ES2317382T3 - Metodos para la identificacion de moleculas que interactuan con p13k y para la purificacion p13k. - Google Patents

Abstract

Un método para la identificación de un compuesto que interactúa con PI3K, que comprenden las etapas de a) proporcionar una preparación de proteína que contiene PI3K, b) poner en contacto la preparación de proteína con clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)- N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado en un soporte sólido bajo condiciones que permiten la formación de un complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)- N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida, c) incubar el complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida con un compuesto dado, y d) determinar si el compuesto es capaz de separar PI3K del clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado.

Description

Métodos para la identificación de moléculas que interactúan con PI3K y para la purificación PI3K.

La presente invención se relaciona con métodos para la identificación de moléculas que interactúan con PI3K y para la purificación de PI3K utilizando el ligando 1 feniltiazol como un ligando para PI3K. Adicionalmente, la presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas que interactúan por ejemplo para el tratamiento de cáncer, enfermedades metabólicas o trastornos autoinmunes/inflamatorios.

Las quinasas catalizan la fosforilación de proteínas, lípidos, azúcares, nucleósidos y otros metabolitos celulares y juegan papeles claves en todos los aspectos de la fisiología celular eucariótica. Especialmente, proteínas quinasas y quinasas lípidas que participan en los eventos de señalización que controlan la activación, crecimiento, diferenciación y supervivencia de las células en la respuesta a mediadores extracelulares o estímulos tales como factores de crecimiento, citoquinas o quimioquinas. En general, las proteínas quinasas se clasifican en dos grupos, aquellas que son preferencialmente residuos tirosina fosforilados y aquellos que son preferencialmente residuos serina y/o treonina fosforilados.

La actividad de proteína quinasa altamente inapropiada está involucrada en muchas enfermedades que incluyen cáncer, enfermedades metabólicas y trastornos autoinmunes/inflamatorios. Esto se puede originar directa o indirectamente por la falla de los mecanismos de control debido a mutación, sobreexpresión o activación inapropiada de la enzima. En todos estos casos, se espera que la inhibición selectiva de la quinasa que tenga un efecto benéfico.

Un grupo de quinasas lípidas que han llegado a ser un foco reciente de descubrimiento de fármaco es la familia 3-quinasa fosfoinositida (PI3K). Los miembros de la familia PI3K son quinasas lípidas que catalizan la transferencia de gama-fosfato de ATP al grupo 3'-hidroxilo de fofatidilinositol y sus derivados, llamados colectivamente fosfoinositidas. Ocho miembros (isoformas) de la familia PI3K hasta ahora se han aislado de células de mamífero y agrupado en tres clases de acuerdo con su estructura primaria y especificidad de sustrato (clase IA: Alfa, beta y delta de PI3K; clase IB: Gamma PI3K; clase II: alfa, beta y gamma PI3KC2; clase III: homólogo de levadura Vps34) (Fruman et al., 1998. Fosfoinositida kinases. Annual Review Biochemistry 67, 481-507; Cantley, L.C., 2002, Science 296, 1655-1657).

Las células de mamífero se conocen por expresar tres isoformas de la subunidad catalítica de PI3K clase IA (p110 alfa, p110 beta y p110 delta, sinónimo "Delta PI3K").La clase IB contiene solo un miembro (subunidad catalítica) que ha sido llamado p110 gamma o Gamma PI3K. En adición a su actividad quinasa lípida Gamma PI3K exhibe también una actividad quinasa de proteína serina/treonina como se demuestra por la autofosforilación.

El estudio de ratones manipulados genéticamente en los que los genes que codifican Gamma o delta PI3K se suprimen dan información importante a cerca de la función fisiológica de estas quinasas y su utilidad potencial como objetivos de fármaco. Ratones que les falta Gamma o delta PI3K son viables y exhiben fenotipos distintivos que sugieren varias indicaciones terapéuticas potenciales. El gamma PI3K parece ser un mediador principal del sistema inmune innato. Por ejemplo, macrófagos deficientes de gamma PI3K y granulocitos neutrófilos exhiben una capacidad mejorada para infiltrar el peritoneo inflamado. Los mastocitos representan otro tipo celular afectado en ratones deficientes de gamma PI3K. El fenotipo de ratones que les falta Delta PI3K se caracteriza por un mejoramiento en las funciones de linfocito y el punto para una función dominante en el control de la respuesta inmune adaptativa (Wetzker y Rommel, Current Pharmaceutical Design, 2004, 10, 1915-1922).

En contraste a las isorformas alfa y beta PI3K ampliamente expresadas las isoformas específicas hematopoyéticas Gamma y delta PI3K sugieren indicaciones terapéuticas importantes. Ambas isoformas aparecen como objetivos ideales para el tratamiento de enfermedades autoinmunes/inflamatorias mediadas por fagocitos hiperactivos, mastocitos, Linfocitos B y T (por ejemplo artritis reumatoide, asma o reacciones alérgicas). Con el fin de evitar efectos colaterales no deseados son necesarios inhibidores de isoforma altamente selectivos (Ohasi y Woodgett 2005, Nature Medicine 11, 924-925).

Un prerrequisito para la identificación y caracterización de Inhibidores PI3K es la provisión de ensayos adecuados, preferiblemente formas fisiológicas de la proteína objetivo. En la técnica, varias estrategias se han propuesto para superar este asunto.

De forma convencional, la actividad quinasa lípida PI3K se puede medir utilizando enzima purificada o recombinante en un ensayo con base en solución con vesículas fosfolípidas. La reacción se termina mediante la adición de disolventes orgánicos ácidificados y separación de fase posterior por extracción o análisis de cromatografía de capa delgada (Carpenter et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 19704-19711).

Otro ensayo descrito en la técnica se basa en la transferencia de fosfato de ATP radiomarcado a fosfatidilinositol inmovilizado en placas. Este tipo de ensayo también utiliza enzima gama PI3K recombinante pero se puede desarrollar en un modo de alto rendimiento (Fuchikami et al., 2002, J. Biomol. Screening 7, 441-450).

Todavía otro ensayo de detección bioquímica se basa en un formato de polarización de fluorescencia competitiva (FP) utilizando fosfoinositida etiquetada con fluoróforo (Drees et al., 2003, Comb. Chem. High Throughput Screening 6, 321-330).

Finalmente, un ensayo de redistribución Akt-EGFP basado en célula se reporta en base a análisis de imagen automatizado y formación de imagen microscópica de fluorescencia. Para este fin las células de Ovario de Hámster Chino (CHO) se transfectan establemente con el receptor de insulina humano y una construcción de fusión de proteína verde fluorescente que mejora al Akt1 (EGFP). Después de estimulación con el PI3K crecimiento factor-1 similar a insulina (IGF-1) se activa y la proteína Akt1-EGFP se capta para la membrana celular la validación del ensayo de redistribución con los inhibidores selectivos de isoforma PI3K muestran que el Alfa PI3K es la isoforma principal activada en células anfitrionas CHO después de estimulación IGF-1 (Wolff et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 9, 339-350).

En vista de lo anterior, existe una necesidad para proporcionar métodos efectivos para la identificación y perfil de selectividad de compuestos que interactúan con PI3K así como también para métodos para la purificación de PI3K.

Para cumplir con esta necesidad, la invención proporciona en un primer aspecto un método para la identificación de un compuesto que interactúa con PI3K, que comprende las etapas de

a) proporcionar una preparación de proteína que contiene PI3K,

b) poner en contacto la preparación de proteína con el ligando feniltiazol I inmovilizado en un soporte sólido bajo condiciones que permiten la formación de un complejo 1-PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida,

c) incubar el complejo 1-PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida con un compuesto dado, y

d) determinar si el compuesto es capaz de separar el PI3K del 3 clorhidrato -(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado.

En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto que interactúa con PI3K, que comprende las etapas de

a) proporcionar una preparación de proteína que contiene PI3K,

b) poner en contacto la preparación de proteína con clorhidrato -(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado en un soporte sólido y con un compuesto dado bajo condiciones que permiten la formación de un complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida, y

c) detectar el complejo 1-PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida formado en la etapa b).

En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para la identificación de un compuesto que interactúa con PI3K, que comprende las etapas de:

a) proporcionar dos alícuotas de una preparación de proteína que contiene PI3K,

b) poner en contacto una alícuota con clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado en un soporte sólido bajo condiciones que permiten la formación de un complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida,

c) poner en contacto la otra alícuota con clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado en un soporte sólido y con un compuesto dado bajo condiciones que permiten la formación de un complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida, y

d) determinar la cantidad de complejo 1-PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida formado en la etapas b) y c).

En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto que interactúa con PI3K, que comprende las etapas de:

a) proporcionar dos alícuotas que comprenden cada una por lo menos una célula que contiene PI3K,

b) incubar una alícuota con un compuesto dado,

c) cosechar las células de cada alícuota,

d) lisar las células con el fin de obtener preparaciones de proteína,

e) poner en contacto la preparación de proteínas con clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-il]-propionamida inmovilizado en un soporte sólido bajo condiciones que permiten la formación de un complejo 1-PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-il]-propionamida, y

f) determinar la cantidad de complejo 1-PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-il]-propionamida formado en cada alícuota en la etapa e).

En el contexto de la presente invención, se ha encontrado sorprendentemente que clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-il]-propionamida es un ligando PI3K. Esto posibilita el uso de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-il]-propionamida en ensayos de detección, por ejemplo en ensayos de detección competitivos así como también en métodos para la purificación de PI3K.

La estructura del clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-
fenil)-4-metil-tiazol-2-il]-propionamida (también el ligando 1 feniltiazol) se da en la Figura 1. Este compuesto es un tiazol sustituido. El clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2-il]-propionamida se puede acoplar covalentemente a un material de soporte sólido adecuado vía el grupo amino primario y ser utilizado para el aislamiento de proteínas de unión. La síntesis del clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-il]-propionamida se describe en el ejemplo 1. De acuerdo con la invención, la expresión clorhidrato ``3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-il]-propionamida también incluye compuestos que comprenden el núcleo idéntico pero que tienen otro ligador, preferiblemente acoplado al nitrógeno que no es parte de las estructuras cíclicas, para la unión al soporte sólido. Típicamente los ligadores tienen estructura de 8, 9 o 10 átomos. Los ligadores pueden contener un grupo activo carboxi, hidroxi o amino.

De acuerdo con la presente invención "PI3K" comprende todos los miembros de la familia PI3K que comprenden clase IA (por ejemplo Alfa, beta y delta PI3K), clase IB (por ejemplo Gamma PI3K), clase II (por ejemplo alfa, beta y gamma PI3KC2) y clase III (por ejemplo homólogo de levadura Vps34).

La secuencia de Gamma PI3K humana (hasta ahora solamente el miembro conocido de clase IB) se da en la Figura 4.

