JP7256796B2 - Thomsen-nouvelle(tn)抗原に対するヒト抗体 - Google Patents
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Description
Tn抗原は、広範な腫瘍タイプアレイに存在するが、正常組織の細胞表面には見られない炭水化物抗原である。Tn抗原の密接に関連するシアル酸付加形態であるsTn抗原も、有望な腫瘍抗原である。Tnは、O-グリコシル化の第1段階中にセリンまたはトレオニンに付加される単糖残基である。通常、次の糖が付加されて複雑な成熟グリカンになる。しかしながら、多くのがんにおいては、未熟なTn前駆体を伴うO-糖タンパク質が細胞表面にたどり着き、そこでそれらは腫瘍抗原として利用され得る。
したがって、がんの処置のため、および悪性病変および転移を検出するための、TnおよびsTn等の腫瘍特異的炭水化物を特異的に認識する抗体を特定および生成する必要がある。本出願は、この必要性を満たし、関連する利益を提供する、Tn抗原またはsTn抗原等の炭水化物抗原に対するヒト抗体を開示する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、本明細書で提供されるVL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3領域を有するVLドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。他の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインの両方を含み、VHドメインおよびVLドメインが、それぞれ、本明細書で提供される各々のVHおよびVLドメインについてのアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、2つのTn抗原分子は、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
・シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ(avidity)、
・Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
・Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有するか、または
・Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン(seine)残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン(seine)残基上に存在する。
抗体またはその機能的断片に関して使用される場合、「二重特異性」という用語は、2つの異なる構造、エピトープまたは抗原決定基について特異性を有する抗体またはその機能的断片を指す。二重特異性抗体は、2つの異なる構造、エピトープまたは抗原決定基に同時に結合することができる。
フレームワークまたはFR残基という用語は、CDRに隣接する可変領域残基である。FR残基は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ドメイン抗体、ディアボディおよび二重特異性抗体において存在する。
本明細書で使用される場合、「結合する」または「結合すること」という用語は、複合体を形成する分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン性結合、疎水性相互作用および/またはファンデルワールス相互作用を含む非共有相互作用であり得る。複合体は、共有もしくは非共有結合、相互作用または力によって結合された2つまたはそれよりも多い分子の結合も含み得る。抗体またはその機能的断片の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、本明細書で提供される実施例で提供される方法、または当業者に周知のいくつかの方法の任意の1つを使用して検出することができる。
一例において、細胞傷害性は、カルセイン-AM(Thermo Fisher)を使用して測定することができる。かなり一般的に、Tn/sTn陽性細胞株を、増大する濃度のTn/sTn Abおよび/またはTn/sTn-CD3結合タンパク質を伴うエフェクター細胞とともに、エフェクター対標的細胞比、例えば20:1で3~24時間共培養する。エフェクター細胞は、例えば、刺激もしくは非刺激(ヒトまたはカニクイザル)T細胞もしくはそれらのサブセット(例えば、CD4、CD8)、または非刺激(ヒトまたはカニクイザル)末梢血単核細胞(PBMC)であり得る。標的細胞はTn/sTnを発現し、ヒト卵巣腺癌細胞株CAOV3等の内因性(天然)Tn/sTn発現を有する細胞であり得る。Tn/sTnおよび/またはTn/sTn-CD3結合分子の細胞傷害活性は、例えば、特異的抗体の存在下でのエフェクター細胞とのインキュベーションの2~48時間後の蛍光色素カルセインAMの放出で決定される。細胞傷害性の決定のために使用されるインキュベーション時間およびリードアウトの改変は可能であり、当業者に公知である。
「sTn抗原」という用語は、Tn抗原の、ガラクトースではなくシアル酸による延長により形成されるTn抗原のシアル酸付加形態を指す(NeuAca2→6GalNAcα-O-セリン/トレオニン)。
「Thomsen-Friedenreich抗原」、「TF抗原」、「T抗原」または「コア1」という用語は、二糖抗原を創出する、追加のガラクトース単糖を伴うTn抗原を指す(Galβ1→3GalNAcα-O-セリン/トレオニン)。
「グロボH」または「グロボヘキサオシルセラミド」という用語は、五糖前駆体、SSEA3(ステージ特異的胎児抗原3)から形成される六糖を指す。グロボHは、糖脂質および糖タンパク質のようにがん細胞の表面上に発現する抗原炭水化物ファミリーのメンバーである。
「検出可能剤」という句は、試料または対象における、本明細書で開示される抗体または機能的断片等の所望の分子の実在または存在を確認するために使用され得る物質を指す。検出可能剤は、可視化することができる物質、または別の方法で(例えば、定量化によって)決定および/または測定することができる物質であり得る。
「有効量」は、有益な結果または所望の結果をもたらすために十分な量である。有効量は、1回または複数回の投与、適用または投与量で投与され得る。そのような送達は、個々の投与単位が使用されるべき期間、剤のバイオアベイラビリティ、投与経路等を含む、いくつかの変数に依存する。
「治療有効量」という句は、本明細書で使用される場合、所与の疾患および/またはそれに関連する症状の重症度および/または持続期間を安定化、低減および/または改善するために十分な治療剤(例えば、本明細書で提供される抗体もしくは機能的断片、または本明細書で提供される他の任意の治療剤)の量を指す。治療剤の治療有効量は、所与の疾患の前進もしくは進行の安定化、低減もしくは改善のため、所与の疾患の再発、発症もしくは開始の低減もしくは改善のため、および/または別の治療(例えば、本明細書で提供される抗体または機能的断片の投与以外の治療)の予防もしくは治療効果を改善もしくは向上させるために必要な量であり得る。
「共刺激分子」とは、リガンドまたはカウンター受容体によるそれらのエンゲージメント後のT細胞への正のシグナルの送達によって免疫応答(例えば、T細胞活性化)をアップレギュレートする分子を指す。T細胞が完全に活性化されるためには、2つのシグナルが必要とされる。1)抗原提示細胞上のペプチド-MHC分子と相互作用するT細胞受容体を通して抗原特異的シグナルが提供され、2)抗原提示細胞の膜上に発現する共刺激分子とT細胞との間の相互作用によって抗原非特異的な共刺激シグナルが提供される。T細胞共刺激は、T細胞増殖、分化および生存を提供する。一部の態様では、共刺激分子は、抗原提示細胞またはT細胞によって発現されるリガンドまたは受容体である。一部の態様では、共刺激分子は、抗原提示細胞およびT細胞の両方によって発現されるリガンドまたは受容体である。
「合成Tn抗原」という用語は、グリコシド結合によって任意の基質に結合された、Tn抗原の単糖構造N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)を指す。非限定的な例示的合成Tn抗原には、α-GalNAc-O(CH2)3NHCO(CH2)5NH-ビオチン(GlycoTech;カタログ番号02-010)およびα-GalNAc-PAA-ビオチン(GlycoTech;カタログ番号01-001、PAAはポリアクリルアミド骨格である)が含まれる。別の例示的な合成Tn抗原は、以下の構造によるTn「クラスター」であり、KLHは、Tn抗原の部分を形成しないキーホールリンペットヘモシアニンを示す。
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、2つのTn抗原分子は、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
・シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
・Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有するか、または
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する。
本発明は、1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する抗体またはその機能的断片をさらに含む。1つまたは複数のセリン残基上のTnまたはsTnへのこの優先的または特異的結合は、例えば、正常免疫細胞等の非標的細胞に対して、がん等の標的細胞を区別することを促進し得る。加えて、1つまたは複数のセリン残基上のTnまたはsTnへの優先性または特異性を有する本明細書で提供される抗体は、例えばIgMアイソタイプと比較して区別できる特徴を有する、IgG1アイソタイプを含むIgGアイソタイプである。それゆえ、一部の実施形態では、本発明は、1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する抗体またはその機能的断片を使用して、例えば、標的対非標的選択性を提供することを促進し得る。ある特定の実施形態では、本発明は、トレオニン結合TnまたはsTnと比較してセリン結合TnまたはsTnをターゲティングすることを通して、Tn抗原を発現するがん細胞を特異的にターゲティングする方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを有する単離された抗体または機能的断片を提供する。そのようなVHドメイン配列を、表5および図2に示す。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインおよびVLドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインおよびVLドメインを有する単離された抗体または機能的断片を提供する。そのようなVHドメインおよびVLドメイン配列を、表5および6ならびに図1~7に示す。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、配列番号108、112および113からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号115からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号117からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105および114~130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号118からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105および114~130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号121からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号122からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号125からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号127からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号128からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号106のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号113のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本明細書で提供される本発明による単離されたポリヌクレオチドは、6つ未満のCDRを含む本明細書で開示される抗体またはその機能的断片をコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体または機能的断片は、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3からなる群から選択される1、2、3、4または5つのCDRを含む。