ES2206191T3 - Inhibidores de alta afinidad para validacion de dianas y usos de los mismos. - Google Patents
Inhibidores de alta afinidad para validacion de dianas y usos de los mismos.Info
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Abstract
Un inhibidor de proteína quinasa de la siguiente fórmula I: en la que R es un 1¿-naftilo, 2¿-naftilo, m-fenoxifenilo, m- benciloxifenilo, m-(2¿, 6¿-dicloro)benciloxifenilo, 3- piperonilo, 1¿-naftilmetilo, 1¿-naftoximetilo o 2¿- naftilmetilo.
Description
Inhibidores de alta afinidad para validación de
dianas y usos de los mismos.
Esta invención proporciona procedimientos
generales para el descubrimiento de inhibidores mutantes para
cualquier clase de enzimas, así como los inhibidores específicos así
identificados. Más específicamente, esta invención proporciona
procedimientos generales para el descubrimiento de inhibidores
específicos para enzimas multisustrato. Los ejemplos de dichas
enzimas multisustrato incluyen quinasas. Los inhibidores mutantes
identificados mediante los procedimientos de esta invención pueden
utilizarse para interrumpir de forma altamente selectiva funciones
celulares tales como la transformación oncogénica. En un ejemplo
particular, esta invención proporciona un inhibidor de proteína
quinasa Src, composiciones farmacéuticas del mismo y procedimientos
para interrumpir la transformación en una célula que expresa la
diana v-Src que comprenden poner en contacto la
célula con el inhibidor de proteína quinasa.
Las solicitudes de patente de EE.UU. nº de serie
08/797.522 y 60/046.727 y el documento PCT/US98/02522 están
relacionados con la presente invención.
La actual explosión en el número de genes recién
descubiertos subraya la necesidad de ligandos moléculas pequeñas
que pueden utilizarse para elucidar y controlar la función génica.
La ingeniería convergente de interfases proteína/molécula pequeña ha
surgido en los últimos años como un potente procedimiento para
generar nuevos pares ligando/receptor con alta especificidad. Al
introducir diversidad química en la proteína diana, así como en la
molécula pequeña, pueden diseñarse interacciones de unión únicas y
explotarse más eficazmente que mediante la química medicinal
tradicional. Dichos enfoques se han utilizado para explorar
químicamente una serie de sistemas biológicos. La proteína de unión
a FK506 se ha modificado mediante ingeniería genética para unirse
preferiblemente a análogos no naturales de FK506 por Schreiber y
colaboradores, así como por Claxon y colaboradores. Este sistema se
ha utilizado extensamente para dimerizar selectivamente receptores
y controlar el término génica en un contexto celular. Se ha
mostrado también que los receptores de hormonas nucleares son
susceptibles de diseño genético químico. Corey y colaboradores
demostraron que las mutaciones en dos residuos aminoacídicos en el
receptor X retinoide son suficientes para crear dos nuevas clases
de receptores con nuevas especificidades de ligando. En un sistema
medicinalmente más aplicable, Smith y colaboradores modificaron por
ingeniería genérica la proteasa carboxipeptidasa A1 para hidrolizar
un profármaco de metotrexato que es resistente a hidrólisis por
proteasas de tipo salvaje.
La fosforilación catalizada por proteína quinasa
del resto hidroxi de serina, treonina o tirosina es el elemento de
control postraduccional básico en la transducción de señal
eucariótica. El estado de fosforilación de una proteína dada puede
gobernar su actividad enzimática, las interacciones de unión
proteína-proteína y la distribución celular. La
fosforilación y desfosforilación es por tanto un "conmutador
químico" que permite que la célula transmita señales desde la
membrana plasmática hasta el núcleo para controlar en última
instancia el término génica de manera altamente regulada.
Inhibidores permeables en célula altamente selectivos de quinasas
individuales permitirían la investigación sistemática de la función
celular de una quinasa en tiempo real, y por tanto, proporcionarían
herramientas valiosas para la desconvolución de los procesos
dependientes de la fosforilación en las cascadas de transducción de
señal.
La familia Src está compuesta a menudo por
quinasas citosólicas altamente homólogas que son componentes
críticos en un conjunto de rutas de señalización celular en el
intervalo de activación de linfocitos a crecimiento y proliferación
celular. La activación constitutiva de estas enzimas puede conducir
a una transformación celular oncogénica, haciéndolas dianas de
fármaco putativas para terapias de cáncer. Debido a su importancia
en la regulación de estos procesos celulares fundamentales, muchos
estudios se han centrado en desarrollar inhibidores para la familia
de quinasas Src. Sin embargo, los potentes inhibidores que se han
descubierto carecen de la alta selectividad que sería necesaria
para ensayar la inhibición celular de una quinasa diana individual.
Los exámenes con inhibidor convencional han producido pocas o
ninguna molécula que pueda discriminar entre los sitios activos de
las diversas quinasas de la familia Src.
Desgraciadamente, los mismos rasgos que hacen a
las quinasas tan útiles en la transducción de señal, y que las han
hecho evolucionar para convertirse en básicas para casi todas las
funciones celulares, las hace también extremadamente difíciles, si
no imposibles, de estudiar y comprender. Sus especificidades de
proteína superpuestas, sus similitudes estructurales y catalíticas,
su gran número, y su gran velocidad hacen la identificación
específica de sus sustratos proteína in vivo extremadamente
difícil, si no imposible, utilizando las técnicas genéticas y
bioquímicas actuales. Este es hoy en día el obstáculo principal
para descifrar las cascadas de señalización implicadas en la
transducción de señal mediada por proteína quinasa (4,
6-8).
Los esfuerzos para desentrañar la implicación de
proteína quinasas específicas en las cascadas de transducción de
señal se han frustrado por su aparente carencia de sustrato
proteína específico in vitro e in vivo (4, 8). Los
dominios catalíticos de las proteínas quinasas poseen poca o
ninguna especificidad de sustrato inherente, como demuestran
experimentos de intercambio de dominio (18-23). El
dominio catalítico de una proteína quinasa puede sustituirse en
otra proteína quinasa diferente con pocos cambios en la
especificidad de sustrato proteína de esta última (22).
La mala especificidad in vitro de las
quinasas hace también difícil, si no imposible, extrapolar cuál
podría ser la función in vivo de las quinasas dadas. Una
proteína quinasa aislada de interés fosforilará a menudo muchos
sustratos de ensayo con igual eficacia (29). Esta aparentemente
mala especificidad de sustrato se encuentra también in vivo;
por ejemplo muchos enfoques genéticos, tales como experimentos de
eliminación génica, no dan un fenotipo interpretable debido a la
compensación por otras proteínas quinasas celulares (30, 31).
Otra complicación es que se ha propuesto que
muchas proteína quinasas fosforilan proteínas cadena abajo y cadena
arriba que son a su vez proteína quinasas; aunque esto parece
posibilitar bucles de retroalimentación positiva complejos, hace
también aún más difícil desentrañar la cascada (1). Una vía
importante para descifrar el papel y para la comprensión de la
función de las enzimas, tanto in vitro como in vivo,
es el uso de inhibidores enzimáticos específicos. Si pueden
encontrarse uno o más compuestos que inhiban únicamente la proteína
quinasa diana, el inhibidor puede utilizarse para modular la
actividad enzimática, y pueden observarse los efectos de esa
reducción. Las técnicas de genoma completo han proporcionado muchas
dianas, pero su función es desconocida. Se han desarrollado muchos
procedimientos para determinar si una nueva quinasa dada podría ser
una buena diana. Estos procedimientos tienen todos en común la
carencia de una molécula pequeña para inhibir la enzima, lo que
puede conducir a confusión.
Por ejemplo, la técnica más habitualmente
utilizada en el estado de la técnica es eliminar genéticamente la
quinasa y observar el nuevo fenotipo. Típicamente, la deleción de
una quinasa en el genoma de ratón (el organismo modelo más habitual)
no causa ningún cambio informativo. Esto es por dos razones: 1) el
gen (quinasa) es esencial durante la embriogénesis, causando así
letalidad antes del nacimiento, o bien 2) el gen está ausente
(eliminado) y su función puede reemplazarse por una quinasa
estrechamente relacionada que está todavía presente. La importante
diferencia entre el enfoque reconocido en la técnica y la invención
de la presente memoria es que en la presente memoria se emplean
moléculas orgánicas pequeñas para inhibir la función de la quinasa
de interés, puesto que está todavía presente en los organismos pero
inactiva, así que puede causar cambios significativos en los
organismos y lo más importante, los cambios son exactamente como
los que aparecerían si se preparara un inhibidor de enzima de tipo
salvaje.
Además, dichos inhibidores están entre los
compuestos farmacéuticos más importantes conocidos. Por ejemplo, la
aspirina (ácido acetilsalicílico) es uno de dichos inhibidores.
Inhibe una enzima que cataliza la primera etapa de la síntesis de
prostaglandina, inhibiendo así la formación de prostaglandinas, que
están implicadas en la producción de dolor (72). El descubrimiento
tradicional de fármacos puede caracterizarse como el diseño y
modificación de compuestos diseñados específicamente para unirse a
e inactivar una proteína causante de enfermedad; el éxito relativo
de dicho esfuerzo depende de la selectividad del fármaco por la
proteína diana, y de su carencia de inhibición de enzimas no
asociadas a la enfermedad con actividades enzimáticas similares.
Dichos enfoques parecerían ser vías prometedoras para desarrollar
tratamientos para el cáncer, puesto que muchos cánceres humanos
están causados por la desrregulación de una proteína normal (por
ejemplo cuando un protooncogén se convierte en un oncogén mediante
una translocación génica). Y puesto que las quinasas son reguladores
clave, han resultado ser protooncogenes muy habituales, y por tanto
dianas de diseño de fármaco ideales.
El proceso de diseño de inhibidores selectivos es
relativamente sencillo en casos en que están presentes pocas
enzimas similares en el organismo diana, por ejemplo en casos en
que puede tomarse como diana de inhibidores una proteína única de
bacteria. Pero, desgraciadamente, las similitudes entre las
quinasas y su gran número han frustrado casi completamente el
descubrimiento y diseño de inhibidores específicos, y ha bloqueado
la mayoría de las esperanzas de desarrollo de tratamientos
farmacéuticos específicos dirigidos al nivel de protooncogén. Se
espera que la vasta mayoría de inhibidores candidatos inhibirá
múltiples quinasas, aunque pueden haberse identificado inicialmente
como inhibidores de una quinasa particular purificada.
Estas dificultades descritas anteriormente tienen
implicaciones más allá de la mera frustración de los científicos;
han frustrado esfuerzos para descifrar las cascadas de proteína
quinasas y la función de quinasas individuales en esas cascadas y
otros mecanismos celulares. Dicha comprensión de la actividad y
función quinasa puede ser esencial antes de que ciertas
enfermedades humanas pueda tratarse, prevenirse o curarse
eficazmente. Por ejemplo, se ha sabido durante más de 30 años que el
oncogén bcr-abl es una proteína quinasa que es responsable
de la leucemia mielogénica crónica; pero los sustratos fisiológicos
sobre los que actúa para causar la oncogénesis, que pueden ser
importantes dianas de diseño de fármacos, han de identificarse
definitivamente todavía (11). Afortunadamente, a pesar de esta
deficiencia, el inhibidor CGP 57148 está experimentando según los
informes ensayos clínicos para uso en el tratamiento de leucemia
mielogénica, aunque los sustratos que pueden bloquear la
fosforilación in vivo no son conocidos.
La trascendencia médica de estas dificultades se
ilustra adicionalmente por el virus del sarcoma de Rous (VSR), que
se ha convertido en un importante sistema modelo para estudiar el
papel de las quinasas en la oncogénesis. La transformación por VSR
de fibroblastos está controlada por un solo producto génico viral,
la proteína quinasa v-src (32). Es el rápido transcurso
temporal y los drásticos cambios morfológicos durante la
transformación de fibroblastos por VSR lo que han hecho del VSR un
paradigma para estudios de actividad oncogénica en todas las
células. El origen (33), la regulación (3, 8, 34, 35) y la
estructura (25, 27, 36) de v-Src se han estudiado
extensamente y son bien comprendidos (8, 37, 38). Pero las
preguntas importantes sobre la quinasa extensamente estudiada
permanecen sin respuesta: ¿Cuáles son sus sustratos celulares
directos?. ¿Inhibe eficazmente la inhibición de su actividad
catalítica, o incluso revierte, la transformación?. ¿Sería dicha
inhibición una terapia eficaz o profiláctica frente a la
transformación por VSR?. Desgraciadamente, como se ha discutido
anteriormente, las respuestas a estas preguntas no están cercanas,
en gran medida debido a que el número de quinasas celulares es
enorme (se estima que el 2% del genoma de mamíferos codifica
proteína quinasas (4)) y debido a que las proteínas quinasas
exhiben especificidades de sustrato superpuestas (8, 39) y
comparten dominios catalíticos, haciendo enormemente difícil el
diseño de inhibidores específicos.
Aunque las dificultades son desalentadoras, los
nuevos procedimientos de diseño racional de fármacos y síntesis
orgánica combinatoria hacen factible el diseño o descubrimiento de
inhibidores específicos de quinasa dados recursos suficientes. Sin
embargo, debido a que las redes de quinasas están altamente
degeneradas e interconectadas de modos desconocidos, existe una
considerable incertidumbre con respecto a muchas enfermedades en
las que las quinasas deberían ser dianas de inhibición. Además, no
está claro en modo alguno que un inhibidor específico de una quinasa
dada tenga algún efecto sobre la enfermedad, in vitro o bien
in vivo. Debido a que las quinasas son altamente promiscuas,
existe una significativa probabilidad de que inhibir una quinasa
fuerce simplemente a otra quinasa a "tomar su lugar".
La presente invención proporciona una estrategia
(concretamente metodología) de combinación de enfoques químicos y
genéticos para posibilitar una rápida generación de inhibidores de
molécula pequeña altamente selectivos para una de las quinasas
modificadas por ingeniería genética, in vitro y en células
enteras. La invención descrita en la presente memoria implica
utilizar una mutación puntual específica para crear un bolsillo
único en el bolsillo o sitio de unión al sustrato de la enzima de
interés que no aparece en otras enzimas del genoma. Se sintetiza
después un inhibidor específico de la enzima modificada por
ingeniería genética derivatizando un inhibidor enzimático con un
grupo voluminoso diseñado para ajustarse al bolsillo del nuevo
sitio activo. Al utilizar manipulación genética para introducir una
diferencia estructural única en el sitio activo enzimático
conservado, pueden identificarse inhibidores altamente selectivos a
partir de paneles muy pequeños (10 compuesto) de inhibidores
putativos como se explica en la presente memoria. Los inhibidores de
la presente invención son útiles para estudiar la función de
enzimas en rutas bioquímicas así como con fines terapéuticos.
La presente invención proporciona inhibidores de
proteína quinasa representados por la siguiente fórmula I:
en la que R es 1'-naftilo,
2'-naftilo, m-fenoxifenilo,
m-benciloxifenilo,
m-2',6'-diclorobenciloxifenilo,
3-piperonilpirazolo,
p-terc-butifenilo,
1'-naftilmetilo, 1'-naftoximetilo o
2'-naftilmetilo. Más específicamente, la presente
invención proporciona aquellos inhibidores de proteína quinasa en
los que R es 1'-naftilo, 2'-naftilo
o 1'-naftilmetilo, 2'-naftilmetilo.
La presente invención proporciona también composiciones que
incluyen los inhibidores de proteína quinasa de la presente
invención.
La presente invención proporciona procedimientos
de interrupción de la transformación en una célula que expresa una
proteína quinasa mutante de la familia Src mediante la puesta en
contacto de la célula con los inhibidores de proteína quinasa de la
presente invención. Más específicamente, la presente invención
proporciona procedimientos de interrupción de la transformación en
una célula que expresa I338G v-Src o T339G Fyn
mediante la puesta en contacto de la célula con los inhibidores de
proteína quinasa de la presente invención.
La presente invención proporciona además
procedimientos de interrupción de la transformación en una célula
que expresa una proteína quinasa mutante de la familia Src mediante
la puesta en contacto de la célula con una composición que comprende
los inhibidores de proteína quinasa de la presente invención. Más
específicamente, la presente invención proporciona procedimientos
de interrupción de la transformación en una célula que expresa
I338G v-Src o T339G Fyn mediante la puesta en
contacto de la célula con una composición que contiene los
inhibidores de proteína quinasa de la presente invención.
La presente invención proporciona también
procedimientos de inhibición de la fosforilación de un sustrato de
una proteína quinasa mutante mediante incubación de un inhibidor de
proteína quinasa de la presente invención con una mezcla que
contiene la proteína quinasa mutante y su sustrato.
La presente invención proporciona también
procedimientos de inhibición de la actividad catalítica de una
enzima mutante mediante la incubación de la enzima mutante con un
inhibidor de la presente invención.
La presente invención proporciona también
procedimientos de inhibición del crecimiento de una célula mediante
la incubación de la célula con un inhibidor de la presente
invención.
Las proteínas quinasas mutantes utilizadas en los
procedimientos de la presente invención incluyen, pero sin
limitación, las siguientes: i) proteína quinasas mutantes de la
familia Src, tales como v-Src mutante; ii) Fyn
mutante; iii) c-Abl mutante; iv) CAMK II\alpha
mutante; v) CDK2 mutante; vi) Cdc28 mutante y vii) Fus3 mutante. Los
ejemplos específicos de proteína quinasas mutantes utilizados en los
procedimientos de la presente invención incluyen, pero sin
limitación, los siguientes: i) I338G v-Src; ii)
T339G Fyn; iii) T315A Abl; iv) F89G CAMK II\alpha; v) F80G CDK2;
vi) Cdc28-as1 y vii) Fus-as1.
Esta invención proporciona también un enfoque
general para sensibilizar a proteína quinasas ante moléculas
permeables en células que no inhiben ninguna proteína quinasa de
tipo salvaje. Utilizando este enfoque, se identifican inhibidores
potentes y específicos de dos clases estructurales de inhibidores
putativos para siete proteína quinasas de cinco subfamilias
distintas. Este enfoque puede utilizarse in vivo para generar
sistemáticamente alelos condicionales de proteína quinasas.
Esta invención proporciona también la quinasa
mutante Cdc28-as1 (análogo específico 1), que es
únicamente sensible a el inhibidor permeable en células
4-amino-1-(terc-butil)-3-(1'-naftilmetil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(1-NM-PP1). En células
cdc28-as1, la entrada en mitosis se inhibe
mediante bajas concentraciones de
1-NM-PP1, mientras que se requieren
concentraciones mayores de inhibidor para inducir la detención en
G1 que se observa típicamente en mutantes cdc28 sensibles a
la temperatura. El análisis transcripcional de todo el genoma
confirma que el tratamiento con
1-NM-PP1 de células
cdc28-as1 conduce a la inhibición del término
génica específica de G2/M, mientras que el tratamiento de células
de tipo salvaje no tiene efectos significativos. La generación del
mutante análogo específico cdc28-as1
proporciona así un procedimiento altamente específico para inhibir
la actividad Cdc28 en la célula, y demuestra la utilidad general
de este procedimiento en el análisis de proteína quinasas.
La Figura 1 es una representación esquemática de
las estructuras de dominios proteicos de v-Src, de
XD4 (que tiene una deleción de los residuos 77-225),
de la proteína de fusión con
glutation-S-transferasa
(GST)-XD4, y de la proteína de fusión
GST-XD4 mutante doble (V323A, I338A).
La Figura 2 es una representación esquemática del
trifosfato de adenosina (ATP), con un "X" unido en la posición
N^{6}; y en la tabla inferior se proporcionan
representaciones esquemáticas de las doce cadenas laterales que
toman el lugar de "X" en cada uno de los análogos de ATP
ortogonales descritos en los ejemplos (que se designan siempre por
los números 1-12).
Estos análogos son:
| 1-N^{6}(metoxi)ATP | 7-N^{6}(pirrolidino)ATP |
| 2-N^{6}(etoxi)ATP | 8-N^{6}(ciclopentil)ATP |
| 3-N^{6}(acetilo)ATP | 9-N^{6}(ciclopentiloxi)ATP |
| 4-N^{6}(isopropoxi)ATP | 10-N^{6}(piperidino)ATP |
| 5-N^{6}(bencil)ATP | 11-N^{6}(ciclohexil)ATP |
| 6-N^{6}(benciloxi)ATP | 12-N^{6}(ciclohexiloxi)ATP |
La Figura 3 es una inmunotransferencia
anti-fosfotirosina que muestra el nivel de
fosforilación de proteína tirosina después del tratamiento de un
lisado celular de linfocitos de murina con ATP o uno de los
análogos de ATP (A*TPs).
La Figura 4 proporciona una vista cercana del
modelo de rayos X que muestra el dominio de unión a ATP en la
proteína quinasa dependiente de AMPc (1 ATP).
Figuras 5A-C: La figura 5A
muestra una transferencia de anti-fosfotirosina de
lisados celulares que expresan XD4 y GST-XD4 (V323A,
I338A) La figura 5B muestra un autorradiograma que muestra los
niveles de fosforilación cuando se proporcionan a los lisados
celulares sólo ATP radiomarcado o sólo
N^{6}-(ciclopentil)-ATP radiomarcado. La
Figura 5C muestra un autorradiograma que muestra la
autofosforilación de GST-XD4 y
GST-XD4(V323A, I338A) mediante ATP
radiomarcado y N^{6}-(ciclopentil)-ATP
radiomarcado (A*TP(8)).
La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra
el grado relativo en que el ATP y cada uno de los doce análogos de
ATP inhibe la fosforilación catalizada por ATP radiomarcado de
GST-XD4 y GST-XD4 (V323A,
I338A).
Las Figuras 7A-7B muestran
autorradiogramas que indican los niveles de autofosforilación para
varias v-Src mutantes simples en la posición 338
cuando se proporcionan ATP radiomarcado y
N^{6}-(ciclopentil)-ATP radiomarcado como
sustrato donante de fosfato.
La Figura 8 es un diagrama esquemático de un
procedimiento de la presente invención para determinar qué sustratos
fosforilados en las células se fosforilaron por una quinasa
particular. En este caso v-src.
Las Figuras 9A-C muestran las
estructuras químicas de tres inhibidores de quinasa conocidos.
Damnacantal (A), PP1 (B) y CGP 57148 (C) junto con resúmenes de sus
constantes de inhibición (CI_{50}) para varias quinasas.
Figuras 10A-C: Las figuras 10A y
10B muestran las estructuras de una serie de sustituyentes
voluminosos que, cuando se añaden a N-4 de PP3 o a
N^{6} de difosfato de adenosina, o a N^{6} de
monofosfato de adenosina, o a N^{6} de adenosina (específicamente
N^{6}-ciclopentiloxiadenosina), producen
inhibidores de la quinasa v-Src(T120G)
mutante, que es una quinasa modificada por ingeniería genética de la
presente invención; las constantes de síntesis e inhibición (Figura
10C) para estos inhibidores se discute en el ejemplo 11
siguiente.
Las Figuras 11A-11B muestran la
estructura química de
N-4-ciclopentoíl-PP3,
y autorradiogramas de proteína electroforetizadas que se han
radiomarcado en presencia de
N-4-ciclopentoil-PP3
en presencia de v-Src de tipo salvaje o bien mutante
(I338G).
Figuras 12A-F: Las Figuras
12A-F describen un gráfico que presenta análogos de
inhibidores adicionales preparados y ensayados según la presente
invención.
| a. | 1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-ilamina. |
| b. | (1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)etilamina. |
| c. | (1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)propilamina. |
| d. | (1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)isobutilamina. |
| e. | (1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)ciclopentilmetilamina. |
| f. | (1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)furan-2-ilmetilamina. |
| g. | bencil-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| h. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)acetamida. |
| i. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)propionamida. |
| j. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)isobutiramida. |
| k. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)-2-fenilacetamida. |
| l. | (1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amida del ácido ciclobutanocarboxílico. |
| m. | (1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amida del ácido ciclopentanocarboxílico. |
| n. | (1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amida del ácido ciclohexanocarboxílico. |
| ñ. | (1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amida del ácido furan-2-carboxílico. |
| o. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)benzamida. |
| p. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)-4-metilbenzamida. |
| q. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)-4-etilbenzamida. |
| r. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)-4- isopropilbenzamida. |
| s. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)-4-propilbenzamida. |
| t. | 4-terc-butil-N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4- il)benzamida. |
| u. | (1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amida del ácido bifenil-4- carboxílico. |
| v. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)-4-clorobenzamida. |
| w. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)-3,4- diclorobenzamida. |
| x. | 1-terc-butil-3-para-tolil-1H-indazol-4-ilamina. |
| y. | (1-terc-butil-3-para-tolil-1H-indazol-4-il)ciclopentilamina. |
| z. | N-(1-terc-butil-3-para-tolil-1H-indazol-4-il)acetamida. |
| aa. | N-(1-terc-butil-3-fenil-1H-indazol-4-il)-2,2- dimetilpropionamida. |
| bb. | 1-metil-3-fenil-1H-indazol-4-ilamina. |
| cc. | sec-butil-(1-metil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| dd. | (1-etilpropil)-(1-metil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| ee. | (2-metilbutil)-(1-metil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| ff. | (3-metilbutil)-(1-metil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| gg. | ciclopentil-(1-metil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| hh. | ciclohexil-(1-metil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| ii. | (1-metil-3-fenil-1H-indazol-4-il)fenilamina. |
| jj. | (3-clorofenil)-(1-metil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| kk. | bencil-(1-metil-3-fenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| ll. | 4-cloro-1,3-difenil-1H-indazol. |
| mm. | 1,3-difenil-1H-indazol-4-ilamina. |
| nn. | (1,3-difenil-1H-indazol-4-il)propilamina. |
| ññ. | sec-butil-(1,3-difenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| oo. | (1,3-difenil-1H-indazol-4-il)-(1-etilpropil)amina. |
| pp. | (1,3-difenil-1H-indazol-4-il)-(2-metilbutil)amina. |
| qq. | (1,3-dimetilbutil)-(1,3-difenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| rr. | (3,3-dimetilbutil)-(1,3-difenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| ss. | (1,3-difenil-1H-indazol-4-il)dietilamina. |
| tt. | ciclopentil-(1,3-difenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| uu. | ciclohexil-(1,3-difenil-1H-indazol-4-il)amina. |
| vv. | (1,3-difenil-1H-indazol-4-il)fenilamina. |
| ww. | 1-bencil-4-cloro-3-fenil-1H-indazol. |
| xx. | 1-bencil-3-fenil-1H-indazol-4-ilamina. |
| yy. | (1-bencil-3-fenil-1H-indazol-4-il)-(1-etilpropil)amina. |
| zz. | (1-bencil-3-fenil-1H-indazol-4-il)-(1,3-dimetilbutil)amina. |
| aaa. | (1-bencil-3-fenil-1H-indazol-4-il)dietilamina. |
| bbb. | (1-bencil-3-fenil-1H-indazol-4-il)ciclopentilamina. |
| ccc. | (1-bencil-3-fenil-1H-indazol-4-il)ciclohexilamina. |
| ddd. | (1-bencil-3-fenil-1H-indazol-4-il)fenilamina. |
Figuras 13A-13B: La Figura 13A
indica una representación esquemática de los problemas de
especificidad asociados al uso de inhibidores de proteína quinasas
moléculas pequeñas para la desconvolución de la señalización
celular. Los dominios catalíticos de quinasa están altamente
conservados. Por tanto, la mayoría de inhibidores potentes bloquean
la actividad de quinasas estrechamente relacionadas y regulan
ampliamente de forma negativa las rutas mediadas por actividad
quinasa. La Figura 13B indica una representación esquemática del
enfoque frente a la inhibición selectiva de proteína quinasa
descrita aquí. Se introduce una mutación creadora de espacio en el
sitio de unión a ATP de la quinasa de elección (Src). Esta mutación
crea un bolsillo de sitio activo (muesca) en Src que puede
reconocerse únicamente por un inhibidor molécula pequeña diseñado
racionalmente. Este inhibidor contiene un grupo químico voluminoso
(saliente) que lo hace ortogonal a las proteínas quinasas de tipo
salvaje. El diseño del par complementario quinasa/inhibidor permite
una inhibición altamente selectiva de la quinasa diana en el
contexto de la célula entera.
Figuras 14A-14B: La Figura 14A
indica una estructura de N-6 ciclopentiloxiadenosina
(1). La Figura 14B indica la síntesis de inhibidor
pirazolo[3,4-d]pirimidina y análogos. 2 se sintetizó
según Hanefeld et al. (i) RCOCl (10 eq.), piridina, 5ºC, 1
h, después se calienta a 22ºC, 1 1 h (ii) LiAlH_{4} (3,0 eq.), THF
seco en atmósfera de argón, 0ºC, 30 min, después se calienta a
reflujo durante 30 min. Todos los compuestos se caracterizaron por
RMN-^{1}H (300 MHz) y espectrometría de masas de
alta resolución (IE).
Figuras 15A-15C: La Figura 15A
indica las estructuras químicas de quercetina (5) y AMP PNP (6). La
Figura 15B muestra la orientación de unión predicha de 2 en los
sitios activos de las quinasas de la familia src. Las estructuras
cristalinas de Hck unida a AMP PNP y Hck unida a quercetina se
superpusieron según la cadena principal de proteína de Hck. La
estructura de 2 se acopló posteriormente en el sitio activo de
quinasa superponiendo el sistema de anillo
pirazolo[3,4-d]pirimidina de 2 sobre el anillo
adenina de AMP PNP. La Figura 15C muestra el estrecho contacto
predicho entre N-4 de 2 y la cadena lateral del
residuo 338 en las quinasas de la familia src. La molécula 2 se ha
acoplado en el sitio de unión a ATP de la quinasa de la familia src,
Hck, como en la Figura 15B. Los hidrógenos de metilo de la cadena
lateral de treonina se muestran ahora. Las imágenes se generaron
utilizando el programa InsightII.
La Figura 16 muestra que el inhibidor 3g (Figura
14) bloquea la fosforilación de p36 en fibroblastos NIH3T3
transformados con I338G v-Src, pero no con WT
v-Src. Se incubaron células NIH3T3 no transformadas
(carril 1), células NIH3T3 transformadas con WT
v-Src (carriles 2-3) y células
NIH3T3 transformadas con I338G v-Src (carriles
4-5) con 1,1% de DMSO (carriles 1, 2 y 4) o 3g 100
\muM en 1,1% de DMSO (carriles 3 y 5). Después de 12 horas, las
células se lisaron. Los niveles de fosforilación se determinaron
como en la Figura 4.
Las Figuras 17A-J muestran que
los fibroblastos transformados con I338G v-Src
adquieren selectivamente una morfología aplanada y recuperan
selectivamente fibras de estrés de actina tras incubación con 3g
(Figura 14). Se trataron fibroblastos NIH3T3 no transformados (a,
b), transformados con WT v-Src (c, d, g, h) y
transformados con I338G v-SRc (e, f, i, j) con 1,1%
de DMSO (a, c, e, g, i) o análogo 3g 100 \muM en 1% de DMSO (d, f,
h, j). Después de 48 horas, las células se fotografiaron (a, c, f),
se tiñeron con faloidina-FITC y se visualizaron (b,
g, j) mediante microscopía de fluorescencia.
La Figura 18 indica la síntesis de análogos de
PP-1 derivatizados en C^{3}. Condiciones: (i) 2
eq. de NaH, 1 eq. de malonitrilo, THF, TA, 0,5 h; (ii) 5 eq. de
NaHCO_{3}, 5 eq. de sulfato de dimetilo, dioxano/H_{2}O (6/1),
80ºC, 1 h; (iii) 1 eq. de trietilamina, 1 eq. de clorhidrato de
terc-butilhidrazina, EtOH, reflujo, 1 h; (iv) formamida,
180ºC, 12 h.
La Figura 19 indica una representación
esquemática de la orientación de unión predicha de dos clases de
pirazolo[3,4-d]pirimidinas derivatizadas. Los
análogos que se derivatizaron en N^{4} pueden haber perdido
potencia debido a una interrupción de la red de enlaces de
hidrógeno de tipo ATP. Esta red está presumiblemente intacta en los
inhibidores derivatizados en C^{3}.
Figuras 20A-20B: La Figura 20A
muestra el efecto de 6a (figura 18) sobre la fosforilación de
tirosina en fibroblastos NIH3T3 que expresan v-Src
de tipo salvaje (carriles 1, 2) o I338G v-Src
(carriles 3-8). Las células se trataron con la
cantidad indicada de 6a (Figura 18) en 0,5% de DMSO durante 30 min y
se lisaron inmediatamente. Las proteínas celulares se separaron
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (al 10%) y se
transfirieron a nitrocelulosa. Las proteínas fosforiladas en
tirosina se visualizaron mediante inmunotransferencia con un
anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (4G10). La
Figura 20B muestra el efecto de 6a (Figura 18) sobre la
fosforilación de tirosina en células Jurkat de tipo salvaje. Se
incubaron 10^{6} células Jurkat a 37ºC durante 30 min en presencia
de 0,5% de DMSO (carriles 9, 10), 6a 500 nM (carril 11) o PPI 10
\muM (carril 12). Las células en los carriles
10-12 se trataron posteriormente con pervanadiato
0,5 mM durante 10 min antes de la lisis. Las proteínas fosforiladas
en tirosina se visualizaron como en la Figura 20A.
