ES2898340T3

ES2898340T3 - Composiciones y métodos para tratar neumopatías y lesión pulmonar

Info

Publication number: ES2898340T3
Application number: ES16822088T
Authority: ES
Inventors: Kuan-Ju Chen; Franziska Leifer; Vladimir Malinin; Walter Perkins; Jimin Zhang; Keith Dipetrillo
Original assignee: Insmed Inc
Current assignee: Insmed Inc
Priority date: 2015-07-09
Filing date: 2016-07-11
Publication date: 2022-03-07
Anticipated expiration: 2036-07-11
Also published as: JP2018519818A; EP3319976A4; AU2016291228A1; EP3319976A1; US20180200186A1; JP6884714B2; CA2989884A1; EP3319976B1; AU2020203367A1; AU2016291228B2; WO2017008076A1

Abstract

Una composición que comprende un compuesto de ácido nucleico complejado o encapsulado por una partícula lipídica; en donde la partícula lipídica comprende: (a) un lípido catiónico que comprende de 40% en moles a 58% en moles del lípido total presente en la composición; (b) un lípido neutro que comprende de 40% en moles a 50% en moles del lípido total presente en la composición; y (c) un lípido conjugado que comprende de 0,3% en moles a 1,5% en moles del lípido total presente en la composición, en donde el compuesto de ácido nucleico es un compuesto de interferencia de ARN (iARN) que elige como diana un ARN mensajero (ARNm) que codifica COL1A1 o anexina A11 (ANXA11), y en donde el lípido catiónico comprende 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP), el lípido neutro comprende una mezcla de i) un fosfolípido y ii) hemisuccinato de colesterol (CHEMS) o hemisuccinato de tocoferilo (THS), y el lípido conjugado comprende 1,2-dimiristoil-sn-glicerol-polietilenglicol 2000 (DMG-PEG2000).

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para tratar neumopatías y lesión pulmonar

REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente Solicitud reivindica el beneficio de la prioridad para la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 62/190.583, presentada el 9 de julio de 2015.

INDICACIÓN REFERENTE A LA LISTA DE SECUENCIAS

La Lista de secuencias asociada con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel, y de ese modo se incorpora por la presente mediante referencia en la memoria descriptiva. El nombre del archivo de texto que contiene la Lista de Secuencias es INMD_125_01WO_SeqList_ST25.txt. El archivo de texto tiene 19 kb, se creó el 7 de julio de 2016 y se envía electrónicamente a través de EFS-Web.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La interferencia de ARN (iARN) a través de ARNs interferentes pequeños (ARNssi) elige como diana ARN mensajero (ARNm) de un modo específico para la diana que permite que el silenciamiento del gen particular sea de un modo dirigido a la diana (véase la Figura 1 para una visión general). Aunque el mecanismo preciso sigue siendo poco claro, se cree que la iARN comienza con la escisión de ARNs bicatenarios más largos en ARNssi mediante una enzima tipo ARNasaIII, dicer. Los ARNssi son ARNs bicatenarios (ARN-ds) que tienen habitualmente una longitud de aproximadamente 17 a aproximadamente 30 pares de bases nucleotídicas (pbs), p. ej., de aproximadamente 20 a aproximadamente 27 pbs, o de aproximadamente 21 a aproximadamente 24 pbs y, en algunos casos, contienen solapamientos 3’ de dos nucleótidos y extremos fosfato 5' e hidroxilo 3'. Una cadena del ARNsi se incorpora en un complejo de ribonucleoproteína conocido como el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El RISC usa esta cadena de ARNsi para identificar moléculas de ARNm que son al menos parcialmente complementarias a la cadena de ARNsi incorporada, y a continuación escinde estos ARNsm o inhibe su traducción. La cadena de ARNsi que se incorpora en el RISC se conoce como la cadena de guía o la cadena antisentido. La otra cadena de ARNsi, conocida como la cadena de sentido, se elimina del ARNsi y es al menos parcialmente homóloga al ARNm diana. En el contexto de la presente solicitud, el término "iARN" o "ARNsi" también incluye ARNs de horquilla corta (ARNssh) y microARNs (miARNs).

Debido a que el ARNsi se puede diseñar contra cualquier diana de ARNm, las aplicaciones terapéuticas para estos compuestos son muy variadas. A pesar del potencial de los compuestos de ARNsi para ser clínicamente satisfactorios, existen obstáculos para su eficacia.

Los ARNsi son propensos a la digestión por nucleasas in vivo. Adicionalmente, las construcciones de ARNsi desnudo son limitadas en su capacidad para difundirse o ser transportadas a través de las membranas celulares. Por lo tanto, son necesarios sistemas de aporte de modo que el ARNsi pueda ser recogido. Aunque los vectores virales son capaces de expresar grandes cantidades de ARNssi de un modo eficaz, están repletos de problemas de toxicidad e inmunogenicidad. Por otra parte, la inyección de estos vectores no permite la elección como diana específica de ARNsi a nivel celular, por ejemplo, para combatir enfermedades asociadas con tipos de células y tejidos específicos.

El documento EP2199298 divulga una composición de nanopartículas que comprende un ácido nucleico de iARN, 2-60% en moles de un lípido catiónico, 5-90% en moles de un lípido neutro y 0,5-20% en moles de un lípido PEGilado. El lípido neutro puede ser una mezcla de fosfolípido y colesterol y la composición es para la inhalación al pulmón.

Como tales, son necesarios las composiciones y los métodos para aportar construcciones de ARNsi a tipos de células y tejidos específicos. La presente invención se orienta a esta y otras necesidades.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona composiciones que comprenden un compuesto de iARN complejado con o encapsulado por partículas lipídicas, en donde las composiciones muestran una captación eficaz y una reducción en la expresión y/o la actividad de ARNsm diana en diversas células pulmonares. La invención se define mediante las reivindicaciones.

La invención proporciona una composición que comprende un compuesto de ácido nucleico complejado o encapsulado por una partícula lipídica; en donde la partícula lipídica comprende: (a) un lípido catiónico que comprende de 40% en moles a 58% en moles del lípido total presente en la composición; (b) un lípido neutro que comprende de 40% en moles a 50% en moles del lípido total presente en la composición; (c) un lípido conjugado que comprende de 0,3% en moles a 1,5% en moles del lípido total presente en la composición; y características adicionales que se definen en la reivindicación 1.

La composición de la invención se podría formular como un polvo seco, una suspensión o una pulverización nebulizada. En algunas realizaciones, las composiciones pueden comprender además un propelente tal como un propelente hidrocarbonado.

La presente invención proporciona la composición reivindicada para el uso en el tratamiento de una fibrosis o sarcoidosis pulmonar en un paciente que lo necesite, comprendiendo el método administrar a los pulmones del paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones descritas en la presente.

Según un aspecto, la administración de las presentes composiciones regula a la baja la expresión y/o la actividad de un ARNm que se sobreexpresa en o está genéticamente ligado a la enfermedad o el trastorno pulmonar.

En la presente invención, el compuesto de iARN elige como diana un ARMm que codifica COL1A1 o anexina A11.

En una realización, la cantidad eficaz de la composición se administra a los pulmones del paciente a través de inhalación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 representa un método de acción de iARN y ARNsi. Adaptado de https://www.scbt.com/gene_silencers.html.

La Figura 2 muestra la captación de nanopartículas lipídicas de la invención en macrófagos y fibroblastos.

La Figura 3 muestra el efecto de diversas formulaciones lipídicas de ARNsi sobre la expresión de COL1A1.

La Figura 4 muestra la reducción específica para la diana en la expresión de COL1A1 usando formulaciones de nanopartículas lipídicas de ARNsi.

La Figura 5 muestra la reducción específica para la diana en la expresión de P4HA1 usando formulaciones de nanopartículas lipídicas de ARNsi.

La Figura 6 muestra la reducción específica para la diana en la expresión de ANXA11 usando formulaciones de nanopartículas lipídicas de ARNsi.

La Figura 7 muestra la captación de nanopartículas lipídicas en macrófagos y fibroblastos bajo microscopio de fluorescencia.

La Figura 8 muestra un esquema de inducción de fibrosis pulmonar en un modelo en ratones in vivo de sarcoidosis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que el tratamiento de trastornos pulmonares localizados se puede producir a través de la elección como diana de células fagocíticas pulmonares en una inflamación o una infección, a través de un aporte por inhalación de composiciones de nanopartículas lipídicas de iARN a pacientes que lo necesiten.

La fagocitosis es una forma específica de endocitosis que implica la internalización vascular de sólidos tales como bacterias y residuos celulares. La presente invención aprovecha la capacidad del sistema inmunitario para fagocitar partículas como un vehículo de aporte de fármacos, al proporcionar composiciones a base de lípidos que comprenden liposomas o nanopartículas lipídicas que están diseñadas para ser recogidas por uno o más fagocitos asociados con daño tisular o infección (p. ej., macrófago, fibroblasto). Tras el aporte a través de inhalación y la captación, las composiciones aportan los compuestos de ácido nucleico a las células y regulan la expresión o la actividad de uno o más ARNs mensajeros (ARNsm) diana.

Los fagocitos de seres humanos y otros animales se denominan "profesionales" o "no profesionales" dependiendo de cuán eficaces sean en la fagocitosis. Los fagocitos profesionales incluyen muchos tipos de glóbulos blancos tales como neutrófilos, monocitos, macrófagos, mastocitos, eosinófilos, basófilos y células dendríticas. Aunque la fagocitosis es un elemento crucial de la defensa del anfitrión contra sustancias extrañas, según se proporciona anteriormente, la respuesta también puede estar asociada con daño tisular al anfitrión.

Por ejemplo, los neutrófilos son un tipo de células fagocíticas que están implicadas en la inducción de la inflamación por estallido respiratorio y desgranulación mediados por receptores. La desgranulación se ha relacionado como un factor en trastornos pulmonares, artritis reumatoide y choque séptico. La desgranulación de neutrófilos depende de la activación de rutas de señalización intracelulares, que pueden ser selectivas y dependen de rutas de señalización no redundantes >Lacy 2006, Allergy Asthma, Clin. Immuno. 2(3):98-108).

En pacientes con fibrosis quística (CF), los neutrófilos representan aproximadamente el setenta por ciento de la población de células inflamatorias en el líquido de revestimiento epitelial (ELF), en comparación con aproximadamente uno por ciento de la población de células inflamatorias en el pulmón normal (Kelly y cols., 1998, Expert Opin. Ther. Targets 12, pp. 145-157). Se ha mostrado que los neutrófilos son ineficaces en la depuración de bacterias y representan un papel principal en la destrucción de la matriz estructural del pulmón, por ejemplo, mediante la secreción de proteasas que escinden y destruyen proteínas del pulmón. Según esto, la inhibición de la función de los neutrófilos en zonas enfermas podría proporcionar una terapia eficaz en paciente con CF.

Los fagocitos pulmonares, p. ej., monocitos y fibroblastos pulmonares, representan un papel importante en la curación de heridas, así como la depuración de microorganismos invasores. Sin embargo, la respuesta descontrolada o desregulada de estas células también puede conducir a un desarrollo final de trastornos pulmonares tales como fibrosis y/o sarcoidosis pulmonares. La fibrosis pulmonar es una enfermedad pulmonar que es refractaria a tratamiento y supone una alta tasa de mortalidad. Incluye un grupo heterogéneo de trastornos pulmonares caracterizados por la destrucción progresiva e irreversible de la arquitectura pulmonar producida por la formación de cicatrices que finalmente conduce a mal funcionamiento del órgano, alteración del intercambio de gases y muerte por insuficiencia respiratoria. La fibrosis pulmonar idiopática (IPF), una forma particularmente grave de fibrosis pulmonar con etiología desconocida, tiene una esperanza de vida de 2-6 años después del diagnóstico (Wynn, JEM, 208 (7): 1339-1350, 2011; incorporado mediante referencia en la presente en su totalidad). La fibrosis pulmonar también se puede desarrollar después de infecciones virales y después de una exposición a radioterapia, fármacos quimioterapéuticos y toxinas ambientales aerosolizadas. También se presenta en algunos receptores de trasplante de médula ósea que sufren la enfermedad del injerto contra el anfitrión crónica y en un subgrupo de individuos con enfermedades inflamatorias crónicas como esclerodermia y artritis reumatoide. Actualmente, el único tratamiento eficaz disponible para la fibrosis pulmonar progresiva es el trasplante de pulmón. La reparación de tejidos dañados es un mecanismo biológico fundamental que permite la sustitución ordenada de células muertas o dañadas después de la lesión, un proceso críticamente importante para la supervivencia. Sin embargo, si este proceso se desregula, puede conducir al desarrollo de una “cicatriz” fibrótica permanente, que se caracteriza por la acumulación excesiva de componentes de la matriz extracelular (ECM) (p. ej., ácido hialurónico, fibronectina, proteoglicanos y colágenos intersticiales) en la zona de lesión tisular. Por consiguiente, la fibrosis o fibrogénesis se define a menudo como una respuesta de curación de heridas fuera de control.

La presente invención proporciona en una realización una composición de ARNsi que inhibe la respuesta descontrolada o desregulada de un macrófago o fibroblasto en un paciente con fibrosis pulmonar, p. ej., un paciente con IPF. Por ejemplo, en una realización, la composición de ARNsi comprende un ARNsi que elige como diana diversos tipos de colágenos y/o enzimas de síntesis de colágeno, según se analiza con más detalle posteriormente. En otra realización, la composición de ARNsi comprende un ARNsi de citocina o receptor de citocina, según se analiza con más detalle posteriormente.

La reparación de heridas tiene cuatro estadios distintos que incluyen una fase de solidificación/coagulación, una fase inflamatoria, una fase de migración/proliferación de fibroblastos y una fase de remodelación final en la que se restaura la arquitectura tisular normal. En los estadios iniciales después del daño tisular, las células epiteliales y/o las células endoteliales liberan mediadores inflamatorios que inician una cascada antifibrinolítica-de coagulación que desencadena la solidificación y el desarrollo de una ECM provisional. La agregación de plaquetas y la posterior desgranulación promueve a su vez la dilatación de los vasos sanguíneos y un incremento de la permeabilidad, permitiendo una incorporación eficaz de células inflamatorias (p. ej., neutrófilos, macrófagos, linfocitos y eosinófilos) a la zona de la lesión. Los neutrófilos son la célula inflamatoria más abundante en los estadios iniciales de la curación de heridas, pero rápidamente son reemplazados por macrófagos después de la desgranulación de neutrófilos. Durante esta fase de migración de leucocitos inicial, macrófagos y neutrófilos activados desbridan la herida y eliminan cualesquiera organismos invasores. También producen una variedad de citocinas y quimiocinas que amplifican la respuesta inflamatoria y desencadenan la proliferación y la incorporación de fibroblastos. Los miofibroblastos se incorporan a partir de una variedad de fuentes incluyendo células mesenquimales locales, progenitores de la médula ósea (llamados fibrocitos) y a través de un proceso llamado transmisión epitelial-mesenquimal (EMT), en el que células epiteliales se transdiferencian en células fibroblastoides. Una vez que los fibroblastos se activan, se transforman en miofibroblastos que expresan actina del músculo liso a que secretan componentes de la ECM. Finalmente, en la fase de maduración/remodelación de la herida, los miofibroblastos promueven la contracción de la herida, un proceso en el que los bordes de la herida migran hacia el centro y las células epiteliales/endoteliales se dividen y migran sobre la matriz temporal para regenerar el tejido dañado. La fibrosis se desarrolla cuando la herida es grave, el irritante que daña el tejido persiste o cuando el proceso de reparación se desregula. Así, muchos estadios en el proceso de reparación de heridas pueden ir mal y contribuir a la formación de cicatrices, lo que explica probablemente la naturaleza compleja de la fibrosis pulmonar. Algunos de los mecanismos que representan un papel en el desarrollo de la fibrosis pulmonar se analizan en Wynn, JEM, 208(7): 1339-1350, 2011; y Todd y cois., Fibrogenesis & Tissue Repair, 2012, 5(11); ambos de los cuales se incorporan mediante referencia en la presente en su totalidad.

La sarcoidosis es un trastorno inmunitario multisistémico, que da como resultado la formación de granulomas epiteloides en todo el cuerpo, particularmente dentro de los pulmones, los ojos y la piel. Los sistemas inmunitarios de individuos afectados exhiben cambios significativos en los números de células y la señalización celular, con un incremento en células T positivas a CD3 y CD4 en los pulmones. También se ha mostrado que las células T activadas dentro de pulmones sarcoideos sobreexpresan varios receptores de citocinas, incluyendo el receptor de interleucina-^{2 (IL-2R), y producen un incremento en las cantidades de citocinas, incluyendo interleucina-2 e interferón-}Y ^(IFNy^{) .}Además, los monocitos y macrófagos están fuertemente implicados en la formación de granulomas sarcoideos y también secretan una gama de citocinas que potencian adicionalmente la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, los ^{macrófagos alveolares secretan factor de necrosis tumoral}a ^(TNFa^{) e interleucina-15, que se ha mostrado que inducen}la proliferación de células T. Como tal, la presente invención proporciona un tratamiento para la sarcoidosis a través de la inhalación de una composición de ARNsi que puede ser recogida por monocitos y macrófagos presentes en pulmones sarcoideos.

Las composiciones de ARNsi proporcionadas en la presente son composiciones de nanopartículas lipídicas que protegen al ARNsi de la digestión por nucleasas, y permiten una captación eficaz por fagocitos pulmonares. La nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico, un lípido neutro y un lípido conjugado tal como un lípido PEGilado.

Las composiciones proporcionadas por la presente invención comprenden un compuesto de iARN complejado a o encapsulado por una partícula lipídica, en donde el compuesto de iARN elige como diana un ARNm cuyo producto proteínico correspondiente representa un papel importante en la patogénesis de una enfermedad/trastorno pulmonar que es fibrosis o sarcoidosis pulmonar. En una realización, las composiciones proporcionadas por la presente invención comprenden un compuesto de iARN complejado a o encapsulado por una partícula lipídica, en donde el compuesto de iARN elige como diana un ARNm que se sobreexpresa en una enfermedad/trastorno pulmonar. En otra realización, las composiciones proporcionadas por la presente invención comprenden un compuesto de iARN complejado a o encapsulado por una partícula lipídica, en donde el compuesto de iARN elige como diana un ARNm cuyo gen correspondiente tiene un polimorfismo nucleotídico que está genéticamente ligado a una enfermedad/trastorno pulmonar, p. ej. anexina A11.

En una realización, las composiciones proporcionadas por la presente invención comprenden un compuesto de iARN complejado a o encapsulado por una partícula lipídica, en donde el compuesto de iARN elige como diana un ARNm cuya función proteínica correspondiente está asociada con una respuesta celular fagocítica, por ejemplo una respuesta inflamatoria, desgranulación de un gránulo en un granulocito (p. ej., desgranulación de neutrófilos), o incorporación de una célula inmunitaria o un granulocito a una zona de infección pulmonar (quimiotaxis). En otra realización, las composiciones proporcionadas por la presente invención comprenden un compuesto de iARN complejado a o encapsulado por una partícula lipídica, en donde el compuesto de iARN elige como diana un ARNm cuya función proteínica correspondiente está asociada con una respuesta fibroblástica, por ejemplo, síntesis de componentes de la ECM tales como colágeno.

Las composiciones proporcionadas por la presente invención comprenden un compuesto de iARN que elige como diana un ARNm implicado en la síntesis de colágeno (a saber, el COL1A1) y/o un ARNm cuyo gen correspondiente tiene un polimorfismo nucleotídico que está genéticamente ligado a una enfermedad/trastorno pulmonar (a saber anexina A11).

Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de la composición es una cantidad del compuesto de ácido nucleico tal como un ARN interferente, o una composición que comprende el mismo, que sea suficiente para producir el efecto deseado, p. ej., una inhibición de la expresión de una secuencia diana en comparación con el nivel de expresión normal detectado en ausencia de un ARN interferente. La inhibición de la expresión de un gen diana o una secuencia diana se alcanza cuando el valor obtenido con un ARN interferente con relación al control es aproximadamente 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o 0%. Ensayos adecuados para medir la expresión de un gen diana o una secuencia diana incluyen, p. ej., el examen de los niveles de proteína o ARN usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica tales como transferencias por puntos, transferencias Northern, hibridación in situ, ELISA, inmunoprecipitación, función enzimática, así como ensayos fenotípicos conocidos por los expertos en la técnica.

Según se usa en la presente, "complejado o encapsulado por una partícula lipídica" se refiere a una partícula lipídica que proporciona un compuesto de ácido nucleico (p. ej., un ARN interferente), con encapsulación total, encapsulación parcial o ambas, o una partícula lipídica que está complejada o aglomerada con el compuesto de ácido nucleico.

El término "lípido conjugado" se refiere a un lípido que está acoplado a un resto no lipídico. Estos lípidos conjugados incluyen, pero no se limitan a, oligómeros de poliamida (p. ej., conjugados de ATTA-lípido), conjugados de PEG-lípido, tales como PEG acoplado a dialquiloxipropilos, PEG acoplado a diacilgliceroles, PEG acoplado a colesterol, PEG acoplado a fosfatidiletanolaminas, PEG conjugado a ceramidas (véase, p. ej., la Pat. EE. UU. N° 5.885.613), lípidos de PEG catiónicos, y sus mezclas. El PEG se puede conjugar directamente al lípido o se puede ligar al lípido a través de un resto enlazador. Se puede usar cualquier resto enlazador adecuado para acoplar el PEG a un lípido, incluyendo, p. ej., restos enlazadores que no contienen éster y restos enlazadores que contienen éster. Según invención, el lípido conjugado comprende DMG-PEG2000.

El término "lípido neutro" se refiere a una especie lipídica que existe en una forma bien no cargada o bien dipolar neutra a un pH seleccionado. A pH fisiológico, estos lípidos incluyen, por ejemplo, fosfolípidos tales como diacilfosfatidilcolina y diacilfosfatidiletanolamina, y otros lípidos tales como ceramida, esfingomielina, cefalina, colesterol, tocoferoles, cerebrósidos y diacilgliceroles. Según la invención, el lípido neutro comprende una mezcla de i) un fosfolípido y ii) hemisuccinato de colesterol (CHEMS) o hemisuccinato de tocoferilo (THS).

El término "lípido no catiónico" se refiere a cualquier lípido anfipático, así como cualquier otro lípido neutro o lípido aniónico. El término "lípido no catiónico" incluye fosfolípidos, colesterol, tocoferoles, y sus derivados.

El término "lípido catiónico" se refiere a cualquiera de un número de especies lipídicas que soportan una carga positiva neta a un pH seleccionado, tal como pH fisiológico (p. ej., pH de aproximadamente 7,0). Se ha encontrado sorprendentemente que los lípidos catiónicos que comprenden cadenas alquílicas con múltiples centros de insaturación, p. ej., al menos dos o tres centros de insaturación, son particularmente útiles para formar partículas lipídicas con una fluidez membranaria incrementada. Un número de lípidos catiónicos y análogos relacionados, que también son útiles en la presente invención, se han descrito en las Publicaciones de Patente de EE. UU. N° 20060083780 y 20060240554; las Pat. EE. UU. N2 5.208.036, 5.264.618, 5.279.833, 5.283.185, 5.753,613 y 5.785.992; y la Publicación PCT N° WO 96/10390. Según la invención, el lípido catiónico comprende 1,2-dioleoil-3-dimetilamoniopropano (DODAP).

Partículas lipídicas

La presente invención proporciona composiciones que comprenden un compuesto de ácido nucleico complejado o encapsulado por una partícula lipídica y dichas composiciones para el uso en el tratamiento o la mejora de una o más fibrosis o sarcoidosis pulmonar.

La partícula lipídica de la composición comprende un lípido catiónico, un lípido neutro y un lípido conjugado. La partícula lipídica de la composición comprende (a) un lípido catiónico que comprende de 40% en moles a 58% en moles del lípido total presente en la composición; (b) un lípido neutro que comprende de 40% en moles a 50% en moles del lípido total presente en la composición; (c) un lípido conjugado que comprende de 0,3% en moles a 1,5% en moles del lípido total presente en la composición; que se definen adicionalmente en la reivindicación 1.

El lípido neutro comprende o consiste en una mezcla de i) un fosfolípido y ii) hemisuccinato de colesterol o hemisuccinato de tocoferol.

En diversas realizaciones, el lípido catiónico comprende uno o más de los lípidos catiónicos descritos en las Patentes EE. UU. N°: 7.341.738, 8.058.069, 9.006.417 y 9.139.554. Sin querer limitarse por una teoría, se cree que el uso de lípido catiónico facilita la condensación de compuestos de iARN en partículas, debido a las interacciones electrostáticas entre el iARN cargado negativamente y los lípidos cargados positivamente.

Según la invención, el lípido catiónico comprende 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP).

