KR100377378B1 - 세포외 사이클릭 아데노신 모노포스페이트-의존성 프로테인 카인나아제를 이용한 extraPKA의 정량방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포외 사이클릭 아데노신 모노포스페이트-의존성 프로테인 카인나제를 이용한 정량방법에 관한 것으로 본 발명은 혈청을 비롯한 체액에서 세포외 프로테인 카인나제 A(extracellular protein kinase A; extraPKA)의 활성을 측정하여 유방암을 비롯한 각종 호발성암을 조기에 진단하는 뛰어난 효과가 있고 치료에 따른 예후를 판정하고 표적 암세포에서 PKA-Ⅱ로부터 유래하는 RⅡβ아형을 억제시켜 extraPKA량을 조절하므로써 효과적으로 암을 치료하는 뛰어난 효과가 있으므로 난치병으로 알려진 인류의 내과적 질병인 암을 초기에 신속하고 정확하게 진단하며 그 예후 및 치료 효과가 있다.

Description

세포외 사이클릭 아데노신 모노포스페이트-의존성 프로테인 카인나제를 이용한 extraPKA의 정량방법{Extracellular cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase in the diagnosis and prognosis}

본 발명은 세포외 사이클릭 아데노신 모노포스페이트-의존성 프로테인 카인나제를 이용한 extraPKA의 정량방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 환자의 혈액으로부터 혈청 또는 소변내의 세포외 프로테인 카인나제 A (extracellular protein kinase A; extraPKA)의 농도를 측정하는 extraPKA의 정량방법에 관한 것이다.

동물세포로부터 분비되는 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)는 카테콜아민으로 자극된 비둘기의 적혈구에서 밝혀졌다(Davoren & Sutherland, J. Biol. Chem. 238, 3009-3015, 1963). 그 후 여러 조직(tissue), 배양세포 및 점액균(Dictyostelium discoideum)을 비롯한 세균 등 하등생물체에서 cAMP의 분비 기전이 보고되었다(Barber & Butcher, In Advances in Cyclic Nucleotides Research, Greengard et al., eds., pp. 119-138, Raven Press, N.Y., 1983). 그러나 cAMP의 생리적인 역할은 하등생물체에서 부분적으로 알려졌다. 즉,D. discoideum에서 화학주성(chemotaxis)과 세포분화는 세포외 cAMP의 자극에 의해서 조절된다(Darmon et al., PNAS, USA, 72, 3163-3166, 1975). 이와 같은 사실은 화학주성과 cAMP 신호가 세포 표면에 있는 특별한 cAMP 결합 수용체 단백질에 의해서 매개된다는 것이다(Theibert et al., J. Biol. Chem. 250, 1218-12381, 1983).

세포외 cAMP의 기능에 대해서도 아직까지 잘 알려져 있지 않으나, 어떤 조건하에서 세포외 cAMP가 계속적으로 축적되면, cAMP의 생산과 세포손상에 있어 다양한 약품에 영향을 받는 것으로 알려졌다(Broadus et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 185, 50-66, 1971). 그러나 세포로부터 cAMP의 유출은 세포의 파괴에 의해서만 설명될 수 없다. 조류의 적혈구와 배양된 포유동물의 세포에서 cAMP는 능동수송(active transport)을 하는 에너지-의존성 기전에 의해 방출됨이 알려졌다(Davoren & Sutherland, J. Biol. Chem. 238, 3009-3015, 1963; Rindler et al., J. Biol. Chem. 253, 5431-5436, 1978; Barber & Butcher, In Advances inCyclic Nucleotides Research, Greengard et al., eds., pp. 119-138, Raven Press, NY, 1983). 일련의 약리학적이고 호르몬적인 약품은 이러한 과정에 의해서 억제된다(Rindler et al., J. Biol. Chem. 253, 5431-5436, 1978; Heasley & Brunton, J. Biol. Chem. 260, 11514-11519, 1985). 이러한 작용중 어떤 것은 아데닐레이트 사이클라제 또는 세포내 ATP량의 변화와 전혀 관계없이 일어나기도 한다(Rindler et al., J. Biol. Chem. 253, 5431-5436, 1978).

포유동물 세포에서 cAMP의 효과는 cAMP-의존성 프로테인 카인나제(cAMP-dependent protein kinase, PKA)에 의해 주로 매개되기 때문에 세포로부터 방출된 cAMP는 cAMP-의존 즉, ecto-PKA라 불리(Krebs & Beavo, Ann. Rev. Biochem. 48, 923-939, 1979)는 세포표면에 위치되어 있는 단백질 카인나제를 조절하는데 있어 생리학적으로 중요한 역할을 할 수 있다. 더욱이 세포표면에 있는 PKA는 세포운동(cell motility), 세포부착(cell adhesion), 세포와 세포 상호작용(cell-cell interaction) 또는 외부 신호전달에 의한 세포수용 및 변환 등에 중요한 역할을 한다.

인간의 직장암 세포(colon carcinoma cell)주인 LS-174 세포외 표면에 PKA가 존재한다는 사실이 최근 밝혀졌다(Kondrashin et al., Biochemistry 38, 172-179, 1999). 이러한 ecto-PKA는 세포내 가용성 PKA(intracellular soluble PKA)와 면역학적으로 관련된어 있다는 사실이 알려졌다. ecto-PKA는 PKA의 합성 펩타이드 기질인 킴타이드(kemptide)을 인산화하는데 있어서 cAMP에 의해 자극되고, PKA를 억제하는 PKI (PKA inhibitory protein)에 의해서 특별히 억제된다는 사실이 알려졌다.ecto-PKA를 활성화하기 위한 cAMP의 근원은 포스콜린(forskolin) 처리 후 cAMP 분비에 따라 세포내 근원으로부터 나온다는 것이 알려졌다. cAMP 분비를 억제하는 프로베네사이드(probenecid)는 포스콜린이 매개하는 ecto-PKA 활성을 차단한다.

포유동물 세포에서 PKA의 구조는 C 아단위(subunit)을 공유하지만 R 아단위에 있어서 RI의 구조를 가지는 type I PKA(PKA-I)과 RⅡ의 구조를 가지는 type Ⅱ(PKA-Ⅱ) 등 두가지 다른 구조가 밝혀졌다( Beebe & Corbin, In The Enzymes: Control by Phosphorylation 17, 43-111, Acadmic Press, NY, 1986). R 아단위는 생화학적인 연구와 유전자 클론방법으로 4가지 다른 이형구조인 RIα, RIβ, RⅡα 및 RⅡβ 등으로 밝혀졌다(McKnight et al., Recent Prog. Horm. Res. 44, 307-335, 1988; Levy et al., Molec. Endocrinol. 2, 1364-1373, 1988). Cα, Cβ 및 Cγ 등으로 분명히 구분되는 C 아단위의 구조도 밝혀졌으나(Uhler et al., PNAS, USA, 83, 1300-13004, 1986a; Uhler et al., J. Biol. Chem. 261, 15360-15363, 1986b), 4가지 다른 R 아단위중 어느 하나와 이들 C 아단위중 하나와의 우선적으로 상호발현은 아직까지 밝혀지지 않았다(Showers & Maurer, 1986; Beebe et al., 1990). 중요하게도 RI/PKA-I과 RⅡ/PKA-Ⅱ의 발현은 개체발생과 세포분화가 이루어지는 동안 반비례 관계가 있는 것으로 알려졌다(Lohmann & Walter, In Advances in Cyclic Nucleotide and Protein Phosphorylation Research, 18, 63-117, Greengard and Robison, eds., Raven Press, NY, 1984; Cho-chung, Cancer Res. 50, 7093-7100, 1990).

화학 발암물질 또는 바이러스 발암물질과 Ki-ras 또는 형질전환 성장인자transforming growth factor-α로 처리하여 형질을 변형한 세포와 과립백혈구-대식세포 집락 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) 또는 포볼에스터(phorbol ester)로 자극한 세포에서 정상세포와 비교하여 RIα/PKA가 매우 높게 발현되었으며, 암세포주와 암조직에서도 RIα/PKA가 높게 발현되었다(Cho-chung, Cancer Res. 50, 7093-7100, 1990; Miller et al., Eur. J. Cancer 29A(7), 989-991, 1993). 대조적으로 인체의 여러 암세포주에서 부위 선택적인 cAMP 유도체에 의해 유도된 성장억제와 관련한 결과는 RIα/PKA-I의 발현이 감소된다는 사실이 보고 되었다(Cho-Chung et al., Cancer Inv. 7, 161-177, 1989).

세포표면은 세포와 세포 전달(cell-cell communication)과 세포 성장의 조절과 관련된 신호전달의 변형을 포함하는 일련의 세포 신호전달인 많은 세포내 기능에 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 이러한 조절은 세포표면으로부터 빠른 전환 분비 단백질과 같이 억제조절 또는 인산화작용과 같은 단백질의 변형에 의한 수용체 분자와 ecto-효소을 경유하여 매개된다.

암은 내과적 질병에서 인류역사상 가장 무서운 질병이라는 사실이고 이러한 이유에서 암을 조기에 정확하게 진단할 수 있는 방법이 확립된다면 현대 생물학의 발전과 더불어 발전된 의학 치료법을 감안한 다면 손쉽게 치료될수 있는 질병중에 하나가 될 것이다. 그러나 불행하게도 지금까지 알려진 암진단 및 예후 판정 분자는 비특이적 반응이 빈번히 일어나 정상인과 암환자를 구별하는 진단의 물질로 사용하는데 문제점이 많았다. 특히 기존의 암진단 분자는 조기에 진단할 수 있는 방법을 제공하지 못했다. 예컨데 난소암을 진단하는 현행 방법은 난소암과 관련있는 태반성 알칼라인 포스파타제(placental alkaline phosphatase)와 다형상피세포뮤신(polymorphic epithelial mucin)과 같은 단백질을 조사하는 방법이다. 그러나 이들 표지(marker)는 전이성 암이 만년되어 치료가 불가능한 상태의 여성에 국한되어 이용되었다.