La secuencia de Delta PI3K humano (un miembro de clase IA) se da en la Figura 5.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "PI3K" se relaciona con proteínas humanas y otras proteínas de esta familia. La expresión incluye especialmente la funcionalidad de sus derivados activos, o funcionalmente sus fragmentos activos, o sus homólogos, o variantes codificadas por un ácido nucleico que hibrida al ácido nucleico que codifica dicha proteína bajo condiciones rigurosas bajas. Preferiblemente, estas condiciones rigurosas bajas incluyen hibridación en un amortiguador que comprende 35% formamida, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% BSA, 100 ug/ml de ADN esperma de salmón desnaturalizado, y 10% (p/vol) sulfato dextrano durante 18-20 horas a 40ºC, que se lava en un amortiguador que consiste de 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, y 0.1% SDS durante 1-5 horas a 55ºC, y que se lava en un amortiguador que consiste de 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4) 5 mM EDTA, y 0.1% SDS durante 1.5 horas a 60ºC.

El ligando 1 feniltiazol es un ligando para todas las isoformas de PI3K (ver anteriormente). Sin embargo, a lo largo de la invención, se prefiere que PI3K es Gamma PI3K o Delta PI3K, especialmente sus isoformas humanas.

En algunos aspectos de la invención, se proporciona primero una preparación de proteína que contiene PI3K. Los métodos de la presente invención se pueden desarrollar con cualquier preparación de proteína como un material de partida, mientras que el PI3K se solubiliza en la preparación. Ejemplos incluyen una mezcla líquida de varias proteínas, un lisato celular, un lisato celular parcial que no contiene todas las proteínas presentes en la célula original o una combinación de varios lisatos celulares. El término "preparación de proteína" también incluye proteína purificada disuelta.

La presencia de las especies de proteína PI3K en una preparación de proteína de interés se puede detectar en Western blots probados con anticuerpos que se dirigen específicamente contra PI3K. En caso que PI3K es una isoforma específica (por ejemplo gamma PIK3y/o PI3K Delta), se puede determinar la presencia de dicha isoforma mediante un anticuerpo específico a isoforma. Tales anticuerpos se conocen en la técnica (Sasaki et al., 2000, Nature 406, 897-902; Deora et al., 1998, J. Biol. Chem. 273, 29923-29928). Alternativamente, también se puede utilizar espectrometría de masa (MS) (ver adelante).

Los lisatos celulares o lisatos celulares parciales se pueden obtener primero al aislar organelos celulares (por ejemplo núcleo, mitocondria, ribosomas, aparato de golgi etc.) y luego elaborar preparaciones de proteína derivadas de estos organelos. Métodos para el aislamiento de organelos celulares se conocen en la técnica (Chapter 4.2 Purification of Organelles from Mammalian Cells in "Current Protocols in Protein Science", Editors: John.E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, ISBN: 0-471-14098-8).

En adición, se pueden elaborar las preparaciones de proteína mediante fraccionamiento de extractos celulares que por lo tanto enriquecen tipos específicos de proteínas tal como proteínas citoplásmicas o de membrana (Chapter 4.3 Subcellular Fractionation of Tissue Culture Cells in "Current Protocols in Protein Science", Editors: John. E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, ISBN: 0-471-14098-8).

Adicionalmente se pueden utilizar preparaciones de proteína de fluidos corporales (por ejemplo sangre, fluidos cerebroespinal, fluido peritoneal y orina).

Por ejemplo se pueden utilizar lisatos de embrión completos derivados de etapas de desarrollo definidas o etapas adultas de organismos modelos tal como C. elegans. Adicionalmente, órganos completos tales como corazón disecado de ratones pueden ser la fuente de preparaciones de proteína. Estos órganos también pueden ser prefusionados in Vitro con el fin de obtener una preparación de proteína.

Adicionalmente, la preparación de proteína puede ser una preparación que contiene PI3K que se ha producido recombinantemente. Métodos para la producción de proteínas recombinantes en células procarióticas y eucarióticas se establecen ampliamente (Chapter 5 Production of Recombinant Proteins in "Current Protocols in Protein Science", Editors: John. E. Coligan, BenM. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, 1995, ISBN: 0-471-14098-8).

En una modalidad preferida de los métodos de la invención, la provisión de una preparación de proteína incluyen las etapas de cosechar por lo menos una célula que contiene PI3K y lisar las células.

Las células adecuadas para este propósito son por ejemplo aquellas células o tejidos que son miembros de la familia PIK3. Los miembros de la familia PI3K se expresan en la mayoría de células y tejidos. El gama PI3K se expresa preferencialmente en células del sistema hematopoyético (por ejemplo granulocitos, macrófagos, mastocitos y plaquetas) pero también en cardiomiocitos, células de epitelio vascular y de músculo liso vascular. El delta PI3K se expresa ubicuamente con expresión pronunciada en linfocitos, granulocitos y mastocitos.

Por lo tanto en una modalidad preferida, las células aisladas de sangre periférica representan un material biológico adecuado. Procedimientos para la preparación y cultivo de linfocitos humanos y subpoblaciones de linfocitos obtenidas de sangre periférica (PBL) se conocen ampliamente (W.E Biddison, Chapter 2.2 "Preparation y culture of human lymphocytes" in Current Protocols in Cell Biology, 1998, John Wiley & Sons, Inc.). Por ejemplo, la centrifugación de gradiente de densidad es un método para la separación de linfocitos a partir de otras poblaciones de células sanguíneas (por ejemplo eritrocitos y granulocitos). Las subpoblaciones de linfocitos humanos se pueden aislar por vía de sus receptores de superficie celular específicos que se pueden reconocer por anticuerpos monoclonales. El método de separación físico involucra acoplar estos reactivos de anticuerpo con glóbulos magnéticos que permiten el enriquecimiento de las células que se unen mediante estos anticuerpos (selección positiva). Las células de linfocitos aisladas se pueden cultivar adicionalmente y estimular al agregar anticuerpos dirigidos contra el receptor o co-receptores de célula T tal como CD-3 para iniciar la señalización del receptor de células T y la posterior fosforilación de PI3K (Houtman et al., 2005, The Journal of Immunology 175_(4), 2449-2458).

Se puede utilizar como una alternativa a las líneas celulares cultivadas de células humanas primarias (por ejemplo células MOLT-4 o células de leucemia basófila de rata (RBL-2H3). Las células RBL-2H3 se pueden estimular al reticular el receptor de alta afinidad para IgE (FcepsilonRI) mediante anfígenos multivalentes para inducir la activación del PI3K (Kato et al., 2006, J. Immunol. 177 (1): 147-154).

En una modalidad preferida, la célula es parte de un sistema de cultivo celular y los métodos para cosechar una célula de un sistema de cultivo celular se conoce en la técnica (literatura supra).

La elección de la célula dependerá principalmente de la expresión del PI3K, en razón a que se tiene que asegurar que la proteína esta principalmente presente en la célula de elección. Con el fin de determinar si una célula dada es un sistema de partida adecuada del método de la invención, métodos similares al Western blot, métodos de detección de ácidos nucleicos basados en PCR, métodos Northern blots y de microdisposición de DNA ("chips de DNA") pueden ser adecuados con el fin de determinar si una proteína de interés dada está presente en la célula.

La elección de la célula también se puede influenciar por el propósito del estudio. Si la eficacia in vivo para un fármaco dado necesita ser analizado entonces las células o tejidos se pueden seleccionar en los cuales ocurre el efecto terapéutico deseado (por ejemplo granulocitos o mastocitos). Por contraste, para la aclaración de objetivos de proteína que median efectos colaterales indeseados la célula o tejido se puede analizar en la que se observa el efecto colateral (por ejemplo cardiomicitos, células de epitelio o de músculo liso vasculares).

Adicionalmente, se abarca dentro de la presente invención que la célula que contiene PI3K se puede obtener a partir de un organismo, por ejemplo por biopsia. Los métodos correspondientes se conocen en la técnica. Por ejemplo una biopsia es un procedimiento diagnostico utilizado para obtener una cantidad pequeña de tejido, que luego se puede examinar microscópicamente o con métodos bioquímicas. Las biopsias son importantes para diagnosticar, clasificar y catalogar una enfermedad, pero también evaluar y monitorear el tratamiento del fármaco.

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Se abarca dentro de la presente invención que al cosechar por lo menos una célula, la lisis se desarrolla simultáneamente. Sin embargo, se prefiere igualmente que las células se cosechen primero y luego se lise separadamente.

Los métodos para la lisis de las células se conocen en la técnica (Karwa y Mitra: Sample preparation for the extraction, isolation, y purification of Nuclei Acids; chapter 8 in "Sample PreparatioTechniques in Analytical Chemistry", Wiley 2003, Editor: Somenath Mitra, print ISBN: 0471328456; online ISBN: 0471457817). La lisis de diferentes tipos de células y tejidos se puede lograr por homogenizadores (por ejemplo homogenizador Potter), desintegradores ultrasónicos, lisis enzimática, detergentes (por ejemplo NP-40, Triton X-100, CHAPS, SDS), choque osmótico, congelamiento y descongelamiento repetido, o una combinación de estos métodos.

De acuerdo con los métodos de la invención, la preparación de proteína que contiene PI3K se pone en contacto con el ligando 1 feniltiazol inmovilizado sobre un soporte sólido bajo condiciones que permiten la formación de un complejo feniltiazol ligando 1 PI3K.

En la presente invención, el término "un complejo de ligando 1 feniltiazol- PI3K" denota un complejo en donde el ligando 1 feniltiazol interactúa con PI3K, por ejemplo mediante enlaces covalentes o, más preferido, mediante enlaces no covalentes.

La persona experta sabrá qué condiciones se pueden aplicar con el fin de posibilitar la formación del complejo ligando 1 feniltiazol- PI3K.

En el contexto de la presente invención, el término "bajo condiciones que permiten la formación del complejo" incluye todas las condiciones bajo las que tal formación, preferiblemente tal unión es posible. Esto incluye la posibilidad de tener el soporte sólido de una fase inmovilizada y verter el lisato sobre éste. En otra modalidad preferida, también se incluye que el soporte sólido este en una forma particulada y mezclado con el lisato celular.

En el contexto de enlaces no covalentes, la unión entre el ligando 1 feniltiazol y el PI3K es, por ejemplo, por vía de fuentes de sal, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas o una combinación de éstas.

En una modalidad preferida, las etapas de la formación del complejo ligando 1 feniltiazol- PI3K se desarrollan esencialmente bajo condiciones fisiológicas. El estado físico de las proteínas dentro de las células se describe en Petty, 1998 (Howard R. Petty 1, Chapter 1, Unit 1.5 in: Juan S. Bonifacino, Mary Dasso, Joe B. Harford, Jennifer Lippincott-Schwartz, y Kenneth M. Yamada (eds.) Current Protocols in Cell Biology Copyright © 2003 John Wiley & Sons, Inc. Todos los derechos reservados. DOI: 10.1002/0471143030.cb0101s00 Fecha de Colocación en Línea: Mayo, 2001 Fecha de Publicación Impresa: Octubre, 1998).