En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende uno o más de los siguientes lípidos catiónicos: 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C2-DMA; "XTC2"), 2,2-dilinoleil-4-(3-dimetilaminopropil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C3-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(4-dimetilaminobutil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C4-DMA), 2,2-dilinoleil-5-dimetilaminometil-[1,3]-dioxano (DLin-K6-DMA), 2,2-dilinoleil-4-N-metilpepiacino-[1,3]-dioxolano (DLin-K-MPZ), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 1,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleiloxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleiloxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1 -linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloruro de 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperacino)propano (DLin-MPZ), 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2 propanodiol (DOAP), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetilaminopropano (DSDMA), cloruro de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1 -(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (Do TAP), 3-(N--(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil)colesterol (DC-Col), bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE), trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermino-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano (CLinDMA), 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil-1-(cis,cis-9',1-2'-octadecadienoxi)propano (CpLinDMA), N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina (Dm OBA), 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DOcarbDAP), 1,2-N,N'-dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DLincarbDAP), o sus mezclas.

En otras realizaciones, el lípido catiónico comprende uno o más de los siguientes lípidos catiónicos: MC3, LenMC3, CP-LenMC3, Y-LenMC3, CP-Y-LenMC3, MC3MC, MC2MC, éter de MC3, éter de MC4, MC3-amida, Pan-MC3, Pan-MC4, Pan MC5 descritos en la Patente de EE. UU. N° 9.006.417, o sus mezclas. La síntesis de estos lípidos también se describe en la Patente de EE. UU. N° 9.006.417.

En una realización, un lípido catiónico incluye sales amónicas de ácidos grasos, fosfolípidos y glicéridos. Los ácidos grasos incluyen ácidos grasos de longitudes de la cadena de carbonos de 12 a 26 átomos de carbono que bien son saturados o bien son insaturados. Algunos ejemplos específicos incluyen: miristilamina, palmitilamina, laurilamina y estearilamina, dilauroiletilfosfocolina (DLEP), dimiristoiletilfosfocolina (DMEP), dipalmitoiletilfosfocolina (DPEP) y diestearoiletilfosfocolina (DSEP), cloruro de N-(2,3-di-(9-(Z)-octadeceniloxi)-prop-1-il-N,N,N-trimetilamio (DOTMA), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) y 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilammonio)propano (DOTAP).

Muchos de estos lípidos catiónicos están disponibles comercialmente. Por ejemplo, DODAP está disponible comercialmente de Avanti Polar Lipids. Adicionalmente, la síntesis de lípidos catiónicos tales como DLin-K-C2-DMA ("XTC2"), DLin-K-C3-DMA, DLin-K-C4-DMA, DLin-K6-DMA y DLin-K-MPZ, así como lípidos catiónicos adicionales, se describe en la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 61/104.212, presentada el 9 de octubre de 2008. La síntesis de lípidos catiónicos tales como DLin-K-DMA, DLin-C-DAP, DLin-DAC, DLin-MA, DLinDAP, DLin-S-DMA, DLin-2-DMAP, DLin-TMA.Cl, DLin-TAP.Cl, DLin-MPZ, DLinAP, DOAP y DLin-EG-DMA, así como lípidos catiónicos adicionales, se describe en la Solicitud pCt N° PCT/US08/88676, presentada el 31 de diciembre de 2008. La síntesis de lípidos catiónicos tales como CLinDMA, así como lípidos catiónicos adicionales, se describe en la Publicación de Patente de EE. UU. N220060240554.

En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende de aproximadamente 45 a aproximadamente 50% en moles, incluyendo valores y subintervalos intermedios, del lípido total presente en la composición.

En algunas otras realizaciones más, el lípido catiónico comprende de 40 a aproximadamente 55% en moles, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50% en moles o de aproximadamente 40 a 45% en moles, incluyendo valores y subintervalos intermedios, del lípido total presente en la composición.

En algunas otras realizaciones más, el lípido catiónico comprende de aproximadamente 45 a aproximadamente 55% en moles, o de aproximadamente 45 a aproximadamente 50% en moles, incluyendo valores y subintervalos intermedios, del lípido total presente en la composición.

En una realización particular, el lípido catiónico comprende de aproximadamente 55 a aproximadamente 58% en moles, tal como de aproximadamente 55, 55,1,55,2, 55,3, 55,4, 55,5, 55,6, 55,7, 55,8, 55,9, 56, 56,1,56,2, 56,3, 56,4, 56,5, 56,6, 56,7, 56,8, 56,9, 57, 57,1, 57,2, 57,3, 57,4, 57,5, 57,6, 57,7, 57,8, 57,9 o 58% en moles, del lípido total presente en la composición. En una realización ejemplar, el lípido catiónico es DODAP y está presente en una cantidad de aproximadamente 55 a aproximadamente 58% en moles del lípido total presente en la composición. En otra realización ejemplar, DODAP está presente en una cantidad de aproximadamente 57,1% en moles del lípido total presente en la composición.

En otra realización particular, el lípido catiónico comprende de aproximadamente 48 a aproximadamente 52% en moles, tal como aproximadamente 48, 48,5, 49, 49,5, 50, 50,5, 51,51,5 o 52% en moles, del lípido total presente en la composición. En una realización ejemplar, el lípido catiónico es DODAP y está presente en una cantidad de aproximadamente 48 a aproximadamente 52% en moles del lípido total presente en la composición. En otra realización ejemplar, DODAP está presente en una cantidad de aproximadamente 50% en moles del lípido total presente en la composición.

En una realización, el lípido catiónico está presente en una cantidad de aproximadamente 50% en moles, del lípido total presente en la composición. En otra realización, el lípido catiónico está presente en una cantidad de aproximadamente 57% en moles, del lípido total presente en la composición.

En algunas realizaciones, el lípido catiónico está presente en una cantidad de aproximadamente 45% en moles o aproximadamente 57,1% en moles del lípido total presente en la composición.

Según la invención, un lípido neutro comprende de 40% en moles a 50% en moles, incluyendo valores y subintervalos intermedios, del lípido total presente en la composición. Según la invención, el lípido neutro presente en las composiciones de la invención comprende una mezcla de uno o más lípidos neutros. Lípidos neutros incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos tales como fosfatidilcolinas y fosfatidiletanolaminas, ceramida, esfingomielina, cefalina, esteroles tales como colesterol o sus derivados, tocoferoles (p. ej. fenoles metilados muchos de los cuales tienen actividad de vitamina E) o sus derivados, cerebrósido y diacilgliceroles. Según la invención, una mezcla de i) un fosfolípido y ii) hemisuccinato de colesterol o hemisuccinato de tocoferilo está presente como el lípido neutro.

En una realización particular, el tocoferol es a-tocoferol o uno de sus derivados (p. ej. hemisuccinato de a-tocoferol). Según la invención, el lípido neutro está presente en una cantidad de 40 a 50% en moles, del lípido total presente en la composición.

En una realización, el lípido neutro comprende de aproximadamente 40 a aproximadamente 42% en moles, incluyendo valores intermedios, tales como aproximadamente 40, 40,1, 40,2, 40,3, 40,4, 40,4, 40,5, 40,6, 40,7, 40,8, 40,9, 41, 41,1,41,2, 41,3, 41,4, 41,5, 41,6, 41,7, 41,8, 41,9 o 42% en moles, del lípido total presente en la composición. En una realización, el lípido neutro comprende o consiste en una mezcla de un fosfolípido y CHEMS o THS y la mezcla comprende de aproximadamente 40 a aproximadamente 42% en moles, incluyendo valores intermedios, del lípido total presente en la composición.

En algunas otras realizaciones, el lípido neutro está presente en una cantidad de aproximadamente 41 a aproximadamente 43% en moles, tal como aproximadamente 41, 41,1,41,2, 41,3, 41,4, 41,5, 41,6, 41,7, 41,8, 41,9, 42, 42,1,42,2, 42,3, 42,4, 42,5, 42,6, 42,7, 42,8, 42,9 o aproximadamente 43% en moles, del lípido total presente en la composición.

En otra realización, el lípido neutro comprende o consiste en una mezcla de un fosfolípido y un derivado de colesterol o tocoferol según se reivindica, y la mezcla comprende de aproximadamente 47 a aproximadamente 50% en moles, incluyendo valores intermedios, tales como aproximadamente 47, 47,1,47,2, 47,3, 47,4, 47,5, 47,6, 47,7, 47,8, 47,9, 48, 48,1,48,2, 48,3, 48,4, 48,5, 48,6, 48,7, 48,8, 48,9, 49, 49,1,49,2, 49,3, 49,4, 49,5, 49,6, 49,7, 49,8, 49,9 o 50% en moles, del lípido total presente en la composición. En una realización ejemplar, el lípido neutro comprende o consiste en una mezcla de un fosfolípido y un derivado de colesterol tal como hemisuccinato de colesterol (CHEMS), y la mezcla comprende de aproximadamente 47 a aproximadamente 50% en moles, incluyendo valores intermedios, del lípido total presente en la composición. En otra realización ejemplar, el lípido neutro comprende o consiste en una mezcla de un fosfolípido y un derivado de tocoferol tal como hemisuccinato de tocoferol (THS), y la mezcla comprende de aproximadamente 47 a aproximadamente 50% en moles, incluyendo valores intermedios, del lípido total presente en la composición.

En una realización, el lípido neutro está presente en una cantidad de aproximadamente 41,4% en moles, del lípido total presente en la composición. En otra realización, el lípido neutro está presente en una cantidad de aproximadamente 42,5% en moles, del lípido total presente en la composición. En algunas otras realizaciones más, el lípido neutro está presente en una cantidad de aproximadamente 49% en moles, del lípido total presente en la composición.

En una realización ejemplar, la partícula lipídica de la composición comprende un lípido catiónico, un fosfolípido, CHEMS y un lípido conjugado. En otra realización ejemplar, la partícula lipídica de la composición comprende un lípido catiónico, un fosfolípido, THS y un lípido conjugado. En otra realización ejemplar más, la partícula lipídica de la composición comprende un lípido catiónico, un fosfolípido, a-THS y un lípido conjugado.

Fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolina (PC), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), fosfatidiletanolamina (PE) y ácido fosfatídico (PA). En una realización, el fosfolípido es un fosfolípido de huevo, un fosfolípido de soja o un fosfolípido de huevo y soja hidrogenado. En una realización, el fosfolípido comprende enlaces éster de ácidos grasos en las posiciones 2 y 3 de glicerol que contienen cadenas de 12 a 26 átomos de carbono y diferentes grupos de cabeza en la posición 1 del glicerol que incluyen colina, glicerol, inositol, serina, etanolamina, así como los ácidos fosfatídicos correspondientes. Las cadenas de estos ácidos grasos pueden ser saturadas o insaturadas, y el fosfolípido puede estar constituido por ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena y diferentes grados de insaturación. En ciertas realizaciones, el fosfolípido comprende diestearoilfosfoetanolamina (DSPE), dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfoetanolamina (DPPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), palmitoilestearoilfosfatidilcolina (PSPC), difosfatidilglicerol (DPG), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG), o sus mezclas.

En una realización particular, el fosfolípido es una fosfatidilcolina (PC) o fosfatidiletanolamina (PE). En ciertas realizaciones, la fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina se selecciona del grupo que consiste en diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) o diestearoilfosfoetanolamina (DSPE).

En diversas realizaciones, el fosfolípido comprende de aproximadamente 4% en moles a aproximadamente 20% en moles, incluyendo valores y subintervalos intermedios, del lípido total presente en la composición. En algunas realizaciones, el fosfolípido comprende de aproximadamente 4 a aproximadamente 17% en moles, de aproximadamente 4 a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12% en moles, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8% en moles, de aproximadamente 7 a aproximadamente 17% en moles, de aproximadamente 7 a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 7 a aproximadamente 12% en moles, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 10 a aproximadamente 17% en moles, de aproximadamente 12 a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 12 a aproximadamente 18% en moles, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 15 a aproximadamente 18% en moles o de aproximadamente 15 a aproximadamente 17% en moles, incluyendo valores y subintervalos intermedios, del lípido total presente en la composición.

En diversas realizaciones, el fosfolípido comprende de aproximadamente 4 a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 4 a aproximadamente 10% en moles, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20% en moles o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20% en moles, del lípido total presente en la composición.

En una realización, el fosfolípido comprende de aproximadamente 4 a aproximadamente 8% en moles, incluyendo valores intermedios, tales como aproximadamente 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 u 8% en moles, del lípido total presente en la composición. En otra realización, el fosfolípido comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 17% en moles, incluyendo valores intermedios, tales como aproximadamente 15, 15,1, 15,2, 15,3, 15,4, 15,5, 15,6, 15,7, 15,8, 15,9, 16, 16,1, 16,2, 16,3, 16,4, 16,5, 16,6, 16,7, 16,8, 16,9 o 17% en moles, del lípido total presente en la composición. En otra realización más, el fosfolípido comprende de aproximadamente 4 a aproximadamente 17% en moles, incluyendo valores intermedios, tales como aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 16,5% en moles, del lípido total presente en la composición.

En algunas realizaciones, las partículas lipídicas de las composiciones comprenden o consisten en una mezcla de fosfolípidos. En estas realizaciones, los fosfolípidos comprenden aproximadamente 75, 80, 85, 90, 95 o aproximadamente 100% en moles, incluyendo valores intermedios, del lípido total presente en la composición. En una realización ejemplar, la partícula lipídica comprende aproximadamente 60, 70 u 80% en moles de fosfolípido 1 y aproximadamente 40, 30 o 20% en moles de fosfolípido 2. Por ejemplo, en una realización, las partículas lipídicas comprenden o consisten en aproximadamente 60, 65, 70, 75 u 80% en moles de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(dodecanilo) (NA-DOPE) y aproximadamente 40, 35, 30, 25 o 20% en moles de DOPC.

En algunas realizaciones, las partículas lipídicas de la invención incluyen esteroles. Los esteroles para el uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, colesterol, ésteres de colesterol incluyendo hemisuccinato de colesterol, sales de colesterol incluyendo hidrogenosulfato de colesterol y sulfato de colesterol, ergosterol, ésteres de ergosterol incluyendo hemisuccinato de ergosterol, sales de ergosterol incluyendo hidrogenosulfato de ergosterol y sulfato de ergosterol, lanosterol, ésteres de lanosterol incluyendo hemisulfato de lanosterol, sales de lanosterol incluyendo hidrogenosulfato de lanosterol y sulfato de lanosterol. Una variedad de esteroles y sus derivados hidrosolubles tales como hemisuccinato de colesterol se han usado para formar liposomas; véase, p. ej., la Patente de EE. UU. N° 4.721.612.

En algunas realizaciones, las partículas lipídicas de la invención incluyen fenoles metilados, tales como tocoferoles. En una realización, las partículas lipídicas incluyen fenoles metilados con actividad de vitamina E, p. ej. a-tocoferol. Los tocoferoles para el uso con la invención incluyen tocoferoles, ésteres de tocoferoles incluyendo hemisuccinatos de tocoferol (p. ej. hemisuccinato de a-tocoferol), sales de tocoferoles incluyendo hidrogenosulfatos de tocoferol y sulfatos de tocoferol. La Publicación PCT N° WO 85/00968 describe un método para reducir la toxicidad de fármacos al encapsularlos en liposomas que comprenden a-tocoferol y ciertos de sus derivados. Además, una variedad de tocoferoles y sus derivados hidrosolubles se han usado para formar liposomas, véase la Publicación PCT N° 87/02219. Los métodos descritos en estas publicaciones son aptos para el uso en la presente.

En una realización particular, el esterol usado en las partículas lipídicas de la invención es hemisuccinato de colesterol (CHEMS). En otra realización particular, el tocoferol usado en las partículas lipídicas de la invención es hemisuccinato de tocoferol (THS). En otra realización particular más, las partículas lipídicas de la invención pueden incluir una mezcla de CHEMS y THS.

En diversas realizaciones, un esterol, un tocoferol, o uno de sus derivados, comprende de aproximadamente 25% en moles a aproximadamente 45% en moles, incluyendo valores e intervalos intermedios, del lípido total presente en la composición. En algunas realizaciones, el esterol, el tocoferol o uno de sus derivados comprende de aproximadamente 25 a aproximadamente 40% en moles, de aproximadamente 25 a aproximadamente 35% en moles, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30% en moles, de aproximadamente 30 a aproximadamente 45% en moles, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40% en moles, de aproximadamente 30 a aproximadamente 35% en moles, de aproximadamente 35 a aproximadamente 45% en moles o de aproximadamente 35 a aproximadamente 40% en moles, incluyendo valores e intervalos intermedios, del lípido total presente en la composición. En ciertas realizaciones, el esterol, el tocoferol o uno de sus derivados comprende de aproximadamente 34 a aproximadamente 45% en moles o de aproximadamente 34 a aproximadamente 39% en moles, incluyendo valores e intervalos intermedios, del lípido total presente en la composición. Según la invención, la partícula lipídica comprende de 40% en moles a 50% en moles de un lípido neutro que comprende i) un fosfolípido y ii) CHEMS o THS. Los valores que se encuentren fuera del intervalo reivindicado no son parte de la invención.

En una realización, el colesterol, el tocoferol, el CHEMS o el THS comprende de aproximadamente 25% en moles a aproximadamente 45% en moles, incluyendo valores e intervalos intermedios, del lípido total presente en la composición. En algunas realizaciones, el colesterol, el tocoferol, el CHEMS o el THS comprende de aproximadamente 25 a aproximadamente 40% en moles, de aproximadamente 25 a aproximadamente 35% en moles, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30% en moles, de aproximadamente 30 a aproximadamente 45% en moles, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40% en moles, de aproximadamente 30 a aproximadamente 35% en moles, de aproximadamente 35 a aproximadamente 45% en moles o de aproximadamente 35 a aproximadamente 40% en moles, incluyendo valores e intervalos intermedios, del lípido total presente en la composición. En ciertas realizaciones, el colesterol, el tocoferol, el CHEMS o el THS comprende de aproximadamente 34 a aproximadamente 45% en moles o de aproximadamente 34 a aproximadamente 39% en moles, incluyendo valores e intervalos intermedios, del lípido total presente en la composición.

En una realización ejemplar, el colesterol, el tocoferol, el CHEMS o el THS comprende aproximadamente 34,1,34,2, 34.3, 34,4, 34,5, 34,6, 34,7, 34,8, 34,9, 35, 35,1, 35,2, 35,3, 35,4, 35,5, 35,6, 35,7, 35,8, 35,9, 36, 36,1, 36,2, 36,3, 36.4, 36,5, 36,6, 36,7, 36,8, 36,9, 37, 37,1, 37,2, 37,3, 37,4, 37,5, 37,6, 37,7, 37,8, 37,9, 38, 38,1, 38,2, 38,3, 38,4, 38.5, 38,6, 38,7, 38,8, 38,9 o 39% en moles, del lípido total presente en la composición. En otra realización ejemplar, el colesterol, el tocoferol, el CHEMS o el THS comprende aproximadamente 25, 34,3, 34,4, 35,4, 38,5 o 45% en moles, del lípido total presente en la composición.

Las partículas lipídicas de las composiciones incluyen además un lípido conjugado. En una realización, el lípido conjugado es un lípido PEGilado. El lípido PEGilado, en una realización, comprende PEG400-PEG5000. Por ejemplo, el lípido PEGilado puede comprender PEG400, PEG500, PEG1000, PEG2000, PEG3000, PEG4000 o PEG5000. En una realización adicional, el componente lipídico del lípido PEGilado comprende colesterol, dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfoetanolamina (DPPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), el glicerol dimiristoilglicerol (DMG), difosfatidilglicerol (DPG) o diestearoilglicerol (DSG). En algunas realizaciones, el lípido PEGilado es DMG-PEG2000, colesterol-PEG2000 o DSPE-PEG2000. Según la invención, el lípido conjugado comprende DMG-PEG2000. Las partículas lipídicas que no comprenden DMG-PEG2000 no forman parte de la invención.

Dependiendo de su peso molecular (PM), el PEG también se denomina en la técnica poli(óxido de etileno) (PEO) o polioxietileno (POE). El lípido PEGilado puede incluir una molécula de PEG ramificada o no ramificada, y no está limitado por un PM del PEG particular. Por ejemplo, el lípido PEGilado, en una realización, comprende una molécula de PEG que tiene un peso molecular de 300 g/mol, 400 g/mol, 500 g/mol, 1000 g/mol, 1500 g/mol, 2000 g/mol, 2500 g/mol, 3000 g/mol, 3500 g/mol, 4000 g/mol, 4500 g/mol, 5000 g/mol o 10,000 g/mol. Según la invención, el PEG tiene un p M de 2000 g/mol.

El lípido conjugado, por ejemplo, el lípido PEGilado, puede tener una carga neta (p. ej., catiónica o aniónica), o puede ser netamente neutro. Los lípidos usados en el componente de lípido PEGilado de la presente invención pueden ser un lípido sintético, semisintético o presente en la naturaleza, incluyendo un fosfolípido, un esfingolípido, un glicolípido, una ceramida, un tocoferol, un esterol, un ácido graso o una glicoproteína tal como albúmina. En una realización, el lípido es un esterol. En una realización adicional, el esterol es colesterol. En otra realización, el lípido es un fosfolípido descrito en la presente. En diversas realizaciones, el lípido PEGilado de la composición proporcionada en la presente comprende diestearoilfosfoetanolamina (DSPE), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfoetanolamina (DPPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dimiristoilglicerol (DMG), difosfatidilglicerol (DPG) o diestearoilglicerol (DSG). Según la invención, el lípido conjugado comprende DMG-PEG2000. Las partículas lipídicas que no comprenden DMG-PEG2000 no forman parte de la invención.

Según la invención, el lípido conjugado comprende un lípido conjugado a polietilenglicol (PEG). El conjugado de PEG-lípido es PEG-1,2-dimiristoil-sn-glicerol (PEG-DMG) y tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2000 daltons.

Según la invención, el lípido conjugado comprende de 0,3% en moles a 1,5% en moles, tal como aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5% en moles, del lípido total presente en la composición. En algunas realizaciones, el lípido conjugado comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,5% en moles, tal como aproximadamente 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 o aproximadamente 1,5% en moles, del lípido total presente en la composición. Según la invención, el lípido conjugado comprende DMG-PEG2000.

En ciertas realizaciones, la partícula lipídica de la composición comprende (a) un lípido catiónico (p. ej. DODAP) que comprende de aproximadamente 50% en moles a aproximadamente 57,5% en moles del lípido total presente en la composición; (b) un fosfolípido (p. ej., DSPC, DOPC, DSPE) que comprende de aproximadamente 4% en moles a aproximadamente 16,5% en moles del lípido total presente en la composición; (c) hemisuccinato de colesterol (CHEMS) o hemisuccinato de tocoferol (THS) que comprende de aproximadamente 25% en moles a aproximadamente 45% en moles, del lípido total presente en la composición; y (d) un lípido conjugado (p. ej. DMG-PEG2000) que comprende de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 1,5% en moles del lípido total presente en la composición.

En algunas realizaciones, la partícula lipídica de la composición comprende (a) un lípido catiónico (p. ej. DODAP) que comprende de aproximadamente 50% en moles a aproximadamente 57,5% en moles del lípido total presente en la composición; (b) un fosfolípido (p. ej., DSPC, DOPC, DSPE) que comprende de aproximadamente 4% en moles a aproximadamente 16,5% en moles del lípido total presente en la composición; (c) hemisuccinato de colesterol (CHEMS) o hemisuccinato de tocoferol (THS) que comprende de aproximadamente 34% en moles a aproximadamente 45% en moles, del lípido total presente en la composición; y (d) un lípido conjugado (p. ej. DMG-PEG2000) que comprende de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 1,5% en moles del lípido total presente en la composición.

En algunas otras realizaciones, la partícula lipídica de la composición comprende (a) un lípido catiónico (p. ej. DODAP) que comprende de aproximadamente 50% en moles a aproximadamente 57,5% en moles del lípido total presente en la composición; (b) un fosfolípido (p. ej., DSPC, DOPC, DSPE) que comprende de aproximadamente 4% en moles a aproximadamente 16,5% en moles del lípido total presente en la composición; (c) hemisuccinato de colesterol (CHEMS) o hemisuccinato de tocoferol (THS) que comprende de aproximadamente 34% en moles a aproximadamente 39% en moles, del lípido total presente en la composición; y (d) un lípido conjugado (p. ej. DMG-PEG2000) que comprende de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 1,5% en moles del lípido total presente en la composición.

En algunas otras realizaciones más, la partícula lipídica de la composición comprende (a) un lípido catiónico (p. ej. DODAP) que comprende de aproximadamente 50% en moles a aproximadamente 57,5% en moles del lípido total presente en la composición; (b) un fosfolípido (p. ej., DSPC, DOPC, DSPE) que comprende de aproximadamente 4% en moles a aproximadamente 16,5% en moles del lípido total presente en la composición; (c) hemisuccinato de colesterol (CHEMS) o hemisuccinato de tocoferol (THS) que comprende aproximadamente 34,3% en moles del lípido total presente en la composición; y (d) un lípido conjugado (p. ej. DMG-PEG2000) que comprende de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 1,5% en moles del lípido total presente en la composición.

