JP7299405B2 - シアリル－Ｌｅｗｉｓ ａに対するヒト抗体をコードする核酸 - Google Patents

シアリル－Ｌｅｗｉｓ ａに対するヒト抗体をコードする核酸 Download PDF

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Description

本願は、２０１３年８月２６日に出願した米国仮出願第６１／８７０，１３７号の優先権の利益を主張する。この出願の内容全体は、本明細書で参考として援用される。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＮＩＨによって授与された助成金番号ＣＡ－１２８３６２の下で政府の支援を受けてなされた。合衆国政府は、本願に一定の権利を有する。
発明の背景
本発明は、一般に、シアリル－Ｌｅｗｉｓａ（ｓＬｅａ）を対象とする抗体に関し、より詳細には、抗ｓＬｅａ抗体をコードするポリヌクレオチドおよび対応するコードされた抗体またはその断片に関する。
腫瘍特異的抗原を対象とする抗体の受動的な投与により、がん発生の間の腫瘍細胞および初期転移が排除され得る。この処置は、がん再発に対しても重要な影響を及ぼし得る。このがん処置では、腫瘍特異的炭水化物を対象とする抗体が有用な候補であり得る。例えば、ヒトがん細胞を用いてマウスを免疫することによって生じる、腫瘍により制限される多くのモノクローナル抗体は、細胞表面に糖脂質または糖タンパク質として発現する炭水化物抗原を対象とすることが示されている。炭水化物ｓＬｅａは、胃腸管の腫瘍において発現することが示されている。ｓＬｅａの発現は、転移能に影響を及ぼすことも示されており、ヒト結腸がんおよび膵臓腺癌の転移能の増大と相関する。しかし、炭水化物化学はどちらかといえば難しいものであり、そのような腫瘍特異的炭水化物を認識する抗体の臨床開発は遅れている。
膵癌は最も侵襲性の高い腺癌の１つであり、多くの場合、予後不良が伴う。膵癌は、がん死亡率の主な原因の第４位である。様々な癌腫のスクリーニングにおける進歩にもかかわらず、膵臓から生じる悪性病変の検出の信頼度は不十分なままである。膵がんの検出および病期分類にはフルオロデオキシグルカーゼ（fluorodeoxyglucase）を利用する陽電子放出断層撮影法（ＦＤＧ－ＰＥＴ）が適応する。しかし、ＦＤＧ－ＰＥＴは、悪性腫瘍から分化中の膵炎に対しては非感受性であり、小さな原発性病変（＜７ｍｍ）および肝転移（＜１ｃｍ）の病期分類には問題が残っている。膵管腺癌（ＰＤＡＣ）患者の状態をモニタリングするために使用される１つの診断的なスクリーニング方法は、血清中の循環ｓＬｅａ抗原のレベルの上昇を検出するステップを含む。循環ｓＬｅａ抗原が＞３７Ｕ／ｍｌである患者はがん再発を示す。しかし、そのような腫瘍特異的炭水化物を利用する代替の診断ツールの開発は遅れている。
したがって、再発性のがんを処置するため、ならびに悪性病変および転移を検出するために、ｓＬｅａなどの腫瘍特異的炭水化物を特異的に認識する抗体を同定し、生成することが必要とされている。本発明は、この必要性を満たし、関連する利点を提供する。
本発明によると、ｓＬｅａに結合する抗体またはその機能性断片を作製するための組成物が本明細書で提供される。組成物は、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む抗体またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供される、抗体またはその機能性断片のＶＨドメインをコードする核酸配列も含み得る。
本発明の別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む抗体またはその機能性断片をコードし得る。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供される、抗体またはその機能性断片のＶＬドメインをコードする核酸配列も含み得る。
本発明の組成物は、ｓＬｅａに結合する単離された抗体またはその機能性断片も含む。一部の実施形態では、本発明は、ｓＬｅａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ｓＬｅａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ｓＬｅａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方を含み、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、それぞれ、本明細書で提供されるクローン単離体のＶＨドメインおよびＶＬドメインそれぞれのアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で提供される抗体または機能性断片が診断剤、検出可能剤（detectable agent）または治療剤とコンジュゲートしまたは組換えによって融合したコンジュゲートを提供する。本発明の一部の態様では、腫瘍形成を検出および／または診断するための方法において使用することができる検出可能剤を含む本発明のコンジュゲートを主題とする。そのような方法は、それを必要とする被験体にコンジュゲートの有効量を投与するステップを含み得る。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の１種または複数種の抗体または機能性断片および薬学的に許容され得る担体を有する医薬組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、疾患を処置または予防することを必要とする被験体において、本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することによって疾患を処置または予防するための方法も提供する。さらに別の態様では、本発明は、第２の治療剤を本発明の抗体または機能性断片と同時にまたは逐次投与することを提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
抗体重鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記抗体重鎖またはその機能性断片が、配列番号２の残基２０～１４２、配列番号６の残基２０～１４２、配列番号１０の残基２０～１４２、および配列番号１４の残基２０～１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２）
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号１の残基５８～４２６、配列番号５の残基５８～４２６、配列番号９の残基５８～４２６および配列番号１３の残基５８～４３５からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、項目１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目３）
抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記抗体軽鎖またはその機能性断片が、配列番号４の残基２０～１３０、配列番号８の残基２０～１２９、配列番号１２の残基２０～１３０、および配列番号１６の残基２３～１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む、抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
（項目４）
前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号３の残基５８～３９０、配列番号７の残基５８～３８７、配列番号１１の残基５８～３９０および配列番号１５の残基６７～３９０からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、項目３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目５）
シアリル－Ｌｅｗｉｓａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、前記抗体またはその機能性断片が、可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインが、配列番号２の残基２０～１４２、配列番号６の残基２０～１４２、配列番号１０の残基２０～１４２、および配列番号１４の残基２０～１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能性断片。
（項目６）
シアリル－Ｌｅｗｉｓａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、前記抗体またはその機能性断片が、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＬドメインが、配列番号４の残基２０～１３０、配列番号８の残基２０～１２９、配列番号１２の残基２０～１３０、および配列番号１６の残基２３～１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその機能性断片。
（項目７）
シアリル－Ｌｅｗｉｓａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、前記抗体またはその機能性断片が、可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインおよび前記ＶＬドメインが、それぞれ、配列番号２の残基２０～１４２および配列番号４の残基２０～１３０；配列番号６の残基２０～１４２および配列番号８の残基２０～１２９；配列番号１０の残基２０～１４２および配列番号１２の残基２０～１３０；ならびに配列番号１４の残基２０～１４５および配列番号１６の残基２３～１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその機能性断片。
（項目８）
前記抗体がヒト抗体である、項目５から７までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目９）
前記抗体機能性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディおよび単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）からなる群から選択される、項目５から７までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１０）
前記抗体機能性断片がダイアボディである、項目９に記載の抗体またはその機能性断片。
（項目１１）
前記ダイアボディが、配列番号１８または２０のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の抗体または機能性断片。
（項目１２）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目５から７までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１３）
前記抗体がＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプである、項目５から７までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１４）
前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ１サブクラスである、項目１３に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１５）
診断剤、検出可能剤または治療剤とコンジュゲートしているかまたは組換えによって融合している、項目５から７までのいずれか一項に記載の単離された抗体または機能性断片を含むコンジュゲート。
（項目１６）
検出可能剤を含む、項目１５に記載のコンジュゲート。
（項目１７）
前記検出可能剤がジルコニウム（８９Ｚｒ）である、項目１６に記載のコンジュゲート。
（項目１８）
項目５から７までのいずれか一項に記載の抗体または機能性断片および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
（項目１９）
疾患を処置または予防するための方法であって、疾患を処置または予防することを必要とする被験体に項目１８に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
（項目２０）
前記疾患ががんまたは腫瘍形成であり、前記がんまたは前記腫瘍の細胞がｓＬｅａを発現する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記がんまたは腫瘍が、胃腸管の腫瘍、結腸がん、結腸直腸腺癌、転移性結腸がん、結腸直腸がん、膵がん、膵臓腺癌、肺小細胞癌、膀胱腺癌、卵巣印環細胞がん、卵巣がん、転移性癌、胃の腺癌、食道の腺癌、咽喉の腺癌、尿生殖路の腺癌、および乳房の腺癌からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
第２の治療剤を同時にまたは逐次投与するステップをさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記第２の治療剤が化学療法剤または免疫療法剤である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
被験体における腫瘍を検出するための方法であって、被験体における腫瘍を検出することを必要とする被験体に項目１６に記載のコンジュゲートの有効量を投与するステップを含む方法。
図１は、組換え発現のために使用することができるクローン５Ｂ１の可変重（ＶＨ）鎖ドメインおよびリーダー配列のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図の上部は、配列番号１のヌクレオチド配列と配列番号２のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）も特定されている。 図２は、組換え発現のために使用することができるクローン５Ｂ１の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインおよびリーダー配列のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図の上部は、配列番号３のヌクレオチド配列と配列番号４のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）も特定されている。 図３は、組換え発現のために使用することができるクローン９Ｈ３の可変重（ＶＨ）鎖ドメインおよびリーダー配列のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図の上部は、配列番号５のヌクレオチド配列と配列番号６のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）も特定されている。 図４は、組換え発現のために使用することができるクローン９Ｈ３の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインおよびリーダー配列のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図の上部は、配列番号７のヌクレオチド配列と配列番号８のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）も特定されている。 図５は、組換え発現のために使用することができるクローン５Ｈ１１の可変重（ＶＨ）鎖ドメインおよびリーダー配列のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図の上部は、配列番号９のヌクレオチド配列と配列番号１０のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）も特定されている。 図６は、組換え発現のために使用することができるクローン５Ｈ１１の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインおよびリーダー配列のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図の上部は、配列番号１１のヌクレオチド配列と配列番号１２のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）も特定されている。 図７は、組換え発現のために使用することができるクローン７Ｅ３の可変重（ＶＨ）鎖ドメインおよびリーダー配列のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図の上部は、配列番号１３のヌクレオチド配列と配列番号１４のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）も特定されている。 図８は、組換え発現のために使用することができるクローン７Ｅ３の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインおよびリーダー配列のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図の上部は、配列番号１５のヌクレオチド配列と配列番号１６のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）も特定されている。 図９は、クローン５Ｂ１の可変重（ＶＨ）鎖ドメインと可変軽（ＶＬ）鎖ドメインの両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ２を有する、５Ｂ１ＣｙｓＤｂと名付けたダイアボディのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図の上部は、配列番号１７のヌクレオチド配列と配列番号１８のアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は太字の下線が引かれたテキストで特定されている。リンカー配列およびアミノ酸が付加されたポリヒスチジンタグ（ポリＨｉｓタグ）も、イタリック体で下線が引かれたテキストで示されている。 図１０は、クローン７Ｅ３の可変重（ＶＨ）鎖ドメインと可変軽（ＶＬ）鎖ドメインの両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ２を有する、７Ｅ３ＣｙｓＤｂと名付けたダイアボディのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図の上部は、配列番号１９のヌクレオチド配列と配列番号２０のアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は太字の下線が引かれたテキストで特定されている。リンカー配列およびアミノ酸が付加されたポリヒスチジンタグ（ポリＨｉｓタグ）も、イタリック体で下線が引かれたテキストで示されている。 図１１のパネルＡ～Ｅは、フローサイトメトリーによって分析した、ヒト抗ｓＬｅａ抗体の腫瘍細胞への結合を示す。パネルＡは、組換え（ｒ）５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１、および７Ｅ３抗体を用いて染色したＤＭＳ－７９細胞を示す。パネルＢ～Ｆは、それぞれ、実施例Ｉに記載の通り１～２μｇ／ｍＬのｒ５Ｂ１またはｒ７Ｅ３プラスＩｇＧまたはＩｇＭ特異的二次抗体を用いて染色したＨＴ２９、ＢｘＰＣ３、ＳＷ６２６、ＳＫ－ＭＥＬ２８、およびＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ細胞を示す。 図１１のパネルＡ～Ｅは、フローサイトメトリーによって分析した、ヒト抗ｓＬｅａ抗体の腫瘍細胞への結合を示す。パネルＡは、組換え（ｒ）５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１、および７Ｅ３抗体を用いて染色したＤＭＳ－７９細胞を示す。パネルＢ～Ｆは、それぞれ、実施例Ｉに記載の通り１～２μｇ／ｍＬのｒ５Ｂ１またはｒ７Ｅ３プラスＩｇＧまたはＩｇＭ特異的二次抗体を用いて染色したＨＴ２９、ＢｘＰＣ３、ＳＷ６２６、ＳＫ－ＭＥＬ２８、およびＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ細胞を示す。 図１２のパネルＡおよびＢは、ＤＭＳ－７９細胞に対して測定した、ヒト補体（Ｈｕ Ｃ’）の存在下でのｒ５Ｂ１およびｒ７Ｅ３抗体のＣＤＣ活性をネズミ１２１ＳＬＥ（ＩｇＭ）と比較して示す。ヒトアイソタイプ対照抗体、Ｈｕ ＩｇＧ（◇）およびＨｕ ＩｇＭ（◆）は＜４％の細胞傷害性を示した。ｒ５Ｂ１ ＩｇＧ（■）、ｒ７Ｅ３ ＩｇＭ（●）および１２１ＳＬＥ ｍＩｇＭ（▲）抗体についての用量反応がパネルＡに示されている。ｒ５Ｂ１（ＩｇＧ）、ｒ７Ｅ３（ＩｇＭ）および１２１ＳＬＥ（ｍＩｇＭ）抗体についての算出されたＥＣ５０（μｇ／ｍｌ）がパネルＢに示されている。 図１３のパネルＡ～Ｃは、ｒ５Ｂ１抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。パネルＡは、ヒトＰＢＭＣを用いたＤＭＳ－７９細胞に対するｒ５Ｂ１媒介性ＡＤＣＣを示す。ＰＢＭＣを、２μｇ／ｍＬのｒ５Ｂ１の存在下または不在下、ＤＭＳ－７９腫瘍細胞と１００：１から１２．５：１までのＥ：Ｔ比で試験した。パネルＢは、初代ヒトＮＫ細胞を用いたＤＭＳ－７９細胞に対するｒ５Ｂ１媒介性ＡＤＣＣを示す。ＮＫ細胞を、２μｇ／ｍＬのｒ５Ｂ１の存在下または不在下、ＤＭＳ－７９腫瘍細胞と５：１から０．６：１までの低Ｅ：Ｔ比で試験した。パネルＣは、示されている濃度のｒ５Ｂ１の存在下、２ドナー由来のＰＢＭＣをＤＭＳ－７９腫瘍細胞と１：１００のＥ：Ｔ比で用いた、様々な濃度のｒ５Ｂ１のＡＤＣＣを示す。 図１４は、ＢｘＰＣ３細胞へのｓＬｅａの内部移行を示す。ＢｘＰＣ３膵腫瘍細胞を、サポリンとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧであるＨｕｍ－ＺＡＰと複合体を形成したｒ５Ｂ１（抗ｓＬｅａ）またはｒ１Ｂ７（抗ＧＤ２）抗体の存在下で成長させた。３日後に、細胞の生存能力を、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを使用して測定し、試料の値を、処理していない培養物の値に対して正規化した。 図１５は、Ｃｏｌｏ２０５－ｌｕｃ細胞を使用した異種移植モデルにおけるｒ５Ｂ１抗体の活性を示す。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（群あたり５匹）に、０日目にＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ細胞５００，０００個を尾静脈注射した。マウスにｒ５Ｂ１を、総用量を６００μｇとして、１日目、７日目、１４日目、および２１日目（実験１、Ｅｘｐ１）または１日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目、および２１日目（実験２、Ｅｘｐ２）に１００μｇを腹腔内注射した。対照（Ｃｔｒｌ）動物にはＰＢＳ偽注射を行った。 図１６は、ＳＣＩＤマウスにおけるｒ５Ｂ１のＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ腫瘍に対する効果を示す。実施例Ｉに記載の通り、マウスにｒ５Ｂ１抗体を注射１回当たり１００μｇ（▼）、３００μｇ（■）または１ｍｇ（◆）注射した。対照（■）動物にはＰＢＳ偽注射を行った。 図１７は、ｒ５Ｂ１で処置した、Ｃｏｌｏ２０５－ｌｕｃ腫瘍を有するマウスに関する、群当たり５匹のマウスの０日目および５週目の蛍光画像処理を示す。マウスに、図１６に示されており、実施例Ｉに記載されている処置レジメンを行った。 図１８のパネルＡおよびＢは、治療的皮下異種移植モデルにおけるＤＭＳ－７９細胞を使用した抗腫瘍活性を示す。パネルＡは、ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ単独（◆）またはＩｇＧ＋ｃＲＧＤ（●））およびＰＢＳを注射した対照（■）と比較した、５Ｂ１で処置したマウス（５Ｂ１単独（▲）または５Ｂ１＋ｃＲＧＤ（▼））に関する抑制または退縮を示す。矢印は、抗体またはＰＢＳを注射した日を示す。 図１８のパネルＡおよびＢは、治療的皮下異種移植モデルにおけるＤＭＳ－７９細胞を使用した抗腫瘍活性を示す。パネルＢは、処置したマウスの代表的な画像を示す。矢印は、目に見える腫瘍が少しも存在しないことを示す。 図１９のパネルＡ～Ｆは、５Ｂ１の種々の腫瘍型への結合を示す。パネルＡは、膵臓、管腺癌、ＩＩＩ期の腫瘍である。パネルＢは、Ｓ状結腸、癌腫ＩＩＩＢ期の腫瘍である。パネルＣは、肺、腺癌、ＩＢ期の腫瘍である。パネルＤは、膀胱、粘液性腺癌、ＩＶ期の腫瘍である。パネルＥは、卵巣、結腸腫瘍由来の転移性癌である。パネルＦは、リンパ節、転移性癌、ＩＩＩＡ期の腫瘍である。 図２０は、ＢｘＰＣ３膵腫瘍を皮下に植え込んだ雌ＳＣＩＤマウスに静脈内投与した８９Ｚｒ放射標識５Ｂ１抗体（８９Ｚｒ－５Ｂ１）を用いて２～１２０時間で得られた段階的なＰＥＴ最大値投影法（ＭＩＰ）画像を示す。ＰＥＴ－ＭＩＰ画像処理により、早ければ注射後２４時間（ｈ ｐ．ｉ．）で非特異的に結合したトレーサーの排除を伴う高い腫瘍への取り込みが実証される。 図２１は、体内分布結果を示す。これは図２０のＰＥＴデータと一致し、８４．７３±１２．２８％ＩＤ／ｇの腫瘍への取り込みが観察された。腫瘍重量が小さいので、時間に対する％ＩＤで表した腫瘍への取り込みのプロットを挿入グラフで示した。腫瘍％ＩＤは全ての時点での８９Ｚｒ－５Ｂ１による有意な腫瘍への取り込みを示し、非特異的８９Ｚｒ－ＩｇＧの少なくとも７倍である。非放射性５Ｂ１（２００μｇ）を用いた競合阻害により、腫瘍蓄積の減少が示される。 図２２、パネルＡ～Ｃは、ＤＭＳ７９異種移植片を有するマウス（パネルＡ）およびＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ異種移植片を有するマウス（パネルＢ）のＰＥＴ－ＭＩＰ画像を示す。８９Ｚｒ－５Ｂ１による腫瘍（Ｔ）、心臓（Ｈ）および肝臓（Ｌ）のＰＥＴ－ＭＩＰ画像処理による描写が示されている。結腸直腸Ｃｏｌｏ２０５－ｌｕｃ異種移植モデルは、２４時間でピークに達する８９Ｚｒ－５Ｂ１蓄積を示し、それは結局減少するが、肝臓への非特異的な結合の増加が示された（パネルＣ）。 図２３は、５Ｂ１抗体とタキソール（パクリタキセル）を連続的に同時投与することにより処置したＤＭＳ－７９小肺細胞癌異種移植モデルにおける腫瘍の成長の用量依存性の阻害および退縮を示す。Ｘ軸上の大きな矢印は５Ｂ１による処置を示す。５Ｂ１抗体とタキソールを同時投与することにより、対照ヒトＩｇＧ（ＨｕＩｇＧ）または５Ｂ１抗体とタキソールの個別投与と比較して腫瘍の成長が有意に制限され、腫瘍の退縮がもたらされた。二元配置ＡＮＯＶＡにより、ｐ＜０．０１（＊＊）およびｐ＜０．００１（＊＊＊）で有意差が示されている。Ｎ＝５。 図２４は、５Ｂ１抗体とタキソール（パクリタキセル）を連続的に同時投与することにより処置したＢｘＰｃ３膵癌異種移植モデルにおける腫瘍の成長の阻害を示す。Ｘ軸上の大きな矢印はタキソールと５Ｂ１による処置を示し、小さな矢印は５Ｂ１単独での処置を示す。５Ｂ１抗体とタキソールを同時投与することにより、対照（ＰＢＳ－Ｃｔｒｌ；ヒトＩｇＧ－ＨｕＩｇＧ）または５Ｂ１抗体とタキソールの個別投与と比較して腫瘍の成長が有意に制限された。 図２５のパネルＡおよびＢは、ＢｘＰＣ３－ｌｕｃ膵腫瘍異種移植片を同所移植したマウスの代表的な画像を示す。パネルＡ：ＦＤＧ－ＰＥＴとコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）の共表示（左側）およびＦＤＧ－ＰＥＴのみの平面断面（右側）により、トレーサーによる最小腫瘍検出が示され、高代謝組織（すなわち、心臓、Ｈおよび膀胱、Ｂ）での取り込みが大きいことが示された。パネルＢ：同じマウスの取得した８９Ｚｒ放射標識５Ｂ１抗体（８９Ｚｒ－５Ｂ１）ＰＥＴ画像とＣＴの共表示により、ＢｘＰＣ３－ｌｕｃ腫瘍異種移植片のすぐれた腫瘍検出が示された。
発明の詳細な説明
腫瘍細胞表面上に発現する炭水化物は、受動免疫療法の標的であり得る。本明細書で提供される組成物は、少なくとも一部において、シアリル－Ｌｅｗｉｓａ－キーホールリンペットヘモシアニン（ｓＬｅａ－ＫＬＨ）コンジュゲートワクチンを用いて免疫した個体の血液リンパ球から生成されたヒト抗体の同定および特徴付けに基づく。ｓＬｅａに対する親和性が高い抗体が少なくとも４種同定された（５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１および７Ｅ３）。これらの抗体のうちの２種を組換え抗体として発現させ（ｒ５Ｂ１およびｒ７Ｅ３）、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいてさらに特徴付けた。どちらの抗体も補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて効力があり、５Ｂ１抗体は抗体依存性細胞傷害アッセイにおいても高度に活性であった。抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに植え付けたＣｏｌｏ２０５腫瘍細胞またはＤＭＳ－７９腫瘍細胞のいずれかを使用した２種の異種移植モデルにおいて試験した。本明細書で提供される本発明の技術移転の妥当性は２倍である。第１に、本明細書で提供される手法により、ｓＬｅａ－ＫＬＨワクチンによって引き出される抗体応答がワクチン自体として有用であることが実証される。第２に、臨床試験において生成した最も強力な抗体を保存し、標的がん集団に対する、治療薬として、または治療薬の生成において最終的に使用することができる。本明細書で提供される抗体の親和性が高いこと、およびそれらのエフェクター機能が高いことにより、この技術移転の潜在性が支持される。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特異的な分子抗原に結合することができ、２つの同一のポリペプチド鎖の対で構成され、各対が１つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）と１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）を有し、各鎖の各アミノ末端部分が約１００～約１３０またはそれ超のアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分が定常領域を含む、ポリペプチドの免疫グロブリンクラスの範囲に入るＢ細胞のポリペプチド産物を意味するものとする（Borrebaeck（編）（１９９５年）Antibody Engineering、第２版、Oxford University Press.；Kuby（１９９７年）Immunology、第３版、W.H. Freeman and Company、New Yorkを参照されたい）。本発明に関しては、本発明の抗体が結合し得る特異的な分子抗原として、標的炭水化物ｓＬｅａが挙げられる。
