JP2010500870A - Pi3k相互作用分子の同定のための方法およびpi3kの精製のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a) PI3Kを含むタンパク質調製物を提供する段階、
(b) タンパク質調製物と、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、
(c) フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体を所与の化合物と共にインキュベートする段階、および
(d) 化合物が、固定化されたフェニルチアゾールリガンド1からPI3Kを分離させることができるかどうかを決定する段階。
(a) PI3Kを含むタンパク質調製物を提供する段階、
(b) タンパク質調製物と、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1および所与の化合物とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、および
(c) 段階(b)において形成されたフェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体を検出する段階。
(a) PI3Kを含むタンパク質調製物の2つのアリコートを提供する段階、
(b) 1つのアリコートと、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、
(c) もう一方のアリコートと、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1および所与の化合物とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、および
(d) 段階(b)および(c)において形成されたフェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の量を決定する段階。
(a) PI3Kを含む少なくとも1つの細胞をそれぞれ含む2つのアリコートを提供する段階、
(b) 1つのアリコートを所与の化合物と共にインキュベートする段階、
(c) それぞれのアリコートの細胞を収集する段階、
(d) タンパク質調製物を得るために細胞を溶解する段階、
(e) タンパク質調製物と、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、および
(f) 段階(e)の各アリコート中に形成されたフェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の量を決定する段階。
(a)上記のようなPI3K相互作用化合物を同定する段階、および
(b)相互作用する化合物を薬学的組成物へと製剤化する段階。
(a) PI3Kを含むタンパク質調製物を提供する段階、
(b) タンパク質調製物と、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、および
(c) 固定化されたフェニルチアゾールリガンド1からPI3Kを分離する段階。
この実施例は、細胞溶解物からのPI3Kキナーゼのアフィニティ捕獲のためのアフィニティマトリックスの調製を例示する。捕獲リガンドをアミノ官能基を用いる共有結合により固体支持体上に共有結合的に固定した。このアフィニティマトリックスを実施例2、実施例3、および実施例4において用いた。
段階1〜3:
1-ブロモ-1-(4-クロロ-3-メタンスルホニル-フェニル)-プロパン-2-オンをWO 2003/072557に記載された手法に従って調製した。
1-ブロモ-1-(4-クロロ-3-メタンスルホニル-フェニル)-プロパン-2-オン(480 mg 1.5 mmol)およびチオ尿素(114 mg 1.5 mmol)をエタノール(12 ml)中で混合し、70℃まで2時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却させ、固体産物をろ過により集め、真空下で乾燥させ、オフホワイトの固体(375 mg)として5-(4-クロロ-3-メタンスルホニル-フェニル)-4-メチル-チアゾール-2-イルアミンを得た。
3-(2-{2-[2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオン酸(690 mg 1.9 mmol)、EDAC(403 mg 2.1 mmol)、HOBT(284 mg 2.1 mmol)、NMM(420 uL 3.8 mmol)および5-(4-クロロ-3-メタンスルホニル-フェニル)-4-メチル-チアゾール-2-イルアミン(520 mg 1.7 mmol)をジメチルホルムアミド(16 ml)中で混合し、一晩室温で攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタン(150 ml)中に溶解し、1M HCl水溶液(50 ml)および炭酸水素ナトリウム飽和水(50 ml)で洗浄し、乾燥し(硫酸マグネシウム)、ろ過し、蒸発させた。残留物を、0〜2%メタノール/ジクロロメタンで溶出する50 g ISTシリカフラッシュカートリッジを用いるフラッシュクロマトグラフィにより精製し、油状の(2-{2-[2-(2-{2[5-(4-クロロ-3-メタンスルホニル-フェニル)-4-メチル-チアゾール-2-イルカルバモイル]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エチル)-カルバミン酸 tert-ブチルエステル(1.1g 残留溶媒存在)を得た。
