KR101559479B1 - 고감도 바이오센서용 다가항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고감도 바이오센서용 다가항체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 한 쌍의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 면역글로블린 G(IgG)의 Fc 영역에 항원 결합능을 가지는 fab 단편(fragment)과 Fc 결합 펩타이드(Fc binding peptide; FcBP)가 융합된 FabFcBP가 결합되어 있는 다가항체(multivalent antibody)에 관한 것이다.
본 발명의 다가항체는 일반 항체보다 감도가 뛰어나므로, 다양한 종류의 항체에 적용하여 바이오센서 및 키드 등의 암 진단용으로 활용할 수 있으며, 특히, 본 발명의 다가항체 구조로 이루어진 J1FcBP는 일반 Jagged 1 항체보다 감도가 뛰어나므로, Jagged 1 시그널과 관련된 질병을 고민감도로 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

고감도 바이오센서용 다가항체{Multivalant Antibodies for Ultrasensitive Biosensor}

본 발명은 고감도 바이오센서용 다가항체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 한 쌍의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 면역글로블린 G(IgG)의 Fc 영역에 항원 결합능을 가지는 fab 단편(fragment)과 Fc 결합 펩타이드(Fc binding peptide; FcBP)가 융합된 FabFcBP가 결합되어 있는 다가항체(multivalent antibody)에 관한 것이다.

면역글로불린 (Ig)은 이황화 결합에 의해 결합된 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄 (경쇄 하나씩 이황화 결합에 의해 각 중쇄에 결합되어 있음)로 구성되어 있으며, 각 중쇄의 한 말단에는 가변 도메인 (VH)가 있고, 이 도메인 뒤에는 다수의 불변 도메인 (항체 부류에 따라 3개 또는 4개의 불변 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4))이 있다. 각 경쇄의 한 말단에는 가변 도메인 (VL)이 있고 다른 말단에는 불변 도메인 (CL)이 있으며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되어 있고, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되어 있다. Ig 중쇄의 COOH-말단 도메인은 Fc 영역을 형성하며, 이는 Fc 수용체 (FcR)라 알려진 특이적 수용체와의 상호작용을 통해 세포 활성을 촉진하는데 관여한다.

다가항체(multivalant antibody)는 동일하거나 상이한 항원 상의 두개의 다른 에피토프에 결합하는 면역글로불린(Ig)-기반 분자로, 예를 들어 작동 세포, 방사핵, 약물 및 톡신과 같은 세포 독성제와 함께 종양 세포를 표적화하거나(Weiner et al ., Cancer Immunol . Immunother ., 45:190. 1997; van Spriel et al ., Immuol . Today, 21:391, 2000; Segal et al ., J. Immunol . Methods , 248:1, 2000), 또는 개별 항체 치료에서 생물학적 활성을 증가시키기 위해 두 개 이상의 상이한 종양 표적(또는 에피토프, 항원)을 동시에 표적화함으로써(Lu et al ., J. Immunol . Methods, 230:159, 1999; Lu et al ., Cancer Res ., 61:7002, 2001; Lu et al ., J. Immunol. Methods , 267:213, 2002) 암 치료용 항체로 사용될 수 있으며, 표적 결합능이 우수하기 때문에 진단센서에 활용될 수 있다.

다가항체-기반 진단 및 치료제를 개발하는 데 있어 하이브리드 하이브리도마와 화학적 접합(Carter et al ., J. Hematotherapy , 4:463, 1995)을 포함하는 종래의 기술을 통해서는 임상 연구에 충분한 양 및 품질의 물질을 제조하기 어려우며, 두 개 이상의 IgG 또는 그들 단편의 화학적 교차-결합은 비효과적이며 항체 활성 손실을 야기하는 문제점이 있다.

다가항체의 효율 개선을 위해, 항체 단편 또는 전장(full-length) IgG 형태로 생성하기 위한 다양한 재조합 방법이 개발되고 있다. 예를 들어, 효과적인 IG CH3 도메인 헤테로타이머화를 위한 일명 "놉즈-인투-홀즈(knobs-into-holes)" 기술(Ridgway et al ., Protein Eng ., 9:617, 1996; Merchant et al ., Nat . Biotech., 16:677, 1998)을 사용하거나, 또는 특이성이 상이한 두개의 단일 쇄 Fv(scFv)를 전장 IgG 분자의 N- 또는 C-말단에 융합합으로써(Zhuang et al ., Protein Eng ., 13:361, 2000; Coloma and Morrison, Nat . Biotechnol ., 15:159, 1997) 균질한(homogeneous) 다가항체를 제조하였다. 또한, 루이신 지퍼와 같은 이합화 디바이스(Kostelny et al ., J. Immunol ., 148:1547, 1992; de Kruif et al ., J. Biol . Chem., 271:7630. 1996), 및 Ig CL/CH1 도메인(Muller et al ., FEBS Lett ., 422:259, 1998); 디아바디(diabody)(Holliger et al ., Proc . Nat . Acad . Sci . USA ., 90:6444. 1993; Zhu et al ., Bio / Technology ( NY ), 14:192, 1996); Fab-scFv 융합(Lu et al ., J. Immunol. Methods , 267:213, 2002); 및 미니항체 포맷(Pack et al., Biochemistry , 31:1579, 1992)을 통하여, 두개의 단일 쇄 Fv(scFv) 또는 Fab 단편을 유전학적으로 융합하여 다가항체를 제조하였다.

