산 서열 정보 및 염기 서열 정보에 따라 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 얻기 위한 방법은 상기에서 언급하였다. 또한, 유사체에 있어서의 바람직하며 구조적인 조건도 상기에서 언급하였다. 이와 같이 얻을 수 있는 유사체는 시노비올린과 같이 본 발명에서 이용될 수 있다. 예를 들면, WO 02/052007에는 각종의 시노비올린 유사체가 개시되어 있으며, 이러한 유사체가 P4HA1를 유비퀴틴화하는 작용을 가지는 한, 본 발명의 방법으로 이용될 수 있다.
서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 있어서 적어도 하나의 아미노산이 치 환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아 미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드는 인위적으로 합성된 또는 자연적으로 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 여기서「복수의 아미노 산」이란, 전형적으로는 50개의 아미노산 이내이며, 바람직하게는 30개의 아미노산 이내이며, 보다 더 바람직하게는 5개의 아미노산 이내(예를 들면, 1개의 아미노산) 이며, 몇 개의 아미노산이다. 일반적으로, 진핵생물의 유전자는 인터페론 유전자 등으로 알려져 있기 때문에 다형성(polymorphism)을 포함한다. 이러한 다형성에 의해 생긴 염기 서열의 변화에 있어서 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽 입 및/또는 첨가되는 경우가 있다. 이와 같이 자연적으로 존재하는 단백질이며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 있어서 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결 여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 본 발명에서 이용될 수 있 다.
또한, 다형성에 의해 염기 서열에는 변화가 있어도 아미노산 서열에는 변화가 없는 경우도 있다. 이러한 염기 서열의 변이는 침묵 변이(silent mutation)로 불린다. 침묵 변이를 가지는 염기 서열로부터 구성되는 유전자도 본 발명에 이용 될 수 있다. 또한, 여기서 말하는 다형성(polymorphism)이란, 집단 내에서 어떤 유전자가 개체간에 다른 염기 서열을 가지는 것을 말한다. 다형성은 발견 되어지는 서로 다른 유전자간의 비율과는 무관하다.
덧붙여, P4HA1 또는 그의 유사체 단백질을 얻는 방법으로 하이브리다이제이션을 이용하는 방법을 들 수 있다. 즉, 서열번호 3에 기재된 시노비올린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 단편을 프로브로 이용하여 하이브리다이즈 할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 분리하는 것이다. 하이브리다이제이션을 엄격한 조건하에서 실시하면, 염기 서열로는 상동성이 높은 폴리뉴클레오티드가 선택되어 결과적으로 분리된 단백질에는 시노비올린 또는 그의 유사체인 단백질이 포함될 가능성이 높아지게 된다. 상동성이 높은 염기 서열이란 예를 들어, 70% 이상, 바람직하지는 90% 이상의 동일성을 나타내는 것이다.
또한, 엄격한 조건이란, 구체적으로 예를 들면 6×SSC, 40% 포름아미드, 25℃에서의 하이브리다이제이션 및 1×SSC를 이용하영 55℃에서 세정하는 조건을 포함한다. 엄격도(stringency)는 소금 농도, 포름아미드의 농도 및 온도의 조건에 의존적이지만, 당업자이면 이러한 조건을 근간으로 필요로하는 엄격도를 얻을 수 있도록 설정하는 것이 당연하다.
하이브리다이제이션을 이용하여 예를 들면, 사람 이외의 동물 종에서의 P4HA1의 유사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 분리하는 것은 가능하다. 사람 이외의 동물 종 즉, 마우스, 래트, 토끼, 돼지 또는 염소 등의 동물 종으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드에 코딩되는 P4HA1의 유사체는 본 발명에 있어서 기능적으로 동등한 단백질을 구성한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 어떠한 종도 가능하다. 즉, cDNA, 게놈 DNA 또는 합성에 의해 얻을 수도 있다. 또한, 본 발명의 단백질을 코딩할 수 있는 한, 유전 암호의 퇴화성에 근거해 임의의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드가 포 함된다.　
사람 P4HA1(서열번호 4)에 변이를 도입하여 얻은 단백질이나, 상기와 같은 하이브리다이제이션 기술 등을 이용해 분리한 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질은 통상, 사람 P4HA1(서열번호 4)와 아미노산 서열과 높은 상동성을 가진다. 높은 상동성이란, 적어도 30% 이상, 바람직하지는 50% 이상, 보다 더 바람직하지는 80% 이상(예를 들면, 95% 이상)의 서열상의 동일성을 의미한다. 염기 서열이나 아 미노산 서열의 상동성은 인터넷을 이용한 homology 검색 사이트를 이용해 확인할 수 있다[예를 들면, 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)의 FASTA, BLAST, PSI-BLAST 및 SSEARCH 등의 상동성 검색을 이용할 수 있다{예를 들면, 일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ)의 웹 사이트의 상동성 검색(Search and Analysis)의 페이지; http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html}. 또한, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BLAST를 이용해 확인할 수 있다(예를 들면, NCBI의 홈 페이지의 웹 사이트의 BLAST의 페이지; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-10, 1990; Altschul, S. F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 266, 460-480, 1996; 및 Altschul, S. F. et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997).
실제로, 본 발명자들은 WO 02/052007에 대해 시노비올린을 구성하는 아미노산 서열에서 한 개의 아미노산이 결여된 클론임을 밝혔다. 이러한 아미노산 서열 에 있어서 변이를 포함한 단백질은 본 발명에서 필요로 하는 기능을 가지는 한, 본 발명의 시노비올린 유사체에 포함된다. 또한, 본 발명자들이 확인한 한 개의 아미노산이 결여된 변이체는 서열번호 3의 1293bp - 1295bp에 해당하는 gca를 결여하고 있다. 그 결과, 서열번호 4의 412 위치에 Ala를 결여하고 있다.
본 발명에서는, 어떤 단백질이 P4HA1를 유비퀴틴화시키는지를 알아보기 위하여 상기의 유비퀴틴화가 가능한 조건하에서 해당 단백질과 기질을 접촉 및 기질의 유비퀴틴화를 검출함으로써 확인하였다.
이어, 본 발명에 있어서 "기질 또는 그의 유사체의 유비퀴틴화가 가능한 조건"이란, 시노비올린에 의해 P4HA1의 유비퀴틴화가 가능한 조건을 말한다. 이러한 조건은 in vitro 또는 in vivo로 구성될 수 있다. 예를 들면, 성분 공존(coexistence)에 의해 제공된 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건은 하기와 같다:
　(i) 유비퀴틴 활성화 효소(E1);
　(ii) 유비퀴틴 전이효소(E2);
　(iii) 유비퀴틴; 및
　(iv) 아데노신 3 인산.
일반적으로, 생체 내에서 단백질의 유비퀴틴화는 하기와 같이 진행한다고 생 각되고 있다. 우선, 단백질의 유비퀴틴화는 상기 4개의 성분을 포함하여 유비퀴틴 연결효소(리가제/E3)가 필요하다. 유비퀴틴 활성화효소(E1), 유비퀴틴 전이효소 (E2) 및 유비퀴틴 연결효소(리가제 /E3)는 유비퀴틴 시스템으로 불리는 복합효소계 를 구성한다. 경우에 따라, E2에 의해 기질이 유비퀴틴화되는 경우도 있지만, P4HA1는 주로 시노비올린(E3)에 의해 유비퀴틴화된다.
유비퀴틴 활성화효소(E1)는 유비퀴틴 전이효소(E2)를 활성화한다. 한편, 유 비키틴 연결효소(리가제/E3)는 기질 단백질을 인식해 포착하며, 활성화된 유비퀴틴 전이효소(E2)의 유비퀴틴을 이용하여 포착한 기질 단백질을 유비퀴틴화시킨다. 유비퀴틴 시스템에서, 유비퀴틴 연결효소(리가제/E3)는 기질이 되는 단백질을 식별 하는 중요한 역할을 한다. 즉, 유비퀴틴 연결효소(리가제/E3)에 의한 기질의 선택 은 기질 단백질의 마지막 운명을 의미한다.
또한, 유비퀴틴 시스템에서 기질을 식별하는 유비퀴틴 연결효소(리가제/E3)와 기질의 조합은 중요하다. 따라서, 본 발명에 있어서의 기질은 P4HA1 또는 그의 유사체가 이용되어야만 한다. 한편, 유비퀴틴 연결효소(리가제/E3)는 시노비올린 또는 그의 유사체여야만 한다. 그러나, 그 외의 효소는 기질의 유비퀴틴화가 가능한 임의의 효소가 이용될 수 있다.
예를 들면, 실시예에서 유비퀴틴 활성화효소(E1)에는 효모 유래의 효소가 이 용되었다. 또한, 유비퀴틴 전이효소(E2)에는 사람 유래의 UbcH5c가 이용되었다. 그러나, 본 발명에 있어서 유비퀴틴 활성화효소(E1)는 효모 유래의 효소에만 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 래트 유래의 유비퀴틴 활성화효소(E1)는 본 발명에 이용될 수가 있다. 이와 같이, 유비퀴틴 전이효소(E2)도 사람 유래의 효소에만 한정되지는 않는다. E1 및/또는 E2는 자연적인 효소뿐만 아니라 유전자 조작체여도 좋다. 이러한 유전자 조작체는 E1 또는 E2가 그 활성을 유지하는 한, 구조의 변형이 가능하다. 구조의 변형에는 아미노산 서열의 치환, 결여, 삽입 및 첨가가 포함된다. 예를 들면, 하기의 실시예에 있어서, 사람 유래의 UbcH5c를 GST 융합 단백 질로서 대장균으로 발현시킨 E2를 이용하고 있다. 이러한 유전자 조작체는 본 발명에 있어서 E2에 포함된다.
상기의 성분 (i) 내지 (iv)를 이용하여 시노비올린에 의한 기질의 유비퀴틴 화가 가능한 조건이 제공되었을 때, 당업자는 유비퀴틴화에 필요한 그 외의 조건을 디자인할 수 있다. 구체적으로는, 배양조건 및 각 성분의 사용량을 당업자가 결 정할 수 있다. 이러한 조건을 예시하면, 각 성분은 하기와 같은 농도로 이용된다:
시노비올린(E3)： 500 ng;
GST-P4HA1： 800 ng;
(i) 유비퀴틴 활성화 효소(E1)： 60 ng;
(ii) 유비퀴틴 전이효소(E2)： 0.3 mg; 및
(iii) 유비퀴틴(32P-표지 His-유비퀴틴)： 0.75 μg.
