KR20060136471A - 절단형 dance, dance 복합체, 및 이들을사용하는 방법 - Google Patents
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Abstract
탄성섬유 조직형성을 조절할 수 있는 작용의 신규한 메카니즘을 실현하는 의약 개발을 가능하게 하는 스크리닝 방법; 및 상기 방법에 필요한 각종 수단. 특히, DANCE 의 절단으로 수득되는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; DANCE 의 절단 방법; DANCE 의 절단으로 수득되는 폴리펩티드에 대한 항체; DANCE 절단량의 측정 방법 및 그의 키트; DANCE 돌연변이 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 각종 DANCE 복합체 및 그의 제조 방법; DANCE 또는 DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법 및 상기 스크리닝 방법으로 수득되는 물질; 탄성섬유 조직형성 조절제; 및 적어도 DANCE 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트가 제공된다.
Description
본 발명은, DANCE의 절단으로 수득되는 폴리펩티드 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; DANCE의 절단 방법; DANCE의 절단으로 수득되는 폴리뉴클레오티드에 대한 항체; DANCE 절단량의 측정 방법 및 키트; DANCE 돌연변이 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 여러 가지의 DANCE 복합체 및 그 제조방법; DANCE의 활성을 조절할 수 있는 물질 또는 DANCE 특이적 프로테아제의 스크리닝 방법, 및 그것에 의하여 수득되는 물질; 탄성섬유 형성 조절제; 및 DANCE 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적어도 포함하는 키트 등에 관한 것이다.
탄성섬유는, 폐·동맥·피부 등의 신축성 조직이 풍부한 조직의 탄성에 원인을 제공하는 세포외 섬유이다. 인간의 노화의 큰 특징은, 조직 탄성의 상실이고, 이것에 의해 폐기종, 동맥의 경화와 사행, 피부의 처짐 등이 생긴다. 이들은 고령화사회에서 중요성이 늘고 있는 과제이며, 그 대부분은 탄성섬유의 열화·단열이 원인이다. 탄성섬유의 중요성에도 불구하고, 탄성섬유의 형성 및 열화의 분자적 메카니즘에 관한 상세한 것은 여전히 불명이다.
탄성섬유의 형성시에는, 마이크로피브릴로 지칭되는 섬유를 따라 엘라스틴이 침착하여, 라이실 옥시다아제 패밀리의 효소〔라이실 옥시다아제: (LOX), 라이실 옥시다아제형 (LOXL) 1-4〕에 의해 엘라스틴이 가교되는 것이 중요하다 (Molnar, J. 등, Bioohim Biophys Acta 1647: 220-4 (2003), Rosenbloom, J. 등, Faseb J.7: 1208-18.(1993)). 그러나 이러한 과정이 어떠한 분자적 메카니즘에 근거하여 생체내에서 행하여지고 있는 것인지에 관해서 알고 있는 것은 적다. 또한, 마이크로피브릴은 핵심적으로 피브릴린 1, 피브릴린 2 및 LTBP2 (잠재성 TGFb-결합 단백질 2) 과 같은 긴 고분자량 단백질을 포함하는 것으로 보고되었지만, 피브릴린 1 또는 피브릴린 2 유전자의 넉아웃 마우스는 탄성섬유에 이상이 없기 때문에; 이들 단백질의 탄성섬유 형성에 대한 기여는 생각하기 어렵고 [Pereira, L. 등, Nat. Genet. 17: 218-22 (1997), Putnam, E. A. 등, Nat. Genet. 11: 456-8 (1995), Chaudhly, S. S. 등, Mol. Genet. 10: 835 내지 43 (2001)], LTBP2 유전자의 넉아웃 마우스는 태생 조기 치사이기 때문에, LTBP2 가 탄성섬유 형성에 기여하는지 여부는 불명이다 [Shipley, J. M. 등, Mol. Cell Biol. 20: 4879-87 (2000)].
본 발명자 등은, Signal Sequence Tap 법을 사용하여 DANCE (development arteries and neural crest epidermal growth factor (EGR) 형); 피불린-5 라고도 한다) 라는 분비 단백질을 클로닝하고 [Nakamura, T. 등, J. Biol. Chem. 274: 22476-83 (1999)], 상기 단백질의 발현이 결핍된 넉아웃 마우스를 제조하여, 전신의 탄성섬유가 결합되지 않음을 발견했다 [Nakamura, T. 등, Nature 415: 171-5 (2002)]. 이것 때문에 DANCE 유전자결손마우스의 표현형은 인간의 노화와 대단 히 유사해, 피부는 탄성이 없게 처지고, 중증의 폐기종을 초래하여, 동맥은 사행하여 경화된다. 즉, DANCE 는 탄성섬유 형성에 필수적인 단백질이다. 또한, 본 발명자들은, DANCE 의 인테그린에 대한 결합이 생체에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 밝힌 바 있다 [Nakamura, T. 등, J. Biol. Chem. 274: 22476-83 (1999)].
최근, 엘라스틴을 가교하는 효소 중 한가지인 LOXL1 의 발현이 결핍된 넉아웃 마우스는 탄성섬유의 형성이상을 초래하는 것이 보고되었다 [Liu, X. 등, Nat. Genet. 36: 178 내지 82 (2004)]. LOXL1 는 DANCE 와 결합하여, DANCE 넉아웃마우스에서 LOXL1 은 탄성섬유 상에 더이상 위치하지 않아, DANCE 는 LOXL1 효소를 지정 위치에 위치시켜 어댑터로서 제공되는 것으로 추측된다. LOXL1 넉아웃 마우스의 표현형은 DANCE 넉아웃 마우스의 표현형보다도 약하고, 약간 늦게 발현하기 때문에, DANCE 의 역할은 LOXL1 을 고정시키는 것 이상인 것으로 생각되지만, DANCE 가 엘라스틴 가교 효소의 위치를 지정한다고 하는 발견은, DANCE가 탄성 섬유 형성에 기여하는 분자적 메카니즘을 이해하는 데에 있어서 중요하다.
그러나, 탄성섬유가 마이크로피브릴을 따라 형성되는 것을 생각하면, DANCE 가 엘라스틴 가교 효소와 결합하는 것만으로는 불충분하고, DANCE 가 마이크로피브릴의 구성 단백질과 결합하는 것이 필요하다고 생각된다. 그러나, DANCE가 마이크로피브릴의 어떤 단백질과 결합하는지 여부는 여전히 분명하지 않다. DANCE의 상세한 기능이 분명하게 되면, 탄성섬유 형성을 조절할 수 있는 새로운 메카니즘을 갖는 의약의 개발이 가능하게 된다고 생각되기 때문에, 그 기능의 해명이 요망된다.
따라서, 본 발명은, DANCE 의 기능의 새로운 해명을 바탕으로, 탄성섬유 형성을 조절할 수 있는 의약의 개발을 가능하게 하는 스크리닝 방법, 탄성섬유 형성의 상태에 관한 진단 방법, 해당 스크리닝 방법 및 진단 방법에 필요한 여러 가지의 수단을 제공하는 것 등을 목적으로 한다.
본 발명자 등은, 상기과제를 해결하도록 예의 연구를 한 결과, DANCE 가 생체 내에서 일부 절단되어 기능변화를 일으킨다는 것을 발견했다. 절단형 DANCE 는, 세포표면 인테그린과의 결합능 및 DANCE 끼리의 결합능을 잃어, 마이크로피브릴의 구성 단백질인 LTBP2 에 대한 더욱 강한 결합능을 획득한다. 따라서, DANCE 의 절단은 탄성섬유 형성의 조절에 중요하다고 생각된다.
또한, 본 발명자들은, DANCE 가 LTBP2 와 결합하는 것, DANCE 끼리가 결합하는 것, DANCE 가 라이실 옥시다아제에 결합하는 것 등을 발견했다. DANCE 의 이들 단백질에 대한 결합은 탄성섬유 형성의 조절에 중요하다고 생각된다.
본 발명자 등은, 이상의 지견에 근거하여 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 하기와 같다:
<1> 서열 식별 번호 6 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열로 이루어진, DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE의 절단으로 수득되는 폴리펩티드.
<2> 서열 식별 번호 6 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
<3> 상기 <1> 의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
<4> 서열 식별 번호 5 로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
<5> 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열로 이루어진, DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE의 절단으로 수득되는 폴리펩티드.
<6> 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
<7> 상기 <5> 의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
<8> 서열 식별 번호 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
<9> DANCE 를 DANCE 특이적 프로테아제에 접촉시키는 것을 특징으로 하는 DANCE 의 절단 방법. .
<10> 상기 <1> 또는 <2> 의 폴리펩티드에 특이적 친화성을 갖는 항체.
<11> 상기 <5> 또는 <6> 의 폴리펩티드에 특이적 친화성을 갖는 모노클로날항체.
<12> 동물유래의 생체시료에 있어서 DANCE 의 절단량을 측정하는 것을 포함하는 방법.
<13> 항 DANCE 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는, DANCE 의 절단량의 측정용 키트.
<14> DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE 의 절단부위에, 해당 프로테아제에 저항성을 나타내는 바와 같이 아미노산 돌연변이가 도입되어 있는 DANCE 돌연변이.
<15> 상기 <14> 의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
<16> 둘 이상의 DANCE를 포함하는 DANCE 복합체.
<17> 상기 <16> 에 있어서, 식별가능한 형태인 두 가지 이상의 DANCE 를 포함하는 복합체.
<18> 상기 <16> 또는 <17> 에 있어서, 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 을 추가로 포함하는 복합체.
<19> 하나 이상의 DANCE, 및 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 을 포함하는 DANCE 복합체.
<20> 둘 이상의 DANCE를 접촉시켜 복합체를 형성시키는 것을 포함하는, 둘 이상의 DANCE 를 포함하는 DANCE 복합체의 제조방법.
<21> 하나 이상의 DANCE 를 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 에 접촉시켜 복합체를 형성시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 DANCE 및 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 을 포함하는 DANCE 복합체의 제조방법.
<22> 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 을 포함하는, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법:
(a) 피검물질을, DANCE 특이적 프로테아제에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 측정하여, 그 활성을 피검물질을 접촉시키지 않은 경우의 DANCE 특이적 프로테아제의 활성과 비교하는 단계;
(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절하는 피검물질을 선택하는 단계.
<23> 상기 <22> 에 있어서, 탄성섬유 형성 조절제를 동정하기 위한 방법.
<24> 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 를 포함하는, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법:
(a) 피검물질을 동물에게 투여하는 단계;
(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 측정하여, 그 활성을 피검물질을 투여하지 않은 경우의 DANCE 특이적 프로테아제의 활성과 비교하는 단계;
(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 특이적 프로테아제의 활성의 조절을 가져오는 피검물질을 선택하는 단계.
<25> 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 를 포함하는, 둘 이상의 DANCE 를 포함하는 DANCE 복합체의 형성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법:
(a) 피검물질의 존재 하, 둘 이상의 DANCE 를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 복합체의 양을 측정하여, 그 양을 피검물질의 부재 하에 수득된 DANCE 복합체의 양과 비교하는 단계;
(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 복합체의 형성을 조절하는 피검물질을 선택하는 단계.
<26> 상기 <25> 에 있어서, 식별가능한 형태인 두 가지 이상의 DANCE 를 사용하는 방법.
<27> 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 를 포함하는, 하나 이상의 DANCE, 및 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 을 포함하는 DANCE 복합체의 형성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법:
(a) 피검물질의 존재 하, 하나 이상의 DANCE 를 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 에 접촉시키는 단계;.
(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 복합체의 양을 측정하여, 그 양을 피검물질의 부재 하에 수득된 DANCE 복합체의 양과 비교하는 단계;
(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 복합체의 형성을 조절하는 피검물질을 선택하는 단계.
<28> 상기 <23> 내지 <27> 중 어느 하나의 방법으로 수득되는 탄성섬유 형성 조절제. .
<29> DANCE의 절단활성을 지표로 하는 DANCE 특이적 프로테아제의 스크리닝 방법.
<30> 상기 <29> 의 방법으로 수득되는 DANCE 특이적 프로테아제.
<31> 상기 <29> 의 방법으로 수득되는 DANCE 특이적 프로테아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
<32> 상기 <30> 의 DANCE 특이적 프로테아제, 또는 상기 <31> 의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 탄성섬유 형성 조절제.
<33> 이하 (a) 및 (b) 을 포함하는 키트:
(a) DANCE, 또는 DANCE 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;
(b) 이하 (i) 내지 (vi) 의 하나 이상의 성분;
(i) (a) 의 DANCE 와 구분가능한 형태의 DANCE;
(ii) (a)의 DANCE 와 구분가능한 형태의 DANCE 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;
(iii) 라이실 옥시다아제;
(iv) 라이실 옥시다아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;
(v) LTBP2;
(vi) LTBP2 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
<34> 이하의 단계 (a) 내지 (b)을 포함하는, DANCE 특이적 프로테아제 발현세포의 동정방법:
(a) 소정의 동물세포와 DANCE 를 접촉시키는 단계;
(b) DANCE 가 절단되는지 여부를 평가하는 단계.
본 발명의 스크리닝 방법은, 탄성섬유 형성을 조절할 수 있는 신규 작용 메카니즘의 의약의 개발, 또는 DANCE 특이적 프로테아제의 동정을 가능하게 하므로 유용하다. 또한, 본 발명의 검정 방법은, 탄성섬유 형성의 상태의 진단을 가능하게 하므로 유용하다. 더욱이, 본 발명의 폴리펩티드, 복합체 및 키트는, 본 발명의 방법을 행하여, 탄성섬유 형성의 조절이 요망되는 상태의 예방, 치료 또는 개선, 또는 연구·진단용 시약 등으로 바람직하게 사용된다.
도면의 간단한 설명
도 1 은, DANCE 결실 돌연변이의 구축물을 나타낸다. 가로줄박스: 시그널 서열; 속이 빈 박스: 칼슘결합성 EGF 형 (cbEGF) 모티브; 속이 찬 박스: RGD 모티브; 종선박스: C 말단도메인; 사선박스: FLAG 태그 .
도 2 는, 293T 세포에서의 인간 및 마우스 DANCE의 강제발현을 나타낸다.
도 3 는, 마우스 피부 섬유아세포의 배양상청액에 있어서의 DANCE의 발현을 나타낸다.
도 4 는, 마우스 폐조직의 웨스턴블랏을 나타낸다.
도 5 는, 전장 DANCE 및 N-말단절단형 DANCE 의 정제를 나타낸다.
도 6 은, 세린 프로테아제 저해제에 의한 DANCE 의 절단저해를 나타낸다.
도 7 은, 시험관 내 배양물에 있어서의 인간 DANCE 의 절단부위, 및 돌연변이화 형태의 DANCE 의 아미노산 돌연변이 부위를 나타낸다.
도 8 은, 돌연변이형 DANCE(R77A) 에서의 DANCE 절단량의 저하를 나타낸다.
도 9 는, 평활근 세포배양물에 있어서의 DANCE 결합단백질을 나타낸다.
도 10 은, DANCE 결실 돌연변이를 이용한 DANCE 끼리의 결합, DANCE 와 LTBP2 의 결합에 필요한 영역의 분석을 나타낸다.
도 11 은, DANCE 와 라이실 옥시다아제의 결합을 나타낸다.
도 12 는, 다양한 연령의 인간의 피부에 있어서의 DANCE 단백질의 발현을 나타낸다. 종양적출시 하기의 각종 조직에서 수득되는 잉여피부 (염증있음): Ba:등; F:안면; N:경부; Bu: 엉덩이; T: 입술 ·
도 13 은, DANCE 의 돌연변이 단백질의 혈관내피세포에 대한 세포결합 검정의 결과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
1. 절단형 DANCE 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은, DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE의 절단으로 수득되는 폴리펩티드, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
"DANCE" 는, 서열 식별 번호 2 로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 식별 번호 4 로 표시되는 아미노산 서열 (서열 식별 번호 2 로 표시되는 아미노산 서열로부터 추정적 시그널 서열을 제외한 아미노산 서열) 로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 그것들의 균등물(예를 들어, SNP, 하플로타입 (haplotype) 을 포함하는 돌연변이, 포유동물 오르톨로그 (orthologue) 등) 를 지칭한다. 구체적으로는, 서열 식별 번호 2 또는 서열 식별 번호 4 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 균등물은, 서열 식별 번호 2 또는 서열 식별 번호 4 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열을 가지며, 또한 DANCE 특이적 프로테아제에 의해 절단되는 폴리펩티드이다. 본 발명자들은 이러한 DANCE가 DANCE 특이적 프로테아제에 의해 절단되는 것을 발견하여, 상기 발견을 근거로 하여 DANCE의 절단으로 수득되는 신규 폴리펩티드를 제공하는 것에 성공하였다.
