DE60004781T2 - Kinase-inhibitoren mit hoher affinität zur ziel detektion und ihre verwendung - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung stellt allgemeine Verfahren zum Entdecken von Mutanteninhibitoren für eine beliebige Klasse von Enzymen sowie die so identifizierten spezifischen Inhibitoren bereit. Insbesondere stellt diese Erfindung allgemeine Verfahren zum Entdecken von spezifischen Inhibitoren für Mehr-Substrat-Enzyme bereit. Beispiele von solchen Mehr-Substrat-Enzymen umfassen Kinasen. Die durch die Verfahren dieser Erfindung identifizierten Mutanteninhibitoren können verwendet werden, um Zellenfunktionen wie z.B. die onkogene Transformation sehr selektiv zu unterbrechen. In einem speziellen Beispiel stellt diese Erfindung einen Src-Proteinkinaseinhibitor, pharmazeutische Zusammensetzungen davon und Verfahren zum Unterbrechen der Transformation in einer Zelle, die das Ziel-v-Src exprimiert, umfassend in Kontakt bringen der Zelle mit dem Proteinkinaseinhibitor, bereit.
  • Die US-Patentanmeldung Seriennrn. 08/797 522 und 60/046 727 und PCT/US98/02522 stehen mit der vorliegenden Erfindung in Zusammenhang.
  • Die derzeitige Explosion der Anzahl von neu entdeckten Genen unterstreicht den Bedarf für kleine Molekülliganden, die verwendet werden können, um die Genfunktion zu aufzuklären und zu kontrollieren. Die konvergente Konstruktion von Schnittstellen von Proteinen/kleinen Molekülen ist in den letzten Jahren als leistungsstarkes Verfahren zum Erzeugen von neuen Liganden/Rezeptor-Paaren mit hoher Spezifität aufgetaucht. Durch Einführen einer chemischen Verschiedenheit in das Zielprotein sowie das kleine Molekül können eindeutige Bindungswechselwirkungen entworfen werden und effizienter ausgenutzt werden als durch die herkömmliche medizinische Chemie. Solche Methoden wurden verwendet, um eine Anzahl von biologischen Systemen chemisch zu erforschen. Das FK506-Bindungsprotein wurde zum bevorzugten Binden von nicht-natürlichen FK506-Analogen von Schreiber und Mitarbeitern sowie Clackson und Mitarbeitern konstruiert. Dieses System wurde umfangreich verwendet, um Rezeptoren selektiv zu dimerisieren und die Genexpression in einem zellulären Zusammenhang zu steuern. Es wurde auch gezeigt, daß Kernhormonrezeptoren für eine chemische genetische Konstruktion zugänglich sind. Corey und Mitarbeiter demonstrierten, daß Mutationen an zwei Aminosäureresten im Retinoid-X-Rezeptor ausreichen, um zwei neue Klassen von Rezeptoren mit neuen Ligandenspezifitäten zu erzeugen. In einem mehr medizinisch anwendbaren System konstruierten Smith und Mitarbeiter die Protease Carboxypeptidase A1, um ein Prodrug von Methotrexat zu hydrolysieren, das gegen die Hydrolyse durch Proteasen vom wilden Typ resistent ist.
  • Die durch Proteinkinase katalysierte Phosphorylierung des Hydroxylanteils von Serin, Threonin oder Tyrosin ist das zentrale posttranslationale Steuerelement bei der eukaryotischen Signalumsetzung. Der Phosphorylierungszustand eines gegebenen Proteins kann seine Enzymaktivität, Protein-Protein-Bindungswechselwirkung und zelluläre Verteilung steuern. Phosphorylierung und Dephosphorylierung ist folglich ein "chemischer Schalter", der ermöglicht, daß die Zelle von der Plasmamembran zum Zellkern Signale überträgt, um letztlich die Genexpression in einer stark regulierten Weise zu steuern. Stark selektive, zellenpermeable Inhibitoren von individuellen Kinasen würden die systematische Untersuchung der zellulären Funktion einer Kinase in Echtzeit ermöglichen und würden folglich unbezahlbare Werkzeuge für die Entfaltung von Phosphorylierungs-abhängigen Prozessen in Signalumsetzungskaskaden bereitstellen.
  • Die Src-Familie besteht aus zehn stark homologen cytosolischen Kinasen, die in einer Anordnung von Zellensignalisierungswegen, die von Lymphozytenaktivierung bis zu Zellwachstum und -proliferation reichen, entscheidende Komponenten sind. Die konstitutive Aktivierung dieser Enzyme kann zu einer onkogenen Zellentransformation führen, die sie zu mutmaßlichen Arzneimittelzielen für Krebstherapien macht. Aufgrund ihrer Bedeutung bei der Regulierung dieser grundlegenden Zellenprozesse haben sich viele Untersuchungen auf die Entwicklung von Inhibitoren für die Src-Familien-Kinase konzentriert. Den potenten Inhibitoren, die entdeckt wurden, fehlt es jedoch an der hohen Selektivität, die zum Prüfen der zellulären Inhibierung einer individuellen Zielkinase erforderlich wäre. Herkömmliche Inhibitorselektionen haben wenige Moleküle, falls überhaupt, erzeugt, die zwischen den aktiven Stellen der verschiedenen Src-Familien-Kinasen unterscheiden können.
  • Leider machen es eben die Merkmale, die Kinasen bei der Signalumsetzung so nützlich machen und die veranlaßt haben, daß sie sich entwickelt haben, so daß sie für fast jede zelluläre Funktion zentral wurden, auch extrem schwierig, wenn nicht unmöglich, sie zu untersuchen und zu verstehen. Ihre überlappenden Proteinspezifitäten, ihre strukturellen und katalytischen Ähnlichkeiten, ihre große Anzahl und ihre große Geschwindigkeit machen die spezifische Identifikation ihrer Proteinsubstrate in vivo extrem schwierig, wenn nicht unmöglich, unter Verwendung derzeitigen genetischen und biochemischen Verfahren. Dies ist heute das Haupthindernis für die Entschlüsselung der Signalisierungskaskaden, die an der durch Proteinkinase vermittelten Signalumsetzung beteiligt sind (4,6–8).
  • Anstrengungen zum Zergliedern der Beteilung von spezifischen Proteinkinasen an Signalumsetzungskaskaden wurden durch ihren scheinbaren Mangel an Proteinsubstratspezifität in vitro und in vivo zunichte gemacht (4, 8). Die katalytischen Domänen von Proteinkinasen besitzen wenig oder keine zugehörige Proteinsubstratspezifität, wie durch Domänenwechselexperimente demonstriert (18–23). Die katalytische Domäne von einer Proteinkinase kann gegen eine andere Proteinkinase mit geringer Änderung der Proteinsubstratspezifität der letzteren ausgetauscht werden (22).
  • Die schlechte Spezifität von Kinasen in vitro macht es auch schwierig, wenn nicht unmöglich, zu extrapolieren, welches die Funktion von gegebenen Kinasen in vivo sein könnte. Eine interessierende isolierte Proteinkinase phosphoryliert häufig viele Testsubstrate mit gleicher Effizienz (29). Diese scheinbar schlechte Substratspezifität ist auch in vivo zu finden; viele genetischen Methoden, wie, z.B. Genzerstörungsexperimente, ergeben beispielsweise keinen interpretierbaren Phänotyp aufgrund der Kompensation durch andere zelluläre Proteinkinasen (30, 31).
  • Eine weitere Komplikation besteht darin, daß viele Proteinkinasen vorgeschlagen wurden, um Stromabwärts- und Stromaufwärtsproteine zu phosphorylieren, die selbst Proteinkinasen sind; obwohl dies komplexe positive Rückkopplungsschleifen möglich zu machen scheint, macht es auch die Zergliederung der Kaskade noch schwieriger (1). Ein wichtiger Weg zum Entschlüsseln der Rolle und zum Verstehen der Funktion von Enzymen sowohl in vitro als auch in vivo ist die Verwendung von spezifischen Enzyminhibitoren. Wenn eine oder mehrere Verbindungen gefunden werden können, die das Proteinkinaseziel eindeutig inhibieren, kann der Inhibitor verwendet werden, um die Enzymaktivität zu modulieren, und die Wirkungen dieser Senkung können beobachtet werden. Verfahren mit ganzen Genomen haben Ziele bereitgestellt, aber ihre Funktion ist unbekannt. Viele Verfahren wurden entwickelt, um festzustellen, ob eine gegebene neue Kinase ein gutes Ziel sein könnte. Diese Verfahren haben alle den Mangel eines kleinen Moleküls zum Inhibieren des Enzyms gemeinsam, was zu Verwirrung führen kann.
  • Das am üblichsten verwendete Verfahren des Standes der Technik ist beispielsweise die Zerstörung der Kinase und das Sehen eines neuen Phänotypen. Typischerweise verursacht die Zerstörung einer Kinase im Mausgenom (üblichster Modellorganismus) keine informative Veränderung. Dies liegt an zwei Gründen: 1) entweder ist das Gen (Kinase) während der Embryogenese wesentlich, wodurch vor der Geburt eine Letalität verursacht wird, oder 2) das Gen fehlt (zerstört) und seine Funktion kann durch eine eng verwandte Kinase, die noch vorhanden ist, ersetzt werden. Der bedeutende Unterschied zwischen der erkannten Methode des Fachgebiets und der Erfindung hierin besteht darin, daß hierin kleine organische Moleküle verwendet werden, um die Funktion der interessierenden Kinase zu inhibieren, da sie noch in den Organismen vorhanden ist, aber inaktiv ist, somit kann sie signifikante Veränderungen an den Organismen verursachen und am bedeutendsten sind die Veränderungen genau wie jene, die auftreten würde, wenn ein Inhibitor eines Enzyms vom Wildtyp hergestellt werden würde.
  • Außerdem sind solche Inhibitoren unter den bedeutendsten bekannten pharmazeutischen Verbindungen. Aspirin (Acetylsalicylsäure) ist beispielsweise ein solcher Inhibitor. Es inhibiert ein Enzym, das den ersten Schritt bei der Prostaglandinsynthese katalysiert, wobei somit die Bildung von Prostaglandinen, die beim Erzeugen von Schmerz beteiligt sind, inhibiert wird (72). Die herkömmliche Arzneimittelentdeckung kann als Konstruktion und Modifikation von Verbindungen charakterisiert werden, die spezifisch zum Binden an ein und Inaktivieren von einem Krankheit verursachenden Protein ausgelegt sind; der relative Erfolg einer solchen Anstrengung hängt von der Selektivität des Arzneimittels für das Zielprotein und seinem Mangel an Inhibierung von nicht mit einer Krankheit verbundenen Enzymen mit ähnlichen Enzymaktivitäten ab. Solche Methoden würden als vielversprechende Weisen zum Entwickeln von Behandlungen für Krebs erscheinen, da viele menschlichen Krebse durch Fehlregulierung eines normalen Proteins verursacht werden (z.B. wenn ein Protoonkogen durch eine Gentranslokation in ein Onkogen umgewandelt wird). Und da Kinasen Schlüsselregulatoren sind, haben sie sich als sehr übliche Protoonkogene und folglich ideale Arzneimittelkonstruktionsziele herausgestellt.
  • Der Prozeß der Konstruktion von selektiven Inhibitoren ist in Fällen, in denen wenige ähnliche Enzyme in dem Zielorganismus vorliegen, beispielsweise in Fällen, in denen auf Inhibitoren eines für Bakterien eindeutigen Proteins gezielt werden kann, relativ einfach. Aber leider haben die Ähnlichkeiten zwischen den Kinasen und ihre große Anzahl die Entdeckung und Konstruktion von spezifischen Inhibitoren fast vollständig zunichte gemacht und hat die meisten Hoffnungen auf die Entwicklung von spezifischen pharmazeutischen Behandlungen, die auf das Proto-onkogen-Niveau abzielen, blockiert. Es wird erwartet, daß die ungeheure Mehrheit von Kandidateninhibitoren viele Kinasen inhibiert, selbst wenn sie anfänglich als eine spezielle gereinigte Kinase inhibierend identifiziert worden sein können.
  • Diese vorstehend beschriebenen Schwierigkeiten haben Auswirkungen weit über die bloße Frustration von Wissenschaftlern hinaus; sie haben Anstrengungen zum Entziffern der Kinasekaskaden und der Funktion von individuellen Kinasen in diesen Kaskaden und anderen Zellenmechanismen zunichte gemacht. Ein solches Verständnis der Kinaseaktivität und -funktion kann wesentlich sein, bevor bestimmte menschliche Krankheiten wirksam behandelt, verhindert oder geheilt werden können. Es war beispielsweise über 30 Jahre bekannt, daß das Onkogen bcr-abl eine Proteinkinase ist, die für chronische markbedingte Leukämie verantwortlich ist; aber die physiologischen Substrate, auf die sie einwirkt, um Onkogenese zu verursachen, die wichtige Arzneimittelkonstruktionsziele sein können, müssen noch endgültig identifiziert werden (11). Trotz dieses Mangels wird auf der Sonnenseite der Inhibitor CGP 57148 laut Bericht nun klinischen Versuchen für die Verwendung bei der Behandlung von markbedingter Leukämie unterzogen, selbst wenn die Substrate, bei denen er die Phosphorylierung in vivo blockieren kann, nicht bekannt sind.
  • Die medizinische Bedeutung dieser Schwierigkeiten wird durch das Rous-Sarkomvirus (RSV) weiter dargestellt, das zu einem wichtigen Modellsystem für die Untersuchung der Rolle von Kinasen bei der Onkogenese geworden ist. Die RSV-Transformation von Fibroblasten wird durch ein einzelnes Virusgenprodukt, die Proteinkinase v-src gesteuert (32). Es ist der schnelle Zeitverlauf und die dramatischen morphologischen Veränderungen während der RSV-Fibroblastentransformation, die das RSV zu einem Paradigma für Untersuchungen der onkogenen Aktivität in allen Zellen gemacht haben. Der Ursprung (33), die Regulierung (3, 8, 34, 35) und die Struktur (25, 27, 36) von v-Src wurden ausgedehnt untersucht und sind gut verstanden (8, 37, 38). Aber zentrale Fragen über die intensiv untersuchte Kinase bleiben unbeantwortet: welche sind ihre direkten Zellsubstrate? Inhibiert die Inhibierung ihrer katalytischen Aktivität wirksam die Transformation oder kehrt sie diese sogar um? Wäre eine solche Inhibierung eine wirksame Therapie für oder eine Prophylaxe gegen RSV-Transformation? Wie vorstehend erörtert, stehen die Antworten auf diese Frage leider nicht kurz bevor, zum größten Teil deshalb, weil die Anzahl von zellulären Kinasen enorm ist (es wird geschätzt, daß 2% des Säugergenoms Proteinkinasen codiert (4)) und weil Proteinkinasen überlappende Substratspezifitäten zeigen (8, 39) und sich katalytische Domänen teilen, was die Konstruktion von spezifischen Inhibitoren enorm schwierig macht.
  • Obwohl die Schwierigkeiten entmutigend sind, machen neue Verfahren. zur rationalen Arzneimittelkonstruktion und zur kombinatorischen organischen Synthese die Konstruktion oder Entdeckung von kinasespezifischen Inhibitoren durchführbar, wenn ausreichend Mittel gegeben sind. Da jedoch die Kinasenetzwerke sehr degeneriert und in unbekannten Weisen miteinander verbunden sind, besteht eine beträchtliche Unsicherheit bezüglich vielen Krankheiten, auf die Kinasen zur Inhibierung abgezielt werden sollten. Überdies ist keineswegs klar, daß ein spezifischer Inhibitor einer gegebenen Kinase irgendeine Wirkung auf die Krankheit entweder in vitro oder in vivo hat. Da Kinasen sehr vermischt sein können besteht eine signifikante Möglichkeit, daß die Inhibierung einer Kinase einfach eine andere Kinase dazu bringt, "ihre Stelle einzunehmen".
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Strategie (d.h. Methodologie) zum Kombinieren von chemischen und genetischen Methoden bereit, um die schnelle Erzeugung von sehr selektiven kleinen Molekülinhibitoren für konstruierte Kinasen in vitro und in ganzen Zellen zu ermöglichen. Die hierin offenbarte Erfindung beinhaltet die Verwendung einer Mutation eines spezifischen Punkts, um eine eindeutige Tasche in der Substratbindungstasche oder -stelle des interessierenden Enzyms zu erzeugen, die nicht in irgendwelchen anderen Enzymen in dem Genom vorkommt. Ein spezifischer Inhibitor des konstruierten Enzyms wird dann durch Derivatisieren eines Enzyminhibitors mit einer Massegruppe synthetisiert, die dazu ausgelegt ist, zur neuen Tasche der aktiven Stelle zu passen. Unter Verwendung von Genmanipulation, um einen eindeutigen strukturellen Unterschied in die bewahrte aktive Enzymstelle einzuführen, können sehr selektive Inhibitoren aus sehr kleinen Feldern (10 Verbindungen) von mutmaßlichen Inhibitoren identifiziert werden, wie hierin erläutert. Die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind zum Untersuchen der Funktion von Enzymen in biochemischen Wegen sowie für Therapiezwecke nützlich.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Proteinkinaseinhibitoren bereit, die durch die folgende Formel I dargestellt werden:
    Figure 00080001
    wobei R 1'-Naphthyl; 2'-Naphthyl; m-Phenoxyphenyl; m-Benzyloxyphenyl; m-2',6'-Dichlorbenzyloxyphenyl; 3-Piperonylpyrazolo; p-tert-Butylphenyl; 1'-Naphthylmethyl; 1'-Naphthoxymethyl; oder 2'-Naphthylmethyl darstellt. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung solche Proteinkinaseinhibitoren bereit, bei denen R 1'-Naphthyl; 2'-Naphthyl oder 1'-Naphthylmethyl; 2'-Naphthylmethyl darstellt. Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die die Proteinkinaseinhibitoren der vorliegenden Erfindung enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Unterbrechen der Transformation in einer Zelle, die eine Mutantenproteinkinase der Src-Familie exprimiert, durch in Kontakt bringen der Zelle mit den Proteinkinaseinhibitoren der vorliegenden Erfindung bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Unterbrechen der Transformation in einer Zelle, die I338G v-Src oder T339G Fyn exprimiert, durch in Kontakt bringen der Zelle mit den Proteinkinaseinhibitoren der vorliegenden Erfindung bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Unterbrechen der Transformation in einer Zelle, die eine Mutantenproteinkinase der Src-Familie exprimiert, durch in Kontakt bringen der Zelle mit einer Zusammensetzung, die die Proteinkinaseinhibitoren der vorliegenden Erfindung umfaßt, bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Unterbrechen der Transformation in einer Zelle, die I338G v-Src oder T339G Fyn exprimiert, durch in Kontakt bringen der Zelle mit einer Zusammensetzung, die die Proteinkinaseinhibitoren der vorliegenden Erfindung umfaßt, bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Inhibieren der Phosphorylierung eines Substrats einer Mutantenproteinkinase durch Inkubieren eines Proteinkinaseinhibitors der vorliegenden Erfindung mit einem Gemisch, das die Mutantenproteinkinase und ihr Substrat enthält, bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Inhibieren der katalytischen Aktivität eines Mutantenenzyms durch Inkubieren des Mutantenenzyms mit einem Inhibitor der vorliegenden Erfindung bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Inhibieren des Wachstums einer Zelle durch Inkubieren der Zelle mit einem Inhibitor der vorliegenden Erfindung bereit.
  • Mutantenproteinkinasen, die bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf die folgenden: i) Mutantenproteinkinasen der Src-Familie, wie z.B. Mutante v-Src; ii) Mutante Fyn; iii) Mutante c-Abl; iv) Mutante CAMK IIα; v) Mutante CDK2; vi) Mutante Cdc28 und vii) Mutante Fus3. Spezielle Beispiele von Mutantenproteinkinasen, die bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf die folgenden: i) I338G v-Src; ii) T339G Fyn; iii) T315A Abl; iv) F89G CAMK IIα; v) F80G CDK2; vi) Cdc28-asi und vi) Fus-as1.
  • Diese Erfindung stellt ferner eine allgemeine Methode zum Sensibilisieren von Proteinkinasen auf zellenpermeable Moleküle bereit, die keine Proteinkinasen vom Wildtyp inhibieren. Unter Verwendung dieser Methode werden potente und spezifische Inhibitoren von zwei Strukturklassen von mutmaßlichen Inhibitoren für sieben Proteinkinasen von fünf unterschiedlichen Unterfamilien identifiziert. Diese Methode kann in vivo verwendet werden, um systematisch konditionelle Allele von Proteinkinasen zu erzeugen.
  • Diese Erfindung stellt auch die Mutantenkinase Cdc28-as1 (analog-spezifisch 1) bereit, die gegen den zellenpermeablen Inhibitor 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(1'-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (1-NM-PP1) eindeutig empfindlich ist. In cdc28-as1-Zellen wird der Eintritt in die Mitose durch niedrige Konzentrationen an 1-NM-PP1 inhibiert, wohingegen höhere Konzentrationen an Inhibitor erforderlich sind, um die G1-Hemmung zu induzieren, die typischerweise in temperaturempfindlichen cdc28-Mutanten beobachtet wird. Die genomweite Transkriptionsanalyse bestätigt, daß die 1-NM-PP1-Behandlung von cdc28-as1-Zellen zur Inhibierung der G2/M-spezifischen Genexpression führt, wohingegen die Behandlung von Zellen vom Wildtyp keine signifikanten Effekte aufweist. Die Erzeugung der analogen-spezifischen cdc28-as1-Mutante stellt somit ein sehr spezifisches Verfahren zum Inhibieren der Cdc28-Aktivität in der Zelle bereit und demonstriert den allgemeinen Nutzen dieses Verfahrens bei der Analyse von Proteinkinasen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist eine schematische Darstellung der Proteindomänenstrukturen von v-Src, von XD4 (das eine Deletion von Resten 77–225 aufweist), des Glutathion-S-Transferase (GST)-XD4-Fusionsproteins und der GST-XD4-Fusionsprotein-Doppelmutante (V323A, I338A).
  • 2 ist eine schematische Darstellung von Adenosintriphosphat (ATP) mit einem an die N6-Position gebundenen "X"; und im Kasten unten sind schematische Darstellungen für die zwölf Seitenketten bereitgestellt, die die Stelle von "X" in jedem der orthogonalen ATP-Analogen einnehmen, die in den Beispielen beschrieben sind (auf die immer mit den Nummer 1–12 Bezug genommen wird).
  • Diese Analoge sind:
    1-N6(Methoxy)ATP 7-N6-(Pyrolidino)ATP
    2-N6(Ethoxy)ATP 8-N6(Cyclopenty)ATP
    3-N6(Acetyl)ATP 9-N6(Cyclopentyloxy)ATP
    4-N6(i-Propoxy)ATP 10-N6(Pipperidino)ATP
    5-N6(Benzyl)ATP 11-N6(Cyclohexyl)ATP
    6-N6-(Benzyloxy)ATP 12-N6(Cyclohexyloxy)ATP
  • 3 ist ein Anti-Phosphotyrosin-Immunoblot, der das Niveau der Proteintyrosinphosphorylierung nach der Behandlung eines Mauslymphozytenzellysats mit ATP oder einem der ATP-Analogen (A*TPs) zeigt.