상기 조성을 하기의 반응 완충액에 첨가하여 반응액량을 30 μL로 하였고, 이 혼합액을 37℃에서 1시간 배양하여 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건을 구성하였다. 각 성분의 농도는 필요에 따라 적절히 조절할 수 있다. 예를 들면, 상기 사용량의 1/10 내지 10배 정도로 조절이 가능하다.
반응 완충액의 조성
50 mM Tris-HCl 완충액 pH 7. 4
5 mM MgCl2
2 mM NaF
10 nM 오카다산(Okadaic acid)
2 mM ATP(iv)
0.6 mM Dithiothreitol(DTT)
한편, 본 발명에 있어서 유비퀴틴화가 가능한 조건은 in vivo에서도 구성될 수 있다. 즉, 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질을 발현하는 세포 내에서 기질을 유비퀴틴화함으로써 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건이 제공될 수 있다. 시노비올린과 기질을 발현하는 세포로는 예를 들면, 활세포(synovial cell)를 이용할 수가 있다.
또한, 시노비올린(또는 그의 유사체)과 기질을 유전공학적으로 강제 발현시킨 세포에 의해 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건이 제공될 수 있다. 외래 유전자 로서의 시노비올린(또는 그의 유사체) 또는 기질을 코딩하는 유전자를 도입한 세포에 있어서, 유도발현이 가능한 발현 시스템을 이용함으로써 시노비올린 또는 그 기질의 발현 시기를 조절할 수가 있다. 살아 있는 세포는 유비퀴틴 시스템을 가지고 있는데, 이것은 상기의 성분 (i) 내지 (iv)가 세포 내에 존재하고 있다는 것을 의미한다. 따라서, 시노비올린과 기질을 함께 존재하게 하면, 본 발명에서의 유비키 틴화가 가능한 조건을 구축할 수 있다.
시노비올린과 그 기질인 P4HA1를 코딩하는 염기 서열은 공지되어 있다. 당업자는 공지된 유전 정보에 따라 그 발현 시스템을 디자인할 수 있으며, 강제 발현 시키기 위한 숙주세포로는 동물세포, 곤충세포 또는 효모 등을 이용할 수가 있다.
세포 내에서 유비퀴틴화된 기질은 세포를 분쇄하여 회수할 수 있다. 더 나아가, 유비퀴틴이나 기질에 대한 친화성 물질을 이용하여 목적하는 기질을 분리할 수도 있다. 또한, 세포 내에는 목적하는 기질 이외에도 유비퀴틴화된 단백질이 많 이 존재하기 때문에 세포 내에서 기질을 유비퀴틴화했을 경우, 목적하는 기질 단 백질의 유비퀴틴화를 특이적으로 측정하는 것이 바람직하다.
예를 들면, 기질 단백질에 대한 항체를 사용하여 기질 단백질을 특이적으로 포착하는 방법이 이용될 수 있다. 또는, 기질 단백질을 히스티딘으로 태그된 태그 펩티드와 융합 단백질로 발현시켜 태그를 마커로서 이용하여 기질 단백질을 분리할 수도 있다. 이렇게 세포로부터 회수된 기질 단백질은 상기의 방법에 따라 그 유비 키틴화 레벨이 측정되었다.
예를 들면, P4HA1(또는 그의 유사체)와 태그된 유비퀴틴(tagged ubiquitin) 및 시노비올린(또는 그의 유사체) 중 어느 하나와 공형질 전환한 세포를 유비퀴틴화가 가능한 조건으로 이용될 수 있다. 유비퀴틴화 레벨은 태그에 대한 항체를 사용한 면역침강(immunoprecipitation) 및 침강 분획의 P4HA1 레벨을 측정하여 결정될 수 있다. 침강 분획의 P4HA1 레벨은 P4HA1에 대한 항체를 이용하여 면역학적으로 측 정될 수 있다. 또는, 면역침강 후, 침강되지 않은 P4HA1 레벨을 측정함으로써 유 비키틴화 되지 않은 기질을 측정할 수도 있다.
더 나아가, 태그된 유비퀴틴 및 시노비올린(또는 그의 유사체)를 가지며 P4HA1를 발현하는 세포에 공형질 전환함으로써 유비퀴틴화가 가능한 조건을 구축할 수도 있다. 항P4HA1 항체로 면역침강한 후, 태그에 대한 항체 또는 유비퀴틴에 대 한 항체를 이용하여 유비퀴틴화 레벨을 측정할 수도 있다. P4HA1를 발현하는 세포로는 예를 들면, 활세포 등을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 가지는 시험 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명에 의한 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하 는 방법에 따라, 시험 화합물에 의한 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활 성을 검출하는 단계; 및
b) 대조군과 비교하여, 기질의 유비퀴틴화 레벨에 차이가 있는 시험 화합물 을 선별하는 단계.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서 보다 구체적인 방법을 하기에 예시하였다.
시노비올린과 P4HA1와의 상호작용에 영향을 주는 물질의 선택에 있어서는, 가장 일반적으로, 시험 화합물의 존재하에서 효소인 시노비올린과 그 기질인 P4HA1 를 반응시켜 그 반응량을 측정하는 것이 좋다. 이러한 경우, 대조군으로 시험 화 합물의 비존재하에서 시노비올린과 P4HA1를 반응시킨 결과를 비교하면 보다 객관적 인 선택이 가능하다.
시노비올린(Synoviolin)은 P4HA1를 유비퀴틴화 반응을 촉매한다. 따라서, 반응량의 측정하기 위해서는, 반응을 유비퀴틴의 존재하에서 실시하여 유비퀴틴화 된 P4HA1를 측정하는 것이 좋다. 유비퀴틴화 된 P4HA1의 양, 즉 P4HA1에 결합한 유비퀴틴의 양을 측정하는 방법으로는 유비퀴틴에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들면 유비퀴틴에 대한 항체를 이용하는 방법을 들 수 있다. 유비퀴틴에 대한 항체 는 일반적인 절차에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 면역원인 유비퀴틴을 면역동 물에 주사하여 그 동물의 혈액으로부터 혈청을 채취하는 것이다. 이때, 이용되는 면역 동물로는 마우스, 래트 또는 토끼 등을 들 수 있다. 또한, 항체로는 단일 클 론 항체를 이용할 수도 있다. 단일 클론 항체를 얻기 위한 방법은 공지되어 있다.
더 나아가, 유비퀴틴의 측정을 위해서는, 유비퀴틴 자체를 표지하여 그것을 검 출 또는 측정할 수 있다. 이러한 표지로는, 상용되고 있는 여러 가지의 표지를 이 용할 수가 있다. 구체적으로, 방사능 표지, 효소 표지 및 비오틴 등을 표지로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 유비퀴틴을 32P에 의해 표지했을 경우,자기방사법(autoradiography)에 의해 검출될 수 있고, 섬광 계수기(scintillation counter)를 이용하여 32P의 방사 활성을 측정할 수 있으며, 비오틴으로 표지했을 경우, 표지한 아비딘(avidin)에 의해 검출될 수도 있다.
구체적인 방법은 하기와 같이 예시하였다.
방법 1.
우선 태그된 P4HA1를 조제한 후, 이것과 E1, E2, ATP, 시노비올린, 유비퀴틴 및 시험 화합물을 배양하여 P4HA1-유비퀴틴 복합체를 생성시킨다. 이어, P4HA1의 태그에 대한 항체를 반응시킨 후, 면역침강에 의해 P4HA1 복합체와 미반응된 유비 키틴을 분리한다. 이어, P4HA1 복합체를 형성한 유비퀴틴을 유비퀴틴에 대한 항 체로 검출 또는 측정하며, 시험 화합물을 포함하지 않는 반응계에 있어서는 상기와 같은 검출 또는 측정을 실시해, 시험 화합물의 유무에 따라 유비퀴틴의 결합량을 비교한다.
방법 2.
P4HA1, E1, E2, ATP, 시노비올린, [32P] 표지된 유비퀴틴 및 시험 화합물을 함께 배양하여 P4HA1-유비퀴틴의 복합체를 생성시킨다. 이어, 전기영동 등을 실시하여 복합체 및 미반응된 유비퀴틴을 분리한다. 이어, P4HA1 복합체를 형성한 유 비키틴을 자기방사법으로 검출 또는 측정하며, 시험 화합물을 포함하지 않는 반응계에 있어서는 상기와 같은 검출 또는 측정을 실시해, 시험 화합물의 유무에 따라 유비퀴틴의 결합량을 비교한다.
상기의 방법에 있어서, 32P를 대신해 비오틴으로 표지된 유비퀴틴을 이용할 수도 있다. 이 경우, 표지된 아비딘으로 유비퀴틴을 검출 또는 측정한다. 표지로 는 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 형광(fluorescence) 등을 이용할 수 있다.
방법 3.
시노비올린, E1, E2, ATP, 액상 섬광체-함유 비드에 결합한 P4HA1, [33P] 또 는 [32P]로 표지된 유비퀴틴 및 시험 화합물을 반응시킨 후, 표지된 유비퀴틴과 P4HA1이 결합했을 발생하는 발광빛을 액체 신틸레이션 카운터로 검출 또는 측정한다. 시험 화합물을 포함하지 않는 반응계에 있어서는 상기와 같은 검출 또는 측정을 실시해, 시험 화합물의 유무에 따라 유비퀴틴의 결합량을 비교한다.
방법 1 내지 3에서, 시험 화합물이 시노비올린의 활성, 즉 시노비올린과 P4HA1와의 상호작용을 저해하는 물질(antagonist)인 경우, 시험 화합물의 존재하에 서 유비퀴틴 결합량은 시험 화합물의 비존재하에서보다 적게 나타난다. 반대로, 시험 화합물이 시노비올린과 P4HA1와의 상호작용을 활성화하는 물질(agonist)인 경 우, 결과는 반대가 된다. 따라서, 상기의 결과에 의해, 시험 화합물이 agonist(활 성화 물질)인지 antagonist(저해 물질)인지를 결정할 수가 있다.