El contacto bajo condiciones esencialmente fisiológicas tiene la ventaja de que las interacciones entre el ligando, la preparación celular (es decir la quinasa a ser caracterizada) y opcionalmente compuesto refleja tanto como sea posible las condiciones naturales. "condiciones esencialmente fisiológicas" son entre otras aquellas condiciones que están presentes en el material de muestra original, no procesada. Ellos incluyen la concentración de proteína fisiológica, pH, concentración de sal, capacidad de amortiguación y modificaciones post-conversionales de las proteínas involucradas. El término "condiciones esencialmente fisiológicas" no requiere condiciones idénticas a aquellas en el organismo viviente original, de donde se deriva la muestra, pero condiciones esencialmente similares a las células o condiciones cercanas a las condiciones celulares. La persona experta en la técnica, por supuesto, se dará cuenta de que pueden surgir ciertas restricciones debido a la configuración experimental que conducirá eventualmente a condiciones celulares menos similares. Por ejemplo, eventualmente la interrupción necesaria de las paredes celulares o membranas celulares cuando se toma y se procesa una muestra de un organismo viviente puede requerir condiciones que no son idénticas a las condiciones fisiológicas encontradas en el organismo. Variaciones adecuadas de condiciones fisiológicas para practicar los métodos de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica y están abarcados por el término "condiciones esencialmente fisiológicas" como se utiliza aquí. En resumen, se debe entender que el término "condiciones esencialmente fisiológicas" se relaciona con condiciones cercanas a las condiciones fisiológicas, como por ejemplo encontradas en células naturales, pero no esencialmente requieren que esas condiciones sean idénticas.

Por ejemplo "condiciones esencialmente fisiológicas" puede comprender 50-200 mM NaCl o KCI, pH 6.5-8.5, 20-37ºC, y 0.001-10 mM catión divalentes (por ejemplo Mg++, Ca++,); más preferiblemente aproximadamente 150 m NaCl o KCI, pH7.2 a 7.6, 5 mM de catión divalente y frecuentemente incluye 0.01-1.0 por ciento de proteína no especifica (por ejemplo BSA). Un detergente no iónico (Tween, NP-40, Triton-X100) puede estar frecuentemente presente, usualmente en aproximadamente 0.001 a 2%, típicamente 0.05-0.2% (volumen/volumen). Para guía general, se pueden aplicar las siguientes condiciones acuosas amortiguadas: 10-250 mM NaCl, 5-50 mM Tris HCl, pH5-8, con adición optima de cationes divalentes y/o quemadores de metal y/o detergentes no iónicos.

Preferiblemente, "condiciones esencialmente fisiológicas" significa un pH de 6.5 a 7.5, preferiblemente de 7.0 a 7.5, y/o una concentración de amortiguador de entre 10 a 50 mM, preferiblemente de 25 a 50 mM, y/o una concentración de sales monovalentes (por ejemplo Na o K) de entre 120 a 170 mM, preferiblemente 150 mM. Sales divalentes (por ejemplo Mg o Ca) pueden adicionalmente estar presentes en una concentración de entre 1 a 5 mM, preferiblemente 1 a 2 mM, en donde más preferiblemente el amortiguador se selecciona del grupo que consiste de Tris-HCl o HEPES.

En el contexto de la presente invención, el ligando 1 feniltiazol se inmoviliza sobre un soporte sólido. A través de la invención, el término "soporte sólido" se relaciona con cada soporte no disuelto que es capaz de inmovilizar un ligando de molécula pequeña sobre su superficie.

De acuerdo con una modalidad adicional preferida, el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste de agarosa, agarosa modificada, glóbulos de sefarosa (por ejemplo sefarosa NH5 activa), látex, celulosa, y partículas ferro o ferromagnéticas.

El ligando 1 feniltiazol se puede acoplar al soporte sólido covalentemente o no covalentemente. La unión no covalente incluye la unión por vía de ligandos de afinidad biotina que se unen a matrices estreptavidina.

Preferiblemente, el ligando 1 feniltiazol se acopla covalentemente al soporte sólido.

Antes del acoplamiento, las matrices pueden contener grupos activos tales como NHS, Carbodimida etc. Para posibilitar la reacción de acoplamiento con el ligando 1 feniltiazol. El ligando 1 feniltiazol se puede acoplar al soporte sólido al acoplar directamente (por ejemplo utilizando grupos funcionales tal como amino-, sulfhidrilo-, carboxilo-, hidroxilo-, aldehído-, y grupos cetona) y al acoplar indirectamente (por ejemplo por vía de biotina, biotina que se adhiere covalentemente al ligando 1 feniltiazol y de unión no covalentemente de biotina a estreptavidina que se une directamente al soporte sólido).

El enlace al material de soporte sólido puede involucrar división y ligadores no divisibles. La división se puede alcanzar por división enzimática o tratamiento con métodos químicos adecuados.

Las interfaces de unión preferidas para el ligando 1 feniltiazol a material de soporte sólido son ligadores con una estructura de átomo C. los ligadores típicamente tienen estructura de 8, 9 o 10 átomos. Los ligadores contienen un grupo carboxi o amino activo.

La persona experta en la técnica apreciara que entre las etapas individuales de los métodos de la invención, pueden ser necesarias etapas de lavado. Tal lavado es parte del conocimiento de la persona experta en la técnica. El lavado sirve para remover componentes no unidos del lisato celular del soporte sólido. Se puede minimizar interacciones de unión no específicas (por ejemplo iónico simple) al agregar menores niveles de detergente o al moderar los ajustes a las concentraciones de sal en el amortiguador de lavado.

De acuerdo con los métodos de identificación de la invención, el sistema de expulsión es la detección o determinación del PI3K (primer aspecto de la invención), la detección del complejo ligando 1 feniltiazol - PI3K (segundo aspecto de la invención), o la determinación de la cantidad del complejo ligando 1 feniltiazol - PI3K (segundo, tercero y cuarto aspecto de la invención). La detección del complejo ligando 1 feniltiazol - PI3K de acuerdo con el segundo aspecto de la invención se puede desarrollar al utilizar anticuerpos marcados dirigidos contra PI3K y un sistema de expulsión adecuado.

De acuerdo con una modalidad preferida del segundo aspecto de la invención, el complejo del ligando 1 feniltiazol - PI3K se detecta al determinar su cantidad.

En el curso del segundo, tercero y cuarto aspecto de la invención, se prefiere que el PI3K se separe de ligando 1 feniltiazol inmovilizado con el fin de determinar la cantidad de complejo del ligando 1 feniltiazol - PI3K.

De acuerdo con la invención, la separación significa cada acción que destruyen las interacciones entre el ligando 1 feniltiazol y el PI3K. Esto incluye en una modalidad preferida la elusión del PI3K del ligando 1 feniltiazol inmovilizado.

La elusión se puede alcanzar al utilizar reactivos no específicos como se describe en detalle adelante (resistencia iónica, valor pH, detergentes). Adicionalmente, se puede probar si un compuesto de interés puede eluir específicamente el PI3K del ligando 1 feniltiazol. Tales compuestos que interactúa con el PI3K se describen adicionalmente en las siguientes secciones.

Tales métodos no específicos para destruir la interacción se conocen en la técnica principalmente y dependen de la naturaleza de la interacción de la enzima ligando. Principalmente, el cambio de resistencia iónica, el valor del pH, la temperatura de incubación con detergentes son métodos adecuados para disociar las enzimas objetivo del ligando inmovilizado. La aplicación de un amortiguador de elusión puede disociar los socios de unión por extremos de valor pH (pH alto o bajo; por ejemplo reducción del pH al utilizar 0.1M citrato, pH 2-3), cambio de resistencia iónica (por ejemplo alta concentración de sal utilizando NaI, KI, MgCl_{2}, o KCl), los agentes de reducción de polaridad que interrumpe las interacciones hidrófobas (por ejemplo dioxano o etilenglicol), o agentes desnaturalizantes (sales caotrópica o detergentes tales como sulfato-docedil-sodio, SDS; Revisar: Subramanian A., 2002, Immunoaffinty
chromatography).

En algunos casos, el soporte sólido se tiene que separar preferiblemente del material liberado. Los métodos individuales para esto dependen de la naturaleza del soporte sólido y se conocen en la técnica, si el material de soporte está contenido dentro de una columna el material liberado se puede recolectar como una columna de flujo pasante. En el caso que el material de soporte se mezcle con los componentes de lisato (también llamado procedimiento de tanda) y la etapa de separación adicional tal como centrifugación gentil pueden ser necesarios y el material liberado se recolecta como sobrenadante. Alternativamente se pueden utilizar glóbulos magnéticos como soporte sólido de tal manera que los glóbulos se puedan eliminar de la muestra al utilizar un dispositivo magnético.

En la etapa d) del método de acuerdo con el primer aspecto de la invención, se determina si el PI3K se ha separado del ligando 1 feniltiazol inmovilizado. Esto puede incluir la detección del PI3K o la determinación de la cantidad de PI3K.

Por consiguiente, se utilizan por lo menos en las modalidades preferidas de todos los métodos de identificación de la invención, los métodos para la detección del PI3K separado o para la determinación de su cantidad. Tales métodos se conocen en la técnica e incluyen los métodos fisicoquímicos tal como secuenciamiento de proteína (por ejemplo degradación Edmann), análisis por métodos de Espectrometría de masa o métodos de inmunodetección que emplean anticuerpos dirigidos contra PI3K.

A través de la invención, si se utiliza un anticuerpo con el fin de detectar el PI3K o con el fin de determinar su cantidad (por ejemplo por vía de ELISA), la persona experta entenderá que, si una isoforma específica del PI3K se detecta o si la cantidad de una isoforma específica de PI3K se determina, se puede utilizar un anticuerpo de isoforma específica. Como se indico anteriormente, tales anticuerpos se conocen en la técnica. Adicionalmente, la persona experta consiente de los métodos para producir los mismo.

Preferiblemente, el PI3K se detecta o la cantidad de PI3K se determina por espectrometría de masa o métodos de inmunodetección.

La identificación de las proteínas con análisis espectrométrico de masa (espectrometría de masa) se conocen en la técnica (Shevchenko et al., 1996, Analytical Chemistry 68: 850-858; Mann et al., 2001, Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry, Annual Review of Biochemistry 70, 437-473) y se ilustra adicionalmente en la sección de ejemplo.

Preferiblemente, el análisis de espectrometría de masa se desarrolla en una forma cuantitativa, por ejemplo al utilizar tecnología iTRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación absoluta y relativa) o cICAT (etiquetas de afinidad codificada por isótopos que se dividen) (Wu et al., 2006. J. Proteome Res. 5, 651-658).

De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención, la caracterización por espectrometría de masa (MS) se desarrolla mediante la identificación de péptidos proteotípicos del PI3K. La idea es que el PI3K se digiera con proteasas y los péptidos resultantes se determinen por MS. como un resultado, las frecuencias péptido para los péptidos de la misma proteína fuente difieren en un alto grado, la mayoría de péptidos frecuentemente observados que contribuyen "típicamente" a la identificación de esta proteína se denomina "péptidos proteotípicos". Por lo tanto, un péptido proteotípico como se utiliza en la presente invención es un péptido bien observable experimentalmente que identifica únicamente una proteína especifica o isoforma de proteína.

De acuerdo con una modalidad preferida, la caracterización se desarrolla al comparar los péptidos proteotípicos obtenidos en el curso de practicar los métodos de la invención con péptidos proteotípicos conocidos. Ya que, cuando se utilizan fragmentos preparados por digestión de proteasa para la identificación de una proteína en MS, observa usualmente los mismos péptidos proteotípicos para una enzima dada, es posible comparar los péptidos proteotípicos obtenidos para una muestra dada con los péptidos proteotípicos ya conocidos para enzimas de una clase de enzimas dadas y por lo tanto identificar la enzima que está presente en la muestra.