En algunas otras realizaciones más, la partícula lipídica de la composición comprende (a) un lípido catiónico (p. ej. DODAP) que comprende de aproximadamente 50% en moles a aproximadamente 57,5% en moles del lípido total presente en la composición; (b) un fosfolípido (p. ej., DSPC, DOPC, DSPE) que comprende de aproximadamente 4% en moles a aproximadamente 16,5% en moles del lípido total presente en la composición; (c) hemisuccinato de colesterol (CHEMS) o hemisuccinato de tocoferol (THS) que comprende aproximadamente 25% en moles del lípido total presente en la composición; y (d) un lípido conjugado (p. ej. DMG-PEG2000) que comprende de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 1,5% en moles del lípido total presente en la composición.

En algunas otras realizaciones más, la partícula lipídica de la composición comprende (a) un lípido catiónico (p. ej. DODAP) que comprende de aproximadamente 50% en moles a aproximadamente 57,5% en moles del lípido total presente en la composición; (b) un fosfolípido (p. ej., DSPC, DOPC, DSPE) que comprende de aproximadamente 4% en moles a aproximadamente 16,5% en moles del lípido total presente en la composición; (c) hemisuccinato de colesterol (CHEMS) o hemisuccinato de tocoferol (THS) que comprende aproximadamente 45% en moles del lípido total presente en la composición; y (d) un lípido conjugado (p. ej. DMG-PEG2000) que comprende de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 1,5% en moles del lípido total presente en la composición.

En algunas realizaciones, las composiciones y/o las partículas lipídicas de la invención están libres de lípidos aniónicos (lípido cargado negativamente). Sin embargo, si está presente un lípido aniónico, estos lípidos incluyen fosfatidilgliceroles (PGs), ácidos fosfatídicos (PAs), fosfatidilinositoles (Pis) y las fosfatidilserinas (PSs). Ejemplos incluyen DMPG, DPPG, DSPG, DMPA, DPP A, DSP A, DMPI, DPPI, DSPI, DMPS, DPPS y DSPS.

Las composiciones proporcionadas en la presente incluyen un compuesto de iARN, complejado a, o encapsulado por, un componente lipídico o una partícula lipídica. Un compuesto de iARN está "complejado" a un lípido o un componente lipídico o una partícula lipídica y describe cualquier composición, solución o suspensión en la que al menos aproximadamente 1% en peso del compuesto de iARN esté asociado (p. ej., encapsulado o unido) con el lípido como parte de un complejo, por ejemplo, como parte de una micropartícula, nanopartícula, micela o liposoma. El complejo, en una realización, está formado por una o más interacciones electrostáticas, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno o mediante la encapsulación del compuesto de iARN por el lípido, p. ej., en una micela o un liposoma. Por ejemplo, la composición complejada a lípido, en una realización, comprende una pluralidad de liposomas, y el compuesto de iARN puede estar en fase acuosa (encapsulado por el liposoma), la fase de bicapa hidrófoba, en la región del grupo de cabeza interfacial de la bicapa liposómica o una de sus combinaciones. En una realización, antes de la administración de la composición a un paciente que lo necesite, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95% del compuesto de iARN en la composición es lípido complejado. La asociación, en una realización, se mide mediante separación a través de un filtro en el que se retiene el lípido y el fármaco asociado a lípido (es decir, en el retenido) y el fármaco libre está en el filtrado.

En una realización, la partícula lipídica está complejada a un compuesto de iARN. El complejo, en una realización, es una micropartícula, nanopartícula, micela o liposoma, o una de sus combinaciones.

En una realización, el complejo lipídico es un liposoma o una pluralidad de liposomas, y el compuesto de iARN está asociado con la superficie del liposoma, o está presente en el interior acuoso del liposoma (o la pluralidad de liposomas). Los liposomas son membranas de bicapa lipídica completamente cerradas que contienen un volumen acuoso atrapado. Los liposomas pueden ser vesículas unilaminares (que poseen una sola bicapa membranaria) o vesículas multilaminares (estructuras tipo cebolla caracterizadas por múltiples bicapas membranarias, cada una separada de la siguiente por una capa acuosa) o una de sus combinaciones. La bicapa está compuesta por dos monocapas lipídicas que tienen una región de "cola" hidrófoba y una región de "cabeza" hidrófila. La estructura de la bicapa membranaria es tal que las “colas” (no polares) hidrófobas de las monocapas lipídicas se orientan hacia el centro de la bicapa mientras que las "cabezas" hidrófilas se orientan hacia la fase acuosa.

En una realización, cuando se formulan conjuntamente, el compuesto de iARN y el componente lipídico forman una pluralidad de partículas lipídicas (p. ej., micropartículas o nanopartículas). En una realización, el diámetro medio de la pluralidad de partículas lipídicas es de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 2 pm, por ejemplo, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 1 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1 pm, de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 600 nm o de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 500 nm.

En una realización de partículas lipídicas, el compuesto de iARN (p. ej., uno o más ARNssi, uno o más ARNsh, uno o más miARNs, o una de sus combinaciones) está presente en la composición en 5% en moles - 99% en moles. En una realización adicional, el compuesto está presente en la composición en 40% en moles - 95% en moles. En una realización adicional, el compuesto de ARNsi está presente en la composición en 40% en moles - 60% en moles. En una realización, el compuesto de ARNsi está presente en la composición en aproximadamente 40% en moles o aproximadamente 45% en moles.

En algunas realizaciones, las composiciones, los sistemas y los métodos proporcionados en la presente comprenden un compuesto de iARN complejado a lípido o encapsulado en liposoma. Los lípidos usados en las composiciones farmacéuticas de la presente invención que se proporcionan en cualquier parte pueden ser lípidos sintéticos, semisintéticos o presentes en la naturaleza. Según se proporciona anteriormente, cuando se emplean compuestos de iARN, los lípidos catiónicos se pueden complejar a los mismos a través de interacciones electrostáticas.

En una realización, la composición puede incluir dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), un constituyente principal de un tensioactivo pulmonar presente en la naturaleza.

Sin querer limitarse por una teoría, las micropartículas, nanopartículas o liposomas lipídicos, que contienen lípidos tales como lípidos catiónicos y fosfatidilcolinas, ayudan en la captación del compuesto de iARN por las células en el pulmón (p. ej., neutrófilos, macrófagos y fibroblastos) y ayuda a mantener el compuesto de iARN en el pulmón.

Las partículas lipídicas de la presente invención en las que un ARN interferente está complejado o totalmente o parcialmente encapsulado en una partícula lipídica se pueden formar mediante cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero no limitado a, un método de mezcladura continua o un procedimiento de dilución directa. Métodos ejemplares para producir partículas lipídicas se divulgan en la Patente de EE. UU. N° 8.058.069.

Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las partículas lipídicas de la presente invención se producen a través de un método de mezcladura continua, p. ej., un procedimiento que incluye proporcionar una solución acuosa que comprende un ácido nucleico tal como un ARN interferente en un primer depósito, proporcionar una solución orgánica lipídica en un segundo depósito y mezclar la solución acuosa con la solución orgánica lipídica de modo que la solución orgánica lipídica se mezcle con la solución acuosa a fin de producir de forma sustancialmente instantánea un liposoma que encapsula el ácido nucleico (p. ej., ARN interferente). Este procedimiento y el aparato para llevar a cabo este procedimiento se describen con detalle en la Publicación de Patente de EE. UU. N° 20040142025.

La acción de introducir continuamente soluciones lipídicas tamponadora en un entorno de mezcladura, tal como en una cámara de mezcladura, provoca una dilución continua de la solución lipídica con la solución tamponadora, produciendo de ese modo un liposoma de forma sustancialmente instantánea tras la mezcladura. Según se usa en la presente, la expresión "diluir continuamente una solución lipídica con una solución tamponadora" (y variaciones) significa generalmente que la solución lipídica se diluye de forma suficientemente rápida en un proceso de hidratación con suficiente fuerza para efectuar la generación de vesículas. Al mezclar la solución acuosa que comprende un ácido nucleico con la solución orgánica lipídica, la solución orgánica lipídica sufre una dilución por etapas continua en presencia de la solución tamponadora (es decir, solución acuosa) para producir una partícula de ácido nucleico-lípido.

Las partículas lipídicas formadas usando el método de mezcladura continua tienen típicamente un tamaño de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm o de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm. Las partículas así formadas no se agregan y opcionalmente se dimensionan para alcanzar un tamaño de partícula uniforme.

En otra realización, las partículas lipídicas de la presente invención se producen a través de un procedimiento de dilución directa que incluye formar una solución liposómica e inmediatamente y directamente introducir la solución liposómica en un recipiente de recogida que contiene una cantidad controlada de tampón de dilución. En aspectos preferidos, el recipiente de recogida incluye uno o más elementos configurados para agitar el contenido del recipiente de recogida para facilitar la dilución. En un aspecto, la cantidad de tampón de dilución presente en el recipiente de recogida es sustancialmente igual al volumen de solución liposómica introducido en el mismo. Como un ejemplo no limitativo, una solución liposómica en etanol al 45% cuando se introduce en el recipiente de recogida que contiene un volumen igual de tampón de dilución dará ventajosamente partículas más pequeñas.

En otra realización más, las partículas lipídicas de la presente invención se producen a través de un procedimiento de dilución en el que un tercer depósito que contiene tampón de dilución está acoplado hidráulicamente a una segunda región de mezcladura. En esta realización, la solución liposómica formada en una primera región de mezcladura se mezcla inmediatamente y directamente con tampón de dilución en la segunda región de mezcladura. En aspectos preferidos, la segunda región de mezcladura incluye un conector en T dispuesto de modo que los flujos de solución liposómica y tampón de dilución se encuentren como flujos de 180° opuestos; sin embargo, se pueden usar conectores que proporcionen ángulos más planos, p. ej., de aproximadamente 27° a aproximadamente 180°. Un mecanismo de bombeo aporta un flujo controlable de tampón a la segunda región de mezcladura. En un aspecto, el caudal de tampón de dilución proporcionado a la segunda región de mezcladura se controla para que sea sustancialmente igual al caudal de solución liposómica introducido en la misma desde la primera región de mezcladura. Esta realización permite ventajosamente más control del flujo de tampón de dilución que se mezcla con la solución liposómica en la segunda región de mezcladura, y por lo tanto también la concentración de solución liposómica en tampón a lo largo del segundo procedimiento de mezcladura. Este control del caudal de tampón de dilución permite ventajosamente la formación de partículas de pequeño tamaño a concentraciones reducidas.

Estos procedimientos y los aparatos para llevar a cabo estos procedimientos de dilución directa se describen con detalle en la Publicación de Patente de EE. UU. N° 20070042031.

Las partículas lipídicas formadas usando el procedimiento de dilución directa tienen típicamente un tamaño de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm o de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm. Las partículas así formadas no se agregan y opcionalmente se dimensionan para alcanzar un tamaño de partícula uniforme.

Si es necesario, las partículas lipídicas de la invención se pueden dimensionar mediante cualquiera de los métodos disponibles para dimensionar liposomas. El dimensionamiento se puede efectuar a fin de alcanzar un intervalo de tamaños deseado y una distribución relativamente estrecha de los tamaños de partícula.

Están disponibles varias técnicas para dimensionar las partículas hasta un tamaño deseado. Un método de dimensionamiento, usado para liposomas e igualmente aplicable a las presentes partículas, se describe en la Pat. EE. UU. N° 4.737.323. Someter a ultrasonidos a una suspensión de partículas bien mediante un baño o bien mediante ultrasonidos con sonda produce una reducción de tamaño progresiva hasta partículas de un tamaño de menos de aproximadamente 50 nm. La homogeneización es otro método que se basa en la energía de cizalladura para fragmentar partículas mayores en otras más pequeñas. En un procedimiento de homogeneización típico, las partículas se recirculan a través de un homogeneizador de emulsiones estándar hasta que se observan tamaños de partícula seleccionados, típicamente entre aproximadamente 60 y aproximadamente 80 nm. En ambos métodos, la distribución de tamaños de partícula se puede comprobar mediante discriminación del tamaño de partícula por rayos láser convencional, o QELS.

La extrusión de las partículas a través de una membrana de policarbonato de poros pequeños o una membrana cerámica asimétrica también es un método eficaz para reducir tamaños de partícula hasta una distribución de tamaños relativamente bien definida. Típicamente, la suspensión se somete a ciclos a través de la membrana una y otra vez hasta que se alcanza la distribución de tamaños de partícula deseada. Las partículas se pueden extruir a través de membranas de poros sucesivamente menores, para alcanzar una reducción gradual en el tamaño.

En algunas realizaciones, los compuestos de iARN en la composición se precondensan según se describe, p. ej., en la solicitud de patente de EE. UU. N° Ser. 09/744.103.

En otras realizaciones, los métodos comprenderán además añadir policationes no lipídicos que sean útiles para efectuar la lipofección de células usando las presentes composiciones. Ejemplos de policationes no lipídicos adecuados incluyen bromuro de hexadimetrina (vendido bajo el nombre comercial POLYBRENE RTM, de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis., EE. UU. de A.) u otras sales de hexadimetrina. Otros policationes adecuados incluyen, por ejemplo, sales de poli-L-ornitina, poli-L-arginina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, polialilamina y polietilenimina. La adición de estas sales es preferiblemente después de que se hayan formado las partículas.

Los liposomas se pueden producir mediante una variedad de métodos y la presente invención no se limita a un tipo particular de métodos de fabricación liposómica. En una realización, uno o más de los métodos descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2008/0089927 o el documento WO 2013/177226 se usan en la presente para producir las composiciones lipídicas con compuesto de iARN encapsulado (dispersión liposómica).

En una realización, la composición liposómica se forma al disolver uno o más lípidos en un disolvente orgánico formando una solución lipídica, y el coacervado de ARNsi se forma a partir de la mezcladura de una solución acuosa del ARNsi con la solución lipídica. En una realización adicional, el disolvente orgánico es etanol. En una realización adicional más, el uno o más lípidos comprenden un fosfolípido y un esterol o un tocoferol. El fosfolípido, en una realización, en netamente neutro o netamente catiónico.

En una realización, los liposomas se producen mediante ultrasonidos, extrusión, homogeneización, hinchamiento, electroformación, emulsión invertida o un método de evaporación inversa. El procedimiento de Bangham (J. Mol. Biol. (1965)) produce vesículas multilaminares normales (MLVs). Lenk y cols. (Patentes de EE. UU. N° 4.522.803, 5.030.453 y 5.169.637), Fountain y cols. (Patente de EE. UU. N° 4.588.578) y Cullis y cols. (Patente de EE. UU. N° 4.975.282) divulgan métodos para producir liposomas multilaminares que tienen una distribución de soluto interlaminar sustancialmente igual en cada uno de sus compartimentos acuosos. La Patente de EE. UU. N° 4.235.871 divulga la preparación de liposomas oligolaminares mediante evaporación en fase inversa. Cada uno de los métodos es apto para el uso con la presente invención.

Se pueden producir vesículas unilaminares a partir de MLVs mediante un número de técnicas, por ejemplo, las técnicas de extrusión de la Patente de EE. UU. N° 5.008.050 y la Patente de EE. UU. N° 5.059.421. También se pueden usar así ultrasonidos y homogeneización para producir liposomas unilaminares más pequeños a partir de liposomas más grandes (véanse, por ejemplo, Paphadjopoulos y cols. (1968); Deamer y Uster (1983); y Chapman y cols. (1968).

La preparación liposómica de Bangham y cols. (J. Mol. Biol. 13, 1965, pp. 238-252) implica suspender fosfolípidos en un disolvente orgánico que a continuación se evapora hasta sequedad dejando una película fosfolipídica sobre el recipiente de reacción. Posteriormente, se añade una cantidad apropiada de fase acuosa, se deja que la mezcla 60 se "hinche" y los liposomas resultantes que consisten en vesículas multilaminares (MLVs) se dispersan por medios mecánicos. Esta preparación proporciona la base para el desarrollo de las pequeñas vesículas unilaminares sometidas a ultrasonidos descritas por Papahadjopoulos y cols. (Biochim. Biophys. Acta. 135, 1967, pp. 624-638) y vesículas unilaminares grandes.

Técnicas para producir vesículas unilaminares grandes (LUVs), tales como evaporación en fase inversa, procedimientos de infusión y dilución con detergente, se pueden usar para producir liposomas para el uso en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente. Una revisión de estos y otros métodos para liposomas se pueden encontrar en el texto Liposomes, Marc Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1983, Capítulo 1. Véase también Szoka, Jr. y cols., (Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 1980, p. 467).

Otras técnicas para elaborar liposomas aptas para elaborar las composiciones descritas en la presente incluyen las que forman vesículas por evaporación en fase inversa (REV), véase, p.ej. la Patente de EE. UU. N° 4.235.871. Otra clase de liposomas que se puede usar se caracteriza por tener una distribución de soluto laminar sustancialmente igual. Esta clase de liposomas se denomina vesículas plurilaminares estables (SPLV) según se define en la Patente de EE. UU. N° 4.522.803, e incluye vesículas monofásicas como las descritas en la Patente de EE. UU. N° 4.588.578, y vesículas multilaminares congeladas y descongeladas (FATMLV) como las descritas anteriormente.

La composición, en una realización, comprende una pluralidad de partículas lipídicas con un diámetro medio que se mide mediante un método de dispersión de luz de aproximadamente 0,005 micras a aproximadamente 3,0 micras, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 pm a aproximadamente 1,0 pm. En una realización, el diámetro medio de la pluralidad de partículas en la composición es de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 2 pm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 1,5 pm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 1 pm, de 50 nm a aproximadamente 900 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 500 nm. En otra realización, el diámetro medio de la pluralidad de partículas en la composición es de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,8 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,7 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,6 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,5 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,4 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,3 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,2 pm o de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,1 pm.

La pluralidad de partículas lipídicas, en una realización, comprende una pluralidad de liposomas. En una realización, la pluralidad de liposomas tiene un diámetro medio que se mide mediante un método de dispersión de luz de aproximadamente 0,01 micras a aproximadamente 3,0 micras, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1,0 micras. En una realización, el diámetro medio de la pluralidad de liposomas en la composición es de aproximadamente 150 nm a aproximadamente 2 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,9 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,8 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,7 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,6 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,5 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,4 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,3 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,2 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1,1 pm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1 pm, 200 nm a aproximadamente 900 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 500 nm.

A fin de minimizar el volumen de la dosis y reducir el tiempo de dosificación al paciente, en una realización, es importante que el atrapamiento liposómico o la complejación del componente lipídico al compuesto de iARN sea muy eficaz y que la relación de lípido a compuesto de iARN esté en un valor tan bajo como sea posible. En una realización, la relación en peso del componente lipídico al compuesto de iARN es 2 a 1 ("componente lipídico a compuesto de iARN" o "componente lipídico:compuesto de iARN") o menor (p. ej., de aproximadamente 2:1,0 a aproximadamente 0,01:1,0, o de aproximadamente 2:1,0 a aproximadamente 0,1:1,0). En otra realización, la relación en peso del componente lipídico al compuesto de iARN es 1,5 a 1,0 ("componente lipídico a compuesto de iARN" o "componente lipídico:compuesto de iARN") o menor (p. ej., de aproximadamente 1,5:1,0 a aproximadamente 0,01:1,0 o de aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 0,1:1,0). En otra realización, la relación en peso del componente lipídico al compuesto de iARN es 1,0 a 1,0 ("componente lipídico a compuesto de iARN" o "componente lipídico:compuesto de iARN") o menor (p. ej., de aproximadamente 1,0:1,0 a aproximadamente 0,01:1,0 o de aproximadamente 1,0:1,0 a aproximadamente 0,1:1,0) o de aproximadamente 1,0:1,0 a aproximadamente 0,5:1,0.

En algunas realizaciones, las relaciones del compuesto de iARN al lípido (relaciones masa/masa) en la composición variarán de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,2, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,1, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 0,1 o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,08. La relación de las materias primas también se encuentra dentro de este intervalo. En otras realizaciones, la preparación usa aproximadamente 400 pg de ácido nucleico por 10 mg de lípido total o una relación en masa de ácido nucleico a lípido de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,08 y, más preferiblemente, aproximadamente 0,04, que corresponde a 1,25 mg de lípido total por 50 pg de ácido nucleico. En otras realizaciones preferidas, la partícula tiene una relación en masa de ácido nucleico:lípido de aproximadamente 0,08.

En otras realizaciones, las relaciones (relaciones masa/masa) del lípido al compuesto de iARN en la composición variarán de aproximadamente 1 (1:1) a aproximadamente 100 (100:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente 100 (100:1), de aproximadamente 1 (1:1) a aproximadamente 50 (50:1), de aproximadamente 2 (2:1) a aproximadamente 50 (50:1), de aproximadamente 3 (3:1) a aproximadamente 50 (50:1), de aproximadamente 4 (4:1) a aproximadamente 50 (50:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente 50 (50:1), de aproximadamente 1 (1:1) a aproximadamente 25 (25:1), de aproximadamente 2 (2:1) a aproximadamente 25 (25:1), de aproximadamente 3 (3:1) a aproximadamente 25 (25:1), de aproximadamente 4 (4:1) a aproximadamente 25 (25:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente 25 (25:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente 20 (20:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente 15 (15:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente 10 (10:1), aproximadamente 5 (5:1), 6 (6:1), 7 (7:1), 8 (8:1), 9 (9:1), (10:1), 11 (11:1) 12 (12:1), 13 (13:1), 14 (14:1) o 15 (15:1). La relación de las materias primas también se encuentra dentro de este intervalo.

La composición, en una realización, comprende una pluralidad de micropartículas o nanopartículas que comprenden uno o más de los compuestos de iARN (p. ej., ARNsi, ARNsh o miARN) que se describen en la presente complejados a un componente lipídico, y un aditivo hidrófobo. En una realización, el aditivo hidrófobo (p. ej., un aditivo que es al menos parcialmente hidrófobo) es un hidrocarburo, un compuesto terpénico o un lípido hidrófobo (p. ej., tocoferol, acetato de tocoferol, esterol, éster esterólico, éster alquílico, acetato de vitamina A, un triglicérido, un fosfolípido). El hidrocarburo puede ser aromático, un alcano, alqueno, cicloalcano o un alquino. En una realización, el hidrocarburo es un alcano (es decir, un hidrocarburo saturado). En otra realización, el hidrocarburo es un hidrocarburo C¹⁵-C⁵⁰. En una realización adicional, el hidrocarburo es un hidrocarburo C¹⁵, C²⁰, C²⁵, C³⁰, C³⁵, C⁴⁰, C⁴⁵o C⁵⁰. En otra realización más, el aditivo hidrófobo es un hidrocarburo C¹⁵-C²⁵, un hidrocarburo C¹⁵-C³⁵, un hidrocarburo C¹⁵-C⁴⁵, un hidrocarburo C¹⁵-C²⁰, un hidrocarburo C²⁰-C²⁵, un hidrocarburo C²⁵-C³⁰, un hidrocarburo C³⁰-C³⁵, un hidrocarburo C³⁵-C⁴⁰, un hidrocarburo C⁴⁰-C⁴⁵o un hidrocarburo C⁴⁵-C⁵⁰.

El aditivo hidrófobo, cuando esté presente en la composición, en una realización, está presente en 25% en moles -50% en moles, por ejemplo, 30% en moles - 50% en moles, 35% en moles - 45% en moles. En una realización adicional más, el aditivo hidrófobo está presente en la composición en aproximadamente 40% en moles o aproximadamente 45% en moles.

En una realización, se proporciona una composición que comprende un compuesto de iARN (p. ej., uno o más ARNssi, uno o más ARNssh, uno o más miARNs, o una de sus combinaciones), un componente lipídico y un compuesto terpénico (p. ej., el aditivo hidrófobo). La composición, en una realización adicional, comprende un lípido catiónico, p. ej., un lípido catiónico PEGilado, como el componente lipídico. El compuesto terpénico (aditivo hidrófobo), en una realización, es un hidrocarburo (p. ej., isopreno, escualano o escualeno). En otra realización, el compuesto terpénico es un hemiterpeno (C⁵H⁸), monoterpeno (C¹⁰H¹⁶), sesquiterpeno (C¹⁵H²⁴), diterpeno (C²⁰H³²) (p. ej., cafestol, kahweol, cembreno, taxadieno), sesterterpeno (C²⁵H⁴⁰), triterpeno (C³⁰H⁴⁸), sescuaterpeno (C³⁵H⁵⁶), tetraterpeno (C⁴⁰H⁶⁴), politerpeno (p. ej., un poliisopreno con dobles enlaces trans) o un norisoprenoide (p. ej., 3-oxo-a-ionol, derivados de 7,8-dihidroionona). El compuesto terpénico, en otra realización, se selecciona de uno de los compuestos proporcionados en la Tabla 3, posteriormente. En una realización, el aditivo hidrófobo es escualano.

Compuestos de iARN y sus dianas

El término "ARN interferente" o "iARN" o "secuencia de ARN interferente" se refiere a ARN monocatenario (p. ej., miARN maduro) o ARN bicatenario (es decir, ARN doble tal como ARNsi, ARNai o pre-miARN) que es capaz de reducir o inhibir la expresión de un gen o una secuencia diana (p. ej., al mediar en la degradación o inhibir la traducción de ARNsm que sean complementarios con la secuencia de ARN interferente). Así, ARN interferente se refiere al ARN monocatenario que es complementario a una secuencia de ARNm diana o al ARN bicatenario formado por dos cadenas complementarias o por una sola cadena autocomplementaria. El ARN interferente puede tener identidad sustancial o completa con el gen o la secuencia diana, o puede comprender una región de divergencia (es decir, motivo de divergencia). La secuencia del ARN interferente puede corresponder al gen diana de longitud completa o una subsecuencia del mismo.