DANCE의 포유동물 상동성은 특별히 한정되는 것이 아니지만, 예를 들어 소, 양, 돼지, 염소, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 기니피그 및 마우스의 오르톨로그가 바람직하며, 인간, 원숭이, 래트 또는 마우스의 오르톨로그가 보다 바람직하다.
본 명세서에서, "DANCE 특이적 프로테아제" 는, 서열 식별 번호 2 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 DANCE 에서 77 번째의 아미노산과 78번째의 아미노산과의 사이를 절단하는 프로테아제를 말한다. DANCE 특이적 프로테아제는, 세린 프로테아제 저해제인 아프로티닌에 의해 저해되며, 시스테인 프로테아제 저해제인 E64 에 의해서는 저해되지 않는 것을 특징으로 한다. 또한, DANCE 특이적 프로테아제는, 피부 섬유아세포, 293T 세포, 폐조직 등에서의 발현이 확인되어 있다. 추가로, DANCE 특이적 프로테아제는, 77 번째의 아르기닌 잔기를 알라닌 잔기로 치환한 돌연변이화 형태 DANCE 에 대한 절단능의 저하가 확인되어 있다.
따라서, 이러한 DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE 의 절단으로 수득되는 본 발명의 폴리펩티드 중 하나는, 서열 식별 번호 2 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 24 번째로부터 77 번째에 해당하는 아미노산 서열 (즉, 서열 식별 번호 6 로 표시되는 아미노산 서열) 로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 그 균등물이다. 구체적으로는, 서열 식별 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 균등물은, 서열 식별 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
또한, 본 발명에 의해 제공되는 DANCE의 절단에 의해 생성하는 또다른 폴리펩티드는, 서열 식별 번호 2 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 78 번째로부터 448 번째에 해당하는 아미노산 서열 (즉, 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열)로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 그 균등물이다. 구체적으로, 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 균등물은, 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열은, 서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 또는 2 개 이상 (예를 들어 1 내지 30 개, 바람직하게는 1 내지 20 개, 보다 바람직하게는 1 내지 10 개, 가장 바람직하게는 1 내지 5 개) 의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열이다.
또한, 서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열로서, 서열 식별 번호 6 또는 8 로 나타내는 아미노산 서열에 대하여 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 약 95% 이상, 한층 더 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 사용할 수도 있다. 동일성(%)은, 해당 분야에서 관용의 프로그램 (예를 들어, BLAST, FASTA 등)을 초기 설정 (default setting) 으로 사용하고 결정할 수 있다. 또한, 별도의 국면으로서는, 동일성(%)은, 해당 분야에서 공지의 임의의 알고리즘, 예를 들어, Needleman 등 (1970) (J. Mol. Biol. 48: 44 453), Myers 및 Miller (CABIOS, 1988, 4: 11-17) 의 알고리즘 등을 사용하여 결정할 수 있다. Needleman 등의 알고리즘은, GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com 에서 입수가능)의 GAP 프로그램에 적용하고, 동일성(%)은, 예를 들어, BLOSUM62 matrix 또는 PAM250 matrix, 및 gap weight: 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 length weight: 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 을 사용함으로써 결정할 수 있다. 또한, Myers 및 Miller의 알고리즘은, GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램에 포함되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해서 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, 예를 들어, PAM120 웨이트 잔기 테이블, 갭 길이 페널티 12, 갭 페널티 4 를 사용할 수 있다.
또한, 서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는, 각각, 서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 활성 (여기서, "활성" 은 기능과 동의로 한다)를 유지하고 있는 것이 바람직하다. "동질의 활성" 이란 활성이 서로 정성적으로 동일하다는 것을 의미하여; 정량적으로도 동등인 것이 바람직하지만, 허용할 수 있는 범위 (예를 들어, 약 0.5 ∼ 약 2 배) 로 상이할 수 있다.
서열 식별 번호 6 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 동질의 활성으로서는, 예를 들어, 인테그린 결합 활성 및 단일복합체 형성활성 (즉, DANCE 사이의 결합 활성) 을 들 수 있다. 따라서, 서열 식별 번호 6 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는, 바람직하게는, 인테그린 결합부위인 콘센서스 Arg-Gly-Asp (RGD) 모티브(서열 식별 번호 6 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 31번째∼33 번째에 해당하는 아미노산 서열) 및/또는 단일복합체 형성부위를 유지한다. 단일복합체 형성 부위의 정확한 위치는, 결실 분석과 같은 자체공지 방법에 의해 동정할 수 있다.
서열 식별 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 바람직한 예로서는, 서열 식별 번호 10 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 (마우스 오르톨로그), 서열 식별 번호 14 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 (래트 오르톨로그) 를 들 수 있다.
서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 동질의 활성의 예시로서는, 예를 들어, 라이실 옥시다아제 결합 활성, 라이실 옥시다아제 유형 1 결합 활성, LTBP2 결합 활성 등을 들 수 있다. 따라서, 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는, 바람직하게는, 라이실 옥시다아제 결합 부위, 라이실 옥시다아제 유형 1 결합 부위, LTBP2 (잠재성 TGF-β-결합 단백질 2 결합 부위) 의 하나 이상, 바람직하게는 2 가지 이상, 보다 바람직하게는 모두를 유지하는 것이 바람직하다. 예를 들어, LTBP2 결합 부위는, 칼슘결합성 EGF(cbEGF) 모양 모티브〔대표적으로는, (D/N)X(D/N)(E/Q)Xm(D/N)*Xn(Y/F): 여기서, m, n 은 변수이며, 별표는 β 수산화를 나타낸다〕가 DANCE 의 중앙에 일련으로 존재하는 도메인에 존재한다고 생각되지만 (예를 들어, 실시예 6 참조), 라이실 옥시다아제 결합부위, 라이실 옥시다아제 유형 1 결합 부위 및 LTBP2 결합 부위의 보다 정확한 위치는 결실 분석 등의 자체 공지방법에 의해 동정할 수 있다.
서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 바람직한 예로서는, 서열 식별 번호 12 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 (마우스 오르톨로그), 서열 식별 번호 16 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 (래트 오르톨로그) 를 들 수 있다.
본 발명은 또, 서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 균등물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, DNA 또는 RNA 모두 가능하다.
서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 바람직한 예로서는, 서열 식별 번호 5 또는 서열 식별 번호 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
별도의 국면에서, 서열 식별 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 균등물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 식별 번호 5 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열에 대해서는 매우 엄격한 (high stringent) 조건 하에서 하이브리다이즈하지만, 서열 식별 번호 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열에 대해서는 매우 엄격한 조건 (바람직하게는, 중간정도 (moderate)의 엄격한 조건) 하에서 하이브리다이즈하지 않는 폴리뉴클레오티드이다.
또한, 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 균등물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 식별 번호 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하지만, 서열 식별 번호 5 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열에 대하여 매우 엄격한 조건 (바람직하게는, 중간 정도의 엄격한 조건) 하에서 하이브리다이즈하지 않는 폴리뉴클레오티드이다.
상기 하이브리다이제이션의 조건은, 선행 기술의 조건을 참고하여 확립될 수 있다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wi1ey & Sons, 6.3.1 내지 6.3.6, 1999). 예를 들어, 매우 엄격한 조건 하에서의 하이브리다이제이션의 조건으로서는, 6 × SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)/45℃ 에 이어, 0.2 × SSC/0.1% SDS/50 ∼ 65℃ 에서의 1 회 이상의 세정을 들 수 있다. 또한, 중간 정도의 엄격한 조건 하에서의 하이브리다이제이션의 조건으로서는, 예를 들어, 2× SSC/30℃ 에 이은, 1× SSC/0.1% SDS/30 ∼ 50℃ 에서의 1 회 이상 세정을 들 수 있다.
서열 식별 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 균등물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 바람직한 예로서는, 서열 식별 번호 9로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 (마우스 오르톨로그), 서열 식별 번호 13 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드(래트 오르톨로그) 를 들 수 있다.
서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 균등물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 바람직한 예로서는, 서열 식별 번호 11 로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 (마우스 오르톨로그), 서열 식별 번호 15 로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 (래트 오르톨로그) 를 들 수 있다.
2. 절단형 DANCE 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법
2.1
비절단
방법
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 자체공지 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 발현 부위 (예를 들어, 심장, 난소, 결장 등) 로부터 총 RNA 를 추출하여, mRNA 에서 cDNA 를 제조한 후, 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 을 함으로써 클로닝할 수 있다. 또한, 서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 균등물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 상기한 바와 같이 클로닝한 폴리뉴클레오티드에 돌연변이를 유발하여 제작할 수 있다. 돌연변이도입법으로서는, 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 도입법 (gapped duplex), 무작위로 점 돌연변이를 유발하는 방법 (예를 들어, 아질산 또는 아황산에서의 처리), 카세트 돌연변이법, 링커 스캐닝법, 미스매치 프라이머법 등의 방법을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 자체공지 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 상기한 바와 같이 제작한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현벡터에 넣고, 수득한 재조합 벡터를 적절한 숙주세포에 도입하고 형질전환체를 수득한 후, 형질전환체를 배양하여, 본 발명의 폴리펩티드를 생성시키고, 이어서 회수한다. 본 발명은 또한 이러한 재조합 벡터 및 해당 벡터가 도입된 형질전환체도 제공한다.
발현벡터로서는, 원핵세포 및/또는 진핵세포 등의 각종의 숙주세포 속에서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현하며, 이들 폴리펩티드를 생성할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 플라스미드벡터, 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있다.
숙주세포로서 세균, 특히 대장균을 사용하는 경우, 일반적으로 발현벡터는 적어도 프로모터-오퍼레이터 영역, 개시코돈, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 정지코돈, 종결자 영역 및 복제가능단위로 이루어진다.
숙주로서 효모, 동물세포 또는 곤충세포를 사용하는 경우, 발현벡터는 적어도 프로모터, 개시코돈, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 정지코돈을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 상기 벡터는 인핸서 서열, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비번역영역, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐화 부위, 선택마커영역 또는 복제가능단위 등을 포함할 수 있다. 또, 목적에 따라서는 통상 사용되는 유전자증폭유전자 (마커) 를 포함하고 있어도 된다.
세균에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 프로모터-오퍼레이터 영역은, 프로모터, 오퍼레이터 및 Shine-Dalgarno (SD) 서열 (예를 들어, AAGG 등) 을 포함하는 것이다. 예를 들어 숙주가 에셰리키아 (Escherichia) 속의 균인 경우, 상기 프로모터-오퍼레이터 영역으로서 바람직하게는 Trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, tac 프로모터 등을 포함하는 것이 예시된다. 효모에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용하는 프로모터로서는, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터를 들 수 있으며, 숙주가 바실러스 (Bacillus) 속의 균인 경우는, SLO1 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등을 들수 있다. 또한, 숙주가 포유동물 세포 등의 진핵세포인 경우, SV40 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 열충격 (heat shock) 프로모터 등을 들 수 있다.
종결자 영역, 복제가능단위, 인핸서 서열, 폴리아데닐화 부위 및 스플라이싱 접합부위에 관해서는, 자체공지의 것을 사용할 수 있다.
선택마커로서는, 자체공지의 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 테트라싸이클린, 앰피실린 및 카나마이신 등의 항생물질 내성유전자 등이 예시된다.
유전자증폭 유전자로서는, 디히드로엽산 리덕타아제 (DHFR) 유전자, 티미딘 키나아제 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 글루탐산 합성효소 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자, 오르니틴 디카르복실라아제 유전자, 히그로마이신-B-포스포트란스퍼라제 유전자, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라아제 유전자 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는, 적어도, 상기 기재된 프로모터, 개시코돈, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 정지코돈 및 종결자 영역을 연속적이고 또한 고리형으로 적당한 복제가능 단위체에 연결함으로써 제조할 수 있다. 상기 조작에서, 필요하다면 제한효소에 의한 절단 또는 T4 DNA 리가아제를 사용하는 라이게이션 등의 통상적인 방법에 의해 적당한 DNA 절편(예를 들어, 링커, 다른 제한효소 절단 부위 등) 을 사용할 수 있다.
본 발명의 형질전환체는, 상기 기재된 재조합 벡터를 숙주세포에 도입함으로써 제조할 수 있다. ,
형질전환체의 제조에 사용되는 숙주세포로서는, 상기 언급한 발현벡터에 적합하여, 형질전환될 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고; 본 발명의 기술분야에서 통상 사용되는 자연세포 또는 인공적으로 확립된 재조합세포 등 여러 가지의 세포 (예를 들어, 박테리아 (에셰리키아 속 박테리아, 바실러스 속 박테리아), 효모 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 속, 피키아 (Pichia) 속 등), 동물세포 또는 곤충세포 (바람직하게는, Sf9) 등이 예시된다.
발현벡터의 숙주세포로의 도입은 자체공지방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 동물세포의 경우는, Graham 방법 (Virology, Vol.52, p.456, 1973), 곤충세포의 경우는, Summers 등의 방법 (Mol. Cell. Biol. Vol.3, p.2156 내지 2165, 1983) 에 의해서 각각 형질전환할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 상기와 같이 제조되는 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 영양배지를 이용해 배양함으로써 제조할 수 있다.
영양배지는, 형질전환체의 생육에 필요한 탄소원, 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예를 들어 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등이 언급될 수 있고; 무기질소원 또는 유기질소원으로서는, 예를 들어 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘 스팁 액체 (corn steep liquor), 펩톤, 카세인, 육류 엑기스, 대두 케이크, 감자 추출액 등이 언급될 수 있다. 또한, 필요하다면 다른 영양소 [예를 들어, 무기염 (예를 들어, 염화칼슘, 인산2수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류, 항생 물질 (예를 들어, 테트라싸이클린, 네오마이신, 앰피실린, 카나마이신 등] 을 함유하고 있어도 된다.
형질전환체의 배양은 자체 공지 방법에 의해 행하여진다. 배양조건, 예를 들어 온도, 배지의 pH 및 배양시간은, 본 발명의 폴리펩티드가 대량 생산되도록 적절히 선택된다.
또, 하기에 숙주세포에 따라 사용되는 구체적인 배지 및 배양조건을 예시하지만, 이들에 한정되는 것이 아니다.
숙주가 동물세포인 경우, 배지로서 예를 들어 약 5 ∼ 20% 의 우태아혈청을 포함하는 MEM 배지 (Science, Vol.122, p.501, 1952), DMEM 배지 (Virology, Vol.8, p.396, 1959), RPMI1640 배지 (J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967), 199 배지 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 73, p.1, 1950) 등을 사용할 수 있다. 배지의 pH 는 약 6 ∼ 8 인 것이 바람직하며, 배양은 통상 약 30 ∼ 40℃ 에서 약 15 ∼ 72 시간 행하여져, 필요에 의해 통기나 교반할 수 있다.
숙주가 곤충세포인 경우, 예를 들어 우태아혈청을 포함하는 Grace's 배지 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985) 등을 들 수 있고, 그 pH 는 약 5 내지 8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 내지 40℃ 에서 15 내지 100 시간 동안 행하여져, 필요에 의해 통기나 교반을 할 수 있다.
숙주가 세균, 방선균, 효모, 실상균인 경우, 예를 들어 상기 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 바람직하게는, pH 가 5 내지 8 인 배지이다.
숙주가 에셰리키아 콜라이 (E. coli) 인 경우, 바람직한 배지로서 LB배지, M9 배지 (Miller 등, Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972) 등이 예시된다. 이러한 경우, 배양은, 필요에 따라 통기, 교반하면서, 통상 14 내지 43℃ 에서, 약 3 내지 24 시간 수행할 수 있다.
숙주가 바실러스 (Bacillus) 속의 균인 경우, 필요에 의해 통기, 교반을 하면서, 통상 30 내지 40℃ 에서, 약 16 내지 96 시간 수행할 수 있다.
숙주가 효모인 경우, 배지로서, 예를 들어 Burkholder 최소배지 (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980) 를 들 수 있고, pH 는 5 내지 8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 내지 35℃ 에서 약 14 내지 144 시간 동안 행하여져, 필요에 의해 통기나 교반을 할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 전술한 바와 같은 형질전환체를 배양하여, 상기 형질전환체로부터 회수, 바람직하게는 단리 및 정제할 수 있다.