(2-{2-[2-(2-{2[5-(4-クロロ-3-メタンスルホニル-フェニル)-4-メチル-チアゾール-2-イルカルバモイル]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エチル)-カルバミン酸 tert-ブチルエステル(1.0 g 1.5 mmol)をジクロロメタン(10 ml)中で溶解し、HCl(4 Mジオキサン溶液4 ml)で処理した。反応物を3時間室温で攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を真空下で乾燥し、黄色の粘性油状の3-(2-{2-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-N-[5-(4-クロロ-3-メタンスルホニル-フェニル)-4-メチル-チアゾール-2イル]-プロピオンアミドヒドロクロリド(830 mg 残留溶媒存在)を得た。
NMRスペクトルをBruker dpx400によって得た。
NHS活性化セファロース4ファストフロー(Amersham Biosciences, 17-0906-01)を無水DMSO(ジメチルスルホキシド、Fluka、41648、H2O <= 0.005%)で平衡化した。1 mlの安定化したビーズを15 mlファルコンチューブ中に置き、化合物ストック溶液(通常、DMFまたは DMSO中で100 mM)を加え(ビーズ1 mlあたり最終濃度0.2〜2μmol)、同様に15μlのトリエチルアミン(Sigma、T-0886、99%純粋)を加えた。ビーズを室温で暗闇中で回転振盪機(Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.)で16〜20時間 インキュベートした。結合効率をHPLCにより決定する。非反応NHS群を、回転振盪機で室温で一晩アミノエタノールとのインキュベーションによりブロックした。ビーズを10 mlのDMSOで洗浄し、イソプロパノール中で-20℃で保存した。これらのビーズを実施例2、3、および4においてアフィニティマトリックスとして用いた。コントロールビーズ(リガンドが固定化されていない)を、上記のようにアミノエタノールとのインキュベーションによりNHS群をブロックすることにより生じさせた。
この実施例は、ヒトT細胞系(MOLT-4細胞; ATCC番号CRL-1582)の細胞溶解物由来のPI3Kタンパク質の同定のための固定化されたフェニルチアゾールリガンド1の使用を明らかにする。この目的のために、MOLT-4細胞の溶解物を実施例1に記載のアフィニティマトリックスと接触させた。フェニルチアゾールリガンド1に結合するタンパク質を、ウェスタンブロットおよびマススペクトロメトリー(MS)解析により同定した。
MOLT-4細胞(ATCC番号1582)を、1リットル スピナーフラスコ(Integra Biosciences, #182101)内で10%ウシ胎仔血清(Invitrogen)を補充したRPMI 1640培地(Invitrogen, #21875-034)中に懸濁状態で細胞0.15×106〜1.2×106個/mlの密度で増殖させた。細胞を遠心分離により収集し、1×PBS緩衝液(Invitrogen, #14190-094)で一度洗浄し、細胞ペレットを液体窒素中で凍結させ、続いて-80℃で保存した。
MOLT-4細胞を、溶解緩衝液: 50 mM Tris-HCl、0.8% NP40、5%グリセロール、150 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、25 mM NaF、1 mM バナジウム酸ナトリウム、1 mM DTT、pH 7.5中でPotter Sホモジナイザーでホモジナイズした。完全にEDTAを含まない錠剤(プロテアーゼインヒビターカクテル、Roche Diagnostics, 1 873 580)を、25 ml緩衝液あたり一錠加えた。材料を機械化されたPOTTER Sを用いて10回加圧型細胞粉砕(dounce)し、50 mlファルコンチューブに移し、30分間氷上でインキュベートし、10分間20,000 g、4℃で遠心沈殿した(予冷したSorvall SLA600で10,000 rpm)。上清を超遠心(UZ)-ポリカーボネートチューブ(Beckmann, 355654)に移し、1時間100.000 g、4℃で回転した(予冷したTi50.2で33.500 rpm)。上清を新しい50 mlファルコンチューブに移し、タンパク質濃度をBradfordアッセイ(BioRad)により決定し、アリコートあたり50 mg のタンパク質を含む試料を調製した。試料は、直ちに実験に用いられるか、または液体窒素中で凍結し-80℃で凍結保存した。