Figuras 21A-21B: Las Figuras 21A
y B muestran que los fibroblastos transformados con I338g
v-Src adquieren selectivamente una morfología
aplanada, y recuperan selectivamente estrés de actina tras
incubación con 6a (Figura 18). La Figura 21A muestra células NIH3T3
no transformadas. La Figura 21B muestra que células transformadas
con v-Src de tipo salvaje o bien I338G
v-Src se trataron con 0,5% de DMSO o 6a 250 mM en
0,5% de DMSO durante 16 horas. Todas las células se fijaron, se
tiñeron con faloidina-rodamina y se visualizaron
mediante microscopía confocal.
Figuras 22A-22B: La Figura 22A
muestra las estructuras químicas de (+)-K252a (1) y
(+)-estaurosporina (2). La Figura 22B muestra la
estructura cristalina de 2 unido a CDK (28). Se muestra CDK2 con la
cadena principal peptídica ilustrada como una cinta y la cadena
lateral F80 como palos. La estaurosporina se muestra con carbono,
nitrógeno y oxígeno. Los hidrógenos no se muestran.
Figuras 23A-C: La Figura 23A
indica un diagrama esquemático del ensayo de apareamiento utilizado
para ensayar la función Fus13. Las Figuras 23B y 23C muestran la
interrupción selectiva de levadura fus3-as1
apareada con (10) (Figura 28B) y (11) (Figura 28). Se hicieron
aparear S. cerevisiae URA3 his3 que expresaba Fus3 de tipo
salvaje, Fus3-as1 o sin Fus3 a DO_{600}= 0,5 con
un número igual de células ura3 HIS3
fus1\Deltafus2\Delta y se pipetearon sobre un disco de
nitrocelulosa. El disco se dispuso en una placa YPD que contenía
las cantidades indicadas de inhibidor durante 5 horas a 30ºC. Las
células se liberaron de los discos y se sembraron diluciones en
serie de los cultivos resultantes en medios carentes de uracilo e
histidina, se hicieron crecer durante 2 días a 30ºC y se estudiaron
las colonias. Para asegurar que (10) y (11) (Figura 28) no fueran no
selectivamente citotóxicas, todos los cultivos se sembraron también
en YPD. No se observó ninguna reducción significativa de las cfu/ml
en placas YPD para ninguna de las tres cepas en presencia de (10) u
(11) (Figura 28). La Figura 23B indica una fotografía de las placas
que carecen de histidina y uracilo que se inocularon con 0,1 ml de
los cultivos apareados de las siguientes cepas (de arriba abajo):
fus3\Delta, fus3, fus3 + 10 5 \muM,
fus3-as1, fus3-as1 +
(10) 5 \muM. La Figura 23C muestra que la interrupción del
apareamiento dependiente de Fus3 es selectiva y dependiente de la
dosis. Las barras indican las cfu/ml x 10^{-3} para levadura que
expresa Fus3 de tipo salvaje o Fus3-as1 a las
concentraciones de inhibidor indicadas. Las condiciones
experimentales son como las descritas anteriormente.
La Figura 24 muestra la estructura de
4-amino-1-(terc-butil)-3-(2'-naftilmetil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6j).
Las Figuras 25A-D indican que la
adición de 1-NM-PP1 500 nM causa una
caída en la transcripción de G2/M. Las Figuras 25A-C
muestran que se trató una población asíncrona de células
cdc28-as1 con
1-NM-PP1 durante 120 minutos. Se
midieron las diferencias transcripcionales en todo el genoma en
ausencia y presencia de inhibidor mediante análisis de
microconjuntos de oligonucleótidos de ARNm celular (127). Para
comparación, la Figura 25A muestra el porcentaje de genes cuya
transcripción es conocida por estar regulada durante el ciclo
celular (150). La Figura 25B muestra que los transcriptos se
redujeron más de 2,5 veces después del tratamiento con inhibidor. La
Figura 25C muestra los transcriptos que aumentan tras el
tratamiento con inhibidor. Los transcriptos se agrupan en las
listas y gráficos circulares según su regulación conocida del ciclo
celular (150). La Figura 25D muestra que los cambios en todo el
genoma del término génica se evaluaron en las cuatro comparaciones
siguientes: 1. células cdc28-as1 +
1-NM-PP1 500 nM se comparó con
células cdc28-as1 no tratadas (as1 +
500/as1); 2. células cdc28-as1 tratadas con
fármaco se compararon con células de tipo salvaje tratadas con
fármaco (as1 + 500/wt + 500); 3. células
cdc28-as1 no tratadas se compararon con
células de tipo salvaje (as1/wt): y 4. células de tipo
salvaje tratadas con fármaco se compararon con células de tipo
salvaje no tratadas (wt + 500 / wt). Para cada comparación, la
relación de expresión génica en las dos condiciones se convirtió en
su logaritmo natural. Se calculó el cambio logarítmico medio en el
término de todos los genes en cada uno de los grandes grupos del
ciclo celular (G1, S, S/G2, G2/M, M/G1), así como el de los genes
cuya expresión no está regulada por el ciclo (no reg.). Las barras
de error representan errores estándar de las medias.
Figuras 26A y 26B: (a) Clasificación,
especificidades de sustrato y funciones celulares de las proteínas
quinasas utilizadas en este ensayo, (b) Alineamiento de secuencias
de los residuos que rodean la posición 338 (numeración de
v-Src) para las proteínas quinasas enumeradas en
(a) (SEC nº ID 14-20).
Figura 27: Concentraciones inhibidoras al 50%
(CI_{50}, \muM) para K252a y análogos de K252a derivatizados
en
C(7) frente a un panel de proteína quinasas salvaje y modificadas racionalmente por ingeniería genética. Se muestran los valores de CI_{50} para los mejores valores de CI_{50} para el mejor par derivado de K252a/quinasa modificada por ingeniería genética. La purificación de quinasa y la medida de los valores de CI_{50} se realizaron esencialmente como se ha
C(7) frente a un panel de proteína quinasas salvaje y modificadas racionalmente por ingeniería genética. Se muestran los valores de CI_{50} para los mejores valores de CI_{50} para el mejor par derivado de K252a/quinasa modificada por ingeniería genética. La purificación de quinasa y la medida de los valores de CI_{50} se realizaron esencialmente como se ha
\hbox{descrito
(86).}
Figura 28: Concentraciones inhibidoras al 50%
(CI_{50}, \muM) para PP1 y análogos de PP1 derivatizados en
C(3)-fenilo frente a un panel de proteína
quinasas salvaje y modificadas racionalmente por ingeniería
genética. Se muestran los valores de CI_{50} para el mejor par de
derivado de PP1/quinasa modificada por ingeniería genética. Los
valores de purificación de quinasa y medida de CI_{50} se
realizaron esencialmente como se ha descrito (86).
Como es generalmente el caso en la biotecnología,
la descripción de la presente invención en la presente memoria
descriptiva ha requerido el uso de un número sustancial de términos
de la técnica. Aunque no es práctico hacerlo exhaustivamente, se
proporcionan aquí definiciones para algunos de estos términos por
facilidad de referencia. Las definiciones para los demás términos
aparecen también en otro lugar de la presente memoria, y estos no
se repiten aquí. Resulta importante observar que no se pretende dar
a los términos definidos aquí o en otro lugar de la presente memoria
un significado distinto que el que los expertos en la técnica
entenderían que tiene cuando se utiliza en el campo, y se
recomienda por lo tanto consultar también otras fuentes para
interpretar el significado de estos términos y otros definidos en
otros lugares de la presente memoria. Sin embargo, las definiciones
proporcionadas aquí y en otros lugares de la presente memoria deben
considerarse siempre para determinar el alcance y significado de los
términos definidos.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "enzima" significa cualquier sustancia macromolecular
de origen natural o sintético compuesta totalmente o en su mayoría
por proteína, que cataliza más o menos específicamente una o más
reacciones (bio)químicas. Las sustancias sobre las que pueden
actuar las enzimas son conocidas como "sustratos", para los
que la enzima posee una unión específica o "sitio activo". Las
enzimas pueden actuar también sobre estructuras macromoleculares
tales como fibras musculares y más "cargas" tales como
vesículas intracelulares. Dichas proteínas se denominan proteínas
motoras, dos clases de las cuales son miosina y quinesina.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "actividad catalítica de una enzima" se define como la
propiedad medida por el aumento de la velocidad de conversión de
una reacción química especificada que la enzima produce en un
sistema de ensayo.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "quinasa" significa cualquier enzima fosfotransferasa
que transfiere un grupo fosfato.
Como se utiliza en la presente memoria, al
expresión "proteína quinasa" significa cualquier enzima que
fosforila uno o más grupos hidroxilo o fenólicos en proteínas,
siendo el ATP el donante del grupo fosforilo.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "fosforilasa" significa cualquier enzima que cataliza
la retirada fosforolítica del residuo de glucosa terminal no
reductor de un glucano.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "fosforilasa quinasa" es sinónimo del término
"proteína quinasa fosforilasa", y significa cualquier enzima
fosforilasa que convierte fosforilasa b en fosforilasa a.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "fosforilasa fosfatasa" es sinónimo de "proteína
fosforilasa fosfatasa", y significa cualquier enzima fosforilasa
que convierte fosforilasa a en fosforilasa b.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "tirosina quinasa" es sinónimo del término "proteína
tirosina quinasa", y significa una enzima que transfiere el
fosfato terminal del ATP a un residuo de tirosina específico en su
proteína diana.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "transferasa" significa cualquier enzima que cataliza
la transferencia de un grupo, por ejemplo el grupo metilo, grupo
glicosilo, grupo acilo, que contienen fósforo u otros grupos.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "metiltransferasa" es sinónimo del término
"transmetilasa" y significa cualquiera de las enzimas que
cataliza la transferencia de un grupo metilo.
El término "inhibidor de baja afinidad"
designa una molécula pequeña que tiene una constante de unión
(CI_{50}) por la enzima diana mayor de aproximadamente 200 nM, y
por tanto necesitaría utilizarse a altas concentraciones en un
ensayo basado en célula o animal completo (una concentración mayor
de 50 \muM). Dichas altas concentraciones podrían inducir efectos
no específicos del fármaco que podrían enmascarar el papel
específico de la diana deseada del inhibidor.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "inhibidor específico mutante" se define como un
inhibidor que inhibe un tipo específico de enzima mutante.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "inhibidor monoespecífico" significa un inhibidor que
es capaz de reaccionar sólo con la enzima única especificada.
El término "inhibidor de alta afinidad"
designa una molécula pequeña que tiene una constante de unión
(CI_{50}) para la enzima diana de menos de aproximadamente 200
nM, y que la permite por tanto utilizarse a "bajas"
concentraciones en un ensayo basado en célula o animal entero (una
concentración menor de 50 \muM). A concentraciones menores, los
efectos no específicos de la molécula pequeña se reducirían,
permitiendo así evaluar una respuesta más real a la inhibición de
la quinasa diana.
El término "ortogonal" se utiliza en la
presente memoria para indicar un compuesto que es similar,
estructural y/o geométricamente, al sustrato natural para una
enzima dada, o a un inhibidor de la forma de tipo salvaje de la
enzima, pero que tiene diferencias en la estructura química que
hacen a ese compuesto menos capaz de unirse a la forma de tipo
salvaje de la enzima que el sustrato natural. Por sustrato
"natural", se quiere indicar que es el sustrato que se utiliza
por la forma de tipo salvaje de esa enzima. Los inhibidores
ortogonales de la presente invención pueden designarse de diferentes
modos en la presente memoria, por ejemplo a veces se designan como
"sustratos modificados", "inhibidores modificados",
"análogos", "derivados", sólo como "sustratos" o
"inhibidores" y quizás también por otros términos. Sin
embargo, en cualquier caso, se pretende el mismo significado. Por
supuesto, el significado de "ortogonal" y sus sinónimos se
explica adicionalmente en las descripciones de la invención
proporcionadas a continuación.
Los sustratos e inhibidores ortogonales putativos
de las realizaciones de la invención descritos en la presente
memoria se prepararon añadiendo sustituyentes voluminosos a un átomo
del sustrato natural de un inhibidor de quinasa conocido,
respectivamente. Sin embargo, la presente invención no está limitada
a ello. Por ejemplo, es posible preparar un sustrato ortogonal que
es menor que un inhibidor conocido del sustrato natural, por
ejemplo preparando un análogo que carece de uno o más átomos o
sustituyentes que están presentes en el sustrato natural. Con dichos
sustratos o inhibidores ortogonales putativos, podría mutarse la
enzima para contener uno o más aminoácidos que tuvieran cadenas
laterales más voluminosas que las encontradas en la secuencia
aminoacídica de tipo salvaje, de modo que cuando el sustrato o
inhibidor ortogonal se una, estas cadenas laterales aminoacídicas
más voluminosas rellenen o rellenen parcialmente el espacio extra
creado por los átomos o sustituyentes faltantes. De este modo, se
esperaría que el mutante se una y/o se inhiba por el sustrato o
inhibidor ortogonal, pero no utilizaría sustancialmente el sustrato
normal, debido a que los aminoácidos voluminosos añadidos presentan
un impedimento estérico a su unión. Dicho enfoque permitiría un
control altamente selectivo del mutante resultante.
Resulta importante tener en mente que aunque los
sustratos e inhibidores de los ejemplos de la presente memoria sean
de tipo no competitivo, esto no debería considerarse como una
limitación del alcance de la presente invención. Se conocen muchos
tipos diferentes de sustratos e inhibidores de enzimas, por ejemplo
inhibidores competitivos, no competitivos, acompetitivos,
"suicidas", etc. Los inhibidores competitivos compiten con un
sustrato por su sitio de unión, pero puesto que el inhibidor no
puede participar en la reacción catalítica que la enzima lleva a
cabo, retardan la catálisis. Los inhibidores no competitivos se
unen al sitio activo, pero después se unen covalente o iónicamente
a la estructura proteica de la enzima de tal modo que no pueden
salir. Por tanto, inhiben la catálisis sacando en conjunto
moléculas de enzima de la reacción. Pueden encontrarse
descripciones más detalladas de estos y otros mecanismos
competitivos en una serie de fuentes (por ejemplo 72). Al aplicar
el conocimiento de la técnica respecto a dichos mecanismos al
diseño de inhibidores de la presente invención, podrían prepararse
todos dichos tipos de inhibidor.
Por ejemplo, un análogo que puede unirse, pero no
reaccionar, proporcionaría una inhibición competitiva, y un análogo
que se une covalentemente a la enzima tras la unión, sería un
inhibidor no competitivo, concretamente un veneno. Todos dichos
tipos de inhibidores están dentro del alcance de la presente
invención.
El término "homólogo a" se ha utilizado para
describir cómo la información acerca de cómo modificar una enzima
puede deducirse de la información referente a la estructura
tridimensional de otras enzimas relacionadas. Como los expertos en
la técnica conocerán bien, una parte de una enzima que es
"homóloga" a parte de una segunda enzima tiene una secuencia
proteica que está relacionada con la de la segunda enzima. Esta
relación es tal que tienen una serie de aminoácidos en la misma
localización relativa entre sí. Por ejemplo, la secuencia
imaginaria
Asp-Met-Phe-Arg-Asp-Lys-Glu
(SEC Nº ID 10) y la secuencia imaginaria
Asp-Met-Ile-Arg-Glu-Lys-Asp
(SEC Nº ID 11) tienen cuatro aminoácidos en la misma localización
relativa, y tres que son diferentes, y se diría que tienen
secuencias homólogas. Obsérvese que los tres aminoácidos que son
diferentes entre las cadenas son diferencias "conservativas"
porque las sustituciones en la segunda secuencia respecto a la
primera son con aminoácidos que tienen funcionalidades similares en
sus cadenas laterales. Por ejemplo, Glu y Arg tienen ambos grupos
cargados y tanto Phe como Ile son hidrófobos. Aunque este es a
menudo el caso con secuencias proteicas homólogas, no tiene porqué
ser el caso, y estas dos secuencias imaginarias seguirían
considerándose homólogas incluso si las diferencias no fueran
conservativas. La referencia 71 proporciona una buena revisión de
cuáles dominios de las quinasas conocidas se consideran por la
técnica que son "homólogas". Además, aunque la técnica puede
no coincidir generalmente, se pretende aquí que las secuencias que
son idénticas entre sí sean consideradas "homólogas" entre
sí.
El término "dominio" es también bien
conocido en la técnica, y designa una región en una proteína que se
ha identificado que tiene una funcionalidad particular. Por
ejemplo, los tres dominios en las proteínas quinasas se han
discutido en otro lugar de la presente memoria, y se han discutido
sus papeles funcionales. A menudo, como es el caso con las
quinasas, diferentes enzimas de la misma familia tendrán el mismo
número de dominios, sirviendo cada uno para la misma función, y
están dispuestos a menudo (pero probablemente no siempre) en el
mismo orden a lo largo de la secuencia proteica. De forma
interesante, como es el caso para las quinasas, una enzima puede
tener una longitud diferente de secuencia proteica entre sus
dominios que otra. Sin embargo, puesto que los dominios de las dos
enzimas relacionadas son generalmente (pero probablemente no
siempre) homólogos entre sí, esto no impide generalmente la
identificación de los correspondientes dominios.
Al describir los aspectos amplios de la presente
invención, se utilizan los términos "multisustrato" o
"enzima multisustrato". Estos términos son sinónimos y se
pretende que signifiquen enzimas que se unen a dos o más sustratos.
Las enzimas multisustrato de más interés aquí son aquellas que unen
catalíticamente al menos a parte de un sustrato al menos a otro
sustrato. Las quinasas y transferasas no son más que dos familias de
dichas enzimas multisustrato, y los expertos en la técnica
reconocerán fácilmente que existen otras de dichas enzimas y
familias de enzimas.
El término "reconocer" se utiliza a veces
aquí para describir la capacidad de un sustrato de unirse
específicamente al sitio activo en una enzima. Esto designa
simplemente el hecho de que un sustrato enzimático (o a veces
derivados de sustrato o incluso compuestos completamente diferentes
que imitan al sustrato) pueden ponerse en contacto y unirse al
sitio activo de la enzima, pero otros compuestos no. Este concepto
es bien conocido en la técnica. Los enzimólogos a menudo dicen que
la enzima tiene afinidad por su sustrato, o que el sustrato tiene
afinidad por la enzima. También dicen que una enzima tiene una
"especificidad de sustrato". Todo esto describe realmente el
mismo fenómeno.
Un término relacionado es el término "unir".
Un inhibidor generalmente se une, o se pega, a un sitio activo
mediante uno o más enlaces hidrófobos, hidrófilos, de hidrógeno y/o
iónicos, o en el caso de inhibidores no competitivos, mediante
enlaces covalentes. Aunque la compleja comprensión en la técnica
respecto a la unión de inhibidor y las razones para la inhibición
pueden ser de interés, dicha comprensión no es esencial para
comprender la presente invención. Es suficiente con observar
simplemente que la unión por un inhibidor causa la inhibición de la
reacción catalítica.
Los términos "mutante" y "forma modificada
por ingeniería genética", cuando se utilizan para describir las
enzimas de la presente invención, significan simplemente que tienen
secuencias que tienen un aminoácido diferente en una o más
posiciones cuando se comparan con la secuencia de la enzima de tipo
salvaje. Al describir dichos mutantes, dos letras separadas por un
número indican las mutaciones de aminoácidos realizadas. Las letras
son códigos de aminoácidos de una letra, y los números son las
posiciones de los residuos aminoacídicos en la enzima intacta de
tipo salvaje. Por ejemplo, GST-XD4 es una proteína
de fusión que contiene un fragmento, XD4, que tiene la misma
secuencia que una parte específica de la v-Src de
tipo salvaje. En la referencia GST-XD4(V323A,
I338A), la valina en la secuencia del fragmento XD4 de
v-Src que representa la posición 323 en la
secuencia de v-Src de tipo salvaje completa ha sido
reemplazada por alanina, y la isoleucina en el fragmento XD4 que
representa la posición 338 en la secuencia de v-Src
de tipo salvaje completa ha sido reemplazada por alanina. Por
tanto, los términos "mutante" y "forma modificada por
ingeniería genética" comprenden porciones de la enzima de tipo
salvaje que contienen el aminoácido o aminoácidos mutados.
El término "A*TP" designa una forma de ATP
en la que se añaden átomos o grupos de átomos adicionales a una o
más posiciones de la estructura del ATP. Además, A*TP significa un
análogo de ATP que tiene uno o más de sus átomos retirados para
formar una molécula que es menor que el ATP mismo. A*TP no significa
necesariamente un análogo no natural de ATP, por ejemplo GPT podría
ser considerado un análogo de ATP con los fines de esta
definición.
La expresión "mutación del sitio activo
funcionalmente silenciosa" significa que la mutación no
desestabiliza el papel celular normal de la proteína. En otras
palabras, el mutante "funcionalmente silencioso" debe ser
completamente capaz, o al menos significativamente capaz, de
reemplazar el papel biológico de la proteína de tipo salvaje. Por
ejemplo, si se crea una célula u organismo en el que la forma de
tipo salvaje de la proteína está ausente y después se añade la
forma "funcionalmente silenciosa" de la enzima a esta célula u
organismo, esta célula u organismo "que contiene mutante" debe
ser muy similar si no idéntico en comportamiento (mediante cualquier
ensayo apropiado) que la forma no modificada original de la célula
u organismo.
Esta invención proporciona inhibidores
específicos de proteína quinasa. Los inhibidores selectivos de
proteína quinasas son altamente buscados como herramientas para
estudiar las cascadas de transducción de señal, aunque se han
descubierto pocos debido al plegamiento altamente conservado de los
dominios catalíticos de quinasa. Mediante una combinación de
síntesis de moléculas pequeñas y mutagénesis de proteínas, se ha
identificado un inhibidor específico único altamente potente
(CI_{50}= 1,5 nM)
(4-amino-1-terc-
butil)-3-(1'-naftil)pirazolo[3,4-d]pirimidina)
de una proteína quinasa v-Src modificada
racionalmente por ingeniería genética (Ile338Gly
v-Src). Tanto la potencia como la especificidad de
este compuesto sobrepasan las de cualquier inhibidor de proteína
quinasa de la familia de Src conocido. La molécula inhibe
fuertemente la v-Src modificada por ingeniería
genética en células enteras, pero no inhibe la fosforilación de
tirosina en células que expresan sólo proteína quinasas de tipo
salvaje. Además, el inhibidor desestabiliza selectivamente la
transformación en células que expresan la v-Src
diana. La degeneración estructural del sitio activo de quinasa debe
permitir que la misma estrategia de diseño inhibidor/proteína
complementarios sea ampliamente aplicable para toda esta
superfamilia de enzimas. Por tanto, esta invención proporciona
tirosina y ser/thr quinasas mutantes.
\newpage
Esta invención proporciona proteína quinasas
mutantes que son sensibles a los inhibidores permeables en células
descritos. Las proteínas quinasas mutantes pertenecen a las
siguientes subfamilias: familia Src (v-Src, Fyn),
familia Ab1 (c-Ab1), familia dependiente de
Ca^{+2}/calmodulina (CAMK II\alpha) y familia dependiente de
ciclina (CDK2 y Cdc28).
La presente invención proporciona un inhibidor de
proteína quinasa representado por la siguiente fórmula I:
en la que R es un 1'-naftilo,
2'-naftilo, m-fenoxifenilo,
m-benciloxifenilo,
m-(2',6'-dicloro)benciloxifenilo,
3-piperonilo,
p-terc-butilfenilo,
1'-naftilmetilo, 1'-naftoximetilo o
2'-naftilmetilo.
En una realización, el naftilo es una
naftilpirazolopirimidina. En otra realización, el inhibidor de
proteína quinasa se representa por la fórmula 6a como se indica en
la Figura 18. En otra realización, el inhibidor de proteína quinasa
se representa por la fórmula 6b como se indica en la Figura 18. En
otra realización, el m-fenoxifenilo es una
m-fenoxifenilpirazolopirimidina. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6c como
se indica en la Figura 18. En otra realización, el
m-benciloxifenilo es una
m-benciloxifenilpirazolopirimidina. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6d como
se indica en la Figura 18. En otra realización, el
m-diclorobenciloxifenilo es una
m-diclorobenciloxifenilpirazolo-pirimidina.
En otra realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa
por la fórmula 6d como se indica en la Figura 18. En otra
realización, el m-diclorobenciloxifenilo es una
m-diclorobenciloxifenilpirazolopirimidina. En otra
realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa por la
fórmula 6e como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
3-piperonilo es
3-piperonilpirazolopirimidina. En otra realización,
el inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6f
como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
p-terc-butilfenilo es una
p-terc-butilfenilpirazolopirimidina. En otra
realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa por la
fórmula 6g como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
naftilmetilo es una naftilmetilpirazolopirimidina. En otra
realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa por la
fórmula 6h como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6j como
se indica en la Figura 24. En otra realización, el naftoximetilo es
una naftoximetilpirazolopirimidina. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6i como
se indica en la Figura 18.
Esta invención proporciona un inhibidor de la
familia de quinasas src, siendo el inhibidor:
4-amino-1-(terc-butil)-3-(1'-naftil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6a);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(2'-naftil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6b);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(m-fenoxifenil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6c);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(m-benciloxfenil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6d);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(m-(2',6'-dicloro)benciloxifenil)pirazolo
[3,4-d]pirimidina (6e);
4-amino-1-(terc-butil)-3-piperonilpirazolo[3,4-d]pirimidina
(6f);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(p-terc-butilfenil)pirazolo
[3,4-d]pirimidina (6g);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(1'-naftilmetil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6h);
4-amino-(terc-butil)-3-(1'-naftoximetil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6i); o
4-amino-1-(terc-butil)-3-(2'-naftilmetil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6j).
Como se demuestra en la presente memoria, todos
los materiales de partida y reactivos sintéticos se adquirieron de
suministradores comerciales a menos que se indique otra cosa. Los
cloruros de ácido que no estaban comercialmente disponibles (3c,
3d, 3e, 3h, 3i) se sintetizaron tratando los correspondientes ácidos
carboxílicos con cloruro de oxalilo en exceso y DMF catalítica en
dietiléter. Todos los análogos de PP1 se sintetizaron según
Henefeld et al.. El grupo de los inhibidores modificados se
examinó frente al dominio catalítico de la quinasa diana, I338G
v-Src, que se expresó en bacterias y se purificó en
forma de una proteína de fusión con
glutation-S-transferasa (GST). Todos
los análogos derivatizados de C^{3} son inhibidores más potentes
de I338G v-Src que la molécula más potente
(compuesto 3g, CI_{50}= 430 nM, Fig. 14) identificada del panel de
primera generación de compuestos derivatizados de N^{4}
(véase la Fig. 14). Cuatro de las moléculas (6a, 6b, 6d, 6h)
inhiben la quinasa diana a concentraciones nM bajas, exhibiendo los
dos isómeros de naftilo (6a, 6b) la mayor potencia (CI_{50}= 1,5
nM). En las condiciones de estos ensayos, la molécula original,
PPI, inhibió su diana óptima, Fyn, a sólo CI_{50}= 30 nM. Este
dato muestra que una estrategia de diseño de inhibidor que combina
ingeniería genética enzimática con síntesis dirigida de moléculas
pequeñas puede no sólo igualar la potencia de moléculas
identificadas mediante el examen de grandes bibliotecas, sino que
puede conducir a un aumento significativo (20 veces en el caso de
6a, 6b) de la afinidad frente a inhibidores previamente optimizados
de quinasa de tipo salvaje. Los compuestos que tienen la fórmula 6a
y 6b son los inhibidores más potentes de cualquier proteína quinasa
de la familia Src que se han reseñado hasta la fecha. Los
compuestos 6h y 6j son más ortogonales con las quinasas de tipo
salvaje y son de potencia media. No son tan potentes como 6a y 6b,
pero puesto que se unen muy mal a quinasas de tipo salvaje, son muy
útiles en última instancia para inhibir quinasas mutantes.
La presente invención proporciona una composición
farmacéutica que comprende un inhibidor de proteína quinasa
representado por la siguiente fórmula I:
en la que R es un 1'-naftilo,
2'-nafilo, m-fenoxifenilo,
m-benciloxifenilo,
m-(2,6-dicloro)benciloxifenilo,
3-piperonilo,
p-terc-butilfenilo,
1'-naftilmetilo, 1'-naftoximetilo o
2'-naftilmetilo; y un diluyente o vehículo
adecuado.
En una realización, el naftilo es una
naftilpirazolopirimidina. En otra realización, el inhibidor de
proteína quinasa se representa por la fórmula 6a como se indica en
la Figura 18. En otra realización, el inhibidor de proteína quinasa
se representa por la fórmula 6b como se indica en la Figura 18. En
otra realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa
por la fórmula 6c como se indica en la Figura 18. En otra
realización, el m-benciloxifenilo es una
m-benciloxifenilpirazolopirimidina. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6d como
se indica en la Figura 18. En otra realización, el
m-diclorobenciloxifenilo es una
m-diclorobenciloxifenilpirazolo-pirimidina.
En otra realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa
por la fórmula 6e como se indica en la Figura 18. En otra
realización, el 3-piperonilo es
3-piperonilpirazolopirimidina. En otra realización,
el inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6f
como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
p-terc-butilfenilo es una
p-terc-butilfenilpirazolopirimidina. En otra
realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa por la
fórmula 6g como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
naftilmetilo es una naftilmetilpirazolopirimidina. En otra
realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa por la
fórmula 6h como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6j como
se indica en la Figura 24. En otra realización, el naftoximetilo es
una naftoximetilpirazolopirimidina. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6i como
se indica en la Figura 18.
Esta invención proporciona una composición
farmacéutica que comprende un inhibidor de la familia de quinasas
src, siendo el inhibidor:
4-amino-1-(terc-butil)-3-(1'-naftil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6a);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(2'-naftil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6b);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(m-fenoxifenil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6c);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(m-benciloxifenil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6d);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(m-(2',6'-dicloro)benciloxifenil)pirazolo
[3,4-d]pirimidina (6e);
4-amino-1-(terc-butil)-3-piperonilpirazolo[3,4-d]pirimidina
(6f);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(p-terc-butilfenil)pirazolo[3,
4-d]pirimidina (6g);
4-amino-1-(terc-butil)-3-(1'-naftilmetil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6h);
4-amino-(terc-butil)-3-(1'-naftoximetil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6i); o
4-amino-1-(terc-butil)-3-(2'-naftilmetil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(6j); y un vehículo o diluyente adecuado.
Esta invención proporciona un procedimiento de
interrupción de la transformación en una célula que expresa la
v-Src mutante diana, que comprende poner en
contacto la célula con un inhibidor de proteína quinasa representado
por la siguiente fórmula I:
en la que R es un 1'-naftilo,
2'-nafilo, m-fenoxifenilo,
m-benciloxifenilo,
m-(2',6'-dicloro)benciloxifenilo,
3-piperonilo,
p-terc-butilfenilo,
1'-naftilmetilo, 1'-naftoximetilo o
2'-naftilmetilo.
En una realización, el naftilo es una
naftilpirazolopirimidina. En otra realización, el inhibidor de
proteína quinasa se representa por la fórmula 6a como se indica en
la Figura 18. En otra realización, el inhibidor de proteína quinasa
se representa por la fórmula 6b como se indica en la Figura 18. En
otra realización, el m-fenoxifenilo es una
m-fenoxifenilpirazolopirimidina. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6c como
se indica en la Figura 18. En otra realización, el
m-benciloxifenilo es una
m-benciloxifenilpirazolopirimidina. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6d como
se indica en la Figura 18. En otra realización, el
m-diclorobenciloxifenilo es una
m-diclorobenciloxifenilpirazolopirimidina. En otra
realización, el 3-piperonilo es
3-piperonilpirazolopirimidina. En otra realización,
el inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6f
como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
p-terc-butilfenilo es una
p-terc-butilfenilpirazolopirimidina. En otra
realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa por la
fórmula 6g como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
naftilmetilo es una naftilmetilpirazolopirimidina. En otra
realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa por la
fórmula 6h como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6j como
se indica en la Figura 24. En otra realización, el naftoximetilo es
una naftoximetilpirazolopirimidina. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6i como
se indica en la Figura 18.
Esta invención proporciona un procedimiento de
interrupción de la transformación en una célula que expresa la
v-Src mutante diana, que comprende poner en
contacto la célula con una composición farmacéutica que comprende un
inhibidor de proteína quinasa representado por la siguiente fórmula
I:
\newpage
en la que R es un 1'-naftilo,
2'-nafilo, m-fenoxifenilo,
m-benciloxifenilo,
m-(2',6'-dicloro)benciloxifenilo,
3-piperonilo,
p-terc-butilfenilo,
1'-naftilmetilo, 1'-naftoximetilo o
2'-naftilmetilo; y un diluyente o vehículo
adecuado.
