KR20050054387A - 암진단용 프로테인 키나제 에이 항체 분절 및 알칼리성포스파타제의 융합단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로테인 키나제 에이(protein kinase A, PKA)를 인지하는 항체와 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase, PhoA)를 결합시킨 융합단백질에 관한 것이다.
상기 융합단백질(anti-PKA Fab-PhoA)로 ELISA법을 실시함으로써 암 표지 분자인 PKA를 간편하게 검출할 수 있으므로 이는 암 진단 용도로 널리 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 PKA를 인식하는 항체의 분절과 검출에 사용되는 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase, PhoA)를 융합단백질 형태로 발현시킴으로써 PKA를 간단하게 검출함으로써 암을 진단할 수 있는 방법에 관한 것이다.
암은 인류가 직면하고 있는 많은 질환 중에서 인간의 수명을 단축시키는 주요 요인이 되고있고, 일부 치료제도 개발되고 있지만, 아직까지도 정복되지 않은 인류의 치명적인 질병이다. 그러나 인체의 각종 암에 있어 조기에 간편하게 진단할 수 있는 시약이 개발된다면, 조기 치료를 실시할 수 있어 예후가 좋아 궁극적으로 인류의 수명을 연장할 수 있을 것으로 예상된다. 우리나라의 암 발생률을 예로 든다면 치료될 수 없는 악성 암환자가 1996년도의 통계로 보면 72,323명으로 이들 중 95%이상 사망한 것으로 보고되었다[참조: 한국중앙암등록 사업 연례 보고서, 보건복지부, 1997]. 이러한 보고는 전년도에 비해서 11.5% 증가된 것으로 보아 2003년 현재는 15만 명으로 추정된다. 암이 원인이 되어 사망되는 환자들은 일반적으로 인체의 다른 여러 조직에 암세포의 만연된 상태로 병원에 오기 때문에 의사의 진단을 받을 때에는 치료의 적절한 시기를 이미 놓쳐 사망에 이르게 된다.
지금까지 암을 진단할 수 있는 표지분자들로서는 AFP(alpha-fetoprotein), CEA(carcinoembryonic antigen), β-HCG(beta-human chorionic gonadotrophic hormone), CA19-9 및 SCC 등이 알려져 있다. 그러나 이들은 암세포뿐만 아니라 다른 질환 등에서도 유리되기 때문에 오류가 발생될 가능성이 높고 실제로도 진단율이 낮은 편이다. 따라서 이들은 정확한 암의 진단보다는 암의 진행정도 또는 경과를 보기 위한 하나의 지표로 사용되고 있다. 이러한 현 실정에도 불구하고 대학병원 1개소에서만 시약 당 연간 7,000∼10,000건 이상 사용된다.
ECPKA (extracellular cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase)는 정상세포에서는 세포질 내에 존재하지만, 세포의 유전적인 변이와 화학물질에 의한 변형세포 등 종양세포에서는 특별하게 세포막에 존재하면서 세포 외로 분비되는 분비성 효소이므로 정상인의 혈청 내 존재하는 양 보다 종양을 가진 환자에서 그 양이 수배 이상 증가된다. 이것은 지금까지 발견된 암 진단 표지분자보다 그 특이성이 매우 우수한 것으로 판단된다. 그러므로 이 표지 분자를 이용하면 인체의 각종 암을 쉽고 간편하게 조기에 진단할 수 있다.
기존에 사용되고 있는 특정항원을 인식하는 항체를 만드는 방법은 항원을 동물에 주사하여 다클론(polyclonal) 항체를 얻는 방법과 세포융합기술을 이용하여 단클론 항체를 제작하는 것이다. 그러나 이들 방법은 긴 시간을 요하며, 다클론(polyclonal) 항체의 경우는 일정량만을 얻을 수 있다. 생산량에 제한이 없는 단클론 항체의 경우도 초기 제작과정과 대량생산 시 긴 시간과 많은 비용을 필요로 한다. 현재 특정 항원의 진단에 널리 사용되고있는 ELISA 방법은 항원을 인식하는 항체를 처리하고 이 항체를 인식하는 항체에 발색반응을 일으키는 효소가 융합된 이차항체를 다시 처리하는 방법으로 번거롭고 상대적으로 많은 시간을 필요로 한다.
