CN112695039A - 编码抗唾液酸化路易斯a抗原的人抗体的核酸 - Google Patents

编码抗唾液酸化路易斯a抗原的人抗体的核酸 Download PDF

Info

Publication number
CN112695039A
CN112695039A CN202011316903.2A CN202011316903A CN112695039A CN 112695039 A CN112695039 A CN 112695039A CN 202011316903 A CN202011316903 A CN 202011316903A CN 112695039 A CN112695039 A CN 112695039A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
residues
functional fragment
sle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011316903.2A
Other languages
English (en)
Inventor
泽田律子
孙淑曼
沃尔夫冈·肖尔兹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotechnology R&d Co
Original Assignee
Biotechnology R&d Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotechnology R&d Co filed Critical Biotechnology R&d Co
Publication of CN112695039A publication Critical patent/CN112695039A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1057—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from liver or pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本申请涉及编码抗唾液酸化路易斯a抗原的人抗体的核酸。本发明提供了用于产生抗唾液酸化路易斯a抗原(sLea)的抗体或其功能性片段的组合物。本发明所述的组合物包括编码结合至sLea的重链和/或轻链可变域的多核苷酸。本发明还提供了治疗或预防疾病，如癌症或肿瘤形成的分离的抗体或其功能性片段和方法，其中所述抗体或功能性片段包括具有本文所提供的氨基酸序列的重链可变域和轻链可变域。本发明还提供了与诊断试剂、可检测试剂或治疗剂缀合或重组融合的抗体或其功能性片段的缀合物，和治疗、预防或诊断对其有需要的受试者中疾病的方法。