한편, Notch의 리간드인 Jagged 1은 유방암 환자에 있어서는 안 좋은 예후(Reedijk M. et al ., Cancer Res ., 15;65:8530, 2005)와, 전립선암에서는 암 전이와 관련이 있다고 알려져 있으며(Santagata S. et al ., Cancer Res., 64:6854, 2004), Notch/리간드 결합으로 시작되는 Notch 신호전달 체계는 kinase 같은 효소적 신호 증폭이 없어 비교적 정확하게 신호강도를 조절할 수 있어 Notch 신호전달이 암 연구에서 주목을 받고 있다. Notch 신호전달은 Notch/리간드 결합을 방해하는 단일클론 항체를 이용해 Notch 신호전달 초기단계에서 억제할 수 있으며, Notch 리간드인 Dll4를 타켓으로 하는 단일클론 항체가 개발되어 내피세포에서의 Notch 신호전달을 억제해 혈관 생성을 제한한다는 보고가 있고(Ridgway J. et al ., Nature, 444:1083, 2006), 현재 Notch와 관련된 암 진단을 위한 항체 및 Notch 신호전이를 방해할 수 있는 많은 단일클론 항체들이 개발중이다 (Yan M. et al ., Nature, 464:1052, 2010).

이에, 본 발명자들은 고감도의 바이오센서용 다가항체를 제공하기 위하여 예의 노력한 결과, 한 쌍의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 면역글로블린 G(IgG)의 Fc 영역에 항원 결합능을 가지는 fab 단편(fragment)과 Fc 결합 펩타이드(Fc binding peptide; FcBP)가 융합된 FabFcBP가 결합되어 있는 다가항체(multivalent antibody)가 고민감도로 항원 또는 항원펩타이드를 인식하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 고민감성 바이오센서용 다가항체를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한 쌍의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 면역글로블린 G(IgG)의 Fc 영역에 항원 결합능을 가지는 fab 단편(fragment)과 Fc 결합 펩타이드(Fc binding peptide; FcBP)가 융합된 FabFcBP가 결합되어 있는 다가항체(multivalent antibody)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 다가항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 암 진단용 바이오센서를 제공한다.

본 발명의 다가항체는 일반 항체보다 감도가 뛰어나므로, 다양한 종류의 항체에 적용하여 바이오센서 및 키드 등의 암 진단용으로 활용할 수 있으며, 특히, 본 발명의 다가항체 구조로 이루어진 J1FcBP는 일반 Jagged 1 항체보다 감도가 뛰어나므로, Jagged 1 시그널과 관련된 질병을 고민감도로 진단할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 다가항체 구조에 관한 모식도이다.
도 2는 Jagged 1에 결합하는 항체의 Fab 단편이 클로닝 되어 있는 파지미드 벡터의 모식도이다.
도 3은 발현된 J1FabFcBP을 웨스턴 블랏으로 확인한 데이타이다.
도 4는 인간 항체 라이브러리로부터 선별된 Jagged 1 펩타이드에 결합하는 J1 항체를 웨스턴 블랏으로 확인한 데이타이다.
도 5는 J1-FcBP 항체 및 J1 항체를 웨스턴 블랏으로 확인한 데이타이다.
도 6은 Jagged 1 펩타이드가 고정된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩을 이용하여 J1-FcBP 항체 및 J1 항체의 항원결합 능력을 비교한 데이타이다.
도 7은 J1-FcBP 항체 및 J1 항체가 고정된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩을 이용하여 Jagged 1 펩타이드와의 결합능력을 비교한 데이타이다.
도 8은 Jagged 1 펩타이드가 고정된 표면 플라즈몬 공명 센서 칩을 이용하여 농도에 따른 J1-FcBP 항체 및 J1 항체의 항원결합 능력을 비교한 데이타이다.
도 9는 면역침강법을 이용하여 J1-FcBP 항체 및 J1 항체의 항원결합 능력을 비교한 데이타이다.
도 10은 이뮤노 도트(immunodot) 방법을 이용하여 J1-FcBP 항체 및 J1 항체의 항원결합 능력을 비교한 데이타이다.
도 11은 Jagged 1 펩타이드가 고정된 글라스칩을 이용하여 J1-FcBP 항체 및 J1 항체의 항원결합 능력을 비교한 데이타이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 한 쌍의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 면역글로블린 G(IgG)의 Fc 영역에 항원 결합능을 가지는 fab 단편(fragment)과 Fc 결합 펩타이드(Fc binding peptide; FcBP)가 융합된 FabFcBP가 결합되어 있는 다가항체(multivalent antibody)에 관한 것이다.