「ヒト」という用語は、抗体またはその機能性断片に関して使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応するヒト可変領域および／またはヒト定常領域またはその一部を有する抗体またはその機能性断片を指す。そのようなヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列は、Kabatら（１９９１年）Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. ９１～３２４２により記載されている。ヒト抗体は、本発明に関しては、ｓＬｅａに結合し、かつ、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞性バリアントである核酸配列によりコードされる抗体を含み得る。ヒト抗体を作製する典型的な方法が実施例Ｉに提示されているが、当業者に周知の任意の方法を使用することができる。
「モノクローナル抗体」という用語は、単一細胞クローンもしくはハイブリドーマまたは単一細胞に由来する細胞の集団の産物である抗体を指す。モノクローナル抗体とは、単一分子免疫グロブリン種が産生されるように組換え方法によって重鎖および軽鎖をコードする免疫グロブリン遺伝子から作製される抗体も指すものとする。モノクローナル抗体調製物内の抗体のアミノ酸配列は実質的に均一であり、そのような調製物内の抗体の結合活性は実質的に同じ抗原結合活性を示す。対照的に、ポリクローナル抗体は、集団内の異なるＢ細胞から得られる、特異的な抗原に結合する免疫グロブリン分子の組合せである。ポリクローナル抗体の各免疫グロブリンは、同じ抗原の異なるエピトープに結合し得る。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の作製方法は当技術分野で周知である（HarlowおよびLane.、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）およびBorrebaeck（編）、Antibody Engineering: A Practical Guide、W.H. Freeman and Co.、Publishers、New York、１０３～１２０頁（１９９１年））。
本明細書で使用される場合、「機能性断片」という用語は、抗体に関して使用される場合、その断片が由来する抗体としての結合活性の一部または全部を保持する重鎖または軽鎖ポリペプチドを含む抗体の一部を指すものとする。そのような機能性断片としては、例えば、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）およびミニボディを挙げることができる。他の機能性断片としては、例えば、そのような機能性断片が結合活性を保持する限りは、重鎖または軽鎖ポリペプチド、可変領域ポリペプチドまたはＣＤＲポリペプチドまたはその一部を挙げることができる。そのような抗体の結合性断片は、例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York（１９８９年）；Myers（編）、Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference、New York：VCH Publisher, Inc.；Hustonら、Cell Biophysics、２２巻：１８９～２２４頁（１９９３年）；PlueckthunおよびSkerra、Meth. Enzymol.、１７８巻：４９７～５１５頁（１９８９年）ならびにDay、E.D.、Advanced Immunochemistry、第２版、Wiley-Liss, Inc.、New York、NY（１９９０年）に見いだすことができる。
「重鎖」という用語は、抗体に関して使用される場合、アミノ末端部分が約１２０～１３０またはそれ超のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む、約５０～７０ｋＤａのポリペプチド鎖を指す。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と称される５種の別個の型のうちの１種であり得る。別個の重鎖は、サイズが異なり、α、δおよびγはおよそ４５０アミノ酸を含有し、μおよびεはおよそ５５０アミノ酸を含有する。これらの別個の型の重鎖を軽鎖と組み合わせると、ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含め、５つの周知のクラスの抗体、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが生じる。重鎖はヒト重鎖であり得る。
「軽鎖」という用語は、抗体に関して使用される場合、アミノ末端部分が約１００～約１１０またはそれ超のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む、約２５ｋＤａのポリペプチド鎖を指す。軽鎖のおおよその長さは２１１～２１７アミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）またはラムダ（λ）と称される２種の別個の型が存在する。軽鎖アミノ酸配列は当技術分野で周知である。軽鎖はヒト軽鎖であり得る。
「可変ドメイン」または「可変領域」という用語は、一般に軽鎖または重鎖のアミノ末端に位置し、長さが重鎖では約１２０～１３０アミノ酸、軽鎖では約１００～１１０アミノ酸であり、特定の抗体それぞれの、その特定の抗原に対する結合および特異性に使用される、抗体の軽鎖または重鎖の一部を指す。可変ドメインは異なる抗体の間で配列が広範囲にわたって異なる。配列の変動性はＣＤＲに集中し、可変ドメイン内の変動性の低い部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と称される。軽鎖および重鎖のＣＤＲは、抗体と抗原の相互作用に主に関与する。本明細書で使用されるアミノ酸の位置の番号付けは、Kabatら（１９９１年）Sequences of proteins of immunological interest.（U.S. Department of Health and Human Services、Washington、D.C.）、第５版にある通りＥＵ Ｉｎｄｅｘに従う。可変領域はヒト可変領域であり得る。
ＣＤＲとは、免疫グロブリン（Ｉｇまたは抗体）ＶＨ β－シートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｈ１、Ｈ２またはＨ３）のうちの１つ、または抗体ＶＬ β－シートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｌ１、Ｌ２またはＬ３）のうちの１つを指す。したがって、ＣＤＲとは、フレームワーク領域配列内に散在する可変領域配列である。ＣＤＲ領域は当業者には周知であり、例えば、Kabatにより、抗体可変（Ｖ）ドメイン内の最も超可変性の領域であると定義されている（Kabatら、J. Biol. Chem. ２５２巻：６６０９～６６１６頁（１９７７年）；Kabat、Adv. Prot. Chem. ３２巻：１～７５頁（１９７８年））。またＣＤＲ領域配列は、Chothiaにより、保存されたβ－シートフレームワークの一部ではなく、したがって、異なるコンフォメーションに適合させることができる残基であると構造的に定義されている（ChothiaおよびLesk、J. Mol. Biol. １９６巻：９０１～９１７頁（１９８７年））。どちらの用語法も当技術分野において十分に認識されている。標準的な抗体可変ドメイン内のＣＤＲの位置は、多数の構造を比較することによって決定されている（Al-Lazikaniら、J. Mol. Biol. ２７３巻：９２７～９４８頁（１９９７年）；Moreaら、Methods ２０巻：２６７～２７９頁（２０００年））。超可変領域内の残基の数は異なる抗体では変動するので、標準的な可変ドメイン番号付けスキームでは慣習的に、標準的な位置と比較して追加的な残基には残基数の隣にａ、ｂ、ｃなどの番号が付される（Al-Lazikaniら、上記（１９９７年））。そのような命名法も同様に当業者に周知である。
例えば、Kabat（超可変）またはChothia（構造的）による命名のいずれかに従って定義されるＣＤＲは、以下の表１に記載されている。
Figure 0007299405000001
１つまたは複数のＣＤＲを共有結合または非共有結合のいずれかにより分子に組み入れて、イムノアドヘシンを作出することもできる。イムノアドヘシンは、ＣＤＲ（複数可）をより大きなポリペプチド鎖の一部として組み入れることもでき、ＣＤＲ（複数可）を別のポリペプチド鎖と共有結合により連結することもでき、ＣＤＲ（複数可）を非共有結合により組み入れることもできる。ＣＤＲにより、イムノアドヘシンが特定の目的の抗原に結合することが可能になる。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、抗体、抗体機能性断片またはポリヌクレオチドに関して使用される場合、参照されている分子が天然で見いだされる少なくとも１つの成分を含まないことを意味するものとする。この用語は、その天然の環境で見いだされる他の成分の一部または全部から取り出された抗体、抗体機能性断片またはポリヌクレオチドを包含する。抗体の天然の環境の成分としては、例えば、赤血球、白血球、血小板、血漿、タンパク質、核酸、塩および栄養素が挙げられる。抗体機能性断片またはポリヌクレオチドの天然の環境の成分としては、例えば、脂質膜、細胞小器官、タンパク質、核酸、塩および栄養素が挙げられる。本発明の抗体、抗体機能性断片またはポリヌクレオチドはまた、それが単離されたまたは組換えによって作製された細胞のこれらの成分または任意の他の成分の全てを含まないまたは実質的にまで含まないものであり得る。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラスを指す。所与の抗体または機能性断片の重鎖により、その抗体または機能性断片のクラス、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥが決定される。各クラスはκまたはλ軽鎖のいずれかを有し得る。「サブクラス」という用語は、サブクラスを識別する重鎖のアミノ酸配列の軽微な差異を指す。ヒトでは、ＩｇＡのサブクラスが２つ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２）存在し、ＩｇＧのサブクラスが４つ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）存在する。そのようなクラスおよびサブクラスは当業者には周知である。
「結合する（ｂｉｎｄｓ）」または「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、複合体が形成される、分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、および／またはファンデルワールス相互作用を含めた、非共有結合性の相互作用であってよい。複合体は、共有結合性または非共有結合性の結合、相互作用または力によって一緒に保持される２つまたはそれ超の分子の結合も含み得る。抗体またはその機能性断片の結合は、例えば、実施例Ｉで提示される方法である酵素結合免疫吸着アッセイ、または当業者に周知のいくつかの方法の任意の１つを使用して検出することができる。
抗体または機能性断片上の単一の抗原結合性部位とｓＬｅａなどの標的分子の単一のエピトープの間の非共有結合性の相互作用全体の強度は、そのエピトープに対する抗体または機能性断片の親和性である。抗体またはその機能性断片と一価の抗原の会合（ｋ１）と解離（ｋ－１）の比（ｋ１／ｋ－１）が会合定数Ｋであり、これが親和性の尺度である。Ｋの値は、抗体または機能性断片と抗原の異なる複合体で変動し、ｋ１およびｋ－１の両方に依存する。本発明の抗体または機能性断片についての会合定数Ｋは、本明細書で提供される任意の方法または当業者に周知の任意の他の方法を使用して決定することができる。
１つの結合性部位における親和性が必ずしも抗体または機能性断片と抗原の間の相互作用の真の強度を反映するとは限らない。複合体の抗原が、例えば、多価ｓＬｅａなど、多数の結合性部位を含有する抗体と接触する多数の反復抗原性決定因子を含有するものである場合、１つの部位における抗体または機能性断片と抗原の相互作用により、第２の部位における反応の確率が上昇する。そのような多価抗体と抗原の間の多数の相互作用の強度は結合活性と称される。抗体または機能性断片の結合活性は、その結合能に関して、その個々の結合性部位の親和性よりも良好な尺度であり得る。例えば、ＩｇＧよりも低い親和性を有する可能性があるが、その多価性によって生じるＩｇＭの高結合活性により抗原に有効に結合することが可能になる五量体ＩｇＭ抗体に関して時に見いだされる通り、高結合活性によって低親和性が補償され得る。
抗体またはその機能性断片の特異性とは、個々の抗体またはその機能性断片の、１つの抗原とのみ反応する能力を指す。抗体または機能性断片は、抗原または抗原の異性体型の一次、二次または三次構造の差異を区別することができるものであれば、特異的であるとみなすことができる。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはその類似体の、任意の長さのポリマーの形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの配列は４種のヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡの場合にはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）で構成される。したがって、「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、ポリヌクレオチドのアルファベット表示である。ポリヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーを含み得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。別段の指定または必要がない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが分かっているまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドおよび核酸は、天然に存在しないポリヌクレオチドおよび核酸を対象とすることが理解される。天然に存在しないポリヌクレオチドおよび核酸としては、これらに限定されないが、ｃＤＮＡおよび化学的に合成された分子を挙げることができる。
ポリヌクレオチドに関して使用される「コードする」という用語またはその文法上の等価物は、そのネイティブな状態の、または当業者に周知の方法によって操作した場合に、転写されてｍＲＮＡを生じ得、次いでそれがポリペプチドおよび／またはその断片に翻訳されるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのようなポリヌクレオチドの相補物であり、それからコード配列を推定することができる。
「治療剤」という句は、ｓＬｅａの発現に関連する疾患および／またはそれに関連する症状の処置、管理または好転に使用することができる任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態では、治療剤とは、本発明の抗体または機能性断片を指す。他の実施形態では、治療剤とは、本発明の抗体または機能性断片以外の薬剤を指す。治療剤は、ｓＬｅａの発現に関連する疾患および／またはそれに関連する１つもしくは複数の症状を処置する、管理するまたは好転させるために有用であることが周知である、または、そのために使用されていたもしくは現在使用されている薬剤であってよい。
「診断剤」という句は、疾患の診断に役立つ、被験体に投与される物質を指す。そのような物質は、疾患を引き起こすプロセスの局在化を明らかにするため、正確に示すため、および／または定義するために使用することができる。ある特定の実施形態では、診断剤は、被験体に投与した場合または被験体由来の試料と接触させた場合に、がんまたは腫瘍形成の診断に役立つ、本発明の抗体または機能性断片とコンジュゲートした物質を含む。
「検出可能剤」という句は、試料または被験体における本発明の抗体または機能性断片などの所望の分子の存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）または存在（ｐｒｅｓｅｎｃｅ）を確認するために使用することができる物質を指す。検出可能剤は、可視化することができる物質または他のやり方で決定および／もしくは測定すること（例えば、定量化によって）ができる物質であってよい。
「有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与、塗布または投薬で投与することができる。そのような送達は、個々の投薬単位が使用される期間、薬剤の生物学的利用能、投与経路などを含めたいくつかの変数に左右される。
「治療有効量」という句は、本明細書で使用される場合、所与の疾患および／またはそれに関連する症状の重症度および／または持続時間を低下および／または好転させるのに十分な、治療剤（例えば、本明細書で提供される抗体もしくは機能性断片または本明細書で提供される任意の他の治療剤）の量を指す。治療剤の治療有効量は、所与の疾患の進行（ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ）または進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）を低下もしくは好転させるため、所与の疾患の再発、発生もしくは発症を低下もしくは好転させるため、および／または、別の療法（例えば、本明細書で提供される抗体または機能性断片を投与すること以外の療法）の予防もしくは治療効果を改善もしくは増強するために必要な量であり得る。
「シアリル－Ｌｅｗｉｓａ」（ｓＬｅａ）という化合物は、シアリルＬｅａ、シアリル－Ｌｅｗｉｓ Ａ、シアリル化Ｌｅｗｉｓ ａおよびＣＡ１９．９としても公知であり、分子式Ｃ３１Ｈ５２Ｎ２Ｏ２３およびモル質量８２０．７４ｇ／ｍｏｌを有する四糖である。ｓＬｅａの構造は、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβおよびＮｅｕ５Ｇｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβを含み得る。ｓＬｅａは、胃腸管の腫瘍上に広範に発現し、膵がんおよび結腸がんの腫瘍マーカーとして使用される。ｓＬｅａはまた、内皮白血球接着分子（ＥＬＡＭ）としても公知であるＥ－選択に対する公知のリガンドでもある。
一部の実施形態では、本発明は、抗体重鎖または軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体重鎖または軽鎖を使用して生成される抗体またはその機能性断片がｓＬｅａに結合する、単離されたポリヌクレオチドを提供する。したがって、一部の実施形態では、本発明は、配列番号２の残基２０～１４２、配列番号６の残基２０～１４２、配列番号１０の残基２０～１４２、および配列番号１４の残基２０～１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１の残基５８～４２６、配列番号５の残基５８～４２６、配列番号９の残基５８～４２６または配列番号１３の残基５８～４３５の核酸配列も含み得、当該核酸配列は、抗体またはその機能性断片のＶＨドメインをコードする。
本発明の別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４の残基２０～１３０、配列番号８の残基２０～１２９、配列番号１２の残基２０～１３０、および配列番号１６の残基２３～１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体またはその機能性断片をコードし得る。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３の残基５８～３９０、配列番号７の残基５８～３８７、配列番号１１の残基５８～３９０または配列番号１５の残基６７～３９０の核酸配列も含み得、当該核酸配列は、抗体またはその機能性断片のＶＬドメインをコードする。
別の実施形態では、本発明は、抗体重鎖または軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる抗体重鎖または軽鎖またはその機能性断片は図１～８に示されているまたは表２に列挙されている相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つまたは複数を有する。ＣＤＲのうちの１つまたは複数を含む抗体またはその機能性断片は、本明細書に記載の通りｓＬｅａに特異的に結合することができる。ｓＬｅａへの特異的な結合は、本明細書で提供される抗体のいずれかに関して実施例Ｉで提示される特異性、親和性および／または結合活性を含み得る。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる抗体またはその機能性断片は、本明細書に記載のクローン単離体５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１または７Ｅ３の任意の１つの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を含み得る。抗体またはその機能性断片の特異性、親和性および／または結合活性を評価するための方法は当技術分野で周知であり、例示的な方法は本明細書で提供される。
Figure 0007299405000002
一部の実施形態では、本発明の抗体またはその機能性断片は、６つ未満のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体またはその機能性断片は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、および／またはＶＬ ＣＤＲ３からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのＣＤＲを含む。特定の実施形態では、抗体またはその機能性断片は、本明細書に記載のクローン単離体５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１または７Ｅ３のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、および／またはＶＬ ＣＤＲ３からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、本発明は、クローン単離体５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１または７Ｅ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）鎖ドメインを含む抗体またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのようなＶＨドメインは、配列番号２のアミノ酸残基５５～６２、７０～７７および１１６～１３１、またはその代わりに配列番号６のアミノ酸残基４５～５２、７０～７７および１１６～１３１、またはその代わりに配列番号１０のアミノ酸残基４５～５２、７０～７７および１１６～１３１、またはその代わりに配列番号１４のアミノ酸残基４５～５２、７０～７７および１１６～１３４を含み得る。別の態様では、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１の残基１３３～１５６、２０８～２３１および３４６～３９３のヌクレオチド配列、またはその代わりに配列番号５の残基１３３～１５６、２０８～２３１および３４６～３９３のヌクレオチド配列、またはその代わりに配列番号９の残基１３３～１５６、２０８～２３１および３４６～３９３のヌクレオチド配列、またはその代わりに配列番号１３の残基１３３～１５６、２０８～２３１、３４６～４０２のヌクレオチド配列を含み得る。
別の実施形態では、本発明は、クローン単離体５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１または７Ｅ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する可変軽（ＶＬ）鎖ドメインを含む抗体またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのようなＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸残基４５～５２、７０～７２および１０９～１２０、またはその代わりに配列番号８のアミノ酸残基４５～５２、７０～７２および１０９～１１９、またはその代わりに配列番号１２のアミノ酸残基４５～５２、７０～７２および１０９～１２０、またはその代わりに配列番号１６のアミノ酸残基４９～５３、７２～７４および１１１～１２０を含み得る。別の態様では、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号３の残基１３３～１５６、２０８～２１６および３２５～３６０のヌクレオチド配列、またはその代わりに配列番号７の残基１３３～１５６、２０８～２１６および３２５～３５７のヌクレオチド配列、またはその代わりに配列番号１１の残基１３４～１５６、２０８～２１６および３２５～３６０のヌクレオチド配列、またはその代わりに配列番号１５の残基１４５～１６２、２１４～２２２および３３１～３６０のヌクレオチド配列を含み得る。
別の実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドのバリアントを提供する。バリアントは、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、例えば、これらに限定されないが、メチル化されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体などの、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。さらに、バリアントポリヌクレオチドは、非ヌクレオチド成分が間に入ったポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドに対する修飾は、当業者に周知の方法を使用してポリヌクレオチドの集合前または後に加えることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、重合後に酵素的または化学的技法のいずれかを使用して標識成分とコンジュゲートすることによって修飾することができる（例えば、GottfriedおよびWeinhold、２０１１年、Biochem. Soc. Trans.、３９巻（２号）：５２３～６２８頁；Paredesら、２０１１年、Methods、５４巻（２号）：２５１～２５９頁に記載の通り）。
当技術分野で周知の任意の方法によってポリヌクレオチドを得、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１および７Ｅ３の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列は既知であるので（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および１６を参照されたい）、抗体およびこれらの抗体の修飾型をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが分かっているヌクレオチドコドンを、当該抗体をコードする核酸が生成するように集合させる。そのような抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドから集合させることができ（例えば、Kutmeierら、１９９４年、BioTechniques １７巻：２４２頁に記載の通り）、これは、簡単に述べると、抗体、断片、またはそのバリアントをコードする配列の重複オリゴヌクレオチド含有部分を合成し、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションを行い、次いで、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって増幅することを伴う。
本発明の抗体またはその機能性断片をコードするポリヌクレオチドは、単離体５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１または７Ｅ３の可変重鎖ドメインおよび／または可変軽鎖ドメインの核酸配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５）を使用して生成することができる。抗体または機能性断片をコードする核酸は、化学的に合成することもでき、適切な供給源（例えば、抗体またはその機能性断片を発現させるために選択されたハイブリドーマ細胞などの抗体またはその機能性断片を発現する細胞から単離したｃＤＮＡ）から、配列の３’および５’末端とハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、または特定の核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって得ることもできる。次いで、ＰＣＲによって生成した増幅核酸を、当技術分野で周知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
一部の実施形態では、本発明は、ｓＬｅａに結合する単離された抗体またはその機能性断片を提供する。したがって、一部の態様では、本発明は、ｓＬｅａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、配列番号２の残基２０～１４２、配列番号６の残基２０～１４２、配列番号１０の残基２０～１４２、および配列番号１４の残基２０～１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ｓＬｅａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、配列番号４の残基２０～１３０、配列番号８の残基２０～１２９、配列番号１２の残基２０～１３０、および配列番号１６の残基２３～１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ｓＬｅａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方を含み、ＶＨドメインおよびＶＬドメインがそれぞれ配列番号２の残基２０～１４２および配列番号４の残基２０～１３０；配列番号６の残基２０～１４２および配列番号８の残基２０～１２９；配列番号１０の残基２０～１４２および配列番号１２の残基２０～１３０；ならびに配列番号１４の残基２０～１４５および配列番号１６の残基２３～１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の実施形態では、ｓＬｅａに結合させるために、本発明の抗体またはその機能性断片は、図１～８に示されているまたは表２に列挙されているＣＤＲのうちの１つまたは複数を有する。ＣＤＲのうちの１つまたは複数、特にＣＤＲ３を含む抗体またはその機能性断片は、本明細書に記載の通りｓＬｅａに特異的に結合することができる。ｓＬｅａへの特異的な結合は、本明細書で提供される抗体のいずれかに対する実施例Ｉにおいて提示される特異性および親和性を含み得る。一部の態様では、本発明の抗体またはその機能性断片は、本明細書に記載のクローン単離体５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１または７Ｅ３の任意の１つのＣＤＣ活性および／またはＡＤＣＣ活性を含み得る。