Description

编码抗唾液酸化路易斯a抗原的人抗体的核酸
本申请是申请号为201480057851.8的中国专利申请的分案申请，原申请是2014年08月26日提交的PCT国际申请PCT/US2014/052631于2016年04月21日进入中国国家阶段的申请。
本专利申请主张2013年8月26日提交的美国临时专利申请序列号第61/870,137号的优先权益，该专利申请的全部内容作为参考并入本文。
本发明是在NIH的国家癌症学会(National Cancer Institute)授予的基金号CA-128362的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本申请涉及抗唾液酸化路易斯a抗原(Sialyl-Lewisa，sLea)的抗体。
背景技术
本发明总体上涉及抗唾液酸化路易斯a抗原(Sialyl-Lewisa，sLea)的抗体，并且更具体地，涉及编码抗-sLea抗体的多核苷酸和相应编码的抗体或其片段。
抗肿瘤特异性抗原的抗体的被动施用可以在癌症发展期间消除肿瘤细胞和早期转移。这种治疗还会对癌症复发具有显著影响。抗肿瘤特异性碳水化合物的抗体可以是这种癌症治疗中的有用候选物。例如，由用人类癌细胞免疫小鼠所产生的多种肿瘤限制性单克隆抗体已被证明是直接针对在细胞表面处作为糖脂或糖蛋白表达的糖抗原的。碳水化合物sLea已被证明在胃肠道的肿瘤上表达。还证明了sLea的表达影响人结肠癌和胰腺腺癌中的转移潜能并且与转移潜能提高有关。然而，碳水化合物的化学性质相当具有挑战性，且识别这些肿瘤特异性碳水化合物的抗体的临床开发还很缓慢。
胰腺癌是最具侵袭性的腺癌之一，并且常与预后不良相关。胰腺癌在癌症死亡的主要原因中排第四位。尽管对于不同癌的筛选已有进展，但是检测从胰腺产生的恶性病变的可靠性仍较差。已显示使用氟脱氧葡萄糖的正电子发射断层成象术(FDG-PET)对于胰癌进行检测和分级。然而，FDG-PET对从恶性肿瘤分化的胰腺炎不灵敏，并且在小型原发性损害(＜7mm)和肝转移(＜1em)的分级中仍有问题。用于监控胰腺导管腺癌(PDAC)患者状态的一种诊断筛选方法包括检测血清中循环sLea抗原水平的升高。循环sLea抗原＞37U/ml的患者表明癌症复发。然而，使用这些肿瘤特异性碳水化合物的替代诊断工具的发展还很缓慢。
因此，需要鉴别和产生特异性识别肿瘤特异性碳水化合物(如sLea)的抗体，以用于复发癌症的治疗和用于检测恶性病变和转移。本发明满足了该需要并提供了相关优势。
发明内容
根据本发明，本文提供了用于产生结合sLea的抗体或其功能性片段的组合物。所述组合物包含编码抗体或其功能性片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体包括具有本文所提供的氨基酸序列的重链(VH)可变域。本发明所述的分离的多核苷酸还可以包括本文所提供的核酸序列，其中所述核酸序列编码抗体或其功能性片段的VH域。
在本发明的另一种实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码抗体或其功能性片段，其中所述抗体包括具有本文所提供的氨基酸序列的轻链(VL)可变域。本发明所述的分离的多核苷酸还可以包括本文所提供的核酸序列，其中所述核酸序列编码抗体或其功能性片段的VL域。
本发明所述的组合物还包括分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体结合至sLea。在一些实施方式中，本发明提供了结合至sLea的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段包括具有本文所提供的氨基酸序列的VH域。
在一些实施方式中，本发明提供了结合至sLea的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段包括具有本文所提供的氨基酸序列的VL域。
在一些实施方式中，本发明提供了结合至sLea的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段包括VH域和VL域两者，其中所述VH域和VL域分别包括本文所提供的克隆分离物的各自VH和VL域的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供了具有与诊断试剂、可检测试剂或治疗剂缀合或重组融合的本文所提供的抗体或功能性片段的缀合物。在本发明的一些方面，包含可检测试剂的本发明的缀合物能够被用于在受试者中检测和/或诊断肿瘤形成的方法中。这些方法可以包括向对其有需要的受试者施用有效量的缀合物。
在一些实施方式中，本发明提供了具有本发明的一个或多个抗体或功能性片段和可药用载体的药物组合物。在一些方面，本发明还提供了通过施用治疗有效量的本发明的药物组合物用于在有需要的受试者中治疗或预防疾病的方法。在另一个方面，本发明提供了与本发明的抗体或功能性片段同时或依次施用第二治疗剂。
附图说明
图1示出了克隆5B1的可变重链(VH)域的核苷酸序列和编码的氨基酸序列以及能够用于重组表达的前导序列。图的上部示出了SEQ ID NO：1的核苷酸序列和SEQ ID NO：2的氨基酸序列之间的比对。还标明了三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。
图2示出了克隆5B1的可变轻链(VL)域的核苷酸序列和编码的氨基酸序列以及能够用于重组表达的前导序列。图的上部示出了SEQ ID NO：3的核苷酸序列和SEQ ID NO：4的氨基酸序列之间的比对。还标明了三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。
图3示出了克隆9H3的可变重链(VH)域的核苷酸序列和编码的氨基酸序列以及能够用于重组表达的前导序列。图的上部示出了SEQ ID NO：5的核苷酸序列和SEQ ID NO：6的氨基酸序列之间的比对。还标明了三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。
图4示出了克隆9H3的可变轻链(VL)域的核苷酸序列和编码的氨基酸序列以及能够用于重组表达的前导序列。图的上部示出了SEQ ID NO：7的核苷酸序列和SEQ ID NO：8的氨基酸序列之间的比对。还标明了三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。
图5示出了克隆5H11的可变重链(VH)域的核苷酸序列和编码的氨基酸序列以及能够用于重组表达的前导序列。图的上部示出了SEQ ID NO：9的核苷酸序列和SEQ ID NO：10的氨基酸序列之间的比对。还标明了三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。
图6示出了克隆5H11的可变轻链(VL)域的核苷酸序列和编码的氨基酸序列以及能够用于重组表达的前导序列。图的上部示出了SEQ ID NO：11的核苷酸序列和SEQ ID NO：12的氨基酸序列之间的比对。还标明了三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。
图7示出了克隆7E3的可变重链(VH)域的核苷酸序列和编码的氨基酸序列以及能够用于重组表达的前导序列。图的上部示出了SEQ ID NO：13的核苷酸序列和SEQ ID NO：14的氨基酸序列之间的比对。还标明了三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。
图8示出了克隆7E3的可变轻链(VL)域的核苷酸序列和编码的氨基酸序列以及能够用于重组表达的前导序列。图的上部示出了SEQ ID NO：15的核苷酸序列和SEQ ID NO：16的氨基酸序列之间的比对。还标明了三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。
图9示出了表示为5B1CysDb的双链抗体的核苷酸序列和编码的氨基酸序列，其具有克隆5B1的可变重链(VH)域和可变轻链(VL)域两者的CDR1、CDR2和CDR2。图的上部示出了SEQ ID NO：17的核苷酸序列和SEQ ID NO：18的氨基酸序列之间的比对。还以加粗和下划线文本标明了VH和VL域的三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。还以斜体和下划线文本标明了具有增加的氨基酸的接头序列和多聚组氨酸标签(Poly His-标签)。
图10示出了表示为7E3CysDb的双链抗体的核苷酸序列和编码的氨基酸序列，其具有克隆7E3的可变重链(VH)和可变轻链(VL)域两者的CDR1、CDR2和CDR2。图的上部示出了SEQ ID NO：19的核苷酸序列和SEQ ID NO：20的氨基酸序列之间的比对。还以加粗和下划线文本标明了VH和VL域的三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。还以斜体和下划线文本标明了具有增加的氨基酸的接头序列和多聚组氨酸标签(Poly His-标签)。
图11，部分A-E，示出了通过流式细胞术分析的人抗sLea抗体与肿瘤细胞的结合。部分A示出了用重组(r)5B1、9H3、5H11和7E3抗体染色的DMS-79细胞。如实施例I所述，部分B-F分别示出了用1-2μg/mL r5B1或r7E3加IgG或IgM-特异性二抗染色的HT29、BxPC3、SW626、SK-MEL28和Colo205-luc细胞。
图12，部分A和B，示出了如针对DMS-79细胞所测量的，在存在人补体(Hu C′)的情况下，与鼠121SLE(IgM)相比的r5B1和r7E3抗体的CDC活性。人同种型对照抗体、Hu IgG(◇)和Hu IgM(◆)显示出＜4％的细胞毒性。部分A中示出了对r5B1 IgG(■)、r7E3 IgM(●)和121SLE mIgM(▲)抗体的剂量反应。部分B中示出了对r5B1(IgG)、r7E3(IgM)和121SLE(mIgM)抗体的计算的EC50(μg/mL)。
图13，部分A-C，示出了r5B1抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。部分A示出了通过针对DMS-79细胞的人PBMC的r5B1-介导的ADCC。在存在或不存在2μg/mL r5B1的情况下，使用DMS-79肿瘤细胞，以100∶1至12.5∶1的E∶T比测试PBMC。部分B示出了通过针对DMS-79细胞的原代人NK细胞的r5B1-介导的ADCC。在存在或不存在2μg/mL r5B1的情况下，使用DMS-79肿瘤细胞，以5∶1至0.6∶1的较低E∶T比测试NK细胞。部分C示出了在存在或不存在指定浓度的r5B1的情况下，使用DMS-79肿瘤细胞，以1∶100的E∶T比，使用来自2个供体的PBMC，在多个浓度下的r5B1的ADCC。
图14示出了sLea向BxPC3细胞的内化。在存在与Hum-ZAP(一种皂草素-缀合的抗人IgG)复合的r5B1(抗sLea)或r1B7(抗GD2)抗体的情况下，使BxPC3胰腺肿瘤细胞生长。3天后，使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)测定测量细胞活力，并将样品值归一化为未处理培养物的值。
图15示出了使用Colo205-luc细胞的异种移植模型中r5b1抗体的活性。在第0天，通过尾静脉注射，重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠(每组5只)接受50万的Colo205-luc细胞。在第1、7、14和21天(实验1，Exp1)或者在第1、4、7、10、14和21(实验2，Exp2)，小鼠通过腹膜内注射接受100μg r5B1，总剂量600μg。对照(Ctrl)动物接受PBS模拟注射。
图16示出了SCID小鼠中r5B1对Colo205-luc肿瘤的影响。如实施例I所述，每次注射小鼠接受100μg
Figure BDA0002789388870000051
、300μg(■)或1mg(◆)的r5b1抗体。对照(■)动物接受PBS模拟注射。
图17示出了在第0天和第5周，对于r5B1治疗的具有Colo205-luc肿瘤的小鼠，每组5只小鼠的荧光成像。小鼠接受在图16中显示并在实施例I中描述的治疗方案。
图18，部分A和B，示出了在使用DMS-79细胞的治疗性皮下异种移植模型中的抗肿瘤活性。部分A显示与人IgG(单独的IgG(◆)或者IgG+cRGD(●))和PBS注射对照(■)相比，5B1治疗的小鼠(单独的5B1(▲)或者5B1+cRGD
Figure BDA0002789388870000052
)的抑制或消退。箭头标明了抗体或PBS注射的天数。部分B显示了治疗小鼠的代表性图像。箭头标明没有任何目视可见的肿瘤。
图19，部分A-F，示出了5B1与多种肿瘤类型的结合。部分A是胰腺导管腺癌，III期肿瘤。部分B是乙状结肠癌，IIIB期肿瘤。部分C是肺腺癌，IB期肿瘤。部分D是膀胱粘液腺癌，IV期肿瘤。部分E是来自结肠肿瘤的卵巢转移癌。部分F是淋巴结转移癌，IIIA期肿瘤。
图20示出了通过将89Zr放射性标记的5B1抗体(89Zr-5B1)静脉内施用于皮下植入BxPC3胰腺肿瘤的雌性SCID小鼠，从2-120小时采集的一系列PET最大强度投影(MIP)图像。PET-MIP成像显示了高肿瘤吸收，以及早在注射后24小时(h p.i)的非特异性结合的示踪剂的清除。
图21示出了与图20的PET数据一致的生物分布结果，观察到的肿瘤吸收为84.73±12.28％ID/g。由于肿瘤重量小，通过插图示出了以相对于时间的％ID表示的肿瘤吸收图。肿瘤％ID显示在所有时间点89Zr-5B1的显著肿瘤吸收，并且它比非特异性89Zr-IgG高至少7倍。使用冷5B1(200μg)的竞争性抑制显示肿瘤积累降低。
图22，部分A-C，示出具有DMS79的小鼠(部分A)和Colo205-luc异种移植(部分B)的PET-MIP图像。示出了通过89Zr-5B1的肿瘤(T)、心脏(H)和肝(L)的PET-MIP成像示意图。结肠直肠Colo205-luc异种移植模型显示在24小时出现89Zr-5B1积累峰值，其最终降低，同时显示出与肝脏的非特异性结合的提高(部分C)。
图23示出用5B1抗体和泰素(Taxol)(紫杉醇)连续共施用治疗的DMS-79小肺细胞癌异种移植模型中肿瘤生长的抑制和消退。X轴上的大箭头表示5B1治疗。与对照人IgG(HuIgG)或者单独施用的5B1抗体和泰素相比，5B1抗体和泰素的共施用显著限制了肿瘤生长并导致肿瘤消退。显示了通过双向ANOVA，与对照的显著差异，p＜0.01(**)和p＜0.001(***)。N＝5。
图24示出了用5B1抗体和泰素(Taxol)(紫杉醇)连续共施用治疗的BxPc3胰腺癌异种移植模型中肿瘤生长的抑制。X轴上的大箭头表示泰素+5B1治疗，而小箭头表示单独的5B1治疗。与对照(PBS-Ctrl；人IgG-HuIgG)或者单独施用的5B1抗体和泰素相比，5B1抗体和泰素的共施用显著限制了肿瘤生长。
图25，部分A和B，示出了正位植入BxPC3-1uc胰腺肿瘤异种移植的小鼠的代表性图像。部分A：FDG-PET和计算机断层(CT)配准(左图)以及仅FDG-PET的平面部分(右图)显示出示踪剂最小的肿瘤检测，其中在高代谢组织(即心，H和和膀胱，B)中的高吸收。部分B：与CT配准的相同小鼠的采集的89Zr放射性标记的-5B1抗体(89Zr-5B1)PET图像显示出优越的BxPC3-luc肿瘤异种移植的肿瘤检测。
具体实施方式
肿瘤细胞表面上表达的碳水化合物可以是被动免疫疗法的靶标。本文提供的组合物至少部分是基于由唾液酸化-路易斯寡糖a-钥孔血蓝素(sLea-KLH)缀合物疫苗免疫的个体的血液淋巴细胞产生的人抗体的鉴别和鉴定。鉴别出了至少四种对sLea具有高亲合力的抗体(5B1、9H3、5H11和7E3)。这些抗体中的两种作为重组抗体(r5B1和r7E3)表达，并在体外和体内模型中进一步鉴定。两种抗体在补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中均有效，并且5B1抗体在抗体-依赖性细胞毒性测定中也是高度活性的。使用移植到重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠的Colo205肿瘤细胞或DMS-79肿瘤细胞中的任一种，在两个异种移植模型中测试了抗体的体内效力。本文所提供的本发明的翻译相关性是2倍：第一，本文所提供的方法表明sLea-KLH疫苗引起的抗体应答作为疫苗本身是有用的。第二，可以保存在临床试验中产生的最有效的抗体，并最终将其用作靶标癌症群体的治疗剂或在所述治疗剂的生产中使用。本文所提供的抗体的高亲合力以及它们的高效应子功能支持了这种翻译能力(translational potential)。
如本文所使用的，术语“抗体”旨在表示多肽的免疫球蛋白类型内的B细胞的多肽产物，所述多肽能够结合至特异性分子抗原并且包括两对相同的多肽链，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，并且每条链的每个氨基末端部分包含约100至约130个或更多个氨基酸的可变区并且每条链的每个羧基末端部分包含恒定区(参见Borrebaeck(主编)(1995)Antibody Engineering，第2版，Oxford University Press.；Kuby(1997)Immunology，第3版，W.H.Freeman and Company，New York)。在本发明的背景中，能够通过本发明的抗体结合的特异性分子抗原包括靶标碳水化合物sLea。
当用于表示抗体或其功能性片段时，术语“人”是指具有人可变区和/或人恒定区或其对应于人种系免疫球蛋白序列的部分的抗体或其功能性片段。Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和公共服务部(U.S.Department ofHealth and Human Services)，NIH Publication No.91-3242描述了这些人种系免疫球蛋白序列。在本发明的背景中，人抗体可以包括结合于sLea并且被作为人种系免疫球蛋白核酸序列的天然存在的体细胞变体的核酸序列编码的抗体。实施例I提供了产生人抗体的示例性方法，但是可以使用本领域技术人员公知的任何方法。
术语“单克隆抗体”是指作为单个细胞克隆或者杂交瘤或者来源于单个细胞的细胞群体的产物的抗体。单克隆抗体还旨在表示通过重组方法从产生单个分子免疫球蛋白物质的重链和轻链编码免疫球蛋白基因产生的抗体。单克隆抗体制剂内抗体的氨基酸序列是基本均一的，并且该制剂内抗体的结合活性显示出基本相同的抗原结合活性。相反，多克隆抗体得自群体内不同的B细胞，它是结合特异性抗原的免疫球蛋白分子的组合。多克隆抗体的每个免疫球蛋白可以结合相同抗原的不同表位。用于产生单克隆抗体和多克隆抗体的方法在本领域中是公知的(Harlow and Lane.，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)和Borrebaeck(主编)，Antibody Enaineering：A Practical Guide，W.H.Freeman and Co.，Publishers，New York，第103-120页(1991))。
如本文所使用的，当用于表示抗体时，术语“功能性片段”旨在表示包含重链或轻链多肽的抗体的一部分，所述多肽保留了片段来源的抗体的一些或所有结合活性。这些功能性片段可以包括(例如)Fd、Fv、Fab、F(ab′)、F(ab)2、F(ab′)2、单链Fv(scFv)、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)和微抗体(minibody)。其他功能性片段可以包括(例如)重链或轻链多肽、可变区多肽或CDR多肽或其部分，只要这些功能性片段保留了结合活性即可。例如，可以在Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，C0ld Spring Harbor Laboratory，New York(1989)；Myers(主编)，Molec.Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference，New York：VCH Publisher，Inc.；Huston等人，Cell Biophysics，22：189-224(1993)；Plückthun和Skerra，Meth.Enzymol.，178：497-515(1989)以及Day，E.D.，Advanced Immunochemistry，第2版，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY(1990)中查阅到对这些抗体结合片段的描述。
当用于表示抗体时，术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120至130个或更多个氨基酸的可变区并且羧基末端部分包含恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是称为α、δ、ε、γ和μ的五种不同类型之一。不同的重链大小不同：α、δ和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε含有约550个氨基酸。当与轻链结合时，这些不同类型的重链分别产生了五类公知的抗体，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链可以是人重链。
当用于表示抗体时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包含约100至约110个或更多个氨基酸的可变区并且羧基末端部分包含恒定区。轻链的大致长度为211至217个氨基酸。基于恒定域的氨基酸序列，存在两种不同的类型，其称为κ和λ。轻链氨基酸序列在本领域中是公知的。轻链可以是人轻链。
术语“可变域”或“可变区”是指抗体的轻链或重链的部分，其通常位于轻链或重链的氨基末端并且在重链中具有约120至130个氨基酸的长度，在轻链中具有约100至110个氨基酸的长度，并且在每个具体抗体对其特定抗原的结合或特异性中使用。不同抗体间，可变域在序列中广泛不同。序列差异度集中在CDR，而可变域中可变性较低的部分被称为框架区(FR)。轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。根据EU指数对本文所使用的氨基酸位置编号，如Kabat等人(1991)Sequences of proteins of immunological interest.(U.S.Department of Health and Human Services，Washington，D.C.)第5版。可变区可以是人可变区。
CDR是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或者抗体VLβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因此，CDR是框架区序列内散布的可变区序列。CDR区对于本领域技术人员来说是公知的并已由(例如)Kabat定义为抗体可变(V)域内最高变的区域(Kabat等人，J.Biol.Chem.252：6609-6616(1977)；Kabat，Adv.Prot.Chem.32：1-75(1978))。Chothia还在结构上将CDR区序列定义为不是保守β-折叠框架的一部分的那些残基，并因此能够适合不同的构象(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。这两个术语在本领域中是公知的。通过比较多种结构确定了规范抗体可变域内的CDR位置(Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；Morea等人，Methods 20：267-279(2000))。由于高变区内的残基数目在不同的抗体中是不同的，因此相对于规范位置其他残基通常用紧邻规范可变域编号方案中的残基编号的a、b、c等编号(Al-Lazikani等人，同上(1997))。对于本领域技术人员，这种命名法是类似地公知的。
例如，根据Kabat(高变的)或Chothia(结构的)命名，在下表1中显示了定义的CDR。
表1：CDR定义
Figure BDA0002789388870000091
1根据Kabat等人(如上)的命名法的残基编号
2根据Chothia等人(如上)的命名法的残基编号
还可以将一个或多个CDR共价或非共价引入分子，从而使其成为免疫粘附素。免疫粘附素可以作为较大的多肽链的一部分引入CDR，可以将CDR共价连接至另一条多肽链，或可以非共价引入CDR。CDR使得免疫粘附素能够结合至所关心的特定抗原。
如本文所使用的，当用于表示抗体、抗体功能性片段或多核苷酸时，术语“分离的”旨在表示所提及的分子不含其在自然界中存在的至少一种成分。该术语包含从其自然环境中存在的一些或所有其他成分中移除的抗体、抗体功能性片段或多核苷酸。抗体自然环境的成分包括(例如)红细胞、白细胞、血小板、血浆、蛋白质、核酸、盐和营养物。抗体功能性片段或多核苷酸的自然环境的成分包括(例如)类脂膜、细胞器、蛋白质、核酸、盐和营养物。本发明的抗体、抗体功能性片段或多核苷酸还可以不含或者完全至基本不含其分离或重组产生的来源的细胞的所有这些成分或任何其他成分。
如本文所使用的，“同种型”是指重链恒定区基因编码的抗体种类。给定抗体或功能性片段的重链决定了抗体或功能性片段的种类：IgM、IgG、IgA、IgD或者IgE。每类可以具有κ或λ轻链。术语“亚类”是指区分亚类的重链氨基酸序列中较少的差异。在人中，存在两个IgA亚类(亚类IgA1和IgA2)和四个IgG亚类(亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。这些种类和亚类对于本领域技术人员是公知的。
如本文所使用的，术语“结合”是指分子间的相互作用以形成复合物。相互作用可以是(例如)非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水性相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可以包括通过共价或非共价键、相互作用或力将两个或多个分子结合在一起。可以使用(例如)酶联免疫吸附测定(实施例I所提供的方法)或本领域技术人员公知的一些方法中的任一种来检测抗体或其功能性片段的结合。
抗体或功能性片段上单个抗原结合位点和靶标分子(如sLea)的单个表位之间的总非共价相互作用的强度为抗体或功能性片段对该表位的亲合力。抗体或其功能性片段对一价抗原的结合(k1)和解离(k-1)的比值(k1/k-1)为结合常数，它是亲合力的量度。对于抗体或功能性片段和抗原的不同复合物，K值是不同的并且取决于k1和k-1两者。可以使用本文所提供的任何方法或者本领域技术人员公知的任何其他方法确定本发明的抗体或功能性片段的结合常数K。
一个结合位点的亲合力(affinity)并不总是能够反映抗体或功能性片段和抗原之间相互作用的真实强度。当含有多个、重复抗原决定簇的复合抗原(如多价sLea)与含有多个结合位点的抗体接触时，抗体或功能性片段与抗原在一个位点的相互作用将使得在第二位点反应的可能性增加。多价抗体和抗原之间这种多个相互作用的强度被称为亲和力(avidity)。抗体或功能性片段的亲和力可以是比其各个结合位点的亲和力更好的对其结合能力的量度。例如，高亲和力能够补偿低亲和力，如有时对五聚体IgM抗体所发现的，它可以具有比IgG低的亲和力，但是由其多价产生的IgM的高亲和力使其能够有效结合抗原。
抗体或其功能性片段的特异性是指各个抗体或其功能性片段仅与一个抗原反应的能力。当可以区分抗原的一级、二级或三级结构中或抗原的异构形式的差异时，可以认为抗体或功能性片段是特异的。
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多聚形式，其可以是脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸序列由四种核苷酸碱基组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；以及当多核苷酸为RNA时，替换胸腺嘧啶的尿嘧啶(U)。因此，术语“核苷酸序列”或者“核酸序列”是多核苷酸的字母表示。多核苷酸可以包括基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使核糖核酸(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸还是指双链和单链分子。除非另作说明或需要，否则本发明的多核苷酸的任何实施方式涵盖了双链形式和已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个。应理解本文所述的分离的多核苷酸和核酸是指非天然存在的多核苷酸和核酸。非天然存在的多核苷酸和核酸可以包括，但不限于，cDNA和化学合成的分子。
当提及多核苷酸使用时，术语“编码”或其语法等价物是指处于其天然状态的多核苷酸或者当通过本领域技术人员公知的方法调控时，可以转录生产mRNA，然后翻译成多肽和/或其片段的多核苷酸。反义链是该多核苷酸的互补链，并可以由此推导出编码序列。
短语“治疗剂”是指可以在与sLea的表达有关的疾病和/或与其相关的症状的治疗、控制或者改善中使用的任何试剂。在某些实施方式中，治疗剂是指本发明的抗体或功能性片段。在其他实施方式中，治疗剂是指除了本发明的抗体或功能性片段之外的试剂。治疗剂可以是对于与sLea的表达有关的疾病和/或与其有关的一种或多种症状的治疗、控制或者改善公知是有用的或已用于或目前正用于所述治疗、控制或者改善的试剂。
短语“诊断剂”是指辅助疾病诊断的施用于受试者的物质。这些物质可以用于揭示、精确定位和/或限定导致疾病的过程的位置。在某些实施方式中，诊断剂包括缀合至本发明的抗体或功能性片段的物质，当施用于受试者或与来自受试者的样品接触时，辅助癌症或者肿瘤形成的诊断。
短语“可检测剂”是指可以用于确定样品或受试者中所需分子的存在的物质，如本发明的抗体或功能性片段。可检测剂可以是能够显象的物质或者能够确定和/或测量的物质(例如，通过定量)。
“有效量”是足以引起有益或所需结果的量。可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用有效量。这种递送取决于一些变量，包括单个剂量单位要使用的时间段，试剂的生物利用率、施用途径等。
如本文所使用的，短语“治疗有效量”是指足以降低和/或改善给定病原和/或与其有关的症状的严重程度和/或持续时间的治疗剂(例如，本文所提供的抗体或功能性片段或者本文所提供的任何其他治疗剂)的量。治疗剂的治疗有效量可以是减缓或改善给定疾病的进展或发展、减少或改善给定疾病的复发、发展或发生和/或改善或提高另一种疗法(例如，除了施用本文所提供的抗体或功能性片段之外的疗法)的预防或治疗效果所需的量。
化合物“唾液酸化路易斯a抗原(Sialyl-Lewisa)”(sLea)，也称为唾液酸化Lea、Sialyl-Lewis A、唾液酸化路易斯寡糖a抗原(Sialylated-Lewis a)和CA 19.9，其是一种四糖，分子式为C31H52N2O23，摩尔质量为820.74g/mol。sLea的结构可以包括Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ和Neu5Gcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ。sLea在胃肠道肿瘤上广泛表达并且在胰腺和结肠癌中用作肿瘤标志物。sLea还是E-选择素(E-selection)的已知配体，还称为内皮性白细胞粘附分子(ELAM)。
在一些实施方式中，本发明提供了编码抗体重链或轻链或其功能性片段的分离的多核苷酸，其中使用结合至sLea的抗体重链或轻链产生抗体或其功能性片段。因此，在一些实施方式中，本发明提供了编码抗体或其功能性片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体包含VH域，其具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的残基20-142、SEQ ID NO：6的残基20-142、SEQ ID NO：10的残基20-142和SEQ ID NO：14的残基残基20-145。本发明的分离的多核苷酸还可以包含SEQ ID NO：1的残基58-426、SEQ ID NO：5的残基58-426、SEQ ID NO：9的残基58-426或者SEQ ID NO：13的残基58-435的核酸序列，其中核酸序列编码抗体或其功能性片段的VH域。
在本发明的另一种实施方式中，分离的多核苷酸可以编码抗体或其功能性片段，其中所述抗体包含VL域，其具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：4的残基20-130，SEQID NO：8的残基20-129，SEQ ID NO：12的残基20-130和SEQ ID NO：16的残基23-130。本发明的分离的多核苷酸还可以包含SEQ ID NO：3的残基58-390，SEQ ID NO：7的残基58-387，SEQID NO：11的残基58-390或SEQ ID NO：15的残基67-390的核酸序列，其中核酸序列编码抗体或其功能性片段的VL域。
在另一种实施方式中，本发明提供了编码抗体重链或轻链或其功能性片段的分离的多核苷酸，其中本发明的多核苷酸编码的抗体重链或轻链或其功能性片段具有图1-8中所示或表2中所列的一个或多个互补决定区(CDR)。包含一个或多个CDR的抗体或其功能性片段可以特异性结合至如本文所述的sLea。与sLea的特异性结合可以包括特异性、亲合力(affinity)和/或亲和力(avidity)，如实施例I中对本文所提供的任何抗体所提供的。在另一个方面，本发明的多核苷酸编码的抗体或其功能性片段可以包括本文所述的克隆分离物5B1、9H3、5H11或7E3中任意一个的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。对于评价抗体或其功能性片段的特异性、亲合力和/或亲和力的方法在本领域中是公知的并且本文提供了示例性方法。
表2：克隆分离物的CDR
Figure BDA0002789388870000121
Figure BDA0002789388870000131
在一些实施方式中，本发明的抗体或其功能性片段包括小于6个CDR。在一些实施方式中，抗体或其功能性片段包括1、2、3、4或5个CDR，其选自VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在具体的实施方式中，抗体或其功能性片段包括1、2、3、4或5个CDR，其选自本文所述的克隆分离物5B1、9H3、5H11或者7E3的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。