Como una alternativa al análisis de espectrometría de masa, el PI3K eluido (que incluye socios de unión co-eluidos o proteínas andamio), se pueden detectar o su cantidad se puede determinar al utilizar un anticuerpo específico dirigido contra PI3K (o contra una isoforma de PI3K, ver arriba).

Adicionalmente, en otra modalidad preferida, una vez se ha establecido la identidad del socio de unión co-eluido por análisis de espectrometría de masa, se puede detectar cada socio de unión con anticuerpos específicos dirigidos contra esta proteína.

Ensayos basados en anticuerpos adecuados incluyen pero no se limitan a Western blots, ensayos ELISA, ensayos ELISA emparedado y disposiciones de anticuerpo o una combinación de éstos. El establecimiento de tales ensayos se conocen en la técnica (Chapter 11, Immunology, páginas 11-1 a 11-30 en: Short Protocols in Molecular Biology. Fourth Edition, Editado por F.M. Ausubel et al., Wiley, New York, 1999).

Estos ensayos no solo se pueden configurar en una forma para detectar y cuantificar una proteína de interés que interactúa con PI3K (por ejemplo una subunidad catalítica o reguladora de un complejo PI3K), sino también analizar los patrones de modificación post-conversionales tal como modificación de ubiquitina o fosforilación.

Adicionalmente, los métodos de identificación de la invención involucran el uso de compuestos que se prueban por su capacidad para hacer un compuesto que interactúa con PI3K.

Principalmente, de acuerdo con la presente invención tal un compuesto puede ser cada molécula que es capaz de interactuar con PI3K, por ejemplo al inhibir su unión al ligando 1 feniltiazol. Preferiblemente, el compuesto tiene un efecto sobre el PI3K, por ejemplo un efecto estimulador o inhibidor.

Preferiblemente, dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de compuestos químicos de ocurrencia natural o sintética o fármacos sintéticos orgánicos, más preferiblemente moléculas pequeñas, fármacos orgánicos o compuestos de moléculas pequeñas naturales. Preferiblemente, dicho compuesto se identifica partiendo de una colección que contiene tales compuestos. Luego, en el curso de la presente invención, se detecta tal colección.

Tales moléculas no son preferiblemente proteínas o ácidos nucleicos. Preferiblemente, las moléculas pequeñas exhiben un peso molecular de menos de 1000 Da, más preferiblemente menos de 750 Da, más preferiblemente menos de 500 Da.

Una "colección" de acuerdo con la presente invención se relaciona con una colección (en su mayoría grande) de (numerosas) diferentes entidades químicas que se proporcionan en una forma clasificada que permite un análisis funcional rápido (detección) de las diferentes entidades individuales, y al mismo tiempo proporcionan una identificación rápida de las entidades individuales que forman la colección. Ejemplos son colecciones de tubos o pozos o manchas sobre superficies que contienen compuestos químicos que se pueden agregar a las reacciones con uno o más socios de interacción potencialmente definidos en una forma de alto rendimiento. Después de la identificación de una interacción "positiva" deseada de ambos socios, el compuesto respectivo se puede identificar rápidamente debido a la construcción de la colección. Las colecciones de origen natural y sintético se pueden comprar o diseñar por el
experto.

Se proporcionan ejemplos de construcciones de colecciones en, por ejemplo, Breinbauer R, Manger M, Scheck M, Waldmann H. Natural product guided compound library development. Curr Med Chem. 2002 Dec;9(23):2129-45, en donde se describen productos naturales que son puntos de partida biológicamente validados para el diseño de colecciones de combinación, ya que ellos tienen un registro probado de relevancia biológica. Este papel especial de los productos naturales en la química medicinal y la biología química se puede interpretar en claridad de nuevas ideas acerca de la arquitectura de dominio de las proteínas ganada por la biología estructural y bioinformática. Con el fin de cumplir los requerimientos específicos del bolsillo de unión individual dentro de una familia de dominio puede ser necesario optimizar la estructura de producto natural mediante variación química. La química de fase sólida se dice que llega a ser una herramienta eficiente para este proceso de optimización, y a veces recientes en este campo se resaltan en este artículo de revisión. Otras referencias relacionadas incluyen Edwards PJ, Morrell AI. Solid-phase compound library synthesis in drug design y development. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Jul; 5(4):594-605.; Merlot C, Domine D, Church DJ. Fragment analysis in small molecule discovery. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 May; 5(3):391-9. Review; Goodnow RA Jr. Current practices in generation of small molecule new leads. J Cell Biochem Suppl. 2001;Supp 1 37:13-21; que describe que el proceso de descubrimiento de fármacos actual en muchas compañías farmacéuticas requiere grandes y crecientes colecciones de estructuras de alta calidad para uso en ensayos de detección de alto rendimiento. Las colecciones de moléculas pequeñas con diversas estructuras y propiedades "similares a fármaco" en el pasado, se han adquirido por varios medios: al archivar esfuerzos de optimización internos previos, mediante compra de nuevos vendedores, y por unión de colecciones separadas luego de fusiones de compañías. Aunque se describe la química de alto rendimiento/combinatoria por ser un componente importante en el proceso de nueva generación, la selección de diseño de colección para la síntesis y posterior diseño de miembros de colección ha involucrado un nuevo nivel de reto e importancia. Los potenciales beneficios de detectar múltiples diseños de colección de compuestos de moléculas pequeñas contra múltiples objetivos biológicos ofrecen sustancial oportunidad para descubrir nuevas estructuras líderes.

En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto de la invención, la preparación de proteína que contiene PI3K se incuba primero con el compuesto y luego con el ligando 1 feniltiazol inmovilizado. Sin embargo, se prefiere igualmente la incubación simultanea del compuesto y el ligando 1 feniltiazol (co-incubación) con la preparación de proteína que contiene PI3K (ensayo de unión competitivo).

En el caso en que la incubación con el compuesto sea primero, el PI3K se incuba primero preferiblemente con el compuesto durante 10 a 60 minutos, más preferiblemente 30 a 45 minutos a una temperatura de 4ºC a 37ºC, más preferido 4ºC A 25ºC, más preferido 4ºC. Preferiblemente los compuestos se utilizan en concentraciones que varían de 1 \muM a 1 \muM, preferiblemente de 10 a 100 \muM. la segunda etapa, poner en contacto con el ligando inmovilizado, se desarrolla preferiblemente durante 10 a 60 minutos a 4ºC.

En el caso de la incubación simultanea, el PI3K se incuba simultáneamente y preferiblemente con el compuesto y el ligando 1 feniltiazol durante 30 a 120 minutos, más preferiblemente 60 a 120 minutos a una temperatura de 4ºC a 37ºC, más preferido 4ºC a 25ºC, más preferido 4ºC. Preferiblemente se utilizan compuestos en concentraciones que varían de 1 \muM a 1 mM, preferiblemente de 10 a 100 \muM.

Adicionalmente, las etapas a) a c) del segundo aspecto de la invención se pueden desarrollar con varias preparaciones de proteínas con el fin de probar diferentes compuesto. Esta modalidad es especialmente interesante en el contexto de detección media o de alto rendimiento (ver adelante).

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En una modalidad preferida del método de la invención de acuerdo con un tercer o cuarto aspecto, una cantidad reducida del complejo ligando 1 feniltiazol - PI3K formado en la etapa c) en comparación con la etapa b) indica que el PI3K es un objetivo del compuesto. Esto resulta del hecho de que en la etapa c) de este método de la invención, el compuesto compite con el ligando para la unión del PI3K. Si menos de PI3K está presente en la alícuota incubada con el compuesto, esto significa preferiblemente que el compuesto ha competido con el inhibidor para la interacción con la enzima y, por lo tanto, es un objetivo directo de la proteína y viceversa.

Preferiblemente, los métodos de identificación de la invención se desarrollan como una detección media o de alto rendimiento.

El compuesto de interacción identificado de acuerdo con la presente invención se puede caracterizar adicionalmente al determinar si este tiene un efecto sobre el PI3K, por ejemplo sobre su actividad quinasa (Carpenter et al., 1990, J. Biol. Chem. 265,19704-19711). Tales ensayos se conocen en la técnica, también en un formato que permite la detección media o de alto rendimiento (Fuchikami et al., 2002, J. Biomol. Screening 7,441-450).

En resumen, la actividad de quinasa lípida PI3K se puede medir utilizando ensayos basados en solución con vesículas de fosfolípidos. La reacción se termina por la adición de disolventes orgánicos ácidos y posterior separación de fase por extracción o análisis de cromatografía de capa delgada (Carpenter et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 19704-19711).

Alternativamente, se puede utilizar un formato de ensayo de polarización de fluorescencia. En resumen, el PI3K se incuba con un sustrato de fosfoinositol adecuado. Después que se termina la reacción los productos de reacción se mezclan con una proteína detectora de fosfoinositol específica y una sonda de fosfoinositol fluorescente. Los valores de polarización (mP) cuando la unión a sonda para la proteína detectora de fosfoinositol se desplaza por el producto de reacción. El grado de polarización de la zona fluorescente es inversamente proporcional a la cantidad del producto de reacción PI3K (Drees et al., 2003, Comb. Chem. HighThroughout Screening 6, 321-330).

Para la determinación de la actividad de proteína quinasa PI3K se puede utilizar un ensayo de polarización de fluorescencia con un péptido adecuado substratecan. En resumen, se puede incubar un péptido etiquetado con fluoresceína con PI3K (por ejemplo PI3K delta), ATP y un anticuerpo anti-fosfoserina. Cuando la reacción procede, el péptido fosforilado se une al anticuerpo anti-fosfoserina, que resulta en un incremento en la señal de polarización. Los compuestos que inhiben el resultado quinasa en una señal de baja polarización.

Los compuestos identificados de acuerdo con la presente invención se pueden optimizar adicionalmente (optimización líder). Esta optimización posterior de tales compuestos se acelera frecuentemente debido a la información de relación de actividad-estructura (SAR) codificada en estas colecciones de generación líder. La optimización líder se facilita frecuentemente debido a los métodos de química de alto rendimiento (HTC) de aplicación instantánea para las siguientes síntesis.

Un ejemplo de tal una colección y optimización líder se describen para el gama PI3K (Pomel et al., 2006, J. med. Chem. 49, 3857-3871).

La invención describe adicionalmente un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende las etapas de

a) Identificar un compuesto que interactúa con PI3K como se describió anteriormente, y

b) Formular el compuesto de interacción con una composición farmacéutica.

Por lo tanto, la invención describe un método para la preparación de composiciones farmacéuticas que se pueden administrar a un sujeto en una cantidad efectiva. El terapéutico se puede purificar sustancialmente. El sujeto a ser tratado puede ser un animal que incluye, pero no se limita a animales tales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y puede ser un mamífero, por ejemplo humano, o un mamífero no humano.

