JP2023086750A - Thomsen-nouvelle(tn)抗原に対するヒト抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】Thomsen-nouvelle(Tn)抗原(CD175)またはそのシアル酸付加形態に対する抗体またはその機能的断片の産生のための組成物を提供する。また、前記抗体または機能的断片が本明細書で提供されるアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとを含む、がんまたは腫瘍形成等の疾患を処置または予防する方法を提供する。本発明は、局在化剤、検出可能剤または治療剤にコンジュゲートまたは組換え融合された抗体またはその機能的断片のコンジュゲート、および疾患を処置、予防または診断する方法を提供する。【解決手段】本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片およびその抗体または機能的断片の重鎖および/または軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。【選択図】なし
Description
本発明は概して、炭水化物抗原に対する抗体、特にThomsen-nouvelle(Tn)抗原またはそのシアル酸付加(シアル化)形態(sTn抗原)に結合する抗体またはその断片、およびそれに関連する方法に関する。
がん発症中の腫瘍特異的抗原に対する抗体の受動的投与は、腫瘍細胞および初期転移を除去し得る。この処置は、がん再発に対しても顕著な影響を有し得る。腫瘍特異的炭水化物に対する抗体は、このがん処置において有用な候補物質であり得る。例えば、ヒトがん細胞によるマウスの免疫化から得られる多くの腫瘍限定モノクローナル抗体は、糖脂質、糖タンパク質またはプロテオグリカンとして細胞表面で発現する炭水化物抗原を対象とすることが示されている。
Tn抗原は、広範な腫瘍タイプアレイに存在するが、正常組織の細胞表面には見られない炭水化物抗原である。Tn抗原の密接に関連するシアル酸付加形態であるsTn抗原も、有望な腫瘍抗原である。Tnは、O-グリコシル化の第1段階中にセリンまたはトレオニンに付加される単糖残基である。通常、次の糖が付加されて複雑な成熟グリカンになる。しかしながら、多くのがんにおいては、未熟なTn前駆体を伴うO-糖タンパク質が細胞表面にたどり着き、そこでそれらは腫瘍抗原として利用され得る。
したがって、がんの処置のため、および悪性病変および転移を検出するための、TnおよびsTn等の腫瘍特異的炭水化物を特異的に認識する抗体を特定および生成する必要がある。
Tn抗原は、広範な腫瘍タイプアレイに存在するが、正常組織の細胞表面には見られない炭水化物抗原である。Tn抗原の密接に関連するシアル酸付加形態であるsTn抗原も、有望な腫瘍抗原である。Tnは、O-グリコシル化の第1段階中にセリンまたはトレオニンに付加される単糖残基である。通常、次の糖が付加されて複雑な成熟グリカンになる。しかしながら、多くのがんにおいては、未熟なTn前駆体を伴うO-糖タンパク質が細胞表面にたどり着き、そこでそれらは腫瘍抗原として利用され得る。
したがって、がんの処置のため、および悪性病変および転移を検出するための、TnおよびsTn等の腫瘍特異的炭水化物を特異的に認識する抗体を特定および生成する必要がある。
本出願は、この必要性を満たし、関連する利益を提供する、Tn抗原またはsTn抗原等の炭水化物抗原に対するヒト抗体を開示する。
本発明に従って、抗体またはその機能的断片を炭水化物抗原にターゲティングするため、特にTn抗原またはsTn抗原にターゲティングするための組成物および方法が本明細書で提供される。本明細書で開示される組成物は、単離された抗体またはその機能的断片であって、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片を含む。本明細書で開示される方法は、本明細書で提供される単離された抗体またはその機能的断片を製造する方法、本明細書で提供される単離された抗体、その機能的断片またはコンジュゲートを使用してTn抗原またはsTn抗原と関連付けられる疾患を処置または予防する方法、および本明細書で提供されるコンジュゲートを使用して対象において細胞表面上にTn抗原またはsTn抗原を有する腫瘍を検出するための方法を含む。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、本明細書で提供されるVH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3領域を有するVHドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。他の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、本明細書で提供されるVL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3領域を有するVLドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。他の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインの両方を含み、VHドメインおよびVLドメインが、それぞれ、本明細書で提供される各々のVHおよびVLドメインについてのアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、本明細書で提供されるVL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3領域を有するVLドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。他の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインの両方を含み、VHドメインおよびVLドメインが、それぞれ、本明細書で提供される各々のVHおよびVLドメインについてのアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体またはその機能的断片は、別個の特色を有する。例えば、一部の態様では、抗体またはその機能的断片は、Tn抗原またはsTn抗原に結合し、以下の特色のうちの1つまたは複数を有する。
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、2つのTn抗原分子は、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
・シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ(avidity)、
・Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
・Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有するか、または
・Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン(seine)残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン(seine)残基上に存在する。
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、2つのTn抗原分子は、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
・シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ(avidity)、
・Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
・Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有するか、または
・Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン(seine)残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン(seine)残基上に存在する。
本明細書で提供される組成物は、本明細書で提供される抗体またはその機能的断片のVHドメイン、VLドメインまたはVHおよびVLドメインの両方をコードする単離されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびそのような発現ベクターを含有する宿主細胞も含む。本明細書で提供される抗体または機能的断片を製造するためにそのような組成物を使用する方法も提供される。そのような方法は、本明細書で提供される宿主細胞を培地中で培養することと、その中で発現する抗体または機能的断片を得ることとを含み得る。
一部の実施形態では、本発明は、局在化剤、検出可能剤または治療剤にコンジュゲートまたは組換え融合された本明細書で提供される抗体または機能的断片を有するコンジュゲートを提供する。本明細書で開示される一部の態様では、局在化剤または検出可能剤を含む本明細書で開示されるコンジュゲートは、対象において腫瘍形成を検出および/または診断するための方法において使用することができる。そのような方法は、有効量のコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することを含み得る。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される1つまたは複数の抗体または機能的断片と薬学的に許容される担体とを有する医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される1つまたは複数のコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを有する医薬組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、本明細書で開示される治療的有効量の医薬組成物を投与することによる、それを必要とする対象において疾患を処置または予防するための方法も提供する。また別の態様では、本発明は、第2の治療剤を本明細書で開示される抗体または機能的断片と同時に、または逐次的に投与することを提供する。
腫瘍細胞表面上に発現する炭水化物は、がん免疫療法の標的であり得る。本明細書で提供される組成物は、少なくとも部分的には、1)他の抗原(グロボH、GM2およびペプチドアセンブルTFクラスター)の存在下でのTn改変Muc1キーホールリンペットヘモシアニン(Tn改変-Muc1-KLH)コンジュゲートワクチンおよびベバシズマブによる処置、または2)全てKLHにコンジュゲートされたグロボH、GM2、sTn、TFおよびTnを含む単分子ワクチンのいずれかで免疫化された個体のB細胞から生成したヒト抗体の特定および特徴付けに基づく。少なくとも7つの候補抗体(1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3および3A7と命名されたクローン単離物)を特定し、組換え抗体として発現させ、in vitroアッセイにおいてさらに特徴付けた。特定した抗体の各々は、本明細書で開示されるある特定の抗原に優先的に結合し、ある特定のクローン単離物は、Tn抗原またはsTn抗原についての特異的な優先性を有する(1A4、2F3および3A7)。特定および試験されたこれらの抗体のうち、1つの抗体(2F3)をさらなる最適化のために選択し、改善されたアビディティ、細胞傷害性、および/またはTnおよび/またはsTn抗原を有する細胞への内部移行を含む改善された特色を有するいくつかの2F3バリアントをもたらした。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の分子抗原に結合することができ、ポリペプチド鎖の2つの同一の対からなり、各対が1つの重鎖(約50~70kDa)および1つの軽鎖(約25kDa)を有し、各鎖の各アミノ末端部分が約100~約130またはそれよりも多いアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分が定常領域を含む、免疫グロブリンクラスのポリペプチド内のB細胞のポリペプチド産物を意味すると意図される(Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Edition, Oxford University Press.;Kuby (1997) Immunology, Third Edition, W.H. Freeman and Company, New Yorkを参照のこと)。本発明の文脈において、本明細書で開示される抗体の結合を受け得る特異的分子抗原は、Tn抗原またはsTn抗原を含む。
「抗原」は、抗体が選択的に結合し得る所定の抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたは他の天然化合物もしくは合成化合物であり得る。ある特定の実施形態の文脈において、標的抗原は、Tn抗原またはsTn抗原である。一部の実施形態では、標的抗原は、セリン残基上のTnまたはsTn抗原である。
抗体またはその機能的断片に関して使用される場合、「二重特異性」という用語は、2つの異なる構造、エピトープまたは抗原決定基について特異性を有する抗体またはその機能的断片を指す。二重特異性抗体は、2つの異なる構造、エピトープまたは抗原決定基に同時に結合することができる。
抗体またはその機能的断片に関して使用される場合、「二重特異性」という用語は、2つの異なる構造、エピトープまたは抗原決定基について特異性を有する抗体またはその機能的断片を指す。二重特異性抗体は、2つの異なる構造、エピトープまたは抗原決定基に同時に結合することができる。
抗体またはその機能的断片に関して使用される場合、「ヒト」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に対応するヒト可変領域、および適用可能である場合、ヒト定常領域またはその部分を有する抗体またはその機能的断片を指す。そのようなヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列は、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242によって説明されている。本発明の文脈におけるヒト抗体は、Tn抗原またはsTn抗原に結合し、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン核酸配列の天然細胞バリアントである核酸配列によってコードされる抗体を含み得る。ヒト抗体を産生させる例示的な方法は、本明細書で提供される実施例で提供されるが、当業者に周知の任意の方法を使用することができる。
「モノクローナル抗体」という用語は、単一細胞クローンもしくはハイブリドーマまたは単一細胞由来の細胞集団の産物である抗体を指す。また、モノクローナル抗体は、単一分子免疫グロブリン種を産生させるために免疫グロブリン遺伝子をコードする重鎖および軽鎖から組換え法により産生された抗体を指すと意図される。モノクローナル抗体調製物中の抗体のアミノ酸配列は、実質的に均一であり、そのような調製物中の抗体の結合活性は、実質的に同じ抗原結合活性を示す。対照的に、ポリクローナル抗体は、集団内の様々なB細胞から得られ、それらは特異的抗原に結合する免疫グロブリン分子の組合せである。ポリクローナル抗体の各免疫グロブリンは、同じ抗原の異なるエピトープに結合し得る。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を産生させるための方法は、当該技術分野において周知である(Harlow and Lane., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)およびBorrebaeck (ed.), Antibody Engineering: A Practical Guide, W.H. Freeman and Co., Publishers, New York, pp. 103-120 (1991))。
本明細書で使用される場合、「機能的断片」という用語は、抗体に関して使用されるとき、その断片が由来する抗体としての結合活性の一部または全てを保持する重鎖および/または軽鎖ポリペプチドを含む抗体の一部を指すと意図される。そのような機能的断片は、例えば、Fd、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、単鎖Fv(scFv)、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディおよびシングルドメイン抗体(sdAB)を含み得る。他の機能的断片は、そのような機能的断片が結合活性を保持する限り、例えば、重鎖もしくは軽鎖ポリペプチド、可変領域ポリペプチドもしくはCDRポリペプチド、またはその部分を含み得る。そのような抗体結合断片は、例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989);Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.;Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993);Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989)およびDay, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990)で説明されていることを見出すことができる。
抗体に関して使用される場合、「重鎖」という用語は、約50~70kDaのポリペプチド鎖を指し、アミノ末端部分が約120~130個またはそれよりも多いアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、アルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)およびミュー(μ)と呼ばれる5つの別個の種類のうちの1つであり得る。別個の重鎖は大きさが異なり、α、δおよびγは約450個のアミノ酸を含有し、一方で、μおよびεは約550個のアミノ酸を含有する。軽鎖と組み合わせると、これらの別個の種類の重鎖は、それぞれ、5つの周知の抗体クラス、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMを生じ、これは4つのIgGサブクラス、つまりIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む。さらに、IgAおよびIgMは、J鎖と関連し得る。重鎖は、ヒト重鎖であり得る。
抗体に関して使用される場合、「軽鎖」という用語は、約25kDaのポリペプチド鎖を指し、アミノ末端部分が約100~約110個またはそれよりも多いアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む。軽鎖のおよその長さは、211~217個のアミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)またはラムダ(λ)と呼ばれる2つの別個の種類がある。軽鎖アミノ酸配列は、当該技術分野において周知である。軽鎖は、ヒト軽鎖であり得る。
「可変ドメイン」または「可変領域」という用語は、概して軽鎖または重鎖のアミノ末端に位置し、重鎖において約120~130個のアミノ酸および軽鎖において約100~110個のアミノ酸の長さを有し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される、抗体の軽鎖または重鎖の一部を指す。可変ドメインは、様々な抗体間で配列が広範に異なる。配列の変動性はCDRに集中しており、一方で、可変ドメイン内のより変動性でない部分はフレームワーク領域(FR:framework region)と呼ばれる。軽鎖および重鎖のCDRは主に、抗体の抗原との相互作用の原因である。本明細書で使用されるアミノ酸位置の番号付けは、Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th edのように、EU指数による。可変領域は、ヒト可変領域であり得る。
「相補性決定領域」または「CDR」は、免疫グロブリン(Igまたは抗体)VHβ-シートフレームワークの非フレームワーク領域内の3つの超可変領域(H1、H2またはH3)のうちの1つ(それぞれ、VH CDR1、VH CDR2またはVH CDR3とも本明細書で呼ばれる)、または抗体VLβ-シートフレームワークの非フレームワーク領域内の3つの超可変領域(L1、L2またはL3)のうちの1つ(それぞれ、VL CDR1、VL CDR2またはVL CDR3とも本明細書で呼ばれる)を指す。したがって、CDRは、フレームワーク領域配列内に散在する可変領域配列である。CDR配列は当業者に周知であり、例えば、抗体可変(V)ドメイン内の最も超可変性の領域としてKabatにより定義されている(Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977);Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978))。また、CDR配列は、保存されたβ-シートフレームワークの部分ではなく、したがって、様々なコンフォメーションに適合させることができる残基としてChothiaにより構造的に定義されている(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。両方の技術用語は、当該技術分野において十分に認識されている。また、CDR配列は、AbM、ContactおよびIMGTにより定義されている。本明細書で開示される抗体に適用可能なCDR配列を、図1~7および表2~4に例示する。標準的な抗体可変領域内のCDRの位置は、多くの構造の比較によって決定されている(Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997);Morea et al., Methods 20:267-279 (2000))。超可変領域内の残基数は異なる抗体で変動するので、標準的な位置に対する追加の残基は慣例的に、標準的な可変領域番号付けスキームにおける残基番号の次にa、b、c等で番号付けされる(Al-Lazikani et al.、上記(1997))。そのような命名法は同様に、当業者に周知である。
本明細書で使用される場合、超可変領域、HVRまたはHVという用語は、配列が超可変性である抗体可変領域の領域および/または構造的に定義されたループを形成する抗体可変領域の領域を指す。一般的に、抗体は、6つの超可変領域を含み、3つはVH(H1、H2、H3)、3つはVL(L1、L2、L3)に存在する。本明細書で、いくつかの超可変領域の描写が使用され、包含される。Kabatの相補性決定領域(CDR:Complementarity Determining Region)は配列変動性に基づき、最も頻繁に使用されている(例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照のこと)。Chothiaは、それよりも構造ループの場所について言及している(例えば、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)を参照のこと)。Kabat番号付け慣例を使用して番号付けした場合、Chothia CDR-H1ループの末端は、ループの長さによってH32~H34で変動する(これは、Kabat番号付けスキームがH35AおよびH35Bで挿入を入れるためであり、35Aも35Bも存在しない場合ループは32で終了し、35Aのみが存在する場合ループは33で終了し、35Aおよび35Bの両方が存在する場合ループは34で終了する)。AbM超可変領域は、Kabat CDRとChothia構造ループとの間の折衷案を表し、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用されている(例えば、Martin, Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlagを参照のこと)。「contact」超可変領域は、利用可能な複雑な結晶構造の解析に基づく(Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309: 657-670 (2001))。これらの超可変領域またはCDRの各々からの残基を以下に示す。
近年、ユニバーサル番号付けシステムが開発され、広く採用されている(ImMunoGeneTics(IMGT)Information System(登録商標))(Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003))。IMGTは、ヒトおよび他の脊椎動物の免疫グロブリン(IG:immunoglobulin)、T細胞受容体(TR:T cell receptor)および主要組織適合抗原(MHC:major histocompatibility complex)専門の統合型情報系である。ここでは、CDRは、アミノ酸配列および軽鎖または重鎖内の場所の両方の点で言及される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のCDRの「場所」は、種間で保存されており、ループと呼ばれる構造に存在するので、構造特色にしたがって可変ドメイン配列を整列する番号付けシステムを使用することによって、CDRおよびフレームワーク残基は、容易に特定される。この情報は、1つの種の免疫グロブリンからのCDR残基の、典型的にヒト抗体からのアクセプターフレームワークへの移植および置換において使用され得る。追加の番号付けシステム(AHon)は、HoneggerおよびPluckthun(上記)により開発されている。例えば、Kabat番号付けおよびIMGTユニーク番号付けシステムを含む番号付けシステム間の対応は、当業者に周知であり(例えば、Kabat、上記;Chothia and Lesk、上記;Martin、上記;Lefranc et al.、上記)、図1~7にも例示する。様々な系により定義される例示的なCDR残基を、表1に示す。
超可変領域は、以下のような「延長された超可変領域」:VLにおける24~36または24~34(L1)、46~56または50~56(L2)および89~97または89~96(L3)、ならびにVHにおける26~35または26~35A(H1)、50~65または49~65(H2)および93~102、94~102または95~102(H3)を含み得る。本明細書で使用される場合、「HVR」および「CDR」という用語は、互換的に使用される。
定常領域または定常ドメインという用語は、抗体の抗原への結合に直接的に関与しないが、Fc受容体との相互作用等の様々なエフェクター機能を示す、軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、免疫グロブリンの他の部分である抗原結合部位を含有する可変領域と比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、重鎖のCH1、CH2およびCH3領域、ならびに軽鎖のCL領域を含有し得る。
フレームワークまたはFR残基という用語は、CDRに隣接する可変領域残基である。FR残基は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ドメイン抗体、ディアボディおよび二重特異性抗体において存在する。
フレームワークまたはFR残基という用語は、CDRに隣接する可変領域残基である。FR残基は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ドメイン抗体、ディアボディおよび二重特異性抗体において存在する。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、抗体、抗体機能的断片またはポリヌクレオチドに関して使用されるとき、言及される分子が、それが天然に見出されるときの少なくとも1つの成分も含まないことを意味すると意図される。この用語は、それがその天然環境において見出されるときの一部の、または全ての他の成分から除去された抗体、抗体機能的断片またはポリヌクレオチドを含む。抗体の天然環境の成分には、例えば、赤血球、白血球、血小板、血漿、タンパク質、核酸、塩および栄養素が含まれる。単離された抗体機能的断片またはポリヌクレオチドの天然環境の成分には、例えば、脂質膜、細胞小器官、タンパク質、核酸、塩および栄養素が含まれる。また、本明細書で開示される抗体、抗体機能的断片またはポリヌクレオチドは、これらの成分、またはそれが単離されたか、またはそれが組換え産生された細胞の他の任意の成分の全てを含まないか、または完全に実質的に含まない場合がある。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラスを指す。所与の抗体または機能的断片の重鎖は、その抗体または機能的断片のクラス:IgM、IgG、IgA、IgDまたはIgEを決定する。各クラスは、κまたはλ軽鎖のいずれかを有し得る。「サブクラス」という用語は、サブクラスを区別する重鎖のアミノ酸配列におけるより小さい相違を指す。ヒトにおいて、2つのIgAサブクラス(サブクラスIgA1およびIgA2)が存在し、4つのIgGサブクラス(サブクラスIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)が存在する。そのようなクラスおよびサブクラスは、当業者に周知である。
本明細書で使用される場合、「結合する」または「結合すること」という用語は、複合体を形成する分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン性結合、疎水性相互作用および/またはファンデルワールス相互作用を含む非共有相互作用であり得る。複合体は、共有もしくは非共有結合、相互作用または力によって結合された2つまたはそれよりも多い分子の結合も含み得る。抗体またはその機能的断片の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、本明細書で提供される実施例で提供される方法、または当業者に周知のいくつかの方法の任意の1つを使用して検出することができる。
本明細書で使用される場合、「結合する」または「結合すること」という用語は、複合体を形成する分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン性結合、疎水性相互作用および/またはファンデルワールス相互作用を含む非共有相互作用であり得る。複合体は、共有もしくは非共有結合、相互作用または力によって結合された2つまたはそれよりも多い分子の結合も含み得る。抗体またはその機能的断片の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、本明細書で提供される実施例で提供される方法、または当業者に周知のいくつかの方法の任意の1つを使用して検出することができる。
抗体または機能的断片上の単一の抗原結合部位とTn抗原またはsTn抗原等の標的分子の単一のエピトープとの間の非共有相互作用の合計の強度は、抗体または機能的断片のそのエピトープに対する「親和性」である。抗体またはその機能的断片の一価の抗原に対する結合(k1)対解離(k-1)の比(k1/k-1)は、親和性の測定値である平衡解離定数Kである。Kの値は、抗体または機能的断片と抗原との様々な複合体について変動し、k1およびk-1の両方に依存する。本明細書で開示される抗体または機能的断片についての解離定数Kは、本明細書で提供される任意の方法または当業者に周知の他の任意の方法を使用して決定することができる(例えば、Hearty et al. 2012. Methods Mol Biol. 907:411-42)。
1つの結合部位における親和性は、抗体または機能的断片と抗原との間の相互作用の真の強度を必ずしも反映しない。多価Tn抗原またはsTn抗原等の多数の反復抗原決定基を含有する複雑な抗原が、多数の結合部位を含有する抗体と接触した場合、1つの部位における抗体または機能的断片の抗原との相互作用は、第2の部位における反応の可能性を増大させる。多価抗体と抗原との間のそのような多数の相互作用の強度は、「アビディティ」と呼ばれる。抗体または機能的断片のアビディティは、その個々の結合部位の親和性よりも、その結合能のより優れた測定値であり得る。例えば、IgGより低い親和性を有し得るが、その多価から生ずるIgMの高いアビディティによりそれが抗原に有効に結合することが可能になる、五量体または六量体IgM抗体について見られることがあるように、高いアビディティは低い親和性を補償し得る。本明細書で使用される場合、「アビディティ」という用語は、免疫グロブリン集団と抗原との間の複合体の全体的な安定性、すなわち、抗原を伴う免疫グロブリン混合物の累積強度を指す。アビディティは、集団中の個々の抗体分子の特異的エピトープとの親和性、およびまた免疫グロブリンと抗原との結合価の両方に関連する。
抗体またはその機能的断片の特異性とは、個々の抗体またはその機能的断片の、ただ1つの抗原と反応する能力を指す。抗体または機能的断片は、それが、抗原または抗原のアイソマー形態の一次、二次または三次構造における相違を区別することができる場合、特異的であると考えることができる。抗体は、結合エピトープが他の抗原上に存在する場合、交差反応性であり得る。
例えば、本明細書で説明される実施形態のいずれかにおいて、最も有効な抗体は、その抗体、抗体断片または抗原結合ユニットがTn抗原、sTn抗原またはこれらの両方に結合する機能的親和性および/またはアビディティに基づいて決定され得る。一実施形態では、例えば、1つのTn/sTn抗体の機能的親和性またはアビディティは、Tn/sTn抗原を発現する細胞の応答性が抗体結合に際して影響を受けるように、別のTn/sTn抗体と比較して比較的より高いか、またはより低くてもよい。相対的アビディティは、当業者に一般的に公知の方法によって、例えば、SD50値が最大特異的溶解を達成するために必要とされる抗体濃度に相関するクロム放出アッセイによりアッセイすることができる。より高いアビディティを有する抗体は、例えば、より低いSD50を有する抗体であり得る、すなわち、より低濃度の抗体が最大特異的溶解を達成するために必要とされる。Tn/sTn抗体のアビディティは、抗Tn/sTn抗体エピトープの特異的Tn/sTn抗体との親和性、およびまた抗体のTn/sTnエピトープとの結合時間の両方の関数であり得る。
さらに、本発明による抗体は、得られる抗体が出発材料または改変前のCDR領域と機能的に同等である限り、それらのCDR配列において1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および/または挿入を含んでもよい。本発明において、「機能的に同等」という用語は、Tn/sTn抗原に対する機能的親和性および/またはアビディティにおいて同等であることを指す。本発明において、「同等」という用語は、特許請求の範囲の抗体と比較して、少なくとも50%、好ましくは70%、より好ましくは90%またはそれよりも高い活性を有することを指す。
潜在的な治療用抗体候補物質を抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)活性についてスクリーニングして、最も有力な抗がん能を有する候補物質を見出す。当業者は、様々な方法を使用して本発明のTn/sTn抗体および/またはTn/sTn-CD3エンゲージャー結合タンパク質によって媒介される細胞傷害性を測定することができることを理解する。ADCC活性を査定するために、目的のバリアントタンパク質を、抗原抗体複合体によって活性化され、標的細胞の細胞溶解をもたらし得る免疫エフェクター細胞と組み合わせて、標的細胞に添加する。細胞溶解は一般的に、溶解された細胞からの標識(例えば、放射性物質、蛍光色素または天然細胞内タンパク質)の放出によって検出される。そのようなアッセイのために有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC:peripheral blood mononuclear cell)およびナチュラルキラー(NK:Natural Killer)細胞が含まれる。in vitro ADCCアッセイの具体例は、Wisecarver et al., 1985 79:277-282;Bruggemann et al., 1987, J Exp Med 166:1351-1361;Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258:183-191;Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184:29-38において説明されている。また、目的のFcバリアントタンパク質のADCC活性は、in vivoで、例えば、Clynes et. al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656において開示されるような動物モデルにおいて査定され得る。
本発明の実施形態では、バリアントタンパク質は、同等の分子と比較して向上したADCC活性を有すると説明され、例えば、バリアントタンパク質は、同等の分子のADCC活性よりも少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍大きいADCC活性を有する。
一例において、細胞傷害性は、カルセイン-AM(Thermo Fisher)を使用して測定することができる。かなり一般的に、Tn/sTn陽性細胞株を、増大する濃度のTn/sTn Abおよび/またはTn/sTn-CD3結合タンパク質を伴うエフェクター細胞とともに、エフェクター対標的細胞比、例えば20:1で3~24時間共培養する。エフェクター細胞は、例えば、刺激もしくは非刺激(ヒトまたはカニクイザル)T細胞もしくはそれらのサブセット(例えば、CD4、CD8)、または非刺激(ヒトまたはカニクイザル)末梢血単核細胞(PBMC)であり得る。標的細胞はTn/sTnを発現し、ヒト卵巣腺癌細胞株CAOV3等の内因性(天然)Tn/sTn発現を有する細胞であり得る。Tn/sTnおよび/またはTn/sTn-CD3結合分子の細胞傷害活性は、例えば、特異的抗体の存在下でのエフェクター細胞とのインキュベーションの2~48時間後の蛍光色素カルセインAMの放出で決定される。細胞傷害性の決定のために使用されるインキュベーション時間およびリードアウトの改変は可能であり、当業者に公知である。