단리 및 정제방법으로서는, 예를 들어, 염석, 용매침전법 등의 용해도를 이용하는 방법; 투석, 울트라여과, 겔여과, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 등과 같은 분자량의 차를 이용하는 방법; 이온교환크로마토그래피 및 히드록실아파타이트 크로마토그래피와 같은 하전 차이를 이용하는 방법; 친화성-크로마토그래피와 같은 특이적 친화성을 이용하는 방법; 역상 고속액체 크로마토그래피와 같은 소수성의 차를 이용하는 방법; 등전점 전기영동과 같은 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
또한, 태그 (예를 들어, 히스티딘 태그, Flag 태그) 를 부가한 폴리펩티드를 형질전환체에 생성시켜, 태그에 대해 해당 친화성을 갖는 물질 (예를 들어, Ni2 + 레진, 태그 특이적인 항체) 를 사용함으로써, 보다 간편히, 본 발명의 폴리펩티드를 단리, 정제할 수도 있다.
더욱이, 본 발명의 폴리펩티드는 무세포계에서 합성가능하다. 무세포계에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 합성으로서는, 예를 들어, 에셰리키아 콜라이, 토끼 망상적혈구, 소맥배아로부터의 추출액 등을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 고상합성법 또는 액상합성법 등의 자체공지의 유기화학적 방법에 의해서 제작할 수 있다.
2.2. 절단 방법
또한, 본 발명의 폴리펩티드는, DANCE 를 DANCE 특이적 프로테아제에 접촉시켜, DANCE 를 절단함으로써 수득할 수 있다. 본 발명은 추가로 이러한 절단 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서 DANCE 의 DANCE 특이적 프로테아제에 대한 접촉은, 서열 식별 번호 2 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 77 번째의 아미노산과 78 번째의 아미노산과의 사이가 절단되는 한 임의의 양식이라도 좋지만; 이러한 절단을 달성하는 접촉의 양태로서는, 예를 들어, DANCE 및 DANCE 특이적 프로테아제 두가지 모두를 발현하는 세포의 배양을 들 수 있다. 이러한 세포의 배양은, 상술한 형질전환체의 배양에 준하여 수행할 수 있다.
DANCE 및 DANCE 특이적 프로테아제의 양쪽을 발현하는 세포는, 이 2개의 단백질을 발현하는 한 특별히 한정되지 않는다. 이러한 세포는, 예를 들어, DANCE 발현세포 (예를 들어, DANCE 를 자연적으로 발현하는 세포, 또는 유전자조작에 의해 DANCE의 발현이 가능해진 세포) 에 대한 DANCE 특이적 프로테아제 발현벡터의 도입, DANCE 특이적 프로테아제 발현세포에 대한 DANCE 발현벡터의 도입, 임의의 선택된 세포에 대한 DANCE 발현벡터 및 DANCE 특이적 프로테아제발현벡터의 도입 등에 의해 제작할 수 있다.
또한, 발현을 증강시킬 목적으로, DANCE 및/또는 DANCE 특이적 프로테아제의 발현세포에, 각각, DANCE 및/또는 DANCE 특이적 프로테아제의 발현벡터를 도입해도 된다.
DANCE 발현세포는, 초대배양세포 (primary culture cell) 또는 임의의 세포주가 이용가능하다. DANCE 의 주요 발현부위로서는, 이에 한정되는 것이 아니지만, 예를 들어, 심장, 신장, 비장, 정소, 난소, 소장, 결장, 동맥, 폐, 자궁, 피부가 DANCE 발현 부위로 공지되어 있으므로, 이들 발현부위에 해당하는 조직 유래의 세포 자체, 또는 그것으로부터 유도되는 세포를 DANCE 발현세포로서 사용할 수 있다. 초대배양세포 및 세포주는, 자체공지방법에 의해 제작할 수 있다 [예를 들어, Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, Inc. (2001); Separation and Cultivation of Functional Cells, Maruzen Shotem (1987) 참조].
DANCE 특이적 프로테아제 발현 세포에 대해, 초대배양세포 및 세포주의 임의의 것이 이용가능하다. 예를 들어, 피부 섬유아세포 및 293T 세포와 같은 세포, 및 폐 및 피부와 같은 조직에 있어서 DANCE 특이적 프로테아제의 발현이 확인되어 있기 때문에, 이들의 세포자체, 또는 이들의 조직 유래의 세포, 또는 이들로부터 유도되는 세포를 DANCE 특이적 프로테아제 발현세포로서 사용할 수 있다. 또한, 어떤 세포가 DANCE 의 절단활성을 갖는지 여부를 평가한 결과, DANCE 의 절단활성을 갖는 것이 분명하게 된 세포를 DANCE 특이적 프로테아제 발현세포로서 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 동물세포 (예를 들어, 인간세포 등의 포유동물세포) 를 사용하는 이러한 DANCE 특이적 프로테아제 발현세포의 동정방법을 제공한다.
본 발명의 절단 방법으로 사용되는 세포종으로서는, 상술한 형질전환체의 제작에 사용되는 숙주와 동종의 세포를 사용할 수 있지만, 그 중에서도, 곤충세포, 동물세포 (예를 들어, 포유동물세포) 가 바람직하다.
DANCE 발현벡터는, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 벡터와 같은 방법으로 제작할 수 있다.
DANCE 특이적 프로테아제 발현벡터는, 후술하는 DANCE 특이적 프로테아제의 스크리닝 방법에 기재되는 방법에 의해 제작할 수 있다. 또, DANCE 특이적 프로테아제 발현벡터는, 후술의 발현 스크리닝에 있어서, DANCE 특이적 발현벡터가 농축된 형질전환체로부터 수득되며, DANCE 특이적 프로테아제 이외의 유전자 산물을 발현하는 벡터와의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 절단 방법에 있어서의 접촉의 별도의 양태로서는, DANCE 특이적 프로테아제 함유 획분에 대한 DANCE 의 첨가를 들 수 있다. DANCE 특이적 프로테아제 함유 획분은, DANCE 절단 활성을 갖는 한 특별히 한정되지 않고; 예를 들어, DANCE 특이적 프로테아제 발현세포의 배양상청액, 해당 세포의 추출액, DANCE 특이적 프로테아제를 발현하는 조직의 추출액, 해당 배양상청액이나 추출액으로부터의 조 정제액 등을 들 수 있다. DANCE 특이적 프로테아제가 단리정제된 경우에는, DANCE 함유획분 또는 단리된 DANCE 와 단리된 DANCE 특이적 프로테아제의 혼합에 의해, DANCE 의 절단이 가능해진다.
DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE의 절단은, 항 DANCE 항체를 사용한 면역학적 수법 (예를 들어, 면역침강법, 웨스턴블랏) 등에 의해 확인할 수 있다.
상기 절단 방법은, 본 발명의 폴리펩티드의 제작 뿐만 아니라, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서의 지표로서도 유용하다.
3.
DANCE 의
절단에 의해 생기는 N-
말단측
및 C-
말단측
폴리펩티드에 대한 항체
본 발명은 또, DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE 의 절단에 의해 발생하는 N-말단 측의 폴리펩티드 (즉, 서열 식별 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 그 균등물) 에 대한 항체, C-말단측의 폴리펩티드 (즉, 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 그 균등물) 에 대한 항체를 제공한다.
본 발명의 항체의 제작에 사용되는 항원으로서는, 서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 균등물, 또는 그것들의 부분펩티드를 사용할 수 있다. 부분펩티드로서는, 항원성을 갖는 한 특히 한정되지 않지만, 예를 들어, 서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 식별 번호 6 또는 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열에서 선택되는 적어도 6 개 이상, 바람직하게는 8 개 이상, 보다 바람직하게는 10 개 이상, 더욱더 바람직하게는 15 개 이상의 연속한 아미노산으로 이루어지는 펩티드이다.
본 발명의 항체는, 폴리클로날항체, 모노클로날항체 중 임의의 것이며, 널리 공지된 면역학적 수법에 의해 제작할 수 있다. 이 항체는, 완전한 항체 분자 뿐만 아니라, 본 발명의 단백질에 대한 항원결합부위 (CDR) 를 갖는 한 임의의 절편도 되고, 예를 들어, Fab, F(ab')2, ScFv, 미니바디 등을 들 수 있다.
예를 들어, 폴리클로날항체는, 상기 항원을, 시판의 아주반트 (예를 들어, 완전 또는 불완전 프로인트 아쥬반트) 과 동시에, 필요에 따라, 소혈청알부민, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) 과 같은 캐리어 단백질에 제공하고, 동물의 피하 또는 복강 내에 2 내지 3 주간에 걸쳐 2 내지 4 회 정도 투여하여 (별도 채혈한 혈청의 항체가를 공지의 항원항체반응으로 측정하여, 그의 상승을 확인한다), 최종면역으로부터 약 3 ∼ 약 10 일 후에 전혈을 채취하고 항혈청을 정제함으로써 수득할 수 있다. 항원을 투여하는 동물로서는, 래트, 마우스, 토끼, 염소, 기니피그 및 햄스터인 임의의 포유동물을 들 수 있다.
또한, 모노클로날항체는, 세포융합법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 마우스에게 상기 항원을 시판의 아쥬반트와 함께 2∼4회 피하 또는 복강 내에 투여하여, 최종투여의 3일 후에 비장 또는 림프절을 채취하여, 백혈구를 채취한다. 상기 백혈구와 골수종세포 (예를 들어, NS-1, P3X63Ag8 등) 을 세포융합하여, 상기 항원에 대한 모노클로날 항체를 제공하는 하이브리도마를 수득한다. 세포융합은 PEG 또는 전압펄스법일 수 있다. 원하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마는, 널리 공지된 EIA 또는 RIA 법등을 사용하여 항원과 특이적으로 결합하는 항체를, 배양상청액 중에서 검출함으로써 선별할 수 있다. 모노클로날 항체를 제공하는 하이브리도마의 배양은, 시험관 내, 또는 마우스 또는 래트, 바람직하게는 마우스 복수 중 등의 생체 내에서 수행할 수 있고, 수득한 항체는 각각 하이브리도마의 배양 상청액 또는 동물의 복수로부터 취득할 수 있다.
추가로, 본 발명의 항체는, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간형 항체, 키메라 항체라도 된다. 키메라 항체는, 예를 들어 "실험의학 (임시 증간호), Vol.6, No.10, 1988", 일본 특허공보 평3-73280 호 등을 참고하여 제조할 수 있고; 인간화항체는, 예를 들어 특표평 4-506458호, 일본 공개특허공보 소 62-296890 호 등을 참조하여 제조할 수 있고; 인간항체는, 예를 들어 [Nature Genetics, Vol.15, 146-156, 1997], [Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994], 특표평 4-504365호, 국제출원공개 W0 94/25585호, [Nikkei Science, 6 월호, 제 40 ∼ 제 50 페이지, 1995년], [Nature, Vol. 368, p.856-859, 1994], 특표평 6-500233호 등을 참고해 제조할 수 있다.
본 발명의 항체는, 본 발명의 폴리펩티드 중 한가지를 특이적으로 검출 또는 저해할 수 있기 때문에, 예를 들어, 본 발명의 스크리닝 방법을 수행하기 위한 탄성섬유 형성 조절제 및 DANCE 에 관한 연구 및 진단용 시약으로서 유용하다.
4. DANCE 절단량 및 절단활성의 측정방법 및 이에 대한
키트
본 발명은 DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE 절단량 및/또는 절단활성을 측정하는 것을 포함하는 방법, 그 중에서도 특히, 동물 유래의 생체시료에 있어서, DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE 절단량을 측정하는 것을 포함하는 방법 및 해당 측정을 가능하게 하는 키트를 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 동물 유래의 생체시료가 사용되는 경우, 사용되는 동물은, 온혈동물인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 포유동물일 수 있다. 포유동물은 특히 한정되는 것이 아니지만, 예를 들어 인간, 소, 양, 돼지, 염소, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 기니피그 및 마우스를 들 수 있다.
생체시료는, 상기 동물로부터 채취가능한 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 생체시료로서는, 예를 들어, 피부, 동맥, 폐, 자궁등의 조직으로부터 채취한 것을 들 수 있다.
DANCE 절단량은, 자체공지 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, DANCE 절단량은, 항 DANCE 항체를 사용하는 면역학적 수법 (예를 들어, 웨스턴블랏) 에 의해 측정할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 항체에 한하지 않고, 임의의 항 DANCE 항체(예를 들어, DANCE의 절단부위에 걸치는 부분 펩티드를 항원으로서 사용하여 제작한 항체)를 사용할 수 있다. 이러한 항체는, 상술한 항체의 제작방법에 준하여 제작할 수 있다.
DANCE 절단량의 측정에 항 DANCE 항체를 사용하는 경우, 예를 들어, 표식된 항 DANCE 항체를 사용하거나 또는 항 DANCE 항체와 표식된 2 차 항체의 병용에 의해, DANCE 절단량을 측정할 수 있다.
항 DANCE 항체의 표식으로서는, 알칼리 포스파타아제, 글루코오스 옥시다아제, 퍼옥시다제 및 β-갈락토시다아제 등의 효소, 형광물질 등을 들 수 있다. 상기 표식과 항 DANCE 항체와의 결합은 자체 공지방법, 예를 들어, 글루타르알데히드법, 말레이이미드법 등에 의해 실시할 수 있다.
표식이 효소인 경우, 기질은 선택한 효소에 따라 선택된다. 예를 들어, 효소로서 알칼리 포스파타아제를 선택한 경우에 있어서는 p-니트로페닐포스페이트(PNPP) 등을 들 수 있고; 이 때의 발색제로서 o-페닐렌디아민 (OPD), 테트라메틸벤지딘 (TMB) 등이 사용된다. 여기서, 세정액, 반응정지액 및 기질용매에 관해서도, 선택한 효소에 따라, 종래 공지의 것을 특별히 제한없이 적절히 사용할 수 있다.
또한, DANCE 절단활성은, 예를 들어, DANCE 절단부위를 갖는 폴리펩티드의 일단에는 형광분자를, 나머지 일단에는 켄처를 결합시켜 놓아, 절단이 생겼을 때에만 형광을 발하는 시스템을 구축 및 사용함으로써 측정할 수 있다. 이러한 시스템의 구축은, 자체공지 방법에 의해 수행할 수 있다.
DANCE 절단활성의 측정에 사용되는 형광분자로서는, DANCE 절단활성을 평가할 수 있는 한 특별히 한정되는 것이 아니지만; 예를 들어, FITC, 6-FAM, HEX, TET, EDANS, Alexa (등록상표), Fluor (Invitrogen) 등을 들 수 있다.
DANCE 절단활성의 측정에 사용되는 켄처로서는, DANCE 절단활성을 평가할 수 있는 한 특별히 한정되는 것이 아니지만; 예를 들어, TAMRA, Dabcyl, Eclipse, QSY 켄처 색소 (Invitrogen) 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정 방법은, 예를 들어, 본 발명의 스크리닝 방법을 수행함에 있어서 및 탄성섬유 형성의 상태에 관한 진단, 특히 분자레벨에서의 해석을 가능하게 하기 때문에 유용하다.
또한, 본 발명은, DANCE 절단량 및/또는 절단활성의 측정을 가능하게 하는 키트에 관한 것이다.
DANCE 절단량의 측정을 가능하게 하는 본 발명의 키트는, 상술한 항 DANCE 항체에 추가하여, DANCE, 2 차 항체, 표식효소에 대한 기질, 생체시료의 처리에 필요한 시약 등을 포함할 수 있다. 이 키트는 또한 DANCE 의 절단에 의해 생기는 폴리펩티드(즉, 본 발명의 폴리펩티드) 의 일편 또는 양편을 대조군으로서 포함할 수 있다. 이 키트에는 추가로 DANCE 절단량이 탄성섬유 형성의 지표가 되어 제공될 수 있음을 기재한 설명서를 포함할 수 있다.
DANCE 절단활성의 측정을 가능하게 하는 본 발명의 키트는, DANCE, 형광분자, 켄처 등을 포함할 수 있다. 이 키트는, 상술한 DANCE 돌연변이를 대조군으로서 포함할 수 있다. 상기 키트는 추가로 DANCE 절단활성이 탄성섬유 형성의 지표가 되어 제공될 수 있음을 기재한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 측정용 키트는, DANCE 절단량 및/또는 절단활성을 간편히 측정할 수 있는 수단을 제공하기 때문에 유용하다.
