KR101451227B1 - Pka 활성을 이용한 암 진단용 조성물 및 암 전이 진단을 위한 정보제공 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PKA(protein kinase A) 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물에 대한 것이다.

Description

PKA 활성을 이용한 암 진단용 조성물 및 암 전이 진단을 위한 정보제공 방법{Diagnostic composition for cancer using protein kinase A and method of providing the information for diagnosis of cancer}
본 발명은 PKA(protein kinase A) 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물에 대한 것이다.
암 은 세계적으로 질환 관련 사망의 가장 일반적인 경우이며, 특히, 암의 조기 발견이 가장 중요하다.
이와 관련하여, 항원결정(antigen determination)에 기반을 둔 암진단을 위해 혈청학상의 암 바이오마커(Serological cancer biomarkers)가 널리 사용되고 있으며, 그 예로, 간암 진단을 위한 a-태아 단백질 (a-fetoprotein; AFP), 전립선암 진단을 위한 전립선 특이 항원 (prostate-specific antigen; PSA), 대장암 진단을 위한 태아성암항원(carcinoembryonic antigen; CEA), 유방암 진단을 위한 암 항원 CA 15-3, 위암 진단을 위한 암 항원 CA19-9 및 난소암 진단을 위한 암 항원 CA125 등이 있다. 또한, 대사 효소, 세포 골격에 관여하는 단백질 및 종양 억제 인자를 포함하여 수많은 잠재적인 단백질 마커가 암의 진단을 위해 보고되고 있다. 그러나 이러한 항원은 암 진단을 위한 감도 및/또는 특이성이 부족하다. 따라서 새롭고 이상적인 암 바이오 마커와 개선된 진단 방법이 암 진단 향상을 위해 필요하다.
한편, 사이 클릭 AMP(cAM)-의존성 단백질 키나아제인 PKA(protein kinase A)는 전사 후 변형(post-transcriptional modifications)을 위한 가장 중요한 효소의 하나이며, 세포 증식, 대사, 유전자 유도, 혈관 형성, 이온 채널의 조절 및 세포사멸과 같은 다양한 생물 학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 유형 I 과 유형 II를 포함하는 PKA는 주로 세포내 효소로, 2 개의 조절(regulatory) 유닛 및 2개의 일반 촉매(common catalytic) 서브 유닛으로 구성되는 4량체 효소이며, cAMP에 의해 R 이합체와 2개의 프리 C서브 유닛 으로 분리된다. 다만, 현재까지 암진단을 위한 마커로써, PKA 또는 PKA 활성을 활용하고자 하는 시도는 없었으며, 이에, 어레이-기반 분석 등의 더 민감한 접근을 통해, sPKA 활성 및/또는 자가 항체가 암 진단을 위한 혈청 학적 바이오 마커로서의 가능성을 가지고 있는지 평가 하는 것이 필요하다.
또한, PKA 활성은 종종 방사성 동위 원소 표지 된 ATP를 사용하여 측정되지만, 전통적인 방법은 방사선의 위험, 번거로움, 시간-소요 등의 단점이 있는 것으로 알려져 있다. 이에, 형광기반의 대체적인 비-방사성의 방법(alternative non-radioactive methods based on fluorescence), 발광(luminescence) 나노입자(nanoparticles) 및 수정 진동자마이크로 밸런스(quartz crystal microbalance) 등이 상기 단점을 극복하기 위하여 제안되고 있다. 형광 검출 방법은 프로-Q 다이아몬드 색소(Pro-Q diamond dye) 및 Zn2 + 복합체 기반과 비오틴화 인산 특이적 리간드(biotinylated phosphate-specific ligand based on Zn2 + complex)와 같은 분자 프로브를 사용 한다. 금 나노 입자, 양자점, 및 지르코늄 이온 고정화 자성 나노 입자를 포함하는 나노 입자 의 다양한 유형은 PKA 활성 분석의 감도를 개선 하는 데 사용 되었다. 그러나 이러한 방법은 감도 및/또는 키나아제 활성을 결정 하기 위한 비용 효율의 한계가 있다. 따라서 고감도이며, 조작 되기 쉽고, 경제적으로 키나아제 활성을 평가하기 위한 분석 방법의 개발이 필요하다.
Jung JW, Jung SH, Yoo JO, Suh IB, Kim YM, Ha KS. Label-free and quantitative analysis of C-reactive protein in human sera by tagged-internal standard assay on antibody arrays. Biosens Bioelectron 2009; 24: 1469-73.
본 발명의 첫 번째 목적은 PKA(protein kinase A) 활성을 이용한 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 PKA(protein kinase A) 활성을 이용한 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용한 암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 PKA(protein kinase A) 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물 또는 키트를 이용한 암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물 또는 키트를 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 암 진단용 조성물 및 암 진단용 키트를 이용하면, 고감도이며, 조작 되기 쉬울 뿐 아니라, 경제적으로 암 진단이 가능하며, 신속하고 정확하게 암 치료제의 스크리닝을 할 수 있다.
도 1a는 온-칩 PKA 활성 분석의 개략도를 나타낸다(GMBS, N-[γ-maleimidobutyryloxy]sulfosuccinimide ester; Ser, serine; Cys, cysteine).
도 1b 내지 도 1e는 온-칩 PKA 활성 분석의 최적화를 위한 실험결과를 나타낸다. 도 1b 내지 도 1d는 다양한 농도의 켐타이드(kemptide)(b), MgCl2(c) 및 ATP (d)를 반응 버퍼 내의 100 U/mL 인간 cPKA와 혼합하여 반응 혼합물을 제조한 후, 웰-타입 펩타이드 어레이에 도포한 것이며, 도 1e는 0.5 mmol/L MgCl2, 0.5 mmol/L ATP, 및 100 U/mL 인간 cPKA를 포함하는 반응 혼합물 1 마이크로 리터(microliter aliquots)를 펩타이드 어레이에 도포하고, 일정 시간 동안 배양한 것이다. 상기에서 설명한 바와 같은 방법으로 어레이 스팟의 형광강도를 측정하여 PKA 활성을 결정하였다. 결과는 3 개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표현하였다.