一例において、細胞傷害性は、カルセイン-AM(Thermo Fisher)を使用して測定することができる。かなり一般的に、Tn/sTn陽性細胞株を、増大する濃度のTn/sTn Abおよび/またはTn/sTn-CD3結合タンパク質を伴うエフェクター細胞とともに、エフェクター対標的細胞比、例えば20:1で3~24時間共培養する。エフェクター細胞は、例えば、刺激もしくは非刺激(ヒトまたはカニクイザル)T細胞もしくはそれらのサブセット(例えば、CD4、CD8)、または非刺激(ヒトまたはカニクイザル)末梢血単核細胞(PBMC)であり得る。標的細胞はTn/sTnを発現し、ヒト卵巣腺癌細胞株CAOV3等の内因性(天然)Tn/sTn発現を有する細胞であり得る。Tn/sTnおよび/またはTn/sTn-CD3結合分子の細胞傷害活性は、例えば、特異的抗体の存在下でのエフェクター細胞とのインキュベーションの2~48時間後の蛍光色素カルセインAMの放出で決定される。細胞傷害性の決定のために使用されるインキュベーション時間およびリードアウトの改変は可能であり、当業者に公知である。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのアナログのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの配列は、4つのヌクレオチド塩基:アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)およびポリヌクレオチドがRNAである場合チミンについてウラシル(U)からなる。したがって、「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、ポリヌクレオチドのアルファベット表記である。ポリヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子断片(例えば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマーを含み得る。また、ポリヌクレオチドは、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。別に指定または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが公知であるか、または予想される2つの相補的一本鎖形態の各々の両方を包含する。本明細書で説明される単離されたポリヌクレオチドおよび核酸は、非天然ポリヌクレオチドおよび核酸、または非天然ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と組み立てられるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを対象とすると理解される。非天然ポリヌクレオチドおよび核酸には、cDNAおよび化学合成分子が含まれ得るが、これらに限定されない。
「コードする」という用語またはその文法的均等物は、それがポリヌクレオチドに関して使用される場合、天然状態で、または当業者に周知の方法によって操作されたとき、転写されてmRNAを産生することができ、その後、そのmRNAがポリペプチドおよび/またはその断片に翻訳され得るポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖はそのようなポリヌクレオチドの相補体であり、コード配列はそこから推測することができる。
「第2の治療剤」という句は、Tn抗原またはsTn抗原の発現と関連付けられる疾患および/またはそれに関連する症状の処置、管理または改善において使用され得る任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態では、第2の治療剤は、本明細書で開示される抗体または機能的断片を指す。他の実施形態では、第2の治療剤は、本明細書で開示される抗体または機能的断片以外の剤を指す。第2の治療剤は、Tn抗原またはsTn抗原の発現と関連付けられる疾患および/またはそれに関連する1つまたは複数の症状の処置、管理または改善のために有用であることが周知であるか、またはそのために使用されてきたか、もしくはそのために現在使用されている剤であり得る。本明細書で開示される実施形態で、または本明細書で開示される実施形態とともに使用され得る第2の治療剤の非限定的な例には、化学療法剤および免疫療法剤が含まれる。
「トリプルネガティブ乳がん」または「TNBC」という句は、エストロゲン受容体についての検査が陰性(ER-)、プロゲステロン受容体についての検査が陰性(PR-)およびHER2についての検査が陰性(HER2-)である乳がんの形態を指す。
「Thomsen-nouvelle抗原」または「Tn抗原」という用語は、単糖構造N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)がグリコシド結合によってセリンまたはトレオニンに結合したもの(GalNAcα-O-セリン/トレオニン)または他の生体由来高分子を指す。
「sTn抗原」という用語は、Tn抗原の、ガラクトースではなくシアル酸による延長により形成されるTn抗原のシアル酸付加形態を指す(NeuAca2→6GalNAcα-O-セリン/トレオニン)。
「Thomsen-Friedenreich抗原」、「TF抗原」、「T抗原」または「コア1」という用語は、二糖抗原を創出する、追加のガラクトース単糖を伴うTn抗原を指す(Galβ1→3GalNAcα-O-セリン/トレオニン)。
「sTn抗原」という用語は、Tn抗原の、ガラクトースではなくシアル酸による延長により形成されるTn抗原のシアル酸付加形態を指す(NeuAca2→6GalNAcα-O-セリン/トレオニン)。
「Thomsen-Friedenreich抗原」、「TF抗原」、「T抗原」または「コア1」という用語は、二糖抗原を創出する、追加のガラクトース単糖を伴うTn抗原を指す(Galβ1→3GalNAcα-O-セリン/トレオニン)。
「ガングリオシド」という用語は、糖鎖上で結合した1つまたは複数のシアル酸(例えば、n-アセチルノイラミン酸、NANA)を伴うスフィンゴ糖脂質(セラミドおよびオリゴ糖)からなる分子を指す。60を超えるガングリオシドが公知であり、それらは主にNANA残基の位置および数において互いに異なる。ガングリオシドの非限定的な例には、1つのNANAを有するガングリオシド(ganglisides)(例えば、フコシル-GM1(F-GM1)を含むGM1、GM2およびGM3)、2つのNANAを有するガングリオシド(例えば、GD1a、GD1b、GD2およびGD3)、3つのNANAを有するガングリオシド(例えば、GT1bおよびGT3)および4つのNANAを有するガングリオシド(例えば、GQ1)が含まれる。
「グロボH」または「グロボヘキサオシルセラミド」という用語は、五糖前駆体、SSEA3(ステージ特異的胎児抗原3)から形成される六糖を指す。グロボHは、糖脂質および糖タンパク質のようにがん細胞の表面上に発現する抗原炭水化物ファミリーのメンバーである。
「グロボH」または「グロボヘキサオシルセラミド」という用語は、五糖前駆体、SSEA3(ステージ特異的胎児抗原3)から形成される六糖を指す。グロボHは、糖脂質および糖タンパク質のようにがん細胞の表面上に発現する抗原炭水化物ファミリーのメンバーである。
「シアリルLea」(sLea)という用語は、シアリル-Lewisa、シアリル-Lewis A、シアル酸付加Lewis aおよびCA 19.9としても公知であり、C31H52N2O23の分子式および820.74g/モルのモル質量を有する四糖である。sLeaの構造は、Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβおよびNeu5Gcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβを含み得る。sLeaは、胃腸管の腫瘍に広く発現しており、膵がんおよび結腸がんの腫瘍マーカーとして使用される。また、sLeaは、内皮細胞白血球付着分子(ELAM:endothelial leukocyte adhesion molecule)としても公知の、E-選択のための公知のリガンドである。
「局在化剤」という句は、疾患の診断または処置において補助する、対象に投与される物質を指す。そのような物質は、疾患を引き起こすプロセスの局在を明らかにし、正確に示し、および/または規定するために使用され得る。そのような物質は、第2の治療剤を、局在化剤を含むコンジュゲートが結合する場所に局在化させるためにも使用され得る。ある特定の実施形態では、局在化剤は、本明細書で開示される抗体または機能的断片にコンジュゲートされ、対象に投与されるか、または対象からの試料と接触された場合、がんまたは腫瘍形成の診断または処置において補助する物質を含む。
「検出可能剤」という句は、試料または対象における、本明細書で開示される抗体または機能的断片等の所望の分子の実在または存在を確認するために使用され得る物質を指す。検出可能剤は、可視化することができる物質、または別の方法で(例えば、定量化によって)決定および/または測定することができる物質であり得る。
「検出可能剤」という句は、試料または対象における、本明細書で開示される抗体または機能的断片等の所望の分子の実在または存在を確認するために使用され得る物質を指す。検出可能剤は、可視化することができる物質、または別の方法で(例えば、定量化によって)決定および/または測定することができる物質であり得る。
「治療剤」という句は、コンジュゲートに関して使用される場合、本明細書で開示される抗体または機能的断片とコンジュゲートまたは組換え融合されたとき、Tn抗原またはsTn抗原の発現と関連付けられる疾患および/またはそれに関連する症状の処置、管理または改善において、抗体または機能的断片とともに使用され得る任意の薬剤を指す。
「有効量」は、有益な結果または所望の結果をもたらすために十分な量である。有効量は、1回または複数回の投与、適用または投与量で投与され得る。そのような送達は、個々の投与単位が使用されるべき期間、剤のバイオアベイラビリティ、投与経路等を含む、いくつかの変数に依存する。
「治療有効量」という句は、本明細書で使用される場合、所与の疾患および/またはそれに関連する症状の重症度および/または持続期間を安定化、低減および/または改善するために十分な治療剤(例えば、本明細書で提供される抗体もしくは機能的断片、または本明細書で提供される他の任意の治療剤)の量を指す。治療剤の治療有効量は、所与の疾患の前進もしくは進行の安定化、低減もしくは改善のため、所与の疾患の再発、発症もしくは開始の低減もしくは改善のため、および/または別の治療(例えば、本明細書で提供される抗体または機能的断片の投与以外の治療)の予防もしくは治療効果を改善もしくは向上させるために必要な量であり得る。
「有効量」は、有益な結果または所望の結果をもたらすために十分な量である。有効量は、1回または複数回の投与、適用または投与量で投与され得る。そのような送達は、個々の投与単位が使用されるべき期間、剤のバイオアベイラビリティ、投与経路等を含む、いくつかの変数に依存する。
「治療有効量」という句は、本明細書で使用される場合、所与の疾患および/またはそれに関連する症状の重症度および/または持続期間を安定化、低減および/または改善するために十分な治療剤(例えば、本明細書で提供される抗体もしくは機能的断片、または本明細書で提供される他の任意の治療剤)の量を指す。治療剤の治療有効量は、所与の疾患の前進もしくは進行の安定化、低減もしくは改善のため、所与の疾患の再発、発症もしくは開始の低減もしくは改善のため、および/または別の治療(例えば、本明細書で提供される抗体または機能的断片の投与以外の治療)の予防もしくは治療効果を改善もしくは向上させるために必要な量であり得る。
「腫瘍抗原」という用語は、宿主において免疫応答を誘発し得るか、または免疫学的医薬剤によってターゲティングされ得る、腫瘍細胞内または腫瘍細胞上で産生される抗原物質を指す。例示的な腫瘍抗原には、変異のために異常な構造を有する腫瘍細胞内で産生される任意のタンパク質またはその改変、癌原遺伝子および腫瘍サプレッサーによって引き起こされる異常なタンパク質産生、腫瘍形成に関連しない他の遺伝子の変異によって引き起こされる腫瘍関連抗原、組織分化抗原、変異タンパク質抗原、発癌性ウイルス抗原、がん精巣抗原、血管または間質特異的抗原、腫瘍胎児性抗原、ならびに腫瘍細胞において異常な構造を有する細胞表面糖脂質および糖タンパク質のような他の物質が含まれる。
「共阻害分子」(「ネガティブチェックポイントレギュレータ(negative checkpoint regulator)」または「NCR」としても公知)とは、リガンドまたはカウンター受容体によるそれらのエンゲージメント後のT細胞への負のシグナルの送達によって免疫応答(例えば、T細胞活性化)をダウンレギュレートする分子を指す。共阻害分子の例示的な機能は、不相当な免疫活性化を予防すること、付随的損傷を最小限にすることおよび/または末梢自己寛容を維持することである。一部の態様では、共阻害分子は、抗原提示細胞またはT細胞によって発現されるリガンドまたは受容体である。態様では、共阻害分子は、抗原提示細胞およびT細胞の両方によって発現されるリガンドまたは受容体である。
「共刺激分子」とは、リガンドまたはカウンター受容体によるそれらのエンゲージメント後のT細胞への正のシグナルの送達によって免疫応答(例えば、T細胞活性化)をアップレギュレートする分子を指す。T細胞が完全に活性化されるためには、2つのシグナルが必要とされる。1)抗原提示細胞上のペプチド-MHC分子と相互作用するT細胞受容体を通して抗原特異的シグナルが提供され、2)抗原提示細胞の膜上に発現する共刺激分子とT細胞との間の相互作用によって抗原非特異的な共刺激シグナルが提供される。T細胞共刺激は、T細胞増殖、分化および生存を提供する。一部の態様では、共刺激分子は、抗原提示細胞またはT細胞によって発現されるリガンドまたは受容体である。一部の態様では、共刺激分子は、抗原提示細胞およびT細胞の両方によって発現されるリガンドまたは受容体である。
「共刺激分子」とは、リガンドまたはカウンター受容体によるそれらのエンゲージメント後のT細胞への正のシグナルの送達によって免疫応答(例えば、T細胞活性化)をアップレギュレートする分子を指す。T細胞が完全に活性化されるためには、2つのシグナルが必要とされる。1)抗原提示細胞上のペプチド-MHC分子と相互作用するT細胞受容体を通して抗原特異的シグナルが提供され、2)抗原提示細胞の膜上に発現する共刺激分子とT細胞との間の相互作用によって抗原非特異的な共刺激シグナルが提供される。T細胞共刺激は、T細胞増殖、分化および生存を提供する。一部の態様では、共刺激分子は、抗原提示細胞またはT細胞によって発現されるリガンドまたは受容体である。一部の態様では、共刺激分子は、抗原提示細胞およびT細胞の両方によって発現されるリガンドまたは受容体である。
「投与する」または「投与」という用語は、粘膜、皮内、静脈内、筋内送達および/または本明細書で説明されるか、または当該技術分野で公知の他の任意の物理的送達法によるような、物質(例えば、本明細書で説明される抗体またはその機能的断片)を、それが体外に存在するとき、患者に注射または別の方法で物理的に送達する行為を指す。疾患が処置される場合、物質の投与は典型的に、疾患の開始後に起こる。疾患が予防される場合、物質の投与は典型的に、その疾患の発症前に起こる。
「EC50」または「有効濃度の最大半量」という用語は、特定の曝露濃度後に基線と最大値との間の中間の応答を誘導する、本明細書で説明される抗体またはその機能的断片の濃度を指す。
「合成Tn抗原」という用語は、グリコシド結合によって任意の基質に結合された、Tn抗原の単糖構造N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)を指す。非限定的な例示的合成Tn抗原には、α-GalNAc-O(CH2)3NHCO(CH2)5NH-ビオチン(GlycoTech;カタログ番号02-010)およびα-GalNAc-PAA-ビオチン(GlycoTech;カタログ番号01-001、PAAはポリアクリルアミド骨格である)が含まれる。別の例示的な合成Tn抗原は、以下の構造によるTn「クラスター」であり、KLHは、Tn抗原の部分を形成しないキーホールリンペットヘモシアニンを示す。
「合成Tn抗原」という用語は、グリコシド結合によって任意の基質に結合された、Tn抗原の単糖構造N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)を指す。非限定的な例示的合成Tn抗原には、α-GalNAc-O(CH2)3NHCO(CH2)5NH-ビオチン(GlycoTech;カタログ番号02-010)およびα-GalNAc-PAA-ビオチン(GlycoTech;カタログ番号01-001、PAAはポリアクリルアミド骨格である)が含まれる。別の例示的な合成Tn抗原は、以下の構造によるTn「クラスター」であり、KLHは、Tn抗原の部分を形成しないキーホールリンペットヘモシアニンを示す。
本発明による「Tn改変ペプチド」という用語は、グリコシド結合によって結合された単糖構造N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)を有するように改変された、2個またはそれよりも多いセリンまたはトレオニン残基、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個のセリンもしくはトレオニン残基、または例えば、約10、15、20、25、30、35、40、45、50~約60、75、80、90、95、100個のセリンもしくはトレオニン残基、または例えば、約3、4、5、6、7、8、9~約10、15、20、25、30、35、40、45、50個のセリンもしくはトレオニン残基を有する単離されたペプチドを指し、改変されたセリンまたはトレオニン残基は、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって、例えば、2、3、4、5、6、7、8または9個の連続するアミノ酸残基によって分離されており、TnまたはsTn抗原を形成するように改変されたセリンまたはトレオニン残基は、互いに隣接して位置し得、例えば、セリンの次にトレオニン、またはトレオニンの次にセリンであり得る。Tn改変ペプチドの非限定的な例は、以下のアミノ酸配列:HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(配列番号155)を有するMuc1-1-5Gペプチドであり、太字および下線テキストの残基はTn抗原になるように改変されている。
本発明による「Tn改変タンパク質」という用語は、細胞によって発現されるタンパク質に関して使用される場合、グリコシド結合によって結合された単糖構造N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)を有するように改変された2つまたはそれよりも多いセリンまたはトレオニン残基を有する、細胞によって発現されるタンパク質を指し、改変されたセリンまたはトレオニン残基は、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されており、これは、改変された少なくとも2つのアミノ酸残基が互いに隣接することを含む。そのような改変は、培養中の細胞が増殖し、その結果、そのような細胞によって発現される酵素が、細胞表面上で改変されたタンパク質を産生することによって起こり得る。
一部の実施形態では、本発明は、抗体重鎖もしくは軽鎖またはその機能的断片が、本明細書で説明される1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3、3A7および2F3バリアントと命名されたクローン単離物からのCDRのうちの1つまたは複数を有する、単離された抗体またはその機能的断片を提供する。したがって、一部の態様では、抗体重鎖もしくは軽鎖またはその機能的断片は、表2~4および図1~7で示されるCDRのうちの1つまたは複数を有する。表2~4および図1~7で示されるCDRのうちの1つまたは複数を含む抗体またはその機能的断片は、特に本明細書で説明されるTn抗原またはsTn抗原等の、本明細書で説明される標的抗原に特異的に結合し得る。CDRのうちの1つまたは複数、特にCDR3を含む本発明による抗体またはその機能的断片は、本明細書で説明されるTn抗原またはsTn抗原に特異的に結合し得る。Tn抗原またはsTn抗原への特異的な結合は、本明細書で提供される本発明の抗体のいずれかについて本明細書で提供される実施例で提供される特異性、親和性および/またはアビディティを含み得る。一部の実施形態では、本発明の抗体は、トレオニンおよび/またはセリン残基上のTnまたはsTnに結合する。一部の実施形態では、抗体は、セリン残基上のTnまたはsTnに優先的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、セリン残基上のTnまたはsTnに特異的に結合する。優先的または特異的結合を示すそのような抗Tnまたは抗sTn抗体には、例えば、抗体2F3およびバリアント289番、6番、1733番、633番、680-4番、1780-2番および17v2番が含まれる。特異的結合は、トレオニン結合TnまたはsTnと比較して、セリン結合TnまたはsTn抗原の一次、二次または三次構造を区別することを含む。結合の区別が大きければ大きいほど、抗体はセリン結合TnまたはsTnについてより特異的である。優先的結合は、セリン特異的TnまたはsTn抗体を含むが、トレオニン結合TnまたはsTnとの交差反応性も示し得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片は、以下の特色のうちの1つまたは複数を有する。
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、2つのTn抗原分子は、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
・シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
・Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有するか、または
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する。
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、2つのTn抗原分子は、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
・シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
・Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有するか、または
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する。
一部の態様では、本明細書で開示される本発明の抗体またはその機能的断片について上記に説明される特色は、合成Tn抗原、Tn改変ペプチドの部分、または細胞によって発現されるTn改変タンパク質の部分であるTn抗原を使用して決定される。一部の態様では、Tn抗原は、がん細胞によって発現される。本明細書で説明される抗体またはその機能的断片の上記の特色のいずれかを査定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例示的な方法は本明細書で提供される。
本発明は、1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する抗体またはその機能的断片をさらに含む。1つまたは複数のセリン残基上のTnまたはsTnへのこの優先的または特異的結合は、例えば、正常免疫細胞等の非標的細胞に対して、がん等の標的細胞を区別することを促進し得る。加えて、1つまたは複数のセリン残基上のTnまたはsTnへの優先性または特異性を有する本明細書で提供される抗体は、例えばIgMアイソタイプと比較して区別できる特徴を有する、IgG1アイソタイプを含むIgGアイソタイプである。それゆえ、一部の実施形態では、本発明は、1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する抗体またはその機能的断片を使用して、例えば、標的対非標的選択性を提供することを促進し得る。ある特定の実施形態では、本発明は、トレオニン結合TnまたはsTnと比較してセリン結合TnまたはsTnをターゲティングすることを通して、Tn抗原を発現するがん細胞を特異的にターゲティングする方法を提供する。
本発明は、1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する抗体またはその機能的断片をさらに含む。1つまたは複数のセリン残基上のTnまたはsTnへのこの優先的または特異的結合は、例えば、正常免疫細胞等の非標的細胞に対して、がん等の標的細胞を区別することを促進し得る。加えて、1つまたは複数のセリン残基上のTnまたはsTnへの優先性または特異性を有する本明細書で提供される抗体は、例えばIgMアイソタイプと比較して区別できる特徴を有する、IgG1アイソタイプを含むIgGアイソタイプである。それゆえ、一部の実施形態では、本発明は、1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する抗体またはその機能的断片を使用して、例えば、標的対非標的選択性を提供することを促進し得る。ある特定の実施形態では、本発明は、トレオニン結合TnまたはsTnと比較してセリン結合TnまたはsTnをターゲティングすることを通して、Tn抗原を発現するがん細胞を特異的にターゲティングする方法を提供する。
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片は、6つ未満のCDRを含む。一部の実施形態では、抗体またはその機能的断片は、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3からなる群から選択される1、2、3、4または5つのCDRを含む。特定の実施形態では、抗体またはその機能的断片は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3からなる群から選択される1、2、3、4または5つのCDRを含む。そのようなCDRは、表2~4および図1~7で示される。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、(a)配列番号2、5、6、8、11および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と;配列番号14、17、18、20、23、24、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と;配列番号26、30、31、33、37、38および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含むVHドメイン、および/または(b)配列番号40、44、45、47、51および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と;配列番号54、53、59、63および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と;配列番号66、70および71からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含むVLドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、(a)配列番号2、5、6、8、11および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と;配列番号14、17、18、20、23、24、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と;配列番号26、30、31、33、37、38および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含むVHドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、(a)配列番号40、44、45、47、51および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と;配列番号54、53、59、63および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と;配列番号66、70および71からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含むVLドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号2および8からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号14および20からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号26および33からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含み、VLドメインが、配列番号40および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号54および59からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、配列番号66のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号5および11からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号17、23、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号30、37および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含み、VLドメインが、配列番号44および51からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号53および63からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、配列番号70のアミノ酸を有するVL CDR3とを含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本明細書で説明される抗体またはその機能的断片は、VHおよびVLドメインを含み、(i)VHドメインは、配列番号5のVH CDR1と、配列番号17のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、VLドメインは、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(ii)VHドメインは、配列番号5のVH CDR1と、配列番号149のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、VLドメインは、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(iii)VHドメインは、配列番号5のVH CDR1と、配列番号17のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、VLドメインは、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(iv)VHドメインは、配列番号5のVH CDR1と、配列番号150のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、VLドメインは、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(v)VHドメインは、配列番号5のVH CDR1と、配列番号151のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、VLドメインは、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(vi)VHドメインは、配列番号5のVH CDR1と、配列番号152のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、VLドメインは、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(vii)VHドメインは、配列番号5のVH CDR1と、配列番号153のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、VLドメインは、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(viii)VHドメインは、配列番号5のVH CDR1と、配列番号149のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、VLドメインは、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(ix)VHドメインは、配列番号5のVH CDR1と、配列番号150のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、VLドメインは、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含む。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号6および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号18および24からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号31および38からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含み、VLドメインが、配列番号45および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号53および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、配列番号71のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを有する単離された抗体または機能的断片を提供する。そのようなVHドメイン配列を、表5および6ならびに図1および3~7に示す。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを有する単離された抗体または機能的断片を提供する。そのようなVHドメイン配列を、表5および図2に示す。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインおよびVLドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインおよびVLドメインを有する単離された抗体または機能的断片を提供する。そのようなVHドメインおよびVLドメイン配列を、表5および6ならびに図1~7に示す。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを有する単離された抗体または機能的断片を提供する。そのようなVHドメイン配列を、表5および図2に示す。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインおよびVLドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインおよびVLドメインを有する単離された抗体または機能的断片を提供する。そのようなVHドメインおよびVLドメイン配列を、表5および6ならびに図1~7に示す。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、配列番号101、105、106、114、115、116、117、118、119、129、121、122、123、124、125、126、127、128、129および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、配列番号108、112および113からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、配列番号108、112および113からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号101のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号108のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号114からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号115からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号115からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号116からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号117からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105および114~130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号118からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号117からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105および114~130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号118からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号119からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105および114~130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105および114~130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号120からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号121からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号122からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号121からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号122からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号123からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号124からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号125からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号125からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号126からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号127からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号128からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号127からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号128からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号129からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号106のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号113のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号106のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号113のアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片を提供する。