  • 4 stellt eine Nahansicht des Röntgenstrahlmodells bereit, das die ATP-Bindungsdomäne in cAMP-abhängiger Proteinkinase (1ATP) zeigt.
  • 5A–5C: 5A zeigt ein Anti-Phosphotyrosin-Blot von Zellysaten, die XD4 und GST-XD4 (V323A, I338A) exprimieren. 5B zeigt ein Autoradiogramm, das Niveaus von Phosphorylierung zeigt, wenn Zellysate nur mit radiomarkiertem ATP oder nur mit radiomarkiertem N6(Cyclopentyl)ATP bereitgestellt werden. 5C zeigt ein Autoradiogramm, das die Autophosphorylierung von GST-XD4 und GST-XD4 (V323A, I338A) durch radiomarkiertes ATP und radiomarkiertes N6(Cyclopentyl)ATP (A*TP(8)) zeigt.
  • 6 ist ein Balkendiagramm, das den relativen Grad zeigt, in dem ATP und jedes der zwölf ATP-Analogen die durch GST-XD4 und GST-XD4 (V323A, I338A) katalysierte Phosphorylierung durch radiomarkiertes ATP inhibiert.
  • 7A–7B zeigt Autoradiogramme, die die Niveaus der Autophosphorylierung durch verschiedene einzelne v-Src-Mutanten in der Position 338 angeben, wenn sie sowohl mit radiomarkiertem ATP als auch radiomarkiertem N6(Cyclopentyl)ATP als Phosphatdonorsubstrat versehen werden.
  • 8 ist ein schematisches Diagramm eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung zum Feststellen, welche phosphorylierten Substrate in Zellen durch eine spezielle Kinase phosphoryliert wurden. Hier v-src.
  • 9A–9C zeigen die chemischen Strukturen für drei bekannte Kinaseinhibitoren, Damnacanthal (A), PP1 (B) und CGP 57148 (C), zusammen mit Zusammenfassungen ihrer Inhibierungskonstanten (IC50) für verschiedene Kinasen.
  • 10A–10C: 10A und 10B zeigen die Strukturen einer Vielzahl von voluminösen Substituenten, die wenn sie zu entweder N-4 von PP3 oder zu N6 von Adenosindiphosphat oder zu N6 von Adenosinmonophosphat oder zu N6 von Adenosin (spezifisch N6-Cyclopentyloxyadenosin) zugegeben werden, Inhibitoren der Mutantenkinase v-Src (T120G) erzeugen, die eine konstruierte Kinase der vorliegenden Erfindung ist; die Synthese und Inhibierungskonstanten (10C) für diese Inhibitoren werden im nachstehenden Beispiel 11 erörtert.
  • 11A–11B zeigen die chemische Struktur von N-4-Cyclopentoyl PP3 und Autoradiogramme von einer Elektrophorese unterzogenen Proteinen, die in Gegenwart von N-4-Cyclopentoyl PP3 in Gegenwart von entweder v-Src vom Wildtyp oder der Mutante (I338G) radiomarkiert wurden.
  • 12A–12F: 12A–12F offenbaren ein Diagramm, das zusätzliche Inhibitoranaloge darstellt, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt und getestet wurden.
  • Namen, die 12A–12F entsprechen:
    • a. 1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-ylamin
    • b. (1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-ethyl-amin
    • c. (1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-propyl-amin
    • d. (1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-isobutyl-amin
    • e. (1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-cyclopentylmethyl-amin
    • f. (1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-furan-2-ylmethyl-amin
    • g. Benzyl-(1-tert-butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • h. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-acetamid,
    • i. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-propionamid
    • j. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-iosbutyramid
    • k. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-2-phenyl-acetamid
    • l. Cyclobutancarbonsäure(1-tert-butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amid
    • m. Cyclopentancarbonsäure(1-tert-butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amid
    • n. Cyclohexancarbonsäure(1-tert-butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amid
    • o. Furan-2-carbonsäure(1-tert-butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amid
    • p. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-benzamid
    • q. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-4-methyl-benzamid
    • r. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-4-ethyl-benzamid
    • s. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-4-isopropyl-benzamid
    • t. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-4-propyl-benzamid
    • u. 4-tert-Butyl-N-(1-tert-butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-benzamid
    • v. Biphenyl-4-carbonsäure(1-tert-butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amid
    • w. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-4-chlor-benzamid
    • x. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-3,4-dichlor-benzamid
    • y. 1-tert-Butyl-3-p-tolyl-1H-indazol-4-ylamin
    • z. (1-tert-Butyl-3-p-tolyl-1H-indazol-4-yl)-cyclopentylmethyl-amin
    • aa. N-(1-tert-Butyl-3-p-tolyl-1H-indazol-4-yl)-acetamid
    • bb. N-(1-tert-Butyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-2,2-dimethyl-propionamid
    • cc. 1-Methyl-3-phenyl-1H-indazol-4-ylamin
    • dd. sec-Butyl-(1-methyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • ee. (1-Ethyl-propyl)-(1-methyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • ff. (2-Methyl-butyl)-(1-methyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • gg. (3-Methyl-butyl)-(1-methyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • hh. Cyclopentyl-(1-methyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • ii. Cyclohexyl-(1-methyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • jj. (1-Methyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-phenyl-amin
    • kk. (3-Chlor-phenyl)-(1-methyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl-amin
    • ll. Benzyl-(1-methyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • mm. 4-Chlor-1,3-diphenyl-1H-indazol
    • mn. 1,3-Diphenyl-1H-indazol-4-ylamin
    • oo. (1,3-Diphenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • pp. sec-Butyl-(1,3-diphenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • qq. (1,3-Diphenyl-1H-indazol-4-yl)-(1-ethyl-propyl)-amin
    • rr. (1,3-Diphenyl-1H-indazol-4-yl)-(2-methyl-butyl)-amin
    • ss. (1,3-Dimethyl-butyl)-(1,3-diphenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • tt. (3,3-Dimethyl-butyl)-(1,3-diphenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • uu. (1,3-Diphenyl-1H-indazol-4-yl)-diethyl-amin
    • vv. Cyclopentyl-(1,3-diphenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • ww. Cyclohexyl-(1,3-diphenyl-1H-indazol-4-yl)-amin
    • xx. (1,3-Diphenyl-1H-indazol-4-yl)-phenyl-amin
    • yy. 1-Benzyl-4-chlor-3-phenyl-1H-indazol
    • zz. 1-Benzyl-3-phenyl-1H-indazol-4-ylamin
    • aaa. (1-Benzyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-(1-ethyl-propyl)-amin
    • bbb. (1-Benzyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-(1,3-dimethyl-butyl)-amin
    • ccc. (1-Benzyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-diethyl-amin
    • ddd. (1-Benzyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-cyclopentyl-amin
    • eee. (1-Benzyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-cyclohexyl-amin
    • fff. (1-Benzyl-3-phenyl-1H-indazol-4-yl)-phenyl-amin
  • 13A-13B: 13A legt eine schematische Darstellung der Spezifitätsprobleme dar, die mit der Verwendung von Proteinkinaseinhibitoren mit kleinen Molekülen zum Entfalten der Zellsignalisierung verbunden sind. Katalytische Kinasedomänen sind stark konserviert. Somit blockiert die Mehrheit von potenten Inhibitoren die Aktivität von eng verwandten Kinasen und reguliert Wege, die durch die Kinaseaktivität vermittelt werden, umfassend herab. 13B legt eine schematische Darstellung der Methode in Richtung der hier beschriebenen selektiven Proteinkinaseinhibierung dar. Eine Raum erzeugende Mutation wird in die ATP-Bindungsstelle der Kinase der Wahl (Src) eingeführt. Diese Mutation erzeugt eine aktive Seitentasche (Kerbe) in Src, die durch einen rational konstruierten Inhibitor mit kleinem Molekül eindeutig erkannt werden kann. Dieser Inhibitor enthält eine voluminöse chemische Gruppe (Anschluß), die ihn zu Proteinkinasen vom Wildtyp orthogonal macht. Die Konstruktion des komplementären Kinase/Inhibitor-Paars ermöglicht eine sehr selektive Inhibierung der Zielkinase im Zusammenhang mit einer ganzen Zelle.
  • 14A–14B: 14A legt eine Struktur von N-6-Cyclopentyloxyadenosin (1) dar. 14B legt die Synthese von Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Inhibitor und Analogen dar. 2 wurde gemäß Hanefeld et al. synthetisiert. (i) RCOCl (10 Äquiv.), Pyridin, 5°C, 1 h; dann Erwärmen auf 22°C, 11 h; (ii) LiAlH4 (3,0 Äquiv.), trockenes THF unter Argon, 0°C, 30 min.; dann für 30 min. auf Rückfluß erhitzen. Alle Verbindungen wurden durch 1H-NMR (300 MHz) und Massenspektrometrie mit hoher Auflösung (EI) charakterisiert.
  • 15A–13C: 15A legt die chemischen Strukturen von Quercetin (5) und AMP PNP (6) dar. 15B zeigt die vorhergesagte Bindungsorientierung von 2 in aktiven src-Familien-Kinasestellen. Die Kristallstrukturen von an AMP PNP gebundenem Hck und an Quercetin gebundenem Hck wurden gemäß dem HcK-Proteingerüst überlagert. Die Struktur von 2 wurde anschließend durch Überlagern des Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Ringsystems von 2 auf den Adeninring von AMP PNP an die aktive Kinasestelle angekoppelt. 15C zeigt den vorhergesagten engen Kontakt zwischen N-4 von 2 und der Seitenkette des Rests 338 in den src-Familie-Kinasen. Das Molekül 2 wurde an die ATP-Bindungsstelle der src-Familien-Kinase Hck angekoppelt, wie in 15B. Die Methylwasserstoffe der Threoninseitenkette sind nun gezeigt. Bilder wurden unter Verwendung des Programms InsightII erzeugt.
  • 16 zeigt, daß der Inhibitor 3g (14) die p36-Phosphorylierung in I338G v-Src, aber nicht in WT v-Src transformierten NIH3T3-Fibroblasten blockiert. Nicht-transformierte NIH3T3-Zellen (Bahn 1). WT v-Src transformierte NIH3T3-Zellen (Bahnen 2–3) und I338G v-Src transformierte NIH3T3-Zellen (Bahnen 4–5) wurden mit 1,1% DMSO (Bahnen 1, 2 und 4) oder 100 μM 3g in 1,1% DMSO (Bahnen 3 und 5) inkubiert. Nach 12 Stunden wurden die Zellen lysiert. Die Phosphorylierungsniveaus wurden wie in 4 bestimmt.
  • 17A–17J zeigen die I338G v-Src transformierten Fibroblasten, die selektiv eine abgeflachte Morphologie annehmen und bei Inkubation mit 3g (14) selektiv wieder Actin-Spannungsfasern erlangen. Nicht-transformiert (a., b), WT v-Src transformiert (c., d., g., h.) und I338G v-Src transformiert (e., f., i., j). NIH3T3-Fibroblasten wurden entweder mit 1,1% DMSO (a., c., e., g., i.) oder 100 μM analog 3g in 1% DMSO (d., f., h., j.) behandelt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen photographiert (a., c., f.), mit Phalloidin-FITC angefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert (b., g., j.).
  • 18 legt die Synthese von C3-derivatisierten PP1-Analogen dar. Bedingungen: (i.) 2 Äquiv. NaH, 1 Äquiv. Malonitril, THF, RT, 0,5 h; (ii.) 5 Äquiv. NaHCO3, 5 Äquiv. Dimethylsulfat, Dioxan/H2O (6/1), 80°C, 1 h; (iii.) 1 Äquiv. Triethylamin, 1 Äquiv. tert-Butylhydrazinhydrochlorid, EtOH, Rückfluß, 1 h; (iv.) Formamid, 180°C, 12 h.
  • 19 legt eine schematische Darstellung der vorhergesagten Bindungsorientierung von zwei Klassen von derivatisierten Pyrazolo[3,4-d]pyrimidinen dar. Analoge, die bei N4 derivatisiert wurden, können aufgrund einer Unterbrechung des ATP-artigen Wasserstoffbindungsnetzwerks an Potenz verloren haben. Dieses Netzwerk ist vermutlich in den C3-derivatisierten Inhibitoren intakt.
  • 20A–20B: 20A zeigt den Effekt von 6a (18) auf die Tyrosinphosphorylierung in NIN3T3-Fibroblasten, die entweder v-Src vom Wildtyp (Bahnen 1, 2) oder I338G v-Src (Bahnen 3–8) exprimieren. Die Zellen wurden mit der angegebenen Menge an 6a (18) in 0,5% DMSO für 30 min. behandelt und sofort lysiert. Zellenproteine wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (10%) getrennt und in Nitrocellulose überführt. Tyrosinphosphorylierte Proteine wurden durch Immunoblotting mit einem monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (4G10) visualisiert. 20B zeigt den Effekt von 6a (18) auf die Tyrosinphosphorylierung in Jurkat-Zellen vom Wildtyp. 106 Jurkat-Zellen wurden bei 37°C für 30 min. in Gegenwart von 0,5% DMSO (Bahnen 9, 10), 500 nM 6a (Bahn 11) oder 10 μM PPI (Bahn 12) inkubiert. Die Zellen in den Bahnen 10–12 wurden anschließend mit 0,5 mM Pervanadat für 10 min. vor der Lyse behandelt. Tyrosinphosphorylierte Proteine wurden wie in 20A visualisiert.
  • 21A–21B: 21A und 21B zeigen 338G v-Src transformierte Fibroblasten, die selektiv eine abgeflachte Morphologie annehmen und nach Inkubation mit 6a (18) selektiv wieder Actinspannung erlangen. 21A zeigt nicht-transformierte NIH3T3-Zellen. 21B zeigt Zellen, die entweder durch v-Src vom Wildtyp oder I338G v-Src transformiert wurden, die mit 0,5% DMSO oder 250 nM 6a in 0,5% DMSO für 16 Stunden behandelt wurden. Alle Zellen wurden fixiert, mit Phalloidin-Rhodamin angefärbt und durch konfokale Mikroskopie visualisiert.
  • 22A–22B: 22A zeigt chemische Strukturen von (+)-K252a (1) und (+)-Staurosporin (2). 22B zeigt die Kristallstruktur von 2, gebunden an CDK2 (28). CDK2 ist mit dem Peptidgerüst, das als Band dargestellt ist, und den F80-Seitenketten als Stäbe gezeigt. Staurosporin ist mit Kohlenstoff, Stickstoff und Sauerstoff gezeigt. Wasserstoffe sind nicht gezeigt.
  • 23A–23C: 23A legt ein schematisches Diagramm eines Paarungsversuchs dar, der zum Testen auf die Fus3-Funktion verwendet wird. 23B und 23C zeigen die selektive Unterbrechung der fus3-as1-Hefepaarung durch 10 (28) und 11 (28). Haploid URA3 his3 S. cerevisiae, das entweder Fus3 vom Wildtyp, Fus3-as1 oder kein Fus3 bei OD600 = 0,5 exprimiert, wurde mit einer gleichen Anzahl von ura3 HIS3 fus1Δfus2Δ-Zellen gepaart und auf eine Nitrocellulosescheibe pipettiert. Die Scheibe wurde auf einer YPD-Platte, die die angegebenen Mengen an Inhibitor enthielt, für 5 Stunden bei 30°C angeordnet. Die Zellen wurden von den Scheiben befreit und serielle Verdünnungen der resultierenden Kulturen wurden auf Medien ausgestrichen, denen Uracil und Histidin mangelte, und für zwei Tage bei 30°C gezüchtet und die Kolonien wurden gezählt. Um sicherzustellen, daß 10 und 11 (28) nicht nicht-selektiv zytotoxisch waren, wurden alle Kulturen auch auf YPD ausgestrichen. Keine signifikante Abnahme an cfu/ml auf den YPD-Platten wurde für irgendeinen der drei Stämme in Gegenwart von 10 oder 11 (28) beobachtet. 23B legt eine Photographie von Platten dar, denen Histidin und Uracil mangelt, die mit 0,1 ml der Paarungskulturen von den folgenden Stämmen (von oben) inokuliert wurden: fus3Δ, fus3, fus3 + 5 μM 10, fus3-as1, fus3-as1 + 5 μM 10. 23C zeigt, daß die Unterbrechung der Fus3-abhängigen Paarung selektiv und dosisabhängig ist. Die Balken geben cfu/ml × 103 für Fus3 vom Wildtyp oder für Fus3-as1, das Hefe exprimiert, mit den angegebenen Inhibitorkonzentrationen an. Die Versuchsbedingungen sind wie vorstehend beschrieben.
  • 24 zeigt die Struktur von 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(2'-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6j).
  • 25A–25D legen dar, daß eine Zugabe von 500 nM 1-NM-PP1 einen Abfall der G2/M-Transkription verursacht. 25A–25C zeigen, daß eine asynchrone Population von cdc28-as1-Zellen für 120 Minuten mit 1-NM-PP1 behandelt wurde. Genomweite Transkriptionsunterschiede bei Abwesenheit und Anwesenheit von Inhibitor wurden durch Oligonukleotid-Mikromatrixanalyse von zellulärer mRNA gemessen (127). Zum Vergleich zeigt 25A den Prozentsatz an Genen, von deren Transkription bekannt ist, daß sie während des Zellenzyklus reguliert wird (150). 25B zeigt Transkripte, die nach der Inhibitorbehandlung über 2,5-fach abnahmen. 25C zeigt Transkripte, die nach der Inhibitorbehandlung zunehmen. Die Transkripte sind in den Listen und Kuchendiagrammen gemäß ihrer bekannten Zellenzyklusregulierung gruppiert (150). 25D zeigt, daß genomweite Änderungen der Genexpression in vier Vergleichen folgendermaßen bewertet wurden: 1. cdc28-as1-Zellen + 500 nM 1-NM-PP1 verglichen mit unbehandelten cdc28-as1-Zellen (as1 + 500/as1); 2. mit Arzneimittel behandelte cdc28-as1-Zellen verglichen mit mit Arzneimittel behandelten Zellen vom Wildtyp (as1+500/wt +500); 3. unbehandelte cdc28-as1-Zellen verglichen mit Zellen vom Wildtyp (as1/wt); und 4. mit Arzneimittel behandelte Zellen vom Wildtyp verglichen mit unbehandelten Zellen vom Wildtyp (wt +500/wt). Für jeden Vergleich wurde das Verhältnis der Genexpression unter den zwei Bedingungen in seinen natürlichen Logarithmus umgewandelt. Die mittlere logarithmische Änderung der Expression aller Gene in jedem der Hauptzellenzyklushäufungen (G1, S, S/G2, G2/M, M/G1) sowie jene von Genen, deren Expression nicht zellenzyklusreguliert ist (unreg.), wurde berechnet. Fehlerbalken stellen Standardfehler des Mittelwerts dar.
  • 26A und 26B: (a.) Klassifizierung, Substratspezifitäten und Zellenfunktionen der in diesem Bericht verwendeten Proteinkinasen. (b.) Sequenzausrichtung der Reste, die die Position 338 umgeben (v-Src-Numerierung) für die in (a) aufgelisteten Proteinkinasen (SEQ ID NR.: 14–20).
  • 27: 50% Inhibitorische Konzentrationen (IC50, μM) für K252a und C(7) derivatisierte K252a-Analoge gegen ein Feld von Wildtyp- und rational konstruierten Proteinkinasen. IC50-Werte für das beste K252a-Derivat/konstruierte Kinasepaar sind gezeigt. Die Kinasereinigung und Messung der IC50-Werte wurden im wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (86).
  • 28: 50% inhibitorische Konzentrationen (IC50, μM) für PP1 und C(3)-Phenyl-derivatisierte PP1-Analoge gegen ein Feld von Wildtyp- und rational konstruierte Proteinkinasen. IC50-Werte für das beste PP1-Derivat/konstruierte Kinasepaar sind gezeigt. Die Kinasereinigung und Messung von IC50-Werten wurden im wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (86).
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • I. Definitionen
  • Wie es in der Biotechnologie im allgemeinen der Fall ist, hat die Beschreibung der vorliegenden Erfindung hierin die Verwendung einer wesentlichen Anzahl von Fachbegriffen erfordert. Obwohl es nicht praktisch ist, dies erschöpfend zu tun, werden hier Definitionen von einigen dieser Begriffe für eine leichte Bezugnahme bereitgestellt. Definitionen für andere Begriffe erscheinen auch sonstwo hierin, und diese werden hier nicht wiederholt. Es ist wichtig zu beachten, daß es nicht beabsichtigt ist, daß den hier oder sonstwo hierin definierten Begriffen eine andere Bedeutung gegeben wird als die, von denen Fachleute verstehen, daß sie diese haben, wenn sie auf dem Gebiet verwendet werden, und es wird daher nahegelegt, daß auch andere Quellen bei der Interpretation der Bedeutung dieser Begriffe und jener, die sonstwo hierin definiert sind, zu Rate gezogen werden. Die hier und sonstwo hierin bereitgestellten Definitionen sollten jedoch immer beim Bestimmen des Umfangs und der Bedeutung der definierten Begriffe betrachtet werden.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Enzym" irgendeine natürlich vorkommende oder synthetische makromolekulare Substanz, die insgesamt oder weitgehend aus einem Protein besteht, das mehr oder weniger spezifisch eine oder mehrere (bio)chemische Reaktionen katalysiert. Die Substanzen, auf die die Enzyme wirken, sind als "Substrate" bekannt, für die das Enzym eine spezifische Bindungs- oder "aktive Stelle" besitzt. Enzyme können auch auf makromolekulare Strukturen wie z.B. Muskelfasern und mehr "Kargo" wie z.B. intrazelluläre Bläschen wirken. Solche Proteine werden Motorproteine genannt, von welchen zwei Klassen Myosine und Kinesine sind.
  • Wie hierin verwendet, ist der Begriff "katalytische Aktivität eines Enzyms" als die Eigenschaft gemessen, die durch die Erhöhung der Umwandlungsrate einer festgelegten chemischen Reaktion gemessen wird, die das Enzym in einem Versuchssystem erzeugt.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Kinase" irgendein Phosphotransferase-Enzym, das eine Phosphatgruppe überträgt.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Proteinkinase" irgendein Enzym, das eine oder mehrere Hydroxyl- oder phenolische Gruppen in Proteinen phosphoryliert, wobei ATP der Phosphorylgruppendonor ist.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Phosphorylase" irgendein Enzym, das die phosphorolytische Entfernung des nicht-reduzierenden endständigen Glucoserests von einem Glucan katalysiert.