또한 호르몬 의존성 유방암을 결정하는 현행 방법은 생체조직 검사와 에스트로겐과 또는 프로게스테론과 같은 호르몬이 암조직에 존재하는지를 실험을 통해 확인해야 하는데, 이러한 방법은 단일클론항체을 이용한 면역조직화학 염색 또는 덱스트란이 피복된 차콜(dextran coated charcoal)과 같은 생화학적 검사에 의해서 조사되었으며 이와 같은 방법은 암 발생에 대한 음성 대조군과 양성 대조군의 변이의 폭이 30 ~ 40%이내에 있어 정확하게 암 진단을 하는데 있어서 뚜렷하지 않고, 호르몬 의존성 암을 판정할 때 에스트로겐과 또는 프로게스테론 수용체를 알아보기위해서는 많은 수의 세포가 필요하며, 생체 조직검사가 동시에 이루어져야 하기 때문에 많은 단점이 있었다.

본 발명자들은 세포성장에 대한 조절 기능의 소실로 나타나는 변형세포에 extraPKA가 존재하며 더욱이 extraPKA가 호르몬 의존성 유방암에 특이적으로 존재한다는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명자들은 extraPKA를 정량하여 암진단 및 예후를 정확히 판단할 뿐만 아니라 호르몬 의존성 또는 비의존성 유방암인지를 정확히 구별하여 진단할 수 있음을 확인하므로써 본 발명을 완성하였다.

유방암이 호르몬 의존성 인지 또는 비의존성 인지의 결정은 질병에 대한sclfy 전략과 예후를 판단하는데 있어 매우 중요하며 예컨대 유방암이 호르몬에 의존하여 발생했다면 항-에스트로겐 시약 또는 난소의 기능을 파괴 또는 제거를 통한 호르몬 치료법을 선택할 수 있고 호르몬에 비의존되어 발생했다면 화학요법에 의한 약을 선택하여 치료할 수 있을 것이다. 더욱이 원발성 종양에 있어서 에스트로겐의 수용체의 부재는 재발율이 높고 생존율이 매우 짧다.

본 발명의 목적은 혈액내 혈청으로부터 세포외 프로테인 카인나제 A(extracellular protein kinase A;extraPKA)의 농도를 측정하여 유방암을 비롯한 각종 호발성 암의 진단방법을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 암의 예후 판단용 암진단 분자를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 표적 암세포에서 PKA-Ⅱ로부터 유래하는 RⅡβ아형을 억제시켜 extraPKA량을 조절하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 환자의 혈액으로부터 혈청을 분리한 다음 혈청내의 extraPKA의 농도를 측정하여 유방암을 비롯한 각종 암의 진단 및 암의 진행상태를 예견하는 지표로 사용하여 호르몬-의존성 또는 호르몬-비의존성 유방암을 구별하는 진단 방법 뿐만 아니라 환자에 있어 유방암의 진단과 예후를 판정하고 또한 본 발명은 extraPKA가 유방암을 비롯한 각종 호발성 암의 조기진단 뿐만 아니라 암의 예후 판단에 뛰어난 효과가 있는 신규 암진단 분자를 제공하고, extraPKA의 억제물질을 처리함으로써 암을 치료하는 새로운 방법을 증명하므로써 달성하였다.

이하 본 발명의 구성을 설명한다.

도 1a는 여러 가지 암세포주 추출액의 유리 단백질 카인나제 A(PKA)와 총 PKA 활성(units/mg 단백질)을 나타낸 히스토그램이다.

도 1b는 여러 가지 암세포주 배양에 따른 세포배지의 유리 PKA 활성(mUnits/10⁶세포/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

도 1c는 여러 가지 암세포주 배양에 따른 세포배지의 LDH 활성(mUnits/10⁶세포/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

도 1d는 여러 가지 암세포주의 세포수(1×10⁶)를 나타낸 히스토그램이다.

도 1e는 T24 방광암 세포 추출액의 유리 PKA와 총 PKA 활성(units/mg 단백질)을 시간경과에 따라 나타낸 히스토그램이다.

도 1f는 T24 방광암 세포배지의 유리 PKA 활성(mUnits/10⁶세포/mL)을 시간경과에 따라 나타낸 히스토그램이다.

도 1g는 T24 방광암 세포 배지의 LDH 활성(mUnit/10⁶세포/mL)을 시간경과에 따라 나타낸 히스토그램이다.

도 1h는 T24 방광암 세포수(1×10⁶)를 시간경과에 따라 나타낸 히스토그램이다.

도 2a는 여러 가지 암세포주 추출액의 유리 PKA와 총 PKA 활성(units/mg/단백질)을 나타낸 히스토그램이다.

도 2b는 여러 가지 암세포주 배양 배지의 유리 PKA 활성(mUnit/10⁶세포/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

도 2c는 여러 가지 암세포주 배양 배지의 LDH 활성(mUnit/10⁶세포/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

도 2d는 여러 가지 암세포 추출액의 유리 PKA와 총 PKA 활성(units/mg 단백질)을 나타낸 히스토그램이다.

도 2e는 여러 가지 암세포주 배양 배지의 유리 PKA 활성(mUnit/10⁶세포/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

도 2f는 여러 가지 암세포주 배양 배지의 LDH 활성(mUnit/10⁶세포/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

도 3a는 여러 가지 암세포주의 유리 PKA와 총 PKA 활성(units/mg 단백질)을 나타낸 히스토그램이다.

도 3b는 기질에 대한 세포배양 배지의 유리 PKA 활성(mUnits/10⁶세포/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

도 3c는 기질에 대한 세포배양 배지의 LDH 활성(mUnits/10⁶세포/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

도 3d는 기질의 종류와 농도에 대해 시간경과에 따른 세포수(1×10⁵)의 변화를 나타낸 선형그래프이다.

도 3e는 기질 또는 억제제에 대한 세포 추출액의 유리 PKA와 총 PKA 활성(units/mg 단백질)을 나타낸 히스토그램이다.

도 3f는 기질 또는 억제제에 대한 세포 배양 배지의 유리 PKA 활성(mUnits/106 세포/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

도 3g는 기질 또는 억제제에 대한 세포 배양 배지의 LDH 활성(mUnits/10⁶세포/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

도 4a는 cAMP만의 존재 또는 cAMP와 PC3M에 대한 PKI의 존재하에서 염화나트륨(NaCl) 농도(M)에 따른 분획별 PKA 활성(units/50μl)을 나타낸 선형그래프이다.

도 4b는 cAMP만의 존재 또는 cAMP와 PC3M Cα에 대한 PKI의 존재하에서 분획별 PKA 활성(unit/50 μl)을 나타낸 선형그래프이다.

도 4c는 cAMP만의 존재 또는 cAMP와 PC3M Cαmut에 대한 PKI의 존재 하에서 염화나트륨(NaCl) 농도(M)에 따른 분획별 PKA 활성(units/50μl)을 나타낸 선형그래프이다.

도 4d는 cAMP만의 존재 또는 cAMP와 PC3M RⅡα에 대한 PKI의 존재 하에서 분획별 PKA 활성(unit/50 μl)을 나타낸 선형그래프이다.

도 4e는 cAMP만의 존재 또는 cAMP와 PC3M RⅡβ에 대한 PKI의 존재 하에서 분획별 PKA 활성(unit/50 μl)을 나타낸 선형그래프이다.

도 4F는 cAMP만의 존재 또는 cAMP와 PC3M 및 8-Cl-cAMP에 대한 PKI의 존재 하에서 분획별 PKA 활성(unit/50 μl)을 나타낸 선형그래프이다.

도 5a는 혈청 시료에 대한 PKA 활성(mUnit/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

도 5b는 혈청 시료에 대한 LDH 활성(mUnits/mL)을 나타낸 히스토그램이다.

본 발명은 환자에서 암을 진단하는 extraPKA의 정량방법을 제공한다. 환자라 함은 동물을 의미하고, 바람직하게는 포유동물을 의미하며, 더욱 바람직하게는 인간을 의미한다.

진단 방법은 extraPKA의 존재에 대한 환자로부터 시료를 분석하는 방법을 의미한다. 시료에서 정상 시료와 비교하여 높은 량의 PKA가 분석되면 암으로 진단할 수 있는 것을 의미한다.

상기 방법은 extraPKA와 관련된 어느 암에서도 진단할 수 있는 방법을 의미 한다. extraPKA의 존재에 관련된 암은 최소한 유방암, 난소암, 전립선암 또는 방광암 등 4가지이다.

암을 진단하는 방법에서 이용될 수 있는 환자의 시료라 함은 액성 시료를 의미한다. 이와 같은 의미의 시료라 함은 혈액과 특별히 혈액내 혈청 또는 뇨를 말한다. 환자로부터 시료를 분석할 때마다 대조군이 필요하지 않으나, 필요시 대조군을 조사한다. 이때 대조군이라 함은 환자의 시료와 비교하는데 유용한 값을 제공하는 것을 뜻하고, 환자의 시료와 비교하여 다른 유용한 값으로 공식 또는 계산과 unit등 으로 표현되는 것을 의미한다. 예컨대, 적당한 대조군이라 함은 환자의 시료를 측정하기 위해 사용되는 것과 비슷한 기술을 이용하여 같은 생물체로부터 생산된 것을 의미한다. 이런 관점에서 대조구 시료에서 extraPKA의 수준은 혈청 또는 뇨가 0-1.0 mUnit/mL의 범위에 있는 상태를 의미한다.

extraPKA를 조사하기 위한 방법은 [γ-32P] ATP와 켐타이드(kemptide)와 같은 기존에 잘 알려진 방법으로 측정할 수 있고, ELISA방법으로도 측정할 수 있다. 만일 ELISA방법으로 측정한다면 extraPKA 조절 아단위 또는 촉매적 아단위에 대한 항체가 필요하다. 이와 관련이 없는 방법은 세포를 용출시켜 측정하는 것이다. 바람직한 세포 용출은 세포내 PKA가 아닌 extraPKA량을 정확히 측정할 수 있는 최소한의 세포용출액이 필요하다.

extraPKA의 존재에 의해서 확인된 암의 특이적 형태는 잘 알려진 방법에 의해서 연차적으로 또는 지속적으로 할 수 있다.