도 2는 트리톤 X-100에 의한 온-칩 PKA 활성 분석의 고감도화 및 PKI를 사용한 억제 분석을 나타낸다. 도 2a 내지 도 2c는 트리톤 X-100 및 100 U/mL 인간 cPKA를 일정 농도로 함유하는 반응 혼합물을 30℃에서 90분간 펩타이드 배열에 로드한 후, 상기에서 설명한 바와 같은 방법으로 PKA 활성을 측정한 결과이다. 도 2a는 트리톤 X-100에 의한 온-칩 PKA 활성 분석의 용량-의존성 감도 강화를 나타내는 그래프이다. 도 2b는 0.01% 트리톤 X-100의 존재 또는 부재에서의, 인간 cPKA의 PKA 활성의 용량-의존적 증가를 나타내는 그래프이다. 도 2c는 검출한계 (Limit of detection; LOD)를 나타내는 그래프이다. 도 2d는 본 발명에 따른 PKA 활성 측정에서, 어레이 간의 재현성(inter-array reproducibility)을 실험한 결과이다. 도 2e는 본 발명에 따른 PKA 활성 측정에서, 스팟 간의 재현성(inter-spot reproducibility)을 실험한 결과이다. 도 2f는 PKI에 의한 PKA 활성의 용량-의존성 억제를 나타내는 그래프이다. 100 U/mL 인간 cPKA의 존재 하, PKI를 일정 농도로 포함하는 반응 혼합물을 펩타이드 어레이에 도포한 후, PKA 활성을 %로 나타냈다. 결과는 3 개의 독립적인 실험을 평균±SD로 표현하였다.
도 3은 정상 개체 및 암 환자로부터의 인간 혈청의 sPKA 활성을 측정한 결과이다. 정상개체(n=30) 및 간암 환자(n=30), 위암 환자(n=30), 폐암 환자(n=30), 및 대장암 환자(n=30)로부터의 인간 혈청(20-배 희석됨; n=150)을 포함하는 반응 혼합물을 펩타이드 어레이에 도포하였다. 150개의 혈청 샘플의 sPKA 활성을 상기 설명한 표준 곡선을 이용하여 결정하였다. 도 3a는 대표적인 형광 어레이 이미지를 나타낸다. 도 3b는 도 3a의 어레이 이미지로부터 만든 표준 곡선이다 (r2=0.99). 도 3c는 sPKA 활성의 분포를 박스 플롯에 나타낸 그래프이다. 박스는 sPKA 활성의 상한 및 하한 사분위수(the upper and lower quartiles)를 나타낸다. 각 박스의 수평선은 중앙값을 나타낸다.
도 4는 혈청학적 암 마커에 대한 sPKA 활성의 ROC 플롯을 나타낸다. 도 4a는 간암 환자(n=30), 위암 환자(n=30), 폐암 환자(n=30), 및 대장암 환자(n=30)에 대하여 ROC 분석을 수행한 후, 각 암에 대한 sPKA의 AUC 값, 감도 및 특이성을 ROC 곡선으로 나타낸 것이다. 도 4b에서 AUC와 컷오프 값은 암 환자(n=120)의 ROC 곡선으로부터 각각 0.966와 3.5 U/mL가 되도록 평가한 결과이다.
도 5는 cPKA 단백질 어레이를 사용한 sPKA자가 항체 분석의 최적화를 나타낸 그림이다. 도 5a는 sPKA자가 항체 분석의 개략도이다. 도 5b는 인간 cPKA를 일정 농도로 아민-개질(amine-modified)어레이에 위에 도포하고, 토끼 항-인간 cPKA(rabbit anti-human cPKA)와의 결합을 Alexa546-컨쥬게이티드 항-토끼 IgG(Alexa546-conjugated anti-rabbit IgG)를 사용하여 분석한 결과이다. 도 5c는 인간 cPKA을 활성화함으로써 항-인간 cPKA의 결합이 강화됨을 나타내는 그래프이다. 인간 cPKA 50㎍/mL를 PBS(비-활성화됨) 또는 활성 분석 완충액(활성화됨)과 함께 사전 배양(pre-incubating)하고, 웰-타입 아민 어레이에 60분 동안 도포하였다. 이어서 상기 어레이를 토끼 항-인간 cPKA(rabbit anti-human cPKA)의 일정 농도와 함께 배양하였고, Alexa546-컨쥬게이트된 항-토끼 IgG(Alexa546-conjugated anti-rabbit IgG)로 탐침하였다. 결과는 3 개의 독립적인 실험을 평균±SD로 표현하였다. 도 5d는 본 발명에 따른 sPKA 자가 항체 수준 측정에서, 어레이 간의 재현성(inter-array reproducibility)을 실험한 결과이다. 도 2e는 본 발명에 따른 PKA 활성 측정에서, 스팟 간의 재현성(inter-spot reproducibility)을 실험한 결과이다.