固定化された化合物を有するセファロース-ビーズ(プルダウン実験あたり100μlビーズ)を溶解緩衝液中で平衡化し、50 mgのタンパク質を含む細胞溶解物試料と共に回転振盪機(Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.)で2時間4℃でインキュベートした。ビーズを集め、Mobicol-カラム(MoBiTech 10055)に移し、0.5% NP40界面活性剤を含む10 ml溶解緩衝液、続いて0.25%界面活性剤を有する溶解緩衝液5 mlで洗浄した。結合タンパク質を溶出するために、2×SDS試料緩衝液60μlを加え、カラムを30分間50℃で加熱し、溶出液を遠心分離により微小遠心管に移した。次に、タンパク質をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)により分離した。
ウェスタンブロットを、標準的な手法に従い行い、特異的な抗PI3K抗体(一次抗体)、蛍光で標識された二次抗体およびLI-COR Biosciences(Lincoln, Nebraska, USA)のOdyssey赤外線イメージングシステムを用いて製造者により提供された説明書(Schutz-Geschwendener et al., 2004. Quantitative, two-color Western blot detection with infrared fluorescence. Published May 2004 by LI-COR Biosciences, www.licor.com)に従って、PI3Kタンパク質を検出および定量した。
5.1 マススペクトロメトリー解析前のタンパク質消化
Shevchenko et al., 1996, Anal. Chem. 68:850-858により記載された手法に従って、ゲル分離したタンパク質をゲル中で本質的に還元し、アルキル化し、消化した。簡単に言うと、ゲル分離したタンパク質をきれいなメスを用いてゲルから切り取り、10 mM DTT(5 mM重炭酸アンモニウム中で54℃、45分)を用いて還元し、続いて55 mMヨードアセトアミド(5 mM重炭酸アンモニウム中で)を用い室温暗闇でてアルキル化した(30分間)。還元されかつアルキル化されたタンパク質を、5 mM重炭酸アンモニウム中12.5 ng/μlのプロテアーゼ濃度でブタトリプシン(Promega)を用いてゲル中で消化した。消化を4時間37℃で進行させ、続いて5μlの5%ギ酸を用いて反応を停止した。
ゲルプラグを20μlの1% TFAで2回抽出し、酸性化した消化上清と共にプールした。
試料を真空遠近機内で乾燥させ、10μlの0.1%ギ酸中で再懸濁した。
ペプチド試料を、四重極TOF(QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass)またはイオントラップ(LCQ Deca XP)質量分析器のいずれかに直接結合した、ナノLCシステム(CapLC, WatersまたはUltimate, Dionex)内に注入した。ペプチドを水性溶媒および有機溶媒の勾配を用いてLCシステムで分離した(以下を参照)。溶媒Aは、0.5%ギ酸中の5%アセトニトリルであり、溶媒Bは0.5%ギ酸中の70%アセトニトリルである。
LC-MS/MS実験で生じたペプチド質量および断片化データは、NCBI(NCBInr、dbESTならびにヒトおよびマウスゲノムについて)およびEuropean Bioinformatics Institute(EBI、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ(D. melanogaster)、および線虫のプロテオームデータベースについて)で維持および定期的にアップデートされるfastaフォーマット型のタンパク質およびヌクレオチド配列データベースに対してクエリーを行うために用いた。測定したペプチド質量および断片化データをソフトウェアツールMascotを用いてデータベース中のエントリから計算された同じデータと関連付けることにより、タンパク質を同定した(Matrix Science; Perkins et al., 1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20, 3551-3567)。どの質量分析器が解析に用いられたかに応じて、検索基準は変化する。
フェニルチアゾールリガンド1アフィニティマトリックスの調製を実施例1に記載の通りに行った。96ウェルプレート中で最大で80個の化合物をスクリーニングするために、溶出実験を以下に記載の通りに行う。