본 발명자들은 시노비올린이 P4HA1와 결합하여 유비퀴틴화 시킨다는 것을 밝 혔다. 따라서, 상기의 양자 간의 결합에 간섭하는 작용을 검출함으로써 시노비오 린에 의한 P4HA1의 유비퀴틴화를 조절하는 작용을 평가할 수 있다. 즉 본 발명은, 하기의 단계를 포함하는, 시험 화합물에 의한 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 방법이다:
(a) 시험 화합물의 존재하에서 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계;
(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후, 시노비올린과 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배 양한 후, 시험 화합물을 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후, 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨이, 시험 화합물 부재하에서 측정된 결합 레벨과 다를 때, 시험 화합물의 시노비올린에 의한 기질의 유비키틴화 작용을 조절하는 활성이 검출되는 단계(이때 상기 기질은 P4HA1 또는 그의 유사체이다).
시노비올린(또는 그의 유사체), 기질 및 시험물질을 접촉시키는 순서는 임의적으로 가능하다. 즉, 본 발명은 하기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 임의의 순서로 시노비올린(또는 그의 유사체), 기질 및 시험물질을 접촉시키는 단계를 포함한다. 시험물질의 존재하에서 세 개의 성분을 배양하는 경우(a), 시노비올린(또는 그의 유사체)의 유비퀴틴화 반응에 의한 시험물질의 작용을 평가할 수 있다. 또한, 시노비올린(또는 그의 유사체) 및 기질 중 어느 하나가 시험물질과 접촉한 후, 유비퀴틴화가 가능한 조건을 제공해 줄 수도 있다(a'). 이 경우에는, 시노비올린에 의한 유비퀴틴리가제의 활성 또는 기질의 유비퀴틴화되는 기능 중 어느 하나에 시험물질 의 작용이 평가된다. 덧붙여, 유비퀴틴화가 가능한 조건을 제공한 후, 시험물질을 접촉시킴으로써(a'') 유비퀴틴화된 기질에 대한 시험물질의 작용을 평가할 수도 있다.
상기 방법에 있어서는, 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질 중 어느 하나가 고체상(solid phase)에 결합하거나 또는 고체상에 결합 가능한 표지를 포함하는 것 이 바람직하다. 고체상에 결합 가능한 표지란, 예를 들면 결합성 리간드를 들 수 있는데, 이러한 결합성 리간드에는 비오틴 등이 포함된다. 또한, 비오틴은 아비딘-세파로스(avidin-sepharose) 등의 고체상에 포착될 수 있으며, 고체상과의 결합에 의해 양자의 결합 생성물을 용이하게 분리할 수 있게 된다.
한편, 고체상화되지 않은 다른 성분은 검출을 용이하게 하기 위하여 표지해 둘 수 있다. 즉, 시노비올린, 그의 유사체, 또는 기질은 단백질을 표지하는 공지된 방법에 의해 표지할 수 있으며 구체적으로는, 방사활성 물질, 효소활성 물질, 형광 활성물질, 또는 발광물질 등을 표지로서 이용할 수 있다. 또한, 표지물질을 간접적으로 단백질에 결합시키기 위해서, 결합성의 태그를 이용할 수도 있다. 예를 들면, 비오틴화된 단백질에는 아비딘화된 표지물질을 결합할 수가 있다.
본 발명에 있어서, P4HA1 또는 그의 유사체는 시노비올린과의 결합 활성을 가진 임의의 단백질을 이용할 수가 있다. 구체적으로, P4HA1 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함한다:
(a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴 리펩티드이며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드; 및
(e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아 미노산 서열을 가지며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드.
또한, 본 발명에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 P4HA1과의 결합 활성을 가진 임의의 단백질을 이용할 수가 있다. 구체적으로, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E)의 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함한다:
(A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
(B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재 된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드;
(D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드; 및
(E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아 미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티 드와 결합하는 폴리펩티드.
주어진 아미노산 서열에 임의의 변이를 도입하는 방법은 상기에서 언급하였다. 또한, 인위적으로 또는 자연적으로 존재하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레 오티드로부터 하이브리다이제이션(hybridization) 또는 PCR을 이용하여 구조적으로 유사한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 분리하는 방법도 공지되었다. 당업자는 상기의 방법을 통하여 얻은 여러 종의 변이체중에서 시노비올린 또는 P4HA1와 결합 활성을 가지는 폴리펩티드를 선택할 수가 있다. 예를 들면, 어떤 단 백질이 고정화된 시노비올린에 의해 포착될 때, 그 단백질은 시노비올린과의 결합 활성을 가진다고 판정한다. 또한, 어떤 단백질이 고정화된 P4HA1에 의해 포착될 때, 그 단백질은 시노비올린과의 결합 활성을 가진다고 판정한다.
예를 들면, P4HA1의 cDNA를 단편화한 DNA를 적당한 발현 벡터에 삽입 및 발 현시킴으로써 P4HA1의 단편 단백질을 얻을 수 있다. 또한, 상기의 단편 단백질의 라이브러리와 시노비올린과의 결합 활성을 확인하면, 시노비올린과의 결합에 필요한 영역을 확인할 수도 있다. 이와 같이 결정된 영역을 포함하는 시노비올린의 단 편은, 본 발명에 있어서 시노비올린의 유사체로 이용될 수 있다. 더 나아가, 해당 영역을 구성하는 아미노산 서열을 보존하고 있는 다른 종으로부터 유래된 P4HA1의 상대물(counterpart)이나, 그 단편 서열을 포함하는 폴리펩티드도 본 발명방법에 있어서 P4HA1의 유사체로 이용될 수 있다.
본 발명에서, 시험 화합물의 시노비올린에 의한 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 방법은, 시노비올린과 기질 사이의 결합을 간섭함으로써 시노비오 린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 작용을 검출하는 화합물의 스크리닝 방법으로 유 용하다. 즉 본 발명은, 하기의 단계를 포함하는, 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 가지는 시험 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다:
(a) 상기에서 언급한 시험 화합물의 시노비올린에 의한 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 방법에 따라, 시험 화합물의 시노비올린에 의한 유비키 틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 단계; 및
(b) 대조군과 비교하여, 시노비올린과 기질의 결합 레벨에 차이가 있는 시험 화합물을 선택하는 단계.
본 발명에 있어서, 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하 는 방법은 상기에서 언급하였다. 해당 방법에 따라, 여러 개의 시험 화합물의 활 성을 평가 및 대조군과 비교함으로써 목적으로 하는 활성을 가진 시험 화합물을 선택할 수가 있다. 본 발명의 대조군으로는, 목적으로 하는 활성의 레벨이 이미 확 인된 임의의 화합물을 이용할 수가 있다. 예를 들면, 목적으로 하는 활성이 없는 화합물은 음성 대조군으로 이용될 수 있다. 또한, 시험 화합물이 없는 경우에 측 정된 유비퀴틴화 레벨을 음성 대조군으로 비교해도 좋다. 또는, 일정한 활성을 가 진 물질을 대조군으로 이용하면, 그 활성 레벨을 초과하는 물질을 스크리닝할 수도 있다.
본 발명의 스크리닝에 이용되는 시험 화합물은 특별히 제한되어 있지 않다. 예를 들면, 무기 화합물, 유기 화합물, 펩티드, 단백질, 천연 또는 합성 저분자화 합물, 천연 또는 합성 고분자 화합물, 조직 또는 세포 추출액, 미생물의 배양 상층 액 및 식물 또는 해양생물로부터 유래된 천연 성분 등을 시험 화합물로 이용할 수 있다. 또한, 유전자 라이브러리의 발현 산물 또는 발현 cDNA 라이브러리 등을 시 험 화합물로 이용할 수도 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 따라, P4HA1에 대한 시노비올린의 유비퀴틴화 작 용을 조절하는 활성을 가진 화합물을 선택할 수가 있으며 이러한 화합물에는, 관절 류마티즘 또는 섬유증의 치료용 약제가 포함된다. 본 발명에서 "유비퀴틴화 작용 을 조절하는 활성"이란, 활성의 자극 및 억제가 포함된다. 단백질의 유비퀴틴화 는, ATP 의존적 프로테아제에 의하여 해당 단백질을 선택적으로 분해함으로써 유도 한다. 생체 내에서는, 비정상적인 단백질 및 불필요한 단백질을 제거하기 위해서 유비퀴틴화가 발생하는 것으로 판단되고 있다. 따라서, P4HA1에 대한 시노비올린 의 유비퀴틴화 작용을 조절함으로써, 프로릴 4 수산화 효소(proryl 4-hydroxylase) 의 활성을 조절할 수 있다.
P4HA1의 유비퀴틴화가 촉진하는 경우, 해당 효소의 활성 레벨이 상승하게 된다. 예를 들면, 류마티스성 관절염 환자의 활세포(synovial cell)에서는 시노비올린의 발현이 상승하게 되며 그 결과, P4HA1의 유비퀴틴화가 촉진되어 해당 효소의 활성 레벨이 상승하게 된다. 이러한 P4HA1의 유비퀴틴화에 의한 비정상적인 분자가 특이적으로 분해되어 정상적인 단백질의 비율로 높아지는 메카니즘은 예측된다.
비정상적인 단백질의 예로는 하기와 같다:
- 비정상적으로 변형된 단백질; 및
- 비정상적인 folding을 가진 단백질.
이와 달리, P4HA1의 유비퀴틴화가 저해되는 경우, 비정상적인 단백질의 축적 이 진행되기 때문에, 프로릴 4 수산화 효소 활성이 저하된다. 비정상적인 단백질은, 그 효소 자체의 활성을 저해할 뿐만 아니라 정상적인 단백질과 다른 서브유닛 또는 효소 분자 및 기질과의 결합을 저해한다.
시노비올린에 의한 P4HA1의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 화합물은, 시노비오 린에 의한 기질의 유비퀴틴화의 조절제로서 유용하다. 즉 본 발명은, 본 발명의 방법에 따라 선택할 수 있는 화합물을 유효 성분으로 하는, 시노비올린에 의한 기질의 유비퀴틴화의 조절제를 제공한다. 본 발명의 유비퀴틴화의 조절제는, 비정상적인 프로릴 4 수산화 효소의 활성으로 기인된 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 또한, 프로릴 4 수산화 효소는 콜라겐 대사에 필수적인 효소이다. 따라서, 콜라겐의 비정상적인 합성으로 수반되는 질환은 시노비올린에 의한 유비퀴틴화의 조절에 의해 치료 또는 예방할 수 있다.