En una realización, el naftilo es una
naftilpirazolopirimidina. En otra realización, el inhibidor de
proteína quinasa se representa por la fórmula 6a como se indica en
la Figura 18. En otra realización, el inhibidor de proteína quinasa
se representa por la fórmula 6b como se indica en la Figura 18. En
otra realización, el m-fenoxifenilo es una
m-fenoxifenilpirazolopirimidina. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6c como
se indica en la Figura 18. En otra realización, el inhibidor de
proteína quinasa se representa por la fórmula 6d como se indica en
la Figura 18. En otra realización, el
m-diclorobenciloxifenilo es una
m-diclorobenciloxifenilpirazolo-pirimidina.
En otra realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa
por la fórmula 6e como se indica en la Figura 18. En otra
realización, el 3-piperonilo es
3-piperonilpirazolopirimidina. En otra realización,
el inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6f
como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
p-terc-butilfenilo es una
p-terc-butilfenilpirazolopirimidina. En otra
realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa por la
fórmula 6g como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
naftilmetilo es una naftilmetilpirazolopirimidina. En otra
realización, el inhibidor de proteína quinasa se representa por la
fórmula 6h como se indica en la Figura 18. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6j como
se indica en la Figura 24. En otra realización, el naftoximetilo es
una naftoximetilpirazolopirimidina. En otra realización, el
inhibidor de proteína quinasa se representa por la fórmula 6i como
se indica en la Figura 18.
Como se demuestra en la presente memoria, las
células que expresan v-Src de tipo salvaje que se
tratan con 6a parecen indistinguibles de las células de tipo salvaje
no tratadas, sugiriendo que 6a no tiene efecto sobre esta línea
celular no mutante. Sin embargo, las células que expresan la quinasa
diana tienen claras fibras de actina y parecen indistinguibles de
fibroblastos NIH3T3 normales cuando se incuban con 6a 250 nM
durante 16 horas. A partir de este dato, resulta evidente que la
inhibición por molécula pequeña de la actividad catalítica
v-Src es suficiente para bloquear su papel en la
oncogénesis.
Los compuestos de la presente invención pueden
incluir marcajes o marcadores tales como tintes fluorescentes en un
intervalo de colores azul, rojo, verde, amarillo, y especialmente
de colores azul y verde. El color de fluorescencia puede ser
diferente del color de absorción. Los pigmentos fluorescentes poseen
una alta luminiscencia y ventajosas propiedades de aplicación, por
ejemplo una alta rapidez lumínica y una baja tendencia migratoria.
La posesión de propiedades fluorescentes posibilita además el uso de
los compuestos de la presente invención en una serie de
aplicaciones médicas, farmacéuticas y de diagnóstico. Los
compuestos de la presente invención pueden utilizarse también para
marcar diversos agentes terapéuticos para posibilitar su disposición
en el cuerpo. Como tales, la terapia con dichos agentes
terapéuticos marcados puede controlarse estrechamente con respecto
a los órganos y tejidos diana. Esto es particularmente útil en el
tratamiento de diversos cánceres, especialmente aquellos de tipo
tumor sólido, en los que la localización del agente
quimioterapéutico es extremadamente importante y la dosificación
debida a la posibilidad de efectos secundarios debe controlarse
estrechamente.
Los inhibidores de la presente invención
pertenecen a la familia de las pirazolopirimidinas (patente de
EE.UU. nº 5.593.997). Las pirazolopirimidinas son útiles en el
tratamiento y la prevención de enfermedades respiratorias
representadas por asma (patente de EE.UU. nº 5.942.515). Además, se
han utilizado derivados de aminopirazolopirimidina como inhibidores
de proteína quinasa para inhibir la proliferación celular, y son
por tanto útiles en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares
y urogenitales (documento DE 19709126) y para tratar isquemia,
artritis y dolor (documento WO 96/ 40707). Por tanto, los
inhibidores de la presente invención se espera que tengan también
aplicaciones terapéuticas.
Además, la presente invención proporciona una
solución a los problemas anteriormente descritos al proporcionar
materiales y procedimientos mediante los que una sola proteína
quinasa puede inhibirse específicamente sin la inhibición
simultánea de otra proteína quinasa.
En un primer aspecto, la presente invención
implica la modificación por ingeniería genética de quinasas y otras
enzimas multisustrato de tal modo que puedan utilizar sustratos
modificados que no se utilizan tan fácilmente por sus formas de tipo
salvaje. La invención proporciona además dichos sustratos trifosfato
de nucleótido químicamente modificados, procedimientos para
prepararlos y procedimientos para utilizarlos. Los procedimientos de
la presente invención incluyen procedimientos para uso de los
sustratos modificados junto con la quinasa modificada por
ingeniería genética para identificar sobre cuáles sustratos proteína
actúa la quinasa, para medir la extensión de dicha acción y para
determinar si los compuestos de ensayo pueden modular dicha
acción.
En un aspecto adicional, la invención proporciona
proteína quinasas modificadas por ingeniería genética que pueden
unir inhibidores que no se unen tan fácilmente por las formas de
tipo salvaje de estas enzimas. Se proporcionan también los
procedimientos de preparación y uso de dichas quinasas modificadas
por ingeniería genética. La invención proporciona además dichos
inhibidores, procedimientos para prepararlos y procedimientos para
utilizarlos. Los procedimientos de la presente invención incluyen
procedimientos para utilizar los inhibidores junto con la quinasa
modificada por ingeniería genética para identificar sobre cuáles
sustratos proteína actúa la quinasa, para medir la cinética de cada
acción, y para determinar los efectos bioquímicos y celulares de
dicha inhibición. Se refieren también al uso de dichos inhibidores
y quinasa modificada por ingeniería genética para elucidar cuál
quinasa puede estar implicada en la enfermedad; estas quinasas
pueden convertirse en el sujeto de esfuerzos para diseñar o
descubrir inhibidores específicos más tradicionales de sus formas
de tipo salvaje, lo que puede probarse valioso para tratar la
enfermedad o trastorno asociado a la quinasa.
Además, se proporcionan procedimientos para
insertar la quinasa modificada por ingeniería genética en células,
preferiblemente en lugar de la correspondiente quinasa de tipo
salvaje, y utilizar después el inhibidor para el que se ha adaptado
como herramienta para el estudio de la relación
enfermedad-quinasa, y en última instancia, como
fármaco para el tratamiento de la enfermedad.
La presente invención se refiere también más
generalmente a formas modificadas por ingeniería genética de enzimas
multisustrato que unen covalentemente una parte de o todo al menos
un sustrato (donante) al menos a otro sustrato (receptor). Estas
formas modificadas por ingeniería genética aceptarán sustratos e
inhibidores modificados que no se unen fácilmente por las formas de
tipo salvaje de estas enzimas.
La invención se refiere también a procedimientos
para preparar y utilizar dichas enzimas modificadas por ingeniería
genética así como sustratos donantes modificados. Los
procedimientos de la presente invención incluyen procedimientos para
utilizar los sustratos e inhibidores modificados junto con las
enzimas modificadas por ingeniería genética para identificar sobre
cuáles sustratos actúan las enzimas, para medir la cinética de
dicha acción, y en el caso de los sustratos modificados, para
determinar los sustratos receptores a los que se unen una parte de
o todo el sustrato donante, para medir la extensión de dicha
acción, y para identificar y medir la extensión de la modulación de
la misma por los compuestos de ensayo.
En el caso de inhibidores, los procedimientos
buscan determinar los efectos bioquímicos y celulares de dicha
inhibición. Los procedimientos se extienden también al uso de
dichos inhibidores y enzimas modificadas por ingeniería genética
para elucidar cuáles enzimas pueden estar implicadas en la
enfermedad; estas enzimas pueden convertirse en el sujeto de
esfuerzos por diseñar o descubrir inhibidores específicos de sus
formas de tipo salvaje, que pueden probarse valiosas para tratar la
enfermedad o trastorno relacionado con enzimas. Además, se
proporcionan procedimientos para insertar la enzima modificada por
ingeniería genética en células, preferiblemente en lugar de la
enzima de tipo salvaje correspondiente, y utilizar después el
inhibidor para el que se ha adaptado como herramienta para el
estudio de la relación enfermedad-enzima, y en
última instancia, como fármaco para el tratamiento de la
enfermedad.
Según la presente invención, mediante la
ingeniería genética enzimática, puede hacerse una distinción
estructural entre el sitio de unión a nucleótidos de una proteína
quinasa de interés y los sitios de unión a nucleótidos de otra
quinasa. Esta distinción permite a la quinasa modificada por
ingeniería genética utilizar un trifosfato de nucleótido o un
inhibidor que no se une tan fácilmente por la forma de tipo salvaje
de esa quinasa, o por otra quinasa. En una realización preferida
con respecto al inhibidor, el inhibidor utilizado es aquel que es
"ortogonal" al sustrato trifosfato de nucleótido
"natural" para esa quinasa, o que es ortogonal a un inhibidor
menos específico (por ejemplo uno que se une fácilmente por la
forma de tipo salvaje de esa quinasa). El término "ortogonal",
como se discute anteriormente, significa que el sustrato o inhibidor
es de estructura similar (incluyendo aquellos que son
geométricamente similares pero no químicamente similares, como se
describe a continuación), pero difieren en un modo que limita su
capacidad de unirse a la forma de tipo salvaje.
Una quinasa modificada por ingeniería genética
preparada según la presente invención será capaz de utilizar un
sustrato trifosfato de nucleótido ortogonal que no se utiliza tan
fácilmente por otras quinasas no modificadas por ingeniería genética
presentes en las células. Preferiblemente, será capaz de utilizar
un trifosfato de nucleótido ortogonal que no se utiliza
sustancialmente por otras quinasas; y lo más preferiblemente será
capaz de utilizar un trifosfato de nucleótido ortogonal que no puede
utilizarse por ninguna otra quinasa. Al marcar el fosfato en el
sustrato ortogonal, por ejemplo utilizando fósforo radiactivo
(P^{32}), y añadir después ese sustrato marcado a células
permeabilizadas o extractos celulares, los sustratos proteína de la
quinasa modificada por ingeniería genética se marcarán, mientras
que los sustratos proteína de otras quinasas se marcarán al menos
en un grado menor; preferiblemente los sustratos proteína de otras
quinasas no se marcarán sustancialmente, y lo más preferiblemente
no se marcarán en absoluto.
La descripción detallada y los ejemplos
proporcionados a continuación describen el uso de esta estrategia
para marcar únicamente los sustratos directos de la proteína
quinasa prototípica, v-Src. Mediante la ingeniería
genética de proteínas, se ha realizado una diferencia química en la
secuencia aminoacídica que confiere una distinción estructural
entre el sitio de unión a nucleótidos de la v-Src
modificada y el de todas las otras quinasas. La quinasa
v-Src se modificó por ingeniería genética para
reconocer un análogo de ATP (A*TP),
N^{6}-(ciclopentil)ATP, que es ortogonal al sustrato
de nucleótido de la quinasa de tipo salvaje. La generación de un
mutante de v-Src con especificidad por un sustrato
A*TP ortogonal permite que los sustratos directos de
v-Src únicamente se marquen radiactivamente
utilizando [\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP, debido a que
puede servir como sustrato para la quinasa v-Src
modificada por ingeniería genética, pero no puede sustancialmente
servir como sustrato para otras quinasas celulares.
La descripción detallada y los ejemplos
proporcionados a continuación describen el uso de esta estrategia
para identificar únicamente los sustratos directos de la proteína
quinasa prototípica, v-Src. Mediante la ingeniería
genética de proteínas, se ha realizado una diferencia química en la
secuencia aminoacídica que confiere una nueva distinción
estructural entre el sitio de unión a nucleótidos de la
v-Src modificada y el de todas las otras quinasas.
La quinasa v-Src modificada por ingeniería genética
que se ha preparado y presentado en la presente memoria se une a un
análogo ortogonal del inhibidor de quinasa más general
PP-3: el compuesto N-4
ciclopentil-PP3 (Fig. 11A). La generación de una
v-Src mutante con especificidad por dicho inhibidor
permite inhibir el mutante, mientras que otras quinasas en el mismo
sistema de ensayo no se inhiben sustancialmente, ni siquiera la
forma de tipo salvaje de la misma quinasa.
Como resulta evidente de lo anterior, es un
objeto de la presente invención proporcionar una proteína quinasa
mutante que acepta un análogo de trifosfato de nucleótido ortogonal
como sustrato donante de fosfato. Es otro objeto de la presente
invención proporcionar una secuencia nucleotídica que codifica dicha
proteína quinasa mutante, y es un objeto adicional proporcionar un
procedimiento para producir dicha secuencia de ácido nucleico. Es
también un objeto de la invención proporcionar procedimientos para
producir dicha proteína quinasa mutante, por ejemplo expresando
dicha secuencia de ácido nucleico. Es también un objeto de la
presente invención proporcionar dichos trifosfatos de nucleótido
ortogonales y procedimientos para su síntesis, incluyendo
N^{6}-(ciclopentil)-ATP,
N^{6}-(ciclopentiloxi)-ATP,
N^{6}-(ciclohexil)-ATP,
N^{6}-(ciclohexiloxi)-ATP,
N^{6}-(bencil)-ATP,
N^{6}-(benciloxi)-ATP,
N^{6}-(pirrolidino)-ATP y
N^{6}-(piperidino)-ATP, (27).
Es aún otro objeto de la invención proporcionar
un procedimiento para determinar si un compuesto de ensayo modula
positiva o negativamente la actividad de una proteína quinasa con
respecto a uno o más sustratos proteína. Más particularmente, y
según un aspecto adicional de la invención, es un objeto primario
proporcionar una proteína quinasa mutante que se une a y es
inhibida por un inhibidor, uniéndose o inhibiendo menos fácilmente
dicho inhibidor la correspondiente quinasa de tipo salvaje.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar una secuencia nucleotídica que codifica dicha proteína
quinasa mutante; y es un objeto adicional proporcionar un
procedimiento para producir dicha secuencia de ácido nucleico. Es
también un objeto de la invención proporcionar procedimientos para
producir dicha proteína quinasa mutante, por ejemplo expresando
dicha secuencia de ácido nucleico. Es otro objeto de la presente
invención proporcionar dichos inhibidores, tales como el compuesto
N-4 ciclopentil-PP3, y
procedimientos para sus síntesis. Es otro objeto proporcionar un
procedimiento para determinar cuáles son los sustratos para una
proteína quinasa dada. Es aún otro objeto de la invención
proporcionar un procedimiento para determinar si la inhibición
específica de una quinasa particular produce un efecto bioquímico o
fenotípico en sistemas de ensayo tales como extractos exentos de
células, cultivos celulares u organismos multicelulares vivos. Es
un objeto adicional de la invención proporcionar un procedimiento
para determinar si la inhibición de una quinasa particular podría
tener valor terapéutico en el tratamiento de enfermedades. Es aún
otro objeto proporcionar procedimientos para el estudio de la
actividad, la cinética y los mecanismos catalíticos de una quinasa
mediante el estudio de la inhibición del correspondiente mutante de
la presente invención. Es un objeto adicional proporcionar
procedimientos de prevención y tratamiento de enfermedades mediadas
por quinasas introduciendo una quinasa mutante adaptada a inhibidor
de la presente invención en un organismo enfermo, y preferiblemente
reduciendo, o lo más preferiblemente agotando, la enzima de tipo
salvaje del organismo, y administrando después el inhibidor para
regular la actividad de la quinasa mutante mediadora ahora de la
enfermedad para disminuir o eliminar la causa o los síntomas de la
enfermedad.
Basándose en lo anterior y en la descripción
detallada de la presente invención proporcionada a continuación, un
experto en la técnica reconocerá fácilmente que la presente
invención puede utilizarse más generalmente para estudiar enzimas
multisustrato que transfieren covalentemente un sustrato donante o
una porción del mismo a un sustrato receptor, como la quinasa, y
enzimas que no unen dos sustratos o transfieren un grupo. Dichas
aplicaciones de la presente invención se describen también
adicionalmente en la descripción detallada siguiente. En
consecuencia, es aún un objeto adicional de la presente invención
proporcionar una enzima multisustrato mutante que se une a un
inhibidor, uniéndose dicho inhibidor menos fácilmente a la enzima de
tipo salvaje o a otras enzimas con actividad similar.
Es otro objeto de la invención proporcionar una
secuencia nucleotídica que codifica dicha enzima multisustrato
mutante; y es un objeto adicional proporcionar un procedimiento para
producir dicha secuencia de ácido nucleico. Es también un objeto de
la invención proporcionar procedimientos para producir dicha enzima
multisustrato mutante, por ejemplo expresando dicha secuencia de
ácido nucleico. Es también un objeto de la presente invención
proporcionar dichos inhibidores y procedimientos para su síntesis.
Es otro objeto proporcionar un procedimiento para determinar cuáles
son los sustratos para una enzima multisustrato dada. Es aún otro
objeto de la invención proporcionar un procedimiento para
determinar si la inhibición específica de una enzima multisustrato
particular produce un efecto bioquímico o fenotípico en sistemas de
ensayo tales como extractos exentos de células, cultivos celulares
u organismos multicelulares vivos. Es un objeto adicional de la
invención proporcionar un procedimiento para determinar si la
inhibición de una enzima multisustrato particular podría tener valor
terapéutico en el tratamiento de enfermedades.
La presente invención implica la modificación por
ingeniería genética de enzimas quinasas de tal modo que puedan
unirse a inhibidores que no se unen tan fácilmente por sus formas
de tipo salvaje. Se han utilizado sustratos modificados y enzimas
mutantes que pueden unirse a ellos para estudiar un factor de
elongación (41) y un receptor para ciclofilina A (42). Sin embargo,
antes de la presente invención, no se sabía cómo o incluso si las
enzimas multisustrato que unen covalentemente una parte de o todo un
sustrato donante a un sustrato receptor podrían modificarse por
ingeniería genética para unirse a un inhibidor, reteniendo todavía
al menos cierta actividad catalítica y al menos cierta
especificidad por el sustrato receptor en ausencia del inhibidor. La
presente invención es que esto puede hacerse, como se explica a
continuación, y esta invención abre por primera vez la puerta a la
inhibición selectiva de quinasas individuales, que no son sólo
herramientas importantes para la comprensión de las cascadas de
quinasa y otros mecanismos celulares catalíticos complejos, sino que
también pueden proporcionar vías para intervención terapéutica en
enfermedades en que estos mecanismos entran en juego.
Es aún otro objeto proporcionar procedimientos
para el estudio de la actividad, la cinética y los mecanismos
catalíticos de una enzima multisustrato mediante el estudio de la
inhibición del correspondiente mutante de la presente invención. Es
un objeto adicional proporcionar un procedimiento de prevención y
tratamiento de enfermedades mediadas por enzimas multisustrato
introduciendo una enzima multisustrato adaptada a inhibidor de la
presente invención en un organismo enfermo, y preferiblemente
reducir, o lo más preferiblemente agotar la enzima de tipo salvaje
en el organismo, y administrar después el inhibidor para regular la
enzima mutante mediadora ahora de la enfermedad para reducir o
eliminar la causa o los síntomas de la enfermedad.
Como se indicó anteriormente, la presente
invención no está limitada a quinasas mutantes, inhibidores
ortogonales y sus síntesis y usos. La presente invención funcionará
igual para otras enzimas multisustrato que transfieren
covalentemente parte de o todo un sustrato, aquí denominado el
donante, a otro sustrato, aquí denominado el receptor; y existen
seguramente más de dichas enzimas aún por descubrir. En cualquiera
de dichos casos, un experto en la técnica que haya estudiado la
presente memoria descriptiva apreciará bien la aplicabilidad de la
presente invención a dichas enzimas. Las tareas a realizar en dicho
casos son bastantes similares a las descritas aquí en detalle para
la quinasa. En primer lugar, es necesario identificar cuál es el
sustrato donante y/o identificar los compuestos que pueden inhibir
esa quinasa, incluso si no son específicos de esa quinasa.
En segundo lugar, es necesario considerar dónde
podría añadirse un sustituyente voluminoso al sustrato del inhibidor
de tal modo que se una tan fácilmente a la quinasa de tipo salvaje,
o preferiblemente no se una sustancialmente a la quinasa de tipo
salvaje, y preferiblemente se una en absoluto. Por supuesto, no es
realmente necesario, en el caso de la quinasa o en el de otras
enzimas multisustrato como las descritas anteriormente, ser
restrictivos con respecto a cuáles análogos de éstas preparar, puede
prepararse una serie de ellas, incluyendo incluso algunas que
parece improbable que sean ideales, y determinarse mediante examen
cuál o cuáles es el mejor. Puede obtenerse una guía adicional
respecto a cómo hacer esto a partir de los siguientes ejemplos. El
ensayo de inhibición, cuyos resultados se muestran en la Figura 6,
es un ejemplo no limitante de un ensayo particularmente bien
adecuado para dicho examen.
La tercera etapa es modificar por ingeniería
genética la quinasa de tal modo que uno o más aminoácidos en la
localización tridimensional en la que el grupo voluminoso se
esperaría que estuviera si se uniera el análogo, se reemplazan por
aminoácidos que tienen cadenas laterales menos voluminosas,
"haciendo sitio" por tanto para el resto voluminoso del
inhibidor. Las etapas dos y tres pueden llevarse a cabo, por
supuesto, en orden inverso.
Como se describe en los ejemplos siguientes,
utilizando la presente invención se demostró la utilidad de una
quinasa v-Src que muestra alta especificidad por un
inhibidor sintético manteniendo su especificidad de tipo salvaje por
péptidos y proteínas que contienen tirosina, satisfaciendo así los
objetivos de investigación iniciales. Al explotar la naturaleza
altamente conservada del sitio de unión a ATP en la superfamilia de
quinasas y la disponibilidad de la información estructural de otras
proteínas quinasas, se modificó por ingeniería genética una nueva
especificidad de inhibición por v-Src sin ninguna
información estructural detallada sobre la v-Src
misma. Que se utilizara una quinasa no relacionada como molde para
diseñar análogos de ATP ortogonales para marcar los sustratos
celulares directos de v-Src, y haber preparado
inhibidores de orígenes similares, demuestra que este enfoque
debería funcionar también para otras quinasas.
Los inhibidores contemplados por esta invención
pueden ser útiles en estudios dirigidos hacia el desarrollo de otros
mutantes útiles de esta y otras quinasas, y para los diversos
procedimientos descritos en otro lugar de la presente memoria. Se
presentan variantes ejemplares en la presente memoria, y se hace
referencia particular a la Figura 12, en la que se indican tanto
los análogos como los datos relacionados con su actividad. Por
supuesto, el uso de dichos inhibidores puede requerir modificar
diferentes posiciones en la secuencia proteica de la quinasa para
preparar una quinasa modificada por ingeniería genética que se una
a ellos, pero dichas modificaciones diferentes están dentro del
alcance de la presente invención.
Además, es importante observar que los
inhibidores de la presente invención no están limitados a ADP y
derivados de PP3. Por ejemplo, debería ser posible utilizar
derivados de otros sustratos donantes de fosfato nucleotídicos como
dichos inhibidores. Para estudiar algunas quinasas, pueden
preferirse de hecho bases análogas diferentes. Por ejemplo, es
conocido que algunas quinasas utilizan GTP como sustrato donante de
fosfato y fuente de energía; para preparar inhibidores para formas
modificadas por ingeniería genética de dicha quinasa, serían
adecuados análogos de difosfato de guanosina. Además, es bien
conocido que compuestos relacionados (por ejemplo otras bases) y
compuestos químicamente no relacionados con el sustrato natural
pueden unirse sin embargo a veces a un sitio activo y pueden (pero
no con fines de necesidad), ser actuados o actuar sobre otros
sustratos mediante catálisis química por la enzima. A veces,
participan en la reacción catalizada del mismo modo que el sustrato
natural, a veces en modos diferentes. Dichos compuestos y sus
derivados serían puntos de partida adecuados para el diseño de
inhibidores que sean ortogonales a ellos, y que estarían en el
alcance de la presente invención. De forma similar, pueden
utilizarse otros inhibidores de proteína quinasa como punto de
partida para la síntesis de inhibidores de la presente invención,
tales como aquellos cuyas estructuras aparecen en la Figura 9. Por
supuesto, incluso derivados de inhibidores que son actualmente
desconocidos serían estructuras núcleo adecuadas, una vez
identificados, para el diseño de inhibidores de la presente
invención, como se ilustra en la presente invención, y formarían
una parte de ella.
Además, los inhibidores de la presente invención
no están limitados a los preparados mediante medios químicos
sintéticos, sino que incluyen también compuestos que pueden
encontrarse en la naturaleza y que pueden servir para ese papel,
algunos de los cuales se discuten anteriormente. Además, los
expertos en la técnica apreciarán que existen otras variaciones
aparte de las indicadas aquí y que éstas están dentro del alcance
de la presente invención.
Los inhibidores que son candidatos para uso según
la presente invención pueden examinarse convenientemente para
determinar la extensión en la que son aceptados por quinasa de tipo
salvaje utilizando un procedimiento de examen tal como el indicado
en el ejemplo 13 siguiente, o mediante un procedimiento de examen
que implica el uso de una célula o células que son ricas en
actividad proteína quinasa como se indica en el ejemplo 9 en la
presente memoria. Mediante dicho ensayo, puede determinarse si cada
inhibidor se une por quinasa de tipo salvaje en un menor grado que
la quinasa modificada por ingeniería genética, o preferiblemente,
si la quinasa de tipo salvaje no se une sustancialmente a ese
inhibidor, o lo más preferiblemente, no se une en absoluto al
inhibidor. Para todos los sustratos que se unen menos fácilmente,
puede ser interesante intentar modificar por ingeniería genética la
quinasa de interés de modo que se una más fácilmente a ellos. Por
supuesto, podría prepararse primero una quinasa modificada por
ingeniería genética y ensayarla después junto con la enzima de tipo
salvaje para determinar si utiliza un sustrato ortogonal dado mejor
que la quinasa de tipo salvaje; éste fue el enfoque utilizado en el
ejemplo 13. Sin embargo, en la mayoría de las circunstancias, se
preferirá un preexámen como se describe anteriormente. Por
supuesto, resultarán evidentes otros enfoques de ensayo para los
expertos en el campo, y el uso de dichos ensayos estará dentro del
alcance de la presente invención.
Existen varios criterios que deberían
satisfacerse para remodificar una quinasa para marcar únicamente
sus sustratos auténticos en presencia de tirosina y
serina/treonina quinasa de tipo salvaje. La quinasa modificada por
ingeniería genética debería: (1) aceptar un análogo de ATP (A*TP)
que se utiliza menos fácilmente por la proteína quinasa de tipo
salvaje; preferiblemente aceptar un A*TP que no se utiliza
sustancialmente por la quinasa de tipo salvaje; y lo más
preferiblemente aceptar un A*TP que no se utiliza en absoluto por
una quinasa de tipo salvaje; (2) utilizar preferiblemente el análogo
A*TP con alta eficacia catalítica; y (3) tener preferiblemente una
eficacia catalítica reducida para el sustrato nucleótido natural
(ATP) de modo que en presencia de niveles celulares de ATP
(1-2 mM), la quinasa mutada utilizaría
preferiblemente A*TP como donante de fósforo. Si se ha de utilizar
dicha quinasa modificada por ingeniería genética para estudiar la
especificidad de sustrato proteína de la quinasa de tipo salvaje,
entonces estos criterios deben satisfacerse sin alterar
sustancialmente la especificidad de diana proteína de la
quinasa.
Varios criterios similares deberían satisfacerse
para remodificar por ingeniería genética una quinasa para que se
inhibiera por los inhibidores de la presente invención. La quinasa
modificada por ingeniería genética debería: (1) unirse a un
inhibidor que se une menos fácilmente por la proteína quinasa de
tipo salvaje; (2) preferiblemente, la quinasa modificada por
ingeniería genética se unirá al inhibidor con alta afinidad
(concretamente baja CI_{50}). No es generalmente particularmente
importante si el inhibidor se une a la forma de tipo salvaje de la
quinasa que corresponde a la quinasa modificada por ingeniería
genética, ya que dicha unión y la inhibición resultante aumentaría
la de la quinasa modificada por ingeniería genética. Sin embargo,
es más probable que la forma de tipo salvaje de esta quinasa no se
una al inhibidor mejor que otra quinasa de tipo salvaje. Si ha de
utilizarse una quinasa modificada por ingeniería genética inhibible
para estudiar la especificidad del sustrato proteína de la quinasa
de tipo salvaje, o para reemplazar la forma de tipo salvaje de esta
quinasa mediante terapia génica u otros medios, como se discute
adicionalmente a continuación, entonces es una preocupación
adicional que los criterios anteriormente descritos deben
satisfacerse preferiblemente sin alterar sustancialmente la
especificidad de diana proteína de la quinasa modificada por
ingeniería genética cuando se compara con la correspondiente forma
de tipo salvaje.
Cuando se observa desde la perspectiva del estado
de la técnica cuando se realizó la presente invención, no era
predecible si sería posible satisfacer todos estos criterios
simultáneamente; de hecho era dudoso, porque el sitio de unión a ATP
que está modificado por ingeniería genética está muy cercano al
segundo sitio de unión a sustrato, concretamente el sitio de unión a
péptido. Sin embargo, como se muestra en los ejemplos siguientes,
todos estos criterios, incluyendo los criterios preferidos, se
satisficieron de hecho simultáneamente cuando se prepararon los
mutantes de v-Src descritos, se proporcionaron con
N^{6}-(ciclopentil)ATP y se inhibieron utilizando
N^{4}-ciclopentil-PP3.
El ejemplo 1 describe los doce análogos de ATP
que se utilizaron en los estudios sobre v-Src
mutante, que se describen en los ejemplos adicionales siguientes.
Estos análogos de ATP ortogonales pueden ser útiles en estudios
dirigidos hacia el desarrollo de otros mutantes útiles de ésta y
otras quinasas, y para los diversos procedimientos descritos en
otro lugar de la presente memoria. Sin embargo, el alcance de la
presente invención no está limitado al uso de estos análogos de ATP
particulares, y los expertos en la técnica reconocerán que muchos
otros sustratos ortogonales posibles podrían sustituir o suplementar
los descritos en la presente memoria. Por ejemplo, podrían añadirse
grupos alifáticos o aromáticos diferentes y aún más complejos a la
posición N^{6} del ATP. Además, los sustratos ortogonales
de la presente invención no están limitados a modificaciones de los
nucleótidos en la posición N^{6}. Son conocidos los medios
químicos para modificar diversas posiciones en adenosina, y
cualquiera de estos estaría dentro del alcance de la presente
invención; y es incluso posible hacer cambios o sustituciones en las
estructuras de anillo de los nucleótidos. Por supuesto, el uso de
dichos sustratos ortogonales puede requerir modificar diferentes
posiciones en la secuencia proteica de la quinasa para preparar una
quinasa modificada por ingeniería genética que se una a ellos, pero
dichas modificaciones diferentes están dentro del alcance de la
presente invención.
Además, resulta importante observar que los
sustratos ortogonales de la presente invención no están limitados a
derivados de ATP. Para estudiar diferentes quinasas, pueden
preferirse de hecho diferentes bases análogas. Por ejemplo, es
conocido que algunas quinasas utilizan GTP como sustrato donante de
fosfato y fuente de energía; para estudios de dichas quinasas,
serían preferidos análogos de trifosfato de guanosina. Es bien
conocido que compuestos químicamente no relacionados con el sustrato
natural pueden unirse sin embargo a veces a un sitio activo, y
pueden incluso ser actuados o actuar sobre otros sustratos mediante
catálisis química por la enzima. A veces, participan en la reacción
catalizada del mismo modo que el sustrato natural, a veces en modos
diferentes. Dichos compuestos y sus derivados estarían también
dentro del alcance de los términos "sustrato natural" y
"sustrato ortogonal" como se utilizan en la presente
memoria.
Además, los sustratos ortogonales de la presente
invención no están limitados a los preparados mediante medios
sintéticos químicos, sino que incluyen también compuestos que
pueden encontrarse en la naturaleza y que pueden servir para ese
papel. Los expertos en la técnica apreciarán que existen otras
variaciones aparte de las indicadas aquí, y que éstas están dentro
del alcance de la presente invención.
Los nucleótidos ortogonales que son candidatos
para uso según la presente invención pueden examinarse
convenientemente para determinar la extensión en que son aceptados
por una quinasa de tipo salvaje utilizando un procedimiento de
examen tal como el indicado en el ejemplo 2 siguiente. Mediante
dicho ensayo, puede determinarse si cada sustrato ortogonal es
aceptado por quinasa de tipo salvaje en un menor grado que el
sustrato para dicha quinasa, o preferiblemente, no acepta
sustancialmente ese sustrato, o lo más preferiblemente no lo acepta
en absoluto. Para aquellos sustratos que son al menos fácilmente
aceptados, puede ser interesante intentar modificar la quinasa de
interés de modo que los acepte más fácilmente. Por supuesto, podría
prepararse primero la quinasa modificada por ingeniería genética y
ensayarla después junto con la enzima de tipo salvaje para
determinar si utiliza un sustrato ortogonal dado mejor que la
quinasa de tipo salvaje. Sin embargo, en la mayoría de las
circunstancias, se preferirá un preexamen tal como el descrito en
el ejemplo 2. Por supuesto, otros enfoques de ensayo resultarán
evidentes para los expertos en el campo, y el uso de dichos ensayos
estaría dentro del alcance de la presente invención.