현재 많은 암은 특별한 암을 예견하는 잘 알려진 유전적 또는 단백질 표지와 관련되어있고 방법적인 측면에서도 잘 확립되어 있다. 예컨대, 전립선암은 혈청내 전립선암 특이적 항원(prostate-specific antigen, PSA)이 매우 높은 수준으로 증가되어 나타난다는 특징이 알려졌다. 비슷하게 유방암은 태반성 아이소페리틴(placental isoferritin) p43, 태생기암 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 유방암관련 항원 15-3(breast cancer associated antigen 15-3, CA 15-3) 및 라미닌(laminin)과 같은 표지를 이용하여 그들의 양이 증가된 상태로 측정된다. M1LP, 태반성 알칼라인포스파타제, 다형 상피형 점소(polymorphic epitherial mucin) 및 PLAP 등이 측정되면 난소암으로 판정할 수 있다. 또한 방광암은 방광 종양 특이성 항원(bladder tumor-specific antigen, BTA), 염기성섬유세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 사이토케라틴-20(cytokeratin-20, CT-20) 등이 높게 발현된다. ELISA, Western blot, Southernblot 및 polymerase chain reaction(PCR)과 같은 방법들을 이용하면 시료에서 특이 단백질 또는 핵산을 결정할 수 있다.

본 발명은 환자에서 암이 진행을 진단하는 방법을 제공하는 것이다. 이때 환자라 함은 원칙적으로 동물을 의미하며 바람직하게는 포유류를 의미하고 보다 더 바람직하게는 인간을 의미한다.

상기 방법은 환자로부터 extraPKA의 존재를 측정하는 것으로 환자의 초기 시료에서 extraPKA의 수준에 비해 시료에서 extraPKA량이 감소되었다면 환자의 암진행 상태가 호전되었다고 할 수 있다. 그러나 환자의 초기 시료에서 extraPKA의 수준에 비해 시료에서 extraPKA량에 있어서 차이가 없다면 환자의 암진행 상태가 변화되지 않았음을 나타내준다. 그리고 환자의 초기 시료에서 extraPKA의 수준에 비해 시료에서 extraPKA량에 있어서 증가되었다면 환자의 암진행 상태가 악화되었음을 나타낸다.

본 발명에서 환자로부터 분리한 시료는 예후 분석에 이용될 수 있다. 바람직한 시료는 액상시료를 의미한다. 구체적으로 시료라 함은 혈액을 의미하고, 특별히 혈액내 혈청 또는 뇨를 의미한다. 이때 사용되는 방법은 ELISA법이 바람직하다. 만일 ELISA방법으로 측정한다면 extraPKA 조절 아단위 또는 촉매적 아단위에 대한 항체가 필요하다. 이와 관련이 없는 방법은 세포를 용출시켜 측정하는 것이다. 바람직스런 세포 용출은 세포내 PKA가 아닌 extraPKA량 정확히 측정할 수 있는 최소한의 세포용출액이 필요하다.

본 발명은 진단된 유방암이 호르몬에 의존되어 있는지 또는 호르몬에 의존되어 있지 않은지 결정하기 위한 방법을 제공한다. 이때 환자라 함은 원칙적으로 동물을 의미하며 보다더 포유류를 의미하고 구체적으로는 인간을 의미한다.

상기 방법은 환자의 시료에 extraPKA의 존재를 측정하는 방법이다. 대조구 시료와 비교하여 환자의 시료에서 extraPKA가 증가되어 나타나면 호르몬에 비의존적으로 암이 발생되어 있다는 것을 의미한다. 대조적으로 대조구 시료에 비하여 환자의 시료에서 extraPKA량이 낮은 수주으로 측정되면 호르몬에 의존적으로 발생된 암이라 판단할 수 있다.

본 발명에서 환자로부터 얻은 시료는 예후 분석에 이용될 수 있는 것을 뜻하고 바람직한 시료는 혈청을 의미한다.

호르몬 의존성 유방암을 결정하기 위해 사용할 수 있는 방법은 상기에 기술된 바와 같고, 바람직한 방법은 ELISA법이다. 만일 ELISA법을 이용하는 방법은 상기에서와 같다.

본 발명은 암세포의 extraPKA를 감소시키므로써 암치료에 유용한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 PKA-Ⅱ의 RⅡβ의 과잉발현이 extraPKA의 량을 감소시키고 결국에는 암세포의 성장을 억제시키는 것이다. 따라서 RⅡβ가 표적 암세포에 운송되게하는 방법은 암세포를 억제시키는데 활용될 수 있다. 이때 바람직한 암치료 대상에 해당되는 것은 유방암, 난소암, 전립선암 또는 방광암 등이다.

한편 이형 유전자(heterologous gene)을 전달하기 위한 표적된 벡터 기술을 이용하는 일반적인 개념은 잘 확립되었다(Miller et al., FASEB J. 9, 190-199, 1995). 표적 암세포에 감염시킬 수 있고 표적 암세포에 RⅡβ를 발현시킬 수 있는적당한 벡터를 이용할 수 있다. 이와 같이 사용되는 적당한 벡터의 예는 플라스미드의 의미로써 나출된 DNA 벡터(naked DNA vector)와 아데노와 관련된 바이러스 벡터(Bems et al., Annals of the New York Academy of Sciences, 772, 95-104, 1995), 에노 바이러스 벡터(bain et al., Gene Theraphy, J. S68, 1994), 허피스 바이러스 벡터(Fink et al., Ann. Rev. Neurosci., 19, 265-2687), 파필로마 바이러스 벡터 피코나바이러스 벡터, 폴리오마 바이러스 벡터, 니트로바이러스 벡터, SV 바이러스 벡터, 벡시니아 바이러스 벡터 및 리포좀알 벡터 등이 알려졌다. 이들 벡터 중에서 선택하여 프로모터에 연결된 RⅡβ에 대한 암호 순열을 포함하여 외인성 폴리뉴클레오티드에 결합시켜 암세포의 진행을 억제시켜 암을 치료할 수 있다. 이때 가장 많이 사용되는 벡터 치료방법은 아데노 관련 바이러스 벡터이다.

벡터는 적당한 암세포에 끼어들어 갈 수 있다. 이와 같은 기술은 세포표면 단백질인 표적 암에 특이적인 영역에 선택적으로 결합하므로써 표적 암세포의 변형을 유도하는 방법이다. 예컨대, Han 등(PNAS USA, 92, 9747-9751, 1995)에 따르면 인간의 유방암 세포에 표적 모로네이 설치류 루케미아 바이러스(Moloney murine leukemia virus, MoMLV)을 표적하는 MoMLV의 피막으로 인간의 히리구린(human heregulin을 부호화하는 순열에 삽입되어 차단한다.

부수적으로 다른 벡터는 같은 분자를 인식하는 벡터로 암특이 항원을 삽입시킴으로써 암특이적 세포표면 분자를 선택적으로 결합하여 변형시키는 작용을 한다. 그와 같은 예는 태반성 알칼라인포스파타제(고환 및 난소암), 다형상피형 점소(난소암), 전립선암 특이 막 항원, 알파-피토단백질(α-fetoprotein), B-림프구 표면항원(B-세포 림포마), EGFR(글리오마), gp95/gp97(멜라노마), N-CAM(소형세포 폐암), ESA(암종), CD19, 22 또는 37(B-림포마), 250kD 프로테오글리칸(멜라노마), P55(유방암), B 또는 O형에 있어서 혈액그룹 A항원(위종양과 직장종양), PLAP(정소암, 난소암과 비소형폐암) 및 이와 유사한 분자 등 다양하다. 암세포 특이 세포표면 분자는 유방, 전립선, 난소 또는 방광의 암양세포에서 발견된다.

또한 벡터는 같은 수용체를 인지하는 벡터로 암특이 항체를 삽입시킴으로써 암특이 세포표면 분자에 선택적으로 결합하여 변형시킬 수 있다. 이러한 수용체는 암과 관련된 것으로 알려졌는데 그 종류는 erbB-2(유방암),erbB-4, IL-2(림포마와 백혈병), MSH(멜라노마), 트렌스페린(글리오마)와 몇 가지 종양 혈관 인터그린 등이 있다. 암 특이 세포표면 단백질 수용체는 유방암, 전립선암, 난소암 또는 방광암에서 발견되는 수용체들이다.

암특이 세포표면 분자와 수용체에 대한 일련의 항체가 알려졌다. 예컨대, 이들 항체는 태생기암 항원에 대한 C46 항체(Amersham)과 85A12 항체(Unipath), 태반성 알칼라인포스파타제에 대한 H17E2 항체(ICRF), 펜 카시노마에 대한 NR-LU-10 항체, B-림프구 표면항원에 대한 RFB4 항체(Royal Free Hospital), 인간 직장암에 대한 A33 항체(Genex), 인간 멜라노마에 대한 TA-99 항체(Genex), c-erbB2(IP 7309780, JP 8176200 및 JP 7059588)에 대한 항체 및 이와 유사한 여러 가지 종류가 알려져 있다.

한편 벡터는 암 특이 세포표면 수용체에 대한 리간드(ligand) 또는 암 특이 세포 표면 수용체에 대한 결합 영역을 포함하여 변형시킬 수 있다. 가능한 벡터는유방암, 난소암, 전립선 또는 방광암에서 발견되는 암 특이 세포표면 수용체에 대한 결합 영역을 변형시킬 수 있어야 한다.

상기에서와 같이 제조합 벡터는 생물학적 활성 형태에 있어서 소단위을 생산하기 위해서 표적 암세포내에서 RⅡβ에 대한 부호화 순열을 포함하고 발현해야 다. 인체의 RⅡβ 소단위에 대한 코딩 시퀀스는 잘 알려졌다(Levy et al., Molec. Endocrinol. 2: 1364-1374, 1988). 표적 암 세포에서 RⅡβ의 발현은 extraPKA의 억제 조절의 결과를 초래한다.

더욱이 제조합 벡터는 RⅡβ 코딩 시퀀스에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 부수적으로 제조합 벡터는 적당한 향상물질을 포함할 수 있다. 코딩 시퀀스의 조절 발현에 대한 적당한 시퀀스 프로모터와 또는 향상제를 사용할 수 있다. 이와 같은 프로모토와 향상 요소는 기술적으로 잘 알려졌다. 예컨데 적당한 프로모터는 전핵생물체 프로모터와 바이러스 프로모터(리트로바이러스 ITRs, LTRs, 허피스바이러스 Iep와 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) IEp와 같은 초기 바이러스 프로모터, Rous Sarcoma Virus (RSV) 프로모터와 Murine Leukemia Virus(MLV) 프로모터와 같은 다른 바이러스 프로모터) 등이 있다.