실제로, 본 발명자들은 유전자 공학적으로 시노비올린을 결여시킨 마우스 세 포를 정상세포와 비교했을 때, 프로릴 4 수산화 효소의 활성(도 6 참조) 및 콜라겐 의 생합성(도 5 참조)이 저하됨을 실험적으로 확인하였다. 한편, 이 세포의 P4HA1 단백질량은 정상세포와 비교했을 때 의미있는 차이를 보이지 않았다(도 4). 즉, 시노비올린에 의한 P4HA1의 유비퀴틴화가 프로릴 4 수산화 효소의 활성 상승을 유도하는 것으로 고려되고 있다. 따라서, 이러한 시노비올린의 작용을 억제하면 콜 라겐의 과도한 생합성을 억제할 수가 있다. 또한, 시노비올린의 작용을 잠정적으로 증가시켜 콜라겐의 생합성을 자극할 수도 있다.
보다 구체적으로, P4HA1의 유비퀴틴화 작용의 지표로서 발견된 시노비올린 저해제는, 섬유세포의 축적에 의해 유도되는 질환 또는 병의 증세를 치료 및/또는 방하는데 유용하다. 예를 들면, 폐섬유증(pulmonary fibrosis) 또는 간섬유증 (hepatic fibrosis) 등의 질환을 섬유세포의 축적으로 인해 기인되는 질환 또는 병 의 증세로 가리킬 수 있다고 보고되었다(Kivirikko, K. I. Ann. Med. 25, 113-26, 1993).
본 발명에서 섬유증(Fibrosis)이란, 조직의 회복 및 장해에 대한 반응으로서 섬유의 형성 및 축적이 증가하는 병의 증세를 가지는 질환을 말한다. 상기에서 언급한 폐섬유증 및 간섬유증은 섬유증의 대표적인 질환이며, 이러한 질환의 병인에 는 여러 가지 메카니즘이 관여할 것으로 보고 있으나, 조직의 섬유화에 의해서 조 직의 기능이 손상되는 것은 일반적인 보고 있다. 예를 들면, 폐섬유증에 의해서 호흡 기능이 손상되며, 간섬유증은 간의 혈류를 방해하여 간기능 장해의 원인이 된 다. 따라서, 섬유증을 개선한다면 이러한 질환의 증상을 치료, 치유 또는 예방할 수가 있다.
간섬유증과 같은 섬유증의 진행이 콜라겐의 생합성을 저해함으로써 억제될 수 있다는 것은 공지되어 있다(Kivirikko, K. I. Ann. Med. 25, 113-126, 1993).
본 발명에서, 섬유증의 치료 또는 예방을 위한 화합물의 스크리닝 방법은, 상기에서 언급한 시노비올린에 의한 P4HA1의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법에 의해 실시할 수 있다.
따라서 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을, 시험 화합물의 존재하에서 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건으로 배양하는 단계;
(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후, 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건으로 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을, 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건으로 배양한 후, 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후, 기질의 유비퀴틴화 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 기질의 유비퀴틴화 레벨이, 시험 화합물 부재하에서 측정된 유비퀴틴화 레벨보다 낮은 시험 화합물을 섬유증 치료 또는 예방하기 위한 화합물로서 선택하 는 단계(이때, 상기 기질은 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
또한 본 발명은 하기의 공정을 포함하는, 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 시험 화합물의 존재하에서 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건으로 배양하는 단계;
(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후, 시노비올린과 기질과의 결합이 가능한 조건으로 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건하에서 배양한 후, 시험 화합물을 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후, 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨이, 시험 화합물 부 재하에서 측정된 결합 레벨보다 낮은 시험 화합물을 섬유증 치료 또는 예방하기 위한 화합물로서 선택하는 단계(이때, 상기 기질은 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
또한 류마티즘에 있어서, 콜라겐의 생합성 과잉은 류마티즘의 대표적인 병의 증세 중 하나이다. 따라서, 시노비올린에 의한 P4HA1 활성의 조절을 제어함으로써 콜라겐의 생합성을 억제하는 것은, 류마티즘의 치료 전략으로 유용하다(Kivirikko, K. I., Ann. Med., 25, 113-126, 1993).
따라서 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을, 시험 화합물의 존재하에서 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건으로 배양하는 단계;
(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후, 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건으로 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을, 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건하에서 배양한 후, 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후, 기질의 유비퀴틴화 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 기질의 유비퀴틴화 레벨이, 시험 화합물 부재하에서 측정된 유비퀴틴화 레벨보다 낮은 시험 화합물을 선택하는 단계(이때, 상기 기질은 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 시험 화합물의 존재하에서 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건으로 배양하는 단계;
*(a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후, 시노비올린과 기질과의 결합이 가능한 조건으로 배양하는 단계; 또는
(a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건으로 배양한 후, 시험 화합물을 접촉시키는 단계;
(b) 상기의 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후, 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질의 결합 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질의 결합 레벨이, 시험 화합물 부재하에서 측정된 결합 레벨보다 낮은 시험 화합물을 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 화합물로서 선택하는 단계(이때, 상기 기질은 프로릴 4 수산화 효소α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
한편, P4HA1의 유비퀴틴화 작용을 지표로하여 발견된 시노비올린의 활성화제 는 콜라겐의 보충 요법으로 유용하다. 예를 들면 연령, 자외선 조사 또는 스트레 스 등에 의해 감소되는 콜라겐을 시노비올린의 활성화제를 투여함으로써 보충할 수 가 있다.
더 나아가, 본 발명은 하기의 성분을 포함하는, 시노비올린의 유비퀴틴화 작 용을 조절하는 활성을 검출하기 위한 키트 및 섬유증과 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 화합물의 스크리닝을 위한 키트를 제공한다:
(1) 시노비올린 또는 그의 유사체; 및
(2) P4HA1 또는 그의 유사체.
본 발명의 키트에 있어서 P4HA1 또는 그의 유사체는, 미리 표지되어 있어도 무 관하며, 표지하기 위한 방법을 더 많이 포함할 수도 있다. 예를 들면, P4HA1 또는 그의 유사체를 인식 및 결합하는 표지된 항체를 더 많이 포함할 수 있다. 본 발명의 키트에 필요한 하기의 성분 (1) 및 (2)는 상기에서 언급한 방법을 이용하여 얻을 수 있다.
본 발명의 키트에는, 하기의 성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 성분 또한 상기에서 언급하였다:
(3) 유비퀴틴 활성화 효소;
(4) 유비퀴틴 전이효소;
(5) 유비퀴틴; 및
(6) 아데노신 3 인산(ATP).
상기의 구성성분 중, 유비퀴틴은 미리 표지해 둘 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 유비퀴틴을 표지하기 위한 방법을 더 많이 포함할 수도 있다. 예를 들면, 유비퀴틴을 인식 및 결합하는 표지된 항체를 이용할 수 있다.
본 발명의 키트를 구성하는 P4HA1는 비드(bead) 등의 고체상(solid phase)에 결합할 수 있다. 특히 액상 섬광체를 포함하는 비드는 32P로 표지된 유비퀴틴 과 P4HA1와의 결합을 간편하게 검출할 수 있기 때문에 유리하다. 따라서, 액상 섬광체(liquid scintillant)을 포함한 비드에 결합된 P4HA1 및 방사 활성으로 표지된 유비퀴틴을 포함한 키트는 본 발명의 키트로서 바람직하다.
본 발명의 키트는 세포를 배양하기 위한 용기 또는/및 배양액을 추가적으로 포함할 수도 있다. 본 발명의 키트는 상기에서 언급한 본 발명의 방법을 실시하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 시험 또는 스크리닝 방법에 의해 분류된 화합물은 시노비올린과 프로릴 4 수산화 효소가 관여하는 질환에 대한 의약제의 후보가 되며, 이러한 질환 의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 또한, 상기 질환으로는 예를 들면, 섬유증(fibrosis) 또는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 등을 들 수 있다. 이러한 화합물은 유효 성분 이외의 적당한 다른 용질이나 용매와 조합하여 의약 조성물로 사용할 수가 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분리된 화합물을 의약품으로 이용하는 경우, 분리된 화합물 자체를 직접 환자에게 투여할 수 있을 뿐만 아니라, 공지된 약제학적인 절차에 의해 분리된 제재화한 의약 조성물로서 투여할 수도 있다.
예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제 및 현탁제 등과 적당히 조합하여 제재화해 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 수용액(aqueous solution), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 트로키(troche), 구강정(buccal tablet), 엘릭시르제(elixirs), 현탁액(suspension), 시럽(syrup), 점비액(nasal drop) 또는 흡입액(inhalant) 등의 형 태일 수 있다. 화합 물의 함유율은 적당히 결정하는 것이 좋다. 환자로의 투여는 일반적으로 예를 들 면, 동맥 내 주사, 정맥 내 주사, 피하 주사, 경구투여, 관절 내 주입 및 그 외의 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
투여량(dosage)은 환자의 체중이나 연령, 투여 방법 및 증상 등에 따라 변동 하지만, 당업자이면 적당한 투여량을 적절히 선택하는 것이 가능하다. 일반적인 투여량은 약제의 유효 혈중농도(effective blood concentration) 및 대사율(metabolic rate)에 따라 다르지만, 1일의 유지량으로서 약 0.1 mg/kg 내지 약 1.0 g/kg, 바람직하게는 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.1 mg/kg 내지 약 1.0 mg/kg로 생각되고 있다. 투여는 1회로부터 몇 차례로 나누어 실시할 수가 있다. 또한, 화합물이 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있는 것 이면, 폴리뉴클레오티드를 유전자 치료용 벡터에 삽입하여 유전자 치료를 실시할 수도 있다.
또한, 본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술 문헌은 참조로서 본 명세서에 첨부되었다.
본 발명에서는 시노비올린에 의한 프로릴 4 수산화 효소의 α서브유닛(proryl 4-hydroxylase α subunit) 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 평가할 수 있다. 더 나아가, 본 발명에서는 시노비올린에 의한 프로릴 4 수산화 효소의α서브유닛 유비키틴화 작용을 조절하는 활성을 가지는 화합물의 스크리닝 방법을 제 공할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
특히, 시노비올린이 α서브유닛 유비퀴틴화에 의해 프로릴 4 수산화 효소의 활성을 조절한다는 사실은 본 발명자들에 의해서 최초로 발견되었다. 프로릴 4 수 산화 효소는 생체 내 콜라겐 합성에 매우 중요한 역할을 수행하는 효소이다. 따라 서, 본 발명의 방법에 따라 선택할 수 있는 화합물은, 프로릴 4 수산화 효소의 비 정상적인 활성으로 초래되는 질환의 치료 및/또는 예방에 유용할 것이다. 예를 들 면, 콜라겐의 축적에 의해 초래되는 여러 종의 섬유증 또는 류마티스성 관절염은, 본 발명에 의해 얻어진 화합물에 의하여 치료 또는 예방할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 효모 투 하이브리드 법(yeast two-hybrid system)에 의한 P4HA1의 스 크리닝
효모 투 하이브리드 시스템인 Clonetech 사의 MATCHMAKER 투 하이브리드 시 스템을 이용하여 효모 형질전환법(Pro. Natl. Aca. Sci. USA., 88, 9578-9582, 1991)으로 시노비올린 기질 단백질의 스크리닝을 수행하였다. 시노비올린 cDNA의 706bp 내지 1854bp 및 805bp 내지 1260bp의 말단을 EcoR I/Xho I으로 절단하여, GBT9 벡터의 EcoR I/Xho I 사이트에 삽입하였다. 하기에는, 시노비올린의 706bp 내지 1854bp의 단편을 SynodTM로, 805bp 내지 1260bp의 단편을 Syno RING으로 기재하였다(도 1 참조).