アフィニティマトリックス(1200μlのビーズ)を30 mlの1×DP-緩衝液で2回洗浄した。各洗浄段階後、ビーズをHeraeus遠心機で2分間1200 rpm、4℃での遠心分離により集めた。上清を捨てた。最後に、ビーズを15 ml結合緩衝液(1×DP緩衝液/0.4% NP40)中で平衡化した。このインキュベーション期間後、ビーズを収集し、50 mlファルコンチューブ中でMOLT-4細胞溶解物と総量75 mgタンパク質を有する5 mg/mlのタンパク質濃度で混合した。溶解物の調製を実施例2に記載の通りに行った。ビーズおよび溶解物を2時間4℃でインキュベートした。溶解物とのインキュベーションの後、ビーズを記載のような遠心分離により集め、2 mlカラム(MoBiTec, #S10129)に移し、10 mlの1×DP緩衝液/0.4% NP40および5 mlの1×DP緩衝液/0.2% NP40で洗浄した。一度、洗浄緩衝液がカラムを完全に通過してしまってから、カラム中に残されたビーズの量を計算した(およそ1000μl)。ビーズを4倍量を超える1×DP-緩衝液/0.2% NP40(4 ml)中で再懸濁し、20%スラリーを生じた。化合物溶出試験のために、50μlのこの懸濁物を96ウェルプレート(Millipore MultiScreenHTS, MSBVN1210、蓋および1.2um 親水性低タンパク質結合Durapore膜付き)の各ウェルに加えた。残留緩衝液を取り除くために、96ウェルプレートをAssembleフィルタおよび収集プレートと共に構築し、このサンドイッチアセンブリを遠心機で10秒間800 rpmで遠心沈殿した。次に、試験化合物を追加した40μlの溶出緩衝液(1×DP-緩衝液/0.2% NP40)をビーズに加えた。DMSO中で40倍に濃縮したストック溶液から出発し希釈緩衝液で希釈することにより、試験化合物を調製した。プレートを収集プレート上に構築し、Eppendorfインキュベータ上に固定し、30分間4℃、650 rpmの振盪でインキュベートした。溶出液を収集するために、96ウェル収集プレート上に構築された96ウェルフィルタプレートを、卓上遠心機(Heraeus)で1分間4℃、800 rpmで遠心分離した。ドットブロットの手法を用いて、PI3KγおよびPI3Kδの存在について溶出液を調べた。
PI3Kγに対する抗体(Jena Bioscience, #ABD-026S)、蛍光でラベルされた二次抗マウスIRDye(商標)800(Rockland, #610-732-124)およびLI-COR Biosciences(Lincoln, Nebraska, USA)のOdyssey赤外線イメージングシステムを用いて、製造者により提供された説明書(Schutz-Geschwendener et al., 2004. Quantitative, two-color Western blot detection with infrared fluorescence. Published May 2004 by LI-COR Biosciences, www.licor.com)に従って、溶出されたPI3Kγタンパク質をドットブロット手法により検出および定量化した。
以下に列記した試験化合物を、以下に記載の希釈後の溶出実験のために用いた。典型的には、全ての化合物を100 mMまたは50 mMの濃度で100% DMSO(Fluka, カタログ番号41647)中で溶解した。化合物を-20℃で保存した。溶出実験のための試験化合物の希釈: 100 mMストックを100% DMSOで1:1に希釈することにより50 mM ストックを調製する。溶出実験のために、化合物を溶出緩衝液(1×DP-緩衝液/0.2% NP40)でさらに希釈する。溶出に用いられる化合物:
化合物1: PI3KインヒビターLY29004(Tocris 1130; Vlahos et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 5241-5248)。
化合物2: PI3Kγインヒビター(Calbiochem 528106; AS-605240; Camps et al., 2005, Nature Medicine 11, 936-943)。
化合物3: PI3KγインヒビターII(Calbiochem 528108; AS-604850; Camps et al., 2005, Nature Medicine 11, 936-943)。
この実施例は、試験化合物を細胞溶解物に直接加える競合的結合アッセイを明らかにする。試験化合物(種々の濃度で)および固定化されたフェニルチアゾールリガンド1を有するアフィニティマトリックスを溶解物のアリコートに加え、溶解物試料中に含まれるタンパク質に結合させた。インキュベーション期間後、捕獲されたタンパク質を有するビーズを溶解物から分離した。次に、結合タンパク質を溶出し、ドットブロット手法における特異的抗体およびOdyssey赤外線検出システムを用いて、PI3Kγの存在を検出および定量化した(図7A)。3つの化合物に対する用量反応曲線を作成した(図7B)。
実施例1に記載したように、アフィニティマトリックス(乾燥量で1.1 ml)を0.4% NP40を含む15 mlの1×DP緩衝液で2回洗浄し、次に0.4% NP40を含む5.5 mlの1×DP緩衝液中で再懸濁した(20%ビーズスラリー)。
最終的に所望の試験濃度と比べて100倍の高い濃度に相当する、試験化合物のストック溶液を、DMSO中で調製した(例えば、4μMの最終試験濃度に対し、4 mMストック溶液を調製した)。この希釈スキームは、1%の最終DMSO濃度をもたらした。全ての試験試料が1% DMSOを含むため、対照実験(試験化合物なし)として1% DMSOを含む緩衝液を用いた。