본 발명은 extraPKA 수준이 암세포에서 감소되는 것에 의해 암세포의 성장을 억제시키는 결과를 초래하는 암세포 치료법에 유용한 방법을 부수적으로 제공한다. 상기 방법은 extraPKA의 Cα 소단위의 미리스틸레이션(myristylation)을 억제하는 것이다. N-말단 글리신이 알라닌을 변형하므로써 일어나는 돌연변이는 Cα 소단위의 미리스틸레이션이 되지 않은 형태로 결과를 초래하는 것과 같은 미리스틸레이션을 억제한다. PKA의 미리스틸레이션이되지 않은 형태는 이것에 대한 단백질 카인나제 활성을 남겨놓는다. 그러나 세포외 PKA처럼 세포로부터 분비된 경우보다 세포질에 남게된다. 더욱이 이것은 세포(Cα-glycine subunit)에서 야생형 Cα 소단위의 과다발현은 extraPKA의 증가를 초래하고, Cα소단위의 돌연변이 형의 과다발현은 extraPKA를 감소시킨다. 따라서 Cα 소단위의 미리스틸레이션을 방해하는 방법은 암과 관련된 세포의 형질전환을 억제시킨다. 이와 같은 방법으로 치료될 수 있는 암은 유방암, 난소암, 방광암 또는 전립선암 등이 있다.

Cα 소단위의 미리스틸레이션은 기존에 잘 알려진 항센서(antisense) 방법을 이용하여 억제시킬 수 있다. 현제 이와 같은 측면의 항센서는 2가지 전략으로 암을 치료하는데 사용되는데, 그 것은 첫째, 표적 암세포에 항센서 cDNA 시퀀스를 가지는 재조합 벡터를 전달하는 방법과 둘째, 표적 암세포에 전달하는 짧은 항센서 올리고뉴클레어티드법이 있다. 현재 적용하고 있는 첫 번째 전략으로 Cα 아단위의 N-말단과 일치하는 초기의 mRNA 시퀀스에 상보적인 단일 스트렌드화된 항 RNA을 생산하기위해서 알려진 재조합 백터가 이용될 것이다. 특별히 항센스 RNA 서열은 항센스 RNA 서열이 초기의 N-말단이라 말하는 것과 잡종화 될 수 있는 글리신 잔기을 포함하는 N-말단과 상보적이고, 이것은 미리스틸레이션 부위를 효과적으로 차단할 것이다. 항센스 서열는 Cα 아단위의 번역을 방해할 수 있을 만큼 길지 않고 처녀 RNA 서열과 특이적으로 잡종화될 수 있는 충분히 긴 것을 의미한다. 우선적으로 항센스 서열은 분명히 잡종화를 만들기 위해서는 최소한 17뉴클레오타이드가 필요하다. 어떤 적합한 벡터는 목적암세포를 감염시킬 수 있고, Cα 아단위에 N-말단글리신을 갖는 서열에 상보적인 항센스 RNA서열을 만드는데 사용될 수도 있다. 항센스 RNA 서열을 만드는데 있어서 사용되는 적합한 벡터는 기술적으로 잘 알려졌다. 또한, 기술적으로 상기한 바와 같이 목적암세포에 적합한 벡터이다.

한편, 항센스 포스포로씨오네이트 OND와 이차 생산 ODNs을 포함하는 다른 유래인자들과 N-말단 글리신 잔기을 포함하는 Cα 아단위의 N-말단과 일치하는 초기의 mRNA와 상보적인 서열인 RNA-DNA 키메릭 또는 잡종 ODNs 등과 같은 데에 이용될 것이다. 우선적으로 항센스 서열은 특이적 잡종화를 허락하기 위해서 최소한 17 뉴클레오타이드 정도 길어야 한다. 또한 ODN은 보다 안정한 ODN을 만드는 ODN의 인산기에서 비연결(non-bridging) 산소원자중 하나를 황원자로 대체한 포스포로씨오네이트 ODN이다. 게다가 ODN은 목적세포에 ODN 전달을 강화시키기 위해 변형되어질 수도 있다. 예를들면, ODN는 합성 양성 지질과 조합할 수도 있고, 포프린이나 콜레스터롤같은 소수성기에 연결되어질 수도 있다. 더구나, ODN는 트렌스페린과 연결되거나 그렇지 않은 폴리라이신과 결합되어 변형될어질 수도 있다. 또한 벡터로 라이포좀을 사용하면 ODN의 운반을 강화시킬 수 있다. 그 ODN 기술에서 잘 알려진 방법을 사용하여 암환자에게 투여될 수 있다.

상기와 같이 본 발명은 포유동물에서 암을 치료하기에 유용할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면 암은 비정상적 세포 증식과 종양형성의 증거가 될 수 있는 접촉 억제가 없을 때 나타나는 암을 포함한다. 이러한 용어는 예를 들어 침입에 의한 국소적 또는 전이에 의한 전신적 종양으로부터 만연한 암과 같이 종양에 국한되지 않은 암 뿐만 아니라 종양에 위치된 암을 포획하는 것을 의미한다.이론적으로, 본 발명은 유방암, 자궁암, 방광암, 또는 전립선암 뿐만 아니라 포괄적으로 폐암, 신장암, 백혈병 등을 포함한 여러 가지 종류의 암 치료 방법을 제공하는 것이다.

포유동물에서 암 치료 방법은 상기한 내용과 같이 재조합 DNA 또는 RNA 벡터를 포함하고 RⅡβ 아단위 부호화 서열을 발현하거나 또는 Cα 아단위의 N-말단에 일치하는 항센스을 효과적으로 암의 치료 방법에 필요한 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 조합된 벡터를 암세포에 넣어주면, 그 재조합된 벡터는 암의 성장을 저해하는 RⅡβ subunit를 발현하여, 암을 치료할수 있다. 다른 방법으로는, 재조합된 벡터를 암세포에 넣어주면, 그 재조합 벡터는 Cα 아단위의 N-말단 서열에 대한 자손 RNA 전사체와 잡종화되는 항센스 RNA를 만들어서 효과적으로 Cα 아단위의 미리스틸레이션을 막고, 따라서 암을 치료할 수 있다. 예컨데, 종양의 크기, 종양의 수 등 종양 성장의 저하와 또는 종양 퇴화을 유도하는 것이다. 본 발명는 구체적으로 유방압, 난소암, 방광암 또는 전립선암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

포유동물에서 암을 치료하기 위한 본 발명은 본 발명이 제공한 단독 치료 방법 또는 방사선, 화학요법 또는 수술을 병행하여 사용할 수 있다. 예컨대, 그런 조합 치료 방법은 전이단계를 포함한 암의 진행과정의 초기나 후기에 사용되어질 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면 RⅡβ 아단위 또는 항센스 서열을 발현하는 재조합벡터는 예를 들어 유방절제 수술 또는 난소절제 수술 후에 남아 있는 종양괴에 주입하여 치료할 수 있다. 재조합 벡터는 캐뉼라십입에 의한 유선으로 주입시킬 수 있다.

본 발명에 따르면 상기한 바와 같이 RⅡβ 아단위와 항센스서열로 전사 될수 있고, RⅡβ 아단위 지정 염기서열을 발현할 수 있는 재조합 벡터는 필요에 따라 포유류에게 주입 될 수 있다. 재조합 벡터를 포유류에 주입한다는 것의 의미는 주입되어질 재조합 벡터의 유형에 따라 결정된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 이러한 벡터를 포함하고 있는 용액은 종양괴 내부에 주입하거나 종양 조직에 공급되는 혈액을 통해 주입 될 수 있다. 적절한 주입 경로는 종양괴 주위 조직이나, 종양괴 내부, 정맥주사, 근육 주사, 복강내 주사, 피하주사, 경구, 항문, 접안, 비강 등이 포함된다. 종양괴 주위나 종양괴 내부 경로를 통해서 투여는 주사 방법이 더 좋다. 리포펙션(lipofection) 이나 직접적인 DNA 주사 , 미소탐침(microprojectile), 전리방사선치료(bombardment), 리포좀, 분자결합 등을 이용한 주입 방법도 효과적일 수 있다. 그러나 방법적인 것은 주입 방식의 어떤 특정한 의미 등에 의해 의존되는 것은 아니다. 단지 투여 방법의 의미는 단지 주입 방식의 기술적인 측면을 고려한 것일 뿐이다.

재조합 벡터는 약학적으로 합당한 조성 성분의 형태로 포유류에 투여된다. 이러한 조성은 재조합 벡터가 치료 되어질 암조직에 특이적인 세포 표면 물질이나 특이적인 세포 표면 수용체에 직접적으로 결합하는 능력을 감소시켜서는 안된다. 우선적으로 재조합 벡터는 양전하성 지질(예; 리포좀)에 의해 투입되는 것이 좋다. 이와 같은 리포좀은 상업적으로 유용하다(예; 리포펙틴, Life technologies, Gibco BRL, Gaithersbur, MD). 게다가 리포좀은 운반능력을 증가시키고, 생체에서 독성을 감소시키기 때문에 현재 사용하고 있는 주입 방식이다. 리포좀에 의한 주입 방식에대한 주의 사항은 WO 93/23569에 소개 되어 있다. 즉, 리포좀 사용시 리포좀을 항체, 리간드, 결합부위, 예를 들어 암세포 특이적인 세포 표면 분자나 수용체에 보여지게 하는 것이 중요하다.

포유류에 투여하기 전에, 현재 발견된 재조합 벡터를 다양한 조성을 가진 형태로 만드는 것이 중요하며, 이들에게 약학적으로 적절하고 받아들일 수 있는 운반체(carrier)와 희석액(diluent)이 사용되어져야 하고 사람과 동물에게 적절한 형태로 만들어져야 한다.

이처럼 재조합 벡터의 사용에 대한 방법론적인 혼합물 구성은 재조합 벡터와 제약학적으로 받아들일 수 있는 운반체의 효율적인 결합에 의해 이루어 질 수 있다. 운반체의 선택은 재조합 알파바이러스(alphavirus)인지 재조합 DNA 벡터 또는 RNA 유전자에 따라 상기 혼합물 주입 방식 등에 따라 선택되어질 수 있다. 한가지 기술로는 다양한 경로를 통해 주입 할 수 있다는 점이고, 하나 이상의 경로로 투입할 수 있다는 점이며, 특정한 경로에 의한 주입은 다른 어떠한 경로보다 더욱 즉각적인 효과가 나타날 뿐만 아니라 더욱 효율적인 효과가 나타난다. 현재 발견되어 사용되어지는 방법으로는 매우 다양한 혼합물로 구성을 할 수 있다.