시노비올린의 기질 단백질 스크리닝에 이용되는 라이브러리는 사람 연골 유 래의 cDNA를 pACT2 벡터에 삽입하여 준비하였다(pACT2-Y). 42℃에서 15분간 열처 리한 후, 효모 주 Y190에 pGBT9-Syno dTM 또는 pGBT9-Syno RING(2.0 μg) 및 pACT2-Y (20μg)를 각각 도입하였다. 각 벡터를 도입한 효모주 Y190를 Tris-EDTA (pH7. 5) 완충액(TE완충액)으로 세정한 후, SD-Trp-Leu-His 플레이트에 TE완충액으 로 희석한 효모주 Y190의 용액을 분주한 후 30℃에서 10일간 배양하였다. 그 후, 형성된 콜로니에 대해, 0.5 mg/ml의 X-gal를 기질로 하는 β-갈락토시다제 필터 분석을 통하여 양성 클론을 검출하였다.
양성 클론을 SD-Leu-His 배양액에서 30℃로 10일간 진탕 배양하여 알칼리- SDS 법(Methods. Enzymol., 194, 169-182, 1991)으로 효모 DNA를 추출하였다. 추 출된 효모 DNA를 대장균 주 HB101에 형질 전환해, M9 플레이트(-Leu)에 분주한 후, 37℃에서 2일간 배양하였다. 그 후, 형성된 콜로니를 20 μg/ml의 암피실린을 첨 가한 LB 배양액에서 37℃, 16시간 진탕 배양한 후 알칼리-SDS 법에 따라 플라스미 드 DNA를 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA에 삽입되어 있는 사람 연골 유래의 cDNA 단편은 어플라이드 바이오시스템즈사의 BigDye Terminator Cycle Sequencing system을 이용하여 분석하였다.
BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 이용하여 서열을 분석한 결 과, 콜라겐의 생합성에 필수적인 프로콜라겐의 프롤린(proline) 잔기의 수산화를 촉매하는 효소인 프로릴 4 수산화 효소의 α서브유닛(procollagen-proline, 2- oxoglutarate 4-dioxygenase(proline-4 hydraxylase), alpha polypeptide I (ACCESSION No. XM_032511 P4HA1)임을 확인하였다.
<실시예 2> 시노비올린(synoviolin)과 P4HA1과의 결합
TNT-coupled Translation System(Promega 사) 및 pcDNA3-Flag-P4HA1를 이용 하여[35S]로 표지된 Flag-P4HA1 융합 단백질을 작성한 후, 이것과 GST-Syno dTM, GST-Syno RING 및 GST 단백질을 20 mM HEPES(pH7.9), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Tween, 5% 글리세롤, 1 mM DTT, 0.2 mM NaVO4, 5 mM NaF, 1 mM PMSF를 포함한 결합 완충액에 첨가한 후 4℃에서 16시간 반응시켰다. 이 반응물을 SDS 폴리아크 릴아미드에서 전개한 후, 이미지 분석기(BAS2000, Fujix)로 방사 활성을 검출하였다. 그 결과, GST-Syno dTM 및 GST-Syno RING 융합 단백질과〔35S〕pcDNA3- Flag-P4HA1에서의 결합이 관찰된 반면, 컨트롤인 GST 단백질과 pcDNA3-Flag-P4HA1 와의 결합은 관찰되지 않았다(도 2 참조). 이러한 결과는 시노비올린과 P4HA1이 서로 결합하고 있다는 것을 의미한다.
<실시예 3> 시노비올린의 유비퀴틴리가제(E3)로서의 기질 분류
유비퀴틴은 활성화 효소(E1), 결합 효소(E2) 및 리가제(E3)를 포함하는 유비 키틴계 효소 시스템 활성에 의하여 표적 단백질(기질)에 공유결합한다. 이러한 반 응이 반복하여 형성된 폴리유비퀴틴 연쇄는, 프로테아솜에 의해 분해되는 기질의 마커로서 작용한다. E3는 기질을 선택하는 가장 중요한 효소이다. 시노비올린에 대한 기질 단백질 분류는 시노비올린이 관여하는 신호전달경로를 결정하는데 있어 서 필수적인 과정이다. 효모 투 하이브리드법에 의한 스크리닝으로 얻을 수 있는 시노비올린과 결합할 수 있는 단백질은 시노비올린 유비퀴틴리가제(E3)의 기질 후 보가 된다.
결국, 시험관내 조건에서 유비퀴틴리가제 활성 측정계를 이용하여 완성되었다. Syno dTM, Syno RING, 시노비올린의 307번째의 시스테인을 세린에 치환한 Syno dTM(C307S), 291번째 내지 329번째의 아미노산을 결여한 Syno dTM(dRING) 및 P4HA1의 전체영역을 포함한 cDNA를, GST 융합 단백질의 벡터(pGEX 4 T-1)에 삽입하여, 대장균에서의 융합 단백질의 생합성을 실시하였다. 대장균의 가용성상층액으로부터 얻은 각 융합 단백질은 글루타치온 세파로스 TM4B 비드(Amersham Bioscience사)에 결합시켰다.
이어, 각 시노비올린 융합 단백질 비드를 프로테아제의 일종인 트롬빈 (thrombin)에 의해 GST 부분을 제외한 후 시노비올린 단백질을 생산하였다. 이미 PKA 사이트에 삽입된 His-유비퀴틴 단백질은[32P-]ATP 로 표지하였다. E1(효모 유래), E2(UbcH5c), ATP,[32P-γ]로 표지된 유비퀴틴, GST 융합 P4HA1 단백질 비 드 및 각 시노비올린 단백질을 혼합해, 37℃에서 60분간 반응시켰다. 반응 후의 각 샘플에 4xSDS-폴리아크릴아미드 완충액을 첨가해 5분간 가열한 후, 10% SDS-폴 리아크릴아미드에서 전개시켰다.
전개된 겔을 이미지 분석기(BAS2000, Fujix)에 의해 현상한 후, 유비키 틴화 된 밴드를 검출하였다. 결과적으로, Syno dTM 및 Syno RING에 의하여 P4HA1 가 유비퀴틴화 되는 것이 확인되었다(도 3 참조). 그러나, Syno dTM(C307S) 및 Syno dTM(dRING)에서는 P4HA1가 유비퀴틴화되지 않았다. 따라서, P4HA1는 시노비 오린의 기질임이 증명되었다.
<실시예 4> 시노비올린과 콜라겐 생합성
여러 종의 마우스 태아 섬유아세포(murine fetal fibroblast, MEF)에 있어서 P4HA1 발현량 및 콜라겐 생합성
태아의 섬유아세포(MEF)를 2 x 105 개 플레이트한 후, 3일간 배양한 후에 회 수하였다. P4HA1 발현량은 항P4HA1 항체(항hPH(α), 정제된 IgG, 제일 정제화학제 품(주))을 이용한 웨스턴 블랏법에 의하여 정량하였다. 동시에, 항시노비올린 항 체(단일 클론 항체, 10 Da) 및 항β엑틴 항체(흑백-널항-β-엑틴, 클론 AC-15, 시그마)에 의해, 시노비올린 및β엑틴의 발현량을 비교하였다. 콜라겐은 Sircol TM 수용성 콜라겐 분석키트(Biocolor사)를 이용하여 정량하였다. 데이터는 MEF(syno +/+) 세포 중의 콜라겐 함량(0.09 μg 콜라겐/mg 단백질)을 1로 처리하였다.
그 결과, 시노비올린 결여 마우스(syno -/- ) MEF에 있어서 P4HA1의 단백질 레벨은 야생형 마우스(syno +/+ )의 MEF 레벨과 거의 같았다(도 4 참조). 이와 달 리, syno -/-의 MEF 배양 상층액의 콜라겐 함량은 syno +/+의 것보다 적었다(도 5 참조). 이러한 두 가지 소견으로부터, 시노비올린은 P4HA1를 유비퀴틴화함으로써, 세포 내에서 프로릴 4 수산화 효소 단백질의 품질을 조절할 가능성을 시사하였다.
여러 종의 MEF에 있어서의 프로릴 4 수산화 효소 활성의 비교
프로릴 4 수산화 효소 활성은 하기의 논문을 참고로 하여 측정하였다.
1) Gribble TJ, Comstock JP, Udenfriend S. Collagen chain formation and peptidyl proline hydroxylation in monolayer tissue cultures of L-929 fibroblasts. Arch. Biochem. Biophys., 129, 308-16, 1969.
2) Margolis RL, Lukens LN. The role of hydroxylation in the secretion of collagen by mouse fibroblasts in culture. Arch. Biochem. Biophys., 147, 612-618, 1971.
3) Methods. enzymol., 82, 247-265, 1982.
콜라겐을 생합성하는 세포인 정상적인 활세포 배양액에 α,α＇-디피리딜 (dipyridyl)을 첨가하여 세포의 히드록실라제에 의한 수산화 반응을 정지시켰고, 그 후 배양 상층액에 [2,3-3H]프롤린(proline)을 첨가해 합성된 H3-프로토콜라겐을 추출하였다. 또한, syno -/- MEF 배양 세포 및 syno +/+ MEF 배양 세포로부터 P4H 가 포함되는 분쇄물을 회수하였고, 3H-프로토콜라겐을 수산화하는 활성(3H-H2O 생합 성량)을 측정하였다.