도 6은 정상 개체 및 네 종류의 암환자로부터의 인간 혈청에서의 혈청학적 PKA 자가 항체를 분석한 결과이다. 정상 개체(n=30), 및 간암 환자(n=30), 위암 환자(n=30), 폐암 환자(n=30) 및 대장암 환자(n=30)로부터의 인간 혈청(20배 희석됨)을 인간 cPKA 단백질 어레이에 도포하였다. sPKA 자가 항체를 검출하기 위해 얻어진 어레이를 Alexa546-컨쥬케이트된 항-인간 IgG와 함께 배양하였고, 형광 스캐너를 이용해 분석하였다. 도 6a는 정상그룹(n=30) 및 간암 환자(n=30), 위암 환자(n=30), 폐암 환자(n=30) 및 대장암 환자(n=30)로부터의 인간혈청에서의 sPKA 자가 항체 수준을 인간 cPKA 단백질 어레이를 이용하여 분석한 결과 얻어진 형광 어레이 이미지를 나타낸다. 도 6b에서 박스 부분은(in box plots) 인간 혈청에서의 sPKA 자기 항체의 분포를 나타낸다. 도 6c는 인간 혈청에서 sPKA 활성과 sPKA 자가 항체의 상관 관계를 나타낸다. 도 6d는 네 종류의 암에 대한 sPKA 자가 항체 분석의 ROC 플롯을 나타낸다.
본 발명은 암 바이오 마커로서의 PKA 활성에 대한 것으로, 구체적으로 PKA(protein kinase A) 활성을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물, 암 진단용 키트, 상기 암 진단용 조성물을 이용한 암 진단 방법 또는 암 진단을 위한 정보의 제공 방법 및 암 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이다.
본 발명자는 암의 바이오 마커로의 sPKA 활성을 평가하기 위해, 어레이 기반의 온-칩 PKA 활성 분석 방법으로, 간암, 위암, 폐암, 및 대장암 환자의 인간 혈청에서의 sPKA 활성을 정상개체의 혈청의 경우와 비교하였으며, 암 환자 그룹에서의 sPKA 활성이 유의적으로 높음을 실험적으로 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, PKA(protein kinase A) 활성을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물에 대한 것이다.
상기 PKA 활성을 측정하는 제제는 PKA와 반응하는 기질인 것이 바람직하며, PKA에 의해 인산화된다고 알려져 있는 단백질을 사용할 수 있는데, 특히, 켐타이드(kemptide), RelA (NF-kappa-B p65 subunit), RhoA (ras homolog gene family, member A; Rho family GTPase) 및 CREB (cAMP response element-binding protein) 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 암은 간암, 위암, 폐암, 대장암, 식도(Esophageal)암, 직장(rectal)암, 전립선(prostate)암, 흑색종(melanoma), 갑상선(thyroid)암, 지방육종(liposarcoma), 방광(bladder)암, 난소(ovarian)암 및 신장(renal)암 중 하나 이상일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서, PKA(protein kinase A) 활성 측정은, 상기 PKA와 반응하는 기질을 이용하여 PKA에 의한 기질의 반응 정도를 확인하는 과정일 수 있으며, 구체적으로 PKA에 의한 기질의 인산화 반응을 탐침하는 과정일 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로, 인산화기를 인식하는 항체를 이용하는 방법, 인산화기를 인식하는 화학물질을 이용하는 방법, 발광법 등을 사용 가능하며, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 인산화기를 인식하는 화학물질은 Zn2 +복합체 기반 비오틴화 인산 특이적 리간드(biotinylated phosphate-specific ligand based on Zn2 + complex)등의 분자 프로브일 수 있으며, 구체적으로 phostag 등일 수 있다.
또한, ELISA, 웨스턴 블롯, 유세포 분석법, 면역형광법, 면역조직화학법 또는 질량 분광법 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 암 진단용 조성물은, 그 목적에 따라 추가의 성분이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 암 진단용 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트에 대한 것이다. 바람직하게, 상기 암 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
일 예로, 본 발명의 실시예에서 실험한 내용과 같이, 암 진단용 키트로 고 효율(high-throughput)의, 온-칩 sPKA 활성 분석 어레이(on-chip sPKA activity array)를 사용할 수 있다. 상기 온-칩 sPKA 활성 분석 어레이는 PKA 기질 펩타이드 및 작은 분자 형광 인-센서를 이용한 것으로, 정량적으로 높은 감도, 재현성 및 비용 절감 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명은, 암 진단을 위한 정보의 제공 방법에 대한 것으로, 상기 암 진단용 조성물 또는 암 진단용 키트를 이용하는 것 일 수 있으며, 바람직하게는 다음의 단계를 포함할 수 있다:
암 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 PKA(protein kinase A) 활성을 측정하는 단계; 및 상기 PKA(protein kinase A) 활성을 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계.
상기 PKA 활성을 측정하는 제제, 상기 PKA와 반응하는 기질, 상기 암, 상기 PKA(protein kinase A) 활성을 측정에 대한 내용은, 앞서 암 진단용 조성물 또는 암 진단용 키트에서 설명한 내용과 동일하다.
상기 암 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료는, 혈액이나 혈청일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은, 암 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것으로, 상기 암 진단용 조성물 또는 암 진단용 키트를 이용하는 것 일 수 있으며, 바람직하게는 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) PKA(protein kinase A) 활성을 측정하는 제제를 포함하는 조성물에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 시료의 PKA 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 PKA 활성이 하향조절 되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 암 치료제임을 판별하는 단계.
상기 PKA 활성을 측정하는 제제, 상기 PKA와 반응하는 기질, 상기 암, 상기 PKA(protein kinase A) 활성을 측정에 대한 내용은, 앞서 암 진단용 조성물 또는 암 진단용 키트에서 설명한 내용과 동일하다.