재조합 벡터나 벡터와 그 외의 다른 활성을 가지는 약품의 조성은 비경구적 투여에 알맞게 만들어질 수 있다. 이와 같은 조성은 항산화제, 완충액, 정균제, 수여자의 혈액으로 이동할 수 있도록 만든 등장성 용액, 액상이거나 비액상의 무균성 부유물, 용해제(solublizer), 부형제, 안정제(stabilizer), 보관액(preservatives)등을 포함한 액상이거나 비액상인 등장성 무균수이다. 이와 같은 조성은 단위 용량이거나 다용량의 보관 앰플이나 바이얼 등에 보관 될 수 있으며 동결건조 형태로 보관할 수 있으나 사용직전에 무균적인 액체 운반체를 이용해야 한다. 미봉책으로 사용되는 주사용 용액이나 부유물은 여기에서 소개되는 것과 같은 무균적인 가루나 과립, 알약 등이 이용될 수 있다.

경구적으로 투여되는 조성은 액상의 용액이어야 하며 다음과 같은 효과적인 양의 희석액에 잘 녹아야 한다. 물, 식염수, 과일 쥬스, 캡슐, 향낭, 알약, 각각은 상당량의 활성 화합물을 포함하고 있다. 고형이나 과립, 액상의 용액이거나 부유물; 물속의 기름 유제, 기름 속의 물 유제 등에 보여지게 함으로써 리포좀이 암세포에 접할 수 있도록 한다. 알약형은 하나 또는 하나 이상의 젖당, 만니톨(mannitol), 옥수수 전분(corn starch), 감자 전분, 미립자 셀룰로우스(microcrytalline cellulose), 아카시아, 젤라틴(gelatin), 콜로이드성 실리콘 다이옥사이드(colloidal silicon dioxide), 크로스카멜로스 소듐 (croscarmellose sodium), 탈크(talc), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 스테아르산(stearic acid), 엑시피언트(excipients), 착색제 (colorants), 희석제(diluents), 완충제(buffering agents), 보습제(moistening agents), 방부제(preservatives), 조미제(flavoring agent) 및 약리학적으로 이용되는 운반체 등을 포함 할 수 있다.

유사하게도, 경구 주입에 알맞은 조성은 마름모 형(lozenge)일 수 있다. 이들은 활성 혼합물로써 슈크로스(sucrose)나 아카시아, 트라가칸스(고무류)등의 향료를 포함하고 있다. 알약(pastilles)은 젤라틴이나 글리세린, 슈크로스(sucrose),아카시아 등의 비활성의 염기를 활성의 혼합물로써 포함하고 있다. 양치질 약은 활성형의 혼합물로써 적절한 액체 운반체와 크림, 유제(emulsion), 겔 등을 포함하고 있다.

에어졸(연무질)형태의 주입방식은 흡입에 적당하다. 에어졸(연무질) 형태는 디클로로디플루오로메탄(dichlorodifluoromethane), 프로판(propane), 니트로겐 (nitrogen) 등의 추진제(propellant)를 이용하여 압력을 일정하게 유지시켜 보존될 수 있다.

국소적으로 사용할 수 있는 제제는 크림이나 연고(ointments), 로션(lotion) 등의 형태를 가진다.

직장용 주입을 위한 형태는 좌약 형태로 존재 할 수 있으며 적절한 염기, 예를 들어 코코아 버터(cocoa butter)나 살리실레이트(salicylate) 등이 포함 되어 있다.

질내 주입용으로 알맞은 형태는 자궁전(pessary), 탐폰(tampon), 크림, 겔, 연고(paste), 거품(foam) 또는 분사 등이 있으며, 이들은 활성형의 혼합물을 포함하고 있다.

포유류, 특히 사람에 주입하는 용량은 현재 발견된 양상으로 보아 감염자 개개인에게 적절한 시간을 두고 치료적 효과가 충분히 나타날 수 있도록 해야 한다. 용량은 치료에 사용되는 특정한 재조합 운반체가 어떠한 정도의 효과를 가지고 있는지, 암의 중등도, 감염자의 체중이나 나이에 따라 결정된다. 용량은 또한 사용되어지는 특정 재조합 운반체의 부작용의 출현 등에 의해 결정되어 질 것이다. 부작용 나타나면 최소량을 투입하는 것이 중요하다.

용량은 알약(tablet)이나 캡슐과 같은 단위 용량의 형태가 될 수 있다. 단위 용량이라는 용어는 여기에서 이용되는 것처럼 생리학적으로 따로 분리된 단위로써 사람이나 동물의 개체에 이미 정해진 벡터의 양과 혹은 그것에 더해 다른 항암제와의 조합에 의해 충분한 임상 효과를 나타낼 수 있는 단위를 나타내며, 이 단위는 약학적으로 사용 가능한 희석액이나 운반체(carrier, vehicle) 등을 이용한 경우도 포함된다. 본 발명에서 단위 용량이라 하는 것은 효과나 숙주에서 각각의 복합물이 약역학적으로 결합하는 정도, 사용의 구체화 등에 의해 결정되어진다. 투여되는 용량은 암치료에 효과를 나타내는 양이어야 하며, 환자 개개인에게 효과적인 양이 도달되어야 하는 양이다.

효과적인 양이라는 것은 투여하는 과정 중 마지막 순간을 말하기 때문에 실제 용량과 투여 계획은 약역학적인 개개인의 다양성, 약물 분포, 대사 등에 따라 다양하다. 효과적인 양은 예를 들어 환자의 혈액이나 조직에서 재조합 벡터가 임상적인 항암 활성에 대한 예견에 따라 표적이 된 암세포를 효과적으로 용해시키는 것을 가능케하는 양으로 정의 할 수 있다. 재조합 벡터의 효과적인 양은 현재 발견된 투여법이나 다른 항암제의 효과 등에 의해 다양해 질 수 있다.

적절한 용량이나 투여 계획, 투여 방법에 대한 한가지 효과적인 기술은 사용되어질 약제의 구성성분의 조성과 개개 환자가 원하는 효과적 용량을 근거로 쉽게 정해질 수 있다. 또다른 한가지 효과적 용량을 정하는 기술로는 현재 존재하는 간접적(예, 혈액내의 PSA양) 으로나 직접적(예; 암조직의 생검, 암조직의 방사선학적imaging)으로 환자의 시료(예; 혈액, 조직)를 정확하게 분석할 수 있는 방법들을 지표로 하여 쉽게 결정하는 방법이 있다.

게다가 환자의 암을 치료에 있어서 효과적인 양을 결정한다는 측면에서 적절한 동물 모델이 유용하고, 과거로부터 재조합 DNA protocol 에 의한 항암 효과를in vivo에서 측정하는데 광범위하게 사용되어져 왔다. 이들 모델에서는 누드 마우스(nude mice)와 SCID 마우스(mice)가 사용되었다. 이와 같은 모델은 역시 RNA 게놈(genome)의 효율성을 생체에서 측정하는데도 유용하다.

일반적으로 주어진 조직에 충분한 재조합의 양의 농도는 약 10^-7M에서 10^-6M이다. 더욱이 일련의 농도는 전달과 투여된 특별한 재조합 벡터에 따라 다양할 것이다.

세포내 PKA와 ectoPKA로부터 extraPKA을 구별하는 단일클론 항체는 기술적으로 알려진 방법에 따라 생산할 수 있다. extraPKA Cα 아단위의 N-말단 글리신은 단일클론 항체에 의해 인식되어질 수 있다. 그와 같은 단일클론 항체는 본 발명의 방법을 수행하는 매우 유용한 핵심이다.

본 발명은 extraPKA을 이용하여 환자를 대상으로 호르몬-의존성 또는 호르몬-비의존성 유방암을 구별하는 진단 방법을 완성하고 환자의 암진행상태의 예후를 판정하며 유방암 뿐만 아니라 각종 호발성 암을 진단하고 진행상태를 예견하는 단계로 구성되고 또한 본 발명은 extraPKA의 억제 약물을 처리하므로써 암의 진행상태를 차단하는 새로운 암치료제의 방법을 제공하는 단계로 이루어진다.

이하, 본 발명은 하기 실시예를 통하여 상세히 설명되지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 각종 암세포주의 유리 PKA와 총 PKA의 활성

본 실시예에서는 조건화된 암세포 배지에서 암세포의 증식에 따른 PKA의 존재를 확인하였다. 암세포는 열에 의해 불활성화된 10% 우태아 혈청과 기본 아미노산이 들어있지 않은 0.1 mM 최소배지(minimum essential medium, MEM) (pH 7.4) 및 항생-항균제가 포함되어 있는 성장배지를 이용해 95% 대기 및 5% C0₂의 대기조건과 37℃의 온도를 유지하였다. PKA 효소 분석을 하기 위해서 세포는 60 mm 페트리 접시당 2-7×10⁵세포의 밀도로 접종했다. 세포가 페트리접시에 50 ~ 60%가 만연되었을 때 배양액을 제거하고 새로운 배지 2 mL을 교환해 주었다. 24시간 배양 후 조건화된 배지를 회수하고 세포는 PKA 분석을 위해서 수확하였다.