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはその機能的断片は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3からなる群から選択される1、2、3、4または5つのCDRを含む。そのようなCDRは、表2~4および図1~7に示される。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを有する抗体または機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのようなVHドメイン配列を、表5および6ならびに図1および3~7に示す。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインおよびVLドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインおよびVLドメインを有する抗体または機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのようなVHドメインおよびVLドメイン配列を、表5および6ならびに図1~7に示す。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、配列番号108、112および113からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号101のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号108のアミノ酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号106のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号113のアミノ酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドのバリアントを提供する。バリアントは、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、非限定的にメチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ等の、1つまたは複数の改変されたヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。加えて、バリアントポリヌクレオチドは、非ヌクレオチド成分によって割り込まれたポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドへの改変は、当業者に周知の方法を使用して、ポリヌクレオチドの組立て前または後に与えられ得る。例えば、ポリヌクレオチドは、重合後に、酵素技術または化学技術のいずれかを使用する標識化成分とのコンジュゲーションによって改変され得る(例えば、Gottfried and Weinhold, 2011, Biochem. Soc. Trans., 39(2):523-628;Paredes et al., 2011, Methods, 54(2):251-259で説明される)。
(i)VLドメインは、例えば、表5および7ならびに図2で示される、2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVLドメインのアミノ酸配列を有し、かつ/または
(ii)VLドメインは、例えば、表3または図1~7で示される、VL CDRのうちの任意の1つのアミノ酸配列を有する1、2または3つのVL CDR(VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3)を含み、かつ
(iii)VHドメインは、例えば、表5もしくは6または図1もしくは3~7で示される、2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインのアミノ酸配列を有し、かつ/または
(iv)VHドメインは、例えば、表2または4で示される、VH CDRのうちの任意の1つのアミノ酸配列を有する1、2または3つのVH CDR(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3)を含む。
また別の実施形態では、本発明は、Tn/sTnに特異的に結合する第1の抗原結合ユニットとCD3に特異的に結合する第2の抗原結合ユニットとを含む多重特異性結合タンパク質(例えば、二重特異性抗体)であって、Tn/sTnに結合する第1の抗原結合ユニットが、配列番号106のアミノ酸配列を含むVHドメインと、配列番号113のアミノ酸配列を含むVLドメインとを含む、多重特異性結合タンパク質を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片を産生する方法を提供する。本明細書で開示される方法は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、本明細書で開示される抗体または機能的断片のコードされる重鎖および/または軽鎖を産生する条件下で、これを産生するために十分な期間、宿主細胞を培養することと、抗体または機能的断片の重鎖および/または軽鎖を精製することとを含み得る。他の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される抗体または機能的断片をコードするポリヌクレオチドを有する組換え細胞を提供する。一部の態様では、抗体またはその機能的断片は、クローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3、3A7および2F3バリアントの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメイン(例えば、表5および6)を有する。
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体機能的断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディまたはシングルドメイン抗体(sdAB)であり得るが、これらに限定されない。抗体およびその機能的断片について、様々な形態、変更および改変が当該技術分野で周知である。本明細書で開示されるTn抗原またはsTn抗原特異的抗体断片は、そのような様々な抗体形態、変更および改変のいずれかを含み得る。そのような様々な形態および用語の例は、それらが当該技術分野で公知である通り、以下に示される。
抗体は、1つまたは複数の結合部位を有し得る。2つ以上の結合部位が存在する場合、結合部位は、互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。例えば、天然免疫グロブリンは2つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはFab断片は1つの結合部位を有し、一方で、「二重特異性」または「二機能性」抗体は2つの異なる結合部位を有する。
単鎖抗体(scFv)とは、VLおよびVH領域がリンカー(例えば、アミノ酸残基の合成配列)を介して接合されて、連続するポリペプチド鎖を形成する抗体を指し、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体で折り返し、一価の抗原結合部位を形成することを可能にするために十分に長い(例えば、Bird et al., Science 242:423-26 (1988)およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)を参照のこと)。ディアボディとは、2つのポリペプチド鎖を含む二価抗体を指し、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるので各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対形成することを可能にするリンカーによって接合される、VHおよびVLドメインを含む(例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)、およびPoljak et al., Structure 2:1121-23 (1994)を参照のこと)。ディアボディの2つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成から生ずるディアボディは、2つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、2つの異なる抗原結合部位を有するディアボディを製造するために使用することができる。同様に、トリアボディおよびテトラボディは、それぞれ、同じであってもよく、異なっていてもよい3つおよび4つのポリペプチド鎖を含み、かつそれぞれ、同じであってもよく、異なっていてもよい3つおよび4つの抗原結合部位を形成する抗体である。
一部の他の態様では、本明細書で開示されるコンジュゲートされたものは、表5もしくは6または図1もしくは3~7で示されるアミノ酸配列を有するVHドメインと、局在化剤、検出可能剤または治療剤とを含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるコンジュゲートされたものは、VHドメインおよびVLドメインと、局在化剤、検出可能剤または治療剤とを含み、VHドメインは、表5もしくは6または図1もしくは3~7および配列番号40で示されるアミノ酸配列を有し、VLドメインは、表5または図2で示されるアミノ酸配列を有する。
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、2つのTn抗原分子は、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
・シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
・Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有するか、または
・Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくは機能的断片またはコンジュゲートが、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを有する、投与することを含む。そのようなVLドメイン配列を、表5および図2に示す。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくは機能的断片またはそのコンジュゲートが、配列番号108、112および113からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、投与することを含む。
したがって、本発明の実施形態は、疾患を処置または予防するための方法であって、治療有効量の上記に説明される抗体またはその機能的断片のいずれか、上記のうちの任意の1つのコンジュゲート、または上記のいずれかの医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。