상기 분석할 시료는, 암 치료나 예방, 암전이 억제에 영향을 미치거나, 암 치료나 예방, 암전이 억제에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 천연물 추출물, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 참조예 >
화학 시약
본 실험에서 사용된, 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-Aminopropyltrimethoxysilane), BSA, 인간 혈청 알부민, ATP 및 H89는 Sigma-Aldrich 사 (St. Louis, MO)로부터 입수하였다. 또한, PKA 펩타이드 억제제 (PKI) 및 cPKA는 각각 Biaffin GmbH & Co KG (Kassel, Germany)에서 구입하였다. N-[γ-maleimidobutyloxy]succinimide ester (GMBS) 는 Pierce (Rockford, IL)에서 입수했다. PKA 기질 펩타이드인 켐타이드(kemptide; C-G-G-L-R-R-A-S-L-G)는 Peptron (대전, 한국)에서 합성한 것을 사용하였다. 프로-Q 다이아몬드 인산화 단백질 젤 염색제(Pro-Q diamond phosphoprotein gel stain) 및 탈색액(destaining solution)은 Invitrogen 사 (캘리포니아 주 칼즈 배드) 에서 구입하였다. 폴리 (디메틸 실록산)(Poly(dimethylsiloxane); PDMS) 용액은 Sewang Hitech(김포, 한국)에서 입수했다.
혈청 샘플
정상적인 개체로부터 채취한 인간혈청샘플(n=30) 및 간암 환자(n=30), 위암 환자(n=30), 폐암 환자(n=30) 및 대장암 환자(n=30)로부터 채취한 샘플은, 강원 대학교 병원 바이오 뱅크 (국립 바이오 뱅크 코리아의 회원, 한국)에 의해 제공되었으며, 사용시까지 -80℃에서 저장되었다. 인간의 샘플을 이용한 실험은 인간 대상 연구를 위한 현지 연구소의 윤리위원회의 승인을 얻어 실시했다.
데이터 분석
형광 강도 및 데이터 추출의 정량화를 위해 ScanArray Express software가 사용되었다. Origin 6.0 software package (Origin Lab, Northampton, MA)을 사용하여 두 집단의 t-검정을 수행하였다. 0.05 미만의 p 값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주했다. AUC(area under curve), 감도 및 특이성을 계산하기 위하여 MedCalc statistical software 11.4.4.0 (Mariakerke, Belgium)을 사용하여 ROC(Receiver operating characteristics) 분석을 수행하였다.
< 실시예 1> 웰-타입 펩타이드 어레이의 제조 및 이를 이용한 PKA 활성 분석
실시예 1-1: 웰-타입 펩타이드 어레이의 제조
(1) PDMS 가스켓의 제조
5g의 PDMS 베이스 및 0.5g의 경화제를 거품이 가득할 때까지(cloudy with bubbles) 혼합하고 30 분간 실온에서 탈포하여, PDMS 프리폴리머(prepolymer) 용액을 제조하였다. 이 혼합물을 직경 1.5mm 와 0.3mm 높이로 폴(poles)이 배열된 크롬 코팅 구리 주형(아모그린텍, 김포 한국)에 부었다. 상기 주형을 84℃에서 90분 동안 배양한 후, 직경 1.5mm의 구멍이 배열된 PDMS 가스켓을 탈착하여, 사용시까지 투명한 필름상에 보관하였다.
(2) 웰-타입 펩타이드 어레이의 제조
알려진 방법에 따라(Jung JW, Jung SH, Yoo JO, Suh IB, Kim YM, Ha KS. Label-free and quantitative analysis of C-reactive protein in human sera by tagged-internal standard assay on antibody arrays. Biosens Bioelectron 2009; 24: 1469-73.), 아민-개질된(amine-modified) 유리 슬라이드를 준비했다. 즉, 유리 슬라이드(75×25mm)를 H2O2/NH4OH/H2O(1:1:5, v/v)를 사용하여 70℃에서 10분 동안 세척하였다. 상기 슬라이드를 1.5%의 3-aminopropyltrimethoxiysilane (v/v)이 첨가된 95 % 에탄올 용액에 2 시간 동안 침지하고, 110℃에서 소성하였다.
이와 같이 아민-개질된(amine-modified) 유리 슬라이드 위에 상기에서 제조된 PDMS 가스켓을 장착하여 웰-타입의 아민 어레이를 제조하였다. 아민 어레이를 50mmol/L sodium bicarbonate 버퍼(pH 7.0) 내 5mmol/L의 sulfo-GMBS 및 포스페이트 버퍼 내 10㎍/mL의 기질 펩타이드(8.1mmol/L Na2HPO4, 1.2mmol/L KH2PO4, pH 7.4)로 순차적으로 개질시켜 웰-타입의 아민 어레이를 제작하였다. sulfo-GMBS 의 N-hydroxysuccinimidyl ester 및 maleimide 모이어티는 각각 어레이의 아민-개질된(amine-modified) 유리 표면 및 각 기질 펩타이드의 시스테인 잔기에 결합한다.
실시예 1-2: 웰-타입 펩타이드 어레이를 사용한 PKA 활성 분석
(1) 형광 기반의 펩타이드 어레이를 사용하여 온-칩 PKA 활성 분석
도 1a는 온-칩 PKA 활성 분석의 개략도를 나타낸다(GMBS, N-[γ-maleimidobutyryloxy]sulfosuccinimide ester; Ser, serine; Cys, cysteine). 도 1a에 나타낸 바와 같이, 프로-Q 다이아몬드 염색제(pro-Q diamond stain)를 사용하여 웰-타입 펩타이드 어레이 상에서 PKA 활성 분석을 수행하였다.
구체적으로, 펩타이드 어레이를 0.1% Tween-20를 함유하는 TBS(13.8mmol/L NaCl 및 2mmol/L Tris-HCl, pH7.4) 내의 1% BSA로 37℃에서 30분 동안 블락한 후, 0.1% Tween-20를 함유하는 TBS 및 milli-Q water로 잇달아 세척하였다. 활성분석 버퍼(50mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 0.5 mmol/L MgCl2, 0.01% Triton X-100, 500umol/L ATP 및 0.2% 인간혈청알부민) 및 희석 혈청(20-배)의 반응 혼합물 1마이크로 리터(microliter)를, 각각 2umol/L PKI 존재 또는 부존재 하에서, 펩타이드 어레이에 도포하고, 30℃에서 90분 동안 배양하였다. 한편, PKA 활성의 정량적 측정을 위한 표준 곡선을 제작하기 위하여, 다양한 농도의 cPKA를 함유하는 반응 혼합물을 펩타이드 어레이에 도포하였다.