在一些实施方式中，本发明提供了编码抗体或其功能性片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体或功能性片段包括具有克隆分离物5B1、9H3、5H11或7E3的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的可变重链(VH)域。这些VH域可以包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基55-62、70-77和116-131，或者可替代地，SEQ ID NO：6的氨基酸残基45-52、70-77和116-131，或者可替代地，SEQ ID NO：10的氨基酸残基45-52、70-77和116-131，或者可替代地，SEQ ID NO：14的氨基酸残基45-52、70-77和116-134。在另一个方面，编码VH域的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列可以分别包括SEQ ID NO：1的残基133-156、208-231和346-393，或者可替代地，SEQ IDNO：5的残基133-156、208-231和346-393的核苷酸序列，或者可替代地，SEQ ID NO：9的残基133-156、208-231和346-393的核苷酸序列，或者可替代地，SEQ ID NO：13的残基133-156、208-231、346-402的核苷酸序列。
在另一种实施方式中，本发明提供了编码抗体或其功能性片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体包括具有克隆分离物5B1、9H3、5H11或7E3的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的可变轻链(VL)域。这些VL域可以包括SEQ ID NO：4的氨基酸残基45-52、70-72和109-120，或者可替代地，SEQ ID NO：8的氨基酸残基45-52、70-72和109-119，或者可替代地，SEQ IDNO：12的氨基酸残基45-52、70-72和109-120，或者可替代地，SEQ ID NO：16的氨基酸残基49-53、72-74和111-120。在另一个方面，编码VH域的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列可以分别包括SEQ ID NO：3的残基133-156、208-216和325-360，或者可替代地，SEQ ID NO：7的残基133-156、208-216和325-357的核苷酸序列，或者可替代地，SEQ ID NO：11的残基134-156、208-216和325-360的核苷酸序列，或者可替代地，SEQ ID NO：15的残基145-162、214-222和331-360的核苷酸序列。
在另一种实施方式中，本发明提供了本文所提供的多核苷酸的变体。当用于表示多核苷酸时，变体包括具有一个或多个修饰的核苷酸(如，但不限于，甲基化核苷酸或者核苷酸类似物)的多核苷酸。另外，变体多核苷酸可以包括被非核苷酸成分中断的多核苷酸。在多核苷酸组装之前或之后，可以使用本领域技术人员公知的方法对多核苷酸进行修饰。例如，可以在聚合后，使用酶促或化学技术通过与标记成分缀合来修饰多核苷酸(例如，如Gottfried and Weinhold，2011，Biochem.Soc.Trans.，39(2)：523-628；Paredes等人，2011，Methods，54(2)：251-259中所述)。
可以通过本领域中公知的任何方法获得多核苷酸和确定多核苷酸的核苷酸序列。由于5B1、9H3、5H11和7E3的可变重链和轻链域的氨基酸序列是已知的(参见，例如，SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14和16)，可以使用本领域中公知的方法确定编码抗体和这些抗体的修饰形式的核苷酸序列，即，以产生编码抗体的核酸的方式组装已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子。可以从化学合成的寡核苷酸(例如，如Kutmeier等人，1994，biotechniques17：242中所述)组装编码抗体的这种多核苷酸，简要地，它包括含有编码抗体、其片段或变体的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成、那些寡核苷酸的退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
可以使用分离物5B1、9H3、5H11或7E3的可变重链和/或轻链域的核酸序列(例如，SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13和15)产生编码本发明的抗体或其功能性片段的多核苷酸。可以化学合成或通过使用可杂交至序列的3′和5′端的合成引物的PCR扩增或通过使用对特定核酸序列特异的寡核苷酸探针的克隆从适合的源(例如，从表达抗体或其功能性片段的细胞分离的cDNA，如选择以表达抗体或其功能性片段的杂交瘤细胞)获得编码抗体或功能性片段的核酸。然后，可以使用本领域中公知的任何方法将通过PCR产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。
在一些实施方式中，本发明提供了分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体结合至sLea。因此，在一些方面，本发明提供了结合至sLea的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段包括具有选自下列的氨基酸序列的VH域：SEQ ID NO：2的残基20-142、SEQ ID NO：6的残基20-142、SEQ ID NO：10的残基20-142和SEQ ID NO：14的残基20-145。
在一些实施方式中，本发明提供了结合至sLea的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段包括具有选自下列的氨基酸序列的VL域：SEQ ID NO：4的残基20-130、SEQ ID NO：8的残基20-129、SEQ ID NO：12的残基20-130和SEQ ID NO：16的残基23-130。
在一些实施方式中，本发明提供了结合至sLea的分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段包括VH域和VL域两者，其中所述VH域和VL域分别包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的残基20-142和SEQ ID NO：4的残基20-130；SEQ ID NO：6的残基20-142和SEQ ID NO：8的残基20-129；SEQ ID NO：10的残基20-142和SEQ ID NO：12的残基20-130；和SEQ ID NO：14的残基20-145和SEQ ID NO：16的残基23-130。
在一些实施方式中，为了结合sLea，本发明的抗体或其功能性片段具有图1-8所示或表2所列的一个或多个CDR。包含一个或多个CDR(具体地CDR3)的抗体或其功能性片段可以特异性结合至如本文所述的sLea。与sLea的特异性结合可以包括特异性和亲合力，如实施例I中对本文所提供的任何抗体所提供的。在一些方面，本发明的抗体或其功能性片段可以包括本文所述的克隆分离物5B1、9H3、5H11或7E3中任意一个的CDC活性和/或ADCC活性。
在一些实施方式中，本发明提供了分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体包括具有克隆分离物5B1、9H3、5H11或7E3的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的VH链域。这些VH域可以包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基55-62、70-77和116-131，或者可替代地，SEQ ID NO：6的氨基酸残基45-52、70-77和116-131，或者可替代地，SEQ ID NO：10的氨基酸残基45-52、70-77和116-131，或者可替代地，SEQ ID NO：14的氨基酸残基45-52、70-77和116-134。
在一些实施方式中，本发明提供了分离的抗体或其功能性片段，其中所述抗体包括具有克隆分离物5B1、9H3、5H11或7E3的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的VL链域。这些VL域可以包括SEQ ID NO：4的氨基酸残基45-52、70-72和109-120，或者可替代地，SEQ ID NO：8的氨基酸残基45-52、70-72和109-119，或者可替代地，SEQ ID NO：12的氨基酸残基45-52、70-72和109-120，或者可替代地，SEQ ID NO：16的氨基酸残基49-53、72-74和111-120。
在本发明的一些方面，分离的抗体或其功能性片段是单克隆抗体。在本发明的一些方面，本文所提供的分离的抗体或其功能性片段是IgG或IgM的同种型。本发明另外的方面中，抗体或其功能片段是IgG1亚类的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗体功能性片段可以是(但不限于)Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、scFv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、微抗体(minibody)或单域抗体(sdAB)。在一些方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：18或20的氨基酸序列的双链抗体。在一些方面，本发明的这类双链抗体可以是由具有SEQ ID NO：17或19的核酸序列的多核苷酸编码的。对于抗体和其功能性片段，多种形式、改变和修饰在本领域中是公知的。本发明的sLea特异性抗体片段可以包括这些多种抗体形式、改变和修饰中的任一种。以下说明了如它们在本领域中已知的这些多种形式和术语的实例。
在一些实施方式中，本发明提供了生产本发明的抗体或其功能性片段的方法。本发明所述的方法可以包括将本发明的多核苷酸引入到宿主细胞，在足以产生本发明的抗体或功能性片段的编码的重链和/或轻链的条件和时间培养宿主细胞，和纯化抗体的重链和/或轻链或功能性片段。
结合至sLea抗原的本发明的抗体或其功能性片段的重组表达可以包括构建含有编码本发明的抗体的重链和/或轻链或功能性片段的多核苷酸的表达载体。一旦获得了编码本发明的抗体或其功能性片段(优选地，但不必需，含有重链和/或轻链可变域)的多核苷酸，则可以使用本领域中公知的技术通过DNA重组技术产生用于产生所述抗体或功能性片段的载体。本文描述了通过表达含有抗体或其功能性片段的编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。
可以使用本领域技术人员公知的方法构建含有抗体或其功能性片段编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括(例如)体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因此，本发明提供了可复制载体，其包含操作性连接至启动子的编码本发明的抗体或其功能性片段的核苷酸序列。这些载体可以包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见，例如，国际专利公开第WO 86/05807号和第WO 89/01036号；和美国专利第5,122,464号)，并且可以将抗体的可变域克隆到该载体中用于表达整个重链、整个轻链或者重链和轻链两者。
可以通过常规方法将表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规方法培养转染的细胞以产生本发明的抗体或其功能性片段。因此，本发明包括宿主细胞，其含有操作性连接至异源启动子的编码本发明的抗体或其功能性片段的多核苷酸。在一些实施方式中，对于双链抗体的表达，可以在用于表达整个免疫球蛋白分子的宿主细胞中共表达编码重链和轻链两者的载体，如下所述。
可以使用多种宿主表达载体系统来表达本发明的抗体或其功能性片段(参见，例如，美国专利第5,807,715号)。这些宿主-表达系统代表了可以通过其产生并随后纯化的所关心的编码序列，其还代表了当被合适的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些宿主-表达系统包括(但不限于)微生物，如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者具有含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或者来源于哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、NS0和3T3细胞)。在一些方面，特别是对完整重组抗体的表达，将细菌细胞(如大肠杆菌(Escherichia coli))或真核细胞用于表达重组抗体或功能性片段。例如，与载体(如来源于人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件)一起使用的哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))是抗体的有效表达系统(Foecking等人，1986，Gene 45：101；和Cockett等人，1990，Bio/Technology 8：2)。在一些实施方式中，在CHO细胞中产生本发明的抗体或其片段。在一种实施方式中，编码本发明的结合至sLea的抗体或其功能性片段的核苷酸序列的表达是通过组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调控的。
在细菌系统中，根据表达的抗体分子的预期用途，可有利地选择一些表达载体。例如，当为了产生抗体分子的药物组合物而生产大量的这种抗体时，指导表达易于纯化的高水平的融合蛋白产物的载体可以是期望的。这些载体包括(但不限于)大肠杆菌(E.coli)表达载体pUR278(Ruther等人，1983，EMBO 12：1791)，其中抗体编码序列可以与lac Z编码区符合读框地单独连接入载体中以产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye，1985，NucleicAcids Res.13：3101-3109；Van Heeke&Schuster，1989，J.Biol.Chem.24：5503-5509)；等。pGEX载体还可以用于表达作为具有谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般地，这些融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附和结合至谷胱甘肽-琼脂糖珠基质上，然后在游离谷胱甘肽存在的情况下洗脱而从裂解的细胞中容易地纯化。pGEX载体设计以包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，从而使克隆的靶标基因产物可以从GST部分上释放。
在昆虫系统中，苜猜银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体或功能性片段编码序列可以单独克隆入病毒的非必需区(例如，多角体蛋白基因)，并且置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制之下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用一些病毒基表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，所关心的抗体编码序列可以与腺病毒转录/翻译控制复合物(例如，晚期启动子和三联前导序列)连接。然后，可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入到腺病毒基因组中。向病毒基因组的非必需区(例如，El或E3区)的插入将产生存活并能够在感染宿主内表达抗体分子的重组病毒(例如，参见，Logan&Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：355-359)。特定的起始信号还可以用于插入的抗体编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框相符，以确保整个插入部分的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的，是天然的和合成的。可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来提高表达效率。(参见，例如，Bittner等人，1987，Methods in Enzymol.153：51-544)。
另外，可以选择宿主细胞株，其调节插入序列的表达，或以希望的具体方式修饰和加工基因产物。对于抗体或功能性片段的功能，蛋白质产物的这些修饰(例如，糖基化作用)和加工(例如，可切割性)可以是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰的特性和特定机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统来确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为了这个目的，可以使用真核宿主细胞，其具有能够适当加工基因产物的初级转录本、糖基化和磷酸化的细胞体系。这些哺乳动物宿主细胞包括(但不限于)CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不会内源产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。
对于重组蛋白质的长期、高产量制备，稳定表达是优选的。例如，可以工程化设计稳定表达本发明的抗体或功能性片段的细胞系。可以用被合适的表达控制元件控制的DNA和可选择标志物转化宿主细胞，而不使用包含病毒复制起点的表达载体，所述表达控制元件例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等。引入外源DNA后，可以让工程细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基。重组质粒中的可选择标志物赋予了选择抗性，并且允许细胞在其染色体中稳定整合质粒并生长以形成灶，其继而可以被克隆并扩增成细胞系。这种方法可以有利地用于表达抗体分子的工程细胞系。
可以使用一些选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell 11：223)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，1980，Cell 22：8-17)基因，它们可以分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。另外，抗代谢物抗性可用作选择下列基因的基础：dhfr，其赋予甲氨蝶呤抗性(Wigler等人1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77(6)：3567-70；O’Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：1527)；谷氨酰胺合成酶(GS)，它是负责使用谷氨酸和氨生物合成谷氨酰胺的酶(Bebbington等人，1992，Biuotechnology 10：169)；gpt，其赋予麦考酚酸抗性(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo，其赋予氨基糖苷G-418抗性(Wu and Wu，1991，Biotherapy3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，1993，Science 260：926-932；和Morgan and Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIB TECH11(5)：155-215)；和hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre等人，1984，Gene 30：147)。可以将DNA重组技术领域中公知的方法常规地应用于选择所需的重组克隆，并且在以下文献中描述了这些方法，例如，Ausubel等人(主编)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；和在第12和13章中，Dracopoli等人(主编)，Current Protocols in Human Genetics.，JohnWiley&Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.150：1，以上文献以其全部内容作为参考并入本文。
可以通过载体扩增来提高抗体分子的表达水平(对于综述，参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3(Academic Press，NewYork，1987))。当表达抗体或其功能性片段的载体系统中的标志物是可扩增的时，宿主细胞培养中存在的抑制剂水平的提高将提高标志物基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因有关，因此抗体的产生也将提高(Crouse等人，1983，Mol.Cell.Biol.3：257)。
宿主细胞可以与本发明的两个表达载体共转染，其中第一载体编码重链来源的多肽，第二载体编码轻链来源的多肽。两个载体可以含有相同的可选择标志物，其使得重链和轻链多肽同等表达。可替代地，可以使用单一载体，其编码并且能够表达重链和轻链多肽两者。在这种情况下，可以将轻链放置在重链之前以避免无毒重链的过量(Proudfoot，1986，Nature 322：52；和Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197-2199)。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。
另外，可以使用本领域中公知的技术对编码本发明的抗体的重链和/或轻链或功能性片段的多核苷酸进行密码子优化以实现本发明的抗体或功能性片段在所需宿主细胞中的优化表达。例如，在密码子优化的一种方法中，通过用来自一组参考基因的最常见密码子代替天然密码子，其中将每种氨基酸的密码子翻译速度设计为高的。在Kanaya等人，Gene，238：143-155(1999)、Wang等人，Mol.Biol.Evol.，18(5)：792-800(2001)、美国专利5,795,737、美国专利公开2008/0076161和WO 2008/000632中描述了产生用于表达所需蛋白的密码子优化的多核苷酸的其他示例性方法，其可以应用于本发明的抗体的重链和/或轻链或功能性片段。
一旦通过重组表达产生了本发明的抗体分子，则可以通过本领域中已知的用于免疫球蛋白分子纯化的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲合色谱，具体地，通过蛋白A后对特定抗原的亲合力，和分选柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过蛋白纯化的任何其他标准技术进行纯化。此外，可以将本发明的抗体或功能性片段融合至本文所提供的或本领域中已知的异源多肽序列以有利于纯化。例如，可以通过重组添加可商购的聚组氨酸标签(His-标签)、FLAG-标签、血球凝集素标签(HA-标签)或myc-标签等并使用本领域技术人员公知的纯化方法纯化本发明的抗体或功能性片段。
Fab片段是指由VL、VH、CL和CH1域组成的一价片段；F(ab′)2片段是二价片段，其包含通过位于铰链区的二硫键连接的两个Fab片段；Fd片段由VH和CH1域组成；Fv片段由抗体单一臂的VL和VH域组成；并且dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546，(1989))由VH域组成。
抗体可以具有一个或多个结合位点。如果有不止一个结合位点，则结合位点可以彼此相同或可以不同。例如，天然存在的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。
单链抗体(scFv)是指其中VL和VH区通过接头(例如，合成氨基酸残基序列)连接以形成连续多肽链的抗体，其中所述接头足够长以允许蛋白链自身向后折叠并形成一价抗原结合位点(参见，例如，Bird等人，Science 242：423-26(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83(1988))。双链抗体是指包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过接头连接的VH和VL域，该接头过短从而不能使相同链上的两个域配对，因此允许每个域与另一条多肽链上的互补域配对(参见，例如，Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48(1993)和Poljak等人，Structure 2：1121-23(1994))。如果双链抗体的两条多肽链是相同的，那么由它们配对所产生的双链抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用于制备具有两个不同抗原结合位点的双链抗体。类似地，三链抗体和四链抗体是分别包含三条和四条多肽链并分别形成三个和四个抗原结合位点的抗体，所述抗原结合位点可以是相同或不同的。
本发明还提供了5B1、9H3、5H11和/或7E3的抗体或其功能性片段衍生物，其中所述抗体或功能性片段结合至sLea。本领域技术人员公知的标准技术可用于向编码本发明的抗体或其功能性片段的核苷酸序列中引入突变，所述技术包括(例如)定向突变和导致氨基酸取代的PCR介导的突变。在一些方面，相对于原始分子，所述衍生物包含小于25个氨基酸取代，小于20个氨基酸取代，小于15个氨基酸取代，小于10个氨基酸取代，小于5个氨基酸取代，小于4个氨基酸取代，小于3个氨基酸取代或小于2个氨基酸取代。
在一些实施方式中，本发明提供了具有天然存在的氨基酸的修饰形式、保守取代、非天然存在的氨基酸、氨基酸类似物和模拟物的抗体或其功能性片段，只要这种抗体或功能性片段保留了如本文所定义的功能活性。在一种实施方式中，所述衍生物在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处具有保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基替代的一种取代。已经在本领域中定义了具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括带碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可替代地，可以通过(如)饱和突变沿编码序列的全部或部分随机引入突变，并且可以筛选所得突变体的生物活性以鉴别保留活性的突变体。突变后，可以表达所编码的抗体或其功能性片段并且可以确定抗体或功能性片段的活性。
在一些实施方式中，本发明提供了抗体或其功能性片段，其具有包含在本发明的抗体或功能性片段内的Fc片段的修饰的岩藻糖基化、半乳糖苷化和/或唾液酸化作用。Fc片段的这类修饰可以影响Fc受体介导的活性，如Peipp等人，Blood，112(6)：2390-2399(2008)中所讨论的。例如，Fc N-聚糖中缺少核心岩藻糖残基的糖基工程化治疗抗体在较低浓度显示出强ADCC，其具有比岩藻糖基化的对应物高得多的效力。Shields等人，J.Biol.Chem.，277(30)：26733-40(2002)；Okazaki等人，J Mol Biol.，336：1239-1249(2004)；Natsume等人，J.Immunol.Methods.，306：93-103(2005)。用于修饰抗体或其功能性片段的岩藻糖基化、半乳糖苷化和/或唾液酸化的方法在本领域中是公知的。例如，可以将去岩藻糖基化方法分成三种方法：(1)将非哺乳动物细胞的N-糖基化作用途径转化为“人源化”非岩藻糖基化途径；(2)使哺乳动物细胞的N-聚糖岩藻糖基化途径失活和(3)非岩藻糖基化N-糖蛋白的体外化学合成或者将N-聚糖酶促修饰为非岩藻糖基化的形式，如Yamane-Ohnuki等人，MAbs.，1(3)：230-236(2009)中所述。应理解这些方法或本领域中公知的任何其他方法中的任一种可以用于产生具有修饰的岩藻糖基化、半乳糖苷化和/或唾液酸化作用的抗体或其功能性片段。
可以通过本领域中已知的用于抗体合成的任何方法，具体地，通过化学合成或者通过重组表达技术产生结合至sLea的本发明的抗体或其功能性片段。除非另外指明，否则本发明的实践使用了本领域技术范围内的分子生物学、微生物学、基因分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交和相关领域中的常规方法。在本文引用的参考文献中描述了并且在文献中充分解释了这些技术。参见，例如，Maniatis等人(1982)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press；Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987和每年更新)；Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(1987和每年更新)Gait(主编)(1984)Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press；Eckstein(主编)(1991)Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，IRL Press；Birren等人(主编)(1999)Genome Analysis：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press；Borrebaeck(主编)(1995)Antibody Engineering，第2版，OxfordUniversity Press；Lo(主编)(2006)Antibody Engineering：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)；Vol.248，Humana Press，Inc；以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
可以使用本领域中已知的多种技术制备单克隆抗体，包括杂交瘤和重组技术或它们的组合的使用。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述技术包括本领域中已知的并在以下文献中教导的那些：Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563681(Elsevier，N.Y.，1981)，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。单克隆抗体不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。产生单克隆抗体的其他示例性方法在本领域中是已知的。在本文的实施例I中提供了产生单克隆抗体的其他示例性方法。
可以通过本领域技术人员公知的任何技术产生结合sLea的抗体功能性片段。例如，可以使用酶，如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或者胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割产生本发明的Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1域。
还可以使用本领域中已知的多种噬菌体展示方法产生本发明的抗体功能性片段。例如，在噬菌体展示方法中，在具有编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上展示功能性抗体域，如具有本文所提供的1、2、3、4、5或6个CDR的重链和/或轻链可变区。通过PCR将编码VH和VL域的DNA与scFv接头重组在一起并克隆到噬粒载体中。在大肠杆菌(E.coli)中，将载体电穿孔，并用辅助噬菌体感染大肠杆菌(E.coli)。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包含fd和M13，并且VH和VL域通常重组融合至噬菌体基因III或基因VIII。可以使用抗原，例如，标记的抗原或者结合或捕获至固体表面或珠上的抗原选择或鉴别表达结合至特定抗原(如sLea)的抗原结合域的噬菌体。可以用于制备本发明的抗体功能性片段的噬菌体展示方法的实例包括以下文献中公开的那些：Brinkman等人，1995，J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames等人，1995，J.Immunol.Methods 184：177-186；Kettleborough等人，1994，Eur.J.Immunol.24：952-958；Persic等人，1997，Gene 187：9-18；Burton等人，1994，Advances in Immunology 57：191-280；PCT专利申请No.PCT/GB91/01134；国际专利公开No.WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO97/13844；以及美国专利No.5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108；以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择之后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生完整抗体，包括人抗体，或任何其他所需的抗原结合片段，并在任何所需的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如本文所述的。