一部の実施形態では、本発明は、クローン単離体５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１または７Ｅ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖ドメインを含む単離された抗体またはその機能性断片を提供する。そのようなＶＨドメインは、配列番号２のアミノ酸残基５５～６２、７０～７７および１１６～１３１、またはその代わりに配列番号６のアミノ酸残基４５～５２、７０～７７および１１６～１３１、またはその代わりに配列番号１０のアミノ酸残基４５～５２、７０～７７および１１６～１３１、またはその代わりに配列番号１４のアミノ酸残基４５～５２、７０～７７および１１６～１３４を含み得る。
一部の実施形態では、本発明は、クローン単離体５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１または７Ｅ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖ドメインを含む単離された抗体またはその機能性断片を提供する。そのようなＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸残基４５～５２、７０～７２および１０９～１２０、またはその代わりに配列番号８のアミノ酸残基４５～５２、７０～７２および１０９～１１９、またはその代わりに配列番号１２のアミノ酸残基４５～５２、７０～７２および１０９～１２０、またはその代わりに配列番号１６のアミノ酸残基４９～５３、７２～７４および１１１～１２０を含み得る。
本発明の一部の態様では、単離された抗体またはその機能性断片はモノクローナル抗体である。本発明の一部の態様では、本明細書で提供される単離された抗体またはその機能性断片はＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプである。本発明のさらなる態様では、抗体またはその機能断片は、ＩｇＧ１サブクラスの抗体である。
一部の実施形態では、本発明の抗体機能性断片は、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、ｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）であってよい。一部の態様では、本発明は、配列番号１８または２０のアミノ酸配列を含むダイアボディを提供する。そのような本発明のダイアボディは、一部の態様では、配列番号１７または１９の核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ得る。抗体およびその機能性断片に関して、種々の形態、変更および修飾が当技術分野で周知である。本発明のｓＬｅａ特異的抗体断片は、そのような種々の抗体の形態、変更および修飾のいずれかを含み得る。当技術分野で公知のそのような種々の形態および用語の例は以下に記載されている。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその機能性断片を作製する方法を提供する。本発明の方法は、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するステップ、宿主細胞を、本発明の抗体または機能性断片のコードされる重鎖および／または軽鎖を産生させる条件下、それに十分な期間にわたって培養するステップ、ならびに抗体または機能性断片の重鎖および／または軽鎖を精製するステップを含み得る。
ｓＬｅａ抗原に結合する本発明の抗体またはその機能性断片の組換え発現は、本発明の抗体または機能性断片の重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を含み得る。本発明の抗体またはその機能性断片（重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインを含有することが好ましいが、必ずしもそうでなくてよい）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、抗体または機能性断片を産生させるためのベクターを、当技術分野で周知の技法を使用して組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。抗体またはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載されている。
当業者に周知の方法を使用して、抗体またはその機能性断片のコード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組換えＤＮＡ技法、合成法、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗体またはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得（例えば、国際公開第ＷＯ８６／０５８０７およびＷＯ８９／０１０３６号；ならびに米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖全体と軽鎖全体の両方を発現させるために、抗体の可変ドメインをそのようなベクターにクローニングすることができる。
発現ベクターを従来の技法によって宿主細胞に移入することができ、次いで、トランスフェクトされた細胞を従来の技法によって培養して本発明の抗体またはその機能性断片を産生させる。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗体またはその機能性断片をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。二本鎖抗体の発現に関する一部の実施形態では、以下に詳述されている通り、免疫グロブリン分子全体を発現させるために、重鎖および軽鎖を両方コードするベクターを宿主細胞において同時発現させることができる。
本発明の抗体またはその機能性断片を発現させるために、種々の宿主－発現ベクター系を利用することができる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）。そのような宿主－発現系は、目的のコード配列を産生させ、その後、精製することができるビヒクルを意味するが、適切なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換またはトランスフェクトすると、ｉｎ ｓｉｔｕで本発明の抗体分子を発現し得る細胞も意味する。これらとしては、これらに限定されないが、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換した細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ）などの微生物；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、もしくは抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、および３Ｔ３細胞）が挙げられる。一部の態様では、特に組換え抗体全体を発現させるための、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、または真核細胞を、組換え抗体または機能性断片を発現させるために使用する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併せて、抗体の有効な発現系である（Foeckingら、１９８６年、Gene ４５巻：１０１頁；およびCockettら、１９９０年、Bio/Technology ８巻：２頁）。一部の実施形態では、本発明の抗体またはその断片をＣＨＯ細胞において産生させる。一実施形態では、ｓＬｅａに結合する本発明の抗体またはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列の発現を構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって調節する。
細菌系では、発現させる抗体分子の意図された使用に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物を生成するためにそのような抗体を大量に産生させる場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターとしては、これらに限定されないが、抗体コード配列を個別にｌａｃ Ｚコード領域とインフレームでベクターにライゲーションすることができ、したがって融合タンパク質を産生させるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Rutherら、１９８３年、EMBO １２巻：１７９１頁）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye、１９８５年、Nucleic Acids Res. １３巻：３１０１～３１０９頁；Van Heeke & Schuster、１９８９年、J. Biol. Chem. ２４巻：５５０３～５５０９頁）などが挙げられる。外来ポリペプチドをグルタチオン５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるためにｐＧＥＸベクターを使用することもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズに吸着および結合させ、その後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出させることによって溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含み、したがって、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出させることができるように設計されている。
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用する。ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で成長する。抗体または機能性断片のコード配列を個別にウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の抗体コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列にライゲーションすることができる。次いで、このキメラ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１領域またはＥ３領域）への挿入により、感染した宿主において生存可能であり、抗体分子を発現することができる組換えウイルスが生じる（例えば、Logan & Shenk、１９８４年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８１巻：３５５～３５９頁を参照されたい）。挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルを使用することもできる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、挿入断片全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード配列の読み枠と同相になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然でも合成でも種々の起源のものであってよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強することができる（例えば、Bittnerら、１９８７年、Methods in Enzymol. １５３巻：５１～５４４頁を参照されたい）。
さらに、挿入配列の発現を調節する、または遺伝子産物を所望の特定の様式で修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、抗体または機能性断片の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関して特徴的かつ特異的な機構を有する。発現させる外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために適切な細胞系統または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、これらに限定されないが、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＹ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＴ４８３細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＨＴＢ２細胞、ＢＴ２Ｏ細胞およびＴ４７Ｄ細胞、ＮＳ０（内因的にはいかなる免疫グロブリン鎖も産生しないネズミ骨髄腫細胞系統）細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。
長期間にわたり、組換えタンパク質の高収率の産生、安定発現が好ましい。例えば、本発明の抗体または機能性断片を安定に発現する細胞系統を工学的に作製することができる。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ、および選択マーカーを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、工学的に作製した細胞を栄養強化培地で１～２日間成長させることができ、次いで選択培地に切り換える。組換えプラスミド内の選択マーカーにより選択に対する耐性が付与され、細胞がそれらの染色体内にプラスミドを安定に組み込み、成長して巣を形成させることが可能になり、今度はそれをクローニングし、拡大増殖させて細胞系統にすることができる。この方法を有利に使用して、抗体分子を発現する細胞系統を工学的に作製することができる。
これらに限定されないが、それぞれｔｋ－細胞、ｈｇｐｒｔ－細胞またはａｐｒｔ－細胞において使用することができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wiglerら、１９７７年、Cell １１巻：２２３頁）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Szybalska & Szybalski、１９９２年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ４８巻：２０２頁）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowyら、１９８０年、Cell ２２巻：８～１７頁）を含めた、いくつかの選択系を使用することができる。また、代謝拮抗薬耐性を以下の遺伝子に対する選択の基礎として使用することができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wiglerら、１９８０年、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. ７７巻（６号）：３５６７～７０頁；O'Hareら、１９８１年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７８巻：１５２７頁）；グルタミン酸およびアンモニアが使用されるグルタミンの生合成に関与する酵素であるグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）（Bebbingtonら、１９９２年、Biuotechnology １０巻：１６９頁）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan & Berg、１９８１年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７８巻：２０７２頁）；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（WuおよびWu、１９９１年、Biotherapy ３巻：８７～９５頁；Tolstoshev、１９９３年、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. ３２巻：５７３～５９６頁；Mulligan、１９９３年、Science ２６０巻：９２６～９３２頁；ならびにMorganおよびAnderson、１９９３年、Ann. Rev. Biochem. ６２巻：１９１～２１７頁；１９９３年５月、TIB TECH １１巻（５号）：１５５～２１５頁）；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerreら、１９８４年、Gene ３０巻：１４７頁）。所望の組換えクローンを選択するために、組換えＤＮＡ技術の技術分野で周知の方法を常套的に適用することができ、そのような方法は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ausubelら（編）、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY（１９９３年）；Kriegler、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manual、Stockton Press、NY（１９９０年）；ならびにDracopoliら（編）、Current Protocols in Human Genetics、１２章および１３章、John Wiley & Sons、NY（１９９４年）；Colberre-Garapinら、１９８１年、J. Mol. Biol. １５０巻：１頁に記載されている。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって上昇させることができる（総説については、BebbingtonおよびHentschel、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells、DNA cloning、３巻（Academic Press、New York、１９８７年）を参照されたい）。抗体またはその機能性断片を発現させるベクター系内のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルが上昇すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅された領域は抗体遺伝子に関連するので、抗体の産生も増加する（Crouseら、１９８３年、Mol. Cell. Biol. ３巻：２５７頁）。
宿主細胞に、本発明の２種の発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターを同時トランスフェクトすることができる。２種のベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含有してよい。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現させることができる単一のベクターを使用することができる。そのような状況では、毒性の遊離重鎖が過剰になるのを回避するために、軽鎖を重鎖の前に置くことができる（Proudfoot、１９８６年、Nature ３２２巻：５２頁；およびKohler、１９８０年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７７巻：２１９７～２１９９頁）。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
さらに、本発明の抗体または機能性断片の重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で周知の技法を使用したコドン最適化に供して、所望の宿主細胞における本発明の抗体または機能性断片の最適化された発現を実現することができる。例えば、コドン最適化の１つの方法では、ネイティブなコドンを参照遺伝子セット由来の最も頻度の高いコドンで置換し、各アミノ酸についてのコドン翻訳の速度が高くなるように設計する。本発明の抗体または機能性断片の重鎖および／または軽鎖に適用することができる、所望のタンパク質を発現させるためのコドン最適化されたポリヌクレオチドを生成するための追加的な例示的な方法は、Kanayaら、Gene、２３８巻：１４３～１５５頁（１９９９年）、Wangら、Mol. Biol. Evol.、１８巻（５号）：７９２～８００頁（２００１年）、米国特許第５，７９５，７３７号、米国特許公開第２００８／００７６１６１号およびＷＯ２００８／０００６３２に記載されている。
本発明の抗体分子が組換え発現によって産生されたら、それを、免疫グロブリン分子を精製するための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、特に特異的な抗原に対してはプロテインＡクロマトグラフィーの後にアフィニティクロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的な溶解性によって、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準の技法によって精製することができる。さらに、本発明の抗体または機能性断片は、精製を容易にするために、本明細書で提供されるまたはそうでなければ当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列と融合することができる。例えば、本発明の抗体または機能性断片は、市販されている、とりわけ、ポリ－ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ＦＬＡＧタグ、赤血球凝集素タグ（ＨＡタグ）またはｍｙｃ－タグを組換えによって付加することおよび当業者に周知の精製方法を利用することによって精製することができる。
Ｆａｂ断片とは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片を指し、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であり、Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなり、Ｆｖ断片は、抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなり、ｄＡｂ断片（Wardら、Nature ３４１巻：５４４～５４６頁、（１９８９年））は、ＶＨドメインからなる。
抗体は１つまたは複数の結合性部位を有し得る。２つ以上の結合性部位が存在する場合、結合性部位は互いと同一であってもよく、異なってもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは２つの同一の結合性部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片は１つの結合性部位を有するが、「二特異性」または「二機能性」抗体は２つの異なる結合性部位を有する。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）とは、ＶＬ領域とＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）によってつながって連続的なポリペプチド鎖を形成した抗体を指し、リンカーは、タンパク質鎖が折りたたまれ、一価の抗原結合性部位が形成されるのが可能になるのに十分に長いものである（例えば、Birdら、Science ２４２巻：４２３～２６頁（１９８８年）およびHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５巻：５８７９～８３頁（１９８８年）を参照されたい）。ダイアボディとは、２つのポリペプチド鎖を含む二価の抗体を指し、各ポリペプチド鎖は、リンカーによってつながったＶＨドメインとＶＬドメインを含み、リンカーは、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成が可能になるには短すぎ、したがって各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的なドメインと対形成するのを可能にするものである（例えば、Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０巻：６４４４～４８頁（１９９３年）、およびPoljakら、Structure ２巻：１１２１～２３頁（１９９４年）を参照されたい）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合には、それらの対形成によって生じるダイアボディは２つの同一の抗原結合性部位を有するものになる。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２つの異なる抗原結合性部位を有するダイアボディを作出することができる。同様に、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）およびテトラボディは、それぞれポリペプチド鎖を３つおよび４つ含み、同じであっても異なってもよい抗原結合性部位をそれぞれ３つおよび４つ形成する抗体である。
本発明は、ｓＬｅａに結合する、５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１および／または７Ｅ３の誘導体である抗体またはその機能性断片も提供する。本発明の抗体またはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列に変異を導入するために、例えば、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発を含めた、当業者に周知の標準の技法を使用することができる。一部の態様では、誘導体は、元の分子と比較して２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、本発明は、修飾された形態の天然に存在するアミノ酸、保存的置換、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸類似体および模倣物を有する抗体またはその機能性断片が本明細書で定義されている機能活性を保持する限りは、そのような抗体または機能性断片を提供する。一実施形態では、誘導体は、１つまたは複数の予測される非必須アミノ酸残基においてなされた保存的アミノ酸置換を有する。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。あるいは、飽和変異誘発などによってコード配列の全部または一部を通してランダムに変異を導入することができ、得られた変異体を生物活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発後、コードされる抗体またはその機能性断片を発現させることができ、抗体または機能性断片の活性を決定することができる。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の抗体または機能性断片内に含有されるＦｃ断片のフコシル化、ガラクトシル化および／またはシアリル化が改変された抗体またはその機能性断片を提供する。Peippら、Blood、１１２巻（６号）：２３９０～２３９９頁（２００８年）において論じられている通り、そのようなＦｃ断片の改変により、Ｆｃ受容体媒介性活性がもたらされ得る。例えば、Ｆｃ Ｎ－グリカン由来のコアフコース残基を欠く糖鎖工学により作製された治療用抗体は、フコシル化対応物と比較して低濃度で強力なＡＤＣＣを示し、また、有効性がはるかに高い。Shieldsら、J. Biol. Chem.、２７７巻（３０号）：２６７３３～４０頁（２００２年）；Okazakiら、J Mol Biol.、３３６巻：１２３９～１２４９頁（２００４年）；Natsumeら、J. Immunol. Methods.、３０６巻：９３～１０３頁（２００５年）。抗体のフコシル化、ガラクトシル化および／またはシアリル化をその機能性断片に関して改変するための方法は当技術分野で周知である。例えば、脱フコシル化手法は、Yamane-Ohnukiら、MAbs.、１巻（３号）：２３０～２３６頁（２００９年）に記載の通り、３つの方法体系（１）非哺乳動物細胞のＮ－グリコシル化経路の「ヒト化」非フコシル化経路への変換；（２）哺乳動物細胞のＮ－グリカンフコシル化経路の不活化および（３）非フコシル化Ｎ－糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける化学合成またはＮ－グリカンから非フコシル化形態への酵素による改変に群分けすることができる。これらの方法の任意の１つまたは当技術分野において周知の任意の他の方法を使用して、フコシル化、ガラクトシル化および／またはシアリル化が改変された抗体またはその機能性断片を作製することができることが理解される。