5. DANCE 돌연변이 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
또, 본 발명은, DANCE 특이적 프로테아제를 이용해 DANCE의 절단부위에, 해당 프로테아제에 저항성을 나타내도록 하는 아미노산 돌연변이가 도입되어 있는 DANCE 돌연변이, 또는 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 DANCE 돌연변이는, 서열 식별 번호 2 또는 서열 식별 번호 4 로 나타내는 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호 2 또는 서열 식별 번호 4 로 나타내는 아미노산과 실질적으로 동일한 아미노산 서열에 있어서, 프로테아제 절단 부위 (Arg-Gly: 서열 식별 번호 2 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 77 번째 내지 78 번째의 아미노산, 및 서열 식별 번호 4 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 54 번째 내지 55 번째의 아미노산에 해당) 또는 그 근방의 아미노산(예를 들어, 서열 식별 번호 2 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 70 번째 내지 85 번째, 바람직하게는 72 번째 내지 83 번째, 보다 바람직하게는 74 번째 내지 81 번째, 더욱더 바람직하게는 76 번째 내지 79 번째의 아미노산, 또는 서열 식별 번호 4 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 47 번째 내지 62 번째, 바람직하게는 49 번째 내지 60 번째, 보다 바람직하게는 51 번째 내지 59 번째, 더욱 바람직하게는 53 번째 내지 56 번째의 아미노산)이 돌연변이 (예를 들어, 결실, 부가, 치환) 되어 DANCE-특이적 프로테아제에 대한 내성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 여기서, "실질적으로 동일" 은 상기 기재된 것과 동의이다.
"DANCE 특이적 프로테아제에 저항성을 나타낸다" 는 DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE의 절단능이, 돌연변이 후에 더욱 저하 (예를 들어 75% 이하, 바람직하게는 50% 이하의 저하) 되는 것을 의미하여, 절단능의 저하 정도는 특별히 한정되지 않는다. DANCE 돌연변이가 DANCE 특이적 프로테아제에 대하여 저항성을 나타내는지 여부는, 상술한 절단 방법에 의한 정상 DANCE 및 DANCE 돌연변이의 절단처리 후, 정상 DANCE 및 DANCE 돌연변이의 절단량을 측정 및 비교함으로써 확인할 수 있다.
본 발명의 DANCE 돌연변이로서는, 예를 들어, 서열 식별 번호 2 로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호 2 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열에 있어서, 77 번째의 아르기닌이 알라닌에 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 및 서열 식별 번호 4 로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호 4 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일의 아미노산 서열에 있어서, 54 번째의 아르기닌이 알라닌으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 들 수 있다.
본 발명은 또, 본 발명의 DANCE 돌연변이를 포함하는 재조합 벡터 및 해당 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 DANCE 돌연변이 및 해당 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서의 네거티브 대조군으로서, 탄성섬유 형성 조절제 (예를 들어, 탄성섬유 제조용) 및 연구용 시약으로서 유용하다.
6. DANCE 복합체
6.1. 둘 이상의 DANCE
를
포함하는 DANCE 복합체 (복합체 I)
본 발명은, 둘 이상의 DANCE를 포함하는 DANCE 복합체(복합체 I)를 제공한다.
복합체 I 은, 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 를 추가로 포함하고 있어도 된다. 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 은 하기 방법대로 제조할 수 있다.
본 발명의 복합체 I 은 또한, 인테그린 및/또는 라이실 옥시다아제 유형 1 을 추가로 포함하고 있어도 된다. 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 인테그린으로서는 여러 가지의 인테그린을 들 수 있지만, 그 중에서도 특히 α5β1, αIIbβ3, αvβ, α9β1 이 바람직하다. 이들 인테그린 및 라이실 옥시다아제 유형 1 및 그 발현 부위는 공지이고, 상기 유전자의 클로닝 및 발현세포의 제조는 자체공지 방법을 이용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 복합체 I 은, 식별가능한 형태인 둘 이상의 DANCE 를 포함하는 것이다. 본원에서, "식별가능한 형태" 는, 둘 이상의 DANCE 에 차이가 존재하여 해당 차이가 검출가능한 것을 의미한다. DANCE 의 식별가능한 형태의 조합의 예시로서, 표식 DANCE 와 비표식 DANCE 와의 조합 및 2 가지의 상이한 표식 DANCE 의 조합이 제공된다.
DANCE 의 표식은, 표식 DANCE 를 비표식 DANCE 또는 상이한 표식 DANCE 와 식별가능한 한 특별히 한정되지 않지만; 예를 들어, 에피토프에 의한 표식 및 방사성동위원소 (예를 들어, 35S) 에 의한 표식을 들 수 있다.
DANCE 의 표식에 사용되는 에피토프로서는, 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA), 티오레독신 (Trx), 히스티딘 (His) 태그, FLAG 태그, Myc 태그 등을 들 수 있다.
본 발명의 복합체 I 이, 추가로 라이실 옥시다아제, LTBP2, 인테그린 및 라이실 옥시다아제 유형 1 에서 선택되는 한 가지 이상을 포함하는 경우, 그것들은 표식되어 있더라도 표식되어 있지 않더라도 좋다.
에피토프 표식 DANCE 는 자체 공지방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 에피토프를 코딩하는 뉴클레오티드에 DANCE 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절히 연결하여, DNA 구축물을 제작하여, 이 DNA 구축물을 숙주세포에서 발현시킴으로써 에피토프 표식 DANCE 를 제조할 수 있다. 한편, 방사성동위원소 (예를 들어, 35S) 표식 DANCE 는, DANCE 발현세포를 방사성동위원소 함유 배지를 이용해 배양함으로써 제조할 수 있다.
본 발명은 또, 상기 기재된 복합체 I 의 제조 방법을 제공한다. 복합체 I 의 제조 방법은, 둘 이상의 DANCE 를 접촉시켜, 복합체를 형성시키는 것을 포함한다.
또한, 복합체 I 의 제조시, 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 을 추가로 접촉시켜도 된다. 추가로, 인테그린 및/또는 라이실 옥시다아제 유형 1 을 접촉시킬 수 있다.
복합체 I 의 형성은, DANCE 의 제조에 의해 (즉, DANCE의 제조에 따르는 필연적인 회합), 또는 따로따로 제조한 적어도 2 종 이상의 DANCE (표식 DANCE 비표식 DANCE, 2 가지의 상이한 표식 DANCE) 의 접촉에 의해 달성할 수 있다.
보다 구체적으로는, 복합체 I의 형성은, 단리된 DANCE 에 대한 단리된 DANCE (예를 들어, 식별가능한 형태)의 접촉, 및 DANCE 발현세포에 대한 DANCE 발현벡터의 도입 (시험관 내, 생체 내를 포함한다) 등에 의해 달성할 수 있다.
복합체 I, 특히, 구분가능한 형태인 두 가지 이상의 DANCE를 포함하는 복합체, 및 해당 복합체의 제조방법은, DANCE 복합체의 형성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법에 있어서의 지표로서, 및 탄성섬유 형성 조절제 및 DANCE 에 대한 연구용 시약으로서 유용하다.
6.2. 하나 이상의 DANCE 및 라이실 옥시다아제를 포함하는 DANCE 복합체 (복합체 II)
본 발명은, 하나 이상의 DANCE 및 라이실 옥시다아제를 포함하는 DANCE 복합체 (복합체 II) 를 제공한다.
복합체 II 는, DANCE (예를 들어, 식별가능한 형태의 DANCE) 및/또는 LTBP2 을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 복합체 II 는 또한, 인테그린 및/또는 라이실 옥시다아제 유형 1 를 추가로 포함할 수 있다. 또, LTBP2, 인테그린 및 라이실 옥시다아제 유형 1 은 각각, 전술한 바와 같이 표식되어 있더라도 표식되어 있지 않더라도 좋다.
본 발명은 또, 상기 기재한 복합체 II 의 제조방법을 제공한다. 복합체 II 의 제조방법은, 하나 이상의 DANCE 를 라이실 옥시다아제에 접촉시켜, 복합체를 형성시키는 것을 포함한다.
또한, 복합체 II 의 제조시, DANCE (예를 들어, 식별가능한 형태의 DANCE) 및/또는 LTBP2 을 추가로 접촉시켜도 된다. 더욱이, 인테그린 및/또는 라이실 옥시다아제 유형 II 를 접촉시킬 수 있다.
복합체 II 의 형성은, 예를 들어, 미표식 DANCE 와 미표식 라이실 옥시다아제의 접촉, 미표식 DANCE 와 표식 라이실 옥시다아제의 접촉, 표식 DANCE 와 미표식라이실 옥시다아제의 접촉, 동종의 표식을 각각 갖는 DANCE 와 라이실 옥시다아제의 접촉, 또는 다른 표식을 각각 갖는 DANCE 와 라이실 옥시다아제의 접촉에 의해 달성할 수 있다.
보다 구체적으로는, 복합체 II 의 형성은, 단리된 DANCE 와 단리된 라이실 옥시다아제의 접촉, 및 DANCE 발현세포에 대한 라이실 옥시다아제 발현벡터의 도입, 및 라이실 옥시다아제 발현세포에 대한 DANCE 발현벡터의 도입 (시험관 내, 생체 내를 포함한다) 등에 의해 달성할 수 있다.
라이실 옥시다아제 및 그 발현부위는 공지이다. 따라서, 라이실 옥시다아제 발현벡터 및 라이실 옥시다아제 발현세포 (예를 들어, 초대배양세포, 세포주) 는 자체공지 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 라이실 옥시다아제는 혈관평활근, 피부, 섬유아세포 등의 세포, 및 동맥, 피부, 폐, 자궁 등의 조직에서의 발현이 확인되어 있기 때문에, 이들 세포 및 조직으로부터 라이실 옥시다아제 유전자를 클로닝할 수 있고, 또한, 라이실 옥시다아제 발현세포를 제조할 수 있다.
복합체 II 및 해당 복합체의 제조방법은, DANCE 복합체의 형성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법에 있어서의 지표로서, 탄성섬유 형성 조절제로서 및 DANCE 에 관하는 연구용 시약으로서 유용하다.
6.3. 하나 이상의 DANCE 및
LTBP2
을 가진 DANCE 복합체
본 발명은, 하나 이상의 DANCE 및 LTBP2을 포함하는 DANCE 복합체 (복합체 III) 를 제공한다.
본 발명의 복합체 III 은, DANCE (예를 들어, 식별가능한 형태의 DANCE) 및/또는 라이실 옥시다아제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 복합체 III 는 또, 인테그린 및/또는 라이실 옥시다아제 유형 1 을 추가로 포함할 수 있다. 또, 라이실 옥시다아제, 인테그린, 라이실 옥시다아제 유형 1 은, 각각, 전술한 바와 같이 표식되어 있더라도 또는 표식되어 있지 않더라도 좋다.
본 발명은 또, 상술의 복합체 III 의 제조방법을 제공한다. 복합체 III 의 제조방법은, 하나 이상의 DANCE 를 LTBP2 에 접촉시켜 복합체를 형성시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 복합체 III 의 제조시, DANCE (예를 들어, 식별가능한 형태의 DANCE) 및/또는 라이실 옥시다아제를 추가로 접촉시켜도 된다. 추가로, 인테그린 및/또는 라이실 옥시다아제 유형 1 을 접촉시킬 수 있다.
복합체 III 의 형성은, 예를 들어, 미표식 DANCE 와 미표식 LTBP2 의 접촉, 미표식 DANCE 와 표식 LTBP2 의 접촉, 표식 DANCE 와 미표식 LTBP2 의 접촉, 동종의 표식을 각각 갖는 DANCE 와 LTBP2 의 접촉, 또는 상이한 표식을 각각 갖는 DANCE 와 LTBP2 의 접촉에 의해 달성할 수 있다.
보다 구체적으로는, 복합체 III의 형성은, 단리된 DANCE 와 단리된 LTBP2 의 접촉, DANCE 발현세포에 대한 LTBP2 발현벡터의 도입, 및 LTBP2 발현세포에 대한 DANCE 발현벡터의 도입(시험관 내 및 생체 내를 포함한다) 등에 의해 달성할 수 있다.
LTBP2 및 그 발현부위는 공지이다. 따라서, LTBP2 발현벡터 및 LTBP2 발현세포 (예를 들어, 초대배양세포, 세포주) 는 자체공지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, LTBP2 는 혈관평활근 세포 및 피부 섬유아세포 등의 세포, 및 동맥, 피부, 폐, 자궁 등의 조직에 있어서 발현이 확인되어 있기 때문에, 이들 세포 및 조직으로부터 LTBP2 유전자를 클로닝할 수 있고, 또한, LTBP2 발현세포를 제조할 수 있다.
복합체 III 및 해당 복합체의 제조방법은 DANCE 복합체의 형성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법에 있어서의 지표로서, 탄성섬유 형성 조절제로서 및 DANCE 에 관한 연구용 시약으로서 유용하다.
7. 스크리닝 방법
본 발명은, 여러 가지의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법 (스크리닝 방법 I, II), DANCE 복합체의 형성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법 (스크리닝 방법 III 내지 V), DANCE 특이적 프로테아제의 스크리닝 방법 (스크리닝 방법 VI) 으로 분류된다. 이하, 각각의 스크리닝 방법에 관해서 상술한다.
7.1. DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법 (시험관 내) (스크리닝 방법 I)
스크리닝 방법 I 은, 동물을 사용하지 않고 DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 평가할 수 있는 한 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 를 포함한다:
(a) 피검물질을, DANCE 특이적 프로테아제에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 측정하여, 그 활성을 피검물질을 접촉시키지 않은 경우의 DANCE 특이적 프로테아제의 활성과 비교하는 단계;
(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 특이적 프로테아제의 활성의 조절을 가져오는 피검물질을 선택하는 단계.
또, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 물질은, 이른바 DANCE 특이적 프로테아제의 애고니스트 및 앤타고니스트 뿐만 아니라, 본 발명의 스크리닝 방법 I 의 특성상, DANCE 특이적 프로테아제의 발현량을 변동시켜 수득하는 물질을 포함한다.
단계 (a) 에 있어서, 피검물질은 임의의 공지화합물 및 신규화합물일 수 있고; 예를 들어, 핵산, 당질, 지질, 단백질, 펩티드, 유기 소분자화합물, 조합화학 기술을 사용하여 제작된 화합물 라이브러리, 고상합성 또는 파지 디스플레이법에 의해 제작된 랜덤 펩티드 라이브러리, 또는 미생물, 동식물, 해양생물 등 유래의 천연 성분 등을 들 수 있다.
피검물질의 DANCE 특이적 프로테아제에의 접촉은, "2.2. 절단 방법" 에서 언급한 접촉과 마찬가지다.
단계 (b) 에 있어서, DANCE 특이적 프로테아제의 활성은 DANCE 절단량 및/또는 절단 활성에 따라서 평가할 수 있다. 예를 들어, DANCE 절단량 및 절단활성은, "4. DANCE 절단량 및 절단활성의 측정 방법 및 이에 대한 키트" 에서 언급한 방법에 의해 측정할 수 있다.
DANCE 절단량 및/또는 절단활성의 비교는 피검물질의 존재 하 및 부재하에 DANCE 절단량 및/또는 절단활성에 있어서의 유의차의 유무에 따라서 수행될 수 있다. 또, 피검물질의 부재 하의 DANCE 절단량 및/또는 절단활성은, 피검물질의 존재 하의 DANCE 절단량 및/또는 절단활성의 측정에 대하여, 사전에 측정하거나 또는 동시에 측정할 수 있지만, 실험의 정밀도, 재현성의 관점에서 동시에 측정한 것이 바람직하다.
이어서, 단계 c) 에 있어서, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절하는 피검물질이 선택된다. 이와 같이 선택된 피검물질은, 탄성섬유 형성 조절제 또는 연구용 시약으로서 유용하다. 예를 들어, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 저해하는 물질은 탄성섬유 형성의 유지에 유용할 수 있다.
7.2. DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법 (
생체내
) (스크리닝 방법 II)
스크리닝 방법 II 는, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 평가할 수 있는 한 특히 한정되지 않지만, 예를 들어, 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 을 포함한다:
(a) 피검물질을 동물에게 투여하는 단계;
(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 측정하여, 그 활성을 피검물질을 투여하지 않은 경우의 DANCE 특이적 프로테아제의 활성과 비교하는 단계;
(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 특이적 프로테아제의 활성의 조절을 가져오는 피검물질을 선택하는 단계.
또, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 물질은, 이른바 DANCE 특이적 프로테아제의 애고니스트, 앤타고니스트 뿐만 아니라, 본 발명의 스크리닝 방법 II 의 관점에서, DANCE 특이적 프로테아제의 발현량을 변동시킬 수 있는 물질을 포함한다. .
단계 (a) 에 있어서, 피검물질로서는, 스크리닝 방법 I 과 같은 것을 사용할 수 있다.
피검물질의 동물에의 투여는, 자체공지 방법에 의해 행하여진다. 투여량, 빈도 및 투여 경로를 임의로 설정할 수 있다. 또, 본 발명의 방법이 적용되는 동물은, "4. DANCE 절단량의 측정 방법 및 이에 대한 키트" 에서 언급한 동물과 마찬가지다.
