CN101563612B

CN101563612B - 鉴定pi3k相互作用分子和纯化pi3k的方法

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Publication number: CN101563612B
Application number: CN2007800344464A
Authority: CN
Inventors: G·博加米尼摩尔; A·坎斯菲尔德; N·拉姆斯登; G·纽鲍尔
Original assignee: Cellzome GmbH
Current assignee: Cellzome GmbH
Priority date: 2006-08-03
Filing date: 2007-08-03
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2027-08-03
Also published as: US20100055711A1; ES2317382T3; AU2007280631A1; ATE414281T1; DK1887359T3; WO2008015013A1; JP2010500870A; AU2007280631B2; JP5234668B2; CN101563612A; DE602006003651D1; HK1111218A1; CA2658904A1; EP1887359A1; US8153389B2; EP1887359B1

Abstract

本发明涉及鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，b)在允许形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，c)使苯基噻唑配体1-PI3K复合物与给定的化合物一起温育，和d)确定所述化合物是否能够从固定的苯基噻唑配体1中分离PI3K。此外，本发明涉及鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，b)在允许形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，和c)检测在步骤b)中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物。此外，本发明涉及鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：a)提供包含PI3K的蛋白质制剂的两份等分试样，b)在允许形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物的条件下，使一份等分试样与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，c)在允许形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物的条件下，使另一份等分试样与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1以及给定的化合物接触，d)确定在步骤b)和c)中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量。此外，本发明涉及鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：a)提供各自包含至少一种含有PI3K的细胞的两份等分试样，b)使一份等分试样与给定的化合物一起温育，c)收获各等分试样的细胞，d)裂解所述细胞以获得蛋白质制剂，e)在允许形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，和f)确定在步骤e)中在各等分试样中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量。

Description

鉴定PI3K相互作用分子和纯化PI3K的方法

1本发明涉及使用苯基噻唑配体1作为PI3K的配体来鉴定PI3K相互作用分子和纯化PI3K的方法。此外，本发明还涉及包含所述相互作用分子例如用于治疗癌症、代谢疾病或自身免疫/炎症病变的药物组合物。

2激酶催化蛋白质、脂类、糖、核苷和其它细胞代谢物的磷酸化，在真核细胞生理的所有方面都起关键作用。特别地，蛋白激酶和脂类激酶参与应答于细胞外介体或刺激(例如生长因子、细胞因子或趋化因子)的控制细胞激活、生长、分化和存活的信号传导事件。通常，蛋白激酶分为两类，一类优选磷酸化酪氨酸残基，一类优选磷酸化丝氨酸和/或苏氨酸残基。

3不适当的高蛋白激酶活性涉及许多疾病，包括癌症、代谢疾病和自身免疫/炎症病变。这可直接或间接地由酶的突变、过表达或不适当的激活导致的控制机制失效引起。在所有这些情况下，期望激酶的选择性抑制具有有益的效果。

4已成为药物发现近期焦点的一组脂类激酶是磷酸肌醇3-激酶(PI3K)家族。PI3K家族的成员为催化γ-磷酸盐从ATP转移至磷脂酰肌醇及其衍生物(总称为磷酸肌醇)的3’-羟基的脂类激酶。迄今为止从哺乳动物细胞中已经分离出PI3K家族的八个成员(同工型(isoforms))，并且根据它们的一级结构和底物特异性分为三类(IA类：PI3Kα、β和δ；IB类：PI3Kγ；II类：PI3KC2α、β和γ；III类：Vps34酵母同源物)(Fruman等，1998.Phosphoinositidekinases.Annual Review Biochemistry 67，481-507；Cantley，L.C.，2002，Science 296，1655-1657)。

5已知哺乳动物细胞表达PI3K IA类催化亚基的三种同工型(p110α，p110β和p110δ，异名“PI3Kδ”)。IB类仅包含一个成员(催化亚基)，其已命名为p110γ或PI3K γ。除了其脂类激酶活性之外，PI3Kγ还显示出如由自身磷酸化所证明的，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。

6关于这些激酶的生物学功能和它们作为药物靶点的潜在应用，其中缺失编码PI3Kγ或δ的基因的基因操作小鼠的研究给出重要的信息。缺少PI3Kγ或δ的小鼠能存活，并且显示独特的暗示几种潜在的治疗性适应症(therapeutic indication)的表型。PI3Kγ似乎是先天免疫系统的主要介体。例如，PI3Kγ缺乏的巨噬细胞和中性粒细胞对于渗透发炎的腹膜显示受损的能力。肥大细胞(mast cell)表示另一种在PI3Kγ缺乏的小鼠中受影响的细胞类型。缺乏PI3Kδ的小鼠的表型的特征在于淋巴细胞功能的损伤和在控制适应性免疫应答中针对显性功能(Wetzker和Rommel，Current PharmaceuticalDesign，2004，10，1915-1922)。

7与广泛表达的PI3Kα和β同工型相反，造血特异性同工型PI3Kγ和δ暗示重要的治疗性适应症。这两种同工型表现为用于治疗由过度激活(hyperactive)的吞噬细胞、肥大细胞、B-和T-淋巴细胞介导的自身免疫/炎症疾病(例如风湿性关节炎、哮喘或过敏反应)的理想靶点。为了避免不想要的副作用，需要高度同工型选择性抑制剂(Ohasi和Woodgett 2005，Nature Medicine 11，924-925)。

8鉴定和表征PI3K抑制剂的一个先决条件是提供适当的测定(assays)，优选蛋白质靶点的生理形式。在本领域，已经提出几种策略来处理这个问题。

9传统上，PI3K脂类激酶活性可以通过在具有磷脂囊泡的基于溶液的测定中使用纯化或重组的酶来测定。该反应通过添加酸化的有机溶剂来终止，随后的相分离通过萃取或薄层色谱分析进行(Carpenter等，1990，J.Biol.Chem.265，19704-19711)。

10本领域描述的另一测定基于将磷酸盐从放射性标记的ATP转移至固定在板(plate)上的磷脂酰肌醇。该测定类型还使用重组PI3Kγ酶，但是可以以高通量模式进行(Fuchikami等，2002，J.Biomol.Screening 7，441-450)。

11另一生化筛选测定基于使用荧光团标记的磷酸肌醇的竞争性荧光偏振(FP)格式(Drees等，2003，Comb.Chem.High ThroughputScreening 6，321-330)。

12最后，报道了基于荧光显微成像和自动图像分析的基于细胞的Akt-EGFP再分布测定。为此，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用人类胰岛素受体和Akt1-增强的绿色荧光蛋白(EGFP)融合构建体稳定转染。用类胰岛素生长因子-1(IGF-1)刺激之后，PI3K被激活，Akt1-EGFP蛋白被招募至细胞膜。用PI3K同工型选择性抑制剂的再分布测定的确认表明：在IGF-1刺激后PI3Kα是在CHO宿主细胞中被激活的主要同工型(Wolff等，Comb.Chem.High Throughput Screen.9，339-350)。

13考虑到以上，需要提供鉴定P I 3K相互作用化合物和分析其选择性图谱(selectivity profiling)的有效方法以及纯化PI3K的方法。

14为了满足该需求，在第一方面本发明提供了鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，

b)在允许形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，

c)使苯基噻唑配体1-PI3K复合物与给定的化合物一起温育，和

d)确定所述化合物是否能够从固定的苯基噻唑配体1中分离PI3K。

15在第二方面，本发明涉及鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，

b)在允许形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，和

c)检测在步骤b)中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物。

16在第三方面，本发明提供鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含PI 3K的蛋白质制剂的两份等分试样(aliquot)，

b)在允许形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物的条件下，使一份等分试样与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，

c)在允许形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物的条件下，使另一份等分试样与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1以及给定的化合物接触，

d)确定在步骤b)和c)中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量。

17在第四方面，本发明涉及鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：

a)提供各自包含至少一种含有PI3K的细胞的两份等分试样，

b)使一份等分试样与给定的化合物一起温育，

c)收获各等分试样的细胞，

d)裂解所述细胞以获得蛋白质制剂，

e)在允许形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触，和

f)确定在步骤e)中在各等分试样中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量。

18在本发明的背景下，已经令人惊奇地发现苯基噻唑配体1为PI3K配体。这使得能够将苯基噻唑配体1用于筛选测定(例如用于竞争性筛选测定)以及用于纯化PI3K的方法。

19苯基噻唑配体1的结构在图1中给出。该化合物为取代的噻唑(3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺，其根据图1具有盐酸作为水溶液中的阴离子。然而，在本发明的背景中还考虑另外的抗衡离子。苯基噻唑配体1可以通过伯胺基共价地偶联到适当的固体支持物材料上并用于分离结合蛋白。苯基噻唑配体1的合成在实施例1中描述。根据本发明，表述“苯基噻唑配体1”还包括包含相同核心但具有用于连接至固体支持物的另一连接子(linker)的化合物，所述连接子优选偶联到氮上而不是成为环状结构的一部分。典型的连接子具有8、9或10个原子的主链。连接子可以包含羧基-、羟基或氨基-活性基团。

20因此，在优选的实施方案中，表述“苯基噻唑配体1”还包括具有相同N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺核心但在N原子处包含另一连接子的化合物，所述连接子例如其中任一个都任选地被卤素、羟基、氨基取代的C1-C8烷羰基或C1-C8烷氨羰基(alkylaminocarbonyl)、C1-C8烷氨基、C1-C8烷氧羰基、任选地被羟基取代的C1-C8烷氧基或任选地被羟基或卤素取代的C1-C8烷基。此外，该表述还包括如上所述但具有另一卤素例如溴而不是4-氯残基或在苯环上被例如卤素进一步取代的化合物。此外，还可以存在另一基团来代替甲磺酰基，例如羟基、羧基或任选地被卤素取代的C1-C8烷基。

21在特别优选的实施方案中，落入表述“苯基噻唑配体1”内的化合物选自：3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐、3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺，和具有相同的N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺核心的仅在N原子处被以下进一步取代的的化合物：其中任一个都任选地被卤素、羟基、氨基取代的C1-C8烷羰基或C1-C8烷氨羰基、C1-C8烷氨基、C1-C8烷氧羰基、任选地被羟基取代的C1-C8烷氧基或任选地被羟基或卤素取代的C1-C8烷基。

22根据本发明，“PI3K”包括PI3K家族的所有成员，所述PI3K家族包括IA类(例如PI3Kα、β和δ)，IB类(例如PI3Kγ)、II类(例如PI3KC2α、β和γ)和III类(例如Vps34酵母同源物)。

23人类PI3Kγ(至今为止唯一已知的IB类成员)序列在图4中给出。

24人类PI3Kδ(IA类成员)序列在图5中给出。

25根据本发明，表述“PI3K”涉及人类和该家族的其它蛋白。该表述特别包括其功能活性衍生物、或其功能活性片段、或其同源物、或由在低严紧条件下与编码所述蛋白的核酸杂交的核酸编码的变体。优选地，这些低严紧条件包括在40℃下在包含35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP，0.02％BSA、100ug/ml变性的鲑鱼精子DNA和10％(wt/vol)硫酸葡聚糖的缓冲液中杂交18-20个小时，在55℃下在由2X SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中洗涤1-5小时，和在60℃下在由2X SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)5mM EDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中洗涤1.5小时。

26苯基噻唑配体1为PI3K所有同工型(参见上文)的配体。然而，遍及本发明，优选PI3K为PI3Kγ或PI3Kδ，特别是其人类同工型。

27在本发明的某些方面，首先提供包含PI3K的蛋白质制剂。本发明方法可以用任何蛋白质制剂作为起始材料来进行，只要PI3K在该制剂中溶解。实例包括几种蛋白的液体混合物，细胞裂解物、不包含存在于原始细胞中的所有蛋白质的部分细胞裂解物或几种细胞裂解物的组合。术语“蛋白质制剂”还包括溶解的纯化蛋白。

28在目的蛋白质制剂中的PI3K蛋白种类的存在可以基于用特异性针对PI3K的抗体探测的蛋白质印迹来检测。在PI3K为特异同工型(例如PI3Kγ和/或PI3Kδ)的情况下，所述同工型的存在可以通过同工型-特异性抗体来确定。此类抗体在本领域是已知的(Sasaki等.，2000，Nature 406，897-902；Deora et al.，1998，J.Biol.Chem.273，29923-29928)。可选择地，还可以使用质谱法(MS)(参见下文)。

29细胞裂解物或部分细胞裂解物可以通过以下获得：首先分离细胞器(例如细胞核、线粒体、核糖体、高尔基体等)，然后制备源自这些细胞器的蛋白质制剂。用于分离细胞器的方法在本领域是已知的(第4.2章Purification of Organelles from Mammalian Cellsin”Current Protocols in Protein Science”，编辑：John.E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；Wiley，ISBN：0-471-14098-8)。

30此外，蛋白质制剂还可以通过以下来制备：分级分离细胞提取物从而富集特定种类的蛋白质例如细胞质蛋白或膜蛋白(第4.3章Subcellular Fractionation of Tissue Culture Cells in”CurrentProtocols in Protein Science”，编辑：John.E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；Wiley，ISBN：0-471-14098-8)。