また別の実施形態では、本発明は、選択位置において1つまたは複数のアミノ酸残基置換を有するVHドメインを有する本明細書で説明される単離された抗体またはその機能的断片を提供する。したがって、一部の態様では、本明細書で説明される本発明の単離された抗体またはその機能的断片は、Kabat番号付けに基づいて、位置17におけるセリンもしくはフェニルアラニン;位置37におけるバリンもしくはイソロイシン;位置55におけるアスパラギン酸、ヒスチジンもしくはアラニン;位置61におけるアスパラギン酸もしくはチロシン;位置63におけるバリンもしくはメチオニン;位置82Bにおけるセリンもしくはアスパラギン;位置87におけるトレオニンもしくはアラニン;位置100Bにおけるアラニンもしくはトレオニン;位置105におけるグルタミンもしくはリジン;または位置110におけるトレオニンもしくはイソロイシンから選択される1つまたは複数のアミノ酸バリアントを有するVHドメインを有する。また追加の実施形態では、VHドメインは、本明細書で説明されるバリアントのうちの2つもしくはそれよりも多く、3つもしくはそれよりも多く、4つもしくはそれよりも多く、5つもしくはそれよりも多く、6つもしくはそれよりも多く、7つもしくはそれよりも多く、8つもしくはそれよりも多く、9つもしくはそれよりも多く、または10個全てを含む。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体重鎖もしくは軽鎖またはその機能的断片が、本明細書で説明される1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3、3A7および2F3バリアントと命名されたクローン単離物からのCDRのうちの1つまたは複数を有する、単離されたポリヌクレオチドを提供する。したがって、一部の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、表2~4および図1~7で示されるCDRのうちの1つまたは複数を有する抗体重鎖もしくは軽鎖またはその機能的断片をコードする。
一部の実施形態では、本明細書で提供される本発明による単離されたポリヌクレオチドは、6つ未満のCDRを含む本明細書で開示される抗体またはその機能的断片をコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体または機能的断片は、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3からなる群から選択される1、2、3、4または5つのCDRを含む。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはその機能的断片は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3からなる群から選択される1、2、3、4または5つのCDRを含む。そのようなCDRは、表2~4および図1~7に示される。
一部の実施形態では、本明細書で提供される本発明による単離されたポリヌクレオチドは、6つ未満のCDRを含む本明細書で開示される抗体またはその機能的断片をコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体または機能的断片は、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3からなる群から選択される1、2、3、4または5つのCDRを含む。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはその機能的断片は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3からなる群から選択される1、2、3、4または5つのCDRを含む。そのようなCDRは、表2~4および図1~7に示される。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、(a)配列番号2、5、6、8、11および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と;配列番号14、17、18、20、23、24、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と;配列番号26、30、31、33、37、38および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含む可変重鎖(VH)ドメイン、および/または(b)配列番号40、44、45、47、51および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と;配列番号54、53、59、63および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と;配列番号66、70および71からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む可変軽鎖(VL)ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、(a)配列番号2、5、6、8、11および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と;配列番号14、17、18、20、23、24、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と;配列番号26、30、31、33、37、38および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含む可変重鎖(VH)ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、(a)配列番号40、44、45、47、51および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と;配列番号54、53、59、63および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と;配列番号66、70および71からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む可変軽鎖(VL)ドメインを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号2および8からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号14および20からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号26および33からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含み、VLドメインが、配列番号40および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号54および59からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、配列番号66のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号5および11からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号17、23、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号30、37および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含み、VLドメインが、配列番号44および51からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号53および63からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、配列番号70のアミノ酸を有するVL CDR3とを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号6および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号18および24からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号31および38からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含み、VLドメインが、配列番号45および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号53および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、配列番号71のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを有する抗体または機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのようなVHドメイン配列を、表5および6ならびに図1および3~7に示す。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを有する抗体または機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのようなVHドメイン配列を、表5および6ならびに図1および3~7に示す。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを有する抗体または機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのようなVLドメイン配列を、表5および図2に示す。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインおよびVLドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインおよびVLドメインを有する抗体または機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのようなVHドメインおよびVLドメイン配列を、表5および6ならびに図1~7に示す。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインおよびVLドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインおよびVLドメインを有する抗体または機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのようなVHドメインおよびVLドメイン配列を、表5および6ならびに図1~7に示す。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、配列番号101、105、106および114~130からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVHドメインを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、配列番号108、112および113からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号101のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号108のアミノ酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、配列番号108、112および113からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号101のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号108のアミノ酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105、114、115、116、117、118、119、129、121、122、123、124、125、126、127、128、129および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号106のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号113のアミノ酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、抗体またはその機能的断片が、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号106のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号113のアミノ酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
また別の実施形態では、本発明は、選択位置において1つまたは複数のアミノ酸残基を有するVHドメインを有する本明細書で説明される抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。したがって、一部の態様では、本明細書で説明される抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドは、Kabat番号付けに基づいて、位置17におけるセリンもしくはフェニルアラニン;位置37におけるバリンもしくはイソロイシン;位置55におけるアスパラギン酸、ヒスチジンもしくはアラニン;位置61におけるアスパラギン酸もしくはチロシン;位置63におけるバリンもしくはメチオニン;位置82Bにおけるセリンもしくはアスパラギン;位置87におけるトレオニンもしくはアラニン;位置100Bにおけるアラニンもしくはトレオニン;位置105におけるグルタミンもしくはリジン;または位置110におけるトレオニンもしくはイソロイシンから選択される1つまたは複数のアミノ酸バリアントを有するVHドメインを有する。したがって、また他の実施形態では、本明細書で説明される抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドは、Kabat番号付けに基づいて、位置30におけるセリン、トレオニンまたはアルギニン;位置56におけるグリシン;位置57におけるアスパラギンまたはトレオニン;位置62におけるグルタミン;位置63におけるリジン;および位置98におけるリジンから選択されるアミノ酸バリアントのうちの1つまたは複数を有するVHドメインを有する。また追加の実施形態では、VHドメインは、本明細書で説明されるバリアントのうちの2つもしくはそれよりも多く、3つもしくはそれよりも多く、4つもしくはそれよりも多く、5つもしくはそれよりも多く、6つもしくはそれよりも多く、7つもしくはそれよりも多く、8つもしくはそれよりも多く、9つもしくはそれよりも多く、または10個全てを含む。
別の実施形態では、本明細書で説明される抗体またはその機能的断片をコードする単離されたポリヌクレオチドは、Kabat番号付けに基づいて、位置31におけるアスパラギンまたはリジン;および位置41におけるグリシンからなる群から選択されるアミノ酸バリアントのうちの1つまたは複数を有するVLドメインを有する。また追加の態様では、VLドメインは、本明細書で説明されるバリアントのうちの1つまたはそれよりも多くを含む。ポリヌクレオチドバリアントは、アミノ酸変化をコードし、したがってさらに、様々なクローンのアミノ酸バリアントとして反映される。
別の実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドのバリアントを提供する。バリアントは、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、非限定的にメチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ等の、1つまたは複数の改変されたヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。加えて、バリアントポリヌクレオチドは、非ヌクレオチド成分によって割り込まれたポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドへの改変は、当業者に周知の方法を使用して、ポリヌクレオチドの組立て前または後に与えられ得る。例えば、ポリヌクレオチドは、重合後に、酵素技術または化学技術のいずれかを使用する標識化成分とのコンジュゲーションによって改変され得る(例えば、Gottfried and Weinhold, 2011, Biochem. Soc. Trans., 39(2):523-628;Paredes et al., 2011, Methods, 54(2):251-259で説明される)。
別の実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドのバリアントを提供する。バリアントは、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、非限定的にメチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ等の、1つまたは複数の改変されたヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。加えて、バリアントポリヌクレオチドは、非ヌクレオチド成分によって割り込まれたポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドへの改変は、当業者に周知の方法を使用して、ポリヌクレオチドの組立て前または後に与えられ得る。例えば、ポリヌクレオチドは、重合後に、酵素技術または化学技術のいずれかを使用する標識化成分とのコンジュゲーションによって改変され得る(例えば、Gottfried and Weinhold, 2011, Biochem. Soc. Trans., 39(2):523-628;Paredes et al., 2011, Methods, 54(2):251-259で説明される)。
当該技術分野で周知の任意の方法によって、ポリヌクレオチドを得、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。特定されたクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3、3A7および2F3バリアント(例えば、表5および6)の可変重鎖および軽鎖ドメインのアミノ酸配列は本明細書で説明されているので、抗体およびこれらの抗体の改変された変形型をコードするヌクレオチド配列は、当該技術分野で周知の方法を使用して決定することができる、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが公知のヌクレオチドコドンは、抗体をコードする核酸を生成するように組み立てられる。抗体をコードするそのようなポリヌクレオチドは、化学合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができ(例えば、Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242で説明される)、これは、簡潔に述べると、抗体、その断片またはバリアントをコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、ならびにその後のPCRによるライゲートしたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
本明細書で開示される抗体またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドは、クローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3、3A7および2F3バリアント(例えば、表5および6)の可変重鎖および/または軽鎖ドメインの核酸配列を使用して生成することができる。抗体または機能的断片をコードする核酸は、化学合成されるか、または好適な供給源(例えば、抗体またはその機能的断片を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞等の、抗体またはその機能的断片を発現する細胞から単離されたcDNA)からその配列の3’および5’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するPCR増幅によって、または特定の核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得ることができる。その後、PCRによって生成した増幅した核酸は、当該技術分野で周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
遺伝暗号の縮重のために、本明細書で示されるポリペプチド配列の各々は、提供されるポリヌクレオチド配列の他に、多数の他のポリヌクレオチド配列によってもコードされることが当業者によって理解される。例えば、単一のアミノ酸は2つ以上のコドンによってコードされ得るので、本明細書で提供される重鎖可変ドメインは、他のポリヌクレオチド配列に加えて、本明細書で説明される特定のポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。したがって、本出願は、各抗原結合タンパク質をコードする各縮重ヌクレオチド配列についての十分な明細および実施可能要件を提供する。アミノ酸配列への改変をもたらさないヌクレオチド配列の変化はサイレントであり、それゆえ、「バリアント」とは考えられない。他方で、「バリアント」として本明細書で説明される配列は、元の単離された「親クローン」配列に対してポリヌクレオチド変化を有する。親配列になされ、機能的特徴の変更を有する結合分子を産生した改変は、コードされるアミノ酸配列が変えられているので「バリアント」としてさらに研究した。したがって、「バリアント」は、ポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列における変化の両方を説明するために使用することができるが、一般的には変えられた機能的特徴または「バリアント」特徴を有するタンパク質をコードする配列に結び付けられる。
本明細書で開示される一部の実施形態では、単離された抗体またはその機能的断片は、モノクローナル抗体である。本明細書で開示される一部の態様では、本明細書で提供される単離された抗体またはその機能的断片は、IgGまたはIgMアイソタイプである。本明細書で開示されるさらなる態様では、抗体またはその機能的断片は、IgG1サブクラスの抗体である。本明細書で開示されるさらなる態様では、抗体またはその機能的断片は、例えばIgG1サブクラスを含むIgGの抗体であり、がん細胞上のTnまたはsTnに結合する。
本明細書で開示される一部の実施形態では、単離された抗体またはその機能的断片は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープについて結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、2つの異なるエピトープに結合し、例えば、細胞防御機構の焦点をTn/sTn発現細胞に合わせるために、Tn/sTn結合アームは、T細胞受容体分子(例えば、CD2またはCD3)等の白血球上の誘発分子、またはIgGについてのFc受容体(FcγR)に結合するアームと組み合わせてもよい。また、二重特異性抗体は、Tn/sTn発現細胞に細胞傷害剤(例えば、サポリン、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトラ・エキセート(methola-exate)または放射性同位体ハプテン)を局在化させるために使用してもよい。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片(例えば、F(ab’):二重特異性抗体)として調製することができる。
二重特異性抗体を製造するための方法は、当該技術分野で公知である。(例えば、Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983);Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991);Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986);Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992);Hollinger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993);Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994);米国特許第4,474,893号;同第4,714,681号;同第4,925,648号;同第5,573,920号;同第5,601,81号;同第95,731,168号;同第4,676,980号;および同第4,676,980号;WO94/04690;WO91/00360;WO92/200373;WO93/17715;WO92/08802;ならびにWO96/27011を参照されたい。)
したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される本発明の単離された抗体またはその機能的断片は、Tn抗原またはsTn抗原に結合するのみではなく、第2の抗原にも結合する。第2の抗原は、抗体またはその機能的断片を所望の標的(例えば、Tn抗原またはsTn抗原)にさらにターゲティングするため、および/または所望の標的に追加の成分(例えば、免疫調節細胞)を補充するために好適な任意の抗原であり得る。したがって、一部の態様では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、Tn抗原またはsTn抗原および腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1AI、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、サイクリンD1、DKK1、ENAH(hMcna)、Ga733(EpCAM)、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Ralpha2、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ-フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53(非変異)、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX10、STEAP1(前立腺の6回膜貫通上皮抗原1)、サバイビン(survivinn)、テロメラーゼ、VEGF、WT1、EGF-R、CEA、CD20、CD33、CD52、糖タンパク質100(GP100またはgp100タンパク質)、MELANA/MART1、MART2、NY-ESO-1、p53、MAGE A1、MAGE A3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、CDK4、アルファ-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、ベータ-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FNl、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARアルファ融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、H-ras、K-ras(V-Ki-ras2 Kirstenラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SSX、SSX2、SYT-SSX1もしくは-SSX2融合タンパク質、TGF-ベータRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、ormdm-2、LMP2、HPV E6/E7、EGFRvIII(上皮増殖因子バリアントIII)、イディオタイプ、Ras-変異体、p53(変異体)、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、PSA、hTERT、肉腫転座切断点、EphA2、前立腺酸性ホスファターゼPAP、neo-PAP、ML-IAP、AFP、ERG(TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MYCN、TRP2、TRP2-Int2、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、sLe(a)、cyp1B1、PLAC1、BORIS、グロボH、NY-BR-1、SART3、炭酸脱水酵素IX、OY-TES1、精子タンパク質17、LCK、高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA:high molecular weight melanoma-associated antigen)、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-ベータ、MAD-CT-2、For関連抗原1、TRP1、CA-125、CA19-9、カルレチニン、上皮膜抗原(EMA:epithelial membrane antigen)、上皮腫瘍抗原(ETA:epithelial tumor antigen)、CD19、CD34、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維酸性タンパク質(GFAP:glial fibrillary acidic protein)、GCDFP(gross cystic disease fluid protein)-15、HMB-45抗原、Myo-D1、筋特異的アクチン(MSA:muscle-specific actin)、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE:neuron-specific enolase)、胎盤性アルカリホスファターゼ、シナプトフィジン(synaptophysis)、サイログロブリン、甲状腺転写因子-1、ピルビン酸キナーゼアイソザイムM2型の二量形態(腫瘍M2-PK)、BAGE BAGE-1、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-SAR-35、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、TPTE、炭水化物、グリカン、Lea、シアリルLea、Leb、Lex、ポリフコシル-Lex、Ley、ガングリオシド、GM1、GM2、GM3、GD2、GD3、CA 15-3(CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA 50、CAM 43、CEA、EBNA、EF2、エプスタイン・バーウイルス抗原、HLA-A2、HLA-A11、HSP70-2、KIAAO205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシンクラスI、GnTV、Herv-K-mel、LAGE-1、LAGE-2、精子タンパク質(SP:sperm protein)17、SCP-1、P15(58)、Hom/Mel-40、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、TSP-180、P185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、TAG-72、TAG-72-4、CA-72-4、CAM 17.1、NuMa、13-カテニン、P16、TAGE、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68/KP1、CO-029、HTgp-175、M344、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TLP、TPS、CD22、CD27、CD30、CD70、CD73(5’-NT;エクト-5’-ヌクレオチダーゼ;NT5E)、prostein、TARP(T細胞受容体ガンマ選択的リーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、インテグリンαvβ3(CD61)、ガラクチン、もしくはRal-B、CD123、CLL-1、CD38、CS-1、CD138、インターフェロン遺伝子タンパク質の刺激薬(STING:stimulator of interferon genes protein)アゴニスト、またはROR1である。
別の態様では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、Tn抗原またはsTn抗原、およびTリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、白血球、単球、マクロファージまたは骨髄由来サプレッサー細胞によって発現されるタンパク質に結合する。一部の実施形態では、そのようなタンパク質は、CD16、T細胞受容体のタンパク質(CD3δ/ε、CD3γ/εおよびCD247ζ/ζまたはζ/η)、C2、CD4、CD8、LFA-1、CD45、FasL、TRAIL、TNF、PRTN3、MPO、BPI、HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD14、IL-12、CD40、CD23、CD31、CD38、CD44、CD45、CD69、LFA-3、ARG1、NOS2、CD11b、PD-L1、PSGL-1、LY-6G、CCR2、CCR2、CD43またはL-セレクチンである。一部の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、Tn抗原またはsTn抗原、およびCD3(例えば、CD3δ/ε、CD3γ/ε)に結合する。T細胞上のCD3および腫瘍細胞に同時に結合することを通して、そのような二重特異性抗体は、2つの細胞間の細胞溶解シナプスの形成を強い、それによって、T細胞活性をターゲティングされた腫瘍細胞へと選択的に再方向付けする。例えば、二重特異性抗体は、(i)クローン単離物1A4、3A7ならびに2F3およびそのバリアントのCDRおよび/またはVH/VL配列(例えば、クローン単離物1A4、3A7ならびに2F3およびそのバリアントについて表2、3、4、5および6で示されるCDRおよび/またはVH/VL配列)によって定義されるVHおよびVLドメインの任意の1つを介してTn抗原またはsTn抗原に、および(ii)CD3(例えば、CD3δ/ε、CD3γ/ε)に結合する。
T細胞の再方向付けは化学療法に対する抵抗性によって影響を受けず、細胞表面上の低い発現レベルはこの作用様式にとってはあまり重要でないので、Tn/sTnを二重特異的T細胞エンゲージメント手法によりターゲティングすることは、ADC手法に優る利点を提供することが予想される。Tエフェクター細胞および腫瘍細胞への同時の結合を通して、T細胞エンゲージャーは、2つの細胞間の細胞溶解シナプスの形成を強い、それにより、T細胞活性をターゲティングされた腫瘍細胞へと選択的に再方向付けする。
一態様では、本発明は、Tn/sTnに特異的に結合する第1の抗原結合ユニットとCD3に特異的に結合する第2の抗原結合ユニットとを含む多重特異性結合タンパク質(例えば、二重特異性抗体)であって、Tn/sTnに特異的に結合する前記第1の抗原結合ユニットが、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインおよびVLドメインのアミノ酸配列を有する第1の軽鎖可変(VL)ドメインおよび第1の重鎖可変(VH)ドメインを含む、多重特異性結合タンパク質を提供する。
本発明の実施形態では、Tn/sTnに特異的に結合する第1の抗原結合ユニットは、それぞれ対のVLおよびVHドメインから選択され、
(i)VLドメインは、例えば、表5および7ならびに図2で示される、2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVLドメインのアミノ酸配列を有し、かつ/または
(ii)VLドメインは、例えば、表3または図1~7で示される、VL CDRのうちの任意の1つのアミノ酸配列を有する1、2または3つのVL CDR(VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3)を含み、かつ
(iii)VHドメインは、例えば、表5もしくは6または図1もしくは3~7で示される、2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインのアミノ酸配列を有し、かつ/または
(iv)VHドメインは、例えば、表2または4で示される、VH CDRのうちの任意の1つのアミノ酸配列を有する1、2または3つのVH CDR(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3)を含む。
(i)VLドメインは、例えば、表5および7ならびに図2で示される、2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVLドメインのアミノ酸配列を有し、かつ/または
(ii)VLドメインは、例えば、表3または図1~7で示される、VL CDRのうちの任意の1つのアミノ酸配列を有する1、2または3つのVL CDR(VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3)を含み、かつ
(iii)VHドメインは、例えば、表5もしくは6または図1もしくは3~7で示される、2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインのアミノ酸配列を有し、かつ/または
(iv)VHドメインは、例えば、表2または4で示される、VH CDRのうちの任意の1つのアミノ酸配列を有する1、2または3つのVH CDR(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3)を含む。
一態様では、本発明は、Tn/sTnに特異的に結合する第1の抗原結合ユニットとCD3に特異的に結合する第2の抗原結合ユニットとを含む多重特異性結合タンパク質(例えば、二重特異性抗体)であって、Tn/sTnに結合する第1の抗原結合ユニットが、配列番号101のアミノ酸配列を含むVHドメインと、配列番号108のアミノ酸配列を含むVLドメインとを含む、多重特異性結合タンパク質を提供する。