本発明のさらなる態様は、疾患の処置または予防のための医薬の製造における、本発明の上記に説明される抗体(例えば、二重特異性抗体)のいずれかの抗体またはその機能的断片、上記のうちの任意の1つのコンジュゲート、または上記のいずれかの医薬組成物の使用も含む。
本明細書で説明される製剤等の製剤は、処置される特定の疾患に必要な2つ以上の活性化合物を含有することもできる。ある特定の実施形態では、製剤は、本明細書で開示される抗体または機能的断片と、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する1つまたは複数の活性化合物とを含む。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組合せにて好適に存在する。例えば、本明細書で開示される抗体または機能的断片は、1つまたは複数の他の治療剤と組み合わせることができる。そのような組合せ療法は、同時に、または逐次的に対象に投与することができる。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、治療有効量の本明細書で提供される医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することによる疾患の処置または予防のための方法であって、医薬組成物が、本明細書で開示される抗体または機能的断片と第2の治療剤とを含む、方法を提供する。適切な第2の治療剤は、本明細書で説明されるように、当業者により容易に決定することができる。一態様では、第2の治療剤は、化学療法剤または免疫療法剤である。免疫療法剤は、セツキシマブ、ベバシズマブ、ハーセプチン(heceptin)またはリツキシマブであり得るが、これらに限定されない。
医薬組成物は、本明細書で開示される1つまたは複数の抗体または機能的断片を含有し得る。一実施形態では、抗体または機能的断片は、非経口投与のための滅菌溶液または懸濁液等の好適な医薬調製物に製剤化される。一実施形態では、本明細書で提供される抗体または機能的断片は、当該技術分野で周知の技術および手技を使用して医薬組成物に製剤化される(例えば、Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th Ed., p. 126を参照のこと)。
一実施形態では、治療有効投与量は、約0.1ng/ml~約50~100μg/mlの抗体または機能的断片の血清濃度を産生する。別の実施形態では、医薬組成物は、1日当たり体重1kg当たり約0.001mg~約500mgの抗体の投与量を提供する。医薬投与単位形態は、投与単位形態当たり約0.01mg、0.1mgまたは1mg~約30mg、100mgまたは500mg、一実施形態では、約10mg~約500mgの抗体もしくは機能的断片、および/または他の任意の本質的成分の組合せを提供するように調製され得る。
本明細書で開示される方法において使用される医薬組成物の治療有効量は、使用される医薬組成物、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重等に依存して変動し、それらの全ては、看護する臨床医の技術の範囲内である。本明細書で開示される方法によって処置され得る対象は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを含む。
本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない改変も、本明細書で提供される本明細書で開示される定義内に提供されることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明を例示すると意図されるが、本発明を限定するとは意図されない。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕Thomsen-nouvelle(Tn)抗原またはそのシアル化形態(sTn抗原)に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、
(a)(i)配列番号2、5、6、8、11および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号14、17、18、20、23、24、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号26、30、31、33、37、38および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含む可変重鎖(VH)ドメイン、
および/または
(b)(i)配列番号40、44、45、47、51および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号54、53、59、63および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号66、70および71からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む可変軽鎖(VL)ドメイン
を含む抗体またはその機能的断片。
〔2〕前記VHドメインが、
(a)配列番号2、5、6、8、11および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(b)配列番号14、17、18、20、23、24、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(c)配列番号26、30、31、33、37、38および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含む、前記〔1〕に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔3〕前記VLドメインが、
(a)配列番号40、44、45、47、51および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(b)配列番号54、53、59、63および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(c)配列番号66、70および71からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、前記〔1〕に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔4〕VHドメインおよびVLドメインを含み、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号2および8からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号14および20からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号26および33からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、且つ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号40および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号54および59からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号66のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、
前記〔1〕に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔5〕VHドメインおよびVLドメインを含み、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号5および11からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号17、23、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号30、37および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、且つ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号44および51からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53および63からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号70のアミノ酸を有するVL CDR3と
を含む、
前記〔1〕に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔6〕VHドメインおよびVLドメインを含み、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号6および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号18および24からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号31および38からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、且つ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号45および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号71のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、
前記〔1〕に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔7〕VHドメインおよびVLドメインを含み、
(i)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号17のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(ii)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号149のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(iii)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号17のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(iv)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号150のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(v)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号151のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(vi)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号152のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(vii)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号153のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(viii)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号149のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(ix)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号150のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含む、