31此外，还可使用来自体液(例如血液、脑脊液、腹腔液和尿)的蛋白质制剂。

32例如，可以使用源自模式生物例如线虫(C.elegans)的确定发育阶段或成体阶段的全胚胎裂解物(whole embryo lysate)。此外，完整器官例如解剖自小鼠的心脏可以为蛋白质制剂的来源。还可以在体外灌注这些器官以获得蛋白质制剂。

33此外，蛋白质制剂可以为包含重组产生的PI3K的制剂。在原核和真核细胞中产生重组蛋白质的方法已广泛建立(第5章Production of Recombinant Proteins in”Current Protocols inProtein Science”，编辑：John.E.Coligan，Ben M.Dunn，HiddeL.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；Wiley，1995，ISBN：0-471-14098-8)。

34在本发明方法的优选实施方案中，蛋白质制剂的提供包括收获至少一种包含PI 3K的细胞和裂解所述细胞的步骤。

35用于此目的的合适细胞为例如表达PI3K家族的成员的那些细胞或组织。PI3K家族的成员在大多数细胞和组织中表达。PI3Kγ优先在造血系统的细胞(例如粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞和血小板)中以及在心肌细胞、血管平滑肌和血管上皮细胞中表达。PI3Kδ随着在淋巴细胞、粒细胞和肥大细胞中显著表达而普遍表达。

36因此，在优选的实施方案中，从外周血分离的细胞代表合适的生物材料。从外周血获得的人类淋巴细胞和淋巴细胞亚群(PBLs)的制备和培养方法是普遍已知的(W.E Biddison，第2.2章“Preparation and culture of human lymphocytes”in CurrentProtocols in Cell Biology，1998，John Wiley & Sons，Inc.)。例如，密度梯度离心为从其它血细胞群(例如红细胞和粒细胞)中分离淋巴细胞的方法。人类淋巴细胞亚群可以通过其特异性细胞表面受体来分离，所述特异性细胞表面受体可以被单克隆抗体识别。物理分离方法包括将这些抗体试剂偶联至磁珠，所述磁珠允许富集与这些抗体结合的细胞(阳性选择)。这些分离的淋巴细胞可以被进一步培养并通过添加针对T-细胞受体或共受体(例如CD-3)的抗体来刺激，以诱发T-细胞受体信号传导和随后PI3K的磷酸化(Houtman等，2005，TheJournal of Immunology 175(4)，2449-2458)。

37作为原代人类细胞的另一选择，可以使用培养的细胞系(例如MOLT-4细胞或大鼠嗜碱性白血病(RBL-2H3)细胞)。RBL-2H3细胞可以通过用多价抗原交联IgE的高亲和力受体(FcepsilonRI)进行刺激以诱导PI3K的激活(Kato等，2006，J.Immunol.177(1)：147-154)。

38在优选的实施方案中，细胞为细胞培养系统的部分，并且用于从细胞培养系统中收获细胞的方法在本领域是已知的(如上述文献)。

39细胞的选择将主要依赖于PI3K的表达，这是因为必须确保该蛋白质主要地存在于所选择的细胞中。为了确定对于本发明方法而言给定的细胞是否为合适的起始系统，例如蛋白质印迹、基于PCR的核酸检测方法、RNA印迹和DNA微阵列方法(“DNA芯片”)等方法可能是合适的，以确定给定的目的蛋白是否存在于所述细胞中。

40所述细胞的选择还可受研究的目的影响。如果需要分析给定的药物的体内功效，则可以选择出现期望疗效的细胞或组织(例如粒细胞或肥大细胞)。相反，为了阐明(elucidation)介导不期望的副反应的蛋白质靶点，可以分析观察到所述副反应的细胞或组织(例如心肌细胞、血管平滑肌或上皮细胞)。

41此外，在本发明中设想包含PI3K的细胞可以例如通过活组织检查从生物体获得。相应的方法在本领域是已知的。例如，活组织检查为用于获得少量组织的诊断方法，所述少量组织随后可以显微或用生化方法检查。活组织检查对于诊断疾病、将疾病分类和将疾病分阶段，以及评价和监控药物治疗都是重要的。

42通过收获至少一种细胞，同时进行裂解，这包含在本发明内。然而，首先收获所述细胞然后单独地裂解也同样地优选。

43裂解细胞的方法在本领域是已知的(Karwa和Mitra：Sample preparation for the extraction，isolation，andpurification of Nuclei Acids；chapter 8 in”Sample PreparationTechniques in Analytical Chemistry”，Wiley 2003，编辑：Somenath Mitra，印刷ISBN：0471328456；在线ISBN：0471457817)。不同细胞类型和组织的裂解可以通过以下来实现：匀浆器(例如Potter匀浆器)、超声粉碎机、酶裂解、洗涤剂(例如NP-40，TritonX-100，CHAPS，SDS)、渗透压休克、反复冻融，或这些方法的组合。

44根据本发明方法，在允许形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物的条件下，使包含PI3K的蛋白质制剂与固定在固体支持物上的苯基噻唑配体1接触。

45在本发明中，术语“苯基噻唑配体1-PI3K复合物”表示其中苯基噻唑配体1与PI3K通过例如共价或最优选通过非共价结合相互作用的复合物。

46本领域技术人员将知道可以使用什么条件以使得能够形成苯基噻唑配体1-PI3K复合物。

47在本发明的背景中，术语“在允许形成复合物的条件下”包括在其下此类形成、优选此类结合是可行的所有条件。这包括使固体支持物在固定的相上和将裂解物倒在其上的可能性。在另一优选实施方案中，还包括所述固体支持物为颗粒形式并且与所述细胞裂解物混合。

48在非共价结合的背景下，苯基噻唑配体1和PI3K之间的结合通过例如盐桥、氢键、疏水性相互作用，或其组合。

49在优选的实施方案中，苯基噻唑配体1-PI3K复合物的形成步骤在基本上生理条件(essentially physiological conditions)下进行。细胞内蛋白质的物理状态描述于Petty，1998(Howard R.Petty¹，Chapter 1，Unit 1.5in：Juan S.Bonifacino，Mary Dasso，JoeB.Harford，Jennifer Lippincott-Schwartz，和Kenneth M.Yamada(eds.)Current Protocols in Cell Biology Copyright2003 JohnWiley & Sons，Inc.版权所有.DOI：10.1002/0471143030.cb0101s00在线发布日期：2001年5月，印刷公布日期：1998年10月)。

50在基本上生理条件下的接触具有以下优点：配体、细胞制剂(即待表征的激酶)和任选地化合物之间的相互作用最大可能地反映天然条件。“基本上生理条件”尤其为存在于原始的、未处理的样品材料中的那些条件。它们包括生理蛋白质浓度、pH、盐浓度、缓冲能力和涉及的蛋白质的翻译后修饰。术语“基本上生理条件”不需要与从中得到样品的最初活生物体中的条件相同的条件，但是需要基本上类似细胞的条件或与细胞条件接近的条件。当然，本领域技术人员将意识到由于将最终导致较少类似细胞的条件的实验结构，可能产生某些限制。例如，当从活生物体中取出和处理样品时，细胞壁或细胞膜的最终所需的破坏可能需要与在生物体中发现的生理条件不同的条件。为了实施本发明方法，生理条件的适当的变化对本领域技术人员来说是明显的，并且包含于本文所用的术语“基本上生理条件”中。总之，应理解术语“基本上生理条件”涉及与例如在天然细胞中发现的生理条件接近的条件，但不必然地需要这些条件相同。

51例如，“基本上生理条件”可以包含：50-200mM NaCl或KCl、pH 6.5-8.5、20-37℃和0.001-10mM二价阳离子(例如Mg++，Ca++，)；更优选约150m NaCl或KCl、pH7.2至7.6、5mM二价阳离子，并且经常包括0.01-1.0百分比的非特异性蛋白(例如BSA)。非离子洗涤剂(Tween，NP-40，Triton-X100)经常可以以通常约0.001至2％，典型地0.05-0.2％(体积/体积)存在。对于一般指导，可应用以下水性缓冲条件：10-250mM NaCl、5-50mM Tris HCl、pH5-8，具有任选添加的二价阳离子和/或金属螯合剂和/或非离子洗涤剂。

52优选地，“基本上生理条件”指6.5至7.5，优选7.0至7.5的pH，和/或10至50mM，优选25至50mM的缓冲液浓度，和/或120至170mM，优选150mM的单价盐(例如Na或K)浓度。可以进一步以1至5mM，优选1至2mM的浓度存在二价盐(例如Mg或Ca)，其中更优选所述缓冲液选自Tris-HCl或HEPES。

53在本发明的背景中，苯基噻唑配体1固定在固体支持物上。遍及本发明，术语“固体支持物”涉及能够在其表面上固定小分子配体的每一不溶性支持物。

54根据更优选的实施方案，固体支持物选自：琼脂糖、改性的琼脂糖、琼脂糖凝胶珠(例如NHS-活化的琼脂糖凝胶)、胶乳、纤维素、亚铁-或铁磁性颗粒。

55苯基噻唑配体1可以共价地或非共价地偶联到固体支持物上。非共价结合包括通过结合到链霉抗生物素基质(steptavidinmatrices)的生物素亲和配体来结合。

56优选地，苯基噻唑配体1共价地偶联到固体支持物上。

57偶联前，基质可以包含活性基团例如NHS、Carbodimide等以使得能够与苯基噻唑配体1偶联反应。苯基噻唑配体1可以通过直接偶联(例如使用官能团例如氨基-、巯基-、羧基-、羟基-、醛基-和酮基)和通过间接偶联(例如通过生物素、共价地连接至苯基噻唑配体1的生物素和使生物素非共价地结合至直接结合到固体支持物的链霉抗生物素)偶联至固体支持物上。

58与固体支持物材料的连接可以包括可裂解和不可裂解连接子。该裂解可以通过酶裂解或用适当的化学方法处理来实现。

59对于使苯基噻唑配体1结合至固体支持物材料上，优选的结合界面为具有C原子主链的连接子。典型的连接子具有8、9或10个原子的主链。该连接子包含羧基或氨基活性基团。

60本领域技术人员将意识到在本发明方法的各步骤之间，可能需要洗涤步骤。该洗涤为本领域技术人员的部分知识。该洗涤用于从固体支持物中除去细胞裂解物的未结合组分。非特异性(例如简单的离子性)结合相互作用可以通过添加低水平的洗涤剂或通过适当地调节洗涤缓冲液中的盐浓度来最小化。

61根据本发明的鉴定方法，读出系统(read-out system)为检测或确定PI3K(本发明的第一方面)、检测苯基噻唑配体1-PI3K复合物(本发明的第二方面)或确定苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量(本发明的第二、三和四方面)。

62在根据本发明第一方面的方法中，检测或确定分离的PI3K优选表示以下事实：该化合物能够从固定的苯基噻唑配体1中分离PI3K。该能力表明各化合物与PI3K相互作用，优选结合到PI3K，这表明其治疗潜力。

63在根据本发明第二方面的方法的一个实施方案中，检测在本发明方法期间形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物。形成此类复合物的事实优选地表明该化合物不完全抑制复合物的形成。另一方面，如果不形成复合物，则推测该化合物为PI3K的强相互作用子，这表明其治疗潜力。

64根据本发明第二、三和四方面的方法，确定在本方法期间形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量。通常，在各化合物的存在下形成的复合物越少，各化合物与PI3K相互作用越强，这表明其治疗潜力。

65根据本发明第二方面，苯基噻唑配体1-PI3K复合物的检测可以通过使用标记的针对PI3K的抗体和合适的读出系统来进行。

66根据本发明第二方面的优选实施方案，苯基噻唑配体1-PI3K复合物通过确定其量来检测。

67在本发明第二、三和四方面的过程中，优选PI3K从固定的苯基噻唑配体1中分离以确定苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量。

68根据本发明，分离指破坏苯基噻唑配体1和PI3K之间相互作用的每一行为。在优选的实施方案中这包括从固定的苯基噻唑配体1中洗脱PI3K。

69洗脱可以通过使用如下详细描述(离子强度、pH值、洗涤剂)的非特异性试剂来实现。此外，能够测试目的化合物是否能够从苯基噻唑配体1中特异性地洗脱PI3K。此类PI3K相互作用化合物在以下部分进一步描述。

70用于破坏相互作用的此类非特异性方法在本领域中大体上已知，并且依赖于配体酶相互作用的性质。大体上，离子强度、pH值、温度的变化或与洗涤剂一起温育为从固定的配体中解离靶酶的适当方法。洗脱缓冲液的使用能够通过以下解离结合的配对物(bindingpartners)：pH值的极端值(extreme)(高或低pH，例如通过使用0.1MpH2-3的柠檬酸盐降低pH)、离子强度的改变(例如使用NaI、KI、MgCl2或KCl的高盐浓度)、破坏疏水性相互作用的极性还原剂(例如二噁烷或乙二醇)、或变性剂(离液盐或洗涤剂例如十二烷基硫酸钠、SDS；综述：Subramanian A.，2002，Immunoaffinty chromatography)。