프로-Q 다이아몬드 염색제(pro-Q diamond stain)와 함께 상온에서 60분 동안 배양하여 펩타이드 기질의 인산화된 세린 잔기를 탐침하였다. 탈색액으로 어레이를 15분 동안 두번 세척한 후 milli-Q water로 5분 동안 두번 세척하였다. 얻어진 어레이를 543 nm의 레이저를 사용하는 형광스캐너 (fluorescence scanner)(ScanArray Express GX, Perkin Elmer, Waltham, MA)를 사용하여 스캔하고, 측정된 어레이 스팟의 형광강도를 PKA 활성을 결정하는데 사용하였다.
(2) PKA 활성의 결정
PKA 활성의 정량적 측정을 위해, 오리진 프로그램(origin program)의 선형 피팅(linear fit)으로 구성된 표준 곡선을 작성했다:
y = ax + b
상기 식에서, y는 어레이 표면 상의 시료의 형광 강도이며, a 및 b는 각각 표준 곡선의 선형 피팅의 기울기와 절편이며, x는 PKA 활성이다. 혈청 시료 중의 PKA 활성은 PKI 부존재 및 PKI 존재 하의 PKA 활성의 차이로부터 계산되어, U/mL 로 표시하였다.
(3) 형광 기반의 펩타이드 어레이를 사용한 온-칩 sPKA 활성 분석의 최적화
도 1a에 나타낸 바와 같이, 프로-Q 다이아몬드 인광체-센서(pro-Q diamond phosphor-sensor)를 사용하여 인간 혈청 시료 중 sPKA 활성을 분석하기 위한 고감도 정량 분석을 수행하였다.
PKA 활성 분석을 최적화하기 위해, 다양한 농도의 켐타이드(kemptide), MgCl2 및 ATP를 포함하는 반응 혼합물을 GMBS-개질된 웰-타입 어레이에 도포하였다. 구체적으로, 다양한 농도의 켐타이드(kemptide), MgCl2 및 ATP를 반응 버퍼 내의 100 U/mL 인간 cPKA와 혼합하여 반응 혼합물을 제조한 후, 웰-타입 펩타이드 어레이에 도포하였다. 또한, 10㎍/mL 펩타이드, 0.5 mmol/L MgCl2, 0.5 mmol/L ATP 및 100 U/mL 인간 cPKA를 포함하는 반응 혼합물 1 마이크로 리터(microliter)를 펩타이드 어레이에 도포하고, 일정 시간 동안 배양하였다.
상기에서 설명한 바와 같은 방법으로 어레이 스팟의 형광강도를 측정하여 PKA 활성을 결정하여 그 결과를 3 개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표현하여 도 1 b 내지 도 1e에 나타내었다. 도 1b에 나타난 바와 같이, 형광강도로 표시되는 PKA 활성은 켐타이드(kemptide)에 의해 농도-의존적으로 증가되며, 10㎍/mL에서 최고 효과(maximal effect)를 나타낸다. MgCl2 역시 용량-의존적으로 PKA 활성을 촉진하며, 0.5mmol/L에서 포화된다(saturation)(도 1c). ATP는 PKA 활성을 용량-의존적으로 증가시키며, 0.5mmol/L에서 최대자극(maximal stimulation)을 나타낸다 (도 1d). PKA 활성은 또한 시간 의존적 (도 1e) 로 증가했다.
(4) 트리톤 X - 100 에 의한 온-칩 PKA 활성 분석의 감도 향상 및 PKA 활성 분석 특성화
트리톤 X-100이 온-칩 PKA 활성 분석 감도를 높일 수 있는지 여부를 시험하였다. 도 2a 내지 도 2c는 트리톤 X-100 및 100 U/mL 인간 cPKA를 일정 농도로 함유하는 반응 혼합물을 30℃에서 90분간 펩타이드 배열에 로드한 후, 상기에서 설명한 바와 같은 방법으로 PKA 활성을 측정한 결과이다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 트리톤 X-100은 PKA 활성을 용량 의존적으로 증가시켰으며, 0.001%에서 명백한 활성화를 나타내었으며, 0.01%에서 포화되었다. 그 후, 트리톤 X-100의 존재 또는 부재 하에서, 일정농도의 cPKA를 포함하는 반응 혼합물의 PKA 활성을 분석하여 PKA 활성 분석의 감도에 대한 트리톤 X-100의 효과를 분석하였다 (도 2b 및 c). 트리톤 X-100은 PKA 활성의 용량 의존적 증가를 촉진시켰다. PKA 활성 분석의 검출 한계는 0.01% 트리톤 X-100에 의해 1.45에서 0.01U/mL로 향상되었으며, 이는 PKA 활성 분석이 트리톤 X-100에 의해 강화됨을 입증하는 것이다.
인간 혈청(n=150)을 사용하여 어레이 간의 재현성(inter-array reproducibility) 및 스팟 간의 재현성(inter-spot reproducibility)을 분석하여 온-칩 PKA 활성 분석의 재현성을 평가하였다.