Los expertos normales en la técnica reconocerán que, en principio, cualquier cadena de un ARNsi se puede incorporar en RISC y funcionar como una cadena de guía/antisentido. Se debe apuntar que, el diseño del ARNsi (p. ej., disminución de la estabilidad del dúplex de ARNsi en el extremo 5' de la cadena de guía deseada) puede favorecer la incorporación de la cadena de guía deseada en el RISC.

La cadena antisentido de un ARNsi es el agente de guiado activo del ARNsi ya que la cadena antisentido se incorpora en el RISC, permitiendo así que el RISC identifique ARNsm diana con al menos complementariedad parcial con la cadena de ARNsi antisentido para la escisión o la represión de la traducción. La escisión relacionada con el RISC de ARNsm que tienen una secuencia al menos parcialmente complementaria con la cadena de guía conduce a una disminución en el nivel de estado estacionario de ese ARNm y de la proteína correspondiente codificada por este ARNm. Alternativamente, el RISC disminuye la expresión de la proteína correspondiente a través de represión de la traducción sin escisión del ARNm diana.

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de interferencia de ARN (iARN) complejado a o encapsulado por una partícula lipídica. El compuesto de iARN elige como diana un ARN mensajero (ARNm) cuya función proteínica correspondiente asociada con una respuesta de células fagocíticas, por ejemplo, una respuesta inflamatoria (p. ej., liberación de uno o más mediadores lipídicos), desgranulación de un gránulo en un granulocito (p. ej., desgranulación de neutrófilos), o incorporación de una célula inmunitaria o un granulocito en una zona de una infección pulmonar. Por ejemplo, en una realización, el compuesto de iARN elige como diana un ARNm cuya función proteínica correspondiente está asociada con desgranulación de granulocitos, por ejemplo, se proporciona desgranulación celular de eosinófilos, basófilos, mastocitos o neutrófilos.

Según la invención, el compuesto de iARN está eligiendo como diana un ARNm que codifica COL1A1 o anexina A11 (ANXA11). Las realizaciones de la presente descripción en las que el compuesto de ácido nucleico no sea iARN y que no elija como diana un ARNm que codifique COL1A1 o anexina A11 no forman parte de la descripción reivindicada.

Un ARNm que es elegido como diana por un compuesto de iARN, que también se denomina en la presente un "ARNm diana", significa un ARNm que comprende una secuencia complementaria o sustancialmente complementaria a una cadena de ARN interferente (p. ej., una cadena de ARNsi). El ARNm diana puede ser ARNm de un animal no humano o de ser humano. Un ARNm diana no necesita ser 100% complementario a una cadena de ARN interferente, con la condición de que el ARN interferente funcione para silenciar o formar de otro modo un complejo RISC con el ARNm diana. En una realización, la cadena de ARN interferente (p. ej., la cadena de ARNsi) es 100% complementaria, al menos aproximadamente 99% complementaria, al menos aproximadamente 95% complementaria, al menos aproximadamente 90% complementaria, al menos aproximadamente 85% complementaria, al menos aproximadamente 80% complementaria, al menos aproximadamente 75% complementaria o al menos aproximadamente 70% complementaria al ARNm diana. ARNsm diana se describen en la presente.

Los ARNs interferentes de la invención, en una realización, actúan de un modo catalítico para la escisión de ARNm diana. En otras palabras, las composiciones de ARNsi descritas en la presente son capaces de efectuar la inhibición de ARNm diana en cantidades subestequiométricas. En una realización, el compuesto de ARNsi, presente en la composición de la invención, se recicla, con 1 molécula de ARNsi capaz de inducir la escisión de al menos aproximadamente 500 o al menos aproximadamente 1000 moléculas de ARNm. Según esto, en comparación con las terapias antisentido, se necesita significativamente menos ARNsi para proporcionar un efecto terapéutico bajo estas condiciones de escisión.

El término "ARNsi" según se usa en la presente se refiere a un compuesto de iARN (compuesto de ARN interferente) bicatenario a menos que se apunte otra cosa. El ARNsi de la invención es una molécula de ácido nucleico bicatenaria que comprende dos cadenas nucleotídicas, teniendo cada cadena de aproximadamente 17 a aproximadamente 30 nucleótidos (p. ej., aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos). Además de las moléculas de "ARNsi", otros compuestos de iARN son aptos para el uso con la presente invención. Ejemplos de otras moléculas de ARN interferente que pueden interactuar con RISC y activar la ruta de interferencia de ARN incluyen ARNs de horquilla cortos (ARNssh), ARNssi monocatenarios, microARNs (miARNs), y dúplex 27-meros de sustrato para dicer. Para los propósitos de la presente invención, cualquier molécula de ARN o similar a ARN (p. ej., una molécula de ARN con una modificación química, una sustitución de ADN o un nucleótido no natural) que pueda interactuar con RISC y participar en la ruta de interferencia de ARN se menciona en la presente como un compuesto de iARN de la invención.

Según la invención, el compuesto de ácido nucleico de las composiciones es un compuesto de interferencia de ARN (iARN). El compuesto de iARN incluye un ARN interferente pequeño (ARNsi), ARN de horquilla corto (ARNsh) y microARN (miARN).

En una realización, el compuesto de iARN es un ARNsi, ARNsh o miARN y tiene una longitud de menos de aproximadamente 30 nucleótidos, por ejemplo, para prevenir el silenciamiento de ARNm inespecífico. En una realización, el compuesto de iARN de la invención tiene una longitud de aproximadamente de 15 a 29 nucleótidos. En una realización, las secuencias de ARNsi de la invención tienen una longitud de aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28 o aproximadamente 29 nucleótidos. Las secuencias de ARNsi de la invención se pueden modificar, p. ej., químicamente o comprendiendo motivos alternos, (véanse, p. ej., Braasch y cols., (2003); Chiu y cols., (2003); las solicitudes PCT WO 2004/015107 y WO 02/44321, las Pat. EE. UU. N° 5.898.031 y 6.107.094, las publicaciones de patente de EE.

UU. 2005/0080246 y 2005/0042647). Por ejemplo, los oligonucleótidos del ARNsi se pueden modificar mediante la inclusión de un resto 5'-fosfato o modificaciones de 2'-O-metilo.

En una realización, el compuesto de iARN está presente en la composición como el compuesto de iARN bicatenario o el compuesto de iARN monocatenario (p. ej., como el compuesto de ARNsi sin la necesidad de expresar el ARN interferente endógenamente).

Según se describe en la presente, la célula diana en una realización es un fagocito. En una realización, la célula diana es un granulocito. En una realización adicional, la célula diana es un neutrófilo. En otra realización más, la célula diana se selecciona de un neutrófilo, eosinófilo, basófilo, mastocito, macrófago, monocito o célula dendrítica. En una realización, la célula es un fagocito mononuclear. En una realización adicional, el fagocito mononuclear es un monocito o un macrófago. En una realización adicional más, el macrófago es un macrófago alveolar.

En una realización, la composición proporcionada en la presente comprende uno o más compuestos de iARN complejados a una partícula lipídica. Por ejemplo, dos o más ARNssi, dos o más ARNssh o combinación de ARNsi y ARNsh pueden estar presentes en la composición. En una realización, la composición comprende una partícula lipídica complejada a uno o más de un ARNsi, ARNsh o miARN.

Los compuestos de iARN pueden comprender ribonucleótidos no modificados o una combinación de ribonucleótidos no modificados y ribonucleótidos y/o ribonucleótidos no naturales.

En diversas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden un compuesto de iARN que elige como diana un ARNm cuyo producto proteínico correspondiente representa un papel importante en la patogénesis de una enfermedad/trastorno pulmonar. Según la invención, las composiciones de la invención comprenden un compuesto de iARN que elige como diana un ARNm implicado en la patogénesis de fibrosis o sarcoidosis pulmonar.

Por ejemplo, se cree que la fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es el resultado de un proceso de curación de heridas aberrante que incluye/implica una deposición anormal y excesiva de colágeno en el tejido pulmonar. Así, en una realización, las composiciones de la presente invención comprenden compuestos de iARN que se dirigen a uno o más ARNsm implicados en el proceso de síntesis de colágeno.

Se sabe que el gen COL1A1 codifica las cadenas pro-alfa1 de colágeno tipo I cuya triple hélice comprende dos cadenas alfa1 y una cadena alfa2. En una realización, las composiciones de la invención comprenden un compuesto de iARN, tal como ARNsi, que elige como diana el ARNm de COL1A1. En otra realización, que no se reivindica, las composiciones de la invención comprenden un ARNsi que elige como diana la cadena alfa2, p. ej. un ARNsi que elige como diana ARNm de COL1A2.

Los estudios han mostrado que otros tipos de colágenos, tales como colágeno III, IV y V, también están asociados con la patogénesis de la fibrosis pulmonar. Según esto, en ciertas realizaciones, la invención proporciona composiciones que comprenden un ARNsi que elige como diana colágeno tipos III, IV o V; p. ej. composiciones que comprenden ARNssi que se dirigen a ARNm de COL3A1, COL4A1, COL4A2, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL4A6, COL5A1, COL5A2 o COL5A3. Según la invención, el compuesto de iARN elige como diana un ARNm que codifica COL1A1 o anexina A11.

En otra realización, las composiciones de la invención comprenden un compuesto de iARN que elige como diana un ARNm que codifica prolil 4-hidroxilasa, una enzima clave en la síntesis de colágeno compuesta por dos subunidades alfa idénticas y dos subunidades beta. La prolil 4-hidroxilasa cataliza la formación de 4-hidroxiprolina que es esencial para el plegamiento tridimensional apropiado de cadenas de procolágeno recientemente sintetizadas. En una realización ejemplar, que no se reivindica, el compuesto de iARN elige como diana el ARNm de P4HA1 que codifica uno de los diversos tipos de subunidades alfa.

El TGFp se ha relacionado con la patogénesis de fibrosis pulmonar. Según esto, en una realización, que no se reivindica, las composiciones de la invención comprenden un ARNsi que elige como diana TGFp o un receptor para TGFp.

La sarcoidosis implica la formación de granulomas sarcoideos en diversos órganos incluyendo los pulmones de los pacientes. Los monocitos y los macrófagos están implicados en la formación de granulomas sarcoideos y también secretan una gama de citocinas que potencian adicionalmente la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, los macrófagos alveolares secretan factor de necrosis tumoral a (TNFa) que se cree que representa un importante papel tanto en la formación como en el mantenimiento de granulomas sarcoideos. Según esto, en una realización, las composiciones de la invención comprenden un compuesto de iARN que elige como diana el ARNm de TNFa.

Adicionalmente, un estudio de asociación de todo el genoma identificó recientemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el gen de anexina A11 como un factor genético potencial ligado a la propensión a la sarcoidosis. En una realización, las composiciones de la invención comprenden un compuesto de iARN que elige como diana el ARNm de anexina A11. En una realización, el compuesto de iARN elige como diana la forma variante del ARNm de anexina A11 que está ligada a la propensión a la sarcoidosis.

En una realización, que no se reivindica, las composiciones de la invención comprenden un compuesto de iARN que elige como diana los receptores para citocinas y quimiocinas descritos en la presente. Por ejemplo, en una realización, las composiciones comprenden un compuesto de iARN que elige como diana un receptor para TNFa. En otra realización, las composiciones comprenden un compuesto de iARN que elige como diana un receptor de IL-6, un receptor de IFNy, un receptor de IL-12 o un receptor de IL-17.

En algunas otras realizaciones más, que no se reivindican, el compuesto de iARN se puede dirigir a cualquier número de ARNsm cuyas proteínas correspondientes estén asociadas con los procesos de células fagocíticas tales como respuesta inflamatoria, desgranulación o incorporación de una célula inmunitaria o un granulocito a una zona de infección pulmonar (es decir, quimiotaxis). Las células fagocíticas están implicadas en numerosos trastornos pulmonares, e incluyen neutrófilos, basófilos, eosinófilos, mastocitos, macrófagos o monocitos, células dendríticas y fibroblastos. La composición, por ejemplo, es una composición liposómica o una composición de nanopartículas lipídicas según se describe en la presente.

La inflamación en los pulmones de pacientes se caracteriza por infiltración de neutrófilos persistente y excesiva. Se ha encontrado que los neutrófilos y otras células fagocíticas liberan grandes cantidades de oxidasas y proteasas destructivas. En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones, sistemas y métodos para tratar y/o prevenir una lesión pulmonar en el pulmón con CF al inhibir la desgranulación de células fagocíticas. Las composiciones, los sistemas y métodos descritos en la presente, en un aspecto, se pueden usar para tratar una lesión pulmonar o una neumopatía en un paciente que lo necesite al impedir el mecanismo de desgranulación de un granulocito, por ejemplo, al impedir la desgranulación de neutrófilos.

La composición puede comprender un compuesto de iARN que elige como diana un ARNm que codifica un componente estructural de un gránulo en un granulocito, una proteína que modula o señala la producción de gránulos (p. ej., un compuesto de señalización celular) o la desgranulación de un gránulo.

El granulocito puede ser un neutrófilo, mastocito, basófilo, eosinófilo o monocito.

En una realización, que no se reivindica, el compuesto de iARN elige como diana un ARNm cuya función proteínica correspondiente está asociada con la desgranulación de células fagocíticas. En una realización adicional, la desgranulación de células fagocíticas es desgranulación de neutrófilos. En una realización adicional más, la desgranulación de neutrófilos comprende desgranulación de gránulos primarios. Sin embargo, la desgranulación no se limita a gránulos primarios. En cambio, el compuesto de iARN, en otra realización, elige como diana un ARNm cuya función proteínica correspondiente está asociada con la desgranulación de gránulos secundarios, gránulos terciarios o vesículas secretoras en neutrófilos.

Por ejemplo, en el caso de la desgranulación de neutrófilos, en una realización, un compuesto de iARN se puede dirigir a un ARNm que codifique una proteína asociada con el proceso de desgranulación de un gránulo primario, un gránulo secundario, un gránulo terciario o una vesícula secretora.

El compuesto de iARN puede elegir como diana un ARNm cuya función proteínica correspondiente está asociada con la desgranulación de un gránulo neutrofílico primario, que almacena mediadores tóxicos tales como elastasa, mieloperoxidasa, catepsinas y defensinas. Mecanismos de desgranulación de neutrófilos son proporcionados en Lacy (2006). Allergy, Asthma, and Clinical Immunology 2, pp. 98-108. La expresión de ARNm de una o más de las dianas que tienen según se describe en Lacy una función en la desgranulación de neutrófilos puede ser elegida como diana por uno o más de los compuestos de iARN de la presente invención.

En ciertos casos, el inicio y la propagación del daño pulmonar es una consecuencia de una respuesta inflamatoria exagerada. Aunque la inflamación es una respuesta protectora fisiológica a una lesión o infección y está diseñada para facilitar la reparación, a veces la respuesta inflamatoria da como resultado lesión adicional y disfunción orgánica. Por ejemplo, los trastornos pulmonares inflamatorios crónicos, la neumopatía obstructiva crónica (COPD), la lesión pulmonar aguda, el síndrome de fatiga respiratoria agudo y la fibrosis quística son síndromes de disfunción pulmonar grave resultantes de una respuesta inflamatoria masiva. Uno de los rasgos distintivos histológicos de estos trastornos pulmonares inflamatorios crónicos es la acumulación de neutrófilos en la microvasculatura del pulmón (Korkmaz y cols. 2010). Pharmacol. Rev. 62, pp. 726-759. La presente invención se orienta a la necesidad de un tratamiento eficaz de uno o más de estos trastornos, entre otros, véanse, p. ej., las Tablas 4-7, al proporcionar una composición de iARN que comprende un componente lipídico y un compuesto de iARN cuya diana es un ARNm que codifica una proteína implicada en la incorporación de neutrófilos (u otra incorporación fagocítica) a la zona de inflamación, una molécula inflamatoria tal como una citocina o quimiocina o una proteína implicada en la desgranulación de neutrófilos (p. ej., una proteína de fusión celular o una proteína vesicular).

Los neutrófilos son el tipo más abundante (de 40% a 75%) de glóbulos blancos y forman una parte esencial del sistema inmunitario innato. Los neutrófilos contribuyen a la patogénesis de diversos trastornos pulmonares. Las características destructivas de los neutrófilos son muy perjudiciales en los escenarios del microambiente patológico pulmonar. Según esto, sin querer limitarse por una teoría, se cree que la composición proporcionada en la presente es eficaz para tratar una enfermedad pulmonar o una lesión pulmonar al inhibir la liberación de mediadores tóxicos procedentes de gránulos neutrofílicos.

Los neutrófilos comprenden múltiples mediadores que se liberan de los gránulos. Dentro del gránulo primario, se ^{pueden encontrar al menos los siguientes mediadores: elastasa, mieloperoxidasa, catepsina G,}a^{-defensinas y}azurocidina 1. En una realización, el compuesto de iARN de la invención elige como diana un ARNm de mieloperoxidasa (MPO), catepsina G, a-defensina y azurocidina 1. El ARNsi se puede diseñar según métodos conocidos por los expertos normales en la técnica o adquiridos comercialmente. Por ejemplo, compuestos de iARN de elastasa (n° catálogo sc-36042, sc-36042-PR, sc-36042-SH, sc-36042-V), MPO (n° catálogo sc-43942, sc-43942-^{PR, sc-43942-SH, sc-43942-V), catepsina G (n° catálogo sc-41478, sc-41478-PR, sc-41478-SH, sc-41478-V),}a-defensina (n° catálogo sc-40476, sc-40476-SH, sc-40476-V) y azurocidina 1 (n° catálogo sc-42966, sc-42966-PR, sc-42966-SH, sc-42966-V) están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX), y son aptos para el uso con las composiciones y los métodos descritos en la presente.

Los neutrófilos también secretan un número de mediadores inflamatorios, incluyendo al menos IFN-y, factor de ^{necrosis tumoral-}a ^(TNF-a^{), interleucina-17 (IL-17), interferón-}Y ^(IFN-y^{) e interferón-a (IFN-}a^{). ARNm que codifican}estas proteínas también son aptos para la elección como diana con las composiciones de iARN y los métodos proporcionados en la presente.

Los macrófagos son células inmunitarias innatas que formar la primera línea de defensa contra patógenos invasores. Los macrófagos son un tipo de glóbulo blanco que traga y digiere residuos celulares, sustancias extrañas y microbios en un proceso fagocítico. Los macrófagos humanos tienen aproximadamente 21 pm de diámetro y se producen mediante la diferenciación de monocitos en tejidos. Los macrófagos alveolares son un tipo de macrófagos encontrados en el alveolo pulmonar y, en algunas realizaciones, los ARNsm expresados por estas células son elegidos como diana por los compuestos de iARN de la presente invención. Por ejemplo, se proporciona un compuesto de iARN que elige como diana un ARNm de macrófago alveolar.

Además del reconocimiento de sustancias extrañas, la fagocitosis y la destrucción de las sustancias extrañas, los macrófagos también están implicados en la presentación antigénica y la secreción de una amplia variedad de productos, incluyendo enzimas, inhibidores de enzimas, citocinas, quimiocinas, componentes del complemento, factores de coagulación y productos intermedios de ácido araquidónico (Parameswaran y Patial. (2010). Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 20, pp. 87-103). Aparte de secretar estos factores, los macrófagos también responden a estos productos, acentuando así la respuesta inmunitaria. Los macrófagos contribuyen a la patogénesis de diversos trastornos pulmonares y las características destructivas de la inflamación mediada por macrófagos son muy perjudiciales en el escenario del microambiente patológico pulmonar. Por ejemplo, los números de macrófagos alveolares están marcadamente incrementados en los pulmones de pacientes con neumopatía inflamatoria como resultado de un incremento de la incorporación, la proliferación y la supervivencia. Estas células secretan mediadores inflamatorios, oxidantes, proteínas y proteinasas. La elección como diana de estos productos de secreción y mediadores de incorporación de macrófagos a la zona de inflamación a través de las composiciones y los métodos descritos en la presente puede proporcionar una estrategia terapéutica para el tratamiento de diversos trastornos pulmonares.

^{Mediadores y efectores de macrófagos incluyen TNF-}a^{, IL-12, IFN-}y^{, IFN-}a^{, IL-6, IL-8, receptores de IL-8 (CXCR1 y CXCR2), IL-10, IL-17, IL-1}p^{, TGF-}p^{, iNOS, proteínas inflamatorias de macrófagos (MIPs) y receptor de quimiocina C}C tipo 5 (CCR5). En una realización, que no se reivindica, un ARNm que codifica uno de estos mediadores/efectores es elegido como diana por una composición y/o un método descritos en la presente. En otra realización, que no se ^{reivindica, un ARNm que codifica un receptor de TNF-}a^{, IL-12, IFN-}y^{, IFN-}a^{, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-1}p ^{o TGF-}p puede ser elegido como diana por una composición y/o un método descritos en la presente.

Los monocitos son un tipo de glóbulos blancos producidos por la médula ósea, y a continuación circulan en la corriente sanguínea durante aproximadamente de uno a tres días. Después de eso, se mueven típicamente a los tejidos de todo el cuerpo. Los monocitos que migran desde la corriente sanguínea a otros tejidos se diferenciarán entonces en macrófagos o células dendríticas residentes en tejidos. Sin embargo, los monocitos de la corriente sanguínea también son capaces de fagocitosis, presentación antigénica y producción de citocinas, y de ahí que estén implicados en ^{algunas enfermedades. Mediadores y efectores incluyen al menos TNF-}a^{, interleucina (IL)-12, interferón (IFN)-}y^{, IL-6, IL-1}p^{, IL-17, IL-10, IL-8, receptores de IL-8 (CXCR1 y CXCR2), proteínas inflamatorias de macrófagos (MIPs) y CCR5.}En una realización, que no se reivindica, un ARNm que codifica uno de estos mediadores/efectores es elegido como diana por una composición y/o un método descritos en la presente.

Las células dendríticas se derivan de monocitos y contribuyen a la patogénesis de diversos trastornos pulmonares, tales como asma y neumopatía obstructiva crónica (COPD). Las características destructivas de la inflamación mediada por células dendríticas son muy perjudiciales en el escenario del microambiente patológico pulmonar. Mediadores y ^{efectores de células dendríticas incluyen al menos TNF-}a^{, IL-12, IFN-}y^{, IL-6, receptores de IL-8 (CXCR1 y CXCR2),}proteínas inflamatorias de macrófagos (MIPs) y CCR5. Cada una de estas moléculas se analiza anteriormente y el ARNm de cada una puede ser elegido como diana con una de las composiciones de iARN proporcionadas en la presente, por ejemplo, para tratar una lesión pulmonar o un trastorno pulmonar tal como uno de los trastornos pulmonares indicados en la Tabla 4, la Tabla 5, la Tabla 6 o la Tabla 7.

Los eosinófilos son uno de los componentes del sistema inmunitario responsables de combatir parásitos multicelulares y ciertas infecciones en vertebrados. Junto con los mastocitos, también controlan mecanismos asociados con alergia y asma. También están implicados en un número de enfermedades pulmonares eosinofílicas incluyendo infecciones, neumonitis inducida por fármacos, toxinas inhaladas, trastornos sistémicos (p. ej., granulomatosis eosinofílica con poliangitis [anteriormente síndrome de Churg-Strauss], síndrome de Loeffler) y aspergilosis broncopulmonar alérgica. Los eosinófilos también contribuyen a eosinofilia pulmonar tropical, síndromes hipereosinofílicos y algunos cánceres pulmonares.

Los eosinófilos comprenden receptores de mediadores lipídicos que incluyen al menos receptor 1 de leucotrieno B⁴(BLT1), receptor 2 de leucotrieno B⁴(BLT2), receptores 1 y 2 de cisteinil-leucotrieno (CysLT 1 y CysLT2) y receptor de factor activador de plaquetas (PAFR). Los eosinófilos comprenden mediadores liberados de gránulos, los mediadores incluyen al menos elastasa y catepsina G. Los eosinófilos comprenden mediadores y/o efectores que están implicados en la quimiotaxis, estos incluyen al menos MIP-1a (CCL3), RANTES (CCL5), CCR5 (receptor de CCL3, 4, y 5), eotaxina-1 (CCL11) y I1-8. Los eosinófilos secretan mediadores inflamatorios que incluyen al menos TNF-a, IL-12, IL-6, IL-5, IL-13, IL-10 y TGF-p. En una realización, que no se reivindica, un ARNm que codifica uno de estos mediadores/efectores es elegido como diana por una composición y/o un método descritos en la presente.