Los compuestos identificados de acuerdo con la invención son útiles para la preparación o tratamiento de enfermedades en donde el PI3K juega un papel tal como cáncer (por ejemplo cáncer de mama, colon u ovario), trastornos metabólicos (por ejemplos diabetes y obesidad) o trastornos autoinmunes/inflamatorios (por ejemplo artritis reumática, soriasis, enfermedad de Crohn colitis ulcerativa asma o reacciones alérgicas).

Por consiguiente, la presente invención también se relaciona con el uso de un compuesto identificado por los métodos de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una o más de las enfermedades mencionadas anteriormente. Adicionalmente, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto.

En general, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un terapéutico, y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listado en la farmacopea estado anídense u otra farmacopea reconocida generalmente para uso en animales, y más particularmente, en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra el terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tal como agua y aceites, que incluyen aquellos de origen animal, vegetal, sintético o petróleo, que incluye pero no se limitan a aceite de maní, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra oralmente. La Salina y dextrosa acuosa son portadores preferidos cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y dextrosa acuosa y soluciones de glicerol se emplean preferiblemente como portadores líquidos para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agente emulsificantes o hidratantes, o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones también pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, capsulas, polvo, formulaciones de liberaciones sostenidas y similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes tradicionales y portadores tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores estándar tal como manitol de grado farmacéutico, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del terapéutico, preferiblemente en forma pura, junto con una cantidad adecuada de portador con el fin de proporcionar la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación se debe adecuar al modo de administración.

En una modalidad preferida, se formula la composición, de acuerdo con procedimientos de rutina, cuando una composición farmacéutica se adapta para administración intravenosa al ser humano. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en amortiguador acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran separadamente o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o bolsa que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se administra por infusión, esta se puede dispensar con una botella de infusión que contiene solución salina o agua grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua o solución salina estéril para inyección con el fin de que los ingredientes se puedan mezclar antes de
administración.

Los terapéuticos de la invención se pueden formular como formas de sal o neutras. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos carboxilos libres tales como aquellas derivadas de ácido clorhídrico fosfórico, acético, oxálico, tartárico etc., aquellas formadas con grupos aminas libres tales como aquellas derivadas de isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc., y aquellas derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, e hidróxidos férricos, etc.

La cantidad del terapéutico de la invención que será efectiva en el tratamiento de un trastorno particular o afección dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y se puede determinar por técnicas clínicas estándar. Adicionalmente, se pueden emplear opcionalmente ensayos in Vitro para ayudar a identificar los rangos de dosificación óptimos. La dosis precisa a ser empleada en la formulación también dependerá de la ruta de administración, y la seriedad de la enfermedad o trastorno, y se debe decidir de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. Sin embargo, los rangos de dosificación adecuados para administración intravenosa son generalmente aproximadamente 20-500 microgramos de compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los rangos de dosificación adecuados para administración intranasal son generalmente aproximadamente 0.01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. La dosis efectiva se puede extrapolar a partir de curvas de dosis-respuestas derivadas de sistemas de prueba de modelo animal o in Vitro. En general, los supositorios pueden contener ingrediente activo en el rango de 0.5% a 10% en peso; formulaciones orales contienen preferiblemente 10% a 95% de ingrediente
activo.

Varios sistemas de suministros se conocen y se pueden utilizar para administrar un terapéutico de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, y microcápsulas: uso de células recombinantes capaces de expresar el terapéutico, uso de endocitosis mediada por receptor (e.g., Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432); construcción de un ácido nucleico terapéutico como parte de un retrovírico u otro vector, etc. Métodos de inducción incluyen pero no se limitan a rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, y oral. Los compuestos se pueden administrar mediante una ruta conveniente, por ejemplo por infusión, por inyección de bolo, por absorción a través de recubrimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal y intestinal, etc.), y se puede administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Adicionalmente puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención dentro del sistema nervioso central mediante cualquier ruta adecuada, que incluye inyección intraventricular e intratraqueal; la inyección intraventricular se puede facilitar mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, adherido a un reservorio, tal como un reservorio Ommaya. La administración pulmonar también se puede emplear, por ejemplo mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente
aerolizantes.

En una modalidad específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área en necesidad de tratamiento. Esto se puede lograr al, por ejemplo, y no por vía de limitación, infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, en conjunto con un vendaje para herida después de cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, dicho implante es de un material poroso, no poroso o gelatinoso, que incluye membranas, tal como membranas sialástica, o fibras. En una modalidad, la administración puede ser mediante inyección directa en el sitio, (o sitio anterior) de un tumor maligno o tejido neoplásico o pre-neoplásico.

En otra modalidad, el terapéutico se puede suministrar en una vesícula, en particular un liposoma (Langer, 1990, Science 249:1527-1533).

En aún otra modalidad, el terapéutico se puede suministrar por vía de sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (Langer, supra). En aún otra modalidad, un sistema de liberación controlada se puede colocar en proximidad al objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, requiriendo así una fracción de la dosis sistémica.

La invención se relaciona adicionalmente con un método para la purificación of PI3K, que comprenden las etapas de

a) Proporcionar una preparación de proteína que contiene PI3K,

b) Poner en contacto la preparación de proteína con el ligando 1 feniltiazol inmovilizado en un soporte sólido bajo condiciones que permiten la formación de de un complejo de ligando 1 feniltiazol - PI3K, y

c) Deparar el PI3K del ligando 1 feniltiazol inmovilizado.

Como se menciono anteriormente, se ha encontrado sorprendentemente que el ligando 1 feniltiazol es un ligando que reconoce el PI3K. Esto permite métodos de purificación eficientes para PI3K.

Con respecto al PI3K, la preparación de proteína que contiene PI3K, las condiciones para poner en contacto el ligando 1 feniltiazol, ligando 1 feniltiazol inmovilizado, complejo de ligando 1 feniltiazol-PI3K, la separación de PI3K del ligando 1 feniltiazol inmovilizado, y la detección de PI3K o la determinación de su cantidad, las modalidades como se definió anteriormente para los métodos de identificación de la invención también aplican al método de purificación de la invención.

En una modalidad preferida, el método de purificación comprende adicionalmente la etapa de purificar una isoforma específica o isoformas especificas de PI3K, preferiblemente la etapa de purificar PI3K gama y/o PI3K delta.

Preferiblemente, dicha purificación se desarrolla utilizando un anticuerpo específico de isoforma como se explico anteriormente, más preferiblemente una anticuerpo específico PI3K gama y/o un anticuerpo específico PI3K
delta.

En una modalidad preferida, el método de purificación de la invención comprende adicionalmente después de la etapa c) la identificación de proteínas que son capaces de unirse al PI3K. Esto es especialmente interesante cuando la formación del complejo se desarrolla bajo condiciones esencialmente fisiológicas, ya que es posible luego preservar la condición natural de la enzima que incluye la existencia de socios de unión, subunidades de enzima o modificaciones post-conversionales, que luego se puede identificar con la ayuda de espectrometría de masa (MS).

Por consiguiente, en una modalidad preferida, el método de purificación de la invención comprende adicionalmente después de la etapa c) la determinación de si el PI3K se modifica post-conversionalmente adicionalmente, por ejemplo mediante modificación de ubiquitina.

La invención se relaciona adicionalmente con el uso de ligando 1 feniltiazol para la identificación de compuestos de interacción PI3K y para la purificación del PI3K. Las modalidades como se definió anteriormente también aplican a los usos de la invención.

La invención se ilustra adicionalmente mediante las siguiente Figuras y ejemplos, que no se consideran limitantes del alcance de protección conferida por las reivindicaciones de la presente solicitud.

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Descripción corta de las figuras

Figura 1

Síntesis y estructura del ligando 1 feniltiazol

El ligando 1 feniltiazol se sintetiza como se describe en el ejemplo 1.

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Figura 2

Experimento de debilitamiento de fármaco con ligando 1 feniltiazol inmovilizado y detección Western de las proteínas PI3K

Se utiliza como material biológico un lisato celular preparado de células MOLT-4. El experimento de debilitamiento de fármaco se desarrolla como se describe en el Ejemplo 2 con muestras de lisato que contienen 50 mg de proteínas. Las proteínas capturadas se eluyen con DMSO que contiene amortiguador (línea 1), 100 \muM del ligando 1 feniltiazol libre o amortiguador de muestra SDS (línea 3). Las muestras eluidas se separan sobre geles SDS-poliacrilamida y se transfieren a las membranas. Los blots primero se incuban con anticuerpos específicos dirigidos contra Gamma PI3K (Figura 2A) y Delta PI3K (Figura 2B). La detección secundaria de los anticuerpos etiquetados con tintes fluorescentes para detección se utilizan con el sistema de formación de imagen infrarojo Odyssey. Línea 1: Control de elusión DMSO; línea 2: elusión con 100 \muM ligando libre 1 feniltiazol; línea 3: elusión SDS.

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Figura 3

Experimento de debilitamiento de fármaco con ligando 1 feniltiazol inmovilizado para análisis de espectrometría de masa de las proteínas

Se muestra un gel de proteína después de teñido con azul Coomassie. Las áreas de gel indicadas se cortan como piezas de gel y las proteínas se someten a análisis por espectrometría de masa. El experimento de debilitamiento de fármaco se desarrolla como se describe en el Ejemplo 2 con una muestra de lisato celular MOLT-4 que contiene 50 mg de proteínas. Las proteínas unidas al ligando 1 feniltiazol inmovilizado se eluye con amortiguador de muestras SDS y se separa por Electrofóresis de gel SDS poliacrilamida (SDS-PAGE).

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Figura 4

Péptidos identificados de Gamma PI3K

Los péptidos que se identifican mediante análisis de espectrometría de masa de la secuencia Delta PI3K humana se muestran en letras en negrilla y subrayadas.

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Figura 5

Péptidos identificados de Delta PI3K

Los péptidos que se identifican mediante análisis de espectrometría de masa de la secuencia Gamma PI3K humana se muestran en letras en negrilla y subrayadas.

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Figura 6

Ensayo de elusión para la identificación de compuestos que interactúan con Gamma PI3K

El experimento se desarrolla como se describe en el ejemplo 3. La proteína Gamma PI3K se captura mediante el ligando 1 feniltiazol inmovilizado del lisato celular MOLT-4 y se eluye mediante los compuestos como se indica. Los eluados se transfieren a una membrana nitrocelulosa y el Gamma PI3K se detecta con el sistema de Formación de Imagen Infraroja Odyssey. Primer anticuerpo: anti-Gamma PI3K (Jena Bioscience ABD-026S; anticuerpo de ratón). Segundo anticuerpo: anti-ratón IRDye800 (Rockland, 610-732-124). Se muestra Intensidad Integrada (kilopixel integrado/mm^{2}). Los compuestos utilizados para elusión:

compuesto 1 (LY29004); IC_{50} > 100 \muM; compuesto 2 (AS-605240): IC_{50}=26 nM; compuesto 3 (AS-604850); IC_{50}=1.7 \muM,

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Figura 7

Ensayo de unión competitivo para la identificación de compuestos que interactúan con Gamma PI3K

El experimento se desarrolla como se describe en el ejemplo 4. Se agregan los compuestos de prueba en las concentraciones indicadas y la matriz de afinidad al lisato celular MOLT-4 y la proteína Gamma PI3K que interactúa con compuestos de prueba se captura por el ligando 1 feniltiazol inmovilizado en la matriz de afinidad. La matriz de afinidad se separa del lisato, las proteínas unidas se eluyen con amortiguador de muestra SDS y los eluados se transfieren a una membrana de nitrocelulosa. La cantidad de Gamma PI3K se determina con el sistema de Formación de Imagen Infraroja Odyssey.