어레이 간의 재현성(inter-array reproducibility)은 서로 다른 어레이상에 반응 혼합물의 동일한 배치를 분석하여 결정되었다. 실험 결과를 도 2d에 나타내었다. 도 2d를 참고하면, 0.990의 평균 상관 계수 (n=3, CV=0.7%)로, 어레이 간의 재현성이 높은 것으로 나타났다. 스팟 간의 재현성(inter-spot reproducibility)은 20개의 중복된 스팟을 분석 하여 결정하였고, 이를 도 2e에 나타내었다. 변이의 평균 계수는 2.2%인 것으로 나타났다(n=3). 정리하면, 이러한 결과는 온-칩 PKA 활성 분석은 높은 재현성이 있다는 것을 입증하고 있다.
다음으로, PKA 특이적 억제제인 PKI의 온-칩 PKA 활성 분석에 대한 저해 효과를 분석 했다. 도 2f는 PKI에 의한 PKA 활성의 용량-의존성 억제를 나타내는 그래프이다. 100 U/mL 인간 cPKA의 존재 하, PKI를 일정 농도로 포함하는 반응 혼합물을 펩타이드 어레이에 도포한 후, PKA 활성을 %로 나타냈다. 결과는 3개의 독립적인 실험을 평균±SD로 표현하였다. 도 2f에 나타낸 바와 같이, 100 U/ml의 cPKA 를 사용한 경우, PKI는 PKA 활성을 용량-의존적으로 억제하였으며, 최대 효과(maximal effect)는 0.5uM에서 나타났다. PKI의 PKA 활성 분석에 대한 (IC50: half maximal inhibitory concentration)는 4.3nM로 계산되었다. 이러한 결과는 인간 혈액 시료 중의 특정 sPKA 활성은 PKI를 사용하여 결정될 수 있으며, 온-칩 PKA 활성 분석은 PKA 억제제를 스크리닝하기 위한 적절한 수단일 수 있다는 것을 나타낸다.
(5) 정상 개체 및 4종류의 암환자로부터의 인간 혈청의 sPKA 활성 측정
암 바이오 마커로의 sPKA 활성을 평가하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 정상개체(n=30) 및 간암 환자(n=30), 위암 환자(n=30), 폐암 환자(n=30) 및 대장암 환자(n=30)로부터의 인간 혈청의 sPKA 활성을 결정하기 위해 온-칩 활성 분석을 수행하였다. 여러 농도의 cPKA와 희석된 인간 혈청을 포함하는 반응 혼합물을 펩타이드 어레이에 도포하고, 켐타이드(kemptide)의 인산화된 세린을 프로-Q 다이아몬드 염색제(pro-Q diamond stain)를 사용하여 탐침하였다. sPKA 활성을 cPKA의 형광 강도로부터 제작된 표준 곡선을 이용하여 측정하였다 (도 3a 와 b). 도 3a는 대표적인 형광 어레이 이미지를 나타내며, 도 3b는 도 3a의 어레이 이미지로부터 만든 표준 곡선이다 (r2 =0.99).
다른 키나아제의 비특이적 신호를 제외하기 위해, 0.5uM PKI 부존재하의 sPKA 활성으로부터 PKI 존재하의 sPKA 활성을 감하여, 인간 혈청 sPKA 활성을 결정하였고, 이를 박스 플롯에 나타내었다(도 3c). 도 3c는 sPKA 활성의 분포를 박스 플롯에 나타낸 그래프이다. 박스는 sPKA 활성의 상한 및 하한 사분위수(the upper and lower quartiles)를 나타낸다. 각 박스의 수평선은 중앙값을 나타낸다. 정상 및 간, 위, 폐 및 대장암 환자 그룹의 평균 sPKA 활성은 각각 1.78±1.09, 8.92±8.72, 8.96±6.53, 9.06±7.50 및 10.94±9.34 U/mL이었으며, 모든 암 환자 그룹에서의 sPKA 활성은 정상 그룹에 비해 훨씬 높았다(p<10-4). 이러한 결과는 온-칩 PKA 활성 분석은 인간 혈청의 sPKA 활성을 결정하는 데 적합함을 입증하는 것이며, sPKA 활성은 암 진단을 위한 바이오 마커로 사용할 수 있음을 시사한다.
암 바이오 마커로의 sPKA 활성을 평가하기 위하여, 네가지 유형의 암에 대하여 상기 방법에 따라 온-칩 활성 분석을 수행하였고, ROC 분석을 실시했다(도 4a). 도 4a는 간암 환자(n=30), 위암 환자(n=30), 폐암 환자(n=30), 및 대장암 환자(n=30)에 대하여 ROC 분석을 수행한 후, 각 암에 대한 sPKA의 AUC 값, 감도 및 특이성을 ROC 곡선으로 나타낸 것이다. 네 가지 유형의 암에서 얻은 sPKA 활성 감도 및 특이성은 다음과 같다: 간암(83.3% 및 90.0%), 위암(96.7% 및 90%), 폐암(90.0% 및 90.0%), 대장암(90.0% 및 90.0%).
또한, 각각 다음과 같이 높은 AUC 값을 나타내었다: 0.939(95% 신뢰 구간, 0.85-0.98), 0.980(95% 신뢰 구간, 0.91-0.99), 0.970(95% 신뢰 구간, 0.89-0.99) 및 0.974(95% 신뢰 구간, 0.90-0.99).
도 4b에서 AUC와 컷오프 값은 암 환자 (n=120)의 ROC 곡선으로부터 각각 0.966와 3.5 U/mL가 되도록 평가한 결과이다. 총 암 환자에 대한 sPKA 활성 분석은 90.0%의 감도와 90.0%의 특이성을 나타냈으며, 특히, 0.966(95% 신뢰 구간, 0.92-0.98)의 AUC 값 및 3.5 U/mL의 컷오프 값을 나타내었으며, 이는 기존 보고치보다 높은 값이다. 이러한 결과는 sPKA 활성이 암 진단을 위한 잠재적인 바이오 마커 임을 보여 주고 있다.