ｓＬｅａに結合する本発明の抗体またはその機能性断片は、抗体を、特に化学合成によってまたは組換え発現技法によって合成するための当技術分野で公知の任意の方法によって作製することができる。本発明の実施には、別段の指定のない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成および修飾、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに当技術分野の技術の範囲内の関連する分野の従来の技法を使用する。これらの技法は、本明細書において引用されている参考文献に記載されており、文献において十分に説明されている。例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Maniatisら(1982年) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrookら(1989年), Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrookら(2001年)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987年および毎年の更新物); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987年および毎年の更新物) Gait (編)(1984年) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein(編)(1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birrenら(編)(1999年) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Borrebaeck(編)(1995年) Antibody Engineering, 第２版, Oxford University Press; Lo (編)(2006年) Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology); 248巻, Humana Press, Incを参照されたい。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマおよび組換え技術、またはこれらの組合せの使用を含めた当技術分野で公知の多種多様な技法を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知であり、例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるHarlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、（Cold Spring Harbor Laboratory Press、第２版、１９８８年）；Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas ５６３～６８１頁（Elsevier、N.Y.、１９８１年）において教示されているものを含めたハイブリドーマ技法を使用して作製することができる。モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術によって作製された抗体に限定されない。モノクローナル抗体を作製する他の例示的な方法は当技術分野で公知である。モノクローナル抗体を作製する追加的な例示的な方法は、本明細書の実施例Ｉにおいて提示されている。
ｓＬｅａに結合する抗体機能性断片は、当業者に周知の任意の技法によって生成することができる。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するため）などの酵素を使用した免疫グロブリン分子のタンパク質分解性の切断によって作製することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、重鎖の可変領域、軽鎖定常領域およびＣＨ１ドメインを含有する。
本発明の抗体機能性断片は、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を使用して生成することもできる。例えば、ファージディスプレイ法では、本明細書で提供されるＣＤＲを１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ有する重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域などの機能性抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示させる。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーと一緒に組み直し、ファージミドベクターにクローニングする。ベクターをＥ．ｃｏｌｉに電気穿孔により導入し、Ｅ．ｃｏｌｉにヘルパーファージを感染させる。これらの方法において使用するファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３を含めた繊維状ファージであり、通常、ＶＨおよびＶＬドメインをファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかと、組換えによって融合する。ｓＬｅａなどの特定の抗原に結合する抗原結合性ドメインを発現するファージを、抗原を用いて、例えば、標識した抗原または固体表面もしくはビーズに結合させたもしくは捕捉した抗原を使用して選択または同定することができる。本発明の抗体機能性断片を作出するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Brinkmanら, 1995年, J. Immunol. Methods 182巻:41-50頁; Amesら,1995年, J. Immunol. Methods 184巻:177-186頁; Kettleboroughら,1994年, Eur. J. Immunol. 24巻:952-958頁; Persicら,1997年, Gene 187巻:9-18頁;Burtonら,1994年, Advances in Immunology 57巻:191-280頁; PCT出願第PCT/GB91/01134号;国際公開第WO 90/02809号、同第WO 91/10737号、同第WO 92/01047号、同第WO 92/18619号、同第WO 93/1 1236号、同第WO 95/15982号、同第WO 95/20401号、および同第WO97/13844号;ならびに米国特許第5,698,426号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,580,717号、同第5,427,908号、同第5,750,753号、同第5,821,047号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,516,637号、同第5,780,225号、同第5,658,727号、同第5,733,743号および同第5,969,108号に開示されているものが挙げられる。
上記の参考文献に記載の通り、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、それを使用して、ヒト抗体を含めた全抗体または任意の他の所望の抗原結合性断片を生成し、例えば、本明細書に記載の哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含めた任意の所望の宿主において発現させることができる。
Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えによって作製するための技法も、そのそれぞれの全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号；Mullinaxら、１９９２年、BioTechniques １２巻（６号）：８６４～８６９頁；Sawaiら、１９９５年、AJRI ３４巻：２６～３４頁；およびBetterら、１９８８年、Science ２４０巻：１０４１～１０４３頁に開示されているものなどの当技術分野で公知の方法を使用して利用することができる。
全抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ｓｃＦｖクローンにおいてＶＨまたはＶＬ配列を増幅することができる。当業者に周知のクローニング技法を利用して、ＰＣＲ増幅されたＶＨドメインをＶＨ定常領域、例えば、ヒトガンマ１定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、ＰＣＲ増幅されたＶＬドメインをＶＬ定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。ＶＨおよびＶＬドメインを必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングすることもできる。次いで、当業者に周知の技法を使用して重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系統に同時トランスフェクトして、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定なまたは一過性の細胞系統を生成する。
一部の実施形態では、本発明の抗体または機能性断片を１つまたは複数の診断剤、検出可能剤または治療剤または任意の他の所望の分子とコンジュゲートする（共有結合または非共有結合によるコンジュゲーション）または組換えによって融合する。コンジュゲートしたまたは組換えによって融合した抗体または機能性断片は、特定の療法の有効性の決定などの、臨床試験の手順の一部として、ｓＬｅａの発現に関連する疾患、例えば、がんまたは腫瘍形成などの発症、発生、進行および／または重症度をモニタリングまたは診断するために有用であり得る。
検出および診断は、例えば、本発明の抗体または機能性断片と、これらに限定されないが、放射性材料、例えば、これらに限定されないが、ジルコニウム（８９Ｚｒ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ、１１Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５Ｏ、１３Ｎ、６４Ｃｕ、９４ｍＴｃ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、８６Ｙ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｓｎなど；および種々の陽電子放出断層撮影法を使用する陽電子放出性金属、種々の酵素、例えば、これらに限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなど；補欠分子族、例えば、これらに限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなど；蛍光材料、例えば、これらに限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocynate）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンなど；発光材料、例えば、これに限定されないが、ルミノールなど；生物発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなど、ならびに非放射性常磁性金属イオンを含めた、検出可能な物質をカップリングすることによって実現することができる。
本発明は、１つまたは複数の治療剤とコンジュゲートした（共有結合または非共有結合によるコンジュゲーション）または組換えによって融合した本発明の抗体または機能性断片の治療的使用をさらに包含する。この場合、例えば、抗体は、細胞毒、例えば、細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤、または放射活性金属イオン、例えば、アルファ－エミッターなどの治療剤とコンジュゲートするまたは組換えによって融合することができる。細胞毒または細胞傷害剤は、細胞に対して有害である任意の薬剤を含む。治療剤は、化学療法薬、例えば、これらに限定されないが、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシンおよびダウノルビシン（以前はダウノマイシン））など；タキサン（例えば、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソテレ）；代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルおよびデカルバジン）；またはアルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（thioepa）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、シスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）およびシスプラチン）；抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））；アウリスタチン分子（例えば、アウリスタチンＰＨＥ、ブリオスタチン１、ソラスタチン（ｓｏｌａｓｔａｔｉｎ）１０、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ））；ホルモン（例えば、グルココルチコイド、プロゲスチン、アンドロゲン、およびエストロゲン）；ヌクレオシド類似体（例えばゲムシタビン）、ＤＮＡ修復酵素阻害剤（例えば、エトポシドおよびトポテカン）、キナーゼ阻害剤（例えば、グリベックまたはメシル酸イマチニブとしても公知の化合物ＳＴ１５７１）；細胞傷害剤（例えば、マイタンシン、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド（glucorticoid）、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体またはホモログ、ならびに米国特許第6,245,759号、同第6,399,633号、同第6,383,790号、同第6,335,156号、同第6,271,242号、同第6,242,196号、同第6,218,410号、同第6,218,372号、同第6,057,300号、同第6,034,053号、同第5,985,877号、同第5,958,769号、同第5,925,376号、同第5,922,844号、同第5,911,995号、同第5,872,223号、同第5,863,904号、同第5,840,745号、同第5,728,868号、同第5,648,239号、同第5,587,459号に開示されている化合物）；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、Ｒ１１５７７７、ＢＭＳ－２１４６６２、および、例えば、米国特許第6,458,935号、同第6,451,812号、同第6,440,974号、同第6,436,960号、同第6,432,959号、同第6,420,387号、同第6,414,145号、同第6,410,541号、同第6,410,539号、同第6,403,581号、同第6,399,615号、同第6,387,905号、同第6,372,747号、同第6,369,034号、同第6,362,188号、同第6,342,765号、同第6,342,487号、同第6,300,501号、同第6,268,363号、同第6,265,422号、同第6,248,756号、同第6,239,140号、同第6,232,338号、同第6,228,865号、同第6,228,856号、同第6,225,322号、同第6,218,406号、同第6,211,193号、同第6,187,786号、同第6,169,096号、同第6,159,984号、同第6,143,766号、同第6,133,303号、同第6,127,366号、同第6,124,465号、同第6,124,295号、同第6,103,723号、同第6,093,737号、同第6,090,948号、同第6,080,870号、同第6,077,853号、同第6,071,935号、同第6,066,738号、同第6,063,930号、同第6,054,466号、同第6,051,582号、同第6,051,574号、および同第6,040,305号によって開示されているもの）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン、ＳＮ－３８、トポテカン、９－アミノカンプトテシン、ＧＧ－２１１（ＧＩ１４７２１１）、ＤＸ－８９５１ｆ、ＩＳＴ－６２２、ルビテカン（ｒｕｂｉｔｅｃａｎ）、ピラゾロアクリジン、ＸＲ－５０００、サイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）、ＵＣＥ６、ＵＣＥ１０２２、ＴＡＮ－１５１８Ａ、ＴＡＮ １５１８Ｂ、ＫＴ６００６、ＫＴ６５２８、ＥＤ－１１０、ＮＢ－５０６、ＥＤ－１１０、ＮＢ－５０６、ファガロニン（ｆａｇａｒｏｎｉｎｅ）、コラリン（ｃｏｒａｌｙｎｅ）、ベータ－ラパコンおよびレベッカマイシン（ｒｅｂｅｃｃａｍｙｃｉｎ））；ＤＮＡ副溝結合物質（例えば、Ｈｏｅｓｃｈｔ色素３３３４２およびＨｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８）；アデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、リン酸フルダラビンおよび２－クロロデオキシアデノシン）；またはそれらの薬学的に許容され得る塩、溶媒和化合物、クラスレート、もしくはプロドラッグであってよい。治療剤は、例えば、これらに限定されないが、セツキシマブ、ベバシズマブ、ハーセプチン（heceptin）、リツキシマブ）などの免疫療法薬であってよい。
さらに、本発明の抗体または機能性断片は、例えば、放射活性金属イオン、例えば、２１３Ｂｉなどのなどのアルファ－エミッターなど、または、これらに限定されないが、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含めた放射性金属イオンのコンジュゲートに有用な大環状キレート化剤；または、大環状キレート化剤、例えば、リンカー分子によって抗体または機能性断片に付着させることができる１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＤＯＴＡ）などの治療剤とコンジュゲートすることができる。そのようなリンカー分子は一般に当技術分野で公知であり、Denardoら、１９９８年、Clin Cancer Res. ４巻（１０号）：２４８３～９０頁；Petersonら、１９９９年、Bioconjug. Chem.１０巻（４号）：５５３～７頁；およびZimmermanら、１９９９年、Nucl. Med. Biol. ２６巻（８号）：９４３～５０頁に記載されている。
さらに、本発明の抗体または機能性断片は、所与の生物学的応答を改変する治療剤とコンジュゲートする（共有結合または非共有結合によるコンジュゲーション）または組換えによって融合することができる。したがって、治療剤は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されるべきでない。例えば、治療剤は、所望の生物活性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素およびジフテリア毒素）；腫瘍壊死因子、γ－インターフェロン、α－インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス作用物質（例えば、ＴＮＦ－γ、ＡＩＭ Ｉ、ＡＩＭ ＩＩ、ＦａｓリガンドおよびＶＥＧＦ）、抗血管新生作用物質（例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンおよび組織因子などの凝固経路の成分）などのタンパク質；生物学的反応修飾物質（例えば、インターフェロンガンマ、インターロイキン－１、インターロイキン－２、インターロイキン－５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－９、インターロイキン－１０、インターロイキン－１２、インターロイキン－１５、インターロイキン－２３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、および顆粒球コロニー刺激因子などのサイトカイン）；増殖因子（例えば、成長ホルモン）、または凝固作用物質（例えば、カルシウム、ビタミンＫ、組織因子、例えば、これらに限定されないが、ハーゲマン因子（第ＸＩＩ因子）、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、プレカリクレイン（ＰＫ）、凝固タンパク質－第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第Ｖ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、リン脂質、およびフィブリン単量体など）を挙げることができる。
本発明は、異種タンパク質またはポリペプチドと組換えによって融合または化学的にコンジュゲートして（共有結合または非共有結合によるコンジュゲーション）融合タンパク質を生成する本発明の抗体または機能性断片を包含する。一部の態様では、そのようなポリペプチドの長さは約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０または約１００アミノ酸であってよい。一部の態様では、本発明は、本発明の抗体の機能性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ ＣＤＲ）および異種タンパク質またはポリペプチドを有する融合タンパク質を提供する。一実施形態では、抗体または機能性断片と融合させる異種タンパク質またはポリペプチドは、抗体または機能性断片を、ｓＬｅａを発現する細胞などの特定の細胞型にターゲティングするために有用である。
本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、診断剤、検出可能剤または治療剤とコンジュゲートした（共有結合または非共有結合によるコンジュゲーション）または組換えによって融合した本明細書で提供される本発明のいずれかの抗体または機能性断片を含む。一実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１または７Ｅ３抗体と、診断剤、検出可能剤または治療剤とを含む。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１または７Ｅ３抗体の機能性断片と、診断剤、検出可能剤または治療剤とを含む。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、配列番号２の残基２０～１４２、配列番号６の残基２０～１４２、配列番号１０の残基２０～１４２、もしくは配列番号１４の残基２０～１４５に示されているＶＨドメインの任意の１つのアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、および／または配列番号４の残基２０～１３０、配列番号８の残基２０～１２９、配列番号１２の残基２０～１３０、もしくは配列番号１６の残基２３～１３０に示されているＶＬドメインの任意の１つのアミノ酸配列を有するＶＬドメインと、診断剤、検出可能剤または治療剤とを含む。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、配列番号２、６、１０または１４に示されているＶＨ ＣＤＲの任意の１つのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＶＨ ＣＤＲと、診断剤、検出可能剤または治療剤とを含む。別の実施形態では、コンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、配列番号４、８、１２または１６に示されているＶＬ ＣＤＲの任意の１つのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＶＬ ＣＤＲと、診断剤、検出可能剤または治療剤とを含む。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、それぞれ配列番号２の残基２０～１４２および配列番号４の残基２０～１３０；配列番号６の残基２０～１４２および配列番号８の残基２０～１２９；配列番号１０の残基２０～１４２および配列番号１２の残基２０～１３０；または配列番号１４の残基２０～１４５および配列番号１６の残基２３～１３０に示されている少なくとも１つのＶＨドメインおよび少なくとも１つのＶＬドメインと、診断剤、検出可能剤または治療剤とを含む。
診断剤、検出可能剤または治療剤（ポリペプチドを含む）と抗体を融合またはコンジュゲートするための方法は周知である。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Arnonら,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら(編),243-56頁(Alan R. Liss, Inc. 1985年); Hellstromら,“Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (第2版), Robinsonら(編),623-53頁 (Marcel Dekker, Inc. 1987年); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84巻: Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編),475-506頁(1985年); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編),303-16頁(Academic Press 1985年), Thorpeら, 1982年, Immunol. Rev. 62巻:119-58頁;米国特許第5,336,603号、同第5,622,929号、同第5,359,046号、同第5,349,053号、同第5,447,851号、同第5,723,125号、同第5,783,181号、同第5,908,626号、同第5,844,095号、同第5,112,946号、同第7,981,695号、同第8,039,273号、同第8,142,784;米国出願公開第2009/0202536号、同第2010/0034837号、同第2011/0137017号、同第2011/0280891号、同第2012/0003247; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; PCT公開第WO 91/06570号、同第WO 96/04388号、同第WO 96/22024号、同第WO 97/34631号および同第WO 99/04813号; Ashkenaziら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88巻:10535-10539頁, 1991年; Trauneckerら, Nature, 331巻:84-86頁,1988年; Zhengら, J. Immunol., 154巻:5590-5600頁,1995年; Vilら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89巻:11337-11341頁,1992年;ならびにSenter, Current Opinion in Chemical Biology, 13巻:235-244頁(2009年)を参照されたい。
別の態様では、診断剤、検出可能剤または治療剤は、還元した抗体成分のヒンジ領域においてジスルフィド結合を形成させることによって付着させることができる。あるいは、そのような薬剤は、Ｎ－サクシニル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などの異種二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）架橋剤を使用して抗体成分に付着させることができる。Yuら、Int. J. Cancer ５６巻：２４４号（１９９４年）。そのようなコンジュゲーションのための一般的な技法は当技術分野で周知である。例えば、Wong、CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS－LINKING（CRC Press １９９１年）；Upeslacisら、「Modification of Antibodies by Chemical Methods」、MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS、Birchら（編）、１８７～２３０頁（Wiley-Liss, Inc. １９９５年）；Price、「Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies」、MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION、ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION、Ritterら（編）、６０～８４頁（Cambridge University Press １９９５年）を参照されたい。
あるいは、診断剤、検出可能剤または治療剤は、抗体のＦｃ領域の炭水化物部分を介してコンジュゲートすることができる。ペプチドを抗体成分と抗体炭水化物部分を介してコンジュゲートするための方法は、当業者には周知である。例えば、全てその全体が参照により組み込まれる、Shihら、Int. J. Cancer. ４１巻：８３２～８３９頁（１９８８年）；Shihら、Int. J. Cancer. ４６巻：１１０１～１１０６頁（１９９０年）；およびShihら、米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたい。一般的な方法は、酸化した炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離のアミン官能を有し、複数のペプチドを担持させた担体ポリマーと反応させることを伴う。この反応により、最初のシッフ塩基（イミン）連結がもたらされ、これを還元によって第二級アミンに安定化して最終的なコンジュゲートを形成することができる。
しかし、Ｆｃ領域が存在しない場合、例えば、本明細書で提供される抗体機能性断片が望ましい場合でも、診断剤、検出可能剤または治療剤を付着させることが可能である。炭水化物部分を全長抗体または抗体断片の軽鎖可変領域に導入することができる。例えば、全てその全体が参照により組み込まれる、Leungら、J. Immunol.、１５４巻:５９１９頁（１９９５年）；米国特許第５，４４３，９５３号および同第６，２５４，８６８号を参照されたい。工学的に作製した炭水化物部分を使用して診断剤、検出可能剤または治療剤を付着させる。
ｓＬｅａに結合する本発明の抗体機能性断片とコンジュゲートしまたは組換えによって融合した治療剤は、所望の予防または治療効果（複数可）が実現されるように選択することができる。どの治療剤を本発明の抗体または機能性断片とコンジュゲートしまたは組換えによって融合するかを決定する際に、疾患の性質、疾患の重症度、および被験体の状態を考慮することは、臨床医または他の医療関係者の技術レベルの範囲内であることが理解される。
本明細書で提供される通り検出可能に標識した、ｓＬｅａに結合する本発明のコンジュゲートまたは融合抗体または機能性断片は、診断目的で、疾患を検出、診断、またはモニタリングするために使用することができ、ここで、疾患を引き起こすまたは疾患に関連する細胞はｓＬｅａを発現する。例えば、本明細書で提供される通り、例えば、これらに限定されないが、胃腸管の腫瘍、乳がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸腺癌、膵がん、膵臓腺癌、肺小細胞癌、膀胱腺癌、転移性結腸がん、結腸直腸がん、卵巣印環細胞がん（ｓｉｇｎｅｔ ｒｉｎｇ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）および転移性癌などのがん細胞および腫瘍は、ｓＬｅａを発現することが示されている。したがって、本発明は、被験体におけるがんまたは腫瘍形成を検出することを必要とする被験体に本発明のコンジュゲートまたは融合抗体または機能性断片の有効量を投与することによって被験体におけるがんまたは腫瘍形成を検出するための方法を提供する。一部の態様では、検出方法は、ｓＬｅａに結合する本発明の１種または複数種のコンジュゲートまたは融合抗体または機能性断片を使用して、被験体の細胞または組織試料におけるｓＬｅａの発現をアッセイするステップ、およびｓＬｅａのレベルを対照レベル、例えば、正常組織試料（例えば、疾患を有さない被験体由来のもの、または疾患が発症する前の同じ被験体由来のもの）におけるレベルと比較し、それにより、アッセイされたｓＬｅａのレベルがｓＬｅａの対照レベルと比較して上昇していることにより、疾患が示されるステップをさらに含んでよい。そのような診断方法により、医療従事者が他の場合で可能になるよりも早く予防の尺度または侵襲性の処置を使用し、それにより、疾患の発生またはさらなる進行を予防することが可能になり得る。