化合物1: PI3KインヒビターLY29004(Tocris 1130; Vlahos et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 5241-5248)。
化合物3: PI3KγインヒビターII(Calbiochem 528108; AS-604850; Camps et al., 2005, Nature Medicine 11, 936-943)。
化合物4(CZC00015387)。
細胞溶解物を実施例2に記載の通りに調製した。典型的な実験1として、50 mgタンパク質を含む溶解物アリコートを37℃水浴中で解凍し、次に4℃で保持した。0.4%の最終的なNP40濃度が達成されるような量の1×DP緩衝液を、溶解物に加えた。その次に、最終量の1/50量の50倍に濃縮されたプロテアーゼインヒビター溶液を加えた(0.4% NP40を含む0.5 mlの1×DP緩衝液中に溶解した1錠のプロテアーゼインヒビター; Roche DiagnosticsのEDTA不含プロテアーゼインヒビターカクテル, カタログ番号41647)。5 mg/mlの最終タンパク質濃度を達成するように、溶解物を0.4% NP40を含む1×DP緩衝液を加えることによりさらに希釈した。
100μl量の希釈した溶解物を96ウェルフィルタプレートの各ウェル内に分注した。次に、DMSOで希釈した1.5μlの試験化合物を加えた。対照反応として、1.5μlのDMSOを試験化合物なしで用いた。次に、ウェルあたり50μlのアフィニティマトリックス(20%スラリー)を加えた。プレートを振盪機(Thermomixer、Eppendorfで750 rpm )で2時間4℃でインキュベートした。
PI3Kγに対する一次抗体(Jena Bioscienceの抗PI3Kγ、ABD-026S)および蛍光で標識された二次抗体(Rocklandの抗マウスIRDye(商標)800、610-732-124)を用いるドットブロット手法により、溶出液中のPI3Kγタンパク質を検出および定量化した。LI-COR Biosciences(Lincoln, Nebraska, USA)のOdyssey赤外線イメージングシステムを製造者により提供された説明書(Schutz-Geschwendener et al., 2004. Quantitative, two-color Western blot detection with infrared fluorescence. Published May 2004 by LI-COR Biosciences, www.licor.com)に従って操作した。
この実施例は、試験化合物を細胞溶解物中に直接加える、または生細胞(RAW264.7 マクロファージ)と共にインキュベートする結合アッセイを明らかにする。
RAW264.7マクロファージ(American Type Culture Collection, Rockville, MD)を、5% CO2の存在下加湿された環境の中で、10%熱不活化ウシ胎仔血清(Gibco #10270)および1.5 g/L 重炭酸ナトリウム(Gibco #25080, 7.5% solution)を追加したDulbecco変法イーグル培地(DMEM、4 mM L-グルタミン、4.5 g/L グルコース; Gibco #41965)中で37℃で培養した。セルスクレーパーを用いてDMEM培養培地中の培養皿から細胞を擦り取り、新鮮な培養培地に再播種することにより、マクロファージを継代培養した。継代数3に達した後、RAW264.7マクロファージを実験に使用した。細胞を、ホスフェートで緩衝化した生理食塩水(D-PBS, Gibco #14040)で1回洗浄し、DMEM培養培地中の培養皿から取り除き、1,000 rpmで室温で3分間遠心分離した。細胞ペレットをDMEM培養培地で再懸濁し、細胞数を決定した。25×106の細胞を1枚の10 cm培養皿の上に播種し、細胞がおよそ90%コンフルエンスに達するまで新鮮なDMEM培養培地中で48時間インキュベートした。
試験化合物による細胞の処理
マクロファージをD-PBS緩衝液で洗浄し、新鮮なDMEM培養培地を加えた。0.2% DMSO(溶媒対照)含むDMEM培養培地、または10μM PI-103(Calbiochem, カタログ番号528100; Knight et al., 2006, Cell 125, 733-747)、10μM 化合物5もしくは10μM 化合物6を有するDMEM培養培地で、30分間にわたって細胞を処理した。試験化合物をDMSOで20 mMストック溶液として調製し、細胞培養培地中で10μM化合物および0.2% DMSOの最終濃度に達するようさらに希釈した。