본 발명의 '항체'는 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함하며, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 단편도 사용될 수 있다. 항체 분자의 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 단일 사슬(single-chain) Fv(scFv), Fab, F(ab'), F(ab')₂, 단일 도메인(single domain) 등을 포함한다.

항체의 '항원-결합 부분' (또는 단순히 '항체 부분')이란 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 지닌 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체(full-length)의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체의 '항원-결합 부분'이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체 단일 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al ., Nature 341:544, 1989);및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다.

본 발명의 '항원'은 항체와 결합하는 부위를 포함하고 있는 분자로, 항원분자에는 항원특히성을 결정하는 입체분자 구조가 존재하고 그것과 대응하는 항체와 반응하며, 그 구조부위를 항원결정기 또는 에피토프라고 한다. 항체와 결합능이 있는 '항원'은 본 명세서에서 사용하는 용어 '항원 펩타이드', '표적 에피토프'와 큰차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명의 '다가항체(multivalent antibody)'는 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체로, 보통, IgG나 IgE급의 항체를 2가 항체, IgM급이나 분비액 내의 IgA급에 속하는 항체처럼 4가 이상의 결합가가 있는 항체를 다가항체로 분류한다. 본 발명에서는 2가 항체인 IgG에 항원 결합능을 가지는 Fab 단편을 결합하여 4가 이상의 결합가가 있는 다가항체를 제조하였다.

본 발명의 'Fab 단편'은 항체를 농도 낮은 환원제가 존재하는 조건에서 단백질분해효소인 파파인으로 소화시켜 얻는 단편의 하나로, 항원-결합 도메인을 포함하고 경쇄 및 이황화 결합에 의하여 브릿지되는 중쇄의 일부를 포함하는 항체 단편이며, Fab 단편들은 F(ab')2 단편에 존재하는 H 사슬들 사이에서 이황화 결합(들)을 가지지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 항원결합 능력을 가진 fab 단편은 면역글로블린 G(IgG)가 결합하는 항원 부위가 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명의 다가항체는 도 1에 나타낸 바와 같이, Fc 결합 펩타이드(Fc binding peptide)에 fab 단편(fragment)이 결합된 Fab-FcBP가 IgG(whole form)의 Fc 영역에 결합되어 있는 구조를 가지고 있어, 항원 또는 표적 에피토프와의 결합력이 일반 IgG보다 높고, 하나 이상의 항원 또는 표적 에피토프를 인지하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다가항체는 진단을 위한 바이오센서용으로 활용하기 위해서 IgG Fc영역의 C-말단에 센서의 표면에 고정될 수 있으므로, 상기 FabFcBP는 면역글로블린 G(IgG) Fc영역의 말단이 아닌 부분에 결합하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 CH2 부분에 결합한다.

본 발명에서 다가항체의 민감성을 확인하기 위해, Jagged 1 또는 Jagged 1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하였으며, 이에 한정되지 않고, 다양한 항원 또는 표적 에피토프를 인식하는 항체를 이용하여 다가항체를 제조할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 다가항체의 민감성을 확인하기 위해, Jagged 1 결합능을 가지는 IgG의 Fc 영역에 Jagged 1 또는 Jagged 1 펩타이드 결합능을 가지는 fab 단편(fragment)과 Fc 결합 펩타이드(Fc binding peptide)가 융합된 J1FabFcBP가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 J1-FcBP 다가항체를 제조하였다.

본 발명에서 'Jagged 1'은 노치 리셉터(notch receptor) 리간드(ligand)에 해당하며, 'Jagged 1'은 본 명세서에서 사용되는 용어 'Jag 1'과 혼용되며, 상기 'J1-FcBP'는 Jagged 1 결합능을 가지는 IgG의 Fc 영역에 J1FabFcBP가 결합되어 있는 다가항체로, 본 명세서의 도면에 표기되어 있는 'Jag 1+FcFab'와 혼용된다.

본 발명의 일 실시예에서, J1FabFcBP는 Jagged 1에 결합하는 항체의 fab 단편 서열(서열번호 1의 염기서열을 가지는 경쇄 가변부위 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 중쇄 가변부위, 이하 'J1Fab'이라 함)이 클로닝 되어 있는 도 2의 파아지미드 벡터에서 gene Ⅲ를 결손시킨 후, Fc 결합펩타이드(Fc binding peptide, 이하 'FcBP'라 함)(서열번호 3)를 삽입하여 클로닝한 다음, TG1 세포에 형질전환시켜 제조하였으며, 생성된 J1FabFcBP를 웨스턴 블랏(Western Blot)으로 확인한 후(도 3), 정제하였다.