El diseño de una v-Src modificada
por ingeniería genética se describe en el ejemplo 3 siguiente. Como
se describe, la forma modificada por ingeniería genética se diseñó
por referencia a las estructuras cristalinas de otras quinasas que
tienen dominios que son homólogos con los encontrados en la mayoría
sino todas las quinasas. Como se observará, la quinasa mutante
ejemplo descrita en la presente memoria se ha construido en forma
de fragmentos de proteína quinasa, en lugar de contener las
secuencias completas; pero se encontró que no hay una diferencia
sustancial de actuación cuando se utiliza la secuencia completa.
Por supuesto, los conceptos y prácticas son las mismas si se
utilizan fragmentos o la quinasa completa, y ambos están dentro del
alcance de la presente invención. Como tal, el término
"quinasa" debería considerarse que incluye la enzima completa o
un fragmento de una, incluyendo cuando se interpretan las
reivindicaciones.
Utilizando este enfoque, es posible diseñar
mutantes similares de virtualmente cualquier otra quinasa, tal como
una proteína quinasa, una lípido quinasa o una aminoglicósido
quinasa. El procedimiento para hacer esto comprende las etapas de:
(a) identificar a partir del alineamiento de los aminoácidos de una
quinasa de interés con una quinasa que tiene un inhibidor de
quinasa conocido (que puede ser no específico de esta quinasa,
específico en general de quinasas pero no por esa quinasa, o
específico por esa quinasa), uno o más aminoácidos que están
suficientemente cerca para que un sustituyente en el sustrato
donante de fosfato o inhibidor unido limite estéricamente la
entrada de un sustituyente voluminoso unido en esa posición en un
inhibidor ortogonal putativo; y (b) mutar una secuencia
nucleotídica que codifica la proteína quinasa de tipo salvaje de
tal modo que los tripletes nucleotídicos que codifican uno o más de
los aminoácidos identificados se convierten en tripletes
nucleotídicos que codifican aminoácidos que tienen cadenas
laterales que son estéricamente menos voluminosas que los
aminoácidos identificados. El procedimiento anteriormente descrito
utiliza la restricción estérica de la entrada o exclusión como
criterio para decidir cuáles aminoácidos cambiar, y cómo
cambiarlos. Sin embargo, la presente invención no está limitada a
ello. También es posible modificar por ingeniería genética una
quinasa para cambiar su capacidad de unirse a un sustrato ortogonal
considerando otros factores, tales como hidrofobicidad,
hidrofilidad, enlace o repulsión iónico, enlace de hidrógeno,
formación de enlaces covalentes entre la enzima y grupos
electrófilos en sustratos ortogonales, etc.
El estudio de proteína quinasas utilizando la
presente invención se facilitará en gran medida por el vasto
conocimiento respecto a las estructuras de dominios de muchas
quinasas diferentes, y sus secuencias generalmente homólogas. El
"Protein Kinase Facts Book" (71) proporciona datos de
secuencia de proteína para los tres dominios funcionales en
literalmente cientos de proteína quinasas, y esto junto con la
información de secuencia disponible en la bibliografía primaria,
debería facilitar en gran medida la aplicación adicional de la
presente invención a la quinasa. Está disponible información
similar respecto a otras enzimas multisustrato, que debería
facilitar su estudio y uso según la presente invención.
Aunque el procedimiento preferido de la presente
invención implica el diseño racional de análogos de sustrato y
proteínas quinasa mutantes, ambos podrían realizarse como
alternativa mediante el uso de procedimientos conocidos como
procedimientos combinatorios. Existen muchos procedimientos
combinatorios de síntesis de compuestos orgánicos. Utilizando uno
de dichos procedimientos, podrían sintetizarse análogos de
nucleósido en perlas de resina utilizando etapas químicas
secuenciales, y liberarlos después de la resina antes de la
fosforilación para preparar los trifosfatos de nucleósido. Después
de utilizar dicho procedimiento para preparar una colección o
biblioteca de sustratos ortogonales putativos para mutantes de
quinasa v-Src, otras proteínas quinasas, u otras
enzimas multisustrato, podrían examinarse en la colección o
biblioteca las propiedades de unión o catalíticas particularmente
favorables. Esto puede permitir una búsqueda más concienzuda de
rasgos estructurales, conformacionales y electrónicos de dichos
sustratos ortogonales putativos. Además, a menudo los compuestos que
son los más deseables no se habrían elegido si sólo se utilizaran
parámetros bien conocidos para diseñar específicamente el mejor
compuesto.
Existen también muchos procedimientos
combinatorios conocidos en la técnica para preparar proteínas
mutantes. Estos incluyen reacción en cadena con polimerasa (PCR)
"con tendencia al error", PCR "sexual" o PCR que utiliza
cebadores con nucleótidos aleatorios como posiciones fijas en la
secuencia proteica. Otros procedimientos de aleatorización de
secuencia podrían incluir el uso de mutágenos químicos de ADNc o ADN
de plásmido, o cepas de tipo MutD de bacterias, que son conocidas
por introducir aleatoriamente mutaciones en las proteínass que
expresan. Sería posible llevar a cabo la presente invención
explotando dichos procedimientos para preparar proteína quinasa
mutada aleatoriamente u otras enzimas multisustrato, y examinar
después una con actividad particularmente alta con un sustrato
ortogonal particular, o preparar algunos o todos los sustratos
ortogonales putativos utilizando síntesis combinatoria, como se
describe en el párrafo anterior. Los procedimientos de ensayo
descritos en los ejemplos siguientes serían adecuados con este fin,
y los expertos en la técnica serían fácilmente capaces de diseñar
enfoques alternativos.
Estos procedimientos y otros que existen o pueden
desarrollarse para explorar el espacio de la secuencia de proteínas
y el espacio estructural de moléculas orgánicas pequeñas, podrían
ser particularmente útiles para la aplicación tecnológica descrita
aquí, cambiando o alterando tanto la proteína como el inhibidor
putativo para encontrar el mejor ajuste posible no natural
(concretamente ortogonal). El uso de cualquiera de estos o
cualquiera de los otros procedimientos descritos en la presente
memoria estaría dentro del alcance de la presente invención.
Se describe la síntesis de una quinasa modificada
por ingeniería genética en el ejemplo 4. El foco de este esfuerzo
estuvo en las cadenas laterales aminoacídicas que estaban en el
radio de aproximadamente 4 \ring{A} del N^{6} de ATP;
pero no hay nada mágico sobre esa distancia. Los residuos con
cadenas laterales que están en el radio de aproximadamente 1
\ring{A}, 2 \ring{A}, 3 \ring{A}, 5 \ring{A}, 6 \ring{A},
7 \ring{A}, 8 \ring{A}, 9 \ring{A}, 10 \ring{A} o
distancias menores, mayores o intermedias deberían considerarse
también como dianas para modificación. Los aminoácidos con cadenas
laterales que están en el radio de aproximadamente 3 \ring{A} a
aproximadamente 6 \ring{A} serían dianas preferidas. Generalmente,
aquellos aminoácidos con cadenas laterales más cercanas se
preferirán frente a aquellos con cadenas laterales más distantes, ya
que se esperaría que causaran una interferencia estérica o de otro
tipo mayor con el sustituyente ortogonal en el inhibidor; y
aquellos con las cadenas laterales más cercanas serían los más
preferidos.
Por supuesto, existen hoy en día muchos otros
modos de modificar y expresar las secuencias genéticas que los
utilizados en los ejemplos, tales como mutagénesis dirigida a
sitio. El uso de cualquiera o todos ellos estaría dentro del alcance
de la presente invención. Además, aunque el uso de ingeniería
genética es hoy en día probablemente el procedimiento preferido
para preparar dichos mutantes, no es el único modo. Por ejemplo,
podría diseñarse una quinasa modificada por ingeniería genética y
sintetizar después esa proteína mediante procedimientos conocidos
de síntesis química de péptidos. O puede ser posible modificar
químicamente una enzima dada en una localización específica tal que
una o más cadenas laterales cambie de tamaño, hidrofobicidad u otras
características, de tal modo que puede utilizar más fácilmente un
sustrato ortogonal. El uso de todos dichos procedimientos está
dentro del alcance de la invención.
El ejemplo 7 describe ensayos que pueden
realizarse para determinar si la quinasa modificada por ingeniería
genética había retenido su especificidad de sustrato proteína. Se
prefiere que la especificidad de sustrato proteína de tipo salvaje
esté sustancialmente retenida si, como en los ejemplos, el objetivo
es utilizar la quinasa modificada por ingeniería genética para
estudiar sobre cuáles sustratos actúa la quinasa y en qué grado lo
hace, o ha de utilizarse para reemplazar o suplementar la
correspondiente quinasa de tipo salvaje in vivo, por ejemplo
mediante ingeniería genética. Sin embargo, aunque con dichos fines
es importante que la quinasa siga reconociendo los mismos sustratos
que la de tipo salvaje, no es crítico que haga esto con la misma
cinética; concretamente, si lo hace más lentamente o más
rápidamente, o en un mayor o menor grado, la quinasa modificada por
ingeniería genética puede tener todavía un valor sustancial con
dichos fines. Si la quinasa modificada por ingeniería genética no
reconoce los mismos sustratos proteína que la enzima de tipo
salvaje, puede tener menos valor para estudiar la enzima de tipo
salvaje, pero puede tener todavía un valor sustancial para estudiar
la fosforilación de proteína y quinasa en general, y estaría
todavía dentro del alcance de la invención.
Por supuesto, los ensayos particulares utilizados
en el ejemplo 7, aunque útiles, no tienen porqué utilizarse. Los
expertos en la técnica serán capaces fácilmente de desarrollar o
adoptar otros ensayos que pueden proporcionar información
comparable.
Una vez se ha preparado una quinasa mutante que
acepta un análogo sustrato ortogonal dado, o que es inhibida por un
inhibidor dado, puede caracterizarse utilizando análisis cinéticos
enzimáticos clásicos, como se ilustra en los ejemplos 5 y 6.
También, como se muestra en el ejemplo 8, puede estudiarse el grado
en que el mutante puede utilizar o ser inhibido por el análogo, y
si el análogo es un inhibidor "muerto" (concretamente
totalmente ineficaz) para la enzima de tipo salvaje. Por supuesto,
los procedimientos utilizados en los ejemplos no son los únicos
modos en que pueden realizarse estos estudios, y los expertos en la
técnica pueden diseñar fácilmente enfoques alternativos.
Como se ilustra en el ejemplo 10, no es necesario
hacer múltiples sustituciones de aminoácidos para proporcionar un
mutante que se inhiba por un inhibidor de la presente invención.
Puede ser necesario hacer sólo un único cambio de aminoácidos, como
es el caso con los mutantes GST-XD4(I338A) y
GST-XD4(I338G).
Una realización de la presente invención es la
siguiente. En primer lugar, se añade el inhibidor ortogonal a dos
muestras de la célula de interés que expresan un gen añadido para
la quinasa modificada por ingeniería genética o bien expresan la
copia normal de la quinasa de interés. El inhibidor puede añadirse
antes, después o durante la activación de una cascada de
señalización (tal como células permeabilizadas, extractos celulares
o células que son naturalmente permeables a ellos). Después, se
utiliza un procedimiento que permite la detección de todas las
proteínas fosforiladas en una célula o fracción celular, por
ejemplo utilizando fósforo radiactivo
[\gamma-^{32}P]ATP o utilizando
anticuerpos monoclonales específicos de aminoácidos fosforilados
para revelar el resultado de la inhibición específica de la quinasa
de interés. En células que expresan la copia normal de la quinasa de
interés, los sustratos proteína de la quinasa nativa se marcarán,
incluso en presencia del inhibidor, mientras que los sustratos
proteína de la quinasa modificada por ingeniería genética se
marcarán al menos en un menor grado; preferiblemente los sustratos
proteína de la quinasa modificada por ingeniería genética no se
marcarán sustancialmente, y lo más preferiblemente, no se marcarán
en absoluto.
Es también preferible si la quinasa de tipo
salvaje correspondiente al mutante se ha retirado de las células,
por ejemplo mediante "eliminación génica" del gen o genes
celulares para ella. Si las proteínas marcadas de dicho ensayo se
examinan en serie con muestras de control que contienen la quinasa
de tipo salvaje pero no la quinasa mutante, ciertas bandas
reducirán su intensidad en la muestra tratada con mutante respecto
al control. Preferiblemente, la diferencia de intensidad será alta;
lo más preferiblemente habrá bandas que falten en las muestras que
contienen mutante tratadas con el inhibidor. Esto indicaría que la
forma de tipo salvaje de esa quinasa fosforila las proteínas
marcadas diferencialmente; cuando la quinasa se inhibe, esas bandas
no se marcan.
El ejemplo 10 proporciona un ejemplo de un
procedimiento de uso de una quinasa mutante de la presente
invención, junto con su análogo sustrato ortogonal o su inhibidor,
según sea el caso, para detectar cuáles son sustratos proteína
intracelular para esa proteína quinasa. El desarrollo de dicho
ensayo fue un objetivo primario de la investigación que condujo a
la presente invención.
Generalmente, el procedimiento descrito en el
ejemplo 10 y en la Figura 8 parecería ser generalmente aplicable;
sin embargo, existen muchas otros posibles enfoques que podrían
utilizarse, una vez se haya preparado un mutante que acepta un
análogo de sustrato ortogonal o inhibidor. El sustrato donante de
fosfato natural se prepara en primer lugar para contener un resto
marcado en el fosfato terminal, por ejemplo reemplazando el fosfato
por fosfato [\gamma-^{32}P]. Este sustrato,
junto con el análogo o inhibidor, se añade después a una mezcla de
células lisadas, extractos celulares, células permeabilizadas o
células que son naturalmente permeables al análogo sustrato
trifosfato de nucleótido ortogonal o al inhibidor, y que expresan
la quinasa mutante, o a las que se ha añadido exógenamente la
quinasa mutante (por ejemplo mediante microinyección). Después de la
incubación en condiciones que permitirán que la quinasa mutante se
inhiba, y/o fosforile sus sustratos proteína en la extensión no
inhibida, los productos marcados se extraen después y se analizan
en comparación con los producidos por una muestra control, que se
trató sustancialmente del mismo modo, pero sin la adición del
análogo o inhibidor, respectivamente. Los procedimientos para la
detección de proteínas marcadas son bien conocidos, e incluyen
procedimientos tanto cuantitativos como cualitativos. Además,
pueden utilizarse todos los procedimientos para caracterizar e
identificar proteínas para determinar con especificidad cuáles son
los sustratos proteína y cuáles son sus funciones. En última
instancia, debería ser posible desarrollar una comprensión de sobre
qué sustratos proteína actúan cada una de las diversas proteína
quinasas, y revelar con gran detalle los misterios de la
transducción de señal celular.
Una vez se han identificado uno o más sustratos
proteína, pueden utilizarse ensayos similares para identificar
fármacos u otros compuestos que pueden modular la actividad de una
proteína quinasa dada sobre uno o más sustratos. Por ejemplo,
podrían añadirse pequeñas cantidades de soluciones de una serie de
dichos compuestos para ensayar muestras que contienen extracto
exento de células, quinasa mutante, junto con un análogo de
sustrato ortogonal marcado y/o inhibidor. Las proteínas marcadas
pueden identificarse después, por ejemplo, mediante electroforesis
en gel seguida de autorradiografía, y compararse con una muestra
de ensayo por duplicado tratada del mismo modo, pero a la que no se
añadió fármaco ni otro compuesto.
Si una proteína no está marcada en una muestra
que tiene un compuesto añadido más análogo de sustrato y/o inhibidor
que se marca en una muestra tratada con análogo y/o inhibidor, esto
indica que el compuesto añadido ha causado que la quinasa fosforile
una proteína que no actúa en ausencia del compuesto, concretamente
el compuesto modula positivamente la actividad de la quinasa por
esa proteína. Como alternativa, si aparece una proteína marcada en
una muestra de ensayo a la que se añadió el compuesto o fármaco,
pero no aparece en una muestra de ensayo a la que no se añadió el
compuesto o fármaco, esto indica que el compuesto añadido ha
impedido que la quinasa fosforile una proteína que actúa en
ausencia del compuesto, concretamente el compuesto modula
negativamente la actividad de la quinasa por ese sustrato
proteína.
Además, si se realizan medidas cuantitativas para
cada proteína marcada, por ejemplo mediante barrido de
autorradiogramas e integración de los datos, pueden detectarse
efectos más sutiles sobre la actividad quinasa. Por ejemplo, puede
encontrarse que una proteína se fosforila más o menos totalmente en
presencia o ausencia de un compuesto dado (concretamente se ha
modulado menos drásticamente). Puede esperarse también que algunos
compuestos modularán positivamente la actividad quinasa por algunas
proteínas y modularán negativamente la actividad por otras al mismo
tiempo.
Como se citó anteriormente, debido a que las
quinasas desempeñan papeles clave en diversas enfermedades, es de
gran interés desarrollar inhibidores que puedan inhibir
específicamente quinasas de tipo salvaje o un grupo de quinasas de
tipo salvaje. Al modular negativamente la actividad de estas
quinasas implicadas en la enfermedad, debería ser posible reducir
los síntomas de la enfermedad, o incluso curar la enfermedad. Sin
embargo, la gran dificultad que se ha experimentado al preparar
dichos inhibidores de quinasa de tipo salvaje, como se describe
brevemente anteriormente, limita el potencial de ese enfoque. La
dificultad primaria es encontrar inhibidores que sean específicos y
que no inhiban quinasas distintas de la diana pretendida. Las
razones para dicha no especificidad son (i) los sitios de unión a
trifosfato de nucleótido de las quinasas están altamente conservados
en la evolución, y (ii) muchas quinasas son "degeneradas", es
decir, tienen actividades y especificidades suficientemente
generales para que puedan sustituir a otras quinasas que están
ausentes o con concentración reducida en las células debido a
deleción génica u otra razón. El problema de las similitudes del
sitio de unión puede superarse en muchos casos, por ejemplo
mediante un diseño cuidadoso racional del inhibidor, o mediante la
selección de inhibidores de bibliotecas combinatorias basándose en
la especificidad. Sin embargo, los esfuerzos para hacer eso con una
quinasa que sea verdaderamente degenerada con otra quinasa serán
probablemente infructuosos, todas las quinasas codegeneradas se
inhibirán incluso por los mejores compuestos candidatos, o incluso
si la diana se inhibe, será imposible de decir, debido a que una
quinasa degenerada "tomará el lugar" de la actividad de la
inhibida.
Debido a esto, existe la necesidad de un modo de
seleccionar quinasas para determinar cuáles quinasas de tipo salvaje
son degeneradas, y por tanto probablemente malos candidatos para
inhibición específica, y cuáles son no degeneradas, y por lo tanto
candidatos preferidos para inhibición específica. La presente
invención proporciona dicho procedimiento. La presente invención
proporciona un medio para generar un inhibidor de quinasa único
específico para cualquier quinasa de interés, preparando un mutante
de la quinasa que se diseña específicamente para inhibirse por los
inhibidores candidatos seleccionados, y estudiando después los
efectos de esa inhibición.
Otro procedimiento preferido de dicha selección
sería producir modelos animales para la enfermedad de interés y
después "eliminar" el gen de tipo salvaje, y después mediante
ingeniería genética, insertar en el genoma un gen que codifica una
quinasa mutante de la presente invención "incorporándolo".
Después, puede utilizarse un inhibidor de la presente invención,
preferiblemente uno que haya mostrado que inhibe al mutante in
vitro, para regular negativamente la quinasa mutante. Si la
regulación negativa conduce a una reducción de los síntomas o
morbilidad de la enfermedad en el modelo animal, o elimina la
enfermedad, entonces la quinasa es un candidato preferido para el
desarrollo de un inhibidor específico de la forma de tipo
salvaje.
La quinasa mutante y los inhibidores de la
presente invención pueden utilizarse también directamente para
tratar enfermedades en seres humanos y animales. Igual que se
describe anteriormente para los sistemas modelo animales, podría
utilizarse la sustitución génica en pacientes con enfermedades que
están mediadas por esas quinasas. Se eliminaría el tipo salvaje para
una o más de dichas quinasas de tipo salvaje, por ejemplo mediante
procedimientos de "eliminación génica" conocidos en la técnica,
y después se añadirían mutantes específicamente inhibibles de esa
una o más quinasas al genoma del animal, por ejemplo mediante
"incorporación génica" o procedimientos de terapia génica que
son conocidos en la técnica. Después, el inhibidor podría utilizarse
como fármaco para regular negativamente esa una o más quinasas
mutantes, de tal modo que la enfermedad mejora al menos en cierto
grado, pero podría mantenerse el grado de actividad de esas
quinasas, que puede encontrarse que sean necesarias para la función
celular normal. Por supuesto, la quinasa podría también
esencialmente "desconectarse" mediante una fuerte inhibición,
si eso probara ser terapéuticamente eficaz. Además, si se encuentra
que la enfermedad mejora en gran medida o se cura por un periodo de
regulación negativa o al desconectarse, entonces podría
discontinuarse la administración del inhibidor, y la enfermedad
podría no volver o exacerbarse. Si no, entonces la inhibición podría
discontinuarse a largo plazo o incluso permanentemente, y los
mutantes podrían dejarse funcionando en lugar de la quinasa de tipo
salvaje para el resto de la vida del paciente. Puesto que no están
presentes los inhibidores específicos de la presente invención en el
entorno, la quinasa mutante se comportaría como la de tipo salvaje
(excepto en la extensión en que la ingeniería genética pueda haber
cambiado su actividad o cinética). Y si la enfermedad recurriera o
se exacerbara de nuevo en el futuro, el paciente podría tratarse de
nuevo con el inhibidor, sin necesidad de repetir el
intercambio
génico.
génico.
\newpage
La presente invención proporciona un enfoque
general para sensibilizar a proteína quinasas ante moléculas
permeables en células que no inhiben ninguna proteína quinasa de
tipo salvaje. Utilizando un conmutador químico para diseñar una
interfase única proteína/molécula pequeña, se modificaron por
ingeniería genética proteína quinasas con sensibilidad única ante
inhibidores permeables. Se seleccionaron siete proteína quinasas de
cinco familias distintas de modo semialeatorio. Los inhibidores se
identificaron para cada quinasa. Se demuestra que este enfoque
puede ser exitoso incluso para proteína quinasas que no se inhiben
potentemente por el inhibidor "líder" elegido. Se ha mostrado
que pueden utilizarse estructuras divergentes para generar análogos
muy diferentes que son específicos de la misma diana. Además, se ha
mostrado la inhibición in vivo de una quinasa diana sin
necesidad de llevar a cabo un exámen in vitro. El dato
sugiere que la mayoría de las proteína quinasas será susceptible de
esta estrategia de inhibición específica de diana. Para organismos
que experimentan fácilmente recombinación (tales como
Saccharomyces cerevisiae, Dictyostelium discoideum, células B
DT40 de pollo y células madre embriónicas), este enfoque abre la
posibilidad de generar rápidamente cepas alélicas condicionales
para cada proteína quinasa en el genoma, incluso aquellas con
fenotipos nulos visibles. Una biblioteca de dichas cepas
representaría un paso adelante significativo en la comprensión de
la visión farmacogenómica de la identificación de ligandos
moléculas pequeñas para cada producto génico en la célula.
Las proteínas quinasas dependientes de ciclina
(Cdk) conducen y coordinan los eventos del ciclo de división celular
eucariótica (112). En la levadura de brotes Saccharomyces
cerevisiae, el ciclo celular se regula mediante Cdc28 (Cdkl)
(revisado en 113)), cuya función se ha estudiado principalmente
mediante el análisis de alelos mutantes sensibles a la temperatura
(ts) (114). A 37ºC, la mayoría de estos mutantes se detienen en G1,
sugiriendo que la progresión mediante START es únicamente sensible a
la inhibición de la actividad Cdc28. De forma interesante, el
análisis de mutantes ts no ha proporcionado una clara evidencia de
que Cdc28 desempeñe un papel en la transición G2/M, a pesar de la
abundante evidencia de que Cdk1 es necesaria para la entrada en
mitosis en otros eucariotas (115-117).
Los mutantes sensibles a la temperatura son
poderosas herramientas en el análisis de la función génica, pero el
análisis de los fenotipos ts puede complicarse a veces por los
efectos del shock térmico. Además, el mecanismo de inactivación de
la proteína ts es poco comprendido con detalle molecular. Por
ejemplo, la actividad quinasa de Cdc28 se reduce en ciertos
mutantes cdc28 ts a alta temperatura (118), pero no está
claro si la detención del ciclo celular es debida a un efecto sobre
la función catalítica de la enzima o debida a defectos en el
plegamiento, estabilidad o interacciones de la proteína con otras
proteínas.
La genética química proporciona un enfoque
alternativo para la generación de defectos condicionales en la
función génica (119-121). En este enfoque, la
función de un producto génico previamente identificado se determina
mediante el uso de un inhibidor químico altamente especifico
identificado mediante diseño racional o examen de bibliotecas
químicas. Desgraciadamente, este enfoque ha tenido sólo un éxito
limitado en el estudio de las proteínas quinasas, cuyos sitios
activos altamente conservados hacen difícil identificar inhibidores
específicos mutantes (121, 122).
Se desarrolló un enfoque genético químico
altamente específico que implica el diseño de una quinasa diana
mutada que es únicamente sensible a un inhibidor químico permeable
en célula (123-125). Basándose en la mutación del
correspondiente residuo en la familia de quinasas Src (126), se
reemplazó la fenilalanina 88 en Cdc28 por una glicina, dando como
resultado la formación de un nuevo bolsillo en el sitio de unión a
ATP. Esta quinasa mutante, Cdc28-as1 (análogo
específico 1), se predijo que era sensible a
4-amino-1-(terc-butil)-3-(1'-naftilmetil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(1-NM-PP1), un análogo del
inhibidor de quinasa PP1 que porta una modificación que debería
ocupar el bolsillo modificado por ingeniería genética en el sitio
de unión a ATP.
Esta invención demuestra que puede utilizarse un
inhibidor químico específico de alelo para estudiar la actividad
Cdc28 in vivo. A bajas concentraciones de
1-NM-PP1, las cepas
cdc28-as1 se retardan o se detienen en G2/M
con brotes hiperpolarizados. Este fenotipo es similar al observado
en células que carecen de las ciclinas mitóticas
Clbl-4 (139). El fenotipo en células
cdc28-as1 es debido a una reducción de la
actividad Cdc28 por debajo de cierto umbral necesario para la
entrada en mitosis y para el cambio de crecimiento de brote apical
a isotrópico. Aparentemente, la actividad de los complejos
ciclina-Cdk G1/S en estas células es todavía
suficiente para desencadenar la formación de brotes y replicación
de ADN. Sólo a concentraciones mayores de inhibidor se reduce la
actividad de estos complejos por debajo del umbral requerido para el
paso a través de START. Estos datos son consistentes en general con
la noción de que diferentes eventos del ciclo celular se
desencadenan por niveles umbral específicos de actividad CDK, y que
los últimos eventos requieren cantidades mayores de actividad (140).
Sin embargo, las diferencias en la especificidad de sustrato de las
diferentes ciclinas contribuyen también al ordenamiento de los
eventos del ciclo celular (141-143).
La evidencia de que la progresión G2/M es más
sensible a la inhibición de Cdc28 parece contradecir resultados
anteriores con mutantes cdc28 sensibles a la temperatura, la
mayoría de los cuales se detienen en forma de células sin brotes en
G1. Quizás, la detención en G1 a alta temperatura se explica por
diferencias en la sensibilidad ante la temperatura de diferentes
formas de Cdc28. Por ejemplo, una detención en G1 podría ser el
resultado si los complejos Cdc28-Clb en fase S o
G2/M son más resistentes al calor que la Cdc28 monomérica que
predomina en G1. El uso de inhibición química específica de alelos
proporciona un potente procedimiento alternativo que evita estos y
otros problemas con los mutantes sensibles a la temperatura.
La estructura del sitio de unión a ATP está
altamente conservada entre las proteínas quinasas, y por lo tanto
este enfoque debería ser aplicable al análisis de cualquier
proteína quinasa (hasta el momento, se han identificado exitosamente
inhibidores específicos de Src, Fyn, Cdk2, CaMKII\alpha,
c-Abl, Fus3, Lck, p38 y Pho85 modificadas por
ingeniería genética (123-125, 144). Este
procedimiento proporciona también un enfoque para la generación de
alelos condiciones que es más rápido que los procedimientos
tradicionales para el aislamiento de alelos sensibles a la
temperatura. Además, la disponibilidad de una nueva clase de alelos
condiciones permitirá el análisis de epistasis directo para ordenar
los productos génicos en rutas de señalización lineales: ahora
pueden realizarse experimentos de desplazamiento recíproco entre un
alelo específico de análogo y cualquier otro producto génico de
interés sensible a la temperatura o sensible al frío. Los resultados
sugieren también que la potencia del alelo mutante puede
controlarse variando la concentración de inhibidor: por lo tanto,
cdc28-as1 se comporta como un alelo débil a
concentraciones moderadas de inhibidor y como un alelo nulo virtual
a altas concentraciones. La aplicación de este procedimiento a
otras proteínas quinasas debería permitir por lo tanto la
identificación de las funciones génicas con diferentes requisitos
para actividad catalítica. De forma similar, en casos en que se
cree que una proteína quinasa tiene funciones tanto dependientes
como independientes de quinasa (145), el uso de un alelo específico
de análogo inhibiría sólo aquellas funciones que requieran actividad
quinasa. Finalmente, la misma mutación en quinasa que genera el
alelo específico de análogo permite también utilizar a la quinasa
análogos de ATP radiomarcados que se modifican para complementar el
sitio de unión a ATP modificado por ingeniería genética (126, 146).
La adición de estos análogos de ATP y la quinasa mutante a lisados
celulares debería conducir al marcaje e identificación de las
dianas de quinasa directas. Este enfoque puede utilizarse también
para identificar sustratos específicos de Cdc28.
Como se explica en otro lugar de la presente
memoria, los vectores de expresión modificados por ingeniería
genética que contienen el ácido nucleico que codifica la enzima
mutante pueden utilizarse para transformar una célula hospedadora
apropiada. Son conocidas una serie de líneas celulares de mamífero
en la técnica, e incluyen líneas celulares inmortalizadas
disponibles en la "American Type Culture Collection" (ATCC),
tales como, pero sin limitación, células de ovario de hámster chino
(CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK),
células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular
humano (por ejemplo Hep G2), células de riñón bovino
Madin-Darby ("MDBK"), células NIH/3T3, células
293 (ATCC nº CRL 1573), COS-7, 293, BHK, CH, TM4,
CV1, VERO-76, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, MMT
060562, células TRI así como otras. Un ejemplo bien conocido de una
línea celular de ave es la línea celular B de pollo
"DT-40". Los ejemplos de vectores útiles para
transformar dichas líneas celulares incluyen, pero sin limitación,
vectores retrovirales, vectores de virus Vaccinia, vectores de
adenovirus, vectores de herpesvirus, vector de virus de la viruela
aviar, vectores de expresión bacteriana, plásmidos tales como pcDNA3
(Invitrogen, San Diego, CA), o vectores de transferencia de
baculovirus.
Las células de insecto para uso con vectores de
expresión de baculovirus incluyen, entre otras, Aedes aegypti,
Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogater,
Spodoptera frugiperda y Trichoplusina ni.
En otra realización, se clonan genes de la
invención cadena abajo de un promotor constitutivo o inducible de
C. elegans, tales como el elemento promotor de shock
térmico, en un vector de expresión tal como pPD69.78 hsp 16.2 o
pPD69.3 hsp 16-41, que son vectores de dominio
público, para crear líneas transgénicas de C. elegans en las
que el gen de interés está bajo el control de un elemento promotor
de shock térmico inducible. La C. elegans transgénica puede
obtenerse después mediante microinyección de oocitos.
En otra realización, pueden transfectarse células
de Drosophila con vectores disponibles habitualmente (156,
157).
Streptococcus sp. y otras células
eucarióticas inferiores encontrarán uso con los presentes
constructos de expresión. Los hospedadores de levadura útiles en la
presente invención incluyen entre otros Saccharomyces cerevisiae,
Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha,
Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondi,
Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia
lipolytica.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
describir e ilustrar la presente invención. Como tales, no debería
considerarse que limitan el alcance de la invención. Los expertos
en la técnica apreciarán que muchas otras realizaciones entran
también dentro del alcance de la invención, como se describe
anteriormente en la presente memoria y en las reivindicaciones.