培養培地を取り除き、細胞をD-PBS緩衝液で1回洗浄し、4 mlの氷冷D-PBS緩衝液を加えた。細胞を緩やかに擦り取り、D-PBS緩衝液中で再懸濁することにより、マクロファージを取り除いた。細胞懸濁液を15 mlファルコンチューブ内に移し、氷上で保持した。マクロファージ懸濁液を、1500 rpm4℃で3分間Heraeus Multifugeで遠心分離した。上清を取り除き、細胞ペレットを冷たいD-PBS緩衝液で洗浄した。追加の遠心分離の段階の後、細胞ペレットを液体窒素中で急速に凍結した。細胞を氷上で解凍し、120μlの1×溶解緩衝液(1×DP緩衝液, 0.8% NP40)を加えることにより溶解した。溶解物を1.5 mlのEppendorfチューブ内に移し、30分間回転させ4℃でインキュベートし、次に10分間13,200 rpm、4℃で遠心分離した。上清を超遠心管内に移し、TLA-120.2ローターで53,000 rpm(100,000×g)、1時間4℃で遠心分離した。澄んだ上清のアリコートをBradfordアッセイ(Bioradタンパク質アッセイ色素濃縮物、カタログ番号500-0006)を行うタンパク質定量化に用いた。残りの試料を、液体窒素中で急速に凍結させ、結合アッセイでの使用まで-80℃で保存した。
細胞溶解物をRAW264.7マクロファージから以下に記載の通りに調製した。1つの溶解物アリコートを37℃水浴中で解凍し、次に4℃で保持した。溶解物に、0.8%の最終NP40濃度を達成するような量のプロテアーゼインヒビター(25 mlの1×DP緩衝液または0.8% NP40を含む25 mlの1×DP緩衝液に1錠のプロテアーゼインヒビターを溶解させる; Roche DiagnosticsのEDTA不含タブレットプロテアーゼインヒビターカクテル、カタログ番号41647)を含む1×DP緩衝液を加えた。10 mg/mlの最終タンパク質濃度を達成するよう、0.8% NP40を含む1容量の1×DP緩衝液およびプロテイナーゼインヒビターを加えることにより、溶解物をさらに希釈した。
実施例1に記載の通りにアフィニティマトリックス(0.25 mlの乾燥ビーズ量)を、0.2% NP40を含む10 mlの1×DP緩衝液で2回洗浄し、最後に0.2% NP40を含む5.0 mlの1×DP緩衝液中で再懸濁した(5%ビーズスラリー)。
50μl量の希釈した溶解物(10 mg/mlタンパク質)を96ウェルフィルタプレートの各ウェルに分注した。次に、ウェルあたり100μlのアフィニティマトリックス(5%スラリー)を加えた。プレートを2時間4℃で振盪機(Thermomixer、Eppendorfで750 rpm)でインキュベートした。プレートを真空マニホールド機器(Millipore, MAVM 096 OR)を用いて洗浄した。各ウェルを0.4% NP-40を含む220μlの1×DP緩衝液で2回洗浄した。タンパク質の溶出のために、フィルタプレートを収集プレート上に置き、DTT(50 mM最終濃度)を有する20μlの2×試料緩衝液(100 mM TrisHCl, pH7.4; 4% SDS; 20%グリセロール; 0.0002%ブロモフェノールブルー)を各ウェルに加えた。プレートを30分間室温で振盪機(Thermomixer、Eppendorfで750 rpm)でインキュベートした。続いて、プレートを1100 rpm(Heraeus遠心機)で4分間遠心分離し、溶出液を収集プレートのウェル中に集めた。
溶出液中のPI3Kδタンパク質を、ニトロセルロース膜上にアリコートをスポットし、PI3Kδに対する一次抗体および蛍光で標識された二次抗体で検出することにより、検出および定量化した。ニトロセルロース膜(BioTrace NT Nitrocellulose, PALL BTNT30R)を20%エタノールで前処理し、続いてPBS緩衝液で洗浄した。
細胞溶解物の調製
培養培地を取り除き、細胞をD-PBS緩衝液で1回洗浄し、4 mlの氷冷D-PBS緩衝液を加えた。細胞を緩やかに擦り取りD-PBS緩衝液中で細胞を再懸濁することより、マクロファージを取り除いた。細胞懸濁液を15 mlファルコンチューブ内に移し、氷上で保持した。マクロファージ懸濁液を1500 rpm、4℃で3分間Heraeus Multifugeで遠心分離した。上清を取り除き、細胞ペレットを冷たいD-PBS緩衝液で洗浄した。追加の遠心分離段階後、細胞ペレットを液体窒素中で急速に凍結させた。細胞を氷上で解凍し、120μlの1×溶解緩衝液(1×DP緩衝液, 0.8% NP40)を加えることにより溶解した。溶解物を1.5 mlのEppendorfチューブ内に移し、30分間回転させ4℃でインキュベートし、次に10分間13,200 rpm、4℃で遠心分離した。上清を超遠心機内に移し、TLA-120.2ローターで53,000 rpm(100,000×g)で1時間4℃で遠心分離した。澄んだ上清のアリコートをBradfordアッセイ(Biorad タンパク質アッセイ色素濃縮物、カタログ番号500-0006)を行うタンパク質定量化のために用いた。残りの試料を液体窒素中で急速に凍結させ、結合アッセイでの使用まで-80℃で保存した。
細胞溶解物を以下に記載の通りにRAW264.7マクロファージから調製した。1つの溶解物アリコートを37℃水浴中で解凍し、次に4℃で保持した。溶解物に、0.8%の最終NP40濃度を達成するような量のプロテアーゼインヒビター(1錠のプロテアーゼインヒビターを25 mlの1×DP緩衝液または0.8% NP40を含む25 mlの1×DP緩衝液中に溶解させる; Roche DiagnosticsのEDTA不含タブレットプロテアーゼインヒビターカクテル, カタログ番号41647)を含む1容量の1×DP緩衝液を加えた。10 mg/mlの最終タンパク質濃度を達成するように0.8% NP40およびプロテイナーゼインヒビターを含む1×DP緩衝液を加えることにより、溶解物をさらに希釈した。