회수된 세포는 원심분리하여 침전시키고 침전된 세포는 NaCl/Pi 완충액(0.0017 M KH₂PO₄, 0.005 M Na₂HPO₄, 0.15 M NaCl, pH 7.4)으로 세척했다. 최종 세포 침전물은 500㎕ 완충액 10(20 mM Tris/HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% Nonidet P-40), 0.5% 소듐 데옥시콜로레이트(sodium deoxychololate), 5 mM MgCl₂, 0.1 mM 펩스타인(pepstain), 0.1 mM 안티페인(antipain), 0.1 mM 키모스타틴 (chymostatin), 0.2 mM 레우펩틴(leupeptin), 0.4 mg/mL 아프로틴인(aprotinin) 및 0.5 mg/mL 대두트립신 억제제(0.45 μm 막여과 시킨 용액)을 첨가하고 1 mL주사기(20 게이지)에 5번 통과시킨 후 15분간 4℃에 방치하고 4℃에서 5분간 원심침전시켰다. 단백질의 정량(일반적으로 1 ~ 5 mg/mL)은 Bradford 방법에 의해서 결정했다(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

PKA 효소활성은 Rohlff 등(J. Biol. Chem. 266(8), 5774-5782, 1993)의 방법에 준하여 측정했다. 조건화된 배지내에 PKA의 활성을 측정하기 위하여 먼저 37℃에서 20분간 배지 200μl을 방치했다. 반응액(전체 250 μl)은 50 mM Tris/HCl (pH 7.5), 1 mM dithiotreitol (DTT), 10 mM MgCl₂, 5 μM Kemptide (PKA을 특이적으로 인식하고 인산화작용 부위을 수행할 수 있는 세린을 포함하는 펩타이드: Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly [SEQ ID NO:1], Gibco-BRL, Gaithesburg, MD)), 1.2 μM [γ-³²P] (25 Ci/mmol, ICN, Costa Mesa, CA), 5 μM cAMP(첨가한 시험구 또는 첨가하지 않은 시험구: 유리형(free) C 아단위 활성과 전체 카인나제 활성을 측정하기 위해서) 및 5 μM PKI (Walsh-Kteb 억제제: PKA를 특이적으로 억제하는 단백질)으로 조성했다. 세포추출(전체량은 50 μl) PKA의 측정은 10 μg의 단백질이 포함되어 있는 반응액에 5분간 37℃에서 수행했다. 그 후 반응혼합물은 포스포셀루로스 디스크(Gibco-BRL)에 반점을 찍고 0.5% 인산용액에 3번 세척한 후 공기건조하고 sintillation counter (Beckman, Fullerton, CA). 효소 1 단위는 표준 조건하에서 분당 [γ-³²P] ATP가 켐타이드로 인산이 1.0 pmol이 전환되는 효소량으로서 정하였다. 조건 배지에서 세포외 PKA를 측정하는 방법과 같이 조건 배지에서 얻은 배양세포를 준비하여 세포출액을 준비한 다음 세포내 PKA량을 측정하였다.

락테이트 디하이드로게나제의 활성은 통상적으로 이용된 키트를 사용하여 측정했다(Sigma Chemical Co., St. Louis MO). 즉, 조건배지 25 μl는 피루베이트-NADH가 포함되어 있는 반응 혼합액 250 μl를 가했다. 37℃에서 30분간 배양 후 2,4-디니트로페닐하이드라진(2,4-dintrophenylhydrazine(20 mg/dL 1N HCl)을 반응 혼합액에 첨가하고 20분간 실온에 방치했다. 0.4 N 수산화나트륨 2.5 mL을 주입하고 교반기를 이용해 완전히 혼합했다. 반응혼합액의 흡광도는 464 nm에서 측정했다.

여러 가지 암 세포주 배양액의 유리 PKA 활성(mUnits/10⁶세포/mL)을 나타낸 도 1b에서처럼 세포외 PKA 활성이 폐암 세포주(A549, American Type Culture Collection, ATCC, Rockville MD), 방광암 세포주(J82, ATCC; T24, ATCC; UMUC3, ATCC), 지장암 세포주(HCT-15, Cancer Institute, NCL, Frederick Cancer Research Facility, Frederick, MD), CoLo205(NCI), LS-174(John W, Grainer, NCl, Bethesda, MD) 및 신장암 세포주(293, Kenneth H. Cowan, NCI, Bethesda, MD), 293K(Kenneth H. Cowan, NCI, Bethesda, MD) 등 여러 가지 암세포주에서 다양한 활성이 나타났다. 조건배지에서 조사된 PKA 활성은 외부적으로 첨가된 cAMP에 의해서 활성화되지 않았다(도 1b). 이와 같이 세포외 PKA 활성은 유리 아단위 활성으로 나타냈다. 이것은 세포추출에서 세포내 PKA와 뚜렷하게 대조를 보이고 있다. 여러 가지 암 세포주 추출액의 유리 PKA(units/mg 단백질)와 총 PKA대해 나타낸 도 1a와 같이 세포외 유리 C 활성은 거의 없고, 외인성 cAMP의 존재에서만 세포내 PKA가 나타났다. 이러한 현상은 세포내 PKA 가 불활성 완전효소(holoenzyme) 형태로 독립적으로 존재되어 있다는 것을 제시해 주고 있다. 중요하게 다른 세포주의 조건배지에서 조사된 세포외 PKA의 유형은 조건배지 LDH 활성(도 1c) 또는 세포배양 용기에서 세포수(도 1d)에 따라 세포내 PKA 활성이 관련 없음을 나타내 주었다.

실시예 2: 각종 암세포주에서 extra PKA의 축적 경로

본 실시예는 방광암 세포가 조건배지에 세포외 PKA 축적의 일시적 경로를 알아보기 위한 것이다. 방광암의 경우 조건배지에서 세포외 PKA의 일시적인 축적은 실시예 1에서와 같은 방법으로 조사했다. 여러 가지 시간별로 T24 방광암 세포주의 유리 PKA 활성(mUnits/10⁹/세포/mL)을 나타낸 도 1f와 같이 세포외 PKA는 시간에 의존적인 방법으로 조건배지에서 증가되어 나타났다. 카인나제 활성은 배양 12시간에 정점에 도달 되었고, 그 후 24시간 이상 까지 지속되었다. 48시간에 보다더 PKA 활성은 서로 다른 양상의 곡선을 보이면서 증가되었다. 도 1e는 여러 가지 시간별로 T24 방광암 세포수(1×10⁶)의 유리 PKA와 총 PKA 활성을 나타내었고, 도 1h는 T24 방광암 세포 수에 따른 유리 PKA와 총 PKA 활성을 나타내었다. 따라서 세포수에 따른 세포외 PKA의 시간에 따른 증가 유형은 세포내 PKA 활성과 유사했다. 이와 같이 세포외 PKA의 축적은 세포 성장과 세포내 PKA의 기능이 있다. LDH 활성이 배양 48시간에 가장 분명히 증가되었기 때문에 세포외 PKA 활성은 어떠한 비특이적 세포 손상에 관련된 PKA의 분비을 피하기 위해서 배양 24시간에 측정했다(도 1g: 시간에따른 T24 방광암 세포 배양액에서 LDH 활성(mUnits/10⁶세포/mL)을 나타내었음).

실시예 3: 유방암 세포주에서 extra PKA가 호르몬-의존성 또는 호르몬-비의존성인지 구별

본 실시예는 세포외 PKA 발현이 유방암 세포에서 호르몬 의존성과 역비례한다는 현상을 증명한 것이다. 호르몬 의존성 유방암 세포주(MCF-7, ATCC; T-47D, David Salomon, NCI, Bethesda, MD)와 호르몬 비의존성 유방암 세포주(SK-BR-3, David Salomon, NCI, Bethesda, MD; MDA-MB-231, ATCC) 및 호르몬 의존성 멀티-약물 저항 유방암 세포주(MCF-7^TH, NCI, Bethesda, MD)을 대상으로 24시간 배양된 조건 배지에서 세포외 PKA 활성을 조사했다. 이들 유방암 세포의 세포외 PKA는 여러 가지 암세포주 조건배지에 따른 유리 PKA를 조사한 도 2b에서 나타낸 유리 C 아단위의 활성을 측정한 반면, 세포내 PKA는 여러 가지 세포주 추출액의 유리 PKA와 총 PKA 활성을 조사한 도 2a에서 나타낸 바와 같이 유방암 세포와 도 1a에서 불활성 완전효소로 측정했다. 호르몬 비의존성 유방암 세포는 호르몬 의존성 유방암 세포(도 2b)보다 세포외 PKA 수준이 매우 높았다. 세포외 PKA 발현의 이러한 유형은 MCF-7TH 세포를 제외하고는 세포내 PKA의 활성과 균등하게 나타나 세포내 PKA와 세포외 PKA(도 2a와 도 2b)사이에 역위적은 관계가 있는 것을 확인했다. 이들 세포 조건배지에서 LDH 활성(mUnits/10⁶세포/mL)과 여러 가지 세포주의 조건 배지에서 LDH 농도을 나타낸 도 2c에서 나타낸 바와 같이 이들 세포에서 세포외 PKA와는 관련이 없었다. 이들 결과는 유방암에서 세포외 PKA 발현과 호르몬 의존성과의 역위적 관계가 있다는 것을 나타낸 것이다.

실시예 4: 전립선 암세포주에서 extra PKA

본 실시예는 전립선암 특이적 항원(PSA) 발현과 세포외 PKA 발현이 독립되어 있다는 것을 증명하였다. 기존에 전립선암 특이적 항원 결정은 전립선암 진단에 이용되어왔는데, 세포외 PKA 발현은 PSA의 높고 낮음으로 표현하는 전립선암에서 실험했다. 여러 가지 세포주의 조건배지에서 유리 PKA 활성을 나타낸 도 2e와 같이 4가지 다른 전립선암 세포주의 조건배지에서 측정된 세포외 PKA 수준은 전립선암 세포주인 PrEC5500(Clonetics, San Die해, CA)에서 보다 100 ~ 180배 높게 나타났다. 이와 같이 이들 전립선암 세포는 그들의 PSA 수준과 관계없이 세포외 PKA가 매우 높은 수준으로 발현 되었다. 중요하게 PrEC5500 세포는 여러 암세포주 추출액의 유리 PKA와 총 PKA 활성(units/mg 단백질)으로써 나타낸 도 2d와 같이 전립선암 세포와 비교하여 세포내 PKA가 포함되어있으나 도 2e에서 나타낸 바와 같이 세포외 PKA는 매우 낮은 수준(0.2 mUnits/10⁶세포/mL)으로 측정되었다. 이들 전립선암 세포주에서 세포외 PKA 발현의 유형은 그들의 세포내 PKA 발현 유형과 구별되었고 LDH 발현과는 관계가 없었다(도 2f).