Los mastocitos contienen muchos gránulos ricos en histamina y heparina. Los mastocitos son muy similares tanto en apariencia como en función a los basófilos. Difieren en que los mastocitos residen en tejidos, p. ej., en tejidos mucosos, mientras que los basófilos se encuentran en la sangre. Los mastocitos se pueden estimular para desgranularse mediante lesión directa, reticulación de receptores de inmunoglobulina E (IgE), o proteínas del complemento y pueden mediar en la inflamación de diversas enfermedades. Los mastocitos liberan al menos los siguientes mediadores o efectores: histidina descarboxilasa (HDC), receptor de histamina H⁴, receptor de leucotrieno B⁴2 (BLT 2), TNF-a, IL-1p, IL-4, IL-6, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e IL-3. En una realización, que no se reivindica, un ARNm que codifica uno de estos mediadores/efectores es elegido como diana por una composición y/o un método descritos en la presente.

Los basófilos son los menos comunes de los granulocitos, representando aproximadamente de 0,01% a 0,3% de los glóbulos blancos en circulación. Como los mastocitos, los basófilos almacenan histamina y la liberan para mediar en la inflamación basofílica. Los basófilos están particularmente implicados en el asma letal. Los basófilos liberan al menos los siguientes mediadores o efectores: histidina descarboxilasa (HDC), receptor de histamina H⁴, RANTES (CCL5), IL-4 y elastasa. En una realización, que no se reivindica, un ARNm que codifica uno de estos mediadores/efectores es elegido como diana por una composición y/o un método descritos en la presente.

Aunque la elastasa, contenida en gránulos neutrofílicos primarios, es utilizada durante respuestas inflamatorias, por ejemplo, al descomponer proteína o proteínas y factor o factores de virulencia de la membrana externa bacteriana, también es destructiva. La elastasa altera uniones estrechas, provoca daño proteolítico al tejido, descompone citocinas e inhibidor de proteinasa alfa, escinde inmunoglobulina A y G (IgA y IgG) y escinde tanto C3bi, un componente de la cascada del complemento, como CR1, un receptor sobre neutrófilos para otra molécula del complemento implicada en la fagocitosis. La escisión de IgA, IgG, C3bi y CR1 contribuye a una disminución de la capacidad de los neutrófilos para destruir bacterias mediante fagocitosis. Según esto, sin querer limitarse por una teoría, se cree que la elección como diana de la liberación por neutrófilos de elastasa con un compuesto de iARN de la invención tiene un efecto beneficioso en el tratamiento de los trastornos pulmonares descritos en la presente. Secuencias de ARNm de elastasa son conocidas en la técnica, por ejemplo, AH001514.1 (SEQ ID NO:1), n M_001972.2 (SEQ ID NO:2), Y00477.1 (SEQ ID NO:3) y NM_002087.3 (s Eq ID NO:4). Según esto, está dentro de la experiencia de un experto normal en la técnica diseñar un compuesto de ARNsi que elija como diana uno de estos ARNsm. Un ejemplo de un compuesto comercial de iARN específico para ARNm de elastasa se proporciona anteriormente.

La mieloperoxidasa (MPO) es un mediador local del daño tisular cuando se libera extracelularmente en enfermedades inflamatorias crónicas. La MPO produce ácido hipocloroso (HOCl) a partir de peróxido de hidrógeno (H²O²) y anión cloruro (Cl-), o el equivalente a partir de un haluro que no sea cloro, durante el estallido respiratorio de neutrófilos. Por otra parte, oxida tirosida hasta un radical tirosilo usando peróxido de hidrógeno como un agente oxidante. El ácido hipocloroso y el radical tirosilo son citotóxicos, de modo que son usados por el neutrófilo para destruir bacterias y otros patógenos, pero al mismo tiempo son destructivos para los tejidos del anfitrión. Según esto, sin querer limitarse por una teoría, se cree que la elección como diana de la liberación por neutrófilos de MPO con un compuesto de iARN de la invención tiene un efecto beneficioso en el tratamiento de los trastornos pulmonares descritos en la presente.

La catepsina G, una serina proteasa almacenada en gránulos neutrofílicos primarios, pertenece al grupo de proteinasas liposómicas. Participan en una amplia gama de funciones en neutrófilos incluyendo la depuración de patógenos internalizados, la modificación proteolítica de citocinas y quimiocinas, la activación así como la protección de receptores de la superficie celular y la apoptosis. La catepsina G induce daño tisular y cambios de permeabilidad directamente en una lesión pulmonar aguda (ALI). Según esto, sin querer limitarse por una teoría, se cree que la elección como diana de la liberación por neutrófilos de catepsina G con un compuesto de iARN de la invención tiene un efecto beneficioso en el tratamiento de los trastornos pulmonares descritos en la presente, incluyendo ALI.

Las a-defensinas (1, 1B, 3, 4) pueden provocar daño pulmonar al alterar la barrera capilar-epitelial. Además, se encuentran niveles elevados de a-defensinas en plasma y en líquido BAL de pacientes con neumopatía inflamatoria y alcanzan 1 mg/ml en esputo de pacientes con fibrosis quística. Según esto, sin querer limitarse por una teoría, se cree que la elección como diana de la liberación por neutrófilos de a-defensina con un compuesto de iARN de la invención tiene un efecto beneficioso en el tratamiento de los trastornos pulmonares descritos en la presente.

La azurocidina 1 es una proteína antibiótica encontrada en un gránulo azurofílico, con actividad quimiotáctica y antibacteriana de monocitos. También es un mediador inflamatorio multifuncional. Según se proporciona anteriormente, la presente invención proporciona en una realización, que no se reivindica, una composición que comprende un compuesto de iARN que elige como diana ARNm de azurocidina 1.

Dentro de un gránulo terciario de neutrófilos, se puede encontrar metaloproteasa 9 (MMP9). En primer lugar, se podría esperar que las actividades de proteinasas que pueden degradar la matriz, tales como metaloproteinasas de matriz (MMPs), resolvieran el exceso de matriz. Sin embargo, algunas MMPs pueden tener funciones profibróticas. La MMP9 es una de estas proteasas profibróticas. La MMP9 contribuye a la lesión del tejido pulmonar a través de la degradación de componentes de la matriz extracelular (ECM). Las MMP9 están implicadas en la descomposición de la matriz extracelular (ECM) en procesos fisiológicos normales, así como en procesos patológicos. La MMP9 contribuye a las funciones de los neutrófilos mediante degradación de la matriz extracelular, activación de IL-1 p y escisión de varias quimiocinas. En una realización, la composición de iARN proporcionada en la presente comprende un compuesto de iARN que elige como diana un ARNm de MMP9. El compuesto de iARN puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de la secuencia del ARNm de MMP9 y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN se puede adquirir comercialmente. Un ejemplo de un compuesto de iARN de MMP9 comercial está disponible de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-29400, sc-29400-PR, sc-29400-SH, sc-29400-V).

Otras MMPs profibróticas incluyen MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-12 y MMP-13. En una realización, que no se reivindica, la invención proporciona composiciones en las que el compuesto de iARN elige como diana una de las susodichas MMPs profibróticas.

Se cree que la desgranulación de neutrófilos está modulada por al menos p-arrestinas, Hck, VAMP-7, SNAP-23 y sintaxina-4. Según esto, en una realización, que no se reivindica, la composición de iARN proporcionada en la presente comprende un compuesto de iARN que elige como diana un ARNm de p-arrestina, ARNm de Hck, ARNm de VAMP-7, ARNm de SNAP-23 y/o ARNm de sintaxina-4.

Las p-arrestinas se requieren para activar rutas de señalización que conducen a la desgranulación de gránulos primarios y secundarios en neutrófilos. Como un grupo de fosfoproteínas citosólicas, las p-arrestinas desacoplan receptores acoplados a proteína G (GPCR) activados de sus proteínas G heterotrímeras asociadas y se unen directamente a la cola citoplásmica del receptor CXCR1, las p-arrestinas también se asocian con los gránulos primarios y secundarios en neutrófilos activados por IL-8 al unirse a Hck (para gránulos primarios) y Fgr (para gránulos secundarios), respectivamente. Así, las p-arrestinas actúan en dos zonas de la célula durante la activación de quimiocinas: una zona en el receptor en la membrana plasmática y una segunda sobre membranas del gránulo. Por lo tanto, se cree que inhibir la expresión de la proteína p-arrestina a través de un compuesto de iARN conduce a la inhibición de la desgranulación de gránulos primarios y secundarios en neutrófilos. El compuesto de iARN de B-arrestina puede se diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de p-arrestina y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de B-arrestina se puede adquirir comercialmente. Un ejemplo de un compuesto de iARN de p-arrestina comercial está disponible de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo sc-29741, sc-29741 -PR, sc-29741 -SH, sc-29741 -V).

La cinasa de células hemopoyéticas (Hck) de homo sapiens es una tirosina-proteína cinasa que pertenece a la familia Src de tirosina cinasas. Representa un papel en la migración de neutrófilos y en la desgranulación de neutrófilos. Hck se transloca a los gránulos primarios después de la activación de la señalización y media en la translocación de los gránulos. El compuesto de iARN de Hck puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de Hck y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de Hck se puede adquirir comercialmente. Un ejemplo de un compuesto de iARN de Hck comercial está disponible de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo sc-35536, sc-35536-PR, sc-35536-SH, sc-35536-V).

La proteína membranaria asociada a vesículas 7 (VAMP-7) es la proteína de acoplamiento sobre la membrana de gránulos que median en el proceso de acoplamiento de gránulos sobre la membrana plasmática. Esta implicada en todos los gránulos primarios, secundarios y terciarios. Por lo tanto, se cree que la inhibición de la expresión de proteína VAMP-7 a través de un compuesto de iARN conduce a la inhibición de la desgranulación de neutrófilos al inhibir el proceso de acoplamiento de gránulos. El compuesto de iARN de VAMP-7 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de VAMP-7 y principios de diseño de iARN.

Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de VAMP-7 se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de VAMP-7 comerciales están disponibles de Life Technologies (n° catálogo 139515, 139516, 139517).

La proteína asociada al sinaptosoma 23 (SNAP-23) es la proteína de acoplamiento sobre la membrana plasmática que media en el proceso de acoplamiento de gránulos sobre la membrana plasmática, formando el complejo con sintaxina-4. Está implicada en al acoplamiento de gránulos neutrofílicos primarios, secundarios y terciarios. Por lo tanto, se cree que la inhibición de la expresión de proteína SNAP-23 a través de un compuesto de iARN conduce a una inhibición de la desgranulación de neutrófilos al inhibir el proceso de acoplamiento de gránulos. El compuesto de iARN de SNAP-23 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de SNAP-23 y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de SNAP-23 se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de SNAP-23 comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo sc-72219, sc-72219-PR, sc-72219-SH, sc-72219-V).

La sintaxina-4 es la proteína de acoplamiento sobre la membrana plasmática que media en el proceso de acoplamiento de gránulos sobre la membrana plasmática, formando el complejo con SNAP-23. Está implicada en el acoplamiento de gránulos neutrofílicos primarios, secundarios y terciarios. Por lo tanto, se cree que la inhibición de la expresión de proteína sintaxina-4 a través de un compuesto de iARN conduce a la inhibición de la desgranulación de neutrófilos al inhibir el proceso de acoplamiento de gránulos. El compuesto de iARN de sintaxina-4 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de sintaxina-4 y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de sintaxina-4 se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de sintaxina-4 comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo sc-36590, sc-36590-PR, sc-36590-SH, sc-36590-V).

La quimiotaxis de granulocitos tales como neutrófilos permite la invasión y la localización de granulocitos en tejidos particulares. En una realización, que no se reivindica, uno o más ARNsm de factores quimiotácticos son elegidos como diana por una composición y/o un método descritos en la presente.

Los receptores de interleucina-8 (IL-8) (p. ej., CXCR1 y CXCR 2) se expresan sobre diversas células fagocíticas tales como neutrófilos, macrófagos, monocitos y células dendríticas. IL-8 es un quimioatrayente que atrae esas células inmunitarias innatas para migrar a las zonas de inflamación local. Se cree que la unión a IL-8 (i) induce quimiotaxis en células diana (p. ej., granulocitos), haciendo que migren a la zona de infección y (ii) desencadena el proceso de desgranulación de granulocitos. Según esto, en una realización, la composición de iARN de la invención elige como diana un ARNm que codifica IL-8 o uno de sus receptores. Por lo tanto, se cree que la inhibición de la expresión de IL-8 o una proteína receptora de IL-8 a través de un compuesto de iARN conduce a la inhibición de la incorporación de granulocitos a una zona de infección, así como la desgranulación de granulocitos. El compuesto de iARN de IL-8 o receptor de IL-8 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de IL-8 o receptor de IL-8 y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de IL-8 o receptor de IL-8 se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de IL-8 comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (IL8 n° catálogo: sc-39631, sc-39631-PR, sc-39631-SH, sc-39631 -V; CXCR1 n° catálogo: sc-40026, sc-40026-PR, sc-40026-SH, sc-40026- V; CXCR2 n° catálogo: sc-40028, sc-40028-PR, sc-40028-SH, sc-40028-V).

Gp²es una de las principales subunidades de Gp expresadas en neutrófilos que median en la migración y la infiltración celular direccional de neutrófilos. La inhibición de la migración y la infiltración celular direccional de neutrófilos con una composición de iARN se usa en una realización, para tratar uno de los trastornos pulmonares o lesión pulmonar descritos en la presente. El compuesto de iARN de Gp²puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de Gp²y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de Gp²se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de Gp²comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-41764, sc-41764-PR, sc-41764-SH, sc-41764-V).

Según se proporciona en la presente, en una realización, el compuesto de ARNsi presente en la composición de ARNsi-lípido elige como diana un ARNm cuya función proteínica correspondiente es como un mediador inflamatorio. El mediador inflamatorio, en una realización, es una citocina o una quimiocina. En una realización adicional, el mediador inflamatorio es una citocina. En una realización adicional, la citocina es factor de necrosis tumoral-a (TNF-a). En otra realización, la citocina es una interleucina. En otra realización más, la citocina es una citocina quimiotáctica. En otra realización más, un receptor para TNF-a es elegido como diana por composiciones y métodos de la invención. Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

IFN-y es una citocina proinflamatoria que está implicada en la inmunidad innata y adaptiva contra infecciones virales, algunas bacterianas, y protozoarias. También se ha presentado que el IFN-y es un activador de macrófagos e incorpora monocitos y neutrófilos a la zona de inflamación. La expresión aberrante de IFN-y está asociada con un número de enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias. Se libera de neutrófilos activados así como células T. En una realización, ARNm de IFN-y es elegido como diana con una de las composiciones de iARN descritas en la presente. En otra realización, un ARNm de receptor de IFN-y es elegido como diana con una de las composiciones de iARN descritas en la presente. El compuesto de iARN de IFN-y puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de |FN-y y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de IFN-y se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de IFN-y comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo sc-39606, sc-39606-PR, sc-39606-SH, sc-39606-V).

TNF-a es una citocina proinflamatoria implicada en la inflamación sistémica y contribuye a la fase aguda de la respuesta inmunitaria. Aunque muchas células producen TNF-a, p. ej., los neutrófilos analizados anteriormente, los macrófagos son los principales productores de TNF-a y también son muy sensibles a TNF-a. La desregulación de la producción de TNF-a, por ejemplo, la producción de TNF-a por macrófagos, está asociada con una variedad de enfermedades humanas. TNF-a promueve la respuesta inflamatoria y a su vez provoca patogénesis asociada con la inflamación. Así, en una realización, la presente invención sirve para atenuar la producción de TNF-a a través de la ruta de iARN. En otra realización, la presente invención sirve para atenuar la producción o la actividad de un receptor de TNF-a a través de la ruta de iARN. Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

En una realización, que no se reivindica, ARNm de TNF-a es elegido como diana con una de las composiciones de iARN descritas en la presente. El compuesto de iARN de TNF-a puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de TNF-a y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de TNF-a se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de TNF-a comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-37216, sc-37216-PR, sc-37216-SH, sc-37216-V).

Existen seis miembros en la familia de citocinas de interleucina 17 (IL-17), incluyendo IL-17A (comúnmente denominada IL-17), IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (también conocida como IL-25) e IL-17F. Los miembros de la familia de IL-17, secretados por macrófagos, funcionan como citocinas proinflamatorias que responden a la invasión del sistema inmunitario por patógenos extracelulares e inducen la destrucción de la matriz celular del patógeno. Los miembros de la familia de IL-17 tienen un papel proinflamatorio en la patogénesis del asma, por ejemplo asma alérgica. La sobreexpresión de IL-17F en las vías respiratorias está asociada con neutrofilia de las vías respiratorias, la inducción de muchas citocinas, un incremento en la hiperreactividad de las vías respiratorias e hipersecreción de moco.

En una realización, uno o más ARNsm de IL-17 es elegido como diana con una de las composiciones de iARN descritas en la presente. El compuesto de iARN de IL-17 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de IL-17 y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de IFN-y se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de IL-17 comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-39649, sc-39649-PR, sc-39649-SH, sc-39649-V). En una realización, ARNsm que codifican receptores para miembros de la familia de IL-17 son elegidos como diana con una de las composiciones de iARN descritas en la presente. Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

El interferón-a (IPN-a) es una familia de interferones tipo I producida por macrófagos, células dendríticas y neutrófilos. En seres humanos, existen 13 genes de IFN-a diferentes, denominados IFN-a1, -a2, -a4, -a5, -a6, -a7, -a8, -a10, -a13, -a14, -a16, -a17 y -a21. Se ha presentado que los macrófagos alveolares son el principal productor de IFN-a en una infección pulmonar con virus de ARN. El IFN-a puede activar neutrófilos y a su vez incrementar el número de neutrófilos. La producción anormal de IFN-a contribuye a la disfunción inmunitaria y media en la inflamación tisular y el daño a órganos. En una realización, un ARNm de lFN-a es elegido como diana con uno de los compuestos de iARN descritos en la presente. En otra realización, un ARNm de receptor de IFN-a es elegido como diana con uno de los compuestos de iARN descritos en la presente. El compuesto de iARN de IFN-a puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de IFN-a y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de IFN-a se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de IFN-a comerciales están disponibles de Novus Biologicals, LLC (Littleton, CO) (IFN-a - n° catálogo H00003440-R01; lFN-a6 - n° catálogo H00003443-R01;. lFN-a8 - n° catálogo H00003445-R01; lFN-a 13 - n° catálogo H00003447-R01). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

IL-3 es una citocina que estimula la diferenciación de células madre hematopoyéticas multipotentes en células progenitoras mieloides. También estimula la proliferación de todas las células en el linaje mieloide (granulocitos, monocitos y células dendríticas); y es un regulador en la inmunidad humoral y adaptiva. IL-4 induce la diferenciación de células T cooperadoras sencillas en células Th2 y disminuye la producción de citocinas de células Th1, macrófagos (IFN-y) y células dendríticas (lL-12). La sobreproducción de lL-4 está asociada con alergias. IL-4 promueve la activación de macrófagos M2 e inhibe la activación clásica de macrófagos en células M1. Un incremento en los macrófagos reparadores (M2) está acoplado con la secreción de lL-10 y TGF-p que dan como resultado una disminución de la inflamación patológica. La liberación de arginasa, prolina, poliaminasas y TGF-p por la célula M2 activada está ligada a la reparación de heridas y, en un caso adverso, la fibrosis. IL-5 es un mediador en la activación de eosinófilos. IL-5 se ha asociado con la causa de varias enfermedades alérgicas incluyendo rinitis alérgica y asma, en las que se han observado un gran incremento en el número de tejido circulante en las vías respiratorias y eosinófilos en esputo inducidos.

La presente invención en una realización sirve para atenuar la producción de IL-3, IL-4 y/o IL-5 a través de la ruta de iARN al proporcionar una composición que comprende un compuesto de iARN que elige como diana ARNm de IL-3, ARNm de IL-4 y/o ARNm de IL-5 complejado a o encapsulado por un componente lipídico. En otra realización, la invención proporciona composiciones y métodos que se dirigen a ARNsm que codifica receptores para IL-3, IL-4 y/o IL-5. En una realización, la composición se usa para tratar a un paciente de rinitis alérgica y/o asma. Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

El compuesto de iARN de IL-3, IL-4 y/o IL-5 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de IL-3, IL-4 y/o IL-5 y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de IL-3, IL-4 y/o IL-5 se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de IL-3, IL-4 y IL-5 comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (IL3 n° catálogo: sc-39621, sc-39621 -PR, sc-39621 -SH, sc-39621-V; IL-4 n2 catálogo: sc-39623, sc-39623-PR, sc-39623-SH, sc-39623-V, IL-5 n2 catálogo: sc-39625, sc-39625-PR, sc-39625-SH, sc-39625-V).

IL-13 e IL-4 exhiben un 30% de similitud de secuencia y tienen una estructura similar. IL-13 tiene efectos sobre células inmunitarias que son similares a los de la citocina IL-4 estrechamente relacionada. IL-13 también es un mediador de los cambios fisiológicos inducidos por inflamación alérgica en muchos tejidos y patogénesis fibrótica. En una realización, la presente invención sirve para atenuar la producción de IL-13 a través de la ruta de iARN al proporciona una composición de iARN que comprende un componente lipídico y un compuesto de iARN, en donde el compuesto de iARN elige como diana un ARNm de IL-13. El compuesto de iARN de IL-13 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de la secuencia de ARNm de IL-13 y principios de diseño de iARN conocidos por los expertos normales en la técnica y ejemplificados en la presente. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de IL-13 se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de IL-13 comerciales están disponibles de OriGene (Rockville, MD) (n° catálogo TR312195). En otra realización, la invención proporciona composiciones y métodos que se dirigen a un receptor de ARNm de IL-13. Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

IL-6 es una citocina proinflamatoria secretada por células T y macrófagos para estimular una respuesta inmunitaria tal como infección y postraumatismo, especialmente quemaduras u otro daño tisular que conduzca a inflamación. IL-6 estimula los procesos inflamatorios y autoinmunitarios en muchas enfermedades. IL-6 también puede contribuir a la señal de activación de la producción de IL-17 por células T. IL-12 es una citocina proinflamatoria producida por fagocitos tales como macrófagos y células dendríticas, y dirige la señal para la diferenciación de células T simples en células Th1. Estimula la producción de interferón-gamma (IFN-y) y factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a) a partir de células T y células asesinas naturales (NK), y reduce la supresión mediada por IL-4 de la expresión de IFN-y. La interleucina-1 p (IL-1 p) es una citocina proinflamatoria producida por macrófagos activados. Incrementa la expresión de factores de adhesión sobre células endoteliales dando como resultado extravasación de neutrófilos. IL-1 p también conduce a la inducción de ciclooxigenasa tipo 2 y la síntesis de óxido nítrico. IL-8 es un quimioatrayente que atrae células inmunitarias innatas para migrar a zonas de inflamación local, y, cuando se aproximan al entorno, la IL-8 desencadena a su vez la señalización del proceso de desgranulación de neutrófilos. Estas funciones se efectúan a través de a unión de IL-8 a receptores de IL-8 --- CXCR1 y CXCR2 sobre la superficie de la membrana de las células. IL-10 es una citocina antiinflamatoria producida por macrófago M2 y algunos tipos de células T. Tiene funciones con múltiples efectos pleiotrópicos en la inmunorregulación y la inflamación, y es capaz de inhibir la síntesis de citocinas de Th1 proinflamatorias. Sin embargo, también es estimulante hacia células Th2 y mastocitos, cuya sobreestimulación puede conducir a enfermedades tales como fibrosis. En una realización, la presente invención sirve para atenuar la producción de estas citocinas a través de la ruta de iARN al proporcionar composiciones de iARN que comprenden un componente lipídico y un compuesto de iARN, donde el compuesto de iARN elige como diana uno de los susodichos ARNsm de interleucina. En una realización adicional, el ARNm de interleucina es ARNm de IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 o IL-1 p. En otra realización, un ARNm que codifica un receptor para IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 o IL-1 p es elegido como diana por las composiciones y los métodos de la invención. Como con los otros compuestos de iARN descritos en la presente, estos pueden ser diseñados por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de la secuencia de ARNm de la citocina respectiva y principios de diseño de iARN conocidos por los expertos normales en la técnica y ejemplificados en la presente. Alternativamente o adicionalmente, en compuesto de iARN de citocina se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de citocina comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (IL-6 n2 catálogo: sc-39627, sc-39627-PR, sc-39627-SH, sc-39627-V; IL-12 n2 catálogo: sc-39640, sc-39640-PR, sc-39640-SH, sc-39640-V; IL-1 p: sc-39615, sc-39615-PR, sc-39615-SH, sc-39615-V; IL-8: sc-39631, sc-39631-PR, sc-39631-SH, sc-39631-V; IL-10: sc-39635, sc-39635-PR, sc-39635-SH, sc-39635-V). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

TGF-p es una proteína multifuncional que regula la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis, el ciclo celular, la embriogénesis, el desarrollo, la curación de heridas, la reparación de tejidos, la angiogénesis y el desarrollo de tumores. TGF-p¹se ha relacionado como una de las citocinas clave en la inducción de fibrosis en muchos órganos, incluyendo el pulmón (Lai y cols. (2009). J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 28, pp. 109-119). Realizaciones descritas en la presente abarcan el uso de un compuesto de iARN de TGF-p o un compuesto de iARN de receptor de TGF-p en una o más de las composiciones y los métodos descritos en la presente, p. ej., para el tratamiento de un trastorno pulmonar tal como fibrosis pulmonar o neumopatía intersticial (ILD). El compuesto de iARN de TGF-B puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de TGF-p y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de TGF-p se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de TGF-p comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-270322, sc-270322-PR, sc-270322-SH, sc-270322-V). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

El receptor de quimiocina C-C tipo 5 (CCR5) es un receptor quimiotáctico que se puede unir a RANTES (una proteína de citocina quimiotáctica también conocida como CCL5) y proteína inflamatoria de macrófagos (MIP) 1a y 1p (también conocidas como CCL3 y CCL4, respectivamente) y se ha presentado que media en la inflamación. Según esto, las composiciones y los métodos proporcionados en la presente son útiles para dirigirse a ARNm de CCR5 a través de la ruta de iARN. El compuesto de iARN de CCR5 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de CCR5 y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de CCR5 se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de CCR5 comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-35062, sc-35062-PR, sc-35062-SH, sc-35062-V).