実施例1に記載したようにアフィニティマトリックス(0.25 mlの乾燥ビーズ量)を、0.2% NP40を含む10 mlの1×DP緩衝液で2回洗浄し、最後に0.2% NP40を含む5.0 mlの1×DP緩衝液中で再懸濁した(5%ビーズスラリー)。
溶解物での競合実験のために、アッセイにおける最終濃度と比べて50倍高い濃度に相当する試験化合物のストック溶液をDMSOで調製した(例えば、10μMの最終試験濃度に対して500μMストック溶液を調製した)。この希釈スキームは、アッセイにおいて2%の最終DMSO濃度をもたらした。全ての試験試料が2% DMSOを含むため、対照実験(試験化合物なし)として、2% DMSOを含む緩衝液を用いた。
50μl量の希釈した溶解物(10 mg/mlタンパク質)を96ウェルフィルタプレートの各ウェル内に分注した。次に、DMSOで希釈した3.0μlの試験化合物を加えた。対照反応として、試験化合物を含まない3.0μlのDMSOを加えた。次に、ウェルあたり100μlのアフィニティマトリックス(5%スラリー)を加えた。プレートを振盪機(Thermomixer、Eppendorfで750 rpm)で2時間4℃でインキュベートした。プレートを真空マニホールド機器(Millipore, MAVM 096 OR)を用いて洗浄した。各ウェルを0.4% NP-40を含む220μlの1×DP緩衝液で2回洗浄した。タンパク質の溶出のために、フィルタプレートを収集プレート上に置き、DTT(50 mM最終濃度)を有する20μlの2×試料緩衝液(100 mM TrisHCl, pH7.4; 4% SDS; 20%グリセロール; 0.0002%ブロモフェノールブルー)を各ウェルに加えた。プレートを振盪機(Thermomixer、Eppendorfで750 rpm)で30分間室温でインキュベートした。続いて、プレートを4分間1100 rpm(Heraeus遠心機)で遠心分離し、溶出液を収集プレートのウェル中に集めた。
Claims (28)
- 以下の段階を含む、PI3K相互作用化合物の同定のための方法:
(a) PI3Kを含むタンパク質調製物を提供する段階、
(b) タンパク質調製物と、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、
(c) フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体を所与の化合物と共にインキュベートする段階、および
(d) 化合物が、固定化されたフェニルチアゾールリガンド1からPI3Kを分離させることができるかどうかを決定する段階。 - 段階(d)が、分離したPI3Kの検出または分離したPI3Kの量の決定を含む、請求項1記載の方法。
- マススペクトロメトリーによって、またはPI3Kに対する抗体を好ましくは用いる免疫検出方法によって、分離したPI3Kが検出されるかまたは分離したPI3Kの量が決定される、請求項2記載の方法。
- 以下の段階を含む、PI3K相互作用化合物の同定のための方法:
(a) PI3Kを含むタンパク質調製物を提供する段階、
(b) タンパク質調製物と、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1および所与の化合物とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、ならびに
(c) 段階(b)で形成されたフェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体を検出する段階。 - 段階(c)における検出する段階が、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の量を決定することにより行われる、請求項4記載の方法。
- 段階(a)〜(c)が、異なる化合物を試験するために複数のタンパク質調製物を用いて行われる、請求項4または5記載の方法。
- 以下の段階を含む、PI3K相互作用化合物の同定のための方法:
(a) PI3Kを含むタンパク質調製物の2つのアリコートを提供する段階、
(b) 1つのアリコートと、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、
(c) もう一方のアリコートと、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1および所与の化合物とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、ならびに
(d) 段階(b)および(c)で形成されたフェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の量を決定する段階。 - 以下の段階を含む、PI3K相互作用化合物の同定のための方法:
(a) PI3Kを含む少なくとも1つの細胞をそれぞれ含む2つのアリコートを提供する段階、