  • Wie hierin verwendet, ist der Begriff "Phosphorylasekinase" synonym mit dem Begriff "Proteinphosphorylasekinase" und bedeutet irgendein Phosphorylaseenzym, das Phosphorylase b in Phosphorylase a umwandelt.
  • Wie hierin verwendet, ist der Begriff "Phosphorylasephosphatase" synonym mit "Proteinphosphorylasephosphatase" und bedeutet irgendein Phosphorylaseenzym, das Phosphorylase a in Phosphorylase b umwandelt.
  • Wie hierin verwendet, ist der Begriff "Tyrosinkinase" synonym mit dem Begriff "Proteintyrosinkinase" und bedeutet ein Enzym, das das endständige Phosphat von ATP zu einem spezifischen Tyrosinrest an seinem Zielprotein überträgt.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Transferase" irgendein Enzym, das die Übertragung einer Gruppe – z.B. der Methylgruppe, Glycosylgruppe, Acylgruppe, Phosphor-enthaltenden oder anderen Gruppen – katalysiert.
  • Wie hierin verwendet, ist der Begriff "Methyltransferase" synonym mit dem Begriff "Transmethylase" und bedeutet irgendeines der Enzyme, die die Übertragung einer Methylgruppe katalysieren.
  • Der Begriff "Inhibitor mit niedriger Affinität" bezieht sich auf ein kleines Molekül, das eine Bindungskonstante (IC50) für das Zielenzym mit mehr als etwa 200 nM aufweist und somit mit hohen Konzentrationen in einem Versuch auf Zellenbasis oder auf Basis eines ganzen Tiers verwendet werden müßte (eine Konzentration von mehr als 50 μM). Solche hohen Konzentrationen könnten nicht-spezifische Arzneimittelauswirkungen einführen, die die spezifische Rolle des gewünschten Ziels des Inhibitors verdecken könnten.
  • Wie hierin verwendet, ist der Begriff "mutantenspezifischer Inhibitor" als Inhibitor definiert, der eine spezifische Art eines Mutantenenzyms inhibiert.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "monospezifischer Inhibitor" einen Inhibitor, der nur mit einem einzelnen festgelegten Enzym reagieren kann.
  • Der Begriff "Inhibitor mit hoher Affinität" bezieht sich auf ein kleines Molekül, das eine Bindungskonstante (IC50) für das Zielenzym von weniger als etwa 200 nM aufweist und folglich ermöglicht, daß es mit "niedrigen" Konzentrationen in einem Versuch auf Zellenbasis oder auf der Basis eines ganzen Tiers verwendet wird (eine Konzentration von weniger als 50 μM). Bei niedrigeren Konzentrationen würden die nicht-spezifischen Effekte des kleinen Moleküls verringert werden, was somit ermöglicht, daß eine echtere Reaktion auf die Inhibierung der Zielkinase bewertet wird.
  • Der Begriff "orthogonal" wird hier verwendet, um eine Verbindung zu bedeuten, die strukturell und/oder geometrisch ähnlich zum natürlichen Substrat für ein gegebenes Enzym oder zu einem Inhibitor der Wildtypform des Enzyms ist, aber Unterschiede in der chemischen Struktur aufweist, die diese Verbindung weniger fähig machen, an die Wildtypform des Enzyms zu binden, als das natürliche Substrat. Mit "natürlichem" Substrat ist das Substrat gemeint, das von der Wildtypform dieses Enzyms verwendet wird. Die orthogonalen Inhibitoren der vorliegenden Erfindung können hierin in verschiedenen Weisen bezeichnet werden; manchmal werden sie beispielsweise als "modifizierte Substrate", "modifizierte Inhibitoren", "Analoge", "Derivate", nur als "Substrate" oder "Inhibitoren" und vielleicht ebenso mit anderen Begriffen bezeichnet. In jedem Fall ist jedoch dieselbe Bedeutung vorgesehen. Die Bedeutung von "orthogonal" und seinen Synonymen wird natürlich in den nachstehend bereitgestellten Beschreibungen der Erfindung weiter erläutert.
  • Die mutmaßlichen orthogonalen Substrate und Inhibitoren der hierin beschriebenen Ausführungsbeispiele der Erfindung wurden jeweils durch Zugeben von voluminösen Substituenten zu einem Atom auf dem natürlichen Substrat des bekannten Kinaseinhibitors hergestellt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht so begrenzt. Es ist beispielsweise möglich, ein orthogonales Substrat herzustellen, das kleiner ist als ein bekannter Inhibitor oder das natürliche Substrat, z.B. durch Herstellen eines Analogen, dem ein oder mehrere Atome oder Substituenten fehlen, die im natürlichen Substrat vorhanden sind. Mit solchen mutmaßlichen orthogonalen Substraten oder Inhibitoren könnte man das Enzym so mutieren, daß es ein oder mehrere Aminosäuren mit voluminöseren Seitenketten als jenen, die in der Aminosäuresequenz vom Wildtyp zu finden sind, enthält, so daß, wenn das orthogonale Substrat oder der orthogonale Inhibitor bindet, diese voluminöseren Aminosäureseitenketten den durch die fehlenden Atome oder Substituenten erzeugten zusätzlichen Raum füllen oder teilweise füllen. In dieser Weise würde erwartet werden, daß die Mutante an das orthogonale Substrat oder den orthogonalen Inhibitor binden würde und/oder von diesem inhibiert werden würde, aber im wesentlichen nicht das normale Substrat verwenden würde, da die hinzugefügten voluminösen Aminosäuren eine sterische Behinderung für seine Bindung darstellen. Eine solche Methode würde eine sehr selektive Steuerung der resultierenden Mutante ermöglichen.
  • Es ist wichtig, nicht zu vergessen, daß, obwohl die Substrate und Inhibitoren der Beispiele hierin vom nicht-kompetitiven Typ sind, dies nicht als Begrenzung des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung betrachtet werden sollte. Viele verschiedenen Arten von Enzymsubstraten und Inhibitoren sind bekannt, z.B. kompetitive, nicht-kompetitive, unkompetitive, "Suizid"-Inhibitoren usw. Kompetitive Inhibitoren konkurrieren mit einem Substrat für seine Bindungsstelle, aber da der Inhibitor nicht an der katalytischen Reaktion, die dieses Enzym ausführt, teilnehmen kann, verlangsamt es die Katalyse. Nicht-kompetitive Inhibitoren binden an die aktive Stelle, aber werden dann kovalent oder ionisch an die Proteinstruktur des Enzyms gebunden, so daß sie nicht loskommen können. Somit inhibieren sie die Katalyse, indem Moleküle des Enzyms vollkommen aus der Reaktion genommen werden. Detailliertere Beschreibungen dieser und anderer kompetitiver Mechanismen sind in einer Vielfalt von Quellen (z.B. 72) zu finden. Durch Anwenden des Verständnisses des Fachgebiets hinsichtlich solcher Mechanismen auf die Konstruktion von Inhibitoren der vorliegenden Erfindung könnten alle derartigen Arten von Inhibitoren hergestellt werden.
  • Ein Analog, das binden, aber nicht reagieren kann, würde beispielsweise eine kompetitive Inhibierung vorsehen, und ein Analog, das bei der Bindung kovalent an das Enzym gebunden wird, wäre ein nicht-kompetitiver Inhibitor, d.h. ein Gift.
  • Alle solchen Arten von Inhibitoren liegen innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
  • Der Begriff "homolog zu" wurde verwendet, um zu beschreiben, wie eine Information darüber, wie ein Enzym zu modifizieren ist, von einer Information hinsichtlich der dreidimensionalen Struktur von anderen verwandten Enzymen abgeleitet werden kann. Wie Fachleute wissen, weist ein Teil eines Enzyms, der zu einem Teil eines zweiten Enzyms "homolog" ist, eine Proteinsequenz auf, die mit jener des zweiten Enzyms verwandt ist. Diese Beziehung besteht darin, daß sie eine Anzahl von Aminosäuren an derselben relativen Stelle zueinander aufweisen. Die imaginäre Sequenz Asp-Met-Phe-Arg-Asp-Lys-Glu (SEQ ID NR.: 10) und die imaginäre Sequenz Asp-Met-Ile-Arg-Glu-Lys-Asp (SEQ ID NR.: 11) weisen beispielsweise vier Aminosäuren an derselben relativen Stelle und drei, die verschieden sind, auf, und es würde behauptet werden, daß sie homologe Sequenzen aufweisen. Man beachte, daß die drei Aminosäuren, die zwischen den Ketten verschieden sind, insofern "konservative" Unterschiede sind, als die Substitutionen in der zweiten Sequenz relativ zur ersten mit Aminosäuren sind, die ähnliche Funktionalitäten an ihren Seitenketten aufweisen: Glu und Arg weisen beispielsweise beide geladene Gruppen auf und sowohl Phe als auch Ile sind hydrophob. Obwohl dies bei homologen Proteinsequenzen häufig der Fall ist, muß es nicht der Fall sein, und diese zwei imaginären Sequenzen würden immer noch als homolog betrachtet werden, selbst wenn die Unterschiede nicht konservativ wären. Die Referenz 71 gibt einen guten Überblick darüber, welche Domänen der bekannten Kinasen vom Fachgebiet als "homolog" betrachtet werden. Obwohl das Fachgebiet nicht im allgemeinen zustimmen kann, wird außerdem hier vorgesehen, daß Sequenzen, die zueinander identisch sind, auch als zueinander "homolog" betrachtet werden.
  • Der Begriff "Domäne" ist auch ein auf dem Fachgebiet gut bekannter und er bezieht sich auf einen Bereich in einem Protein, der als eine spezielle Funktionalität aufweisen identifiziert wurde. Die drei Domänen in Proteinkinasen wurden beispielsweise anderswo hierin erörtert und ihre funktionalen Rollen . wurden erörtert. Wie es bei Kinasen der Fall ist, weisen häufig verschiedene Enzyme derselben Familie dieselbe Anzahl von Domänen auf, die jeweils derselben Funktion dienen, und sie werden häufig (aber wahrscheinlich nicht immer) in derselben Reihenfolge entlang der Proteinsequenz angeordnet. Wie es für die Kinasen der Fall ist, kann ein Enzym interessanter Weise eine andere Proteinsequenzlänge zwischen seinen Domänen aufweisen als ein anderes. Da jedoch die Domänen von zwei verwandten Enzymen im allgemeinen (aber wahrscheinlich nicht immer) zueinander homolog sind, erschwert dies im allgemeinen nicht die Identifikation von entsprechenden Domänen.
  • Beim Beschreiben der breiteren Aspekte der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe "Multi-Substrat" oder "Multi-Substrat-Enzym" verwendet. Diese Begriffe sind synonym und sollen Enzyme bedeuten, die zwei oder mehr Substrate binden. Diejenigen am meisten interessierenden Multi-Substrat-Enzyme sind jene, die zumindest einen Teil eines Substrats an mindestens ein weiteres Substrat katalytisch binden. Die Kinasen und die Transferasen sind nur zwei Familien solcher Multi-Substrat-Enzyme und Fachleute werden leicht erkennen, daß es andere derartige Enzyme und Enzymfamilien gibt.
  • Der Begriff "erkennen" wird hier manchmal verwendet, um die Fähigkeit eines Substrats zu beschreiben, spezifisch and irgendein aktive Stelle an einem Enzym zu binden. Dies bezieht sich einfach auf die Tatsache, daß das Substrat eines Enzyms (oder manchmal Substratderivate oder auch vollständig andere Verbindungen, die das Substrat nachahmen) mit der aktiven Stelle des Enzyms in Kontakt kommen oder an diese binden können, aber andere Verbindungen dies nicht können. Dieses Konzept ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Enzymologen sagen häufig, daß das Enzym eine Affinität für sein Substrat aufweist oder daß das Substrat eine Affinität für das Enzym aufweist. Sie sagen auch, daß ein Enzym eine "Substratspezifität" aufweist. Diese alle beschreiben wirklich dasselbe Phänomen.
  • Ein verwandter Begriff ist der Begriff "binden". Ein Inhibitor bindet oder klebt im allgemeinen an eine aktive Stelle durch eine oder mehrere hydrophobe, hydrophile, Wasserstoff- und/oder ionische Bindungen oder im Fall von nicht- kompetitiven Inhibitoren durch kovalente Bindungen. Obwohl das komplexe Verständnis auf dem Fachgebiet hinsichtlich der Inhibitorbindung und der Gründe für die Inhibierung interessant sein kann, ist ein solches Verständnis für das Verständnis der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich. Es genügt, einfach festzustellen, daß die Bindung durch einen Inhibitor eine Inhibierung der katalytischen Reaktion verursacht.
  • Der Begriff "Mutante" und "konstruierte Form", wenn sie zum Beschreiben der Enzyme der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bedeuten einfach, daß sie Sequenzen aufweisen, die eine andere Aminosäure an einer oder mehreren Positionen aufweisen, wenn sie mit der Sequenz vom Enzym vom Wildtyp verglichen werden. Beim Beschreiben solcher Mutanten geben zwei durch eine Zahl getrennte Buchstaben die durchgeführten Aminosäuremutationen an. Die Buchstaben sind Ein-Buchstaben-Aminosäurecodes und die Zahlen sind die Aminosäurerestpositionen im intakten Enzym vom Wildtyp. GST-XD4 ist beispielsweise ein Fusionsprotein, das ein Fragment XD4 enthält, das dieselbe Sequenz aufweist wie ein spezifischer Teil des v-Src vom Wildtyp. Bei der Bezeichnung GST-XD4 (V323A, I338A) wurde das Valin in der Sequenz des v-Src-Fragments XD5, das die Position 323 in der vollständigen v-Src-Sequenz vom Wildtyp darstellt, durch Alanin ersetzt und das Isoleucin in dem XD4-Fragment, das die Position 338 in der vollständigen v-Src-Sequenz vom Wildtyp darstellt, wurde auch durch Alanin ersetzt. Somit umfassen die Begriffe "Mutante" und "konstruierte Form" Teile des Enzyms vom Wildtyp, die die mutierte Aminosäure oder die mutierten Aminosäuren enthalten.
  • Der Begriff "A*TP" bezieht sich auf eine Form von ATP, in der zusätzliche Atome oder Gruppen von Atomen zu einer oder mehreren Positionen der ATP-Struktur hinzugefügt sind. Außerdem bedeutet A*TP ein Analog von ATP, von welchem ein oder mehrere seiner Atome entfernt sind, um ein Molekül zu bilden, das kleiner ist als ATP selbst. A*TP bedeutet nicht notwendigerweise ein nicht-natürliches Analog von ATP, beispielsweise könnte GTP als Analog von ATP für die Zwecke dieser Definition betrachtet werden.
  • Der Satz "funktional ruhige Mutation der aktiven Stelle" bedeutet, daß die Mutation die normale zelluläre Rolle des Proteins nicht unterbricht. Mit anderen Worten, die "funktional ruhige" Mutante sollte die biologische Rolle des Proteins vom Wildtyp vollständig oder zumindest signifikant ersetzen können. Wenn beispielsweise eine Zelle oder ein Organismus erzeugt wird, in dem die Form des Proteins vom Wildtyp fehlt, und dann die "funktional ruhige" Form des Enzyms in diese Zelle oder diesen Organismus hinzugefügt wird, sollte diese "Mutante enthaltende" Zelle oder Organismus sehr ähnlich, wenn nicht identisch, im Verhalten (durch irgendeinen geeigneten Versuch) zur ursprünglichen unmodifizierten Form der Zelle oder des Organismus sein.
  • II. Allgemeine Beschreibung
  • Diese Erfindung stellt spezifische Proteinkinaseinhibitoren bereit. Nach selektiven Proteinkinaseinhibitoren wird als Werkzeuge zum Untersuchen von zellulären Signalumsetzungskaskaden stark gesucht, dennoch wurden aufgrund der stark konservierten Faltung von katalytischen Kinasedomänen wenige entdeckt. Durch eine Kombination der Synthese von kleinen Molekülen und der Proteinmutagenese wurde ein sehr potenter (IC50 = 1,5 nM) und eindeutig spezifischer Inhibitor (4-Amino-1-tert-butyl)-3-(1'-naphthyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin) einer rational konstruierten v-Src-Proteinkinase (Ile338Gly v-Src) identifiziert. Sowohl die Leistungsfähigkeit als auch die Spezifität dieser Verbindung übertreffen jene von irgendwelchen bekannten Src-Familien-Proteinkinaseinhibitoren. Das Molekül inhibiert stark das konstruierte v-Src in ganzen Zellen, aber inhibiert nicht die Tyrosinphosphorylierung in Zellen, die nur Proteinkinasen vom Wildtyp exprimieren. Außerdem unterbricht der Inhibitor selektiv die Transformation in Zellen, die das Ziel-v-Src exprimieren. Die strukturelle Entartung der aktiven Kinasestelle sollte ermöglichen, daß dieselbe komplementäre Inhibitor/Protein-Konstruktionsstrategie umfassend über diese ganze Enzym-Superfamilie anwendbar ist. Somit stellt diese Erfindung Mutantentyrosin- und ser/thr-Kinasen bereit.
  • Diese Erfindung stellt Mutantenproteinkinasen bereit, die gegen die offenbarten zellenpermeablen Inhibitoren empfindlich sind. Die Mutantenproteinkinasen gehören zu den folgenden Unterfamilien: Src-Familie (v-Src, Fyn), Abl-Familie (c-Abl), Ca2+/Calmodulin-abhängige Familie (CAMK IIa) und Cyclin-abhängige Familie (CDK2 und Cdc28).
  • III. Proteinkinaseinhibitor
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Proteinkinaseinhibitor bereit, der durch die folgende Formel I dargestellt wird:
    Figure 00280001
    wobei R 1'-Naphthyl; 2'-Naphthyl; m-Phenoxyphenyl; m-Benzyloxyphenyl; m-(2',6'-Dichlor)benzyloxyphenyl; 3-Piperonyl; p-tert-Butylphenyl; 1'-Naphthylmethyl; 1'-Naphthoxymethyl; oder 2'-Naphthylmethyl darstellt.
  • In einem Ausführungsbeispiel ist das Naphthyl Naphthylpyrazolo, Pyrimidin. In einem anderen Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6a dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6b dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist m-Phenoxyphenyl ein m-Phenoxyphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6c dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das m-Benzyloxyphenyl ein m-Benzyloxyphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6d dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das m-Dichlor, Benzyloxyphenyl ein m-Dichlor, Benzyloxyphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6e dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das 3-Piperonyl ein 3-Piperonyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6f dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das p-tert-Butylphenyl ein p-tert-Butylphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6g dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Naphthylmethyl ein Naphthylmethyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6h dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6j dargestellt, wie in 24 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Naphthoxymethyl ein Naphthoxymethyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6i dargestellt, wie in 18 dargelegt.
  • Diese Erfindung stellt einen src-Familien-Kinaseinhibitor bereit, wobei der Inhibitor folgendes ist

    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(1'-naphthyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6a);
    4-Amino-l-(tert-butyl)-3-(2'-naphthyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6b);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(m-phenoxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6c);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(m-benzyloxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6d);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(m-(2',6'-dichlor)benzyloxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6e);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-piperonylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6f);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(p-tert-butylphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6g);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(1'-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6h);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(1'-naphthoxymethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6i); oder
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(2'-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6j).
  • Wie hierin demonstriert, wurden alle Ausgangsmaterialien und synthetischen Reagenzien von kommerziellen Lieferanten erworben, wenn nicht anders angegeben. Säurechloride, die nicht leicht kommerziell erhältlich waren (3c, 3d, 3e, 3h, 3i), wurden durch Behandlung der entsprechenden Carbonsäuren mit überschüssigem Oxalylchlorid und katalytischem DMF in Diethylether synthetisiert. Alle PP1-Analogen wurden gemäß Henefeld et al. synthetisiert. Die Gruppe von modifizierten Inhibitoren wurde gegen eine katalytische Domäne der Zielkinase I338G v-Src selektiert, die in Bakterien exprimiert wurde, und als Gluthathion-S-Transferase (GST) Fusionsprotein gereinigt. Alle C3-derivatisierten Analoge sind potentere Inhibitoren von I338G v-Src als das potenteste Molekül (Verbindung 3g, IC50 = 430 nM, 14), das aus dem ersten Generationsfeld von N4-derivatisierten Verbindungen identifiziert wurde (siehe 14). Vier der Moleküle (6a, 6b, 6d, 6h) inhibieren die Zielkinase bei niedrigen nM-Konzentrationen, wobei die zwei Naphthylisomere (6a, 6b) die größte Leistungsfähigkeit aufweisen (IC50 = 1,5 nM). Unter den Bedingungen unseres Versuchs inhibierte das Muttermolekül PP1 sein optimales Ziel Fyn mit nur IC50 = 30 nM. Diese Daten zeigen, daß eine Inhibitorkonstruktionsstrategie, die Enzymkonstruktion mit gerichteter Synthese von kleinen Molekülen kombiniert, nicht nur die Leistungsfähigkeit von Molekülen anpassen kann, die durch Selektieren von großen Bibliotheken identifiziert werden, sondern auch zu einer signifikanten Zunahme (20-fach im Fall von 6a, 6b) der Affinität gegenüber vorher optimierten Inhibitoren von Kinase vom Wildtyp führen kann. Verbindungen mit der Formel 6a oder 6b sind die potentesten Inhibitoren von irgendeiner Src-Familien-Proteinkinase, die bis jetzt berichtet wurden. Verbindung 6h und 6j sind orthogonaler zu Kinasen vom Wildtyp und weisen eine mittlere Leistungsfähigkeit auf. Sie sind nicht so potent wie 6a und 6b, aber da sie sehr schlecht an Kinasen vom Wildtyp binden, sind sie letztlich für die Inhibierung von Mutantenkinasen sehr nützlich.
  • Diese Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Proteinkinaseinhibitor bereit, die durch die folgende Formel I dargestellt wird:
    Figure 00310001
    wobei R 1'-Naphthyl; 2'-Naphthyl; m-Phenoxyphenyl; m-Benzyloxyphenyl; m-(2',6'-Dichlor)benzyloxyphenyl; 3-Piperonyl; p-tert-Butylphenyl; 1'-Naphthylmethyl; 1'-Naphthoxymethyl; oder 2'-Naphthylmethyl darstellt; und mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger.
  • In einem Ausführungsbeispiel ist das Naphthyl ein Naphthylpyrazolo, Pyrimidin. In einem anderen Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6a dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6b dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6c dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das m-Benzyloxyphenyl ein m-Benzyloxyphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6d dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das m-Dichlor, Benzyloxyphenyl ein m-Dichlor, Benzyloxyphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6e dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das 3-Piperonyl ein 3-Piperonyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6f dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das p-tert-Butylphenyl ein p-tert-Butylphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6g dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Naphthylmethyl ein Naphthylmethyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6h dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6j dargestellt, wie in 24 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Naphthoxymethyl ein Naphthoxymethyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6i dargestellt, wie in 18 dargelegt.