이와 같은 단점을 극복하기 위하여 본 발명자들은 항체의 유전자를 직접 이용하여 유전공학적 방법으로 보다 저렴한 비용으로 빠른 시간에 대량생산이 가능한 대장균에서 항체를 얻을 수 있는 방법을 개발하였다. 또한 발색반응을 일으키는 효소의 유전자와 항체의 유전자를 연결하여 항체와 발색효소가 융합되어 발현되게 함으로서 보다 간편하게 ELISA를 시행할 수 있도록 하고자 하였다.
본 발명은 프로테인 키나제 에이(protein kinase A, PKA)를 인식하는 항체 분절과 검출에 사용되는 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase, PhoA)를 결합시킨 융합단백질을 제공하고, 상기 융합단백질을 이용하여 ELISA를 시행함으로써, 간편하게 암을 진단할 수 있도록 함에 그 목적이 있다.
본 발명은 프로테인 키나제 에이(protein kinase A, PKA)를 인지하는 항체와 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase, PhoA)를 결합시킨 융합단백질에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 상기 융합단백질(anti-PKA Fab-PhoA)로 ELISA법을 실시하여 암 표지 분자인 PKA를 검출함으로써, 간편하게 암을 진단할 수 있도록 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 pComb3 벡터를 변형하여 항체분절과 알칼리성 포스파타제(Alkaline phosphatase, PhoA)가 결합된 상태로 발현될 수 있게 하는 FLSPA 벡터를 제작하였다. 이후 PKA를 면역시킨 쥐로부터 mRNA를 얻고 여러 번의 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)으로 항체분절의 유전자를 만든 후 FLSPA 벡터에 넣고 대장균에서 발현시켜 PKA에 결합하는 항체분절과 PhoA의 융합단백질을 선별해 내었다. 선별된 anti-PKA Fab-PhoA를 대장균에서 발현시킨 뒤 웨스턴 블럿(Western blot)과 ELISA 방법을 수행한 결과 특이적으로 PKA를 인식함을 알 수 있었다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 완성된 anti-PKA Fab-PhoA 중 항체분절 부분의 가변영역의 염기서열과 그에 따른 아미노산 서열
Fab-PhoA 라이브러리(library)를 제작하기 위하여 ECPKA를 면역한 쥐로부터 비장을 취해 MRC의 TRI 시액(Reagent)을 이용하여 총(total) RNA를 분리하였다. SuperScript First-strand synthesis system(Invitrogen)으로 RT-PCR을 이용하여 0.2 mg의 RNA를 cDNA로 합성하였다. cDNA를 주형으로 쥐 항체의 가변영역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트(primer set)를 이용하여 쥐 항체의 중사슬과 경사슬의 가변영역을 증폭, 분리하였다. 동일한 방법으로 사람 항체의 불변영역을 얻어 linker PCR 방법으로 경사슬과 중사슬 분절로 만든 다음 다시 linker PCR방법으로 하나의 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)로 제작하였다. 제작한 폴리뉴클레오티드를 FLSPA 벡터에 넣어 Fab-PhoA 라이브러리(library)를 제작하고 ER2738 (NEB) 균주에 전기충격법(electroporation)으로 형질전환(transformation)시켰다. 상기 FLSPA 벡터는 pComb3 벡터(전북대학교 정준호 교수로부터 입수함)를 변형한 것으로, 항체분절과 알칼리성 포스파타제(Alkaline phosphatase, PhoA)가 결합된 상태로 발현될 수 있도록 PCR법으로 제작한 것이다.