7A:

Dot blot probado con anticuerpos y señales detectados con sistema de formación de imagen de infrarojo Odyssey. Primer anticuerpo: anti-Gamma PI3K (Jena Bioscience ABD-026S; anticuerpo de ratón). Segundo anticuerpo: anti-ratón IRDye800 (Rockland, 610-732-124).

7B:

curvas de unión de competición. Se grafican unidades Odyssey relativas (Intensidad integrada; kilopixel integrado/mm^{2}) contra concentraciones del compuesto y valores calculados de competición de unión máxima media (IC). Compuesto 1 (LY294002): IC_{50} > 30 \muM; compuesto 2 (AS-605240): IC_{50} = 4.6 \muM; compuesto 3 (AS-604850): IC_{50} = 176 nM.

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Ejemplo 1

Preparación de la matriz de afinidad

Este ejemplo ilustra la preparación de la matriz de afinidad para captura de afinidad de las quinasas PI3K a partir de los lisatos celulares. El ligando capturado se inmoviliza covalentemente en un soporte sólido a través del ligando covalente utilizando un grupo amino funcional. Esta matriz de afinidad se utiliza en el ejemplo 2, ejemplo 3 y ejemplo 4.

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Síntesis del ligando 1 feniltiazol (clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida)

Etapas 1-3: 1-bromo-1-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-propan-2-ona se prepara siguiendo el procedimiento descrito en la WO 2003/072557.

Etapa 4: 5-(4-cloro-3-metanosufonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-ilamina.

Se combinan 1-bromo-1-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-propan-2-ona (480 mg 1.5 mmol) y tiourea (114 mg 1.5 mmol) en etanol (12 ml) y se calientan a 70ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se le permite enfriar a temperatura ambiente y el producto sólido se recolecta mediante filtración y se seca bajo vacío para proporcionar 5-(4-cloro-3-metanosufonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-ilamina como un sólido blancuzco (375 mg). ^{1}H RMN (400 MHz DMSO- d6) \delta 9.4 (br s, 2H), 8.0 (d, 1H), 7.9 (d, 1H), 7.8 (dd, 1H), 3.4 (s, 3H), 2.3 (s, 3H).

Etapa 5: terc-butil éster de ácido (2-{2-[2-(2-{2-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etil)-carbámico de ácido 3-(2-{2-[2-(2-terc-butoxicarbonilaminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionico (690 mg 1.9 mmol), EDAC (403 mg 2.1 mmol), HOBT (284 mg 2.1 mmol), NMM (420 uL 3.8 mmol) y 5-(4-cloro-3-metanosufonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-ilamina (520 mg 1.7 mmol) se combinan en dimetilformamida (16 ml) y se agita durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se remueve bajo presión reducida y el residuo disuelto en diclorometano (150 ml), se lava con solución acuosa HCl 1M (50 ml) y carbonato de hidrógeno de sodio acuoso saturado (50 ml), se seca (sulfato de magnesio), se filtra y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía flash utilizando 50 g de cartucho flash de sílice IST eluyendo con 0-2% metanol/diclorometano para proporcionar terc-butil éster de ácido (2-{2-[2-(2-{2-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etil)-carbámico como un aceite (1.1 g disolvente residual presente) ^{1}H RMN (400 MHz CDCl_{3}) 10.3 (br s, 1H), 8.2 (s, 1H), 7.6 (m, 2H), 7.2 (br s, 1H), 3.9 (t, 2H) 3.8-3.5 (br m, 14H), 3.3 ( br m, 5H), 2.8 (t, 2H), 2.4 (s, 3H), 1.4 (s, 9H).

Etapa 6: clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida

Se disuelve terc-butil éster de ácido (2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etil)-carbámico (1.0 g 1.5 mmol) en diclorometano (10 ml) y se trata con HCl (4 ml de solución 4M en dioxano). La reacción se agita a temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se evapora y el residuo se seca bajo vacío para proporcionar clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol 2il]-propionamida como un aceite viscoso amarillo (830 mg disolvente residual presente) ^{1}H RMN (400 MHz CDCl_{3}) 8.4 (br s, 3H), 8.2 (s, 1H), 7.7 (br d, 1H), 7.6 (br d, 1H) 3.9 (br m, 4H), 3.8-3.6 (br m, 12H), 3.3 (s, 3H), 3.3 (br m, 2H), 3.1 (br m, 2H), 2.6 (s, 3H).

El espectro de RMN se obtiene en un Bruker dpx400.

TABLA 1 Abreviaturas utilizadas

1

Inmobilización del ligando 1 feniltiazol en glóbulos (matriz de afinidad)

Se equilibra sefarosa activada pro NHS 4 Flujo rápido (Amersham Biosciences, 17-0906-01) con DMSO anhidro (Dimetilsulfóxido, Fluka, 41648, H20 <= 0.005%). 1 ml de glóbulos decantados se coloca en un tubo de 15 ml Falcon, se agrega solución madre del compuesto (usualmente 100 mM en DMF o DMSO) (concentración final 0.2-2 \mumol/ml de glóbulos) así como también 15 \mul de trietilamina (Sigma, T-0886, 99% puro). Los glóbulos se incuban a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador vertical (Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.) durante 16 - 20 horas. La eficacia de acoplamiento se determina por HPLC. Los grupos NHS que no se hacen reaccionar se bloquean por incubación con aminoetanol a temperatura ambiente en el agitador de vertical durante la noche. Los glóbulos se lavan con 10 ml de DMSO y se almacenan en isopropanol a -20ºC. Estos glóbulos se utilizan como la matriz de afinidad en el ejemplo 2, 3 y 4. Los glóbulos de control (sin ligando inmovilizado) se generan al bloquear los grupos NHS por incubación con aminoetanol como se describió anteriormente.

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Ejemplo 2

Debilitamiento de fármaco de PI3K utilizando el ligando 1 feniltiazol inmovilizado

Este ejemplo demuestra el uso del ligando 1 feniltiazol inmovilizado para la identificación de proteínas PI3K de lisatos celulares de una línea celular T humana (células MOLT-4; número ATCC CRL-1582). Para este extremo un lisato de células MOLT-4 se ponen en contacto con la matriz de afinidad descrita en el ejemplo 1. La unión de las proteínas del ligando 1 feniltiazol se identifican por Western blot y análisis de espectrometría de masa (MS).

Para el análisis Western blot las proteínas de unión se eluyen de la matriz de afinidad y posteriormente se separan por electrofóresis de gel SDS-Poliacrilamida. Se detectan Gamma PI3K y Delta PI3K con anticuerpos específicos (Figura 2). Los resultados del análisis Western blot muestran que el ligando 1 feniltiazol inmovilizado captura (debilita) Gamma PI3K y Delta PI3K del lisato celular.

Para la identificación de proteínas mediante análisis de espectrometría de masa las proteínas capturadas por la matriz de afinidad se eluyen y posteriormente se separan por electrofóresis de gel SDS-Poliacrilamida (Figura 3). Bandas de gel adecuadas se cortan y se someten a digestión proteolítica en gel con tripsina y se analiza por espectrometría de masa LC-MS/MS. La identificación de los miembros de la familia PI3K se documenta en la Tabla 3. El cubrimiento de la secuencia de péptido de Gamma PI3K se muestra en la Figura 4 y para Delta PI3K en la Figura 5.

1. Cultivo celular

Las células MOLT-4 (número ATCC 1582) se hacen crecer en frascos Spinner de 1 litro (Integra Biosciences, #182101) en suspensión en medio RPMI 1640 (Invitrogen, #21875-034) complementado con 10% de Suero Bovino Fetal (Invitrogen) en una densidad entre 0.15 x 10^{6} y 1.2 x 10e6 células/ml. Las células se cosechan por centrifugación, se lavan una vez con 1 x amortiguador PBS (Invitrogen, #14190-094) y los glóbulos celulares se congelan en nitrógeno líquido y se almacenan posteriormente a -80ºC.

2. Preparación de lisatos celulares

Las células MOLT-4 se homogenizan en un homogenizador Potter S en amortiguador de lisis: 50 mM Tris-HCl, 0.8% NP40, 5% glicerol, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl_{2}, 25 mM NaF, 1 mM de vanadato de sodio, 1 mM DTT, pH 7.5. Se agrega un comprimido EDTA completo libre (cóctel inhibidor de proteasa, Roche Diagnostics, 1 873 580) por 25 ml de amortiguador. El material se mezcla 10 veces utilizando un POTTER S mecanizado, se transfiere a tubos falcón de 50 ml, se incuba durante 30 minutos en hielo y se centrifuga durante 10 min a 20,000 g a 4ºC (10,000 rpm en Sorvall SLA600, preenfriado). El sobrenadante se transfiere a una ultracentrifuga (UZ)-tubo de policarbonato (Beckmann, 355654) y centrifuga durante 1 hora a 100.000 g a 4ºC (33.500 rpm en Ti50.2, preenfriado). El sobrenadante se transfiere de nuevo a un tubo falcón fresco de 50 ml, la concentración de proteína se determina mediante un ensayo Bradford (BioRad) y se preparan las muestras que contienen 50 mg de proteínas por alícuota. Las muestras se utilizan inmediatamente para todos los experimentos o se congelan en nitrógeno líquido y se almacenan congeladas a -80ºC.

3. Experimento de avance de compuesto

Los glóbulos de sefarosa con el compuesto inmovilizado (100 \mul glóbulos por experimento centrifugado) se equilibran en amortiguador de lisis y se incuban con una muestra de lisato celular que contiene 50 mg de proteínas en un agitador vertical (Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.) durante 2 horas a 4ºC. Los glóbulos se recolectan, se transfieren a columnas Mobicol (MoBiTech 10055) y se lavan con 10 ml de amortiguador de lisis que contiene 0.5% de detergente NP40, seguido por 5 ml de amortiguador de lisis con 0.25% de detergente. Para eluir la proteína unida, se agrega 60 \mul de 2 x Amortiguador de muestra SDS, la columna se calienta durante 30 minutos a 50ºC y el eluado se transfiere a un tubo microfuga por centrifugación. Las proteínas luego se separan por electrofóresis SDS poliacrilamida (SDS-PAGE).

4. Detección de proteína mediante análisis Western blot

Se desarrollan Western blots de acuerdo con procedimientos estándar y las proteínas PI3K se detectan y cuantifican al utilizar anticuerpos anti-PI3K específicos (primer anticuerpo), un segundo anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente y el sistema de formación de imagen infrarojo Odyssey de LI-COR Biosciences (Lincoln, Nebraska, USA) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Schutz-Geschwendener et al., 2004. Quantitative, two-color Western blot detection with infrared fluorescence. Publicado en Mayo 2004 por LI-COR Biosciences, www.licor.com).