71在某些情况下，优选必须将固体支持物与释放的物质分离。用于此的各方法依赖于固体支持物的性质，并且在本领域中是已知的。如果支持物材料包含于柱内，可以收集释放的物质为柱流出物。在支持物材料与裂解物组分混合的情况下(所谓的分批方法)，可能需要额外的分离步骤例如温和的离心，并且收集释放的物质为上清液。可选择地，磁珠可以用作固体支持物以便通过使用磁性装置从样品中除去所述珠。

72在根据本发明第一方面的方法的步骤d)中，确定PI3K是否已经从固定的苯基噻唑配体1中分离。这可以包括检测PI3K或确定PI3K的量。

73因此，至少在本发明所有鉴定方法的优选实施方案中，使用检测分离的PI3K或确定其量的方法。此类方法在本领域中是已知的，并且包括物理-化学方法例如蛋白质测序(例如Edmann降解)、通过质谱法或使用针对PI3K的抗体的免疫检测方法的分析。

74遍及本发明，如果使用抗体以检测PI3K或以确定其量(例如通过ELISA)，本领域技术人员将理解如果检测特定的PI3K的同工型或如果确定特定的PI3K的同工型的量，可以使用同工型-特异性抗体。如上所述，此类抗体在本领域中是已知的。此外，本领域技术人员知道其生产方法。

75优选地，通过质谱或免疫检测方法检测PI3K或确定PI3K的量。

76用质谱分析(质谱)鉴定蛋白质在本领域中是已知的(Shevchenko等，1996，Analytical Chemistry 68：850-858，；Mann等，2001，Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry，Annual Review of Biochemistry 70，437-473)，并且在实施例部分进一步描述。

77优选地，质谱分析以定量方式进行，例如通过使用iTRAQ技术(同位素标签相对和绝对定量)或cICAT(可裂解同位素编码亲和标签(cleavable isotope-coded affinity tags))(Wu等，2006.J.Proteome Res.5，651-658等)。

78根据本发明另一优选实施方案，通过鉴定PI3K的蛋白典型肽(proteotypic peptide)来进行质谱(MS)的表征。该想法为PI3K用蛋白酶进行消化，所得的肽通过MS确定。结果，对于相同来源蛋白质的肽而言肽频率在很大程度上不同，“典型地”有助于鉴定该蛋白的最经常观察到的肽被命名为“蛋白典型肽”。因此，用于本发明的“蛋白典型肽”为实验上良好可观察的肽，其独特地鉴定特异蛋白或蛋白同工型。

79根据优选的实施方案，通过比较在实施本发明方法的过程中获得的蛋白典型肽与已知的蛋白典型肽来进行表征。当使用通过蛋白酶消化制备的片段在MS中鉴定蛋白质时，通常对于给定的酶观察到相同的蛋白典型肽，因此，可以将对于给定样品获得的蛋白典型肽与对于给定种类的酶的酶而言已知的蛋白典型肽比较，从而鉴定存在于样品中的酶。

80作为质谱分析的另一选择，可以通过使用针对PI3K(或针对PI3K的同工型，参见上文)的特异性抗体检测洗脱的PI3K(包括共洗脱的结合的配对物或支架蛋白(scaffold protein))或确定其量。

81此外，在另一优选的实施方案中，一旦已经通过质谱分析鉴定出共洗脱的结合的配对物，各结合的配对物可以用针对该蛋白质的特异性抗体来检测。

82适当的基于抗体的测定包括但不限于蛋白质印迹、ELISA测定、夹心ELISA测定和抗体测定或其组合。此类测定的建立在本领域是已知的(第11章，Immunology，pages 11-1 to 11-30 in：ShortProtocols in Molecular Biology.第四版，由F.M.Ausubel等编辑，Wiley，New York，1999)。

83这些测定不仅能够以检测和定量目的PI3K相互作用蛋白(例如PI3K复合物的催化性或调控性亚基)的方式，还能够以分析翻译后修饰模式例如磷酸化或泛素化修饰的方式配置。

84此外，本发明的鉴定方法包括使用就其为PI3K相互作用化合物的能力对其进行测试的化合物。

85大体上，根据本发明，此类化合物可以为能够与PI3K相互作用(例如通过抑制其结合至苯基噻唑配体1)的每一分子。优选地，该化合物对PI3K起作用，例如刺激性或抑制性作用。

86优选地，所述化合物选自：合成或天然存在的化学化合物或有机合成药物，更优选小分子、有机药物或天然小分子化合物。优选地，从包含此类化合物的文库开始鉴定所述化合物。然后，在本发明的过程中，筛选此类文库。

87此类小分子优选不是蛋白质或核酸。优选地，小分子显示低于1000Da、更优选低于750Da、最优选低于500Da的分子量。

88根据本发明的“文库”涉及(许多)不同化学实体的(通常巨大的)集合，所述化学实体以分类的方式提供，其使得能够快速官能化分析(筛选)不同的单独的实体，并且同时提供快速鉴定形成文库的单独的实体。实例为在表面上包含化学化合物的管或孔或点的集合，所述化学化合物可以与一种或多种确定的潜在相互作用配对物(interacting partner)一起以高通量的方式加入反应。鉴定所需要的配对物的“阳性”相互作用之后，由于文库构造，可以快速地鉴定各化合物。合成和天然起源的文库可以购买或由本领域技术人员设计。

89文库构造的实例提供于例如Breinbauer R，Manger M，Scheck M，Waldmann H.Natural product guided compound librarydevelopment.Curr Med Chem.2002 Dec；9(23)：2129-45，其中对对于设计组合文库而言为生物学有效起始点的天然产物进行描述，因为它们具有生物相关性的已证明记录。在药物化学和化学生物学中天然产物的该特殊作用可以根据通过结构生物学和生物信息学获得的关于蛋白质的结构域构架(domain architecture)的新观点进行解释。为了满足结构域家族内单独的结合口袋的特殊需求，可能必须通过化学变化最优化天然产物结构。据说固相化学成为用于这一最优化过程的有效工具，并且该领域的最新进展在该综述论文中被突出强调。其它相关文献包括Edwards PJ，Morrell AI.Solid-phase compound librarysynthesis in drug design and development.Curr Opin Drug DiscovDevel.2002 Jul；5(4)：594-605.；Merlot C，Domine D，Church DJ.Fragment analysis in small molecule discovery.Curr Opin DrugDiscov Devel.2002 May；5(3)：391-9.Review；Goodnow RA Jr.Current practices in generation of small molecule new leads.J Cell Biochem Suppl.2001；Suppl 37：13-21；其描述在许多药物公司中目前药物发现方法需要巨大的和不断增长的高质量的先导结构(lead structures)的集合以用于高通量筛选测定。过去具有各种结构和“类药物”性质的小分子的集合通过以下几种方法获得：通过之前内部先导最优化成果的存档，通过从化合物供应商购买，和通过公司兼并后分开的集合的合并。虽然高通量/组合化学被描述为新的先导产生方法中的重要组成，但用于合成的文库设计和随后文库成员的设计的选择已经发展到新水平的挑战性和重要性。针对多个生物学靶点的多个小分子化合物文库设计的筛选的潜在利益为发现新的先导结构提供了实质上的机会。

90在本发明第二和第三方面的优选实施方案中，将包含PI3K的蛋白质制剂首先与化合物然后与固定的苯基噻唑配体1一起温育。然而，将化合物和固定的苯基噻唑配体1与包含PI3K的蛋白质制剂一起同时温育(共温育)是同等优选的(竞争性结合测定)。

91在首先与化合物温育的情况下，PI3K优选与该化合物在4℃至37℃，更优选4℃至25℃，最优选4℃的温度下一起温育10至60分钟，更优选30至45分钟。优选以1μM至1mM，更优选10至100μM范围的浓度使用化合物。第二步，与固定的配体接触，优选在4℃下进行10至60分钟。

92在同时温育的情况下，PI3K优选与化合物和苯基噻唑配体1一起在4℃至37℃，更优选4℃至25℃，最优选4℃的温度下同时温育30至120分钟，更优选60至120分钟。优选以1μM至1mM，更优选10至100μM范围的浓度使用化合物。

93此外，本发明第二方面的步骤a)至c)可以用几种蛋白质制剂来进行以测试不同的化合物。该实施方案在中或高通量筛选的背景下特别有利(参见下文)。

94根据第三或第四方面的本发明方法的优选实施方案中，比较在步骤c)中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物的量与在步骤b)中形成的量。

95根据第三或第四方面的本发明方法的优选实施方案中，在步骤c)中形成的苯基噻唑配体1-PI3K复合物与步骤b)相比减少的量表明PI3K为该化合物的靶点。这源自以下事实：在本发明此方法的步骤c)中，该化合物与配体竞争结合PI3K。如果较少的PI3K存在于与该化合物一起温育的等分试样中，那么这意味着该化合物优选与抑制剂竞争与酶相互作用，因此，其为该蛋白质的直接靶点，反之亦然。

96优选地，本发明的鉴定方法以中或高通量筛选方式来进行。

97根据本发明鉴定的相互作用化合物可以通过确定其对PI3K，例如对其激酶活性是否起作用来进一步表征(Carpenter等，1990，J.Biol.Chem.265，19704-19711)。此类测定在本领域是已知的，也以允许中至高通量筛选的形式(Fuchikami等，2002，J.Biomol.Screening 7，441-450)。

98简要地说，PI3K脂类激酶活性可以使用具有磷脂囊泡的基于溶液的测定来测量。该反应通过添加酸化的有机溶剂来终止，随后的相分离通过萃取或薄层色谱分析来进行(Carpenter等，1990，J.Biol.Chem.265，19704-19711)。

99可选择地，可以使用荧光偏振测定形式。简要地说，PI3K与适当的磷酸肌醇底物一起温育。反应完成后，反应产物与特异性磷酸肌醇检测蛋白和荧光磷酸肌醇探针混合。随着结合到磷酸肌醇检测蛋白上的探针被反应产物代替，偏振(mp)值降低。荧光探针偏振的程度与PI3K反应产物的量成反比例(Drees等，2003，Comb.Chem.HighThroughput Screening 6，321-330)。

100为了确定PI3K蛋白激酶活性，可以使用具有适当肽底物的荧光偏振测定。简要地说，荧光素标记的肽底物可以与PI3K(例如PI3Kδ)、ATP和抗磷酸丝氨酸抗体一起温育。随着反应进行，磷酸化的肽结合到抗磷酸丝氨酸抗体，导致偏振信号增加。抑制激酶的化合物导致低的偏振信号。

101根据本发明鉴定的化合物可以被进一步最优化(先导优化)。由于在这些先导产生文库(lead generation libraries)中编码的结构-活性关系(SAR)信息，通常促进此类化合物的随后的最优化。由于用于后续合成的高通量化学(HTC)方法的易适应性，通常促进先导最优化。

102针对PI3Kγ，描述此类文库和先导最优化的一个实例(Pomel等，2006，J.med.Chem.49，3857-3871)。

103本发明进一步涉及制备药物组合物的方法，其包括以下步骤：

a)如上所述鉴定PI3K相互作用化合物，和

b)将所述相互作用化合物配制成药物组合物。

104因此，本发明提供制备药物组合物的方法，其可以以有效量施用给受试者。在优选方面，治疗剂(therapeutic)被充分纯化。待治疗的受试者优选动物，其包括但不限于例如牛、猪、马、鸡、猫、狗等动物，并且优选哺乳动物，最优选人类。在特定实施方案中，非人类哺乳动物为受试者。

105将根据本发明鉴定的化合物用于预防或治疗其中PI 3K起作用的疾病，例如癌症(例如乳腺、结肠或卵巢癌)、代谢疾病(例如糖尿病或肥胖)或自身免疫/炎症病变(例如风湿性关节炎、银屑病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、哮喘或过敏反应)。

106因此，本发明还涉及通过本发明方法鉴定的化合物在制备治疗一种或多种上述疾病的药物中的用途。此外，本发明涉及包含所述化合物的药物组合物。

107通常，本发明的药物组合物包含治疗有效量的治疗剂、药学上可接受的载体。在特定实施方案中，术语“药学上可接受的”指被联邦或国家政府的管理机构批准的或列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其它普遍认可的药典用于动物，特别是人类的。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介(vehicle)。此类药物载体可以为无菌液体，例如水或油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当口服施用药物组合物时，水为优选的载体。当药物组合物静脉内施用时，盐水或水性葡萄糖为优选的载体。优选将盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液用作可注射溶液的液体载体。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物也可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。该组合物可以与传统的粘合剂和载体例如甘油三酸酯一起配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于由E.W.Martin编写的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中。此类组合物将包含治疗有效量的治疗剂，优选以纯的形式，以及适当量的载体，以提供恰当的施用给患者的形式。制剂应该适合施用的模式。

108在优选的实施方案中，根据常规方法将组合物配制为适于静脉内施用给人类的药物组合物。典型地，用于静脉内施用的组合物为在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。当必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。通常，成分单独或在单位剂型中混合在一起供给，例如作为在密封容器例如标明活性试剂量的安瓿或sachette中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当该组合物通过灌输施用时，其可以用包含无菌药物级别的水或盐水的输液瓶配药。当该组合物通过注射施用时，可以提供含注射用无菌水或盐水的安瓿以便成分可以在施用之前混合。