使用本领域中已知的方法，还可以使用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，如以下文献中公开的那些：PCT专利公开No.WO 92/22324；Mullinax等人，1992，BioTechniques 12(6)：864-869；Sawai等人，1995，AJRI 34：26-34；和Better等人，1988，Science 240：1041-1043，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入。
为了产生完整的抗体，包含VH或VL核苷酸序列的PCR引物、限制酶切位点和保护限制酶切位点的侧接序列可以用于扩增scFv克隆中的VH或VL序列。使用本领域技术人员公知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH域克隆到表达VH恒定区的载体中，例如，人γ1恒定区，并且可以将PCR扩增的VL域克隆到表达VL恒定区的载体中，例如，人κ或λ恒定区。还可以将VH和VL域克隆到表达必需恒定区的一个载体中。然后，使用本领域技术人员公知的技术，将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体(例如，IgG)的稳定或瞬时细胞系。
在一些实施方式中，将本发明的抗体或功能性片段缀合(共价或非共价缀合)或重组融合至一个或多个诊断试剂、可检测试剂或治疗剂或者任何其他所需分子。对于作为临床试验程序的一部分(如确定特定疗法的效力)的监控或诊断与sLea的表达有关的疾病(如癌症或肿瘤形成)的发生、发展、进展和/或严重性，缀合或重组融合的抗体或功能性片段可以是有用的。
可以(例如)通过将本发明的抗体或功能性片段偶联至可检测物质来完成检测和诊断，所述可检测物质包括(但不限于)放射性物质，如(但不限于)锆(89Zr)、碘(131I、125I、124I、123I和121I)、碳(14C、11C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)15O、13N、64Cu、94mTc、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、86y、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、”113Sn和117Sn；和使用多种正电子发射断层显像的正电子发射金属、多种酶，例如但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基(prosthetic group)，例如但不限于，抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，例如但不限于，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于，鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于，荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白，和非放射性顺磁性金属离子。
本发明还涵盖了缀合(共价或非共价缀合)或重组融合至一种或多种治疗剂的本发明的抗体或功能性片段的治疗性使用。在这方面，例如，抗体可以缀合或重组融合至治疗剂，如细胞毒素，例如，细胞抑制剂或杀细胞剂，或放射性金属离子，例如，α发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。治疗剂可以是化学治疗剂，例如但不限于，蒽环类(例如，多柔比星和柔红霉素(先前为道诺霉素))；taxan(例如，泰素(Taxol)和泰素帝(Taxotere)；抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶和氨烯咪胺)；或者烷化剂(例如，氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、顺二氯二胺铂(II)(DDP)和顺铂)；抗生素(例如，放线菌素D、博来霉素、普卡霉素和安曲霉素(AMC))；奥瑞他汀分子(例如，奥瑞他汀PHE、苔藓抑素1、海兔毒素10、一甲基奥瑞他汀E(MMAE)和一甲基奥瑞他汀F(MMAF))；激素(例如，糖皮质激素、孕酮、雄激素和雌激素)；核苷类似物(例如，吉西他滨)、DNA-修复酶抑制剂(例如，依托泊苷和拓扑替康)、激酶抑制剂(例如，化合物ST1571，也称为格列卫或伊马替尼甲磺酸盐)；细胞毒性剂(例如，美登素、紫杉醇、细胞分裂抑素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、普卡霉素、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌罗霉素及其类似物或同源物，以及以下专利中公开的那些化合物：美国专利No.6,245,759、6,399,633、6,383,790、6,335,156、6,271,242、6,242,196、6,218,410、6,218,372、6,057,300、6,034,053、5,985,877、5,958,769、5,925,376、5,922,844、5,911,995、5,872,223、5,863,904、5,840,745、5,728,868、5,648,239、5,587,459)；法呢基转移酶抑制剂(例如，R115777、BMS-214662，和(例如)以下专利公开的那些：美国专利No.6,458,935、6,451,812、6,440,974、6,436,960、6,432,959、6,420,387、6,414,145、6,410,541、6,410,539、6,403,581、6,399,615、6,387,905、6,372,747、6,369,034、6,362,188、6,342,765、6,342,487、6,300,501、6,268,363、6,265,422、6,248,756、6,239,140、6,232,338、6,228,865、6,228,856、6,225,322、6,218,406、6,211,193、6,187,786、6,169,096、6,159,984、6,143,766、6,133,303、6,127,366、6,124,465、6,124,295、6,103,723、6,093,737、6,090,948、6,080,870、6,077,853、6,071,935、6,066,738、6,063,930、6,054,466、6,051,582、6,051,574和6,040,305)；局部异构酶抑制剂(例如，喜树碱、伊立替康、SN-38、拓扑替康、9-氨基喜树碱、GG-211(GI 147211)、DX-8951f、IST-622、卢比替康、吡唑啉吖啶、XR-5000、saintopin、UCE6、UCE1022、TAN-1518A、TAN 1518B、KT6006、KT6528、ED-110、NB-506、ED-110、NB-506、法格罗宁、柯喃因、β-拉帕醌和蝴蝶霉素)；DNA小沟结合剂(例如，Hoescht染料33342和Hoechst染料33258)；腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨磷酸盐和2-氯代脱氧腺苷)；或其可药用盐、溶剂化物、笼形物或前体药物。治疗剂可以是免疫治疗剂，例如但不限于西妥昔单抗、贝伐单抗、赫赛汀、利妥昔单抗。
另外，本发明的抗体或功能性片段可以缀合至治疗剂，如放射性金属离子，如α发射体，如213Bi或用于缀合射电金属离子的大环螯合剂，所述射电金属离子包括，但不限于，131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm；或者大环螯合剂，如1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-乙二醇双乙胺醚(DOTA)，其可以通过接头分子连接至抗体或其功能性片段。这些接头分子通常在本领域中是已知的并在Denardo等人，1998，Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等人，1999，Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；和Zimmerman等人，1999，Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50中有所描述。
此外，本发明的抗体或功能性片段可以缀合(共价或非共价缀合)或重组融合至改变给定生物反应的治疗剂。因此，治疗剂不视为仅限于经典的化学治疗剂。例如，治疗剂可以是具有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。这些蛋白质可以包括(例如)毒素(例如，相思豆毒蛋白、蓖麻毒A、假单胞菌属外毒素、霍乱毒素和白喉毒素)；蛋白质，如肿瘤坏死因子、γ-干扰素、α-干扰素、神经生长因子、血小板源生长因子、组织纤维蛋白溶酶原活化因子、凋亡剂(例如，TNF-γ、AIM I、AIM II、Fas配体和VEGF)、抗血管原试剂(例如，血管阻断素、内皮抑素和凝血途径成分，如组织因子)；生体应答修饰物质(例如，细胞因子，如干扰素γ、白介素-1、白介素-2、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-9、白介素-10、白介素-12、白介素-15、白介素-23、粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子和粒细胞集落刺激因子)；生长因子(例如，生长激素)或凝血剂(例如，钙、维生素K、组织因子，如(但不限于)哈格曼因子(因子XII)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽释放酶(PK)、凝血蛋白-因子II(凝血酶原)、因子V、XIIa、VIII、XIIIa、XI、XIa、IX、IXa、X、磷脂和纤维蛋白单体)。
本发明涵盖了重组融合或化学缀合(共价或非共价缀合)至异源蛋白质或多肽以产生融合蛋白的本发明的抗体或功能性片段。在一些方面，这种多肽的长度可以为约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100个氨基酸。在一些方面，本发明提供了融合蛋白，其具有本发明的抗体的功能性片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)和异源蛋白质或者多肽。在一种实施方式中，抗体或功能性片段所融合至的异源蛋白质或多肽对于将抗体或其功能性片段靶向特定细胞类型是有用的，如表达sLea的细胞。
本发明的缀合或融合蛋白包括缀合(共价或非共价缀合)或重组融合至诊断试剂、可检测试剂或治疗剂的本文所提供的本发明的任何抗体或功能性片段。在一种实施方式中，本发明的缀合或融合蛋白包括5B1、9H3、5H11或7E3抗体，和诊断试剂、可检测试剂或治疗剂。在另一种实施方式中，本发明的缀合或融合蛋白包括5B1、9H3、5H11或7E3抗体的功能性片段，和诊断试剂、可检测试剂或治疗剂。在另一种实施方式中，本发明的缀合或融合蛋白包括VH域，其具有SEQ ID NO：2的残基20-142、SEQ ID NO：6的残基20-142、SEQ ID NO：10残基20-142或SEQ ID NO：14的残基20-145中所示的VH域中任一个的氨基酸序列，和/或VL域，其具有SEQ ID NO：4的残基20-130、SEQ ID NO：8的残基20-129、SEQ ID NO：12的残基20-130或SEQ ID NO：16的残基23-130中所示的VL域中任一个的氨基酸序列，和诊断试剂、可检测试剂或治疗剂。在另一种实施方式中，本发明的缀合或融合蛋白包括具有SEQ IDNO：2、6、10或14中所示的VH CDR的任一个的氨基酸序列的一个或多个VH CDR，和诊断试剂、可检测试剂或治疗剂。在另一种实施方式中，缀合或融合蛋白包括具有SEQ ID NO：4、8、12或16中所示的VL CDR的任一个的氨基酸序列的一个或多个VL CDR，和诊断试剂、可检测试剂或治疗剂。在另一种实施方式中，本发明的缀合或融合蛋白包括分别在SEQ ID NO：2的残基20-142和SEQ ID NO：4的残基20-130；SEQ ID NO：6的残基20-142和SEQ ID NO：8的残基20-129；SEQ ID NO：10的残基20-142和SEQ ID NO：12的残基20-130；或SEQ ID NO：14的残基20-145和SEQ ID NO：16的残基23-130中所示的至少一种VH域和至少一种VL域，和诊断试剂、可检测试剂或治疗剂。
用于将诊断试剂、可检测试剂或治疗剂(包括多肽)融合或缀合至抗体的方法是公知的，参见，例如，Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(主编)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For DrugDelivery”，Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(主编)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy：A Review”，Monoclonal Antibodies 84：Biological And ClinicalApplications，Pinchera等人(主编)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(主编)，第303-16页(Academic Press 1985)，Thorpe等人，1982，Immunol.Rev.62：119-58；美国专利No.5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,723,125、5,783,181、5,908,626、5,844,095、5,112,946、7,981,695、8,039,273、8,142,784；美国专利公开2009/0202536、2010/0034837、201I/0137017、2011/0280891、2012/0003247；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT专利公开WO 9I/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631和WO 99/04813；Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10535-10539，1991；Traunecker等人，Nature，331：84-86，1988；Zheng等人，J.Immunol.，154：5590-5600，1995；Vil等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：11337-11341，1992；和Senter，Current Opinionin Chemical Biology，13：235-244(2009)，以上文献以其全部内容作为参考并入本文。
在另一个方面，可以通过二硫键形成将诊断试剂、可检测试剂或治疗剂连接在还原抗体成分(reduced antibody component)的铰链区。可替代地，可以使用异双官能交联接头，如3-(2-吡啶基二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)将这些试剂连接至抗体成分。Yu等人，Int.J.Cancer 56：244(1994)。用于这种缀合的一般技术在本领域中是公知的。参见，例如，Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press1991)；Upeslacis等人，“Modification of Antibodies by Chemical Methods，”inMONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等人(主编)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“Production and Characterization of SyntheticPeptide-Derived Antibodies，”in MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERINGAND CLINICAL APPLICATION，Ritter等人(主编)，第60-84页(Cambridge UniversityPress 1995)。
可替代地，可以通过抗体Fc区中的碳水化物部分来缀合诊断试剂、可检测试剂或治疗剂。通过抗体碳水化物部分将肽缀合至抗体的方法对本领域技术人员是公知的。参见，例如，Shih等人，Int.J.Cancer.41：832-839(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer.46：1101-1106(1990)；和Shih等人，美国专利No.5,057,313，以上所有文献以其全部内容作为参考并入本文。一般方法涉及将具有氧化的碳水化合物部分的抗体成分与具有至少一个游离胺官能并且加载了多个肽的载体聚合物反应。该反应导致产生了初始的席夫碱(亚胺)键，可以通过还原成仲胺来使其稳定以形成最终缀合物。
然而，如果缺少Fc区，例如，如果如本文所提供的抗体功能性片段是所期望的，则仍可能连接诊断试剂、可检测试剂或治疗剂。可以将碳水化物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.，154：5919(1995)；美国专利第5,443,953号和第6,254,868号，以上所有文献以其全部内容作为参考并入本文。使用工程化碳水化物部分连接诊断试剂、可检测试剂或治疗剂。
可以选择缀合或重组融合至本发明的结合至sLea的抗体功能性片段的治疗剂以实现所需的预防或治疗效果。应理解当决定将哪个治疗剂缀合或重组融合至本发明的抗体或功能性片段时，在临床医师或其他医务人员的技术水平内考虑以下因素：疾病性质、疾病严重程度和受试者状况。
如本文所提供的可检测地标记的并且结合至sLea的本发明的缀合或融合抗体或功能性片段可以用于诊断目的以检测、诊断或监控疾病，其中引起疾病或与疾病有关的细胞表达sLea。例如，如本文所提供的，已表明癌细胞和肿瘤表达sLea，例如但不限于，胃肠道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、结肠直肠腺癌、胰癌、胰腺腺癌、小细胞肺癌、膀胱腺癌、转移性结肠癌、结肠直肠癌、印戒细胞卵巢癌(signet rihg ovarian cancer)和转移癌。因此，本发明提供了通过向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合或融合抗体或功能性片段来检测受试者中的癌症或肿瘤形成的方法。在一些方面，该检测方法还可以包括使用结合至sLea的一种或多种本发明的缀合物或融合抗体或功能性片段来测定受试者细胞或组织样品上sLea的表达；并将sLea的水平与对照水平，例如，正常组织样品(例如，来自未患病的受试者，或来自疾病发生之前的相同受试者)中的水平相比较，借此与sLea的对照水平相比sLea的测定水平的升高是疾病的指示。这些诊断方法可以使得专业医疗人员能够在其他可能之前使用预防措施或积极治疗，从而预防疾病的发展或进一步进展。
还可以使用如本文所提供的或者本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法将本发明的抗体或功能性片段用于测定生物样品中的sLea抗原水平(例如，参见Jalkanen等人，1985，J.Cell.Biol.101：976-985；和Jalkanen等人，1987，J.Cell.Biol.105：3087-3096)。用于检测sLea的其他抗体基方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。适合的抗体测定标记物是本领域已知的并且包括酶标记物，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标记物，如氨基苯二酰肼；和荧光标记物，如荧光素和罗丹明，和生物素。
在一个方面，本发明提供了在人类中进行的疾病检测和诊断。在一种实施方式中，该诊断包括：a)向受试者施用(例如，肠胃外、皮下或腹膜内)有效量的结合至sLea的本发明的缀合物或融合蛋白；b)施用后，等待一定时间间隔以使得缀合物或融合蛋白能够优先在受试者中表达sLea的位点集中(并且，在一些方面，等待未结合的缀合物或融合蛋白被清除至背景水平)；c)确定背景水平；和d)检测受试者中缀合物或融合蛋白，从而高于背景水平的缀合物或融合蛋白的检测结果表明受试者患病。可以通过多种方法确定背景水平，包括将所检测的缀合物或融合蛋白的量与先前对特定系统确定的标准值进行比较。
应理解，受试者的体型和所使用的成像系统将会决定产生诊断图像所需的成像部分的量，并且这可以由本领域技术人员容易地确定。例如，在缀合至本发明的抗体或功能性片段的放射性同位素方面，对于人类受试者，所注射的放射性物质的量通常将在约5至20毫居里的99Tc的范围内。然后，缀合物将优选在表达sLea的细胞位置处累积。S.W.Burchiel等人，“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.”(Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes主编，Masson Publishing Inc.(1982)中的第13章)中描述了体内肿瘤成像。
基于一些变量，包括所使用的可检测试剂的类型和施用模式，施用后使得缀合物优选地能够在受试者中位点处集中和未结合的缀合物清除至背景水平的时间间隔为6至48小时，或者6至24小时，或者6至12小时。在另一种实施方式中，施用后的时间间隔为5至20天或5至10天。在一种实施方式中，例如，在初始诊断后一个月，在初始诊断后六个月，在初始诊断后一年或更长时间，通过重复如本文所提供的用于诊断的方法来进行疾病的监控。
可以使用本领域中已知的用于体内扫描的方法检测受试者中缀合物或融合蛋白的存在。这些方法取决于所使用的可检测试剂的类型。熟练的技术人员将能够确定用于检测特定可检测试剂的适当方法。可以在本发明的诊断方法中使用的方法和装置包括(但不限于)计算机断层扫描(CT)、全身扫描如正电子发射体层成像(PET)、磁共振成象(MRI)和声图描记法。在一种实施方式中，将本发明的抗体或功能片段缀合至放射性同位素并使用放射反应性手术仪在受试者中检测。在另一种实施方式中，将本发明的抗体或功能片段缀合至荧光化合物并使用荧光反应性扫描仪在受试者中检测。在另一种实施方式中，将本发明的抗体或功能片段缀合至正电子发射金属，如锆(89Zr)或者本文所提供的或通过正电子发射断层显像可检测的在本领域中公知的任何其他正电子发射金属，并使用正电子发射断层显像在受试者中检测。在另一种实施方式中，将本发明的抗体或功能片段缀合至顺磁标记物并使用磁共振成象(MRI)在受试者中进行检测。
在一种实施方式中，本发明提供了具有本发明的抗体或功能性片段和可药用载体的药物组合物。可以在本发明的药物组合物中使用的可药用载体包括本领域中已知的任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，如油水乳液，和多种类型的润湿剂。可以以液体单位剂量形式或足以将本发明的抗体或功能性片段递送至需要治疗的受试者的靶标区的任何其他剂量施用形式制备这些药物组合物。例如，所述药物组合物可以以适合于所选施用形式(例如，血管内、肌内、皮下、腹膜内等)的任何方式制备。本领域技术人员可以容易地选择其他任选的组分，例如，药品级稳定剂、缓冲剂、防腐剂、赋形剂等。充分考虑pH、等渗性、稳定性等，药物组合物的制备在本领域的技术水平内。
可以通过将具有所需纯度的抗体与任选的生理学可用的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.，Easton，PA)混合，以冷冻干燥制剂或水溶液形式制备用于存储的含有本文所提供的本发明的一种或多种抗体或功能性片段的药物制剂。在所使用的剂量和浓度，可用的载体、赋形剂或稳定剂对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸，如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
因此，在一些实施方式中，本发明还提供了在对其有需要的受试者中治疗或预防疾病的方法。本发明所述的方法可以包括向受试者施用治疗有效量的本文所提供的药物组合物。例如，药物组合物可以包括本文所提供的一种或多种抗体或功能性片段。可以使用本发明所述的方法治疗或预防的疾病包括癌症、肿瘤形成和/或转移。具体地，本发明所述的方法对治疗癌症或肿瘤形成是有用的，其中癌细胞或肿瘤表达碳水化合物sLea。可以使用本发明所述的方法治疗或预防的癌症或肿瘤的非限制性实例包括胃肠道肿瘤，例如，结肠癌、结肠直肠腺癌、转移性结肠癌、结肠直肠癌、胰癌或胰腺腺癌；小细胞肺癌；膀胱腺癌；印戒细胞卵巢癌；卵巢癌、转移癌；和胃、食管、喉、泌尿生殖道或乳腺腺癌。
因此，在一些方面，本发明提供了通过施用治疗有效量的具有抗体或其功能性片段的药物组合物在对其有需要的受试者中治疗癌症或预防肿瘤转移的方法，其中所述抗体或功能性片段结合至sLea并包括具有选自下列的氨基酸序列的VH域：SEQ ID NO：2的残基20-142、SEQ ID NO：6的残基20-142、SEQ ID NO：10的残基20-142和SEQ ID NO：14的残基20-145。在另一个方面，本发明提供了通过施用治疗有效量的具有抗体或其功能性片段的药物组合物在对其有需要的受试者中治疗癌症或预防肿瘤转移的方法，其中所述抗体或功能性片段结合至sLea并包括具有选自下列的氨基酸序列的VL域：SEQ ID NO：4的残基20-130、SEQ ID NO：8的残基20-129、SEQ ID NO：12的残基20-130和SEQ ID NO：16的残基23-130。在另一个方面，本发明提供了通过施用治疗有效量的具有抗体或其功能性片段的药物组合物在对其有需要的受试者中治疗癌症或预防肿瘤转移的方法，其中所述抗体或功能性片段结合至sLea并包括VH域和VL域两者，其中VH域和VL域分别包括选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的残基20-142和SEQ ID NO：4的残基20-130；SEQ ID NO：6的残基20-142和SEQ ID NO：8的残基20-129；SEQ ID NO：10的残基20-142和SEQ ID NO：12的残基20-130；和SEQ ID NO：14的残基20-145和SEQ ID NO：16的残基23-130。
如本文所述的那些的制剂还可以含有不止一种待治疗的特定疾病所必需的活性化合物。在某些实施方式中，制剂包含本发明的抗体或功能性片段和具有彼此不会不利地影响的补充活性的一种或多种活性化合物。这些分子以对预定用途有效的量适合地以组合存在。例如，本发明的抗体或功能性片段可以与一种或多种其他治疗剂混合。可以同时或依次将这些组合疗法施用于受试者。
因此，在一些方面，本发明提供了通过向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本文所提供的药物组合物治疗或预防疾病的方法，其中所述药物组合物包含本发明的抗体或功能性片段和第二治疗剂。如本文所讨论的，本领域的技术人员可以容易地确定适合的第二治疗剂。如本文在实施例IV中所提供的，在本发明的一些方面，第二治疗剂可以是泰素(Taxol)。
本文所提供的药物组合物在可药用载体中含有治疗有效量的一种或多种本文所提供的本发明的抗体，和任选地一种或多种其他治疗剂。这些药物组合物在疾病(如癌症或肿瘤形成或其一种或多种症状)的预防、治疗、控制或改善中是有用的。
药物组合物可以含有一种或多种本发明的抗体或功能性片段。在一种实施方式中，将抗体或功能性片段配制到适合的药物制剂中，如用于肠胃外施用的无菌溶液或混悬液。在一种实施方式中，使用本领域中公知的技术和程序，将本文所提供的抗体或功能性片段配制到药物组合物中(参见，例如，Ansel(1985)Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第4版，p.126)。
可以将本发明的抗体或功能性片段在对治疗的受试者没有不希望的副作用的情况下以足以产生治疗有效作用的治疗有效量包含在药物组合物中。可以通过使用常规方法在体外和体内系统中测试化合物，然后由此外推用于人的剂量来经验性地确定治疗有效浓度。药物组合物中抗体或功能性片段的浓度将取决于(例如)抗体或功能性片段的物理化学特性、剂量施用时间表和所施用的量以及本领域技术人员公知的其他因素。
在一种实施方式中，治疗有效剂量生产了约0，1ng/ml至约50-100μg/ml的抗体或功能性片段的血清浓度。在另一种实施方式中，药物组合物提供了约0.001mg至约500mg抗体/公斤体重/天的剂量。可以制备药物剂量单位形式以提供约0.01mg、0.1mg或1mg至约30mg、100mg或500mg，并且在一种实施方式中，约10mg至约500mg的抗体或功能性片段和/或每个剂量单位形式的其他任选必需成分的组合。
可以一次施用本发明的抗体或功能性片段，或可以将其分成以一定时间间隔施用的一些较小剂量。应理解治疗的精确剂量和持续时间是要治疗的疾病的函数，并且可以使用已知的测试规程或通过体内或体外测试数据外推来经验性地确定。应注意，浓度和剂量值还可以随要减轻的病况的严重程度而变。还应理解对于任何特定受试者，可以根据个体需要以及施用或监督化合物施用的人的专业判断而随时间调整具体剂量方案，并且本文所说明的浓度范围仅是示例性的，而不是意在限制所要求保护的组合物的范围和实际应用。
一旦混合或添加本发明的抗体或功能性片段，则所得混合物可以是溶液、混悬液等。所得混合物的形式取决于一些因素，包括预期施用形式和化合物在所选载体或媒介物中的溶解度。有效浓度足以改善要治疗的疾病、病症或病况的症状，并且可以通过经验确定。
以单位剂量形式提供用于人和动物施用的药物组合物，如含有适合的量的化合物或其可药用衍生物的无菌肠胃外溶液或混悬液。在一种实施方式中，可以以单位剂量形式或多剂量形式配制和施用抗体或功能性片段。单位剂量形式是指如本领域中已知的，适合人和动物受试者并且单独包装的物理上分离的单元。每个单位剂量含有与所需的药物载体、媒介物或稀释剂相结合足以产生所需治疗效果的预定量的本发明的抗体或功能性片段。单位剂量形式的实例包括安瓿瓶和注射器。可以部分或多次施用单位剂量形式。多剂量形式是包装在单个容器中以分离的单位剂量形式施用的多个相同的单位剂量形式。多剂量形式的实例包括品脱或加仑小瓶或瓶。因此，多剂量形式是在包装中不分开的多个单位剂量。
在一种实施方式中，本发明的一个或多个抗体或功能性片段处于液体药物制剂。可以(例如)通过将如本文所提供的抗体或功能性片段和任选的药物佐剂溶解、分散或混合在载体，如，例如，水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等中，从而借此形成溶液来制备液体药物可施用的组合物。如果需要，要施用的药物组合物还可以含有少量无毒助剂物质，如润湿剂、乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂等，例如，乙盐酸、柠檬酸钠、环糊精衍生物、单月桂酸山梨聚糖酯、三乙醇胺乙酸钠、油酸三乙醇胺酯及其他这类试剂。制备这些剂量形式的实际方法是已知的或对本领域技术人员是显而易见的；例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.，Easton，PA。
施用本发明的药物组合物的方法在本领域中是公知的。应理解可以通过熟练的临床医师容易地确定药物组合物的适合施用途径。示例性施用途径包括静脉注射、肌肉注射、皮内注射或皮下注射。此外，应理解可以容易地调节药物组合物的制剂以适合施用途径。本发明还提供了在本发明的药物组合物施用后，可以将如本文所提供的一种或多种药物组合物的迟延、连续和/或重复剂量施用于受试者。
本发明用于治疗疾病的方法旨在包括(1)预防疾病，即在可能易患疾病，但尚未经受或显示疾病症状的受试者中导致疾病临床症状不出现；(2)抑制疾病，即阻止或降低疾病或其临床症状的发展；或者(3)减轻疾病，即导致疾病或其临床症状的消退。本发明用于预防疾病的方法旨在包括阻碍指示癌症或肿瘤形成的临床症状。这种阻碍包括(例如)受试者中正常生理学指示物的维持。因此，预防可以包括受试者的预防性治疗以保护它们不会发生肿瘤转移。
在本发明所述的方法中使用的药物组合物的治疗有效量将根据要治疗的受试者的所使用的药物组合物、疾病及其严重程度以及年龄、体重等而改变，所有这些均在主治临床医师的技术范围内。可以通过本发明所述的方法治疗的受试者包括脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人。
应理解在本文所提供的本发明的定义内还提供了基本上不影响本发明的多个实施方式的活动的修改。因此，以下实施例旨在说明但不限制本发明。
实施例I
抗sLea的人单克隆抗体具有有效的抗肿瘤活性