  • Diese Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem src-Familien-Kinaseinhibitor bereit, wobei der Inhibitor folgendes ist

    4-Amino-1-(teri-butyl)-3-(1'-naphthyl)pyrazolo[3,4-djpyrimidin (6a);
    4-Amino-l-(tert-butyl)-3-(2'-naphthyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6b);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(m-phenoxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6c);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(m-benzyloxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6d);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(m-(2',6'-dichlor)benzyloxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6e);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-piperonylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6f);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(p-tert-butylphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6g);
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(1'-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6h);
    4-Amino-l-(tert-butyl)-3-(1'-naphthoxymethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6i); oder
    4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(2'-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6j);

    und mit einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Unterbrechen der Transformation in einer Zelle bereit, die die Zielmutante v-Src exprimiert, umfassend in Kontakt bringen der Zelle mit einem Proteinkinaseinhibitor, die durch die folgende Formel I dargestellt wird:
    Figure 00330001
    wobei R 1'-Naphthyl; 2'-Naphthyl; m-Phenoxyphenyl; m-Benzyloxyphenyl; m-(2',6'-Dichlor)benzyloxyphenyl; 3-Piperonyl; p-tert-Butylphenyl; 1'-Naphthylmethyl; 1'-Naphthoxymethyl; oder 2'-Naphthylmethyl darstellt.
  • In einem Ausführungsbeispiel ist das Naphthyl ein Naphthylpyrazolo, Pyrimidin. In einem anderen Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6a dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6b dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das m-Phenoxyphenyl ein m-Phenoxyphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6c dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das m-Benzyloxyphenyl ein m-Benzyloxyphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6d dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das m-Dichlor, Benzyloxyphenyl ein m-Dichlor, Benzyloxyphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist der Proteinkinaseinhibitor das 3-Piperonyl, ein 3-Piperonyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6f dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das p-tert-Butylphenyl ein p-tert-Butylphenyl, Ryrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6g dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Naphthylmethyl ein Naphthylmethyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6h dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6j dargestellt, wie in 24 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Naphthoxymethyl ein Naphthoxymethyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6i dargestellt, wie in 18 dargelegt.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Unterbrechen der Transformation in einer Zelle bereit, die die Zielmutante v-Src exprimiert, umfassend in Kontakt bringen der Zelle mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem Proteinkinaseinhibitor, die durch die folgende Formel I dargestellt wird:
    Figure 00340001
    wobei R 1'-Naphthyl; 2'-Naphthyl; m-Phenoxyphenyl; m-Benzyloxyphenyl; m-(2',6'-Dichlor)benzyloxyphenyl; 3-Piperonyl; p-tert-Butylphenyl; 1'-Naphthylmethyl; 1'-Naphthoxymethyl; oder 2'-Naphthylmethyl darstellt; und mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger.
  • In einem Ausführungsbeispiel ist das Naphthyl ein Naphthylpyrazolo, Pyrimidin. In einem anderen Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6a dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6b dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das m-Phenoxyphenyl ein m-Phenoxyphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6c dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6d dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das m-Dichlor, Benzyloxyphenyl ein m-Dichlor, Benzyloxyphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6e dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das 3-Piperonyl ein 3-Piperonyl, Pyrazalopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6f dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das p-tert-Butylphenyl ein p-tert-Butylphenyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6g dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Naphthylmethyl ein Naphthylmethyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6h dargestellt, wie in 18 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6j dargestellt, wie in 24 dargelegt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Naphthoxymethyl ein Naphthoxymethyl, Pyrazolopyrimidin. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der Proteinkinaseinhibitor durch die Formel 6i dargestellt, wie in 18 dargelegt.
  • Wie hierin demonstriert, erscheinen v-Src exprimierende Zellen vom Wildtyp, die mit 6a behandelt werden, von unbehandelten Zellen vom Wildtyp als ununterscheidbar, was darauf hindeutet, daß 6a keine Wirkung auf diese Nicht-Mutanten-Zellinie hat. Zellen, die die Zielkinase exprimieren, weisen jedoch deutliche Actinfasern auf und erscheinen von normalen NIH3T3-Fibroblasten ununterscheidbar, wenn sie mit 250 nM 6a für 16 Stunden inkubiert werden. Aus diesen Daten ist klar, daß die Inhibierung kleiner Moleküle der katalytischen Aktivität von v-Src's ausreicht, um ihre Rolle bei der Onkogenese zu blockieren.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können Markierungen oder Marker wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffe in einem Bereich von blauen, roten, grünen, gelben Farben und insbesondere blauen und grünen Farben umfassen. Die Farbe der Fluoreszenz kann von der Absorptionsfarbe verschieden sein. Fluoreszenzpigmente besitzen hohe Lumineszenz und vorteilhafte Anwendungseigenschaften, beispielsweise hohe Lichtschnelligkeit und eine geringe Wanderungstendenz. Der Besitz von Fluoreszenzeigenschaften ermöglicht ferner die Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von medizinischen, pharmazeutischen und Diagnoseanwendungen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um verschiedene therapeutische Mittel zu markieren, um ihre Anordnung im Körper zu ermöglichen. An sich kann die Therapie mit solchen markierten therapeutischen Mitteln bezüglich der Zielorgane und -gewebe eng überwacht werden. Dies ist bei der Behandlung von verschiedenen Krebsen besonders nützlich, insbesondere jenen vom festen Tumortyp, wo die Lokalisierung des Chemotherapiemittels äußerst wichtig ist und die Dosierung aufgrund der Möglichkeit von Nebenwirkungen eng überwacht werden muß.
  • Die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung gehören zur Familie von Pyrazolopyrimidinen (US-Patent Nr. 5 593 997 ). Pyrazolopyrimidine sind bei der Behandlung und Verhinderung von Atemerkrankungen, die durch Asthma dargestellt werden, nützlich (US-Patent Nr. 5 942 515 ). Überdies wurden Aminopyrazolopyrimidin-Derivate als Proteinkinaseinhibitoren zum Inhibieren der Zellproliferation verwendet und sind somit bei der Behandlung von Tumoren und hyperproliferativen Erkrankungen nützlich ( WO 9631510 ). Es wurde auch gezeigt, daß diese Familie von Inhibitoren bei der Behandlung von kardiovaskulären und urogenitalen Erkrankungen ( DE 19709126 A ) und für die Behandlung von Ischämie, Arthritis und Schmerz ( WO 9640707 ) nützlich ist. Somit wird auch erwartet, daß die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung therapeutische Anwendungen aufweisen.
  • Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine Lösung für die vorstehend beschriebenen Probleme durch Bereitstellung von Materialien und Verfahren bereit, durch die eine einzige Proteinkinase spezifisch ohne die gleichzeitige Inhibierung einer anderen Proteinkinase inhibiert werden kann.
  • IV. Konstruierte Kinase und konstruierte Multi-Substrat-Enzyme
  • In einem ersten Aspekt beinhaltet die vorliegende Erfindung die Konstruktion von Kinase und anderen Multi-Substrat-Enzymen, so daß sie modifizierte Substrate verwenden kann, die von ihren Wildtypformen nicht so leicht verwendet werden. Die Erfindung stellt ferner solche chemisch modifizierten Nukleotidtriphosphatsubstrate, Verfahren zur Herstellung derselben und Verfahren zur Verwendung derselben bereit. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen Verfahren zur Verwendung der modifizierten Substrate zusammen mit der konstruierten Kinase, um zu identifizieren, auf welche Proteinsubstrate die Kinase wirkt, um das Ausmaß einer solchen Wirkung zu messen und um festzustellen, ob Testverbindungen eine solche Wirkung modulieren können.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine konstruierte Proteinkinase bereit, die Inhibitoren binden kann, die von den Wildtypformen dieser Enzyme nicht so leicht gebunden werden. Verfahren zur Herstellung und Verwendung jeglicher solcher konstruierter Kinase werden auch bereitgestellt. Die Erfindung stellt ferner solche Inhibitoren, Verfahren zur Herstellung derselben und Verfahren zur Verwendung derselben bereit. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen Verfahren zur Verwendung der Inhibitoren zusammen mit der konstruierten Kinase, um zu identifizieren, auf welche Proteinsubstrate die Kinase wirkt, um die Kinetik einer solchen Wirkung zu messen und um die biochemischen und zellulären Wirkungen einer solchen Inhibierung zu bestimmen. Sie betrifft auch die Verwendung solcher Inhibitoren und einer solchen konstruierten Kinase, um aufzuklären, welche Kinase an der Krankheit beteiligt sein kann; diese Kinase kann dann zum Gegenstand für Anstrengungen zum Konstruieren oder Entdecken von traditionelleren spezifischen Inhibitoren ihrer Wildtypformen werden, die sich als bei der Behandlung der mit Kinase verbundenen Krankheit oder Störung wertvoll erweisen können.
  • Ferner werden Verfahren zum Einfügen der konstruierten Kinase in Zellen, vorzugsweise anstelle der entsprechenden Kinase vom Wildtyp, und dann zur Verwendung des Inhibitors, an den sie angepaßt wurde, als Werkzeug zum Untersuchen der Krankheit-Kinase-Beziehung und letztlich als Arzneimittel für die Behandlung der Krankheit bereitgestellt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch allgemeiner konstruierte Formen von Multi-Substrat-Enzymen, die einen Teil oder alles von mindestens einem (Donor) Substrat an mindestens ein anderes (Empfänger) Substrat kovalent binden. Diese konstruierten Formen nehmen modifizierte Substrate und Inhibitoren an, die von den Wildtypformen dieser Enzyme nicht so leicht gebunden werden.
  • Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung und Verwendung von solchen konstruierten Enzymen sowie modifizierten Donorsubstraten. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen Verfahren zur Verwendung der modifizierten Substrate und Inhibitoren zusammen mit den konstruierten Enzymen, um zu identifizieren, auf welche Substrate die Enzyme wirken, um die Kinetik einer solchen Wirkung zu messen, und im Fall der modifizierten Substrate, um die Empfängersubstrate zu bestimmen, an die ein Teil oder alles des Donorsubstrats gebunden wird, um das Ausmaß einer solchen Wirkung zu messen und um das Ausmaß der Modulation davon durch Testverbindungen zu identifizieren und zu messen.
  • Im Fall von Inhibitoren streben die Verfahren danach, die biochemischen und zellulären Wirkungen einer solchen Inhibierung zu bestimmen. Die Verfahren erstrecken sich auch auf die Verwendung solcher Inhibitoren und konstruierten Enzyme, um aufzuklären, welche Enzyme an der Krankheit beteiligt sein können; diese Enzyme können dann zum Gegenstand von Anstrengungen zum Konstruieren oder Entdecken von spezifischen Inhibitoren ihrer Wildtypformen werden, die sich als bei der Behandlung der mit dem Enzym verbundenen Krankheit oder Störung als wertvoll erweisen können. Ferner werden Verfahren zum Einfügen des konstruierten Enzyms in Zellen, vorzugsweise anstelle des entsprechenden Enzyms vom Wildtyp, und dann zur Verwendung des Inhibitors, an den es angepaßt wurde, als Werkzeug für die Untersuchung der Krankheit- Enzym-Beziehung und schließlich als Arzneimittel für die Behandlung der Krankheit bereitgestellt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Enzymkonstruktion eine strukturelle Unterscheidung zwischen der Nukleotidbindungsstelle einer interessierenden Proteinkinase und den Nukleotidbindungsstellen einer anderen Kinase gemacht werden. Diese Unterscheidung ermöglicht, daß die konstruierte Kinase ein Nukleotidtriphosphat oder einen Inhibitor verwendet, der durch die Wildtypform dieser Kinase oder durch eine andere Kinase nicht so leicht gebunden wird. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel bezüglich des Inhibitors ist der verwendete Inhibitor einer, der zum "natürlichen" Nukleotidtriphosphat-Substrat für diese Kinase "orthogonal" ist oder zu einem weniger spezifischen Inhibitor (z.B. einem, der durch die Wildtypform dieser Kinase leicht gebunden wird) orthogonal ist. Der Begriff "orthogonal", wie vorstehend erörtert, bedeutet, daß das Substrat oder der Inhibitor in der Struktur ähnlich ist (einschließlich jenen, die geometrisch ähnlich, aber nicht chemisch ähnlich sind, wie nachstehend beschrieben), aber sich in einer Weise unterscheidet, die seine Fähigkeit begrenzt, an die Wildtypform zu binden.
  • V. Orthogonales Nukleotidtriphosphat
  • Eine gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte konstruierte Kinase kann ein orthogonales Nukleotidtriphosphatsubstrat verwenden, das von einer anderen, nicht-konstruierten Kinase, die in Zellen vorliegt, nicht so leicht verwendet wird. Vorzugsweise kann sie ein orthogonales Nukleotidtriphosphat verwenden, das von der anderen Kinase im wesentlichen nicht verwendet wird; und am meisten bevorzugt kann sie ein orthogonales Nukleotidtriphosphatsubstrat verwenden, das von einer anderen Kinase überhaupt nicht verwendet werden kann. Durch Markieren des Phosphats am orthogonalen Substrat, z.B. unter Verwendung von radioaktivem Phosphor (P32) und dann Zugeben von diesem markierten Substrat zu permeabilisierten Zellen oder Zellextrakten werden die Proteinsubstrate der konstruierten Kinase markiert, wohingegen die Proteinsubstrate einer anderen Kinase zumindest in einem geringeren Grad markiert werden; vorzugsweise werden die Proteinsubstrate der anderen Kinase im wesentlichen nicht markiert und am meisten bevorzugt werden sie überhaupt nicht markiert.
  • Die nachstehend bereitgestellte detaillierte Beschreibung und die Beispiele beschreiben die Verwendung dieser Strategie zum eindeutigen Markieren der direkten Substrate der prototypischen Proteinkinase v-Src. Durch Proteinkonstruktion wurde ein chemischer Unterschied in der Aminosäuresequenz hergestellt, der eine strukturelle Unterscheidung zwischen der Nukleotidbindungsstelle des modifizierten v-Src und jener von jeglicher anderer Kinase verleiht. Die v-Src-Kinase wurde konstruiert, um ein ATP-Analogon (A*TP), N 6-(Cyclopentyl)ATP, zu erkennen, das zum Nukleotidsubstrat von Kinase vom Wildtyp orthogonal ist. Die Erzeugung einer v-Src-Mutante mit Spezifität für ein orthogonales A*TP-Substrat ermöglicht, daß die direkten Substrate von v-Src unter Verwendung von [y-32P] N 6-(Cyclopentyl)ATP eindeutig radiomarkiert werden, da es als Substrat für die konstruierte v-Src-Kinase dienen kann, aber im wesentlichen nicht als Substrat für die andere zelluläre Kinase dienen kann.
  • Die nachstehend bereitgestellte detaillierte Beschreibung und die Beispiele beschreiben die Verwendung dieser Strategie zum eindeutigen Identifizieren der direkten Substrate der prototypischen Proteinkinase v-Src. Durch Proteinkonstruktion wurde ein chemischer Unterschied in der Aminosäuresequenz hergestellt, der eine neue strukturelle Unterscheidung zwischen der Nukleotidbindungsstelle des modifizierten v-Src und jener von jeglicher anderer Kinase verleiht. Die konstruierte v-Src-Kinase, die hergestellt und hierin dargestellt wurde, bindet an ein orthogonales Analogon des allgemeineren Kinaseinhibitors PP3: die Verbindung N-4-Cyclopentyl PP3 (11A). Die Erzeugung einer v-Src-Mutante mit Spezifität für einen solchen Inhibitor ermöglicht, daß die Mutante inhibiert wird, wohingegen eine andere Kinase in demselben Testsystem im wesentlichen nicht inhibiert wird, nicht einmal die Wildtypform eben dieser Kinase.
  • VI. Mutantenproteinkinase
  • Wie aus dem vorangehenden ersichtlich ist, ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Mutantenproteinkinase bereitzustellen, die ein orthogonales Nukleotidtriphosphat-Analogon als Phosphatdonorsubstrat annimmt. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Nukleotidsequenz, die eine solche Mutantenproteinkinase codiert; und es ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Nukleinsäuresequenz bereitzustellen. Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Herstellung einer solchen Mutantenproteinkinase beispielsweise durch Exprimieren einer solchen Nukleinsäuresequenz bereitzustellen. Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche orthogonalen Nukleotidtriphosphate und Verfahren für ihre Synthese bereitzustellen, einschließlich N6-(Cyclopentyl)ATP, N6-(Cyclopentyloxy)ATP, N6-(Cyclohexyl)ATP, N6-(Cyclohexyloxy)ATP, N6-(Benzyl)ATP, N6-(Benzyloxy)ATP, N6-(Pyrolidino)ATP und N6-(Piperidino)ATP, (27).
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine Testverbindung die Aktivität einer Proteinkinase bezüglich einem oder mehreren Proteinsubstraten positiv oder negativ moduliert, bereitzustellen. Insbesondere und gemäß dem weiteren Aspekt der Erfindung ist es eine Hauptaufgabe, eine Mutantenproteinkinase bereitzustellen, die an einen Inhibitor bindet und durch diesen inhibiert wird, wobei der Inhibitor die entsprechende Kinase vom Wildtyp weniger leicht bindet oder inhibiert.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Nukleotidsequenz, die eine solche Mutantenproteinkinase codiert; und es ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Nukleinsäuresequenz bereitzustellen. Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Herstellung einer solchen Mutantenproteinkinase beispielsweise durch Exprimieren einer solchen Nukleinsäuresequenz bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche Inhibitoren wie z.B. die Verbindung N-4-Cyclopentyl PP3 und Verfahren für ihre Synthese bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Feststellen, welches die Substrate für eine gegebene Proteinkinase sind. Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Bestimmen, ob die spezifische Inhibierung einer speziellen Kinase eine biochemische oder phänotypische Wirkung in einem Testsystem wie z.B. zellenfreien Extrakten, Zellkulturen oder lebenden mehrzelligen Organismen erzeugt, bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Bestimmen, ob die Inhibierung einer speziellen Kinase einen therapeutischen Wert bei der Behandlung einer Krankheit haben könnte, bereitzustellen. Es ist noch eine weitere Aufgabe, Verfahren für die Untersuchung der Aktivität, Kinetik und der katalytischen Mechanismen einer Kinase durch Untersuchen der Inhibierung der entsprechenden Mutante der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung von Verfahren zum Verhindern und Behandeln von durch Kinase vermittelten Krankheiten durch Einführen einer Inhibitor-angepaßten Mutantenkinase der vorliegenden Erfindung in einen erkrankten Organismus und vorzugsweise Vermindern oder am meisten bevorzugt Verarmen des Organismus vom Enzym vom Wildtyp; und dann Verabreichen des Inhibitors, um die Aktivität der nun die Krankheit vermittelnden Mutantenkinase zu regulieren, um die Ursache oder Symptome der Krankheit zu vermindern oder zu beseitigen.
  • VII. Multi-Substrat-Enzyme
  • Auf der Basis des vorangehenden und der detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung, die nachstehend bereitgestellt ist, wird ein Fachmann leicht erkennen, daß die vorliegende Erfindung allgemeiner verwendet werden kann, um Multi-Substrat-Enzyme zu untersuchen, die ein Donorsubstrat oder einen Teil davon kovalent zu einem Empfängersubstrat übertragen, wie die Kinase, und Enzyme, die nicht zwei Substrate binden oder eine Gruppe übertragen. Solche Anwendungen der vorliegenden Erfindung sind auch ferner in der detaillierten Beschreibung, die folgt, beschrieben. Folglich ist es noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mutanten-Multi-Substrat-Enzym bereitzustellen, das an einen Inhibitor bindet, wobei der Inhibitor an das Enzym vom Wildtyp oder an andere Enzyme mit ähnlicher Aktivität weniger leicht gebunden wird.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Nukleotidsequenz bereitzustellen, die ein solches Mutanten-Multi-Substrat-Enzym codiert; und es ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Nukleinsäuresequenz bereitzustellen. Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Herstellung eines solchen Mutanten-Multi-Substrat-Enzyms beispielsweise durch Exprimieren einer solchen Nukleinsäuresequenz bereitzustellen. Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche Inhibitoren und Verfahren für ihre Synthese bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Bestimmen, welches die Substrate für ein gegebenes Multi-Substrat-Enzym sind. Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Bestimmen, ob die spezifische Inhibierung eines speziellen Multi-Substrat-Enzyms eine biochemische oder phänotypische Wirkung in Testsystemen wie z.B. zellenfreien Extrakten, Zellkulturen oder lebenden mehrzelligen Organismen erzeugt, bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Bestimmen, ob die Inhibierung eines speziellen Multi-Substrat-Enzyms einen therapeutischen Wert bei der Behandlung einer Krankheit haben könnte, bereitzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Konstruktion von Kinaseenzymen, so daß sie durch Inhibitoren gebunden werden können, die von ihren Wildtypformen nicht so leicht gebunden werden. Modifizierte Substrate und Mutantenenzyme, die sie binden können, wurden verwendet, um einen Dehnungsfaktor (41) und einen Rezeptor für Cyclophilin A (42) zu untersuchen. Vor der vorliegenden Erfindung war es jedoch nicht bekannt, wie, oder ob überhaupt, Multi-Substrat-Enzyme, die einen Teil oder alles eines Donorsubstrats kovalent an ein Empfängersubstrat binden, konstruiert werden könnten, um an einen Inhibitor zu binden, und dennoch zumindest eine gewisse katalytische Aktivität und zumindest eine gewisse Spezifität für das Empfängersubstrat in Abwesenheit des Inhibitors beibehalten. Die vorliegende Erfindung ist, daß dies durchgeführt werden kann, wie nachstehend erläutert; und diese Erfindung öffnet zum ersten Mal die Tür für die selektive Inhibierung einer individuellen Kinase, die nicht nur wichtige Werkzeuge für das Verständnis der Kinasekaskaden und anderer komplexer katalytischer zellulärer Mechanismen sind, sondern auch Wege für den therapeutischen Eingriff in Krankheiten bereitstellen können, wo diese Mechanismen ins Spiel kommen.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe, Verfahren für die Untersuchung der Aktivität, Kinetik und der katalytischen Mechanismen eines Multi-Substrat-Enzyms durch Untersuchen der Inhibierung der entsprechenden Mutante der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Verhindern und Behandeln von durch Multi-Substrat-Enzyme vermittelte Krankheiten durch Einführen eines Inhibitor-angepaßten Multi-Substrat-Enzyms der vorliegenden Erfindung in einen erkrankten Organismus und vorzugsweise Vermindern oder am meisten bevorzugt Verarmen des Organismus von dem Enzym vom Wildtyp; und dann Verabreichen des Inhibitors, um das nun die Krankheit vermittelnde Mutantenenzym zu regulieren, um die Ursache oder die Symptome der Krankheit zu vermindern oder zu beseitigen.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist die vorliegende Erfindung nicht auf eine Mutantenkinase, orthogonale Inhibitoren und ihre Synthese und Verwendung begrenzt. Die vorliegende Erfindung funktioniert genauso gut für andere Multi-Substrat-Enzyme, die einen Teil oder alles von einem Substrat, hier Donor genannt, zu einem anderen Substrat, hier Empfänger genannt, kovalent übertragen; und es gibt sicher mehr derartige Enzyme, die noch zu entdecken sind. In irgendeinem solchen Fall wird ein Fachmann, der die vorliegende Beschreibung studiert hat, die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung auf solche Enzyme gut erkennen. Die verfügbaren Aufgaben in einem solchen Fall sind zu den hier für die Kinase im einzelnen beschriebenen ziemlich ähnlich. Zuerst ist es erforderlich zu identifizieren, welches das Donorsubstrat ist, und/oder Verbindungen zu identifizieren, die diese Kinase inhibieren können, selbst wenn es für diese Kinase nicht spezifisch ist.