본 발명에서 제조한 J1FabFcBP에서 FcBP는 J1Fab의 중쇄 가변부위의 c-말단에 융합되어 있는 것을 특징으로 하며, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변부위 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 FcBP가 융합된 중쇄 가변부위로 구성된다.

본 발명의 Jagged 1 결합능을 가지는 IgG(이하 'J1 항체'라 함)는 인간 항체 라이브러리로부터 Jagged 1 펩타이드를 항원으로 결합하는 항체를 선별하여 Whole form의 J1 항체(서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 중쇄)를 제조하였으며, 정제된 J1 항체를 웨스턴 블랏으로 확인해본 결과, 중쇄 및 경쇄가 발현되는 것을 확인하였다 (도 4).

본 발명에서는 제조된 J1FabFcBP 및 J1 항체를 혼합하여, 다가항체인 J1-FcBP를 제조하였으며, 도 5에 나타난 바와 같이, J1 항체에 J1FabFcBP가 결합된 J1-FcBP 다가항체가 생성된 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 다가항체인 J1-FcBP의 항체 결합력을 확인하기 위해, 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서(SPR) 칩에 J1-FcBP 항체 및 J1 항체를 고정시킨 후, Jagged 1 펩타이드를 반응시킨 결과, J1-FcBP 항체가 J1항체만 고정화된 표면보다 50% 결합능이 증가하는 것을 확인하였으며(도 6), Jagged 1 펩타이드를 SPR센서 칩에 고정시킨 다음, J1-FcBP 항체 및 J1 항체를 반응시킨 결과, J1-FcBP 항체가 J1항체 보다 항원에 대해 50% 결합능이 증가하는 것을 확인하였다 (도 7). 또한, Jagged 1 펩타이드를 고정시킨 SPR센서 칩에 0.1, 0.25, 0.4, 0.6, 0.8μM의 농도별로 J1-FcBP 항체를 반응시킨 결과, J1-FcBP 항체의 농도가 0.1, 0.25, 0.4, 0.6μM로 증가될 때 항원에 대한 SPR의 RU값이 70, 160, 300, 538 RU로 2배씩 증가하는 것을 확인하였다 (도 8).

본 발명의 다른 실시예에서, 면역침강법(immunoprecipitation)을 이용하여 J1-FcBP의 항체 결합력을 확인한 결과, J1-FcBP 항체가 J1 항체보다 2배 이상의 항원 항체 반응을 나타냄을 확인하였으며(도 9), J1-FcBP 항체(1μM, 100nM, 10nM, 1nM)와 J1 항체((1μM, 100nM, 10nM, 1nM)를 이용하여 이뮤노 도트 방법을 확립하여 Jagged1 펩타이드와 결합력을 비교한 결과, J1-FcBP 항체는 1nM에서 J1 항체의 100nM과 비슷한 수치를 보이는 것을 확인하여, 약 100배 이상 민감도가 증가한 것을 확인하였다 (도 10).

본 발명의 다른 실시예에서, 다가항체인 J1-FcBP의 항체 결합력을 확인하기 위해, 글라스 칩을 이용하여 Jagged 1 펩타이드와 결합력을 비교한 결과, J1 항체는 0.1㎍/㎖ 농도에서 Jagged 1 펩타이드와 반응한 반면, J1-FcBP 항체는 0.01㎍/㎖ 농도에서도Jagged 1 펩타이드와 반응하는 것을 확인하였으며(도 11), SPR 이미징 시스템을 사용하여 분석한 결과, J1-FcBP 항체가 고정화된 금박막에서 항원 결합이 더 밝은 이미지를 확인하였다 (도 11).

본 발명은 다른 관점에서, 다가항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 암 진단용 바이오센서에 관한 것이다.

상기 바이오센서는 본 발명의 다가항체가 포함되어 있으므로, 다가항체에 특이적으로 결합하는 항원을 검출할 수 있으며, 본 발명의 바이오센서로 진단할 수 있는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 포함한다. 바람직하게 대장암, 결장암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 이자암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경세포아종, 흑색종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 또는 신경교종 등을 포함하며, 본 발명의 다가항체 구조로 제조된 J1-FcBP는 Jagged 1 또는 Jagged 1 펩타이트를 고민감도로 인지할 수 있으므로, Notch, 특히 Jagged 1를 리간드로 포함하는 Notch 1의 시그널과 관련된 질병을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 바이오센서는 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 면역침강법(immunoprecipitation), 이뮤노 도트(immunodot) 또는 글라스 칩(glass chip)을 이용한 바이오센서일 수 있다. 특히, 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 바이오센서는 정성적인 정보(두 분자들이 특이적으로 결합을 하는지)와 정량적인 정보(반응 속도, Kinetics와 평형상수, equilibrium constants)를 제공할 뿐만 아니라 형광으로 표지할 필요 없이 실시간으로 감지할 수 있어, 항원과 항체 결합을 측정하는데 특히 유용하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

다가항체 제조

1-1 : J1FabFcBP 클로닝 및 정제

Jagged 1에 결합하는 항체의 Fab 단편 부분과 Fc 결합 펩타이드가 융합된J1FabFcBP을 제조하기 위해, 파아지미드(phagemid) 벡터를 이용하여 J1FabFcBP를 클로닝(cloning) 하였다.