Se sintetizaron 12 análogos de ATP ortogonales
diferentes. La Figura 2 es una representación esquemática de su
estructura. La Figura muestra trifosfato de adenosina (ATP) con una
"X" unida en la posición 6; y en la tabla inferior, se
proporcionan representaciones esquemáticas de las doce cadenas
laterales que toman el lugar de "X" en cada uno de los análogos
de ATP ortogonales descritos en los ejemplos (que se designan
siempre por los números 1-12). Estos análogos
son:
\newpage
| 1-N^{6}(metoxi)-ATP | 7-N^{6}(pirrolidino)-ATP |
| 2-N^{6}(etoxi)-ATP | 8-N^{6}(ciclopentil)-ATP |
| 3-N^{6}(acetilo)-ATP | 9-N^{6}(ciclopentiloxi)-ATP |
| 4-N^{6}(isopropoxi)-ATP | 10-N^{6}(piperidino)-ATP |
| 5-N^{6}(bencil)-ATP | 11-N^{6}(ciclohexil)-ATP |
| 6-N^{6}(benciloxi)-ATP | 12-N^{6}(ciclohexiloxi)-ATP |
Los análogos 1, 2, 4, 6, 9 y 12 se sintetizaron
mediante transposición de Dimroth de los correspondientes derivados
N^{1} alcoxiadenina en cuatro etapas partiendo de
adenosina, según el procedimiento de Fuji et al. (43). El
análogo 5 se sintetizó de forma similar mediante transposición de
Dimroth de N^{1} benciladenosina (44). El análogo 3 se
preparó mediante protección in situ de los grupos hidroxilo
de adenosina en forma de trimetilsililéteres y tratamiento
posterior con cloruro de acetilo, según McLaughlin et al.
(45). Los análogos 7, 8, 10 y 11 se sintetizaron mediante
tratamiento de ribósido de 6-cloropurina (Aldrich)
con pirrolidina, ciclopentilamina, piperidina y ciclohexilamina,
respectivamente (46).
La síntesis de trifosfato se llevó a cabo según
el procedimiento de Ludwig (47), con la excepción de la preparación
del pirofosfato. En consecuencia, se preparó pirofosfato de
bis-tri-N-butilamonio mezclando 1 equivalente
de ácido pirofosfórico con 2 equivalentes de tributilamina en una
mezcla de agua:etanol (1:1) hasta que se obtuvo una solución
homogénea. El disolvente se retiró a vacío hasta sequedad y el
pirofosfato se almacenó sobre P_{2}O_{5} durante una noche.
Todos los nucleótidos no radiactivos se caracterizaron mediante
RMN-^{1}H, análisis espectral de masa y HPLC de
intercambio de anión fuerte (SAX) (Rainin nº
83-EO3-ETI).
Se sintetizó [\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)ATP según el procedimiento de
Hecht y Kozarich (48). El análogo radiomarcado se purificó mediante
cromatografía en columna DEAE (A-25) Sephadex
(Pharmacia) y el trifosfato se identificó mediante coinyección del
material radiomarcado con una muestra auténtica de
N^{6}-(ciclopentil)ATP en una columna HPLC de
intercambio aniónico SAX (Rainin) (gradiente lineal de fosfato de
amonio 5-750 mM, pH 3,9 en 10 mn. A 0,5 ml/min). El
rendimiento químico de la reacción varió de 70% a 80%.
Para identificar compuestos que no serían
aceptados como sustratos por ninguna quinasa celular existente (53),
se examinó un panel de análogos A*TP sintéticos en un lisado de
linfocitos de murina (FC) rico en tirosina proteína quinasa (13).
Los ensayos se realizaron utilizando esplenocitos (de ratones C57/B6
machos y hembras de 8-30 semanas de Princeton
University Animal Facility) que se aislaron y lavaron en medio
RPMI-1640 que contenía 5% de suero bovino de ternero
(BCS), 1% de HEPES y DNAsel (1 \mug/ml). Se lisaron los glóbulos
rojos a 4ºC mediante tratamiento con Tris 17 mM, cloruro de amonio,
pH 7,2. Las células se lisaron hipotónicamente en hielo durante 10
minutos en HEPES 1 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 5 mM, leupeptina (10
\mug/ml), aprotinina (10 \mug/ml) y PMSF 100 \muM según el
procedimiento de Fukazawa et al. (51). Después de agitación
con vórtex y centrifugación a 500 x g, se recogió el sobrenadante.
Las células se almacenaron a 4ºC durante 20 min para atenuar el
nivel de fosforilación de proteína basal, después de ello se ajustó
el tampón a Hepes 20 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM y NaF 1 mM. Se
añadió después vanadiato de sodio (100 \muM) para inhibir la
actividad de las fosfotirosina fosfatasas.
Se añadió cada trifosfato de nucleótido a una
concentración final de 100 \muM a 5 x 10^{6} equivalentes
celulares y se incubó a 37ºC durante 5 min, después de lo cual se
añadió tampón de carga 4 x Laemmli al lisado celular para inactivar
la reacción. Se separaron las proteínass mediante
SDS-PAGE al 12,5% y se transfirieron a Protran BA85
(Schleicher-Schuell). Se sondeó la transferencia
con anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina 4G10
(Upstate Biotechnology) y se detectó el anticuerpo unido mediante
quimioluminiscencia potenciada (cat. 34080, Pierce) después de
tratamiento con anticuerpo de cabra anti-ratón
acoplado a HRP (cat. VWR 7101332) según las instrucciones del
fabricante.
Los resultados se muestran en la figura 3, que es
una inmunotransferencia de proteína
anti-fosfotirosina que muestra el nivel de
fosforilación de proteína tirosina después de tratamiento de un
lisado celular de linfocitos de murina (FC) con 100 \muM de ATP o
A*TP (1-12). El lisado celular utilizado incluye la
proteína tirosina quinasa Src, Fyn, Lck, Lyn, Yes, Fgr, Hck, Zap,
Syk, Btk, Blk y otras proteína tirosina quinasas presentes en
linfocitos B y T, macrófagos y células dendríticas foliculares (13).
Se indican patrones de tamaño molecular (en kDa). Los A*TP que
contienen los menores sustituyentes N^{6}, 1 (metoxi), 2
(etoxi) y 3 (acetilo), mostraron cierta capacidad de servir como
sustratos de proteína tirosina quinasa celulares (Figura 3,
carriles 3-5). Los A*TP con sustituyentes
N^{6} con requisitos estéricos, 4 (isopropoxi), 5 (bencilo)
y 6 (benciloxi) y todos los análogos que contiene sustituyentes
alifáticos cíclicos (7-12) mostraron poca o ninguna
fosforilación (Figura 3, carriles 6-8,
11-16).
Para ensayar posibles metátesis de A*TP
ortogonales (7-12) con ADP celular para dar A*DP y
ATP, se añadió ADP 1 mM a reacciones de quinasa en lisado celular
idénticas a las mostradas en la Figura 3; el patrón de
fosfoproteínas fue el mismo, indicado que no ocurre una metátesis
significativa de A*TP en un sistema de lisado celular completo.
Basándose en estos resultados, parece que los
análogos (7-12) son "sustratos muertos" para la
proteína tirosina quinasa de tipo salvaje, concretamente, los
sustratos de tipo salvaje no aceptan sustancialmente, o nada en
absoluto, a éstos como sustrato donante de fosfato. Por tanto, se
eligieron estos análogos como las dianas más preferidas para
remodificar por ingeniería genética el sitio de unión a nucleótido
de v-Src.
No se han resuelto hasta la fecha ninguna
estructura cristalina de ninguna proteína tirosina quinasa en
conformación activa, aunque se han resuelto diversas estructuras de
quinasa inactiva (54, 55). Sin embargo, se han resuelto dos
estructuras cristalinas de ser/thr quinasas catalíticamente activas
(56, 57). Existe un alto grado de homología funcional entre los
dominios catalíticos de ser/thr y proteína tirosina quinasas, como
muestra el marcaje por afinidad del residuo de lisina
catalíticamente activo idéntico en ambas familias de quinasas (K72
en quinasa dependiente de AMPc (PKA), K295 en v-Src)
(58, 58). La inspección de las estructuras cristalinas de PKA (56)
y quinasa-2 dependiente de ciclina
(CDK2)-ciclina A (57) reveló dos cadenas laterales
aminoacídicas dentro de una esfera de 4 \ring{A} del grupo
N^{6} amino del ATP unido: V104/M210 (PKA) y V64/F80
(CDK2) (60).
La Figura 4 muestra una vista cercana del sitio
de unión a ATP en proteína quinasa dependiente AMPc (PKA) que está
unida a ATP. Se muestran tres residuos dentro de una esfera esfera
de 4 \ring{A} de la N^{6} amina de ATP (Val104, Met120 y
Glu121) y el residuo de lisina catalíticamente esencial (Lys72) en
representación de bolas y palos. El resto de la proteína se muestra
en formato de cinta. Esta figura se creó alimentando la salida de
Molscript en el programa de reproducción Raster3D (68,69). Obsérvese
que, en el modelo, la cadena lateral de Glu121 sobresale de la
región de unión al anillo adenina, y por lo tanto Glu121 no era un
candidato para alteración.
Se muestra a continuación el alineamiento de
secuencia de las regiones de unión a ATP de PKA (SEC Nº ID 1), CDK2
(SEC Nº ID 2) y v-Src (SEC Nº ID 3). Los residuos
mostrados en negrita corresponden a los aminoácidos con cadenas
laterales dentro de una esfera de 5 \ring{A} del grupo
N^{6} amino del ATP unido a quinasa.
Basándose en la similitud funcional entre las
quinasas anteriormente descritas, se mutaron las posiciones V323 e
I338 en el dominio catalítico de v-Src, lo que
corresponde a V104/M120 en PKA y V64/F80 en CDK2. Al mutar estos
residuos a alanina, se esperaba crear un "bolsillo" adicional
en el sitio de unión a nucleótido de v-Src para
permitir la unión a uno de los A*TP ortogonales preferidos
(4-12).
Se preparó el mutante (V323A, I338A) como se
describe a continuación. Se prepararon tanto el tipo salvaje como el
mutante doble de alanina del dominio catalítico de
v-Src (el fragmento XD4) en forma de proteínas de
fusión con glutation-S-transferasa
(GST) (GST-XD4) (61, 62). Éstas se prepararon en
E. coli, que es un buen hospedador de expresión porque carece
de proteínas tirosina quinasa endógenas, como se describe en el
siguiente ejemplo. El fragmento XD4 de v-Src se
utilizó porque contiene un dominio catalítico SH1 intacto pero
carece de dominios reguladores no catalíticos SH3 y SH2, y exhibe
una mayor actividad específica que la v-Src
completa.
Se utilizó una PCR de extensión por superposición
para preparar GST-XD4 (V323A, I338A) (49). Se
utilizó polimerasa pfu (Stratagene) en las reacciones PCR según el
protocolo del fabricante. Se utilizaron seis oligonucleótidos
sintéticos:
SEC Nº ID 4
(5'-TTTGGATCCATGGGGAGTAGCAAGAGCAAG),
SEC Nº ID 5
(5'-TTTGAATTCCTACTCAGCGACCTCCAACAC).
SEC Nº ID 6
(5'-TGAGAAGCTGGCTCAACTGTACGCAG).
SEC Nº ID 7
(5'-CTGCGTACAGTTGAGCCAGCTTCTCA).
SEC Nº ID 8
(5'-CTACATCGTCGCTGAGTACATGAG).
SEC Nº ID 9
(5'-CTCATGTACTCAGCGACGATGTAG).
El cebador SEC Nº ID 4 contiene un sitio
BamH1 y el cebador SEC Nº ID 5 contiene un sitio EcoR1
(mostrado en cursiva). Los cebadores SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 7
contienen los cambios de secuencia nucleotídica para introducir la
mutación V323A (los nucleótidos que codifican las mutaciones se
muestran en negrita). Los cebadores SEC Nº ID 8 y SEC Nº ID 9
contienen el desapareamiento I338A.
El gen XD4 del plásmido Yep51-XD4
(una donación de B. Cochran de Tufts Medical School) se amplificó
con los cebadores SEC Nº ID 4 y SEC Nº ID 5. El producto PCR se
digirió con BamH1 y EcoR1 y se ligó en
pGEX-KT digerido con BamH1 y EcoR1 y
después se transformó en la cepa DH5a de E. coli, BOSC
23(6) y se recogieron partículas virales después de 2 días
como se ha descrito (6). Se infectaron células NIH3T3 como se ha
descrito (7) con estas partículas virales, y se seleccionaron
transfectantes estables en medios que contenían puromicina como se
ha descrito (5). Los transfectantes estables se mantuvieron en
medios que contenían puromicina para asegurar ninguna pérdida de
expresión de v-Src.
Los resultados finales se muestran en la Figura
1, que es un diagrama que muestra la estructura del dominio de
v-Src incluyendo los dominios de homología con Src
3, 2 y 1 (SH3, SH2 y SH1), con los límites de dominio indicados por
los números de residuos aminoacídicos enumerados encima de cada
dominio encasillado. Se representa también la estructura de dominio
de XD4, que contiene una deleción de los residuos
77-225 (\Delta77-225). Se muestran
también esquemáticamente las organizaciones de dominio de la fusión
de glutation-S-transferasa (GST)
con XD4 (numeración de v-Src), y el
GST-XD4 doblemente mutado (que representa tanto
V323A, I338A como I338G).
Se evaluó la capacidad de los análogos de ATP
sustituidos en N^{6} (1-12, Figura 2) para
inhibir diferencialmente la fosforilación por quinasa de tipo
salvaje y mutante de RR-Src con
[\gamma-^{32}P] ATP, que es una medida de su
capacidad de unirse a los respectivos sitios de unión a ATP. Los
ensayos se llevaron a cabo por triplicado a 37ºC en un volumen
final de 30 \mul tamponados a pH 8,0 que contienen Tris 50 mM, 10
MgCl_{2} 10 mM, glutation 1,6 mM, BSA 1 mg/ml, péptido
RR-Src 1 mM con GST-XD4 (100 nM) o
bien GST-XD4(V323A, I338A) (100 nM) y
[\gamma-^{32}P]ATP 10 \muM (1000
cpm/pmol) [Dupont NEN]. Se añadieron ATP o análogos de ATP fríos
(100 \muM) (1-12) antes de la adición de la
quinasa. Después de 30 minutos, las reacciones se inactivaron
pipeteando 25 \mul del volumen de reacción sobre discos de
fosfocelulosa p81 (Whatman) y se sumergieron estos en 250 ml de
ácido acético al 10% durante >30 minutos, seguido de lavado y
recuento de centelleo según procedimientos estándar (52).
Los resultados se muestran en la Figura 56. La
inhibición relativa de GST-XD4 se muestra por
barras negras, y la inhibición relativa por
GST-XD4(V323A, I338A) se representa por
barras rayadas en diagonal. El porcentaje de inhibición
(1-v_{l}/v_{0}) se reseña como una relación de
v_{l} (cpm en presencia de 100 \muM del trifosfato indicado y
10 \muM de [\gamma-^{32}P] ATP (1000
cpm/pmol)/v_{0} (cpm en presencia de
[\gamma-^{32}P]ATP 10 \muM (1000
cpm/pmol) solo - cpm de fondo debidas a la unión no específica de
[\gamma-^{32}P] ATP 10 \muM a los discos de
fosfocelulosa (< 0,1% de recuentos de entrada totales)). Las
barras de error representan la D.E. determinada a partir de cuatro
experimentos separados con tres repeticiones.
La quinasa de tipo salvaje
GST-XD4 presenta una mala afinidad de unión por la
mayoría de análogos de ATP (Figura 6, barras sólidas) como se
esperaba por el ensayo de quinasa de linfocito (Figura 3). En
contraposición, la GST-XD4(V323A, I338A)
doblemente mutada muestra una excelente inhibición por los análogos
de ATP sustituidos en N^{6} con más requisitos estéricos
(Figura 6, barras sombreadas). Lo más significativamente, el
mutante GST-XD4(V323A, I338A) se inhibe de
fosforilar RR-Src con
[\gamma-^{32}P] ATP mediante los análogos de
ATP 5, 8, 9 y 11 casi tan bien como la quinasa de tipo salvaje
GST-XD4 se inhibe de fosforilar
RR-Src con [\gamma-^{32}P] ATP
por su sustrato natural ATP. Se confirmó que
GST-XD4(V323A, I338A) y
GST-Src(V323A, I338A) completa presentan el
mismo patrón de inhibición con los ATP (1-12).
Cuatro de los nueve sustratos "muertos"
identificados en el examen de especificidad de quinasa de tipo
salvaje (Figura 3) se unen bien a la quinasa mutante. Esta alta tasa
de éxito en la identificación de nuevos sustratos para una
v-Src mutante que no son aceptados por quinasa de
tipo salvaje sugiere que se había identificado un rasgo clave del
sitio de unión a nucleótido de v-Src, es decir, los
residuos que hacen un ajuste estrecho alrededor del grupo
N^{6} amino del ATP. Merece la pena observar que no se
conoce ninguna proteína quinasa que contenga una alanina en la
posición correspondiente a I338 en v-Src (posición
120 en PKA). Si una cadena lateral aminoacídica con requerimientos
estéricos en esta posición desempeña también un papel crítico en la
determinación de la especificidad de otras quinasas, sería posible
modificarlas por ingeniería genética para aceptar sustratos
ortogonales utilizando un enfoque muy similar al descrito aquí, y
dicha quinasa modificada por ingeniería genética estaría bien dentro
del alcance de la presente invención.
Se ensayó la capacidad de
N^{6}-(ciclopentil)-ATP, 8, para servir
como sustrato catalíticamente competente tanto de
GST-XD4 de tipo salvaje como del mutante
GST-XD4(V323A, I338A) frente a los otros tres
análogos de ATP 5, 9 y 11, debido a que 8 exhibía un nivel
ligeramente menor de fosforilación con la quinasa de tipo salvaje
(Figura 3, carril 12).
Se llevó a cabo la fosforilación de
RR-Src (1 mM) dependiente de ATP y
N^{6}-(ciclopentil)-ATP mediante
GST-XD4(V323A, I338A) y
GST-XD4 a una conversión de sustrato baja (<5%)
por triplicado. Se determinaron las constantes cinéticas mediante
análisis de gráficas Linewaver-Burk de los datos de
velocidad (64). Se llevaron a cabo los ensayos por triplicado a 37ºC
en un volumen final de 30 \mul tamponado a pH 8,0 que contenían
Tris 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, glutation 1,6 mM, BSA 1 mg/ml,
péptido RR-Src 1 mM con GST-XD4 (100
nM) o GST-XD4(V323A, I338A) (100 nM) y
[\gamma-^{32}P] ATP 10 \muM (1000 cpm/pmol) o
[\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP (5000 cpm/pmol)
como se ha indicado.
| Cinética para sustratos donantes de fosfato | ||||||
| GST-XD4 | GST-XD4/V323A, I338A) | |||||
| Nucleótido | k_{cat} | K_{M} | k_{cat}/K_{m} | k_{cat} | K_{M} | k_{cat}/K_{m} |
| (min^{-1}) | (\muM) | (min^{-1}M^{-1}) | (min^{-1}) | (\muM) | (min^{-1}M^{-1}) | |
| ATP | 2\pm0,5 | 12\pm3 | 1,6 x 10^{5} | 0,8 \pm 0,2 | 150 \pm 20 | 5,3 x 10^{3} |
| N^{6}-(ciclopentil)-ATP | 2000 (K_{1}) | (5 \pm 2) x 10^{2} | 15 \pm 3 | 3,3 x 10^{3} |
Como se muestra en la Tabla 1 anterior, la
quinasa de tipo salvaje GST-XD4 no fosforiló
sustancialmente el péptido RR-Src con
[\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP, confirmando las
observaciones previas de que este análogo no es un sustrato
significativo para la quinasa de tipo salvaje. En contraposición,
GST-XD4(V323A, I338A) presentó una cinética
de Michaelis-Menten con el ATP ortogonal,
[\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)ATP. La K_{M} del mutante por
el sustrato ortogonal es bastante cercana a la K_{M} de
GST-XD4 por ATP. Por otro lado, el mutante tiene
una K_{M} por ATP que es más de 10 veces superior que la K_{M}
de GST-XD4 por ATP.
El parámetro utilizado para ordenar los
catalizadores por sustratos competitivos es la relación del número
de recambio a la constante de Michaelis-Menten,
k_{cat}/K_{M} (la "constante de especificidad") (64). La
k_{cat}/K_{M} de la GST-XD4(V323A, I338A)
mutante modificada por ingeniería genética con el sustrato
ortogonal [\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP es sólo 50 veces
menor que el valor de k_{cat}/K_{M} de la quinasa de tipo
salvaje con su sustrato natural, ATP. Esta eficacia catalítica con
el sustrato ATP ortogonal, acoplada a la menor eficacia catalítica
de la quinasa mutante con ATP en comparación con el tipo salvaje,
satisface dos de los criterios de diseño discutidos
anteriormente.
Es aún más significativo que el nuevo
sustrato[\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP no se utiliza
sustancialmente por la GST-XD4 de tipo salvaje, como
se demuestra por la incapacidad completa aparente de
GST-XD4 de utilizar este análogo como donante de
fósforo para autofosforilación. Esto se ilustra en la Figura 5C,
carril 3. La Figura 5C es una autorradiografía que muestra la
autofosforilación dependiente de [\gamma-^{32}P]
ATP de GST-XD4, carril 1, o
GST-XD4(V323A, I338A), carril 2; y la
fosforilación dependiente de [\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP de
GST-XD4, carril 3, o la fosforilación de
GST-XD4(V323A, I338A), carril 4. Obsérvese
que, en contraposición con GST-XD4, la quinasa
modificada por ingeniería genética se autofosforila eficazmente con
[\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP (Figura 5C, carril
4).
Como se muestra en la tabla 2 siguiente, se
descubrió que la quinasa GST-XD4 de tipo salvaje
fosforilaba un sustrato peptídico bien caracterizado de
v-Src, RR-Src, con una cinética
consistente con las reseñas de la bibliografía (63). Esto indica
que la modificación por ingeniería genética de la secuencia no había
afectado sustancialmente a la actividad catalítica de la enzima con
respecto a sus sustratos proteicos.
| Cinética para el sustrato proteína RR-Src | ||
| GST-XD4 | GST-XD4(V323A, I338A) | |
| Nucleótido (saturado) | K_{M} (mM) | K_{M} (mM) |
| ATP | 2,6 \pm 0,9 | 3,1 \pm 0,9 |
| N^{6}-(ciclopentil)-ATP | - | 2,1 \pm 0,9 |
Se llevaron a cabo ensayos de fosforilación con
GST-XD4 y GST-XD4(V323A,
I338A) de RR-Src por triplicado a 37ºC en un
volumen final de 30 \mul a pH 8,0 que contenía Tris 50 mM,
MgCl_{2} 10 mM, glutation 1,6 mM, BSA 1 mg/ml, péptido
RR-Src 1 mM con GST-XD4 (100 nM) o
bien GST-XD4(V323A, I338A) (100 nM) y
[\gamma-^{32}P] ATP
10 \muM (1000 cpm/pmol) [Dupont NEN].
10 \muM (1000 cpm/pmol) [Dupont NEN].
Para determinar si las mutaciones de alanina
tienen algún efecto sobre la especificidad de sustrato proteína, se
midió la K_{M} de ambas proteínas de fusión de tipo salvaje y
mutante por el péptido RR-Src. A concentraciones
saturantes de [\gamma-^{32}P] ATP, la mutante y
la de tipo salvaje presentan esencialmente la misma K_{M} por
RR-Src, 2,6 \pm 0,9 mM, respectivamente (63).
Además, la K_{M} de la mutante por el sustrato proteína en
presencia de concentraciones saturantes del sustrato ortogonal era
también esencialmente la misma, 2,1 \pm 0,9 mM. Estos
descubrimientos sugieren que las mutaciones de alanina en el
bolsillo de unión a ATP que está próximo al sitio de unión
fosfoaceptor adyacente no afectan a la especificidad de diana
proteína.
En apoyo de esto, la quinasa modificada por
ingeniería genética fosforila el mismo amplio conjunto de proteínas
que se fosforilan por la XD4 de tipo salvaje cuando se expresa cada
una en células de insecto Sf9. Esto se muestra en la Figura
5(a), que muestra una transferencia de proteína
anti-fosfotirosina de lisados celulares (10^{8}
equivalentes celulares/carril) de células de insecto Sf9 que
expresan 6-His-XD4, carril 2, o
6-His-XD4(V323A, I338A),
carril 3. Estas transferencias se llevaron a cabo después de la
lisis de 10^{6} células en un tampón que contenía 0,1% de
Triton-X-100, Tris 50 mM, pH 8,0,
utilizando un procedimiento similar a las transferencias del ejemplo
2.
El sistema de célula de insecto Sf9 es un buen
hospedador para expresar pequeñas cantidades de proteína tirosina
quinasa porque estas células contienen la mayoría de la misma
maquinaria necesaria para llevar a cabo modificaciones
postraduccionales en proteínas, dando como resultado quinasas que
son más similares en actividad a las encontradas en células de
mamífero. Además, las células Sf9 no infectadas carecen de actividad
proteína tirosina quinasa endógena, como se muestra en la Figura 5A,
carril 1, y por tanto las proteínas que contienen fosfotirosina en
los carriles 2 y 3 de la Figura 5A son sustratos de la quinasa
6-His-XD4 expresada o
6-His-XD4 mutante. Las pequeñas
diferencias en el nivel de fosforilación de proteínas particulares
se atribuyen a la menor actividad catalítica del mutante
XD4(V232A, I338A) en comparación con la quinasa de tipo
salvaje. Tomados conjuntamente, estos datos muestran que la
especificidad peptídica de la quinasa modificada por ingeniería
genética es virtualmente idéntica a la de v-Src de
tipo salvaje.
El objetivo último de este trabajo es utilizar
quinasas mutantes específicas por análogos de sustrato sintéticos
para marcar los sustratos proteína directos en células completas o
lisados celulares. Para esto, es preferible que ninguna quinasa de
tipo salvaje, incluyendo ser/thr quinasas específicas (que llevan a
cabo el grueso de la fosforilación celular, ya que sólo un 0,03% de
todos los fosfoaminoácidos son tirosina) (65) acepte sustancialmente
el sustrato sintético. Para establecer que el
[\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP es esencialmente un
"sustrato muerto" para todas las quinasas celulares de tipo
salvaje, se realizaron reacciones de quinasa in vitro con
[\gamma-^{32}P] ATP o
[\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP con lisados de
linfocito de murina.
Estos ensayos se realizaron de manera similar al
procedimiento indicado en el ejemplo 2, con la excepción del uso de
[\gamma-^{32}P] ATP o
[\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP radiomarcado (5000
cpm/pmol) añadido a una concentración final de 100 \muM con 5 x
10^{6} equivalentes celulares e incubado a 37ºC durante 10 min,
después de lo cual se añadió 4 x tampón de carga de gel Laemmli al
lisado celular para inactivar la reacción. Las proteínas se
separaron mediante SDS-PAGE al 12,5%. El gel se
empapó en 10% de ácido acético, 10% de isopropanol durante 1 h,
después de lo cual se secó en un secador de gel y se expuso a
película Biomax MS (Kodak nº 111-1681) durante 1
h.
Los resultados se muestran en la Figura
5(b), que es un autorradiograma que muestra el nivel de
fosforilación en linfocitos de murina lisados hipotónicamente con
[\gamma-^{32}P] ATP, carril 1, o
[\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP, carril 2. No hay
fosfoproteínas radiomarcadas en el lisado celular después de la
adición de [\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP, confirmando la
verdadera naturaleza ortogonal del
N^{6}-(ciclopentil)-ATP con respecto a
todas las quinasas de tipo salvaje. Se encontró el mismo resultado
cuando se utilizaron reacciones de quinasa in vitro con
[\gamma-^{32}P] ATP o
[\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP y lisados
celulares de NIH3T3 en lugar de linfocitos de murina recién
aislados. En principio, la capacidad de seguir una actividad
proteína quinasa en presencia de todas las otras quinasas celulares
permitiría la identificación de las dianas directas de quinasa en un
tipo celular particular utilizando permeabilización de membrana
(66) y una forma permeable en célula de A*TP para introducir
[\gamma-^{32}P] A*TP en las células (67).
Para determinar si una mutación única podría ser
suficiente para permitir utilizar eficazmente
N^{6}-(ciclopentil)-ATP como sustrato, se
prepararon tres mutantes derivados de v-Src
adicionales, utilizando procedimientos comparables a los el ejemplo
4. Sin embargo, estos tenían sólo mutaciones únicas en la posición
338. Se expresaron estos de nuevo en forma de proteínas de fusión
GST-XD. Estos mutantes,
GST-XD(I338A),
GST-XD(I338G) se ensayaron después como se
describe en el ejemplo 8.
Los resultados se muestran en la Figura 7. Los
carriles de gel mostrados en la parte superior izquierda de la
Figura 7 muestran que el mutante con alanina en la posición 338 era
capaz de utilizar el sustrato natural, ATP, más fácilmente que el
mutante con serina en la misma posición. Los carriles de gel
mostrados en la parte inferior izquierda de la Figura 7 muestran que
el mutante con alanina en posición 338 es también más capaz de
utilizar ATP como sustrato que el mutante con glicina en esa
posición. Los paneles en el lado derecho de la Figura 7 cuentan una
historia aún más interesante. A partir del panel superior derecho,
resulta evidente que el mutante con serina en posición 338 no es
capaz de utilizar N^{6}-(ciclopentil)-ATP
casi tan bien como el mutante con alanina en esa posición. Sin
embargo, el panel inferior muestra que el mutante con glicina en la
posición 338 es más capaz de utilizar
N^{6}-(ciclopentil)-ATP como sustrato que
el mutante con alanina en esa posición.
Estos resultados son los más prometedores. Parece
que una mutación única es suficiente para permitir el uso de este
sustrato ortogonal. Notablemente, el mutante con glicina en la
posición 338 parece ser el mutante v-Src mejor
modificado por ingeniería genética producido hasta la fecha. Además,
resulta bastante sorprendente que una sustitución de glicina
funcionara aquí. Generalmente, no se espera que la sustitución de
glicina funcione en dichas situaciones porque introduce demasiada
flexibilidad en la estructura enzimática y por tanto afecta
perjudicialmente al resultado deseado.
Se muestra una representación esquemática de un
enfoque experimental para identificar sustratos de
v-Src en la Figura 8. Se añade la
v-Src modificada por ingeniería genética, tal como
GST-XD(V323A, I338A) a extractos celulares de
células permeabilizadas junto con un sustrato ortogonal
radiomarcado, tal como [\gamma-^{32}P]
N^{6}-(ciclopentil)-ATP. Típicamente, esto
se haría por triplicado. Después de la incubación, las células se
lisarían (si no se han lisado ya), y las muestras resultantes se
separarían mediante electroforesis en gel de poliacrilaminda. Una
transferencia Western tomada del gel y marcada con
anti-fosfotirosina mostraría todas las proteínass
fosforiladas en la muestra, y un autorradiograma del gel revelaría
cuáles de ellas se fosforilaron por v-Src.
Se muestra la cadena principal de
pirazolipirimidina para los primeros seis inhibidores en la Figura
10A. Se llevó a cabo la síntesis de
4-amino-1-terc-butil-3-fenilpirazolo
[3,4-d]pirimidina, que tiene un grupo fenilo en la posición
"R", compuesto 1 (que es la misma estructura que PP1, mostrada
en la Figura 9, pero sin el grupo para-metilo en el anillo
fenilo), según el procedimiento de Hanefeld et al. (76). Los
compuestos 2-6, que tienen sustituyentes
ciclobutoílo, ciclopentoílo, ciclohexoilbenzoílo y
2-furoílo en la posición "R" (Figura 10B),
respectivamente, se sintetizaron mediante tratamiento de 1 con
cloruro de ciclobutoílo, cloruro de ciclopentoílo, cloruro de
ciclohexoílo, cloruro de benzoílo o cloruro de faroílo,
respectivamente, en piridina seca durante una hora a temperatura
ambiente. Se muestran las estructuras de cada uno de los
sustituyentes en la Figura 10B. La purificación mediante
cromatografía en gel de sílice proporcionó productos puros con
16-84% de rendimiento. Los compuestos
1-6 (Figura 10B) se caracterizaron mediante
RMN-^{1}H y procedimientos espectrales de
masas.
Para identificar compuestos que no inhibirían
ninguna quinasa celular existente, se examinó el panel de análogos
de pirazolopirimidina sintéticos (1-6 (Figura 10)
frente a dos proteína tirosina quinasas purificadas estrechamente
relacionadas, v-Src y Fyn, en un ensayo de
fosforilación peptídica utilizando
[\gamma-^{32}P] ATP como trazador de
radiomarcaje de la actividad quinasa, como se describe en Shah
et al. (79). Los resultados mostraron que cada uno de los
compuestos 2-6 tenía valores de CI_{50} superiores
a 400 \muM para la inhibición de Src y los compuestos 3 y 5
mostraron valores de CI_{50} superiores a 400 \muM para la
inhibición de Fyn de tipo salvaje, indicando que estos análogos (2 y
5) son ortogonales a (no inhiben) estas quinasas de tipo salvaje
representativas.