本発明の抗体または機能性断片は、本明細書で提供されるまたは当業者に周知の古典的な免疫組織学的方法を使用して生体試料中のｓＬｅａ抗原レベルをアッセイするためにも使用することができる（例えば、Jalkanenら、１９８５年、J. Cell. Biol. １０１巻：９７６～９８５頁；およびJalkanenら、１９８７年、J. Cell. Biol. １０５巻：３０８７～３０９６頁を参照されたい）。ｓＬｅａを検出するために有用な他の抗体に基づく方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は当技術分野で公知であり、それらとして、酵素標識、例えばグルコースオキシダーゼなど；放射性同位元素、例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）など；発光標識、例えばルミノールなど；および蛍光標識、例えばフルオレセインおよびローダミンなど、ならびにビオチンが挙げられる。
一態様では、本発明は、ヒトにおける疾患の検出および診断を提供する。一実施形態では、診断は、ａ）ｓＬｅａに結合する本発明のコンジュゲートまたは融合タンパク質の有効量を被験体に投与する（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）ステップ、ｂ）コンジュゲートまたは融合タンパク質を被験体におけるｓＬｅａが発現している部位に優先的に集中させるために（および、一部の態様では、結合していないコンジュゲートまたは融合タンパク質をバックグラウンドレベルまで除くために）、投与後ある時間間隔をあけるステップ、ｃ）バックグラウンドレベルを決定するステップ、およびｄ）被験体におけるコンジュゲートまたは融合タンパク質を検出し、その結果、バックグラウンドレベルを上回るコンジュゲートまたは融合タンパク質が検出されることにより、被験体が疾患を有することが示されるステップを含む。バックグラウンドレベルは、検出されたコンジュゲートまたは融合タンパク質の量を特定の系に関して予め決定された標準値と比較することを含めた、種々の方法によって決定することができる。
被験体のサイズおよび使用する画像処理系は、診断画像を作成するために必要な画像処理部分の数量を決定し、当業者により容易に決定され得ることが理解される。例えば、ヒト被験体に関して、本発明の抗体または機能性断片とコンジュゲートした放射性同位元素の場合では、注射する放射活性の数量は通常、約５～２０ミリキュリーの９９Ｔｃに及ぶ。次いで、コンジュゲートはｓＬｅａを発現する細胞の場所に優先的に蓄積する。ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍画像処理は、S.W. Burchielら、「Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.」（Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer、１３章、S.W. BurchielおよびB.A. Rhodes編、Masson Publishing Inc.（１９８２年）に記載されている。
使用する検出可能剤の種類および投与形式を含めたいくつかの変数に応じて、コンジュゲートを被験体における部位に優先的に集中させるため、および結合していないコンジュゲートをバックグラウンドレベルまで除くための投与後の時間間隔は６～４８時間または６～２４時間または６～１２時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は５～２０日または５～１０日である。一実施形態では、疾患のモニタリングを、本明細書で提供される診断方法を、例えば、最初の診断の１カ月後、最初の診断の６カ月後、最初の診断の１年後、またはそれよりも後に繰り返すことによって行う。
コンジュゲートまたは融合タンパク質の存在は、被験体においてｉｎ ｖｉｖｏにおけるスキャンの技術分野で公知の方法を使用して検出することができる。これらの方法は、使用する検出可能剤の種類に依存する。当業者は、特定の検出可能剤を検出するために適した方法を決定することができる。本発明の診断方法において使用することができる方法およびデバイスとしては、これらに限定されないが、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、陽電子放出断層撮影法（position emission tomography）（ＰＥＴ）などの全身スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられる。一実施形態では、本発明の抗体または機能断片を放射性同位元素とコンジュゲートし、被験体において放射線応答性外科用機器を使用して検出する。別の実施形態では、本発明の抗体または機能断片を蛍光化合物とコンジュゲートし、被験体において蛍光応答性スキャン機器を使用して検出する。別の実施形態では、本発明の抗体または機能断片を、ジルコニウム（８９Ｚｒ）などの陽電子放出性金属または本明細書で提供されるもしくは陽電子放出断層撮影法によって検出可能であることが当技術分野において周知である任意の他の陽電子放出性金属とコンジュゲートし、被験体において陽電子放出断層撮影法を使用して検出する。さらに別の実施形態では、本発明の抗体または機能断片を常磁性標識とコンジュゲートし、被験体において磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して検出する。
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体または機能性断片および薬学的に許容され得る担体を有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物において使用することができる薬学的に許容され得る担体としては、リン酸緩衝食塩水溶液、水、および油・水エマルションなどのエマルション、および種々の型の湿潤剤などの当技術分野で公知の標準の医薬担体のいずれかが挙げられる。これらの医薬組成物は、本発明の抗体または機能性断片を、処置を必要とする被験体の標的領域に送達するのに十分な液体の単位用量形態または任意の他の投薬形態で調製することができる。例えば、医薬組成物は、選択された投与形式、例えば、血管内、筋肉内、皮下、腹腔内などに適した任意の様式で調製することができる。他の任意選択の成分、例えば、医薬品グレードの安定剤、緩衝剤、防腐剤、賦形剤などは、当業者が容易に選択することができる。ｐＨ、等張性、安定性などを考慮する医薬組成物の調製は当技術分野の技術レベルの範囲内である。
本明細書で提供される本発明の１つまたは複数の抗体または機能性断片を含有する医薬製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を任意選択の生理的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤と混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences（１９９０年）Mack Publishing Co.、Easton、PA）、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保管用に調製することができる。許容され得る担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性のものであり、それらとして、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性物質が挙げられる。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、疾患を処置または予防することを必要とする被験体において疾患を処置または予防するための方法を提供する。本発明の方法は、本明細書で提供される医薬組成物の治療有効量を被験体に投与するステップを含み得る。例えば、医薬組成物は、本明細書で提供される１つまたは複数の抗体または機能性断片を含み得る。本発明の方法を使用して処置または予防することができる疾患としては、がん、腫瘍形成および／または転移が挙げられる。特に、本発明の方法は、がん細胞または腫瘍が炭水化物ｓＬｅａを発現するがんまたは腫瘍形成を処置するために有用である。本発明の方法を使用して処置または予防することができるがんまたは腫瘍の非限定的な例としては、胃腸管の腫瘍、例えば、結腸がん、結腸直腸腺癌、転移性結腸がん、結腸直腸がん、膵がん、または膵臓腺癌；肺小細胞癌；膀胱腺癌；卵巣印環細胞がん；卵巣がん、転移性癌；および胃、食道、咽喉、尿生殖路、または乳房の腺癌が挙げられる。
したがって、一部の態様では、本発明は、がんを処置するまたは腫瘍転移を予防することを必要とする被験体において、抗体またはその機能性断片を有する医薬組成物の治療有効量を投与することによってがんを処置するまたは腫瘍転移を予防するための方法であって、抗体または機能性断片がｓＬｅａに結合し、配列番号２の残基２０～１４２、配列番号６の残基２０～１４２、配列番号１０の残基２０～１４２、および配列番号１４の残基２０～１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、がんを処置するまたは腫瘍転移を予防することを必要とする被験体において、抗体またはその機能性断片を有する医薬組成物の治療有効量を投与することによってがんを処置するまたは腫瘍転移を予防するための方法であって、抗体または機能性断片がｓＬｅａに結合し、配列番号４の残基２０～１３０、配列番号８の残基２０～１２９、配列番号１２の残基２０～１３０、および配列番号１６の残基２３～１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、がんを処置するまたは腫瘍転移を予防することを必要とする被験体において、抗体またはその機能性断片を有する医薬組成物の治療有効量を投与することによってがんを処置するまたは腫瘍転移を予防するための方法であって、抗体または機能性断片がｓＬｅａに結合し、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方を含み、ＶＨドメインおよびＶＬドメインがそれぞれ、配列番号２の残基２０～１４２および配列番号４の残基２０～１３０；配列番号６の残基２０～１４２および配列番号８の残基２０～１２９；配列番号１０の残基２０～１４２および配列番号１２の残基２０～１３０ならびに配列番号１４の残基２０～１４５および配列番号１６の残基２３～１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法を提供する。
本明細書に記載されているものなどの製剤は、処置する特定の疾患に対する必要に応じて２種以上の活性化合物を含有してもよい。ある特定の実施形態では、製剤は、本発明の抗体または機能性断片と、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する１種または複数種の活性化合物とを含む。そのような分子は、意図された目的のために有効な量で組み合わせて適切に存在する。例えば、本発明の抗体または機能性断片は、１種または複数種の他の治療剤と組み合わせることができる。そのような併用療法は、被験体に同時にまたは逐次投与することができる。
したがって、一部の態様では、本発明は、疾患を治療または予防することを必要とする被験体に本明細書で提供される医薬組成物の治療有効量を投与することによって疾患を治療または予防するための方法であって、医薬組成物が本発明の抗体または機能性断片と第２の治療剤とを含む、方法を提供する。適切な第２の治療剤は、本明細書で論じられている通り当業者が容易に決定することができる。本明細書において実施例ＩＶで提示されている通り、本発明の一部の態様では、第２の治療剤はタキソールであってよい。
本明細書で提供される医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体中で、本明細書で提供される本発明の抗体の１つまたは複数の治療有効量、および任意選択で１種または複数種の追加的な治療剤を含有する。そのような医薬組成物は、がんもしくは腫瘍形成などの疾患、またはその症状の１つもしくは複数の予防、処置、管理または好転において有用である。
医薬組成物は、本発明の１つまたは複数の抗体または機能性断片を含有してよい。一実施形態では、抗体または機能性断片を、非経口投与用の滅菌溶液または懸濁剤などの適切な医薬調製物に製剤化する。一実施形態では、本明細書で提供される抗体または機能性断片を、当技術分野で周知の技法および手順を使用して医薬組成物に製剤化する（例えば、Ansel（１９８５年）Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms、第４版、１２６頁を参照されたい）。
本発明の抗体または機能性断片は、処置される被験体に対して、望ましくない副作用がなく、治療的に有用な効果が発揮されるのに十分な治療有効量で医薬組成物中に含めることができる。治療有効濃度は、常套的な方法を使用して化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ系において試験し、次いで、そこからヒトに対する投薬量を推定することによって経験的に決定することができる。医薬組成物中の抗体または機能性断片の濃度は、例えば、抗体または機能性断片の物理化学特性、投薬スケジュール、および投与量、ならびに当業者に周知の他の因子に左右される。
一実施形態では、治療有効投薬量により、約０．１ｎｇ／ｍｌから約５０～１００μｇ／ｍｌまでの、抗体または機能性断片の血清中濃度がもたらされる。別の実施形態では、医薬組成物により、１日当たり体重１キログラム当たり抗体約０．００１ｍｇから約５００ｍｇまでの投薬量がもたらされる。医薬単位剤形（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）を、単位剤形当たり約０．０１ｍｇ、０．１ｍｇまたは１ｍｇから約３０ｍｇ、１００ｍｇまたは５００ｍｇまで、一実施形態では約１０ｍｇから約５００ｍｇまでの抗体もしくは機能性断片および／または他の任意選択の基本的な成分の組合せがもたらされるように調製することができる。
本発明の抗体または機能性断片は、一度に投与することもでき、時間間隔をあけて投与するいくつかのより小さな用量に分けることもできる。処置の正確な投薬量および持続時間は、処置される疾患に応じ、公知の試験プロトコールを使用して、またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける試験データを外挿することによって、経験的に決定することができることが理解される。濃度および投薬量値は、軽減しようとする状態の重症度によっても変動し得ることに留意すべきである。任意の特定の被験体に対して、個々の必要性および組成物の投与を管理または監督する人の専門的な判断に応じて特定の投薬レジメンを経時的に調整することができること、および本明細書に記載されている濃度範囲は単なる例示であり、特許請求された組成物の範囲または実施を制限するものではないことがさらに理解されるべきである。
本発明の抗体または機能性断片を混合または添加した際に生じる混合物は、溶液、懸濁液などであってよい。生じる混合物の形態は、意図された投与形式および選択された担体またはビヒクル中での化合物の溶解性を含めたいくつかの因子に左右される。有効濃度は、処置される疾患、障害または状態の症状を好転させるのに十分であり、経験的に決定することができる。
医薬組成物は、ヒトおよび動物に、化合物または薬学的に許容され得るそれらの誘導体の適切な分量を含有する滅菌非経口用溶液または懸濁液などの単位剤形（ｕｎｉｔ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）で投与するように提供される。一実施形態では、抗体または機能性断片は、単位剤形または複数剤形（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）で製剤化し投与することができる。単位剤形（ｕｎｉｔ－ｄｏｓｅ ｆｏｒｍ）とは、ヒトおよび動物被験体に適するものであり、当技術分野で公知の通り個別に包装された物理的に別個の単位を指す。各単位用量は、所望の治療効果をもたらすのに十分な本発明の抗体または機能性断片の所定数量を、必要な医薬担体、ビヒクルまたは希釈剤を伴って含有する。単位剤形の例としては、アンプルおよびシリンジが挙げられる。単位剤形は、その分数または倍数で投与することができる。複数剤形（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｄｏｓｅ ｆｏｒｍ）は、単位剤形を分けて投与するように単一の容器内に包装された複数の同一の単位剤形である。複数剤形の例としては、パイントまたはガロンのバイアルまたはビンが挙げられる。したがって、複数剤形は、包装が分けられていない複数の単位用量である。
一実施形態では、本発明の１種または複数種の抗体または機能性断片は、液体医薬製剤中にある。薬学的に投与可能な液体組成物は、例えば、本明細書で提供される抗体または機能性断片と任意選択の医薬アジュバントを、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノールなどの担体中に溶解させるか、分散させるか、または他のやり方で混合して、それにより、溶液を形成することによって調製することができる。所望であれば、投与される医薬組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、および他のそのような薬剤も含有してよい。そのような剤形の実際の調製方法は当業者に公知である、または明らかになる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（１９９０年）Mack Publishing Co.、Easton、PAを参照されたい。
本発明の医薬組成物を投与するための方法は当技術分野で周知である。医薬組成物の適切な投与経路は、熟練臨床医が容易に決定することができることが理解される。例示的な投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射または皮下注射が挙げられる。さらに、医薬組成物の製剤は、投与経路に適応するように容易に調整することができることが理解される。本発明は、本発明の医薬組成物の投与後に、本明細書で提供される１種または複数種の医薬組成物の遅延、連続的および／または反復投薬を被験体に施すことができることも提供する。
疾患を処置するための本発明の方法は、（１）疾患を予防すること、すなわち、疾患の素因があり得るが、まだ疾患の症状を経験しておらず、現していない被験体において疾患の臨床症状が発生しないようにすること；（２）疾患を阻害すること、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の発生を静止もしくは低下させること；または（３）疾患を軽減すること、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の退縮を引き起こすことを含むものとする。疾患を予防するための本発明の方法は、がんまたは腫瘍形成を示す臨床症状を未然に防ぐことを含むものとする。そのような未然に防ぐことは、例えば、被験体における正常な生理的指標の維持を含む。したがって、予防は、被験体を腫瘍転移の出現から保護するための被験体に対する予防的処置を含み得る。
本発明の方法において使用される医薬組成物の治療有効量は、使用される医薬組成物、疾患およびその重症度、ならびに処置される被験体の年齢、体重などに応じて変動し、これらは全て、担当臨床医の技能の範囲内である。本発明の方法によって処置される被験体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを含む。
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない改変も本明細書で提供される本発明の定義の範囲内で提供されることが理解される。したがって、以下の実施例は、例示であるが本発明を限定するものではないものとする。
（実施例Ｉ）
ｓＬｅａに対するヒトモノクローナル抗体は強力な抗腫瘍活性を有する
炭水化物抗原ｓＬｅａは、胃腸管、乳房、および膵臓の上皮腫瘍上、ならびに小細胞肺がん上に広範に発現する。ｓＬｅａの過剰発現は多くの腫瘍の浸潤および転移における重要な事象であると思われ、抗体に媒介される溶解を受けやすくなるので、ｓＬｅａは腫瘍療法の魅力的な分子標的である。したがって、本明細書に記載の通り、ｓＬｅａ－ＫＬＨワクチンを用いて免疫した個体由来の血液リンパ球由来の完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成し特徴付けた。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳに基づいて、ｓＬｅａに対する親和性が高い２種のｍＡｂ（５Ｂ１および７Ｅ３、結合親和性がそれぞれ０．１４および０．０４ｎｍｏｌ／Ｌ）を含めたいくつかのｍＡｂを選択し、さらに特徴付けた。どちらの抗体も、グリカンアレイ解析によって決定したところＮｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβおよびＮｅｕ５Ｇｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβに特異的であった。ＤＭＳ－７９細胞に対する補体依存性細胞傷害は、ｒ７Ｅ３（ＩｇＭ）の方がｒ５Ｂ１（ＩｇＧ１）よりも高かった（ＥＣ５０、０．１μｇ／ｍＬ対１．７μｇ／ｍＬ）。さらに、ｒ５Ｂ１抗体はヒトＮＫ細胞または末梢血単核細胞を用いてＤＭＳ－７９細胞に対する高レベルの抗体依存性細胞傷害活性を示した。ｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を評価するために、異種移植モデルにおいて、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに植え付けたＣｏｌｏ２０５腫瘍細胞またはＤＭＳ－７９腫瘍細胞を用いて抗体を試験した。Ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルでは、最初の２１日間のｒ５Ｂ１の４回投薬（投薬当たり１００μｇ）を用いた処置により、生存期間中央値が２０７日に倍増し、動物５匹中３匹が６回の投薬で生存した。ＤＳＭ－７９異種移植モデルでは、ｒ５Ｂ１抗体で処置した動物において、樹立ＤＭＳ－７９腫瘍の成長が抑制されたまたは退縮した。免疫攻撃の標的としてのｓＬｅａの潜在性ならびにそれらの親和性、特異性、およびエフェクター機能に基づいて、５Ｂ１および７Ｅ３には、がんの処置における臨床的な有用性がある。
材料、細胞、および抗体
ＤＭＳ－７９（Pettengillら、Cancer、４５巻：９０６～１８頁（１９８０年））、ＳＷ６２６、ＥＬ４、ＨＴ２９、ＢｘＰＣ３、ＳＫ－ＭＥＬ２８、およびＰ３×６３Ａｇ８．６５３細胞系統はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。Ｃｏｌｏ２０５－ｌｕｃ細胞（Ｂｉｏｗａｒｅ ｕｌｔｒａ）はＣａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ネズミ対照ｍＡｂ １２１ＳＬＥ（ＩｇＭ）は、ＧｅｎｅＴｅｘから購入した。ｓＬｅａ四糖（Ｃａｔ番号Ｓ２２７９）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ｓＬｅａ－ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）コンジュゲート（Ｃａｔ番号０７－０１１）、一価ビオチン化ｓＬｅａ（ｓＬｅａ－ｓｐ－ビオチン；Ｃａｔ番号０２－０４４）、多価ビオチン化ｓＬｅａ－ＰＡＡ（Ｃａｔ番号０１－０４４）、ビオチン標識Ｌｅａ－ＰＡＡ（Ｃａｔ番号０１－０３５）、およびｓＬｅｘ－ＰＡＡ－ビオチン（Ｃａｔ番号０１－０４５）はＧｌｙｃｏＴｅｃｈから購入した。多価の提示形態では、四糖をポリアクリルアミドマトリックス（ＰＡＡ）に組み入れ、それにより、ポリマー鎖のおよそ５番目のアミド基ごとに４：１の比でビオチンによりＮ置換されており、炭水化物含有量がおよそ２０％である３０ｋＤａの多価ポリマーを創出した。この研究において使用した他のＨＳＡまたはＢＳＡ複合糖質は、記載の通りｓＬｅａペンテニル配糖体を使用して社内で調製した。Ragupathiら、Cancer Immunol Immunother、５８巻：１３９７～４０５頁（２００９年）。ＧＤ３、フコシル－ＧＭ１、ＧＭ２、およびＧＭ３はＭａｔｒｅｙａから購入し、ＧＤ２はＡｄｖａｎｃｅｄ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｃａｌから購入した。
抗ｓＬｅａｍＡｂ産生ハイブリドーマの生成
ＭＳＫＣＣにおいて、ＭＳＫＣＣおよびＦＤＡの認可を受けたＩＲＢプロトコールおよびＩＮＤの下で開始された、乳がんの患者におけるｓＬｅａ－ＫＬＨコンジュゲートワクチンを用いた進行中の治験における患者３名から血液試料を得た。３回または４回のワクチン接種後の患者２名から血液検体を選択し、これらはｓＬｅａに対してそれぞれ１／１６０および１／３２０の抗体価を示した。これらの血清（およびネズミｍＡｂ１９．９）はＦＡＣＳアッセイにおいてｓＬｅａ陽性細胞系統と十分に反応し、強力なＣＤＣを媒介する。Ragupathiら、Cancer Immunol Immunother、５８巻：１３９７～４０５頁（２００９年）。およそ８０～９０ｍＬの血液からＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）での勾配遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。
Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、および１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（Ｇ２８－５ハイブリドーマ上清；ＡＴＣＣ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地でＰＢＭＣを培養した。細胞を電気融合によってＰ３×６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合した。
ｓＬｅａ ＥＬＩＳＡ
ｓＬｅａ ＥＬＩＳＡのために、プレートを、１μｇ／ｍＬのｓＬｅａ－ＨＳＡコンジュゲート、一価ビオチン化ｓＬｅａを用いて、またはＮｅｕｔｒ－アビジンでコーティングしたプレート上に捕捉した多価ビオチン化ｓＬｅａ－ＰＡＡを用いてコーティングした。コーティングしていないウェル（ＰＢＳ）およびＨＳＡでコーティングしたウェルを対照として使用した。結合した抗体を、最初に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ＋Ｇ＋Ｍ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出し、陽性ウェルをその後、ＩｇＧ－ＦｃまたはＩｇＭ特異的二次抗体を用いてプローブしてアイソタイプを決定した。
炭水化物特異性分析
密接に関連する抗原、ＬｅａおよびｓＬｅｘに対する交差反応性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価し、ビオチン標識Ｌｅａ－ＰＡＡおよびビオチン－ｓＬｅｘ－ＰＡＡを使用したＥＬＩＳＡによって確認した。ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、フコシル－ＧＭ１、ＧＭ２、およびＧＭ３への結合をＥＬＩＳＡによって試験した。競合ＥＬＩＳＡを使用して、いくつかの他の関連する炭水化物部分に対するｍＡｂの特異性を評価した。簡単に述べると、２μｇ／ｍＬのｓＬｅａ－ＨＳＡコンジュゲートをプレートにコーティングし、その後、ＰＢＳ中３％ＢＳＡでブロッキングした。次に、コンジュゲートしていないか、またはＨＳＡもしくはＢＳＡとコンジュゲートした異なる炭水化物部分３０μＬ（１ｍｇ／ｍＬの保存溶液から調製したＰＢＳ中４０μｇ／ｍＬ）を別々に試験抗体３０μＬと混合し、試料プレート中、室温でインキュベートした。３０分後、混合物５０μＬを、コーティングしたアッセイプレートに移し、１時間インキュベートし、その後、ＨＲＰ標識したヤギ抗ヒトＩｇＡ＋Ｇ＋Ｍと一緒にインキュベートし、洗浄し、Ｖｅｒｓａｍａｘ ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを使用して結合した抗体を比色定量検出した（全てのステップを室温で行った）。試験した炭水化物部分としては、ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｌｅｗｉｓ Ｘ、シアリル－Ｔｈｏｍｓｏｎ－ｎｏｕｖｅａｕｘ（ｓＴｎ）、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｓＴｎ、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）、Ｔｉｇｈｅ Ｌｅｂ／ＬｅＹムチン、ブタ顎下ムチン（ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｙ ｍｕｃｉｎ）（ＰＳＭ）、およびｓＬｅａ四糖およびｓＬｅａ－ＨＳＡコンジュゲートが含まれた。抗体の細かい特異性を決定するために、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｈ ｇｒｏｕｐによるグリカンアレイ解析を行った。４６５種のグリカンからなるｐｒｉｎｔｅｄ ａｒｒａｙのバージョン４．１を使用して６連で１０μｇ／ｍＬの５Ｂ１および７Ｅ３抗体を試験した。
免疫グロブリンｃＤＮＡクローニングおよび組換え抗体発現
ヒトｍＡｂ重鎖および軽鎖の可変領域ｃＤＮＡをＲＴ－ＰＣＲによって個々のハイブリドーマ細胞系統から回収し、以前に記載されている通りＩｇＧ１もしくはＩｇＭ重鎖発現ベクターまたはＩｇＫもしくはＩｇＬ軽鎖発現ベクターにサブクローニングした。Sawada-Hiraiら、J. Immune Based Ther. Vaccines、２巻:５頁（２００４年）。Ｉｇ重鎖または軽鎖発現ベクターをＮｏｔ ＩおよびＳａｌ Ｉで２重消化し、次いで、両方の断片をライゲーションして二重遺伝子発現ベクターを形成した。６ウェルプレート中のＣＨＯ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して二重遺伝子発現ベクターをトランスフェクトした。２４時間後に、トランスフェクトされた細胞を、選択培地［１０％透析ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０μｍｏｌ／ＬのＬ－メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）、ＧＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＤＭＥＭ］を伴う１０ｃｍのディッシュに移した。２週間後、ＭＳＸ耐性トランスフェクタントを単離し、拡大増殖させた。ｓＬｅａ特異的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて上清中の抗体レベルを測定することによって高抗ｓＬｅａ抗体産生クローンを選択し、大規模ｍＡｂ産生のために拡大増殖させた。