別の実施形態では、本発明は、Tn/sTnに特異的に結合する第1の抗原結合ユニットとCD3に特異的に結合する第2の抗原結合ユニットとを含む多重特異性結合タンパク質(例えば、二重特異性抗体)であって、Tn/sTnに結合する第1の抗原結合ユニットが、VHおよびVLドメインを含み、(i)VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号17のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、かつVLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(ii)VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号149のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、かつVLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(iii)VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号17のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、かつVLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(iv)VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号150のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、かつVLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(v)VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号151のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、かつVLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(vi)VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号152のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、かつVLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(vii)VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号153のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、かつVLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(viii)VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号149のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、かつVLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または(ix)VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号150のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、かつVLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含む、多重特異性結合タンパク質を提供する。
また別の実施形態では、本発明は、Tn/sTnに特異的に結合する第1の抗原結合ユニットとCD3に特異的に結合する第2の抗原結合ユニットとを含む多重特異性結合タンパク質(例えば、二重特異性抗体)であって、Tn/sTnに結合する第1の抗原結合ユニットが、配列番号105、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVHドメインと、配列番号112のアミノ酸配列を含むVLドメインとを含む、多重特異性結合タンパク質を提供する。
また別の実施形態では、本発明は、Tn/sTnに特異的に結合する第1の抗原結合ユニットとCD3に特異的に結合する第2の抗原結合ユニットとを含む多重特異性結合タンパク質(例えば、二重特異性抗体)であって、Tn/sTnに結合する第1の抗原結合ユニットが、配列番号106のアミノ酸配列を含むVHドメインと、配列番号113のアミノ酸配列を含むVLドメインとを含む、多重特異性結合タンパク質を提供する。
また別の実施形態では、本発明は、Tn/sTnに特異的に結合する第1の抗原結合ユニットとCD3に特異的に結合する第2の抗原結合ユニットとを含む多重特異性結合タンパク質(例えば、二重特異性抗体)であって、Tn/sTnに結合する第1の抗原結合ユニットが、配列番号106のアミノ酸配列を含むVHドメインと、配列番号113のアミノ酸配列を含むVLドメインとを含む、多重特異性結合タンパク質を提供する。
したがって、二重特異性抗体の非限定的な一例では、本発明は、Tn/sTnに特異的に結合する第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖とを含むタンパク質であって、第1の鎖が、第1のリンカーに共有結合する第1の軽鎖を含み、第1のリンカーそれ自体が第1の重鎖に共有結合し、CD3に特異的に結合する第2の鎖が、第2のリンカーに共有結合する第2の軽鎖を含み、第2のリンカーそれ自体が第2の重鎖に共有結合する、タンパク質を提供する。
例示的な一実施形態では、第1の鎖は、そのN末端から出発して、Tn/sTnに特異的に結合する第1の軽鎖可変領域(例えば、配列番号112のアミノ酸配列を含むVLドメイン)と、第1の軽鎖定常領域と、第1のリンカーと、Tn/sTnに特異的な第1の重鎖可変領域(例えば、配列番号105、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVHドメイン)と、第1の重鎖定常領域とを含む。一部の実施形態では、第2の鎖は、そのN末端から出発して、CD3に特異的に結合する第2の軽鎖可変領域と、第2の軽鎖定常領域と、第2のリンカーと、CD3についての第2の重鎖可変領域と、第2の重鎖定常領域とを含む。
上記の二重特異的な実施形態は多価結合分子を達成するための1つの例示的な組合せであるが、一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体機能的断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディおよびシングルドメイン抗体(sdAB)であってもよいが、これらに限定されず、Tn/sTnおよびCD3の両方ならびに/または任意の他の共阻害性もしくは共刺激性分子に対する特異性を有する抗体結合分子を達成するために多くの様々な構成を組み合わせてもよいことが当業者によって理解される。
また別の態様では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、Tn抗原またはsTn抗原および共阻害性分子または共刺激性分子に結合する。一部の実施形態では、共阻害性分子は、VISTA、CD86、CD80、PDL-1、PDL-2、CTLA-4、PD1、LAG3、BTNL2、B7-H3、B7-H4、ブチロフィリン、CD48、CD244、TIM-3、CD200R、CD200、CD160、BTLA、HVEM、LAIR1、TIM1、ガレクチン9、TIM3、CD48、2B4、CD155、CD112、CD113およびTIGITからなる群から選択される。一部の実施形態では、共刺激性分子は、CD154、TNFRSF25、GITR、4-1BB(TNFRSF9、CD137)、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD28、CD40、TL1A、GITRL、41BBL、OX40L、CD70、HHLA2、ICOSL、サイトカイン、LIGHT、HVEM、CD30、CD30L、B7-H2、CD80、CD86、CD40L、TIM4、TIM1、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、DR3、GITR、CD2およびCD226からなる群から選択される。
そのような二重特異性抗体を生成するための方法は、当該技術分野で周知である(例えば、Tomlinson and Holliger, Methods in Enzymology, 326: 461-479 (2000);Doppalapudi et al., PNAS, 107(52):22611-22616 (2010)およびEP特許第2606064号を参照のこと)。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片を産生する方法を提供する。本明細書で開示される方法は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、本明細書で開示される抗体または機能的断片のコードされる重鎖および/または軽鎖を産生する条件下で、これを産生するために十分な期間、宿主細胞を培養することと、抗体または機能的断片の重鎖および/または軽鎖を精製することとを含み得る。他の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される抗体または機能的断片をコードするポリヌクレオチドを有する組換え細胞を提供する。一部の態様では、抗体またはその機能的断片は、クローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3、3A7および2F3バリアントの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメイン(例えば、表5および6)を有する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片を産生する方法を提供する。本明細書で開示される方法は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、本明細書で開示される抗体または機能的断片のコードされる重鎖および/または軽鎖を産生する条件下で、これを産生するために十分な期間、宿主細胞を培養することと、抗体または機能的断片の重鎖および/または軽鎖を精製することとを含み得る。他の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される抗体または機能的断片をコードするポリヌクレオチドを有する組換え細胞を提供する。一部の態様では、抗体またはその機能的断片は、クローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3、3A7および2F3バリアントの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメイン(例えば、表5および6)を有する。
Tn抗原またはsTn抗原に結合する本明細書で開示される抗体またはその機能的断片の組換え発現は、本明細書で開示される抗体または機能的断片の重鎖および/または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を含み得る。本明細書で開示される抗体またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド(好ましくは重鎖および/または軽鎖可変ドメインを含有するが、必ずしも含有しない)が得られると、抗体または機能的断片の産生のためのベクターは、当該技術分野で周知の技術を使用する組換えDNA技術によって産生することができる。抗体またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製するための方法は、本明細書で説明される。
当業者に周知の方法を使用して、抗体またはその機能的断片をコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術およびin vivo遺伝子組換えを含む。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく(例えば、国際公開WO86/05807およびWO89/01036ならびに米国特許第5,122,464号を参照のこと)、抗体の可変ドメインは、重鎖全体、軽鎖全体または重鎖および軽鎖両方の全体の発現のためにそのようなベクターにクローニングすることができる。
発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞に移行することができ、その後、トランスフェクトした細胞を従来技術によって培養して、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片を産生する。したがって、本発明は、異種のプロモーターに作動可能に連結された、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現のための一部の実施形態では、以下に詳述するように、免疫グロブリン分子全体の発現のために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞において共発現することができる。
様々な宿主-発現ベクター系を利用して、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片を発現することができる(例えば、米国特許第5,807,715号を参照のこと)。そのような宿主-発現系は、目的のコード配列を産生し、次に精製することができる媒体を意味するが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換されたか、またはトランスフェクトされた場合、in situで本明細書にて開示される抗体分子を発現することができる細胞も意味する。これらには、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌(例えば、大腸菌(E.coli)および枯草菌(B. subtilis))、抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母(例えば、Saccharomyces Pichia)等の微生物;抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞系;抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染させたか、または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換した植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、NS0および3T3細胞)が含まれるが、これらに限定されない。一部の態様では、大腸菌等の細菌細胞、または真核細胞は、とりわけ組換え抗体全体の発現のために、組換え抗体または機能的断片の発現のために使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO:Chinese hamster ovary)細胞等の哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルスからの主要な最初期遺伝子プロモーターエレメント等のベクターとともに、抗体の有効な発現系である(Foecking et al., 1986, Gene 45:101;およびCockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2)。一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体またはその断片は、CHO細胞において産生される。一部の実施形態では、Tn抗原またはsTn抗原に結合する本明細書で開示される抗体またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導的プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって調節される。
細菌系では、発現される抗体分子について意図される使用によって、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物の生成のために、大量のそのような抗体が産生されるべき場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターは望ましい場合がある。そのようなベクターには、融合タンパク質が産生されるように抗体コード配列がlacZコード領域とインフレームでベクターに個々にライゲートされ得る大腸菌発現ベクターpUR278(Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791);pINベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109;Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509)等が含まれるが、これらに限定されない。pGEXベクターを使用して、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(glutathione 5-transferase)(GST:glutathione S-transferase)を伴う融合タンパク質として外来性ポリペプチドを発現することができる。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、その後の遊離グルタチオンの存在下での溶離によって溶解した細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から放出され得るように、トロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
昆虫系では、キンウワバ科(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV:Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)は、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。ウイルスは、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞内で増殖する。抗体または機能的断片コード配列は、ウイルスの非本質的領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)に個々にクローニングされ、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置かれ得る。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベース発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三要素リーダー配列にライゲートされ得る。その後、このキメラ遺伝子は、in vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非本質的領域(例えば、領域E1またはE3)内への挿入は、感染した宿主において生存可能、かつ抗体分子を発現することができる組換えウイルスをもたらす(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359を参照のこと)。また、特定の開始シグナルは、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために使用することができる。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同位相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源のものであってもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含めることによって向上させることができる(例えば、Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照のこと)。
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質産物のそのような改変(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は、抗体または機能的断片の機能に重要であり得る。様々な宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的かつ特異的機構を有する。適切な細胞株または宿主系を選択して、発現する外来性タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にすることができる。この目的のために、主要な転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞には、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2OおよびT47D、NS0(任意の免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株)、CRL7O3OならびにHsS78Bst細胞が含まれるが、これらに限定されない。
組換えタンパク質の長期高収率産生のために、安定な発現は好ましい。例えば、本明細書で開示される抗体または機能的断片を安定に発現する細胞株を操作設計してもよい。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等)および選択可能マーカーによって制御されるDNAで宿主細胞を形質転換してもよい。外来DNAの導入後、操作設計した細胞を富化培地で1~2日間増殖させてもよく、その後、選択培地に変える。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する抵抗性を与え、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に統合し、増殖して増殖巣を形成することを可能にし、次に、増殖巣はクローニングされ、細胞株に拡張され得る。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作設計するために有利に使用することができる。
非限定的に、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17)遺伝子を含む、いくつかの選択系を使用してもよく、それぞれ、tk-細胞、hgprt-細胞またはaprt-細胞において使用することができる。また、以下の遺伝子:メトトレキセートに対する抵抗性を与えるdhfr(Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 77(6):3567-70;O’Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527);グルタメートおよびアンモニアを使用するグルタミンの生合成の原因である酵素であるグルタミン合成酵素(GS:glutamine synthetase)(Bebbington et al., 1992, Biuotechnology 10:169);ミコフェノール酸に対する抵抗性を与えるgpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072);アミノグリコシドG-418に対する抵抗性を与えるneo(Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95;Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596;Mulligan, 1993, Science 260:926-932;およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217;May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215);およびハイグロマイシンに対する抵抗性を与えるhygro(Santerre et al., 1984, Gene 30:147)についての選択の基礎として代謝拮抗薬抵抗性を使用することができる。組換えDNA技術の当該技術分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するためにルーチンに適用することができ、そのような方法は、例えば、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993);Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);およびChapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994);Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1で説明されており、当該文献はそれらの全体を参照により本明細書に組み込む。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大することができる(概略については、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)を参照のこと)。抗体またはその機能的断片を発現するベクター系のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤レベルを増大させると、マーカー遺伝子のコピー数が増大する。増幅した領域は抗体遺伝子を伴うので、抗体の産生もまた増大する(Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257)。
本明細書で開示される2つの発現ベクターで宿主細胞をコトランスフェクトしてもよく、第1のベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードし、第2のベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードする。2つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能マーカーを含有し得る。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、かつこれらの両方を発現することができる単一のベクターを使用してもよい。そのような状況では、過剰な毒性のない重鎖を避けるために、軽鎖を重鎖の前に入れてもよい(Proudfoot, 1986, Nature 322:52;およびKohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-2199)。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含み得る。
加えて、本明細書で開示される抗体または機能的断片の重鎖および/または軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞における本明細書で開示される抗体または機能的断片の最適化発現を達成するために、当該技術分野で周知の技術を使用するコドン最適化に供してもよい。例えば、コドン最適化の1つの方法において、ネイティブコドンは、参照の組の遺伝子からの最も頻繁なコドンよって置換され、ここでは、各アミノ酸についてのコドン翻訳速度が高くなるように設計される。本明細書で開示される抗体または機能的断片の重鎖および/または軽鎖に適用することができる、所望のタンパク質の発現のためのコドン最適化ポリヌクレオチドを生成するための追加の例示的な方法は、Kanaya et al., Gene, 238:143-155 (1999);Wang et al., Mol. Biol. Evol., 18(5):792-800 (2001);米国特許第5,795,737号、米国特許出願公開第2008/0076161号およびWO2008/000632で説明されている。
本明細書で開示される抗体分子を組換え発現によって産生すると、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、特にタンパク質Aの後の特異的抗原に対する親和性によるクロマトグラフィー、およびサイズ分類カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解性の差異によって、またはタンパク質精製のための他の任意の標準技術によってそれを精製することができる。さらに、本発明の抗体または機能的断片は、精製を促進するために、本明細書で提供されるか、または別に当該技術分野で公知の異種のポリペプチド配列に融合してもよい。例えば、本明細書で開示される抗体または機能的断片は、数ある中で、市販されているポリヒスチジンタグ(Hisタグ)、FLAGタグ、ヘマグルチニンタグ(HAタグ)またはmycタグを組換え付加し、当業者に周知の精製方法を利用することを通して精製することができる。
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体機能的断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディまたはシングルドメイン抗体(sdAB)であり得るが、これらに限定されない。抗体およびその機能的断片について、様々な形態、変更および改変が当該技術分野で周知である。本明細書で開示されるTn抗原またはsTn抗原特異的抗体断片は、そのような様々な抗体形態、変更および改変のいずれかを含み得る。そのような様々な形態および用語の例は、それらが当該技術分野で公知である通り、以下に示される。
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体機能的断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディまたはシングルドメイン抗体(sdAB)であり得るが、これらに限定されない。抗体およびその機能的断片について、様々な形態、変更および改変が当該技術分野で周知である。本明細書で開示されるTn抗原またはsTn抗原特異的抗体断片は、そのような様々な抗体形態、変更および改変のいずれかを含み得る。そのような様々な形態および用語の例は、それらが当該技術分野で公知である通り、以下に示される。
Fab断片は、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価の断片を指し;F(ab’)2断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された2つのFab断片を含む二価の断片であり;Fd断片は、VHおよびCH1ドメインからなり;Fv断片は、抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなり;dAb断片(Ward et al., Nature 341:544-546, (1989))は、VHドメインからなる。
抗体は、1つまたは複数の結合部位を有し得る。2つ以上の結合部位が存在する場合、結合部位は、互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。例えば、天然免疫グロブリンは2つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはFab断片は1つの結合部位を有し、一方で、「二重特異性」または「二機能性」抗体は2つの異なる結合部位を有する。
単鎖抗体(scFv)とは、VLおよびVH領域がリンカー(例えば、アミノ酸残基の合成配列)を介して接合されて、連続するポリペプチド鎖を形成する抗体を指し、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体で折り返し、一価の抗原結合部位を形成することを可能にするために十分に長い(例えば、Bird et al., Science 242:423-26 (1988)およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)を参照のこと)。ディアボディとは、2つのポリペプチド鎖を含む二価抗体を指し、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるので各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対形成することを可能にするリンカーによって接合される、VHおよびVLドメインを含む(例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)、およびPoljak et al., Structure 2:1121-23 (1994)を参照のこと)。ディアボディの2つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成から生ずるディアボディは、2つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、2つの異なる抗原結合部位を有するディアボディを製造するために使用することができる。同様に、トリアボディおよびテトラボディは、それぞれ、同じであってもよく、異なっていてもよい3つおよび4つのポリペプチド鎖を含み、かつそれぞれ、同じであってもよく、異なっていてもよい3つおよび4つの抗原結合部位を形成する抗体である。
抗体は、1つまたは複数の結合部位を有し得る。2つ以上の結合部位が存在する場合、結合部位は、互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。例えば、天然免疫グロブリンは2つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはFab断片は1つの結合部位を有し、一方で、「二重特異性」または「二機能性」抗体は2つの異なる結合部位を有する。
単鎖抗体(scFv)とは、VLおよびVH領域がリンカー(例えば、アミノ酸残基の合成配列)を介して接合されて、連続するポリペプチド鎖を形成する抗体を指し、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体で折り返し、一価の抗原結合部位を形成することを可能にするために十分に長い(例えば、Bird et al., Science 242:423-26 (1988)およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)を参照のこと)。ディアボディとは、2つのポリペプチド鎖を含む二価抗体を指し、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるので各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対形成することを可能にするリンカーによって接合される、VHおよびVLドメインを含む(例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)、およびPoljak et al., Structure 2:1121-23 (1994)を参照のこと)。ディアボディの2つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成から生ずるディアボディは、2つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、2つの異なる抗原結合部位を有するディアボディを製造するために使用することができる。同様に、トリアボディおよびテトラボディは、それぞれ、同じであってもよく、異なっていてもよい3つおよび4つのポリペプチド鎖を含み、かつそれぞれ、同じであってもよく、異なっていてもよい3つおよび4つの抗原結合部位を形成する抗体である。
本発明は、本明細書で開示される1A4、2F3、3A7または2F3バリアントの抗体またはその機能的断片誘導体であって、Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体または機能的断片も提供する。例えば、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発を含む、当業者に周知の標準技術を使用して、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列において変異を導入することができる。一部の態様では、誘導体は、元の分子と比較して25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換または2個未満のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、本発明は、抗体または機能的断片が本明細書で定義される機能活性を保持する限り、天然アミノ酸の改変形態、保存的置換、非天然アミノ酸、アミノ酸アナログおよびミメティクスを有するそのような抗体またはその機能的断片を提供する。一実施形態では、誘導体は、1つまたは複数の予想される非必須アミノ酸残基で行われる保存的アミノ酸置換を有する。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似する電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているアミノ酸置換である。類似する電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ-分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。あるいは、変異は、例えば飽和変異誘発によって、コード配列の全てまたは部分に沿ってランダムに導入してもよく、得られる変異体は、活性を保持する変異体を特定するために生理活性についてスクリーニングしてもよい。変異誘発後、コードされる抗体またはその機能的断片を発現させてもよく、抗体または機能的断片の活性を決定してもよい。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される抗体または機能的断片内に含有されるFc断片のフコシル化、ガラクトシル化および/またはシアル酸付加が改変されている抗体またはその機能的断片を提供する。Fc断片のそのような改変は、Peipp et al., Blood, 112(6):2390-2399 (2008)で説明されているように、Fc受容体媒介活性に影響を及ぼし得る。例えば、Fc N-グリカンからの核フコース残基を欠く糖について操作設計した治療用抗体は、フコシル化相対物と比較して、より低濃度でもっと高い有効性を有する強いADCCを示す。Shields et al., J. Biol. Chem., 277(30):26733-40 (2002);Okazaki et al., J Mol Biol., 336:1239-1249 (2004);Natsume et al., J. Immunol. Methods., 306:93-103 (2005)。抗体の機能的断片のための抗体のフコシル化、ガラクトシル化および/またはシアル酸付加を改変するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、脱フコシル化手法は、Yamane-Ohnuki et al., MAbs., 1(3):230-236 (2009)で説明されているように、3つの方法:(1)非哺乳動物細胞のN-グリコシル化経路の「ヒト化」非フコシル化経路への変換、(2)哺乳動物細胞のN-グリカンフコシル化経路の不活性化、および(3)非フコシル化N-糖タンパク質のin vitro化学合成またはN-グリカンの非フコシル化形態への酵素的改変に分類することができる。これらの方法の任意の1つまたは当該技術分野で周知の他の任意の方法は、フコシル化、ガラクトシル化および/またはシアル酸付加が改変されている抗体またはその機能的断片を産生するために使用することができることが理解される。