109本发明的治疗剂可以配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离羧基形成的那些盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐，与游离氨基形成的那些盐，例如衍生自异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些盐，和衍生自钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物等的那些盐。

110在治疗特定疾病或病况中有效的本发明治疗剂的量将依赖于疾病或病况的性质，并且能够由标准临床技术确定。此外，可以任选使用体外测定以帮助鉴定最佳剂量范围。用于制剂的精确剂量也将依赖于给药途径，和疾病或病症的严重性，并且应该根据从业者的判断和各病人的情况决定。然而，用于静脉内施用的合适剂量范围通常为约20-500毫克活性化合物每千克体重。用于鼻内给药的合适剂量范围通常为约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。可以从得自体外或动物模式测试系统的剂量-反应曲线推断有效剂量。通常，栓剂可以以0.5％至10％重量的范围包含活性成分，口服制剂优选包含10％至95％活性成分。

111各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本发明治疗剂，例如，包装在脂质体、微粒和微胶囊中：使用能够表达治疗剂的重组细胞，使用受体-介导的胞吞作用(例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)；构建治疗核酸作为逆转录病毒或其它载体的部分等。导入方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述化合物可以通过任意常规途径施用，例如通过灌输、通过团注、通过经由上皮或皮肤粘膜的内衬(linings)(例如，口腔、直肠和肠粘膜等)的吸收，可以与其它生物活性剂一起施用。给药可以是全身或局部的。此外，可能需要通过任何适当的途径，包括脑室内和鞘内注射，将本发明的药物组合物导入中枢神经系统；脑室内注射可以通过脑室内导管促进，例如，连接至贮器(reservoir)，例如奥马耶贮器(Ommaya reservoir)。也可以使用肺部给药，例如，通过使用吸入器或喷雾器，以及用气雾化剂配制。

112在特定实施方案中，可能需要将本发明的药物组合物局部施用至需要治疗的区域。这可以通过例如(不以限制方式)以下方式来实现：手术期间的局部灌输，例如手术后与创伤敷料一起的局部应用，通过注射、通过导管、通过栓剂、或通过植入物，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜，例如硅橡胶(sialastic)膜，或纤维。在一个实施方案中，可以通过在恶性肿瘤或瘤或前瘤组织的位置(或前体位置)直接注射给药。

113在另一实施方案中，治疗剂可以在囊泡，特别是脂质体中递送(Langer，1990，Science 249：1527-1533)。

114在另一实施方案中，治疗剂可以通过控释系统递送。在一实施方案中，可以使用泵(Langer，如上所述)。在还一实施方案中，控释系统可以置于治疗目标(即脑)的附近，从而仅需要全身剂量的部分。

115本发明进一步涉及纯化PI3K的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，

c)从固定的苯基噻唑配体1中分离PI3K。

116如上所述，令人惊奇地发现苯基噻唑配体1为识别PI3K的配体。其使得能够进行有效的PI3K纯化方法。

117关于PI3K、包含PI3K的蛋白质制剂、用于与苯基噻唑配体1接触的条件、固定的苯基噻唑配体1、苯基噻唑配体1-PI3K复合物、从固定的苯基噻唑配体1中分离PI3K和检测PI3K或确定其量，将用于本发明鉴定方法的如上所述的实施方案也用于本发明的纯化方法。

118在优选的实施方案中，纯化方法进一步包括纯化PI3K的特定同工型的步骤，优选纯化PI3Kγ和/或PI3Kδ的步骤。

119优选地，所述纯化使用如上所述的同工型特异性抗体，更优选PI3Kγ特异性抗体和/或PI3Kδ特异性抗体来进行。

120在优选的实施方案中，本发明的纯化方法进一步包括在步骤c)之后鉴定能够结合至PI3K的蛋白质。当复合物的形成在基本上生理条件下进行时，这特别引起关注，这是因为其后能够保持酶的天然条件，包括结合的配对物、酶亚基或翻译后修饰的存在，其然后在质谱(MS)的帮助下能够进行鉴定。

121因此，在优选的实施方案中，本发明的纯化方法进一步包括在步骤c)之后确定PI3K是否进一步被翻译后修饰，例如被泛素化修饰。

122本发明进一步涉及苯基噻唑配体1在鉴定PI3K相互作用化合物和在纯化PI3K中的用途。如上所述的实施方案也可用于本发明的用途。

123通过以下附图和实施例进一步阐述本发明，不认为其限制由本申请的权利要求确定的保护范围。

附图简述

124图1：苯基噻唑配体1的合成和结构

苯基噻唑配体1按照实施例1中所述合成。

125图2：使用固定的苯基噻唑配体1的药物下拉实验(pull downexperiment)和PI3K蛋白质的蛋白质印迹检测。

将从MOLT-4细胞制备的细胞裂解物用作生物材料。按照实施例2中所述用包含50mg蛋白质的裂解物样品进行药物下拉实验。捕获的蛋白质用包含DMSO的缓冲液(泳道1)、100μM游离苯基噻唑配体1或SDS样品缓冲液(泳道3)洗脱。洗脱的样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移到膜上。首先用针对PI3Kγ(图2A)和PI3Kδ(图2B)的特异性抗体温育印迹。用Odyssey红外成像系统使用检测用荧光染料标记的第二检测抗体。泳道1：DMSO洗脱对照；泳道2：用100μM游离苯基噻唑配体1的洗脱；泳道3：SDS洗脱。

126图3：用于蛋白质质谱分析的使用固定的苯基噻唑配体1的药物下拉实验。

示出用考马斯亮蓝染色后的蛋白质凝胶。将标记的凝胶区域切下作为凝胶切片，蛋白质通过质谱进行分析。

按照实施例2中所述使用包含50mg蛋白质的MOLT-4细胞裂解物样品进行药物下拉实验。结合到固定的苯基噻唑配体1的蛋白质用SDS样品缓冲液洗脱，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。

127图4：PI3Kγ的鉴定的肽

将通过质谱分析人类PI3Kδ序列鉴定出的肽以黑体的形式显示并加下划线。

128图5：PI3Kδ的鉴定的肽。

将通过质谱分析人类PI3Kγ序列鉴定出的肽以黑体的形式显示并加下划线。

129图6：用于鉴定PI3Kγ相互作用化合物的洗脱测定

该实验按照实施例3中所述进行。通过固定的苯基噻唑配体1从MOLT-4细胞裂解物中捕获PI3Kγ蛋白质，并通过标示的化合物将其洗脱。将洗脱物转移到硝酸纤维素膜，并用Odyssey红外成像系统检测PI3Kγ。一抗：抗PI3Kγ(Jena Bioscience ABD-026S；小鼠抗体)。二抗：抗小鼠IRDye800(Rockland，610-732-124)。示出积分强度(积分千像素/mm²)。

用于洗脱物的化合物：

化合物1(LY29004)；IC₅₀＞100μM；化合物2(AS-605240)：IC₅₀＝26nM；化合物3(AS-604850)；IC₅₀＝1.7μM。

130图7：用于鉴定PI3Kγ相互作用化合物的竞争结合测定

该实验按照实施例4中所述进行。将在标示浓度下的测试化合物和亲和基质加至MOLT-4细胞裂解物，不与测试化合物相互作用的PI3Kγ蛋白质通过在亲和基质上的固定的苯基噻唑配体1捕获。将亲和基质从裂解物中分离，结合的蛋白质用SDS样品缓冲液洗脱，将洗脱物转移至硝酸纤维素膜。PI3Kγ的量用Odyssey红外成像系统确定。

7A：用抗体探测的斑点印迹和用Odyssey红外成像系统检测的信号。一抗：抗-PI3Kγ(Jena Bioscience ABD-026S；小鼠抗体)。二抗：抗小鼠IRDye800(Rockland，610-732-124)。

7B：竞争结合曲线。将相对Odys sey单位(积分强度；积分千像素/mm²)相对于化合物浓度绘图，并且计算出半最大结合竞争(halfmaximal binding competition)(IC)值。化合物1(LY294002)：IC₅₀＞30μM；化合物2(AS-605240)：IC₅₀＝4.6μM；化合物3(AS-604850)：IC₅₀＝176nM。

131图8：通过添加化合物至细胞裂解物(裂解物测定)或通过将化合物与活RAW264.7细胞一起温育(细胞测定)分析化合物图谱(Compound profiling)。

该实验按照实施例5中所述进行。在两个测定中以10μM的浓度使用化合物，PI3Kδ的量用Odyssey红外成像系统定量。

实施例1亲和基质的制备

132该实施例举例说明用于从细胞裂解物中亲和捕获PI3K激酶的亲和基质的制备。捕获性配体通过使用氨基官能团的共价键共价地固定在固体支持物上。将该亲和基质用于实施例2、实施例3和实施例4。

133苯基噻唑配体1(3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐)的合成

134步骤1-3：按照W02003/072557中描述的方法制备1-溴-1-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-丙烷-2-酮。

135步骤4：5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基胺

136使1-溴-1-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-丙烷-2-酮(480mg1.5mmol)和硫脲(114mg 1.5mmol)在乙醇(12ml)中化合，并且加热至70℃，持续2个小时。使反应混合物冷却至室温，通过过滤和真空干燥收集固体产物以产生灰白色固体5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(375mg)。¹H NMR(400MHz DMSO-d₆)δ9.4(br s，2H)，8.0(d，1H)，7.9(d，1H)，7.8(dd，1H)，3.4(s，3H)，2.3(s，3H)。

137步骤5：(2-{2-[2-(2-{2[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-氨基甲酸叔丁酯

138使3-(2-{2-[2-(2-叔丁氧羰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸(690mg 1.9mmol)、EDAC(403mg 2.1mmol)、HOBT(284mg 2.1mmol)、NMM(420uL 3.8mmol)和5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(520mg 1.7mmol)在二甲基甲酰胺(16ml)中化合，并在室温下搅拌过夜。减压除去溶剂，将残留物溶于二氯甲烷(150ml)，用1M HCl水溶液(50ml)和饱和碳酸氢钠水溶液(50ml)洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤和蒸发。通过快速层析(使用50g IST二氧化硅flash cartridge，用0-2％甲醇/二氯甲烷洗脱)来纯化残留物以产生油(2-{2-[2-(2-{2[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-氨基甲酸叔丁酯(1.1g存在的残留溶剂)¹H NMR(400MHz CDCl3)10.3(br s，1H)，8.2(s，1H)，7.6(m，2H)，7.2(br s，1H)，3.9(t，2H)3.8-3.5(br m，14H)，3.3(br m，5H)，2.8(t，2H)，2.4(s，3H)，1.4(s，9H)。

139步骤6：3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐。

140将(2-{2-[2-(2-{2[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2-基氨基甲酰基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-氨基甲酸叔丁酯(1.0g 1.5mmo l)溶于二氯甲烷(10ml)，并用HCl(4ml在二噁烷中的4M溶液)。反应物在室温下搅拌3小时。蒸发溶剂，真空干燥残留物以产生黄色粘性油3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐(830mg存在残留溶剂)¹H NMR(400MHz CDCl3)8.4(br s，3H)，8.2(s，1H)，7.7(br d，1H)，7.6(br d，1H)3.9(br m，4H)，3.8-3.6(br m，12H)，3.3(s，3H)，3.3(br m，2H)，3.1(br m，2H)，2.6(s，3H).NMR质谱在Bruker dpx400上获得。

141表1：使用的缩略语

br	宽
		CDCl3	氘氯仿
d	双重态
		dd	双重态的双重态
DMSO	二甲亚砜
		EDAC	1-乙基-3-(3’-二甲氨基丙基)碳二亚胺
g	克
		HCl	盐酸
HOBT	N-羟基苯并三唑
		m	多重态
mg	毫克
		ml	毫升
mmol	毫摩尔
		M	摩尔
MHz	兆赫
		NMM	N-甲基吗啉

NMR	核磁共振
		q	四重态
s	单线态
		t	三重态

苯基噻唑配体1在珠(亲和基质)上的固定

142用无水DMSO(二甲亚砜，Fluka，41648，H20＜＝0.005％)平衡NHS-活化的Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，17-0906-01)。将1ml沉淀的珠置于15ml Falcon管，添加化合物原液(stock solution)(通常在DMF或DMSO中100mM)(终浓度0.2-2μmol/ml珠)以及15μl三乙胺(Sigma，T-0886，99％纯度)。将珠在室温下在黑暗中在立式圆筒形振动筛(end-over-end shaker)(RotoShake Genie，Scientific Industries Inc.)上温育16-20小时。通过HPLC确定偶联效率。通过在室温下在立式圆筒形振动筛上与氨基乙醇一起温育过夜来封闭未反应的NHS-基团。用10ml DMSO洗涤珠，并将其贮存在-20℃下的异丙醇中。将这些珠用作实施例2、3和4中的亲和基质。如上所述通过与氨基乙醇一起温育封闭NHS-基团来产生对照珠(没有固定的配体)。