먼저, Jagged 1에 결합하는 항체의 fab 단편 서열(서열번호 1의 염기서열을 가지는 경쇄 가변부위 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 중쇄 가변부위)을 포함하는 pKB-Fab100 벡터(펩트론, 한국)(도 2)에 NotⅠ(NEB cat No. r0189s) 제한효소를 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켜 gene Ⅲ를 결손(deletion)시킨 다음, 1% 아가로스 젤(Agarise gel(Cambrex))을 이용하여 분리 정제한 후 자가-결합(self-ligation)을 시켰다.

그 다음, Fc 결합펩타이드(Fc binding peptide, 이하 'FcBP'라 칭함)(서열번호 3)를 gene Ⅲ가 결손된 pKB-Fab100 벡터에 삽입하기 위해 FcBP 유전자의 양 말단에 NotⅠ제한부위가 포함되도록 PCR을 사용하여 증폭시켰으며, PCR 과정에서 사용된 프라이머는 FcBP 유전자를 증폭할 수 있도록 디자인하였다 (바이오니아, 한국).

FcBP 프라이머

[서열번호 4] 5'-GAAGACCTGGCGGCCGCTGACAAAACTCACA-3'

[서열번호 5] 5'-GCCGCCGCGGCCGCTCATTAGTGGTGATGATGATGATGGGTGCACCAGAC CAGTTC-3'

PCR은 먼저 50ng의 DNA 주형, 각각 12.5pmol의 프라이머 한쌍, 10mM dNTP와 DNA 중합효소 pfu (Solgent, 한국)를 DNA 중합효소 완충용액 (Solgent, 한국)에 섞어 95℃에서 5분간 전처리반응을 시킨 다음, 95℃에서 30초간 DNA를 변성시키고, 55℃에서 60초간 프라이머를 결합시킨다. 72℃에서 1분간 DNA를 합성시키는 과정을 25회 반복하였고, 마지막 단계에서는 72℃에서 10분간 반응시켜 효소가 충분히 활성을 발휘하도록 하여 NotⅠ제한부위가 포함된 FcBP 유전자를 증폭하였다.

상기 증폭된 FcBP 유전자와 pKB-Fab100 벡터는 Not(NEB cat No. r0189s)을 사용하여 37℃에서 1시간 30분 동안 처리한 후 정제하였으며, 정제된 pKB-Fab100 벡터와 FcBP 유전자를 몰/2몰 비율로 사용하여 20㎕의 10 x 리가아제(ligase. DaKaRa cat No. 2011B) 완충용액, 10㎕의 T4 DNA 리가아제(ligase)와 살균 증류수를 넣어 총 부피가 200 ㎕가 되도록 한 후, 16℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 라이게이션(ligation)시켜, FcBP 유전자가 포함된 pKB-Fab100 벡터를 제조하였다.

그 후, 2.5 kV, 200 O, 25 D 조건으로 엘렉트로포레이션(BioRad Gene Pulser Xcell 이용) 하여, 대장균(Escherichia coli)인 TG1 세포(ATCC #39078)에 형질전환(transfection)시켜, J1Fab의 경쇄 가변부위 C-말단에 FcBP가 융합된 J1FabFcBP 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제조하였다.

상기 J1FabFcBP 생산능을 가지는 TG1 세포를 암피실린(ampicilline, 100 ㎍/㎖)을 함유하고 있는 2YT 배지(Bactotryptone 16 g, 효모 추출물(Yeast extract) 10 g, NaCl 5 g in 1 liter H2O, pH 7.0)에 넣고 37℃에서 배양하여 단일콜로니(single colony)를 선별하였으며, 선별된 콜로니를 2YT 앰피실린(ampicillin) 배지 4ℓ에서 OD₆₀₀ 값이 0.6 내지 0.7이 되도록 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. OD₆₀₀ 값이 0.6 내지 0.7이 되면, 100μM IPTG(isopropyl-βD-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 26℃, 200rpm으로 16시간 동안 배양하였다. IPTG에 의해 인덕션(induction)된 세포를 4000rpm에서 15분 동안 원심분리한 다음, 상등액을 버리고 남아있는 세포펠렛(pellet)을 40㎖의 TES 버퍼(0.2M Tris-HCl, PH8.0; 0.5mM EDTA; 0.5M sucrose)로 현탁(suspention)시켰으며, 현탁된 세포에 라이소자임(lysozyme; 10㎎/㎖ in TES buffer, SIGMA-ADRICH L6876) 2.5㎖을 첨가하였다. 라이소자임을 첨가한 후, 차가운 증류수(약 1 내지 4 ℃)로 1:2로 희석된 TES 버퍼를 250㎖ 첨가하여 30분 동안 얼음(ice)에서 삼투압 쇼크(osmotic shock)를 준 다음, 12000 ×ｇ에서 10분 동안 원심분리(hanil. supra 22k)하였다.