Ejemplos
13-15
La desconvolución de las rutas de señalización de
proteína quinasas, utilizando enfoques genéticos y bioquímicos
convencionales, ha sido difícil debido al número abrumador de
quinasas estrechamente relacionadas. Si pudieran diseñarse
inhibidores permeables en célula de cada quinasa individual, el
papel de cada proteína quinasa podría evaluar sistemáticamente.
Se desarrolló un enfoque de combinación de
química y genética para obtener el primer inhibidor permeable en
célula específico único de la proteína tirosina quinasa oncogénica
v-Src. Se hizo una mutación de sitio activo
funcionalmente silenciosa en v-Src para distinguirla
de todas las demás quinasas celulares. Se diseñó y sintetizó un
inhibidor permeable en célula de unión fuerte (CI_{50}= 430 nM)
de esta quinasa mutante que no inhibe quinasas de tipo salvaje.
Ensayos in vitro y de célula completa establecieron la
especificidad única del par v-Src
mutante/inhibidor. Este inhibidor revierte los efectos de
transformación del término celular de la v-Src
modificada por ingeniería genética, pero no desestabiliza la
transformación celular mediada por v-Src de tipo
salvaje. Estas líneas celulares difieren sólo por un único
aminoácido en una única proteína quinasa, estableciendo que cambios
drásticos en la señalización celular pueden atribuirse directamente
a la inhibición específica de la quinasa modificada por ingeniería
genética. Se ensayó la generalidad de este procedimiento modificando
por ingeniería genética otra proteína tirosina quinasa, Fyn, para
contener la correspondiente mutación silenciosa. Se encontró que el
mismo compuesto era también un inhibidor potente (CI_{50}= 830 nM)
de esta quinasa mutante, confirmando la generalidad de la estrategia
hacia preparar inhibidores específicos de alelo de múltiples
proteína tirosina quinasas.
Pueden desarrollarse rápidamente inhibidores
permeables en célula específicos de alelo de quinasas individuales
de la familia Src utilizando un enfoque químico y genético
combinado. El tratamiento de fibroblastos NIH3T3 transformados con
v-Src mutante con una v-Src
específica única revierte los hitos morfológicos de transformación.
El inhibidor no exhibe efecto alguno sobre células transformadas
por el alelo de v-Src de tipo salvaje, sugiriendo
fuertemente que el fenotipo inducido por el tratamiento con
inhibidor es el resultado de un evento inhibidor único. La capacidad
de generar rápidamente inhibidores específicos de quinasa de modo
generalizable será útil para la desconvolución de las rutas
celulares mediadas por quinasa y para validar nuevas quinasas como
buenas dianas para el descubrimiento de fármacos tanto in
vitro como in vivo.
Como se afirmó anteriormente, se ha desarrollado
una estrategia combinada química y genética que permite la
generación de quinasas mutantes "sensibles químicamente" que se
inhiben únicamente por un inhibidor molécula pequeña diseñado
racionalmente. El enfoque implica modificar por ingeniería genética
un único bolsillo en el sitio activo de la quinasa de interés con
una mutación funcionalmente silenciosa. Se sintetiza después un
inhibidor específico de la quinasa modificada por ingeniería
genética derivatizando un inhibidor de quinasa conocido con un grupo
voluminoso diseñado para ajustarse al nuevo bolsillo del sitio
activo. El grupo voluminoso anula la potencia del inhibidor por
quinasas de tipo salvaje. Por lo tanto, un diseño complementario
exitoso conduce a interacciones de unión favorables que son sólo
posibles en el complejo quinasa modificada por ingeniería
genética/inhibidor. La transfección de células con el gen que
codifica la quinasa modificada por ingeniería genética genera una
célula en la que sólo una quinasa puede bloquearse por el inhibidor
diseñado (véase la Figura 13).
De forma importante, puesto que la quinasa
mutante sirve para la misma función que la quinasa de tipo salvaje,
un inhibidor de la mutante afectará a la señalización celular de la
misma manera que un inhibidor selectivo de la quinasa de tipo
salvaje en células no transfectadas. La capacidad de observar el
fenotipo de células después de la inhibición selectiva de cualquier
proteína quinasa proporciona un procedimiento rápido para determinar
los papeles únicos individuales en cascadas de transducción de
señal.
Las proteínas tirosina quinasas de la familia src
se tomaron como dianas para el diseño de inhibidor específico debido
a su importancia ubicua en la mediación de la función celular. A
pesar de las intensas investigaciones, los papeles de los miembros
individuales de la familia src han sido difíciles de evaluar debido
a la colocalización celular y a sus altas identidades de secuencia.
Aunque se conocen varios potentes inhibidores de quinasas de la
familia src, no se ha identificado ninguna molécula que pueda
discriminar eficazmente (20 veces selectivamente para un miembro de
la familia src) entre estas enzimas estrechamente relacionadas. Se
eligieron dos quinasas src funcionalmente importantes,
v-Src y Fyn, como dianas primarias del diseño de par
quinasa mutante/inhibidor. La quinasa Src ha surgido como una diana
de fármaco importante debido a su implicación en la oncogénesis de
cáncer de mama, pulmón y colon. Aunque la v-Src es
el prototipo de proteína tirosina quinasa oncogénica, no se han
descubierto inhibidores molécula pequeña que sean altamente
selectivos por esta quinasa. Fyn es una proteína tirosina quinasa de
la familia src que es importante en la activación de linfocitos
mediada por receptor de células T. Src y Fyn comparten una
estructura de dominio similar y tienen aproximadamente un 85% de
identidad aminoacídica en sus dominios catalíticos. La estrecha
relación estructural de los miembros de la familia src proporciona
el ensayo ideal de la capacidad de modificar por ingeniería genética
la especificidad enzima/inhibidor entre quinasas altamente
homólogas. Si puede discriminarse entre estos miembros src
estrechamente relacionados utilizando un inhibidor permeable en
célula, es probable que la especificidad para miembros de otras
familias de proteína quinasa pueda conseguirse también utilizando un
enfoque similar.
Todos los materiales de partida y reactivos
sintéticos se adquirieron en Aldrich a menos que se observe otra
cosa. Todos los compuestos se caracterizaron mediante
RMN-^{1}H y espectrometría de masas de alta
resolución. Se sintetizó
4-amino-1-terc-butil-3-fenilpirazol
3,4-d]pirimidina (2, Figura 14) según Hanefeld et
al.
Se añadieron 10 equivalentes del cloruro de
acilo deseado a 0ºC a una solución de 2 (100 mg) disuelto en 2 ml de
piridina. La mezcla de reacción se permitió calentar a temperatura
ambiente y se agitó durante 12 horas. La reacción se inactivó
mediante la adición de 25 ml de agua. La mezcla resultante se
extrajo con Et_{2}O y los extractos combinados de Et_{2}O se
lavaron con HCl 1 N y 5% de NaHCO_{3}. La fase de Et_{2}O se
secó sobre MgSO_{4} y se evaporó. El residuo se purificó mediante
cromatografía ultrarrápida en 25 g de sílice mediante elución con
Et_{2}O/hexanos 1:1, proporcionando 3a-3g
puros.
Rendimiento: 0,0116 g (16%), polvo blanco; EMAR
(IE) ión molecular calculado para C_{20}H_{23}N_{5}O:
349,19049, encontrado. 349,18762; RMN-^{1}H (300
MHz, CDCl_{3}, ppm) d 1,86 (9H, s), 1,89-2,27 (6H,
m), 3,58 (1H, m), 7,26-7,67 (5H, m), 8,69 (1H,
s).
Rendimiento: 0,0456 g (68%), polvo blanco; EMAR
(IE) ión molecular calculado para C_{21}H_{25}N_{5}O:
363,20615, encontrado: 363,20398; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}, ppm) d 1,41-1,91 (8H, m), 1,87 (9H,
s), 2,97 (1H, m), 7,51-7,67 (5H, m), 8,70 (1H,
s).
Rendimiento: 0,0575 g (84%), polvo blanco; EMAR
(IE) ión molecular calculado para C_{22}H_{27}N_{5}O:
RMN-^{1}H (270 MHz, CDCl_{3}, ppm) d
1,21-1,93 (10H, m), 1,86 (9H, s), 2,43 (1H, m),
7,51-7,67 (5H, m), 8,70 (1H, s).
Rendimiento: 0,0342 g (60 g), polvo blanco; EMAR
(IE) ión molecular calculado para C_{20}H_{19}N_{5}O_{2}:
361,15407, encontrado: 361,15254; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}, ppm) d 1,87 (9H, s), 6,52 (1H, d), 7,23 (1H, d),
7,43-7,53 (5H, m), 7,95 (1H, s), 8,59 (1H, s).
Rendimiento: 0,1309 g (56%), polvo blanco, EMAR
(IE) ión molecular calculado para C_{22}H_{21}N_{5}O
371,17933, encontrado: 371,17324; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}, ppm): d 1,41-1,91 (8H, m),
7,22-8,11 (10H, m), 8,48 (1H, s).
Rendimiento: 0,0751 g (33%), polvo blanco; EMAR
(IE) ión molecular calculado para C_{23}H_{23}N_{5}O:
385,19499, encontrado: 385,18751; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}, ppm) d 1,88 (9H, s), 2,42 (3H, s), 7,19 (2H, d),
7,41-8,11 (7H, m), 8,49 (1H, s).
Rendimiento: 0,1050 g (42%), polvo blanco, EMAR
(IE) ión molecular calculado para C_{26}H_{29}N_{5}O:
427,23747, encontrado: 427,23474; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}, ppm) d 1,35 (9H, s), 1,88 (9H, s),
7,38-7,99 (9H, m), 8,50
\hbox{(1H,
s).}
Se cargó un matraz de fondo redondo con 30 mg de
LiAlH_{4}. El matraz se equipó con un embudo de adición igualador
de presión y se purgó con argón seco. Se suspendió el LiAlH_{4} en
3 ml de THF en un baño de hielo. Se disolvieron aproximadamente 100
mg del correspondiente análogo 2 N-4 acilo en 5 ml
de THF y se añadieron gota a gota a la suspensión de LiAlH_{4}. La
mezcla de reacción se agitó durante 30 min en baño de hielo y se
calentó posteriormente a reflujo durante 30 min. La reacción se
inactivó mediante adiciones secuenciales gota a gota de 1 ml de
AcOEt, 1 ml de agua y 1 ml de NaOH 6 N. Después de agitar durante 5
minutos, la mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla
de celite, se diluyó con agua y se extrajo con Et_{2}O. Los
extractos de Et_{2}O se combinaron, se secaron sobre MgSO_{4} y
se evaporaron. El residuo se purificó mediante cromatografía
ultrarrápida en 10 g de gel de sílice mediante elución con
hexanos/AcOEt 4:1.
Rendimiento 0,0649 (75%), aceite transparente,
EMAR (IE) ión molecular calculado para C_{21}H_{27}N_{5}:
349,22691, encontrado: 349,2240; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}, ppm) d 1,16-2,14 (9H, m), 1,84 (9H,
s), 3,54 (2H, d), 5,51 (1H, s), 7,46-7,67 (5H, m),
8,43 (1H, s).
Rendimiento: 0,0620 (66%), polvo beis, EMAR (IE)
ión molecular calculado para C_{20}H_{21}N_{5}O: 347,17843,
encontrado: 371,17330; RMN-^{1}H (270 MHz,
CDCl_{3}, ppm) d 1,83 (9H, s), 4,75 (2H, d), 5,64 (1H, s), 6,25
(2H, d), 7,34-7,63 (6H, m), 8,45 (1H, s).
Rendimiento: 0,0520 g (54%), polvo blanco, EMAR
(IE) ión molecular calculado para C_{22}H_{23}N_{5}:
357,19559, encontrado: 357,19303; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}, ppm) d 1,82 (9H, s), 4,76 (2H, d), 5,63 (1H, s),
7,28-7,63 (10H, m), 8,44 (1H, s).
Se llevaron a cabo mutagénesis dirigida a sitio y
clonación de los genes de las proteínass de fusión con
glutation-S-transferasa de dominio
SH1 de WT v-Src, SH1 de I338G v-Src,
WT Fyn, T339G Fyn y WT Abl en el plásmido pGEX-KT
como se describe anteriormente. Estas quinasas se expresaron en
DH5\alpha de E. coli y se purificaron sobre perlas de
glutation inmovilizado (Sigma). Se adquirió PKA (Pierce) y se
utilizó sin purificación adicional. Se expresó PKCd en forma del
constructo 6-His utilizando el sistema de expresión
Bac-to-Bac® (vector pFastBac B). Se
purificó PKCd utilizando una columna de agarosa
QIAexpress®Ni-NTA.
Se determinaron las CI_{50} para inhibidores de
quinasa putativos midiendo las cuentas por minuto (cpm) de ^{32}P
transferido a un sustrato peptídico optimizado para las quinasas de
la familia src (IYGEFKKK (SEC Nº ID 12)). Se incubaron diversas
concentraciones de inhibidor con Tris 50 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 10
mM, glutation 1,6 mM, BSA 1 mg/ml, IYGEFKKK (SEC Nº ID 12), 3,5% de
DMSO, quinasa 0,05 mM y [\gamma-^{32}P] ATP 11
nM (2 mCi) (6000 Ci/mmol, NEN) en un volumen total de 30 ml durante
30 minutos. Las mezclas de reacción (25 ml) se pulverizaron sobre un
disco de fosfocelulosa, se sumergieron en HOAc al 10% y se lavaron
con 0,5% de H_{3}PO_{4}. Se midió la transferencia de ^{32}P
mediante recuento de centelleo estándar. CI_{50} se define como la
concentración de inhibidor a la que las cpm fueron un 50% del disco
control. Cuando la CI_{50} entraba entre dos concentraciones
medidas, se calculó basándose en la presunción de una relación
inversamente proporcional entre la concentración de inhibidor y las
cpm entre los dos puntos de datos. Debido a que el límite de
solubilidad de los análogos inhibidores en soluciones acuosas es
\sim300 \muM, los valores de CI_{50} de \sim250 \muM son
aproximados, ya que las valoraciones completas del límite superior
de inhibición no pudieron ensayarse. Las CI_{50} para quinasas de
familias no scr se midieron equivalentemente con las siguientes
excepciones. Se utilizó quemptida (Pierce, 133 mg/ml) como sustrato
para PKA. Se utilizó un Abl optimizado (EAIYAAPFAKKK (SEC Nº ID 13)
133 mg/ml) para ensayos de Abl. Los ensayos de PKCd se realizaron en
presencia de diacilglicerol 17 ng/ml (Sigma) y fosfatidilserina 17
ng/ml (Sigma) con histona 170 ng/ml (Sigma) como sustrato de
quinasa.
Se aislaron linfocitos esplénicos de ratones
Balb/C o C57/B6 de 6-20 semanas. Las células se
retiraron por lavado del bazo en medio RPMI que contenía ADNasa 1
mg/ml y los glóbulos rojos se lisaron en cloruro de trisamonio 17
mM, pH 7,2. Se incubaron aproximadamente 4 x 10^{6} células a 37ºC
durante 30 minutos con 3g 100 \muM o 2 en 1,1% de DMSO. La
estimulación de células B se inició mediante la adición de 2 mg de
IgM de cabra anti-ratón (Jackson Immuno Research, nº
cat. 115-005-075) y posterior
incubación durante 5 minutos a 37ºC. Las células se aislaron
mediante centrifugación (13.000 rpm, 2 min) y se lisaron (tampón de
lisis: 1% de Triton X-100, Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA
2 mM, NaCl 150 mM, PMSF 100 mM, ortovanadiato de sodio 2 mM,
leupeptina 10 mg/ml, apoprotina 10 mg/ml). Los residuos celulares se
sedimentaron después a 13.000 rpm durante 15 min. Las proteínas
celulares se separaron mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida al 10% y se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa mediante transferencia Western. Las proteínas que
contenían fosfotirosina se visualizaron mediante inmunotransferencia
con anticuerpo anti-fosfotirosina (Upstate
Biotechnology, Inc.).
Se transfectaron genes codificantes de WT e I338G
v-Src a una línea celular empaquetada y se
infectaron fibroblastos NIH3T3 retroviralmente utilizando el vector
retroviral pBabe y un marcador selectivo de puromicina (2,5 mg/ml)
como se ha descrito (Shah, K., Liu, Y., Shokat, K.M., en
preparación). Se cultivaron las células transformadas con WT y
I338G v-Src en DMEM/10% de BCS que contenía
puromicina 2,5 mg/ml).
Se incubaron células NIH3T3 no transformadas,
células NIH3T3 transformadas con WT v-Src y células
NIH3T3 transformadas con I338G v-Src a 37ºC con 1,1%
de DMSO o 3 g 100 \muM en 1,1% de DMSO. Después de 12 horas, las
células se lavaron con PBS y se lisaron (tampón de lisis: 1% de
Triton X-100, Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 2 mM, NaCl
150 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 100 mM, ortovanadiato de
sodio 2 mM, leupeptina 10 mg/ml, apoprotina 10 mg/ml). El lisado se
clarificó mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 15 min. Las
concentraciones de proteína en el lisado se normalizaron, se
resolvieron electroforéticamente volúmenes iguales del lisado y se
analizó el contenido de fosfotirosina como se describe
anteriormente.
Se hicieron crecer fibroblastos NIH3T3 no
transformados, transformados con WT v-Src y
transformados con I338G v-Src en DMEM/10% de BCS en
portaobjetos tratados con cultivo de tejido. Las células que
expresaban v-Src se trataron con 1,1% de DMSO o bien
con 3 g 100 \muM en 1,1% de DMSO. Después de 48 horas, las células
se fotografiaron con 400 x aumentos con un microscopio óptico Nikon
TMS. Inmediatamente después de la microscopía óptica, las células se
fijaron durante 20 min en 3,7% de formaldehído/PBS y se
permeabilizaron durante 60 s en 0,2% de Triton
X-100/PBS. Las células permeabilizadas se incubaron
con faloidina-FITC 200 ng/ml/PBS durante 20 min. Se
aclararon los portaobjetos con PBS y se visualizó la actina
polimerizada mediante microscopía de fluorescencia con 600 x
aumentos con un microscopio de fluorescencia Zeiss.
Se desarrolló un residuo funcionalmente
conservado en el bolsillo de unión a ATP de v-Src
(Ile338) que podría mutarse a glicina sin alterar la especificidad
fosfoaceptora o la función biológica de la quinasa. La mutación
creadora de espacio causa sólo una modesta caída de k_{cat}, un
modesto aumento de K_{m} por ATP y ningún cambio cuantitativo en
el nivel de transformación de fibroblastos (Shah K., resultados no
publicados). Los sustratos biológicos de la v-Src
mutante no cambian y la I338G v-Src lleva a cabo las
mismas funciones biológicas que la v-Src de tipo
salvaje. Todas las estructuras cristalinas de las proteínas quinasas
unidas a ATP han revelado una interacción de estrecho contacto entre
el residuo correspondiente a 338 (numeración Src) y el ATP. El
análisis de los alineamientos de secuencia de proteína quinasa
confirmó que el residuo 338 contiene una cadena lateral voluminosa
(habitualmente Thr, Ile, Leu, Met o Phe) en todas las proteínas
quinasas eucarióticas conocidas. Por tanto, una mutación de glicina
en la posición 338 crearía un nuevo bolsillo que no está presente
en ninguna quinasa de tipo salvaje. Debido al sitio de unión a ATP
expandido, las quinasas mutantes de glicina deberían aceptar
inhibidores voluminosos que no podrían unirse a quinasas de tipo
salvaje. Utilizando procedimientos convencionales, se clonó la
proteína de fusión
glutation-S-transferasa (GST) de los
dominios catalíticos de WT e I338G v-Src, se
expresó y se purificó como se describe anteriormente. Se expresaron
también WT Fyn, T339G Fyn (numeración Src) y WT Abl y se purificaron
en forma de proteínas de fusión GST.
Para ensayar la estrategia de diseño básica, se
ensayaron los dominios SH1 de WT e I3398G v-Src
frente a un panel previamente sintetizado de moléculas de adenosina
N-6 sustituidas para la inhibición selectiva de
I338G v-Src frente a WT v-Src.
Debido a que la adenosina es sólo un inhibidor moderado de las
proteínas tirosina quinasas de la familia src, no se esperaba
descubrir un potente inhibidor de la quinasa modificada por
ingeniería genética. Como se esperaba, todos los análogos de
N-6 adenosina inhibieron I338G v-Src
más potentemente que WT v-Src. El inhibidor más
potente encontrado en este examen fue N-6
ciclopentiloxiadenosina (1, Figura 14A) con una concentración
inhibidora de un 50% (CI_{50}) de 1 mM por I338G
v-Src. Los experimentos posteriores para ensayar la
selectividad demostraron que la N-6
ciclopentiloxiadenosina no mostraba una inhibición in vitro
detectable de WT v-Src ni Fyn a concentraciones de
hasta 400 mM. Este primer examen animó a proseguir la estrategia de
desarrollo de nuevos inhibidores de I338G v-Src,
puesto que el diseño había permitido superar fácilmente las barreras
de selectividad que son importantes problemas en el descubrimiento
convencional de inhibidores.
Como inhibidores, los análogos de adenosina no
son ideales debido a las muchas funciones celulares realizadas por
la adenosina, así como el gran número de proteínas celulares que
unen adenosina. Los análogos de N-6 adenosina han
mostrado actuar como agonistas y antagonistas de receptor de
adenosina, y puede imaginarse que los análogos de
N-6 adenosina actúen como sustratos para nucleósido
quinasas. Por estas razones, se utilizó una clase de inhibidores de
proteína tirosina quinasa conocida que no son análogos directos de
moléculas biológicamente conocidas. La estrategia de diseño
reclamaba una estructura núcleo que exhiba una potente inhibición de
múltiples quinasas de tipo salvaje y se sintetice fácilmente.
También, la orientación de unión de la molécula en el sitio activo
enzimático debe ser conocida o fácilmente predecible. Además, la
molécula debe unirse de manera que el sitio que apunta a Ile338
pueda modificarse fácilmente. Como núcleo del inhibidor se utilizó
la estructura 4-amino-1-
terc-butil-3-fenilpirazolo[3,4-d]pirimidina
(2, Figura 14B). Esta molécula es un derivado de
4-amino-1-terc-butil-3-(p-metilfenil)pirazolo[3,4-d]pirimidina
(PP1) que se reseñó por Hanks y colaboradores como un potente
inhibidor de las quinasas de la familia src. Basándose en la
estructura cocristalina de la quinasa de la familia src Hck, unida
al inhibidor general de quinasa quercetina (5, Figura 15A), se
postuló que 2 se une a quinasas de la familia src en una
conformación similar a la del ATP. La orientación de unión predicha
de 2 en Hck se muestra en una superposición con las estructuras
cocristalinas conocidas de Hck con AMP PNP (6) y quercetina (Figura
15B). En esta conformación, la posición fácilmente derivatizable
N-4 de 2 corresponde al N-6 del ATP
(contacto estrecho con el reiduo 338, Figura 15C). Y el resto
terc-butilo se corresponde aproximadamente al anillo ribosa
del ATP. Se hipotetizó que en esta orientación el anillo fenilo
C-3 de 2 podría unirse a un bolsillo que rodea el
N-7 de ATP, como se observa en la estructura
cocristalina Hck/quercetina. Este análisis conduce a sintetizar un
pequeño panel de análogos N-4 derivatizados de 2
(Figura 14).
El panel de
pirazolo[3,4-d]pirimidinas se examinó frente a
quinasas WT e I338G v-Src. Todos los análogos son
mejores inhibidores de la v-Src modificada por
ingeniería genética en comparación con el tipo salvaje, confirmando
la predicción de la orientación de unión de 2 en el sitio activo de
quinasa. Cualquier derivatización de 2 en la posición
N-4 destruye la actividad inhibidora frente a WT
v-Src (sin inhibición detectable en el límite de
solubilidad, 300 mM). Los 10 análogos demostraron una inhibición
mensurable de I338G v-Src y varios de los compuestos
tienen CI_{50} en el intervalo bajo mM. El análogo
N-4-(p-terc-butil)
benzamido-1-terc-butil-3-fenilo
(3g de la Fig. 14) es el inhibidor más potente de I338G
v-Src en el panel (CI_{50}= 430 nM). Esta
molécula no muestra inhibición de WT v-Src a 300 mM,
sugiriendo que 3g es un inhibidor al menos 1000 veces mejor de la
v-Src mutante en comparación con el tipo salvaje. El
gran tamaño de la derivatización necesaria para conseguir una
potencia submicromolar para el sitio activo de I338G
v-Src fue bastante inesperado. Sólo se eliminaron
cuatro átomos de carbono del sitio de unión a ATP y se derivatizó la
molécula original con once átomos de carbono. Esta discrepancia
puede deberse a una imperfección en la predicción de unión, También,
la mutación Ile a Gly puede conferir una mayor flexibilidad al sitio
activo de la enzima, permitiendo que la quinasa mutante acepte un
análogo inhibidor más grande que el predicho. Para confirmar que 3g
inhibe I338G v-Src en el sitio de unión a ATP, se
investigó su cinética de inhibición a diversas concentraciones de
ATP. El análisis de Lineaweaver-Burk confirmó que 3g
inhibe I338G v-Src competitivamente con respecto a
ATP con una constante de inhibición (K_{i}) de aproximadamente 400
nM.
El panel de análogos de inhibición se examinó de
nuevo frente a WT Fyn para investigar su potencial de reacción
cruzada con esta quinasa. Se eligió WT Fyn como control del "caso
peor" de quinasas de tipo salvaje porque la molécula original
publicada, PP1, y 2 (Figura 14) son inhibidores de Fyn altamente
potentes (bajo nM). Muchos de los 10 análogos sintéticos no
presentaron una alta selectividad por la quinasa diana. Los análogos
N-acilo con sistemas de anillo saturados
(3a-3c, Figura 14) inhiben eficazmente la Fyn de
tipo salvaje. Los compuestos N-metileno (4b, 4d, 4e,
Figura 14) son suficientemente ortogonales a WT Fyn, pero muestran
sólo una inhibición baja a moderada de la v-Src
modificada por ingeniería genética. De forma importante, 3g (Figura
14), el inhibidor más potente de la mutante v-Src,
inhibió WT Fyn muy débilmente (CI_{50}= 300 mM). Por tanto, 3g
inhibe v-Src modificada por ingeniería genética más
de 700 veces más eficazmente que WT Fyn, que es probablemente la
quinasa celular de tipo salvaje que es más capaz de unir la
molécula. Otras quinasas de familias no src se inhibieron
fortuitamente por 3g in vitro, Las serina/treonina quinasas,
PKCd y PKA, no se inhibieron detectablemente a concentraciones hasta
300 mM. Igualmente, 3g exhibió sólo una débil inhibición
(CI_{50}>300 mM) de la proteína tirosina quinasa Abl. Por lo
tanto, 3g satisfizo todos los requisitos de diseño iniciales para
una inhibición potente y selectiva de una quinasa modificada por
ingeniería genética.
Para demostrar adicionalmente que 3g (Figura 14)
no inhibe proteína tirosina quinasas de tipo salvaje, se
investigaron los efectos del tratamiento de 3g sobre la cascada de
fosforilación mediada por receptor de células B (BCR). Las proteína
tirosina quinasas de la familia src (Fyn, Lyn, Lck, Blk) y de una
familia no src (Btk, Syk) son conocidas por activarse tras la
reticulación de BCR. Debido a la naturaliza amplificadora de la
cascada mediada por BCR, la inhibición de cualquiera de estas
quinasas alteraría drásticamente la distribución e intensidad de la
postactivación de fosfotirosina celular. Debido a que 3g se diseñó
para ser estéricamente incompatible con los sitios activos de
quinasas de tipo salvaje, no debería interrumpir la señalización
dependiente de fosforilación de tirosina en células B de tipo
salvaje. El tratamiento de 3g 100 \muM con células B de murina
reticuladas con receptor de antígeno no tiene efecto sobre el patrón
de fosforilación de la estimulación de células B. Las intensidades
de señal de todas las bandas principales no cambian, y sólo es
detectable una ligera depleción de algunas bandas menores,
confirmando que 3g no inhibe apreciablemente el panel de proteína
tirosina quinasas que se activan mediante reticulación de BCR. El
tratamiento de células B con 2 100 mM, sin embargo, causa una
reducción significativa de la fosforilación de tirosina que es
consistente con su potente inhibición de las quinasas de la familia
src de tipo salvaje.
Para utilizar el inhibidor selectivo para
estudiar una ruta mediada por Src, se introdujeron retroviralmente
tanto WT como I338G v-Src en fibroblastos NIH3T3.
Estas células adquieren un fenotipo transformado que depende del
término de v-Src. Se mostró que 3g (Figura 14) podía
alterar selectivamente la ruta de transducción de señal dependiente
de Src de células transformadas con I338G v-Src, no
afectando a células transformadas con WT. El tratamiento de células
infectadas con WT v-Src (3g 100 \muM) no causa
pérdida de fosforilación de tirosina en comparación con los
carriles tratados con DMSO control (Figura 16), demostrando que el
inhibidor diseñado no inhibe WT-Src o cualquiera de
las otras proteína tirosina quinasas que se activan mediante
transformación celular mediada por v-Src. Un
tratamiento equivalente de células transformadas con I338G
v-Src da lugar a una drástica reducción de la
fosforilación de tirosina del sustrato v-Src
putativo, p36, así como una reducción global moderada del nivel
celular de fosfotirosina. Anteriormente, se ha mostrado que el
tratamiento de células transformadas con v-Src con
inhibidores generales de proteína tirosina quinasas causa una
reducción de la fosforilación de tirosina de una proteína de 36 kDa.
Se cree que p36 está asociada a una fosfotirosinafosfatasa
específica, explicando posiblemente su rápida desfosforilación en
células tratadas con inhibidor.
La CI_{50} de 3g por la señal de fosfotirosina
de p36 en células que expresan I338G v-Src (50 mM)
es aproximadamente 100 veces el valor in vitro. Esto es
debido presuntamente al hecho de que el inhibidor debe competir con
concentraciones milimolares de ATP por el sitio activo de quinasa en
los experimentos celulares.
La actividad v-Src es necesaria
para la transformación del virus del sarcoma de Rous de células de
mamífero. El tratamiento de células NIH3T3 que expresan I338G
v-Src con 3g 100 \muM (Figura 14) causó cambios
drásticos en la morfología celular que son consistentes con la
reversión de la transformación (Figura 17). Las células mutantes que
se trataron con inhibidor 3g parecieron planas y no exhibieron las
características de crecimiento de las células transformadas
(concretamente la capacidad de crecer una encima de otra). En
condiciones idénticas, las células WT V-Src
infectadas demostraron la morfología prototípica redondeada y
patrones de crecimiento superpuesto de las células
transformadas.
Para demostrar adicionalmente la reversión
selectiva de la morfología celular se utilizó microscopía de
fluorescencia para ver células tratadas con 3g después de teñir la
actina polimerizada celular con faloidina-FITC
(Figura 17). Las células NIH3T3 no transformadas muestran largos
husos de actina que se forman entre las células. Las células
transformadas con v-Src (tanto WT como I338G)
parecen redondeadas sin un patrón discernible de formación de
actina. De acuerdo con los datos de microscopía óptica, las células
que expresan WT v-Src tratadas con inhibidor parecen
indistinguibles de células WT no tratadas. Sin embargo, células que
expresan I388G v-Src tratadas con 3g tienen fibras
de actina polimerizada definidas, fuertemente parecidas a las
formaciones de actina de fibroblastos NIH3T3 no transformados. Estas
células tratadas con inhibidor tienen una morfología exageradamente
aplanada y muestran una tinción de actina periférica que no está
presente en las células NIH3T3 no transformadas. Este dato muestra
que 3g puede inducir únicamente cambios morfológicos en células que
están modificadas por ingeniería genética para contener un único
cambio de aminoácido en la quinasa de interés. Esta es la primera
demostración de que un inhibidor molécula pequeña selectivo por un
producto oncogénico de proteína tirosina quinasa puede revertir los
cambios morfológicos asociados a la transformación celular. Los
ejemplos previos de reversión morfológica de la transformación
mediante herbimicina A (y otras benzoquinonansamicinas) han mostrado
recientemente funcionar mediante un mecanismo no relacionado con la
inhibición de quinasa, constituido por un direccionamiento mediado
por proteína de shock término (hsp90) de la proteína tirosina
quinasa oncogénica al proteosoma.
La ventaja de utilizar mutagénesis es proporciona
una diferencia molecular única entre la enzima de interés y todas
las demás es que, debido al plegamiento conservado de las quinasas,
el enfoque debería ser extensible a la superfamilia de quinasas.