그 결과, 3H-H2O의 생합성량은 Syno+/+에서는 39.28 cpm/μg 전체 세포 추출 물이며, Syno-/-에서는 27.58 cpm/μg 전체 세포 추출물이었다. Syno+/+의 실측치 를 1로 하여 3H-H2O의 생합성량 비를 도 6에 나타내었고, syno-/-의 MEF의 P4H 효소 활성은 syno+/+의 MEF에 비해 낮은 것이 밝혀졌다(도 6 참조).
<실시예 5> 간경변(liver cirrhosis) 및 결절성 근막염(nodular fasciitis)을 가 진 병리 조직에서의 시노비올린 발현
섬유증을 수반하는 질환에 있어서 시노비올린의 발현 부위를 확인하기 위하 여, 간경변 및 결절성 근막염의 병리 조직을 이용해 항시노비올린 항체에 의한 조 직 면역염색을 실시하였다.
간경변(liver cirrhosis) 및 결절성 근막염(nodular fasciitis)의 병리 조직 은 관계기관의 승인하에 얻었다. 조직은 잘 알려진 방법에 의해 포르말린 고정을 한 후, 파라핀에 침전시켜 마이크로톰으로 박편하였고, 검사대상의 조직으로서 사 용했다. 조직 절편은 자일렌으로 각각 5분간 3번씩 처리하여 완전하게 파라핀을 제거하였고, 100% 에틸 알코올부터 각각 10%씩 줄이면서 50%까지 총 6단계 하강 계 열의 알코올 용액에 담근 후, 1% 소혈청알부민(BSA)에서 30분간 블로킹하였다.
블로킹 종료 후, 이 조직에 1% BSA를 포함한 완충액 용액으로 희석한 1차 항 체 용액(항시노비올린 단일 항체)을 실온에서 60분간 반응시켰다. 그 후, 이 조직 을 완충액에서 5분씩 5회 세정한 후, 1% 완충액 용액에서 희석한 2차 양고추냉이 과산화효소(HRP)로 표지된 항마우스 Ig 항체를 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 완충액에서 5분씩 5회 세정한 다음 발색시약(3, 3＇-디아미노벤지딘 4하 이드로콜리드)에 좀 더 반응시켰다. 적당히 발색을 수행한 후 조직을 세정하여 현 미경으로 관찰하였다.
또한, 대조군 염색으로 헤마톡실린 핵 염색을 실시하여 현미경으로 관찰하였 다. 추가적인 대조군으로서, 염색에 이용한 항시노비올린 단일 항체의 정규장소외 (epitope)의 아미노산 서열을 포함하는 블로킹 펩티드와 반응시킨 시료도 현미경 으로 관찰하였다.
그 결과, 간경변의 병리 조직에 있어서 간장의 실질 세포(hepatic parenchymal cell), 특히 세포 증식성이 높은 부분에 시노비올린의 높은 발현을 볼 수 있었다(도 7 참조). 종양과 유사한 증식성을 가지는 근막의 섬유아세포 (fascial fibroblast)의 결절성 근막염 병리 조직에 있어서도 세포 증식성이 높은 결절 부분에 있어 시노비올린의 높은 발현을 볼 수 있었다(도 8 참조).
<실시예 6> 시노비올린과 P4HA1의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝법
시노비올린과 그 기질인 P4HA1와의 결합을 저해하는 화합물을 high- throughput screening(HTS) 방법으로 조사하였다. 시노비올린을 His 태그로 융합 된 단백질로서 발현시켰고, P4HA1은 GST로 융합된 단백질로서 발현시켜 시노비올린 과 P4HA1가 결합하면 XL665로 표지된 항His 항체와 Eu(K)로 표지된 항GST 항체 사 이에서 에너지 전이가 발생하여 형광이 검출되는 시스템을 고안하였다.
1) MBP-Syno dTM-His의 제작
MBP 시노비올린 dTM-Hisx12는 세포막 관통부분(transmembrane segment, TM) 을 결여시킨 시노비올린(시노비올린 dTM)을 MBP와 융합시킨 것이다. MBP 시노비오 린 dTM-Hisx12는 대장균에서 융합 단백질을 생합성함으로써 Ni-NTA 컬럼(QIAGEN 사) 으로 정제하여 조제하였다.
2) His-E2의 제작
His-E2는 UbcH5c의 전체 영역을 포함하는 cDNA를 His로 태그된 융합 단백질 벡터(pET)에 삽입한 후, 대장균에서 이 융합 단백질을 생합성함으로써 Ni-NTA 컬럼 (QIAGEN 사)으로 정제하여 조제하였다.
3) GST-P4HA1의 제작
P4HA1의 전체 영역을 포함하는 cDNA를 GST로 융합된 단백질 벡터(pGEX 4T-1) 에 삽입한 후, 대장균에서 이 융합 단백질을 생합성하였다. 대장균의 가용화 상층 으로부터 얻은 융합 단백질은 를루타치온세파로스 TM4B 비드(Amersham bioscience 사)로 정제하여 조제하였다.
4) 시노비올린과 P4HA1와의 결합 저해 활성의 측정
384-well 플레이트를 이용하는데 있어서 15 μL의 50 mM HEPES(pH 7.5) 용액 중에 60 ng MBP-시노비올린 His, 10 ng GST-P4HA1, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.3% DMSO 및 시험 화합물을 포함한 표준 반응액을 제작하였다. 반응은 5 μL의 GST-P4HA1를 포함한 50 mM HEPES 용액을 첨가하여 개시하였다. 실 온에서 30분간 반응시킨 후, Eu(K)로 표지된 항GST 항체(20000 B counts, CIS bio international 사), XL665로 표지된 항His 항체(0.025 μg, CIS bio international 사) 및 1 M KF를 포함한 50 mM HEPES 용액 5μL를 첨가하여 실온에서 하룻밤 배양 한 후, 형광을 RUBYstarTM로 측정하였다.
일부 변형된 시노비올린의 부분 펩티드(서열번호 5)에 의한 저해 활성을 조 사한 결과, 167 μg/ml의 IC50에서 시노비올린과 P4HA1와의 결합을 억제하였다.
<실시예 7> 시노비올린의 P4HA1 유비퀴틴화 활성을 저해하는 화합물의 스크리닝법1) XL665-Eu(K)의 에너지 전이(HTRF 법)를 이용한 유비퀴틴화 활성을 저해하는 화합물의 스크리닝법
시노비올린의 P4HA1 유비퀴틴화 활성을 저해하는 화합물을 high-throughput screening(HTS) 방법으로 조사하였다. GST와 융합된 단백질로 발현시킨 P4HA1를 기질로하여, Eu(K)로 표지된 유비퀴틴에 의한 유비퀴틴화를 실시하였고, P4HA1가 Eu(K)로 표지된 유비퀴틴이 유비퀴틴화 되면, XL665로 표지된 항GST 항체와 Eu(K) 로 표지된 유비퀴틴 사이에서 에너지 전이가 발생하여 형광이 검출되는 시스템을 고안하였다.
384-well 플레이트를 이용하는데 있어서 15 μL의 20 mM HEPES(pH 7.5) 용액 중에 60 ng MBP-시노비올린 His, 15 ng GST-P4HA1, 15 ng E1(Boston Biochem 사), 200 ng His-E2, 6.25 nM Eu(K)로 표지된 유비퀴틴(CIS bio international 사), 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 1 mM DTT, 0.1% BSA, 0.3% DMSO 및 시험 화합물을 포함한 표준 반응액을 제작하였다. 반응은 5 μL의 GST-P4HA1를 포함한 50 mM HEPES 용액을 첨가하여 개시하였다. 37℃에서 30분간 반응한 후, 5 μL의 0.5 M EDTA를 첨가하여 반응을 정지시켰고, 이 반응에 XL665로 표지된 항His 항체(0.025 μg) 및 1 M KF를 포함한 20 mM HEPES 용액 5 μL를 첨가하여 실온에서 하룻밤 배양한 후, 형광을 RUBYstarTM로 측정하였다.
일부 변형된 시노비올린의 부분 펩티드(서열번호 5)에 의한 저해 활성을 조 사한 결과, 1/20의 농도로 P4HA1의 유비퀴틴화를 억제하였다.
2) ELISA법을 이용한 유비퀴틴화 활성을 저해하는 화합물의 스크리닝법
96-well ELISA용 플레이트를 항GST 항체로 4℃에서 하룻밤 흡착시킨 다음 사 용할 때까지 실온에서 5% BSA/PBS 용액을 이용하여 블로킹하였다. 플레이트는 사 용전에 0.3% BSA를 포함한 300 μL의 PBS(PBSA)로 2번 세정하였다.
반응용 튜브를 이용하여 30 μL의 50 mM HEPES(pH7. 5) 용액 중에 80 ng MBP-시노비올린 His, 40 ng GST-P4HA1, 15 ng E1, 200 ng His-E2, 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 1 mM DTT, 0.1% BSA, 0.3% DMSO 및 시험 화합물을 포함한 표준 반응액을 제작 하였다. 실온에서 30분간 반응한 후, 70 mM EDTA 및 50 mM HEPES를 포함한 70 μL 의 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이때, 30 μL를 미리 70 μL PBSA를 첨가 한 플레이트에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어, 300 μL PBSA로 3번 세정한 후, PBSA로 5000배 희석한 마우스 항유비퀴틴 항체 용액 100 μL를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어, 300μL PBSA로 3번 세정한 후, PBSA로 10000배 희석한 과산화효소로 표지된 항마우스 IgG 용액 100 μL를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어, 300μL PBSA로 3번 세정한 후, 100 μL TMB 용액을 첨가하여 실온에서 배양하였다. 충분히 발색 되었을 때, 1 M 인산 (phosphoric acid)을 첨가하여 반응을 정지한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였 다.
일부 변형된 시노비올린의 부분 펩티드(서열번호 5)에 의한 저해 활성을 조 사한 결과, 55 μg/ml의 IC50에서 P4HA1의 유비퀴틴화를 억제하였다.
도 1은 효모 투 하이브리드 시스템(yeast two-hybrid system)을 이용하여 스크리닝하는데 사용된 미끼(bait)를 구성하는 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는[32P]로 표지된 Flag-P4HA1 융합 단백질과 GST-Syno dTM 및 GST-Syno RING 융합 단백질과의 결합을 나타내는 자기방사선상이다.
도 3은 각각의 시노비올린 단백질：Syno dTM, Syno dTM(C307S), Syno dTM(dRING) 및 Syno RING에 의한 GST 단백질 또는 GST 융합 P4HA1 단백질의 유비키틴 분석 결과를 나타내는 자기방사선상이다.