前記〔1〕に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔8〕前記VHドメインが、配列番号101、105、106、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記〔1〕に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔9〕前記VLドメインが、配列番号108、112および113からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記〔1〕に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔10〕前記VHドメインが、配列番号101のアミノ酸配列を含み、前記VLドメインが、配列番号108のアミノ酸配列を含む、前記〔1〕に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔11〕前記VHドメインが、配列番号105、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、且つ前記VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、前記〔1〕に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔12〕前記VHドメインが、配列番号106のアミノ酸配列を含み、且つ前記VLドメインが、配列番号113のアミノ酸配列を含む、前記〔1〕に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔13〕前記VHドメインが、Kabat番号付けに基づいて、
(a)位置17におけるセリンまたはフェニルアラニン、
(b)位置37におけるバリンまたはイソロイシン、
(c)位置55におけるアスパラギン酸、ヒスチジンまたはアラニン、
(d)位置61におけるアスパラギン酸またはチロシン、
(e)位置63におけるバリンまたはメチオニン、
(f)位置82Bにおけるセリンまたはアスパラギン、
(g)位置87におけるトレオニンまたはアラニン、
(h)位置100Bにおけるアラニンまたはトレオニン、
(i)位置105におけるグルタミンまたはリジン、および
(j)位置110におけるトレオニンまたはイソロイシン
からなる群から選択されるアミノ酸バリアントのうちの1つまたは複数を含む、前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔14〕前記VHドメインが、Kabat番号付けに基づいて、
(a)位置30におけるセリン、トレオニンまたはアルギニン、
(b)位置56におけるグリシン、
(c)位置57におけるアスパラギンまたはトレオニン、
(d)位置62におけるグルタミン、
(e)位置63におけるリジン、および
(f)位置98におけるリジン
からなる群から選択されるアミノ酸バリアントのうちの1つまたは複数を含む、前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔15〕前記VLドメインが、Kabat番号付けに基づいて、
(a)位置31におけるアスパラギンまたはリジン、および
(b)位置41におけるグリシン
からなる群から選択されるアミノ酸バリアントのうちの1つまたは複数を含む、前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の単離された抗体または機能的断片。
〔16〕前記機能的断片が、Fab、Fab’、F(ab’) 2 、scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディおよびsdABからなる群から選択される、前記〔1〕~〔5〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔17〕前記抗体が、モノクローナル抗体である、前記〔1〕~〔15〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔18〕二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、CDRグラフト化抗体および完全ヒト抗体の構成成分である、前記〔1〕~〔15〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔19〕前記二重特異性抗体が、Tn抗原および腫瘍抗原に結合する、前記〔18〕に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔20〕前記二重特異性抗体が、Tn抗原、およびTリンパ球によって発現されたタンパク質、好ましくはCD3、ナチュラルキラー細胞によって発現されたタンパク質、好中球によって発現されたタンパク質、白血球によって発現されたタンパク質、単球によって発現されたタンパク質、マクロファージによって発現されたタンパク質または骨髄由来サプレッサー細胞によって発現されたタンパク質に結合する、前記〔18〕に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔21〕前記二重特異性抗体が、Tn抗原および共阻害性分子または共刺激性分子に結合する、前記〔18〕に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔22〕前記抗体が、ヒト抗体である、前記〔1〕~〔15〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔23〕前記抗体が、IgGまたはIgMアイソタイプである、前記〔1〕~〔15〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔24〕前記IgG抗体が、IgG1サブクラスである、前記〔23〕に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔25〕2つのTn抗原分子に結合する、前記〔1〕~〔24〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔26〕1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する、前記〔1〕~〔24〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔27〕前記2つのTn抗原分子が、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、前記2つのTn抗原分子が、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、前記〔26〕に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔28〕前記2つのTn抗原分子が、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、前記〔26〕に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔29〕シアリルLe a 、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティを有する、前記〔1〕~〔28〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔30〕Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティを有する、前記〔1〕~〔28〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔31〕酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLe a 、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、前記〔1〕~〔28〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔32〕酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、前記〔1〕~〔28〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔33〕Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有する、前記〔1〕~〔32〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔34〕Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有する、前記〔1〕~〔32〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔35〕Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、前記〔1〕~〔32〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔36〕前記Tn抗原が、
(a)合成Tn抗原、
(b)Tn改変ペプチドの部分、または
(c)細胞によって発現されるTn改変タンパク質の部分
である、前記〔32〕~〔35〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔37〕前記抗体が、1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する、前記〔32〕~〔35〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔38〕Tn抗原が、がん細胞によって発現される、前記〔37〕に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
〔39〕前記〔1〕~〔38〕のいずれか1項に記載の抗体またはその機能的断片のVHドメイン、VLドメイン、またはVHドメインおよびVLドメインの両方をコードする単離されたポリヌクレオチド。
〔40〕前記〔39〕に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔41〕前記〔39〕に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
〔42〕原核細胞または真核細胞である、前記〔41〕に記載の宿主細胞。
〔43〕Thomsen-nouvelle(Tn)抗原またはそのシアル化形態(sTn抗原)に結合する抗体またはその機能的断片を製造する方法であって、
(a)前記〔41〕または〔42〕に記載の宿主細胞を培地中で培養することと、
(b)その中で発現する前記抗体または機能的断片を得ることと
を含む方法。
〔44〕局在化剤、検出可能剤または治療剤にコンジュゲートまたは組換え融合された前記〔1〕~〔38〕のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片を含むコンジュゲート。
〔45〕局在化剤を含む、前記〔44〕に記載のコンジュゲート。
〔46〕前記局在化剤が、好適な基質による形式的環化付加を受けることができるアルケンまたはアルキンである、前記〔45〕に記載のコンジュゲート。
〔47〕前記アルケンまたはアルキンが、歪みのあるアルケンまたは歪みのあるアルキンである、前記〔46〕に記載のコンジュゲート。
〔48〕前記歪みのあるアルケンが、シクロアルカンである、前記〔47〕に記載のコンジュゲート。
〔49〕前記シクロアルカンが、トランス-シクロアルケンである、前記〔48〕に記載のコンジュゲート。
〔50〕前記トランス-シクロアルケンが、シクロペンテン、シクロヘキセン、トランス-シクロヘプタン、トランス-シクロオクテンまたはオキサノルボルナジエンである、前記〔49〕に記載のコンジュゲート。
〔51〕前記好適な基質が、アジド、テトラジンまたはテトラゾールである、前記〔46〕に記載のコンジュゲート。
〔52〕前記形式的環化付加が、クリック反応である、前記〔46〕に記載のコンジュゲート。