단계 (b) 에 있어서, DANCE 특이적 프로테아제의 활성은, 예를 들어, 대상 동물 유래의 생체시료의 채취 후, 해당 생체시료에 있어서의 DANCE 절단량에 따라서 평가할 수 있다. 생체시료 및 DANCE 절단량의 측정 방법은, "4. DANCE 절단량 및 절단활성의 측정 방법 및 이에 대한 키트" 에서 언급한 것과 같다.
DANCE 절단량의 비교는, 피검물질의 투여시 및 비투여시 모두, DANCE 절단량에 있어서의 유의차의 유무에 따라서 수행될 수 있다. 또, 피검물질의 비투여시 DANCE 절단량은, 피검물질의 투여시 DANCE 절단량의 측정에 대하여, 사전에 측정하거나 또는 동시에 측정할 수 있지만, 실험의 정밀도, 재현성의 관점에서 동시에 측정하는 것이 바람직하다.
이어서, 단계 (c) 에 있어서, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절하는 피검물질이 선택된다. 이와 같이 선택된 피검물질은, 탄성섬유 형성 조절제 또는 연구용 시약으로서 유용하다. 예를 들어, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 저해하는 물질은, 탄성섬유 형성의 유지에 유용할 수 있다.
7.3. 둘 이상의
DANCE 를
가진 DANCE 복합체 (복합체 I) 의 형성의 조절이 가능한 물질의 스크리닝 방법 (스크리닝 방법 III)
스크리닝 방법 III 은, 복합체 I의 형성을 평가할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 을 포함한다:
(a) 피검물질의 존재 하, 둘 이상의 DANCE를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 복합체의 양을 측정하여, 그 양을 피검물질의 부재 하의 DANCE 복합체의 양과 비교하는 단계;
(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 복합체의 형성을 조절하는 피검물질을 선택하는 단계.
단계 (a) 에 있어서, 피검물질로서는, 스크리닝 방법 I 과 같은 것을 사용할 수 있다.
둘 이상의 DANCE 의 접촉은, "6.1. 둘 이상의 DANCE 를 포함하는 DANCE 복합체(복합체 I)" 에서 언급한 접촉과 마찬가지다. 또, 본 발명의 스크리닝 방법 III 에서는, 식별가능한 형태의 DANCE를 사용하는 것이 바람직하다.
단계 (b) 에 있어서, 복합체 I 의 양은, 예를 들어, 면역침강법 (예를 들어, 실시예 6 참조) 과 밀도측정계의 병용, 표면 플라즈몬 공명 등의 상호작용 분석법, ELISA 에 준하는 방법 등에 의해 측정할 수 있다.
복합체 I 의 양의 비교는, 피검물질의 존재 하 및 부재 하에, 복합체 I 의 양에 있어서의 유의차의 유무에 따라서 수행될 수 있다. 또, 피검물질의 부재 하의 복합체 I 의 양은, 피검물질의 존재 하의 복합체 I 의 양의 측정에 대하여, 사전에 측정하거나 또는 동시에 측정할 수 있지만, 실험의 정밀도, 재현성의 관점에서 동시에 측정하는 것이 바람직하다.
이어서, 단계 (c) 에 있어서, 복합체 I 의 형성을 조절하는 피검물질이 선택된다. 이와 같이 선택된 피검물질은, 탄성섬유 형성 조절제 또는 연구용 시약으로서 유용하다. 예를 들어, 복합체 I 의 형성을 촉진하는 물질은 탄성섬유 형성에 유용할 수 있다.
7.4. 하나 이상의 DANCE 및 라이실 옥시다아제를 가진 DANCE 복합체 (복합체 II) 의 형성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법 (스크리닝 방법 IV)
스크리닝 방법 IV는, 복합체 II 의 형성을 평가할 수 있는 한 특히 한정되지 않지만, 예를 들어, 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 을 포함한다:
(a) 피검물질의 존재 하, 하나 이상의 DANCE 를 라이실 옥시다아제에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 복합체의 양을 측정하여, 그 양을 피검물질의 부재 하의 DANCE 복합체의 양과 비교하는 단계;
(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 복합체의 형성을 조절하는 피검물질을 선택하는 단계.
단계 (a) 에 있어서, 피검물질로서는, 스크리닝 방법 I 와 같은 것을 사용할 수 있다.
하나 이상의 DANCE 와 라이실 옥시다아제의 접촉은, "6.2.하나 이상의 DANCE 및 라이실 옥시다아제를 포함하는 DANCE 복합체(복합체 I)" 에서 언급한 접촉과 마찬가지다.
단계 (b) 에 있어서, 복합체 II 의 양은 면역침강법 (예를 들어, 실시예 7 참조) 과 밀도측정계의 병용, 표면플라즈몬 공명 등의 상호작용 분석법, ELISA 에 준하는 방법 등에 의해 측정할 수 있다.
복합체 II 의 양의 비교는, 피검물질의 존재 하 및 부재 하에, 복합체 II 의 양에 있어서의 유의차의 유무에 따라서 수행될 수 있다. 또, 피검물질의 부재 하의 복합체 II 의 양은, 피검물질의 존재 하의 복합체 II 의 양의 측정에 대하여, 사전에 측정하거나 또는 동시에 측정할 수 있지만, 실험의 정밀도, 재현성의 관점에서 동시에 측정하는 것이 바람직하다.
이어서, 단계 (c) 에 있어서, 복합체 II의 형성을 조절하는 피검물질이 선택된다. 이와 같이 선택된 피검물질은, 탄성섬유 형성 조절제 또는 연구용 시약으로서 유용하다.
7.5. 하나 이상의 DANCE 및
LTBP2
을 포함하는 DANCE 복합체 (복합체 III) 의 형성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법 (스크리닝 방법 V)
스크리닝 방법 V는, 복합체 III의 형성을 평가할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 를 포함한다:
(a) 피검물질의 존재 하, 하나 이상의 DANCE 를 LTBP2 에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 복합체의 양을 측정하여, 그 양을 피검물질 부재 하의 DANCE 복합체의 양과 비교하는 단계;
(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 복합체의 형성을 조절하는 피검물질을 선택하는 단계.
단계 (a) 에 있어서, 피검물질로서는, 스크리닝 방법 I와 같은 것을 사용할 수 있다.
하나 이상의 DANCE 와 LTBP2 의 접촉은, "6.3. 하나 이상의 DANCE 및 LTBP2 을 포함하는 DANCE 복합체 (복합체 III)" 에서 언급한 접촉과 마찬가지다.
단계 (b) 에 있어서, 복합체 III 의 양은, 면역침강법 (예를 들어, 실시예 6 참조) 과 밀도측정계의 병용, 표면 플라즈몬 공명 등의 상호작용 분석법, ELISA 에 준하는 방법 등에 의해 측정할 수 있다.
복합체 III 의 양의 비교는, 피검물질의 존재 하 및 부재 하에, 복합체 III의 양에 있어서의 유의차의 유무에 따라서 수행될 수 있다. 또, 피검물질의 부재 하의 복합체 III 의 양은, 피검물질의 존재 하의 복합체 III 양의 측정에 대하여, 사전에 측정하거나 또는 동시에 측정할 수 있지만, 실험의 정밀도, 재현성의 관점에서 동시에 측정하는 것이 바람직하다.
이어서, 단계 (c) 에 있어서, 복합체 III 의 형성을 조절하는 피검물질이 선택된다. 이와 같이 선택된 피검물질은, 탄성섬유 형성 조절제 또는 연구용 시약으로서 유용하다.
7.6. DANCE 특이적 프로테아제의 스크리닝 방법 (스크리닝 방법 VI)
스크리닝 방법 VI 는, DANCE 의 절단활성을 지표로서 이용하여, DANCE 특이적 프로테아제를 스크리닝하는 것을 포함한다.
DANCE 특이적 프로테아제는, 예를 들어, 해당 프로테아제를 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다. DANCE 특이적 프로테아제 발현세포는 "2.2. 절단 방법" 에서 언급한 세포와 마찬가지다.
예를 들어, 스크리닝 방법 VI 로서, 발현클로닝 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, Mo1ecular Cloning (제 2 판); Current protocols in Molecular Biology (제3판), Acad. Press(1993); Antibody Engineering: A Practica1 Approach, IRL Press at Oxford University Press (1996) 참조).
구체적으로는, DANCE 특이적 프로테아제 발현세포로부터 cDNA 를 제조하여, 그 cDNA 를 적당한 발현벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 발현벡터를 제작하여, cDNA 라이브러리를 제작한다. 재조합 발현벡터를, 상기 발현벡터에 적합한 숙주세포에 도입함으로써, DANCE 특이적 프로테아제 발현세포 유래의 유전자 산물을 발현하는 형질전환체를 제작하여, 이들로부터 DANCE 특이적 프로테아제를 생성하는 형질전환체를 선택한다. 이어서, DANCE 특이적 프로테아제를 생성하는 형질전환체에 도입한 cDNA 로 코딩되는 유전자 서열을 결정함으로써, DANCE 특이적 프로테아제를 수득할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법 VI 에서 사용되는 숙주세포로서는, DANCE 의 절단활성을 갖고 있지 않거나, 또는 DANCE 의 절단활성이 매우 낮은 세포라도 사용할 수 있다. 임의의 세포가 DANCE의 절단활성을 갖는지 여부는, 해당 세포에 DANCE 발현벡터를 도입하고, 발현된 DANCE 의 절단의 유무를 확인함으로써 평가할 수 있다.
cDNA의 제조에 사용되는 세포로서는, DANCE 특이적 프로테아제 발현세포, 예를 들어, 섬유아세포, 293T 세포, 동맥평활근 세포 등의 세포, 및 폐조직, 자궁조직 등의 조직유래의 세포가 사용된다.
cDNA 라이브러리의 제조는, 자체공지 방법에 의해 행하여진다. 먼저, DANCE 특이적 프로테아제 발현세포로부터, 산성 티오시아네이트 구아니딘-페놀-클로로포름 (AGPC) 법 등의 방법에 의해 총 RNA를 제조한다. 이어서, 올리고 (dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법 등의 방법에 의해, 또는 시판의 키트(예를 들어, Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia 제)) 를 사용하여, mRNA 를 제조한다. 이어서, 제조한 mRNA 로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다 (예를 들어, Molecular Cloning (제 2 판), Current Protocols in Molecular Biology (제 3 판) 참조). cDNA 라이브러리의 제작에 사용되는 발현벡터로서는, 사용하는 숙주세포에 있어서 삽입물의 발현이 가능한 한 특별히 한정되지 않는다.
그러나, 제작한 cDNA 라이브러리를 그대로 사용해도 되는 경우, 목적으로 하는 유전자를 농축하기 위해서, DANCE 특이적 프로테아제를 발현하지 않는 세포의 mRNA 를 사용하여 차감법 (substraction method) (Proo. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5783 (1988)) 을 실시하여 제작한 cDNA 라이브러리를 사용할 수도 있다.
또한, DANCE 를 발현하지 않고 있는 세포를 숙주세포로서 선택한 경우에는, 상기한 바와 같이 제조된 cDNA 라이브러리에 더하여, DANCE 발현 벡터도 또 숙주세포에 도입된다. 재조합 벡터의 숙주세포에의 도입방법으로서는, 동물세포에 DNA 를 도입하는 방법으로 사용할 수 있는 한 임의의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 전자천공법, 인산칼슘법, 리포펙틴법을 언급할 수 있다.
이상과 같이 하여 수득되는 형질전환체를 배지에 배양함으로써, 도입한 cDNA가 코딩하는 유전자 산물을 발현시킬 수 있다. 형질전환체를 배지로 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상 방법에 따라서 사용할 수 있다. 예를 들어, 배지로서는, 일반적으로 사용되는 RPMI1640 배지, α MEM 배지, DMEM 배지, 199 배지 및 이들 배지에 소태아혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 배양은, 통상 pH 6 내지 8, 30 내지 40℃으로, 5% CO2 존재 하 등의 조건 하에서 1 내지 7 일간 행하여진다. 또한, 배양 중 필요에 따라, 카나마이신 및 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
본 발명의 스크리닝 방법 VI 에서는, 상술한 형질전환체의 배양 후, 배양상청액에 있어서 DANCE 의 절단의 유무 또는 정도를 웨스턴블랏 등의 방법에 의해 확인함으로써, DANCE 특이적 프로테아제를 생성하는 형질전환체를 선택할 수 있다. 필요에 따라, 상술의 단계를 여러 번 되풀이하는 것으로, DANCE 특이적 발현벡터가 농축된 형질전환체를 수득할 수 있다. 선택한 형질전환체에 도입한 cDNA의 단리 및 단리된 cDNA의 유전자서열의 결정은, 자체 공지방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 수득한 DANCE 특이적 프로테아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
스크리닝 방법 VI 는 발현 클로닝 방법 이외의 방법에 의해 수행될 수도 있다. 구체적으로는, DANCE 특이적 프로테아제 발현세포의 추출액 또는 배양상청액을 제조하고, DANCE의 절단활성을 지표로서 이용해 상기 추출액 또는 배양상청액을 분획함으로써, DANCE 특이적 프로테아제를 정제할 수 있다. 정제방법에는, 예를 들어, 용매추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 음이온교환 크로마토그래피법, 양이온교환 크로마토그래피법, 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 친화성-크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법, 또는 이들 방법의 조합이 포함된다.
또한, 인간 등의 게놈분석 프로젝트가 완료된 현재로서는, 데이터 베이스에 등록되어 있는 서열, 발현 부위 등의 정보, 상동성 검색 등의 수단에 근거하여 프로테아제를 클로닝하여, 해당 프로테아제에 관하여 DANCE 절단활성을 하나씩 평가함으로써, DANCE 특이적 프로테아제를 스크리닝할 수도 있다. 또, DANCE 특이적 프로테아제는 세린 프로테아제 저해제인 아프로티닌에 의해 저해된다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법으로서는, 효율성 중시의 관점에서, 세린 프로테아제가 우선적으로 스크리닝된다.
본 발명의 스크리닝 방법 VI 는 DANCE 특이적 프로테아제의 스크리닝을 가능하게 하기 때문에 유용하다. 또한, 해당 스크리닝 방법에 의해 수득되는 DANCE 특이적 프로테아제는, 탄성섬유 형성 조절제로서 (예를 들어, 탄성섬유의 파괴를 위해), DANCE 의 절단시, 및 본 발명의 스크리닝 방법에 유용하다.
8.
키트
또한, 본 발명은, 이하 (a) 및 (b) 를 포함하는 키트를 제공한다:
(a) DANCE, 또는 DANCE를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;
(b) 이하 (i) 내지 (vi) 의 하나 이상의 성분;
(i) (a) 의 DANCE 와 식별가능한 형태의 DANCE;
(ii) (a) 의 DANCE 와 식별가능한 형태의 DANCE 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;
(iii) 라이실 옥시다아제;
(iv) 라이실 옥시다아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;
(v) LTBP2;
(vi) LTBP2 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
또한, 본 발명의 키트는, 탄성섬유 형성을 조절하기 위해, 또는 스크리닝을 하기 위해서 사용해야 하거나 또는 사용될 수 있는 것 등을 기재하는 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 또, 상기 성분에 추가하여, 인테그린, 인테그린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 라이실 옥시다아제 유형 1 및 라이실 옥시다아제 유형 1 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이들은, 자체공지방법에 의해 제작할 수 있다.
본 발명의 키트는 추가로, 상기 성분에 추가하여, DANCE, 라이실 옥시다아제, LTBP2 인테그린 및 라이실 옥시다아제 유형 1 에 대한 항체를 포함할 수 있다. 이들 항체는, 상술한 항체의 제작법에 준해 제작할 수 있다.
본 발명의 키트는, 상기 스크리닝 방법 I 내지 VI, 및 DANCE 에 관련되는 다른 연구 등을 가능하게 하는 간편한 수단을 제공할 수 있어 유용하며; 탄성섬유 형성 조절제로서 (예를 들어, 탄성섬유의 형성 또는 유지) 유용하다.
9. 탄성섬유 형성 조절제
본 발명의 조절제는 본 발명의 폴리펩티드, 항체, DANCE 돌연변이, 복합체 또는 해당 복합체를 구성하는 여러 성분, DANCE 특이적 프로테아제, 또는 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 등을 함유한다.