糖抗原sLea在胃肠道、乳腺和胰腺上皮细胞肿瘤以及在小细胞肺癌上广泛表达。由于sLea的过表达似乎是多种肿瘤的侵袭和转移中的重要事件并导致对抗体介导的溶胞敏感，因此sLea在肿瘤治疗中是有吸引力的分子靶标。因此，如本文所述，产生并鉴定了来自sLea-KLH疫苗免疫的个体的血液淋巴细胞的完整人单克隆抗体(mAb)。基于ELISA和FACS选择了一些mAb，包括对sLea具有高亲合力的两个mAb(5B1和7E3，结合亲合力分别为0.14和0.04nmol/L)并进一步鉴定了它们。如通过聚糖阵列分析确定的，两个抗体对Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ和Neu5Gcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ特异。r7E3(IgM)对DMS-79细胞的补体依赖性细胞毒性比r5B1(IgG1)高(EC500.1μg/mL相对于1.7μg/mL)。另外，通过人NK细胞或周围血单核细胞，r5b1抗体对DMS-79细胞显示出高抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性水平。为了评价体内效力，在使用移植到重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠的Colo205肿瘤细胞或DMS-79肿瘤细胞的异种移植模型中测试抗体。在Colo205异种移植模型中，在使用4次r5B1剂量(100μg每剂量)的前21天期间，治疗使中值存活时间加倍至207天，并且5只动物中有3只通过6次剂量存活。在DSM-79异种移植模型，在用r5B1抗体治疗的动物中，所建立的DMS-79肿瘤的生长被抑制或消退。基于sLea作为免疫攻击靶标的潜能以及它们的亲合力、特异性和效应子功能，5B1和7E3在癌症治疗中具有临床应用。
材料、细胞和抗体
DMS-79(Pettengill等人，Cancer，45：906-18(1980))、SW626、EL4、HT29、BxPC3、SK-MEL28和P3×63Ag8.653细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。Colo205-luc细胞(Bioware ultra)获自Caliper Life Sciences。鼠对照mAb 121SLE(IgM)购自GeneTex。sLea四糖(Cat#S2279)购自Sigma-Aldrich。sLea-HSA(人血清白蛋白)缀合物(Cat#07-011)、一价生物素化的sLea(sLea-sp-生物素；Cat#02-044)、多价生物素化的sLea-PAA(Cat#01-044)、生物素-标记的Lea-PAA(Cat#01-035)和sLex-PAA-生物素(Cat#01-045)购自GlycoTech。在多价递呈(polyvalent presentation)中，将所述四糖引入聚丙烯酰胺基质(PAA)，借此产生30-kDa的多价聚合物，其中聚合物链的大约每五个酰胺基被生物素以4∶1的比值N-取代，并且碳水化合物含量为约20％。如所述的，使用sLea戊烯基糖苷在实验室内制备在本研究中使用的其他HSA或BSA糖缀合物。Ragupathi等人，CancerImmunolImmunother，58：1397-405(2009)。GD3、岩藻糖基-GM1、GM2和GM3购自Matreya，GD2购自Advanced ImmunoChemical。
抗-sLea mAb的杂交瘤的产生
按照MSKCC-和FDA-批准的IRB规程和IND，在MSKCC起始的正在进行的sLea-KLH缀合物疫苗试验中的乳腺癌患者中，从3位患者获得血液样品。在3或4次疫苗接种后，从2位患者选择血液样本，他们对sLea分别显示出1/160和1/320的抗体滴度。这些血清(和鼠mAb19.9)在FACS测定中与sLea-阳性细胞系反应良好并介导了有效的CDC。Ragupathi等人，CancerImmunolImmunother，58：1397-405(2009)。通过在Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)上的梯度离心，从约80至90mL的血液分离了周围血单核细胞(PBMC)。
在补充有1-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、维生素、青霉素/链霉素、10％FBS(Omega Scientific)、10ng/mL IL-21(Biosource)和1μg/mL抗-CD40mAb(G28-5杂交瘤上清液；ATCC)的RPMI-1640培养基中培养PBMC。通过电融合将细胞融合至P3×63Ag8.653骨髓瘤细胞。
sLea ELISA
对于sLea ELISA，用1μg/mL sLea-HSA缀合物、一价生物素化的sLea或捕获在涂覆有Neutr-抗生物素蛋白的板上的多价生物素化的sLea-PAA涂覆板。未涂覆的孔(PBS)和HSA-涂覆的孔用作对照。开始，用辣根过氧化物酶(HRP)-标记的山羊抗人IgA+G+M(JacksonImmunoResearch)检测结合的抗体，并随后用IgG-Fc-或者IgM-特异性第二抗体检验阳性孔以确定同种型。
碳水化合物特异性分析
通过表面等离子共振(SPR)评价并且使用生物素-标记的Lea-PAA和生物素-sLex-PAA确认对密切相关的抗原Lea和sLex的交叉反应性。通过ELISA测试对神经节糖苷GD2、GD3、岩藻糖基-GM1、GM2和GM3的结合。使用竞争性ELISA评价mAb对一些其他相关碳水化合物部分的特异性。简言之，将2μg/mL sLea-HSA缀合物涂覆至板上，随后用3％BSA在PBS中的溶液封闭。然后，将30μL非缀合或缀合至HSA或BSA的不同的碳水化合物部分(40μg/mL在PBS中的溶液，从1mg/mL储液制备)分别与30μL测试抗体混合，并在样品板中在室温下孵育。30分钟后，将50μL混合物转移至涂覆的测定板中并孵育1小时，然后与HRP-标记的山羊抗人IgA+G+M孵育，清洗并使用Versamax荧光分光光度计比色检测结合的抗体(所有步骤在室温下进行)。测试的碳水化合物部分包括globo H、Lewis Y、Lewis X、唾液酰基-Thomson-nouveaux(sTn)、簇sTn(clustered sTn)、Thomson Friedenreich(TF)、Tighe Leb/LeY粘蛋白、猪下颚粘蛋白(PSM)以及sLea四糖和sLea-HSA缀合物。为了确定抗体的精细特异性，通过功能性糖类协会核心H组(Consortium for Functional Glycomics Core H group)进行聚糖阵列分析。使用由465个聚糖组成的4.1版印制阵列，以10μg/mL测试5B1和7E3抗体，实验重复6次。
免疫球蛋白cDNA克隆和重组抗体表达
通过RT-PCR，从单个杂交瘤细胞系回收人mAb重链和轻链可变区cDNA，并亚克隆至IgG1或IgM重链或者IgK或IgL轻链表达载体，如前所述。Sawada-Hirai等人，J.ImmuneBased Ther.Vaccines，2：5(2004)。Ig重链或轻链表达载体是Not I和Sal I双消化的，然后将两个片段连接以形成双-基因表达载体。在6孔板中，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用双-基因表达载体转染CHO细胞。24小时后，将转染的细胞转移至具有选择培养基[补充有10％透析的FBS(invitrogen)、50μmo1/11-蛋氨酸磺基肟(MSX)、GS补充剂(Sigma-Aldrich)和青霉素/链霉素(Omega Scientific)的DMEM]的10-cm平皿中。两周后，分离并扩增MSX-抗性转染子。通过在sLea-特异性ELISA测定中测量上清液中的抗体水平选择抗-sLea抗体高产克隆，并扩增用于大规模mAb生产。
人mAb的纯化
使用运行Unicorn 5.0软件的Akta Explorer(GE Healthcare)系统纯化抗体。简言之，将稳定的5B1或7E3克隆在Wave生物反应器中在无血清培养基中生长，通过离心和过滤使收获的上清液澄清，并将其冷冻储存直至使用。使用10mmol/L PBS和150mmol/L NaCl的运行缓冲液，在大小合适的蛋白A柱上纯化人IgG抗体。在羟基磷灰石柱上纯化人IgM抗体，并用500mmol/L的磷酸盐梯度洗脱IgM。通过OD280确定抗体浓度，使用对IgG和IgM分别为1.4和1.18的E1％来计算浓度。在还原条件下，通过SDS-PAGE分析(1-5μg/泳道)评价每个制剂的纯度，并基于重链和轻链的总和，纯度大于90％。
流式细胞术
在PBS/2％FBS(PBSF)中清洗sLea-阳性或-阴性肿瘤细胞系(每个条件0.5×106个细胞)。然后，加入测试或对照人mAb(1-2μg/mL，在完全培养基中)并在冰上孵育30分钟。Gilewski等人，Clin Cancer Res，6：1693-701(2000)；Gilewski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98：3270-5(2001)。在PBSF中清洗后，在冰上用Alexa-488抗人IgG-Fcγ或者抗人IgM-μ(invitrogen)孵育细胞30分钟。在PBSF中清洗细胞两次，并使用Guava Personal Cell Analysis96(PCA-96)系统(Millipore)通过流式细胞术进行分析。将Colo205-luc细胞与2μg/mL的第一抗体一起孵育，随后用来自SouthernBiotech的第二抗体染色，并使用FlowJo7.2.4软件在Becton Dickinson FACS Advantage IV仪上分析。
亲合力确定
通过Biacore 3000(GE Healthcare)，使用SPR的原理确定亲合常数。根据生产商的说明，将生物素-标记的一价sLea(Cat#02-044)或多价sLea-PAA-生物素(Cat#01-044)偶联至SPA生物传感器芯片的单独的流通池。用HSA封闭流通池，并将含有游离生物素的培养基用作参比池。使用sLea-PAA-生物素-涂覆的流通池，从在HBS-EP缓冲液(10mmol/LHEPES，pH7.4，150mmol/L NaCl，3.4mmol/L EDTA，0.005％表面活性剂P20)中稀释的一些已知抗体浓度确定结合动力学参数。使用Biacore instrument提供的曲线拟合软件产生结合和解离速率的估计值，并从中计算亲合力。
CDC测定
使用人补充剂(Quidel；Cat#A113)和多个稀释度的纯化的人mAb(0.1-25μg/mL)或使用如前所述的阳性对照mAb，将sLea抗原-阳性和-阴性细胞系用于90-分钟细胞毒性测定(Guava PCA-96细胞毒性试剂盒；Millipore；Cat#4500-0200)(Ragupathi等人ClinCancerRes 2003，9：5214；Ragupathi等人Int J Cancer 2000，85：659；Dickler等人CancerRes1999，5：2773)。简言之，用羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CSFE)对2.5×106个靶细胞染色以获得绿色/黄色荧光靶细胞。将染色细胞(1×105/50μL样品)与100μL抗体在冰上孵育40分钟。然后，将50μL在完全培养基(RPMI-1640，10％FCS)中1∶2稀释的人补充剂或者单独的培养基加入至三份重复样品中，并在37℃孵育90分钟。因此，测定中最终的补充剂稀释为1∶8。通过加入膜不渗透性染料7-氨基-放线菌素D(7-AAD)标记在孵育期间被杀死的细胞，使用Guava CellToxicity软件模块通过双色免疫荧光分析样品。将接受NP40的对照样品用于确定最大杀死，并将接受单独的补充剂的样品用作基线。通过适当设门来确定杀死细胞的百分比，并根据下式进行计算：％杀死＝[(％样品-％单独的补充剂)/(％NP40-％单独的补充剂)]×100。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定
通过Ficoll-Hypaque密度离心，从根据MSKCC IRB-批准的规程获得的血液样品分离PBMC效应细胞。在存在5％CO2的情况下，在37℃，将靶细胞以5×106个细胞/mL在具有15μL0.1％钙黄绿素-AM溶液(Sigma-Aldrich)的完全生长培养基中孵育30分钟。用15mL PBS-0.02％EDTA清洗细胞两次，并在1mL完全生长培养基中再悬浮。在存在或不存在图13中所述浓度的抗体的情况下，将50微升(10000个细胞)标记的靶细胞铺板到96-孔板中，并因此与50μL新鲜分离的周围血单核细胞(效应细胞，100：1E/T比)孵育。孵育2小时后，将板以300×g离心10分钟，并将75μL上清液转移到新的平底96-孔板中。在Fluoroskan Ascent(ThermoScientific)中，在485-nm激发和535-nm发射测量上清液中的荧光。对具有30％FBS且无效应细胞的RPMI-1640培养基中的靶细胞确定自发释放，并对具有30％FBS和6％Triton X-100且无效应细胞的RPMI-1640培养基中的靶细胞确定最大释放。细胞毒性百分比计算为[(样品中的计数-自发释放)/(最大计数-自发释放)]×100。
mAb内化测定
针对在96孔板(2000个细胞/90μl/孔)中铺板并孵育过夜的表达sLea的BxPC3细胞(重复两次)，通过测量r5B1和Hum-ZAP第二缀合物(Advanced Targeting Systems)复合物的细胞毒活性评价5B1抗体的内化。根据生产商的说明，在RT将不同浓度的5B1抗体与Hum-ZAP第二缀合物一起孵育。然后，将10μl/孔的r5B1和Hum-ZAP复合物加入至细胞并孵育3天。将25微升噻唑蓝溴化四唑(Sigma-Aldrich)溶液(5mg/mL，在PBS中的溶液)加入每个孔中并在37℃孵育。孵育2小时后，将100μL/孔的溶解溶液(20％SDS/50％N，N-二甲基甲酰胺)加入至每个孔中并在37℃孵育另外16小时。在570/690nm测量OD，将使用单独的培养基所获得的值用于板背景扣除。将8个不使用抗体的平行培养用于归一化样品值(样品/未处理的平均值×100)。
异种移植模型
雌性CB17 SCID小鼠(5-8周龄)购自Taconic。对于Colo205异种移植模型，在第0天使用具有28G针的BD胰岛素注射器(Becton Dickinson&Co)通过尾静脉注射在0.1mL完全生长培养基中的Colo205-luc细胞(0.5×106)。对于第一个研究，在第1、7、14和21天(实验1)或在第1、4、7、10、14和21天(实验2)腹膜内注射100微克mAb 5B1。对于第二个研究，在肿瘤细胞注射后的第4天，腹膜内注射100μg、300μg或1mg的mAb 5B1，然后对于前两周，每周注射两次，并在随后7周，每周一次。监控小鼠的肿瘤发展。对于DMS-79异种移植模型，将DMS-79细胞(1×106)皮下注射到雌性CB17 SCID小鼠中，并在肿瘤长度达到5mm(～20mm2)后在第19天，小鼠开始治疗。然后，使用以200μg每剂量通过腹膜内注射施用的人IgG或5B1抗体加上为提高血管通透性起初以80μg，然后每周5天，40μg每剂量静脉注射直至第37天的cRGD处理动物。
所有程序均在纪念斯隆-凯特林癌症中心(Memorial Sloan Kettering CancerCenter)实验动物关怀及使用委员会批准的规程下进行。使用GraphPad Prism5.1(GraphPad软件)产生Kaplan-Meier生存曲线，并使用Mantel-Haenszel对数秩检验分析。
结果
通过ELISA鉴别人单克隆抗体和重组抗体的产生
将来自3位接种患者的血液样品用于杂交瘤产生，并在抗原特异性ELISA测定中检测到了多个阳性孔(表3)。使用大量筛选来消除显示出较差或非特异性结合的抗体。起初选择了对sLea具有稳定反应性的八个表达人抗体的杂交瘤细胞(1个IgM和7个IgG)、扩增并亚克隆以用于进一步鉴定。两个抗体(9H1和9H3)显示对sLea-HSA缀合物具有强烈结合，但是对sLea-PAA涂覆的板没有。当通过ELISA测定测量时，三个抗体(5B1、5H11和7E3)显示对一价和多价sLea以及sLea-HSA缀合物具有强烈结合(表4)。
表3：含有IgG或IgM单克隆抗体的候选杂交瘤上清液与sLea-乙酰基苯二胺(APD)-人血清白蛋白(HSA)缀合物(sLea-HuSA)的结合。
Figure BDA0002789388870000401
*减去同种型对照空白。HuSA表示人血清白蛋白对照。
PBS表示磷酸盐缓冲盐水对照。
表4：所选抗体与作为一价(单-)sLea、多价(聚-)sLea或sLea-HSA形式提供的sLea的结合。
Figure BDA0002789388870000411
HuSA表示人血清白蛋白对照。PBS表示磷酸盐缓冲盐水对照。NAV表示中性抗生物素蛋白对照。
通过RT-PCR回收来自4个所选抗体的重链和轻链可变区，并克隆至我们的全长IgG1或IgM表达载体。使用IMGT/V-Quest(Brochet等人，Nucleic Acids Res.，36：W503-8(2008))的分子序列分析显示3个所选IgG抗体5B1(IgG/λ)、9H3(IgG/λ)和5H11(IgG/λ)来源于相同VH家族并且均使用λ轻链。这些IgG1抗体显示了不同的CDR序列，其分别与种系具有16、5或3个突变(图1-6；表5)。IgM抗体(7E3)使用κ轻链并且具有6个重链突变(图7-8；表5)。5B1中突变的增加是亲合力成熟的指示。在摇袋式生物反应器系统中在CHO细胞系中产生重组抗体，并且对IgG和IgM分别使用蛋白A或羟基磷灰石色谱法进行纯化。对于ELISA结合和特异性，纯化的重组抗体保留了原始杂交瘤来源的抗体的性质。
表5：来源于接种的血液供体的所选人抗-sLea抗体的cDNA分类。
Figure BDA0002789388870000412
肿瘤细胞结合的分析
细胞表面结合对细胞毒活性是至关重要的，并因此随后进行了测定。流式细胞术显示5B1、9H3、5H11和7E3重组抗体与DMS-79细胞、小细胞肺癌混悬细胞系的强烈结合(图11A)。还对HT29结肠癌细胞(图11B)、BxPC3胰癌细胞(图11C)、SW626卵巢癌细胞(图11D)和Colo205-luc结肠癌细胞(图11F)确认了r5B1和r7E3的结合。这些抗体不能与sLea-阴性(SLE121-阴性)SK-MEL28黑素瘤细胞(图11E)或EL4小鼠淋巴瘤细胞(数据未显示)结合。
亲合力测量
使用捕获生物素化的sLea-ppA的抗生蛋白链菌素-涂覆的生物传感器芯片，通过SPR检查了与sLea结合的相对亲合力/亲合力(affinity/avidity)。如表6所示，r5B1和r7E3与sLea-pPA快速结合并且与121SLE(用于比较的可商购的鼠IgM抗-sLea抗体)相比，显示出显著较慢的解离速率。5B1的亲合力测量为0.14nmol/L，并且7E3的表观亲合力/亲合力(affinity/avidity)高约4倍(表6)。由于9H3抗体(天然和重组)不能结合至sLea-PAA-涂覆的生物传感器芯片，因此妨碍了9H3亲合力的测定。
表6：通过SPR对抗-sLea抗体的动力学参数的测定。
Figure BDA0002789388870000421
特异性分析
如通过ELISA或SPR所测量的，探索碳水化合物特异性的初步测定显示5B1、9H3和7E3不结合至密切相关的sLex、Lea或LeY抗原或者神经节糖苷GD2、GD3、岩藻糖基-GM1、GM2和GM3。7E3、5B1和121SLE与捕获在Biacore抗生物素蛋白芯片上的sLea-PAA-生物素或者sLea-sp-生物素结合的其他分析显示所有三个抗体结合至sLea的多价形式，而发现7E3和5B1结合一价形式。在Biacore浓度分析系列中，sLea四糖还以剂量依赖性方式抑制5B1与sLea-PAA的结合(数据未示出)。这些结果与以上观察结果一致：通过ELISA发现具有高抗-sLea抗体滴度的血清对sLea是特异性的，即与神经节糖苷GM2、GD2、GD3、岩藻糖基-GM1或中性糖脂globo H和Ley不反应。Ragupathi等人，Cancer ImmunolImmunother 58：1397-405(2009)。在多种递呈中(例如，作为神经酰胺或缀合至BSA或HSA)，在与9种不同的相关碳水化合物部分的竞争测定中，仅sLea四糖和sLea-HSA缀合物能够抑制与sLea-HSA缀合物的结合(表7)。
表7：在存在多种相关糖缀合物的情况下与sLea-PAA-HSA的结合
Figure BDA0002789388870000422
Figure BDA0002789388870000431
为了进一步详细检验碳水化合物的特异性，还通过功能性糖类协会核心H组(Consortium for Functional Glycomics Core H group)的聚糖阵列分析测试了5B1和7E3抗体。以10μg/ml，在由465个聚糖组成的印制阵列上测试了两种抗体，实验重复6次。结果确认了两种抗体的高特异性，其选择性识别sLea四糖Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ和Neu5Gcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ，并且实质上不结合阵列中存在的密切相关的抗原，包括sLex、Lea、Lex和Ley。表8中总结了结果，其示出了各个抗体识别的465个聚糖结构中排名前5的结构。
表8：通过聚糖阵列筛选的碳水化合物特异性分析。
A.5B1
Figure BDA0002789388870000432
B.7E3
Figure BDA0002789388870000433
Figure BDA0002789388870000441
CDC活性
为了评价5B1和7E3的功能活性，我们在存在人血清作为补充剂来源的情况下对DMS-79细胞测试了细胞毒活性。在一些测定中，两种抗体在10μg/mL显示出接近于100％的杀死活性，而在相同浓度，具有不同特异性的对照抗体(1B7、抗-GD2 IgG1 mAb)没有影响(数据未显示)。CDC活性是浓度依赖性的，而在该测定中，7E3比5B1显著活性更高(图12)，这是所预期的，因为在补体介导的细胞毒测定中已知IgM抗体更有效。对于5B1的EC50(50％细胞毒性)为1.7μg/mL，7E3的EC50为0.1μg/mL，基于摩尔计算，这相当于比7E3的效力大约要高85倍(图12)。
ADCC活性
尽管在CDC测定中7E3显著更有效，但是已知IgG抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，这被认为对肿瘤体内杀死是重要的。使用5B1抗体，通过人PBMC和DMS-79靶细胞，以多个E∶T比测量了高细胞毒性水平(图13A)。通过原代NK细胞，在较低E∶T比情况下观察到了类似的细胞毒性水平(图13B)。通过来自2位供体的PBMC，以100∶1的E/T比测量的剂量-反应实验显示了类似的效力，并且在0.5μg/mL或以上的5B1浓度达到了大于85％的细胞毒性(图13C)。5B1介导的细胞毒性需要FcγRIII受体，这是因为它可以被3G8抗-CD16抗体阻断。还使用抗Colo205-luc细胞的5B1抗体，通过人PBMC以100∶1的E∶T比测量了高细胞毒性水平。以1μg/mL 5B1抗体实现的ADCC活性优于使用抗GM2、岩藻糖基-GM1、globo H或聚唾液酸的抗体所观察到的活性。如所期望的，在该测定中7E3和鼠121SLE(两者均为IgM)是无活性的。
5B1内化测定
先前表明在动物模型中抗与Lewis Y“密切相关的”抗原的抗体缀合物快速内化并且是非常有效的。Hellstrom等人，CancerRes 50：2183-90(1990)；Trail等人，Science261：212-5(1993)。为了检测sLea是否内化，我们将胰腺细胞系BxPC3与5B1一起孵育，然后加入Hum-ZAP，缀合至核糖体-失活蛋白肥皂草素的抗人IgG。Kohls等人，Biotechniques28：162-5(2000)。内化含肥皂草素的复合物的细胞死亡，而未内化的肥皂草素不会损伤细胞。如图14所示，在存在高剂量5B1的情况下，有效杀死了BxPC3细胞，而存在抗GD2(在这些细胞上不表达)的同种型匹配的IgG1抗体时，却不会杀死细胞。
异种移植动物模型中的转移活性
为了评价5B1的体内活性，在SCID小鼠中，使用Colo205-luc肿瘤细胞或DMS-79肿瘤细胞中的任一个，在两个异种移植模型中测试了抗体。对于使用Colo205-luc肿瘤细胞的异种移植模型，在第0天对每组5只小鼠向尾静脉注射0.5×106个细胞，并且通过使用IVIS200体内成像系统(Caliper Life Sciences)对动物成像来验证细胞的成功注射。1天后，通过腹膜内施用的5B1抗体或PBS模拟注射治疗动物。在实验1中，在第1、7、14和21(400μg总剂量)施用100μg 5B1，并且在实验2中，在第1、4、7、10、14和21天，动物接受100μg 5B1(600μg总剂量)。在实验2中，未治疗动物的平均中值存活时间为102天，并且所有未治疗动物在155天内死亡(图15)。动物治疗显著改善了存活：在接受4次剂量5B1的组中，中值存活时间加倍至207天，并且5只动物中有2只存活直至301天后实验结束(对数秩检验，P＝0.0499；HR＝3.46)。当施用6次剂量时，存活者比例进一步提高至5只小鼠中3只存活(对数秩检验，P＝0.0064；HR＝6.375)。在308天后终止第2组实验，并且在最灵敏的成像系统中，存活动物不能显示Colo205-luc肿瘤(数据未示出)。
在第2组研究中，用高剂量的5B1或7E3抗体(100μg、300μg或者1mg)治疗如上所述类似地注射Colo205-luc肿瘤细胞的小鼠。起初，在肿瘤细胞注射后的第4天，所有动物腹膜内接受5B1或7E3抗体或者PBS模拟注射(对照)，然后在前2周，每周2次并且在随后7周，每周1次。在植入了Colo205-luc肿瘤细胞的SCID小鼠中，多个5B1剂量的延迟治疗显示高达完全治愈的剂量依赖性保护(图16和图17)。7E3抗体的治疗未显示出更高的保护，尽管表观亲合力提高(数据未示出)。
在使用DMS-79细胞的异种移植模型中，在第0天每组5只小鼠皮下注射1×106个细胞，并在肿瘤长度达到5mm(～20mm2)后的第19天开始治疗。然后，通过以每个剂量200μg腹膜内注射施用的人IgG或5B1抗体，加通过静脉注射的cRGD(开始80μg，然后每周5天，每次剂量40μg，直至第37天)治疗动物。在用5B1或5B1加cRGD的组合治疗的动物中，所建立的DMS-79肿瘤的生长被抑制或消退(图18A和图18B)。DMS-79细胞植入当天，在皮下模型中，使用5B1的动物治疗完全防止肿瘤生长(数据未显示)。
以上数据显示了使用5B1抗体治疗抑制或消退所建立的肿瘤和提供存活益处的显著能力。
实施例II
使用放射性标记的单克隆抗体5B1的胰癌及其他sLea阳性腺癌的免疫-PET检测和诊断
腺癌是癌症的主要死因。胰癌的检测仍是特别困难的，通常确诊都在晚期。原发性和转移性胰癌的早期检测方法可以具有显著临床影响。在临床实践中，监控sLea抗原水平升高以鉴别胰癌患者中怀疑的隐藏恶性肿瘤。如本文所述，在胰癌及其他sLea阳性腺癌的临床前模型中研究了靶向sLea的新型免疫PET成像探针的潜能。人抗sLea单克隆抗体5B1显示对已知为sLea阳性的人腺癌阳性染色，但是不能对sLea阴性恶性肿瘤或大部分正常组织染色。89Zr放射性标记的5B1(89Zr-5B1)显示出高标记(＞80％)和纯化得率(＞95％)。在雌性SCID小鼠中，在皮下、正位和转移性胰癌异种移植中研究了使用89Zr-5B1的成像。所采集的PET图像和生物分布研究显示出89Zr-5B1对sLea过表达BxPC3异种移植出色的特异性和定位，并且与健康组织的非特异性结合最小。结肠和小细胞肺癌皮下异种移植模型中的进一步分析还获得了通过89Zr-5B1的优良的肿瘤示意图。因此，这些结果表明89Zr-5B1可以在临床中用作sLea表达恶性肿瘤早期检测的分子探针。
细胞系和组织培养
按照无菌技术进行所有组织培养操作。小细胞肺癌DMS79和BxPC3胰腺癌细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。Colo205-luc结肠直肠癌细胞(BiowareUltra)购自Caliper Life Sciences(CLS，Hopkinton，MA)。根据ATCC和CLS的建议，所有细胞在37℃，在5％CO2的加湿气氛中生长。
通过FACS的sLea表达水平的体外评价
如本文所述，在实施例I中使用所指明的培养的癌细胞系进行了流式细胞术。简言之，在具有3％胎牛血清(FBS)的PBS中清洗每管1×106个培养肿瘤细胞的单细胞混悬液。然后，以每管20μg/ml加入人单克隆抗体r5B1(抗sLea的IgG)，并在冰上孵育30分钟。在具有3％FBS的PBS中清洗后，加入20μl用荧光素-异硫氰酸盐(FITC，Southern Biotechnology，Birmingham，AL)标记的1∶25稀释的山羊抗人IgG，并将混合物在冰上再孵育30分钟。最终清洗后，使用FACS扫描(Becton&Dickinson，San Jose，CA)区分染色细胞的阳性群体和中值荧光强度。将仅被荧光素-异硫氰酸盐标记的山羊抗人IgG染色的细胞用于作为背景将FACScan结果设置为1％，以用于和原代mAb染色的阳性细胞百分比进行比较。
89Zr-标记的抗体的制备
如本文所述，制备并纯化了重组5B1抗体。以1∶4的mAb：DFO-Bz-NCS比，用p-异硫氰酸苄基-去铁胺(DFO-Bz-NCS，Macrocyclics，Inc.，Dallas，TX)对5B1抗体和非特异性人IgG进行官能化。例如，向300μL 5B1(1.23mg，在PBS中的溶液，pH～9)中加入体积7.2μL的DFO-Bz-NCS(4.25mM，在DMSO中的溶液)。在37℃，将反应孵育1-1.5小时。通过PD10脱盐柱(GEHealthcare)或者10kDa离心过滤器(Amicon)纯化功能化抗体。
通过钇箔片的质子束轰击产生Zr-89，并根据先前建立的程序在MSKCC作为Zr-89草酸盐以高纯度分离。Holland等人，Nuclear Medicine and Biology 36：729-39(2009)。通过Holland等人，Journal of Nuclear Medicine official publication，Society ofNuclear Medicine 51：1293-300(2010)所述的方法进行抗体标记。一般地，用1M Na2CO3将Zr-89草酸盐中和至pH 7.0-7.2。然后，加入DFO-抗体。将反应在室温下孵育1-2小时。使用PD10脱盐柱，用0.9％的盐水进行后续纯化。
体外实验
在37℃，在0.9％的盐水和1％的牛血清白蛋白中，研究89Zr-5B1的体外稳定性5天。以50mM DTPA作为流动相，通过放射性iTLC，在t＝0-5天监控放射化学纯度的变化。根据Lindmo等人，Journal of Immunological Methods 72：77-89(1984)所述的规程，进行体外免疫反应性测定以表明Zr-89放射性标记的抗体的完整性。
动物模型
根据实验动物关怀及使用委员会设定的方针，进行所有动物研究。在后腿上用肿瘤诱导雌性CB17SC-F SCID小鼠(Jackson Laboratories，6-8周，20-22g)或无胸腺(nu/nu)裸鼠。在200μL1∶1培养基：Matrigel(BD Biosciences)溶液中皮下接种所有细胞系，并在使用前使其生长至最大肿瘤体积250mm3。
生物分布研究
对具有单独的Colo205-luc结肠直肠、BxPC3胰腺和DMS79小细胞肺异种移植的一些小鼠群组进行生物分布研究(n＝3-5)。在侧静脉中静脉内施用在100μl 0.9％的盐水中的Zr-89mAb(10-20μCi，1-2μg)。与示踪剂一起共注射其他未标记的mAb(10-50μg)。使用250μg过量的未标记mAb进行阻断研究以应对小鼠群组中抗体对sLea的特异性。每个时间点后(t＝24小时、48小时、120小时，p.i.)，通过用CO2窒息使小鼠安乐死。立即通过心脏刺穿采集血液，同时与所选择的器官一起收获肿瘤。测量每个组织的湿重，并使用Wizard2 2480γ计数器(Perkin Elmer)对结合至每个器官的放射性计数。将表示为注射剂量％/克(％ID/g)的示踪剂百分比计算为结合至单位器官重量的单位实际注射剂量的活性降低-修正至计数时间。
小动物免疫-PET
使用microPET Focus 120或R4扫描仪(Concorde Microsystems)进行成像实验。通过侧尾静脉注射，向小鼠(n＝3-5)施用100-200μL 0.9％的盐水制剂中的Zr-89标记的抗体(200-300μCi，15-25μg)。在24-96小时，p.i.，在用1.5-2.0％在氧气中的异氟烷(BaxterHealthcare)麻醉时，对小鼠记录PET全身采集。使用ASIPro VMTM软件(ConcordeMicrosystems)分析图像。绘制感兴趣区(ROI)并相对于时间作图。
免疫组织化学
通过在室温下将20×摩尔过量的磺基-NHS-LC-生物素(Thermo Scientific/Pierce cat#21327)孵育30分钟制备生物素化的5B1。根据生产商的说明，使用Zebra脱盐离心柱(Thermo Scientific/Pierce，cat#89889)除去游离的生物素。将抗体缓冲液交换至含有0.01％叠氮化钠的PBS(浓度1.1mg/ml)。通过FACS确认DMS79细胞上的结合，并且这种结合与亲本5B1抗体相当。
使用Colo205细胞作为阳性对照并使用SK-MEL28细胞作为阴性对照确定了基本的免疫组织化学染色条件。制备细胞颗粒，福尔马林固定并石蜡包埋。将载玻片与在10％(v/v)正常人血清在PBS中的溶液(Jackson ImmunoResearch Labs；cat#009-000-121)中稀释的生物素化的5B1孵育。使用标准抗生蛋白链菌素-生物素免疫过氧化物酶法并使用DAB检测系统作为染色法通过Ventana自动仪(Discovery XT platform-Ventana MedicalSystems，Inc，Tucson，AZ)进行染色。使用热和Ventana的CC1条件溶液(CC1 conditioningsolution)进行抗原回收。在初步研究中，来自Signet(Covance)的CA 19.9小鼠单克隆(克隆116-NS-19-9)提供了相当的结果。以10μg/ml使用生物素化的5B1时，Colo205细胞是强阳性的，而SKMEL28细胞是完全阴性的。Histo-ArrayTM组织微阵列购自Imgenex(San Diego，CA)。使用了下列含有肿瘤活组织检查核心以及一些正常组织核心的载玻片：IMH-327(常见癌症，59个样品)、IMH-359(结肠直肠：癌症-转移-正常；59个样品)和IMH-324(向卵巢转移的癌症)。在IMH-327上存在胰腺肿瘤组织核心。
sLea体内血清浓度