Casi todas las proteínas quinasas conocidas contienen una cadena
lateral voluminosa en la posición correspondiente al residuo 338 de
v-Src. Por lo tanto, una mutación creadora de
espacio en esta posición debería volver múltiples quinasas
susceptibles de inhibición selectiva. Para ensayar esto, se midió la
inhibición de los análogos frente a T339G Fyn. Existe una destacada
similitud en las relaciones estructura-actividad de
los análogos I338G v-Src y T339G Fyn. De acuerdo con
los datos para I338G, 3g era el análogo inhibidor más potente
frente a T339G Fyn, exhibiendo una CI_{50} de 830 nM. Esto
corresponde a una selectividad de más de 300 veces por T339G Fyn
frente a WT Fyn. La implicación de este dato es que múltiples
proteína tirosina quinasas pueden modificarse sistemáticamente por
ingeniería genética para aceptar preferiblemente un análogo
inhibidor sin necesidad de examinar grandes bibliotecas de
inhibidores putativos.
Lo anterior se describe un nuevo enfoque de
inhibición selectivo de proteína quinasa mediante la modificación
complementaria por ingeniería genética de quinasas químicamente
sensibles e inhibidores diseñados racionalmente. Se demostró que
puede conseguirse una alta selectividad por la quinasa diana en
células completas, y que la inhibición del sitio activo de una
proteína tirosina quinasa oncogénica puede ser suficiente para la
interrupción de una morfología de célula transformada. Debido a que
el enfoque es fácilmente generalizable, debería tener aplicaciones
de más alcance para la desconvolución de rutas de transducción de
señal, así como para la validación de quinasas como dianas para el
diseño de fármacos. La vía del descubrimiento de fármacos eficaces
está limitada por la identificación y validación de importantes
dianas de fármaco. Este no es un problema trivial en un medio de
2000 proteínas homólogas. El uso de mutantes químicamente sensibles
de proteína quinasas expande la capacidad de ensayar los efectos
celulares y fisiológicos de la inhibición farmacológica de quinasas.
Puesto que pueden generarse ahora rápidamente líneas celulares
transfectadas e incluso ratones "con introducción génica", el
enfoque debería acelerar en gran medida el proceso de ensayar los
efectos de la inhibición selectiva de una quinasa dada en una célula
completa o modelo animal. A medida que se ponen a disposición más
estructuras cristalinas de proteína quinasa unida a inhibidor, esta
estrategia permitirá la investigación sistemática de los efectos de
la inhibición dependiente del tiempo y la dosis de cualquier quinasa
dada en el alcance de una cascada de transducción de señal
entera.
Basándose en los experimentos de la presente
memoria, el diseño basado en la estructura dirigida de pares
quinasa/inhibidor ha proporcionado inhibidores permeables en célula
específicos mutantes de quinasas de la familia Src modificados por
ingeniería genética con potencias que no han sido alcanzables con
procedimientos de examen de inhibidores convencionales. Al mutar el
sitio activo de v-Src, no sólo se ha diferenciado
una proteína quinasa de todas las demás, sino que simultáneamente se
ha creado un sitio de unión nuevo accesible para uso en el diseño de
inhibidores más potentes. Por tanto, puede aumentarse tanto la
potencia como la selectividad en comparación con las estrategias de
diseño de inhibidor tradicionales. El diseño es altamente
generalizable, debido a la conservación de las quinasas en el sitio
correspondiente a Ile338 en v-Src. De hecho,
trabajos recientes han mostrado que la sensiblidad de las proteínas
quinasas activadas por mitógenos (MAPK) hacia inhibidores de
piridinilimidazol está controlada en gran parte por la cadena
lateral del residuo 106, que corresponde a 338 de Src. La ventaja
principal del enfoque del diseño de inhibidores selectivos de
quinasa para el estudio de la función proteína quinasa es la
capacidad de "programar" genéticamente la quinasa de interés
para una inhibición única por una molécula pequeña. Esto permite la
asignación no ambigua de la actividad de una quinasa específica al
fenotipo inducido. La combinación de manipulación genética y control
con molécula pequeña de la actividad enzimática debería tener
aplicaciones de gran alcance en la validación farmacológica de
proteína quinasas como dianas viables de fármaco en células, así
como en organismos completos.
Se llevaron a cabo mutagénesis dirigida a sitio y
clonación de los genes de las proteínass de fusión con
glutation-S-transferasa de dominio
catalítico de v-Src de tipo salvaje, SH1 de I338G
v-Src y WT Fyn en el plásmido
pGEX-KT como se describe anteriormente. Estas
quinasas se expresaron en DH5\alpha de E. coli y se
purificaron sobre perlas de glutation inmovilizado (Sigma).
Se determinaron las CI_{50} para inhibidores de
quinasa putativos midiendo las cuentas por minuto (cpm) de ^{32}P
transferido a un sustrato peptídico optimizado para las quinasas de
la familia src (IYGEFKKK (SEC Nº ID 12)). Se incubaron diversas
concentraciones de inhibidor con Tris 50 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 10
mM, glutation 1,6 mM, BSA 1 mg/ml, IYGEFKKK (SEC Nº ID 12), 3,3% de
DMSO, la quinasa apropiada y [\gamma-^{32}P]
ATP 11 nM (2 mCi) (6000 Ci/mmol, NEN) en un volumen total de 30 ml
durante 30 minutos. Las mezclas de reacción (25 ml) se pulverizaron
sobre un disco de fosfocelulosa, se sumergieron en 10% de HOAc y se
lavaron con 0,5% de H_{3}PO_{4}. Se midió la transferencia de
^{32}P mediante recuento de centelleo estándar. CI_{50} se
define como la concentración de inhibidor a la que las cpm fueron un
50% del disco control. Cuando la CI_{50} entraba entre dos
concentraciones medidas, se calculó basándose en la presunción de
una relación inversamente proporcional entre la concentración de
inhibidor y las cpm entre los dos puntos de datos.
Todos los materiales de partida y reactivos
sintéticos se adquirieron de suministradores comerciales a menos que
se indique otra cosa. Los cloruros de ácido que no estaban
comercialmente disponibles (3c, 3d, 3e, 3h, 3i) se sintetizaron
tratando los correspondientes ácidos carboxílicos con cloruro de
oxalilo en exceso y DMF catalítica en dietiléter. Todos los análogos
de PP-1 se sintetizaron según Hanefeld et
al.
Polvo blanco; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}) d 1,92 (s, 9H), 5,04 (m, 2H),
7,43-7,73 (m, 4H), 7,92-8,02 (m,
3H), 8,34 (s, 1H); EMAR (IE) ión molecular calculado para
C_{19}H_{19}N_{5}: 317,16427, encontrado: 317,16247.
Polvo blanco, RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}) d 1,88 (s, 9H), 5,55 (m, 2H),
7,56-8,00 (m, 6H), 8,16 (s, 1H), 8,39 (s, 1H); EMAR
(IE) ión molecular calculado para C_{19}H_{19}N_{5}:
317,16427, encontrado: 317,16539.
Polvo blanco; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}): d 1,83 (s, 9H), 5,61 (m, 2H),
7,08-7,49 (m, 9H), 8,35 (s, 1H), EMAR (IE) ión
molecular calculado para C_{21}H_{21}N_{5}: 359,17483,
encontrado: 359,17325.
Polvo blanco; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}) d 1,85 (s, 9H), 5,17 (s, 2H), 5,55 (m, 2H), 5,74
(s, 2H), 7,10 (d, J= 8 Hz, 1H), 7,27-7,48 (m, 8H),
8,34 (s, 1H), EMAR (IE) ión molecular calculado para
C_{22}H_{23}N_{5}O: 373,19049, encontrado: 373,18833.
Polvo blanco; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}) d 1,85 (s, 9H), 5,36 (m, 2H), 5,74 (s, 2H),
7,11-7,51 (m, 7H), 8,36 (s, 1H), EMAR (IE) ión
molecular calculado para C_{22}H_{21}Cl_{2}N_{5}O:
441,11263, encontrado: 441,11050.
Polvo blanco; RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}) d 1,83 (s, 9H), 5,70 (m, 2H), 6,05 (s, 2H), 6,96
(d, J= 8 Hz, 1H), 7,13-7,27 (m, 2H), 8,34 (s, 1H),
EMAR (IE) ión molecular calculado para
C_{16}H_{17}N_{5}O_{2}: 311,13841, encontrado:
311,13777.
Polvo blanco, RMN-^{1}H (300
MHz, CDCl_{3}) d 1,38 (s, 9H), 1,84 (m, 9H), 5,83 (s, 2H), 7,58
(dd, J= 8 Hz, 12 Hz, 4H), 8,33 (s, 1H), EMAR (IE) ión molecular
calculado para C_{19}H_{25}N_{5}: 323,21125, encontrado:
323,21024.
Polvo blanco, RMN-^{1}H (270
MHz, CDCl_{3}) d 1,85 (s, 9H), 4,76 (s, 2H), 5,04 (s, 2H), 7,19
(d, J= 6 Hz, 1H), 7,39 (t, J= 8 Hz, 1H), 7,55 (t, J= 4 Hz, 2H),
7,79-7,92 (m, 2H), 8,20 (d, J= 8 Hz, 1H), 8,24 (s,
1H); EMAR (IE) ión molecular calculado para C_{20}H_{21}N_{5}:
331,17993, encontrado: 331,17951.
Polvo beis; RMN-^{1}H (270 MHz,
CDCl_{3}) d 1,83 (s, 9H), 5,57 (m, 2H), 6,12 (s, 2H), 7,07 (d, J=
6 Hz, 1H), 7,39-7,54 (m, 4H), 7,84 (d, J= 8 Hz, 1H),
8,25 (d, J= 8 Hz, 1H), 8,35 (s, 1H); EMAR (IE) ión molecular
calculado para C_{20}H_{21}N_{5}O: 347,17483, encontrado:
347,17408.
Inicialmente, la N^{4} amina exocíclica
del inhibidor
4-amino-1-(terc-butil)-3-fenilpirazolo[3,4-d]pirimidina
(1, Figura 19) de quinasa de la familia Src se utilizó como gancho
químico que podría enlazarse a grupos voluminosos para destruir la
afinidad de la molécula por quinasas de tipo salvaje (1 como análogo
modificado desmetilado de PP1, reseñado por Hanks et al.).
Aunque este enfoque proporcionó un inhibidor muy selectivo (2,
Figura 19) de la quinasa v-Src modificada de tipo
salvaje (I338G v-Src), no fue totalmente
satisfactorio porque se perdió más de un orden de magnitud de
energía de unión desde la afinidad de partida de la molécula
original por quinasas de la familia Src de tipo salvaje (véase la
Figura 19).
Para aumentar la potencia de los inhibidores, se
modelizó la unión de 1 al sitio activo del bolsillo de unión de la
quinasa de la familia Src, Hck. Utilizando el programa de gráficos
moleculares GRASP, la proteína se comparó con el mapa de superficie
del bolsillo de unión a ATP de Hck con el correspondiente mapa
predicho del bolsillo expandido en la proteína quinasa modificada
por ingeniería genética. A partir de este modelo, se dedujo que la
derivatización de N^{4} no era el único medio para generar
interacciones de Van der Waals complementarias con el bolsillo de
unión único de I338G v-Src. Pudo observarse en el
mapa de superficie que la derivatización del anillo fenilo C^{3}
de 1 (ex.: anillo fenilo reemplazado por sistema anillo naftilo,
compuesto 6a) con un grupo voluminoso conduce a un choque estérico
entre el inhibidor derivatizado y la superficie molecular creada por
Thr338. La mutación del residuo 338 a glicina genera un bolsillo de
unión único que se predice que será suficientemente grande para
aceptar el análogo naftilo de 1. La derivatización de este grupo
fenilo con sustituyentes hidrófobos proporciona compuestos que
complementan el sitio activo de I338G v-Src
correspondiente sin interrumpir ninguna interacción de puente de
hidrógeno potencial en N^{4}. Además, este volumen añadido
en el resto C^{3} causa que estas moléculas sean estéricamente
incompatibles con los sitios activos de proteína tirosina quinasas
de tipo salvaje, proporcionando una alta especificidad por la
v-Src adecuadamente modificada por ingeniería
genética.
Se sintetizó un pequeño panel de análogos de PP1
derivatizados en C^{3} (6a-6i) como se muestra en
la Figura 18. El grupo de inhibidores modificados se examinó frente
al dominio catalítico de la quinasa diana, I338G
v-Src, que se expresó en bacterias y se purificó en
forma de una proteína de fusión con
glutation-S-transferasa (GST). Todos
los análogos derivatizados en C^{3} son inhibidores más potentes
de I338G v-Src que la molécula más potente (2,
CI_{50}= 430 nM) identificada en el panel de primera generación
de compuestos derivatizados en N^{4} (véase la tabla 3).
Cuatro de las moléculas (6a, 6b, 6d, 6h) inhiben la quinasa diana a
bajas concentraciones nM, exhibiendo los dos isómeros de naftilo
(6a, 6b) la mayor potencia (CI_{50}= 1,5 nM). En las condiciones
de ensayo, la molécula original PP1 inhibía su diana óptima, Fyn, a
sólo CI_{50}= 30 nM. Este dato muestra que una estrategia de
diseño de inhibidor que combina ingeniería genética enzimática con
síntesis dirigida de molécula pequeña puede no sólo igualar la
potencia de moléculas identificadas mediante el examen de grandes
bibliotecas, sino que puede conducir a un aumento significativo (20
veces en el caso de 6a, 6b) de la afinidad frente a inhibidores
previamente optimizados de quinasas de tipo salvaje. Los compuestos
que tienen la fórmula 6a y 6b son los inhibidores más potentes de
cualquier proteína tirosina quinasa de la familia Src que se han
reseñado hasta la fecha
De forma importante, las nueve moléculas muestran
una destacada selectividad por I338G v-Src con
respecto a la enzima de tipo salvaje. Las selectividades in
vitro están en el intervalo de 120 para el compuesto piperonilo
(6f) a tan alta como >6500 para el derivado naftoximetilo (6i).
Este intervalo es similar a las selectividades generadas mediante
derivatización de N^{4}, validando adicionalmente tanto la
predicción de la orientación de unión para el inhibidor original
como la modelización del sitio de unión expandido de I338G
v-Src. Estas selectividades se comparan
favorablemente con las de otras estrategias que combinan
modificación por ingeniería genética de la proteína con
reconocimiento de molécula pequeña, así como estrategias que
utilizan técnicas de selección para identificar proteínas de unión
estrecha de grandes mezclas de combinación de mutantes.
Para confirmar adicionalmente la selectividad por
la quinasa diana, el panel se examinó frente a Fyn de tipo salvaje
(tabla 3). Esta es presuntamente una inhibición control más estricta
que la de v-Src de tipo salvaje porque Fyn se
inhibe más potentemente por PP1. Tres de los cuatro inhibidores más
potentes (6a, 6d, 6h, Figura 18) mostraron suficiente selectividad
por la quinasa diana (100 veces) con respecto a la Fyn de tipo
salvaje. El inhibidor más potente de I338G v-Src,
6a, se une a Fyn de tipo savaje a 600 nM, representando una
selectividad de 400 veces por la diana diseñada.
Se emplearon dos sistemas de cultivo celular para
investigar la utilidad del compuesto 6a como inhibidor específico de
quinasa en el contexto de una célula completa. En primer lugar, se
generaron líneas celulares de fibroblasto NIH3T3 que expresaban
v-Src de tipo salvaje o I338G mediante infección
retroviral. Debido a que v-Src es una proteína
tirosina quinasa oncogénica altamente activada, la mayoría de la
fosforilación de tirosina en estas células es el resultado del
término de v-Src. Para investigar la inhibición
selectiva de la v-Src modificada por ingeniería
genética, se incubaron células que expresaban tanto
v-Src de tipo salvaje como I338G con concentraciones
variables de 6a. Las transferencias de
anti-fosfotirosina de lisados derivados de estas
células demuestran que 6a reduce fuertemente la fosforilación de
tirosina de manera dependiente de la concentración en minutos
(Figura 20, carriles 3-8). De acuerdo con las
potencias in vitro, la anulación de la señal de
fosfotirosina de 6a es mucho más rápida y completa que la causada
por el análogo derivatizado de N^{4} más potente en la
misma línea celular. Las células que expresan v-Src
de tipo salvaje en presencia de 6a 500 nM no muestran pérdida de
señal de fosfotirosina (carriles 1 y 2), y pueden hacerse crecer en
presencia del compuesto durante días sin pérdida de fosforilación de
tirosina o citotoxicidad aparente.
Para confirmar adicionalmente la selectividad de
6a, se trataron células Jurkat (una línea derivada de células T
humanas sin quinasas modificadas por ingeniería genética) con el
inhibidor general de proteína tirosina quinasa pervanadiato, que se
une covalentemente a una cisteína catalíticamente esencial en el
sitio activo de las fosfotirosinafosfatasas. La presencia de
pervanadiato desplaza eficazmente el equilibrio celular de la
fosfotirosina, dando lugar a un gran aumento de fosforilación de
tirosina (véase la Figura 20, comparar el carril 10 con el carril
9). Cuando estas células se tratan con 6a 500 nM (carril 11), no
hay ninguna reducción detectable de la fosforilación, indicando que
ninguna de las proteínas tirosina quinasas de tipo salvaje en
células Jurkat está apreciablemente inhibida por el inhibidor
diseñado. Se utilizó PP1 como control positivo para la inhibición de
quinasas de tipo salvaje a 10 \muM (carril 12), concentración a la
que se ha mostrado previamente que se suprime fuertemente la
fosforilación de tirosina mediada por receptor de célula T.
La rápida generación de inhibidores de quinasa
altamente selectivos debería tener aplicaciones de largo alcance en
la validación farmacológica de proteína quinasas como dianas de
fármacos viables. Para ensayar esta idea, se investigó si el
compuesto 6a (Figura 18) podía o no interrumpir selectivamente la
transformación oncogénica en células que expresaban la quinasa
diana. Los fibroblastos NIH3T3 normales tienen largas fibras de
actina polimerizada entre las células que pueden visualizarse
mediante tinción de las células con faloidina conjugada a rodamina
(Figura 21A). Las células que expresan una proteína oncogénica
(v-Src de tipo salvaje o bien I338G) son
redondeadas, y por tanto tienen un patrón difuso de actina (Figura
21B). Las células que expresan v-Src de tipo salvaje
que se calientan con 6a parecen indistinguibles de las células de
tipo salvaje no tratadas, sugiriendo que 6a no tiene efecto sobre
esta línea celular no mutante. Sin embargo, las células que expresan
la quinasa diana tienen claras fibras de actina y parecen
indistinguibles de fibroblastos NIH3T3 normales cuando se incuban
con 6a 250 nM durante 16 horas. A partir de este dato, resulta
evidente que la inhibición de molécula pequeña de la actividad
catalítica de v-Src es suficiente para bloquear su
papel en la oncogénesis.
En los ejemplos anteriores, las proteínas
tirosina quinasas de la familia Src se modificaron por ingeniería
genética para contener un único bolsillo de unión que no está
presente en ninguna proteína quinasa de tipo salvaje. Estos mutantes
son únicamente sensibles al derivado del inhibidor PP1 selectivo de
la familia Src (10, Figura 28) (85-87) que se ha
modificado para complementar el aumento de tamaño del sitio activo
del mutante. Todas las proteínas quinasas identificadas hasta la
fecha poseen el rasgo de sitio activo conservado explotado por este
enfoque (88). Sin embargo, puesto que la estructura de PP1 es
selectiva de quinasas de la familia Src, presuntamente no
proporcionará una estrategia ampliamente generalizable para inhibir
quinasas en la superfamilina (no es el compuesto original ideal para
aplicaciones amplias en familias de quinasas divergentes) (85). Por
lo tanto, es deseable desarrollar un conmutador químico basado en un
inhibidor de quinasa más promiscuo, que podría utilizarse para tomar
como diana rápidamente cualquier proteína quinasa de elección para
inhibición específica.
Para remodificar por ingeniería genética la
interfase quinasa/inhibidor, se seleccionó el producto natural
(+)-K252a (1, Figura 22A). El producto satisface
tres importantes criterios de diseño: 1) 1 inhibe muchas familias
diferentes de proteína quinasas; 2) la orientación de unión de 1 es
fácilmente predecible; 3) los derivados derivatizados racionalmente
de 1 son sintéticamente accesibles. K252a es un inhibidor muy
general de proteína quinasa que se predijo que se unía a sitios
activos de quinasa en una orientación idéntica a la de un compuesto
estrechamente relacionado, la estaurosporina (2, Figura 22A). Se ha
reseñado que K252a es un potente inhibidor (CI_{50} \leq 30 nM)
de proteína quinasa C, proteína quinasa A, proteína quinasa
dependiente de GMPc, quinasa de cadena ligera de miosina y tirosina
quinasas de la familia Trk (89, 90). Este ejemplo muestra que la
misma molécula puede inhibir eficazmente quinasas de la familia Src,
quinasas dependientes de ciclina y quinasas dependientes de
calmodulina (Figura 27). Las estructuras de 2 (Figura 22A) unido a
la proteína quinasa A (91), quinasa 2 dependiente de ciclina (CDK2)
(92) y Lck (93), se han resuelto recientemente, permitiendo el
diseño basado en la estructura para modificar por ingeniería
genética una sensibilidad única ante la clase de indolocarbazol de
inhibidores de quinasa (Figura 22B).
Como se muestra en los ejemplos anteriores, la
mutación de I338 a glicina fue suficiente para conferir una
sensibilidad única ante inhibidor a un derivado de PP1. El residuo
correspondiente en CDK2 es F80, que está cerca (3,7 \ring{A}) de
C(7) (numeración K252a) de 2 (Figura 22A) en la estructura
cristalina de CDK2 unida a estaurosporina (figura 22B) (92). Por
tanto, se anticipó que el desarrollo de inhibidores únicos basados
en indolocarbazol de las quinasas sensibilizadas requeriría una
manipulación selectiva de C(7) en 1 ó 2 (Figura 22A). Para
explorar esta hipótesis, la síntesis total y el enfoque recién
desarrollado que permite el ensamblaje modular de 1 (Figura 22A),
así como de derivados de 1 que están modificados
estereoespecíficamente en C(7) (94, 95), se sintetizó un
pequeño panel de derivados de K252a sustituidos en C(7). Dado
que F80 de CDK2 no es coplanar con el anillo indolocarbazol (Figura
22B), se anticipó que la síntesis utilizando
S-(L)-aminoácidos proporcionaría
derivados de K252a que complementarían mejor la mutación creadora de
espacio de F80 a glicina o alanina. Además de los análogos
S-C(7), se preparó
R-C(7)-bencil-(+)-K252a
(6, Figura 27) que, basándose en la predicción del modo de unión, se
supuso que inhibía proteína quinasas modificadas por ingeniería
genética menos potentemente que el correspondiente diastereoisómero
S (Figura 27).
En los análogos de K252a descritos inmediatamente
antes se examinó la inhibición frente a un panel de proteína
quinasas compuesto por tanto tirosina como serina/treonina quinasas.
La inhibición in vitro de al menos una proteína quinasa de
cuatro subfamilias distintas y fisiológicamente importantes (Figura
26A; familia Src (v-src, Fyn) (96, 47), familia Abl
(cAble) (98), familia dependiente de Ca^{+2}/calmodulina (CAMK
II\alpha) (99) y familia dependiente de ciclina (CDK2) (100). El
aminoácido correspondiente a 338 de v-Src se mutó a
un residuo pequeño (glicina o alanna) para todas las proteínas
quinasas anteriores (Figura 24B, para c-Abl el
mutante T315G era inestable (101)) para generar las siguientes
quinasas sensibles a inhibidor: I338G v-Src, T339G
Fyn, T315A Abl, F89G CAMK II\alpha y F80G CDK2. Se seleccionaron
quinasas que son sensibles a K252a y una que no es sensible
(c-Abl) para representar ambas clases de quinasas
diana (Figura 27).
Los análogos de K252a se examinaron frente a
proteína quinasas de tipo salvaje y modificadas por ingeniería
genética para la inhibición in vitro de la fosforilación de
un sustrato exógeno. Como se predecía, todos los derivados de K252a
sustituidos en C(7) fueron mucho menos eficaces que 1 (Figura
22A) en la inhibición del panel de proteína quinasas de tipo salvaje
(Figura 27). De las cinco quinasas de tipo salvaje, CAMK II\alpha
es la más susceptible de inhibición por los derivados de K252a, lo
que no es sorprendente debido a que es también la más sensible al
K252a mismo. Para cada una de las quinasas, los valores de
CI_{50} de los análogos de K252a se redujeron en presencia de la
mutación, confirmando la predicción de la orientación de unión de 1.
Se encontró un asociado derivatizado para cada una de las quinasas
mutantes, de tal modo que la unión se aproximaba o superaba la
afinidad del par quinasa de tipo salvaje/1. Notablemente, el análogo
2-metilpropilo (4, Figura 27) se unió a las quinasas
de la familia Src modificadas por ingeniería genética
(v-Src y C-Fyn) con valores de
CI_{50} subnanomolares (230 pM y 550 pM, respectivamente),
aproximadamente dos órdenes de magnitud por debajo de los valores de
1 frente a las mismas quinasas de tipo salvaje. Estos valores
representan la inhibición más potente de cualquier quinasa de la
familia Src reseñada hasta la fecha. Se encontraron equivalentes
potentes (CI_{50}<50 nM) y selectivos (=15 veces en comparación
con todas las quinasas de tipo salvaje en el panel) para todas las
quinasas mutantes excepto para c-Abl. Abl es la
única proteína quinasa de tipo salvaje en el panel que no es
eficazmente inhibida por K252a, sugiriendo que la sensibilidad de 1
es un determinante predictivo de si otras quinasas (no en la Figura
26) serían o no bien adecuadas para inhibición por análogos de
K252a.
Inicialmente, no estaba claro si la débil
inhibición de T315A c-Abl era debida al grupo
\beta-metilo de la cadena lateral de alanina o era
debida a la insensibilidad intrínseca de c-Abl ante
la inhibición por 1 (Figura 22A). Para probar el efecto del grupo
\beta-metilo más directamente, los inventores
comprobaron otra quinasa con una sustitución Ala. Midieron la
inhibición de los dos inhibidores de I338G v-Src
más potentes, 4 y 7 (Figura 27) frente a I338A
v-Src. El mutante de alanina de
v-Src tiene valores de CI_{50} de 0,024 y 0,43
\muM, respectivamente, para estos compuestos, aproximadamente 100
veces mayores que los valores para I338G. Sin embargo, los valores
de inhibición difieren entre I338G v-Src y T315A
c-Abl en más de 10.000 veces, implicando que
c-Abl es intrínsecamente menos inhibible por
análogos de 1.
En un esfuerzo por desarrollar un inhibidor más
generalizable que pudiera inhibir cualquier quinasa adecuadamente
mutada, se ensayó un panel de quinasas de tipo salvaje y mutantes
frente a un grupo de análogos de PP1 modificados en
C(3)-fenilo. Aunque PP1 es selectivo de la
familia Src, se razonó que la mutación en la posición 338
(v-Src) a un aminoácido pequeño puede conferir una
sensibilidad al análogo de PP1 única ante otras quinasas, puesto que
este aminoácido se mostró que era responsable en gran medida de la
selectividad de PP1 mismo. De este panel de inhibidores,
C(3)-1'-naftil-PP1
(9, Figura 28) o bien
C(3)-1'-naftilmetil-PP1
(11, Figura 28) fue el inhibidor más potente de cada quinasa
modificada por ingeniería genética ensayada. El análisis de los
datos de inhibición del análogo de PP1 en la Figura 28, revela
ciertas tendencias notables. PP1 proporcionó análogos con más amplia
utilidad en el contexto de los pares de quinasa modificada por
ingeniería genética/inhibidor. Cada una de las cinco quinasas diana
se inhibió por análogos de PP1 a bajas concentraciones nanomolares
con especificidades de diana en el intervalo de 85 a 400 veces
(medidas frente a la quinasa de tipo salvaje más inhibible). Existe
poca o ninguna correlación entre la CI_{50} de PP1 de tipo
salvaje y la sensibilidad ante el análogo de PP1 de la misma quinasa
(modificada por ingeniería genética). Esto resulta más evidente en
las Ser/Thr quinasas CDK2 y CMK II\alpha. Estas enzimas de tipo
salvaje poseen ambas débiles CI_{50} de PP1 mayores de 15 \muM.
Sin embargo, las versiones modificadas por ingeniería genética de
estas quinasas se inhiben muy potentemente por el análogo de PP1
(11; 5,0 nM y 8,0 nM, respectivamente). Esta dicotomía es debida muy
probablemente a una combinación de la importancia del residuo 338 en
la determinación de la sensibilidad ante PP1 de una proteína quinasa
dada (86) y la afinidad del anillo naftilo por el sitio activo
expandido de la quinasa. La CI_{50} por 11 para todos los
mutantes de glicina estaba en un intervalo de 3 veces (todos <10
nM) entre sí, aunque sus sensibilidades ante PP1 de tipo salvaje
varían en más de 400 veces. De forma importante, ninguna de las
quinasas de tipo salvaje ensayada se inhibe a concentraciones
menores de 1 \muM de 11, demostrando la alta selectividad de diana
de este compuesto.
Los análogos de PP1 10 y 11 (Figura 28) son
selectivos de diferentes mutaciones creadoras de espacio basadas en
su tamaño y flexibilidad. El
C(3)-1'-naftil-PP1
(10) más rígido muestra un intervalo de potencia más amplio entre
diferentes quinasas mutantes de glicina (Figura 28). Sin embargo,
inhibe potencialmente T315A c-Abl (7,0 nM) con alta
especificidad, proporcionando el primer inhbidor mutante de esta
proteína tirosina quinasa (102). Para determinar si 10 podría
utilizarse generalmente para inhibir proteína quinasas que están
mutadas a una alanina en la posición 338, los inventores ensayaron
su potencia frente a I338A v-Src. 10 inhibe el
mutante de alanina v-Src (CI_{50}= 1,0 nM) aún
más fuertemente que inhibe el correspondiente mutante de glicina,
sugiriendo que esta molécula proporcionará un esquema general para
el desarrollo de inhibidores mutantes para proteína quinasas cuya
actividad o estabilidad esté significativamente comprometida por la
mutación de glicina (101).
Posteriormente, se investigó la estrategia
anterior para determinar si podría utilizarse para generar alelos de
quinasa "sensibles a análogos de PP1" (as) con utilidad
in vivo. Los inventores han elegido esta nomenclatura porque
pueden utilizarse las mismas quinasas mutantes para identificar los
sustratos celulares directos de cada quinasa mediante el uso de
análogos de ATP ortogonales diseñados para complementar la mutación
"as" (154, 155).
Se ha mostrado que pueden utilizarse análogos de
PP1 derivatizados en C(3) para inhibición específica de diana
de v-Src expresada retroviralmente en fibroblastos
murinos. Sin embargo, es más interesante demostrar la inhibición
mutante de productos génicos de quinasa endógenos en un organismo
que tiene una amplia utilidad en exámenes genéticos tradicionales.
La levadura de brotes, Saccharomyces cerevisiae, se utiliza
ampliamente como organismo modelo unicelular en estudios genéticos
debido a su susceptibilidad de manipulación genética y su rápido
crecimiento (103). El genoma de S. cerevisiae codifica
aproximadamente 120 proteína quinasas incluyendo homólogos de
proteínas de muchas familias de quinasas de mamíferos (104). La
quinasa dependiente de ciclina de la levadura, Cdc28, se eligió como
diana inicial para inhibición in vivo. Esta enzima es la CDK
más importante en levadura de brotes y es esencial para la
viabilidad celular en START y la mitosis en el ciclo celular de
S. cerevisiae (105). La Cdc28 es un 62% idéntica a la CDK2
humana, sugiriendo que la F88G Cdc28 modificada por ingeniería
genética, Cdc28-as1, debería ser susceptible de
inhibición por análogos de PP1 derivatizados en C(3). Se
expresaron Cdc28 de tipo salvaje y Cdc28-as1 y se
investigó la sensibilidad de las dos quinasas ante derivados de PP1
in vitro. Como con CDK2, 11 (Figura 28) es un inhibidor muy
potente de la Cdc28 modificada por ingeniería genética (CI_{50} =
3,9 nM), pero no inhibe la proteína de tipo salvaje (CI_{50}
\geq 50 \muM). Se encontró también que el crecimiento de
levadura que expresa Cdc28-as1 estaba completamente
anulado a concentraciones de 11 que no tenían efecto sobre el
crecimiento de cepas de tipo salvaje. Debido al hecho de que estas
líneas celulares difieren sólo en una cadena lateral de aminoácido
en una proteína, esta interrupción selectiva del ciclo celular es
específica de diana de forma no ambigua. Además, la capacidad de 11
de cruzar fácilmente la pared celular de levadura es inhabitual y
evita la necesidad de añadir concentraciones extremadamente altas
del inhibidor durante los ensayos.