(b) 1つのアリコートを所与の化合物と共にインキュベートする段階、
(c) それぞれのアリコートの細胞を収集する段階、
(d) タンパク質調製物を得るために細胞を溶解する段階、
(e) タンパク質調製物と、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、および
(f) 段階(e)の各アリコート中に形成されたフェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の量を決定する段階。 - 化合物と共にインキュベートされていないアリコートと比較して、化合物と共にインキュベートされたアリコート中に形成されたフェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の量が減少することが、化合物の標的がPI3Kであることを示す、請求項7または8記載の方法。
- 固定化されたフェニルチアゾールリガンド1からPI3Kを分離させ、続いて、分離したPI3Kを検出するかまたは分離したPI3Kの量を決定することによって、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の量が決定される、請求項5から9のいずれか一項に記載の方法。
- マススペクトロメトリーによって、またはPI3Kに対する抗体を好ましくは用いる免疫検出方法によって、PI3Kが検出されるかまたはPI3Kの量が決定される、請求項10記載の方法。
- 培地スクリーニングまたはハイスループットスクリーニングとして行われる、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 化合物が、合成化合物、または有機合成薬剤、より好ましくは低分子有機薬剤、および天然の低分子化合物からなる群より選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- PI3K相互作用化合物がPI3Kインヒビターである、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 固体支持体が、アガロース、修飾されたアガロース、セファロースビーズ(例えば、NHS活性化セファロース)、ラテックス、セルロース、および強磁性またはフェリ磁性の粒子からなる群より選択される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- フェニルチアゾールリガンド1が固体支持体に共有結合的に結合する、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の段階を含む、薬学的組成物の調製のための方法:
(a) 請求項1から16に従って、PI3K相互作用化合物を同定する段階、および
(b) 相互作用化合物を薬学的組成物へと製剤化する段階。 - PI3KがPI3Kγおよび/またはPI3Kδである、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の段階を含む、PI3Kの精製のための方法:
(a) PI3Kを含むタンパク質調製物を提供する段階、
(b) タンパク質調製物と、固体支持体上に固定化されたフェニルチアゾールリガンド1とを、フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、および
(c) 固定化されたフェニルチアゾールリガンド1からPI3Kを分離する段階。 - PI3Kγおよび/またはP13 Kδを精製する段階をさらに含む、請求項19記載の方法。
- 精製が、PI3Kγ特異的抗体および/またはPI3Kδ特異的抗体を用いて行われる、請求項20記載の方法。
- 段階(c)の後に、PI3Kに結合する能力を有するタンパク質の同定をさらに含む、請求項19から21のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(c)の後に、翻訳後修飾PI3Kの同定をさらに含む、請求項19から21のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(c)の後に、PI3Kに結合する能力を有するタンパク質および/またはPI3Kのいずれかが、マススペクトロメトリーまたは免疫検出方法によって特徴付けられる、請求項19から23のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質調製物の提供が、PI3Kを含む少なくとも1つの細胞を集める段階および細胞を溶解する段階を含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
- フェニルチアゾールリガンド1-PI3K複合体の形成段階が、本質的に生理的な条件下で行われる、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- PI3K相互作用化合物の同定のためのフェニルチアゾールリガンド1の使用。
- PI3Kの精製のためのフェニルチアゾールリガンド1の使用。
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