El anticuerpo anti Gamma PI3K de ratón (Jena Bioscience, catalogo número ABD-026S) se utiliza en una dilución de 1:200 y se incuba con el blot durante la noche a 4ºC. El anticuerpo anti-ratón IRDye^{TM} 800 secundario (Rockland, catalogo número 610-732-124) se utiliza en una dilución de 1:15000. El anticuerpo anti Delta PI3K de conejo (Santa Cruz, catálogo número sc-7176 se diluye 1:600 y se incuba durante la noche a 4ºC. Como un anticuerpo de detección secundario el anticuerpo IRDyeTM 800 anticonejo se diluye 1:20 000 (LICOR, catálogo número 926-32211).

5. Identificación de proteína mediante Espectrometría de masa 5.1 Digestión de proteína antes de análisis espectrométrico de masa

Las proteínas separadas por gel se reducen, alquilatan y digieren en gel siguiendo esencialmente el procedimiento descrito por Shevchenko et al., 1996, Anal. Chem. 68: 850-858. Brevemente, las proteínas separadas por gel se cortan y retiran del gel utilizando un escalapelo limpio, se reduce utilizando 10 mM de DTT (en 5 mM de bicarbonato de amonio, 54ºC, 45 min) y posteriormente se alquilatan con 55 mM de yodoacetamida (en 5 mM de bicarbonato de amonio) a temperatura ambiente en la oscuridad (30 minutos). Las proteínas reducidas y alquilatadas se digieren en gel con tripsina de porcino (Promega) a una concentración de proteasa de 12.5 ng/\mul en 5 mM de bicarbonato de amonio. La digestión se le permite proceder durante 4 horas a 37ºC y la reacción se detiene posteriormente utilizando 5 \mul de 5% de ácido fórmico.

5.2 Preparación de la muestra antes de análisis mediante espectrometría de masa

Se extrae tapones gel dos veces con 20 \mul 1% de TFA y se agrupan con sobrenadantes digeridos ácidificados. Se secan las muestras en una centrífuga de vacío y se resuspenden en 10 \mul 0.1% de ácido fórmico.

5.3. Adquisición de datos espectrométricos de masa

Las muestras de péptido se inyectan en un sistema LC nano (CapLC, Waters o Ultimate, Dionex) que se acopla directamente a un cuadripolo TOF (QTOF2, QTOE Ultima, QTOF Micro, Micromasa) o espectrómetro de masa de trampa de ión (LCQ Deca XP). Los péptidos se separan en el sistema LC utilizando un gradiente de disolventes orgánicos y acuosos (ver adelante). Disolvente A es 5% acetonitrilo en 0.5% de ácido fórmico y disolvente B es 70% acetonitrilo en 0.5% de ácido fórmico.

TABLA 2 Péptidos que se eluyen del sistema LC se secuencian parcialmente dentro del espectrómetro de masa

2

5.4. Identificación de la proteína

La masa de péptido y los datos de fragmentación generados en los experimentos LC-MS/MS se utilizan para solicitar la proteína formateada fasta y las bases de datos de la secuencia de nucleótido mantenidas y actualizadas regularmente en el NCBI (para el NCBInr, dbEST y los genomas de ratón y humanos) y el Instituto de Bioinformática Europeo (EBI, para las bases de datos humanas, de ratón, de proteome D. melanogaster y C. elegans). Las proteínas se identifican mediante la correlación de la masa de péptido medida y los datos de fragmentación con los mismos datos computados de las entradas en la base de datos utilizando el software tool Mascot (Matrix Science; Perkins et al., 1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using spectrometry of mass data. Electrophoresis 20, 3551-3567).

\hbox{Los criterios de búsqueda varían dependiendo de qué
espectrómetro  de masa se utiliza para el análisis.}

TABLA 3 Proteínas PI3K identificadas por espectrometría de masa (células MOLT-4; experimento P15234B; muestra MS que se refiere a la pieza de gel cortada del gel de poliacrilamida (Figura 3)

3

4

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Ejemplo 3

Ensayo de elusión para la identificación de compuestos que interactúan con Gamma PI3K

La preparación de la matriz de afinidad del ligando 1 feniltiazol se hace como se describe en el ejemplo 1. Para detectar de forma máxima 80 compuestos en una placa de 96 pozos, el experimento de elusión se desarrolla como se describe adelante.

Ensayo de elusión

La matriz de afinidad (1200 \mul de glóbulos) se lava 2 x con 30 ml 1x amortiguador DP. Después de cada etapa de lavado los glóbulos se recolectan por centrifugación durante 2 minutos a 1200 rpm a 4ºC en una centrifuga Heraeus. Los sobrenadantes se descargan. Finalmente, los glóbulos se equilibran en 15 ml de amortiguador de ligado (1x amortiguador DP/0.4% NP40). Después de este tiempo de incubación los glóbulos se cosechan y se mezclan en un tubo falcón de 50 ml con un lisato celular MOLT-4 a una concentración de proteína de 5 mg/ml con una cantidad total de 75 mg de proteína. La preparación del lisato se hace como se describe en el ejemplo 2. Los glóbulos y el lisato se incuban durante 2 horas a 4ºC. Después de la incubación con el lisato los glóbulos se recolectan por centrifugación como se describe y se transfiere a columnas de 2 ml (MoBiTec, #S10129) y se lava con 10 ml 1x amortiguador DP/0.4% NP40 y 5 ml 1x amortiguador DP/0.2% NP40. Una vez el amortiguador de lavado ha corrido a través de la columna completamente se calcula el volumen de los glóbulos dejados en la columna (aproximadamente 1000 \mul). Los glóbulos se resuspenden en exceso de 4 veces de 1x amortiguador DP/0.2% NP40 (4 ml) para generar una suspensión al 20%. Para las pruebas de elusión del compuesto 50 \mul de esta suspensión se agrega a cada pozo de una placa de 96 pozos (Millipore MultiScreenHTS, MSBVN 1210, con tapa y 1.2um de membrana Durapore de ligado de proteína baja hidrófila). Para remover el amortiguador residual la placa de 96 pozos se ensambla con filtro de Assemble y la placa de recolección y este ensamble de emparedado se centrifuga durante 10 segundos a 800 rpm en una centrifuga. Luego 40 \mul de amortiguador de elusión (1x amortiguador DP/0.2% NP40) complementado con el compuesto de prueba se agrega a los glóbulos. Los compuestos de prueba se preparan al diluirlos en el amortiguador de dilución partiendo de solución madre concentrada 40 veces en DMSO. La placa se ensambla en la placa de recolección, se fija en un incubador Eppendorf y se incuba durante 30 minutos a 4ºC en agitación a 650 rpm. Para cosechar el eluado la placa de filtro de 96 pozos se ensambla en la placa de recolección de 96 pozos se centrifuga durante 1 minuto a 800 rpm en una centrifuga de tabla superior a 4ºC (Heraeus). Los eluados se revisan parar la presencia de gamma PI3K y delta PI3K al utilizar un procedimiento dot blot.

Detección de Gamma PI3K eluado

La proteína Gamma PI3K eluada se detecta y se cuantifica por un procedimiento dot blot utilizando un anticuerpo dirigido contra Gamma PI3K (Jena Bioscience, # ABD-026S), un antiratón secundario etiquetado fluorescentemente IRDye^{TM} 800 (Rockland, #610-732-124) y el sistema de Formación de Imagen Infraroja Odyssey de LI-COR Biosciences (Lincoln, Nebraska, USA) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Schutz-Geschwendener et al., 2004. Quantitative, twocolor Western blot detection with infrared fluorescence. Publicado en Mayo 2004 por LI-COR Biosciences, www.licor.com).

Las membranas de nitrocelulosa se tratan con 20% de etanol y posteriormente se lava con 1 x amortiguador PBS. Los eluados (como se describió anteriormente) se combinan con 12 \mul de 4 x amortiguador de carga SDS (200 mM Tris-HCl pH6.8, 8% SDS, 40% glicerol, 0.04% azul Bromfenol) y se aplica a la membrana de Nitrocelulosa con un aparato dot blot BioRad (BioRad, #170-6545).

Para la detección de las membranas Gamma PI3K primero se bloquean por incubación con amortiguador de bloqueo Odyssey durante 1 hora. Las membranas de bloqueo se incuban durante 16 horas a 4ºC con el primer anticuerpo (antiratón Gamma PI3K de Jena Bioscience, ABD-026S) se diluye 1:100 en amortiguador de bloqueo Odyssey complementado con 0.2% Tween 20. Después de lavar la membrana cuatro veces durante 5 minutos con 1 x amortiguador PBS que contiene 0.1% Tween 20 la membrana se incuba durante 40 minutos con el anticuerpo de detección (anti-ratón IRDye^{TM} 800 de Rockland, 610-732-124), diluido 1: 10 000 en amortiguador de bloqueo Odyssey complementado con 0.2% Tween 20. Luego de esto la membrana se lava cuatro veces durante 5 minutos con 1 x amortiguador PBS/0.1% Tween 20 y una vez durante 5 minutos con 1 x amortiguador PBS. Luego de esto la membrana se escanea con el lector Odyssey y se analizan los datos.

TABLA 5 Preparación de amortiguador 5x-DP

5

El 5x-amortiguador DP se filtra a través de un filtro 0.22 \mum y se almacena en alícuotas de 40 ml - 80ºC. Estas soluciones se obtienen de los siguientes proveedores: 1.0 M Tris/HCl pH 7.5 (Sigma, T-2663), 87% Glicerol (Merck, catalogo número 04091.2500); 1.0 M MgCl_{2} (Sigma, M-1028); 5.0 M NaCl (Sigma, S-5150).

Compuestos de prueba para elusión

Se utilizan los compuestos de prueba listados adelante para experimentos de elusión después de dilución como se describe adelante. Típicamente todos los compuestos se disuelven en 100% DMSO (Fluka, cat.no 41647) en una concentración de 100 mM o 50 mM. Los compuestos se almacenan a -20ºC. La dilución de los compuestos de prueba para experimentos de elusión: Preparar solución madre 50 mM al diluir la solución madre de100 mM 1:1 con 100% DMSO. Para experimentos de elusión se diluye adicionalmente el compuesto con amortiguador de elusión (1x amortiguador DP/0.2% NP40). Los compuestos utilizados para elusión:

compuesto 1:

inhibidor PI3K LY29004 (Tocris 1130; Vlahos et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 5241-5248).

compuesto 2:

inhibidor Gamma PI3K (Calbiochem 528106; AS-605240; Camps et al., 2005, Nature Medicine 11, 936-943).

compuesto 3:

inhibidor II Gamma PI3K (Calbiochem 528108; AS-604850; Camps et al., 2005, Nature Medicine 11, 936-943).

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Ejemplo 4

Ensayo de unión competitivo para la identificación de compuestos que interactúan con Gamma PI3K

Estos ejemplos demuestran un ensayo de unión competitivo en cuyos compuestos de prueba se agregan directamente en un lisato celular. Los compuestos de prueba (en varias concentraciones) y la matriz de afinidad con el ligando 1 feniltiazol inmovilizado se agregan a las alícuotas de lisato y se les permite unirse a las proteínas contenidas en la muestra de lisato. Después del tiempo de incubación las proteínas capturadas con glóbulos se separan del lisato. Las proteínas de unión luego se eluan y la presencia de Gamma PI3K se detecta y se cuantifica utilizando un anticuerpo específico en un procedimiento dot blot y el sistema de detección infrarojo Odyssey (Figura 7A). Se generan las curvas de respuesta de dosis para tres compuestos (Figura 7B).