〔53〕前記形式的環化付加が、レトロ形式的環化付加によって追従される、前記〔46〕に記載のコンジュゲート。
〔54〕検出可能剤を含む、前記〔44〕に記載のコンジュゲート。
〔55〕前記検出可能剤が、陽電子放出放射性核種またはガンマ線放出放射性核種である、前記〔54〕に記載のコンジュゲート。
〔56〕前記陽電子放出放射性核種または前記ガンマ線放出放射性核種が、 78 Br、 14 C、 11 C、 57 Co、 64 Cu、 51 Cr、 18 F、 68 Ga、 67 Ga、 68 Ge、 153 Gd、 159 Gd、 3 H、 166 Ho、 131 I、 125 I、 124 I、 123 I、 121 I、 115 In、 113 In、 112 In、 111 In、 140 La、 177 Lu、 54 Mn、 99 Mo、 13 N、 15 O、 32 P、 103 Pd、 142 Pr、 149 Pm、 186 Re、 188 Re、 82 Rb、 105 Rh、 97 Ru、 35 S、 47 Sc、 75 Se、 153 Sm、 113 Sn、 117 Sn、 85 Sr、 94m Tc、 99 Tc、 201 Ti、 133 Xe、 86 Y、 90 Y、 169 Yb、 175 Yb、 65 Znおよび 89 Zrからなる群から選択される、前記〔55〕に記載のコンジュゲート。
〔57〕前記検出可能剤が、検出可能な反応を触媒する酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質または非放射性常磁性金属イオンである、前記〔54〕に記載のコンジュゲート。
〔58〕治療剤を含む、前記〔44〕に記載のコンジュゲート。
〔59〕前記治療剤が、所与の生物学的応答を改変する剤、または細胞毒素である、前記〔58〕に記載のコンジュゲート。
〔60〕所与の生物学的応答を改変する前記剤が、毒素、アポトーシス剤、抗血管新生剤、サイトカイン、増殖因子、凝固剤およびキメラ抗原受容体からなる群から選択される、前記〔59〕に記載のコンジュゲート。
〔61〕前記細胞毒素が、化学療法剤である、前記〔59〕に記載のコンジュゲート。
〔62〕前記化学療法剤が、アントラサイクリン、タキサン、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、オーリスタチン分子、ホルモン、ヌクレオシドアナログ、DNA修復酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤、細胞傷害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNA副溝結合剤、アデノシンデアミナーゼ阻害剤および微小管攪乱剤からなる群から選択される、前記〔61〕に記載のコンジュゲート。
〔63〕前記細胞毒素が、アルファ線放出放射性核種またはベータ線放出放射性核種である、前記〔59〕に記載のコンジュゲート。
〔64〕前記アルファ線放出放射性核種が、 211 At、 212 Bi、 213 Bi、 225 Ac、 223 Ra、 212 Pb、 227 Thおよび 149 Tbからなる群から選択される、前記〔63〕に記載のコンジュゲート。
〔65〕前記ベータ線放出放射性核種が、 90 Y、 131 I、 109 Pd、 131 Luおよび 177 Luからなる群から選択される、前記〔63〕に記載のコンジュゲート。
〔66〕前記〔1〕~〔38〕のいずれか1項に記載の抗体またはその機能的断片と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
〔67〕前記〔44〕~〔65〕のいずれか1項に記載のコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
〔68〕疾患の処置または予防のための方法であって、Thomsen-nouvelle(Tn)抗原またはそのシアル化形態(sTn抗原)に結合し、且つ、以下の(a)~(j):
(a)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、且つ前記2つのTn抗原分子が、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
(b)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
(c)シアリルLe a 、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(d)Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(e)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLe a 、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
(f)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
(g)Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有する、
(h)Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有する、および
(i)Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
(j)1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する
からなる群から選択される1つまたは複数の特色を有する、抗体またはその機能的断片を治療有効量投与することを含む方法。
〔69〕疾患の処置または予防における使用のためのThomsen-nouvelle(Tn)抗原またはそのシアル化形態(sTn抗原)に結合する抗体またはその機能的断片であって、前記抗体が、以下の(a)~(j):
(a)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、且つ前記2つのTn抗原分子が、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
(b)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
(c)シアリルLe a 、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(d)Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(e)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLe a 、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
(f)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
(g)Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有する、
(h)Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有する、および
(i)Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
(j)1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する
からなる群から選択される1つまたは複数の特色を含む、抗体またはその機能的断片。
〔70〕疾患の処置または予防のための医薬の製造におけるThomsen-nouvelle(Tn)抗原またはそのシアル化形態(sTn抗原)に結合する抗体またはその機能的断片の使用であって、前記抗体が、以下の(a)~(j):
(a)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、且つ前記2つのTn抗原分子が、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
(b)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
(c)シアリルLe a 、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(d)Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(e)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLe a 、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
(f)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
(g)Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有する、
(h)Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有する、および
(i)Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
(j)1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する
からなる群から選択される1つまたは複数の特色を含む、使用。
〔71〕治療有効量の前記〔1〕~〔38〕のいずれか1項に記載の抗体もしくはその機能的断片、前記〔44〕~〔65〕のいずれか1項に記載のコンジュゲート、または前記〔66〕または〔67〕に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む疾患を処置または予防するための方法。
〔72〕それを必要とする対象における疾患の処置または予防での使用のための前記〔1〕~〔38〕のいずれか1項に記載の抗体もしくはその機能的断片、前記〔44〕~〔65〕のいずれか1項に記載のコンジュゲート、または前記〔66〕または〔67〕に記載の医薬組成物。
〔73〕疾患の処置または予防のための医薬の製造における前記〔1〕~〔38〕のいずれか1項に記載の抗体もしくはその機能的断片、前記〔44〕~〔65〕のいずれか1項に記載のコンジュゲート、または前記〔66〕または〔67〕に記載の医薬組成物の使用。
〔74〕前記疾患が、がんまたは腫瘍形成であり、前記がんまたは前記腫瘍の細胞が、Tn抗原またはsTn抗原を含むタンパク質をその表面上に発現する、前記〔68〕または〔71〕に記載の方法。
〔75〕前記がんまたは腫瘍が、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、子宮内膜がんおよび膵がんからなる群から選択される、前記〔74〕に記載の方法。
〔76〕前記がんまたは腫瘍が、乳がんである、前記〔75〕に記載の方法。
〔77〕前記乳がんが、トリプルネガティブ乳がんである、前記〔75〕に記載の方法。
〔78〕第2の治療剤を同時に、または逐次的に投与することをさらに含む前記〔68〕、〔71〕、〔74〕、〔75〕、76または77のいずれか1項に記載の方法。
〔79〕前記第2の治療剤が、化学療法剤または免疫療法剤である、前記〔78〕に記載の方法。
〔80〕有効量の前記〔44〕~〔65〕のいずれか1項に記載のコンジュゲートを対象に投与することを含むそれを必要とする前記対象における腫瘍を検出するための方法。
〔81〕前記疾患が、がんまたは腫瘍形成であり、前記がんまたは前記腫瘍の細胞が、Tn抗原またはsTn抗原を含むタンパク質をその表面上に発現する、前記〔69〕または〔72〕に記載の使用のための抗体、コンジュゲートまたは医薬組成物。
〔82〕前記がんまたは腫瘍が、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、子宮内膜がんおよび膵がんからなる群から選択される、前記〔81〕に記載の使用のための抗体、コンジュゲートまたは医薬組成物。
〔83〕前記がんまたは腫瘍が、乳がん、好ましくはトリプルネガティブ乳がんである、前記〔82〕に記載の使用のための抗体、コンジュゲートまたは医薬組成物。
〔84〕第2の治療剤、好ましくは化学療法剤または免疫療法剤との組合せで使用される、前記〔69〕、〔72〕、〔81〕、〔82〕または83のいずれか1項に記載の使用のための抗体、コンジュゲートまたは医薬組成物。