J1FabFcBP를 정제하기 위해, 주변세포질 추출(periplasm extraction)(Bothmann H et . al ., Nat Biotechnol ., 16(4):376, 1998)을 이용하였으며, 도 3에 나타낸 바와 같이, J1FabFcBP가 발현되는 것을 확인하고, protein L(pierce cat. No 0020512)를 이용하여 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변부위 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 FcBP가 융합된 중쇄 가변부위로 구성된 J1FabFcBP를 정제하였다.

1-2 : Jagged 1에 대한 전체 항체( J1 Whole antibody ) 제조

J1 whole antibody를 제조하기 위해, 인간 항체 라이브러리로부터 Jagged 1 펩타이드를 항원으로 결합하는 항체를 선별하여 이를 Whole form(서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 중쇄)으로 전환하여 293T 세포에 형질전환시킨 후, protein A 컬럼(Milipore cat No. 16-156)를 이용하여 정제하였다.

정제된 J1 전체 항체를 웨스턴 블랏(Western Blot)으로 확인해본 결과, 중쇄 및 경쇄가 발현되는 것을 확인하였다 (도 4).

상기 정제된 J1 전체 항체와 실시예 1-1에서 제조한 J1FabFcBP를 결합하기 위해서, J1 whole antibody : Fab FcBP = 1:3으로 2시간 반응을 시킨 뒤 100KDa centrifugal filter로 농축하여 미반응 J1Fab FcBP를 걸러냈으며, 도 5에 나타난 바와 같이, 웨스턴 블랏으로 복합체를 확인해본 결과, 다가항체인 J1-FcBP가 생성된 것을 확인하였다 (도 5).

표면 플라즈몬 공명( surfaceplasmon resonance )을 이용한 항체 분석

실시예 1에서 제조한 다가항체인 J1-FcBP의 항체 결합력을 확인하기 위해, 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서(SPR)를 이용하여 항체결합에 따른 표면 플라즈몬 공명의 신호 변화를 측정하였다.

먼저, SPR 센서 칩(CM5 chip)을 BIACORE 3000(GE Healthcare, cat. No BR100668)에 장착한 후, 인산 완충용액 (pH 7.4)을 10㎕/min 속도로 흘려주고, EDC (0.4M)와 NHS (0.1M)를 1:1 비율로 주입하여 칩 표면의 카르복실기를 활성화시켰다.

그 다음, 다가항체인 J1-FcBP(0.1㎎/㎖)와 J1 전체 항체(0.1㎎/㎖)를 각각 1600RU 수준으로 칩 표면에 고정화 시킨 후 BSA (bovine serum albumin, 1㎎/㎖)를 이용하여 블로킹하였다. Jagged 1 펩타이드(0.5㎎/㎖)를 항체가 고정된 칩에 흘려 항원 항체 반응시킨 결과, J1-FcBP 항체가 J1항체만 고정화된 표면보다 50% 결합능이 증가하는 것을 확인하였다 (도 6).

또한, Jagged 1항원(0.5㎎/㎖)을 250 RU 수준으로 칩 표면에 고정화시킨 BSA (bovine serum albumin, 1㎎/㎖)를 이용하여 블로킹하였다. 다가항체인 J1-FcBP 항체, J1 전체 항체 및 IgG를 각각 1μM을 Jagged 1 항원이 고정된 칩에 흘려 반응시킨 결과, J1-FcBP 항체가 J1항체 보다 항원에 대해 50% 결합능이 증가하는 것을 확인하였다 (도 7).

250 RU 수준으로 Jagged1 peptide(0.5㎎/㎖)를 칩 표면에 고정화시킨 1㎎/㎖ amine-PEG로 블로킹하였다. 그 다음 단계로 표적분자로서 0.1, 0.25, 0.4, 0.6, 0.8μM의 J1-FcBP 항체를 주입하여 항원 항체 결합력을 확인하였다. 그 결과, J1-FcBP 항체의 농도가 0.1, 0.25, 0.4, 0.6μM로 증가될 때 항원에 대한 SPR의 RU값이 70, 160, 300, 538 RU로 2배씩 증가하는 것을 확인하였다 (도 8).

즉, SPR 바이오 센서를 이용하여 Jagged1 항원이 Jagged1 항체와 J1-FcBP 항체에 결합하는 것을 확인하였고, J1-FcBP 항체가 FcBP가 없는 항체보다 50%이상 Jagged 1 항원에 대한 반응이 증가하는 것을 확인하였다.