实施例2：使用固定的苯基噻唑配体1的PI3K的药物下拉

143该实施例示范固定的苯基噻唑配体1用于鉴定来自人类T细胞系(MOLT-4细胞；ATCC编号CRL-1582)的细胞裂解物的PI3K蛋白质的用途。为此，使MOLT-4细胞的裂解物与实施例1中所述的亲和基质接触。通过蛋白质印迹和质谱(MS)分析鉴定结合至苯基噻唑配体1的蛋白质。

144对于蛋白质印迹分析，将结合蛋白从亲和基质中洗脱，随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。用特异性抗体检测PI3Kγ和PI3Kδ(图2)。蛋白质印迹分析的结果显示固定的苯基噻唑配体1从细胞裂解物中捕获(下拉)PI3Kγ和PI3Kδ。

145为了通过质谱分析鉴定蛋白质，将亲和基质捕获的蛋白质洗脱，随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离(图3)。将合适的凝胶带切下，用胰蛋白酶进行凝胶内蛋白水解消化，并通过LC-MS/MS质谱分析。

146PI3K家族成员的鉴定在表3中证明。PI3Kγ的肽序列覆盖(coverage)示于图4，PI3Kδ的肽序列覆盖示于图5。

1.细胞培养

147使MOLT-4细胞(ATCC编号1582)在1升转瓶(Spinner flasks)(Integra Biosciences，#182101)中悬浮于补充有10％胎牛血清(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Invitrogen，#21875-034)中以0.15x 10⁶至1.2x 10e6个细胞/ml的密度生长。通过离心收获细胞，用1x PBS缓冲液(Invitrogen，#14190-094)洗涤一次，细胞团在液氮中冷冻，随后在-80℃下贮存。

2.细胞裂解物的制备

148使MOLT-4细胞在Potter S匀浆器中在下述裂解缓冲液中匀浆：50mM Tris-HCl、0.8％NP40、5％甘油、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、25mM NaF、1mM钒酸钠、1mM DTT、pH 7.5。每25ml缓冲液加入一片完整的无EDTA片剂(蛋白酶抑制剂混合物，Roche Diagnostics，1873 580)。使用机械化POTTER S将材料匀浆(dounced)10次，转移至50ml Falcon管中，在冰上温育30分钟，在4℃下以20,000g离心10分钟(在Sorvall SLA600中10,000rpm，预冷)。将上清液转移至超速离心机(UZ)-聚碳酸酯管(Beckmann，355654)，并且在4℃下以100.000g离心1小时(在Ti50.2中33.500rpm，预冷)。再次将上清液转移至新的50ml Falcon管中，通过Bradford测定(BioRad)确定蛋白质浓度，并且制备每等分试样包含50mg蛋白质的样品。立即将样品用于实验或在液氮中冷冻并在-80℃下贮存。

3.化合物下拉实验

149将具有固定的化合物的琼脂糖凝胶-珠(100μl珠每下拉实验)在裂解缓冲液中平衡，并用包含50mg蛋白质的细胞裂解物样品在立式圆筒形振动筛(Roto Shake Genie，Scientific Industries Inc.)上在4℃下温育2小时。收集珠，将其转移至Mobicol柱(MoBiTech10055)，并用10ml包含0.5％NP40洗涤剂的裂解缓冲液洗涤，随后用5ml具有0.25％洗涤剂的裂解缓冲液洗涤。为了洗脱结合蛋白，加60μl 2x SDS样品缓冲液，将柱在50℃下加热30分钟，将洗脱物通过离心转移至微量离心管(microfuge tube)。然后通过SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质。

4.通过蛋白质印迹分析的蛋白质检测

150根据标准方法进行蛋白质印迹，通过使用特异性抗PI3K抗体(一抗)、荧光标记的二抗和来自LI-COR Biosciences(Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像系统，根据由制造商提供的说明书检测和定量PI3K蛋白质(Schutz-Geschwendener等.，2004.Quantitative，two-color Western blot detection with infraredfluorescence.由LI-COR Biosciences于2004年5月公布，www.licor.com)。

151以1∶200的稀释比使用小鼠抗PI3Kγ抗体(JenaBioscience，产品目录号ABD-026S)，并与印迹一起在4℃下温育过夜。以1∶15000的稀释比使用第二抗-小鼠IRDye^TM800抗体(Rockland，产品目录号610-732-124)。将兔抗PI3Kδ(Santa Cruz，产品目录号sc-7176)稀释1∶600，并在4℃下温育过夜。将抗兔IRDyeTM 800抗体稀释1∶20 000作为第二检测抗体(LICOR，产品目录号926-32211)。

5.通过质谱的蛋白质鉴定

5.1质谱分析前的蛋白质消化

152基本上按照Shevchenko等，1996，Anal.Chem.68：850-858描述的方法将凝胶-分离的蛋白还原、烷基化并在凝胶中消化。简要地说，使用干净的手术刀将凝胶分离的蛋白从凝胶中切下，使用10mMDTT(在5mM碳酸氢铵中，54℃，45min)进行还原，随后用55mM碘乙酰胺(在5mM碳酸氢铵中)在室温下在黑暗中进行烷基化(30分钟)。经还原和烷基化的蛋白质用猪胰蛋白酶(Promega)以12.5ng/μl的蛋白酶浓度(在5mM碳酸氢铵中)在凝胶中消化。使消化在37℃下进行4小时，随后使用5μl 5％的甲酸终止反应。

5.2质谱分析之前的样品制备

153凝胶小块样本(Gel plugs)用20μl 1％TFA提取两次，并与酸化的消化上清液混合。将样品在真空离心机中干燥，并在l0μl 0.1％甲酸中重悬。

5.3质谱数据的获得

154将肽样品注入nano LC系统(CapLC，Waters or Ultimate，Dionex)，所述nano LC系统直接偶联至四极杆TOF(QTOF2，QTOFUltima，QTOF Micro，Micromass)或离子阱(LCQ Deca XP)质谱。使用梯度水性和有机溶剂(参见下文)在LC系统上分离肽。溶剂A为在0.5％甲酸中的5％乙腈，溶剂B为在0.5％甲酸中的70％乙腈。

155表2：在质谱中对LC系统洗脱出的肽部分地测序

时间(分钟)	％溶剂A	％溶剂B
			0	95	5
5.33	92	8
			35	50	50
36	20	80
			40	20	80
41	95	5
			50	95	5

5.4蛋白质鉴定

156将在LC-MS/MS实验中产生的肽质量和片段数据用于查询fasta格式的蛋白质和核苷酸序列数据库，所述数据库在NCBI(对于NCBInr，dbEST以及人类和小鼠基因组)和European BioinformaticsInstitute(EBI，对于人类，小鼠，果蝇(D.melanogaster)和线虫(C.elegans)蛋白质组数据库)进行维护并定期升级。使用软件工具Mascot通过将测量的肽质量和片段数据与从数据库的实体中计算出的相同数据关联来鉴定蛋白质(Matrix Science；Perkins等，1999.Probability-based protein identification by searching sequencedatabases using mass spectrometry data.Electrophoresis 20，3551-3567)。检索标准依赖于将哪一种质谱仪用于分析而变化。

157表3：通过质谱鉴定的P I 3K蛋白(MOLT-4细胞；实验P15234B；MS样品指从聚丙烯酰胺凝胶中切下的凝胶切片(图3))

MS样品	蛋白质登录号(IPI)	蛋白质名称	鉴定的肽的数量
				4	IPI00070943.3	PIK4CA；磷脂酰肌醇4-激酶，催化性，α多肽	62
5	IPI00024006.1	PIK3R4；磷酸肌醇-3-激酶，调节亚基4，p150	11
				6	IPI00292690.1	PIK3CG；磷酸肌醇-3-激酶，催化性，γ多肽	39
6	IPI00298410.2	PIK3CD；磷酸肌醇-3-激酶，催化性，δ多肽	26
				7	IPI00298410.2	PIK3CD；磷酸肌醇-3-激酶，催化性，δ多肽	12
8	IPI00002591.3	PIK4CB；磷脂酰肌醇4-激酶，催化性，β多肽	15
				9	IPI00021448.1	PIK3R1；磷酸肌醇-3-激酶，调节亚基1(p85α)	27
9	IPI00011736.3	PIK3R2；磷酸肌醇-3-激酶，调节亚基2(p85β)	8
				14	IPI00333040.3	PIK3R1；磷酸肌醇-3-激酶，调节亚基1(p85α)	7

实施例3用于鉴定PI3Kγ相互作用化合物的洗脱测定

158按照实施例1中所述制备苯基噻唑配体1亲和基质。为了最大限度地筛选在96孔板上的80种化合物，如下所述进行洗脱实验。

洗脱测定

159用30ml 1x DP-缓冲液洗涤亲和基质(1200μl珠)2次。每一洗涤步骤之后，通过在Heraeus离心机中在4℃下以1200rpm离心2分钟来收集珠。弃去上清液。最后，在15ml结合缓冲液(1x DP缓冲液/0.4％NP40)中平衡珠。此温育时间之后，收获珠，将其与MOLT-4细胞裂解物在50ml Falcon管中混合，所述MOLT-4细胞裂解物的蛋白质浓度为5mg/ml，蛋白质总量为75mg。如实施例2所述制备裂解物。在4℃下温育珠和裂解物2小时。与裂解物一起温育之后，如上所述通过离心收集珠，将其转移至2ml柱(MoBiTec，#S10129)并用10ml 1x DP缓冲液/0.4％NP40和5ml 1x DP缓冲液/0.2％NP40洗涤。一旦洗涤缓冲液完全地流过柱，计算柱中剩下的珠的体积(大约1000μl)。将珠重悬于4倍过量的1x DP-缓冲液/0.2％NP40(4ml)中以产生20％浆料。对于化合物洗脱测试，将50μl此悬浮液加至96孔板(Millipore MultiScreenHTS，MSBVN1210，具有盖和1.2um亲水性低蛋白结合Durapore膜)的每个孔中。为了除去残留的缓冲液，将96孔板与Assemble过滤器和收集板组装在一起，并将该三明治组件在离心机中以800rpm离心10秒。然后，将40μl补充有测试化合物的洗脱缓冲液(1×DP-缓冲液/0.2％NP40)加至珠。测试化合物通过将它们稀释于稀释缓冲液中来制备，所述稀释开始于40倍浓缩的在DMSO中的原液。将板组装在收集板上，在Eppendorf孵化器上固定，在4℃下以650rpm的振动温育30分钟。为了收获洗脱物，将组装在96孔收集板上的96孔过滤板在4℃下在台式离心机(Heraeus)中以800rpm离心1分钟。通过使用斑点印迹方法就PI3Kγ和PI3Kδ的存在检查洗脱物。

洗脱的PI3Kγ的检测

160使用针对PI3Kγ的抗体(Jena Bioscience，#ABD-026S)、荧光标记的第二抗小鼠IRDye^TM800(Rockland，#610-732-124)和来自LI-COR Biosciences(Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像系统，根据由制造商提供的说明书，通过斑点印迹方法检测和定量洗脱的PI3Kγ蛋白质(Schutz-Geschwendener等，2004.Quantitative，two-color Western blot detection with infraredfluorescence.由LI-COR Biosciences于2004年5月公布，www.licor.com)。

161用20％乙醇处理硝酸纤维素膜，随后用1x PBS缓冲液洗涤。使洗脱物(如上所述)与12μl 4x SDS上样缓冲液(200mM Tris-HClpH6.8，8％SDS，40％甘油，0.04％溴酚蓝)结合，并用BioRad斑点印迹设备(BioRad，#170-6545)将其施用至硝酸纤维素膜上。

162为了检测PI3Kγ，首先通过与Odyssey封闭缓冲液温育1小时来封闭膜。使封闭的膜与一抗(来自Jena Bioscience，ABD-026S的小鼠抗PI3Kγ)在4℃温育16小时，所述一抗在补充有0.2％Tween20的Odyssey封闭缓冲液中稀释1∶100。用包含0.1％Tween 20的1xPBS缓冲液洗涤膜4次(每次5分钟)之后，将膜与检测抗体(来自Rockland的抗小鼠IRDye^TM800，610-732-124)温育40分钟，所述检测抗体在补充有0.2％Tween 20的Odyssey封闭缓冲液中稀释1∶10000。然后，用1x PBS缓冲液/0.1％Tween 20洗涤膜4次(每次5分钟)并用1x PBS缓冲液洗涤1次，进行5分钟。然后，用Odyssey阅读器扫描该膜，并分析数据。

163表5：5x-DP缓冲液的制备

物质：	原液	在1x裂解缓冲液中的终浓度	对于115x裂解缓冲液的添加量
				Tris/HCl pH7.5	1M	50mM	250ml
甘油	87％	5％	288ml
				MgCl₂	1M	1.5mM	7.5ml
NaCl	5M	150mM	150ml
				Na₃VO₄	100mM	1mM	50ml

164将5x-DP缓冲液通过0.22μm过滤器过滤并以40ml等分试样贮存-80℃下。这些溶液获自以下供应商：1.0M Tris/HCl pH 7.5(Sigma，T-2663)，87％甘油(Merck，产品目录号04091.2500)；1.0M MgCl₂(Sigma，M-1028)；5.0M NaCl(Sigma，S-5150)。