실시예 5: extra PKA는 세포내 PKA에 의해서 조절

본 실시예는 세포외 PKA의 발현이 세포내 PKA에 의해서 조절됨을 보여주었다. PKA 동이효소 타입 Ⅱ와 반대로 PKA 동이효소 타입 I은 세포 형질전환과 관계가 있다(Cho-Chung, Cancer Res. 50: 7093-7100, 1990). 즉, 세포외 PKA에 기여한 세포에서 PKA 동이효소 분포가 되어있는지 없는지는 PKA 동이효소을 다르게 결정할 수 있는 부위 선택적 cAMP 유도체를 이용하여 실험했다(Doskeland, Biochem. Biophys. Res. Commun. 83, 543-549, 1978; Rannels & Corbin, J. Biol. Chem. 225, 7085-7088, 1980). 부모형 cAMP보다 부위 A 뿐만 아니라 부위 B에 대해서 매우 높은 친화도를 가지는 cAMP 유도체중의 하나인 8-Cl-cAMP는 PKA-Ⅱ에 영향을 주지 않는 PKA-I의 억제 조절을 이끄는 RI와 C 아단위로 PKA-I 완전효소를 효과적으로 해리할 수 있다. PC3M 세포(NCI Federick Cancer Research Facility, Federick, MD).는 10%의 열처리 불활성화된 소태반 혈청과, 0.1 mM MEM 비필수 아미노산이 제공되고 pH가 7.4로 조절된 RPMI 1640 배지를 이용하여 배양하고, 항생제를 투여하였다. 공기 조건은 5%의 이산화탄소와 95%의 공기와 보습조건을 이용하였다.

세포는 60 mm 디쉬에 1×10⁵개 정도의 수를 조절하여 넣고 cAMP의 아날로그인 8-Cl-cAMP(5 μM, 3일) 또는 8-Cl-아데노신(2μM, 3일)을 처리하고 실시예 1에서 제공된 방법에 따라 PKA의 활성을 측정하였다. 도 3a에서 보면 새포 종류에 따라 유리상태 그리고 총 PKA활성(units/mg 단백질)을 막대 그래프로 보였고 도 3b를 보면 기질에 따라 세포배양액에 유리된 PKA 활성(mUnits/10⁶cells/mL)의 막대그래프이고, 8-Cl-cAMP는 세포외와 세포내 PKA의 조절을 저하시키는 것을 볼수 있다. 도 3d는주어진 기질의 농도에서의 처리 시간(시간)에 따른 세포의 수를 선그래프로 그린 것으로 8-Cl-cAMP 역시 성장을 억제시킴을 알 수 있다. 유의할만한 세포성장의 억제를 가져왔고(도 3d) 도 3c에서 보듯이 기질에 따라 세포배양액 내에서의 LDH 활성(mUnits/10⁶cells/mL)을 나타낸 막대그래프를 보면 LDH활성을 증가시키는 세포 독성적 대사물인 8-Cl-아데노신은 세포내 PKA 또는 세포외 PKA의 수준에 최소한의 영향을 미쳤다(도 3a 그리고 3b). DEAE 컬럼 크로마토그래피는 이러한 PKA 억제에서의 8-Cl-cAMP의 효과를 PKA-1 이형효소의 선택적 downregulation의 명확한 결과이다. 도 4f는 cAMP와 PC3M을 위한 PKI 그리고 8-Cl-cAMP의 존재하에서 또는 cAMP 단독 존재하에서 염화나트륨 농도에 따른 분획별 PKA 활성을 선그래프로 나타낸 것이다.

알려진대로 암세포로부터 제공된 PKA 이형효소의 변형은 PKA의 조절적 그리고 촉매적 소단위 유전자의 과잉발현에 의해 일어날 수 있고(Tortora & Cho-Chung, J. Biol. Chem. 265, 18067-18070, 1990; Nesterova et al.,, Eur. J. Biochem. 234, 486-494, 1996), PC3m 세포는 금속이온 유입성(MT-발현)운반체인 OT1521/OT1529(McGeady 등, Oncogene 4, 1375-1382, 1989)에 Cα, Cα mutant, RIα 그리고 RⅡβ유전자와 더불어 감염시켰다. Cα 돌연변이 유전자는 벡터 pGEX-4T-1(Amersham Phamacia Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ)로 인간 Cα cDNA(Steven K. Hanks, The Salk Institude, San Diego, CA; Maldonado & Hanks, Neucleic Acids Res. 16, 8189-8190, 1998)을 포함하는 완전 개방 프램BamHI/SalI 절편의 서브클론링, 유전자로 두 개의 돌연변이체를 유입(Kamps et al., Cell 46, 105-112, 1988)하고 NH₂말단 Gly(GGC)에서 Ala(GCA)으로 변환에 의한, 부위-다이렉트 돌연변이 시스템(Stratagene, La Jolla, CA; Catalog No. 200518) 등에 의해 생산했다. 즉, 아래와 같은 프라이머를 이용했다.

5'-ccg-cgt-gga-tcc-atg-gea-aac-gcc-gcc-gcc-3'[SEQ ID NO:2]과

5'-ggc-ggc-ggc-gtt-tgc-cat-gga-tcc-acg-cgg-3'(SEQ ID NO:3].

DNA 서열 분석은 다른 추가적 변이가 없었다는 것을 검증하였다. pGex-Cα(야생형 또는 돌연변이) 벡터 절편의BamHI/Not I은 벡터 pcDNA 3.1(Invitrogen, Carsbed, CA)에 유입시키고, kdma에HindⅢ/XbaI절편을 pGEM-11zf(+)(Promega, Madison, WI)에 유입시겼다. 마지막으로 pGEM-11zf(+) Cα운반체는BamHI로 절단하고, 그 레트로바이럴 벡터인 MT-1(Tortora & Cho-Chung, 1991, 상기에 기재) 벡터 OT1579의(McGeady et al., 1989, 상기에 기재)BamHI 부위로 클론링했다.

PCM 세포는(10⁶세포/100 mm 페트리접시) 라이포펙틴 방법(GIBCO-BRL)에 의해 Cα, Cαmut, PKA의RIα 또는 RⅡβ 부 단위체가 포함된 MT-발현된 벡터 플라스미드 7.5 μg과 함께 감염시켰다. 감염 후 48시간이 지나서 네오마이신 아날로그인 G418을 배지에 넣고 2 ~ 3주 후에 살아남은 클론을 분리했다. 집락은 60 μM의 ZnDO₄를 넣고 6일간 배양하고 그들의 발현을 조사하였다. 과잉발현된 유전자의 클론들은 모두 모으고 실험에 사용하였다. 클론들은 각 감염된 유전자의 과잉발현을 선택하였고 세포내와 세포외의 PKA 수준을 측정하였다.

세포에서 과잉발현된 Cα는 도 3e와 같이 세포내 PKA(세포 추출물)의 증가를 보였고, 이것은 기질 또는 억제제에 따라 세포추출물의 유리 PKA 또는 총 PKA활성(units/mg 단백질)의 히스토그램이다. 또한 기질 또는 억제제에 따른 세포배양 배지 내의 유리 PKA 활성(mUnits/10⁶Cell/mL)을 나타낸 도 3f와 같이 세포외 PKA(조건이 주어진 배지)가 6배 증가되었다. RIα 과 발현은 도 3e과 같이 세포내 PKA의 3배 증가를 가져왔고, 도 3f에서 보면 세포외 PKA는 5배 증가를 보였다. 세포외 PKA의 이러한 증가는 세포의 손상에서 오는 것이 아니며, 그 이유는 비감염 부계 세포를 키우는 배지에서 동일한 수준의 LDH를 유지하고 있기 때문이다[LDH 활성(mUnits/10⁶Cells/mL)을 히스토그램으로 나나낸 도 3g]. DEAE-컬럼 크로마토그래피 분석은 Cα와 RIα과 발현이 cAMP 단독으로 존재시 또는 cAMP 와 PC3M Cα(도 4a: 비감염된 PC3M 부계 세포를 대조군으로 나타낸 선형그래프이다)의 존재하에서 염화나트륨의 농도에 따라 분획별 PKA 활성(units/50μl)을 선형그래프로 그린 도 4b와 같이 타입Ⅱ PKA의 수준에 따른 효과 없이도 타입 I PKA 완전효소의 수준이 증가되도록 이끄는 것을 보여주었다. 그리고 도 4d는 cAMP가 단독으로 존재하든지 또는 cAMP와 PC3M RIα를 위해 PKI가 존재할 때에 염화나트륨의 농도에 따른 분획수에 따라 PKA 활성의 선형그래프를 나타낸 것이다.

도 3e와 같이 RⅡβ 과잉발현은 세포내 PKA수준은 변화가 없었고, 특이할만한 것은 도 3f에서 보듯이 세포외 PKA 발현에서 환원된다는 것이다. DEAE 컬럼 크로마토그래피는 RⅡβ 과잉발현은 PKA-Ⅱ의 상승조절(upregulation) 사이에서 PKA-I의 특이할만한 억제조절(down-regulation)이 일어났다. 도 4e는 cAMP 단독으로 존재시 또는 cAMP와 PC3M RⅡβ의 존재시에서 염화나트륨농도에 따른 분획별 PKA 활성(units/50μl)의 선그래프이다. 중요한 것은 RⅡβ의 과잉발현은 균일하고 느린 세포 성장으로 보이는 세포 형태 변화를 가져왔다(이것은 PBS로 세포를 세척하고 70%의 메탄올로 고정한다음 Giemsa(Bio-Rad, Sigma Chemical Co.)염색을 15분간 시행하여 역상 현미경으로 관찰하였다). 반면에 Cα또는 RIα-과발현된 세포는 어떠한 세포 형태 변화나 세포 성장에 영향을 보이지 않았다.

실시예 6: PKA의 억제 기전

본 실시예는 PKA 촉매적 부단위의 미리스틸레이션의 억제가 세포외 PKA 발현을 억제시키는 것을 증명한 것이다.

PKA의 촉매적(C) 부단위는 myristic acid(Carr등, PNAS USA 79, 6128-6131, 1982)와 더불어 아미노 말단에서 아실화되어 있다. 정자의 C 아단위(Cs)에서 아미노말단 미리스테이트(myristate)와 Cα의 첫 14개의 아미노산은 아미노 말단 아세테이트와 여섯 개의 다른 아미노산에 의해 구성되어 있다(San Agustin 등, J. Biol. Chem. 38, 24874-24888, 1998). 이미 알려진 보고는 이러한 Cα의 서로 다른 아미노 말단이 아마도 정자 편모(San Agustin, 1998, 상기에 기재)안의 유리 C 아단위의 분포에 폭넓게 요구되는데 연관이 있을 것이다. 여기서 보는 바는 세포외 PKA로 기대되는 C 아단위의 미리스틸레이션의 가능한 역할을 아실화된 아미노 말단의 글라이신은 알라닌으로 돌연변이 시킨 cDNA 벡터인 OT1529를 이용하여 실험하였다(McGeady 등, 1989, 상기에 기재).