ヒトｍＡｂ精製
Ｕｎｉｃｏｒｎ５．０ソフトウェアを実行するＡｅｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムを使用して抗体を精製した。簡単に述べると、５Ｂ１または７Ｅ３の安定なクローンをＷａｖｅバイオリアクター中、無血清培養培地で成長させ、回収した上清を遠心分離および濾過によって清澄化し、使用するまで冷蔵保管した。ヒトＩｇＧ抗体を、適切なサイズにしたプロテインＡカラムで１０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳおよび１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌランニング緩衝液を使用して精製した。ヒトＩｇＭ抗体をヒドロキシアパタイトカラムで精製し、５００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸の勾配を用いてＩｇＭを溶出した。ＩｇＧおよびＩｇＭについて、それぞれＥ１％１．４および１．１８を使用してＯＤ２８０によって抗体濃度を決定して濃度を算出した。各調製物の純度を還元性条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって評価し（レーン当たり１～５μｇ）、純度は重鎖および軽鎖の合計に基づいて９０％超であった。
フローサイトメトリー
ｓＬｅａ陽性または陰性腫瘍細胞系統（条件当たり細胞０．５×１０６個）をＰＢＳ／２％ＦＢＳ（ＰＢＳＦ）中で洗浄した。次いで、試験または対照ヒトｍＡｂを添加し（完全培地中１～２μｇ／ｍＬ）、氷上で３０分インキュベートした。Gilewskiら、Clin Cancer Res、６巻：１６９３～７０１頁（２０００年）；Gilewskiら Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、９８巻：３２７０～５頁（２００１年）。ＰＢＳＦ中で洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ－４８８抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃγまたは抗ヒトＩｇＭ－μ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に氷上で３０分インキュベートした。細胞をＰＢＳＦ中で２回洗浄し、Ｇｕａｖａ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ－９６（ＰＣＡ－９６）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してフローサイトメトリーによって分析した。Ｃｏｌｏ２０５－ｌｕｃ細胞を、２μｇ／ｍＬの一次抗体と一緒にインキュベートし、その後、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈからの二次抗体を用いて染色し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＩＶ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔでＦｌｏｗＪｏ７．２．４ソフトウェアを使用して分析した。
親和性の決定
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＲの原理を使用して親和定数を決定した。ビオチン標識した一価ｓＬｅａ（Ｃａｔ番号０２－０４４）または多価ｓＬｅａ－ＰＡＡ－ビオチン（Ｃａｔ番号０１－０４４）をＳＰＡバイオセンサーチップの別々のフローセルに製造者の説明書に従ってカップリングした。ＨＳＡ、および遊離のビオチンを含有する培養培地を用いてブロッキングしたフローセルを参照細胞として使用した。ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、３．４ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性物質Ｐ２０）中に希釈したいくつかの既知濃度の抗体から、ｓＬｅａ－ＰＡＡ－ビオチンでコーティングしたフローセルを使用して結合速度パラメータを決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔから提供された曲線あてはめソフトウェアを使用して、親和性を算出するための会合および解離速度の推定値を出した。
ＣＤＣアッセイ
ｓＬｅａ抗原陽性および陰性細胞系統を、以前に記載されている通り、ヒト補体（Ｑｕｉｄｅｌ；Ｃａｔ番号Ａ１１３）および種々の希釈度（０．１～２５μｇ／ｍＬ）の精製ヒトｍＡｂを使用した、または陽性対照ｍＡｂを用いた９０分細胞傷害アッセイ（Ｇｕａｖａ ＰＣＡ－９６ Ｃｅｌｌ－Ｔｏｘｉｃｉｔｙキット；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｃａｔ番号４５００－０２００）のために使用した（Ragupathiら Clin Cancer Res ２００３年、９巻：５２１４頁；Ragupathiら Int J Cancer ２０００年、８５巻：６５９頁；Dicklerら Cancer Res １９９９年、５巻：２７７３頁）。簡単に述べると、標的細胞２．５×１０６個にカルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル（carboxyfluorescein diacetate succinymyl ester）（ＣＳＦＥ）を塗布して緑色／黄色蛍光標的細胞を得た。塗布された細胞（試料５０μＬ当たり１×１０５個）を抗体１００μＬと一緒に氷上で４０分インキュベートした。次に、完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ＦＣＳ）中１：２に希釈したヒト補体５０μＬまたは培地単独を３連の試料に添加し、３７℃で９０分インキュベートした。したがって、アッセイにおける最終的な補体の希釈度は１：８であった。このインキュベート時間の間に死滅した細胞を、膜不浸透性色素７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を添加することによって標識し、Ｇｕａｖａ ＣｅｌｌＴｏｘｉｃｉｔｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｍｏｄｕｌｅを利用した二色免疫蛍光法によって試料を分析した。ＮＰ４０を添加した対照試料を最大死滅を決定するために使用し、補体単独を添加した試料はベースラインとしての機能を果たした。死滅した細胞の百分率を、適切なゲーティングによって決定し、次式に従って算出した：死滅％＝［（試料％－補体単独％）／（ＮＰ４０％－補体単独％）］×１００。
抗体依存性細胞傷害アッセイ
ＰＢＭＣエフェクター細胞を、ＭＳＫＣＣ ＩＲＢの認可を受けたプロトコールの下で得た血液試料からＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離によって単離した。標的細胞を完全成長培地１ｍＬ当たり細胞５×１０６個で、０．１％カルセイン－ＡＭ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１５μＬと一緒に、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で３０分インキュベートした。細胞を１５ｍＬのＰＢＳ－０．０２％ＥＤＴＡで２回洗浄し、完全成長培地１ｍＬに再浮遊させた。標識した標的細胞５０マイクロリットル（細胞１０，０００個）を図１３に記載の濃度の抗体の存在下または不在下で９６ウェルプレートにプレーティングし、新鮮に単離した末梢血単核細胞（エフェクター細胞、Ｅ／Ｔ比１００：１）５０μＬと一緒に適宜インキュベートした。２時間インキュベートした後に、プレートを３００×ｇで１０分遠心分離し、上清７５μＬを新しい平底９６ウェルプレートに移した。上清における蛍光をＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４８５ｎｍにおける励起および５３５ｎｍにおける放出で測定した。３０％ＦＢＳを伴い、エフェクター細胞を伴わないＲＰＭＩ－１６４０培地中の標的細胞から自然放出を決定し、３０％ＦＢＳおよび６％トリトンＸ－１００を伴い、エフェクター細胞を伴わないＲＰＭＩ－１６４０培地中の標的細胞から最大放出を決定した。パーセント細胞傷害性を［（試料における計数－自然放出）／（最大計数－自然放出）］×１００として算出した。
ｍＡｂ内部移行アッセイ
５Ｂ１抗体の内部移行を、２連で９６ウェルプレートにプレーティングし（細胞２，０００個／９０μＬ／ウェル）、一晩インキュベートしたｓＬｅａ発現ＢｘＰＣ３細胞に対するｒ５Ｂ１およびＨｕｍ－ＺＡＰ二次コンジュゲート（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）複合体の細胞傷害活性を測定することによって評価した。様々な濃度の５Ｂ１抗体を、Ｈｕｍ－ＺＡＰ二次コンジュゲートと一緒に、製造者の説明書に従い、室温でインキュベートした。次に、１０μＬ／ウェルのｒ５Ｂ１およびＨｕｍ－ＺＡＰ複合体を細胞に添加し、３日間インキュベートした。Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）２５マイクロリットルを各ウェルに添加し、３７℃でインキュベートした。２時間インキュベートした後に、１００μＬ／ウェルの可溶化溶液（２０％ＳＤＳ／５０％Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）を各ウェルに添加し、３７℃でさらに１６時間インキュベートした。５７０／６９０ｎｍにおいてＯＤを測定し、培地単独を用いて得られた値をプレートバックグラウンド減算のために使用した。抗体を伴わない８つの並行した培養物を使用して試料の値を正規化した（試料／無処理平均×１００）。
異種移植モデル
雌ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（５～８週齢）をＴａｃｏｎｉｃから購入した。Ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルのために、完全成長培地０．１ｍＬ中Ｃｏｌｏ２０５－ｌｕｃ細胞（０．５×１０６個）を、０日目に２８Ｇ針を伴うＢＤインスリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ）を使用して尾静脈に注射した。第１の研究については、１００マイクログラムのｍＡｂ ５Ｂ１を１日目、７日目、１４日目、および２１日目（実験１）または１日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目、および２１日目（実験２）に腹腔内に注射した。第２の研究については、１００μｇ、３００μｇまたは１ｍｇのｍＡｂ ５Ｂ１を腫瘍細胞注射の４日後、次いで、最初の２週間にわたって週２回および次の７週間にわたって週１回、腹腔内注射した。マウスを腫瘍の発生についてモニタリングした。ＤＭＳ－７９異種移植モデルについては、ＤＭＳ－７９細胞（１×１０６）を雌ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスに皮下注射し、腫瘍の長さが５ｍｍ（約２０ｍｍ２）に到達した後、１９日目にマウスの処置を開始した。次いで、動物を、ヒトＩｇＧまたは５Ｂ１抗体を投薬当たり２００μｇで腹腔内注射し、それに加えて、血管透過性を上昇させるためにｃＲＧＤを最初に８０μｇ、次いで１週間当たり５日、投薬当たり４０μｇを３７日目まで静脈内注射することにより処置した。
全ての手順をＭｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる認可を受けたプロトコールの下で行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してカプラン・マイヤー生存曲線を作成し、Ｍａｎｔｅｌ－Ｈａｅｎｓｚｅｌログランク検定を使用して解析した。
結果
ＥＬＩＳＡによるヒトモノクローナル抗体の同定および組換え抗体の生成 ワクチン接種を受けた患者３名由来の血液試料をハイブリドーマ生成の試みのために使用し、抗原特異的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて多くの陽性ウェルが検出された（表３）。広範囲にわたるスクリーニングを使用して、劣ったまたは非特異的な結合を示す抗体を排除した。ｓＬｅａに対して強力な反応性を有する８つのヒト抗体発現ハイブリドーマ細胞（ＩｇＭが１つおよびＩｇＧが７つ）を最初に選択し、拡大増殖させ、さらに特徴付けるためにサブクローニングした。２種の抗体（９Ｈ１および９Ｈ３）はｓＬｅａ－ＨＳＡコンジュゲートへの強力な結合を示したが、ｓＬｅａ－ＰＡＡでコーティングしたプレートへの結合は示さなかった。３種の抗体（５Ｂ１、５Ｈ１１、および７Ｅ３）はＥＬＩＳＡアッセイによって測定したところ一価ｓＬｅａ、多価ｓＬｅａおよびｓＬｅａ－ＨＳＡコンジュゲートへの強力な結合を示した（表４）。
Figure 0007299405000003
Figure 0007299405000004
４種の選択された抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をＲＴ－ＰＣＲによって回収し、我々の全長ＩｇＧ１またはＩｇＭ発現ベクターにクローニングした。ＩＭＧＴ／Ｖ－Ｑｕｅｓｔを使用した分子配列解析（Brochetら、Nucleic Acids Res.、３６巻：Ｗ５０３～８頁（２００８年））により、３種の選択されたＩｇＧ抗体、５Ｂ１（ＩｇＧ／λ）、９Ｈ３（ＩｇＧ／λ）、および５Ｈ１１（ＩｇＧ／λ）が同じＶＨファミリーに由来すること、および全てラムダ軽鎖が使用されていることが明らかになった。これらのＩｇＧ１抗体は、生殖細胞系列から外れた変異をそれぞれ１６個、５個、または３個伴う異なるＣＤＲ配列を示した（図１～６；表５）。ＩｇＭ抗体（７Ｅ３）ではカッパ軽鎖が利用され、重鎖変異が６個ある（図７～８；表５）。５Ｂ１における変異の増加により、親和性成熟が示される。ウェーブバイオリアクターシステム中、ＣＨＯ細胞系統において組換え抗体を産生させ、ＩｇＧおよびＩｇＭに対してそれぞれプロテインＡまたはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して精製した。精製された組換え抗体は、ＥＬＩＳＡでの結合および特異性に関して元のハイブリドーマ由来の抗体の性質を保持した。
Figure 0007299405000005
腫瘍細胞結合の分析
細胞表面結合は細胞傷害活性に関して極めて重要であり、したがって、これを次に試験した。フローサイトメトリーにより、５Ｂ１、９Ｈ３、５Ｈ１１、および７Ｅ３組換え抗体のＤＭＳ－７９細胞、小細胞肺がん浮遊細胞系統への強力な結合が示された（図１１Ａ）。ｒ５Ｂ１およびｒ７Ｅ３の結合は、ＨＴ２９結腸がん細胞（図１１Ｂ）、ＢｘＰＣ３膵がん細胞（図１１Ｃ）、ＳＷ６２６卵巣がん細胞（図１１Ｄ）、およびＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ結腸がん細胞（図１１Ｆ）でも確認された。これらの抗体は、ｓＬｅａ陰性（ＳＬＥ１２１－陰性）ＳＫ－ＭＥＬ２８メラノーマ細胞（図１１Ｅ）またはＥＬ４マウスリンパ腫の細胞には結合することができなかった（データは示していない）。
親和性測定
ｓＬｅａへの結合の相対的な親和性／結合活性を、ビオチン化ｓＬｅａ－ＰＰＡを捕捉するためにストレプトアビジンでコーティングしたバイオセンサーチップを使用してＳＰＲによってプローブした。表６に示されている通り、ｒ５Ｂ１およびｒ７Ｅ３は、ｓＬｅａ－ＰＰＡに迅速に結合し、比較のために使用した市販のネズミＩｇＭ抗ｓＬｅａ抗体である１２１ＳＬＥと比較して有意に遅い解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）を示す。５Ｂ１の親和性を０．１４ｎｍｏｌ／Ｌで測定し、７Ｅ３の見かけの親和性／結合活性はおよそ４倍高かった（表６）。９Ｈ３親和性の決定は、９Ｈ３抗体（ネイティブなおよび組換え）がｓＬｅａ－ＰＡＡでコーティングしたバイオセンサーチップに結合できないことにより阻止された。
Figure 0007299405000006
特異性分析
炭水化物特異性をプローブするための予備アッセイにより、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲによって測定して、５Ｂ１、９Ｈ３、および７Ｅ３は密接に関連するｓＬｅＸ、Ｌｅａ、およびＬｅＹ抗原にもガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、フコシル－ＧＭ１、ＧＭ２、およびＧＭ３にも結合しないことが示された。Ｂｉａｃｏｒｅアビジンチップに捕捉したｓＬｅａ－ＰＡＡ－ビオチンまたはｓＬｅａ－ｓｐ－ビオチンへの７Ｅ３、５Ｂ１および１２１ＳＬＥの結合に関する追加的な分析により、３種の抗体全てが多価の形態のｓＬｅａに結合することが示され、一方では７Ｅ３および５Ｂ１が一価の形態に結合することが見いだされた。同様に、Ｂｉａｃｏｒｅ濃度分析シリーズにおいて、５Ｂ１のｓＬｅａ－ＰＡＡへの結合はｓＬｅａ四糖によって用量依存的に阻害された（データは示していない）。これらの結果は、抗ｓＬｅａ抗体価が高い血清はｓＬｅａに特異的である、すなわちＥＬＩＳＡによりガングリオシドＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、または中性糖脂質ｇｌｏｂｏ ＨおよびＬｅｙとは反応しないことが見いだされた以前の観察と一致する。Ragupathiら、Cancer Immunol Immunother ５８巻：１３９７～４０５頁（２００９年）。９種の別個の関連する炭水化物部分を種々の提示形態で（例えば、セラミドとして、またはＢＳＡもしくはＨＳＡとコンジュゲートして）用いた競合アッセイでは、ｓＬｅａ四糖およびｓＬｅａ－ＨＳＡコンジュゲートだけがｓＬｅａ－ＨＳＡコンジュゲートへの結合を阻害することができた（表７）。
Figure 0007299405000007
炭水化物特異性をさらに詳細に調査するために、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｈ ｇｒｏｕｐにより行われたグリカンアレイ解析によって５Ｂ１および７Ｅ３抗体も試験した。どちらの抗体も、４６５種のグリカンからなるｐｒｉｎｔｅｄ ａｒｒａｙにおいて１０μｇ／ｍＬで６連で試験した。結果により、どちらの抗体も特異性が高いことが確認され、ｓＬｅａ四糖、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβおよびＮｅｕ５Ｇｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβが選択的に認識され、また、ｓＬｅｘ、Ｌｅａ、Ｌｅｘ、およびＬｅｙを含めた、アレイに存在していた密接に関連する抗原への結合は事実上存在しなかった。結果が表８に要約されており、４６５種のグリカン構造のうち、それぞれの抗体によって認識された上位５種が示されている。
Figure 0007299405000008
ＣＤＣ活性
５Ｂ１および７Ｅ３の機能活性を評価するために、ＤＭＳ－７９細胞を用い、補体の供給源としてヒト血清の存在下で細胞傷害活性を試験した。どちらの抗体も、いくつかのアッセイにおいて１０μｇ／ｍＬでほぼ１００％の死滅活性を示したが、特異性が異なる対照抗体（１Ｂ７、抗ＧＤ２ ＩｇＧ１ ｍＡｂ）は同じ濃度で効果を有さなかった（データは示していない）。ＣＤＣ活性は濃度依存性であり、このアッセイでは７Ｅ３が５Ｂ１よりも有意に活性が高く（図１２）、これは、補体媒介性細胞傷害アッセイにおいてＩｇＭ抗体がより有効であることが分かっていたので、予測される。ＥＣ５０（５０％細胞傷害性）は、５Ｂ１については１．７μｇ／ｍＬであり、７Ｅ３については０．１μｇ／ｍＬであり、これを変換すると、モル濃度ベースでは７Ｅ３の効力がおよそ８５倍大きい（図１２）。
ＡＤＣＣ活性
ＣＤＣアッセイでは７Ｅ３の効力が有意に大きいが、ＩｇＧ抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の死滅に関して重要であると考えられている抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有することが公知である。５Ｂ１抗体をヒトＰＢＭＣおよびＤＭＳ－７９標的細胞と種々のＥ：Ｔ比で使用して、高レベルの細胞傷害性が測定された（図１３Ａ）。初代ＮＫ細胞ではより低いＥ：Ｔ比で同様のレベルの細胞傷害性が観察された（図１３Ｂ）。Ｅ／Ｔ比１００：１で測定した、２ドナー由来のＰＢＭＣを用いた用量－応答実験により同様の有効性が示され、０．５μｇ／ｍＬまたはそれ超の濃度の５Ｂ１で細胞傷害性が８５％超に達した（図１３Ｃ）。５Ｂ１によって媒介される細胞傷害性は、３Ｇ８抗ＣＤ１６抗体で遮断することができるので、ＦｃγＲＩＩＩ受容体を必要とする。５Ｂ１抗体とヒトＰＢＭＣをＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ細胞に対してＥ：Ｔ比１００：１で使用して同様に高レベルの細胞傷害性が測定された。１μｇ／ｍＬの５Ｂ１抗体を用いて実現されたＡＤＣＣ活性は、ＧＭ２、フコシル－ＧＭ１、ｇｌｏｂｏ Ｈ、またはポリシアル酸に対する抗体を用いて観察された活性よりも優れていた。予測通り、７Ｅ３およびネズミ１２１ＳＬＥ（どちらもＩｇＭである）はこのアッセイでは不活性であった。
５Ｂ１内部移行アッセイ
Ｌｅｗｉｓ Ｙに「密接に関連する」抗原を対象とする抗体コンジュゲートは、急速に内部移行し、動物モデルにおいて非常に有効であることが以前に示されている。Hellstromら、Cancer Res ５０巻：２１８３～９０頁（１９９０年）；Trailら、Science ２６１巻：２１２～５頁（１９９３年）。ｓＬｅａが内部移行するかどうかを調査するために、膵臓細胞系統ＢｘＰＣ３を５Ｂ１と一緒にインキュベートし、次いで、リボソーム不活化タンパク質サポリンとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧであるＨｕｍ－ＺＡＰを添加した。Kohlsら、Biotechniques ２８巻：１６２～５頁（２０００年）。サポリンを含有する複合体が内部移行した細胞は死滅するが、サポリンが内部移行しないことにより細胞は無傷のままになる。図１４に示されている通り、ＢｘＰＣ３細胞は漸増用量の５Ｂ１の存在下で有効に死滅するが、これらの細胞では発現しないＧＤ２を対象とする、アイソタイプを適合させたＩｇＧ１抗体が存在することでは細胞は死滅しない。
転移に関する異種移植動物モデルにおける活性
ｉｎ ｖｉｖｏにおける５Ｂ１の活性を評価するために、ＳＣＩＤマウスにＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ腫瘍細胞またはＤＭＳ－７９腫瘍細胞のいずれかを使用した２種の異種移植モデルにおいて抗体を試験した。Ｃｏｌｏ２０５－ｌｕｃ腫瘍細胞を使用した異種移植モデルについては、群当たり５匹のマウスに対し、０日目に細胞０．５×１０６個を尾静脈に注射し、上首尾の細胞の注射を、ＩＶＩＳ ２００ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して動物を画像処理することによって検証した。１日後、動物を、腹腔内に与えた５Ｂ１抗体またはＰＢＳ偽注射で処置した。実験１では、１００μｇの５Ｂ１を１日目、７日目、１４日目、および２１日目に与え（総用量４００μｇ）、実験２では、動物に１００μｇの５Ｂ１を１日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目、および２１日目に与えた（総用量６００μｇ）。２つの実験における無処置の動物の平均生存期間中央値は１０２日であり、無処置の動物は全て１５５日以内に死亡した（図１５）。動物を処置することにより、生存が有意に改善され、５Ｂ１を４回投薬した群における生存期間中央値は２０７日に倍増し、動物５匹中２匹が３０１日後に実験が終了するまで生存した（ログランク検定、Ｐ＝０．０４９９；ＨＲ＝３．４６）。６回投薬を施した場合には生存動物の割合はマウス５匹中３匹にさらに増加した（ログランク検定、Ｐ＝０．００６４；ＨＲ＝６．３７５）。第２の実験を３０８日後に終了し、生存していた動物では画像処理系の最も高い感度でＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ腫瘍を明らかにすることができなかった（データは示していない）。
第２の研究では、上記の通りＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ腫瘍細胞を同様に注射したマウスを、漸増用量の５Ｂ１または７Ｅ３抗体（１００μｇ、３００μｇまたは１ｍｇ）で処置した。全ての動物に、５Ｂ１または７Ｅ３抗体の腹腔内注射またはＰＢＳ偽注射（対照）を、最初に腫瘍細胞注射の４日後、次いで、最初の２週間にわたって週２回、および次の７週間にわたって週１回行った。Ｃｏｌｏ２０５－ｌｕｃ腫瘍細胞を植え付けたＳＣＩＤマウスにおいて、様々な用量の５Ｂ１を用いた遅延処置により、完全な治癒に至るまでの用量依存性の保護が示された（図１６および１７）。７Ｅ３抗体を用いた処置では、見かけの親和性の増加にもかかわらず、より高い保護は示されなかった（データは示していない）。
ＤＭＳ－７９細胞を使用した異種移植モデルでは、群当たり５匹のマウスに対し、０日目に細胞１×１０６個を皮下注射し、腫瘍の長さが５ｍｍ（約２０ｍｍ２）に到達した後、１９日目に処置を開始した。次いで、動物を、ヒトＩｇＧまたは５Ｂ１抗体を投薬当たり２００μｇで腹腔内注射し、それに加えて、ｃＲＧＤを最初に８０μｇ、次いで１週間当たり５日、投薬当たり４０μｇを３７日目まで静脈内注射することにより処置した。５Ｂ１または５Ｂ１プラスｃＲＧＤの組合せで処置した動物では、樹立ＤＭＳ－７９腫瘍の成長が抑制されたまたは退縮した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。皮下モデルにおいてＤＭＳ－７９細胞を植え付けた日に５Ｂ１を用いて動物を処置することにより、腫瘍の成長が完全に妨げられた（データは示していない）。
上記のデータにより、樹立腫瘍を抑制するまたは退縮させ、５Ｂ１抗体処置を使用した生存に対する利点をもたらす有意な能力が実証される。
（実施例ＩＩ）
放射標識したモノクローナル抗体５Ｂ１を使用した、膵がんおよび他のｓＬｅａ陽性腺癌のＩｍｍｕｎｏ－ＰＥＴによる検出および診断
腺癌はがんによる死亡の主な原因である。膵がんの検出は特に難しいままであり、多くの場合、後期に診断がなされる。原発性および転移性膵がんを早期に検出するための手法は、著しい臨床的影響を有し得る。診療では、膵がんの患者における疑わしい肉眼で見えない悪性腫瘍を同定するためにｓＬｅａ抗原のレベルの上昇をモニタリングする。本明細書に記載の通り、膵がんおよび他のｓＬｅａ陽性腺癌の前臨床モデルにおけるｓＬｅａを標的とする新規のｉｍｍｕｎｏＰＥＴ画像処理プローブの潜在性を調査した。ヒト抗ｓＬｅａモノクローナル抗体５Ｂ１はｓＬｅａ陽性であることが公知のヒト腺癌に対して陽性染色を示したが、ｓＬｅａ陰性悪性腫瘍および大部分の正常組織に対しては陽性染色を示さなかった。８９Ｚｒ放射標識５Ｂ１（８９Ｚｒ－５Ｂ１）は高い標識収率（＞８０％）および精製収率（＞９５％）を示した。雌ＳＣＩＤマウスにおける皮下の同所性および転移性の膵がん異種移植片において８９Ｚｒ－５Ｂ１を用いた画像処理を調査した。取得したＰＥＴ画像および体内分布研究により、健康な組織への非特異的な結合は最小であり、ｓＬｅａを過剰発現しているＢｘＰＣ３異種移植片に対する８９Ｚｒ－５Ｂ１のすぐれた特異性および局在化が実証された。結腸がん皮下異種移植モデルおよび小細胞肺がん皮下異種移植モデルにおけるさらなる分析により、同様に８９Ｚｒ－５Ｂ１による優れた腫瘍描写がもたらされた。したがって、これらの結果により、８９Ｚｒ－５Ｂ１を、診療所においてｓＬｅａ発現悪性腫瘍を早期検出するための分子プローブとして使用することができることが示される。
細胞系統および組織培養物
全ての組織培養操作を滅菌技法に従って実施した。小細胞肺がんＤＭＳ７９細胞およびＢｘＰＣ３膵がん細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。Ｃｏｌｏ２０５－ｌｕｃ結腸直腸がん細胞（Ｂｉｏｗａｒｅ Ｕｌｔｒａ）をＣａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＬＳ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。全ての細胞をＡＴＣＣおよびＣＬＳの推奨に従い、５％ＣＯ２加湿雰囲気、３７℃で成長させた。
ＦＡＣＳによるｓＬｅａ発現レベルのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける評価 示されている培養がん細胞系統を用いたフローサイトメトリーを本明細書の実施例Ｉに記載の通り実施した。簡単に述べると、チューブ当たり培養物腫瘍細胞１×１０６個の単一細胞浮遊液を、３％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を伴うＰＢＳ中で洗浄した。次いで、ヒトモノクローナル抗体ｒ５Ｂ１（ｓＬｅａに対するＩｇＧ）をチューブごとに２０μｇ／ｍｌで添加し、氷上で３０分インキュベートした。３％ＦＢＳを伴うＰＢＳ中で洗浄後、フルオレセイン－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧの１：２５希釈物２０μｌを添加し、混合物を氷上でさらに３０分インキュベートした。最終的な洗浄後、染色された細胞の陽性集団および蛍光強度の中央値を、ＦＡＣＳ Ｓｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して識別した。フルオレセイン－イソチオシアネートで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧでのみ染色された細胞を使用して、１％のＦＡＣＳｃａｎ結果を一次ｍＡｂで染色されたパーセント陽性細胞と比較するためのバックグラウンドとして設定した。
８９Ｚｒ標識抗体の調製
組換え５Ｂ１抗体を本明細書に記載の通り調製し、精製した。５Ｂ１抗体および非特異的ヒトＩｇＧに、ｐ－イソチオシアネートベンジル－デスフェリオキサミン（ＤＦＯ－Ｂｚ－ＮＣＳ、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）をｍＡｂ：ＤＦＯ－Ｂｚ－ＮＣＳ比１：４で用いて官能性をもたせた。例えば、３００μＬの５Ｂ１（ＰＢＳ中１．２３ｍｇ、ｐＨ約９）に、体積７．２μＬのＤＦＯ－Ｂｚ－ＮＣＳ（ＤＭＳＯ中４．２５ｍＭ）を添加した。反応物を３７℃で１～１．５時間インキュベートした。官能性をもたせた抗体をＰＤ１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または１０ｋＤａの遠心濾過器（Ａｍｉｃｏｎ）のいずれかで精製した。