  • Zweitens ist es erforderlich, zu betrachten, wo ein voluminöser Substituent zum Substrat des Inhibitors hinzugefügt werden könnte, so daß er nicht so leicht an die Kinase vom Wildtyp bindet, oder vorzugsweise im wesentlichen nicht an die Kinase vom Wildtyp bindet und vorzugsweise überhaupt nicht bindet. Es ist natürlich nicht wirklich erforderlich im Fall von Kinase oder bei anderen Multi-Substrat-Enzymen, wie vorstehend beschrieben, bezüglich dessen einschränkend zu sein, welche Analoge dieser herzustellen sind; man kann eine Vielzahl von ihnen herstellen, selbst einschließlich einiger, die unwahrscheinlich ideal zu sein scheinen, und durch Selektieren bestimmen, welches oder welche die besten sind. Eine weitere Richtlinie hinsichtlich dessen, wie dies durchzuführen ist, kann aus den nachstehenden Beispielen erlangt werden. Der Inhibierungsversuch, dessen Ergebnisse in 6 gezeigt sind, ist ein nicht-begrenzendes Beispiel eines Versuchs, der sich für eine solche Selektion besonders gut eignet.
  • Der dritte Schritt besteht darin, die Kinase derart zu konstruieren, daß eine oder mehrere Aminosäuren an der dreidimensionalen Stelle, wo die voluminöse Gruppe erwartet werden würde, wenn das Analogon gebunden hat, gegen Aminosäuren mit weniger voluminösen Seitenketten ausgetauscht werden, wobei somit für den voluminösen Anteil des Inhibitors "Platz geschaffen" wird. Schritte zwei und drei können natürlich in der umgekehrten Reihenfolge ausgeführt werden.
  • Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, wurde unter Verwendung der vorliegenden Erfindung der Nutzen einer v-Src-Kinase, die eine hohe Spezifität für einen synthetischen Inhibitor zeigt, während ihre Wildtypspezifität für Tyrosin enthaltende Peptide und Proteine beibehalten wird, demonstriert und hergestellt, wobei somit die anfänglichen Forschungsziele erfüllt wurden. Durch Ausnutzen der stark konservierten Art der ATP-Bindungsstelle über die Kinase-Superfamilie und der Verfügbarkeit der strukturellen Information von einer anderen Proteinkinase, wurde eine neue Inhibierungsspezifität für v-Src ohne irgendeine detaillierte strukturelle Information über v-Src selbst konstruiert. Daß eine unverwandte Kinase als Schablone zum Konstruieren von orthogonalen ATP-Analogen zum Markieren der direkten zellulären Substrate von v-Src verwendet wurde und Inhibitoren von gleichen Ursprüngen hergestellt haben, demonstriert, daß diese Methode für eine andere Kinase ebenso funktionieren sollte.
  • VIII. Modifizierte Inhibitoren und Substrate
  • Die durch diese Erfindung in Erwägung gezogenen Inhibitoren können in Untersuchungen, die auf die Entwicklung von anderen nützlichen Mutanten von dieser und anderer Kinase gerichtet sind, und für die anderswo hierin beschriebenen mehreren Verfahren nützlich sein.
  • Beispielhafte Varianten werden hierin dargestellt und auf 12 wird speziell Bezug genommen, in der sowohl Analoge als auch Daten bezüglich ihrer Aktivität dargelegt sind. Die Verwendung solcher Inhibitoren kann natürlich erfordern, daß verschiedene Positionen in der Proteinsequenz der Kinase modifiziert werden, um eine konstruierte Kinase herzustellen, die an diese bindet, aber solche anderen Modifikationen liegen durchaus innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
  • Außerdem ist es wichtig zu beachten, daß die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung nicht auf ADP- und PP3-Derivate begrenzt sind. Es sollte beispielsweise möglich sein, Derivate eines anderen natürlichen Nukleotidphosphat-Donorsubstrats als solche Inhibitoren zu verwenden. Zum Untersuchen einer gewissen Kinase können tatsächlich andere analoge Basen bevorzugt sein. Es ist beispielsweise bekannt, daß eine gewisse Kinase GTP als Phosphatdonorsubstrat und Energiequelle verwendet; um Inhibitoren für konstruierte Formen einer solchen Kinase herzustellen, wären Analoge von Guanosindiphosphat geeignet. Ferner ist es gut bekannt, daß verwandte Verbindungen (z.B. andere Basen) und Verbindungen, die chemisch mit dem natürlichen Substrat nicht verwandt sind, manchmal trotzdem an eine aktive Stelle binden können und auf diese eingewirkt werden kann oder sie auf andere Substrate durch chemische Katalyse durch das Enzym einwirken können (aber für die Zwecke dieser Erfindung nicht müssen). Manchmal nehmen sie an der katalysierten Reaktion in derselben Weise teil wie das natürliche Substrat, manchmal in anderen Weisen. Solche Verbindungen und ihre Derivate wären geeignete Ausgangspunkte für die Konstruktion von Inhibitoren, die zu ihnen orthogonal sind, und die innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegen würden. Ebenso können andere bekannte Kinaseinhibitoren als Ausgangspunkt für die Synthese von Inhibitoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie z.B. jene, deren Strukturen in 9 erscheinen. Selbst Derivate von Inhibitoren, die derzeit unbekannt sind, wären, sobald sie identifiziert sind, natürlich geeignete Kernstrukturen für die Konstruktion von Inhibitoren der vorliegenden Erfindung, wie hierin dargestellt und zu einem Teil hiervon gemacht.
  • Ferner sind die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung nicht auf jene begrenzt, die durch chemische synthetische Mittel hergestellt werden, sondern umfassen auch Verbindungen, die in der Natur zu finden sind und die dieser Rolle dienen können, von denen einige vorstehend erörtert wurden. Außerdem werden Fachleute erkennen, daß es andere Variationen neben den hier dargelegten gibt und daß diese alle innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung dienen.
  • Die Inhibitoren, die Kandidaten für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung sind, können zweckmäßig selektiert werden, um das Ausmaß zu bestimmen, in dem sie von Kinase vom Wildtyp angenommen werden, unter Verwendung einer Selektierungsprozedur wie z.B. der in nachstehendem Beispiel 13 dargelegten, oder durch eine Selektierungsprozedur, die die Verwendung einer Zelle oder von Zellen beinhaltet, die an Proteinkinaseaktivität reich ist oder sind, wie in Beispiel 9 hierin dargelegt. Durch einen solchen Versuch kann man feststellen, ob jeder Inhibitor durch Kinase vom Wildtyp in einem geringeren Grad gebunden wird als die konstruierte Kinase, oder vorzugsweise, ob die Kinase vom Wildtyp im wesentlichen nicht an diesen Inhibitor bindet, oder am meisten bevorzugt den Inhibitor überhaupt nicht bindet. Für diejenigen Substrate, die weniger leicht gebunden werden, kann es wert sein, zu versuchen, die interessierende Kinase zu konstruieren, so daß sie leichter an diese bindet. Man könnte natürlich die konstruierte Kinase zuerst herstellen und dann sie längsseits des Enzyms vom Wildtyp testen, um festzustellen, ob sie ein gegebenes orthogonales Substrat besser verwendet als die Kinase vom Wildtyp; dies war die in Beispiel 13 verwendete Methode. Unter den meisten Umständen ist jedoch Vorselektion, wie vorstehend beschrieben, bevorzugt. Andere Versuchsmethoden sind natürlich für Fachleute ersichtlich und die Verwendung solcher Versuche läge innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
  • IX. Neukonstruktion einer Kinase
  • Es gibt verschiedene Kriterien, die bei der Neukonstruktion einer Kinase erfüllt werden sollten, um ihre authentischen Substrate in Gegenwart von Tyrosin vom Wildtyp und Serin/Threonin-Kinase eindeutig zu markieren. Die konstruierte Kinase sollte: (1) ein ATP-Analogon (A*TP) annehmen, das weniger leicht von Proteinkinase vom Wildtyp verwendet wird; vorzugsweise ein A*TP annehmen, das von Kinase vom Wildtyp im wesentlichen nicht verwendet wird; und am meisten bevorzugt ein A*TP annehmen, das von Kinase vom Wildtyp überhaupt nicht verwendet wird; (2) vorzugsweise das A*TP-Analogon mit hoher katalytischer Effizienz verwenden; und (3) vorzugsweise eine verringerte katalytische Effizienz für das natürliche Nukleotidsubstrat (ATP) aufweisen, so daß in Gegenwart von zellulären Niveaus von ATP (1–2 mM) die Kinase vorzugsweise A*TP als Phosphodonor verwenden würde. Wenn eine solche konstruierte Kinase verwendet werden soll, um die Proteinsubstratspezifität der Kinase vom Wildtyp zu untersuchen, dann müssen diese Kriterien erfüllt werden, ohne die Proteinzielspezifität der Kinase wesentlich zu ändern.
  • Ebenso sollten verschiedene Kriterien bei der Neukonstruktion einer Kinase erfüllt werden, damit sie durch die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung inhibiert wird. Die konstruierte Kinase sollte: (1) an einen Inhibitor binden, der von Proteinkinase vom Wildtyp weniger leicht gebunden wird; vorzugsweise bindet der Inhibitor im wesentlichen nicht an Kinase vom Wildtyp; und am meisten bevorzugt bindet er überhaupt nicht an Kinase vom Wildtyp; (2) vorzugsweise bindet die konstruierte Kinase den Inhibitor mit hoher Affinität (d.h. niedriger IC50). Es ist im allgemeinen nicht von spezieller Bedeutung, ob der Inhibitor an die Wildtypform der Kinase bindet, die der konstruierten Kinase entspricht, da eine solche Bindung und die resultierende Inhibierung jene der konstruierten Kinase steigern würden. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, daß die Wildtypform dieser Kinase den Inhibitor nicht besser bildet als eine andere Kinase vom Wildtyp. Wenn eine inhibierbare konstruierte Kinase verwendet werden soll, um die Proteinsubstratspezifität der Kinase vom Wildtyp zu untersuchen oder die Wildtypform dieser Kinase durch Gentherapie oder ein andres Mittel zu ersetzen, wie weiter nachstehend erörtert, dann ist eine weitere Besorgnis, daß die vorstehend beschriebenen Kriterien vorzugsweise erfüllt werden müssen, ohne die Proteinzielspezifität der konstruierten Kinase im Vergleich zur entsprechenden Wildtypform wesentlich zu verändern.
  • Von der Perspektive des Standes der Technik, als die vorliegende Erfindung durchgeführt wurde, betrachtet, war es nicht vorhersagbar, ob es möglich wäre, alle diese Kriterien gleichzeitig zu erfüllen; tatsächlich war es zweifelhaft, da die ATP-Bindungsstelle, die konstruiert wird, sehr nahe an der zweiten Substratbindungsstelle, d.h. der Peptidbindungsstelle, liegt. Wie durch die nachstehenden Beispiele gezeigt, wurden jedoch alle dieser Kriterien, einschließlich der bevorzugten Kriterien, tatsächlich gleichzeitig erfüllt, als die beschriebenen v-Src-Mutanten hergestellt wurden, wobei sie mit N6(Cyclopentyl)ATP versehen wurden und unter Verwendung von N4-Cyclopentyl PP3 inhibiert wurden.
  • Beispiel 1 beschreibt die zwölf ATP-Analogen, die in den Untersuchungen an der Mutante v-Src verwendet wurden, die in den weiteren Beispielen beschrieben werden, die folgen. Diese orthogonalen ATP-Analoge können in Untersuchungen, die auf die Entwicklung von anderen nützlichen Mutanten dieser und einer anderen Kinase gerichtet sind, und für die anderswo hierin beschriebenen verschiedenen Verfahren nützlich sein. Der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung dieser speziellen ATP-Analogen begrenzt und Fachleute werden erkennen, daß viele anderen möglichen orthogonalen Substrate die hierin beschriebenen ersetzen oder ergänzen könnten. Verschiedene und noch komplexere aliphatische oder aromatische Gruppen könnten beispielsweise zur N6-Position von ATP hinzugefügt werden. Außerdem sind die orthogonalen Substrate der vorliegenden Erfindung nicht auf Modifikationen von Nukleotiden in der N6-Position begrenzt. Chemische Mittel zum Modifizieren von verschiedenen Positionen an Adenosin sind bekannt und beliebige von diesen würden innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegen; und es sich sogar möglich, Änderungen oder Substitutionen in den Ringstrukturen von Nukleotiden vorzunehmen. Die Verwendung von solchen orthogonalen Substraten kann natürlich erfordern, daß verschiedene Positionen in der Proteinsequenz der Kinase modifiziert werden, um eine konstruierte Kinase herzustellen, die an diese bindet, aber solche anderen Modifikationen liegen durchaus innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
  • Außerdem ist es wichtig zu beachten, daß die orthogonalen Substrate der vorliegenden Erfindung nicht auf ATP-Derivate begrenzt sind. Zum Untersuchen von verschiedenen Kinasen können tatsächlich verschiedene analoge Basen bevorzugt sein. Es ist beispielsweise bekannt, daß eine gewisse Kinase GTP als Phosphatdonorsubstrat und Energiequelle verwendet; für Untersuchungen einer solchen Kinase wären Analoge von Guanosintriphosphat bevorzugt. Es ist gut bekannt, daß Verbindungen, die chemisch nicht mit dem natürlichen Substrat verwandt sind, manchmal trotzdem an eine aktive Stelle binden können und auf diese sogar eingewirkt werden kann oder diese auf andere Substrate durch chemische Katalyse durch das Enzym einwirken können. Manchmal nehmen sie an der katalysierten Reaktion in derselben Weise teil wie das natürliche Substrat, manchmal in anderen Weisen. Solche Verbindungen und ihre Derivate würden auch innerhalb des Umfangs der Begriffe "natürliches Substrat" und "orthogonales Substrat", wie hierin verwendet, liegen.
  • Ferner sind die orthogonalen Substrate der vorliegenden Erfindung nicht auf jene begrenzt, die durch chemische synthetische Mittel hergestellt werden, sondern umfassen auch Verbindungen, die in der Natur zu finden sind und die dieser Rolle dienen können. Fachleute werden erkennen, daß es andere Variationen neben den hier dargelegten gibt und daß diese alle innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegen.
  • Die orthogonalen Nukleotide, die Kandidaten zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung sind, können zweckmäßig selektiert werden, um das Ausmaß zu ermitteln, in dem sie von einer Kinase vom Wildtyp angenommen werden, unter Verwendung einer Selektierungsprozedur wie z.B. der in nachstehendem Beispiel 2 dargelegten. Durch einen solchen Versuch kann man bestimmen, ob jedes orthogonale Substrat von der Kinase vom Wildtyp in einem geringeren Grad angenommen wird als das normale Substrat für eine solche Kinase, oder vorzugsweise dieses Substrat im wesentlichen nicht annimmt, oder am meisten bevorzugt es überhaupt nicht annimmt. Für diejenigen Substrate, die am wenigsten leicht angenommen werden, kann es wert sein, zu versuchen, die interessierende Kinase so zu konstruieren, daß sie sie leichter annimmt. Man könnte natürlich die konstruierte Kinase zuerst herstellen und sie dann längsseits des Enzyms vom Wildtyp testen, um festzustellen, ob sie ein gegebenes orthogonales Substrat besser verwendet als die Kinase vom Wildtyp. Unter den meisten Umständen ist jedoch Vorselektion, wie z.B. in Beispiel 2 beschrieben, bevorzugt. Andere Versuchsmethoden sind natürlich für Fachleute ersichtlich und die Verwendung von solchen Versuchen läge innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
  • Der Entwurf eines konstruierten v-Src ist in nachstehendem Beispiel 3 beschrieben. Wie beschrieben wird, wurde die konstruierte Form durch Bezugnahme auf die Kristallstrukturen von anderen Kinasen entworfen, die Domänen aufweisen, die zu jenen homolog sind, die in den meisten, wenn nicht allen Kinasen zu finden sind. Wie zu sehen ist, wurde die hierin beschriebene Beispielmutantenkinase vielmehr als Fragmente von Proteinkinase konstruiert, als daß sie die gesamten Sequenzen enthält; aber es wurde festgestellt, daß kein wesentlicher Unterschied in der Leistung besteht, wenn die gesamte Sequenz verwendet wird. Die Konzepte und praktischen Einzelheiten sind natürlich gleich, ob Fragmente oder ganze Kinase verwendet wird, und beide liegen innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. An sich sollte der Begriff "Kinase" als das ganze Enzym oder ein Fragment von einem einschließend betrachtet werden, einschließlich wenn die Ansprüche interpretiert werden.
  • Unter Verwendung dieser Methode ist es möglich, ähnliche Mutanten von virtuell einer beliebigen anderen Kinase wie z.B. einer Proteinkinase, einer Lipidkinase oder einer Aminoglycosidkinase zu entwerfen. Das Verfahren, um dies zu tun, umfaßt die Schritte: (a) Identifizieren der Ausrichtung einer interessierenden Kinase aus der Aminosäure mit einer Kinase mit einem bekannten Kinaseinhibitor (der für diese Kinase nicht-spezifisch, für Kinasen im allgemeinen spezifisch, aber nicht für diese Kinase oder für diese Kinase spezifisch sein kann), von einer oder mehreren Aminosäuren, die eng genug an einem Substituenten am gebundenen Phosphatdonorsubstrat oder Inhibitor liegen, die sterisch den Eintritt eines voluminösen Substituenten einschränken würden, der an diese Position in einem mutmaßlichen orthogonalen Inhibitor gebunden wird; und (b) Mutieren einer Nukleotidsequenz, die die Proteinkinase vom Wildtyp codiert, so daß die Nukleotidtripletts, die ein oder mehrere der identifizierten Aminosäuren codieren, in Nukleotidtripletts umgewandelt werden, die Aminosäuren mit Seitenketten, die sterisch weniger voluminös sind als die identifizierten Aminosäuren, codieren. Das vorstehend beschriebene Verfahren verwendet die sterische Einschränkung des Eintritts oder den Ausschluß als Kriterien zum Entscheiden, welche Aminosäure(n) zu ändern ist (sind), und wie sie zu ändern sind. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht so begrenzt. Es ist auch möglich, eine Kinase zu konstruieren, um ihre Fähigkeit, an ein ortrthogonales Substrat zu binden, zu ändern, durch Betrachten von anderen Faktoren wie z.B. Hydrophobizität, Hydrophilizität, ionische Bindung oder Abstoßung, Wasserstoffbindung, Bilden von kovalenten Bindungen zwischen dem Enzym und elektrophilen Gruppen an orthogonalen Substraten usw.
  • Die Untersuchung von Proteinkinase unter Verwendung der vorliegenden Erfindung wird durch das ungeheure Wissen hinsichtlich der Domänenstruktur von vielen verschiedenen Kinasen und ihre im allgemeinen homologen Sequenzen erheblich erleichtert. Das Protein Kinase Facts Book (71) stellt Proteinsequenzdaten für die drei funktionalen Domänen in buchstäblich Hunderten von Proteinkinasen bereit und dies sollte zusammen mit einer Sequenzinformation, die in der Hauptliteratur zur Verfügung steht, die weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung auf die Kinase erheblich erleichtern. Eine ähnliche Information steht hinsichtlich anderer Multi-Substrat-Enzyme zur Verfügung, was ihre Untersuchung und Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung erleichtern sollte.
  • Obwohl das bevorzugte Verfahren der vorliegenden Erfindung den rationalen Entwurf von Substratanalogen und Mutantenproteinkinase beinhaltet, könnten beide alternativ durch Verwendung von Verfahren, die als kombinatorische Verfahren bekannt sind, durchgeführt werden. Es gibt viele kombinatorische Verfahren zum Synthetisieren von organischen Verbindungen. Unter Verwendung eines solchen Verfahrens könnte man Nukleosidanaloge an Harzkügelchen unter Verwendung von sequentiellen chemischen Schritten synthetisieren und sie dann von dem Harz vor der Phosphorylierung freisetzen, um die Nukleotidtriphosphate herzustellen. Nach der Verwendung eines solchen Verfahrens zur Herstellung einer Sammlung oder Bibliothek von mutmaßlichen orthogonalen Substraten für Mutanten von v-Src-Kinase, anderer Proteinkinase oder anderer Multi-Substrat-Enzyme, könnte die Sammlung oder Bibliothek nach besonders günstigen Bindungs- oder Katalyseeigenschaften selektiert werden. Dies kann die gründlichere Suche nach strukturellen, Konformations- und elektronischen Eigenschaften von solchen mutmaßlichen orthogonalen Substraten ermöglichen. Überdies wird häufig festgestellt, daß, wenn größere Zahlen von Analogen eines gegebenen Substrats untersucht werden, ein unerwartet effizientes Substrat oder Inhibitor gefunden werden kann. Ferner wären manchmal die Verbindungen, die am meisten erwünscht sind, nicht ausgewählt worden, wenn nur gut verstandene Parameter verwendet werden würde, um die beste Verbindung spezifisch zu entwerfen.
  • Es gibt auch viele kombinatorischen Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, zur Herstellung von Proteinmutanten. Diese umfassen "fehleranfällige" Polymerasekettenreaktion (PCR), "sexuelle" PCR oder PCR unter Verwendung von Primern mit zufälligen Nukleotiden als feste Positionen in der Proteinsequenz. Andere Sequenzzufallsverfahren könnten die Verwendung von chemischen Mutagenen von cDNA oder Plasmid-DNA oder MutD-Typ-Stämme von Bakterien umfassen, von denen bekannt ist, daß sie zufällig Mutationen in Proteine einführen, die sie exprimieren. Es wäre möglich, die vorliegende Erfindung durch Ausnutzen solcher Verfahren zur Herstellung von zufällig mutierter Proteinkinase oder anderen Multi-Substrat-Enzymen und dann Selektieren nach einem mit besonders hoher Aktivität mit einem speziellen orthogonalen Substrat oder mit einem gewissen oder allen der mutmaßlichen orthogonalen Substrate, die unter Verwendung der kombinatorischen Synthese hergestellt werden, auszuführen, wie im vorstehenden Absatz beschrieben. Die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Versuchsverfahren wären für diesen Zweck geeignet und Fachleute könnten leicht alternative Methoden entwerfen.