도 4는 서로 다른 마우스 태아의 섬유아세포에서의 P4HA1 발현량을 웨스턴 블랏으로 나타낸 사진이다.
도 5는 서로 다른 마우스 태아의 섬유아세포로부터 얻은 배양 상층액에 포함 된 콜라겐 함량을 나타내는 그래프이다. 그림 중, 세로축은 콜라겐 함량의 비(0.09 μg 콜라겐/mg 단백질을 1로 한다)를, 가로축은 마우스 세포의 종류를 나타낸 다.
도 6은 서로 다른 마우스 태아의 섬유아세포에 있어서의 프로릴 4 수산화 효 소 활성을 나타내는 그래프이다. 그림 중, 세로축은 Syno+/+의 실측치를 1로 하는 3H-H2O의 생합성량의 비를, 가로축은 마우스 세포의 종류를 나타낸다.
도 7은 간경변(liver cirrhosis)의 병리 조직에 있어서의 시노비올린 발현을 나타내는 현미경 사진(200배)이다.
좌상：항시노비올린 항체에 의한 염색
*우상：헤마톡실린(hematoxylin) 핵 염색
좌하：마우스 IgG에 의한 염색(대조군)
도 8은 결절성 근막염(nodular fasciitis)의 병리 조직에 있어서의 시노비오 린 발현을 나타내는 현미경 사진(오른쪽은 200배 및 왼쪽은 400배)이다. 위로부 터, 마우스 IgG, 항시노비올린 항체 및 블로킹 펩티드를 가진 항시노비올린 항체에 의한 염색 결과를 나타낸다.
<110> LOCOMOGENE INC. Eisai Co., Ltd. <120> Method for detection of regulatory effect for synoviolin activities <130> 7PFI-08-04 <150> JP 2003-295951 <151> 2003-08-20 <150> JP 2003-295964 <151> 2003-08-20 <160> 7 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1605 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1602) <400> 1 atg atc tgg tat ata tta att ata gga att ctg ctt ccc cag tct ttg 48 Met Ile Trp Tyr Ile Leu Ile Ile Gly Ile Leu Leu Pro Gln Ser Leu 1 5 10 15 gct cat cca ggc ttt ttt act tca att ggt cag atg act gat ttg atc 96 Ala His Pro Gly Phe Phe Thr Ser Ile Gly Gln Met Thr Asp Leu Ile 20 25 30 cat act gag aaa gat ctg gtg act tct ctg aaa gat tat att aag gca 144 His Thr Glu Lys Asp Leu Val Thr Ser Leu Lys Asp Tyr Ile Lys Ala 35 40 45 gaa gag gac aag tta gaa caa ata aaa aaa tgg gca gag aag tta gat 192 Glu Glu Asp Lys Leu Glu Gln Ile Lys Lys Trp Ala Glu Lys Leu Asp 50 55 60 cgg cta act agt aca gcg aca aaa gat cca gaa gga ttt gtt ggg cat 240 Arg Leu Thr Ser Thr Ala Thr Lys Asp Pro Glu Gly Phe Val Gly 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460 Ala Thr Val Phe Pro Glu Val Gly Ala Ser Val Trp Pro Lys Lys Gly 465 470 475 480 Thr Ala Val Phe Trp Tyr Asn Leu Phe Ala Ser Gly Glu Gly Asp Tyr 485 490 495 Ser Thr Arg His Ala Ala Cys Pro Val Leu Val Gly Asn Lys Trp Val 500 505 510 Ser Asn Lys Trp Leu His Glu Arg Gly Gln Glu Phe Arg Arg Pro Cys 515 520 525 Thr Leu Ser Glu Leu Glu 530 <210> 4 <211> 3374 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (403)..(2253) <400> 4 gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg 60 ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa 120 gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat 180 tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca 240 ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag 300 tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga 360 gcgggctcgc ggcgctgggt tcctggtctc cgggccaggg ca atg ttc cgc 411 Met Phe Arg 1 acg gca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg gct gtg gtg 459 Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val 5 10 15 gct cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act gtg gtg tac 507 Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr Val Val Tyr 20 25 30 35 ctg acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc cag gcc ttt 555 Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln Ala Phe 40 45 50 gtc ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg ttc ttt ggg 603 Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val Phe Phe Gly 55 60 65 caa ctg agg gca gca gag atg gag cac ctt ctg gaa cgt tcc tgg tac 651 Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg Ser Trp Tyr 70 75 80 gcc gtc aca gag act tgt ctg gcc ttc acc gtt ttt cgg gat gac ttc 699 Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg Asp Asp Phe 85 90 95 agc ccc cgc ttt gtt gca ctc ttc act ctt ctt ctc ttc ctc aaa tgt 747 Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe Leu Lys Cys 100 105 110 115 ttc cac tgg ctg gct gag gac cgt gtg gac ttt atg gaa cgc agc ccc 795 Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu Arg Ser Pro 120 125 130 aac atc tcc tgg ctc ttt cac tgc cgc att gtc tct ctt atg ttc ctc 843 Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu Met Phe Leu 135 140 145 ctg ggc atc ctg gac ttc ctc ttc gtc agc cac gcc tat cac agc atc 891 Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr His Ser Ile 150 155 160 ctg acc cgt ggg gcc tct gtg cag ctg gtg ttt ggc ttt gag tat gcc 939 Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe Glu Tyr Ala 165 170 175 atc ctg atg acg atg gtg ctc acc atc ttc atc aag tat gtg ctg cac 987 Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr Val Leu His 180 185 190 195 tcc gtg gac ctc cag agt gag aac ccc tgg gac aac aag gct gtg tac 1035 Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys Ala Val Tyr 200 205 210 atg ctc tac aca gag ctg ttt aca ggc ttc atc aag gtt ctg ctg tac 1083 Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val Leu Leu Tyr 215 220 225 atg gcc ttc atg acc atc atg atc aag gtg cac acc ttc cca ctc 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ctatgaactt gctcgctggc ccacccctaa 2710 gactggtacc catttccttt tcttaccctg atctccccag aagcctcttg tggtggtggc 2770 tgtgccccct atgccctgtg gcatttctgc gtcttactgg caaccacaca actcagggaa 2830 aggaatgcct gggagtgggg gtgcaggcgg gcagcactga gggaccctgc cccgcccctc 2890 cccccaggcc cctttcccct gcagcttctc aagtgagact gacctgtctc acccagcagc 2950 cactgcccag ccgcactcca ggcaagggcc agtgcgcctg ctcctgacca ctgcaatccc 3010 agcgcccaag gaaggccact tctcaactgg cagaacttct gaagtttaga attggaatta 3070 cttccttact agtgtctttt ggcttaaatt ttgtcttttg aagttgaatg cttaatcccg 3130 ggaaagagga acaggagtgc cagactcctg gtctttccag tttagaaaag gctctgtgcc 3190 aaggagggac cacaggagct gggacctgcc tgcccctgtc ctttcccctt ggttttgtgt 3250 tacaagagtt gttggagaca gtttcagatg attatttaat ttgtaaatat tgtacaaatt 3310 ttaatagctt aaattgtata tacagccaaa taaaaacttg cattaacaaa aaaaaaaaaa 3370 aaaa 3374 <210> 5 <211> 617 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly 1 5 10 15 Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr 20 25 30 Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile 35 40 45 Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val 50 55 60 Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg 85 90 95 Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe 100 105 110 Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu 115 120 125 Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu 130 135 140 Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr 145 150 155 160 His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe 165 170 175 Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr 180 185 190 Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys 195 200 205 Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val 210 215 220 Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe 225 230 235 240 Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys 245 250 255 Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met 260 265 270 Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp 275 280 285 Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg 290 295 300 Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe 305 310 315 320 Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala 325 330 335 Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly 340 345 350 Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn 355 360 365 Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu 370 375 380 Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser 385 390 395 400 Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg 405 410 415 Pro Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala 420 425 430 Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala 435 440 445 Gly Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro 450 455 460 Leu Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly 465 470 475 480 Phe Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu 485 490 495 Arg Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr 500 505 510 Leu Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu 515 520 525 Ala Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu 530 535 540 Gly Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro 545 550 555 560 Ser Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro 565 570 575 Glu Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met 580 585 590 Pro Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu 595 600 605 Gln Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His 610 615 <210> 6 <211> 617 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly 1 5 10 15 Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr 20 25 30 Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile 35 40 45 Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val 50 55 60 Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg 85 90 95 Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe 100 105 110 Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu 115 120 125 Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu 130 135 140 Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr 145 150 155 160 His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe 165 170 175 Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr 180 185 190 Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys 195 200 205 Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val 210 215 220 Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe 225 230 235 240 Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys 245 250 255 Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met 260 265 270 Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp 275 280 285 Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg 290 295 300 Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe 305 310 315 320 Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala 325 330 335 Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly 340 345 350 Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn 355 360 365 Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu 370 375 380 Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser 385 390 395 400 Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg 405 410 415 Pro Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala 420 425 430 Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala 435 440 445 Gly Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro 450 455 460 Leu Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly 465 470 475 480 Phe Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu 485 490 495 Arg Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr 500 505 510 Leu Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu 515 520 525 Ala Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu 530 535 540 Gly Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro 545 550 555 560 Ser Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro 565 570 575 Glu Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met 580 585 590 Pro Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu 595 600 605 Gln Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His 610 615 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <400> 7 Asp Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg Leu Asp Cys Asn 20

Claims (53)

  1. 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 시험 화합물을 이용한 시노비올린의유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 방법:
    (a) 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질을 시험 화합물의 존재하에서 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계;
    (a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
    (a'') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질을 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후 기질의 유비 퀴틴화 레벨을 측정하는 단계; 및
    (c) 기질의 유비퀴틴화 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 유비퀴틴화 레벨과 다를 때, 시험 화합물의 시노비올린에 의한 기질의 유비퀴틴화 작용을 조절 하는 활성을 검출하는 단계(이때, 상기 기질은 프롤린 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
  2. 제 1항에 있어서, 하기 성분의 공존에 의하여 제공된 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 유비퀴틴 활성화 효소;
    (ii) 유비퀴틴 전이효소;
    (iii) 유비퀴틴; 및
    (iv) 아데노신 3 인산.
  3. 제 1항에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질을 발현하는 세포 내에서 유비퀴틴화에 의해 제공된 기질의 유비퀴틴화를 가능케 하는 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
  4. 제 1항에 있어서, 기질의 유비퀴틴화 레벨을 하기의 (A) 내지 (C) 레벨을 지표로서 측정하는 것을 포함하는 방법:
    (A) 유비퀴틴화된 기질의 레벨;
    (B) 유비퀴틴화되지 않았던 기질의 레벨; 및
    (C) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛의 생물학적 활성의 레벨.