对具有Colo205、BxPC3和DMS79异种移植的小鼠抽血以用于sLea抗原测定。将一组无肿瘤小鼠用作对照。使用ST AIA-PACK CA19.9试剂盒(Cat#025271，TOSOH BioscienceInc，South San Francisco，CA)测量小鼠血清中的sLea水平。测定原理基于两位点免疫酶量度测定(immunoenzyme-metric assay)。如生产商的使用手册中所述进行分析。通过TOSOH AIA2000自动免疫测定分析仪(TOSOH Bioscience，Inc，San Francisco，CA)测量免疫测定板的光密度。
统计分析
除非另有说明，否则数据值表示为平均值±SD。使用GraphPad Prism5.03版软件，使用单因素方差分析，然后通过Dunnett检验进行统计分析。认为P值＜0.05是统计学显著的。
结果
通过染色选择的恶性和正常组织微阵列，探索5B1的结合特异性。5B1反应性限于恶性肿瘤和偶尔一些先前已知过表达sLea的正常组织(图19；表9)。大部分正常组织是完全阴性的(表9)。相反，在各个阶段的21/34例结肠腺癌(62％)、33/57例转移至卵巢的腺癌(58％)和7/9例胰腺导管癌(66％)中发现了强阳性染色(表10)。如图19所示，典型反应性为弥漫性细胞质染色，其中一些肿瘤细胞明确显示出细胞膜明显的染色。另外，还发现一些印戒细胞卵巢癌和一些肺癌和乳腺癌是强阳性的。相反，仅4/43例前列腺癌样品和0/51例GIST病例是阳性的(数据未示出)。
表9：5B1与正常组织结合的调查。
Figure BDA0002789388870000491
表10：5B1对胰腺导管腺癌的染色
Figure BDA0002789388870000492
Figure BDA0002789388870000501
5B1对表达sLea的癌症组织的免疫染色的高特异性的使用这种mAb作为PET探针的基础。以4∶1(螯合物：mAb)的比例，使用去铁胺的苄基-异硫氰酸盐类似物(DFO-Bz-NCS)进行5B1修饰，使用盐水作为清洗缓冲液通过离心过滤进行后续纯化。在pH调节至7.0-7.2后，在室温下进行使用Zr-89的简易放射性标记。对于实现＞80％的最佳放射性标记得率来说，更接近于中性的较窄的pH范围是必需的。通过PD10脱盐柱除去游离的未结合的Zr-89。使用离心过滤器(MWCO：10kDa)进行产物浓缩。确立了12.1±1.1mCi/mg的相对高的特异活性。使用前，确保大于95％的放射化学纯度。免疫反应性测定显示了对sLea的活性保留(72.4±1.1％，n＝3)。在5天内，在37℃，在牛血清白蛋白中稳定性保持在＞95％(数据未示出)。在盐水中，早在24小时就观察到了脱金属(de-metallation)(＞85％复合)，其中在37℃，在120小时后，约＞75％的放射性金属结合。
使用在左后腿皮下植入BxPC3胰腺癌异种移植的雌性SCID小鼠进行小动物PET成像和生物分布研究。通过89Zr-5B1所采集的PET图像确认了肿瘤-相关sLea的明显的轮廓图。根据图20中的最大强度投影(MIP)，BxPC3异种移植(n＝3)示出了静脉内施用的放射性示踪剂优越的积累(accretion)。在来自PET图像的肿瘤上绘制的所关心的区域(ROI)示出了5.0±0.4％ID/g(2h)、16.2±2.5％ID/g(24h)、23.8±4.7％ID/g(48h)、36.8±6.1％ID/g(96h)和49.5±7.7％ID/g(120h)的吸收。在24h p.i.后，血液混合物和正常组织的结合活性似乎是清楚的。生物分布实验的结果与PET数据一致。在24小时，观察到了89Zr-5B1的高度肿瘤局部化(84.7±12.3％ID/g，n＝4)；在120小时，p.i.，进一步显示出吸收提高(114.1±23.1％ID/g，n＝4)(图21)。由于体重小(62.4±0.03mg)，肿瘤吸收超过100％。发现24小时p.i.时的％ID比类似时间点时非特异性IgG的高10倍(图21的插图)。在24小时，p.i.，250μg非放射性标记的5B1的竞争性抑制阻断了限定吸收特异性的示踪剂的积累。观察到了89Zr-5B1与正常胰腺和其他收获的正常组织的最小结合，从而在所有时间点提供了高肿瘤-对-组织对比。
根据以上结果，在正位BxPC3胰腺肿瘤模型中测定89Zr-5B1。正位模型是临床相关的并且提供了PET探针效力的临床可接受的测试。在胰腺中接种后，每周通过生物发光光学成像监控肿瘤生长。一旦肿瘤明显，进行PET成像实验。在FDG-PET和89Zr-5B1之间进行探针肿瘤轮廓示意性质比较(图25)。计算机断层扫描(CT)串联PET提供了感兴趣的解剖区提高的显像。
为了在其他sLea表达腺癌中评价作为PET探针的89Zr-5B1，在肺癌和结肠癌模型中测定了89Zr-5B1。使用在雌性SCID小鼠右后腿皮下注射的DMS79小细胞肺癌细胞和Colo205-luc结肠癌细胞进行小动物实验。在静脉内注射200-300μCi(16-25μg)的24-120h p.i.后采集PET MIP图像。早在24h p.i就显示了非均一的DMS79肿瘤吸收(38.15±2.12％ID/g)，其对背景具有优良的信号(图22A)。在48h p.i.后，示踪剂肿瘤积累增加(44.60±6.47％ID/g)，其在120h p.i.仍保留(41.97±12.23％ID/g)。从正常组织中快速清除非特异性结合的89Zr-5B1，其在48h p.i.时具有最低至无背景。另外，如图22B所示，在24-120h p，i.在Colo205-luc异种移植中观察到肿瘤轮廓图。ROI显示在2、24、48、96和120h，肿瘤积累分别为10.5±0.76、23.5±2.7、24.8±4.0、18.4±4.7、16.5±2.3％ID/g。如PET图中绘制的所关心区域所示，肝积累随时间可观察地提高，并且随后肿瘤吸收减小(图22C)。从生物分布研究产生的数据与所观察到的PET结果很好地相关(数据未显示)。
随着肿瘤发展，对小鼠血清中的sLea水平进行定量。对具有Colo205、DMS79和BxPC3异种移植的SCID小鼠抽血，并以无肿瘤组作为对照。sLea值显示与胰腺BxPC3和DSM79植入小鼠相比，Colo205激发的小鼠中sLea水平较高(表11)。
表11：与对照相比，具有结肠直肠肿瘤(Colo205)、胰腺肿瘤(BxPC3)和小细胞肺肿瘤(DMS79)异种移植的小鼠的sLea血清值。
Figure BDA0002789388870000511
Figure BDA0002789388870000521
N.D.＝未检测到。
这些结果表明放射性标记的抗-sLea抗体(89Zr-5B1)对胰腺腺癌及其他sLea阳性腺癌的检测和诊断是特异性的。以优良的得率和纯度以及高特异活性和保留的免疫反应性制备了89Zr-5B1。皮下、正位和转移性胰腺肿瘤模型中89Zr-5B1的评价提供了优良的肿瘤轮廓图和诊断。这种放射性示踪剂在具有结肠和小细胞肺肿瘤的小动物中的临床前评价表明了这种示踪剂对于表达sLea的恶性肿瘤的通用用途。
实施例III
抗sLea双链抗体结合至多种癌细胞系
使用本文所述的5B1和7E3克隆分离物的VH和VL域产生了两个双链抗体，其分别表示为5B1CysDb和7E3CysDb(图9和图10)。两个双链抗体在VL和VH域之间含有5个氨基酸接头区。对于两个双链抗体，还包含了用于纯化和检测的C末端的聚组氨酸标签。
通过将0.2mL中的25万个细胞分别与10μg/ml5B1CysDb或7E3CysDb孵育，测定了5B1CysDb和7E3CysDb与三种癌细胞系的结合：(1)DMS-79细胞，小细胞肺癌混悬液细胞系；(2)Capan-2细胞，胰腺腺癌细胞；和(3)BxPC3细胞，胰癌细胞。在冰上，在PBS/2％FBS中孵育细胞和双链抗体组合40分钟。
清洗后，将细胞与0.2mL 1∶1000稀释的ALEXA-488-标记的抗-His抗体(LifeTechnology，Cat#A21215)孵育40分钟。第二次清洗后，使用Guava流式细胞仪分析细胞。5B1CysDb和7E3CysDb两者显示与DMS-79、Capan-2和BxPC3细胞显著结合(表12)。
表12：5B1CysDb和7E3CysDb与细胞系的结合。
Figure BDA0002789388870000522
MFI-平均荧光强度
实施例IV
5B1和泰素的施用抑制肿瘤生长
在胰癌和小细胞肺癌的异种移植模型中评价了共施用抗-sLea抗体(5B1)和化疗剂泰素(紫杉醇)的抗肿瘤活性。如本文以上所述，将100万个BxPc3细胞(胰腺肿瘤细胞)或500万个DMS-79细胞(小细胞肺癌细胞)注射到6周龄的雌性CB17SCID小鼠的后胁部(第0天；N＝5)。使DMS79肿瘤生长21天，直至平均肿瘤大小为193±64mm3。每周两次ip施用人IgG或5B1(0.5或1mg)(在第21天开始)，并且在第23、30、37和44天iv施用泰素(0.2mg/剂量)。在DMS-79异种移植模型中，与单独施用的对照人IgG或5B1抗体和泰素相比，5B1抗体和泰素的共施用显著限制了肿瘤生长并导致肿瘤消退(图23)。
在BxPc3异种移植模型中，肿瘤生长14天，此时它们达到平均126±30mm3。在第14、21、28和34天(每周)iv施用泰素，并从第14天开始每周施用两次5B1。与单独施用的对照或5B1抗体和泰素相比，5B1抗体和泰素的共施用显著限制了肿瘤生长(图24)。这些结果表明，对于胰腺和小细胞肺癌，抗-sLea抗体和化疗剂在预防肿瘤生长和/或减小肿瘤尺寸中的协同作用。
在本发明申请全文中，参考了多篇文献。在本发明申请中，这些文献的公开内容以它们的全部内容作为参考并入本文，以更充分地描述本发明所属领域当前的技术水平。尽管本发明已参考以上所提供的实施例进行了说明，但是应理解在不背离本发明的精神的情况下可以做出多种改变。
序列表
<110> 生物技术研发公司
<120> 编码抗唾液酸化路易斯a抗原的人抗体的核酸
<130> 12967-033-228
<140> PCT/US2014/052631
<141> 2014-08-26
<150> US 61/870,137
<151> 2013-08-26
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆5B1的VH链结构域
<400> 1
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggcgt acagtgccag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctcg gtgcagcctg gcaggtccct gagactctcc 120
tgtgaagcct ctggattcac ctttgaggcc tatgccatgc actgggtccg gcaacctcca 180
gggaagggcc tggagtgggt ctcaagtatt aattggaata gtggtcgcat agcctatgcg 240
gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaggaattc cctgtatctg 300
caaatgaaca gtctgagact tgaggacacg gccttctatt actgtgcaaa agatatacgg 360
aggtttagta ccgggggggc ggagtttgag tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 420
tcctca 426
<210> 2
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆5B1的VH链结构域
<400> 2
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Glu Ala Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Trp Asn Ser Gly Arg Ile Ala Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Leu Glu Asp Thr Ala Phe
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Arg Arg Phe Ser Thr Gly Gly Ala Glu
115 120 125
Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 3
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆5B1的VL链结构域
<400> 3
atggccggct tccctctcct cctcaccctc ctcactcact gtgcagggtc ttgggcccag 60
tctgtgctga ctcagccgcc ctcagcgtct gggacccccg ggcagagggt caccatctct 120
tgttctggaa gcagctccaa catcggaagt aattttgtat actggtacca gcagctccca 180
ggaacggccc ccaaactcct catatatagg aataatcagc ggccctcagg ggtccctgac 240
cgattctctg gctccaggtc tggcacctca gcctccctgg ccatcagtgg actccggtcc 300
gaggatgagg ctgattatta ctgtgcagca tgggatgaca gcctgggagg ccattatgtc 360
ttcggaactg ggaccaaggt caccgtcctt 390
<210> 4
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆5B1的VL链结构域
<400> 4
Met Ala Gly Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr
20 25 30
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile
35 40 45
Gly Ser Asn Phe Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
100 105 110
Asp Ser Leu Gly Gly His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
115 120 125
Val Leu
130
<210> 5
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆9H3的VH链结构域
<400> 5
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggcgt acagtgcgaa 60
gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gcaggtccct gagactctcc 120
tgtgcggcct ctggatttac ctttgatgat tatgtcatgc actgggtccg gcaagctcca 180
gggaagggcc tggagtgggt ctcaagtatt agttggaata gtggtagcat aggctatgcg 240
gactctgtga agggccgatt catcatctcc agagacaacg ccaagaactc cctgtatctg 300
caaatgaaca gtctgagagc tgaggacacg gccttgtatt actgtgcaaa agatcgtcgt 360
attaggggtg actcggggtt cgagggtgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 420
tcctca 426
<210> 6
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆9H3的VH链结构域
<400> 6
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asp Asp Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Arg Ile Arg Gly Asp Ser Gly Phe Glu
115 120 125
Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 7
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆9H3的VL链结构域
<400> 7
atggccggct tccctctcct cctcaccctc ctcactcact gtgcagggtc ttgggcccag 60
tctgtgttga cgcagccgcc ctcagcgtct gggacccccg ggcagagggt caccatctct 120
tgttctggaa gcagctccaa catcggaagt aattatgtat actggtacca gcagctccca 180
ggaacggccc ccaaactcct catctatagg aataatcagc ggccctcagg ggtccctgac 240
cgattctctg gctccaagtc tggcacctca gcctccctgg ccatcagtgg gctccggtcc 300
gaggatgagg ctgattatta ctgtgcagca tgggatgcca gcctgagtgg tgtggtattc 360
ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 387
<210> 8
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆9H3的VL链结构域
<400> 8
Met Ala Gly Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr
20 25 30
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile
35 40 45
Gly Ser Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
100 105 110
Ala Ser Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
115 120 125
Leu
<210> 9
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆5H11的VH链结构域
<400> 9
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggcgt acagtgccag 60
gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gcaggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac ctttgatgaa tatgccatgc actgggtccg gcaagctcca 180
gggaagggcc tggagtgggt ctcaagtgtt agttggaata gtggtagcat aggctatgcg 240
gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc cctgtatcta 300
caaatgaaca gtctgagagc tgaggacacg gccttgtatt actgtgcaaa agatatacgg 360
acctatagca ccgggggggc ggagtttgcc tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgcc 420
tcctca 426
<210> 10
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆5H11的VH链结构域
<400> 10
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asp Glu Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ser Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Arg Thr Tyr Ser Thr Gly Gly Ala Glu
115 120 125
Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ala Ser Ser
130 135 140
<210> 11
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆5H11的VL链结构域
<400> 11
atggccggct tccctctcct cctcaccctc ctcactcact gtgcagggtc ttgggcccag 60
tctgtgttga cgcagccgcc ctcagcgtct gggacccccg ggcagagggt caccatctct 120
tgttctggaa gcagctccaa catcggaagt aattatgtat actggtacca gcaggtccca 180
ggaacggccc ccaaactcct catctatagg aataatcagc ggccctcagg ggtccctgac 240
cgattctctg gctccaagtc tggcacctca gcctccctgg ccatcagtgg gctccggtcc 300
gaggatgagg ctgattatta ctgtgcagca tgggatgaca gcctgagtgg ccattatgtc 360
ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 390
<210> 12
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆5H11的VL链结构域
<400> 12
Met Ala Gly Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr
20 25 30
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile
35 40 45
Gly Ser Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
100 105 110
Asp Ser Leu Ser Gly His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
115 120 125
Val Leu
130
<210> 13
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆7E3的VH链结构域
<400> 13
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggcgt acagtgccaa 60
gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac cttcagtttc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180
ggcaaggggc tggagtgggt ggcagctata tcatatgatg gaagtaataa atactatgca 240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgaa aaggcccaac 360
caattttatt gtagtgatgg tagatgctac tccattgact actggggcca gggaaccctg 420
gtcaccgtct cctca 435
<210> 14
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆7E3的VH链结构域
<400> 14
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Phe Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ala Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Pro Asn Gln Phe Tyr Cys Ser Asp Gly Arg
115 120 125
Cys Tyr Ser Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser
145
<210> 15
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆7E3的VL链结构域
<400> 15
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60
cggtgtgaaa ttgtaatgac gcagtctcca gccaccctgt ctgtgtctcc aggggagaga 120
gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt gttagcagca acttagcctg gtaccagcag 180
aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc tatggtgcat ccaccagggc cactggtatc 240
ccagccaggt tcagtggcag tgggtctggg acagacttca ctctcaccat cagcagcctg 300
cagtctgtag attctgcagt ttattactgt cagcagtata ataactggcc tccgtacact 360
tttggccagg ggaccaagct ggagatcaaa 390
<210> 16
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆7E3的VL链结构域
<400> 16
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr
20 25 30
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile
65 70 75 80
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys
130
<210> 17
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 双链抗体5B1CysDb序列
<400> 17
cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaattttg tatactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatatat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccag gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tggactccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctggg aggccattat 300
gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc ctttctggtg gtggtggtca ggtgcagctg 360
gtggagtctg ggggaggctc ggtgcagcct ggcaggtccc tgagactctc ctgtgaagcc 420
tctggattca cctttgaggc ctatgccatg cactgggtcc ggcaacctcc agggaagggc 480
ctggagtggg tctcaagtat taattggaat agtggtcgca tagcctatgc ggactctgtg 540
aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaggaatt ccctgtatct gcaaatgaac 600
agtctgagac ttgaggacac ggccttctat tactgtgcaa aagatatacg gaggtttagt 660
accggggggg cggagtttga gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcaggt 720
tctcaccatc accatcacca tggcggttgc 750
<210> 18
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双链抗体5B1CysDb序列
<400> 18
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Phe Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Gly Gly His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
115 120 125
Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr
130 135 140
Phe Glu Ala Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
145 150 155 160
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Trp Asn Ser Gly Arg Ile Ala Tyr
165 170 175
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg
180 185 190
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Leu Glu Asp Thr Ala
195 200 205
Phe Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Arg Arg Phe Ser Thr Gly Gly Ala
210 215 220
Glu Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Ser His His His His His His Gly Gly Cys
245 250
<210> 19
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 双链抗体7E3CysDb序列
<400> 19
gatgttgtgc tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga gagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattctg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctccgta cacttttggc 300
caggggacca aggtggatat caaatctggt ggtggtggtg aagtgcagct ggtggagtct 360
gggggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc 420
accttcagtt tctatggcat gcactgggtc cgccaggctc caggcaaggg gctggagtgg 480
gtggcagcta tatcatatga tggaagtaat aaatactatg cagactccgt gaagggccga 540
ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga 600
gctgaggaca cggctgtgta ttactgtgcg aaaaggccca accaatttta ttgtagtgat 660
ggtagatgct actccattga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcaggt 720
tctcaccatc accatcacca tggcggttgc 750
<210> 20
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双链抗体7E3CysDb序列
<400> 20
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
115 120 125
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr
130 135 140
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
145 150 155 160
Ala Ala Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
165 170 175
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
180 185 190
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
195 200 205
Ala Lys Arg Pro Asn Gln Phe Tyr Cys Ser Asp Gly Arg Cys Tyr Ser
210 215 220
Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser
225 230 235 240
His His His His His His Gly Gly Cys
245