  • Diese Verfahren und weitere Verfahren, die entwickelt werden oder werden können, um den Proteinsequenzraum und den strukturellen Raum von kleinen organischen Molekülen zu erforschen, könnten für die hier beschriebene technologische Anwendung besonders nützlich sein, wobei sowohl das Protein als auch der mutmaßliche Inhibitor verändert oder geändert werden, um die bestmögliche nicht-natürliche (d.h. orthogonale) Anpassung zu finden. Die Verwendung von irgendeinem von diesen oder irgendeinem der anderen hierin beschriebenen Verfahren läge innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
  • Die Synthese von einer konstruierten Kinase ist in Beispiel 4 beschrieben. Der Brennpunkt dieser Bemühung lag auf den Aminosäureseitenketten, die innerhalb etwa 4 Å des N6 von ATP lagen; aber an diesem Abstand ist nichts magisches. Reste mit Seitenketten, die innerhalb etwa 1 Å, 2 Å, 3 Å, 5 Å, 6 Å, 7 Å, 8 Å, 9 Å, 10 Å oder weniger, mehr oder in Zwischenabständen liegen, sollten auch als Ziele für die Modifikation betrachtet werden. Aminosäuren mit Seitenketten, die innerhalb etwa 3 Å bis etwa 6 Å liegen, wären bevorzugte Ziele. Im allgemeinen sind diejenigen Aminosäuren mit den näheren Seitenketten gegenüber jenen mit entfernteren Seitenketten bevorzugt, da es erwartet werden würde, daß sie die größte sterische oder andere Störung des orthogonalen Substituenten am Inhibitor verursachen, und jene mit den nächsten Seitenketten wären die bevorzugtesten.
  • Es gibt natürlich heute viele andere Weisen zum Modifizieren und Exprimieren von genetischen Sequenzen als die in den Beispielen verwendeten, wie z.B. stellengerichtete Mutagenese. Die Verwendung von irgendeiner oder allen von diesen lägen innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Obwohl die Verwendung der Gentechnik heute wahrscheinlich das bevorzugte Verfahren zum Herstellen solcher Mutanten ist, ist es außerdem nicht die einzige Weise. Man könnte beispielsweise eine konstruierte Kinase entwerfen und dann dieses Protein durch bekannte Verfahren von chemischer Peptidsynthese synthetisieren. Oder es kann möglich sein, ein gegebenes Enzym an einer spezifischen Stelle chemisch zu modifizieren, so daß sich eine oder mehrere Seitenketten in der Größe, Hydrophobizität oder anderen Eigenschaften ändern, so daß es leichter ein orthogonales Substrat verwenden kann. Die Verwendung von allen solchen Verfahren liegt innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung.
  • Beispiel 7 beschreibt das Testen, das durchgeführt werden könnte, um festzustellen, ob die konstruierte Kinase ihre Proteinsubstratspezifität beibehalten hat. Es ist bevorzugt, daß die Proteinsubstratspezifität vom Wildtyp im wesentlichen beibehalten wird, wenn, wie in den Beispielen, das Ziel darin besteht, die konstruierte Kinase zu verwenden, um zu untersuchen, auf welche Substrate die Kinase wirkt und in welchem Grad sie dies tut, oder sie verwendet werden soll, um die entsprechende Kinase vom Wildtyp in vivo zu ersetzen oder zu ergänzen, z.B. durch Gentechnik. Obwohl es für solche Zwecke wichtig ist, daß die Kinase immer noch dieselben Substrate als Wildtyp erkennt, ist es jedoch nicht entscheidend, daß sie dies mit derselben Kinetik tut, d.h. ob sie es langsamer oder schneller oder in einem größeren oder geringeren Grad durchführt, die konstruierte Kinase kann immer noch einen beträchtlichen Wert für solche Zwecke aufweisen. Wenn die konstruierte Kinase nicht dieselben Proteinsubstrate erkennt wie das Enzym vom Wildtyp, kann sie weniger Wert bei der Untersuchung des Enzyms vom Wildtyp aufweisen, aber sie kann immer noch einen beträchtlichen Wert bei der Untersuchung der Proteinphosphorylierung und Kinase im allgemeinen aufweisen und läge immer noch innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung.
  • Die in Beispiel 7 verwendeten speziellen Versuche müssen, obwohl sie nützlich sind, natürlich nicht verwendet werden. Fachleute können leicht andere Versuche entwickeln oder aufgreifen, die eine vergleichbare Information bereitstellen können.
  • Sobald eine Mutantenkinase hergestellt wurde, die ein gegebenes orthogonales Substratanalog annimmt oder die durch einen gegebenen Inhibitor inhibiert wird, kann sie unter Verwendung von klassischer kinetischer Enzymanalyse charakterisiert werden, wie in Beispielen 5 und 6 dargestellt. Wie in Beispiel 8 gezeigt, kann man auch den Grad untersuchen, in dem die Mutante das Analogon verwenden oder durch dieses inhibiert werden kann, und ob das Analogon ein "toter" (d.h. vollständig unwirksamer) Inhibitor für das Enzym vom Wildtyp ist. Die in den Beispielen verwendeten Verfahren sind natürlich nicht die einzigen Weisen, in denen diese Untersuchungen durchgeführt werden können, und Fachleute können leicht alternative Methoden entwerfen.
  • Wie in Beispiel 10 dargestellt, ist es nicht erforderlich, mehrere Aminosäuresubstitutionen vorzunehmen, um eine Mutante bereitzustellen, die durch einen Inhibitor der vorliegenden Erfindung inhibiert wird. Es kann nur erforderlich sein, eine einzige Aminosäureänderung durchzuführen, wie es bei den Mutanten GST-XD4 (I338A) und GST-XD4 (I338G) der Fall ist.
  • X. Versuch zum Identifizieren von Kinasesubstraten
  • Ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist folgendermaßen. Zuerst wird der orthogonale Inhibitor zu zwei Proben der interessierenden Zelle gegeben, die entweder ein hinzugefügtes Gen für die konstruierte Kinase exprimieren oder die normale Kopie der interessierenden Kinase exprimieren. Der Inhibitor kann vor, nach oder während der Aktivierung einer Signalisierungskaskade (wie z.B. permeabilisierte Zellen, Zellextrakte oder Zellen, die für diese natürlich permeabel sind) zugegeben werden. Dann wird ein Verfahren, das den Nachweis aller phosphorylierten Proteine in einer Zelle oder Zellfraktion ermöglicht, z.B. unter Verwendung von radioaktivem Phosphor [γ-32P]ATP oder unter Verwendung von monoklonalen Antikörper, die für phosphorylierte Aminosäuren spezifisch sind, verwendet, um das Ergebnis der spezifischen Inhibierung der interessierenden Kinase aufzudecken. In den Zellen, die die normale Kopie der interessierenden Kinase exprimieren, werden die Proteinsubstrate der nativen Kinase selbst in Gegenwart des Inhibitors markiert, wohingegen die Proteinsubstrate der konstruierten Kinase zumindest in einem geringeren Grad markiert werden; vorzugsweise werden die Proteinsubstrate der konstruierten Kinase im wesentlichen nicht markiert und am meisten bevorzugt werden sie überhaupt nicht markiert.
  • Es ist auch bevorzugt, wenn die Kinase vom Wildtyp entsprechend der Mutante aus den Zellen entfernt wurde, z.B. durch "Zerstörung" des (der) zellulären Gens (Gene) für diese. Wenn die markierten Proteine eines solchen Versuchs parallel mit Kontrollproben, die Kinase vom Wildtyp, aber nicht die Mutantenkinase enthalten, untersucht werden, werden bestimmte Bänder in der Intensität in der mit Mutante behandelten Probe relativ zur Kontrolle vermindert. Vorzugsweise ist die Differenz der Intensität hoch; bevorzugter sind Bänder vorhanden, die in den Mutante enthaltenden Proben, die mit dem Inhibitor behandelt wurden, fehlen. Dies würde darauf hindeuten, daß die Wildtypform dieser Kinase jene anders markierten Proteine phosphoryliert; wenn die Kinase inhibiert wird, werden diese Bänder nicht markiert.
  • Beispiel 10 stellt ein Beispiel eines Verfahrens zur Verwendung einer Mutantenkinase der vorliegenden Erfindung zusammen mit ihrem orthogonalen Substratanalogen oder ihrem Inhibitor bereit, gegebenenfalls zum feststellen, welches die intrazellulären Proteinsubstrate für diese Proteinkinase sind. Die Entwicklung eines solchen Tests war das Hauptziel der Forschung, die zur vorliegenden Erfindung führte.
  • Im allgemeinen würde das in Beispiel 10 und in 8 beschriebene Verfahren als allgemein anwendbar erscheinen; es gibt jedoch viele andere mögliche Methoden, die verwendet werden könnten, sobald eine Mutante, die ein orthogonales Substratanalogon oder einen Inhibitor annimmt, hergestellt wurde. Das natürliche Phosphatdonorsubstrat wird zuerst so hergestellt, daß es einen markierten Anteil am endständigen Phosphat enthält, beispielsweise durch Ersetzen des Phosphats mit [γ-32P] Phosphat. Dieses Substrat wird dann zusammen mit dem Analogen oder Inhibitor zu einer Probe von lysierten Zellen, Zellextrakten, permeabilisierten Zellen oder Zellen, die für das orthogonale Nukleotidtriphosphatsubstratanalogon oder für den Inhibitor natürlich permeabel sind und die die Mutantenkinase exprimieren, oder zu denen die Mutantenkinase exogen zugegeben wurde (z.B. durch Mikroinjektion), zugegeben. Nach Inkubation unter Bedingungen, die ermöglichen, daß die Mutantenkinase inhibiert wird, und/oder zum Phosphorylieren ihrer Proteinsubstrate in dem Ausmaß, daß sie nicht inhibiert wird, werden die markierten Produkte dann extrahiert und im Vergleich zu jenen, die durch eine Kontrollprobe erzeugt werden, die im wesentlichen in derselben Weise behandelt wurde, jedoch ohne Zugabe des Analogen bzw. Inhibitors, analysiert. Verfahren für den Nachweis von markierten Proteinen sind gut bekannt und umfassen sowohl quantitative als auch qualitative Verfahren. außerdem können alle Verfahren zum Charakterisieren und Identifizieren von Proteinen verwendet werden, um mit Spezifität festzustellen, welches die Proteinsubstrate sind und welche ihre Funktionen sind. Schließlich sollte es möglich sein, ein Verständnis dessen zu entwickeln, auf welche Proteinsubstrate jede der verschiedenen Proteinkinasen einwirkt, und in großem Detail die Mysterien der zellulären Signalumsetzung aufzudecken.
  • Sobald ein oder mehrere zelluläre Proteinsubstrate identifiziert wurden, können ähnliche Versuche verwendet werden, um Arzneimittel oder andere Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität einer gegebenen Proteinkinase an einem oder mehreren Substraten modulieren können. Man könnte beispielsweise kleine Mengen an Lösungen einer Vielzahl von solchen Verbindungen zu Testproben zugeben, die zellenfreien Extrakt, Mutantenkinase zusammen mit einem markierten orthogonalen Substratanalogen und/oder Inhibitor enthalten. Die markierten Proteine können dann z.B. durch Gelelektrophorese, gefolgt von Autoradiographie, identifiziert werden und mit einer doppelten Testprobe verglichen werden, die in derselben Weise behandelt wurde, aber zu der kein Arzneimittel oder eine andere Verbindung zugegeben wurde.
  • Wenn ein Protein in einer Probe mit einer zugegebenen Verbindung plus Substratanalogem und/oder Inhibitor nicht markiert wird, welches in einer Probe, die mit dem Analogen und/oder dem Inhibitor behandelt ist, markiert wird, deutet dies darauf hin, daß die zugegebene Verbindung die Kinase zum Phosphorylieren eines Proteins veranlaßt hat, auf das sie bei Abwesenheit der Verbindung nicht wirkt, d.h. die Verbindung moduliert die Aktivität der Kinase für dieses Protein herauf. Wenn ein markiertes Protein in einer Testprobe erscheint, zu der die Verbindung oder das Arzneimittel zugegeben wurde, aber nicht in einer Testprobe erscheint, zu der die Verbindung oder das Arzneimittel nicht zugegeben wurde, deutet dies alternativ darauf hin, daß die zugegebene Verbindung verhindert hat, daß die Kinase ein Protein phosphoryliert, auf das sie bei Abwesenheit der Verbindung nicht wirkt, d.h. die Verbindung moduliert die Aktivität der Kinase für dieses Proteinsubstrat herab.
  • Wenn quantitative Messungen für jedes markierte Protein durchgeführt werden, z.B. durch Abtasten von Autoradiogrammen und Integrieren der Daten, kann ein subtilerer Effekt auf die Kinaseaktivität nachgewiesen werden. Es kann beispielsweise festgestellt werden, daß ein Protein in Gegenwart oder Abwesenheit einer gegebenen Verbindung vollständiger oder weniger vollständig phosphoryliert wird (d.h. weniger drastisch moduliert wurde). Es kann auch erwartet werden, daß einige Verbindungen die Kinaseaktivität für einige Proteine heraufmodulieren und die Aktivität für andere gleichzeitig herabmodulieren.
  • XI. Verwendung beim Selektieren auf Arzneimittelentwurfs-Zielkinase
  • Wie vorstehend erwähnt, ist es, da die Kinase bei verschiedenen Krankheiten eine Schlüsselrolle spielt, von großem Interesse, Inhibitoren zu entwickeln, die eine einzelne Kinase vom Wildtyp oder eine Gruppe von Kinasen vom Wildtyp spezifisch inhibieren können. Durch Herabmodulieren der Aktivität dieser an der Krankheit beteiligten Kinase sollte es möglich sein, die Krankheitssymptome zu verringern oder sogar die Krankheit zu heilen. Die große Schwierigkeit, die bei der Herstellung solcher Inhibitoren von Kinase vom Wildtyp erfahren wurde, wie kurz vorstehend beschrieben, begrenzt jedoch das Potential dieser Methode. Die Hauptschwierigkeit ist das Auffinden von Inhibitoren, die spezifisch sind und nicht eine andere Kinase als das beabsichtigte Ziel inhibieren. Die Gründe für eine solche Nicht-Spezifität sind (i) die Nukleotidtriphosphat-Bindungsstellen von Kinase sind in der Evolution sehr konserviert, und (ii) viele Kinasen sind "degeneriert", das heißt sie weisen ausreichend ähnliche Aktivitäten und Spezifitäten auf, daß sie eine andere Kinase ersetzen können, die aufgrund von Genzerstörung oder aus einem anderen Grund nicht vorhanden ist oder in der Konzentration in den Zellen vermindert ist. Das Problem der Bindungsstellenähnlichkeiten kann in vielen Fällen beseitigt werden, z.B. durch sorgfältige rationale Inhibitorkonstruktion oder durch Auswahl von Inhibitoren aus kombinatorischen Bibliotheken auf der Basis der Spezifität. Anstrengungen dafür mit einer Kinase, die wahrhaft mit einer anderen Kinase degeneriert ist, sind jedoch wahrscheinlich unfruchtbar, entweder werden alle der co-degenerierten Kinasen auch durch die besten Kandidatenverbindungen inhibiert oder, selbst wenn das Ziel inhibiert wird, ist es unmöglich mitzuteilen, da eine degenerierte Kinase die Aktivität der inhibierten "übernimmt".
  • Aufgrund dessen besteht ein Bedarf für eine Weise zum Selektieren von Kinasen, um festzustellen, welche Kinasen vom Wildtyp degeneriert sind, und folglich schlechte Kandidaten für die spezifische Inhibierung sind, und welche nicht degeneriert sind und daher bevorzugte Kandidaten für die spezifische Inhibierung sind. Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren bereit. Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zum Erzeugen eines spezifischen, eindeutigen Kinaseinhibitors für irgendeine interessierende Kinase bereit durch Herstellen einer Mutante der Kinase, die spezifisch dazu ausgelegt ist, durch ausgewählte Kandidateninhibitoren inhibiert zu werden, und dann Untersuchen der Wirkungen dieser Inhibierung.
  • Ein weiteres bevorzugtes Verfahren einer solchen Selektierung bestünde darin, Tiermodelle für die interessierende Krankheit zu erzeugen und dann das Gen vom Wildtyp zu "zerstören" und dann durch Gentechnik in das Genom ein Gen einzufügen, das eine Mutantenkinase der vorliegenden Erfindung codiert, "Einschalten". Dann kann ein Inhibitor der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise einer, von dem in vitro gezeigt wurde, daß er die Mutante inhibiert, verwendet werden, um die Mutantenkinase herabzuregulieren. Wenn die Herabregulierung zu einer Senkung der Symptome oder Morbidität der Krankheit im Modelltier führt oder die Krankheit beseitigt, dann ist diese Kinase ein bevorzugter Kandidat für die Entwicklung eines spezifischen Inhibitors der Wildtypform.
  • XII. Gentherapieanwendungen
  • Die Mutantenkinase und Inhibitoren der vorliegenden Erfindung können auch direkt verwendet werden, um Krankheiten in Menschen und Tieren zu behandeln. Genau wie vorher für die Tiermodellsysteme beschrieben, könnte die Gensubstitution verwendet an Patienten mit Krankheiten, die durch diese Kinase vermittelt werden, verwendet werden. Der Wildtyp für eine oder mehrere solche Kinasen vom Wildtyp würde zerstört werden, z.B. durch "Zerstörungs"-Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, und dann würden spezifisch inhibierbare Mutanten dieser einen oder mehreren Kinasen zum Genom des Tiers zugegeben werden, z.B. durch "Einschalten" oder Gentherapieverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Dann könnte der Inhibitor als Arzneimittel verwendet werden, um diese eine oder mehrere Mutantenkinasen herabzumodulieren, so daß die Krankheit zumindest in einem gewissen Grad verbessert wird, aber der Grad der Aktivität jeder Kinase, die als für die normale Zellfunktion erforderlich festgestellt werden kann, könnte beibehalten werden. Die Kinase könnte natürlich auch durch starke Inhibierung im wesentlichen "ausgeschaltet" werden, wenn sich dies als therapeutisch wirksam erweisen würde. Wenn festgestellt wird, daß die Krankheit durch eine Periode der Herabregulierung stark verbessert oder ausgeschaltet wird, dann könnte die Verabreichung des Inhibitors unterbrochen werden und die Krankheit könnte durchaus nicht zurückkehren oder sich verschlimmern. Wenn nicht, dann könnte die Inhibierung auf Langzeit- oder auch permanenter Basis unterbrochen werden und die Mutanten könnten zur Funktion an der Stelle der Kinase vom Wildtyp für den Rest des Lebens dieses Patienten belassen werden. Da die spezifischen Inhibitoren der vorliegenden Erfindung in der Umgebung nicht vorhanden sind, sollte sich die Mutantenkinase genau wie der Wildtyp verhalten (außer in dem Umfang, wie die Konstruktion ihre Aktivität oder Kinetik verändert haben kann). Und wenn die Krankheit in der Zukunft wieder auftreten oder ausbrechen sollte, könnte der Patient wieder mit dem Inhibitor behandelt werden, ohne den Bedarf, den Genaustausch zu wiederholen.
  • XIII. Entwicklung eines modularen Schalters für inhibitorempfindliche Allele irgendeiner Proteinkinase
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine allgemeine Methode zum Sensibilisieren von Proteinkinasen für zellenpermeable Moleküle bereit, die keine Proteinkinasen vom Wildtyp inhibieren. Unter Verwendung eines chemischen Schalters zum Entwerten einer eindeutigen Schnittstelle eines Proteins/kleinen Moleküls wurden Proteinkinasen mit eindeutiger Empfindlichkeit gegen zellenpermeable Inhibitoren konstruiert. Sieben Proteinkinasen aus fünf verschiedenen Familien wurden in einer halbzufälligen Weise ausgewählt. Die Inhibitoren wurden für jede Kinase identifiziert. Es wird demonstriert, daß diese Methode selbst für Proteinkinasen erfolgreich sein kann, die durch den gewählten "Leit"-Inhibitor nicht potent inhibiert werden. Es wurde gezeigt, daß divergente Gerüste verwendet werden können, um sehr unterschiedliche Analoge zu erzeugen, die für dasselbe Ziel spezifisch sind. Außerdem wurde eine spezifische Inhibierung in vivo einer Zielkinase ohne den Bedarf, eine Selektion in vitro auszuführen, gezeigt. Die Daten deuten darauf hin, daß eine Mehrheit von Proteinkinasen für diese spezifische Zielinhibierungsstrategie zugänglich sind. Für Organismen, die leicht einer homologen Rekombination unterzogen werden (wie z.B. Saccharomyces cerevisiae, Dictyostelium discoideum, DT40 Hühner-B-Zellen und Embryostammzellen), eröffnet diese Methode die Möglichkeit für schnelles Erzeugen von konditionellen Allelstämmen für jede Proteinkinase in dem Genom, selbst jene ohne sichtbare Nullphänotypen. Eine Bibliothek von solchen Stämmen würde einen signifikanten Schritt vorwärts bei der Realisierung der pharmakogenomischen Vision der Identifikation von kleinen Molekülliganden für jedes Genprodukt in der Zelle darstellen.
  • XIV. Cdc28-Mutantenkinase, empfindlich gegen zellpermeablen chemischen Inhibitor
  • Die cyclinabhängigen Proteinkinasen (Cdks) steuern und koordinieren die Ereignisse des eukaryotischen Zellteilungszyklus (112). In der Sproßhefe Saccharomyces cerevisiae wird der Zellzyklus durch Cdc28(Cdkl) reguliert (in (113) überprüft), deren Funktion hauptsächlich durch die Analyse von temperaturempfindlichen (ts) Mutantenallelen untersucht wurde (114). Bei 37°C halten die meisten dieser Mutanten in G1 an, was darauf hindeutet, daß der Fortschritt durch START für die Inhibierung der Cdc28-Aktivität eindeutig empfindlich ist. Interessanterweise hat die Analyse von ts-Mutanten keinen klaren Beweis geliefert, daß Cdc28 beim G2/M-Übergang eine Rolle spielt, trotz des reichlichen Beweises, daß Cdk1 für den mitotischen Eintritt in andere Eukaryoten erforderlich ist (115–117).
  • Temperaturempfindliche Mutanten sind leistungsstarke Werkzeuge bei der Analyse der Genfunktion, aber die Analyse von ts-Phänotypen kann manchmal durch die Effekte eines Wärmeschocks kompliziert sein. Außerdem ist der Mechanismus der ts-Proteininaktivierung selten in molekularem Detail verstanden. Die Kinaseaktivität von Cdc28 wird beispielsweise in bestimmten cdc28-ts-Mutanten bei hoher Temperatur gesenkt (118), aber es ist nicht klar, ob der Zellzyklusstop an einer Wirkung auf die katalytische Funktion des Enzyms oder an Defekten der Proteinfaltung, Stabilität oder Wechselwirkungen mit anderen Proteinen liegt.