用于洗脱的测试化合物

165如下所述稀释之后，将下文列出的测试化合物用于洗脱实验。典型地，将所有化合物以100mM或50mM的浓度溶于100％DMSO(Fluka，产品目录号41647)。将化合物贮存在-20℃下。用于洗脱实验的测试化合物的稀释：通过用100％DMSO将100mM原液按1∶1稀释来制备50mM原液。为了洗脱实验，进一步用洗脱缓冲液(1x DP-缓冲液/0.2％NP40)稀释该化合物。用于洗脱的化合物：

化合物1：PI3K抑制剂LY29004(Tocris 1130；Vlahos等，1994，J.Biol.Chem.269，5241-5248)。

化合物2：PI3Kγ抑制剂(Calbiochem 528106；AS-605240；Camps等，2005，Nature Medicine 11，936-943)。

化合物3：PI3Kγ抑制剂II(Calbiochem 528108；AS-604850；Camps等，2005，Nature Medicine 11，936-943)。

实施例4：用于鉴定PI3Kγ相互作用化合物的竞争结合测定

166该实施例示范其中将测试化合物直接加入细胞裂解物的竞争结合测定。将测试化合物(以不同的浓度)和具有固定的苯基噻唑配体1的亲和基质加至裂解物等分试样，并允许其结合至包含于裂解物样品中的蛋白质。温育时间之后，将具有捕获的蛋白质的珠从裂解物中分离。然后洗脱结合蛋白，通过在斑点印迹法中使用特异性抗体和Odyssey红外检测系统检测和定量PI3Kγ的存在(图7A)。产生三种化合物的剂量反应曲线(图7B)。

亲和基质的洗涤

167用15ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液将如实施例1中所述的亲和基质(干体积1.1ml)洗涤两次，然后将其重悬于5.5ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液(20％珠浆料)。

测试化合物的制备

168按照与最终所需测试浓度相比100倍更高浓度，在DMSO中制备测试化合物的原液(例如对于4μM的最终测试浓度，制备4mM原液)。该稀释方案导致1％的最终DMSO浓度。对于对照实验(无测试化合物)，使用包含1％DMSO的缓冲液以便所有的测试样品包含1％DMSO。

化合物4(CZC00015387)。

细胞裂解物的稀释

169如实施例2所述制备细胞裂解物。对于典型的实验，使包含50mg蛋白质的1裂解物等分试样在37℃水浴中解冻，然后保持在4℃下。向裂解物加入1体积的1xDP缓冲液以便达到0.4％的最终NP40浓度。然后，加入1/50最终体积的50倍浓缩的蛋白酶抑制剂溶液(1片蛋白酶抑制剂溶于0.5ml包含0.4％NP40的1x DP缓冲液；无EDTA片剂蛋白酶抑制剂混合物来自Roche Diagnostics，产品目录号41647)。通过添加包含0.4％NP40的1x DP缓冲液进一步稀释裂解物以便达到5mg/ml的最终蛋白质浓度。

用测试化合物和亲和基质温育裂解物

170将100μl体积的稀释的裂解物分配到96孔过滤板的各孔中。然后加入1.5μl在DMSO中稀释的测试化合物。对于对照反应，使用1.5μl无测试化合物的DMSO。然后，每孔加入50μl亲和基质(20％浆料)。将板在振荡器上(在Thermomixer，Eppendorf上750rpm)在4℃下温育2小时。

171使用真空歧管仪(Millipore，MAVM 0960R)洗涤板。各孔用400μl包含0.4％NP-40的1x DP缓冲液洗涤4次和用400μl包含0.2％NP-40的1x DP缓冲液洗涤2次。

为了洗脱，将过滤板置于收集板上，向各孔加入40μl具有DTT(50mM终浓度)的2x样品缓冲液(100mM Tris HCl，pH6.8；4％SDS；20％甘油；0.02％溴酚蓝)。将板在振荡器上(在Thermomixer，Eppendorf上750rpm)在室温下温育30分钟。随后，以1100rpm(Heraeus离心机)将板离心2分钟，在收集板的孔中收集洗脱物。

洗脱的PI3Kγ的检测和定量

172使用针对PI3Kγ的一抗(来自Jena Bioscience的抗PI3Kγ，ABD-026S)和荧光标记的二抗(抗-小鼠IRDye^TM 800，来自Rockland，610-732-124)，通过斑点印迹法检测和定量在洗脱物中的PI3Kγ蛋白质。根据制造商提供的说明书运行来自LI-CORBiosciences的Odyssey红外成像系统(Lincoln，Nebraska，USA)(Schutz-Geschwendener等，2004.Quantitative，two-colorWestern blot detection with infrared fluorescence.由LI-CORBiosciences于2004年5月公布，www.licor.com)。

173根据供应商的说明书使用斑点印迹设备(Bio-Dotmicrofiltration apparatus，BioRad 170-65)。硝酸纤维素膜(BioTrace NT Nitrocellulose，PALL BTNT 30R)用20％乙醇进行处理，随后用PBS缓冲液洗涤。每斑点施用30μl洗脱物样品，并在使用真空泵之前静置30分钟。

174为了检测PI3Kγ，首先通过与Odyssey封闭缓冲液(LICOR，927-40000)一起在室温下温育1小时来封闭膜。然后使封闭的膜与一抗(来自Jena Bioscience的抗PI3Kγ，ABD-026S)一起在4℃下温育16小时，所述一抗在包含0.2％Tween-20的Odyssey封闭缓冲液中进行稀释。在用包含0.1％Tween 20的PBS缓冲液洗涤该膜4次(每次5分钟)之后，将膜与检测抗体(来自Rockland的抗-小鼠IRDye^TM800，610-732-124)一起温育40分钟，所述检测抗体在包含0.2％Tween-20的Odyssey封闭缓冲液中进行稀释。其后，将膜每次用1x PBS缓冲液/0.1％Tween 20洗涤4次(每次5分钟)，并用1x PBS缓冲液洗涤1次(5分钟)。将膜保持在4℃下PBS缓冲液中，然后用Odyssey仪扫描，根据制造商的说明书记录和分析信号。

实施例5：通过将化合物加至细胞裂解物或活细胞分析PI3Kδ相互作用化合物的化合物图谱

175该实施例示范其中将测试化合物直接加入细胞裂解物或与活细胞(RAW264.7巨噬细胞)一起温育的结合测定。

176对于细胞裂解物竞争结合测定，将化合物加至裂解物样品，允许其结合至包含于裂解物样品中的蛋白质。然后，加入包含固定的苯基噻唑配体的亲和基质以捕获未结合至测试化合物的蛋白质。温育时间之后，通过离心从裂解物中分离具有捕获的蛋白质的珠。然后洗脱珠-结合蛋白，使用特异性抗体和Odyssey红外检测系统检测和定量PI3Kδ蛋白质的存在。

177对于细胞内图谱分析实验，将活RAW264.7巨噬细胞的等分试样首先与化合物一起在细胞培养基中温育30分钟。此温育时间期间，化合物能够进入细胞并结合至细胞内的蛋白质靶点。然后，收获细胞，制备细胞裂解物，加入亲和基质以捕获未结合至测试化合物的蛋白质。细胞裂解物与亲和基质一起温育90分钟后，通过离心从裂解物中分离具有捕获的蛋白质的珠。然后洗脱结合蛋白，使用特异性抗体和Odyssey红外检测系统检测和定量PI3Kδ的存在。

178对于细胞-通透的参照化合物PI-103，两种方法产生类似的结果(图8)。在裂解物测定中两种其它化合物(化合物5和6)与PI3Kδ相互作用，但在细胞测定中不显著。对于此差异可能的原因是后两种化合物不是充分细胞通透的。

细胞培养

179在存在5％CO₂的加湿的大气中在37℃下，在补充有10％热灭活胎牛血清(Gibco #10270)和1.5g/L碳酸氢钠(Gibco #25080，7.5％溶液)的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM，4mM L-谷氨酰胺，4.5g/L葡萄糖；Gibco #41965)中，培养RAW264.7巨噬细胞(American Type Culture Collection，Rockville，MD)。通过使用细胞刮(cell scraper)在DMEM培养基中从培养皿中刮取细胞，并将其再涂布(replating)在新鲜培养基中来亚培养巨噬细胞。传代数达到3之后，将RAW264.7巨噬细胞用于实验。用磷酸盐缓冲的盐水(D-PBS，Gibco #14040)洗涤细胞一次，在DMEM培养基中将其从培养皿中除下，并在室温下以1,000rpm离心3分钟。将细胞团重悬于DMEM培养基中，确定细胞数。将25x 10⁶个细胞涂布至一个10cm培养皿上，在新鲜DMEM培养基中温育48小时，直到它们达到大约90％汇合(confluence)。

A)活细胞中的化合物图谱分析

用测试化合物处理细胞

180用D-PBS缓冲液洗涤巨噬细胞，并添加新鲜DMEM培养基。用包含0.2％DMSO的DMEM培养基(媒介对照(vehicle control))或具有10μM PI-103(Calbiochem，产品目录号528100；Knight等，2006，Cell 125，733-747)、10μM化合物5或10μM化合物6的DMEM培养基处理细胞30分钟。将测试化合物制备成DMSO中的20mM原液，并进一步稀释以达到在细胞培养基中10μM化合物和0.2％DMSO的终浓度。

细胞裂解物的制备

181除去培养基，用D-PBS缓冲液洗涤细胞一次，添加4ml冰冷的D-PBS缓冲液。通过轻轻地刮取细胞将巨噬细胞除下，并将其重悬于D-PBS缓冲液中。将细胞悬浮液转移入15ml Falcon管并保持在冰上。在Heraeus Multifuge中在4℃下以1500rpm离心巨噬细胞悬浮液3分钟。弃去上清液，用冷D-PBS缓冲液洗涤细胞团。另外的离心步骤之后，在液氮中快速地冷冻细胞团。将细胞在冰上解冻，并通过添加120μl 1x裂解缓冲液(1x DP缓冲液，0.8％NP40)进行裂解。将裂解物转移入1.5ml Eppendo rf管，在4℃下旋转温育30分钟，然后在4℃下以13,200rpm离心10分钟。将上清液转移入超速离心管，在4℃下以53,000rpm(100,000x g)在TLA-120.2转子中离心1小时。通过进行Bradford测定将澄清上清液的等分试样用于蛋白质定量(Biorad蛋白质测定染料浓缩物，产品目录号500-0006)。剩余的样品在液氮中迅速地冷冻并贮存于-80℃下直到用于结合测定。

细胞裂解物的稀释

182如下所述从RAW264.7巨噬细胞制备细胞裂解物。将一份裂解物等分试样在37℃水浴中解冻，然后保持在4℃下。向裂解物加入1体积包含蛋白酶抑制剂的1xDP缓冲液(1片剂的蛋白酶抑制剂溶于25ml 1xDP缓冲液或25ml包含0.8％NP40的1xDP缓冲液；无EDTA片剂蛋白酶抑制剂混合物，来自Roche Diagnostics，产品目录号41647)，以便达到0.8％的最终NP40浓度。通过添加包含0.8％NP40和蛋白酶抑制剂的1xDP缓冲液进一步稀释裂解物，以便达到10mg/ml的最终蛋白质浓度。

亲和基质的洗涤

183将如实施例1中所述的亲和基质(0.25ml干珠体积)用10ml包含0.2％NP40的1x DP缓冲液洗涤两次，并最后重悬于5.0ml包含0.2％NP40的1x DP缓冲液中(5％珠浆料)。

细胞裂解物与亲和基质一起温育

184将50μl体积的稀释的裂解物(10mg/ml蛋白质)分配到96孔过滤板的各孔。然后，每孔添加100μl亲和基质(5％浆料)。将板在振荡器(750rpm，在Thermomixer，Eppendorf上)上在4℃下温育2小时。使用真空歧管仪(Millipore，MAVM 0960R)洗涤板。各孔用220μl包含0.4％NP-40的1x DP缓冲液洗涤两次。对于蛋白质的洗脱，将过滤板置于收集板上，向各孔添加20μl具有DTT(50mM终浓度)的2x样品缓冲液(100mM Tris HCl，pH7.4；4％SDS；20％甘油；0.0002％溴酚蓝)。将板在振荡器(750rpm，在Thermomixer，Eppendorf上)上在室温下温育30分钟。随后，以1100rpm(Heraeus离心机)将板离心4分钟，在收集板的孔中收集洗脱物。

PI3Kδ的检测和定量

185通过在硝酸纤维素膜上点样(spotting)等分试样和用针对PI3Kδ的一抗以及荧光标记的二抗来检测和定量洗脱物中的PI3Kδ蛋白质。将硝酸纤维素膜(BioTrace NT Nitrocellulose，PALLBTNT30R)用20％乙醇预处理，随后用PBS缓冲液洗涤。