Tn抗原またはsTn抗原に結合する本明細書で開示される抗体またはその機能的断片は、抗体合成についての当該技術分野で公知の任意の方法によって、特に、化学合成によって、または組換え発現技術によって産生することができる。本明細書で開示される実施は、別に示されない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組換えDNA、有機化学、生化学、PCR、オリゴヌクレオチド合成および改変、核酸ハイブリダイゼーションならびに当該技術分野の技術の範囲内の関連分野の従来技術を使用する。これらの技術は、本明細書で引用される参考文献で説明されており、文献で完全に説明されている。例えば、Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press;Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press;Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates);Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press;Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press;Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press;Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Edition, Oxford University Press;Lo (ed.) (2006) Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology); Vol. 248, Humana Press, Incを参照されたく、当該参考文献の各々は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマおよび組換え技術またはそれらの組合せの使用を含む当該技術分野で公知の多種多様な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の、例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988);Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)で教示されている技術を含むハイブリドーマ技術を使用して産生することができ、当該参考文献の各々は、その全体を参照により本明細書に組み込む。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を通して産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体を産生する他の例示的な方法は、当該技術分野で公知である。モノクローナル抗体を産生する追加の例示的な方法は、本明細書で提供される実施例で提供される。
Tn抗原またはsTn抗原に結合する抗体機能的断片は、当業者に周知の任意の技術によって生成することができる。例えば、本明細書で開示されるFabおよびF(ab’)2断片は、パパイン(Fab断片を産生する)またはペプシン(F(ab’)2断片を産生する)等の酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質溶解切断によって産生することができる。F(ab’)2断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のCH1ドメインを含有する。
本明細書で開示される抗体機能的断片は、当該技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成することもできる。例えば、ファージディスプレイ法では、本明細書で提供される1、2、3、4、5または6つのCDRを有する重鎖および/または軽鎖可変領域等の機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示される。VHおよびVLドメインをコードするDNAは、PCRによってscFvリンカーを伴って組み換えられ、ファージミドベクターにクローニングされる。ベクターを大腸菌にエレクトロポレーションし、大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用されるファージは典型的に、fdおよびM13を含む繊維状ファージであり、VHおよびVLドメインは通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのいずれかに組換え融合される。Tn抗原またはsTn抗原等の特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識化抗原、または固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を使用して、抗原で選択または特定することができる。本発明の抗体機能的断片を製造するために使用することができるファージディスプレイ法の例には、Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50;Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186;Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958;Persic et al., 1997, Gene 187:9-18;Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280;PCT出願PCT/GB91/01134;国際公開WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO/93/11236、WO95/15982、WO95/20401およびWO97/13844;ならびに米国特許第5,698,426号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,580,717号、同第5,427,908号、同第5,750,753号、同第5,821,047号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,516,637号、同第5,780,225号、同第5,658,727号、同第5,733,743号および同第5,969,108号が含まれ、当該参考文献の各々は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
上記の参考文献において説明されるように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、ヒト抗体を含む抗体全体または他の任意の所望の抗原結合断片を生成するために使用し、例えば、本明細書で説明されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主で発現することができる。
PCT公開WO92/22324;Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869;Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34;およびBetter et al., 1988, Science 240:1041-1043で開示される方法等の当該技術分野で公知の方法を使用して、Fab、Fab’およびF(ab’)2断片を組換え産生するための技術を使用することもでき、当該参考文献の各々は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
抗体全体を生成するために、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限酵素部位および制限酵素部位を保護するための隣接する配列を含むPCRプライマーを使用して、scFvクローンにおいてVHまたはVL配列を増幅してもよい。当業者に周知のクローニング技術を利用して、PCR増幅したVHドメインをVH定常領域、例えばヒトガンマ1定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、PCR増幅したVLドメインをVL定常領域、例えばヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。VHおよびVLドメインは、必要な定常領域を発現する1つのベクターにクローニングすることもできる。その後、当業者に周知の技術を使用して、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株にコトランスフェクトして、全長抗体、例えばIgGを発現する安定な、または一過性の細胞株を生成する。
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体または機能的断片は、1つまたは複数の局在化剤、検出可能剤もしくは治療剤または他の任意の所望の分子にコンジュゲート(共有または非共有コンジュゲーション)または組換え融合される。コンジュゲートまたは組換え融合された抗体または機能的断片は、特定の治療の有効性を決定すること等の臨床試験手技の部分として、がんまたは腫瘍形成等の、Tn抗原またはsTn抗原の発現と関連付けられる疾患の開始、発症、進行および/または重症度をモニターまたは診断するために有用であり得る。
一部の態様では、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片は、局在化剤とコンジュゲートされる。抗体は局在化剤(例えば、置換されるアルケン)を付加することができ、その後、それは検出可能剤(例えば、陽電子放出放射性核種またはガンマ線放出放射性核種)または治療剤(例えば、アルファ線放出またはベータ線放出放射性核種)を付加した好適な基質(例えば、アジド、テトラジンまたはテトラゾール)と「クリック」様式(形式的環化付加)で選択的に反応して、その後、抗体に検出可能剤または治療剤を結合することができることが、当該技術分野で周知である。クリック化学反応を使用するそのようなターゲティング療法の例は、例えば、Houghton et. al., Mol Cancer Ther 16(1):124 (2017)、米国特許第8,398,956号および同第8,992,931号で開示されている。
したがって、一部の実施形態では、局在化剤は、好適な基質による形式的環化付加を受けることができるアルケンまたはアルキンである。一部の態様では、アルケンまたはアルキンは、歪みのあるアルケンまたは歪みのあるアルキンである。一部の態様では、歪みのあるアルケンは、シクロアルカンである。一部の態様では、シクロアルカンは、トランス-シクロアルケンである。一部の態様では、トランス-シクロアルケンは、シクロペンテン、シクロヘキセン、トランス-シクロヘプタン、トランス-シクロオクテンまたはオキサノルボルナジエンである。一部の態様では、好適な基質は、アジド、テトラジンまたはテトラゾールである。またさらなる態様では、形式的環化付加は、クリック反応であり、それは、レトロ形式的環化付加によって追従され得る。
一部の態様では、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片は、検出可能剤とコンジュゲートされる。検出および診断は、例えば、本明細書で開示される抗体または機能的断片を、陽電子放出放射性核種またはガンマ線放出放射性核種(例えば、78Br、14C、11C、57Co、64Cu、51Cr、18F、68Ga、67Ga、68Ge、153Gd、159Gd、3H、166Ho、131I、125I、124I、123I、121I、115In、113In、112In、111In、140La、177Lu、54Mn、99Mo、13N、15O、32P、103Pd、142Pr、149Pm、186Re、188Re、82Rb、105Rh、97Ru、35S、47Sc、75Se、153Sm、113Sn、117Sn、85Sr、94mTc、99Tc、201Ti、133Xe、86Y、90Y、169Yb、175Yb、65Znまたは89Zr)等の放射性物質;検出可能な反応を触媒する酵素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ);補欠分子族(例えば、ストレプトアビジン/ビオチンまたはアビジン/ビオチン);蛍光物質(例えば、インドシアニングリーン(ICG:indocyanine green)、IRDye蛍光色素(例えば、IRDye800)、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(isothiocynate)、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン);発光物質(例えば、ルミノール);生物発光物質(例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリンまたはエクオリン);および非放射性常磁性金属イオンを含む検出可能な物質とカップリングすることによって達成することができる。
本発明は、1つまたは複数の治療剤にコンジュゲート(共有または非共有コンジュゲーション)または組換え融合された本明細書で開示される抗体または機能的断片の治療的使用をさらに包含する。これに関連して、例えば、抗体は、細胞毒素(例えば、細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤)等の治療剤にコンジュゲートまたは組換え融合され得る。細胞毒素または細胞傷害剤には、細胞に有害な任意の剤が含まれる。細胞毒素は、アルファ線放出放射性核種(例えば、211At、212Bi、213Bi、225Ac、223Ra、212Pb、227Thおよび149Tb)またはベータ線放出放射性核種(例えば、90Y、131I、109Pd、131Luおよび177Lu)等の放射性核種であり得る。細胞毒素は、非限定的に、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシンおよびダウノルビシン(以前のダウノマイシン));タキサン(例えば、パクリタキセル(Taxol)およびドセタキセル(Taxotere));代謝拮抗薬(例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルおよびダカルバジン);アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパ(thioepa)、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、シスジクロロジアンミン白金(II)(DDP:cisdichlorodiamine platinum(II)));抗生物質(例えば、アクチノマイシンD、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(AMC:anthramycin));オーリスタチン分子(例えば、オーリスタチンPHE、ブリオスタチン1、ソラスタチン10、モノメチルオーリスタチンE(MMAE:monomethyl auristatin E)およびモノメチルオーリスタチンF(MMAF:monomethylauristatin F));ホルモン(例えば、グルココルチコイド、プロゲスチン、アンドロゲンおよびエストロゲン);ヌクレオシドアナログ(例えば、ゲムシタビン)、DNA修復酵素阻害剤(例えば、エトポシドおよびトポテカン)、キナーゼ阻害剤(例えば、化合物ST1571、Gleevecまたはイマチニブメシレートとしても公知);細胞傷害剤(例えば、マイタンシン、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン(colchicin)、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン(dihydroxy anthracin dione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド(glucorticoid)、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびそれらのアナログもしくはホモログ、ならびに米国特許第6,245,759号、同第6,399,633号、同第6,383,790号、同第6,335,156号、同第6,271,242号、同第6,242,196号、同第6,218,410号、同第6,218,372号、同第6,057,300号、同第6,034,053号、同第5,985,877号、同第5,958,769号、同第5,925,376号、同第5,922,844号、同第5,911,995号、同第5,872,223号、同第5,863,904号、同第5,840,745号、同第5,728,868号、同第5,648,239号、同第5,587,459号で開示される化合物);ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(例えば、R115777、BMS-214662、および例えば、米国特許第6,458,935号、同第6,451,812号、同第6,440,974号、同第6,436,960号、同第6,432,959号、同第6,420,387号、同第6,414,145号、同第6,410,541号、同第6,410,539号、同第6,403,581号、同第6,399,615号、同第6,387,905号、同第6,372,747号、同第6,369,034号、同第6,362,188号、同第6,342,765号、同第6,342,487号、同第6,300,501号、同第6,268,363号、同第6,265,422号、同第6,248,756号、同第6,239,140号、同第6,232,338号、同第6,228,865号、同第6,228,856号、同第6,225,322号、同第6,218,406号、同第6,211,193号、同第6,187,786号、同第6,169,096号、同第6,159,984号、同第6,143,766号、同第6,133,303号、同第6,127,366号、同第6,124,465号、同第6,124,295号、同第6,103,723号、同第6,093,737号、同第6,090,948号、同第6,080,870号、同第6,077,853号、同第6,071,935号、同第6,066,738号、同第6,063,930号、同第6,054,466号、同第6,051,582号、同第6,051,574号および同第6,040,305号によって開示されるもの);トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、カンプトテシン、イリノテカン、SN-38、トポテカン、9-アミノカンプトテシン、GG-211(GI147211)、DX-8951f、IST-622、ルビテカン、ピラゾロアクリジン、XR-5000、サントピン(saintopin)、UCE6、UCE1022、TAN-1518A、TAN1518B、KT6006、KT6528、ED-110、NB-506、ED-110、NB-506、ファガロニン、コラリン(coralyne)、ベータ-ラパコンおよびレベッカマイシン);DNA副溝結合剤(DNAマイナーグローブバインダー)(例えば、ピロロベンゾジアゼピン、Hoescht色素33342およびHoescht色素33258);アデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビンフォスフェートおよび2-クロロデオキシアデノシン);微小管攪乱剤(disrupter)(例えば、メイタンシノイド);またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、包接体もしくはプロドラッグ等の化学療法剤であり得る。本明細書で説明される細胞傷害剤は、細胞内への進入に際して酵素的に切断されてその細胞傷害活性を媒介するリンカーを含む、当該技術分野で周知の化学リンカーと結合され得る。
さらに、本明細書で開示される抗体または機能的断片は、所与の生物学的応答を改変する剤である治療剤にコンジュゲート(共有または非共有コンジュゲーション)または組換え融合され得る。したがって、治療剤は、古典的な化学療法剤に限定されるとは解釈されるべきでない。例えば、治療剤は、所望の生理活性を有するタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質には、例えば、毒素(例えば、α-アマニチン、アブリン、リシンA、緑膿菌(pseudomonas)外毒素、コレラ毒素およびジフテリア毒素);腫瘍壊死因子、γ-インターフェロン、α-インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス剤(例えば、TNF-γ、AIM I、AIM II、FasリガンドおよびVEGF)、抗血管新生剤(例えば、アンギオスタチン、エンドスタチン、および組織因子等の凝固経路の成分)等のタンパク質;生物学的応答改変剤(例えば、インターフェロンガンマ、インターロイキン-1、インターロイキン-2、インターロイキン-5、インターロイキン-6、インターロイキン-7、インターロイキン-9、インターロイキン-10、インターロイキン-12、インターロイキン-15、インターロイキン-23、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子および顆粒球コロニー刺激因子等のサイトカイン);増殖因子(例えば、成長ホルモン)、凝固剤(例えば、カルシウム、ビタミンK、非限定的にハーゲマン因子(第XII因子)等の組織因子、高分子量キニノーゲン(HMWK:high-molecular-weight kininogen)、プレカリクレイン(PK:prekallikrein)、凝固タンパク質因子II(プロトロンビン)、第V因子、第XIIa因子、第VIII因子、第XIIIa因子、第XI因子、第XIa因子、第IX因子、第IXa因子、第X因子、リン脂質およびフィブリンモノマー)、またはT細胞によって発現され、CAR T細胞療法で使用され得るキメラ抗原受容体(CAR:chimeric antigen receptor)(例えば、Posey et al., Immunity, 44(6):1444-1451 (2016)を参照のこと)が含まれ得る。
本発明は、コンジュゲートを生成するために異種のタンパク質またはポリペプチドに組換え融合または化学コンジュゲート(共有または非共有コンジュゲーション)された本明細書で開示される抗体または機能的断片を包含する。一部の態様では、そのようなポリペプチドは、長さが約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90または約100個のアミノ酸であり得る。一部の態様では、本発明は、本明細書で開示される抗体の機能的断片(例えば、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、VHドメイン、VH CDR、VLドメインまたはVL CDR)と異種のタンパク質またはポリペプチドとを有するコンジュゲートを提供する。一実施形態では、抗体または機能的断片が融合された異種のタンパク質またはポリペプチドは、抗体または機能的断片を、Tn抗原またはsTn抗原を発現する細胞等の特定の細胞種にターゲティングするために有用である。
本明細書で開示されるコンジュゲートされたものは、局在化剤、検出可能剤または治療剤にコンジュゲート(共有または非共有コンジュゲーション)または組換え融合された本明細書で開示される任意の抗体または機能的断片を含む。一実施形態では、本明細書で開示されるコンジュゲートされたものは、本明細書で説明されるクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3、3A7または2F3バリアントのCDR、VHおよび/またはVLドメインを有する抗体またはその機能的断片と、局在化剤、検出可能剤または治療剤とを含む。
一部の実施形態では、本発明のコンジュゲートされたものは、表2~4で示されるVH CDRの任意の1つのアミノ酸配列を有する1つまたは複数のVH CDRと、局在化剤、検出可能剤または治療剤とを含む。別の実施形態では、コンジュゲートされたものは、表2~4または図1~7で示されるVL CDRの任意の1つのアミノ酸配列を有する1つまたは複数のVL CDRと、局在化剤、検出可能剤または治療剤とを含む。
一部の他の態様では、本明細書で開示されるコンジュゲートされたものは、表5もしくは6または図1もしくは3~7で示されるアミノ酸配列を有するVHドメインと、局在化剤、検出可能剤または治療剤とを含む。
一部の他の態様では、本明細書で開示されるコンジュゲートされたものは、表5もしくは6または図1もしくは3~7で示されるアミノ酸配列を有するVHドメインと、局在化剤、検出可能剤または治療剤とを含む。
一部の他の態様では、本明細書で開示されるコンジュゲートされたものは、表5または図2で示されるアミノ酸配列を有するVLドメインと、局在化剤、検出可能剤または治療剤とを含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるコンジュゲートされたものは、VHドメインおよびVLドメインと、局在化剤、検出可能剤または治療剤とを含み、VHドメインは、表5もしくは6または図1もしくは3~7および配列番号40で示されるアミノ酸配列を有し、VLドメインは、表5または図2で示されるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるコンジュゲートされたものは、VHドメインおよびVLドメインと、局在化剤、検出可能剤または治療剤とを含み、VHドメインは、表5もしくは6または図1もしくは3~7および配列番号40で示されるアミノ酸配列を有し、VLドメインは、表5または図2で示されるアミノ酸配列を有する。
局在化剤、検出可能剤または治療剤(ポリペプチドを含む)を抗体に融合またはコンジュゲートするための方法は周知であり、例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985);Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987);Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985);“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985);Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58;米国特許第5,336,603号、同第5,622,929号、同第5,359,046号、同第5,349,053号、同第5,447,851号、同第5,723,125号、同第5,783,181号、同第5,908,626号、同第5,844,095号、同第5,112,946号、同第7,981,695号、同第8,039,273号、同第8,142,784号;米国特許出願公開第2009/0202536号、同第2010/0034837号、同第2011/0137017号、同第2011/0280891号、同第2012/0003247号;EP307,434;EP367,166;EP394,827;PCT公開WO91/06570、WO96/04388、WO96/22024、WO97/34631およびWO99/04813;Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991;Traunecker et al., Nature, 331:84-86, 1988;Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995;Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992;ならびにSenter, Current Opinion in Chemical Biology, 13:235-244 (2009)を参照されたく、当該参考文献は、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。
別の態様では、局在化剤、検出可能剤または治療剤は、ジスルフィド結合形成を介して還元された抗体成分のヒンジ領域で結合することができる。あるいは、そのような剤は、N-スクシニル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)等のヘテロ二機能性架橋結合剤を使用して抗体成分に結合することができる。Yu et al., Int. J. Cancer 56: 244 (1994)。そのようなコンジュゲーションのための一般的な技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991);Upeslacis et al., “Modification of Antibodies by Chemical Methods,” in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995);Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,” in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)を参照されたい。
あるいは、局在化剤、検出可能剤または治療剤は、抗体のFc領域の炭水化物部分を介してコンジュゲートすることができる。抗体炭水化物部分を介して抗体成分にペプチドをコンジュゲートするための方法は、当業者に周知である。例えば、Shih et al., Int. J. Cancer. 41:832-839 (1988);Shih et al., Int. J. Cancer. 46:1101-1106 (1990);およびShihらの米国特許第5,057,313号を参照されたく、当該文献の全ては、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。一般的な方法は、酸化炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも1つの遊離アミン官能基を有し、かつ複数のペプチドをロードした担体ポリマーと反応させることを含む。この反応は開始シッフ塩基(イミン)結合をもたらし、これは第2アミンへの還元によって安定化されて最終的なコンジュゲートを形成することができる。
しかしながら、Fc領域が非存在である場合、例えば、本明細書で提供される抗体機能的断片が望ましい場合、局在化剤、検出可能剤または治療剤を結合することはそれでも可能である。炭水化物部分は、全長抗体または抗体断片の軽鎖可変領域に導入され得る。例えば、Leung et al., J. Immunol., 154: 5919 (1995);米国特許第5,443,953号および同第6,254,868号を参照されたく、当該参考文献の全ては、それらの全体を参照により組み込む。操作設計された炭水化物部分は、局在化剤、検出可能剤または治療剤を結合するために使用される。
Tn抗原またはsTn抗原に結合する本明細書で開示される抗体または機能的断片にコンジュゲートまたは組換え融合された治療剤は、所望の予防効果または治療効果を達成するように選択され得る。どの治療剤を本明細書で開示される抗体または機能的断片にコンジュゲートまたは組換え融合するかを決定する場合、以下のこと:疾患の性質、疾患の重症度および患者の状態を考慮することは臨床医または他の医療関係者の技術レベルの範囲内であることが理解される。
本明細書で提供されるように検出可能に標識化され、かつTn抗原またはsTn抗原に結合する本明細書で開示されるコンジュゲートは、疾患を引き起こすか、または疾患と関連付けられる細胞がTn抗原またはsTn抗原を発現する疾患を検出、診断またはモニターする診断目的のために使用することができる。本明細書で提供されるように治療剤とコンジュゲートまたは融合され、かつTn抗原またはsTn抗原に結合する本明細書で開示されるコンジュゲートは、疾患を引き起こすか、または疾患と関連付けられる細胞がTn抗原またはsTn抗原を発現する疾患を処置または予防するために使用することができる。例えば、本明細書で提供されるように、非限定的に乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、子宮内膜がんおよび膵がん等の、がん細胞および腫瘍は、Tn抗原またはsTn抗原を発現することが示されている。Tn抗原またはsTnを発現することが示されている特定の種類の乳がんは、トリプルネガティブ乳がんである。
本発明は、1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する抗体またはその機能的断片をさらに含む。1つまたは複数のセリン残基上のTnまたはsTnへのこの優先的または特異的結合は、例えば、正常免疫細胞等の非標的細胞に対して、がん等の標的細胞を区別することを促進し得る。加えて、1つまたは複数のセリン残基上のTnまたはsTnへの優先性または特異性を有する本明細書で提供される抗体は、例えば、IgMアイソタイプと比較して区別できる特徴を有する、IgG1アイソタイプを含むIgGアイソタイプである。それゆえ、一部の実施形態では、本発明は、1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する抗体またはその機能的断片を使用して、例えば、標的対非標的選択性を提供することを促進し得る。ある特定の実施形態では、本発明は、トレオニン結合TnまたはsTnと比較してセリン結合TnまたはsTnをターゲティングすることを通して、Tn抗原を発現するがん細胞を特異的にターゲティングする方法を提供する。
したがって、本発明は、有効量の本明細書で開示される抗体、その機能的断片またはコンジュゲートをそれを必要とする対象に投与することによって、対象においてがんまたは腫瘍形成を検出するための方法を提供する。一部の態様では、検出法は、Tn抗原またはsTn抗原に結合する本明細書で開示される1つまたは複数のコンジュゲートまたは融合抗体もしくは機能的断片を使用し;かつTn抗原またはsTn抗原のレベルを対照レベル、例えば、正常組織試料(例えば、疾患を有しない対象からの試料、または疾患開始前の同じ対象からの試料)中のレベルと比較して、対象の細胞または組織試料上のTn抗原またはsTn抗原の発現をアッセイすることをさらに含んでもよく、それによって、Tn抗原またはsTn抗原の対照レベルと比較したTn抗原またはsTn抗原のアッセイしたレベルの増大が、疾患を示す。そのような診断法は、医療従事者が予防的手段または積極的処置を使用することをそのような診断法を使用しない場合に可能であるよりも早く可能にし、それによって、疾患の発症またはさらなる進行を予防することができる。
また、本明細書で開示される抗体または機能的断片は、本明細書で提供されるか、または当業者に周知の古典的な免疫組織学的方法を使用して、生物学的試料中のTn抗原またはsTn抗原レベルをアッセイするために使用することができる(例えば、Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985;およびJalkanen et al., 1987, J. Cell . Biol. 105:3087-3096を参照のこと)。Tn抗原またはsTn抗原を検出するために有用な他の抗体ベース方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA:enzyme linked immunosorbent assay)および放射免疫アッセイ(RIA:radioimmunoassay)等の免疫アッセイを含む。好適な抗体アッセイ標識は当該技術分野で公知であり、グルコースオキシダーゼ等の酵素標識;ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(121In)およびテクネチウム(99Tc)等の放射性同位体;ルミノール等の発光標識;およびフルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識;ならびにビオチンを含む。
一態様では、本発明は、ヒトにおける疾患の検出および診断を提供する。一実施形態では、診断は、a)Tn抗原またはsTn抗原に結合する有効量の本明細書で開示されるコンジュゲートまたは融合タンパク質を対象に(例えば、非経口で、皮下に、または腹腔内に)投与することと、b)コンジュゲートまたは融合タンパク質が対象におけるTn抗原またはsTn抗原が発現される部位で優先的に濃縮すること(および一部の態様では、非結合コンジュゲートまたは融合タンパク質がバックグラウンドレベルまで除去されること)を可能にするために投与後のある時間間隔の間待つことと、c)バックグラウンドレベルを決定することと、d)バックグラウンドレベルを超えるコンジュゲートまたは融合タンパク質の検出が、対象が疾患を有することを示すように、対象においてコンジュゲートまたは融合タンパク質を検出することとを含む。バックグラウンドレベルは、検出されるコンジュゲートまたは融合タンパク質の量を、特定の系について以前に決定された標準値と比較することを含む、様々な方法によって決定することができる。
対象のサイズおよび使用される画像化系は、診断画像を産生するために必要とされる画像化部分の量を決定し、当業者によって容易に決定され得ることが理解される。例えば、本明細書で開示される抗体または機能的断片にコンジュゲートされた放射性同位体の場合、ヒト対象について、注射される放射活性の量は通常、約5~20ミリキュリーの99Tcの範囲である。その後、コンジュゲートは、Tn抗原またはsTn抗原を発現する細胞の場所で優先的に蓄積する。in vivo腫瘍画像化は、S.W. Burchiel et al., “Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.” (Chapter 13, Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)で説明されている。
使用される検出可能剤の種類および投与様式を含む、いくつかの変数に依存して、コンジュゲートが対象における部位で優先的に濃縮することおよび非結合コンジュゲートがバックグラウンドレベルまで除去されることを可能にするための投与後の時間間隔は、6~48時間または6~24時間または6~12時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は、5~20日間または5~10日間である。一実施形態では、疾患のモニタリングは、本明細書で提供される診断のための方法を、例えば最初の診断の1カ月後、最初の診断の6カ月後、最初の診断の1年後またはそれよりも長い期間後に繰り返すことによって行われる。