  • Die chemische Genetik stellt eine alternative Methode für die Erzeugung von konditionellen Defekten in der Genfunktion bereit (119–121). Bei dieser Methode wird die Funktion eines vorher identifizierten Genprodukts durch die Verwendung eines hochspezifischen chemischen Inhibitors bestimmt, der durch rationale Konstruktion oder Selektion von chemischen Bibliotheken identifiziert wird. Leider hatte diese Methode bei der Untersuchung von Proteinkinasen nur begrenzten Erfolg, deren stark konservierte aktive Stellen es schwierig machen, mutantenspezifische Inhibitoren zu identifizieren (121, 122).
  • Eine sehr spezifische chemische genetische Methode, die den Entwurf einer mutierten Zielkinase beinhaltet, die für einen zellenpermeablen chemischen Inhibitor eindeutig empfindlich ist, wurde entwickelt (123–125). Auf der Basis der Mutation des entsprechenden Rests in der Src-Familie von Kinasen (126), wurde Phenylalanin 88 in Cdc28 gegen ein Glycin ausgetauscht, was zur Bildung einer neuen Tasche an der ATP-Bindungsstelle führte. Diese Mutantenkinase Cdc28-as1 (analog-spezifisch 1) wurde als empfindlich gegen 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(1'-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (1-NM-PP1), ein Analogon des Kinaseinhibitors PP1, der eine Modifikation trägt, die die konstruierte Tasche an der ATP-Bindungsstelle belegen sollte, vorhergesagt.
  • Diese Erfindung demonstriert, daß ein allelspezifischer chemischer Inhibitor verwendet werden kann, um die Cdc28-Aktivität in vivo zu untersuchen. Bei niedrigen Konzentrationen von 1-NM-PP1 verzögern sich cdc28-as1-Stämme in G2/M oder stoppen dort mit hyperpolarisierten Sprossen. Dieser Phänotyp ist ähnlich zu dem in Zellen beobachteten, denen die mitotischen Cycline Clbl-4 fehlen (139). Der Phänotyp in cdc28-asl-Zellen liegt an einer Verringerung der Cdc28-Aktivität unter eine gewisse Schwelle, die für den mitotischen Eintritt und für den Schalter vom apikalen zum isotropen Sprossenwachstum erforderlich ist. Scheinbar ist die Aktivität von G1/S-Cyclin-Cdk-Komplexen in diesen Zellen noch ausreichend, um das Sprossen und die DNA-Replikation auszulösen. Nur bei höheren Konzentrationen an Inhibitor ist die Aktivität dieser Komplexe unter die Schwelle verringert, die für den Durchgang durch START erforderlich ist. Diese Daten sind im allgemeinen mit der Vorstellung konsistent, daß verschiedene Zellzyklusereignisse durch spezifische Schwellenpegel der CDK-Aktivität ausgelöst werden und daß spätere Ereignisse höhere Mengen an Aktivität erfordern (140). Die Unterschiede in der Substratspezifität von verschiedenen Cyclinen tragen jedoch auch zur Ordnung der Zellzyklusereignisse bei (141–143).
  • Der Beweis, daß der G2/M-Fortschritt gegen die Cdc28-Inhibierung am empfindlichsten ist, scheint vorherigen Ergebnisse mit temperaturempfindlichen cdc28-Mutanten zu widersprechen, von denen die meisten als ungesprossene Zellen in G1 verharren. Vielleicht wird der G1-Stop bei hoher Temperatur durch Unterschiede der Temperaturempfindlichkeit von verschiedenen Formen von Cdc28 erklärt. Ein G1-Stop könnte sich beispielsweise ergeben, wenn Cdc28-Clb-Komplexe in der S-Phase oder G2/M wärmebeständiger sind als das monomere Cdc28, das in G1 vorherrscht. Die Verwendung der allelspezifischen chemischen Inhibierung stellt ein leistungsstarkes alternatives Verfahren bereit, das diese und weitere Probleme mit temperaturempfindlichen Mutanten vermeidet.
  • Die Struktur der ATP-Bindungsstelle ist unter Proteinkinasen stark konserviert und daher sollte unsere Methode auf die Analyse einer beliebigen Proteinkinase anwendbar sein (bisher haben wir erfolgreich spezifische Inhibitoren von konstruiertem Src, Fyn, Cdk2, CaMKIIα, c-Abl, Fus3, Lck, p38 und Pho85 identifiziert (123–125, 144). Dieses Verfahren stellt auch eine Methode für die Erzeugung von konditionellen Allelen bereit, die schneller ist als herkömmliche Verfahren für die Isolation von temperaturempfindlichen Allelen. Außerdem ermöglicht die Verfügbarkeit einer neuen Klasse von konditionellen Allelen eine unkomplizierte Überdeckungsanalyse, um Genprodukte in linearen Signalisierungswegen zu ordnen: reziproke Verschiebungsversuche zwischen einem analog-spezifischen Allel und irgendeinem anderen temperaturempfindlichen oder kälteempfindlichen interessierenden Genprodukt können nun durchgeführt werden. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, daß die Stärke des Mutantenallels durch Verändern der Konzentration an Inhibitor gesteuert werden kann: folglich verhält sich cdc28-as1 wie ein schwaches Allel bei mäßigen Inhibitorkonzentrationen und ein virtuelles Nullallel bei hohen Konzentrationen. Die Anwendung dieses Verfahrens auf andere Proteinkinasen sollte daher die Identifikation von Genfunktionen mit verschiedenen Anforderungen für die katalytische Aktivität ermöglichen. In Fällen, in denen angenommen wird, daß eine Proteinkinase sowohl kinaseabhängige als auch -unabhängige Funktionen aufweist (145), würde die Verwendung eines analogen-spezifischen Allels ebenso nur diejenigen Funktionen inhibieren, die eine Kinaseaktivität erfordern. Schließlich ermöglicht dieselbe Kinasemutation, die das analoge-spezifische Allel erzeugt, auch, daß die Kinase radiomarkierte ATP-Analoge verwendet, die modifiziert sind, um die konstruierte ATP-Bindungsstelle zu ergänzen (126, 146). Die Zugabe dieser ATP-Analoge und der Mutantenkinase zu Zellysaten sollte zur Markierung und Identifikation von direkten Kinasezielen führen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um spezifische Cdc28-Substrate zu identifizieren.
  • XV. Zellinien
  • Wie anderswo hierin erläutert, können die konstruierten Expressionsvektoren, die die Nukleinsäure enthalten, die das Mutantenenzym codieren, verwendet werden, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren. Eine Anzahl von Säugerzellinien sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen immortalisierte Zellinien, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, wie z.B., jedoch nicht begrenzt auf Eizellen vom chinesischen Hamster (CHO), HeLa-Zellen, Babyhamster-Nieren- (BHK) Zellen, Affennierenzellen (COS), menschliche hepatozelluläre Krebszellen (z.B. Hep G2), Madin-Darby-Rindernieren- ("MDBK") Zellen NIH/3T3, 293-Zellen (ATCC #CRL 1573), COS-7, 293, BHK, CHO, TM4, CV1, VERO-76, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, MMT 060562, TRI-Zellen sowie andere. Ein gut bekanntes Beispiel einer Avian-Zellinie ist die Hühner-B-Zellinie "DT-40". Beispiele von Vektoren, die zum Transformieren solcher Zellinien nützlich sind, umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf retrovirale Vektoren, Impfstoffvirusvektoren, Adenovirusvektoren, Herpesvirusvektor, Fowlpox-Virusvektor, Bakterienexpressionsvektoren, Plasmide wie z.B. pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Kalif.) oder die Baculovirus-Transfervektoren.
  • Insektenzellen zur Verwendung mit Baculovirusexpressionsvektoren umfassen unter anderem Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni.
  • In einem anderen Ausführungsbeispiel werden Gene der Erfindung stromabwärts eines konstitutiven oder induzierbaren C. elegans Promotors geklont, wie z.B. das Wärmeschock-Promotorelement in einem Expressionsvektor wie z.B. pPD69.78 hsp 16.2 oder pPD69.3 hsp 16–41, die Vektoren der öffentlichen Domäne zum Erzeugen von transgenen C. elegans Linien, in denen das interessierende Gen unter der Steuerung eines induzierbaren Wärmeschock-Promotorelements steht, sind. Transgenes C. elegans kann dann durch Mikroinjektion von Eizellen erhalten werden.
  • In einem weiteren Ausführungsbeispiel können Drosophila-Zellen mit üblicherweise erhältlichen Vektoren transfiziert werden (156, 157).
  • Streptococcus spp. und andere niedrigere eukaryotische Zellen finden bei den vorliegenden Expressionskonstrukten Anwendung. Hefewirte, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen unter anderem Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Nasenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica.
  • Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung zu beschreiben und zu erläutern. An sich sollten sie nicht als Begrenzung des Schutzbereichs der Erfindung aufgefaßt werden. Fachleute werden erkennen, daß viele anderen Ausführungsbeispiele innerhalb den Schutzbereich der Erfindung fallen, wie vorstehend und in den Ansprüchen beschrieben ist.
  • VERSUCHSDETAILABSCHNITT
  • BEISPIEL 1
  • Synthese von ATP-Analogen: Zwölf verschiedene orthogonale ATP-Analoge wurden synthetisiert. 2 ist eine schematische Darstellung ihrer Struktur. Die Figur zeigt Adenosintriphosphat (ATP) mit einem an die 6-Position gebundenen "X"; und in dem Kasten unten sind schematische Darstellungen für die zwölf Seitenketten vorgesehen, die die Stelle von "X" in jedem der in den Beispielen beschriebenen orthogonalen ATP-Analoge einnehmen (die immer mit den Ziffern 1–12 bezeichnet werden). Diese Analoge sind:
    1-N6(Methoxy)ATP 7-N6-(Pyrolidino)ATP
    2-N6(Ethoxy)ATP 8-N6(Cyclopenty)ATP
    3-N6(Acetyl)ATP 9-N6(Cyclopentyloxy)ATP
    4-N6(i-Propoxy)ATP 10-N6-(Pipperidino)ATP
    5-N6(Benzyl)ATP 11-N6-(Cyclohexyl)ATP
    6-N6-(Benzyloxy)ATP 12-N6-(Cyclohexyloxy)ATP
  • Analoge 1, 2, 4, 6, 9 und 12 wurden über Dimroth-Umordnung der entsprechenden N 1-Alkoxyadeninderivate in vier Schritten, ausgehend von Adenosin, gemäß dem Verfahren von Fujii et al. (43) synthetisiert. Das Analogon 5 wurde ähnlich über Dimroth-Umordnung von N 1-Benzyladenosin synthetisiert (44). Das Analogon 3 wurde über in situ Schutz der Adenosinhydroxylgruppen als Trimethylsilylether und anschließende Behandlung mit Acetylchlorid gemäß McLaughlin et al. hergestellt (45). Die Analoge 7, 8, 10 & 11 wurden über Behandlung von 6-Chlorpurinribosid (Aldrich) mit Pyrrolidin, Cyclopentylamin, Piperidin bzw. Cyclohexylamin synthetisiert (46).
  • Die Triphosphatsynthese wurde gemäß dem Verfahren von Ludwig (47) ausgeführt, mit der Ausnahme der Herstellung von Pyrophosphat. Folglich wurde Bis-tri-N-butylammoniumpyrophosphat durch Vermischen von 1 Äquivalent Pyrophosphorsäure mit 2 Äquivalenten Tributylamin in einem (1:1) Wasser:Ethanol-Gemisch, bis eine homogene Lösung erhalten wurde, hergestellt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum zur Trockne entfernt und das Pyrophosphat wurde über P2O5 über Nacht gelagert. Alle nicht-radioaktiven Nukleotide wurden durch 1H-NMR, Massenspektralanalyse und HPLC mit starkem Anionenaustausch (SAX) (Rainin #83-EO3-ETI) charakterisiert.
  • [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl)ATP wurde gemäß dem Verfahren von Hecht und Kozarich synthetisiert (48). Das radiomarkierte Analogon wurde durch DEAE (A-25) Sephadex (Pharmacia) Säulenchromatographie gereinigt und das Triphosphat wurde durch Coinjektion des radiomarkierten Materials mit einer authentischen Probe von N 6-(Cyclopentyl)ATP an einer SAX-Anionenaustausch-HPLC-Säule (Rainin) identifiziert (linearer Gradient von 5–750 mM Ammoniumphosphat pH 3,9 in 10 min. bei 0,5 ml/min). Die chemische Ausbeute der Reaktion variierte von 70% bis 80%.
  • BEISPIEL 2
  • Selektion von Nukleotidanalogen: Um Verbindungen zu identifizieren, die nicht als Substrate durch irgendeine existierende zelluläre Kinase angenommen werden würden (53), wurde ein Feld von synthetischen A*TP- Analogen in einem Mäuselymphozytenlysat (CF), das reich an Proteintyrosinkinase war, selektiert (13). Die Versuche wurden unter Verwendung von Milzzellen 8–30 Wochen alte männliche und weibliche C57/B6-Mäusen von der Princeton University Animal Facility) durchgeführt, die in RPMI-1640-Medium, das 5% Rinderkalbsserum (BCS), 1% Hepes und DNAsel (1 μg/ml) enthielt, isoliert wurden. Rote Zellen wurden bei 4°C durch Behandlung mit 17 mM Trisammoniumchlorid, pH 7,2, lysiert. Die Zellen wurden hypotonisch auf Eis für 10 min. in 1 mM Hepes, pH 7,4, 5 mM MgCl2, Leupeptin (10 μg/ml), Aprotinin (10 μg/ml) und 100 μM PMSF gemäß dem Verfahren von Fukazawa et al. lysiert (51). Nach Verwirbelung und Zentrifugierung bei 500×g wurde der Überstand gesammelt. Die Zellen wurden bei 4°C für 20 min. gelagert. Um den basalen Proteinphosphorylierungspegel zu dämpfen, wonach der Puffer auf 20 mM Hepes, pH 7,4, 10 mM MgCl2 und 1 mM NaF eingestellt wurde. Natriumvanadat (100 μM) wurde dann zugegeben, um die Aktivität von Phosphotyrosinphosphatasen zu inhibieren.
  • Jedes Nukleotidtriphosphat wurde zu einer Endkonzentration von 100 μM zu 5 × 106 Zelläquivalenten zugegeben und bei 37°C für 5 min. inkubiert, wonach 4X Laemmli-Gelbeladungspuffer zu dem Zellysat zugegeben wurde, um die Reaktion zu löschen. Proteine wurden durch 12,5% SDS-PAGE getrennt und zu Protran BA85 (Schleicher-Schuell) überführt. Das Blot wurde mit dem monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper 4G10 (Upstate Biotechnology) geprüft und der gebundene Antikörper wurde über verstärkte Chemilumineszenz (Kat. 34080, Pierce) nach der Behandlung mit HRP-gekoppeltem Ziegen-Antimaus-Antikörper (VWR Kat. 7101332) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen.
  • Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt, die ein Anti-Phosphotyrosinprotein-Immunoblot ist, das das Niveau der Proteintyrosinphosphorylierung nach der Behandlung eines Mäuse-Lymphozytenzellysats (CF) mit 100 μM ATP oder A*TPs (1–12) zeigt. Das verwendete Zellysat umfaßt die Proteintyrosinkinase Src, Fyn, Lck, Lyn, Yes, Fgr, Hck, Zap, Syk, Btk, Blk und andere Proteintyrosinkinase, die in B- und T-Lymphozyten, Makrophagen und Follikeldendritzellen vorliegt (13). Molekulargrößenstandards (in Kilodalton) sind angegeben. Die A*TPs, die die kleinsten N 6-Substituenten enthielten, 1 (Methoxy), 2 (Ethoxy) und 3 (Acetyl), zeigten eine gewisse Fähigkeit, als zelluläre Proteintyrosinkinase-Substrate zu dienen (3, Bahnen 3–5). Die A*TPs mit sterisch fordernden N 6-Substituenten, 4 (1-Propoxy), 5 (Benzyl) und 6 (Benzyloxy) und alle Analoge, die zyklische aliphatische Substituenten enthalten (7–12), zeigten wenig oder keine Proteinphosphorylierung (3, Bahnen 6–8, 11–16).
  • Zum Testen auf mögliche Metathese von orthogonalen A*TPs (7–12) mit zellulärem ADP, um A*DP und ATP zu ergeben, wurde 1 mM ADP zu Zellysatkinasereaktionen identisch zu den in 3 gezeigten zugegeben; das Muster von Phosphoproteinen war dasselbe, was darauf hindeutete, daß keine signifikante Metathese von A*TP in einem vollständigen Zellysatsystem auftritt.
  • Auf der Basis dieser Ergebnisse scheint es, daß Analoge (7–12) "tote Substrate" für Proteintyrosinkinase vom Wildtyp sind, d.h. die Substrate vom Wildtyp diese im wesentlichen nicht oder überhaupt nicht als Phosphatdonorsubstrat annehmen. Diese Analoge wurden folglich als bevorzugteste Ziele für die Neukonstruktion der Nukleotidbindungsstelle von v-Src gewählt.
  • BEISPIEL 3
  • Konstruktion der Mutante v-Src: Keine Kristallstrukturen von irgendeiner Proteintyrosinkinase in einer aktiven Konformation wurden bis jetzt gelöst, obwohl verschiedene Strukturen von inaktiver Kinase gelöst wurden (54, 55). Zwei Kristallstrukturen von katalytisch aktiver ser/thr-Kinase wurden jedoch gelöst (56, 57). Es besteht ein hoher Grad an funktionaler Homologie zwischen den katalytischen Domänen der ser/thr- und der Proteintyrosinkinase, wie durch Affinitätsmarkierung des identischen katalytisch aktiven Lysinrests in beiden Kinasefamilien (K72 in cAMP-abhängiger Kinase (PKA), K295 in v-Src) (58, 58). Die Untersuchung der PKA (56) und cyclinabhängigen Kinase-2 (CDK2)-CyclinA (57) Kristallstrukturen deckten zwei Aminosäureseitenketten innerhalb einer Kugel von 4 Å der N 6-Aminogruppe von gebundenem ATP auf: V104/M120 (PKA) und V64/F80 (CDK2) (60).
  • 4 zeigt eine Nahansicht der ATP-Bindungsstelle in cAMP-abhängiger Proteinkinase (PKA), die an ATP gebunden ist. Diese Reste innerhalb einer Kugel von 4 Å des N 6-Amins von ATP (Val104, Met120 und Glu121) und der katalytisch wesentliche Lysinrest (Lys72) sind in Kugel- und Stabdarstellung gezeigt. Der Rest des Proteins ist im Bandformat dargestellt. Diese Figur wurde durch Zuführen der Ausgabe des Molskripts in das Raster3D-Wiedergabeprogramms erzeugt (68, 69). Man beachte, daß in dem Modell die Seitenkette von Glu121 von dem Adeninring-Bindungsbereich wegweist und daher Glu121 kein Kandidat zur Veränderung war.
  • Die Sequenzanordnung der ATP-Bindungsbereiche von PKA (SEQ ID NR.: 1), CDK2 (SEQ ID NR.: 2) und v-Src (SEQ ID NR.: 3) sind nachstehend gezeigt. Die fest dargestellten Reste entsprechen den Aminosäuren mit Seitenketten in einer Kugel von 5 Å der N 6-Aminogruppe von kinasegebundenem ATP.
  • Figure 00710001
  • Auf der Basis der funktionalen Ähnlichkeit zwischen der vorstehend beschriebenen Kinase wurden die Positionen V323 und I338 in der katalytischen v-Src-Domäne mutiert, welche V104/M120 in PKA & V64/F80 in CDK2 entsprechen. Durch Mutieren dieser Reste zu Alanin wurde gehofft, eine zusätzliche "Tasche" an der Nukleotidbindungsstelle von v-Src zu erzeugen, um die Bindung von einem der bevorzugten orthogonalen A*TPs zu ermöglichen. 4–12).
  • BEISPIEL 4
  • Mutantensynthese, Expression und Reinigung: Die Mutante (V323A, I338A) wurde wie nachstehend beschrieben hergestellt. Sowohl die Wildtyp- als auch die Doppelalaninmutante der katalytischen v-Src-Domäne (das XD4-Fragment) wurden als Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionsproteine (GST-XD4) hergestellt (61, 62). Diese wurden in E. coli hergestellt, der ein guter Expressionswirt ist, da ihm jegliche endogene Proteintyrosinkinase fehlt, wie in dem folgenden Beispiel beschrieben. Das XD4-Fragment von v-Src wurde verwendet, da es eine intakte katalytische SH1-Domäne enthält, aber ihm die nicht-katalytischen regulatorischen SH3- und SH2-Domänen fehlen, und eine höhere spezifische Aktivität aufweist als v-Src mit voller Länge.
  • Überlappungserweiterungs-PCR wurde verwendet, um GST-XD4 (V323A, I338A) herzustellen (49). Pfu-Polymerase (Stratagen) wurde in den PCR-Reaktionen gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet. Sechs synthetische Oligonukleotide wurden verwendet:

    SEQ ID NR.: 4 (5'-TTTGGATCCATGGGGAGTAGCAAGAGCAAG)
    SEQ ID NR.: 5 (5'-TTTGAATTCCTACTCAGCGACCTCCAACAC)
    SEQ ID NR.: 6 (5'-TGAGAAGCTGGCTCAACTGTACGCAG)
    SEQ ID NR.: 7 (5'-CTGCGTACAGTTGAGCCAGCTTCTCA)
    SEQ ID NR.: 8 (5'-CTACATCGTCGCTGAGTACATGAG)
    SEQ ID NR.: 9 (5'-CTCATGTACTCAGCGACGATGTAG)
  • Der Primer SEQ ID Nr. 4 enthält eine BamH1-Stelle und der Primer SEQ ID Nr. 5 enthält eine EcoR1-Stelle (kursiv gezeigt). Die Primer SEQ I NR.: 6 und SEQ ID NR.: 7 enthalten die Nukleotidsequenzänderungen, um die V323A-Mutation einzuführen (Nukleotide, die Mutationen codieren, sind fett dargestellt). Die Primer SEQ ID NR. 8 und SEQ ID NR. 9 enthalten die fehlende I338A-Übereinstimmung.
  • Das XD4-Gen von Yep51-XD4-Plasmid (ein Geschenk von B. Cochran bei Tufts Medical School) wurde mit den Primern SEQ. ID NR. 4 und SEQ. ID. NR. 5 erweitert. Das PCR-Produkt wurde mit BamH1 und EcoR1 abgebaut und in BamH1 und EcoR1-abgebautes pGEX-KT ligiert und dann in den E. coli Stamm DH5a transformiert. BOSC 23(6) und Virusteilchen wurden nach 2 Tagen geerntet, wie beschrieben (6). NIH3T3-Zellen wurden wie beschrieben (7) mit diesen Virusteilchen infiziert und stabile Transfektanten wurden in Puromycin enthaltenden Medien ausgewählt, wie beschrieben (5). Stabile Transfektanten wurden in Medien, die Puromycin enthielten, gehalten, um keinen Verlust der Expression von v-Src sicherzustellen.