Para determinar si esta estrategia podría
extenderse a identificar alelos sensibles a análogo de otras
familias de proteína quinasas sin purificar ni ensayar
individualmente cada enzima in vitro, se seleccionó la MAP
quinasa, Fus3, de Saccharomyces cerevisiae, que es necesaria
para la inducción de genes inducibles por feromonas, la detención
del ciclo celular y la fusión celular durante el apareamiento
(106). En presencia de feromonas de factor de apareamiento, Fus3
fosforila Far1 y Ste12. Estos eventos de fosforilación son
necesarios para la detención del ciclo celular en G1 y la
transcripción de los genes necesarios para apareamiento (107, 108).
No se han aislado alelos sensibles a la temperatura (ts) de Fus3,
posiblemente debido a la sensibilidad ante la temperatura del
proceso de apareamiento (109).
Para generar un alelo sensible a análogo de
fus3, se mutó la glutamina 93 (correspondiente a I338 en
v-Src) a glicina (D93G Fus 3,
Fus-as1) y esta enzima se expresó en levadura de
brotes que carece de Fus3 de tipo salvaje. El mutante
fus3-as1 complementó totalmente la deleción
génica como se muestra por el apareamiento de números iguales de
células haploides de tipo salvaje o fus3-as1
(URA3 his3) a una cepa fus1\Deltafus2\Deltaura3 HIS
3 seguido de selección de la progenie diploide en medio carente
de uracilo e histidina (Figura 23). Las cepas que expresan Fus3 y
Fus3-as1 proporcionaron ambas aproximadamente 7,5 x
10^{4} unidades de formación de colonias (cfu)/ml, mientras que el
apareamiento de una cepa fus3\Delta proporcionó sólo
0-100 cfu/ml en las mismas condiciones de selección.
Cuando se llevó a cabo el apareamiento de una cepa
fus3-as1 en presencia de 10 50 \muM (Figura
28), la cantidad de diploides formados fue indistinguible de una
cepa fus3\Delta (Figura 23B-23C). Incluso a
10 500 nM, la cepa fus3-as1 proporcionó sólo
1,7 x 10^{3} cfu/ml, una reducción de 44 veces de las células
control equivalentes (Figura 23C). Debido a la competición con
cantidades milimolares de ATP en la célula de levadura, esta fuerte
inhibición de 10 500 nM implica una CI_{50} in vitro para
Fus3-as1 en el intervalo de pocos nanomoles. 11
(Figura 28) desestabilizó también el apareamiento mediado por
Fus3-as1, pero con menos potencia (reducción de 85
veces a 50 \muM). En contraposición, no se observó una reducción
de la eficacia de apareamiento cuando se trataron células que
expresaban Fus3 de tipo salvaje con 10 u 11 (0,6-1,1
x 10^{5}) cfu/ml a todas las concentraciones hasta 50 \muM,
Figura 23c). Por lo tanto, fus3-as1
representa el primer alelo condicional de MAPK, fus3.
Mediante la adición in vivo de 10, la actividad del producto
génico de fus3 puede controlarse selectiva y rápidamente y
de manera dependiente de la dosis.
Los alelos sensibles a análogo descritos aquí
mantenían una serie de ventajas frente a los alelos ts
tradicionales. Están sujetos a control estequiométrico y temporal.
La adición de un inhibidor específico único no debería interrumpir
la estabilidad de la diana enzima o sus interacciones
proteína-proteína. Pueden generarse cepas
sensibilizadas ante inhibidor par genes que funcionan en procesos
celulares que son inherentemente sensibles a la temperatura
(redisposición del citoesqueleto de actina, apareamiento, etc.)
(109, 110). Además, la actividad proteína quinasa puede controlarse
específicamente sin causar los efectos transcripcionales no
específicos que se inducen por el shock
térmico (111).
térmico (111).
Se prepararon lisados a partir de células de
insecto coinfectadas con baculovirus que codifican
Cdc28-His_{6} o
Cdc28-as1-HIS_{6} y
Cakl-HA_{3} (151). Se purificaron
Cdc28-His_{6} y
Cdc28-as1-HIS_{6} mediante
cromatografía de afinidad me como se ha descrito (152), seguida de
intercambio aniónico (Pharmacia SP Sepharose Fast Flow) e
intercambio catiónico (Pharmacia Q Sepharose Fast Flow). Se purificó
MBP-Clb2 a partir de lisados de bacterias que
expresaban MBP-Clb2 (un obsequio de R. Deshaies) en
una columna de amilosa (NEBL), seguida de cromatografía de
intercambio aniónico (Pharmacia Q Sepharose Fast Flow).
Se incubaron Cdc28-His_{6}
(concentración final 1 nM) y MBP-Cib2 (concentración
final 3 nM) purificadas durante 10 min a 23ºC en 25 \mul de una
mezcla de reacción que contenía 5 \mug de histona H1, 1 \muCi de
\gamma-^{32}P-ATP (1 \muCi/10
\muM y 1 \muCi/1 mM) y diversas concentraciones de
1-NM-PP1 en tampón quinasa (41).
Los productos de reacción se analizaron mediante
SDS-PAGE al 15% seguido de autorradiografía. La
incorporación de fosfato se determinó a cada concentración de
inhibidor mediante recuento de centelleo. Se representó la
concentración de inhibidor frente a la incorporación de fosfato, y
la concentración de 1-NM-PP1 a la
que la incorporación de fosfato fue de un 50% la del control sin
inhibidor, se reseñó como CI_{50}.
Los medios y técnicas genéticas y microbianas
fueron esencialmente como se han descrito (148, 153). Todas las
cepas eran derivados de W30-3
(ura3-a, leu2-3, 112,
trpl-1, his3-11,
ade2-1, can1-100, GAL+). Todas
las cepas se hicieron crecer a 23ºC a menos que se observe otra
cosa. Para crear cdc28-as1, la secuencia
codificante de CDC28 y 400 pb 5'- y 386 pb 3'- de ADN flanqueante se
amplificaron por PCR a partir de ADN genómico y se ligaron en pRS306
para preparar pJAU1. La mutación F88G se modificó por ingeniería
genética mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótidos de pJAU1.
El plásmido se integró en el locus CDC28 de tipo salvaje
después de digestión con AflII mediante una estrategia de
entrada- salida como se ha descrito (148, 153).
Se incubaron Cdc28-His_{6}
(concentración final 1 nM) y MBP-Clb2 (concentración
final 3 nM) purificadas durante 10 minutos a 23ºC en 25 \mul de
una mezcla de reacción que contenía 5 \mug de histona H1 y
diversas concentraciones de
\gamma-^{32}P-ATP en tampón
quinasa (Hepes 25 mM-NaOH, pH 7,4, NaCl 10 mM,
MgCl_{2} 10 mM y ditiotreitol (DTT) 1 mM. Los productos de
reacción se analizaron mediante SDS-PAGE al 15%
seguido de autorradiografía. Se determinó la incorporación de
fosfato a cada concentración de ATP mediante recuento de centelleo.
Se utilizaron después representaciones Eadie-Hofstee
para calcular K_{m} y k_{cat}.
Se incubaron Cdc28-His_{6}
(concentración final 1 nM) y MBP-Clb2 (concentración
final 3 nM) purificadas durante 10 minutos a 23ºC en 25 \mul de
una mezcla de reacción que contenía 5 \mug de histona H1, 1
\muCi de \gamma-^{32}P-ATP (1
\muCi/10 \muM y 1 \muCi/1 mM) y diversas concentraciones de
1-NM-PP1 en tampón quinasa.
Se incubaron Cdc28-His_{6}
(concentración final 1 nM) y MBP-Clb2 (concentración
final 3 nM) purificadas durante 10 minutos a 23ºC en 25 \mul de
una mezcla de reacción que contenía 5 \mug de histona H1 y
diversas concentraciones de
\gamma-^{32}P-ATP en tampón
quinasa (Hepes 25 mM-NaOH, pH 7,4, NaCl 10 mM,
MgCl_{2} 10 mM y ditiotreitol (DTT) 1 mM. Los productos de
reacción se analizaron mediante SDS-PAGE al 15%
seguido de autorradiografía. Se determinó la incorporación de
fosfato a cada concentración de ATP mediante recuento de centelleo.
Se utilizaron después representaciones Eadie-Hofstee
para calcular K_{m} y k_{cat}.
Los productos de reacción se analizaron mediante
SDS-PAGE al 15% seguida de autorradiografía. Se
determinó la incorporación de fosfato a cada concentración de
inhibidor mediante recuento de centelleo. Se representó la
concentración de inhibidor frente a incorporación de fosfato y se
reseñó la concentración de 1-NM-PP1
a la que la incorporación de fosfato era un 50% de la de control sin
inhibidor como CI_{50}.
Se fijaron aproximadamente 1 x 10^{7} células
para cada muestra en 70% de etanol, se resuspendieron en
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, se sometieron brevemente a
sonicación, se digirieron con ARNasa 2 mg/ml durante 2 horas a 37ºC
y se resuspendieron en 0,2 ml de solución de proteasa (5 mg/ml de
pepsina, 0,5% de HCl concentrado) y se digirieron durante 45 minutos
a 37ºC. Se tiñó ADN con Sytox Green 1 \muM (Molecular Probes) en
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 y se examinaron 20.000
células de cada muestra con un dispositivo FACS FACScan
(Becton-Dickinson).
Se expresaron Cdc28-His_{6} y
Cdc28-as1-His_{6} y se purificaron
a partir de células de insecto Sf9. Formaron complejos activos con
MBP-Clb2 purificada de bacterias. Se prepararon
lisados a partir de células de insecto coinfectadas con baculovirus
que codificaban Cdc28-His_{6} o
Cdc28-as1-His_{6} y
Cak1-HA_{3} (48). Se purificaron
Cdc28-His_{6} y
Cdc28-as1-His_{6} mediante
cromatografía de afinidad metálica como se ha descrito (49),
seguida de intercambio aniónico (Pharmacia SP Sepharose Fast Flow) e
intercambio catiónico (Pharmacia Q Sepharose Fast Flow). Se purificó
MBP-Clb2 de lisados de bacterias que expresaban
MBP-Clb2 (un obsequio de R. Deshaies) en una columna
de amilosa (NEBL), seguida de cromatografía de intercambio aniónico
(Pharmacia Q Sepharose Fast Flow).
Respecto a Cdc28 de tipo salvaje,
Cdc28-as1 presentó una reducción moderada de la
actividad, incluyendo una reducción de 20 veces de la afinidad de
unión por ATP y una reducción de 6 veces de la tasa de recambio
máxima de ATP (Tabla 4). De forma más importante, Cdc28as1 era
exquisitamente sensible al inhibidor
1-NM-PP1. En presencia de ATP 1mM,
que se acerca aproximadamente a la concentración de ATP
intracelular, Cdc28-as1 era aproximadamente 16.000
veces más sensible a 1-NM-PP1 que la
Cdc28 de tipo salvaje (CI_{50} \approx 3 nM por
Cdc28-as1 y 44.000 nM por Cdc28). Por tanto, la
sustitución única de una glicina por una fenilalanina da como
resultado un mutante Cdc28 que presenta tanto alta afinidad como
especificidad por 1-NM-PP1.
Para examinar la función de Cdc28 in vivo,
se construyó una cepa de levadura en la que la copia de CDC28
de tipo salvaje se reemplazaba por
cdc28-as1. Los medios y técnicas genéticas y
microbianas fueron esencialmente como se han descrito (148, 153).
Todas las cepas fueron derivados de W303 (ura3-1,
leu2-3, 112, trpl-1,
his3-11, 15, ade2-1,
canl-100, GAL+). Todas las cepas se hicieron
crecer a 23ºC a menos que se observe otra cosa. Para crear
cdc28-as1, la secuencia codificante
CDC28 y 400 pb 5'- y 386 pb 3'- de ADN flanqueantes se
amplificaron por PCR a partir de ADN genómico y se ligaron a pRS306
para preparar pJAU1. La mutación F88G se modificó por ingeniería
genética mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótidos de pJAU1.
El plásmido se integró en el locus de CDC28 de tipo salvaje
después de digestión con Af/II mediante una estrategia de
entrada-salida como se ha descrito (148, 153).
En ausencia de
1-NM-PP1, las células
cdc28-as1 presentaron una viabilidad y
crecimiento normales en placas de cultivo, aunque estaban
hiperpolarizadas y eran más grandes que la cepa CDC28
isogénica, y tenían un 20% más de tiempo de duplicación en cultivo
líquido. El análisis de citometría de flujo de células de división
asíncrona reveló que las cepas cdc28-as1 y
CDC28 presentaban perfiles de contenido de ADN similares.
Finalmente, se utilizaron conjuntos de ADN de oligonucleótido
sintético para medir las diferencias transcripcionales en todo el
genoma entre células asíncronas de tipo salvaje y
cdc28-as1 (127).
Los cambios se consideraron significativos si
eran mayores o iguales a 2 veces, o si el transcripto cambiaba su
estatus presente/ausente (como se indica por el software Affymetrix)
en las siguientes comparaciones: para efectos de fármacos no
específicos: CDC28 + 1-NM-PP1
frente a CDC28; para efectos de
cdc28-as1: cdc28-as1
frente a CDC28. Para efectos de inhibición específicos de
Cdc28, los cambios se consideraron significativos si eran mayores o
iguales a 2,5 veces para cdc28-as1
1-NM-PP1 frente a
Cdc28-as1 y mayores o iguales a un cambio de
2,0 veces para cdc28-as1
1-NM-PP1 frente a CDC28 +
1-NM-PP1.
En dos experimentos separados, se observaron
cambios de más de dos veces en sólo once transcriptos (0,2% del
genoma). Se observaron diferencias de más de 2 veces en el término
de los siguientes genes en una comparación de células de tipo
salvaje y cdc28-as1: experimento 1:
LEU2, YDL241W, YFL057C, YHR071W, CBP1, YJR130C,
CWP1, YLL060c; ATR1 YML128C, YMR095C, YMR096W,
YNL275W, YNR065C, ARG1, YOL101C, SPS4, SSU1, SVS1,
OYE3, RLF2 e YPR203W, TWT1, YHR209W, YIL011W, YIL023C,
DAL4, YKL218C, YLL060C, YL0108C, YLR237W, YLR437C, YML071C,
ATR1, YMR095C, YMR096W, YNR065C, ARG1, YOR302W,
SPS4, YPL088W, SVS1, YPR013C, CTR1.
El defecto de crecimiento menor en células
cdc28-as1 se sospechó que era debido a la
k_{cat} 6 veces menor de la enzima mutante, que daría como
resultado una actividad 6 veces menor a las altas concentraciones de
ATP in vivo (la menor afinidad de unión a ATP del mutante no
debería ser relevante in vivo, cuando la concentración de
ATP es mucho mayor de K_{m}). Por tanto,
cdc28-as1 es un alelo ligeramente debilitado
de CDC28 que puede soportar sin embargo la progresión del
ciclo celular.
A continuación, se analizaron los efectos del
inhibidor 1-NM-PP1 sobre el
crecimiento y morfología celulares. La proliferación de células de
tipo salvaje no estaba afectada por el inhibidor excepto a muy
altas concentraciones (50.000 nM), cuando los tiempos de
duplicación aumentaban aproximadamente 2 veces. El análisis de
microconjuntos de ADN reveló que la transcripción de sólo 6 genes
(0,1%) cambió más de dos veces después de un tratamiento de 30
minutos de células de tipo salvaje con
1-NM-PP1 500 nM.
De los seis transcriptos que cambiaron en células
de tipo salvaje después de 30 minutos de tratamiento con inhibidor,
tres no tienen función conocida (YGR035C, YLR346C, YPL222W), y los
otros tienen papeles en el shock térmico (SSA4), respuesta de
estrés osmótico (GRE2) y resistencia a fármacos
(YOR1). La transcripción de sólo uno de estos genes (YGR035C)
está regulada por el ciclo celular (150). El tratamiento de células
de tipo salvaje con inhibidor durante 120 minutos dio como
resultado cambios en sólo 3 genes (YGR035C y dos genes que codifican
proteínas ribosómicas: RPS26A y RPL26B).
El tratamiento de células durante 120 minutos
causó aún menos respuestas transcripcionales: se observaron cambios
de más de dos veces para sólo tres transcriptos. De forma
interesante, no se observó una activación significativa de
transcriptos sensibles al estrés, consistentemente con la propuesta
de que muchos mecanismos sensibles a fármacos responden a la función
en lugar de a la presencia del fármaco (122). Por lo tanto, se
concluyó que el tratamiento con
1-NM-PP1 500 nM no tiene efectos
significativos sobre la fisiología de la célula de tipo salvaje,
sugiriendo que no inhibe ni estimula ningún tipo de quinasa de tipo
salvaje u otra enzima en levadura.
El cambio aminoacídico único en la quinasa
Cdc28-as1 la hace excepcionalmente sensible al
inhibidor 1-NM-PP1 in vivo.
El crecimiento de la cepa cdc28-as1 se
inhibió un 50% con inhibidor de 50 a 100 nM; la detención completa
del crecimiento ocurrió por encima de 500 nM. La estrecha
correspondencia entre la CI_{50} in vivo y las medidas en
ensayos de quinasa (Tabla 4) ilustra la eficacia con la que
1-NM-PP1 puede penetrar en una
célula de levadura, un rasgo no exhibido por otros inhibidores de
CDK de molécula pequeña (122).
| Cinética de ATP^{1/} | CI_{50} de 1-NM-PP1^{2/} (\muM) | ||||
| Quinasa | K_{m} | k_{cat} | k_{cat}/K_{m} | a 10 \muM de | a 1 mM de |
| (\muM) | (min^{-1}) | (\muM^{-1}min^{-1}) | ATP | ATP | |
| Cdc28-MBP-Clb2 | 35 | 132 | 3,730 | 22 | 44 |
| Cdc28-as1-MBP-Clb2 | 322 | 21,3 | 0,066 | 0,0020 | 0,0029 |
1/ Se incubaron Cdc28-His
(concentración final 1 nM) y MBP-Clb2 (concentración
final 3 nM) purificadas durante 10 minutos a 23ºC en 25 \mul de
una mezcla de reacción que contenía 5 \mug de histona H1 y
diversas concentraciones de
\gamma-^{32}P-ATP en tampón
quinasa (Hepes 25 mM-NaOH, pH 7,4, NaCl 10 mM,
MgCl_{2} 10 mM y ditiotreitol (DTT) 1 mM). Los productos de
reacción se analizaron mediante SDS-PAGE al 15%
seguido de autorradiografía. Se determinó la incorporación de
fosfato a cada concentración de ATP mediante recuento de centelleo.
Se utilizaron después representaciones Eadie-Hofstee
para calcular K_{m} y
k_{cat}.
2/ Se incubaron Cdc28-His
(concentración final 1 nM) y MBP-Clb2 (concentración
final 3 nM) purificadas durante 10 minutos a 23ºC en 25 \mul de
una mezcla de reacción que contenía 5 \mug de histona H1, 1
\muCi de
\gamma-^{32}P-ATP
(1 \muCi/10 \muM y 1 \muCi/1 mM) y diversas concentraciones 1-NM-PP1 en tampón quinasa (147). Los productos de reacción se analizaron mediante SDS-PAGE al 15% seguido de autorradiografía. Se determinó la incorporación de fosfato a cada concentración de ATP mediante recuento de centelleo. Se representó la concentración de inhibidor frente a incorporación de fosfato, y la concentración de 1-NM-PP1 a la que la incorporación de fosfato fue de un 50% la de control sin inhibidor se reseñó como CI_{50}.
(1 \muCi/10 \muM y 1 \muCi/1 mM) y diversas concentraciones 1-NM-PP1 en tampón quinasa (147). Los productos de reacción se analizaron mediante SDS-PAGE al 15% seguido de autorradiografía. Se determinó la incorporación de fosfato a cada concentración de ATP mediante recuento de centelleo. Se representó la concentración de inhibidor frente a incorporación de fosfato, y la concentración de 1-NM-PP1 a la que la incorporación de fosfato fue de un 50% la de control sin inhibidor se reseñó como CI_{50}.
Cdc28-as1 es altamente sensible a
1-NM-PP1 in vitro y es una
quinasa ligeramente debilitada. Se formaron complejos de ciclina
activa-Cdk mediante la adición de
MPB-Clb2 en exceso a Cdc28-His_{6}
o Cdc28-as1-His_{6} purificadas,
y se midió su capacidad de fosforilar histona HI a diferentes
concentraciones de ATP para generar valores de K_{m} y k_{cat}.
Para determinar la CI_{50}, la concentración de inhibidor a la
que la quinasa se inhibe un 50%, los inventores midieron la
actividad quinasa de Cdc28-MBP-Clb2
o Cdc28-as1-MBP-Clb2
en presencia de concentraciones variables de
1-NM-PP1, a dos concentraciones
diferentes de ATP.
El análisis detallado del contenido de ADN y la
morfología de células cdc28-as1 reveló que
concentraciones menores de 1-NM-PP1
causaron un retardo (50 nM) o detención (500 nM) con un contenido de
ADN G2/M y grandes brotes hiperpolarizados. Concentraciones mayores
de inhibidor (5000 nM) causaron una detención no uniforme que
incluía células G1 sin brotes así como células G2/M con grandes
brotes; la hiperpolarización de los brotes ya no era evidente. Por
tanto, parece posible valorar el nivel de actividad
Cdc28-as1 in vivo, permitiendo la
identificación de eventos del ciclo celular que son
diferencialmente sensibles a reducciones de la actividad
catalítica
de Cdc28.
de Cdc28.
Cuando se sincronizaron en G1 células
cdc28-as1 con la feromona de apareamiento de
levadura, factor \alpha, y se liberaron después en medio fresco
que contenía 1-NM-PP1 500 nM, el
inicio de la formación de brotes y la síntesis de ADN se retardaron
aproximadamente 30 a 60 minutos, mientras que la acumulación de la
ciclina mitótica Clb2 se retardó 60 a 90 minutos. Las células
continuaron deteniéndose con niveles moderados de Clb2, brotes
altamente hiperpolarizados y un contenido de ADN G2/M, muy parecida
a la detención observada en células asíncronas. Los análisis
microscópicos de mictrotúbulos y ADN revelaron que estas células
carecen de un huso mitótico y se detenían con una sola masa de ADN
posicionada correctamente en el cuello del brote. Por tanto, las
células tratadas con bajas concentraciones del inhibidor se retardan
significativamente durante la progresión hacia etapas tempranas del
ciclo celular, pero eventualmente se detienen debido a la
incapacidad de ensamblar un huso mitótico y entrar en mitosis.
Cuando se liberaron células
cdc28-as1 sincronizadas en G1 en medio que
contenía 1-NM-PP1 5000 nM, se
detuvieron con un contenido de ADN IC e inicialmente no consiguieron
brotar, sugiriendo una detención en START. Estas células
eventualmente brotaron después de 180 a 240 minutos y se detuvieron
con un contenido de ADN 1C, grandes brotes hiperpolarizados, una
sola masa de ADN en la célula madre y un conjunto de microtúbulos
astrales en interfase.
Pho85, una Cdk que está estrechamente relacionada
con Cdc28, se ha implicado en la iniciación de la brotación en S.
cerevisiae (128, 129). Por lo tanto, se investigó la brotación
observado en células cdc28-as1 liberadas en
\hbox{1-NM-PP1} 5000 nM
debida a la actividad Cdc28-as1 residual o debida a
la actividad Pho85. Se construyó una cepa
cdc28-as1 que carecía de PCL1 y
PCL2, que codifican las dos ciclinas activadoras de G1 de
Pho85. Cuando estas células se sincronizaron en G1 y se liberaron en
1-NM-PP1 5000 nM, se detuvieron con
un contenido de ADN 1C y nunca brotaron, siquiera después de 6
horas. Se concluyó que la actividad Pho85 asociada a PcI1 y Pcl2, y
no la actividad Cdc28 residual, era la responsable de la brotación
retardada en gran medida observada en células
cdc28-as1 tratadas con altas concentraciones
de inhibidor.
Para caracterizar adicionalmente la detención del
ciclo celular causada por el tratamiento con inhibidor, se analizó
la transcripción de todo el genoma después de tratamiento de células
cdc28-as1 asíncronas con
1-NM-PP1 500 nM (Figura
25A-D). Un tratamiento de dos horas causó cambios de
2,5 veces o mayores de la transcripción de 104 genes (66
reducciones, 38 aumentos) (Figura 25B y C). De los transcriptos
regulados negativamente, 60 son regulados por el ciclo celular y 32
tienen expresión máxima en G2/M. Este subconjunto regulado
negativamente de G2/M contiene un amplio intervalo de reguladores
mitóticos bien establecidos, incluyendo CLB2, SW15, CDC20 y
CDC5. Niveles reducidos del transcripto CLB2 son
consistentes con el retardo en la acumulación de Clb2 después de la
liberación de la detención en G1. El subconjunto G2/M regulado
negativamente incluía también 11 transcriptos de función
desconocida, estos transcriptos pueden codificar reguladores de G2/M
bajo control transcripcional de Cdc28. El tratamiento de 30 minutos
con 1-NM-PP1 produjo un bloqueo
transcripcional en G2/M similar (37 de los 42 genes regulados
negativamente están regulados por el ciclo celular y 57% de estos
tienen máximos en G2/M) (130).
Una exposición de dos horas a fármaco aumentó
también el término de 38 transcriptos más de 2,5 veces (10 regulados
por ciclo celular) (Figura 25A-D). Todos excepto uno
de estos transcriptos regulados por ciclo celular se expresan a
niveles máximos en G1. Este grupo incluye genes que codifican
ciclinas G1 (Cln2, una Pcl I). Este resultado, combinado con la
observación de que el inhibidor Far 1 de Cln-Cdc28
estaba regulado negativamente 20 veces, sugiere que una prolongada
inhibición de Cdc28 y detención en G2/M conduce a un programa
transcripcional que impulsa la actividad de complejos ciclina
GI-Cdk.
Para evalular las tendencias generales en la
respuesta transcripcional a la inhibición por Cdc28, se calcularon
los cambios medios en el término de todos los genes de cada uno de
los grupos mayoritarios de genes del ciclo celular (Figura 25D).
Este análisis confirmó que el tratamiento con inhibidor de células
cdc28-as1 conducía principalmente a una
expresión reducida de genes que se expresan normalmente en las
etapas G2/M y M/G1 del ciclo celular.
Además de ser necesaria para la entrada en
mitosis, Cdk1 es también conocida por controlar la salida de mitosis
(131, 132). La actividad de Cdk1 inhibe la progresión de la anafase
a G1, y por lo tanto la inactivación de Cdk1 (principalmente por
proteólisis de ciclina) es necesaria para la salida de mitosis.
Además, Cdk1 inhibe su propia activación en la mitosis tardía
fosforilando e inactivando componentes del complejo promotor de la
anafase (APC) que se toma como dianas las ciclinas para su
destrucción (133, 134). Si las células se detienen en mitosis con
el veneno microtubular nocodazol, pueden desencadenarse la
destrucción de ciclina y la salida de mitosis mediante la
sobreexpresión de la proteína Sic 1 inhibidora de Cdk (135).
Consistentemente con estos resultados, el tratamiento con
1-NM-PP1 500 nM se encontró que
conducía a una rápida (<60 min) destrucción de ciclina y a la
rebrotación de células cdcM-as1 detenidas en
mitosis tardía con la mutación cdc15-2
(136).
Aunque las Cdk inhiben la progresión de la
anafase a G1, también parece que promueven la actividad APC y la
separación de crómatidas hermanas en la transición de metafase a
anafase (131, 132, 137). Por ejemplo, la evidencia genética sugiere
que ciertos alelos débiles de CDC28, incluyendo
cdcM-as1, presentan defectos menores en la
progresión a anafase (137); además, un mutante ts de CDC28
(cdc28-IN) exhibe una detención en metafase a
la tempertura restrictiva (138). Las condiciones experimentales en
que el tratamiento con inhibidor causa una detención en metafase en
células cdc28-as1 no se han determinado
todavía, presuntamente debido a que bajas concentraciones de
inhibidor previenen la entrada en mitosis o desencadenan la salida
prematura de mitosis. Además, la detención en metafase de células
cdc28-IN puede no ser debida a una reducción
general de la actividad quinasa, sino que en su lugar podría ser
debida a un defecto limitado en la actividad hacia los sustratos
implicados en la progresión de metafase a anafase.
Una familia de proteína quinasas que fosforila
trifosfatos de inositol en células se denomina
fosfatidilinositol-3-fosfato
quinasas (PI-3K). Estas proteínas utilizan ATP como
sustrato donante de fósforo. Son reguladores clave de la
señalización celular que es importante en cáncer.
Basándose en los ejemplos anteriores, se han
identificado los residuos en proteína quinasas que pueden alterarse
para permitir la unión de moléculas inhibidoras que no inhiben
ninguna quinasa de tipo salvaje. Utilizando los procedimientos
descritos anteriormente, se genera un alineamiento de secuencia
proteica entre proteína quinasas y PI-3K. Este
alineamiento está basado en la estructura cristalina de
PI-3K\gamma. Basándose en la similitud estructural
entre PI-3K\gamma y PI-3Ka y en
el alineamiento de secuencia de las proteínas quinasas y
PI-3K, se propone que el residuo I848 en
PI-3K\alpha corresponde al residuo I338 en
v-Src. Por lo tanto, mutar I848 a Ala o Gly genera
un mutante I848A PI-3-K\alpha o
I848G PI-3-K\alpha que se espera
que sea sensible a los inhibidores descritos en la presente
memoria.
Otra familia de enzimas que pueden modificarse
por ingeniería genética mediante los procedimientos descritos
anteriormente es la de quinasas bacterianas que fosforilan
antibióticos aminoglicósido tales como canamicina. Es un ejemplo de
una aminoglicósido quinasa APH (III-a').
Siguiendo los procedimientos descritos
anteriormente, se genera un alineamiento de secuencia entre APH
(III-a') y v-Src. Este alineamiento
está basado también en la estructura cristalina de APH
(III-a'). Basándose en el alineamiento de secuencia,
se propone que el residuo de metionina 90 en APH
(III-a') corresponde a I338 en
v-Src. M90 en APH (III-a') se muta a
alanina y glicina para generar M90A APH (III-a') o
M90G APH (III-a'), mutantes que se espera que sean
sensibles a los inhibidores de la presente invención.
La descripción detallada anterior se ha dado por
sólo claridad de comprensión, y no deberían entenderse limitaciones
innecesarias de la misma, ya que las modificaciones resultarán
obvias para los expertos en la técnica.
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Claims (20)
1. Un inhibidor de proteína quinasa de la
siguiente fórmula I:
en la que R es un 1'-naftilo,
2'-naftilo, m-fenoxifenilo,
m-benciloxifenilo,
m-(2',6'-dicloro)benciloxifenilo,
3-piperonilo, 1'-naftilmetilo,
1'-naftoximetilo o
2'-naftilmetilo.
2. Un inhibidor de proteína quinasa de la
reivindicación 1, en el que R es 1'-naftilo.
3. Un inhibidor de proteína quinasa de la
reivindicación 1, en el que R es 2'-naftilo.
4. Un inhibidor de proteína quinasa de la
reivindicación 1, en el que R es
1'-naftilmetilo.
5. Un inhibidor de proteína quinasa de la
reivindicación 1, en el que R es
2'-naftilmetilo.
6. Una composición que comprende el inhibidor de
proteína quinasa de una cualquiera de las reivindicaciones
1-5.
7. Un procedimiento de inhibición de la
fosforilación de un sustrato de una proteína quinasa mutante in
vitro, que comprende incubar un inhibidor de proteína quinasa de
la reivindicación 1 con una mezcla que contiene la proteína quinasa
y su sustrato.
8. Un procedimiento de inhibición de la actividad
catalítica de una proteína quinasa mutante in vitro, que
comprende incubar la proteína quinasa mutante con un inhibidor de la
reivindicación 1.
9. Un procedimiento de inhibición del crecimiento
de una célula que expresa una proteína quinasa mutante in
vitro, que comprende incubar la célula con un inhibidor de
proteína quinasa de la reivindicación 1.
10. Un procedimiento de interrupción de la
transformación en una célula que expresa una proteína quinasa
mutante in vitro, que comprende poner en contacto la célula
con el inhibidor de proteína quinasa de la reivindicación 1.
11. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 7-10, en el que la proteína quinasa
mutante es una proteína quinasa mutante de la familia Src.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que la proteína quinasa mutante es una v-Src
mutante o Fyn mutante.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que la v-Src mutante es I338G
v-Src.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que la Fyn mutante es T339G.
15. El procedimiento de una de las
reivindicaciones 7-10, en el que la proteína quinasa
mutante se selecciona del grupo constituido por
c-Abl mutante, CAMK II\alpha mutante, CDK2
mutante, Cdc28 mutante y Fus3 mutante.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que la c-Abl mutante es T315 Abl.
17. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que la CAMK II\alpha mutante es F89G CAMK II\alpha.
18. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que la CDK2 mutante es F80G CDK2.
\newpage
19. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que la Cdc28 mutante es Cdc28-as1.
20. El procedimiento según la reivindicación 15,
en el que la Fus3 mutante es Fus-as1.
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