결론적으로, 간암, 위암, 폐암, 및 대장암 환자의 인간 혈청에서의 sPKA 활성은 대조군 보다 훨씬 높았다. 그러나 암과 정상군에서 sPKA 자가 항체의 유의 한 차이는 없었다. 또한 인간 혈청에서, sPKA 활성은 sPKA 자가 항체 수준과 상관관계가 없는 것으로 나타났다. 따라서, sPKA 자가 항체 보다 sPKA 활성이 암의 진단을 위한 바이오 마커로 적절한 것으로 판단된다. 또한 온칩 sPKA 활성 분석은 암 진단을 위한 효과적인 방법이고, 억제제 스크리닝 및 PKA 관련 인간 질환에 대한 매우 큰 잠재력이 있는 것으로 보인다.
< 비교예 1> cPKA 단백질 어레이의 제조 및 이를 이용한 인간 혈청 sPKA 자가 항체 수준분석
(1) 인간 cPKA 단백질 어레이의 제작 및 인간 혈청 시료 중의 sPKA 자가 항체 분석
도 5a는 sPKA 자가 항체 분석의 개략도이다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, 인간 혈청 sPKA 자가 항체 수준을 cPKA 단백질 어레이를 이용하여 분석하였다. 인간 cPKA 단백질 어레이를 제작하기 위해, 다양한 농도의 인간 cPKA를 얼음상(on ice) PBS (8.1mmol/L Na2HPO4, 1.2mmol/L KH2PO4, pH7.4, 2.7mmol/L KCl, 및 138mmol/L NaCl; 비-활성화됨) 또는 활성 분석 버퍼(활성화 됨) 내에 준비하고, 60분 동안 37 ℃에서 웰-타입 아민 어레이에 도포했다. 얻어진 어레이를 순차적으로 0.1% Tween-20(PBST)을 함유하는 PBS로 10분간 세척한 후, milli-Q water로 5분간 세척하였다. PBST 내의 1% BSA를 사용하여 어레이를 60분 동안 37℃에서 차단하였다. 0.05% Tween-20를 포함하는 PBS 내의 토끼 항-인간 PKA(rabbit anti-human PKA) 또는 20-배 희석된 인간 혈청을 일정 농도로 인간 cPKA 어레이에 37℃에서 60분 동안 도포하고, 0.05% Tween-20 및 1% BSA를 포함하는 PBS 내에서 10 g/mL의 Alexa546-컨쥬게이티드 항-토끼 IgG(Alexa546-conjugated anti-rabbit IgG) 또는 항-인간IgG(anti-human IgG)를 각각 사용하여 60분 동안 37 ℃에서 탐침하였다. 어레이를 PBST를 사용하여 10분 동안 세척한 후, milli-Q water를 사용하여 5분 동안 세척하고, 공기 중에서 건조시켰다. 그 후, 543nm 레이저를 사용하는 형광스캐너 (fluorescence scanner)로 상기 어레이를 스캔하였다.
(2) cPKA 단백질 어레이를 이용한 혈청 학적 PKA 자가 항체 분석 최적화
sPKA 자가 항체 분석을 최적화하기 위해, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 상기 웰-타입 어레이 아민 표면에 인간 cPKA의 일정 농도를 고정화하여 단백질 어레이를 제작하고, 토끼 항-인간 cPKA를 포함하는 반응 혼합물을 cPKA 단백질 어레이에 도포하였다. 토끼 항-인간 cPKA(rabbit anti-human cPKA)와의 결합은 Alexa546-컨쥬게이티드 항-토끼 IgG(Alexa546-conjugated anti-rabbit IgG)로 탐침하여 분석하였다. 도 5b는 인간 cPKA를 일정 농도로 아민-개질(amine-modified)어레이에 위에 도포하고, 토끼 항-인간 cPKA(rabbit anti-human cPKA)와의 결합을 Alexa546-컨쥬게이티드 항-토끼 IgG(Alexa546-conjugated anti-rabbit IgG)를 사용하여 분석한 결과이다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, 인간 cPKA는 항-인간 cPKA의 결합을 용량 의존적으로 증가시켰으며, 50㎍/mL에서 포화되었다(saturation).
다음으로, 활성 분석 완충액으로의 인간 cPKA의 활성화가 항 인간 cPKA의 cPKA에 대한 결합 친화성을 향상시킬 수 있는지 여부를 시험하였다. PBS(비-활성화됨) 또는 활성 분석 완충액(활성화됨)으로 사전 배양(pre-incubating) 후, 인간 cPKA를 웰-타입 아민 어레이 위에 고정화하였고 항-인간 cPKA의 결합을 분석하였다. 도 5c는 인간 cPKA을 활성화함으로써 항-인간 cPKA의 결합이 강화됨을 나타내는 그래프이다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, cPKA의 활성화는 항-인간 cPKA와 그 항원과의 결합을 크게 강화했다. 또한, 두 조건 모두에서 항-인간 cPKA와 인간 cPKA 단백질 어레이의 결합은 그 항체의 농도에 40㎍/mL까지 선형으로 비례했다.
또한 상기 온-칩 PKA 분석의 재현성을 분석하기 위해, 동일한 방법을 사용하여 어레이 간의 재현성(inter-array reproducibility) 및 스팟 간의 재현성(inter-spot reproducibility)을 시험함으로, 인간 혈청(n=150)을 이용한 온-칩 sPKA 자기 항체 분석 재현성을 평가하여 도 5d에 나타내었다. 실험결과, 상관 계수의 평균값(n=3의 CV=0.7%)이 0.954로, 어레이 간의 재현성(inter-array reproducibility)이 높음을 밝혀냈다. 또한, 스팟 간의 재현성(inter-spot reproducibility)을 평가하여 도 5e에 나타내었으며, 5.0%(n=3)의 변동 계수로 평가되었다. 이러한 결과는 인간 cPKA 단백질 어레이를 이용한 sPKA 자가 항체 분석은 인간 혈청의 항-cPKA 분석에 적합함을 나타낸다.