면역침강법을 이용한 항체 분석

실시예 1에서 제조한 다가항체인 J1-FcBP의 항체 결합력을 확인하기 위해, 면역침강법(immunoprecipitation)을 이용하여 실험을 수행하였다.

먼저, myc이 태그된 Jagged 1이 클로닝 되어있는 벡터(Sino Biologicla Inc. cat No. HG11648-M-M pCMV/hygro-Myc)로 형질감염된 HEK293 세포들을 세포 용해 버퍼(Cell lysis buffer: 1% triton X-100, 150mM NaCl, 50mM Tris-Cl(pH 7.5), 0.1% SDS, 1% NP-40, 1mM PMSF)을 이용하여 파괴시킨 후, 세포 용해액(cell lysate)에서 단백질의 상층액을 얻어내기 위하여, 12,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 면역침강 분석을 수행하기 위해서, 세포 용해액을 J1-FcBP 항체(1㎍/㎖)와 J1 항체(1㎍/㎖)를 처리하여 PBS에서 1시간 동안 반응시켰고, 그 후 단백질 A/G-아가로스 비드(protein A/G-agarose beads)를 첨가하여 4℃ 조건에서 24시간 동안 반응시켰다. 상기 비드를 tween 20이 0.05% 함유된 PBS로 3회 세척하고, 2X protein loading dye(25 % SDS, 62.5mM Tris-HCl (pH 6.8), 25% Gylcerol, and 0.01% Bromophenol Blue)와 함께 5분간 끓인 후, 상기 샘플들을 SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동상에서 분리하였다.

SDS-PAGE로 분리된 결합 단백질들을 웨스턴 블랏을 진행하기 위해 PVDF membrane으로 옮긴 후, 단백질이 옮겨진 PVDF membrane을 5% skim-milk에서 1시간동안 실온에서 블로킹(Blocking) 하였다. PVDF membrane을 TBST 용액을 사용하여 10분씩 3번 세척한 다음, PVDF membrane을 1차 항체(myc primary antibodies)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, TBS-T(8.8ｇ NaCl, 0.2ｇ KCl, 3ｇ Tris base, pH 7.4, 0.05% Tween20을 1L 용액으로 제작)로 10분간 3번 세척하고 HRP(horse raddish peroxidase)가 붙어있는 2차 항체(secodary antibodies)와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, TBST로 10분간 3번 세척하고 ECL(enhanced chemo-luminal)을 처리하여, Las 3000(Fujifilm)를 이용하여 확인하였다.

그 결과, J1-FcBP 항체가 FcBP가 없는 항체보다 2배 이상의 항원 항체 반응을 나타냄을 확인하였다 (도 9).

이뮤노 도트 ( immunodot ) 분석을 이용한 항체 분석

다가항체인 J1-FcBP의 항체 결합력을 확인하기 위해, J1-FcBP 항체(1μM, 100nM, 10nM, 1nM)와 J1 항체(1μM, 100nM, 10nM, 1nM)를 이용하여 이뮤노 도트 방법을 확립하여 Jagged1 펩타이드와 결합력을 비교하였다.

먼저, 나이트로 셀룰로오스 멤브레인에 J1-FcBP 항체(1μM, 100nM, 10nM, 1nM)와 J1 항체(1μM, 100nM, 10nM, 1nM)를 2㎕씩 점적한 후 상온에서 건조시키고, 1% BSAT(bovine serum albumin in Tris-buffered saline) 용액으로 블로킹하였다. cy5로 라벨링된 jagged1 펩타이드(1㎍/㎖)을 반응시킨 후, tween 20 0.05%가 함유된 PBS로 세척한 후 Las 3000(Fujifilm)장비를 이용하여 635nm에서 형광물질의 발광 정도를 확인하였다.

그 결과, J1-FcBP 항체가 J1 항체보다 Jagged 1 펩타이드와 결합력이 높은 것을 확인하였으며, 특히 J1-FcBP 항체는 1nM에서 J1 항체의 100nM과 비슷한 수치를 보이는 것을 확인하여, 본 발명의 J1-FcBP 항체가 우수한 항원 항체 반응을 나타냄을 확인하였다 (도 10).

글라스칩을 이용한 항체 분석

다가항체인 J1-FcBP의 항체 결합력을 확인하기 위해, 글라스 칩을 이용하여 Jagged1 펩타이드와 결합력을 비교하였다.

먼저, 카르복실기(-COOH)로 표면이 개질된 글라스(Arrayit, cat. No. SMA2, 캐나다)에 EDC (0.4M)와 NHS (0.1M)를 1:1비율로 도포하여 칩 표면의 카르복실기를 활성화시킨 후, 멸균수로 세척하고 항원(jagged 1 peptide, 1mg/ml을 글라스 표면에 골고루 도포하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, amine-PEG(1mg/㎖)를 이용하여 블로킹하고 인산완충용액으로 세척 후 멸균수로 세척한 후 질소가스로 표면을 건조시키고 cy3로 레이블된 J1 항체(1000, 500, 250, 100, 10, 1, 0.1, 0.01㎍/㎖)와 J1-FcBP 항체(1000, 500, 250, 100, 10, 1, 0.1, 0.01㎍/㎖)를 농도별로 점적하여 반응 후 인산완충용액과 멸균수로 세척하여 532nm에서 형광이미지를 확인하였다.