RANTES (CCL5) es quimiotáctica para células T, eosinófilos y basófilos y los incorpora en zonas inflamatorias. Con la ayuda de citocinas particulares (p. ej., IL-2 y IFN=y) que son liberadas por células T, CCL5 también induce la proliferación y la activación de ciertas células asesinas naturales (NK) para formar células CHAK (asesinas activadas por quimiocina CC). Se ha mostrado que RANTES está en las secreciones respiratorias de asmáticos (Culley y cols. (2006). J. Virol. 80, pp. 8151 -8157). También se ha presentado que RANTES representa un papel en el rechazo agudo de aloinjertos de pulmón. Según esto, en una realización, la presente invención proporciona un compuesto de iARN que elige como diana ARNm de RANTES. En una realización adicional, la composición de iARN se usa para tratar a un paciente que se haya sometido a un trasplante de pulmón o un paciente asmático. La elección como diana de RANTES con una de las composiciones de iARN proporcionadas en la presente en otra realización se usa para el tratamiento de uno de los trastornos pulmonares indicados en la Tabla 4, la Tabla 5, la Tabla 6 y/o la Tabla 7. El compuesto de iARN de RANTES puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de RANTES y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de RANTES se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de RANTES comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-44066, sc-44066-PR, sc-44066-SH, sc-44066-V). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

La eotaxina (también denominada eotaxina-1 o CCL11) es un miembro de la familia C-C o p de quimiocinas que se caracteriza por un par de residuos de cisteína adyacentes. La eotaxina-1 se une a CCR2, CCR3 y CCR5. Sin embargo, se ha encontrado que la eotaxina-1 tiene un alto grado se selectividad para su receptor, de modo que son inactivas sobre neutrófilos y monocitos, que no expresan CCR3. El receptor de eotaxina humano, CCR3, se expresa sobre eosinófilos, basófilos y células TH2. La eotaxina-1 es un quimioatrayente que incorpora selectivamente eosinófilos y, por lo tanto, está implicada en respuestas alérgicas. También se ha demostrado su presencia en el suero de pacientes con COPD (Janz-Rozyk y cols. (2000). Mediators of Inflammation 9, pp. 175-179). Así, el ARNm de eotaxina, en una realización, es elegido como diana por la composición de iARN proporcionada en la presente para el tratamiento de un trastorno pulmonar, p. ej., un trastorno pulmonar indicado en la Tabla 4, la Tabla 5, la Tabla 6 o la Tabla 7. En otra realización, la composición de iARN de eotaxina se usa para tratar a un paciente con COPD o un paciente asmático. El compuesto de iARN de eotaxina-1 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de eotaxina-1 y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de RANTES se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de eotaxina-1 comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-43753, sc-43753-PR, sc-43753-SH, sc-43753-V). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

Las proteínas inflamatorias de macrófagos 1a y 1p (MIP-1a y -1p) y la proteína inflamatoria de macrófagos 2 (MIP-2) son proteínas que se unen a heparina de aproximadamente 6-8 kd que exhiben un número de actividades inflamatorias e inmunorreguladoras, y pertenecen a la familia de citocinas quimiotácticas (Driscoll (1994). Exp. Lung Res. 20, pp. 473 490). Activan granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) humanos que pueden conducir a inflamación aguda. Se ha observado un incremento en la expresión de MIP en modelos de septicemia bacteriana, silicosis y lesión pulmonar inducida por oxidantes. Los estudios en seres humanos indican que MIP-1a contribuye a la respuesta de células inflamatorias asociada con sarcoidosis y fibrosis pulmonar idiopática (Driscoll (1994). Exp. Lung Res. 20, pp. 473-490).

En una realización, la presente invención proporciona una composición de iARN que incluyen un compuesto de iARN que elige como diana ARNm de MIP-1a, MIP-1 p o MIP-2, por ejemplo, para el tratamiento de un trastorno pulmonar asociado con una respuesta de células inflamatorias tales como sarcoidosis o fibrosis pulmonar idiopática. En otra realización, la presente invención proporciona una composición de iARN que incluyen un compuesto de iARN que elige como diana MIP-1a, MIP-1 p o MIP-2, por ejemplo, para el tratamiento de septicemia pulmonar bacteriana, silicosis o lesión pulmonar, p. ej., lesión pulmonar inducida por oxidantes. El compuesto de iARN de MIP puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de MIP y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de MIP se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de MIP comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (MIP-1a n° catálogo: sc-43933, sc-43933-PR, sc-43933-SH, sc-43933-V; MIP-1 p n° catálogo: sc-43932, sc-43932-PR, sc-43932-SH, sc-43932-V). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

El factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) funciona como una citocina de factor de crecimiento de glóbulos blancos. GM-CSF estimula células madre para producir granulocitos (neutrófilos, eosinófilos, y basófilos) y monocitos. GM-CSF se encuentra en altos niveles en algunas zonas de inflamación y el bloqueo de la expresión de GM-CSF puede reducir la inflamación o el daño. La presente invención en una realización se dirige a ARNm de GM-CSF en el pulmón al proporcionar una composición de iARN que comprende un componente lipídico y un compuesto de iARN que elige como diana ARNM de GM-CSF así como métodos para tratar a un paciente a través del aporte pulmonar de la composición de ARN. Los compuestos de iARN de GM-CSF pueden ser diseñados por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de la respectiva secuencia de ARNm de GM-CSF y principios de diseño de iARN conocidos por los expertos normales en la técnica y ejemplificados en la presente. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de GM-CSF se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de GM-CSF comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-39391, sc-39391-PR, sc-39391-SH, sc-39391-V). También se proporcionan en la presente composiciones que se dirigen al receptor de GM-CSF (véanse Santa Cruz Biotechnology n° catálogo: sc-35501, sc-35501 -PR, sc-35501 -SH, sc-35501 -V para un compuesto de ARNsi ejemplar que se puede usar en los métodos y las composiciones proporcionados en la presente). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

La óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) es la isoforma inducible de óxido nítrico sintasa expresada en macrófago. Cataliza la producción de óxido nítrico (NO) a partir de L-arginina; y produce grandes cantidades de NO como un mecanismo de defensa. La expresión de iNOS se ha presentado enfermedades con una etiología autoinmunitaria. La regulación alterada de la liberación de NO está asociada con la patofisiología de casi todas las enfermedades inflamatorias (Hesslinger y cols. (2009). Biochem Soc. Trans. 37 (Pt 4), pp. 886-89). La presente invención en una realización elige como diana ARNm de iNOS con una composición de iARN, a fin de inhibir su efecto inflamatorio en diversos trastornos pulmonares. El compuesto de iARN de iNOS puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de iNOS y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de iNOS se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de iNOS comerciales están disponibles de OriGene (Rockville, MD) (n° catálogo TG302918). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

La histidina descarboxilasa (HDC) es la enzima que cataliza la reacción que produce histamina a partir de histidina (usando el cofactor vitamina B6). La histamina es liberada por basófilos y mastocitos y está implicada en la respuesta inflamatoria. Sin querer limitarse por una teoría, se cree que la histamina puede estar implicada en trastornos del sistema inmunitario y alergias. Por ejemplo, la mastocitosis es una enfermedad rara en la que existe una proliferación de mastocitos que producen exceso de histamina. Según esto, la presente invención se refiere en una realización a una composición de iARN que comprende un componente lipídico y un compuesto de iARN de HDC para el tratamiento de mastocitosis, asma y/u otros trastornos pulmonares (p. ej., uno de los trastornos pulmonares indicados en la Tabla 4, la Tabla 5, la Tabla 6 o la Tabla 7). El compuesto de iARN de HDC puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de HDC y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de HDC se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de HDC comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-45375, sc-45375-PR, sc-45375-SH sc-45375-V). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

El receptor de histamina H4 responde a histamina liberada bien de basófilos o bien de mastocitos, y está implicado en la mediación del cambio de conformación de eosinófilos y la quimiotaxis de basófilos y mastocitos. La presente invención se refiere en una realización a una composición de iARN que comprende un componente lipídico y un compuesto de iARN de receptor de histamina H4 para el tratamiento de un trastorno asociado con la expresión aberrante del receptor de histamina H4. Por ejemplo, en una realización, el trastorno pulmonar es uno de los trastornos pulmonares indicados en la Tabla 4, la Tabla 5, la Tabla 6 o la Tabla 7. El compuesto de iARN de receptor de histamina H4 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de receptor de histamina H4 y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de receptor de histamina H4 se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de receptor de histamina H4 comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-40025, sc-40025-PR, sc-40025-SH, sc-40025-V). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

Los cisteinil-leucotrienos (cys-LTs, p. ej., LTC4, LTD4 y LTE4) son una familia de potentes lípidos bioactivos que actúan a través de sus receptores acoplados a proteína G estructuralmente divergentes, denominados los receptores de CysLT¹y CysLT². Los cisteinil-leucotrienos (CysLTs) contribuyen al desarrollo de la obstrucción y la inflamación de las vías respiratorias en el asma (Fullmer y cols. (2005). Pediatr. Allergy Immunol. 16, pp. 593-601. Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada. Según esto, la presente invención se refiere en una realización a una composición de iARN que comprende un componente lipídico y un compuesto de iARN de CysLT¹y/o CysLT²para el tratamiento de inflamación pulmonar, asma y/u otro trastorno pulmonar (p. ej., uno de los trastornos pulmonares indicados en la Tabla 3, la Tabla 4, la Tabla 5 o la Tabla 6). El compuesto de iARN de CysLT¹y/o CysLT²puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de CysLT¹y/o CysLT²y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de CysLT¹y/o CysLT²se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de CysLT¹y/o CysLT²están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (CysLT¹n° catálogo: sc-43712, sc-43712-PR, sc-43712-SH, sc-43712-V; CysLT²n2 catálogo: sc-43713, sc-43713-PR, sc-43713-SH, sc-43713-V). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

El factor activador de plaquetas (PAF) es un mediador inflamatorio fosfolipídico implicado en la inflamación pulmonar. Por ejemplo, se ha mostrado que incrementaba los niveles de PAF que están presentes en pacientes con lesión pulmonar aguda (ALI). El receptor de PAF se denomina receptor de factor activador de plaquetas (PAFR). Realizaciones de la presente se dirigen a composiciones de iARN de PAFR, p. ej., para el tratamiento de trastornos pulmonares. En una realización, el trastorno pulmonar está asociado con la inflamación. En otra realización, el trastorno pulmonar es lesión pulmonar aguda. En otra realización más, el trastorno pulmonar es uno de los trastornos pulmonares indicados en la Tabla 4, la Tabla 5, la Tabla 6 o la Tabla 7. El compuesto de iARN de PAFR puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de PAFR y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de PAFR se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de PAFR comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n° catálogo: sc-40165, sc-40165-PR, sc-40165-SH, sc-40165-V). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

Los mediadores lipídicos son una clase de lípidos bioactivos que se producen localmente a través de rutas biosintéticas específicas en respuesta a estímulos extracelulares. Esta clase de compuestos contribuye a muchos procesos fisiológicos, y su desregulación se asocia con diversas enfermedades, especialmente inflamación. Los leucotrienos son un tipo de mediadores lipídicos y están implicados en reacciones asmáticas y alérgicas y actúan para apoyar reacciones inflamatorias. La presente invención en una realización abarca una composición de iARN que comprende un compuesto de iARN que elige como diana un ARNm de receptor de mediador lipídico presente sobre un granulocito y, en particular, un neutrófilo. Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

Los neutrófilos comprenden receptores de mediadores lipídicos, que comprenden al menos el receptor de leucotrieno B⁴1 (BLT1) y el receptor de leucotrieno B⁴2 (BLT2). Según esto, la presente invención en una realización abarca una composición de iARN que comprende un compuesto de iARN que elige como diana ARNm de BLT1 o ARNm de BLT2. El BLT1 se une al mediador lipídico llamado leucotrieno B⁴y conduce a sus señales aguas abajo en las funciones de los neutrófilos. BLT2 se une al mediador lipídico leucotrieno B⁴y conduce a sus señales aguas abajo en las funciones de los neutrófilos. En una realización, que no se reivindica, ARNm de BLT 1 o BLT2 es elegido como diana con una de las composiciones de iARN descritas en la presente. El compuesto de iARN de BLT1 o BLT2 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de BLT1 o BLT2 y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de BLT1 y/o BLT2 se puede adquirir comercialmente. Se han publicado compuestos de iARN de BLT1 y BLT2, véase, por ejemplo, Hirata y cols. (2013). Lipids Health Dis. 12, p. 122. Las secuencias de Hirata, que son aptas para el uso en la presente, son como sigue:

• BLT1:

5'-CAACCUACACUUCCUAUUA-3'(sentido) (SEQ ID NO: 5) y

5'-UAAUAGGAAGUGUAGGUUG-3' (antisentido) (SEQ ID NO: 6).

• BLT2:

5'-GGGACUUAACAUACUCLUUA-3' (sentido) (SEQ ID NO: 7) y

5'-UAAGAGUAUGUUAAGUCCG-3' (antisentido) (SEQ ID NO: 8).

La proteinasa 3 (PR3) es una serina proteasa producida por neutrófilos y, en una realización; que no se reivindica, ARNm de PR3 es elegido como diana por una composición de iARN de la invención. PR3 convierte o activa muchas moléculas inflamatorias, tales como IL-8, IL-32, IL1 -p, TNF-a. También es uno de los antígenos reconocidos por anticuerpos citoplásmicos antineutrofílicos (ANCAs) encontrados en la enfermedad granulomatosis con poliangitis (anteriormente "granulomatosis de Wegener") que implica daño pulmonar. El compuesto de iARN de PR3 puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de PR3 y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de PR3 se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de PR3 comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (n2 catálogo sc-42968, sc-42968-PR, sc-42968-SH, sc-42968-V).

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una citocina multifuncional que se ha observado que media en alteraciones de células endoteliales durante la inflamación, la neovascularización y la angiogénesis. La investigación ha mostrado que el VEGF derivado de neutrófilos puede regular respuestas vasculares durante la inflamación aguda y crónica. En una realización, un ARNm de receptor de VEGF (VEGFR) (p. ej., VEGFR-1 (Flt-1) o VEGFR-2 (Flk-1)) es elegido como diana por una composición de iARN de la invención. Sin querer limitarse por una teoría, se cree que la atenuación o la eliminación de la unión de VEGF a su receptor en la zona de inflamación pulmonar a través de la ruta de iARN es un medio eficaz de tratar trastornos pulmonares inflamatorios. En efecto, la concentración sérica de VEGF es alta en el asma bronquial, indicando la implicación de VEGF en la inflamación asmática. El compuesto de iARN de VEGFR puede ser diseñado por un experto normal en la técnica, p. ej., con el conocimiento de una secuencia de ARNm de VEGFR y principios de diseño de iARN. Alternativamente o adicionalmente, el compuesto de iARN de VEGFR se puede adquirir comercialmente. Compuestos de iARN de Flt-1 y Flk-1 comerciales están disponibles de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) (Flt-1: n° catálogo sc-29319, sc-29319-PR, sc-29319-SH, sc-29319-V; Flk-1: n° catálogo sc-29318, sc-29318-PR, sc-29318-SH, sc-29318-V). Estas realizaciones no forman parte de la invención reivindicada.

Un sumario de algunos de los ARNsm aptos para la elección como diana con las composiciones de iARN proporcionadas en la presente se proporciona en la Tabla 1. Según la invención, el compuesto de iARN está dirigiéndose a un ARNm que codifica COL1A1 o anexina A11.

Según se describe anteriormente, una secuencia de ARNm de un ARNm diana descrito en la presente es útil para diseñar un compuesto de iARN de la invención. Secuencias de ARNm humano de referencia para ciertas dianas descritas en la presente se proporcionan en la Tabla 2 posteriormente. Aunque se proporcionan en la presente los números de las secuencias de referencia de ARNm humano, la invención también abarca composiciones que eligen como diana ARNm no humano. Compuestos de iARN que eligen como diana ARNm que codifica COL1A1 o anexina A11 son abarcados por la invención reivindicada.

Métodos de tratamiento: la fibrosis o la sarcoidosis pulmonar son las dos enfermedades para las que se reivindica el uso de las composiciones de la invención.

En un aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar una enfermedad o un trastorno pulmonar.

En una realización, el método para tratar un trastorno pulmonar comprende administrar a los pulmones de un paciente que lo necesite una o más de las composiciones descritas en la presente. El trastorno pulmonar, en una realización, es uno de los trastornos pulmonares indicados en la Tabla 4, la Tabla 5, la Tabla 6, la Tabla 7 o una de sus combinaciones.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un método para tratar fibrosis pulmonar que comprende administrar a los pulmones de un paciente que lo necesite una o más composiciones de la invención. En realizaciones ejemplares, un método para tratar fibrosis pulmonar comprende administrar a los pulmones de un paciente que lo necesite una composición según la invención que comprende un compuesto de iARN complejado a o encapsulado por una partícula lipídica, en donde el compuesto de iARN elige como diana un ARNm implicado en la síntesis de colágeno (p. ej. COL1A1, P4HA1, etc.) o una producción de citocinas (p. ej. TNFa, TGFp, etc.).

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un método para tratar sarcoidosis que comprende administrar a los pulmones de un paciente que lo necesite una o más composiciones de la invención. En realizaciones ejemplares, un método para tratar sarcoidosis comprende administrar a los pulmones de un paciente que lo necesite una composición según la invención que comprende un compuesto de iARN complejado a o encapsulado por una partícula lipídica, en donde el compuesto de iARN elige como diana un ARNm implicado en la síntesis de colágeno (p. ej. COL1A1, P4HA1, etc.) o la producción de citocinas (p. ej. TNFa, TGFp, etc.). En otra realización, un método para tratar sarcoidosis comprende administrar a los pulmones de un paciente que lo necesite una composición según la invención que comprende un compuesto de iARN complejado a o encapsulado por una partícula lipídica, en donde el compuesto de iARN elige como diana el ARNm de anexina A11.

La administración de las composiciones de iARN de la invención da como resultado una disminución de la expresión y/o la actividad de dianas de ARNm en comparación con células no tratadas. Por ejemplo, la administración de las composiciones de la invención regula a la baja la expresión y/o la actividad de uno o más ARNsm sobreexpresados en o ligados genéticamente a la enfermedad o el trastorno pulmonar.

En una realización, la administración de las presentes composiciones regula a la baja la expresión y/o la actividad de un ARN mensajero (ARNm) que codifica una proteína asociada con una respuesta de células fagocíticas. En algunas realizaciones, la célula fagocítica es un macrófago y/o un fibroblasto.

En algunas realizaciones, la administración de la composición regula a la baja la expresión y/o la actividad de un ARNm que codifica una citocina, una proteína asociada con la síntesis de colágeno y/o una proteína que se une a fosfolípidos. En realizaciones ejemplares, la administración de las composiciones de la invención regula a la baja la expresión y/o la actividad de un ARNm que codifica TNFa, COL1A1, prolilhidroxilasa y anexina A11.

En una realización, la administración de las composiciones de iARN de la invención da como resultado una disminución de la expresión y/o la actividad de proteínas codificadas por dianas de ARNm. Por ejemplo, en una realización, la administración de las composiciones de la invención regula a la baja la producción de citocinas inflamatorias tales como TNFa y TGFp. En otra realización, la administración de las composiciones de la invención regula a la baja la síntesis de colágeno.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención reducen o inhiben la expresión y/o la actividad de dianas de ARNm, tales como ARNm de COL1A1, P4HA1, TNFa, TGFp y anexina a 11, en células del paciente, en aproximadamente o al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% o 100%, incluyendo valores intermedios, en comparación con células no tratadas.

En ciertas realizaciones, la reducción o inhibición en la expresión y/o la actividad de dianas de ARNm (p. ej. COL1A1, P4HA1, TNFa, TGFp y anexina A11) proporcionada por las composiciones es aproximadamente 5-90%, 5-80%, 5-70%, 5-60%, 5-50%, 5-40%, 5-30%, 5-20%, 5-10%, 10-90%, 10-80%, 10-70%, 10-60%, 10-50%, 10-40%, 10-30%, 20-80%, aproximadamente 20-70%, aproximadamente 20-60%, aproximadamente 20-50%, aproximadamente 20-40%, aproximadamente 30-80%, aproximadamente 30-70%, aproximadamente 30-60%, aproximadamente 30-50%, aproximadamente 40-80%, aproximadamente 50-80%, aproximadamente 50-70% o aproximadamente 50-60%, incluyendo valores y subintervalos intermedios, en comparación con células no tratadas.

En algunas otras realizaciones, existe una reducción de aproximadamente o al menos aproximadamente 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, o aproximadamente 10 veces, en la expresión y/o la actividad de dianas de ARNm (p. ej. COL1A1, P4HA1, TNFa, TGFp y anexina A11) en comparación con células no tratadas.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención reducen o inhiben la incorporación células fagocíticas y linfocitos a placas fibróticas y/o granulomas sarcoideos en los órganos del paciente. Por ejemplo, en una realización, existe una reducción de aproximadamente o al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% o 100%, incluyendo valores intermedios, en la incorporación de células fagocíticas y/o linfocitos a placas fibróticas y/o granulomas sarcoideos del paciente en comparación con la incorporación antes del tratamiento o en comparación con un paciente no tratado. En otra realización, existe una reducción de aproximadamente 5-90%, 5-80%, 5-70%, 5-60%, 5-50%, 5-40%, 5-30%, 5-20%, 5-10%, 10-90%, 10-80%, 10-70%, 10-60%, 10-50%, 10-40%, 10-30%, 20-80%, aproximadamente 20-70%, aproximadamente 20-60%, aproximadamente 20-50%), aproximadamente 20-40%, aproximadamente 30-80%), aproximadamente 30-70%, aproximadamente 30-60%, aproximadamente 30-50%, aproximadamente 40-80%, aproximadamente 50-80%, aproximadamente 50-70% o aproximadamente 50-60%, incluyendo valores y subintervalos intermedios, en la incorporación de células fagocíticas y/o linfocitos a placas fibróticas y/o granulomas sarcoideos.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención reducen o inhiben la migración de células fagocíticas y linfocitos desde placas fibróticas y/o granulomas sarcoideos a otros órganos del paciente. Por ejemplo, en una realización, existe una reducción de aproximadamente o al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% o 100%, incluyendo valores intermedios, en la migración de células fagocíticas y/o linfocitos en comparación con la migración antes del tratamiento o en comparación con un paciente no tratado. En otra realización, existe una reducción de aproximadamente 5-90%, 5-80%, 5-70%, 5-60%, 5-50%, 5-40%, 5-30%, 5-20%, 5-10%, 10-90%, 10-80%, 10-70%, 10-60%, 10-50%, 10-40%, 10-30%, 20-80%, aproximadamente 20-70%, aproximadamente 20-60%, aproximadamente 20-50%, aproximadamente 20-40%, aproximadamente 30-80%, aproximadamente 30-70%), aproximadamente 30-60%, aproximadamente 30-50%, aproximadamente 40-80%, aproximadamente 50-80%, aproximadamente 50-70%, o aproximadamente 50-60%, incluyendo valores y subintervalos intermedios, en la migración de células fagocíticas y/o linfocitos en comparación con la migración antes del tratamiento o en comparación con un paciente no tratado.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención reducen o inhiben la producción de citocinas/quimiocinas de Th1 en el paciente en comparación con la producción antes del tratamiento o en comparación con un paciente no tratado. Por ejemplo, en una realización, existe una reducción de aproximadamente o al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% o 100%, incluyendo valores intermedios, en la producción de citocinas/quimiocinas de Th1 en comparación con la producción antes del tratamiento o en comparación con un paciente no tratado. En otra realización, existe una reducción de aproximadamente 5-90%, 5-80%, 5-70%, 5-60%, 5-50%, 5-40%, 5-30%, 5-20%, 5-10%, 10-90%, 10-80%, 10-70%, 10-60%, 10-50%, 10-40%, 10-30%, 20-80%, aproximadamente 20-70%, aproximadamente 20-60%, aproximadamente 20-50%, aproximadamente 20-40%, aproximadamente 30-80%, aproximadamente 30-70%, aproximadamente 30-60%, aproximadamente 30-50%, aproximadamente 40-80%, aproximadamente 50-80%, aproximadamente 50-70%, o aproximadamente 50-60%, incluyendo valores y subintervalos intermedios, en la producción de citocinas/quimiocinas de Th1 en comparación con la producción antes del tratamiento o en comparación con un paciente no tratado.