ECPKA에 특이적으로 결합하는 Fab-PhoA는 M13 파지(phage)의 표면에 Fab-PhoA를 발현시킨 뒤 ECPKA에 결합하는 파지(phage)를 취하는 방법으로 선별하였다. Fab-PhoA를 파지(phage) 표면에 발현시키기 위하여 Fab-PhoA 라이브러리 (library)가 들어있는 ER2537를 0.05 mg/ml의 카르베니실린(carbenicillin)이 들어있는 SB 배양액 15 ml에 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양한 다음 VCSM13 헬퍼 파지(helper phage)와 카르베니실린(carbenicillin)이 들어 있는 SB 배양액 200 ml에 넣어 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양액상에 떠있는 파지(phage)들은 3000 x g로 15분간 원심분리하여 균을 제거한 다음 4%의 PEG8000과 3%의 NaCl을 넣고 다시 15000 x g에서 15분간 원심분리하여 침전시킨 후 1%의 BSA가 들어있는 TBS 2 ml에 녹여 ECPKA와의 결합반응에 사용하였다. ECPKA에 결합하는 파지를 선별하기 위하여 준비된 파지들을 ECPKA가 붙어 있는 ELISA 플레이트(plate)에 넣고 37℃ 에 2시간 동안 둔 다음 결합하지 않은 파지는 0.5 %의 Tween 20이 들어 있는 TBS로 10회 세척하여 제거하였다. 결합되어 있는 파지는 10 mg/ml의 트립신(Trypsin)이 들어있는 TBS를 넣어 떼어낸 다음 다시 ER2537 균주에 넣고 키워서 파지(phage)를 준비하여 다시 결합하는 것을 선별하는 것을 6회 반복하였다.
선별된 파지(phage)가 가지고 있는 벡터의 염기서열을 분석한 결과 동일한 항체의 유전자를 갖고 있었다(도 1 참조).
실시예 2: 대장균에서 발현된 anti-PKA Fab-PhoA와 이를 이용한 웨스턴 블럿과 ELISA 결과
선별된 anti-PKA Fab-PhoA를 ER2537에 형질전환(transformation) 시킨 뒤 0.05 mg/ml의 카르베니실린(carbenicillin)이 들어있는 SB 배양액 20 ml에 넣고 37℃ 에서 12시간 동안 배양한 다음 0.05 mg/ml의 carbenicillin이 들어있는 SB 배양액 1l에 접종한 후 37℃에서 배양하다가 O.D.600 값이 0.5일 때 0.5 mM의 IPTG를 넣고 30℃에서 20시간동안 배양하였다. 배양액을 전기영동으로 분리한 후 니트로셀룰로오스 페이퍼(Nitrocellulose paper)에 일렉트로트랜스퍼(electrotransfer)하고 anti-PKA Fab-PhoA를 인식할 수 있는 anti-HA antibody를 이용하여 웨스턴 블럿(western blot)을 수행하였다. 그 결과 순수한 배양액 내에 anti-PKA Fab-PhoA가 발현되어 존재함을 확인할 수 있었다(도 2a 참조).
anti-PKA Fab-PhoA의 PKA에 대한 결합능을 알아보기 위하여 소의 PKA를 전기영동한 후 니트로셀룰로오스 페이퍼(Nitrocellulose paper)에 일렉트로트랜스퍼 (electrotransfer)한 다음 anti-PKA Fab-PhoA의 배양액을 이용하여 웨스턴 블럿(western blot)을 수행하였다. 배양액을 원심분리하여 대장균을 분리하고 순수한 배양액만을 얻어 농축한 용액을 PKA가 트랜스퍼(transfer)된 니트로셀룰로오스 페이퍼(Nitrocellulose paper)와 반응시킨 뒤 TTBS로 세척하고 anti-HA antibody-HRP와 반응시킨 결과 anti-PKA Fab-PhoA가 PKA에 결합함을 확인할 수 있었다(도 2b 참조).
Anti-PKA Fab-PhoA의 PKA에 대한 결합능은 ELISA 방법을 통해서도 확인 되었다. 96 웰 플레이트(well plate)에 PKA를 넣고 4 ℃에서 8 시간 이상 반응시키고 상청액을 제거하였다. 이를 TTBS로 세척한 후 여기에 비 특이적 결합을 방지한 블로킹 용액(blocking solution)을 첨가하여 실온에서 1 시간을 반응시켰다. TTBS로 세척한 후 anti-PKA Fab-PhoA의 배양 농축액을 넣고 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이를 TTBS로 3회 세척한 후 2% BSA가 포함된 TTBS에 희석한 anti-HA antibody를 첨가하고 실온에서 1 시간을 반응시켰다. 그 후 TTBS로 3회 세척한 후 안정제(stabilizer)가 함유된 ABTS에 과산화수소를 첨가한 후 각 웰(well)에 첨가하여 실온에서 20 분간 반응시켰다. 그 후 스펙트로포토미터(Molecular Device, USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 anti-PKA Fab-PhoA가 PKA에 결합함을 확인할 수 있었다(도 2c 참조).