186为了检测PI3Kδ，首先通过与Odyssey封闭缓冲液(LICOR，927-40000)一起在室温下温育1小时来封闭膜。然后将封闭的膜与一抗(抗PI3Kδ，兔多克隆抗体，来自Santa Cruz，产品目录号sc-7176)一起在4℃下温育16小时，所述一抗在包含0.2％Tween-20的Odyssey封闭缓冲液中稀释1∶800。将膜用包含0.1％Tween 20的PBS缓冲液洗涤4次(每次7分钟)之后，使膜与检测抗体(山羊抗-兔IRDye^TM 800CW，来自LICOR，产品目录号926-32211)一起温育60分钟，所述检测抗体在包含0.2％Tween-20和0.02％SDS的Odyssey封闭缓冲液中稀释1∶2500。其后，将膜用1x PBS缓冲液/0.1％Tween20洗涤4次(每次5分钟)，并用1x PBS缓冲液洗涤1次(5分钟)。将膜保持在4℃下PBS缓冲液中，然后用Odyssey仪扫描，根据制造商的说明书记录和分析信号。根据制造商提供的说明书运行来自LI-COR Biosciences(Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像系统(Schutz-Geschwendener等，2004.Quantitative，two-colorWestern blot detection with infrared fluorescence.LI-CORBiosciences于2004年5月公布，www.licor.com)。

B)细胞裂解物中的化合物图谱分析(Compound profiling)

细胞裂解物的制备

187除去培养基，用D-PBS缓冲液洗涤细胞1次，添加4ml冰冷的D-PBS缓冲液。通过轻轻地的刮取细胞将巨噬细胞除下，并重悬于D-PBS缓冲液中。将细胞悬浮液转移入15ml Falcon管并保持在冰上。在Heraeus Multifuge中在4℃下1500rpm离心巨噬细胞悬浮液3分钟。除去上清液，用冷D-PBS缓冲液洗涤细胞团。另一离心步骤之后，将细胞团快速地在液氮中冷冻。将细胞在冰上解冻，并通过添加120μl 1x裂解缓冲液(1x DP缓冲液，0.8％NP40)进行裂解。将裂解物转移入1.5ml Eppendorf管，在4℃下旋转温育30分钟，然后在4℃下以13,200rpm离心10分钟。将上清液转移入超速离心管，并在4℃下以53,000rpm(100,000x g)在TLA-120.2转子中离心1小时。通过进行Bradford测定将澄清上清液的等分试样用于蛋白质定量(Biorad蛋白质测定染料浓缩物，产品目录号500-0006)。剩余的样品快速地在液氮中冷冻，并贮存在-80℃下直到用于结合测定。

细胞裂解物的稀释

188如下所述从RAW264.7巨噬细胞制备细胞裂解物。将一份裂解物等分试样在37℃水浴中解冻，然后保持在4℃下。向裂解物加入1体积包含蛋白酶抑制剂的1xDP缓冲液(1片剂的蛋白酶抑制剂溶于25ml 1xDP缓冲液或25ml包含0.8％NP40的1xDP缓冲液；无EDTA片剂蛋白酶抑制剂混合物，来自Roche Diagnostics，产品目录号41647)，以便达到0.8％的最终NP40浓度。通过添加包含0.8％NP40和蛋白酶抑制剂的1xDP缓冲液进一步稀释裂解物，以便达到10mg/ml的最终蛋白质浓度。

亲和基质的洗涤

189将如实施例1中所述的亲和基质(0.25m l干珠体积)用10ml包含0.2％NP40的1x DP缓冲液洗涤两次，并最后重悬于5.0ml包含0.2％NP40的1x DP缓冲液中(5％珠浆料)。

测试化合物的制备

190对于裂解物竞争实验，按照与测定中的终浓度相比50倍更高浓度，在DMSO中制备测试化合物的原液(例如对于10μM的最终测试浓度，制备500μM原液)。该稀释方案导致测定中2％的最终DMSO浓度。对于对照实验(无测试化合物)，使用包含2％DMSO的缓冲液以便所有的测试样品包含2％DMSO。

用测试化合物和亲和基质温育细胞裂解物

191将50μl体积的稀释的裂解物(10mg/ml蛋白质)分配到96孔过滤板的各孔。然后，添加3.0μl在DMSO中稀释的测试化合物。对于对照反应，使用3.0μl无测试化合物的DMSO。然后，每孔添加100μl亲和基质(5％浆料)。将板在振荡器(750rpm，在Thermomixer，Eppendorf上)上在4℃下温育2小时。使用真空歧管仪(Millipore，MAVM 0960R)洗涤板。各孔用220μl包含0.4％NP-40的1x DP缓冲液洗涤两次。对于蛋白质的洗脱，将过滤板置于收集板上，向各孔添加20μl具有DTT(50mM终浓度)的2x样品缓冲液(100mM Tris HCl，pH7.4；4％SDS；20％甘油；0.0002％溴酚蓝)。将板在振荡器(750rpm，在Thermomixer，Eppendorf上)上在室温下温育30分钟。随后，以1100rpm(Heraeus离心机)将板离心4分钟，在收集板的孔中收集洗脱物。

192如上所述进行PI3Kδ的检测和定量。

序列表

<110>Cellzome AG

<120>鉴定PI3K相互作用分子和纯化PI3K的方法

<130>CEL64302PC

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1102

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Met Glu Leu Glu Asn Tyr Lys Gln Pro Val Val Leu Arg Glu Asp Asn

1 5 10 15

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Met Lys Pro Arg Ser Ala Ala Ala Ser Leu

20 25 30

Ser Ser Met Glu Leu Ile Pro Ile Glu Phe Val Leu Pro Thr Ser Gln

35 40 45

Arg Lys Cys Lys Ser Pro Glu Thr Ala Leu Leu His Val Ala Gly His

50 55 60

Gly Asn Val Glu Gln Met Lys Ala Gln Val Trp Leu Arg Ala Leu Glu

65 70 75 80

Thr Ser Val Ala Ala Asp Phe Tyr His Arg Leu Gly Pro His His Phe

85 90 95

Leu Leu Leu Tyr Gln Lys Lys Gly Gln Trp Tyr Glu Ile Tyr Asp Lys

100 105 110

Tyr Gln Val Val Gln Thr Leu Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Lys Ala Thr

115 120 125

His Arg Ser Pro Gly Gln Ile His Leu Val Gln Arg His Pro Pro Ser

130 135 140

Glu Glu Ser Gln Ala Phe Gln Arg Gln Leu Thr Ala Leu Ile Gly Tyr

145 150 155 160

Asp Val Thr Asp Val Ser Asn Val His Asp Asp Glu Leu Glu Phe Thr

165 170 175

Arg Arg Gly Leu Val Thr Pro Arg Met Ala Glu Val Ala Ser Arg Asp

180 185 190

Pro Lys Leu Tyr Ala Met His Pro Trp Val Thr Ser Lys Pro Leu Pro

195 200 205

Glu Tyr Leu Trp Lys Lys Ile Ala Asn Asn Cys Ile Phe Ile Val Ile

210 215 220

His Arg Ser Thr Thr Ser Gln Thr Ile Lys Val Ser Pro Asp Asp Thr

225 230 235 240

Pro Gly Ala Ile Leu Gln Ser Phe Phe Thr Lys Met Ala Lys Lys Lys

245 250 255

Ser Leu Met Asp Ile Pro Glu Ser Gln Ser Glu Gln Asp Phe Val Leu

260 265 270

Arg Val Cys Gly Arg Asp Glu Tyr Leu Val Gly Glu Thr Pro Ile Lys

275 280 285

Asn Phe Gln Trp Val Arg His Cys Leu Lys Asn Gly Glu Glu Ile His

290 295 300

Val Val Leu Asp Thr Pro Pro Asp Pro Ala Leu Asp Glu Val Arg Lys

305 310 315 320

Glu Glu Trp Pro Leu Val Asp Asp Cys Thr Gly Val Thr Gly Tyr His

325 330 335

Glu Gln Leu Thr Ile His Gly Lys Asp His Glu Ser Val Phe Thr Val

340 345 350

Ser Leu Trp Asp Cys Asp Arg Lys Phe Arg Val Lys Ile Arg Gly Ile

355 360 365

Asp Ile Pro Val Leu Pro Arg Asn Thr Asp Leu Thr Val Phe Val Glu

370 375 380

Ala Asn Ile Gln His Gly Gln Gln Val Leu Cys Gln Arg Arg Thr Ser

385 390 395 400

Pro Lys Pro Phe Thr Glu Glu Val Leu Trp Asn Val Trp Leu Glu Phe

405 410 415

Ser Ile Lys Ile Lys Asp Leu Pro Lys Gly Ala Leu Leu Asn Leu Gln

420 425 430

Ile Tyr Cys Gly Lys Ala Pro Ala Leu Ser Ser Lys Ala Ser Ala Glu

435 440 445

Ser Pro Ser Ser Glu Ser Lys Gly Lys Val Gln Leu Leu Tyr Tyr Val

450 455 460

Asn Leu Leu Leu Ile Asp His Arg Phe Leu Leu Arg Arg Gly Glu Tyr

465 470 475 480

Val Leu His Met Trp Gln Ile Ser Gly Lys Gly Glu Asp Gln Gly Ser

485 490 495

Phe Asn Ala Asp Lys Leu Thr Ser Ala Thr Asn Pro Asp Lys Glu Asn

500 505 510

Ser Met Ser Ile Ser Ile Leu Leu Asp Asn Tyr Cys His Pro Ile Ala

515 520 525

Leu Pro Lys His Gln Pro Thr Pro Asp Pro Glu Gly Asp Arg Val Arg

530 535 540

Ala Glu Met Pro Asn Gln Leu Arg Lys Gln Leu Glu Ala Ile Ile Ala

545 550 555 560

Thr Asp Pro Leu Asn Pro Leu Thr Ala Glu Asp Lys Glu Leu Leu Trp

565 570 575

His Phe Arg Tyr Glu Ser Leu Lys His Pro Lys Ala Tyr Pro Lys Leu

580 585 590

Phe Ser Ser Val Lys Trp Gly Gln Gln Glu Ile Val Ala Lys Thr Tyr

595 600 605

Gln Leu Leu Ala Arg Arg Glu Val Trp Asp Gln Ser Ala Leu Asp Val

610 615 620

Gly Leu Thr Met Gln Leu Leu Asp Cys Asn Phe Ser Asp Glu Asn Val

625 630 635 640

Arg Ala Ile Ala Val Gln Lys Leu Glu Ser Leu Glu Asp Asp Asp Val

645 650 655

Leu His Tyr Leu Leu Gln Leu Val Gln Ala Val Lys Phe Glu Pro Tyr

660 665 670

His Asp Ser Ala Leu Ala Arg Phe Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg Asn

675 680 685

Lys Arg Ile Gly His Phe Leu Phe Trp Phe Leu Arg Ser Glu Ile Ala

690 695 700

Gln Ser Arg His Tyr Gln Gln Arg Phe Ala Val Ile Leu Glu Ala Tyr

705 710 715 720

Leu Arg Gly Cys Gly Thr Ala Met Leu His Asp Phe Thr Gln Gln Val

725 730 735

Gln Val Ile Glu Met Leu Gln Lys Val Thr Leu Asp Ile Lys Ser Leu

740 745 750

Ser Ala Glu Lys Tyr Asp Val Ser Ser Gln Val Ile Ser Gln Leu Lys

755 760 765

Gln Lys Leu Glu Asn Leu Gln Asn Ser Gln Leu Pro Glu Ser Phe Arg

770 775 780

Val Pro Tyr Asp Pro Gly Leu Lys Ala Gly Ala Leu Ala Ile Glu Lys

785 790 795 800

Cys Lys Val Met Ala Ser Lys Lys Lys Pro Leu Trp Leu Glu Phe Lys

805 810 815

Cys Ala Asp Pro Thr Ala Leu Ser Asn Glu Thr Ile Gly Ile Ile Phe

820 825 830

Lys His Gly Asp Asp Leu Arg Gln Asp Met Leu Ile Leu Gln Ile Leu

835 840 845

Arg Ile Met Glu Ser Ile Trp Glu Thr Glu Ser Leu Asp Leu Cys Leu

850 855 860

Leu Pro Tyr Gly Cys Ile Ser Thr Gly Asp Lys Ile Gly Met Ile Glu

865 870 875 880

Ile Val Lys Asp Ala Thr Thr Ile Ala Lys Ile Gln Gln Ser Thr Val

885 890 895

Gly Asn Thr Gly Ala Phe Lys Asp Glu Val Leu Asn His Trp Leu Lys

900 905 910

Glu Lys Ser Pro Thr Glu Glu Lys Phe Gln Ala Ala Val Glu Arg Phe

915 920 925

Val Tyr 5er Cys Ala Gly Tyr Cys Val Ala Thr Phe Val Leu Gly Ile

930 935 940

Gly Asp Arg His Asn Asp Asn Ile Met Ile Thr Glu Thr Gly Asn Leu

945 950 955 960

Phe His Ile Asp Phe Gly His Ile Leu Gly Asn Tyr Lys Ser Phe Leu

965 970 975

Gly Ile Asn Lys Glu Arg Val Pro Phe Val Leu Thr Pro Asp Phe Leu

980 985 990

Phe Val Met Gly Thr Ser Gly Lys Lys Thr Ser Pro His Phe Gln Lys

995 1000 1005

Phe Gln Asp Ile Cys Val Lys Ala Tyr Leu Ala Leu Arg His His

1010 1015 1020

Thr Asn Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ser Met Met Leu Met Thr Gly