En una realización, las composiciones de la invención reducen las cicatrices fibróticas o las placas fibróticas de la fibrosis pulmonar, por ejemplo, en aproximadamente o al menos en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% o 100%, incluyendo valores intermedios, en comparación con las cicatrices o placas fibróticas antes del tratamiento o en comparación con un paciente no tratado. Se pueden usar radiografía de tórax, tomografía axial computarizada y/o biopsias pulmonares para comprobar las cicatrices/placas fibróticas en el paciente.

En una realización, las composiciones de la invención reducen los granulomas sarcoideos en el paciente, por ejemplo, en aproximadamente o al menos en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% o 100%, incluyendo valores intermedios, en comparación con los granulomas sarcoideos antes del tratamiento o en comparación con un paciente no tratado. Se pueden usar radiografía de tórax, tomografía axial computarizada y/o biopsias pulmonares para comprobar el estado de los granulomas sarcoideos en el paciente.

En otra realización, las composiciones de la invención mejoran la saturación de oxígeno en la sangre del paciente, por ejemplo, en aproximadamente o al menos en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% o 100%, incluyendo valores intermedios, en comparación con los niveles de saturación de oxígeno antes del tratamiento o en comparación con un paciente no tratado. Se puede usar una prueba oximétrica para comprobar la saturación de oxígeno.

En diversas realizaciones, las composiciones de la invención se administran a los pulmones de un paciente a través de inhalación. Por ejemplo, la administración a los pulmones a través de inhalación incluye la administración a través de un inhalador de dosis medidas (MDI), un nebulizador o un inhalador de polvo seco. Según esto, en un aspecto, la invención proporciona un método para tratar fibrosis o sarcoidosis pulmonar que comprende administrar a los pulmones de un paciente que lo necesite, a través de inhalación, una o más composiciones de la invención.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se administran a los pulmones de un paciente intranasalmente o intratraquealmente. La administración intranasal incluye la administración a través de un inhalador de dosis medidas (MDI), un nebulizador o un inhalador de polvo seco. Según esto, en un aspecto, la invención proporciona un método para tratar fibrosis o sarcoidosis pulmonar que comprende administrar intranasalmente o intratraquealmente a los pulmones de un paciente que lo necesite una o más composiciones de la invención.

En algunas realizaciones, un paciente que necesite un tratamiento usando composiciones de la invención puede tener una afección pulmonar preexistente. Por ejemplo, en una realización, un paciente que necesite un tratamiento usando composiciones de la invención es un paciente con fibrosis quística, un paciente con bronquiectasia o un paciente con una infección pulmonar bacteriana o viral. Un paciente con fibrosis quística, un paciente con bronquiectasia o un paciente con una infección pulmonar bacteriana o viral puede desarrollar finalmente enfermedades pulmonares adicionales tales como fibrosis o sarcoidosis pulmonar.

En algunas realizaciones, un paciente que necesite un tratamiento usando composiciones de la invención podría tener fibrosis pulmonar asociada con sarcoidosis.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se podrían usar para tratar un cáncer de pulmón en un paciente que lo necesite.

Los neutrófilos pueden estar asociados con diversos trastornos pulmonares incluyendo neumopatía obstructiva crónica (COPD), lesión pulmonar aguda (ALI), fibrosis quística (CF), bronquiectasia y neumopatías infiltrantes, entre otras. Los basófilos pueden estar asociados con asma letal. Los eosinófilos pueden estar asociados con asma alérgica; neumopatías eosinofílicas tales como infecciones, neumonitis inducida por fármacos, toxinas inhaladas, trastornos sistémicos (p. ej., granulomatosis eosinofílica con poliangitis y síndrome de Loeffler); aspergilosis broncopulmonar alérgica; eosinofilia pulmonar tropical; síndromes hipereosinofílicos; y cánceres de pulmón. Los mastocitos pueden estar asociados con diversos trastornos pulmonares, incluyendo asma, COPD, infecciones respiratorias y fibrosis pulmonar. Los macrófagos pueden estar asociados con diversos trastornos pulmonares, incluyendo COPD, CF y sarcoidosis. Las células dendríticas pueden estar asociadas con diversos trastornos pulmonares, incluyendo COPD, asma alérgica y rinitis alérgica. La presente invención proporciona métodos para tratar una o más de las susodichas enfermedades a través de la administración de una de las composiciones de iARN de la presente invención a un paciente que lo necesite. Por otra parte, diversos trastornos pulmonares tratables mediante los métodos proporcionados en la presente se proporcionan en las Tablas 4-7.

Las composiciones descritas en la presente son útiles para el tratamiento de un paciente que tenga niveles de células fagocíticas pulmonares elevados en comparación con un individuo sano. A este fin, las composiciones descritas en la presente, en un aspecto, se administran a un paciente que lo necesite, para inhibir la producción de una de las proteínas de interés, es decir, mediante iARN. Por ejemplo, en una realización, una cantidad eficaz de una o más de las composiciones descritas en la presente se administran a través de un paciente que lo necesite, por ejemplo, un paciente con fibrosis quística o un paciente con deficiencia de a1-AT. En una realización, una cantidad eficaz de una de las composiciones proporcionadas en la presente se aporta a un paciente que lo necesite, para tratar o prevenir daño pulmonar y/o para tratar o prevenir bronquiectasia. Por ejemplo, en una realización, se proporciona un método para tratar a un paciente de bronquiectasia. El método comprende, en una realización, administrar a los pulmones del paciente que sufre bronquiectasia una cantidad eficaz de una o más de las composiciones descritas en la presente, por ejemplo, una composición que comprende ARNsi complejado a un lípido (p. ej., un lípido catiónico). En una realización adicional, el paciente es un paciente con fibrosis quística (CF). En otra realización, una cantidad eficaz de una de las composiciones descritas en la presente se administra a un paciente que necesite tratamiento de deficiencia de a¹-AT.

El término "tratamiento" incluye: (1) prevención o retardo de la aparición de síntomas clínicos del estado, el trastorno o la afección que se desarrolla en el sujeto que puede estar afectado de o está predispuesto al estado, el trastorno o la afección pero que todavía no experimenta o exhibe síntomas clínicos o subclínicos del estado, el trastorno o la afección; (2) inhibir el estado, el trastorno o la afección (es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad, o una recaída de la misma en el caso de un tratamiento de mantenimiento, de al menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos); y/o (3) aliviar la afección (p. ej., provocar la regresión del estado, el trastorno o la afección o al menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos). El beneficio para un sujeto que va a ser tratado bien es estadísticamente significativo o bien al menos perceptible para el sujeto o el médico.

"Profilaxis", según se usa en la presente, puede significar la prevención completa de una infección o enfermedad, o la prevención del desarrollo de síntomas de esa infección o enfermedad; un retraso en el comienzo de una infección o enfermedad o sus síntomas; o una disminución en la gravedad de una infección o enfermedad posteriormente desarrolladas o sus síntomas.

Diversos trastornos pulmonares se pueden tratar mediante los métodos y las composiciones proporcionados en la presente. Por ejemplo, en una realización, se proporciona un método para tratar a un paciente que lo necesite de un trastorno pulmonar asociado con daño tisular. En otra realización, se proporciona un método para tratar a un paciente que lo necesite de un trastorno pulmonar inflamatorio.

En una realización, el trastorno pulmonar es uno de los trastornos indicados en una cualquiera de las Tablas 4-7. La fibrosis o sarcoidosis pulmonar están presentes en las reivindicaciones de la invención.

En una realización, se proporciona un método para tratar a un paciente de COPD. El método comprende, en una realización, administrar a los pulmones del paciente con COPD una cantidad eficaz de una o más de las composiciones descritas en la presente a través de un MDI, DPI o nebulizador.

En otra realización, se proporcionan métodos en la presente para tratar a un paciente que necesite un tratamiento para leucocitosis, neumopatía inflamatoria, daño al tejido pulmonar, enfisema, trastorno de fatiga respiratoria agudo o lesión pulmonar aguda. En una realización, el método comprende administrar a un paciente que lo necesite a través de inhalación una o más de las composiciones descritas en la presente, por ejemplo, a través de un MDI, DPI o nebulizador.

La composición, en una realización, se administra directamente a los pulmones (i) de un paciente con CF para tratar o prevenir una lesión pulmonar debida a desgranulación de neutrófilos, o desgranulación de algún otro granulocito tal como un monocito, eosinófilo, basófilo mastocito (ii) a un paciente que presente deficiencia de a ¹-AT, o (iii) a un paciente para el tratamiento de bronquiectasia, infección crónica o cualquier otro trastorno pulmonar que dé como resultado la elevación de los niveles de células fagocíticas en comparación con los niveles de un individuo sano.

En una realización, un paciente con deficiencia en antitripsina a¹se trata con una composición y un método proporcionados en la presente. En una realización adicional, las composiciones de la invención se coadministran al paciente con una cantidad eficaz de antitripsina a¹.

Un experto en la técnica entenderá que la cantidad de dosificación y la frecuencia de dosificación de las composiciones dependerán mucho del ARNm diana, la eficacia de los compuestos de iARN, la gravedad de la enfermedad, la edad y el peso del paciente, etc.

Frecuencias de dosificación ejemplares incluyen administrar la cantidad eficaz de la composición diariamente, cada dos días, una vez a la semana, dos veces a la semana o tres veces a la semana.

En una realización, antes del aporte de la composición de iARN al paciente que lo necesite, de aproximadamente 70% a aproximadamente 100% del compuesto de iARN presente en la composición está complejado liposómicamente o presente en nanopartículas lipídicas. En otra realización, antes del aporte de la composición de ARNsi al paciente que lo necesite, de aproximadamente 80% a aproximadamente 99%, o de aproximadamente 85% a aproximadamente 99%, o de aproximadamente 90% a aproximadamente 99% o de aproximadamente 95% a aproximadamente 99% o de aproximadamente 96% a aproximadamente 99% del ARNsi presente en la composición está complejado liposómicamente o presente en nanopartículas lipídicas. En otra realización, antes del aporte de la composición de ARNsi al paciente que lo necesite, aproximadamente 98% del ARNsi presente en la composición está complejado liposómicamente o presente en nanopartículas lipídicas.

En una realización, tras el aporte de la composición a los pulmones de un paciente que lo necesite, por ejemplo, a través de aerosolización a través de un nebulizador, se libera de aproximadamente 20% a aproximadamente 50% del compuesto de iARN complejado liposómicamente (o complejado a lípido en el caso de nanopartículas lipídicas y/o micropartículas lipídicas), debido a tensión por cizalladura sobre los liposomas (o las partículas lipídicas). En otra realización, tras el aporte de la composición, se libera de aproximadamente 25% a aproximadamente 45%, o de aproximadamente 30% a aproximadamente 40% del compuesto de iARN complejado liposómicamente (o complejado a lípido en el caso de nanopartículas lipídicas y/o micropartículas lipídicas), debido a tensión por cizalladura sobre los liposomas (o las partículas lipídicas).

Composiciones y dispositivos de aporte (la invención se define mediante las reivindicaciones. Cualquier composición que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones no es según la invención. Los dispositivos de aporte no se reivindican).

Según se proporciona en la presente, la presente invención proporciona composiciones, sistemas y métodos para el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados con expresión y/o actividad aberrante de elastasa neutrofílica. Los métodos de tratamiento comprenden, en una realización, el aporte de una de las composiciones descritas en la presente a los pulmones de un paciente que lo necesite, por ejemplo, un paciente con fibrosis quística.

Las composiciones de la presente invención se pueden usar en cualquier dispositivo de distribución de dosificaciones adaptado para la administración pulmonar. Según esto, en un aspecto, la presente invención proporciona sistemas que comprenden una o más de las composiciones descritas en la presente y un dispositivo de aporte por inhalación. El dispositivo, en una realización, se construye para asegurar una exactitud de medida óptima y compatibilidad de sus elementos constructivos, tales como un recipiente, una válvula y un accionador, con la composición y se podría basar en un sistema de bomba mecánica, p. ej., el de un nebulizador de dosis medidas, un inhalador de polvo seco, un inhalador de dosis medidas (MDI), un inhalador de niebla fina o un nebulizador. Por ejemplo, dispositivos de aporte pulmonar incluyen un nebulizador de chorro, un nebulizador electrónico, un inhalador de niebla fina y un inhalador de polvo seco a base de cápsulas, todos los cuales son aptos para el uso con las composiciones de la presente invención.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención para administración pulmonar/por inhalación/nasal/intranasal se formulan en la forma de una formulación en polvo seco, una formulación en suspensión, una formulación en nanosuspensión, una formulación en microsuspensión o un aerosol nebulizado.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención formuladas para administración pulmonar/por inhalación/nasal/intranasal comprenden un propelente, p. ej. un propelente hidrocarbonado.

La composición, en una realización, se administra a través de un nebulizador, que proporciona una niebla de aerosol de la composición para el aporte a los pulmones de un sujeto. Un dispositivo de aporte por inhalación de tipo nebulizador puede contener las composiciones de la presente invención como una solución acuosa o una suspensión. Al generar la pulverización nebulizada de las composiciones para inhalación, el dispositivo de aporte por inhalación de tipo nebulizador se puede accionar ultrasónicamente, mediante aire comprimido, mediante otros gases, electrónicamente o mecánicamente. El dispositivo nebulizador ultrasónico trabaja habitualmente al imponer una forma de onda rápidamente oscilatoria sobre la película líquida de la composición a través de una superficie vibratoria electroquímica. A una amplitud dada, la forma de la onda se hace inestable, con lo que disgrega la película líquida, y produce pequeñas gotas de la composición. El dispositivo nebulizador accionado por aire u otros gases funciona sobre la base de que una corriente de gas a alta presión produce una caída de presión local que empuja la composición líquida a la corriente de gases a través de una acción capilar. Esta corriente líquida fina se desintegra a continuación por fuerzas de cizalladura.

Un dispositivo de aporte por inhalación de tipo nebulizador puede contener las composiciones de la presente invención como una solución, habitualmente acuosa, o una suspensión. Por ejemplo, la composición se puede suspender en solución salina y cargar al dispositivo de aporte por inhalación. Al generar la pulverización nebulizada de las composiciones para inhalación, el dispositivo de aporte nebulizador se puede accionar ultrasónicamente, mediante aire comprimido, mediante otros gases, electrónicamente o mecánicamente (p. ej., malla vibratoria o placa con aberturas). Los nebulizadores de malla vibratoria generan un aerosol de baja velocidad de partículas finas y nebulizan soluciones y suspensiones terapéuticas a una velocidad más rápida que los nebulizadores de chorro o ultrasónicos convencionales. Según esto, la duración del tratamiento se puede acortar con un nebulizador de malla vibratoria, en comparación con un nebulizador de chorro o ultrasónico. Nebulizadores de malla vibratoria aptos para el uso con los métodos descritos en la presente incluyen el Respironics I-Neb® de Philips, el MicroAir de Omron, el Aeroneb® de Nektar y el eFlow® de PARI. Otros dispositivos que se pueden usar con las composiciones descritas en la presente incluyen nebulizadores de chorro (p. ej., LC Star de PARI, AKITA), inhaladores de niebla fina e inhaladores de polvo seco a base de cápsulas (p. ej., Turbospin de PH&T).

El nebulizador puede ser de diseño portátil y manual, y puede estar equipado con una unidad eléctrica autónoma. El dispositivo nebulizador puede comprender una tobera que tiene dos canales de salida coincidentes de tamaño de abertura definido a través de los cuales se puede acelerar la composición líquida. Esto da como resultado el impacto de las dos corrientes y la atomización de la composición. El nebulizador puede usar un accionador mecánico para forzar la composición líquida a través de una tobera con múltiples orificios de tamaño o tamaños de abertura definidos para producir un aerosol de la composición para inhalación. En el diseño de nebulizadores de una sola dosis, se pueden emplear blísteres que contienen dosis individuales de la composición.

El dispositivo puede contener, y ser usado para aportar, una sola dosis de las composiciones de la invención, o el dispositivo puede contener, y usarse para aportar, múltiples dosis de las composiciones de la invención.

En la presente invención, el nebulizador que se puede emplear para asegurar el dimensionamiento de partículas es óptimo para la colocación de la partícula dentro de, por ejemplo, la membrana pulmonar.

Un inhalador de dosis medidas (MDI) se puede emplear como el dispositivo de aporte por inhalación para las composiciones de la presente invención. Este dispositivo está presurizado (pMDI) y su estructura básica comprende una válvula de medida, un accionador y un recipiente. Se usa un propelente para descargar la composición desde el dispositivo. Propelentes adecuados, p. ej., para el aporte con MDI, se pueden seleccionar entre gases tales como fluorocarbonos, clorofluorocarbonos (CFCs), hidrocarburos, hidrofluorocarbonos, propelentes de hidrofluoroalcano (p. ej., HFA-134a y HFA-227), nitrógeno y óxido de dinitrógeno o sus mezclas.

La composición puede consistir en partículas de un tamaño definido suspendidas en el propelente o los propelentes líquidos presurizados, o la composición puede ser una solución o suspensión de propelente o propelentes líquidos presurizados. Los propelentes usados son principalmente hidroflourocarbonos (HFCs) atmosféricamente ecológicos tales como 134a y 227. El dispositivo de aporte por inhalación, en una realización, aporta una sola dosis a través de, p. ej., un blíster, o puede tener un diseño de múltiples dosis. El inhalador de dosis medidas presurizado del sistema de inhalación puede ser accionado por la respiración para aportar una dosis exacta de la composición que contiene lípido. Para asegurar la exactitud de la dosificación, el aporte de la composición se puede programar a través de un microprocesador para que se produzca en un cierto punto en el ciclo de inhalación. El MDI puede ser portátil y manual.

Tras la nebulización, la composición nebulizada (también denominada "composición aerosolizada") está en la forma de partículas aerosolizadas. La composición aerosolizada se puede caracterizar por el tamaño de partícula del aerosol, por ejemplo, al medir el "diámetro aerodinámico mediano en masa" o la "fracción de partículas finas" asociados con la composición aerosolizada. El "diámetro aerodinámico mediano en masa" o "MMAD" se normaliza en cuanto a la separación aerodinámica de gotículas aerosólicas de agua y se determina mediante medidas de impactadora, p. ej., la impactadora de cascada de Anderson (ACI) o la impactadora de próxima generación (NGI). El caudal de gas, en una realización, es 28 litros por minuto para la ACI y 15 litros por minuto para la NGI.

La "desviación geométrica estándar" o "GSD" es una medida de la extensión de una distribución del tamaño de partícula aerodinámico. Bajas GSDs caracterizan una distribución estrecha del tamaño de gotícula (gotículas dimensionadas homogéneamente), que es ventajosa para dirigir el aerosol al sistema respiratorio. El tamaño de gotícula promedio de la composición nebulizada proporcionada en la presente, en una realización, es menor de 5 pm o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, y tiene una GSD en un intervalo de 1,0 a 2,2, o de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 2,2, o de 1,5 a 2,2, o de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,2.

"Fracción de partículas finas" o "FPF," según se usa en la presente, se refiere a la fracción del aerosol que tiene un tamaño de partícula menor de 5 pm de diámetro, según se mide mediante impacto en cascada. La FPF se expresa habitualmente como un porcentaje.

En una realización, el diámetro aerodinámico mediano en masa (MMAD) de la composición nebulizada es de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 4 pm, o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 3 pm o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 2 pm, según se mide mediante la impactadora de cascada de Anderson (ACI) o la impactadora de próxima generación (NGI). En otra realización, el MMAD de la composición nebulizada es aproximadamente 5 pm o menos, aproximadamente 4 pm o menos, aproximadamente 3 pm o menos, aproximadamente 2 pm o menos, o aproximadamente 1 pm o menos, según se mide mediante impacto en cascada, por ejemplo, mediante la ACI o NGI.

En una realización, el MMAD del aerosol de la composición farmacéutica es menor de aproximadamente 4,9 pm, menor de aproximadamente 4,5 pm, menor de aproximadamente 4,3 pm, menor de aproximadamente 4,2 pm, menor de aproximadamente 4,1 pm, menor de aproximadamente 4,0 pm o menor de aproximadamente 3,5 pm, según se mide mediante impacto en cascada.

En una realización, el MMAD del aerosol de la composición farmacéutica es de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 5,0 pm, de aproximadamente 2,0 pm a aproximadamente 4,5 pm, de aproximadamente 2,5 pm a aproximadamente 4,0 pm, de aproximadamente 3,0 pm a aproximadamente 4,0 pm o de aproximadamente 3,5 pm a aproximadamente 4,5 pm, según se mide mediante impacto en cascada (p. ej., mediante la ACI o NGI).

En una realización, la FPF de la composición aerosolizada es mayor de o igual a aproximadamente 50%, según se mide mediante la ACI o NGI, mayor de o igual a aproximadamente 60%, según se mide mediante la ACI o NGI o mayor de o igual a aproximadamente 70%, según se mide mediante la ACI o NGI. En otra realización, la FPF de la composición aerosolizada es de aproximadamente 50% a aproximadamente 80%, o de aproximadamente 50% a aproximadamente 70% o de aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, según se mide mediante la NGI o ACI.

En una realización, se emplea un inhalador de dosis medidas (MDI) como el dispositivo de aporte por inhalación para las composiciones de la presente invención. En esta situación, el compuesto de iARN se formula como una suspensión en un propelente (p. ej., hidroflourocarbono) antes de cargar en el MDI. La estructura básica del MDI, según se proporciona anteriormente, comprende una válvula de medida, un accionador y un recipiente. Se usa un propelente para descargar la composición desde el dispositivo. La composición puede consistir en partículas de un tamaño definido suspendidas en el propelente o los propelentes líquidos, o la composición puede estar en una solución o suspensión de propelente o propelentes líquidos presurizados. Los propelentes usados son principalmente hidroflourocarbonos (HFCs) atmosféricamente ecológicos tales como 134a y 227, y puede contener otros codisolventes. El dispositivo del sistema de inhalación puede aportar una sola dosis a través de, p. ej. un blíster, o puede tener un diseño para múltiples dosis. El inhalador de dosis medidas presurizado del sistema de inhalación puede ser accionado por la respiración para aportar una dosis exacta de la composición que contiene lípido. Para asegurar la exactitud de dosificación, el aporte de la composición se puede programar a través de un microprocesador para que se produzca en un cierto punto en el ciclo de inhalación. El MDI puede ser portátil y manual.

En una realización, se emplea un inhalador de polvo seco (DPI) como el dispositivo de aporte por inhalación para las composiciones de la presente invención. En una realización, el DPI genera partículas que tienen un MMAD de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 10 pm, o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 9 pm, o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 8 pm, o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 7 pm, o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 6 pm, o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 4 pm, o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 3 pm, o de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 2 pm de diámetro, según se mide mediante la NGI o ACI. En otra realización, el DPI genera partículas que tienen un MMAD de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 10 pm, o de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 10 pm, o de aproximadamente 3 pm a aproximadamente 10 pm, o de aproximadamente 4 pm a aproximadamente 10 pm, o de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 10 pm, o de aproximadamente 6 pm a aproximadamente 10 pm, o de aproximadamente 7 pm a aproximadamente 10 pm, o de aproximadamente 8 pm a aproximadamente 10 pm, o de aproximadamente 9 pm a aproximadamente 10 pm, según se mide mediante la NGI o ACI.

En una realización, el MMAD de las partículas generadas por el DPI es aproximadamente 1 pm o menos, aproximadamente 9 pm o menos, aproximadamente 8 pm o menos, aproximadamente 7 pm o menos, 6 pm o menos, 5 pm o menos, aproximadamente 4 pm o menos, aproximadamente 3 pm o menos, aproximadamente 2 pm o menos, o aproximadamente 1 pm o menos, según se mide mediante la NGI o ACI.

En una realización, el MMAD de las partículas generadas por el DPI es menor de aproximadamente 9,9 pm, menor de aproximadamente 9,5 pm, menor de aproximadamente 9,3 pm, menor de aproximadamente 9,2 pm, menor de aproximadamente 9,1 pm, menor de aproximadamente 9,0 pm, menor de aproximadamente 8,5 pm, menor de aproximadamente 8,3 pm, menor de aproximadamente 8,2 pm, menor de aproximadamente 8,1 pm, menor de aproximadamente 8,0 pm, menor de aproximadamente 7,5 pm, menor de aproximadamente 7,3 pm, menor de aproximadamente 7,2 pm, menor de aproximadamente 7,1 pm, menor de aproximadamente 7,0 pm, menor de aproximadamente 6,5 pm, menor de aproximadamente 6,3 pm, menor de aproximadamente 6,2 pm, menor de aproximadamente 6,1 pm, menor de aproximadamente 6,0 pm, menor de aproximadamente 5,5 pm, menor de aproximadamente 5,3 pm, menor de aproximadamente 5,2 pm, menor de aproximadamente 5,1 pm, menor de aproximadamente 5,0 pm, menor de aproximadamente 4,5 pm, menor de aproximadamente 4,3 pm, menor de aproximadamente 4,2 pm, menor de aproximadamente 4,1 pm, menor de aproximadamente 4,0 pm o menor de aproximadamente 3,5 pm, según se mide mediante la NGI o ACI.