본 발명의 조절제는, 임의의 담체, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체를 배합함으로써 탄성섬유 형성의 조절이 필요한 상태의 예방, 치료 또는 개선에 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 조절제가, 탄성섬유를 형성 또는 재생시키는 성분을 포함하는 경우, 해당 조절제는, 탄성섬유 형성의 조절이 필요한 상태, 예를 들어, 폐기종, 혈관손상, 피부이완증, 창상, 탄성섬유열화 (예를 들어, 노화 또는 자외선에 의해 야기되는 것), 튼살, 동맥 경화, 대동맥통의 예방, 치료 또는 개선, 또는 미용의 목적에 유용하다.
한편, 본 발명의 조절제가, 탄성섬유의 형성을 억제하는 성분을 포함하는 경우, 해당 조절제는, 탄성섬유 형성의 억제가 소망되는 상태, 예를 들어 심근경색의 예방, 치료 또는 개선에 유용하다.
의약상 허용되는 담체로서는, 예를 들어, 자당, 전분, 만니톨, 솔비톨, 유당, 글루코오스, 셀룰로오스, 탤크, 인산칼슘, 탄산칼슘 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리프로필렌 피롤리돈, 젤라틴, 아라비아 고무, 폴리에틸렌글리콜, 수크로오스, 전분 등의 결합제, 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필 전분, 나트륨-글리콜-전분, 탄산수소나트륨, 인산칼슘, 시트르산칼슘 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 에어로질, 탤크, 라우릴황산나트륨 등의 활제, 시트르산, 멘솔, 글리신 라이신 암모늄염, 글리신, 오렌지 분말 등의 방향제, 벤조산나트륨, 아황산수소나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등의 보존제, 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산 등의 안정제, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 스테아르산알루미늄 등의 현탁제, 계면활성제 등의 분산제, 물, 생리식염수, 오렌지 쥬스 등의 희석제, 카카오지, 폴리에틸렌글리콜, 백등유 등의 베이스 왁스를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것이 아니다.
경구투여에 바람직한 제제는, 물, 생리식염수, 오렌지쥬스 같은 희석액에 유효량의 리간드를 용해시킨 액체, 유효량의 리간드를 고체 또는 과립으로서 포함하고 있는 캡슐제, 환제 (sachet) 또는 정제, 적당한 분산매 중에 유효량의 리간드를 현탁시킨 현탁액제, 적당한 분산매 중에 유효량의 리간드를 분산 및 유화시킨 용액을 포함하는 유제 등이다.
비경구적인 투여 (예를 들어, 피하 주사, 근육내주사, 국소주입, 복강내투여 등) 에 바람직한 제제에는 예를 들어, 항산화제, 완충액, 제균제, 등장화제 등이 포함되어 있을 수 있는 수성 또는 비수성의 등장인 무균의 주사액제가 포함된다. 이는 현탁액, 가용화제, 증점제, 안정제, 보존제 등이 포함된 수성 또는 비수성 무균 현탁액일 수 있다. 해당 제제는, 앰플이나 바이알과 같이 단위 투여량 또는 복수회 투여량씩 용기에 봉입될 수 있다. 또한, 유효성분 및 약제학적으로 허용되는 담체를 동결건조하여, 사용직전에 적당한 무균의 비히클에 용해 또는 현탁시킬 것이 요구되는 상태로 보존할 수도 있다.
본 발명의 제제의 투여량은, 유효성분의 종류·활성, 병의 중증도, 투여대상이 되는 동물종, 투여대상의 약품수용성, 체중, 연령 등에 따라 다르나, 통상, 성인 1 인 당 유효성분량으로서 1 일 약 0.0008 내지 약 2.5 mg/kg 이다.
본 명세서에 제시된 모든 간행물에 기재된 내용은, 본 명세서에서의 인용에 의해, 그 모두가 명시된 것과 같은 정도로 본 명세서에 포함된다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 실시예는 본 발명의 단순한 예시를 나타내는 것에 지나지 않고, 본 발명의 범위를 전혀 한정하는 것이 아니다.
실시예
1. 재료 및 방법
1.1. 발현 플라스미드의 구축
본 발명으로 사용한 발현 플라스미드는 하기와 같이 제작하였다. 또, 이들 구축물은 전부 뉴클레오티드 서열을 확인한 후, 발현실험에 사용하였다.
pEF6
/
ssFLAG
:
하기의 합성 뉴클레오티드:
ggtaccgctagcgaattcaccatgtctgcacttctgatcctagctcttgttggagctgcagttgctgactacaaagacgatgacgacaagactagtcatcatcaccatcaccattctagagaaggatccgatatccgcggccgcatcgattgactagctgaggccgcaaaccc (서열 식별 번호 17)
및 그에 상보적인 가닥을 가진 합성 뉴클레오티드를 pEF6/V5-A 플라스미드 (Invitrogen) 의 KpnI - PmeI 부위에 삽입했다. 이로써 KpnI - NheI - EcoRI - 프리프로 트립신 시그널 펩티드 (MSALLILALVGAAVA (서열 식별 번호 18)) - FLAG 태그 (DYKDDDDK (서열 식별 번호 19)) - SpeI - 6 x His 태그 (HHHHHH (서열 식별 번호 20)) - XbaI - BamHI - EcoRV - NotI - ClaI 이 신장 인자 프로모터 (elongation factor promoter) 의 하류 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열의 상류에 위치한다.
pEF6
/
ssMyc
:
하기의 합성 뉴클레오티드:
gaattcaccatgtctgcacttctgatcctagctcttgttggagctgcagttgctgactacgaagaggacgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgactagt (서열 식별 번호 21)
및 그에 상보적인 가닥을 가진 합성 뉴클레오티드를 pEF6/ssFLAG 플라스미드의 EcoRI - SpeI 부위에 삽입했다. 이로써 KpnI - NheI - EcoRI - 프리프로 트립신 시그널 펩티드 (MSALLILALVGAAVA (서열 식별 번호 18)) - Myc 태그 (EQKLISEEDL (서열 식별 번호 22)) - SpeI - 6 x His 태그 (HHHHHH (서열 식별 번호 20)) - XbaI - BamHI - EcoRV - NotI - ClaI 가 신장 인자 프로모터의 하류 및 소 성장 인자 호르몬 폴리아데닐화 서열의 상류에 위치한다.
pEF6
/FLAG:
하기의 합성 뉴클레오티드:
tggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattctgcagatatccagcacagtggcggccgtctagagactacaaagacgatgacgacaagagagggtctcatcatcaccatcaccattgagcggccgcaaaccc (서열 식별 번호 23)
및 그에 상보적인 가닥을 가진 합성 뉴클레오티드를 pEF6/V5-A 플라스미드 (Invitrogen) 의 KpnI - PmeI 부위에 삽입했다. 이로써 KpnI - BamHI - SpeI - EcoRI - EcoRV - XbaI - FLAG 태그 (DYKDDDDK (서열 식별 번호 19)) - 6 x His 태그 (HHHHHH (서열 식별 번호 20)) - 정지 코돈 - NotI 이 신장 인자 프로모터의 하류 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열의 상류에 위치한다.
pEF6
/
ssFLAG
-
hDANCE
:
서열 식별 번호 2 로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 인간 DANCE 의 25 번째 아미노산으로부터 정지 코돈까지의 부분을 프라이머인 tctagagcacagtgcacgaatggctttg (서열 식별 번호 24) 및 gcggccggtcagaatgggtactgcgacacatatatccg (서열 식별 번호 25) 을 이용한 PCR 방법으로 증폭하고, 제품에 대한 지시사항에 기재된 방법으로 pCR4-Blunt Topo (Invitrogen) 에 클로닝하고; 서열을 확인한 후, XbaI - NotI 를 이용한 절단을 실시하고, 수득한 분절을 pEF6/ssFLAG 의 SpeI - NotI 부위에 삽입했다.
pEF6
/
ssMyc
-
hLTBP2
:
인간 LTBP2 의 36 번째 아미노산으로부터 정지 코돈까지의 부분을 tctagacaaagggaccccgtagggagatacgag (서열 식별 번호 26) 및 gcggccgcctggtactccttggcagtgcagtggg (서열 식별 번호 27) 을 이용하는 PCR 방법으로 증폭하고, 증폭된 분절을 상기 기재된 것과 동일한 방법으로 pEF6/ssMyc 의 SpeI - NotI 부위에 삽입했다.
pEF6
-
hDANCE
-FLAG:
서열 식별 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 인간 DANCE 의 첫번째 아미노산으로부터 최종적인 448 번째 아미노산까지의 부분을 프라이머인 gaattcttcttctcgccttcgcatctcctcc (서열 식별 번호 28) 및 tctagagaatgggtactgcgacacatatatccg (서열 식별 번호 29) 을 이용한 PCR 방법으로 증폭하고; 클로닝하여 상기 기재된 것과 동일한 방법으로 서열분석을 수행한 후, EcoRI - XbaI 을 이용한 절단을 실시하여, 수득한 절편을 pEF6/FLAG (도 1) 의 EcoRI - XbaI 부위에 삽입했다.
pEF6
-
hDANCE
(
R77A
)-FLAG:
인간 DANCE 의 77 번째 아미노산인 아르기닌을, Quick Change 시험관내 돌연변이 유발 키트 (Stratagene) 를 이용하여 알라닌으로 치환했다. 나머지 과정들은 pEF6-hDANCE-FLAG 와 동일하다.
pEF6
-
hDANCE
ΔND-FLAG:
서열 식별 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 인간 DANCE 의 1 번째 아미노산으로부터 26 번째 아미노산까지의 부분 및 78 번째 아미노산으로부터 448 번째 아미노산까지의 부분 각각을 PCR 방법으로 증폭하고, 증폭된 분절을 NheI 부위에 라이게이션시킨 후, 라이게이션된 생성물을 pEF6/FLAG (도 1) 의 EcoRI - XbaI 부위에 삽입했다.
pEF6
-
hDANCE
ΔN-FLAG:
서열 식별 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 인간 DANCE 의 1 번째 아미노산으로부터 26 번째 아미노산까지의 부분 및 113 번째 아미노산으로부터 448 번째 아미노산까지의 부분 각각을 PCR 방법으로 증폭하고, 증폭된 분절을 NheI 부위에 라이게이션시킨 후, 라이게이션된 생성물을 pEF6/FLAG 의 EcoRI - XbaI 부위에 삽입했다 (도 1).
pEF6
-
hDANCE
ΔM-FLAG:
서열 식별 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 인간 DANCE 의 1 번째 아미노산으로부터 112 번째 아미노산까지의 부분 및 315 번째 아미노산으로부터 448 번째 아미노산까지의 부분 각각을 PCR 방법으로 증폭하고, 증폭된 분절을 NheI 부위에 라이게이션시킨 후, 라이게이션된 생성물을 pEF6/FLAG 의 EcoRI - XbaI 부위에 삽입했다 (도 1).
pEF6
-
hDANCE
ΔC-FLAG:
서열 식별 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 인간 DANCE 의 1 번째 아미노산으로부터 315 번째 아미노산까지의 부분을 PCR 방법으로 증폭하고, 수득한 생성물을 pEF6/FLAG 의 EcoRI - XbaI 부위에 삽입했다 (도 1).
인간 라이실 옥시다아제 (GenBank 접근 번호: AF039291.1) cDNA 로 코딩되는 폴리펩티드 (417 개의 아미노산) 의 22 번째 아미노산으로부터 417 번째 아미노산까지를 PCR 법으로 증폭하고, pEF6/ssMyc 의 XbaI/NotI 부위에 포함시켰다 .
1.2. 세포 및
트랜스펙션
293T 세포를 발현 실험에 이용했다. 트랜스펙션은 Lipofect AMINE Plus 시약을 이용하여 제품 설명서에서 지시한 대로 수행했다. 트랜스펙션 24 시간 후, 배지를 무혈청 배지로 교환하고, 배양을 48 시간 동안 지속했으며; 수득한 상청액 또는 세포 분해물을 웨스턴 블랏 및 시험관내 결합 검정에 이용했다.
신생자 마우스 피부 섬유아세포를 수집하고, "Current Protocols in Cell Biology" 에 기재된 방법으로 배양했다.
소 대동맥 평활근은 Cambrex 에서 구입했다.
1.3.
재조합체
DANCE
인간 DANCE 의 안정 발현 세포주는 293T 세포 및 pEF6-hDANCE-FLAG 를 이용하여 제조했으며, 재조합체 DANCE 는 Ni-NTA 아가로스 (Qiagen) 를 이용한 배양 상청액으로부터 정제한 후, 정제된 용액을 탈염 컬럼 (Amersham) 을 이용하여 탈염했다.
1.4. 항체
항-마우스 DANCE 항체 BSYN1923 를 마우스 DANCE 76 - 98 아미노산에 해당하는 합성 펩티드를 이용해 토끼를 면역화하여 제조했으며, 그곳에서 면역화되는 항원 펩티드를 이용하는 컬럼을 사용해 친화성-정제했다. 항-엘라스틴 모노클로날 항체는 Chemicon and Elastin Products Company (EPC) 로부터 구입했으며; 피브릴린 1 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체, 피브릴린 2 폴리클로날 항체, 및 LTBP2 모노클로날 항체는 EPC 로부터 구입했다. 항-FLAG M2 항체 및 항-FLAG M2 아가로스는 Sigma 로부터 구입했고; 항-Myc (9E10) 항체는 Santa Cruz 로부터 구입했다. 폴리클로날 항-엘라스틴 항체 (PR533) 는 Elastin Products Company, INC 로부터 구입했다. 항-토끼 Alexa Fluor 488 항체 및 항-마우스 Alexa Fluor 546 항체는 Molecular Probes 로부터 구입했다.
1.5.
35
S-Met 및
Cys 를
이용한
메타보라벨링
(
metabolabelling
), 면역침전, 시험관내 결합 검정 및
웨스턴
블랏
이들은 "Molecular Cloning, 3rd Ed." 에 기재된 방법으로 실시했다.
1.6. 섬유아세포의 배양
인간 섬유아세포는 교토 대학 부속 병원의 성형외과로부터 공급받았다. 커버 글래스를 24-웰 플레이트의 바닥 위에 놓고, 그 위에 웰 당 7.5 × 104 세포로 인간 섬유아세포를 시딩하고, 5% CO2 의 존재 하에 37℃ 로 10% FBS 가 보충된 DMEM 배지에서 배양했다. 3 일째에 플레이트를 PBS 로 세척한 후, 배지를 FBS 가 보충되지 않은 DMEM/F12 배지로 교환하고 DANCE 단백질을 정제하여, DANCE 단백질 4 ㎍/ml 로 절단하거나, 또는 FBS 를 첨가했다. 5% CO2 의 존재 하에 37℃ 에서 배양을 지속하고, 세포를 고정하여 14 일째에 면역학적으로 염색했다.
1.7. 면역염색
배양 14 일째에, 세포를 1 ml 의 PBS 로 3 회 세척한 후, 이들을 -20℃ 에서 30 분 동안 100% 메탄올로 고정했다. PBS 로 세척한 후, 세포를 실온에서 30 분 동안 2% BSA 를 포함하는 PBS 로 블로킹한 후, 세포를 폴리클로날 항-엘라스틴 항체 (희석 비율 1/100) 및 모노클로날 항-FLAG 항체 (희석 비율 1/100) 과 함께 실온에서 1 시간 이상 인큐베이션했다. 세포를 PBS 로 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 항-토끼 Alexa Fluor 488 항체 (희석 비율 1/100) 및 항-마우스 Alexa Fluor 546 항체 (희석 비율 1/100) 와 인큐베이션했다. PBS 로 세척한 후, 세포를 실온에서 10 분 동안 4% 파라-포름알데히드로 고정하고, PBS 로 다시 세척한 후, 시료를 DAPI-포함 Vectashield 를 이용한 글래스 슬라이드 상에 마운팅시켰다. 다중초점 현미경을 이용해 시험을 수행했다.
실시예
1: 소정의
DANCE 를
시험관내
및
생체내에서
N-말단에서 절단
1.1. 293T 세포에서의 인간 및 마우스
DANCE 의
강제 발현
시그널 펩티드 절단 부위의 인접 하류에 FLAG 태그가 추가된 인간 및 마우스 DANCE cDNA 를 293T 세포에 트랜스펙션하고; 배지를 무혈청 배지로 교환한 후, 48 시간 동안 배양을 지속하고, 15 ㎕ 의 배양 상청액을 SDS-PAGE 로 전개시키고, 웨스턴 블랏을 수행했다. 사용한 항체는 마우스 DANCE 의 76 내지 98 번째 아미노산에 상응하는 펩티드로 토끼를 면역화시켜 수득한 BSYN 및 항-FLAG M2 항체였다.