1025 1030 1035

Met Pro Gln Leu Thr Ser Lys Glu Asp Ile Glu Tyr Ile Arg Asp

1040 1045 1050

Ala Leu Thr Val Gly Lys Asn Glu Glu Asp Ala Lys Lys Tyr Phe

1055 1060 1065

Leu Asp Gln Ile Glu Val Cys Arg Asp Lys Gly Trp Thr Val Gln

1070 1075 1080

Phe Asn Trp Phe Leu His Leu Val Leu Gly Ile Lys Gln Gly Glu

1085 1090 1095

Lys His Ser Ala

1100

<210>2

<211>1044

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Pro Pro Gly Val Asp Cys Pro Met Glu Phe Trp Thr Lys Glu Glu

1 5 10 15

Asn Gln Ser Val Val Val Asp Phe Leu Leu Pro Thr Gly Val Tyr Leu

20 25 30

Asn Phe Pro Val Ser Arg Asn Ala Asn Leu Ser Thr Ile Lys Gln Leu

35 40 45

Leu Trp His Arg Ala Gln Tyr Glu Pro Leu Phe His Met Leu Ser Gly

50 55 60

Pro Glu Ala Tyr Val Phe Thr Cys Ile Asn Gln Thr Ala Glu Gln Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Asp Glu Gln Arg Arg Leu Cys Asp Val Gln Pro Phe Leu

85 90 95

Pro Val Leu Arg Leu Val Ala Arg Glu Gly Asp Arg Val Lys Lys Leu

100 105 110

Ile Asn Ser Gln Ile Ser Leu Leu Ile Gly Lys Gly Leu His Glu Phe

115 120 125

Asp Ser Leu Cys Asp Pro Glu Val Asn Asp Phe Arg Ala Lys Met Cys

130 135 140

Gln Phe Cys Glu Glu Ala Ala Ala Arg Arg Gln Gln Leu Gly Trp Glu

145 150 155 160

Ala Trp Leu Gln Tyr Ser Phe Pro Leu Gln Leu Glu Pro Ser Ala Gln

165 170 175

Thr Trp Gly Pro Gly Thr Leu Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Leu Val

180 185 190

Asn Val Lys Phe Glu Gly Ser Glu Glu Ser Phe Thr Phe Gln Val Ser

195 200 205

Thr Lys Asp Val Pro Leu Ala Leu Met Ala Cys Ala Leu Arg Lys Lys

210 215 220

Ala Thr Val Phe Arg Gln Pro Leu Val Glu Gln Pro Glu Asp Tyr Thr

225 230 235 240

Leu Gln Val Asn Gly Arg His Glu Tyr Leu Tyr Gly Ser Tyr Pro Leu

245 250 255

Cys Gln Phe Gln Tyr Ile Cys Ser Cys Leu His Ser Gly Leu Thr Pro

260 265 270

His Leu Thr Met Val His Ser Ser Ser Ile Leu Ala Met Arg Asp Glu

275 280 285

Gln Ser Asn Pro Ala Pro Gln Val Gln Lys Pro Arg Ala Lys Pro Pro

290 295 300

Pro Ile Pro Ala Lys Lys Pro Ser Ser Val Ser Leu Trp Ser Leu Glu

305 310 315 320

Gln Pro Phe Arg Ile Glu Leu Ile Gln Gly Ser Lys Val Asn Ala Asp

325 330 335

Glu Arg Met Lys Leu Val Val Gln Ala Gly Leu Phe His Gly Asn Glu

340 345 350

Met Leu Cys Lys Thr Val Ser Ser Ser Glu Val Ser Val Cys Ser Glu

355 360 365

Pro Val Trp Lys Gln Arg Leu Glu Phe Asp Ile Asn Ile Cys Asp Leu

370 375 380

Pro Arg Met Ala Arg Leu Cys Phe Ala Leu Tyr Ala Val Ile Glu Lys

385 390 395 400

Ala Lys Lys Ala Arg Ser Thr Lys Lys Lys Ser Lys Lys Ala Asp Cys

405 410 415

Pro Ile Ala Trp Ala Asn Leu Met Leu Phe Asp Tyr Lys Asp Gln Leu

420 425 430

Lys Thr Gly Glu Arg Cys Leu Tyr Met Trp Pro Ser Val Pro Asp Glu

435 440 445

Lys Gly Glu Leu Leu Asn Pro Thr Gly Thr Val Arg Ser Asn Pro Asn

450 455 460

Thr Asp Ser Ala Ala Ala Leu Leu Ile Cys Leu Pro Glu Val Ala Pro

465 470 475 480

His Pro Val Tyr Tyr Pro Ala Leu Glu Lys Ile Leu Glu Leu Gly Arg

485 490 495

His Ser Glu Cys Val His Val Thr Glu Glu Glu Gln Leu Gln Leu Arg

500 505 510

Glu Ile Leu Glu Arg Arg Gly Ser Gly Glu Leu Tyr Glu His Glu Lys

515 520 525

Asp Leu Val Trp Lys Leu Arg His Glu Val Gln Glu His Phe Pro Glu

530 535 540

Ala Leu Ala Arg Leu Leu Leu Val Thr Lys Trp Asn Lys His Glu Asp

545 550 555 560

Val Ala Gln Met Leu Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Pro Glu Leu Pro Val

565 570 575

Leu Ser Ala Leu Glu Leu Leu Asp Phe Ser Phe Pro Asp Cys His Val

580 585 590

Gly Ser Phe Ala Ile Lys Ser Leu Arg Lys Leu Thr Asp Asp Glu Leu

595 600 605

Phe Gln Tyr Leu Leu Gln Leu Val Gln Val Leu Lys Tyr Glu Ser Tyr

610 615 620

Leu Asp Cys Glu Leu Thr Lys Phe Leu Leu Asp Arg Ala Leu Ala Asn

625 630 635 640

Arg Lys Ile Gly His Phe Leu Phe Trp His Leu Arg Ser Glu Met His

645 650 655

Val Pro Ser Val Ala Leu Arg Phe Gly Leu Ile Leu Glu Ala Tyr Cys

660 665 670

Arg Gly Arg Thr His His Met Lys Val Leu Met Lys Gln Gly Glu Ala

675 680 685

Leu Ser Lys Leu Lys Ala Leu Asn Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gln

690 695 700

Lys Thr Pro Lys Pro Gln Thr Lys Glu Leu Met His Leu Cys Met Arg

705 710 715 720

Gln Glu Ala Tyr Leu Glu Ala Leu Ser His Leu Gln Ser Pro Leu Asp

725 730 735

Pro Ser Thr Leu Leu Ala Glu Val Cys Val Glu Gln Cys Thr Phe Met

740 745 750

Asp Ser Lys Met Lys Pro Leu Trp Ile Met Tyr Ser Asn Glu Glu Ala

755 760 765

Gly Ser Gly Gly Ser Val Gly Ile Ile Phe Lys Asn Gly Asp Asp Leu

770 775 780

Arg Gln Asp Met Leu Thr Leu Gln Met Ile Gln Leu Met Asp Val Leu

785 790 795 800

Trp Lys Gln Glu Gly Leu Asp Leu Arg Met Thr Pro Tyr Gly Cys Leu

805 810 815

Pro Thr Gly Asp Arg Thr Gly Leu Ile Glu Val Val Leu Arg Ser Asp

820 825 830

Thr Ile Ala Asn Ile Gln Leu Asn Lys Ser Asn Met Ala Ala Thr Ala

835 840 845

Ala Phe Asn Lys Asp Ala Leu Leu Asn Trp Leu Lys Ser Lys Asn Pro

850 855 860

Gly Glu Ala Leu Asp Arg Ala Ile Glu Glu Phe Thr Leu Ser Cys Ala

865 870 875 880

Gly Tyr Cys Val Ala Thr Tyr Val Leu Gly Ile Gly Asp Arg His Ser

885 890 895

Asp Asn Ile Met Ile Arg Glu Ser Gly Gln Leu Phe His Ile Asp Phe

900 905 910

Gly His Phe Leu Gly Asn Phe Lys Thr Lys Phe Gly Ile Asn Arg Glu

915 920 925

Arg Val Pro Phe Ile Leu Thr Tyr Asp Phe Val His Val Ile Gln Gln

930 935 940

Gly Lys Thr Asn Asn Ser Glu Lys Phe Glu Arg Phe Arg Gly Tyr Cys

945 950 955 960

Glu Arg Ala Tyr Thr Ile Leu Arg Arg His Gly Leu Leu Phe Leu His

965 970 975

Leu Phe Ala Leu Met Arg Ala Ala Gly Leu Pro Glu Leu Ser Cys Ser

980 985 990

Lys Asp Ile Gln Tyr Leu Lys Asp Ser Leu Ala Leu Gly Lys Thr Glu

995 1000 1005

Glu Glu Ala Leu Lys His Phe Arg Val Lys Phe Asn Glu Ala Leu

1010 1015 1020

Arg Glu Ser Trp Lys Thr Lys Val Asn Trp Leu Ala His Asn Val

1025 1030 1035

Ser Lys Asp Asn Arg Gln

1040

Claims

1.用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，

b)在允许形成3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐接触，

c)使3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物与给定的化合物一起温育，和

d)确定所述化合物是否能够从固定的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐中分离PI3K。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d)包括检测分离的PI3K或确定分离的PI3K的量。

3.根据权利要求2所述的方法，其中通过质谱或免疫检测方法，来检测分离的PI3K或确定分离的PI3K的量。

4.根据权利要求2所述的方法，其中用针对PI3K的抗体来检测分离的PI3K或确定分离的PI3K的量。

5.用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，

b)在允许形成3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐和给定的化合物接触，和

c)检测在步骤b)中形成的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物，

其中与未与所述化合物一起温育的等分试样相比，与所述化合物一起温育的等分试样中形成的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的减少的量表明PI3K为所述化合物的靶点。

6.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤c)中所述的检测通过确定3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的量来进行。

7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中用几种蛋白质制剂进行步骤a)至c)以测试不同的化合物。

8.用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂的两份等分试样，

b)在允许形成3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的条件下，使一份等分试样与固定在固体支持物上的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐接触，

c)在允许形成3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的条件下，使另一份等分试样与固定在固体支持物上的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐以及给定的化合物接触，

d)确定在步骤b)和c)中形成的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的量。

9.用于鉴定PI3K相互作用化合物的方法，其包括以下步骤：

a)提供各自包含至少一种含有PI3K的细胞的两份等分试样，

b)使一份等分试样与给定的化合物一起温育，

c)收获各等分试样的细胞，

d)裂解所述细胞以获得蛋白质制剂，

e)在允许形成3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐接触，和

f)确定在步骤e)中在各等分试样中形成的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的量。

10.根据权利要求5所述的方法，其中3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的量通过以下步骤确定：从固定的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐中分离PI3K，随后检测分离的PI3K或随后确定分离的PI3K的量。

11.根据权利要求10所述的方法，其中通过质谱或免疫检测方法检测PI3K或确定PI3K的量。

12.根据权利要求11所述的方法，其中用针对PI3K的抗体检测PI3K或确定PI3K的量。

13.根据权利要求1所述的方法，以中或高通量筛选的方式进行。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的化合物选自合成化合物和天然小分子化合物。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述的化合物为有机合成药物。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物选自琼脂糖、琼脂糖凝胶珠、胶乳、纤维素和亚铁-或铁磁性颗粒。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物为改性的琼脂糖。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述固体支持物是NHS-活化的琼脂糖凝胶。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐共价地偶联到所述固体支持物。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述PI3K为PI3Kγ和/或PI3Kδ。

21.用于纯化PI3K的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含PI3K的蛋白质制剂，

b)在允许形成3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的条件下，使所述蛋白质制剂与固定在固体支持物上的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐接触，和

c)从固定的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐中分离PI3K。

22.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括纯化PI3Kγ和/或PI3Kδ的步骤。

23.根据权利要求22所述的方法，其中使用PI3Kγ特异性抗体和/或PI3Kδ特异性抗体来进行所述纯化。

24.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括在步骤c)之后鉴定能够结合PI3K的蛋白质。

25.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括在步骤c)之后确定PI3K的翻译后修饰。

26.根据权利要求21所述的方法，其中在步骤c)之后通过质谱或免疫检测方法表征PI3K和/或能够结合PI3K的蛋白质。

27.根据权利要求1所述的方法，其中提供蛋白质制剂包括以下步骤：收获至少一种包含PI3K的细胞和裂解所述细胞。

28.根据权利要求1所述的方法，其中形成3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐-PI3K复合物的步骤在基本上生理条件下进行。

29.3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐在鉴定PI3K相互作用化合物中的用途。

30.3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-N-[5-(4-氯-3-甲磺酰基-苯基)-4-甲基-噻唑-2基]-丙酰胺盐酸盐在纯化PI3K中的用途。