그 결과, J1 항체는 0.1㎍/㎖ 농도에서 Jagged 1 펩타이드와 반응한 반면, J1-FcBP 항체는 0.01㎍/㎖ 농도에서도 Jagged 1 펩타이드와 반응하는 것을 확인하였다 (도 11).

SPR 이미징시스템을 이용한 항체 결합력 비교

다가항체인 J1-FcBP의 항체 결합력을 확인하기 위해, SPR 이미징 시스템을 사용하여 공지된 방법(Proteomics. Apr;6(7):2108, 2006)으로 SPR 이미징 분석을 수행하였다. SPR 이미징 시스템에서는 반사광의 정도에 따라 이미지가 결정되는데, 이미지가 밝을수록 반사광이 많다는 것이며, 금 박막 표면에 분자가 더 많이 결합되어 있다는 것을 의미한다.

먼저, 금박막 칩에 J1 항체(0.1mg/㎖)와 J1-FcBP 항체(0.1mg/㎖)를 상온에서 1시간 동안 고정시키고 BSA(1mg/㎖)로 블로킹하였다. 항체가 고정된 금박막 칩을 PBS 버퍼로 세척하고 건조시킨 후에 항원(jagged 1 peptide)을 농도별(50000, 5000, 500, 50, 5, 0.5ng/㎖)로 점적하였다. 그 다음, 칩을 PBS 버퍼로 세척하고 건조시킨 후 SPR 이미징 시스템을 이용하여 분석하였다.

그 결과, J1-FcBP 항체가 고정화된 금박막에서 항원 결합이 더 밝은 이미지를 확인하였다 (도 11).

이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> korea research institute of bioscience and biotechnology <120> Multivalant Antibodies for Ultrasensitive Biosensor <130> P13-B140 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J1 fab VL <400> 1 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgcgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gattgtttct tcttggctgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatagg gcatccaact tggcaagtgg ggtcccatca 180 cgcttcagtg gcagtggatc tgggacggat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag cattccaact ttcctgtcac gttcggccaa 300 gggaccaaag tggagatcaa a 321 <210> 2 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J1 fab VH <400> 2 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggagggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttctct tcttactgga tgagctgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttctagg atttctccgg ctggcggtta tactaactac 180 gcagactctg tgaagggccg tttcaccatc tcccgggaca actctaagaa cactctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtct attactgtgc gagattctgc 300 gacaacagcc ggcgcgcctg ctatgcgatg gattattggg gccaaggcac cctggtcacc 360 gtctcctcgg ccagc 375 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide <400> 3 gactgtgcat ggcacctggg agaactggtc tggtgcacc 39 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP primer forward <400> 4 gaagacctgg cggccgctga caaaactcac a 31 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP primer reverse <400> 5 gccgccgcgg ccgctcatta gtggtgatga tgatgatggg tgcaccagac cagttc 56 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1FabFcBP VL <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Asn Phe Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1FabFcBP VH(+FcBP) <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Cys Asp Asn Ser Arg Arg Ala Cys Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Cys Ala Trp His Leu Gly 130 135 140 Glu Leu Val Trp Cys Thr 145 150 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1 Whole antibody light chain <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Asn Phe Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1 Whole antibody heavy chain <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Cys Asp Asn Ser Arg Arg Ala Cys Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Claims (6)

1. 항원 결합능을 가지는 fab 단편(fragment)과 Fc 결합 펩타이드(Fc binding peptide; FcBP)가 융합된 FabFcBP가 한 쌍의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 면역글로블린 G(IgG)의 Fc 영역의 CH2 부분에 결합되어 있는 바이오센서용 4가항체.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 항원결합능을 가진 fab 단편이 결합하는 항원 부위가 상기 면역글로블린 G(IgG)가 결합하는 항원 부위와 동일하거나 상이한 것을 특징으로 하는 바이오센서용 4가 항체.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 전장(full-length) Jagged 1 또는 Jagged 1의 단편 펩타이드 결합능을 가지는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 4가 항체.
   
5. 제4항에 있어서, Jagged 1 결합능을 가지는 IgG의 Fc 영역에 Jagged 1 또는 Jagged 1의 단편 펩타이드 결합능을 가지는 fab 단편(fragment)과 Fc 결합 펩타이드(Fc binding peptide; FcBP)가 융합된 J1FabFcBP가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 4가 항체.
   
6. 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항의 바이오센서용 4가 항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 Jagged 1을 표적으로 하는 암 진단용 바이오센서.

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