Claims (24)

1.编码抗体重链或其功能性片段的分离的多核苷酸，其中，所述抗体重链或其功能性片段包含具有选自由SEQ ID NO：2的残基20-142、SEQ ID NO：6的残基20-142、SEQ ID NO：10的残基20-142和SEQ ID NO：14的残基20-145组成的组中的氨基酸序列的重链(VH)可变域。
2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中，所述VH域氨基酸序列由选自由SEQ IDNO：1的残基58-426、SEQ ID NO：5的残基58-426、SEQ ID NO：9的残基58-426和SEQ ID NO：13的残基58-435组成的组中的核酸序列编码。
3.编码抗体轻链或其功能性片段的分离的多核苷酸，其中，所述抗体轻链或其功能性片段包含具有选自由SEQ ID NO：4的残基20-130、SEQ ID NO：8的残基20-129、SEQ ID NO：12的残基20-130和SEQ ID NO：16的残基23-130组成的组中的氨基酸序列的轻链(VL)可变域。
4.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中，所述VL域氨基酸序列由选自由SEQ IDNO：3的残基58-390、SEQ ID NO：7的残基58-387、SEQ ID NO：11的残基58-390和SEQ ID NO：15的残基67-390组成的组中的核酸序列编码。
5.结合至唾液酸化路易斯a抗原的分离的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链(VH)可变域，所述VH域包含选自由SEQ ID NO：2的残基20-142、SEQ ID NO：6的残基20-142、SEQ ID NO：10的残基20-142和SEQ ID NO：14的残基20-145组成的组中的氨基酸序列。
6.结合至唾液酸化路易斯a抗原的分离的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含轻链(VL)可变域，所述VL域包含选自由SEQ ID NO：4的残基20-130、SEQ ID NO：8的残基20-129、SEQ ID NO：12的残基20-130和SEQ ID NO：16的残基23-130组成的组中的氨基酸序列。
7.结合至唾液酸化路易斯a抗原的分离的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链(VH)可变域和轻链(VL)可变域，其中，所述VH域和所述VL域分别包含选自由SEQ ID NO：2的残基20-142和SEQ ID NO：4的残基20-130；SEQ ID NO：6的残基20-142和SEQID NO：8的残基20-129；SEQ ID NO：10的残基20-142和SEQ ID NO：12的残基20-130；和SEQID NO：14的残基20-145和SEQ ID NO：16的残基23-130组成的组中的氨基酸序列。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗体为人抗体。
9.根据权利要求5-7中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗体功能性片段选自由Fab、Fab′、F(ab′)2、scFV、双链抗体、三链抗体、微抗体和单域抗体(sdAB)组成的组。
10.根据权利要求9所述的抗体或其功能性片段，其中，所述抗体功能性片段为双链抗体。
11.根据权利要求10所述的抗体或功能性片段，其中，所述双链抗体包含SEQ ID NO：18或20的氨基酸序列。
12.根据权利要求5-7中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗体为单克隆抗体。
13.根据权利要求5-7中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗体为IgG或IgM同种型。
14.根据权利要求13所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述IgG抗体为IgG1亚类。
15.缀合物，其包含与诊断试剂、可检测试剂或治疗剂缀合或重组融合的根据权利要求5-7中任一项所述的分离的抗体或功能性片段。
16.根据权利要求15所述的缀合物，其中，所述缀合物包含可检测试剂。
17.根据权利要求16所述的缀合物，其中，所述可检测试剂为锆(89Zr)。
18.药物组合物，其包含根据权利要求5-7中任一项所述的抗体或功能性片段和可药用载体。
19.治疗或预防疾病的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求18所述的药物组合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述疾病为癌症或肿瘤形成，其中所述癌症或所述肿瘤的细胞表达sLea。
21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述癌症或肿瘤选自胃肠道肿瘤、结肠癌、结肠直肠腺癌、转移性结肠癌、结肠直肠癌、胰癌、胰腺腺癌、小细胞肺癌、膀胱腺癌、印戒细胞卵巢癌、卵巢癌、转移癌、胃腺癌、食管腺癌、喉腺癌、泌尿生殖道腺癌和乳腺腺癌。
22.根据权利要求19所述的方法，其中，所述方法还包括同时或依次施用第二治疗剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述第二治疗剂为化疗剂或免疫治疗剂。
24.检测受试者中肿瘤的方法，包括向对其有需要的受试者施用有效量的根据权利要求16所述的缀合物。
CN202011316903.2A 2013-08-26 2014-08-26 编码抗唾液酸化路易斯a抗原的人抗体的核酸 Pending CN112695039A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361870137P 2013-08-26 2013-08-26
US61/870,137 2013-08-26
CN201480057851.8A CN105764526B (zh) 2013-08-26 2014-08-26 编码抗唾液酸化路易斯a抗原的人抗体的核酸