コンジュゲートまたは融合タンパク質の存在は、in vivoスキャニングのための当該技術分野で公知の方法を使用して対象において検出することができる。これらの方法は、使用される検出可能剤の種類に依存する。当業者は、特定の検出可能剤を検出するための適切な方法を決定することができる。本明細書で開示される診断方法において使用され得る方法およびデバイスには、コンピュータ断層撮影法(CT:computed tomography)、陽電子放出断層撮影法(PET:position emission tomography)等の全身スキャン、磁気共鳴画像法(MRI:magnetic resonance imaging)および超音波検査法が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書で開示される抗体または機能的断片は、放射性同位体にコンジュゲートされ、放射感応性外科器具を使用して対象において検出される。別の実施形態では、本明細書で開示される抗体または機能的断片は、蛍光化合物にコンジュゲートされ、蛍光感応性スキャニング器具を使用して対象において検出される。別の実施形態では、本明細書で開示される抗体または機能的断片は、ジルコニウム(89Zr)または本明細書で提供されるか、または陽電子放出断層撮影法によって検出可能であることが当該技術分野で周知の他の任意の陽電子放出金属等の陽電子放出金属にコンジュゲートされ、陽電子放出断層撮影法を使用して対象において検出される。また別の実施形態では、本明細書で開示される抗体または機能的断片は、常磁性標識にコンジュゲートされ、磁気共鳴画像化法(MRI)を使用して対象において検出される。
一実施形態では、本発明は、本明細書で開示される抗体または機能的断片と薬学的に許容される担体とを有する医薬組成物を提供する。本明細書で開示される医薬組成物において使用され得る薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝食塩水、水、および油と水とのエマルション等のエマルション、ならびに様々な種類の湿潤剤等の当該技術分野で公知の標準の医薬担体のいずれかを含む。これらの医薬組成物は、液体単位用量形態、または本明細書で開示される抗体または機能的断片の、処置の必要のある対象の標的領域への送達のために十分な他の任意の投与形態で調製することができる。例えば、医薬組成物は、選択された投与様式、例えば、静脈内、筋内、皮下、腹腔内等のために適切な任意の様式で調製することができる。他の任意の成分、例えば、医薬グレードの安定剤、緩衝液、保存剤、賦形剤等は、当業者によって容易に選択することができる。医薬組成物の調製は、pH、等張性、安定性等に鑑みて、当業者のレベルの範囲内である。
本明細書で提供される本明細書で開示される1つまたは複数の抗体または機能的断片を含有する医薬製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって(Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA)、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、保存のために調製することができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で受容者に非毒性であり、ホスフェート、シトレートおよび他の有機酸等の緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン等のアミノ酸;グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属複合体(例えば、Zn-タンパク質複合体);ならびに/またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)またはポリエチレングリコール(PEG:polyethylene glycol)等の非イオン性界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において疾患を処置または予防するための方法を提供する。本明細書で開示される方法は、治療有効量の本明細書で提供される医薬組成物を対象に投与することを含み得る。例えば、医薬組成物は、1つまたは複数の本明細書で提供される抗体または機能的断片を含み得る。本明細書で開示される方法を使用して処置または予防され得る疾患には、がん、腫瘍形成および/または転移が含まれる。特に、本明細書で開示される方法は、がん細胞または腫瘍が、Tn抗原および/またはsTn抗原を有するタンパク質を有する、がんまたは腫瘍形成を処置するために有用である。本明細書で開示される方法を使用して処置または予防され得るがんまたは腫瘍の非限定的な例には、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、子宮内膜がんおよび膵がんが含まれる。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、トリプルネガティブ乳がんを処置するために有用である。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、がん細胞を特異的にターゲティングするために有用である。
一部の実施形態では、疾患の処置または予防のための方法であって、Tn抗原またはsTn抗原に結合し、また、以下の特色のうちの1つまたは複数を含む治療有効量の抗体またはその機能的断片を投与することを含む方法が、本明細書で提供される。
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、2つのTn抗原分子は、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
・シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
・Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有するか、または
・Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する。
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、2つのTn抗原分子は、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
・2つのTn抗原分子に結合し、2つのTn抗原分子は、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
・シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティ、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
・酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
・Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有するか、
・Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有するか、または
・Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に優先的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する、
・TnまたはsTn抗原に特異的に結合し、TnまたはsTn抗原は、がん細胞上に存在し、TnまたはsTn抗原は、セリン残基上に存在する。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することによって、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法であって、抗体重鎖もしくは軽鎖またはその機能的断片が、本明細書で説明される1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3、3A7および2F3バリアントと命名されたクローン単離物からのCDRのうちの1つまたは複数を有する、方法を提供する。したがって、一部の態様では、抗体重鎖もしくは軽鎖またはその機能的断片は、表2~4および図1~7で示されるCDRのうちの1つまたは複数を有する。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、本明細書で開示される抗体またはその機能的断片が、6つ未満のCDRを含む、投与することを含む。一部の実施形態では、抗体もしくは機能的断片またはコンジュゲートは、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3からなる群から選択される1、2、3、4または5つのCDRを含む。特定の実施形態では、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートは、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2および/またはVL CDR3からなる群から選択される1、2、3、4または5つのCDRを含む。そのようなCDRは、表2~4および図1~7で示される。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、(a)配列番号2、5、6、8、11および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と;配列番号14、17、18、20、23、24、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と;配列番号26、30、31、33、37、38および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含む可変重鎖(VH)ドメイン、および/または(b)配列番号40、44、45、47、51および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と;配列番号54、53、59、63および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と;配列番号66、70および71からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む可変軽鎖(VL)ドメインを含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、(a)配列番号2、5、6、8、11および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と;配列番号14、17、18、20、23、24、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と;配列番号26、30、31、33、37、38および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含む可変重鎖(VH)ドメインを含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、(a)配列番号40、44、45、47、51および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と;配列番号54、53、59、63および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と;配列番号66、70および71からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む可変軽鎖(VL)ドメインを含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号2および8からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号14および20からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号26および33からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含み、VLドメインが、配列番号40および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号54および59からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、配列番号66のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号5および11からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号17、23、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号30、37および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含み、VLドメインが、配列番号44および51からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号53および63からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、配列番号70のアミノ酸を有するVL CDR3とを含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号6および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号18および24からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号31および38からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含み、VLドメインが、配列番号45および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号53および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、配列番号71のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくは機能的断片またはコンジュゲートが、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを有する、投与することを含む。そのようなVHドメイン配列を、表5および6ならびに図1および3~7に示す。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくは機能的断片またはコンジュゲートが、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを有する、投与することを含む。そのようなVLドメイン配列を、表5および図2に示す。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくは機能的断片またはコンジュゲートが、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを有する、投与することを含む。そのようなVLドメイン配列を、表5および図2に示す。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくは機能的断片またはコンジュゲートが、本明細書で説明される2F3バリアントを含むクローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3または3A7についてのVHドメインおよびVLドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインおよびVLドメインを有する、投与することを含む。そのようなVHドメインおよびVLドメイン配列を、表5および6ならびに図1~7に示す。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、配列番号101、105、106および114~130からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVHドメインを含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくは機能的断片またはそのコンジュゲートが、配列番号108、112および113からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくは機能的断片またはそのコンジュゲートが、配列番号108、112および113からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号101のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号108のアミノ酸配列を含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号105、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、投与することを含む。
一部の実施形態では、それを必要とする対象においてがんまたは腫瘍形成を処置するための方法は、本明細書で説明される抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートを有する治療有効量の医薬組成物を投与することであって、抗体もしくはその機能的断片またはコンジュゲートが、VHドメインおよびVLドメインを含み、VHドメインが、配列番号106のアミノ酸配列を含み、VLドメインが、配列番号113のアミノ酸配列を含む、投与することを含む。
したがって、本発明の実施形態は、疾患を処置または予防するための方法であって、治療有効量の上記に説明される抗体またはその機能的断片のいずれか、上記のうちの任意の1つのコンジュゲート、または上記のいずれかの医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。
したがって、本発明の実施形態は、疾患を処置または予防するための方法であって、治療有効量の上記に説明される抗体またはその機能的断片のいずれか、上記のうちの任意の1つのコンジュゲート、または上記のいずれかの医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。
本発明の実施形態は、それを必要とする対象における疾患の処置または予防における使用のための、本発明の上記に説明される抗体(例えば、二重特異性抗体)のいずれかの抗体またはその機能的断片、上記のうちの任意の1つのコンジュゲート、または上記のいずれかの医薬組成物も含む。
本発明のさらなる態様は、疾患の処置または予防のための医薬の製造における、本発明の上記に説明される抗体(例えば、二重特異性抗体)のいずれかの抗体またはその機能的断片、上記のうちの任意の1つのコンジュゲート、または上記のいずれかの医薬組成物の使用も含む。
本明細書で説明される製剤等の製剤は、処置される特定の疾患に必要な2つ以上の活性化合物を含有することもできる。ある特定の実施形態では、製剤は、本明細書で開示される抗体または機能的断片と、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する1つまたは複数の活性化合物とを含む。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組合せにて好適に存在する。例えば、本明細書で開示される抗体または機能的断片は、1つまたは複数の他の治療剤と組み合わせることができる。そのような組合せ療法は、同時に、または逐次的に対象に投与することができる。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、治療有効量の本明細書で提供される医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することによる疾患の処置または予防のための方法であって、医薬組成物が、本明細書で開示される抗体または機能的断片と第2の治療剤とを含む、方法を提供する。適切な第2の治療剤は、本明細書で説明されるように、当業者により容易に決定することができる。一態様では、第2の治療剤は、化学療法剤または免疫療法剤である。免疫療法剤は、セツキシマブ、ベバシズマブ、ハーセプチン(heceptin)またはリツキシマブであり得るが、これらに限定されない。
本発明のさらなる態様は、疾患の処置または予防のための医薬の製造における、本発明の上記に説明される抗体(例えば、二重特異性抗体)のいずれかの抗体またはその機能的断片、上記のうちの任意の1つのコンジュゲート、または上記のいずれかの医薬組成物の使用も含む。
本明細書で説明される製剤等の製剤は、処置される特定の疾患に必要な2つ以上の活性化合物を含有することもできる。ある特定の実施形態では、製剤は、本明細書で開示される抗体または機能的断片と、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する1つまたは複数の活性化合物とを含む。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組合せにて好適に存在する。例えば、本明細書で開示される抗体または機能的断片は、1つまたは複数の他の治療剤と組み合わせることができる。そのような組合せ療法は、同時に、または逐次的に対象に投与することができる。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、治療有効量の本明細書で提供される医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することによる疾患の処置または予防のための方法であって、医薬組成物が、本明細書で開示される抗体または機能的断片と第2の治療剤とを含む、方法を提供する。適切な第2の治療剤は、本明細書で説明されるように、当業者により容易に決定することができる。一態様では、第2の治療剤は、化学療法剤または免疫療法剤である。免疫療法剤は、セツキシマブ、ベバシズマブ、ハーセプチン(heceptin)またはリツキシマブであり得るが、これらに限定されない。
本明細書で提供される医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に、治療有効量の本明細書で提供される本明細書で開示される抗体のうちの1つまたは複数と、任意に1つまたは複数の追加の治療剤とを含有する。そのような医薬組成物は、がんまたは腫瘍形成等の疾患、またはその症状の1つもしくは複数の予防、処置、管理または改善において有用である。
医薬組成物は、本明細書で開示される1つまたは複数の抗体または機能的断片を含有し得る。一実施形態では、抗体または機能的断片は、非経口投与のための滅菌溶液または懸濁液等の好適な医薬調製物に製剤化される。一実施形態では、本明細書で提供される抗体または機能的断片は、当該技術分野で周知の技術および手技を使用して医薬組成物に製剤化される(例えば、Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th Ed., p. 126を参照のこと)。
医薬組成物は、本明細書で開示される1つまたは複数の抗体または機能的断片を含有し得る。一実施形態では、抗体または機能的断片は、非経口投与のための滅菌溶液または懸濁液等の好適な医薬調製物に製剤化される。一実施形態では、本明細書で提供される抗体または機能的断片は、当該技術分野で周知の技術および手技を使用して医薬組成物に製剤化される(例えば、Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th Ed., p. 126を参照のこと)。
本明細書で開示される抗体または機能的断片は、処置される対象に対する望ましくない副作用の非存在下で、治療的に有用な効果を発揮するために十分な治療有効量にて医薬組成物中に含まれ得る。治療有効濃度は、ルーチン法を使用してin vitroおよびin vivo系で化合物を試験することによって経験的に決定し、その後、ヒトのための投与量についてそこから外挿することができる。医薬組成物中の抗体または機能的断片の濃度は、例えば、抗体または機能的断片の物理化学特徴、投与スケジュールおよび投与される量ならびに当業者に周知の他の因子に依存する。
一実施形態では、治療有効投与量は、約0.1ng/ml~約50~100μg/mlの抗体または機能的断片の血清濃度を産生する。別の実施形態では、医薬組成物は、1日当たり体重1kg当たり約0.001mg~約500mgの抗体の投与量を提供する。医薬投与単位形態は、投与単位形態当たり約0.01mg、0.1mgまたは1mg~約30mg、100mgまたは500mg、一実施形態では、約10mg~約500mgの抗体もしくは機能的断片、および/または他の任意の本質的成分の組合せを提供するように調製され得る。
一実施形態では、治療有効投与量は、約0.1ng/ml~約50~100μg/mlの抗体または機能的断片の血清濃度を産生する。別の実施形態では、医薬組成物は、1日当たり体重1kg当たり約0.001mg~約500mgの抗体の投与量を提供する。医薬投与単位形態は、投与単位形態当たり約0.01mg、0.1mgまたは1mg~約30mg、100mgまたは500mg、一実施形態では、約10mg~約500mgの抗体もしくは機能的断片、および/または他の任意の本質的成分の組合せを提供するように調製され得る。
本明細書で開示される抗体または機能的断片は一度に投与してもよく、いくつかのより小さな用量に分割して時間間隔で投与してもよい。正確な投与量および処置の持続期間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して経験的に、またはin vivoまたはin vitro試験データからの外挿によって決定することができることが理解される。また、濃度および投与量値は、緩和するべき状態の重症度とともに変動し得ることに留意するべきである。任意の特定の対象について、特定の投与量レジメンを、個々の要求、および組成物を投与するか、または組成物の投与を監督する人の専門的判断にしたがって経時的に調節してもよいこと、および本明細書で示される濃度範囲は単に例示であり、特許請求の範囲の組成物の範囲または実施を限定するとは意図されないことがさらに理解されるべきである。
本明細書で開示される抗体または機能的断片の混合または添加に際して、得られる混合物は、溶液、懸濁液その他であり得る。得られる混合物の形態は、意図される投与様式、および選択された担体または媒体中の化合物の溶解度を含む、いくつかの因子に依存する。有効濃度は、処置される疾患、障害または状態の症状を改善するために十分であり、経験的に決定され得る。
医薬組成物は、好適な量の化合物またはその薬学的に許容される誘導体を含有する滅菌非経口溶液または懸濁液等の単位投与形態で、ヒトおよび動物への投与のために提供される。一実施形態では、抗体または機能的断片は、単位投与形態または多投与形態で製剤化および投与され得る。単位用量形態とは、ヒトおよび動物対象に好適な、当該技術分野で公知であるように個々に包装された物理的に個別の単位を指す。各単位用量は、必要とされる医薬担体、媒体または希釈剤とともに、所望の治療効果を産生するために十分な、所定の量の本明細書で開示される抗体または機能的断片を含有する。単位用量形態の例には、アンプルおよびシリンジが含まれる。単位用量形態は、小部分または多数の小部分で投与され得る。多用量形態は、分離した単位用量形態で投与される、単一の容器に包装された複数の同一の単位投与形態である。多用量形態の例には、バイアル、またはパイント瓶もしくはガロン瓶が含まれる。それゆえ、多用量形態は、包装において分離していない多数の単位用量である。
一実施形態では、本明細書で開示される1つまたは複数の抗体または機能的断片は、液体医薬製剤で存在する。液体の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノール等の担体中で、例えば、本明細書で提供される抗体または機能的断片および任意の医薬補助剤を溶解、分散または別の方法で混合して、それによって、溶液を形成することによって調製され得る。所望の場合、投与される医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、pH緩衝剤等の少量の非毒性補助物質、例えば、アセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエート、アミノ酸(例えば、ヒスチジン)および他のそのような剤も含有し得る。そのような投与形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または当業者に明らかであり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PAを参照されたい。
本明細書で開示される医薬組成物を投与するための方法は、当該技術分野で周知である。医薬組成物の適切な投与経路は、熟練した臨床医によって容易に決定され得ることが理解される。例示的な投与経路には、静脈内注射、筋内注射、皮内注射または皮下注射が含まれる。さらに、医薬組成物の製剤は、投与経路に適応させるために容易に調節され得ることが理解される。また、本発明は、本明細書で開示される医薬組成物の投与後に、本明細書で提供される1つまたは複数の医薬組成物の遅延投与量、逐次的投与量および/または反復投与量が対象に投与され得ることを提供する。
疾患を処置するための本明細書で開示される方法は、(1)疾患を予防すること、すなわち、疾患にかかりやすくなっている場合があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、または示していない対象において疾患の臨床症状が発症しないようにすること、(2)疾患を阻害すること、すなわち、疾患またはその臨床症状の発症を阻止または低減すること、または(3)疾患を軽減すること、すなわち、疾患またはその臨床症状の退縮を引き起こすことを含むと意図される。疾患を予防するための本明細書で開示される方法は、がんまたは腫瘍形成を示す臨床症状を未然に防ぐことを含むと意図される。そのような未然に防ぐことには、例えば、対象における正常な生理学的インジケータの維持が含まれる。それゆえ、予防することは、対象を腫瘍転移の発生から保護するための対象の予防的処置を含み得る。
本明細書で開示される方法において使用される医薬組成物の治療有効量は、使用される医薬組成物、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重等に依存して変動し、それらの全ては、看護する臨床医の技術の範囲内である。本明細書で開示される方法によって処置され得る対象は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを含む。
本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない改変も、本明細書で提供される本明細書で開示される定義内に提供されることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明を例示すると意図されるが、本発明を限定するとは意図されない。
本明細書で開示される方法において使用される医薬組成物の治療有効量は、使用される医薬組成物、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重等に依存して変動し、それらの全ては、看護する臨床医の技術の範囲内である。本明細書で開示される方法によって処置され得る対象は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを含む。
本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない改変も、本明細書で提供される本明細書で開示される定義内に提供されることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明を例示すると意図されるが、本発明を限定するとは意図されない。
(実施例I)
Tn抗原またはsTn抗原への有力なヒトモノクローナル抗体の生成および選択
Tn抗原またはsTn抗原は、広範なスペクトルのヒト腫瘍において発見されている。したがって、本明細書で説明されるように、Tn抗原またはsTn抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体(mAb)を生成した。いくつかのmAbを、Tn ELISAに基づいてハイブリドーマから選択し、炭水化物特異性についてさらに特徴付け、精製した。
Tn抗原またはsTn抗原への有力なヒトモノクローナル抗体の生成および選択
Tn抗原またはsTn抗原は、広範なスペクトルのヒト腫瘍において発見されている。したがって、本明細書で説明されるように、Tn抗原またはsTn抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体(mAb)を生成した。いくつかのmAbを、Tn ELISAに基づいてハイブリドーマから選択し、炭水化物特異性についてさらに特徴付け、精製した。
抗Tn mAb産生ハイブリドーマの生成
2つの進行中のワクチン治験において患者から血液試料を得た。第1の治験では、患者に、他の抗原(グロボH、GM2およびペプチドアセンブルTFクラスター)およびベバシズマブによる処置の存在下でTn改変Muc1-KLHをワクチン接種した(NCT01223235)。第2の治験では、全てKLHにコンジュゲートしたグロボH、GM2、sTn、TFおよびTnを含む単分子ワクチンを使用した(NCT01248273)。両方の治験は、MSKCC承認およびFDA承認IRBプロトコールおよびINDの下、MSKCCにおいて行われた。3~5回のワクチン接種後、28人の患者(各治験から14人の患者)から血液標本を回収し、これらはTnに対して0~1/1280の抗体タイターを示した。Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)上での勾配遠心分離によって、約80~90mLの血液から末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。EasySep Memory B細胞単離キット(StemCell Technologies)を使用して、PBMCからB細胞を単離した。
B細胞を、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、10%FBS(Omega Scientific)、10ng/mL IL-10、2000U/mL IL2、5μg/mL R-848および1μg/mL抗CD40 mAb(G28-5ハイブリドーマ上清;ATCC)を補充したRPMI-1640培地中で培養した。24~48時間後のB95-8培養上清を、B細胞に添加した(30% V/V)。活性化B細胞を、電気融合によってP3x63Ag8.653骨髄腫細胞に融合した。
2つの進行中のワクチン治験において患者から血液試料を得た。第1の治験では、患者に、他の抗原(グロボH、GM2およびペプチドアセンブルTFクラスター)およびベバシズマブによる処置の存在下でTn改変Muc1-KLHをワクチン接種した(NCT01223235)。第2の治験では、全てKLHにコンジュゲートしたグロボH、GM2、sTn、TFおよびTnを含む単分子ワクチンを使用した(NCT01248273)。両方の治験は、MSKCC承認およびFDA承認IRBプロトコールおよびINDの下、MSKCCにおいて行われた。3~5回のワクチン接種後、28人の患者(各治験から14人の患者)から血液標本を回収し、これらはTnに対して0~1/1280の抗体タイターを示した。Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)上での勾配遠心分離によって、約80~90mLの血液から末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。EasySep Memory B細胞単離キット(StemCell Technologies)を使用して、PBMCからB細胞を単離した。
B細胞を、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、10%FBS(Omega Scientific)、10ng/mL IL-10、2000U/mL IL2、5μg/mL R-848および1μg/mL抗CD40 mAb(G28-5ハイブリドーマ上清;ATCC)を補充したRPMI-1640培地中で培養した。24~48時間後のB95-8培養上清を、B細胞に添加した(30% V/V)。活性化B細胞を、電気融合によってP3x63Ag8.653骨髄腫細胞に融合した。
Tn ELISAによる抗Tn mAb産生ハイブリドーマのスクリーニング
Tn ELISAのために、Neutr-アビジンコーティングし、かつ0.25%BSAで遮断したプレート上に捕捉した5μg/mLの多価ビオチニル化Tn-PAAにより、プレートをコーティングした。Neutr-アビジンコーティングしたウェルを対照として使用した。ハイブリドーマ上清(100μL/ウェル)を室温で1時間インキュベートし、0.05%Tween/PBSで3回洗浄した。結合した抗体を最初にホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP:horseradish peroxidase)標識ヤギ抗ヒトIgG+M(Jackson ImmunoResearch)で検出し、次に、陽性ウェルをIgG-Fc特異的二次抗体またはIgM特異的二次抗体でプローブしてアイソタイプを決定した。
Tn ELISAのために、Neutr-アビジンコーティングし、かつ0.25%BSAで遮断したプレート上に捕捉した5μg/mLの多価ビオチニル化Tn-PAAにより、プレートをコーティングした。Neutr-アビジンコーティングしたウェルを対照として使用した。ハイブリドーマ上清(100μL/ウェル)を室温で1時間インキュベートし、0.05%Tween/PBSで3回洗浄した。結合した抗体を最初にホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP:horseradish peroxidase)標識ヤギ抗ヒトIgG+M(Jackson ImmunoResearch)で検出し、次に、陽性ウェルをIgG-Fc特異的二次抗体またはIgM特異的二次抗体でプローブしてアイソタイプを決定した。
ELISAによる炭水化物特異性分析
多価または一価のビオチニル化合成炭水化物(Tn、sTn、TF、Tnクラスター、グロボH、GD2、GM2およびGD3)を、Neutr-アビジンコーティングし、かつ0.25%BSAで遮断したプレート上に捕捉した。MUC1-ペプチド(配列番号157)、MUC1-ジ-Tnペプチド(配列番号156)、MUC1-1-5Gペプチド(配列番号155)およびBSM(ウシ顎下腺ムチン)でプレートを直接コーティングし、0.25%BSAで遮断した。様々な濃度の精製mAb(100μL/ウェル)を室温で1時間インキュベートし、0.5%Tween/PBSで3回洗浄した。結合した抗体を、0.05%Tween/PBSで4回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗ヒトIgG-Fc(Jackson ImmunoResearch)で、基質としてOPDを使用して検出した。ガングリオシドGD2、GD3、フコシル-GM1、GM2およびGM3を、5μg/mLでEtOH中に希釈し、プレートが乾燥するまでインキュベートした。プレートを2%ヒト血清アルブミンで遮断し、PBSで洗浄した。精製mAbを室温で1時間インキュベートし、PBSで2回洗浄した。0.025%Tween/PBSによる3回の洗浄後、結合した抗体をアルカリホスファターゼコンジュゲート抗ヒトIgG-Fc(KPL)で、基質としてdNPPを使用して検出した。