상기 실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 PKA를 인식하는 항체의 분절과 검출에 사용되는 알칼리성 포스파타제(PhoA)를 성공적으로 융합 발현시킬 수 있었으며 PKA에 대한 결합능력을 나타내었다. 이는 간편한 방법으로 PKA를 검출하는데 사용되어질 수 있어, 암 진단 용도로 활용될 수 있으므로 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 완성된 anti-PKA Fab-PhoA 중 항체분절 부분의 가변영역의 염기서열과 그에 따른 아미노산 서열이다.
도 2a는 대장균에서 발현된 anti-PKA Fab-PhoA를 검증한 결과이다.
도 2b는 발현된 anti-PKA Fab-PhoA를 이용한 소(bovine) PKA의 웨스턴 블럿 결과이다.
도 2c는 발현된 anti-PKA Fab-PhoA를 이용한 소(bovine) PKA의 ELISA 결과이다.
<110> A.B.I. Co.,Ltd
<120> anti-PKA Fab-PhoA fusion protein for diagnosing cancer
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> light chain variable of anti-PKA Fab-PhoA fusion protein
<400> 1
Glu Leu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser
1 5 10 15
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser
20 25 30
Tyr Met Leu Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable of anti-PKA Fab-PhoA fusion protein
<400> 2
Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Met Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp
20 25 30
Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ala Ile Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Thr Gly Tyr Asn Gln Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Lys Gly Thr Thr Val Val Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gene coding light chain variable of anti-PKA Fab-PhoA
<400> 3
gagctcgata ttgttctcac ccagtctcca gcactcatgt ctgcatctcc aggggagaag 60
gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gcaagttaca tgttatggtt ccagcagaag 120
ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcatatcca acctggcttc tggagtccct 180
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagaatggag 240
gctgaagatg ctgccactta ttactgccag caaaggagta gttacccgta cacgttcgga 300
ggggggacca agctggagct gaaa 324
<210> 4
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gene coding heavy chain variable of anti-PKA Fab-PhoA
<400> 4
ctcgaggtcc aactacagca gcctggggct gagcttgtga tgcctggggc ttcagtgaag 60
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aggcctggac aaggccttga gtggatcggg gcgattgata cttctgatag ttatactggc 180
tacaatcaaa agttcaaggg caaggccaca ttgactgtag acgaatcctc cagcacagcc 240
tacatgcagc tcagcagcct gacatctgag gactctgcgg tctattactg tgcaagaaag 300
ggtactacgg tagtagccga ctactttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360
tcctca 366
Claims (1)
- 프로테인 키나제 에이(PKA) 항체와 알칼리성 포스파타제(PhoA)를 결합시키는 것을 특징으로 하며, 서열번호 1 및 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 재조합항체.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020030087758A KR20050054387A (ko) | 2003-12-04 | 2003-12-04 | 암진단용 프로테인 키나제 에이 항체 분절 및 알칼리성포스파타제의 융합단백질 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101451227B1 (ko) * | 2014-03-06 | 2014-10-15 | 강원대학교산학협력단 | Pka 활성을 이용한 암 진단용 조성물 및 암 전이 진단을 위한 정보제공 방법 |
| KR102314451B1 (ko) * | 2021-01-12 | 2021-10-20 | 크레너지 주식회사 | 단백질 키나아제 a의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 활용한 암 진단 용도 |
| US11492654B2 (en) | 2014-03-06 | 2022-11-08 | Kangwon National University University-Industry Cooperation Foundation | Method for measuring protein kinase activity and kit for same |
-
2003
- 2003-12-04 KR KR1020030087758A patent/KR20050054387A/ko not_active Application Discontinuation
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| WO2022154288A1 (ko) * | 2021-01-12 | 2022-07-21 | 주식회사 낙스 | 단백질 키나아제 a의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 활용한 암 진단 용도 |
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