(3) 인간 혈청 샘플에서의 sPKA 자가 항체 수준 및 sPKA 활성과의 상관관계 분석
암 바이오 마커로서의 PKA 자가 항체를 평가하기 위해, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 정상그룹(n=30) 및 간암 환자(n=30), 위암 환자(n=30), 폐암 환자(n=30) 및 대장암 환자 (n=30)로부터의 인간혈청에서의 sPKA 자가 항체 수준을 인간 cPKA 단백질 어레이를 이용하여 분석했으며(도 6a), 이는 sPKA 활성 분석에 이용되었다. 도 6b에서 박스 부분 내(in box plots) 인간 혈청에서의 sPKA 자기 항체의 분포를 나타낸다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 정상 그룹과 네개의 암 그룹 사이에 PKA 자가 항체 수준의 유의적 차이는 없었으며(p>0.05), 이는 PKA 자가 항체 수준은 암 진단을 위한 좋은 바이오마커가 아님을 나타낸다.
또한, 정상 세포와 암 환자의 혈청 내에 sPKA 활성 및 PKA의 자가 항체 수준 사이의 상관 계수를 분석했다. 도 6c는 인간 혈청에서 sPKA 활성과 sPKA 자가 항체의 상관 관계를 나타낸다. sPKA 활성의 분포는 PKA의 자가 항체 수준의 분포와 상관 하지 않았다, 정상적인 개체 및 암 환자에 대한 R은 각각 0.17 및 -0.11로 나타났다(도 6c). 또한, 도 6d는 네 종류의 암에 대한 sPKA 자가 항체 분석의 ROC 플롯을 나타낸다. 각 암에 대한 AUC 값, 감도(sensitivity), 특이성(specificity)이 표에 기재되어 있다. sPKA 자가 항체의 AUC 값은 0.698 (간, 감도; 86.7%, 특이성; 60.0%), 0.526 (위, 감도; 66.7%, 특이성; 46.7%), 0.544 (폐, 감도; 56.7%, 특이성; 60.0%), 및 0.659 (대장, 감도; 76.6%, 특이성; 60.0%)로, sPKA 활성(도 6d)의 값보다 훨씬 낮았다. 총 암 환자(n=120) 에 대한 AUC 값은 0.607, 감도는 68.3%, 특이성은 60.0%를 나타내어, sPKA 활성(도 6d)의 값 보다 훨씬 낮았다.
따라서, 이러한 결과는 sPKA 자가 항체 수준은 sPKA 활성과 비교하여 암 진단을 위한 우수한 바이오 마커가 아님을 입증한다.
또한, 자가 항체 분석을 통해 단백질 키나아제를 분석하는 비교예 1의 방법에 비해, 단백질 키나아제(protein kinase)와 반응하는 기질의 인산화 반응을 측정하는 본원 발명의 단백질 키나아제 활성 측정 방법이, 비교적 고감도이며, 조작되기 쉬울 뿐 아니라, 경제적으로 단백질 키나아제 활성을 측정할 수 있음을 확인하였다.

Claims (12)

  1. PKA(protein kinase A) 활성을 측정하는 제제로써 켐타이드(kemptide), 기판 및 상기 켐타이드와 기판을 연결하는 링커로써 GMBS(N-[γ-maleimidobutyryloxy]sulfosuccinimide ester)를 포함하는, 암 진단용 키트.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 PKA 활성을 측정하는 제제는 PKA와 반응하는 기질인 것인, 암 진단용 키트.
  3. 청구항 1에 있어서,
    폴리 디메틸 실록산(Poly(dimethylsiloxane); PDMS)을 이용하여 제조된 가스켓이 장착된 것인, 암 진단용 키트.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 암은 간암, 위암, 폐암, 대장암, 식도(Esophageal)암, 직장(rectal)암, 전립선(prostate)암, 흑색종(melanoma) 및 갑상선(thyroid) 중 하나 이상인, 암 진단용 키트.
  5. 암 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 PKA(protein kinase A) 활성을 측정하는 단계; 및
    상기 PKA(protein kinase A) 활성을 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 PKA(protein kinase A) 활성은 청구항 1의 키트를 사용하여 측정하는 것인,
    암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  6. 삭제
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 암은 간암, 위암, 폐암, 대장암, 식도(Esophageal)암, 직장(rectal)암, 전립선(prostate)암, 흑색종(melanoma) 및 갑상선(thyroid) 중 하나 이상인, 암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  8. (a) PKA(protein kinase A) 활성을 측정하는 제제를 포함하는 조성물에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 시료의 PKA 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 PKA 활성이 하향조절 되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 암 치료제임을 판별하는 단계를 포함하며,
    상기 PKA(protein kinase A) 활성은 청구항 1의 키트를 사용하여 측정하는 것인,
    암 치료제의 스크리닝 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 PKA 활성을 측정하는 제제는 PKA와 반응하는 기질인 것인, 암 치료제의 스크리닝 방법.
  10. 삭제
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 암은 간암, 위암, 폐암, 대장암, 식도(Esophageal)암, 직장(rectal)암, 전립선(prostate)암, 흑색종(melanoma) 및 갑상선(thyroid) 중 하나 이상인, 암 치료제의 스크리닝 방법.
  12. 청구항 1에 있어서,
    트리톤 X -100 (Triton X-100)을 더 포함하는, 암 진단용 키트.

KR1020140026755A 2014-03-06 2014-03-06 Pka 활성을 이용한 암 진단용 조성물 및 암 전이 진단을 위한 정보제공 방법 KR101451227B1 (ko)

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