〔85〕前記疾患が、がんまたは腫瘍形成であり、前記がんまたは前記腫瘍の細胞が、Tn抗原またはsTn抗原を含むタンパク質をその表面上に発現する、前記〔70〕または〔73〕に記載の使用。
〔86〕前記がんまたは腫瘍が、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、子宮内膜がんおよび膵がんからなる群から選択される、前記〔85〕に記載の使用。
〔87〕前記がんまたは腫瘍が、乳がん、好ましくはトリプルネガティブ乳がんである、前記〔86〕に記載の使用。
〔88〕前記抗体、コンジュゲートまたは医薬組成物が、第2の治療剤、好ましくは化学療法剤または免疫療法剤との組合せで使用される、前記〔70〕、〔73〕、〔85〕、〔86〕または87のいずれか1項に記載の使用。
Tn抗原またはsTn抗原への有力なヒトモノクローナル抗体の生成および選択
Tn抗原またはsTn抗原は、広範なスペクトルのヒト腫瘍において発見されている。したがって、本明細書で説明されるように、Tn抗原またはsTn抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体(mAb)を生成した。いくつかのmAbを、Tn ELISAに基づいてハイブリドーマから選択し、炭水化物特異性についてさらに特徴付け、精製した。
2つの進行中のワクチン治験において患者から血液試料を得た。第1の治験では、患者に、他の抗原(グロボH、GM2およびペプチドアセンブルTFクラスター)およびベバシズマブによる処置の存在下でTn改変Muc1-KLHをワクチン接種した(NCT01223235)。第2の治験では、全てKLHにコンジュゲートしたグロボH、GM2、sTn、TFおよびTnを含む単分子ワクチンを使用した(NCT01248273)。両方の治験は、MSKCC承認およびFDA承認IRBプロトコールおよびINDの下、MSKCCにおいて行われた。3~5回のワクチン接種後、28人の患者(各治験から14人の患者)から血液標本を回収し、これらはTnに対して0~1/1280の抗体タイターを示した。Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)上での勾配遠心分離によって、約80~90mLの血液から末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。EasySep Memory B細胞単離キット(StemCell Technologies)を使用して、PBMCからB細胞を単離した。
B細胞を、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、10%FBS(Omega Scientific)、10ng/mL IL-10、2000U/mL IL2、5μg/mL R-848および1μg/mL抗CD40 mAb(G28-5ハイブリドーマ上清;ATCC)を補充したRPMI-1640培地中で培養した。24~48時間後のB95-8培養上清を、B細胞に添加した(30% V/V)。活性化B細胞を、電気融合によってP3x63Ag8.653骨髄腫細胞に融合した。
Tn ELISAのために、Neutr-アビジンコーティングし、かつ0.25%BSAで遮断したプレート上に捕捉した5μg/mLの多価ビオチニル化Tn-PAAにより、プレートをコーティングした。Neutr-アビジンコーティングしたウェルを対照として使用した。ハイブリドーマ上清(100μL/ウェル)を室温で1時間インキュベートし、0.05%Tween/PBSで3回洗浄した。結合した抗体を最初にホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP:horseradish peroxidase)標識ヤギ抗ヒトIgG+M(Jackson ImmunoResearch)で検出し、次に、陽性ウェルをIgG-Fc特異的二次抗体またはIgM特異的二次抗体でプローブしてアイソタイプを決定した。
多価または一価のビオチニル化合成炭水化物(Tn、sTn、TF、Tnクラスター、グロボH、GD2、GM2およびGD3)を、Neutr-アビジンコーティングし、かつ0.25%BSAで遮断したプレート上に捕捉した。MUC1-ペプチド(配列番号157)、MUC1-ジ-Tnペプチド(配列番号156)、MUC1-1-5Gペプチド(配列番号155)およびBSM(ウシ顎下腺ムチン)でプレートを直接コーティングし、0.25%BSAで遮断した。様々な濃度の精製mAb(100μL/ウェル)を室温で1時間インキュベートし、0.5%Tween/PBSで3回洗浄した。結合した抗体を、0.05%Tween/PBSで4回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗ヒトIgG-Fc(Jackson ImmunoResearch)で、基質としてOPDを使用して検出した。ガングリオシドGD2、GD3、フコシル-GM1、GM2およびGM3を、5μg/mLでEtOH中に希釈し、プレートが乾燥するまでインキュベートした。プレートを2%ヒト血清アルブミンで遮断し、PBSで洗浄した。精製mAbを室温で1時間インキュベートし、PBSで2回洗浄した。0.025%Tween/PBSによる3回の洗浄後、結合した抗体をアルカリホスファターゼコンジュゲート抗ヒトIgG-Fc(KPL)で、基質としてdNPPを使用して検出した。
以前に説明されるように、個々のハイブリドーマ細胞株からRT-PCRによってヒトmAb重鎖および軽鎖cDNAの可変領域を回復し、IgG1もしくはIgM重鎖またはIgKもしくはIgL軽鎖発現ベクターにサブクローニングした。Sawada-Hirai et al., J. Immune Based Ther. Vaccines, 2:5 (2004)。抗体クローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3および3A7のFab重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列を、それぞれ、以下の表7および8に示す。組換えmAbを、Expi-CHO発現キット(Thermo Fisher)を使用して一過的に発現させた。
Unicorn 5.0ソフトウェアを使用するAkta Explorer(GE Healthcare)系を使用して、抗体を精製した。血清非含有培養培地上清を、遠心分離および濾過によって浄化し、使用するまで冷蔵保存した。適切なサイズのタンパク質Aカラム上で10mmol/L PBSおよび150mmol/L NaClランニング緩衝液を使用してヒトIgG抗体を精製した。ヒドロキシアパタイトカラム上でヒトIgM抗体を精製し、IgMを500mmol/Lホスフェートの勾配で溶離した。抗体濃度を、IgGおよびIgMについてそれぞれ、1.4および1.18のE1%を使用するOD280、およびタンパク質A HPLCによって決定した。各調製物の純度を、還元条件下でのSDS-PAGE分析(1レーン当たり1~5μg)によって評価した。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、凝集を査定した。
US Biomax,Incから4つの腫瘍マイクロアレイを得、2F3-G3で染色し、結合についてスコア付けした。小細胞肺がん(SCLC:small cell lung cancer)アレイ(カタログ番号LC818)は、80症例を含有し、1症例当たり単一のコアを有した。35症例の漿液性腺癌、15症例の明細胞癌、15症例の子宮体部類内膜腺癌、10症例の粘液性腺癌、5症例のがん隣接組織を含有する卵巣がんアレイ(カタログ番号OV8011)は、全部で80症例からの単一のコアを有した。対照としてがん隣接乳房組織を伴う乳がん組織アレイ(カタログ番号BR1504b)は、TNM、臨床段階、病理グレードおよびIHCマーカー(ER、PR、Her-2、ARおよびKi67)結果を含み、様々な75症例からの2つ組のコアを含有した。これらの症例のうちの11症例は、両方のコアにおいてトリプルネガティブであり、これらを2F3染色についてさらに分析した。少なくとも1つのコアにおける2F3染色は、その症例について陽性と考えられた。最後に、各20症例の腺癌および転移性癌、各5症例の腺腫およびポリープ、4症例のクローン病、1症例の結核、5症例の結腸炎、各10症例の隣接正常結腸組織および正常組織を含有する結腸疾患スペクトル組織マイクロアレイ(カタログ番号BC05002a)を染色した。
腫瘍マイクロアレイからのデータは、文献からの証拠とともに、様々な腫瘍組織タイプにおけるTn抗原の広範な発現を実証した。特に、卵巣がん、乳がんおよび結腸がんの全ては、原発性ヒト腫瘍の約50%またはそれよりも高い染色を実証する。(図22)。全ての11症例のトリプルネガティブ乳がんは、2F3について陽性染色され、11症例のうちの10症例は、両方のコアにおいて陽性染色された。
Tn抗原またはsTn抗原への有力なヒトモノクローナル抗体のバリアント、2F3の生成および最適化
実施例Iで生成および特定したリード抗体の1つである2F3を、さらなるバリアントの生成および最適化のために選択した。エラープローンPCRを使用して2F3抗体の変異体を生成し、次に、部位特異的変異誘発および組換え法を使用して、生成した2F3変異体をさらに最適化した。一連の親和性成熟試験において、ELISAおよびFACSによって、好ましい変異抗体をモデルTn抗原へのそれらの改善した結合親和性についてスクリーニングした。
以前に説明されるように(Sawada-Hirai et al., J. Immune Based Ther. Vaccines, 2:5 (2004))、プライマーとしてVHFおよびCγRを使用するGeneMorphIIポリメラーゼ(Agilent)によるPCRによって、2F3 VH領域を増幅した。VH断片を精製し、IgG発現ベクターにサブクローニングした。個々のクローンからのプラスミドDNAを精製し、配列決定した。野生型2F3軽鎖を伴う変異体重鎖を使用して、Cos1細胞またはExpi-CHO細胞をコトランスフェクトした。Tn陽性細胞株(T-47DおよびJurkat)およびTn陰性細胞株(SK-MEL28)で、Tn特異的ELISAおよびフローサイトメトリーによって上清を評価した。
オーバーラッピングPCR(overlapping PCR)によって、CDRにおける点変異を生成した。PCRにより最初の5’および3’断片を別々に増幅した。N末端断片についてのリバースプライマーおよびC末端断片についてのフォワードプライマーは、中間のCDR位置をターゲティングするためのNNN配列との重複相補配列を有する。その後、混合鋳型として5’および3’断片を使用するVHFおよびCγRプライマーによるPCRによって、VH領域全体を増幅した。精製したVH断片をIgG発現カセットにサブクローニングし、発現させ、上記に説明されるように精製した。
断片間の接合がCDR2とCDR3との間のFR3に存在する5’断片および3’断片によるオーバーラップPCRを行うことによって、CDR2とCDR3との間の変異体組合せバリアントを同様に生成した。2つの断片を混合し、鋳型として使用して、VHFおよびCγRプライマーにより2つの変異を有するVH領域を増幅した。精製したVH断片をIgG発現カセットにサブクローニングし、発現させ、上記に説明されるように精製した。
Tn陽性(T-47D、OVCAR3、MCF7またはJurkat)腫瘍細胞株(状態当たり細胞0.5x106個)をPBS/2%FBS(PBSF)中で洗浄した。様々な濃度の試験または対照ヒトmAbを細胞に添加し、氷上で30分間インキュベートした(Gilewski et al., Clin Cancer Res, 6:1693-701 (2000);Gilewski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98:3270-5 (2001))。PBSF中で洗浄後、細胞をAlexaFluor-488抗ヒトIgG-Fcγまたは抗ヒトIgM-μ(Thermo Fisher)と氷上で30分間インキュベートした。細胞をPBSF中で2回洗浄し、Guava Personal Cell Analysis-96(PCA-96)系(Millipore)を使用するフローサイトメトリーによって蛍光データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。