多価または一価のビオチニル化合成炭水化物(Tn、sTn、TF、Tnクラスター、グロボH、GD2、GM2およびGD3)を、Neutr-アビジンコーティングし、かつ0.25%BSAで遮断したプレート上に捕捉した。MUC1-ペプチド(配列番号157)、MUC1-ジ-Tnペプチド(配列番号156)、MUC1-1-5Gペプチド(配列番号155)およびBSM(ウシ顎下腺ムチン)でプレートを直接コーティングし、0.25%BSAで遮断した。様々な濃度の精製mAb(100μL/ウェル)を室温で1時間インキュベートし、0.5%Tween/PBSで3回洗浄した。結合した抗体を、0.05%Tween/PBSで4回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗ヒトIgG-Fc(Jackson ImmunoResearch)で、基質としてOPDを使用して検出した。ガングリオシドGD2、GD3、フコシル-GM1、GM2およびGM3を、5μg/mLでEtOH中に希釈し、プレートが乾燥するまでインキュベートした。プレートを2%ヒト血清アルブミンで遮断し、PBSで洗浄した。精製mAbを室温で1時間インキュベートし、PBSで2回洗浄した。0.025%Tween/PBSによる3回の洗浄後、結合した抗体をアルカリホスファターゼコンジュゲート抗ヒトIgG-Fc(KPL)で、基質としてdNPPを使用して検出した。
免疫グロブリンcDNAクローニングおよび組換え抗体発現
以前に説明されるように、個々のハイブリドーマ細胞株からRT-PCRによってヒトmAb重鎖および軽鎖cDNAの可変領域を回復し、IgG1もしくはIgM重鎖またはIgKもしくはIgL軽鎖発現ベクターにサブクローニングした。Sawada-Hirai et al., J. Immune Based Ther. Vaccines, 2:5 (2004)。抗体クローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3および3A7のFab重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列を、それぞれ、以下の表7および8に示す。組換えmAbを、Expi-CHO発現キット(Thermo Fisher)を使用して一過的に発現させた。
以前に説明されるように、個々のハイブリドーマ細胞株からRT-PCRによってヒトmAb重鎖および軽鎖cDNAの可変領域を回復し、IgG1もしくはIgM重鎖またはIgKもしくはIgL軽鎖発現ベクターにサブクローニングした。Sawada-Hirai et al., J. Immune Based Ther. Vaccines, 2:5 (2004)。抗体クローン単離物1A12b、1A4、1E2b、1G10、2A8、2F3および3A7のFab重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列を、それぞれ、以下の表7および8に示す。組換えmAbを、Expi-CHO発現キット(Thermo Fisher)を使用して一過的に発現させた。
ヒトmAb精製
Unicorn 5.0ソフトウェアを使用するAkta Explorer(GE Healthcare)系を使用して、抗体を精製した。血清非含有培養培地上清を、遠心分離および濾過によって浄化し、使用するまで冷蔵保存した。適切なサイズのタンパク質Aカラム上で10mmol/L PBSおよび150mmol/L NaClランニング緩衝液を使用してヒトIgG抗体を精製した。ヒドロキシアパタイトカラム上でヒトIgM抗体を精製し、IgMを500mmol/Lホスフェートの勾配で溶離した。抗体濃度を、IgGおよびIgMについてそれぞれ、1.4および1.18のE1%を使用するOD280、およびタンパク質A HPLCによって決定した。各調製物の純度を、還元条件下でのSDS-PAGE分析(1レーン当たり1~5μg)によって評価した。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、凝集を査定した。
Unicorn 5.0ソフトウェアを使用するAkta Explorer(GE Healthcare)系を使用して、抗体を精製した。血清非含有培養培地上清を、遠心分離および濾過によって浄化し、使用するまで冷蔵保存した。適切なサイズのタンパク質Aカラム上で10mmol/L PBSおよび150mmol/L NaClランニング緩衝液を使用してヒトIgG抗体を精製した。ヒドロキシアパタイトカラム上でヒトIgM抗体を精製し、IgMを500mmol/Lホスフェートの勾配で溶離した。抗体濃度を、IgGおよびIgMについてそれぞれ、1.4および1.18のE1%を使用するOD280、およびタンパク質A HPLCによって決定した。各調製物の純度を、還元条件下でのSDS-PAGE分析(1レーン当たり1~5μg)によって評価した。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、凝集を査定した。
ヒトがん組織マイクロアレイ(TMA:Tissue Mirroarray)染色
US Biomax,Incから4つの腫瘍マイクロアレイを得、2F3-G3で染色し、結合についてスコア付けした。小細胞肺がん(SCLC:small cell lung cancer)アレイ(カタログ番号LC818)は、80症例を含有し、1症例当たり単一のコアを有した。35症例の漿液性腺癌、15症例の明細胞癌、15症例の子宮体部類内膜腺癌、10症例の粘液性腺癌、5症例のがん隣接組織を含有する卵巣がんアレイ(カタログ番号OV8011)は、全部で80症例からの単一のコアを有した。対照としてがん隣接乳房組織を伴う乳がん組織アレイ(カタログ番号BR1504b)は、TNM、臨床段階、病理グレードおよびIHCマーカー(ER、PR、Her-2、ARおよびKi67)結果を含み、様々な75症例からの2つ組のコアを含有した。これらの症例のうちの11症例は、両方のコアにおいてトリプルネガティブであり、これらを2F3染色についてさらに分析した。少なくとも1つのコアにおける2F3染色は、その症例について陽性と考えられた。最後に、各20症例の腺癌および転移性癌、各5症例の腺腫およびポリープ、4症例のクローン病、1症例の結核、5症例の結腸炎、各10症例の隣接正常結腸組織および正常組織を含有する結腸疾患スペクトル組織マイクロアレイ(カタログ番号BC05002a)を染色した。
US Biomax,Incから4つの腫瘍マイクロアレイを得、2F3-G3で染色し、結合についてスコア付けした。小細胞肺がん(SCLC:small cell lung cancer)アレイ(カタログ番号LC818)は、80症例を含有し、1症例当たり単一のコアを有した。35症例の漿液性腺癌、15症例の明細胞癌、15症例の子宮体部類内膜腺癌、10症例の粘液性腺癌、5症例のがん隣接組織を含有する卵巣がんアレイ(カタログ番号OV8011)は、全部で80症例からの単一のコアを有した。対照としてがん隣接乳房組織を伴う乳がん組織アレイ(カタログ番号BR1504b)は、TNM、臨床段階、病理グレードおよびIHCマーカー(ER、PR、Her-2、ARおよびKi67)結果を含み、様々な75症例からの2つ組のコアを含有した。これらの症例のうちの11症例は、両方のコアにおいてトリプルネガティブであり、これらを2F3染色についてさらに分析した。少なくとも1つのコアにおける2F3染色は、その症例について陽性と考えられた。最後に、各20症例の腺癌および転移性癌、各5症例の腺腫およびポリープ、4症例のクローン病、1症例の結核、5症例の結腸炎、各10症例の隣接正常結腸組織および正常組織を含有する結腸疾患スペクトル組織マイクロアレイ(カタログ番号BC05002a)を染色した。
2F3v3G3抗体の、ヒト組織のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE:formalin fixed,paraffin embedded)切片および腫瘍マイクロアレイへの結合を、Charles River Laboratoriesで行われた免疫組織化学によって評価した。US Biomaxから、結腸がん(BC05002a)、乳がん(BR1504b)、卵巣がん(OV8011)および小細胞肺がん(LC818)患者からの80個の組織を各々含有するTMAスライドを取得した。スライドを脱脂し、抗原回復のためにシトレート溶液(pH6.0)による短時間処理を使用した。2Xホスフェート緩衝塩溶液中で0.5%カゼイン、1%BSA、1.5%ロバ血清により、非特異的タンパク質結合を遮断し、残留のペルオキシダーゼ活性を3%H2O2により遮断した。各TMAスライドを、2mg/mlの2F3V3G3またはヒトIgG1アイソタイプ対照抗体と2時間インキュベートした。洗浄後、事前複合体化ビオチニル化F(ab’)2ロバ抗ヒトIgG(Fc特異的)を使用して1:1.5の一次抗体:二次抗体比で、2F3のTMAへの結合を検出した。ビオチニル化二次抗体による免疫組織化学検出のための高感度法であるアビジン-ビオチン複合体(ABC:avidin-biotin complex)技術を使用して、結合を検出した。簡潔に述べると、スライドをPBSで2回すすぎ、その後、アビジンおよびビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)を含有するElite ABC試薬で30分間処理し、PBSで2回すすぎ、その後、ペルオキシダーゼ反応のための基質として3,3’-ジアミノベンジジン(DAB:diaminobenzidine)で4分間処理した。全てのスライドを水道水ですすぎ、対比染色し、脱水し、載せた。PBS+1%BSAは、全ての抗体およびABC試薬の希釈剤として機能した。熟練した研究病理学者によって、染色したスライドを評価した。
結果
腫瘍マイクロアレイからのデータは、文献からの証拠とともに、様々な腫瘍組織タイプにおけるTn抗原の広範な発現を実証した。特に、卵巣がん、乳がんおよび結腸がんの全ては、原発性ヒト腫瘍の約50%またはそれよりも高い染色を実証する。(図22)。全ての11症例のトリプルネガティブ乳がんは、2F3について陽性染色され、11症例のうちの10症例は、両方のコアにおいて陽性染色された。
腫瘍マイクロアレイからのデータは、文献からの証拠とともに、様々な腫瘍組織タイプにおけるTn抗原の広範な発現を実証した。特に、卵巣がん、乳がんおよび結腸がんの全ては、原発性ヒト腫瘍の約50%またはそれよりも高い染色を実証する。(図22)。全ての11症例のトリプルネガティブ乳がんは、2F3について陽性染色され、11症例のうちの10症例は、両方のコアにおいて陽性染色された。
Tn抗原の腫瘍発現プロファイルを考慮して、抗Tn mAbを産生するハイブリドーマを生成した。試験した7つの陽性ハイブリドーマからの上清は、TnまたはsTnと相互作用した。これらのハイブリドーマからV遺伝子を単離し、ヒトIgG1または3/カッパ配列のコンテクストにクローニングした。抗体クローン単離物2F3、3A7および1A4ならびに他の4つの単離物のFab重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列を、それぞれ、以下の表7および8に示す。精製した抗体を、1パネルの炭水化物抗原との反応性についてスクリーニングして、特異性の幅を決定した(図8)。方法の節で説明されるように、ELISAプレート上に抗原を固定した。第1の組の抗原のための溶媒であるPBSを、陰性対照として試験した。第2の組の抗原のための溶媒であるEtOHを、第2の陰性対照として試験した。相互作用の特異性は、図8の「ELISAによる特異性」のカラムで示され、これらの特異性を示すOD数は、図8の右側の15個のカラムに示される。2F3は、TnおよびSTnに対する最も優れた選択性を示した。3A7および1A4も、この組の抗原について優れた選択性を示した。
(実施例II)
Tn抗原またはsTn抗原への有力なヒトモノクローナル抗体のバリアント、2F3の生成および最適化
実施例Iで生成および特定したリード抗体の1つである2F3を、さらなるバリアントの生成および最適化のために選択した。エラープローンPCRを使用して2F3抗体の変異体を生成し、次に、部位特異的変異誘発および組換え法を使用して、生成した2F3変異体をさらに最適化した。一連の親和性成熟試験において、ELISAおよびFACSによって、好ましい変異抗体をモデルTn抗原へのそれらの改善した結合親和性についてスクリーニングした。
Tn抗原またはsTn抗原への有力なヒトモノクローナル抗体のバリアント、2F3の生成および最適化
実施例Iで生成および特定したリード抗体の1つである2F3を、さらなるバリアントの生成および最適化のために選択した。エラープローンPCRを使用して2F3抗体の変異体を生成し、次に、部位特異的変異誘発および組換え法を使用して、生成した2F3変異体をさらに最適化した。一連の親和性成熟試験において、ELISAおよびFACSによって、好ましい変異抗体をモデルTn抗原へのそれらの改善した結合親和性についてスクリーニングした。
エラープローンPCRを使用する2F3変異体の生成
以前に説明されるように(Sawada-Hirai et al., J. Immune Based Ther. Vaccines, 2:5 (2004))、プライマーとしてVHFおよびCγRを使用するGeneMorphIIポリメラーゼ(Agilent)によるPCRによって、2F3 VH領域を増幅した。VH断片を精製し、IgG発現ベクターにサブクローニングした。個々のクローンからのプラスミドDNAを精製し、配列決定した。野生型2F3軽鎖を伴う変異体重鎖を使用して、Cos1細胞またはExpi-CHO細胞をコトランスフェクトした。Tn陽性細胞株(T-47DおよびJurkat)およびTn陰性細胞株(SK-MEL28)で、Tn特異的ELISAおよびフローサイトメトリーによって上清を評価した。
以前に説明されるように(Sawada-Hirai et al., J. Immune Based Ther. Vaccines, 2:5 (2004))、プライマーとしてVHFおよびCγRを使用するGeneMorphIIポリメラーゼ(Agilent)によるPCRによって、2F3 VH領域を増幅した。VH断片を精製し、IgG発現ベクターにサブクローニングした。個々のクローンからのプラスミドDNAを精製し、配列決定した。野生型2F3軽鎖を伴う変異体重鎖を使用して、Cos1細胞またはExpi-CHO細胞をコトランスフェクトした。Tn陽性細胞株(T-47DおよびJurkat)およびTn陰性細胞株(SK-MEL28)で、Tn特異的ELISAおよびフローサイトメトリーによって上清を評価した。
部位特異的変異誘発および組換え法による2F3変異体の生成
オーバーラッピングPCR(overlapping PCR)によって、CDRにおける点変異を生成した。PCRにより最初の5’および3’断片を別々に増幅した。N末端断片についてのリバースプライマーおよびC末端断片についてのフォワードプライマーは、中間のCDR位置をターゲティングするためのNNN配列との重複相補配列を有する。その後、混合鋳型として5’および3’断片を使用するVHFおよびCγRプライマーによるPCRによって、VH領域全体を増幅した。精製したVH断片をIgG発現カセットにサブクローニングし、発現させ、上記に説明されるように精製した。
断片間の接合がCDR2とCDR3との間のFR3に存在する5’断片および3’断片によるオーバーラップPCRを行うことによって、CDR2とCDR3との間の変異体組合せバリアントを同様に生成した。2つの断片を混合し、鋳型として使用して、VHFおよびCγRプライマーにより2つの変異を有するVH領域を増幅した。精製したVH断片をIgG発現カセットにサブクローニングし、発現させ、上記に説明されるように精製した。
オーバーラッピングPCR(overlapping PCR)によって、CDRにおける点変異を生成した。PCRにより最初の5’および3’断片を別々に増幅した。N末端断片についてのリバースプライマーおよびC末端断片についてのフォワードプライマーは、中間のCDR位置をターゲティングするためのNNN配列との重複相補配列を有する。その後、混合鋳型として5’および3’断片を使用するVHFおよびCγRプライマーによるPCRによって、VH領域全体を増幅した。精製したVH断片をIgG発現カセットにサブクローニングし、発現させ、上記に説明されるように精製した。
断片間の接合がCDR2とCDR3との間のFR3に存在する5’断片および3’断片によるオーバーラップPCRを行うことによって、CDR2とCDR3との間の変異体組合せバリアントを同様に生成した。2つの断片を混合し、鋳型として使用して、VHFおよびCγRプライマーにより2つの変異を有するVH領域を増幅した。精製したVH断片をIgG発現カセットにサブクローニングし、発現させ、上記に説明されるように精製した。
フローサイトメトリー
Tn陽性(T-47D、OVCAR3、MCF7またはJurkat)腫瘍細胞株(状態当たり細胞0.5x106個)をPBS/2%FBS(PBSF)中で洗浄した。様々な濃度の試験または対照ヒトmAbを細胞に添加し、氷上で30分間インキュベートした(Gilewski et al., Clin Cancer Res, 6:1693-701 (2000);Gilewski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98:3270-5 (2001))。PBSF中で洗浄後、細胞をAlexaFluor-488抗ヒトIgG-Fcγまたは抗ヒトIgM-μ(Thermo Fisher)と氷上で30分間インキュベートした。細胞をPBSF中で2回洗浄し、Guava Personal Cell Analysis-96(PCA-96)系(Millipore)を使用するフローサイトメトリーによって蛍光データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。
Tn陽性(T-47D、OVCAR3、MCF7またはJurkat)腫瘍細胞株(状態当たり細胞0.5x106個)をPBS/2%FBS(PBSF)中で洗浄した。様々な濃度の試験または対照ヒトmAbを細胞に添加し、氷上で30分間インキュベートした(Gilewski et al., Clin Cancer Res, 6:1693-701 (2000);Gilewski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98:3270-5 (2001))。PBSF中で洗浄後、細胞をAlexaFluor-488抗ヒトIgG-Fcγまたは抗ヒトIgM-μ(Thermo Fisher)と氷上で30分間インキュベートした。細胞をPBSF中で2回洗浄し、Guava Personal Cell Analysis-96(PCA-96)系(Millipore)を使用するフローサイトメトリーによって蛍光データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。
結果
リード抗体の1つである2F3を、親和性最適化のために選択した。エラープローンPCRを使用して変異体を生成し、変異体をELISAによってスクリーニングした(図9)。未精製細胞上清を定量し、Tn-PAAに結合させるために使用して、結合に対する変異の影響を決定した。この回において、バリアント17、33および75は、親配列と比較して顕著に改善した結合を示した。
さらに、1サブセットのリード最適化重鎖をわずかに改変して、人為的結果の配列を除去し(クローン17)、ある場合には、2つの好ましい変異体を組み合わせて単一の構築物にした(クローン1733)(図10)。ELISAによって多数の精製バッチをアッセイし、親分子と比較した。図10の表で示されるように、全ての最適化バリアントは、親分子に優る結合を示し、試験したバリアントの中でクローン1733、17v2および6は、Tn抗原への最も強い結合体であった。
リード抗体の1つである2F3を、親和性最適化のために選択した。エラープローンPCRを使用して変異体を生成し、変異体をELISAによってスクリーニングした(図9)。未精製細胞上清を定量し、Tn-PAAに結合させるために使用して、結合に対する変異の影響を決定した。この回において、バリアント17、33および75は、親配列と比較して顕著に改善した結合を示した。
さらに、1サブセットのリード最適化重鎖をわずかに改変して、人為的結果の配列を除去し(クローン17)、ある場合には、2つの好ましい変異体を組み合わせて単一の構築物にした(クローン1733)(図10)。ELISAによって多数の精製バッチをアッセイし、親分子と比較した。図10の表で示されるように、全ての最適化バリアントは、親分子に優る結合を示し、試験したバリアントの中でクローン1733、17v2および6は、Tn抗原への最も強い結合体であった。
位置H55(Kabat)は、バリアント6および17においてエラープローンPCR変異プロセスによる2つの好ましい変異を含有することが分かった。したがって、この位置をコードするコドンについての配列をランダム化することによって、これらの位置で追加の変異を作製した。クローンを選択し、この位置の全てのアミノ酸のサンプリングを達成するために配列決定し、変異抗体を生成し、Tn-PAA抗原への結合に対する変異の影響について試験した。図11の表で示されるように、この位置での大多数の改変は、親2F3と比較して優れた結合を達成した。図12は、モデル抗原への親和性成熟結合プロファイルからの好ましい2F3変異体についてのELISAデータを要約する。
親に優る相対的改善を決定するため、および親和性の増大が特異性に対して任意の影響を有するかどうかを決定するために、5つの変異体を選択し、ELISAアッセイにおいてモデル抗原(Tn-PAA、sTN-PAA、TnクラスターおよびdBSM)に結合させた(図13A~13D)。バリアント6、1733および633の全ては、全てのオンターゲット抗原への最も優れた結合体であった。他方で、TF-PAA、GalNac-ベータ-PAA(TnがGalNac-アルファ結合である)、モノマーTnおよびモノマーsTnについては、いずれのバリアントによっても結合が観察されなかった(データは示していない)。
加えて、Tn抗体の結合が多数のTn分子との緊密な相互作用を必要とするかどうかを確認するために、ELISAアッセイにおいてMuc1ペプチドの2つの異なる形態をモデルとして試験した。Tn改変が12個の非改変残基によって分離されているムチン-1由来のペプチドであるジ-Tn Muc1(PAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPG(配列番号156))は、2F3バリアントのいずれかによる結合を示さなかったが(図14A)、一方で、隣接する残基におけるTn改変を含む多数のTn改変を有する類似するMuc1ペプチド(Muc1-1-5G;HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(配列番号155))は、高親和性で2F3およびその誘導体による結合を示した(図14B)。
2F3およびバリアント抗体の、様々な細胞株によって生理的条件下で内因的に発現されるTn抗原への結合を確認するために、元の2F3親および選択された親和性バリアントを、FACS分析によって試験した。試験した2F3バリアントの全ては、2F3親と比較してEC50値における強いシフトを伴って、Tn陽性T47-D細胞に結合することが示された(図15A~15D)。加えて、バリアント6および17は、最大結合におけるシフトを示し、平衡においてより使用可能な部位を占有するそれらの能力を示した(図15Aおよび15C)。同様に、FACSによって、元の分子およびバリアント2F3分子は、追加の多数のTn陽性細胞種に結合することが示された(図16A~16D)。
(実施例III)
2F3抗体バリアントの機能的特徴付け
抗がん治療等の治療適用に好適な2F3抗体バリアントの細胞機能性および生理機能性を査定するために、様々な機能アッセイを行って、蛍光色素のコンジュゲーション;細胞内部移行プロファイルの経時変化;細胞傷害薬の特定の細胞種への送達;および抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)を測定した。
2F3抗体バリアントの機能的特徴付け
抗がん治療等の治療適用に好適な2F3抗体バリアントの細胞機能性および生理機能性を査定するために、様々な機能アッセイを行って、蛍光色素のコンジュゲーション;細胞内部移行プロファイルの経時変化;細胞傷害薬の特定の細胞種への送達;および抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)を測定した。
抗体の蛍光色素へのコンジュゲーション
抗体を最初に、PEG化N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SAT(PEG)4)とのコンジュゲーションによって官能化した。Zebaスピンカラム(ThermoFisher)を介して抗体を50mM NaHCO3に脱塩し、その後、4当量のPEG化N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SAT(PEG)4)(ThermoFisher 26099)で1時間を超えて処理した。反応を完了した後、Zebaスピンカラムを介して反応混合物を1XPBS pH7.4まで脱塩し、10体積%の脱保護緩衝液で処理し、室温で2時間反応させ、Zebaスピンカラムを使用して1XPBSに緩衝液交換して脱保護PEGチオールを得た。
AF488マレイミドとのコンジュゲーション
PEGチオール抗体を、マレイミド基を有する4.4当量のAF488(ThermoFisher)で室温にて1時間を超えて処理した。反応が完了した後、Zebaスピンカラムを使用して材料を1XPBS pH7.4に緩衝液交換した。
pHAbマレイミドとのコンジュゲーション。
PEGチオール抗体を、マレイミド基を有する4.4当量のpHAb(Promega)で室温にて1時間を超えて処理した。反応が完了した後、Zebaスピンカラムを使用して材料を1XPBS pH7.4に緩衝液交換した。
抗体を最初に、PEG化N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SAT(PEG)4)とのコンジュゲーションによって官能化した。Zebaスピンカラム(ThermoFisher)を介して抗体を50mM NaHCO3に脱塩し、その後、4当量のPEG化N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SAT(PEG)4)(ThermoFisher 26099)で1時間を超えて処理した。反応を完了した後、Zebaスピンカラムを介して反応混合物を1XPBS pH7.4まで脱塩し、10体積%の脱保護緩衝液で処理し、室温で2時間反応させ、Zebaスピンカラムを使用して1XPBSに緩衝液交換して脱保護PEGチオールを得た。
AF488マレイミドとのコンジュゲーション
PEGチオール抗体を、マレイミド基を有する4.4当量のAF488(ThermoFisher)で室温にて1時間を超えて処理した。反応が完了した後、Zebaスピンカラムを使用して材料を1XPBS pH7.4に緩衝液交換した。
pHAbマレイミドとのコンジュゲーション。
PEGチオール抗体を、マレイミド基を有する4.4当量のpHAb(Promega)で室温にて1時間を超えて処理した。反応が完了した後、Zebaスピンカラムを使用して材料を1XPBS pH7.4に緩衝液交換した。
pHAb-色素内部移行パーセントアッセイによる2F3変異体のスクリーニング
100mLのT-47D細胞(RPMI 1640+10%FBS中の細胞1x106個/mL、細胞0.5x106個/mLの最終濃度)を等体積のpHAbコンジュゲートmAb(PBS中の40μg/mL、20μg/mLの最終濃度)と37℃で5時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、2つの管に分割した。細胞を200μLのpH7培地(内部移行されたmAbのみを検出する)またはpH5.5培地(全mAbを検出する)に再懸濁し、氷上で維持した。Guava PCA-96系によって試料データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。内部移行%=MFI(pH7)/MFI(pH5.5)*100(MFI値はバックグラウンドについて補正した)。
100mLのT-47D細胞(RPMI 1640+10%FBS中の細胞1x106個/mL、細胞0.5x106個/mLの最終濃度)を等体積のpHAbコンジュゲートmAb(PBS中の40μg/mL、20μg/mLの最終濃度)と37℃で5時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、2つの管に分割した。細胞を200μLのpH7培地(内部移行されたmAbのみを検出する)またはpH5.5培地(全mAbを検出する)に再懸濁し、氷上で維持した。Guava PCA-96系によって試料データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。内部移行%=MFI(pH7)/MFI(pH5.5)*100(MFI値はバックグラウンドについて補正した)。
内部移行経時変化/バリアント6番
pHAb色素を使用すること。
T-47D細胞(細胞0.5x106個/培地mL)を20μg/mLのpHAbコンジュゲート2F3 6番と4℃で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、同じ体積に再懸濁し、37℃でインキュベートした。示される時点で、200μLの細胞を回収し、遠心分離した。細胞を、10mM NaN3および5mM 2-デオキシグルコースを含有する200μLの培地に再懸濁し、2つのウェルに分割し(100μL/ウェル)、氷上で維持した。240分間のインキュベーション期間での最終回収後、100μL/ウェルの培地を添加して、各試料についてpH7.0またはpH5.5のいずれかに調節した。Guava PCA-96系によって試料データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。内部移行%=MFI(pH7)/MFI(pH5.5)*100(MFI値はバックグラウンドについて補正した)。
pHAb色素を使用すること。
T-47D細胞(細胞0.5x106個/培地mL)を20μg/mLのpHAbコンジュゲート2F3 6番と4℃で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、同じ体積に再懸濁し、37℃でインキュベートした。示される時点で、200μLの細胞を回収し、遠心分離した。細胞を、10mM NaN3および5mM 2-デオキシグルコースを含有する200μLの培地に再懸濁し、2つのウェルに分割し(100μL/ウェル)、氷上で維持した。240分間のインキュベーション期間での最終回収後、100μL/ウェルの培地を添加して、各試料についてpH7.0またはpH5.5のいずれかに調節した。Guava PCA-96系によって試料データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。内部移行%=MFI(pH7)/MFI(pH5.5)*100(MFI値はバックグラウンドについて補正した)。
AF488クエンチャーを使用すること。
T-47D細胞(細胞0.5x106個/培地mL)を2μg/mLのAlexaFluor-488コンジュゲート2F3 6番と4℃で1時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、同じ体積に再懸濁し、37℃でインキュベートした。示される時点で、200μLの細胞を回収し、2つのウェルに分割した。AF488クエンチャー抗体を伴うか、または伴わない10mM NaN3を含有する100mLの培地(25μg/mLの最終濃度、ThermoFisher)をウェルに添加した。細胞を最終回収まで氷上で維持した(37℃で180分間、その後、4℃で30分間)。Guava PCA-96系によって試料データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。内部移行%=MFI(w/クエンチャー)/MFI(w/oクエンチャー)*100(MFI値はバックグラウンドについて補正した)。
T-47D細胞(細胞0.5x106個/培地mL)を2μg/mLのAlexaFluor-488コンジュゲート2F3 6番と4℃で1時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、同じ体積に再懸濁し、37℃でインキュベートした。示される時点で、200μLの細胞を回収し、2つのウェルに分割した。AF488クエンチャー抗体を伴うか、または伴わない10mM NaN3を含有する100mLの培地(25μg/mLの最終濃度、ThermoFisher)をウェルに添加した。細胞を最終回収まで氷上で維持した(37℃で180分間、その後、4℃で30分間)。Guava PCA-96系によって試料データを取得し、Guava ExpressProソフトウェアにより解析した。内部移行%=MFI(w/クエンチャー)/MFI(w/oクエンチャー)*100(MFI値はバックグラウンドについて補正した)。
細胞傷害性アッセイ
96ウェルプレートにJurkat細胞を、10%FBS、L-GluおよびP/Sを含むRPMI 1640培地中に細胞1x105個/mL(細胞0.5x104個/50μL/ウェル)にて播種した。様々な濃度の精製mAb(別々の96ウェルプレート中で培地により希釈した)を200nMのタンパク質A-MMAE(LEV-AME-100)と室温で20分間インキュベートした。50mLのmAbとタンパク質A-MMAEとの複合体を各ウェルに添加し、37℃で3日間インキュベートした。CellTiter-Glo(70μL/ウェル、Promega)を各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートした。Gen5ソフトウェアを使用して化学発光シグナルを測定した。
96ウェルプレートにJurkat細胞を、10%FBS、L-GluおよびP/Sを含むRPMI 1640培地中に細胞1x105個/mL(細胞0.5x104個/50μL/ウェル)にて播種した。様々な濃度の精製mAb(別々の96ウェルプレート中で培地により希釈した)を200nMのタンパク質A-MMAE(LEV-AME-100)と室温で20分間インキュベートした。50mLのmAbとタンパク質A-MMAEとの複合体を各ウェルに添加し、37℃で3日間インキュベートした。CellTiter-Glo(70μL/ウェル、Promega)を各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートした。Gen5ソフトウェアを使用して化学発光シグナルを測定した。
ADCCアッセイ
健康なドナーの血液試料からフィコール密度勾配遠心分離によってPBMCを調製した。CAOV3細胞をカルセイン-AM(Thermo Fisher)により37℃で30分間標識した。培地による洗浄後、標識した細胞を96ウェルプレートに細胞10,000個/ウェルで添加した。PBMC(E/T 20:1)および様々な濃度の2F3バリアントをウェルに添加し、37℃で3時間インキュベートした。蛍光光度計を使用して蛍光シグナルを測定した。細胞傷害性%=(試料RFI-最小放出RFI)/(最大放出RFI-最小放出RFI)*100、NP40で溶解したCAOV3を最大放出として使用した。PBMCのみを有するCAOV3細胞を自発的(最小)放出として使用した。
健康なドナーの血液試料からフィコール密度勾配遠心分離によってPBMCを調製した。CAOV3細胞をカルセイン-AM(Thermo Fisher)により37℃で30分間標識した。培地による洗浄後、標識した細胞を96ウェルプレートに細胞10,000個/ウェルで添加した。PBMC(E/T 20:1)および様々な濃度の2F3バリアントをウェルに添加し、37℃で3時間インキュベートした。蛍光光度計を使用して蛍光シグナルを測定した。細胞傷害性%=(試料RFI-最小放出RFI)/(最大放出RFI-最小放出RFI)*100、NP40で溶解したCAOV3を最大放出として使用した。PBMCのみを有するCAOV3細胞を自発的(最小)放出として使用した。
結果
pH7.0でT-47D細胞株に内部移行される蛍光色素とコンジュゲートしたバリアント抗体の蛍光強度中央値(MFI:median fluorescence intensity)の、pH7.0での内部移行され得る抗体の全量に対する比を測定することによって、2F3バリアントの細胞内部移行パーセントを評価した(図17)。結果は、全ての2F3バリアントは5時間で74%~95%の結合抗体を内部移行したこと、および内部移行アッセイにおいてバリアント6および1733は最も優れた結合体および内部移行薬であることを示した。最も高い内部移行パーセントを有する最も高い結合リードである2F3バリアントクローン6について、3時間の期間にわたる内部移行を測定する直交法を使用することによって、内部移行経時変化研究をさらに行った(図18A)。時間の関数として計算される内部移行パーセントは、Tn抗原を内因的に発現する細胞株に内部移行されたバリアント抗体の部分における比例的増大を実証した(図18B)。
pH7.0でT-47D細胞株に内部移行される蛍光色素とコンジュゲートしたバリアント抗体の蛍光強度中央値(MFI:median fluorescence intensity)の、pH7.0での内部移行され得る抗体の全量に対する比を測定することによって、2F3バリアントの細胞内部移行パーセントを評価した(図17)。結果は、全ての2F3バリアントは5時間で74%~95%の結合抗体を内部移行したこと、および内部移行アッセイにおいてバリアント6および1733は最も優れた結合体および内部移行薬であることを示した。最も高い内部移行パーセントを有する最も高い結合リードである2F3バリアントクローン6について、3時間の期間にわたる内部移行を測定する直交法を使用することによって、内部移行経時変化研究をさらに行った(図18A)。時間の関数として計算される内部移行パーセントは、Tn抗原を内因的に発現する細胞株に内部移行されたバリアント抗体の部分における比例的増大を実証した(図18B)。
pH5.5未満で効率的に蛍光を発するが中性pHでは蛍光を発しない蛍光色素であるpHAbで、時間の関数として内部移行パーセントを計算することによって、第2の直交法を使用して上記の結果を確認した。図19A~19Cで示されるように、抗体をpHAb色素と直接コンジュゲートし、時間の関数として内部移行させた場合、pH7では内部移行した抗体のみからの蛍光が観察され、一方で、pH5.5では内部および外部抗体画分両方からの蛍光(全量)が観察された。したがって、前者の後者に対する比は、内部移行された蛍光パーセントを表し、図18で説明される蛍光脱クエンチング研究から得た結果と非常に類似する結果を示した。
次に、治療薬を結合し、それを内部移行する特定の細胞種に細胞傷害薬をターゲティングする前記治療薬について、抗Tn抗体の内部移行を評価した。細胞傷害剤を細胞へと方向付け得る2F3バリアントについてスクリーニングするために、タンパク質A-MMAEコンジュゲートと抗体との複合体を使用して細胞を処理し、3日後に細胞生存能を測定した(図20A~20B)。多くのバリアントからのデータは、効率的な死滅を実証し、多くの場合、親クローンによる死滅を3~10倍超えた。
最後に、エフェクター細胞の存在下で腫瘍細胞に対する細胞傷害性効果を媒介する親和性バリアントの能力を実証するために、ADCCアッセイを行った(図21)。バリアント17、80および6は、特に高いADCCを実証し、クローン80は最も高い効力を実証する。この結果から動機付けられ、クローン80とクローン6および17との間の組合せ変異体を生成した。