ＭＳＫＣＣにおいて、予め確立された手順に従ってイットリウムホイルの陽子線照射によってＺｒ－８９を生じさせ、Ｚｒ－８９シュウ酸として高い純度で単離した。Hollandら、Nuclear Medicine and Biology ３６巻：７２９～３９頁（２００９年）。抗体の標識をHollandら、Journal of Nuclear Medicine official publication、Society of Nuclear Medicine ５１巻：１２９３～３００頁（２０１０年）により記載されている方法によって進めた。概して、Ｚｒ－８９シュウ酸を１ＭのＮａ２ＣＯ３でｐＨ７．０～７．２に中和した。次いでＤＦＯ－抗体を添加した。反応物を室温で１～２時間インキュベートした。その後の精製を、０．９％生理食塩水を用いてＰＤ１０脱塩カラムを使用して行った。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実験
８９Ｚｒ－５Ｂ１をｉｎ ｖｉｔｒｏにおける安定性について０．９％生理食塩水中および１％ウシ血清アルブミン中、３７℃で５日間調査した。放射化学的純度の変化をｔ＝０～５日に５０ｍＭのＤＴＰＡを移動相として用いた放射性ｉＴＬＣによってモニタリングした。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける免疫反応性アッセイをLindmoら、Journal of Immunological Methods ７２巻：７７～８９頁（１９８４年）により記載されているプロトコールに従って実施して、Ｚｒ－８９で放射標識された抗体の完全性を実証した。
動物モデル
動物研究は全て、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより設定されたガイドラインに従って行った。雌ＣＢ１７ＳＣ－Ｆ ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、６～８週、２０～２２ｇ）またはｎｕｄｅ ａｔｈｙｍｉｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスに対して、後肢に腫瘍を誘導した。１：１培地：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液２００μＬ中で全ての細胞系統を皮下に接種し、使用する前に最大腫瘍体積２５０ｍｍ３まで成長させた。
体内分布研究
別々のＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ結腸直腸異種移植片、ＢｘＰＣ３膵臓異種移植片およびＤＭＳ７９小細胞肺異種移植片を有するマウス（ｎ＝３～５）のいくつかのコホートに対して体内分布研究を実施した。０．９％生理食塩水１００μＬ中Ｚｒ－８９ ｍＡｂ（１０～２０μＣｉ、１～２μｇ）を外側静脈に静脈内投与した。追加的な無標識ｍＡｂ（１０～５０μｇ）をトレーサーと同時注射した。マウスのコホートにおいて２５０μｇの過剰な無標識ｍＡｂを用いた遮断研究を実施してｓＬｅａに対する抗体の特異性に取り組んだ。各時点（ｔ＝２４、４８、１２０ｈ ｐ．ｉ．）の後、マウスをＣＯ２を用いた窒息によって安楽死させた。すぐに血液を心臓穿刺によって採取すると同時に、腫瘍を選択された器官と一緒に回収した。各組織の湿重量を測定し、Ｗｉｚａｒｄ２ ２４８０ ｇａｍｍａ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、各器官に結合した放射活性を計数した。１グラム当たりの％注射用量として表されるトレーサー取り込みの百分率（％ＩＤ／ｇ）を、計数時間に対して減衰補正した実際に注射した用量当たりの器官の重量当たりの組織に結合した活性として算出した。
小動物ｉｍｍｕｎｏ－ＰＥＴ
ｍｉｃｒｏＰＥＴ Ｆｏｃｕｓ １２０またはＲ４ｓｃａｎｎｅｒ（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて画像処理実験を行った。マウス（ｎ＝３～５）に、０．９％生理食塩水製剤１００～２００μＬ中Ｚｒ－８９標識抗体（２００～３００μＣｉ、１５～２５μｇ）を外側尾静脈注射によって投与した。注射後２４～９６時間の時点で酸素中１．５～２．０％イソフルオラン（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて麻酔しながらＰＥＴ全身取得をマウスに記録した。ＡＳＩＰｒｏ ＶＭ（商標）ソフトウェア（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して画像を解析した。関心領域（ＲＯＩ）を引き出し、時間に対してプロットした。
免疫組織化学的検査
２０×モル過剰のスルホ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ、ｃａｔ番号２１３２７）を室温で３０分インキュベートすることによってビオチン化５Ｂ１を調製した。Ｚｅｂｒａ（商標）ｄｅｓａｌｔ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ、ｃａｔ番号８９８８９）を製造者の説明書に従って用いて遊離のビオチンを除去した。抗体の緩衝液を、０．０１％アジ化ナトリウムを１．１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するＰＢＳと交換した。ＤＭＳ７９細胞への結合をＦＡＣＳによって確認し、それは親５Ｂ１抗体に匹敵するものであった。
陽性対照としてＣｏｌｏ２０５細胞、および陰性対照としてＳＫ－ＭＥＬ２８細胞を使用して予備免疫組織化学的染色条件を決定した。細胞ペレットを調製し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した。スライドを、ＰＢＳ中１０％（ｖ／ｖ）正常ヒト血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ；ｃａｔ番号００９－０００－１２１）中に希釈したビオチン化５Ｂ１と一緒にインキュベートした。染色方法として標準のストレプトアビジン－ビオチン免疫ペルオキシダーゼ法およびＤＡＢ検出システムを用いてＶｅｎｔａｎａ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ ｐｌａｔｆｏｒｍ－Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）によって染色を実施した。ｈｅａｔ ａｎｄ Ｖｅｎｔａｎａ’ｓ ＣＣ１ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して抗原の回収を行った。パイロット研究においてＳｉｇｎｅｔ（Ｃｏｖａｎｃｅ）からのＣＡ１９．９マウスモノクローナル（クローン１１６－ＮＳ－１９－９）により匹敵する結果がもたらされた。Ｃｏｌｏ２０５細胞は１０μｇ／ｍｌで使用したビオチン化５Ｂ１に対して強力に陽性であるが、ＳＫＭＥＬ２８細胞は完全に陰性であった。Ｈｉｓｔｏ－Ａｒｒａｙ（商標）ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙはＩｍｇｅｎｅｘ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。腫瘍生検コアならびにいくつかの正常な組織コアを含有する以下のスライドを使用した：ＩＭＨ－３２７（Ｃｏｍｍｏｎ Ｃａｎｃｅｒｓ、５９試料）、ＩＭＨ－３５９（結腸直腸の：がん－転移－正常；５９試料）、およびＩＭＨ－３２４（卵巣への転移がん）。ＩＭＨ－３２７には膵腫瘍組織コアが存在していた。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｓＬｅａ血清中濃度
Ｃｏｌｏ２０５、ＢｘＰＣ３およびＤＭＳ７９の異種移植片を有するマウスをｓＬｅａ抗原アッセイのために失血させた。腫瘍を有さないマウスの群が対照としての機能を果たした。ＳＴ ＡＩＡ－ＰＡＣＫ ＣＡ１９．９ ｋｉｔ（Ｃａｔ番号０２５２７１、ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を使用してマウスの血清中のｓＬｅａレベルを測定した。このアッセイの原理は、２部位免疫酵素測定アッセイに基づく。分析を製造者の取扱説明書に記載の通り実施した。イムノアッセイプレートの光学濃度をＴＯＳＯＨ ＡＩＡ２０００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）によって測定した。
統計解析
別段の指定のない限りデータ値は平均±ＳＤとして表した。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ バージョン５．０３ソフトウェアを使用し、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後にダネット検定を使用して実施した。Ｐ値＜０．０５が統計的に有意であるとみなされる。
結果
選択された悪性組織および正常組織のマイクロアレイを染色することによって５Ｂ１の結合特異性をプローブした。５Ｂ１反応性は悪性腫瘍およびｓＬｅａを過剰発現することが予め分かっている特定の場合の正常組織に制限された（図１９；表９）。大部分の正常組織は完全に陰性であった（表９）。対照的に、結腸腺癌の２１／３４（６２％）、卵巣への腺癌転移の３３／５７（５８％）、および種々の病期の（表１０）膵管がんの７／９（６６％）において強力な陽性染色が見いだされた。図１９に示されている通り、典型的な反応性は広がった細胞質染色であり、いくつかの腫瘍細胞では細胞膜の別個の染色が明白に示された。さらに、いくつかの卵巣印環細胞がん、ならびに肺および乳房のいくつかのがんも強力に陽性であることが見いだされた。対照的に、前立腺がん試料では４／４３のみが陽性であり、ＧＩＳＴ症例では０／５１が陽性であった（データは示していない）。
Figure 0007299405000009
Figure 0007299405000010
５Ｂ１免疫染色のｓＬｅａを発現しているがん組織に対する特異性が高いことが、このｍＡｂをＰＥＴプローブとして使用することの基礎であった。５Ｂ１のデスフェリオキサミンのベンジル－イソチオシアネート類似体（ＤＦＯ－Ｂｚ－ＮＣＳ）を用いた修飾を４:１（キレート：ｍＡｂ）の比で行い、その後、生理食塩水を洗浄緩衝液として使用して遠心濾過によって精製した。ｐＨを７．０～７．２に調整した後、Ｚｒ－８９での簡易放射標識を室温で進行させた。８０％超の最適な放射標識収率を実現するためには、中性に近い狭いｐＨ範囲が必要である。遊離の結合していないＺｒ－８９をＰＤ１０脱塩カラムによって除去した。遠心濾過器（ＭＷＣＯ：１０ｋＤａ）を使用して産物の濃縮を行った。１２．１±１．１ｍＣｉ／ｍｇの比較的高い特異的活性が確立された。使用する前に９５％超の放射化学的純度を確実にした。免疫反応性アッセイにより、ｓＬｅａに対する活性の保持が示された（７２．４±１．１％、ｎ＝３）。３７℃におけるウシ血清アルブミン中での安定性は５日にわたって９５％超で維持された（データは示していない）。生理食塩水中では、早ければ２４時間で脱金属（ｄｅ－ｍｅｔａｌｌａｔｉｏｎ）が観察され（＞８５％複合体形成）、３７℃で１２０時間後に約７５％超の放射性金属が結合した。
ＢｘＰＣ３膵がん異種移植片を左後肢の皮下に埋め込んだ雌ＳＣＩＤマウスを使用して小動物ＰＥＴ画像処理および体内分布研究を行った。取得したＰＥＴ画像により、８９Ｚｒ－５Ｂ１による腫瘍関連ｓＬｅａの実質的な描写が確認された。図２０の最大値投影法（ＭＩＰ）から、ＢｘＰＣ３異種移植片（ｎ＝３）は静脈内投与した放射性トレーサーのすぐれた付着を示した。ＰＥＴ画像から腫瘍に対して引き出された関心領域（ＲＯＩ）は、５．０±０．４％ＩＤ／ｇ（２時間）、１６．２±２．５％ＩＤ／ｇ（２４時間）、２３．８±４．７％ＩＤ／ｇ（４８時間）、３６．８±６．１％ＩＤ／ｇ（９６時間）および４９．５±７．７％ＩＤ／ｇ（１２０時間）の取り込みを示した。血液プールおよび正常組織の結合活性は注射後２４時間で消えると思われた。体内分布実験からの結果はＰＥＴデータと一致する。２４時間の時点で８９Ｚｒ－５Ｂ１の高い腫瘍局在化（８４．７±１２．３％ＩＤ／ｇ、ｎ＝４）が観察され、さらに注射後１２０時間で取り込みの増加が示された（１１４．１±２３．１％ＩＤ／ｇ、ｎ＝４）（図２１）。腫瘍への取り込みは重量が少ないことに起因して１００％を超えた（６２．４±０．０３ｍｇ）。注射後２４時間の時点での％ＩＤは、同様の時点での非特異的ＩｇＧのものよりも１０倍高いことが見いだされた（図２１挿入図）。注射後２４時間の時点での２５０μｇの放射標識していない５Ｂ１による競合阻害により、取り込みの特異性を規定するトレーサー蓄積が遮断された。８９Ｚｒ－５Ｂ１の正常な膵臓および回収された正常組織の残りへの最小の結合が観察され、これにより、全ての時点において高い腫瘍対組織対比がもたらされた。
上記の結果に従って、同所性ＢｘＰＣ３膵臓腫瘍モデルにおいて８９Ｚｒ－５Ｂ１をアッセイした。同所性モデルは臨床的に意義があり、ＰＥＴプローブの有効性の臨床的に許容され得る試験をもたらす。膵臓への接種後、腫瘍の成長を週１回、生物発光による光学的画像処理によってモニタリングした。腫瘍が触知できたらＰＥＴ画像処理実験を行った。ＦＤＧ－ＰＥＴと８９Ｚｒ－５Ｂ１の間でプローブ腫瘍描写性の比較を行った（図２５）。ＰＥＴとタンデムなコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）により、解剖学的関心領域の可視化の増強がもたらされた。
他のｓＬｅａ発現腺癌におけるＰＥＴプローブとして８９Ｚｒ－５Ｂ１を評価するために、肺がんモデルおよび結腸がんモデルにおいて８９Ｚｒ－５Ｂ１をアッセイした。雌ＳＣＩＤマウスの右後肢に皮下注射したＤＭＳ７９小細胞肺がん細胞およびＣｏｌｏ２０５－ｌｕｃ結腸がん細胞を使用して小動物実験を行った。２００～３００μＣｉ（１６～２５μｇ）の静脈内注射後２４～１２０時間の時点でＰＥＴ ＭＩＰ画像を取得した。早ければ注射後２４時間の時点で、バックグラウンドに対した優れたシグナルを伴う３８．１５±２．１２％ＩＤ／ｇの異種ＤＭＳ７９腫瘍への取り込みが実証された（図２２Ａ）。注射後４８時間の時点でトレーサー腫瘍蓄積が増加し（４４．６０±６．４７％ＩＤ／ｇ）、注射後１２０時間の時点で保持されていた（４１．９７±１２．２３％ＩＤ／ｇ）。非特異的結合した８９Ｚｒ－５Ｂ１は正常組織から急速に消え、注射後４８時間の時点でバックグラウンド取り込みは最小であったか取り込みがなかった。さらに、図２２Ｂに示されている通り、Ｃｏｌｏ２０５－ｌｕｃ異種移植片において注射後２４～１２０時間の時点で腫瘍描写が観察された。ＲＯＩは、腫瘍蓄積を示し、２、２４、４８、９６および１２０時間の時点でそれぞれ１０．５±０．７６、２３．５±２．７、２４．８±４．０、１８．４±４．７、１６．５±２．３％ＩＤ／ｇであった。ＰＥＴ画像から引き出された関心領域に示されている通り、肝臓蓄積の観察可能な増加が経時的に生じ、その結果として腫瘍への取り込みが減少した（図２２Ｃ）。体内分布研究から生じたデータは、観察されたＰＥＴ結果とよく相関する（データは示していない）。
腫瘍が進行するに従ったマウス血清中のｓＬｅａレベルを数量化した。Ｃｏｌｏ２０５異種移植片を有するＳＣＩＤマウス、ＤＭＳ７９異種移植片を有するＳＣＩＤマウスおよびＢｘＰＣ３異種移植片を有するＳＣＩＤマウス、それと共に対照としての機能を果たす、腫瘍を有さない群の全採血を実施した。ｓＬｅａ値は、Ｃｏｌｏ２０５を用いたチャレンジを行ったマウスにおいて膵臓ＢｘＰＣ３を埋め込んだマウスおよびＤＳＭ７９を埋め込んだマウスと比較して高レベルのｓＬｅａを示した（表１１）。
Figure 0007299405000011
これらの結果により、放射標識抗ｓＬｅａ抗体（８９Ｚｒ－５Ｂ１）が、膵臓腺癌および他のｓＬｅａ陽性腺癌の検出および診断に対して特異的であることが実証される。８９Ｚｒ－５Ｂ１は、高い特異的活性および免疫反応性の保持と共に、優れた収率および純度で作製された。皮下同所性膵臓腫瘍モデルおよび転移性膵臓腫瘍モデルにおける８９Ｚｒ－５Ｂ１の評価により、優れた腫瘍描写および診断がもたらされた。結腸腫瘍を有する小動物および小細胞肺腫瘍を有する小動物におけるこの放射性トレーサーの前臨床的評価により、このトレーサーのｓＬｅａを発現している悪性腫瘍に対する普遍的な有用性が実証された。
（実施例ＩＩＩ）
抗ｓＬｅａダイアボディは種々のがん細胞系統に結合する
本明細書に記載の５Ｂ１および７Ｅ３クローン単離体のＶＨおよびＶＬドメインを使用して２種のダイアボディを生成し、それぞれ５Ｂ１ＣｙｓＤｂおよび７Ｅ３ＣｙｓＤｂと名付けた（図９および１０）。どちらのダイアボディもＶＬドメインとＶＨドメインの間に５つのアミノ酸リンカー領域を含有した。精製および検出のために利用したＣ末端上のポリヒスチジンタグも両方のダイアボディに含めた。
５Ｂ１ＣｙｓＤｂおよび７Ｅ３ＣｙｓＤｂの３種のがん細胞系統：（１）ＤＭＳ－７９細胞、小細胞肺がん浮遊細胞系統；（２）Ｃａｐａｎ－２細胞、膵臓腺癌細胞；および（３）ＢｘＰＣ３細胞、膵がん細胞への結合を、１０μｇ／ｍｌの５Ｂ１ＣｙｓＤｂまたは７Ｅ３ＣｙｓＤｂをそれぞれ伴う０．２ｍｌ中２５万個の細胞をインキュベートすることによってアッセイした。細胞とダイアボディの組合せをＰＢＳ／２％ＦＢＳ中、氷上で４０分インキュベートした。
洗浄後、細胞を、１:１０００希釈したＡＬＥＸＡ－４８８標識抗Ｈｉｓ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ番号Ａ２１２１５）０．２ｍｌと一緒に４０分インキュベートした。２回目の洗浄後、Ｇｕａｖａフローサイトメーターを用いて細胞を分析した。５Ｂ１ＣｙｓＤｂおよび７Ｅ３ＣｙｓＤｂの両方でＤＭＳ－７９、Ｃａｐａｎ－２およびＢｘＰＣ３細胞への有意な結合が実証された（表１２）。
Figure 0007299405000012
（実施例ＩＶ）
５Ｂ１およびタキソールの投与は、腫瘍の成長を阻害する
抗ｓＬｅａ抗体（５Ｂ１）と化学療法剤であるタキソール（パクリタキセル）を同時投与することの抗腫瘍活性を膵がんおよび小細胞肺がんの異種移植モデルにおいて評価した。本明細書で前に記載した通り、ＢｘＰｃ３細胞（膵腫瘍細胞）１００万個またはＤＭＳ－７９細胞（小細胞肺がん細胞）５００万個を６週齢の雌ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスの後側腹部に注射した（０日目；Ｎ＝５）。ＤＭＳ７９腫瘍を平均腫瘍サイズが１９３±６４ｍｍ３になるまで２１日間成長させた。ヒトＩｇＧまたは５Ｂ１（０．５または１ｍｇ）を週２回（２１日目に開始）腹腔内に与え、タキソール（０．２ｍｇ／投薬）を２３日目、３０日目、３７日目および４４日目に静脈内投与した。ＤＭＳ－７９異種移植モデルでは、５Ｂ１抗体とタキソールを同時投与することにより、対照ヒトＩｇＧまたは５Ｂ１抗体とタキソールの個別投与と比較して、腫瘍の成長が有意に制限され、腫瘍の退縮がもたらされた（図２３）。
ＢｘＰｃ３異種移植モデルでは、腫瘍を１４日間成長させ、その時点で平均１２６±３０ｍｍ３に達した。タキソールを１４日目、２１日目、２８日目および３４日目に（週に１回）静脈内投与し、５Ｂ１を１４日目から開始して週２回与えた。５Ｂ１抗体とタキソールを同時投与することにより、対照または５Ｂ１抗体とタキソールの個別投与と比較して腫瘍の成長が有意に制限された（図２４）。これらの結果により、膵がんおよび小細胞肺がんに対する腫瘍の成長の予防および／または腫瘍サイズの縮小における抗ｓＬｅａ抗体と化学療法剤の相乗効果が実証される。
本出願全体を通して種々の刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示は、本発明が関する技術分野の現状をより詳細に説明するためにそれらの全体がこれによって参照により本出願に組み込まれる。本発明は上に提供した実施例を参照して説明されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく種々の改変を行うことができることが理解されるべきである。
（項目１）
抗体重鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記抗体重鎖またはその機能性断片が、配列番号２の残基２０～１４２、配列番号６の残基２０～１４２、配列番号１０の残基２０～１４２、および配列番号１４の残基２０～１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２）
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号１の残基５８～４２６、配列番号５の残基５８～４２６、配列番号９の残基５８～４２６および配列番号１３の残基５８～４３５からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、項目１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目３）
抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記抗体軽鎖またはその機能性断片が、配列番号４の残基２０～１３０、配列番号８の残基２０～１２９、配列番号１２の残基２０～１３０、および配列番号１６の残基２３～１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む、抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
（項目４）
前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号３の残基５８～３９０、配列番号７の残基５８～３８７、配列番号１１の残基５８～３９０および配列番号１５の残基６７～３９０からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、項目３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目５）
シアリル－Ｌｅｗｉｓａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、前記抗体またはその機能性断片が、可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインが、配列番号２の残基２０～１４２、配列番号６の残基２０～１４２、配列番号１０の残基２０～１４２、および配列番号１４の残基２０～１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能性断片。
（項目６）
シアリル－Ｌｅｗｉｓａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、前記抗体またはその機能性断片が、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＬドメインが、配列番号４の残基２０～１３０、配列番号８の残基２０～１２９、配列番号１２の残基２０～１３０、および配列番号１６の残基２３～１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその機能性断片。
（項目７）
シアリル－Ｌｅｗｉｓａに結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、前記抗体またはその機能性断片が、可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインおよび前記ＶＬドメインが、それぞれ、配列番号２の残基２０～１４２および配列番号４の残基２０～１３０；配列番号６の残基２０～１４２および配列番号８の残基２０～１２９；配列番号１０の残基２０～１４２および配列番号１２の残基２０～１３０；ならびに配列番号１４の残基２０～１４５および配列番号１６の残基２３～１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその機能性断片。
（項目８）
前記抗体がヒト抗体である、項目５から７までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目９）
前記抗体機能性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディおよび単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）からなる群から選択される、項目５から７までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１０）
前記抗体機能性断片がダイアボディである、項目９に記載の抗体またはその機能性断片。
（項目１１）
前記ダイアボディが、配列番号１８または２０のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の抗体または機能性断片。
（項目１２）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目５から７までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１３）
前記抗体がＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプである、項目５から７までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１４）
前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ１サブクラスである、項目１３に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１５）
診断剤、検出可能剤または治療剤とコンジュゲートしているかまたは組換えによって融合している、項目５から７までのいずれか一項に記載の単離された抗体または機能性断片を含むコンジュゲート。
（項目１６）
検出可能剤を含む、項目１５に記載のコンジュゲート。
（項目１７）
前記検出可能剤がジルコニウム（８９Ｚｒ）である、項目１６に記載のコンジュゲート。
（項目１８）
項目５から７までのいずれか一項に記載の抗体または機能性断片および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
（項目１９）
疾患を処置または予防するための方法であって、疾患を処置または予防することを必要とする被験体に項目１８に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
（項目２０）
前記疾患ががんまたは腫瘍形成であり、前記がんまたは前記腫瘍の細胞がｓＬｅａを発現する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記がんまたは腫瘍が、胃腸管の腫瘍、結腸がん、結腸直腸腺癌、転移性結腸がん、結腸直腸がん、膵がん、膵臓腺癌、肺小細胞癌、膀胱腺癌、卵巣印環細胞がん、卵巣がん、転移性癌、胃の腺癌、食道の腺癌、咽喉の腺癌、尿生殖路の腺癌、および乳房の腺癌からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
第２の治療剤を同時にまたは逐次投与するステップをさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記第２の治療剤が化学療法剤または免疫療法剤である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
被験体における腫瘍を検出するための方法であって、被験体における腫瘍を検出することを必要とする被験体に項目１６に記載のコンジュゲートの有効量を投与するステップを含む方法。

Claims (12)

  1. シアリル－Ｌｅｗｉｓａに結合し、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を誘導する単離された抗体であって、前記抗体が、可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインおよび前記ＶＬドメインがそれぞれ、配列番号２の残基２０～１４２および配列番号４の残基２０～１３０のアミノ酸配列を含む、単離された抗体。
  2. 抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドおよび抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記抗体重鎖が、配列番号２の残基２０～１４２のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含み、前記抗体軽鎖が、配列番号４の残基２０～１３０のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、前記抗体重鎖および前記抗体軽鎖を含む抗体が、シアリル－Ｌｅｗｉｓａに結合し、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を誘導する、単離されたポリヌクレオチド。
  3. 前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号１の残基５８～４２６の核酸配列によりコードされる、請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  4. 前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号３の残基５８～３９０の核酸配列によりコードされる、請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  5. 前記抗体がヒト抗体である、請求項１に記載の単離された抗体。
  6. 前記抗体がＩｇＧまたはＩｇＭ抗体である、請求項５に記載の単離された抗体。
  7. 前記抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項５に記載の単離された抗体。
  8. 請求項１または７に記載の抗体および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
  9. 疾患の処置または予防における使用のための、請求項１または７に記載の抗体および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物であって、前記使用が、疾患の処置または予防を必要とする被験体に前記医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、医薬組成物。
  10. 前記疾患ががんまたは腫瘍形成であり、前記がんまたは前記腫瘍の細胞がｓＬｅａを発現するか、あるいは、前記がんまたは腫瘍が、胃腸管の腫瘍、結腸がん、結腸直腸腺癌、転移性結腸がん、結腸直腸がん、膵がん、膵臓腺癌、膀胱腺癌、卵巣印環細胞がん、卵巣がん、転移性癌、胃の腺癌、食道の腺癌、咽喉の腺癌、尿生殖路の腺癌、および乳房の腺癌からなる群から選択される、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。
  11. 前記医薬組成物が第２の治療剤を同時にまたは逐次投与するために適合される、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。