リード抗体の1つである2F3を、親和性最適化のために選択した。エラープローンPCRを使用して変異体を生成し、変異体をELISAによってスクリーニングした(図9)。未精製細胞上清を定量し、Tn-PAAに結合させるために使用して、結合に対する変異の影響を決定した。この回において、バリアント17、33および75は、親配列と比較して顕著に改善した結合を示した。
さらに、1サブセットのリード最適化重鎖をわずかに改変して、人為的結果の配列を除去し(クローン17)、ある場合には、2つの好ましい変異体を組み合わせて単一の構築物にした(クローン1733)(図10)。ELISAによって多数の精製バッチをアッセイし、親分子と比較した。図10の表で示されるように、全ての最適化バリアントは、親分子に優る結合を示し、試験したバリアントの中でクローン1733、17v2および6は、Tn抗原への最も強い結合体であった。
2F3抗体バリアントの機能的特徴付け
抗がん治療等の治療適用に好適な2F3抗体バリアントの細胞機能性および生理機能性を査定するために、様々な機能アッセイを行って、蛍光色素のコンジュゲーション;細胞内部移行プロファイルの経時変化;細胞傷害薬の特定の細胞種への送達;および抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)を測定した。
抗体を最初に、PEG化N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SAT(PEG)4)とのコンジュゲーションによって官能化した。Zebaスピンカラム(ThermoFisher)を介して抗体を50mM NaHCO3に脱塩し、その後、4当量のPEG化N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SAT(PEG)4)(ThermoFisher 26099)で1時間を超えて処理した。反応を完了した後、Zebaスピンカラムを介して反応混合物を1XPBS pH7.4まで脱塩し、10体積%の脱保護緩衝液で処理し、室温で2時間反応させ、Zebaスピンカラムを使用して1XPBSに緩衝液交換して脱保護PEGチオールを得た。
AF488マレイミドとのコンジュゲーション
PEGチオール抗体を、マレイミド基を有する4.4当量のAF488(ThermoFisher)で室温にて1時間を超えて処理した。反応が完了した後、Zebaスピンカラムを使用して材料を1XPBS pH7.4に緩衝液交換した。
pHAbマレイミドとのコンジュゲーション。
PEGチオール抗体を、マレイミド基を有する4.4当量のpHAb(Promega)で室温にて1時間を超えて処理した。反応が完了した後、Zebaスピンカラムを使用して材料を1XPBS pH7.4に緩衝液交換した。
100mLのT-47D細胞(RPMI 1640+10%FBS中の細胞1x106個/mL、細胞0.5x106個/mLの最終濃度)を等体積のpHAbコンジュゲートmAb(PBS中の40μg/mL、20μg/mLの最終濃度)と37℃で5時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、2つの管に分割した。細胞を200μLのpH7培地(内部移行されたmAbのみを検出する)またはpH5.5培地(全mAbを検出する)に再懸濁し、氷上で維持した。Guava PCA-96系によって試料データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。内部移行%=MFI(pH7)/MFI(pH5.5)*100(MFI値はバックグラウンドについて補正した)。
pHAb色素を使用すること。
T-47D細胞(細胞0.5x106個/培地mL)を20μg/mLのpHAbコンジュゲート2F3 6番と4℃で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、同じ体積に再懸濁し、37℃でインキュベートした。示される時点で、200μLの細胞を回収し、遠心分離した。細胞を、10mM NaN3および5mM 2-デオキシグルコースを含有する200μLの培地に再懸濁し、2つのウェルに分割し(100μL/ウェル)、氷上で維持した。240分間のインキュベーション期間での最終回収後、100μL/ウェルの培地を添加して、各試料についてpH7.0またはpH5.5のいずれかに調節した。Guava PCA-96系によって試料データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。内部移行%=MFI(pH7)/MFI(pH5.5)*100(MFI値はバックグラウンドについて補正した)。
T-47D細胞(細胞0.5x106個/培地mL)を2μg/mLのAlexaFluor-488コンジュゲート2F3 6番と4℃で1時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、同じ体積に再懸濁し、37℃でインキュベートした。示される時点で、200μLの細胞を回収し、2つのウェルに分割した。AF488クエンチャー抗体を伴うか、または伴わない10mM NaN3を含有する100mLの培地(25μg/mLの最終濃度、ThermoFisher)をウェルに添加した。細胞を最終回収まで氷上で維持した(37℃で180分間、その後、4℃で30分間)。Guava PCA-96系によって試料データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。内部移行%=MFI(w/クエンチャー)/MFI(w/oクエンチャー)*100(MFI値はバックグラウンドについて補正した)。
96ウェルプレートにJurkat細胞を、10%FBS、L-GluおよびP/Sを含むRPMI 1640培地中に細胞1x105個/mL(細胞0.5x104個/50μL/ウェル)にて播種した。様々な濃度の精製mAb(別々の96ウェルプレート中で培地により希釈した)を200nMのタンパク質A-MMAE(LEV-AME-100)と室温で20分間インキュベートした。50mLのmAbとタンパク質A-MMAEとの複合体を各ウェルに添加し、37℃で3日間インキュベートした。CellTiter-Glo(70μL/ウェル、Promega)を各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートした。Gen5ソフトウェアを使用して化学発光シグナルを測定した。
健康なドナーの血液試料からフィコール密度勾配遠心分離によってPBMCを調製した。CAOV3細胞をカルセイン-AM(Thermo Fisher)により37℃で30分間標識した。培地による洗浄後、標識した細胞を96ウェルプレートに細胞10,000個/ウェルで添加した。PBMC(E/T 20:1)および様々な濃度の2F3バリアントをウェルに添加し、37℃で3時間インキュベートした。蛍光光度計を使用して蛍光シグナルを測定した。細胞傷害性%=(試料RFI-最小放出RFI)/(最大放出RFI-最小放出RFI)*100、NP40で溶解したCAOV3を最大放出として使用した。PBMCのみを有するCAOV3細胞を自発的(最小)放出として使用した。
pH7.0でT-47D細胞株に内部移行される蛍光色素とコンジュゲートしたバリアント抗体の蛍光強度中央値(MFI:median fluorescence intensity)の、pH7.0での内部移行され得る抗体の全量に対する比を測定することによって、2F3バリアントの細胞内部移行パーセントを評価した(図17)。結果は、全ての2F3バリアントは5時間で74%~95%の結合抗体を内部移行したこと、および内部移行アッセイにおいてバリアント6および1733は最も優れた結合体および内部移行薬であることを示した。最も高い内部移行パーセントを有する最も高い結合リードである2F3バリアントクローン6について、3時間の期間にわたる内部移行を測定する直交法を使用することによって、内部移行経時変化研究をさらに行った(図18A)。時間の関数として計算される内部移行パーセントは、Tn抗原を内因的に発現する細胞株に内部移行されたバリアント抗体の部分における比例的増大を実証した(図18B)。
次に、治療薬を結合し、それを内部移行する特定の細胞種に細胞傷害薬をターゲティングする前記治療薬について、抗Tn抗体の内部移行を評価した。細胞傷害剤を細胞へと方向付け得る2F3バリアントについてスクリーニングするために、タンパク質A-MMAEコンジュゲートと抗体との複合体を使用して細胞を処理し、3日後に細胞生存能を測定した(図20A~20B)。多くのバリアントからのデータは、効率的な死滅を実証し、多くの場合、親クローンによる死滅を3~10倍超えた。
最後に、エフェクター細胞の存在下で腫瘍細胞に対する細胞傷害性効果を媒介する親和性バリアントの能力を実証するために、ADCCアッセイを行った(図21)。バリアント17、80および6は、特に高いADCCを実証し、クローン80は最も高い効力を実証する。この結果から動機付けられ、クローン80とクローン6および17との間の組合せ変異体を生成した。
2F3抗Tn/sTn抗体はSer残基上のTnを優先的に認識する
2F3抗体およびそのバリアントが結合するグリカンエピトープを決定するために、上記に説明されるように、ELISAアッセイを使用して一連の実験を行った。上記に説明される実験と一致して、Tn-PAA以外の合成抗原に対する2F3バリアントの結合は観察されなかった。例えば、2F3G1変異体のThomsen-Friedenreich(TF)-ポリアクリルアミド(PAA)糖コンジュゲート(TF-PAA)、Tn-β-PAAまたはTn-SPへの結合は観察されなかった(図23A~C)。Muc1上のエピトープを決定するために、基質として、Tn抗原がトレオニン(Thr)残基に連結されたジ-Tn-MUC1ペプチド(PAPGST*APPAHGVTSAPDT*RPAPG)(配列番号156)を使用して、2F3G1変異体の結合を査定した。結果は、抗体はジ-Tn-MUC1ペプチドに結合しないことを実証し、2F3G1変異体はThr改変MUC1に結合しないことを示した(図23D)。
Claims (26)
- Thomsen-nouvelle(Tn)抗原(グリコシド結合によってセリンまたはトレオニンに結合した単糖構造N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)(GalNAcα-O-セリン/トレオニン))またはそのシアル化形態(sTn抗原)に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、
(a)可変重鎖(VH)ドメインであって、下記:
(i)配列番号5のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号17、149、150、151および152からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号30および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含む前記可変重鎖(VH)ドメイン、
および
(b)可変軽鎖(VL)ドメインであって、下記:
(i)配列番号44のアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53のアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号70のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む前記可変軽鎖(VL)ドメイン
を含む、前記抗体またはその機能的断片。 - VHドメインとVLドメインを含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片であって、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号5のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号17のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号30のアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、かつ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号44のアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53のアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号70のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、