  5. 제 1항에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화 될 수 있는 폴리펩티드;
    (d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드; 및
    (e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아 미노산 서열을 가지며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드.
  6. 제 1항에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 2에 기재 된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩 티드;
    (D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드; 및
    (E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아 미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티 드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드.
  7. 하기의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는, 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 가지는 시험 화합물의 스크리닝 방법:
    (a) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 시험 화합물의 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 단계; 및
    (b) 대조군과 비교하여 기질의 유비퀴틴화 레벨에 차이가 있는 시험 화합물을 선택하는 단계.
  8. 제 7항에 기재된 방법에 따라 얻을 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 시노비올린에 의한 기질의 유비퀴틴화 조절제.
  9. 하기의 (1) 및 (2) 성분을 포함하는, 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 키트:
    (1) 시노비올린 또는 그의 유사체; 및
    (2) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체.
  10. 하기의 (3) 내지 (6) 성분을 추가적으로 포함하는 제 9항에 기재된 키트:
    (3) 유비퀴틴 활성화 효소;
    (4) 유비퀴틴 전이효소;
    (5) 유비퀴틴; 및
    (6) 아데노신 3 인산.
  11. 시노비올린 또는 그의 유사체 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그 유도체를 발현하는 세포; 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체의 유비퀴틴화 레벨을 측정하는 방법을 포함하는 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하기 위한 키트.
  12. 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 시험 화합물을 이용한 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 방법:
    (a) 시험 화합물의 존재하에서 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계;
    (a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후 시노비올린과 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
    (a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후, 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨을 측정하는 단계; 및
    (c) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 결합 레벨과 다를 때, 시험 화합물의 시노비올린에 의한 기질의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성이 검출되는 단계(이때, 상기 기질은 프롤린 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
  13. 제 12항에 있어서, 시노비올린 및 기질 중 어느 하나가 고체상(solid phase)에 결합하는, 또는 고체상에 결합 가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드;
    (d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴 리펩티드이며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드; 및
    (e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드.
  15. 제 12항에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드;
    (D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드; 및
    (E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 포함하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 와 결합하는 폴리펩티드.
  16. 하기의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는, 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 가지는 시험 화합물의 스크리닝 방법:
    (a) 제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라, 시험 화합물을 이용한 시노비올린의 유비퀴틴화 작용을 조절하는 활성을 검출하는 단계; 및
    (b) 대조군과 비교하여, 시노비올린과 기질의 결합 레벨에 차이가 있는 시험 화합물을 선택하는 단계.
  17. 제 16항에 기재된 방법에 따라 얻을 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하 는, 시노비올린에 의한 기질의 유비퀴틴화 조절제.
  18. 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 화합물의 스크리닝 방법:
    (a) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을 시험 화합물의 존재하에서 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계;
    (a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나를 시험 화합물과 접촉한 후 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
    (a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후 기질의 유비 퀴틴화 레벨을 측정하는 단계; 및
    (c) 기질의 유비퀴틴화 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 유비퀴틴화 레벨보다 낮은 시험 화합물을 섬유증 치료 또는 예방하기 위한 화합물로서 선택하 는 단계(이때, 상기 기질은 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
  19. 제 18항에 있어서, 하기 성분의 공존에 의하여 제공된 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 유비퀴틴 활성화 효소;
    (ii) 유비퀴틴 전이효소;
    (iii) 유비퀴틴; 및
    (iv) 아데노신 3 인산.
  20. 제 18항에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질을 발현하는 세포 내에서 유비퀴틴화에 의해 제공된 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 기질의 유비퀴틴화 레벨을 하기의 (A) 내지 (C) 레벨을 지표로서 측정하는 것을 포함하는 방법:
    (A) 유비퀴틴화된 기질의 레벨;
    (B) 유비퀴틴화되지 않았던 기질의 레벨; 및
    (C) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛의 생물학적 활성의 레벨.
  22. 제 18항에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체는 하 기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드;
    (d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드; 및
    (e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드.
  23. 제 18항에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기 재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리 펩티드;
    (D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드; 및
    (E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드.
  24. 제 18항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 선택할 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 섬유증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성 물.
  25. 하기의 (1) 및 (2) 성분을 포함하는, 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 화합물의 스크리닝을 위한 키트:
    (1) 시노비올린 또는 그의 유사체; 및
    (2) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체.
  26. 하기의 (3) 내지 (6) 성분을 추가적으로 포함하는 제 25항에 기재된 키트:
    (3) 유비퀴틴 활성화 효소;
    (4) 유비퀴틴 전이효소;
    (5) 유비퀴틴; 및
    (6) 아데노신 3 인산.
  27. 시노비올린 또는 그의 유사체 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체를 발현하는 세포; 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체의 유비퀴틴화 레벨을 측정하기 위한 방법을 포함하는 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 시험 화합물의 스크리닝을 위한 키트.
  28. 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 화합물의 스크리닝 방법:
    (a) 시험 화합물의 존재하에서 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계;
    (a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후 시노비올린과 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
    (a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨을 측정하는 단계; 및
    (c) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 결합 레벨보다 낮은 시험 화합물을 섬유증 치료 또는 예방하기 위한 화합물로서 선택하는 단계(이때, 상기 기질은 프롤린 4 수산화 효소 α서브유닛 또 는 그의 유사체이다).
  29. 제 28항에 있어서, 시노비올린 및 기질 중 하나가 고체상(solid phase)에 결합하거나 또는 고체상에 결합 가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28항에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드;
    (d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴 리펩티드이며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드; 및
    (e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드.
  31. 제 28항에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드;
    (D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드; 및
    (E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드.
  32. 제 28항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 선택할 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 섬유증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성 물.
  33. 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방 하기 위한 화합물의 스크리닝 방법:
    (a) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을 시험 화합물의 존재하에서 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계;
    (a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
    (a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질을 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후 기질의 유비 퀴틴화 레벨을 측정하는 단계; 및
    (c) 기질의 유비퀴틴화 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 유비퀴틴화 레벨보다 낮은 시험 화합물을 류마티스성 관절염 치료 또는 예방하기 위한 화합물 로서 선택하는 단계(이때, 상기 기질은 프롤린 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
  34. 제 33항에 있어서, 하기 성분의 공존에 의하여 기질의 유비퀴틴화가 가능한조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 유비퀴틴 활성화 효소;
    (ii) 유비퀴틴 전이효소;
    (iii) 유비퀴틴; 및
    (iv) 아데노신 3 인산.
  35. 제 33항에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질을 발현하는 세포 내에서 유비퀴틴화에 의해 제공된 기질의 유비퀴틴화가 가능한 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 33항에 있어서, 기질의 유비퀴틴화 레벨을 하기의 (A) 내지 (C) 중 어느 하나의 레벨을 지표로서 측정하는 방법:
    (A) 유비퀴틴화된 기질의 레벨;
    (B) 유비퀴틴화되지 않았던 기질의 레벨; 및
    (C) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛의 생물학적 활성의 레벨.
  37. 제 33항에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드;
    (d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드; 및
    (e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 시노비올린에 의해 유비퀴틴화될 수 있는 폴리펩티드.
  38. 제 33항에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티 드;
    (D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드; 및
    (E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유비퀴틴화하는 활성을 가지는 폴리펩티드.
  39. 제 33항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 선택할 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 류마티스성 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
  40. 하기의 (1) 및 (2) 성분을 포함하는, 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방 하기 위한 화합물의 스크리닝을 위한 키트:
    (1) 시노비올린 또는 그의 유사체; 및
    (2) 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체.
  41. 제 39항에 있어서, 하기의 (3) 내지 (6) 성분을 추가적으로 포함하는 키트:
    (3) 유비퀴틴 활성화 효소;
    (4) 유비퀴틴 전이효소;
    (5) 유비퀴틴; 및
    (6) 아데노신 3 인산.
  42. 시노비올린 또는 그의 유사체 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체를 발현하는 세포; 및 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체의 유비퀴틴화 레벨을 측정하는 방법을 포함하는, 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 시험 화합물의 스크리닝을 위한 키트.
  43. 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방 하기 위한 화합물의 스크리닝 방법:
    (a) 시험 화합물의 존재하에서 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계;
    (a') 시노비올린 또는 그의 유사체 및 기질 중 어느 하나가 시험 화합물과 접촉한 후 시노비올린과 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양하는 단계; 또는
    (a'') 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질과의 결합이 가능한 조건에서 배양한 후 시험 화합물을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기의 단계 (a), (a') 및 (a'') 중 적어도 하나의 단계 후 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질의 결합 레벨을 측정하는 단계; 및
    (c) 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질의 결합 레벨이 시험 화합물 부재하에서 측정된 결합 레벨보다 낮은 시험 화합물을 류마티스성 관절염 치료 또는 예방하기 위한 화합물로서 선택하는 단계(이때, 상기 기질은 프롤린 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체이다).
  44. 제 43항에 있어서, 시노비올린 또는 기질 중 어느 하나가 고체상에 결합하거나 또는 고체상에 결합 가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 43항에 있어서, 프로릴 4 수산화 효소 α서브유닛 또는 그의 유사체는 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해, 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드;
    (d) 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드; 및
    (e) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미 노산 서열을 가지며, 시노비올린과 결합할 수 있는 폴리펩티드.
  46. 제 43항에 있어서, 시노비올린 또는 그의 유사체는 하기의 (A) 내지 (E) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (A) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    (B) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (C) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드;
    (D) 서열번호 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 하 이브리다이즈하며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드; 및
    (E) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드.
  47. 제 43항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 선택할 수 있는 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 류마티스성 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
  48. 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  49. 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결여, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩 티드가 제 1항의 방법에서 시험 화합물로 사용되었을 때, 기질의 유비퀴틴화 레벨이 폴리펩티드 부재하에서 측정된 유비퀴틴화 결합 레벨보다 낮은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  50. 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 아미노산이 치환,결여, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 제 12항에 기재된 방법에서 시험 화합물로서 사용되었을 때, 시노비올린 또는 그의 유사체와 기질의 결합 레벨이 폴리펩티드 부재하에서 측정된 결합 레벨보다 낮은 폴리펩티드.
  51. 제 48항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리 뉴클레오티드.
  52. 제 48항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는, 섬유증의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
  53. 제 48항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는, 류마티스성 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
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