次に、治療薬を結合し、それを内部移行する特定の細胞種に細胞傷害薬をターゲティングする前記治療薬について、抗Tn抗体の内部移行を評価した。細胞傷害剤を細胞へと方向付け得る2F3バリアントについてスクリーニングするために、タンパク質A-MMAEコンジュゲートと抗体との複合体を使用して細胞を処理し、3日後に細胞生存能を測定した(図20A~20B)。多くのバリアントからのデータは、効率的な死滅を実証し、多くの場合、親クローンによる死滅を3~10倍超えた。
最後に、エフェクター細胞の存在下で腫瘍細胞に対する細胞傷害性効果を媒介する親和性バリアントの能力を実証するために、ADCCアッセイを行った(図21)。バリアント17、80および6は、特に高いADCCを実証し、クローン80は最も高い効力を実証する。この結果から動機付けられ、クローン80とクローン6および17との間の組合せ変異体を生成した。
(実施例IV)
2F3抗Tn/sTn抗体はSer残基上のTnを優先的に認識する
2F3抗体およびそのバリアントが結合するグリカンエピトープを決定するために、上記に説明されるように、ELISAアッセイを使用して一連の実験を行った。上記に説明される実験と一致して、Tn-PAA以外の合成抗原に対する2F3バリアントの結合は観察されなかった。例えば、2F3G1変異体のThomsen-Friedenreich(TF)-ポリアクリルアミド(PAA)糖コンジュゲート(TF-PAA)、Tn-β-PAAまたはTn-SPへの結合は観察されなかった(図23A~C)。Muc1上のエピトープを決定するために、基質として、Tn抗原がトレオニン(Thr)残基に連結されたジ-Tn-MUC1ペプチド(PAPGST*APPAHGVTSAPDT*RPAPG)(配列番号156)を使用して、2F3G1変異体の結合を査定した。結果は、抗体はジ-Tn-MUC1ペプチドに結合しないことを実証し、2F3G1変異体はThr改変MUC1に結合しないことを示した(図23D)。
2F3抗Tn/sTn抗体はSer残基上のTnを優先的に認識する
2F3抗体およびそのバリアントが結合するグリカンエピトープを決定するために、上記に説明されるように、ELISAアッセイを使用して一連の実験を行った。上記に説明される実験と一致して、Tn-PAA以外の合成抗原に対する2F3バリアントの結合は観察されなかった。例えば、2F3G1変異体のThomsen-Friedenreich(TF)-ポリアクリルアミド(PAA)糖コンジュゲート(TF-PAA)、Tn-β-PAAまたはTn-SPへの結合は観察されなかった(図23A~C)。Muc1上のエピトープを決定するために、基質として、Tn抗原がトレオニン(Thr)残基に連結されたジ-Tn-MUC1ペプチド(PAPGST*APPAHGVTSAPDT*RPAPG)(配列番号156)を使用して、2F3G1変異体の結合を査定した。結果は、抗体はジ-Tn-MUC1ペプチドに結合しないことを実証し、2F3G1変異体はThr改変MUC1に結合しないことを示した(図23D)。
次に、Ser残基へのTn改変の効果を試験した。この趣旨で、2F3G1変異体の非改変MUC1ペプチド(HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(配列番号157))への結合、またはThrおよびSer残基上でペプチドに結合された5つのTnグリカンを有するMUC1ペプチド(HGVT*S*APDT*RPAPGS*T*APPA)(配列番号155)への結合。2F3G1変異体の非改変残基を含有するMUC1ペプチドへの結合は観察されなかったが、改変MUC1ペプチドにおいては強い結合が観察された(図23E~F)。Thr改変残基を有するMUC1への結合がなく、かつSerおよびThr改変残基の存在下で強い結合があるとすると、これらの結果は、2F3G1変異体は、Ser残基上でTnによって改変されたMUC1ペプチドに結合することを示す。
このことを、Tnグリカンアレイ分析によってさらに確認した。糖ペプチドマイクロアレイを、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS:N-hydroxysuccinimide)スライドガラス(Schott Nexterion)上に調製し、アミン官能基を通してペプチドおよび糖ペプチドの固定を達成した。プリンティング緩衝液(300mMリン酸ナトリウム、pH8.5)中で100μMに調節した濃度で、圧電式プリンターを使用して、0.33nLの各溶液を点に配置した。マイクロアレイを6つの反復点にプリントした。アレイをモノクローナル抗Tn抗体2F3親、2F3Vバリアント6または2F3バリアント17-2について問い合わせ、示されるように蛍光標識二次抗体およびストレプトアビジンで検出した。ProScanArrayスキャナーおよびScanArray Expressソフトウェア(Perkin-Elmer)によりスキャニングおよび定量を行った。アッセイにより1パネルの約50個のTn糖ペプチドを調査し、スペーシング、Tn改変の数、改変された特定の残基または配列コンテクストが2F3による結合の特異性に寄与したかどうかに取り組んだ。Ser-Tnを含有するペプチド、および固形マトリックスへの結合点から少なくとも5つのアミノ酸であるペプチドへの効率的な結合が観察された。遊離末端近くのSer-Tn、および単一ペプチド中の多数のSer-Tnは結合を増大した。2F3親抗体(「親」)、バリアント6およびバリアント17を使用して、抗体の1パネルの様々な糖タンパク質への結合をアッセイして、2F3および2F3G1バリアントによって認識される好ましいTnコンテクストを決定した。上記に説明されるELISAアッセイと一致して、親2F3および2F3G1バリアントは、糖ペプチドがセリン残基上で改変された場合、強い結合を示した(図24)。重要なことに、Thr残基への改変は、ほとんど乃至全く結合を向上させなかった。しかしながら、単一のSer残基のみへの連結は、結合を顕著に増大することができた。例えば、試験した全ての3つの抗体の結合は、Ser改変ペプチドIgA-Pep17(H2N-KPSTPPTPSPS*C-OH(配列番号159))について、同じ配列ペプチドIgA-Pep18と比較して大いに向上したが、Thr改変ペプチド(H2N-KPST*PPTPSPSC-OH(配列番号160))では向上しなかった(表9)。さらに、Ser-Tnを含有するペプチドへの結合のみでなく、特に固形マトリックスへの結合点から少なくとも5つのアミノ酸であるペプチドへの結合も観察された。遊離末端近くのSer-Tn、および単一ペプチド中の多数のSer-Tnは結合を増大した。
加えて、600個の様々な哺乳動物グリカンからなるグリカンアレイ分析(バージョン5.3)は、Tn/sTnに対する高い特異性を実証し、哺乳動物において見られる600個近いグリカン構造への有意な結合は観察されなかった(図25)。2つの最も強いヒットはスペーサーアームに接続されたTnであり、また、セリンに接続されたTnへの有意な結合が見られた。高い抗体濃度でさえも、非関連複合体N-連結グリカンへの非常に弱い結合が観察された(図26)。このことは、様々な濃度の抗体を使用してさらに支持することができた(図26)。さらに、親2F3抗体の親和性成熟は2つのバリアント(2F3 6番および2F3 17v2番)をもたらし、これらは特異性を失うことなくTnおよびsTnへの劇的に増大した親和性を示した(図26)。
抗体を5μg/mL(この群からのデータは示していない)または50μg/mL(棒グラフおよび表9にデータを示す)の濃度で糖ペプチドアレイに適用した。
Tn-Ser残基とTn-Thr残基との間の差の構造解析は、Tn-Ser残基は、Tn-Thr残基よりも様々なコンフォメーションをとることを示す(図27)。Tn-Serについての好ましいコンフォメーションはペプチド骨格に平行であるが、Tn-Thrについての好ましいコンフォメーションは垂直である。この差により、結合に使用可能なTn分子の面がシフトする。合わせると、これらの結果は、2F3抗Tn/sTn抗体が、アクセス可能なコンテクストにあるSer残基上のTnを優先的に認識することを実証する。
本出願全体を通して、様々な刊行物が引用されている。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術分野の状態をより完全に説明するために、それらの全体を本出願において参照により本明細書に組み込む。本発明は上記に提供される実施例に関して説明されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な改変を行うことができることを理解するべきである。
Claims (88)
- Thomsen-nouvelle(Tn)抗原またはそのシアル酸付加形態(sTn抗原)に結合する単離された抗体またはその機能的断片であって、
(a)(i)配列番号2、5、6、8、11および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号14、17、18、20、23、24、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号26、30、31、33、37、38および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含む可変重鎖(VH)ドメイン、
および/または
(b)(i)配列番号40、44、45、47、51および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号54、53、59、63および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号66、70および71からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む可変軽鎖(VL)ドメイン
を含む抗体またはその機能的断片。 - 前記VHドメインが、
(a)配列番号2、5、6、8、11および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(b)配列番号14、17、18、20、23、24、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(c)配列番号26、30、31、33、37、38および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。 - 前記VLドメインが、
(a)配列番号40、44、45、47、51および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(b)配列番号54、53、59、63および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(c)配列番号66、70および71からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。 - VHドメインおよびVLドメインを含み、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号2および8からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号14および20からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号26および33からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、且つ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号40および47からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号54および59からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号66のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、
請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。 - VHドメインおよびVLドメインを含み、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号5および11からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号17、23、149、150、151、152および153からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号30、37および154からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、且つ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号44および51からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53および63からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号70のアミノ酸を有するVL CDR3と
を含む、
請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。 - VHドメインおよびVLドメインを含み、
(a)前記VHドメインが、
(i)配列番号6および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1と、
(ii)配列番号18および24からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2と、
(iii)配列番号31および38からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3と
を含み、且つ
(b)前記VLドメインが、
(i)配列番号45および52からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1と、
(ii)配列番号53および64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2と、
(iii)配列番号71のアミノ酸配列を有するVL CDR3と
を含む、
請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。 - VHドメインおよびVLドメインを含み、
(i)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号17のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(ii)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号149のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(iii)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号17のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(iv)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号150のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(v)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号151のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(vi)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号152のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(vii)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号153のVH CDR2と、配列番号30のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(viii)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号149のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含むか、または
(ix)前記VHドメインが、配列番号5のVH CDR1と、配列番号150のVH CDR2と、配列番号154のVH CDR3とを含み、且つ前記VLドメインが、配列番号44のVL CDR1と、配列番号53のVL CDR2と、配列番号70のVL CDR3とを含む、
請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。 - 前記VHドメインが、配列番号101、105、106、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。
- 前記VLドメインが、配列番号108、112および113からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。
- 前記VHドメインが、配列番号101のアミノ酸配列を含み、前記VLドメインが、配列番号108のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。
- 前記VHドメインが、配列番号105、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129および130からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、且つ前記VLドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。
- 前記VHドメインが、配列番号106のアミノ酸配列を含み、且つ前記VLドメインが、配列番号113のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された抗体または機能的断片。
- 前記VHドメインが、Kabat番号付けに基づいて、
(a)位置17におけるセリンまたはフェニルアラニン、
(b)位置37におけるバリンまたはイソロイシン、
(c)位置55におけるアスパラギン酸、ヒスチジンまたはアラニン、
(d)位置61におけるアスパラギン酸またはチロシン、
(e)位置63におけるバリンまたはメチオニン、
(f)位置82Bにおけるセリンまたはアスパラギン、
(g)位置87におけるトレオニンまたはアラニン、
(h)位置100Bにおけるアラニンまたはトレオニン、
(i)位置105におけるグルタミンまたはリジン、および
(j)位置110におけるトレオニンまたはイソロイシン
からなる群から選択されるアミノ酸バリアントのうちの1つまたは複数を含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の単離された抗体または機能的断片。 - 前記VHドメインが、Kabat番号付けに基づいて、
(a)位置30におけるセリン、トレオニンまたはアルギニン、
(b)位置56におけるグリシン、
(c)位置57におけるアスパラギンまたはトレオニン、
(d)位置62におけるグルタミン、
(e)位置63におけるリジン、および
(f)位置98におけるリジン
からなる群から選択されるアミノ酸バリアントのうちの1つまたは複数を含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の単離された抗体または機能的断片。 - 前記VLドメインが、Kabat番号付けに基づいて、
(a)位置31におけるアスパラギンまたはリジン、および
(b)位置41におけるグリシン
からなる群から選択されるアミノ酸バリアントのうちの1つまたは複数を含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の単離された抗体または機能的断片。 - 前記機能的断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディおよびsdABからなる群から選択される、請求項1~5のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1~15のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、CDRグラフト化抗体および完全ヒト抗体の構成成分である、請求項1~15のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記二重特異性抗体が、Tn抗原および腫瘍抗原に結合する、請求項18に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記二重特異性抗体が、Tn抗原、およびTリンパ球によって発現されたタンパク質、好ましくはCD3、ナチュラルキラー細胞によって発現されたタンパク質、好中球によって発現されたタンパク質、白血球によって発現されたタンパク質、単球によって発現されたタンパク質、マクロファージによって発現されたタンパク質または骨髄由来サプレッサー細胞によって発現されたタンパク質に結合する、請求項18に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記二重特異性抗体が、Tn抗原および共阻害性分子または共刺激性分子に結合する、請求項18に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記抗体が、ヒト抗体である、請求項1~15のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記抗体が、IgGまたはIgMアイソタイプである、請求項1~15のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記IgG抗体が、IgG1サブクラスである、請求項23に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 2つのTn抗原分子に結合する、請求項1~24のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する、請求項1~24のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記2つのTn抗原分子が、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、前記2つのTn抗原分子が、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、請求項26に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記2つのTn抗原分子が、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、請求項26に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティを有する、請求項1~28のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティを有する、請求項1~28のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、請求項1~28のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、請求項1~28のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有する、請求項1~32のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有する、請求項1~32のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、請求項1~32のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 前記Tn抗原が、
(a)合成Tn抗原、
(b)Tn改変ペプチドの部分、または
(c)細胞によって発現されるTn改変タンパク質の部分
である、請求項32~35のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。 - 前記抗体が、1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する、請求項32~35のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- Tn抗原が、がん細胞によって発現される、請求項37に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
- 請求項1~38のいずれか1項に記載の抗体またはその機能的断片のVHドメイン、VLドメイン、またはVHドメインおよびVLドメインの両方をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項39に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項39に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
- 原核細胞または真核細胞である、請求項41に記載の宿主細胞。
- Thomsen-nouvelle(Tn)抗原またはそのシアル酸付加形態(sTn抗原)に結合する抗体またはその機能的断片を製造する方法であって、
(a)請求項41または42に記載の宿主細胞を培地中で培養することと、
(b)その中で発現する前記抗体または機能的断片を得ることと
を含む方法。 - 局在化剤、検出可能剤または治療剤にコンジュゲートまたは組換え融合された請求項1~38のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその機能的断片を含むコンジュゲート。
- 局在化剤を含む、請求項44に記載のコンジュゲート。
- 前記局在化剤が、好適な基質による形式的環化付加を受けることができるアルケンまたはアルキンである、請求項45に記載のコンジュゲート。
- 前記アルケンまたはアルキンが、歪みのあるアルケンまたは歪みのあるアルキンである、請求項46に記載のコンジュゲート。
- 前記歪みのあるアルケンが、シクロアルカンである、請求項47に記載のコンジュゲート。
- 前記シクロアルカンが、トランス-シクロアルケンである、請求項48に記載のコンジュゲート。
- 前記トランス-シクロアルケンが、シクロペンテン、シクロヘキセン、トランス-シクロヘプタン、トランス-シクロオクテンまたはオキサノルボルナジエンである、請求項49に記載のコンジュゲート。
- 前記好適な基質が、アジド、テトラジンまたはテトラゾールである、請求項46に記載のコンジュゲート。
- 前記形式的環化付加が、クリック反応である、請求項46に記載のコンジュゲート。
- 前記形式的環化付加が、レトロ形式的環化付加によって追従される、請求項46に記載のコンジュゲート。
- 検出可能剤を含む、請求項44に記載のコンジュゲート。
- 前記検出可能剤が、陽電子放出放射性核種またはガンマ線放出放射性核種である、請求項54に記載のコンジュゲート。
- 前記陽電子放出放射性核種または前記ガンマ線放出放射性核種が、78Br、14C、11C、57Co、64Cu、51Cr、18F、68Ga、67Ga、68Ge、153Gd、159Gd、3H、166Ho、131I、125I、124I、123I、121I、115In、113In、112In、111In、140La、177Lu、54Mn、99Mo、13N、15O、32P、103Pd、142Pr、149Pm、186Re、188Re、82Rb、105Rh、97Ru、35S、47Sc、75Se、153Sm、113Sn、117Sn、85Sr、94mTc、99Tc、201Ti、133Xe、86Y、90Y、169Yb、175Yb、65Znおよび89Zrからなる群から選択される、請求項55に記載のコンジュゲート。
- 前記検出可能剤が、検出可能な反応を触媒する酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質または非放射性常磁性金属イオンである、請求項54に記載のコンジュゲート。
- 治療剤を含む、請求項44に記載のコンジュゲート。
- 前記治療剤が、所与の生物学的応答を改変する剤、または細胞毒素である、請求項58に記載のコンジュゲート。
- 所与の生物学的応答を改変する前記剤が、毒素、アポトーシス剤、抗血管新生剤、サイトカイン、増殖因子、凝固剤およびキメラ抗原受容体からなる群から選択される、請求項59に記載のコンジュゲート。
- 前記細胞毒素が、化学療法剤である、請求項59に記載のコンジュゲート。
- 前記化学療法剤が、アントラサイクリン、タキサン、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、オーリスタチン分子、ホルモン、ヌクレオシドアナログ、DNA修復酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤、細胞傷害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNA副溝結合剤、アデノシンデアミナーゼ阻害剤および微小管破壊剤からなる群から選択される、請求項61に記載のコンジュゲート。
- 前記細胞毒素が、アルファ線放出放射性核種またはベータ線放出放射性核種である、請求項59に記載のコンジュゲート。
- 前記アルファ線放出放射性核種が、211At、212Bi、213Bi、225Ac、223Ra、212Pb、227Thおよび149Tbからなる群から選択される、請求項63に記載のコンジュゲート。
- 前記ベータ線放出放射性核種が、90Y、131I、109Pd、131Luおよび177Luからなる群から選択される、請求項63に記載のコンジュゲート。
- 請求項1~38のいずれか1項に記載の抗体またはその機能的断片と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 請求項44~65のいずれか1項に記載のコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 疾患の処置または予防のための方法であって、Thomsen-nouvelle(Tn)抗原またはそのシアル酸付加形態(sTn抗原)に結合し、且つ、以下の(a)~(j):
(a)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、且つ前記2つのTn抗原分子が、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
(b)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
(c)シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(d)Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(e)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
(f)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
(g)Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有する、
(h)Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有する、および
(i)Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
(j)1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する
からなる群から選択される1つまたは複数の特色を有する、抗体またはその機能的断片を治療有効量投与することを含む方法。 - 疾患の処置または予防における使用のためのThomsen-nouvelle(Tn)抗原またはそのシアル酸付加形態(sTn抗原)に結合する抗体またはその機能的断片であって、前記抗体が、以下の(a)~(j):
(a)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、且つ前記2つのTn抗原分子が、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
(b)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
(c)シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(d)Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(e)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
(f)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
(g)Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有する、
(h)Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有する、および
(i)Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
(j)1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する
からなる群から選択される1つまたは複数の特色を含む、抗体またはその機能的断片。 - 疾患の処置または予防のための医薬の製造におけるThomsen-nouvelle(Tn)抗原またはそのシアル酸付加形態(sTn抗原)に結合する抗体またはその機能的断片の使用であって、前記抗体が、以下の(a)~(j):
(a)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、各々、タンパク質のアミノ酸残基上に位置し、且つ前記2つのTn抗原分子が、10個またはそれよりも少ない連続するアミノ酸残基によって分離されている、
(b)2つのTn抗原分子に結合する、ここで、前記2つのTn抗原分子が、タンパク質の隣接するアミノ酸残基上に位置する、
(c)シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドの10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(d)Thomsen-Friedenreich(TF)抗原の10倍を超える、Tn抗原に対するアビディティである、
(e)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、シアリルLea、グロボH、またはF-GM1、GM2、GM3、GD2およびGD3からなる群から選択されるガングリオシドに結合しない、
(f)酵素結合免疫吸着アッセイにおいてバックグラウンド対照を超えて、TF抗原に結合しない、
(g)Tn抗原への結合について50nM未満のEC50値を有する、
(h)Tn抗原への結合について20nM未満のEC50値を有する、および
(i)Tn抗原への結合について10nM未満のEC50値を有する、
(j)1つまたは複数のセリン残基上のTn抗原またはsTn抗原に優先的または特異的に結合する
からなる群から選択される1つまたは複数の特色を含む、使用。 - 治療有効量の請求項1~38のいずれか1項に記載の抗体もしくはその機能的断片、請求項44~65のいずれか1項に記載のコンジュゲート、または請求項66または67に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む疾患を処置または予防するための方法。
- それを必要とする対象における疾患の処置または予防での使用のための請求項1~38のいずれか1項に記載の抗体もしくはその機能的断片、請求項44~65のいずれか1項に記載のコンジュゲート、または請求項66または67に記載の医薬組成物。
- 疾患の処置または予防のための医薬の製造における請求項1~38のいずれか1項に記載の抗体もしくはその機能的断片、請求項44~65のいずれか1項に記載のコンジュゲート、または請求項66または67に記載の医薬組成物の使用。
- 前記疾患が、がんまたは腫瘍形成であり、前記がんまたは前記腫瘍の細胞が、Tn抗原またはsTn抗原を含むタンパク質をその表面上に発現する、請求項68または71に記載の方法。
- 前記がんまたは腫瘍が、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、子宮内膜がんおよび膵がんからなる群から選択される、請求項74に記載の方法。
- 前記がんまたは腫瘍が、乳がんである、請求項75に記載の方法。
- 前記乳がんが、トリプルネガティブ乳がんである、請求項75に記載の方法。
- 第2の治療剤を同時に、または逐次的に投与することをさらに含む請求項68、71、74、75、76または77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の治療剤が、化学療法剤または免疫療法剤である、請求項78に記載の方法。
- 有効量の請求項44~65のいずれか1項に記載のコンジュゲートを対象に投与することを含むそれを必要とする前記対象における腫瘍を検出するための方法。
- 前記疾患が、がんまたは腫瘍形成であり、前記がんまたは前記腫瘍の細胞が、Tn抗原またはsTn抗原を含むタンパク質をその表面上に発現する、請求項69または72に記載の使用のための抗体、コンジュゲートまたは医薬組成物。
- 前記がんまたは腫瘍が、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、子宮内膜がんおよび膵がんからなる群から選択される、請求項81に記載の使用のための抗体、コンジュゲートまたは医薬組成物。
- 前記がんまたは腫瘍が、乳がん、好ましくはトリプルネガティブ乳がんである、請求項82に記載の使用のための抗体、コンジュゲートまたは医薬組成物。
- 第2の治療剤、好ましくは化学療法剤または免疫療法剤との組合せで使用される、請求項69、72、81、82または83のいずれか1項に記載の使用のための抗体、コンジュゲートまたは医薬組成物。
- 前記疾患が、がんまたは腫瘍形成であり、前記がんまたは前記腫瘍の細胞が、Tn抗原またはsTn抗原を含むタンパク質をその表面上に発現する、請求項70または73に記載の使用。
- 前記がんまたは腫瘍が、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、子宮内膜がんおよび膵がんからなる群から選択される、請求項85に記載の使用。
- 前記がんまたは腫瘍が、乳がん、好ましくはトリプルネガティブ乳がんである、請求項86に記載の使用。
- 前記抗体、コンジュゲートまたは医薬組成物が、第2の治療剤、好ましくは化学療法剤または免疫療法剤との組合せで使用される、請求項70、73、85、86または87のいずれか1項に記載の使用。
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