前記単離された抗体または機能的断片。 - VHドメインとVLドメインを含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片であって、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号5のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号150のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号30のアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、かつ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号44のアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53のアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号70のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、
前記単離された抗体または機能的断片。 - VHドメインとVLドメインを含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片であって、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号5のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号149のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号30のアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、かつ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号44のアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53のアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号70のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、
前記単離された抗体または機能的断片。 - VHドメインとVLドメインを含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片であって、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号5のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号151のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号30のアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、かつ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号44のアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53のアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号70のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、
前記単離された抗体または機能的断片。 - VHドメインとVLドメインを含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片であって、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号5のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号152のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号30のアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、かつ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号44のアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53のアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号70のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、
前記単離された抗体または機能的断片。 - VHドメインとVLドメインを含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片であって、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号5のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号150のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号154のアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、かつ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号44のアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53のアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号70のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、
前記単離された抗体または機能的断片。 - VHドメインとVLドメインを含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片であって、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号5のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号149のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号154のアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、かつ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号44のアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53のアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号70のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、
前記単離された抗体または機能的断片。 - 前記VHドメインが、配列番号105、122、123、124、125、127および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。
- 前記VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。
- 前記機能的断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびミニボディからなる群から選択される、請求項1~10のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1~10のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記抗体またはその機能的断片が、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、CDRグラフト化抗体および完全ヒト抗体の構成成分である、請求項1~11のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記抗体が、ヒトIgGまたはIgMアイソタイプ抗体である、請求項1~10のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記抗体またはその機能的断片が、Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、請求項1~14のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記抗体が、1つまたは複数のセリン残基上でTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する、請求項15に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- Tn抗原が、がん細胞によって発現される、請求項16に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 局在化剤、検出可能剤または治療剤にコンジュゲートまたは組換え融合された請求項1~17のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片を含むコンジュゲート。
- 前記コンジュゲートが検出可能剤を含み、前記検出可能剤が検出可能な反応を触媒する酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、非放射性常磁性金属イオン、陽電子放出放射性核種またはガンマ線放出放射性核種である、請求項18に記載のコンジュゲート。
- 前記コンジュゲートが治療剤を含み、前記治療剤が毒素、アポトーシス剤、抗血管新生剤、サイトカイン、増殖因子、凝固剤およびキメラ抗原受容体からなる群から選択されるか、或いは前記治療剤が化学療法剤である、請求項18に記載のコンジュゲート。
- 前記化学療法剤が、アントラサイクリン、タキサン、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、オーリスタチン分子、ホルモン、ヌクレオシドアナログ、DNA修復酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤、細胞傷害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNA副溝結合剤(DNAマイナーグローブバインダー)、アデノシンデアミナーゼ阻害剤および微小管攪乱剤からなる群から選択される、請求項20に記載のコンジュゲート。
- 請求項1~17のいずれか1項に記載の抗体またはその機能的断片を含み、且つ薬学的に許容される担体を含んでいてもよい医薬組成物。
- 請求項18~21のいずれか1項に記載のコンジュゲートを含み、且つ薬学的に許容される担体を含んでいてもよい医薬組成物。
- がんまたは腫瘍形成を治療または予防するのに用いるための請求項22または23に記載の医薬組成物であって、前記がんまたは前記腫瘍の細胞が、Tn抗原またはsTn抗原を含むタンパク質を前記細胞の表面上に発現する、医薬組成物。
- 前記がんまたは腫瘍が、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、子宮内膜がんおよび膵がんからなる群から選択される、請求項24に記載の医薬組成物。
- 第2の治療剤(好ましくは化学療法剤または免疫療法剤)と組み合わせて用いられる、請求項24または25に記載の医薬組成物。
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