그 결과, 도 2 에 나타낸 바와 같이, BSYN 는 인간 DANCE 를 인식하지 않았고, 마우스 DANCE 는 2 개의 밴드로 검출되었다. 대조적으로, 항-FLAG M2 항체는 인간 및 마우스 DANCE 를 시그널 밴드로서 검출했다.
1.2. 마우스-유래 피부 섬유아세포에서의
DANCE 의
발현
신생자 DANCE 넉아웃 마우스 [참고문헌은 Nature 415: 171-175 (2002)] 및 같은 배의 대조군 마우스의 피부 유래의 섬유아세포를 35S-Met 및 Cys 로 24 시간 동안 배양 및 표지한 후, 배양 상청액을 BSYN 항체로 면역침전시켰다. 면역침전물을 SDS-PAGE 로 전개하고 방사선사진촬영 (autoradiography) 으로 검출했다.
그 결과, DANCE+/+ 마우스 유래의 피부 섬유아세포에서 2 개의 밴드가 검출되었고, DANCE-/-마우스 유래의 피부 섬유아세포에서는 밴드가 검출되지 않았다 (도 3).
1.3. 마우스 폐 조직의
웨스턴
블랏
12-주령 DANCE 넉아웃 마우스 및 같은 배의 대조군 마우스 유래의 폐 조직 추출물을 SDS-PAGE 에 전개시키고 BSYN 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행했다.
그 결과, DANCE+/+ 마우스의 폐조직에서는 DANCE 가 2 개의 밴드로서 검출되었고, DANCE-/- 마우스의 폐조직에서는 밴드가 검출되지 않았다 (도 4).
실시예
2:
DANCE 의
절단된 형태의 N-말단은
DANCE 의
78 번째 및 이어지는 아미노산과 일치한다
FLAG 태그 및 6 x His 태그가 그의 카르복실 말단에 추가된 인간 DANCE cDNA 를 293T 세포에 트랜스펙션하여 안정한 발현을 나타내는 세포주를 확립했다. 재조합체 DANCE 를 Ni-NTA 아가로스 (Qiagen) 를 이용한 무혈청 배양 상청액 800 ml 로부터 정제하여, SDS-PAGE 로 전개시키고, Coomassie-Blue 로 염색했다. 주된 2 개의 밴드 중에서, DANCE 의 절단된 형태에 해당하는 밴드를 잘라내어 Edman 분해로 분석하여 그의 N-말단 아미노산 서열을 결정했다 (도 5).
그 결과, DANCE 의 절단된 형태의 N-말단 아미노산 서열은 DANCE 의 78 번째 및 후속 위치의 아미노산 서열과 일치했다.
따라서, 상기 저분자량 단백질은 77 번째 아미노산과 78 번째 아미노산 사이의 DANCE 의 절단으로 생성되는 것으로 간주되었다.
실시예
3:
DANCE 의
절단은 세린 프로테아제 저해제에 의해 저해된다
FLAG 태그 및 6 × His 태그가 그의 카르복실 말단에 추가된 인간 DANCE cDNA 를 293T 세포에 트랜스펙션하고; 상기 세포를 시스테인 프로테아제 저해제 (E64) 또는 세린 프로테아제 저해제 (아프로티닌) 를 포함하는 무혈청 배지를 이용하여 48 시간 동안 배양하고; 재조합체 단백질을 Ni-NTA 아가로스를 이용해 배양 상청액으로부터 침전시키고 SDS-PAGE 에 전개시켜, 항-FLAG M2 항체를 이용해 웨스턴 블랏을 수행했다.
그 결과, DANCE 의 절단은 E64 로는 저해되지 않았으나 아프로티닌에 의해서는 저해되었다 (도 6).
따라서, DANCE 이 세린 프로테아제에 의해 절단된다는 것이 시사되었다.
실시예
4:
Arg77
이
Ala 로
치환되는 경우 DANCE 는 절단되지 않게 된다
DANCE 의 77 번째 아르기닌을 알라닌으로 치환하여 생긴 (C-말단의 FLAG 및 6 x His 태그가 있음) DANCE 의 돌연변이화 형태에 대한 발현 벡터 (도 7) 및 DANCE 의 정상 형태 (C-말단의 FLAG 및 6 x His 태그가 있음) 에 대한 발현 벡터를 293T 세포에 트랜스펙션하고; 세포를 무혈청 배지를 이용하여 48 시간 동안 배양하고; 재조합체 단백질을 Ni-NTA 아가로스를 이용하여 배양 상청액으로부터 침전시키고, SDS-PAGE 로 전개하고, 항-FLAG M2 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행했다.
그 결과, 상기 돌연변이화 형태의 DANCE 는 프로테아제를 이용한 절단에 저항성을 보였다 (도 8).
실시예
5: DANCE 는 단일복합체를 형성하며
LTBP2
에 결합한다
9-cm 플레이트 상에 시딩된 소 대동맥 평활근 세포를 35S-Met 및 Cys 로 24 시간 동안 표지한 후, 배양 상청액 및 50 ㎍ 의 재조합체 인간 DANCE (C-말단의 FLAG 및 6 x His 가 있음) 를 혼합하고 항-FLAG 아가로스 (Sigma) 로 침전화시켜, 수득한 침전을 SDS-PAGE 로 전개시키고 방사선촬영을 수행했다. 동일한 배양 상청액을 탄성섬유 구성 단백질 (엘라스틴, 피브릴린 1, 피브릴린 2 및 LTBP2) 에 대한, 시판되어 입수가능한 항체로 면역침전시키고, 동일한 SDS-PAGE 겔을 이용하여 전개하고, 방사선촬영을 수행했다.
그 결과, DANCE 는 단일복합체를 형성하며 DANCE 가 LTBP2 에 결합하는 것으로 나타났다 (도 9).
실시예
6: 인간 DANCE 및 DANCE 또는
LTBP2
에 대한 결합 영역의 분석
실시예 5 의 결과로부터, DANCE 의 서로간 결합 영역 및 DANCE 의 LTBP2 에 대한 결합영역을 분석했다.
FLAG 태그가 있는 인간 DANCE 구축물 (도 8), Myc 태그가 있는 인간 DANCE 구축물 및 인간 LTBP2 구축물을 따로따로 293T 세포에 트랜스펙션시켰다. 무혈청 배지에서 48 시간 동안 배양 후, 각각의 배양 상청액 및 세포 추출물을 혼합하고, 이를 단백질 용액으로서 사용했다. FLAG 태그가 있는 DANCE 구축물 유래의 단백질 용액 및 DANCE 또는 Myc 태그가 있는 LTBP2 의 단백질 용액을 얼음에서 1 시간 동안 혼합하고, 항-FLAG 항체로 침전시키고, 수득한 침전물을 SDS-PAGE 로 전개하여, 항-Myc 항체 또는 항-FLAG 항체를 이용하여 검출했다.
그 결과, DANCE 의 서로간 결합은 N-말단 도메인을 필요로 하며, DANCE 의 LTBP2 에 대한 결합은 DANCE 의 중앙 도메인을 필요로 한다는 것을 발견했다 (도 10). DANCE 의 N-말단 또는 C-말단이 결핍된 경우 DANCE 와 LTBP2 의 결합이 더욱 강하다는 것이 발견되었다.
실시예
7: DANCE 는 라이실 옥시다아제에 결합가능하다
본 발명의 발명자들은 라이실 옥시다아제 유전자 결핍 마우스 [J. Biol. Chem. 278(16): 14387-93 (2003); Circulation 106(19): 2503-9 (2002)] 의 표현형이 본 발명자들에 의해 예전에 보고된 DANCE 유전자 결핍 마우스 [Nature 415: 171-175 (2002)] 의 표현형과 매우 유사하다는 것을 발견했다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 DANCE 와 라이실 옥시다아제 간의 복합체 형성이 DANCE 가 그의 기능을 발휘함에 있어 중요할 것이라고 간주했으며, DANCE 가 라이실 옥시다아제에 결합하는지 여부를 조사했다. 검정은 실시예 6 과 동일한 방법으로 수행했으며, 단, 항-FLAG 항체를 이용하여 수득한 침전물을 SDS-PAGE 에 전개시키고 항-Myc 항체를 사용해 검출했다.
그 결과, DANCE 는 라이실 옥시다아제에 결합하는 것으로 시사되었다 (도 11).
고찰
1. DANCE 및
LTBP2 의
결합
본 발명의 발명자들은 DANCE 가 LTBP2 에 특이적으로 결합하는 것을 발견했다. 상기 결합은 DANCE 의 중앙의 도메인을 통해 발생하는데, 여기서 칼슘-결합 EGF-형 모티브가 일렬로 제시된다. 최근, 본 발명의 발명자들은 DANCE 의 아미노 말단 도메인이 세포 표면 인테그린에 결합한다는 것을 보고했으며, Liu 등은 DANCE 가 그의 절반 카르복시-말단 측에서 LOXL1 에 결합한다는 것을 보고했다. 그러나, 엘라스틴은 세포 표면에 근접하여 침착되어 있다기 보다는 마이크로피브릴을 따라 침착되어 있어, 성숙한 엘라스틴계 섬유가 되어 가는 것으로 공지되어 있다 [Matrix Biol. 19: 455-6 (2000)]. 따라서, DANCE 및 LOXL1 의 결합이 엘라스틴의 마이크로피브릴에 대한 침착 및 가교를 촉진한다면, DANCE 는 마이크로피브릴에 결합되어 있어야 한다. 마이크로피브릴은 긴 세포외 섬유이며, 피브릴린 1, 피브릴린 2 및 LTBP2 와 같은 장방형의 단백질 분자로 이루어진 것으로 간주된다. 피브릴린 넉아웃 마우스는, 피브릴린이 피브릴린 1 이던 또는 피브릴린 2 이던, 탄성섬유의 형성장애를 겪지 않으며, 피브릴린과 DANCE 의 결합은 가망이 없다. LTBP2 이 LTBP 패밀리에 속함에도 불구하고, 잠재한 TGFβ 에 결합하지 않고 탄성섬유에 위치하는 단백질이지만, LTBP2 넉아웃 마우스가 초기 태아 시기에 폐사하여 살아있는 유기체에서의 그의 역할은 불명료하다 [Mol. Cell Biol. 20: 4879-87 (2000)]. 본 발명자들에 의한 본 발명의 발견은 DANCE 를 마이크로피브릴에 고정시킴으로써 마이크로피브릴에 따른 엘라스틴의 침착 및 가교를 도움으로써 LTBP2 가 엘라스틴-가교 효소를 마이크로피브릴 내에 위치시킨다는 것을 시사한다.
2.
DANCE 의
서로에 대한 결합
DANCE 가 단량체, 이량체 또는 다량체의 형태 중 어느 것으로 작용하는지 여부가 여전히 불명료하지만, DANCE 는 본 연구에서 평활근 배양 상청액에 존재하는 주된 DANCE-결합 단백질로서 동정되었다. 이는 DANCE 가 단독 복합체 (이량체 또는 다량체) 를 형성한다는 것을 나타낸다. DANCE 의 서로에 대한 결합은 그의 아미노-말단 도메인에 의해 중재된다. 선행 기술에서, 본 발명의 발명자들은 DANCE 의 아미노-말단 도메인이 세포 표면 인테그린에 결합한다는 것을 알려줬으며 [J. Biol. Chem. 274(32): 22476-22483 (1999)], 본 발명의 데이터는 DANCE 의 서로에 대한 결합을 그의 아미노-말단 도메인의 신규한 기능으로 공표한다.
3.
DANCE 의
아미노-말단 도메인의 절단
본 발명의 발명자들은 생체내 및 시험관 내에서 소정의 DANCE 가 그의 아미노-말단 도메인에서 절단된다는 것을 발견했다. 상기 절단은 동정되지 않은 세린 프로테아제에 의해 제공된다; 절단 부위의 아르기닌이 알라닌으로 치환되는 경우, 절단이 발생할 가망이 없다. DANCE 의 아미노-말단 도메인의 기능으로 유추하건데, (1) DANCE 의 절단된 형태는 더 이상 세포 표면 인테그린에 결합하지 않으며, (2) DANCE 의 절단된 형태는 더 이상 서로간에 결합하지 않으며, (3) DANCE 의 절단된 형태는 전장 DANCE 보다 LTBP2 와 더욱 강한 결합을 나타낸다. 상기 신규한 발견 (1) 내지 (3) 은 살아있는 유기체에서 프로테아제를 이용한 DANCE 의 절단이 DANCE 의 기능 변화 제어 및 그에 따른 탄성섬유의 형성을 위한 메카니즘으로서 제공된다는 것을 시사한다. 상기 고안에 근거하면, DANCE 절단 프로테아제의 약물-유도성 저해 또는 촉진이 탄성섬유 악화 방지 및 그의 재생 촉진에 유용할 수 있다.
4. DANCE 와 라이실 옥시다아제의 결합
LOX1 유전자 결핍 마우스는 탄성섬유의 형성에서 비정상을 나타낸다. LOXL1 은 DANCE 와 직접적으로 연관되어 있으며 엘라스틴을 가교하기 위한 탄성섬유 형성 부위에 DANCE 에 의해 고정되어 있는 것으로 간주된다. 그러나, LOXL1 유전자-결핍 마우스의 표현형은 DANCE 유전자-결핍 마우스의 표현형보다 더 약하며; DANCE 의 총체적인 작용은 LOXL1 와의 결합만으로 단독적으로 설명될 수 없다. 라이실 옥시다아제 유전자 결핍 마우스가 또한 탄성섬유의 형성에서 비정상을 나타내지만, DANCE 와 라이실 옥시다아제의 결합은, 본 발명의 경우에서 본 발명의 발명자들이 발견했는데, 라이실 옥시다아제를 고정시킴으로써 효과적으로 DANCE 가 엘라스틴의 가교를 제공하도록 한다는 것을 시사한다.
실시예
8:
DANCE 의
절단을 조절하는 물질의 스크리닝
FLAG 태그 및 6 x His 태그가 그의 카르복실 말단에 추가된 인간 DANCE cDNA 를 293T 세포에 트랜스펙션시키고, 상기 세포를 시험 물질의 존재 및 부재 하에 무혈청 배지에서 48 시간 동안 배양했으며; 인간 DANCE 는 Ni-NTA 아가로스를 이용한 배양 상청액으로부터 침전시키고, SDS-PAGE 로 전개하고, 항-FLAG M2 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행했다. 시험 물질의 존재 및 부재 하에 2 개 밴드를 정량 분석함으로써, 시험 물질이 DANCE 의 절단을 조절할 수 있는지 여부를 결정한다.
실시예
9: 다양한 연령층의 인간 피부에서
DANCE 의
전장 및 절단된 형태의 발현
성형외과 수술 동안 적출되는 피부 조직에서의 DANCE 의 발현을 시험하기 위해, 항-인간 DANCE 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행했다 (도 12). DANCE 단백질의 전장 및 절단된 형태가 모든 시료에서 검출되었지만, 발현 수준에서의 주된 차이점이 연령 및 피부 수집 부위에 따라 관찰되었다. 우선, 안면 피부에서는, 전장 DANCE 및 DANCE 의 절단된 형태가 모두 높은 수준으로 발현되었고, 특히 0 세 유아에서는 전장 DANCE 의 발현이 더 높은 반면, 성인에서는 전장 DANCE 및 DANCE 의 절단된 형태 모두 더 낮은 발현 경향이 있었으며, 특히 전장 DANCE 는 더욱 낮은 발현이 있었다. 광에 노출되지 않은 다른 부위의 피부에서는, 성인에서조차 전장 DANCE 및 DANCE 의 절단된 형태 모두에 대해 수락할 만한 수준의 발현이 유지되는 경향이 있었다.
참고예
1:
DANCE 의
절단된 형태는
인테그린
-중재 세포 결합 촉진 활성이 없다
전장 DANCE 는 세포 표면 인테그린을 통해 도관 내피 세포의 결합 및 신장을 촉진한다. 본 발명의 발명자들은 최근 전장 DANCE 가 인테그린 αvβ3, αvβ5 및 α9β1 에 대한 리간드로서 제공될 수 있다는 것을 보고한 바 있다. 리간드로서 제공되는 도메인은 DANCE 의 아미노-말단 도메인의 RGD 모티프 주변에 존재하는 것으로 간주되므로, RGD 가 1 개 아미노산 치환에 대해 RGE 로 치환된 DANCE 돌연변이 (RGE DANCE) 및 DANCE 의 아미노-말단 절단 형태 (ΔND DANCE) 의 각각의 재조합체 단백질을 정제하고, 전장 DANCE 을 따라 이들을 도관 내피 세포 결합 검정에 적용했다 (도 13). 전장 DANCE 의 경우, 세포 결합은 코팅에 사용된 단백질의 농도에 의존하여 촉진되었으며, RGE DANCE 는 세포 결합 활성이 거의 없었고, ΔND DANCE 는 세포 결합 활성이 전혀 없었다.