  12. 前記第２の治療剤が化学療法剤または免疫療法剤である、請求項１１に記載の使用のための医薬組成物。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102553717B1 (ko) * 2013-08-26 2023-07-11 바이오엔테크 리서치 앤드 디벨롭먼트 인코포레이티드 시알릴-루이스 ａ에 대한 사람 항체 코드화 핵산
GB201515094D0 (en) 2015-08-25 2015-10-07 Univ Nottingham Sialyl-di-lewis a as expressed on glycoproteins but not glycolipids as a functional cancer target and antibodies thereto
RU2019102746A (ru) * 2016-07-14 2020-08-14 Биоарктик Аб Белок для транспорта в мозг
MA46851A (fr) 2016-11-18 2019-09-25 Astellas Pharma Inc NOUVEAU FRAGMENT Fab D'ANTICORPS ANTI-MUC1 HUMAIN
MA46952A (fr) 2016-12-01 2019-10-09 Regeneron Pharma Anticorps anti-pd-l1 radiomarqués pour imagerie immuno-pet
CN118557758A (zh) 2017-02-10 2024-08-30 瑞泽恩制药公司 用于免疫-pet成像的放射性标记的抗-lag3抗体
JP7264831B2 (ja) * 2017-06-15 2023-04-25 ディベロップメント センター フォー バイオテクノロジー 抗ｇｌｏｂｏ ｈ抗体を含有する抗体－薬物コンジュゲートおよびその使用
TWI795415B (zh) 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
JP7304846B2 (ja) 2017-07-24 2023-07-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｃｄ８抗体およびその使用
PT110526B (pt) 2018-01-26 2021-02-04 Univ Nova De Lisboa Anticorpo, fragmento funcional ou sonda do mesmo contra antigénios tumorais
KR102115236B1 (ko) * 2018-01-29 2020-05-27 (주)에스엠티바이오 췌장 또는 담관계암 치료를 위한 키메라 항원 수용체
CA3112382A1 (en) * 2018-09-10 2020-03-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for treating pancreatitis
SG11202103670XA (en) 2018-10-10 2021-05-28 Astellas Pharma Inc Pharmaceutical composition containing tagged site-antihuman antibody fab fragment complex
JP2022513372A (ja) * 2018-10-19 2022-02-07 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター シアリルルイスａを標的とするキメラ抗原受容体およびその使用
EP4065605A4 (en) * 2019-11-26 2023-07-12 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. ANTIBODIES AGAINST CARBOHYDRATE ANTIGENS
CN114605550B (zh) * 2020-12-08 2023-09-22 东莞市朋志生物科技有限公司 抗ca19-9的抗体、其应用和检测ca19-9的试剂盒
WO2022153298A1 (en) * 2021-01-12 2022-07-21 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to cancer glycosylation and uses thereof
US20240190991A1 (en) 2021-03-26 2024-06-13 BioNTech SE Combination therapy with an anti-ca19-9 antibody and folfirinox in the treatment of cancer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010538301A (ja) 2007-09-07 2010-12-09 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 臨床サンプルにおける分泌性のルイス抗原およびシアル化抗原のレベルの疾患リスクの予測指標としての使用

Family Cites Families (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA128362A (en) 1910-07-25 1910-09-27 Victor Herbert Gregory Furnace for drawing glass
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB2183662B (en) 1985-04-01 1989-01-25 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
AU4308689A (en) 1988-09-02 1990-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
EP0394827A1 (en) 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
DE69123241T2 (de) 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
ES2315612T3 (es) 1991-04-10 2009-04-01 The Scripps Research Institute Genotecas de receptores heterodimericos usando fagemidos.
WO1992022324A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US6271242B1 (en) 1992-02-10 2001-08-07 Bristol-Myers Squibb Co. Method for treating cancer using a tyrosine protein kinase inhibitor
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
JPH0630786A (ja) * 1992-07-14 1994-02-08 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd バイスペシフィック抗体
ATE361759T1 (de) 1993-07-15 2007-06-15 Cancer Res Campaign Tech Verbindungen die zur herstellung von protein- tyrosin-kinase-inhibitor-prodrogen verwendet werden können
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US5925376C1 (en) 1994-01-10 2001-03-20 Madalene C Y Heng Method for treating psoriasis using selected phosphorylase kinase inhibitor and additional compounds
ES2247204T3 (es) 1994-01-31 2006-03-01 Trustees Of Boston University Bancos de anticuerpos policlonales.
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
HUT76369A (en) 1994-07-29 1997-08-28 Smithkline Beecham Corp Novel soluble protein compounds
US5911995A (en) 1994-08-19 1999-06-15 Regents Of The University Of Minnesota EGF-genistein conjugates for the treatment of cancer
US5587459A (en) 1994-08-19 1996-12-24 Regents Of The University Of Minnesota Immunoconjugates comprising tyrosine kinase inhibitors
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
EP0805628B1 (en) 1995-01-17 2003-05-02 Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
GB9501567D0 (en) 1995-01-26 1995-03-15 Pharmacia Spa Hydrosoluble 3-arylidene-2-oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
GB9515975D0 (en) 1995-08-04 1995-10-04 Zeneca Ltd Chemical compounds
US5863904A (en) 1995-09-26 1999-01-26 The University Of Michigan Methods for treating cancers and restenosis with P21
GB9601081D0 (en) 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
US6127366A (en) 1995-11-22 2000-10-03 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
DE69620445T2 (de) 1995-12-08 2002-12-12 Janssen Pharmaceutica N.V., Beerse (imidazol-5-yl)methyl-2-chinolinoderivate als farnesyl protein transferase inhibitoren
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5958769A (en) 1996-01-18 1999-09-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for mediating cell cycle progression
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
AU704087B2 (en) 1996-01-30 1999-04-15 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
AU703203B2 (en) 1996-01-30 1999-03-18 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
DE69729283T2 (de) 1996-03-20 2005-05-25 Immunomedics, Inc. GLYKOSYLIERTE IgG ANTIKÖRPER
US5891889A (en) 1996-04-03 1999-04-06 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US5883105A (en) 1996-04-03 1999-03-16 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6063930A (en) 1996-04-03 2000-05-16 Merck & Co., Inc. Substituted imidazole compounds useful as farnesyl-protein transferase inhibitors
US6080870A (en) 1996-04-03 2000-06-27 Merck & Co., Inc. Biaryl substituted imidazole compounds useful as farnesyl-protein transferase inhibitors
US6300501B1 (en) 1996-05-22 2001-10-09 Warner-Lambert Company Histidine-(N-benzyl glycinamide) inhibitors of protein farnesyl transferase
US5648239A (en) 1996-06-21 1997-07-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human camp-dependent protein kinase inhibitor homolog
JPH11512750A (ja) 1996-06-27 1999-11-02 ファイザー インク． ２―（２―オキソ―エチリデン）―イミダゾリジン―４―オンの誘導体およびファルネシル蛋白質トランスフェラーゼ阻害物質としてのそれらの使用法
DE69737631T3 (de) 1996-08-12 2011-08-18 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp. MEDIKAMENTE ENTHALTEND Rho-KINASE INHIBITOREN
US5945429A (en) 1996-09-13 1999-08-31 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6040305A (en) 1996-09-13 2000-03-21 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6030982A (en) 1996-09-13 2000-02-29 Schering Corporationm Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US5939439A (en) 1996-12-30 1999-08-17 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6013662A (en) 1996-12-30 2000-01-11 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Farnesyl transferase inhibitors, their preparation, the pharmaceutical compositions which contain them and their use in the preparation of medicaments
US6093737A (en) 1996-12-30 2000-07-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
AU5772698A (en) 1997-01-29 1998-08-18 Zeneca Limited Inhibitors of farnesyl protein transferase
ZA981080B (en) 1997-02-11 1998-08-12 Warner Lambert Co Bicyclic inhibitors of protein farnesyl transferase
CA2280794A1 (en) 1997-02-20 1998-08-27 The Regents Of The University Of California Plasmon resonant particles, methods and apparatus
WO1998039027A2 (en) 1997-03-05 1998-09-11 John Wayne Cancer Institute Sialyl lewis antigens as targets for immunotherapy
TW591030B (en) 1997-03-10 2004-06-11 Janssen Pharmaceutica Nv Farnesyl transferase inhibiting 1,8-annelated quinolinone derivatives substituted with N- or C-linked imidazoles
US6225322B1 (en) 1997-06-17 2001-05-01 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6211193B1 (en) 1997-06-17 2001-04-03 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6159984A (en) 1997-06-17 2000-12-12 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
US6051582A (en) 1997-06-17 2000-04-18 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6239140B1 (en) 1997-06-17 2001-05-29 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6228865B1 (en) 1997-06-17 2001-05-08 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
HUP0003194A3 (en) 1997-08-15 2003-03-28 Cephalon Inc West Chester Use of tyrosine kinase inhibitor in synergic pharmaceutical composition treating prostate cancer
US6103723A (en) 1997-10-17 2000-08-15 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6342765B1 (en) 1997-10-22 2002-01-29 Astrazeneca Uk Limited Imidazole derivatives and their use as farnesyl protein transferase inhibitors
EP1025089A1 (en) 1997-10-22 2000-08-09 Zeneca Limited Imidazole derivatives and their use as farnesyl protein transferase inhibitors
US6124465A (en) 1997-11-25 2000-09-26 Rhone-Poulenc S.A. Farnesyl transferase inhibitors, their preparation, the pharmaceutical compositions which contain them and their use in the preparation of medicaments
HUP0004238A3 (en) 1997-11-28 2001-07-30 Lg Chemical Ltd Imidazole derivatives having an inhibitory activity for farnesyl transferase, process for preparation thereof and pharmaceutical compositions containing them
US6054466A (en) 1997-12-04 2000-04-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6242196B1 (en) 1997-12-11 2001-06-05 Dana-Farber Cancer Institute Methods and pharmaceutical compositions for inhibiting tumor cell growth
US6335156B1 (en) 1997-12-18 2002-01-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine 14-3-3σ arrests the cell cycle
CN1158277C (zh) 1998-02-02 2004-07-21 Lg化学株式会社 具有哌啶结构的法尼转移酶抑制剂及其制备方法
BR9909961A (pt) 1998-04-27 2000-12-26 Warner Lambert Co Derivados de cadeia lateral alquila e alquenila funcionalizados de glicinamidas como inibidores de farnesil transferase
BR9911869A (pt) 1998-07-06 2001-03-27 Janssen Pharmaceutica Nv Inibidores da transferase da proteìna farnesil para o tratamento das artropatias
US6034053A (en) 1998-07-13 2000-03-07 Wayne Hughes Institute EGF-isoflavone conjugates for the prevention of restenosis
US6787638B1 (en) * 1998-12-02 2004-09-07 Applied Molecular Evolution, Inc. Tumor specific human monoclonal antibodies and methods of use
US6362188B1 (en) 1998-12-18 2002-03-26 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
US6372747B1 (en) 1998-12-18 2002-04-16 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
FR2787327B1 (fr) 1998-12-21 2003-01-17 Aventis Pharma Sa Compositions contenant des inhibiteurs de farnesyle transferase
US6432959B1 (en) 1998-12-23 2002-08-13 Schering Corporation Inhibitors of farnesyl-protein transferase
EP1140938B1 (en) 1999-01-11 2003-08-27 Princeton University High affinity inhibitors for target validation and uses thereof
US6399633B1 (en) 1999-02-01 2002-06-04 Aventis Pharmaceuticals Inc. Use of 4-H-1-benzopryan-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation
US6245759B1 (en) 1999-03-11 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6143766A (en) 1999-04-16 2000-11-07 Warner-Lambert Company Benzopyranone and quinolone inhibitors of ras farnesyl transferase
US6458935B1 (en) 1999-06-23 2002-10-01 Merck & Co., Inc. Radiolabeled farnesyl-protein transferase inhibitors
US6403581B1 (en) 2000-01-19 2002-06-11 American Cyanamid Company Method of inhibition of farnesyl-protein transferase using substituted benz (cd) indol-2-imine and-amine derivatives
CA2480504A1 (en) 2002-04-01 2003-10-16 Evelina Angov Method of designing synthetic nucleic acid sequences for optimal protein expression in a host cell
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
PT3248613T (pt) 2005-07-18 2022-03-16 Seagen Inc Conjugados de ligante de fármaco e beta-glucuronida
EA015925B1 (ru) 2006-06-29 2011-12-30 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Способ получения полипептидов
EP2975057A1 (en) * 2006-07-10 2016-01-20 Fujita Health University Novel anti-cd73 antibody
WO2009026274A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
WO2010009124A2 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Genentech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
CA2735900A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune, Llc Antibodies directed to dll4 and uses thereof
EP2396034A4 (en) * 2009-02-10 2012-11-21 Shenogen Pharma Group Ltd ANTIBODIES AND METHODS FOR TREATING DISEASES ASSOCIATED WITH A STROGEN RECEPTOR
KR20130048242A (ko) 2010-07-22 2013-05-09 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 항-종양 항원 항체 및 이용 방법
CA2867700A1 (en) * 2012-03-23 2013-09-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Potentiating antibody-induced complement-mediated cytotoxicity via pi3k inhibition
BR112015019341A2 (pt) * 2013-02-13 2017-08-22 Lab Francais Du Fractionnement Anticorpo anti-tnf-alfa, composição que compreende o anticorpo, método para produzir uma população de anticorpos, células epiteliais da glândula mamária, mamífero não humano transgênico, e, composição de anticorpo anti-tnf monoclonal
KR102553717B1 (ko) * 2013-08-26 2023-07-11 바이오엔테크 리서치 앤드 디벨롭먼트 인코포레이티드 시알릴-루이스 ａ에 대한 사람 항체 코드화 핵산
EP3694889A1 (en) * 2017-10-13 2020-08-19 Boehringer Ingelheim International GmbH Human antibodies to thomsen-nouvelle (tn) antigen
JP2022513372A (ja) * 2018-10-19 2022-02-07 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター シアリルルイスａを標的とするキメラ抗原受容体およびその使用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010538301A (ja) 2007-09-07 2010-12-09 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 臨床サンプルにおける分泌性のルイス抗原およびシアル化抗原のレベルの疾患リスクの予測指標としての使用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Clinical Cancer Research，2011年，Vol.17, No.5，pp.1024-1032
Current Opinion in Chemical Biology，2009年，Vol.13, No.3，pp.235-244
Isotope News，2013年07月，No.711，pp.2-7
PET Journal，2011年，Vol.13，pp.20-22

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016534735A (ja) 2016-11-10
KR20210079426A (ko) 2021-06-29
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