Lavado de la matriz de afinidad

La matriz de afinidad como se describe en el ejemplo 1 (1.1 ml de volumen seco) se lava dos veces con 15 ml de 1x amortiguador DP que contiene 0.4% NP40 y luego se resuspende en 5.5 ml de 1x amortiguador DP que contiene 0.4% NP40 (20% suspensión de glóbulos).

Preparación de compuestos de prueba

Las soluciones madre de los compuestos de prueba se preparan en DMSO que corresponde a una concentración mayor de 100 veces comparada con la concentración de prueba deseada final (por ejemplo una solución madre 4 mM se prepara para una concentración de prueba final de 4 PM). Este esquema de disolución resulta en una concentración final DMSO de 1%. Para experimentos de control (sin compuesto de prueba) un amortiguador que contiene 1% DMSO se utiliza dado que todas las muestras de ensayo contienen 1% DMSO.

compuesto 1:

inhibidor PI3K LY29004 (Tocris 1130; Vlahos et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 5241-5248).

compuesto 3:

inhibidor II Gamma PI3K (Calbiochem 528108; AS-604850; Camps et al., 2005, Nature Medicine 11, 936-943).

compuesto 4

(CZC00015387).

Los lisatos celulares se preparan como se describe en el ejemplo 2. Para un experimento típico la alícuota de lisato que contiene 50 mg de proteínas se descongela en un baño de agua a 37ºC y luego se mantiene a 4ºC. Para el lisato un volumen de 1x amortiguador DP se agrega dado se alcanza que una concentración final de NP40 de 0.4%. Luego, se agrega 1/50 del volumen final de una solución de inhibidor proteasa concentrada 50 veces (1 comprimido de inhibidor proteasa disuelto en 0.5 ml de 1x amortiguador DP que contiene 0.4% NP40; el cóctel de inhibidor proteasa de comprimido libre EDTA de Roche Diagnostics, catálogo número 41647). El lisato se diluye adicionalmente al agregar 1x amortiguador

\hbox{DP que contiene 0.4% NP40 de modo que se
alcanza una concentración  final de proteína de 5 mg/ml.}

Incubación del lisato con el compuesto de prueba y matriz de afinidad

Un volumen de 100 \mul del lisato diluido se dispensa en cada pozo de una placa de filtro de 96 pozos. Luego se agrega 1.5 \mul del compuesto de ensayo diluido en DMSO. Para las reacciones de control se utilizan 1.5 \mul DMSO sin el compuesto de ensayo. Luego se agregan 50 \mul de la matriz de afinidad (20% de suspensión) por pozo. La placa se incuba durante 2 horas a 4ºC en un agitador (750 rpm en un Thermomixer, Eppendorf).

La placa se lava utilizando un instrumento de vacío múltiple (Millipore, MAVM 096 0R). Cada pozo se lava 4 veces con 400 \mul de 1x amortiguador DP que contiene 0.4% NP-40 y 2 veces con 400 \mul con 1x amortiguador DP que contiene 0.2% NP-40. Para elusión la placa de filtro se coloca en una placa de recolección y 40 \mul de 2x amortiguador de ensayo (100 mM TrisHCl, pH 6.8; 4% SDS; 20% glicerol; 0.02% azul Bromfenol) con DTT (50 mM concentración final) se agrega a cada pozo. Las placas se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador (750 rpm en un Thermomixer, Eppendorf). Posteriormente las placas se centrifugan durante 2 minutos a 1100 rpm (centrífuga Heraeus) y el eluado se recolecta en los pozos de la placa de recolección.

Detección y cuantificación de Gamma PI3K eluido

La proteína Gamma PI3K en los eluados se detecta y cuantifica mediante un procedimiento dot blot utilizando un primer anticuerpo dirigido contra Gamma PI3K (anti Gamma PI3K de Jena Bioscience, ABD-026S) y un anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente (anti-ratón IRDye^{TM} 800, de Rockland, 610-732-124). El sistema de formación de imagen de infrarojo Odyssey de LI-COR Biosciences (Lincoln, Nebraska, USA) se opera de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Schutz-Geschwendener et al., 2004. Quantitative, two-color Western blot detection withinfrared fluorescence. Publicado en Mayo 2004 por LI-COR Biosciences, www.licor.com).

El aparato dot blot se utiliza de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Bio-Dot microfiltration apparatus, BioRad 170-65). Las membranas de nitrocelulosa (BioTrace NT Nitrocelulosa, PALL BTNT30R) se tratan con 20% etanol y posteriormente se lavan con amortiguador PBS. Por punto 30 \mul de la muestra eluada se aplican y dejan durante 30 min antes de que se aplique una bomba de vacío.

Para la detección de las membranas Gamma PI3K primero se bloquean por incubación con amortiguador de bloqueo Odyssey (LICOR, 927-40000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas de bloqueo luego se incuban durante 16 horas a 4ºC con el primer anticuerpo (anti Gamma PI3K de Jena Bioscience, ABD-026S) que se diluye en el amortiguador de bloqueo Odyssey que contiene 0.2% Tween-20. Después de lavar la membrana cuatro veces durante 5 minutos con amortiguador PBS que contiene 0.1% Tween 20 la membrana se incuba durante 40 minutos con el anticuerpo de detección (anti-ratón IRDye^{TM} 800 de Rockland, 610-732-124) se diluye en el amortiguador de bloqueo Odyssey que contiene 0.2% Tween-20. Después de esto la membrana se lava cuatro veces durante 5 minutos cada una con 1 x amortiguador PBS/0.1% Tween 20 y una vez durante 5 minutos con 1 x amortiguador PBS. La membrana se mantiene en amortiguador PBS a 4ºC y luego se escanea con el instrumento Odyssey y se registran las señales y se analizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Claims (27)

1. Un método para la identificación de un compuesto que interactúa con PI3K, que comprenden las etapas de

a) proporcionar una preparación de proteína que contiene PI3K,

b) poner en contacto la preparación de proteína con clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado en un soporte sólido bajo condiciones que permiten la formación de un complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida,

c) incubar el complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida con un compuesto dado, y

d) determinar si el compuesto es capaz de separar PI3K del clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa d) incluye la detección del PI3K separado o la determinación de la cantidad de PI3K separado.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el PI3K separado se detecta o la cantidad del PI3K separado se determina por espectrometría de masa o métodos de inmunodetección, preferiblemente con un anticuerpo dirigido contra PI3K.

4. Un método para la identificación de un compuesto que interactúa con PI3K, que comprende las etapas de

a) proporcionar una preparación de proteína que contiene PI3K,

b) poner en contacto la preparación de proteína con clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado en un soporte sólido y con un compuesto dado bajo condiciones que permiten la formación de un complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida, y

c) detectar el complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida formado en la etapa b).

5. El método de la reivindicación 4, en donde en la etapa c) dicha detección se desarrolla al determinar la cantidad del complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en donde las etapas a) a c) se desarrollan con varias preparaciones de proteína con el fin de probar diferentes compuestos.

7. Un método para la identificación de un compuesto que interactúa con PI3K, que comprende las etapas de:

a) proporcionar dos alícuotas de una preparación de proteína que contienen PI3K,

b) poner en contacto una alícuota con el clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado en un soporte sólido bajo condiciones que permiten la formación de un complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida,

c) poner en contacto la otra alícuota con el clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado en un soporte sólido y con un compuesto dado bajo condiciones que permiten la formación de un complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida, y

d) determinar la cantidad del complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida formado en la etapas b) y c).

8. Un método para la identificación de un compuesto que interactúa con PI3K, que comprende las etapas de:

a) proporcionar dos alícuotas que comprenden cada una por lo menos una célula que contiene PI3K,

b) incubar una alícuota con un compuesto dado,

c) cosechar las células de cada alícuota,

d) lisar las células con el fin de obtener preparaciones de proteína,

e) poner en contacto las preparaciones de proteína con el clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado en un soporte sólido bajo condiciones que permiten la formación de un complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida, y

f) determinar la cantidad del complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-miazol-2il]-propionamida formado en cada alícuota en la etapa e).

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 o 8, en donde una cantidad reducida del complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2il]-pro-
pionamida formado en la alícuota incubado con el compuesto en comparación a la alícuota no incubada con el compuesto que indica que el PI3K es un objetivo del compuesto.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde la cantidad del complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonilfenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida se determina al separar PI3K del clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado y detección posterior del PI3K separado o la determinación posterior de la cantidad de PI3K separado.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el PI3K se detecta o la cantidad de PI3K se determina por espectrometría de masa o métodos de inmunodetección, preferiblemente con un anticuerpo dirigido contra PI3K.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, se desarrolla como un medio o detección de alto rendimiento.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de compuestos sintéticos, o fármacos sintéticos orgánicos, más preferiblemente fármacos orgánicos de molécula pequeña, y compuestos de molécula pequeña natural.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el compuesto que interactúa con PI3K es un inhibidor PI3K.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste de agarosa, agarosa modificada, glóbulos de sefarosa (por ejemplo sefarosa activada con NHS), látex, celulosa, y partículas ferro o ferrimagnéticas.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida se acopla covalentemente al soporte sólido.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el PI3K es Gamma PI3K y/o Delta PI3K.

18. Un método para la purificación de PI3K, que comprende las etapas de

a) proporcionar una preparación de proteína que contiene PI3K,

b) poner en contacto la preparación de proteína con clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado en un soporte sólido bajo condiciones que permiten la formación de un complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida, y

c) separar el PI3K del clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida inmovilizado.

19. El método de la reivindicación 18, que comprende adicionalmente la etapa de purificar el Gamma PI3K y/o Delta PI3K.

20. El método de la reivindicación 19, en donde dicha purificación se desarrolla utilizando un anticuerpo específico Gamma PI3K y/o un anticuerpo específico Delta PI3K.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, que comprende adicionalmente después de la etapa c) la identificación de proteínas que son capaces de unir al PI3K.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, que comprende adicionalmente después de la etapa c) la determinación de modificaciones post-translacionales PI3K.

23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en donde después de la etapa c) el PI3K y/o las proteínas que son capaces de unirse a PI3K se caracterizan por espectrometría de masa o métodos de inmunodetección.

24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde la provisión de una preparación de proteína incluye las etapas de cosechar por lo menos una célula que contiene PI3K y lisar la célula.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde las etapas de la formación del complejo PI3K de clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-miazol-2il]-propionamida se desarrollan bajo condiciones esencialmente fisiológicas.

26. Uso del clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida para la identificación de compuestos que interactúan con PI3K.

27. Uso del clorhidrato 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-N-[5-(4-cloro-3-metanosulfonil-fenil)-4-metil-tiazol-2il]-propionamida para la purificación de PI3K.