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480057851.8A Division CN105764526B (zh) 2013-08-26 2014-08-26 编码抗唾液酸化路易斯a抗原的人抗体的核酸

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112695039A true CN112695039A (zh) 2021-04-23

Family

ID=52480556

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480057851.8A Active CN105764526B (zh) 2013-08-26 2014-08-26 编码抗唾液酸化路易斯a抗原的人抗体的核酸
CN202011316903.2A Pending CN112695039A (zh) 2013-08-26 2014-08-26 编码抗唾液酸化路易斯a抗原的人抗体的核酸

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480057851.8A Active CN105764526B (zh) 2013-08-26 2014-08-26 编码抗唾液酸化路易斯a抗原的人抗体的核酸

Country Status (22)

Country Link
US (4) US9475874B2 (zh)
EP (2) EP3041507B1 (zh)
JP (6) JP6626445B2 (zh)
KR (4) KR102362630B1 (zh)
CN (2) CN105764526B (zh)
AU (3) AU2014332442B2 (zh)
CA (2) CA3090644C (zh)
CY (1) CY1124435T1 (zh)
DK (1) DK3041507T3 (zh)
ES (1) ES2880709T3 (zh)
HK (1) HK1226295A1 (zh)
HR (1) HRP20211129T1 (zh)
HU (1) HUE056325T2 (zh)
IL (2) IL244297B (zh)
LT (1) LT3041507T (zh)
PL (1) PL3041507T3 (zh)
PT (1) PT3041507T (zh)
RS (1) RS62189B1 (zh)
RU (1) RU2699289C2 (zh)
SI (1) SI3041507T1 (zh)
WO (1) WO2015053871A2 (zh)
ZA (1) ZA201601354B (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201515094D0 (en) * 2015-08-25 2015-10-07 Univ Nottingham Sialyl-di-lewis a as expressed on glycoproteins but not glycolipids as a functional cancer target and antibodies thereto
EP3484918A1 (en) * 2016-07-14 2019-05-22 BioArctic Neuroscience AB Brain delivery protein
UA126388C2 (uk) 2016-11-18 2022-09-28 Астеллас Фарма Інк. Fab-фрагмент антитіла до muc1 людини
JP7105235B2 (ja) 2016-12-01 2022-07-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 免疫ｐｅｔイメージングのための放射性標識された抗ｐｄ－ｌ１抗体
BR112019016336A2 (pt) 2017-02-10 2020-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Conjugado de anticorpo radiorrotulado, método para imageamento de um tecido que expressa lag3 e para tratar um tumor, e, composto.
TWI726217B (zh) * 2017-06-15 2021-05-01 財團法人生物技術開發中心 含有抗globo h抗體之抗體－藥物共軛物及其用途
TWI795415B (zh) 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
US10730944B2 (en) 2017-07-24 2020-08-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-CD8 antibodies and uses thereof
PT110526B (pt) 2018-01-26 2021-02-04 Univ Nova De Lisboa Anticorpo, fragmento funcional ou sonda do mesmo contra antigénios tumorais
KR102115236B1 (ko) * 2018-01-29 2020-05-27 (주)에스엠티바이오 췌장 또는 담관계암 치료를 위한 키메라 항원 수용체
KR20210073515A (ko) 2018-09-10 2021-06-18 콜드스프링하버러보러토리 췌장염을 치료하는 방법
CN113454115A (zh) * 2018-10-19 2021-09-28 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向唾液酸化路易斯a的嵌合抗原受体及其用途
WO2021105988A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Antibodies to carbohydrate antigens
CN114605550B (zh) * 2020-12-08 2023-09-22 东莞市朋志生物科技有限公司 抗ca19-9的抗体、其应用和检测ca19-9的试剂盒
EP4277932A1 (en) * 2021-01-12 2023-11-22 Yeda Research and Development Co. Ltd Antibodies to cancer glycosylation and uses thereof
AU2022244125A1 (en) 2021-03-26 2023-10-19 BioNTech SE Combination therapy with an anti-ca19-9 antibody and folfirinox in the treatment of cancer

Family Cites Families (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA128362A (en) 1910-07-25 1910-09-27 Victor Herbert Gregory Furnace for drawing glass
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
DE3668186D1 (de) 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
JP3771253B2 (ja) 1988-09-02 2006-04-26 ダイアックス コープ． 新規な結合タンパク質の生成と選択
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
EP0394827A1 (en) 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
KR100246529B1 (ko) 1990-12-14 2000-04-01 스티븐 에이. 서윈. 엠.디. 수용체 관련된 신호 변환 경로를 위한 키메라 사슬
PT100379B (pt) 1991-04-10 1999-01-29 Scripps Research Inst Bibliotecas de receptores heterodimericos usando fagomideos
WO1992022324A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US6271242B1 (en) 1992-02-10 2001-08-07 Bristol-Myers Squibb Co. Method for treating cancer using a tyrosine protein kinase inhibitor
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
JPH0630786A (ja) * 1992-07-14 1994-02-08 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd バイスペシフィック抗体
KR960703622A (ko) 1993-07-15 1996-08-31 수잔 포오덴 단백질 티로신 키나아제 억제제의 프로드러그(prodrugs of protein tyrosine kinase inhibitors)
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US5925376C1 (en) 1994-01-10 2001-03-20 Madalene C Y Heng Method for treating psoriasis using selected phosphorylase kinase inhibitor and additional compounds
AU1736495A (en) 1994-01-31 1995-08-15 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
MX9700764A (es) 1994-07-29 1997-05-31 Smithkline Beecham Plc Compuestos novedosos.
US5587459A (en) 1994-08-19 1996-12-24 Regents Of The University Of Minnesota Immunoconjugates comprising tyrosine kinase inhibitors
US5911995A (en) 1994-08-19 1999-06-15 Regents Of The University Of Minnesota EGF-genistein conjugates for the treatment of cancer
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
DK1323346T3 (da) 1995-01-17 2006-10-30 Brigham & Womens Hospital Receptorspecifik transport af immunogener gennem epitelet
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
GB9501567D0 (en) 1995-01-26 1995-03-15 Pharmacia Spa Hydrosoluble 3-arylidene-2-oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
GB9515975D0 (en) 1995-08-04 1995-10-04 Zeneca Ltd Chemical compounds
US5863904A (en) 1995-09-26 1999-01-26 The University Of Michigan Methods for treating cancers and restenosis with P21
GB9601081D0 (en) 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
US6127366A (en) 1995-11-22 2000-10-03 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
EP0865440B1 (en) 1995-12-08 2002-04-03 Janssen Pharmaceutica N.V. Farnesyl protein transferase inhibiting (imidazol-5-yl)methyl-2-quinolinone derivatives
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5958769A (en) 1996-01-18 1999-09-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for mediating cell cycle progression
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
EP1011669A4 (en) 1996-01-30 2001-09-12 Merck & Co Inc FARNESYL PROTEIN TRANSFERASE INHIBITORS
WO1997027852A1 (en) 1996-01-30 1997-08-07 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
DE69731289D1 (de) 1996-03-18 2004-11-25 Univ Texas Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten
CA2249320C (en) 1996-03-20 2008-12-23 Immunomedics, Inc. Glycosylated humanized b-cell specific antibodies
US5883105A (en) 1996-04-03 1999-03-16 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6080870A (en) 1996-04-03 2000-06-27 Merck & Co., Inc. Biaryl substituted imidazole compounds useful as farnesyl-protein transferase inhibitors
US5891889A (en) 1996-04-03 1999-04-06 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6063930A (en) 1996-04-03 2000-05-16 Merck & Co., Inc. Substituted imidazole compounds useful as farnesyl-protein transferase inhibitors
US6300501B1 (en) 1996-05-22 2001-10-09 Warner-Lambert Company Histidine-(N-benzyl glycinamide) inhibitors of protein farnesyl transferase
US5648239A (en) 1996-06-21 1997-07-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human camp-dependent protein kinase inhibitor homolog
WO1997049700A1 (en) 1996-06-27 1997-12-31 Pfizer Inc. Derivatives of 2-(2-oxo-ethylidene)-imidazolidin-4-one and their use as farnesyl protein transferase inhibitors
SI0956865T2 (sl) 1996-08-12 2011-04-29 Mitsubishi Pharma Corp Zdravila, ki obsegajo inhibitor Rho-kinaze
US5945429A (en) 1996-09-13 1999-08-31 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6040305A (en) 1996-09-13 2000-03-21 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6030982A (en) 1996-09-13 2000-02-29 Schering Corporationm Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6093737A (en) 1996-12-30 2000-07-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6013662A (en) 1996-12-30 2000-01-11 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Farnesyl transferase inhibitors, their preparation, the pharmaceutical compositions which contain them and their use in the preparation of medicaments
US5939439A (en) 1996-12-30 1999-08-17 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
JP2001509156A (ja) 1997-01-29 2001-07-10 ゼネカ・リミテッド ファルネシルプロテイントランスフェラーゼの阻害剤
ZA981080B (en) 1997-02-11 1998-08-12 Warner Lambert Co Bicyclic inhibitors of protein farnesyl transferase
DE69836734D1 (de) 1997-02-20 2007-02-08 Univ California Plasmon-schwingteilchen, methode und vorrichtung
WO1998039027A2 (en) 1997-03-05 1998-09-11 John Wayne Cancer Institute Sialyl lewis antigens as targets for immunotherapy
TW591030B (en) 1997-03-10 2004-06-11 Janssen Pharmaceutica Nv Farnesyl transferase inhibiting 1,8-annelated quinolinone derivatives substituted with N- or C-linked imidazoles
US6228865B1 (en) 1997-06-17 2001-05-08 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6211193B1 (en) 1997-06-17 2001-04-03 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6239140B1 (en) 1997-06-17 2001-05-29 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6051582A (en) 1997-06-17 2000-04-18 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6225322B1 (en) 1997-06-17 2001-05-01 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6159984A (en) 1997-06-17 2000-12-12 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
WO1999008668A2 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Cephalon, Inc. Combination of tyrosine kinase inhibitor and chemical castration to treat prostate cancer
US6103723A (en) 1997-10-17 2000-08-15 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
WO1999020612A1 (en) 1997-10-22 1999-04-29 Astrazeneca Uk Limited Imidazole derivatives and their use as farnesyl protein transferase inhibitors
PT1025088E (pt) 1997-10-22 2002-01-30 Astrazeneca Ab Derivados de imidazole e sua utilizacao como inibidores de farnesil proteino transferase
US6124465A (en) 1997-11-25 2000-09-26 Rhone-Poulenc S.A. Farnesyl transferase inhibitors, their preparation, the pharmaceutical compositions which contain them and their use in the preparation of medicaments
US6268363B1 (en) 1997-11-28 2001-07-31 Lg Chemical Ltd. Imidazole derivatives having an inhibitory activity for farnesyl transferase and process for preparation thereof
US6054466A (en) 1997-12-04 2000-04-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6242196B1 (en) 1997-12-11 2001-06-05 Dana-Farber Cancer Institute Methods and pharmaceutical compositions for inhibiting tumor cell growth
US6335156B1 (en) 1997-12-18 2002-01-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine 14-3-3σ arrests the cell cycle
PT1058683E (pt) 1998-02-02 2003-04-30 Lg Chemical Ltd Inibidores da farnesil-transferase com uma estrutura de piperidina e seu processo de preparacao
AU759492B2 (en) 1998-04-27 2003-04-17 Warner-Lambert Company Functionalized alkyl and alkenyl side chain derivatives of glycinamides as farnesyl transferase inhibitors
ID27199A (id) 1998-07-06 2001-03-08 Janssen Pharmaceutica Nv Penghambat transferase protein farnesil untuk pengobatan artropatis
US6034053A (en) 1998-07-13 2000-03-07 Wayne Hughes Institute EGF-isoflavone conjugates for the prevention of restenosis
US6787638B1 (en) 1998-12-02 2004-09-07 Applied Molecular Evolution, Inc. Tumor specific human monoclonal antibodies and methods of use
US6362188B1 (en) 1998-12-18 2002-03-26 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
US6372747B1 (en) 1998-12-18 2002-04-16 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
FR2787327B1 (fr) 1998-12-21 2003-01-17 Aventis Pharma Sa Compositions contenant des inhibiteurs de farnesyle transferase
US6432959B1 (en) 1998-12-23 2002-08-13 Schering Corporation Inhibitors of farnesyl-protein transferase
DK1140938T3 (da) 1999-01-11 2003-12-22 Univ Princeton Højaffinitetsinhibitorer for målvalidering og anvendelser heraf
US6399633B1 (en) 1999-02-01 2002-06-04 Aventis Pharmaceuticals Inc. Use of 4-H-1-benzopryan-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation
US6245759B1 (en) 1999-03-11 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6143766A (en) 1999-04-16 2000-11-07 Warner-Lambert Company Benzopyranone and quinolone inhibitors of ras farnesyl transferase
US6458935B1 (en) 1999-06-23 2002-10-01 Merck & Co., Inc. Radiolabeled farnesyl-protein transferase inhibitors
US6403581B1 (en) 2000-01-19 2002-06-11 American Cyanamid Company Method of inhibition of farnesyl-protein transferase using substituted benz (cd) indol-2-imine and-amine derivatives
WO2003085114A1 (en) 2002-04-01 2003-10-16 Walter Reed Army Institute Of Research Method of designing synthetic nucleic acid sequences for optimal protein expression in a host cell
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
SG195524A1 (en) 2003-11-06 2013-12-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
AU2005286607B2 (en) 2004-09-23 2011-01-27 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP4026840A1 (en) 2005-07-18 2022-07-13 Seagen Inc. Beta-glucuronide-linker drug conjugates
WO2008000632A1 (en) 2006-06-29 2008-01-03 Dsm Ip Assets B.V. A method for achieving improved polypeptide expression
EP2078732B1 (en) 2006-07-10 2015-09-16 Fujita Health University Method of identifying a candidate diagnostic or therapeutic antibody using flow cytometry
WO2009026274A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
EP2185931B1 (en) 2007-09-07 2013-07-10 Children's Hospital Medical Center Use of secretor, lewis and sialyl antigen levels as predictors for disease
AR072804A1 (es) 2008-07-15 2010-09-22 Genentech Inc Conjugados derivados de antraciclina,proceso para su preparacion,composiciones farmaceuticas que los contienen y su uso como agentes antitumorales.
EP2927244A1 (en) 2008-09-19 2015-10-07 MedImmune, LLC Antibodies directed to DLL4 and uses thereof
EP2396034A4 (en) 2009-02-10 2012-11-21 Shenogen Pharma Group Ltd ANTIBODIES AND METHODS FOR TREATING DISEASES ASSOCIATED WITH A STROGEN RECEPTOR
RU2598711C2 (ru) 2010-07-22 2016-09-27 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Антитело к противоопухолевому антигену и способы применения

Also Published As

Publication number Publication date
CY1124435T1 (el) 2022-07-22
JP2024050966A (ja) 2024-04-10
JP2016534735A (ja) 2016-11-10
JP2023165831A (ja) 2023-11-17
ES2880709T3 (es) 2021-11-25
JP2019047821A (ja) 2019-03-28
CA2922478C (en) 2020-09-29
NZ717428A (en) 2020-09-25
US20200247900A1 (en) 2020-08-06
WO2015053871A8 (en) 2016-03-31
KR20160054501A (ko) 2016-05-16
RU2016111015A3 (zh) 2018-03-30
AU2020201225B2 (en) 2022-05-05
CA2922478A1 (en) 2015-04-16
IL244297B (en) 2020-09-30
LT3041507T (lt) 2021-08-25
PL3041507T3 (pl) 2021-11-15
JP7299405B2 (ja) 2023-06-27
KR20210079426A (ko) 2021-06-29
US9475874B2 (en) 2016-10-25
JP2021151263A (ja) 2021-09-30
WO2015053871A4 (en) 2015-07-30
US20230365707A1 (en) 2023-11-16
BR112016004133A2 (pt) 2017-10-24
KR102362630B1 (ko) 2022-02-15
HK1226295A1 (zh) 2017-09-29
AU2022209226A1 (en) 2022-08-18
US20170015756A1 (en) 2017-01-19
EP3041507A4 (en) 2017-07-12
JP7161397B2 (ja) 2022-10-26
IL276819A (en) 2020-10-29
SI3041507T1 (sl) 2021-11-30
KR20220025183A (ko) 2022-03-03
AU2014332442B2 (en) 2019-12-19
KR20200085940A (ko) 2020-07-15
HUE056325T2 (hu) 2022-02-28
WO2015053871A2 (en) 2015-04-16
EP3906945A2 (en) 2021-11-10
RS62189B1 (sr) 2021-08-31
EP3041507A2 (en) 2016-07-13
CA3090644C (en) 2023-02-07
JP6626445B2 (ja) 2019-12-25
WO2015053871A3 (en) 2015-06-11
HRP20211129T1 (hr) 2021-10-15
CN105764526A (zh) 2016-07-13
PT3041507T (pt) 2021-07-26
ZA201601354B (en) 2020-08-26
DK3041507T3 (da) 2021-07-26
CN105764526B (zh) 2020-12-15
IL244297A0 (en) 2016-04-21
RU2016111015A (ru) 2017-10-03
RU2019125161A (ru) 2019-09-03
EP3041507B1 (en) 2021-06-30
KR102553717B1 (ko) 2023-07-11
AU2020201225A1 (en) 2020-03-12
KR102313341B1 (ko) 2021-10-18
US20150056134A1 (en) 2015-02-26
NZ756328A (en) 2020-09-25
EP3906945A3 (en) 2022-03-16
RU2699289C2 (ru) 2019-09-04
JP2023026538A (ja) 2023-02-24
CA3090644A1 (en) 2015-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7299405B2 (ja) シアリル－Ｌｅｗｉｓ ａに対するヒト抗体をコードする核酸
AU2014332442A1 (en) Nucleic acids encoding human antibodies to Sialyl-Lewis
US11760809B2 (en) Human monoclonal antibodies to ganglioside GD2
RU2791967C2 (ru) НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ СИАЛИРОВАННОГО АНТИГЕНА ЛЬЮИСАа ЧЕЛОВЕКА
NZ717428B2 (en) NUCLEIC ACIDS ENCODING HUMAN ANTIBODIES TO SIALYL-LEWISa
BR122020012421B1 (pt) Polinucleotídeos isolados, anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo que se liga a sialil-lewisa, usos dos mesmos, conjugado e composições
BR112016004133B1 (pt) Polinucleotídeos isolados, anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo que se liga a sialillewisa, usos dos mesmos, conjugado e composição farmacêutica

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40050582

Country of ref document: HK