En una realización, el MMAD de las partículas generadas mediante el DPI es de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 10,0 pm, de aproximadamente 2,0 pm a aproximadamente 9,5 pm, de aproximadamente 2,5 pm a aproximadamente 9,0 pm, de aproximadamente 3,0 pm a aproximadamente 9,0 pm, de aproximadamente 3,5 pm a aproximadamente 8,5 pm o de aproximadamente 4,0 pm a aproximadamente 8,0 pm.

En una realización, la FPF de la composición en partículas generada mediante el DPI es mayor de o igual a aproximadamente 40%, según se mide mediante la ACI o NGI, mayor de o igual a aproximadamente 50%, según se mide mediante la ACI o NGI, mayor de o igual a aproximadamente 60%, según se mide mediante la ACI o NGI, o mayor de o igual a aproximadamente 70%, según se mide mediante la ACI o NGI. En otra realización, la FPF de la composición aerosolizada es de aproximadamente 40% a aproximadamente 70%, o de aproximadamente 50% a aproximadamente 70% o de aproximadamente 40% a aproximadamente 60%, según se mide mediante la NGI o ACI.

Según los métodos de la invención, las composiciones descritas en la presente se aportan a los pulmones de un paciente que lo necesite a través de un dispositivo de aporte por inhalación. Se puede emplear cualquiera de los dispositivos de aporte por inhalación descritos en la presente, por ejemplo, un MDI, nebulizador o inhalador de polvo seco, para aportar una cantidad eficaz de una o más de las composiciones descritas en la presente a un paciente que lo necesite, por ejemplo, un paciente con CF o un paciente con deficiencia de a1 -AT.

Sin querer limitarse por una teoría, se cree que los métodos de aporte por inhalación descritos en la presente evitan la inactivación sistémica del ARNsi. Por otra parte, los métodos de inhalación descritos en la presente proporcionan un aporte directo eficaz de las composiciones a las células fagocíticas en los pulmones.

EJEMPLOS ^{(los ejemplos que se encuentren fuera del alcance de las reivindicaciones se deben considerar ejemplos}de referencia y no forman parte de la invención).

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante referencia a los siguientes Ejemplos. Sin embargo, se apunta que estos Ejemplos son ilustrativos y no se deben considerar de ningún modo restrictivos del alcance de la invención.

Ejemplo 1- Diseño y Síntesis de ARNsi

Las secuencias diana de ARNsi son específicas del gen de interés y tienen un contenido de GC de ~20-50%. Por ejemplo, los ARNssi que satisfagan las siguientes condiciones son capaces de silenciamiento génico eficaz en células de mamífero: (1) G/C en el extremo 5' de la cadena de sentido; (2) A/U en el extremo 5' de la cadena antisentido; (3) al menos 5 residuos de A/U en las 7 primeras bases del extremo 5' de la cadena antisentido; (4) sin series de más de 9 residuos de G/C. Generalmente, el sitio diana del ARNm está al menos 50-200 bases aguas abajo del codón de inicio para evitar regiones en las que se pudieran unir proteínas reguladoras.

Los oligonucleótidos incluyen la secuencia diana más la secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 y 6 nucleótidos adicionales aguas arriba de la secuencia promotora mínima para permitir una unión eficaz de la ARN polimerasa de T7. Los oligonucleótidos de ADN se resuspenden en agua libre de nucleasas hasta una concentración final de 100 pmol/pl. Cada par de oligonucleótidos de ADN se combina para generar las plantillas bien del ARN de la cadena de sentido o bien del ARN de la cadena antisentido al mezclar 10 pl de cada uno de los dos oligonucleótidos de ADN, 30 pl de agua libre de nucleasas y 50 pl de 2x tampón de renaturalización de oligonucleótidos para un volumen total de 100 pl. Esta mezcla se calienta a 90-95°C durante 3-5 minutos y a continuación se deja enfriar lentamente hasta temperatura ambiente. La concentración final de oligonucleótido renaturalizado es aproximadamente 10 pmol/pl.

Para sintetizar grandes cantidades del ARNsi, se mezclan a temperatura ambiente 10 pl de RiboMAX™ (Promega), 2,0 pl del ADN de plantilla para oligonucleótidos renaturalizados (10 pmol/pl), 6,0 pl, y 2,0 pl de enzima T7 hasta un volumen total de 20 pl. La reacción de 20 pl se puede aumentar a escala según sea necesario (hasta 500 pl de volumen total). Esta mezcla se incuba a 37°C durante 30 minutos.

Para retirar la plantilla de ADN y renaturalizar ARNsi, la plantilla de ADN se puede retirar mediante digestión con ADNasa después de la reacción de transcripción al añadir a cada reacción de transcripción 1 pl de ADNasa libre de ARNasa e incubar la mezcla durante 30 minutos a 37°C. Las reacciones de sentido y antisentido separadas se combinan y se incuban durante 10 minutos a 70°C. A continuación, la mezcla se deja enfriar hasta temperatura ambiente (aproximadamente 20 minutos). Esta etapa renaturaliza las cadenas de ARN de sentido y antisentido cortas separadas generando ARNsi.

Para purificar el ARNsi, se añaden al ARNsi 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M (pH 5,2) y 1 volumen de isopropanol y la mezcla se pone sobre hielo durante 5 minutos. La reacción se presenta turbia. La mezcla se centrifuga a velocidad máxima en una microcentrífuga durante 10 minutos. El sobrenadante se aspira y la pella se lava con 0,5 ml de etanol al 70% frío, para retirar todo el etanol después del lavado. La pella se seca al aire durante 15 min. a temperatura ambiente y a continuación se resuspende en agua libre de nucleasas en un volumen 2-5 veces el volumen de reacción original.

Ejemplo 2 - Preparación de formulaciones liposómicas y de nanopartículas

Para probar la captación y la actividad de ARNssi complejados con o encapsulados por nanopartículas liposómicas y lipídicas de la invención, se prepararon las formulaciones 1 -17. Estas formulaciones se resumen en la Tabla 8.

Tabla 8: Resumen de formulación de nanopartículas de ARNsi

Comp. 1 (molar %) Comp. 2 (molar %) Comp. 3 (molar %) Comp. 4 (molar %) Comp. 5 (molar %) 1 DODAP (57,1) DSPC (7,1) Col (34,3) DMG-PEG2000 (1,5) ARNt/ARNs i (0,05) 2 DODAP (57,1) DSPC (7,1) Col (34,3) DMG-PEG2000 (1,5) ARNt/ARNsi (0,025) 3 NA-DOPE (70) DOPC (30)

4 DODAP (57,1) DSPC (7,1) Col (35,4) DMG-PEG2000 (0,4) ARNt/ARNsi (0,025) 5 DODAP (57,1) DSPE (7,1) Col (34,3) DMG-PEG2000 (1,5) ARNt/ARNsi (0,025) 6 DODAP (57,1) DSPC (7,1) CHEMS (34,3) DMG-PEG2000 (1,5) ARNt/ARNsi (0,025) 7 DODAP (57,1) DSPE (7,1) Col (35,4) DMG-PEG2000 (0,4) ARNt/ARNsi (0,025) 8 DODAP (57,1) DSPE (7,1) CHEMS (34,4) DMG-PEG2000 (1,4) ARNt/ARNsi (0,025) 9 DODAP (70) DSPC (4) Col (24,5) DMG-PEG2000 (1,5) ARNt/ARNsi (0,025) 10 DODAP (45) DSPC (15) Col (38,5) DMG-PEG2000 (1,5) ARNt/ARNsi (0,025) 11 DODAP (70) DSPC (4) CHEMS (24,5) DMG-PEG2000 (1,5) ARNt/ARNsi (0,025) 12 DODAP (45) DSPC (15) CHEMS (38,5) DMG-PEG2000 (1,5) ARNt/ARNsi (0,025) 13 DODAP 57,1 DSPC (7,1) THS (34,3) DMG-PEG2000 (1,5) ARNt/ARNsi (0,025) 14 DODAP (57,1) DSPC (16,4) CHEMS (25) DMG-PEG2000 (1,5) ARNt/ARNsi (0,025) 15 DODAP (50) DSPC (4) CHEMS (45) DMG-PEG2000 (1) ARNt/ARNsi (0,025) 16 DODAP (57,1) DSPC (16,4) THS (25) DMG-PEG2000 (1,5) ARNt/ARNsi (0,025) 17 DODAP (50) DSPC (4) THS (45) DMG-PEG2000 (1) ARNt/ARNsi (0,025) DODAP: 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano; DSPC: 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina; Col: colesterol; DMG-PEG2000: 1,2-Dimiristoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol; NA-DOPE: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(dodecanilo); DOPC: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DSPE: 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina; CHEMS: hemisuccinato de colesterol; THS: hemisuccinato de tocoferol; ARNt: ácido ribonucleico de transferencia; ARNsi: ácido ribonucleico interferente pequeño.

Una amplia gama de porcentajes de lípido catiónico, de aproximadamente 45 a 70% en moles, apoyaba la encapsulación tanto de ARNt como de ARNsi en nanopartículas estables. Estas partículas se probaron adicionalmente en ensayos de captación celular y/o expresión génica para confirmar su capacidad para entrar en células fagocíticas y reducir la expresión de genes diana.

Ejemplo 3 - Captación de ARNssi por células fagocíticas

Para comparar la captación celular de formulaciones liposómicas y de nanopartículas por células fagocíticas encontradas en los pulmones, se midió la captación in vitro de partículas por macrófagos y fibroblastos. Antes de los ensayos de captación, los monocitos THP-1 se diferenciaron en macrófagos mediante una incubación de 24 horas con 50 ng/ml de miristato-acetato de forbol (PMA), seguido por una incubación de 24 horas en medio RPMI reciente. Para los ensayos de captación, macrófagos diferenciados o fibroblastos WI-38 cultivados en medio Opti-MEM que contenía 2% de suero bovino fetal (FBS) se incubaron con partículas marcadas con AF647 (concentración de lípido final de 140 pg/ml) durante 1 o 4 horas, se recogieron suavemente y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Como un sustituto para ARNsi, se usó ARNt para generar nanopartículas marcadas con AF647 usadas en experimentos de captación. La captación de partículas en células individuales se cuantificó mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se normalizó para la cantidad total de marcador fluorescente añadido por ml de medio para calcular la intensidad de fluorescencia mediana (MFI) normalizada.

La formulación n° 3 compuesta por NA-DOPE y DOPC mostraba la mayor captación tanto en macrófagos como en fibroblastos (Figura 2). Otras formulaciones que contenían diversas relaciones molares de DODAP, DSPC, CHEMS, DMG-PEG2000 y ARN (formulaciones n° 6, n° 11 y n° 12) o DODAP, DSPE, colesterol, DMG-PEG2000 y ARN (formulaciones n° 5 y n° 7) también exhibían buena captación tanto en macrófagos como en fibroblastos (Figura 2).

La formulación n° 2 mostraba una pobre captación tanto en macrófagos como en fibroblastos (Figuras 2 y 7) mientras que la Formulación n° 13 mostraba buena captación tanto en macrófagos como en fibroblastos (Figura 7).

Ejemplo 4 - Actividad de formulaciones de ARNsi

Se elaboraron posteriormente varias formulaciones de nanopartículas con ARNsi (en lugar de ARNt) y se evaluaron con respecto a la capacidad para reducir la expresión del gen COL1A1 en fibroblastos. Fibroblastos WI-38 se cultivaron durante 48 horas, se incubaron con Lipofectamine (LFC) o diversas formulaciones de ARNsi que contenían 13-100 pmol de un ARNsi que elige como diana COL1A1 durante 24 horas adicionales en medio reciente, y a continuación tampón de lisis RLT (Qiagen) recogido. Las células se homogeneizaron usando columnas QiaShredder (Qiagen), se extrajo ARN usando RNeasy Mini Kits (Qiagen) y el ARN total se cuantificó usando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo). El ARN se convirtió en ADNc con un High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (Fisher Scientific) y la expresión de COL1A1 se midió usando un CFX96 Real-Time PCR Detection System (BioRad). La expresión de COL1A1 se normalizó con respecto a la expresión del gen de p-actina (ACTB) para cada muestra y a continuación con respecto al nivel de expresión en fibroblastos no tratados. Secuencias para el ARNsi que elige como diana COL1A1 y cebadores de PCR en tiempo real para detectar la expresión de COL1A1 se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9: Resumen de secuencias de ARNsi y cebadores de PCR en tiempo real

Gen Secuencia

ARNsi COL1A1

P4HA1

C U C U G U U A C G U C U C C A G G A T T U C C IJG G A G A C G U A A C A G A G T T TNF

ANXA11

G A U U C A C C G U C C U A G A G C U T T A G C U C U A G G A C G G U G Á A U C T T PCR en tiempo real COL1A1

A G G C T G G T G T G A T G G G A T T A G G G C C T T G T T C A C C T C T C T

P4HA1

G A A A G A T C T G G T G A C T T C T C T G A A C C A G A T T C T C C A A C T C A C T C C TNF C C A G G C A G T C Á G A T C A T C T T C A T G A G G T A C ’A G G C C C T C T G A

ANXA11

C G G C A G C A G A T C C T A C T T T C A T C A G G C A G G C T T C A T C A G T

ARNsi desnudo que elige como diana COL1A1 no disminuía la expresión del gen de COL1A1 en comparación con fibroblastos no tratados (Figura 3). 50, 100 o 500 pmol del mismo ARNsi formulado en Lipofectamine (LFC) reducían la expresión de COL1A1 en más de 60% con relación a fibroblastos no tratados (Figura 3). La formulación n° 2 no disminuía la expresión de COL1A1 en fibroblastos (Figura 3), de acuerdo con la pobre captación de la formulación n° 2 en fibroblastos. Aunque las formulaciones n° 3, n° 11 y n° 12 mostraban buena captación en fibroblastos, ninguna disminuía la expresión de COL1A1 en fibroblastos (Figura 3). En contraste, la formulación n° 6 reducía la expresión de COL1A1 en casi 80% en comparación con fibroblastos no tratados (Figura 3).

Para confirmar que los efectos de la formulación n° 6 sobre la expresión de COL1A1 se deben a una desactivación específica del gen diana, se incubaron fibroblastos durante 24 horas con Lipofectamine (LFC) o formulación n° 6 que contiene bien un ARNsi que elige como diana COL1A1, bien un ARNsi que elige como diana un gen irrelevante o bien ARNt, y se midió la expresión de COL1A1. Ni el ARNt ni la formulación de ARNsi inespecífica disminuían la expresión de COL1A1 mientras que las formulaciones que contenían ARNssi específicos para la diana disminuían la expresión de COL1A1 (Figura 4).

Se realizó un experimento similar para probar la desactivación específica para la diana de las formulaciones n° 6 y n° 13 que contenía ARNssi dirigido a ARNM de P4HA1 y ANXA11. Las formulaciones que contenían ARNssi de control no disminuían la expresión de ARNs de P4HA1 y ANXA11 mientras que las formulaciones que contenían ARNssi específicos para la diana disminuían la expresión de P4HA1 y ANXA11 (Figuras 5 y 6).

Estos hallazgos demuestran que los ARNssi encapsulados en nanopartículas pueden ser recogidos por células fagocíticas para reducir eficazmente la expresión de un gen diana.

Ejemplo 5 - Efecto de form ulaciones de ARNsi sobre la formación de granulomas en un modelo en ratones in vivo de sarcoidosis

La capacidad de ARNssi encapsulados en nanopartículas para disminuir la formación de granulomas y mejorar la histopatología pulmonar se probará en un modelo de sarcoidosis en ratones. Un modelo de sarcoidosis en ratones ejemplar se describe en McCaskill y cols., Am J Respir Cell Mol Biol., sep. 2006; 35(3): 347-356, que se incorpora en la presente mediante referencia para todos los propósitos. Específicamente, Propionibacterium acnes (PA) es una bacteria anaeróbica grampositiva implicada como un agente etiológico putativo de sarcoidosis. Para inducir sarcoidosis en ratones, PA termoinactivada se inyectará intraperitonealmente en ratones C57BL/6 y/o BALB/c. Dos semanas después de la inyección intraperitoneal, ratones sensibilizados a PA se estimularán con PA termoinactivada (p. ej. 0,5 mg: 0,05 ml de suspensión de 10 mg/ml) intratraquealmente. Se usarán como controles ratones C57BL/6 y BALB/c sensibilizados y estimulados con PBS (PBS/PBS). Adicionalmente, algunos ratones bien se sensibilizarán a PA pero no se estimularán (PA intraperitoneal/PBS intratraqueal) o bien no se sensibilizarán pero se estimularán (PBS intraperitoneal/PA intratraqueal) para determinar el impacto de la sensibilización sola así como la estimulación sola.

Las formulaciones de ARNsi según la invención se administrarán a ratones en diversos momentos para determinar el efecto de las formulaciones en la mejora de la patofisiología de la sarcoidosis, tal como una disminución en la formación de granulomas. Por ejemplo, formulaciones de ARNsi de prueba y control se inyectarán el día 5, el día 7, el día 10, el día 12 y/o el día 14 después de la sensibilización intraperitoneal y el día 2, el día 5, el día 7, el día 10, el día 14, el día 21 y/o el día 28 después de la estimulación intratraqueal.

McCaskill y cols. han mostrado que ratones estimulados con PA desarrollaban una respuesta inmunitaria celular caracterizada por elevaciones en citocinas/quimiocinas de Th1, un incremento en los números de linfocitos y macrófagos en líquido de lavado pulmonar e inflamación granulomatosa y peribroncovascular compuesta por linfocitos T y B e histiocitos epitelioides, todos los cuales se asemejan a la patofisiología de la sarcoidosis.

Los ratones fueron sacrificados en momentos específicos y diversos marcadores patológicos e inmunológicos, tales como los descritos en McCaskill y cols., se probarán para determinar el efecto de las formulaciones de ARNsi sobre la patofisiología de la sarcoidosis. Adicionalmente, se seguía la supervivencia de los ratones para determinar el efecto de la formulación de ARNsi sobre la supervivencia.

Ejemplo 6 Efecto de formulaciones de ARNsi en modelo en ratones ^{in v iv o} de fibrosis pulmonar (PF) asociada con sarcoidosis

La capacidad de formulaciones de ARNsi para mejorar la patofisiología de PF asociada con sarcoidosis se probará en un modelo en ratones. Un modelo en ratones ejemplar de PF asociada con sarcoidosis se describe en Jiang y cols., Oncotarget, mayo 2016 ay; doi: 10.18632/oncotarget.9397 [Epub ya disponible], que se incorpora en la presente mediante referencia para todos los propósitos. En este modelo, la estimulación repetida con Propionibacterium acnes (PA) induce inflamación persistente que conduce a sarcoidosis seguida por PF en ratones.

El día 0, 0,25 ml de la suspensión de 2 mg/ml de PA termoinactivada (un total de 0,5 mg) se inyectarán intraperitonealmente en ratones. El día 14, los ratones se anestesiarán con pentobarbital sódico al 1% y se estimularán con 0,05 ml de la suspensión de 10 mg/ml de PA termoinactivada (un total de 0,5 mg) a través de la vía intratraqueal. La inoculación y la estimulación intratraqueal con PA inducirían granulomatosis sarcoidea en el pulmón. Los ratones con sarcoidosis se someterán a una estimulación de refuerzo en día 28 con otros 0,05 ml de la suspensión de 10 mg/ml de PA termoinactivada (un total de 0,5 mg) intratraquealmente durante una segunda estimulación; estos ratones se denominarán grupo con fibrosis sarcoidea. Se espera que los ratones a los que se administran 0,05 ml de PBS estéril el día 28 frenen el curso natural de la enfermedad después de una estimulación con PA de una vez el día 14; estos ratones se denominarán grupo de remisión sarcoidea. Ratones inoculados y estimulados con PBS estéril (PBS/PBS/PBS) se usarán como controles negativos. Véase la Figura 8 para el esquema del modelo en ratones.

Las formulaciones de ARNsi según la invención se administrarán a ratones en diversos momentos para determinar el efecto de las formulaciones en la mejora de la patofisiología de PF asociada con sarcoidosis, tal como una disminución en la fibrosis pulmonar y la formación de granulomas. Por ejemplo, formulaciones de ARNsi de prueba y control se inyectarán el día 5, el día 7, el día 10, el día 12 y/o el día 14 después de la sensibilización intraperitoneal; el día 2, el día 5, el día 7, el día 10, el día 14, el día 21 y/o el día 28 después de la estimulación intratraqueal; y el día 2, el día 5, el día 7, el día 10, el día 14, el día 21 y/o el día 28 después de la dosis de refuerzo intratraqueal.

Los ratones fueron sacrificados en momentos específicos y diversos marcadores patológicos e inmunológicos, tales como los descritos en McCaskill y cols., se probarán para determinar el efecto de las formulaciones de ARNsi sobre la patofisiología de la sarcoidosis y la fibrosis pulmonar. Adicionalmente, se seguía la supervivencia de los ratones para determinar el efecto de la formulación de ARNsi sobre la supervivencia.

Ejemplo 7 - Efecto de formulaciones de ARNsi en modelo en ratones ^{in v iv o} de fibrosis pulmonar (PF)

La capacidad de las formulaciones de ARNsi para mejorar la patofisiología de PF se probará en un modelo experimental ampliamente usado de fibrosis pulmonar en el que se instila bleomicina intratraquealmente en ratones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un compuesto de ácido nucleico complejado o encapsulado por una partícula lipídica; en donde la partícula lipídica comprende:

(a) un lípido catiónico que comprende de 40% en moles a 58% en moles del lípido total presente en la composición;

(b) un lípido neutro que comprende de 40% en moles a 50% en moles del lípido total presente en la composición; y

(c) un lípido conjugado que comprende de 0,3% en moles a 1,5% en moles del lípido total presente en la composición,

en donde el compuesto de ácido nucleico es un compuesto de interferencia de ARN (iARN) que elige como diana un ARN mensajero (ARNm) que codifica COL1A1 o anexina A11 (ANXA11), y

en donde el lípido catiónico comprende 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP), el lípido neutro comprende una mezcla de i) un fosfolípido y ii) hemisuccinato de colesterol (CHEMS) o hemisuccinato de tocoferilo (THS), y el lípido conjugado comprende 1,2-dimiristoil-sn-glicerol-polietilenglicol 2000 (DMG-PEG2000).

2. La composición según la reivindicación 1, en donde el lípido catiónico está presente en una cantidad de 45 a 58% en moles, del lípido total presente en la composición.

3. La composición según la reivindicación 1 o 2, en donde el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(dodecanilo) (NA-DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), y una de sus mezclas.

4. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el lípido catiónico está presente en una cantidad de 50 a 55% en moles, del lípido total presente en la composición.

5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el lípido catiónico está presente en una cantidad de 50% en moles, del lípido total presente en la composición.

6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el lípido catiónico está presente en una cantidad de 55 a 58% en moles, del lípido total presente en la composición.

7. La composición según la reivindicación 6, en donde el lípido catiónico está presente en una cantidad de 57% en moles, del lípido total presente en la composición.

8. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el lípido neutro está presente en una cantidad de 41 a 43% en moles, del lípido total presente en la composición.

9. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el lípido neutro está presente en una cantidad de 49% en moles, del lípido total presente en la composición.

10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el lípido conjugado está presente en una cantidad de 1% en moles a 1,5% en moles del lípido total presente en la composición.

11. La composición según la reivindicación 1 o 2, en donde la partícula lipídica comprende:

(a) 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP) que comprende de 50% en moles a 57,5% en moles del lípido total presente en la composición;

(b) un fosfolípido que comprende de 4% en moles a 16,5% en moles del lípido total presente en la composición;

(c) hemisuccinato de colesterol (CHEMS) o hemisuccinato de tocoferol (THS) que comprende de 25% en moles a 45% en moles del lípido total presente en la composición, y

(d) 1,2-dimiristoil-sn-glicerol-polietilenglicol 2000 (DMG-PEG2000) que comprende de 1% en moles a 1,5% en moles del lípido total presente en la composición,

en donde el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE).

12. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el compuesto de iARN que elige como diana un ARN mensajero (ARNm) que codifica COL1A1 es un ARN interferente pequeño (ARNsi) que comprende una cadena de sentido que comprende la secuencia nucleotídica de CAG AAG AAC UGG UAC AUC ATT y una cadena antisentido que comprende la secuencia nucleotídica de UGA UGU ACC AGU UCU UCU GTT.

13. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el compuesto de iARN que elige como diana un ARN mensajero (ARNm) que codifica ANXA11 es un ARN interferente pequeño (ARNsi) que comprende una cadena de sentido que comprende la secuencia nucleotídica de GAU UCA CCG UCC UAG AGC UTT y una cadena antisentido que comprende la secuencia nucleotídica de AGC UCU AGG ACG GUG AAU CTT.

14. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para el uso en tratamiento de una fibrosis o sarcoidosis pulmonar en un paciente que lo necesite al administrar a los pulmones del paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición.

15. La composición para el uso según la reivindicación 14, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz de la composición se administra a los pulmones del paciente a través de inhalación.