참고예
2:
DANCE 의
아미노-말단 도메인이 탄성섬유 형성에 필요하다
후속적으로, 프로테아제를 이용한 DANCE 의 아미노-말단 도메인의 절단이 탄성섬유의 형성에 영향을 주는지 여부를 시험했다.
인간 피부 섬유아세포를 융합성에 이르도록 시딩하고; 배지를 무혈청 배지 또는 10% 우태아 혈청 포함 배지로 교체하고; 세포를 2 주 동안 배양하고; 탄성섬유의 형성을 항-엘라스틴 항체를 이용한 면역염색으로 분석했다.
그 결과, 10% 우태아 혈청을 포함하는 배지를 이용하여, 탄성섬유의 형성을 관찰했다. 무혈청 배지에서도 세포가 생존했지만, 탄성섬유는 거의 형성되지 않았다. 그러나, 재조합체 DANCE 가 4 ㎍/ml 로 무혈청 배지에 첨가되는 경우, 혈청 포함 배지를 사용한 경우보다 탄성섬유가 더 높은 수준으로 형성되었다. 그 때 첨가된 재조합체 DANCE 의 위치 지정을 항-FLAG 항체를 이용하여 시험할 때, 형성된 탄성섬유가 함께 위치지정되는 것으로 발견되었다. 한편, ΔND-DANCE 가 보충된 배지를 이용하면, 탄성섬유의 형성은 거의 없어; ΔND-DANCE 는 탄성섬유 형성에 거의 활성이 없거나 또는 매우 약한 활성을 갖는 것으로 간주된다.
따라서, 프로테아제를 이용한 DANCE 의 아미노-말단 도메인의 절단이 DANCE 불활성화를 나타내는 것으로 간주되므로, DANCE 절단 프로테아제의 저해는 전장 DANCE 를 증가시킴으로써 탄성섬유를 형성 또는 유지하기 위한 의약으로서 유용하게 제공되는 것으로 예측된다.
본 발명의 스크리닝 방법은, 탄성섬유 형성을 조절할 수 있는 신규 작용메카니즘의 의약의 개발, 또는 DANCE 특이적 프로테아제의 동정을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 측정 방법은, 탄성섬유 형성의 상태의 진단을 가능하게 한다. 더욱이, 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 복합체 및 키트는, 본 발명의 방법 수행, 탄성 섬유 형상의 조절이 소망되는 상태의 예방, 치료 또는 개선, 또는 연구/진단용 시약 등으로 바람직하다. ,
본 출원은, 2004 년 3 월 29 일에 일본에서 출원된 특원 2004-096685 를 기초로 하며, 그 내용은 본 명세서 중에 원용된다.
<110> Kyoto University
<120> Cleaved forms of DANCE and DANCE complexes, and methods of
screening an agent for regulating formation of elastic fibre
using them
<150> JP 2004-096685
<151> 2004-03-29
<160> 29
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1347
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1344)
<400> 1
atg cca gga ata aaa agg ata ctc act gtt acc att ctg gct ctc tgt 48
Met Pro Gly Ile Lys Arg Ile Leu Thr Val Thr Ile Leu Ala Leu Cys
1 5 10 15
ctt cca agc cct ggg aat gca cag gca cag tgc acg aat ggc ttt gac 96
Leu Pro Ser Pro Gly Asn Ala Gln Ala Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp
20 25 30
ctg gat cgc cag tca gga cag tgt tta gat att gat gaa tgc cga acc 144
Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr
35 40 45
atc ccc gag gcc tgc cga gga gac atg atg tgt gtt aac caa aat ggc 192
Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly
50 55 60
ggg tat tta tgc att ccc cgg aca aac cct gtg tat cga ggg ccc tac 240
Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg Thr Asn Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr
65 70 75 80
tcg aac ccc tac tcg acc ccc tac tca ggt ccg tac cca gca gct gcc 288
Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Pro Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala
85 90 95
cca cca ctc tca gct cca aac tat ccc acg atc tcc agg cct ctt ata 336
Pro Pro Leu Ser Ala Pro Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg Pro Leu Ile
100 105 110
tgc cgc ttt gga tac cag atg gat gaa agc aac caa tgt gtg gat gtg 384
Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Ser Asn Gln Cys Val Asp Val
115 120 125
gac gag tgt gca aca gat tcc cac cag tgc aac ccc acc cag atc tgc 432
Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys
130 135 140
atc aat act gaa ggc ggg tac acc tgc tcc tgc acc gac gga tat tgg 480
Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp
145 150 155 160
ctt ctg gaa ggc cag tgc tta gac att gat gaa tgt cgc tat ggt tac 528
Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr
165 170 175
tgc cag cag ctc tgt gcg aat gtt cct gga tcc tat tct tgt aca tgc 576
Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys
180 185 190
aac cct ggt ttt acc ctc aat gag gat gga agg tct tgc caa gat gtg 624
Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Glu Asp Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val
195 200 205
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Asn Glu Cys Ala Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys Val Asn Thr
210 215 220
tac ggc tct ttc atc tgc cgc tgt gac cca gga tat gaa ctt gag gaa 720
Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu
225 230 235 240
gat ggc gtt cat tgc agt gat atg gac gag tgc agc ttc tct gag ttc 768
Asp Gly Val His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe
245 250 255
ctc tgc caa cat gag tgt gtg aac cag ccc ggc aca tac ttc tgc tcc 816
Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Thr Tyr Phe Cys Ser
260 265 270
tgc cct cca ggc tac atc ctg ctg gat gac aac cga agc tgc caa gac 864
Cys Pro Pro Gly Tyr Ile Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp
275 280 285
atc aac gaa tgt gag cac agg aac cac acg tgc aac ctg cag cag acg 912
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290 295 300
tgc tac aat tta caa ggg ggc ttc aaa tgc atc gac ccc atc cgc tgt 960
Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro Ile Arg Cys
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Glu Glu Pro Tyr Leu Arg Ile Ser Asp Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala
325 330 335
gag aac cct ggc tgc aga gac cag ccc ttt acc atc ttg tac cgg gac 1056
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355 360 365
caa gcc acg acc cgc tac cct ggg gcc tat tac att ttc cag atc aaa 1152
Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys
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Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile
385 390 395 400
agt gcc acc ctg gtg atg aca cgc ccc atc aaa ggg ccc cgg gaa atc 1248
Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro Arg Glu Ile
405 410 415
cag ctg gac ttg gaa atg atc act gtc aac act gtc atc aac ttc aga 1296
Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg
420 425 430
ggc agc tcc gtg atc cga ctg cgg ata tat gtg tcg cag tac cca ttc 1344
Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe
435 440 445
tga 1347
<210> 2
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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1 5 10 15
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20 25 30
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195 200 205
Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Asp Gly Val His Cys Ser Asp
210 215 220
Met Asp Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val
225 230 235 240
Asn Gln Pro Gly Thr Tyr Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Ile Leu
245 250 255
Leu Asp Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg
260 265 270
Asn His Thr Cys Asn Leu Gln Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly
275 280 285
Phe Lys Cys Ile Asp Pro Ile Arg Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Arg Ile
290 295 300
Ser Asp Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp
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Gln Pro Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg
325 330 335
Ser Val Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro
340 345 350
Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu
355 360 365
Phe Tyr Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr
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Thr Val Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu
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1 5 10 15
tgt tta gat att gat gaa tgc cga acc atc ccc gag gcc tgc cga gga 96
Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly
20 25 30
gac atg atg tgt gtt aac caa aat ggc ggg tat tta tgc att ccc cgg 144
Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg
35 40 45
aca aac cct gtg tat cga 162
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50
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<213> Homo sapiens
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Gln Ala Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln
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Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg
35 40 45
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
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Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Pro Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro
1 5 10 15
gca gct gcc cca cca ctc tca gct cca aac tat ccc acg atc tcc agg 96
Ala Ala Ala Pro Pro Leu Ser Ala Pro Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg
20 25 30
cct ctt ata tgc cgc ttt gga tac cag atg gat gaa agc aac caa tgt 144
Pro Leu Ile Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Ser Asn Gln Cys
35 40 45
gtg gat gtg gac gag tgt gca aca gat tcc cac cag tgc aac ccc acc 192
Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr
50 55 60
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100 105 110
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gtc aac acc tac ggc tct ttc atc tgc cgc tgt gac cca gga tat gaa 480
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165 170 175
tct gag ttc ctc tgc caa cat gag tgt gtg aac cag ccc ggc aca tac 576
Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Thr Tyr
180 185 190
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aac ttc aga ggc agc tcc gtg atc cga ctg cgg ata tat gtg tcg cag 1104
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1 5 10 15
Ala Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ser Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg
20 25 30
Pro Leu Val Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Gly Asn Gln Cys
35 40 45
Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr
50 55 60
Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp
65 70 75 80
Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg
85 90 95
Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser
100 105 110
Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Asp Asp Gly Arg Ser Cys
115 120 125
Gln Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys
130 135 140
Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu
145 150 155 160
Leu Glu Glu Asp Gly Ile His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe
165 170 175
Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Ser Tyr
180 185 190
Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Val Leu Leu Glu Asp Asn Arg Ser
195 200 205
Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Thr Pro
210 215 220
Leu Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro
225 230 235 240
Ile Val Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Leu Ile Gly Asp Asn Arg Cys Met
245 250 255
Cys Pro Ala Glu Asn Thr Gly Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu
260 265 270
Phe Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile
275 280 285
Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe
290 295 300
Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr
305 310 315 320
Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro
325 330 335
Arg Asp Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile
340 345 350
Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln
355 360 365
Tyr Pro Phe
370
<210> 17
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding preprotrypsin signal peptide, FLAG tag, 6 x His tag
and restriction sites
<400> 17
ggtaccgcta gcgaattcac catgtctgca cttctgatcc tagctcttgt tggagctgca 60
gttgctgact acaaagacga tgacgacaag actagtcatc atcaccatca ccattctaga 120
gaaggatccg atatccgcgg ccgcatcgat tgactagctg aggccgcaaa ccc 173
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> preprotrypsin signal peptide
<400> 18
Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLAG tag
<400> 19
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6 x His tag
<400> 20
His His His His His His
1 5
<210> 21
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding preprotrypsin signal peptide, Myc tag and
restriction sites
<400> 21
gaattcacca tgtctgcact tctgatccta gctcttgttg gagctgcagt tgctgactac 60
gaagaggacg aacaaaaact catctcagaa gaggatctga ctagt 105
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myc tag
<400> 22
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 23
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding FLAG tag, 6 x His tag and restriction sites
<400> 23
tggtaccgag ctcggatcca ctagtccagt gtggtggaat tctgcagata tccagcacag 60
tggcggccgt ctagagacta caaagacgat gacgacaaga gagggtctca tcatcaccat 120
caccattgag cggccgcaaa ccc 143
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer for amplifying human DANCE
<400> 24
tctagagcac agtgcacgaa tggctttg 28
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer for amplifying human DANCE
<400> 25
gcggccggtc agaatgggta ctgcgacaca tatatccg 38
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer for amplifying human LTBP2
<400> 26
tctagacaaa gggaccccgt agggagatac gag 33
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer for amplifying human LTBP2
<400> 27
gcggccgcct ggtactcctt ggcagtgcag tggg 34
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer for amplifying human DANCE
<400> 28
gaattcttct tctcgccttc gcatctcctc c 31
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer for amplifying human DANCE
<400> 29
tctagagaat gggtactgcg acacatatat ccg 33
Claims (34)
- 서열 식별 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진, DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE 의 절단으로 수득되는 폴리펩티드.
- 서열 식별 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
- 제 1 항의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
- 서열 식별 번호 5 로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
- 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진, DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE의 절단으로 수득되는 폴 리펩티드.
- 서열 식별 번호 8 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
- 제 5 항의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
- 서열 식별 번호 7 로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
- DANCE 를 DANCE 특이적 프로테아제에 접촉시키는 것을 특징으로 하는 DANCE 의 절단 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩티드에 특이적 친화성을 갖는 항체.
- 제 5 항 또는 제 6 항의 폴리펩티드에 특이적 친화성을 갖는 모노클로날 항체.
- 동물유래의 생체시료에 있어서 DANCE 의 절단량을 측정하는 것을 포함하는 방법.
- 항 DANCE 항체를 함유하는, DANCE 의 절단량의 측정용 키트.
- DANCE 특이적 프로테아제에 의한 DANCE의 절단부위에 해당 프로테아제에 저항성을 나타내는 아미노산 돌연변이가 도입된 DANCE 돌연변이.
- 제 14 항의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
- 둘 이상의 DANCE 를 포함하는 DANCE 복합체.
- 제 16 항에 있어서, 구분가능한 형태인 둘 이상의 DANCE 를 포함하는 복합체.
- 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 을 추가로 포함하는 복합체.
- 하나 이상의 DANCE 및 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 을 포함하는 DANCE 복합체.
- 둘 이상의 DANCE 를 접촉시켜 복합체를 형성시키는 것을 포함하는, 둘 이상의 DANCE 를 포함하는 DANCE 복합체의 제조방법.
- 하나 이상의 DANCE 를 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 에 접촉시켜 복합체 를 형성시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 DANCE 및 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2 을 포함하는 DANCE 복합체의 제조방법.
- 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 를 포함하는 DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법:(a) 피검물질을 DANCE 특이적 프로테아제에 접촉시키는 단계;(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 측정하여, 그 활성을 피검물질을 접촉시키지 않은 경우의 DANCE 특이적 프로테아제의 활성과 비교하는 단계;(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절하는 피검물질을 선택하는 단계.
- 제 22 항에 있어서, 탄성섬유 형성 조절제의 동정 방법.
- 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 를 포함하는, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법:(a) 피검물질을 동물에게 투여하는 단계;(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 측정하여, 그 활성을 피검물질을 투여하지 않은 경우의 DANCE 특이적 프로테아제의 활성과 비교하는 단계;(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 특이적 프로테아제의 활성을 조절하는 피검물질을 선택하는 단계.
- 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 를 포함하는, 둘 이상의 DANCE를 포함하는 DANCE 복합체의 형성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법:(a) 피검물질의 존재 하, 둘 이상의 DANCE를 접촉시키는 단계;(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 복합체의 양을 측정하여, 그 양을 피검물질의 부재 하에 수득된 DANCE 복합체의 양과 비교하는 단계;(c) 상기 (b) 의 비교결과에 따라서, DANCE 복합체의 형성을 조절하는 피검물질을 선택하는 단계.
- 제 25 항에 있어서, 구분가능한 형태인 둘 이상의 DANCE 를 사용하는 방법.
- 이하의 단계 (a), (b) 및 (c) 을 포함하는, 하나 이상의 DANCE 및 라이실 옥 시다아제 및/또는 LTBP2 을 포함하는 DANCE 복합체의 형성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법:(a) 피검물질의 존재 하, 하나 이상의 DANCE 를 라이실 옥시다아제 및/또는 LTBP2에 접촉시키는 단계;(b) 상기 (a) 의 단계에 기인하여 생기는 DANCE 복합체의 양을 측정하여, 그 양을 피검물질의 부재 하에 수득된 DANCE 복합체의 양과 비교하는 단계;(c) 상기 (b) 의 비교 결과에 따라서, DANCE 복합체의 형성을 조절하는 피검물질을 선택하는 단계.
- 제 23 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 수득되는 탄성섬유 형성 조절제.
- DANCE 의 절단활성을 지표로 하는 DANCE 특이적 프로테아제의 스크리닝 방법.
- 제 29 항의 방법으로 수득되는 DANCE 특이적 프로테아제.
- 제 29 항의 방법으로 수득되는 DANCE 특이적 프로테아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
- 제 30 항의 DANCE 특이적 프로테아제 또는 제 31 항의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 탄성섬유 형성 조절제.
- 이하 (a) 및 (b) 을 포함하는 키트:(a) DANCE, 또는 DANCE 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;(b) 이하 (i) 내지 (vi) 의 하나 이상의 성분;(i) (a) 의 DANCE 와 구분가능한 형태의 DANCE;(ii) (a) 의 DANCE 와 구분가능한 형태의 DANCE 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;(iii) 라이실 옥시다아제;(iv) 라이실 옥시다아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;(v) LTBP2;(vi) LTBP2 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
- 이하의 단계 (a) 내지 (b) 를 포함하는, DANCE 특이적 프로테아제 발현세포의 동정 방법:(a) 소정의 동물세포와 DANCE 를 접촉시키는 단계;(b) DANCE 가 절단되는지 여부를 평가하는 단계.
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