도 3e에서 보면 변이 Cα, Cα-ala-과잉발현 세포는 동일하나 자연타입의 Cα 과발현 세포에 비해 세포내 PKA 수준이 증가되어 있다. 그러나 현저하게 세포외 PKA수준이 증가된 자연타입의 Cα-과발현 세포와 같지 않게 변형된 Cα-ala-과잉발현 세포는 비감염 모세포보다 세포외 PKA수준이 증가되지 않았다(도 3f)

DEAE-컬럼 크로마토그래피를 위한 준비로 세포 침전물(4×10⁷Cells)을 얼음으로 냉각시킨 염화나트륨/Pi 완충액으로 2회 세척하고 10 mM Tris/HCl pH 7.1, 1mM DTT, 0.5mM 페닐메친술포닐플로라이드(PMSF), 1mM benzamidine, 30 μg/mL leupeptin, 5.0 μg/mL aprotinin, 그리고 5.0 μg/mL pepstatin 이 들어 있는 완충액 15mL을 넣어 잘 부유시키고 얼음속에서 30분간 반응시킨다. 세포는 Dounce 분쇄기로 분쇄하고 10,000 g에서 20분간 원심분리하여 0.45μm 구경의 주사기 필터를 통하여 거렸다. 상청액을 위하여 Bradford법을 이용하여(BioRad) 단백질을 정량하고 크로마토그래피를 위한 세포추출액으로서 사용했다. DEAE 컬럼(0.9×5.0 cm)은 완충액 A(10mM Tris/HCl, pH 7.1, 1mM EDTA와 1mM PMSF 포함)로 동질화시켜 두었다. 세포 추출액(10 mg 단백질)을 컬럼위에 적하하고 30 mL의 완충액 A로 세척해 주었고 0-0.4M 기울기로 염화나트륨-완충액 A로 용출시켰고 분획은 1.4mL 씩 취했다. PKA 정량은(총 100 μl) 실시예 1에서 기술한 바와 같이 실험하였고 컬럼 분획의 50 μl씩을 사용하였다.

DEAE 컬럼 크로마토그래피 분석은 변이 Cα-ala 세포가 cAMP 단독으로 존재하던지 cAMP와 PC3M Cαmut를 위한 PKI가 존재할 때 염화나트륨 농도에 따른 분획별 PKA 활성(units/50μl)의 선그래프인 도 4b와 도 4c가 보여주듯이 변이 Cα-ala 세포가 PKA-I 완전효소 수준이 자연타입인 Cα 세포와 동일한 범위까지 유도할수 있음을 보여주었다. 이러한 결과는 N-말단 미리스틸레이션이 세포외 공간으로 C 부 단위의 배출을 위한 필수 요구조건임을 나타내고 있다.

실시예 7: extra PKA와 세포내 PKA의 면역학적 관계

본 실시예는 세포외 PKA가 세포내 PKA에 대해 면역학적으로 연관성이 있다는 것을 증명한 것이다. 모세포 또는 감염된 PC3M 세포를 60 μM의 ZnSO₄의 유무에 따라 배양하였다. 세포는 실시예 1에서 제시한 바와 같이 분리하였다. 이 조절된 배지에서 PKA 부단위를 검출하기 위해 10mL의 PC3M 배양 배지를 150회 microcon(Milipore, Bedford, MA)로 농축시켰다. 세포 추출액으로부터 10 μg의 단백질 또는 20 μl의 농축된 배양액은 SDS-PAGE에 적용시키고 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스 용지에 전이시켰다. 압지는 5%의 탈지우유와 1%의 소 혈청알부민으로 4℃에서 1시간동안 블록킹을 하고 Cα, RIα 또는 RⅡβ에 대한 단클론항체(Phamingen/Transduction Laboratoris, San Diego, CA)로 4℃에서 4시간동안 반응시킨 후 압지는 세척하고 호스래디쉬퍼옥시다아제가 결합된 이차항체와 함께 반응시키고, Amersham ECL^TMsystem(Amersham, Phamacia Biotechnology, Inc.)를 이용하여 가시화시켰다.

항-사람 Cα 항체로 탐지로서 세포 추출물에서와 배양액에서 Cα 단백질의 존재를 증명할수 있었다. 세포추출액과 조절된 배양액에서의 Cα 단백질은 SDS-PAGE상에서 40 KDa의 단일 단백질 밴드로 동일한 거리에 서로 모여있었고 항-사람 RIα 항체로 탐지했을 때 세포 추출액과 조절된 배양액에서 48 KDa의 단일 단백질의 밴드를 확인하였다. RⅡα와 RⅡβ는 단지 세포 추출액에서만 검출되었고 조절된 배양액에서는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 세포외 PKA는 타입 I PKA라는 것을 나타내었다.

실시예 8: 암환자의 혈청내 PKA 활성

본 실시예는 암환자의 혈청내 세포외 PKA 존재를 증명하는 것이다. 혈청 시료는 다양한 암과 신장, 결장, 직장, 그리고 피부암종과 흑색종을 포함하여 LDH 활성과(혈청을 6배 희석해서 10 μl 사용하였다) PKA 활성(혈청 10μl를 사용하였다)을 실시예 1에서 기술한대로 측정하였다. 도 5a는 신장 암종세포(n=7), 흑색종(n=5), 기타 암종(n=6), 그리고 총 암종(n=18)으로부터 환자와 정상환자로부터 보이는 혈청시료별 PKA 활성(mUnits/mL)을 나타낸 막대그래프이다. 세포외 PKA활성은 정상 혈청시료에서와 비교해볼 때 암환자의 혈청시료에서 유의할만하게 증가되어 있었다. 신장세포 암종, 흑색종 그리고 기타 암종환자의 혈청안에서의 PKA 활성(mU/mL)의 표준오차는 각각 9.84±5.44(범위:2.13-22,62;n=7); 5.15±2.38(범위 :1.62-8.12;n=5) 그리고 3.52+1.41(범위:1.62-6.75;n=6)이었다. 세포외 PKA활성은 정상 혈장내에서 0 ~ 1.10mUnits/mL(평균치=0.52mUnits/mL)의 범위로 측정되었다. 그리고 평균 세포외 PKA 수준은 무든 암환자의 경우(평균 표준오차 :6.17±2.45, n=18) 정상 사람 혈청(평균 표준오차: 0.52±0.18; 범위 0.1.10; n=12)에 비해 평균 PKA 수치보더 10배 높은 것으로 나타났다. 더 나아가서 cAMP로 활성화시키지 않은 사람혈청에서는 세포외 PKA가 검출되었지만 PKA 억제제인 PKI에 의해서는 제어되었다. 이것은 사람혈청내에 존재하는 세포외 PKA는 '자유'로운 C 부 단위일 때 활성이 존재한다는 것임을 나타내었다. 모든 시료의 LDH 수준은 사람 시료에서 세포 붕괴를 보이는 유의점의 없는 사람의 혈청과 LDH 활성(mUnits/mL)을 막대그래프로 나타낸 도 5b를 보면 148 ~ 158mU/mL(정상범위:55-170mUnits/mL)로 비교할만한 수치를 나타내고 있다.

이상 상기 실시예에서 설명한 바와 같이 혈청을 비롯한 체액에서 extraPKA의 활성을 측정하여 유방암을 비롯한 각종 호발성암을 조기에 진단하는 뛰어난 효과가 있고 치료에 따른 예후를 판정하고 표적 암세포에서 PKA-Ⅱ로부터 유래하는 RⅡβ아형을 억제시켜 extraPKA량을 조절하므로써 효과적으로 암을 치료하는 뛰어난 효과가 있으므로 난치병으로 알려진 인류의 내과적 질병인 암을 초기에 신속하고 정확하게 진단하며 그 예후 및 치료 효과를 높이는 새로운 방법으로 의학 산업상 매우 유용한 발명이다.

Claims (7)

1. 암환자에서 분리한 혈액내 혈청 또는 소변 시료를 세포외 cAMP 의존적 단백질 카인나제(extraPKA)의 양이 0.1 ~ 1.0mUnit/mL인 대조시료와 비교하여 증가된 세포외 cAMP 의존적 단백질 카인나제의 양을 정량함을 특징으로 하는 extraPKA의 정량방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 방광암, 전립선암 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 암임을 특징으로 하는 extraPKA의 정량방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 cAMP 의존적 단백질 카인나제 정량은 extraPKA 촉매 아단위에 특이적인 항체 또는 extraPKA의 조절 아단위에 특이적인 항체를 이용한 ELISA방법으로 측정하는 것임을 특징으로 하는 extraPKA의 정량방법.
4. 암환자에서 분리한 혈액내 혈청 또는 소변 시료에서 (a) 초기에 정량한 extraPKA의 수준과 치료경과 후 감소된 extraPKA의 수준을 비교하는 암의 호전상태의 예후 판정단계 (b) 초기에 정량한 extraPKA의 수준과 암진행 경과 후 extraPKA의 수준을 비교하는 암의 진행 상태의 예후 판정단계 (c) 초기 상태의 extraPKA의 수준 보다 경과 후 증가된 extraPKA의 수준을 비교하는 것을 특징으로 하는 extraPKA의 정량방법.
5. 제 4 항에 있어서, 암은 유방암, 전립선암, 난소암, 방광암으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 암임을 특징으로 하는 extraPKA의 정량방법.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 세포외 cAMP 의존적 단백질 카인나제 정량은 extraPKA 촉매 아단위에 특이적인 항체 또는 extraPKA의 조절 아단위에 특이적인 항체를 이용한 ELISA방법으로 측정하는 것임을 특징으로 하는 extraPKA의 정량방법.
7. 표적 암세포에서 PKA-Ⅱ로부터 유래하는 RⅡβ아형을 발현하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 extraPKA의 발현을 억제하는 암 치료용 재조합 벡터 조성물.