  • Die Endergebnisse sind in 1 gezeigt, die ein Diagramm ist, das die Domänenstruktur von v-Src, einschließlich der Src-Homologie 3, 2 und 1 (SH3, SH2 & SH1) Domänen zeigt, wobei die Domänengrenzen durch die Aminosäurerestnummern angegeben sind, die vorstehend in jeder Kastendomäne aufgelistet sind. Die Domänenstruktur von XD4 ist auch dargestellt, die eine Deletion der Reste 77–225 (Δ77–225) enthält. Domänenorganisationen der Glutathion-S-Transferase (GST) Fusion mit XD4 (Numerierung von v-Src) und des zweifelhaft mutierten GST-XD4 (die beide V323A, I338A und I338G darstellen) sind auch schematisch dargestellt.
  • BEISPIEL 5
  • Testen der Mutante v-Src auf die Fähigkeit, orthogonale ATP-Analoge zu binden: Die Fähigkeit der N 6-substituierten ATP-Analoge (1–12, 2), differentiell Wildtyp- und Mutantenkinasephosphorylierung von RR-Src mit [γ-32P] ATP zu inhibieren, was ein Maß für ihre Fähigkeit, an die jeweiligen ATP-Bindungsstellen zu binden, wurde bewertet. Versuche wurden dreifach bei 37°C in einem Endvolumen von 30 μl gepuffertem bei pH 8,0, enthaltend 50 mM Tris, 10 mM MgCl2, 1,6 mM Glutathion, 1 mg/ml BSA, 1 mM RR-Src-Peptid mit entweder GST-XD4 (100 nM) oder GST-XD4 (V323A, I338A) (100 nM) und 10 μM [γ-32P]ATP (1000 cpm/pmol) [Dupont NEN]. Kaltes ATP oder ATP-Analoge (100 μM) (1–12) wurden vor der Zugabe der Kinase zugegeben. Nach 30 Minuten wurden die Reaktionen durch Tüpfeln von 25 μL des Reaktionsvolumens auf p81-Phosphocellulosescheiben (Whattman) gelöscht und diese wurden in 250 ml 10% Essigsäure für > 30 Minuten eingetaucht, gefolgt von Waschen und Szintillationszählung gemäß Standardverfahren (52).
  • Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Die relative Inhibierung von GST-XD4 ist durch volle Balken gezeigt und die relative Inhibierung durch GST-XD4 (V323A, I338A) ist durch die diagonal gefüllten Balken dargestellt. Der Prozentsatz an Inhibierung (1-v1/v0) ist als Verhältnis von v1 (cpm in Gegenwart von 100 μM des angegebenen Triphosphats und 10 μM [γ-32P] ATP (1000 cpm/pmol)/v0 (cpm in Gegenwart von 10 μM [γ-32P] ATP (1000 cpm/pmol) allein – Hintergrund-cpm aufgrund von nicht-spezifischer 10 μM [γ-32P] ATP-Bindung an die Phosphozellulosescheiben (< 0,1% an gesamten Eingangszählungen), berichtet. Die Fehlerbalken stellen die SD dar, die aus vier separaten Versuchen mit drei Wiederholungen bestimmt wurde.
  • Die Kinase vom Wildtyp GST-XD4 zeigt eine schlechte Bindungsaffinität für die meisten ATP-Analoge (6, volle Balken), wie aus dem Lymphozytenkinaseversuch erwartet (3). Im Gegensatz dazu zeigt das doppelt mutierte GST-XD4 (V323A, I338A) ausgezeichnete Inhibierung durch mehr sterisch fordernde N 6-substituierte ATP-Analoge (6, schattierte Balken). Am bedeutendsten wird die Mutante GST-XD4 (V323A, I338A) an der Phosphorylierung von RR-Src mit [γ-32P] ATP durch ATP-Analoge 5, 8, 9 und 11 fast so gut inhibiert wie die Kinase vom Wildtyp GST-XD4 an der Phosphorylierung von RR-Src mit [γ-32P] ATP durch ihr natürliches Substrat-ATP inhibiert wird. Es wurde bestätigt, daß GST-XD4 (V323A, I338A) und das GST-v-Src (V323A, I338A) mit voller Länge dasselbe Inhibierungsmuster mit ATPs (1–12) zeigen.
  • Vier der neun "toten" Substrate, die bei der Selektion der Kinasespezifität vom Wildtyp identifiziert wurden (3), binden gut an die Mutantenkinase. Diese hohe Erfolgsrate bei der Identifikation von neuen Substraten für eine Mutanten-v-Src, die von Kinase vom Wildtyp nicht angenommen werden, deutet darauf hin, daß ein Schlüsselmerkmal der v-Src-Nukleotidbindungsstelle identifiziert wurde, nämlich die Reste, die eine enge Anpassung um die N 6-Aminogruppe von ATP machen. Es ist erwähnenswert, daß keine Proteinkinase vom Wildtyp bekannt ist, die ein Alanin in der Position entsprechend I338 in v-Src (Position 120 in PKA) enthält. Wenn eine sterisch fordernde Aminosäureseitenkette in dieser Position auch eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Spezifität einer anderen Kinase spielt, sollte es durchaus möglich sein, sie zu konstruieren, um orthogonale Substrate anzunehmen, unter Verwendung einer Methode, die zu der hier beschriebenen sehr ähnlich ist, und eine solche konstruierte Kinase läge durchaus innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
  • BEISPIEL 6
  • Bestimmung der katalytischen Effizienz der Mutante v-Src mit dem bevorzugtesten orthogonalen ATP-Analog: Die Fähigkeit von N 6-(Cyclopentyl) ATP 8 als katalytisch kompetentes Substrat von sowohl GST-XD4 vom Wildtyp als auch der GST-XD4 (V323A, I338A) Mutante über die anderen drei ATP-Analoge 5, 9 und 11 zu dienen, da das Analogon 8 einen geringfügig niedrigeren Pegel an Phosphorylierung mit der Kinase vom Wildtyp zeigte, wurde getestet (3, Bahn 12).
  • ATP und N 6-(Cyclopentyl) ATP abhängige RR-Src-Phosphorylierung (1 mM) durch GST-XD4 (V323A, I338A) und GST-XD4 wurden bei einer niedrigen Substratumwandlung (< 5%) dreifach ausgeführt. Die kinetischen Konstanten wurden durch die Analyse von Lineweaver-Burk-Diagramme der seltenen Daten bestimmt (64). Die Versuche wurden dreifach bei 37°C in einem Endvolumen von 30 μL, gepuffert bei pH 8,0, enthaltend 50 mM Tris, 10 mM MgCl2, 1,6 mM Glutathion, 1 mg/ml BSA, 1 mM RR-Src-Peptid mit entweder GST-XD4 (100 nM) oder GST-XD4 (V323A, I338A) (100 nM) und 10 μM [γ-32P] ATP (1000 cpm/pmol) oder [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP (5000 cpm/pmol), wie angegeben, ausgeführt.
  • Tabelle 1 Kinetik für Phosphatdonorsubstrate
    Figure 00750001
  • Figure 00760001
  • Wie in Tabelle 1 vorstehend gezeigt, phosphorylierte die Kinase vom Wildtyp GST-XD4 das RR-Src-Peptid im wesentlichen nicht mit [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP, was die vorherigen Beobachtungen bestätigte, daß dieses Analogon kein signifikantes Substrat für die Kinase vom Wildtyp ist. Im Gegensatz dazu zeigte GST-XD4 (V323A, I338A) eine Michaelis-Menten-Kinetik mit dem orthogonalen ATP, [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP. Das KM der Mutante für das orthogonale Substrat liegt ziemlich nahe am KM von GST-XD4 für ATP. Andererseits weist die Mutante ein KM für ATP auf, das mehr als 10-fach höher ist als das KM von GST-XD4 für ATP.
  • Der zum Bewerten der Katalyse für kompetitive Substrate verwendete Parameter ist das Verhältnis der Wechselzahl zur Michaelis-Menten-Konstante kcat/KM (die "Spezifitätskonstante") (64). Das kcat/KM der konstruierten Mutante GST-XD4 (V323A, I338A) mit dem orthogonalen Substrat [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP ist nur 50-mal geringer als der kcat/KM-Wert der Kinase vom Wildtyp mit ihrem natürlichen Substrat ATP. Diese katalytische Effizienz mit dem orthogonalen ATP-Substrat, gekoppelt mit der niedrigeren katalytischen Effizienz der Mutantenkinase mit ATP, im Vergleich zum Wildtyp, erfüllen zwei der vorstehend erörterten Entwurfskriterien.
  • Es ist noch signifikanter, daß das neue Substrat, [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP von GST-XD4 vom Wildtyp im wesentlichen nicht verwendet wird, wie durch die scheinbare vollständige Unfähigkeit von GST-XD4, dieses Analogon als Phosphodonor für die Autophosphorylierung zu verwenden, demonstriert; dies ist in 5C, Bahn 3, dargestellt. 5C ist ein Autoradiogramm, das die [γ-32P] ATP-abhängige Autophosphorylierung von GST-XD4, Bahn 1, oder GST-XD4 (V323A, I338A), Bahn 2; und die von [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP abhängige Phosphorylierung von GST-XD4, Bahn 3, oder GST-XD4 (V323A, I338A) Phosphorylierung, Bahn 4, zeigt. Man beachte, daß im Gegensatz zu GST-XD4 die konstruierte Kinase mit [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP effizient autophosphoryliert wird (5C, Bahn 4).
  • BEISPIEL 7
  • Bestätigung der Beibehaltung der Proteinsubstratspezifität: Wie in nachstehender Tabelle 2 gezeigt, wurde entdeckt, daß GST-XD4-Kinase vom Wildtyp zu einem gut charakterisierten Peptidsubstrat von v-Src, RR-Src, mit einer Kinetik, die mit Literaturberichten (63) konsistent ist, phosphorylierte. Dies weist darauf hin, daß die Sequenzkonstruktion die katalytische Aktivität des Enzyms bezüglich seiner Proteinsubstrate im wesentlichen nicht beeinflußt hatte.
  • Tabelle 2 Kinetik für Proteinsubstrat RR-Src
    Figure 00770001
  • Versuche der GST-XD4 und GST-XD4 (V323A, I338A) Phosphorylierung von RR-Src wurden dreifach bei 37°C in einem Endvolumen von 30 μl, gepuffert auf pH 8,0, enthaltend 50 mM Tris, 10 mM MgCl2, 1,6 mM Glutathion, 1 mg/ml BSA, 1 mM RR-Src-Peptid mit entweder GST-XD4 (100 nM) oder GST-XD4 (V323A, I338A) (100 nM) und 10 μM [γ-32P] ATP (1000 cpm/pmol) [Dupont NEN], ausgeführt.
  • Um festzustellen, ob die Alaninmutationen irgendeine Wirkung auf die Proteinsubstratspezifität haben, wurde das KM sowohl der Wildtyp- als auch der Mutantenfusionsproteine für das RR-Src-Peptid gemessen. Bei Sättigungskonzentrationen von [γ-32P] ATP zeigen der Wildtyp und die Mutante im wesentlichen dasselbe KM für RR-Src, jeweils 2,6 ± 0,9 mM (62). Außerdem war das KM der Mutante für das Proteinsubstrat in Gegenwart von Sättigungsmengen des orthogonalen Substrats auch im wesentlichen dasselbe, 2,1 ± 0,9 mM. Diese Feststellungen deuten darauf hin, daß die Alaninmutationen in der ATP-Bindungstasche, die nahe der benachbarten Phosphoakzeptor-Bindungsstelle liegt, die Proteinzielspezifität nicht beeinflussen.
  • Zur Stützung dessen phosphoryliert die konstruierte Kinase denselben breiten Satz von Proteinen, die durch XD4 vom Wildtyp phosphoryliert werden, wenn jedes in Sf9-Insektenzellen exprimiert wird. Dies ist in 5A gezeigt, die ein Anti-Phosphotyrosinprotein-Blot von Zellysaten (108 Zelläquivalente/Fleck) von Sf9-Insektenzellen, die 6-His-XD4, Bahn 2, oder 6-His-XD4 (V323A, I338A), Bahn 3, exprimieren, zeigt. Diese Blots wurden nach der Lyse von 106 Zellen in einem Puffer, der 0,1% Triton-X-100, 50 mM Tris, pH 8,0, enthielt, unter Verwendung eines Verfahrens ähnlich zu jenem der Blots von Beispiel 2 ausgeführt.
  • Das Sf9-Insektenzellsystem ist ein guter Wirt für das Exprimieren von kleinen Mengen an Proteintyrosinkinase, da diese Zellen das meiste derselben Maschinerie enthalten, die zum Ausführen von posttranslationalen Modifikationen an Proteinen erforderlich ist, die zu Kinase führen, die in der Aktivität zu den in Säugerzellen zu findenden ähnlicher ist. Ferner fehlt es uninfizierten Sf9-Zellen an endogener Proteintyrosinkinaseaktivität, wie in 5A, Bahn 1, gezeigt, und folglich sind die Phosphotyrosin enthaltenden Proteine in Bahnen 2 und 3 von 5A Substrate der exprimierten 6-His-XD4- oder Mutanten-6-His-XD4-Kinase. Die kleinen Unterschiede im Phosphorylierungsniveau von speziellen Proteinen wird der niedrigeren katalytischen Aktivität der Mutante XD4 (V323A, I338A) im Vergleich zur Kinase vom Wildtyp zugeschrieben. Zusammengenommen zeigen diese Daten, daß die Peptidspezifität der konstruierten Kinase theoretisch zu jener von v-Src vom Wildtyp identisch ist.
  • BEISPIEL 8
  • Bestätigung, daß die konstruierte Kinase das bevorzugte orthogonale Substrat annimmt, aber die Kinase vom Wildtyp es im wesentlichen nicht annimmt. Das letztliche Ziel dieser Arbeit besteht darin, eine Mutantenkinase, die für synthetische Substratanaloge spezifisch ist, zu verwenden, um die direkten Proteinsubstrate in ganzen Zellen oder Zellysaten zu markieren. Dazu ist es bevorzugt, daß keine Kinase vom Wildtyp, einschließlich spezifische ser/thr-Kinase (die die Masse von zellulärer Phosphorylierung ausführt, da nur 0,33% aller Phosphoaminosäuren Tyrosin sind) (65), das synthetische Substrat im wesentlichen annimmt. Um festzustellen, daß [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP im wesentlichen ein "totes Substrat" für jegliche zelluläre Kinase vom Wildtyp ist, wurden Kinasereaktionen mit [γ-32P] ATP oder [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP in vitro mit Mäuselymphozytenlysaten durchgeführt.
  • Diese Versuche wurden in einer Weise ähnlich zu dem in Beispiel 2 dargelegten Verfahren durchgeführt, mit der Ausnahme der Verwendung von radiomarkiertem [γ-32P] ATP oder [γ-32P] N6-(Cyclopentyl) ATP (5000 cpm/pmol), zugegeben zu einer Endkonzentration von 100 μM mit 5 × 106 Zelläquivalenten und inkubiert bei 37°C für 10 min., wonach 4X-Laemmli-Gelbeladungspuffer zu dem Zellysat zugegeben wurde, um die Reaktion zu löschen. Proteine wurden durch 12,5% SDS-PAGE getrennt. Das Gel wurde in 10% Essigsäure, 10% Isopropanol für 1 h aufgesogen, wonach es in einem Geltrockner getrocknet wurde und für 1 h auf einem Biomax MS Film (Kodak # 111–1681) belichtet wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 5(B) gezeigt, die ein Autoradiogramm ist, das das Niveau der Phosphorylierung in hypotonisch lyoierten Mäuselymphozyten mit [γ-32P] ATP, Bahn 1, oder [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP, Bahn 2, zeigt. Es sind keine radiomarkierten Phosphoproteine im Zellysat nach der Zugabe von [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP vorhanden, was die echte orthogonale Natur von N 6-(Cyclopentyl) ATP bezüglich jeglicher Proteinkinase vom Wildtyp bestätigt. Dasselbe Ergebnis wurde gefunden, wenn Kinasereaktionen in vitro mit [γ-32P] ATP oder [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP und NIH3T3-Zellysaten anstelle von frisch isolierten Mäuselymphozyten verwendet wurden. Im Prinzip würde die Fähigkeit, der Aktivität einer Proteinkinase in Gegenwart von jeglicher anderen zellulären Kinase zu folgen, die Identifikation der direkten Kinaseziele in einer speziellen Zellenart unter Verwendung von Membranpermeabilisierung (66) und einer zellenpermeablen Form von A*TP zum Einführen von [γ-32P] A*TP in die Zellen (67) ermöglichen.
  • BEISPIEL 9
  • Konstruktion und Analyse von v-Src-Mutanten mit einziger Mutation: Um zu bestimmen, ob eine einzige Mutation ausreichen könnte, um zu ermöglichen, daß N 6-(Cyclopentyl) ATP effizient als Substrat verwendet wird, wurden drei zusätzliche von v-Src abgeleitete Mutanten unter Verwendung von Verfahren hergestellt, die zu jenen von Beispiel 4 vergleichbar sind. Diese hatten jedoch nur einzige Mutationen in der Position 338. Diese wurden wieder als GST-XD4-Fusionsproteine exprimiert. Diese Mutanten GIST-XD (I338A), GST-XD (I338G) wurden dann wie in Beispiel 8 beschrieben getestet.
  • Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Die oben links in 7 gezeigten Gelbahnen zeigen, daß die Mutante mit Alanin in der 338-Position das natürliche Substrat ATP leichter verwenden konnte als die Mutante mit Serin in eben dieser Position. Die unten links in 7 gezeigten Gelbahnen zeigen, daß die Mutante mit Alanin in der Position 338 auch ATP besser als Substrat verwenden kann als die Mutante mit Glycin in dieser Position. Die Felder auf der rechten Seite von 7 erzählen eine noch interessantere Geschichte. Aus dem oberen rechten Feld ist klar, daß die Mutante mit dem Serin in der Position 338 N 6(Cyclopentyl) ATP nicht fast so gut verwenden kann wie die Mutante mit Alanin in dieser Position. Das untere Feld zeigt jedoch, daß die Mutante mit Glycin in der Position 338 N 6(Cyclopentyl) ATP besser als Substrat verwenden kann als die Mutante mit Alanin in dieser Position.
  • Diese Ergebnisse sind äußerst vielversprechend. Es scheint, daß eine einzige Mutation genügt, um die Verwendung dieses orthogonalen Substrats zu ermöglichen. Merklich scheint die Mutante mit Glycin in der Position 338 die beste konstruierte v-Src-Mutante zu sein, die bis jetzt hergestellt wurde. Überdies ist es ziemlich überraschend, daß eine Glycinsubstitution hier funktionieren würde. Im allgemeinen wird gewöhnlich nicht erwartet, daß eine Glycinsubstitution in solchen Situationen funktioniert, da sie zu viel Flexibilität in die Enzymstruktur einführt und somit das gewünschte Ergebnis schädlich beeinflußt.
  • BEISPIEL 10
  • Identifikation von Substraten von v-Src: Eine schematische Darstellung einer Versuchsmethode zum Identifizieren von v-Src-Substraten ist in 8 dargestellt. Das konstruierte v-Src wie z.B. GST-XD (V323A, I338A) wird zu Zellextrakten oder permeabilisierten Zellen zusammen mit einem radiomarkierten orthogonalen Substrat wie z.B. [γ-32P] N 6-(Cyclopentyl) ATP zugegeben. Typischerweise würde dies dreifach durchgeführt werden. Nach der Inkubation würden die Zellen lysiert werden (wenn sie nicht bereits lysiert sind) und die resultierenden Proben würden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt werden. Ein Western-Blot, das aus dem Gel aufgenommen wird und mit Anti-Phosphotyrosin markiert wird, würde alle phosphorylierten Proteine in der Probe zeigen; und ein Autoradiogramm des Gels würde aufdecken, welche von diesen durch v-Src phosphoryliert wurden.
  • BEISPIEL 11
  • Synthese von Inhibitoren: Das Pyrazolopyrimidin-Gerüst für die ersten sechs Inhibitoren ist in 10A dargestellt. Die Synthese von 4-Amino-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin mit einer Phenylgruppe in der "R"-Position, Verbindung 1 (die dieselbe Struktur war wie PP1, das in 9 gezeigt ist, jedoch ohne die para-Methylgruppe am Phenylring), wurde gemäß dem Verfahren von Hanefeld et al. (76) ausgeführt. Die Verbindungen 2–6 mit Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Benzoyl- bzw. 2-Furoyl-Substituenten in der "R"-Position (10B) wurden durch Behandlung von 1 mit Cyclobutylchlorid, Cyclopentoyl, Cyclohexoylchlorid, Benzoylchlorid oder Furoylchlorid jeweils in trockenem Pyridin für eine Stunde bei Raumtemperatur synthetisiert. Die Strukturen von jedem der Substituenten sind in 10B dargestellt. Reinigung durch Kieselgel-Chromatographie ergab reine Produkte in 16–84% Ausbeute. Verbindungen 1–6 (10B) wurden durch 1N-NMR und Massenspektralverfahren charakterisiert.
  • BEISPIEL 12
  • Selektion von Inhibitoren, die zu Kinasen vom Wildtyp orthogonal sind: Um Verbindungen zu identifizieren, die irgendwelche zellulären Kinasen nicht inhibieren würden, wurde das Feld von synthetischen Pyrazolopyrimidinanalogen (1–6) (10) gegen zwei eng verwandte gereinigte Proteintyrosinkinasen, v-Src und Fyn, in einem Peptidphosphorylierungsversuch unter Verwendung von [γ-32P] ATP als Radiomarkierungsindikator für die Kinaseaktivität selektiert, wie bei Shah et al. (79) beschrieben. Die Ergebnisse zeigten, daß jede der Verbindungen 2–6 IC50-Werte von über 400 μM für die Inhibierung von Src hatten und die Verbindungen 3 und 5 zeigten bei über 400 μM IC50-Werte für die Inhibierung von Fyn vom Wildtyp, was darauf hinweist, daß diese Analoge (2 und 5) zu diesen repräsentativen Kinasen vom Wildtyp orthogonal sind (diese nicht inhibieren).
  • BEISPIELE 13–15
  • Die Entfaltung von Proteinkinase-Signalisierungswegen unter Verwendung von herkömmlichen genetischen und biochemischen Methoden war aufgrund der überwältigenden Einzahl von eng verwandten Kinasen schwierig. Wenn zellenpermeable Inhibitoren von jeder individuellen Kinase entworfen werden könnten, könnte die Rolle jeder Proteinkinase systematisch bewertet werden.
  • Eine Methode zum Kombinieren der Chemie und Genetik wurde entwickelt, um den ersten eindeutig spezifischen zellenpermeablen Inhibitor der onkogenen Proteintyrosinkinase v-Src zu erhalten. Eine funktional ruhige Mutation der aktiven Stelle wurde in v-Src durchgeführt, um sie von allen anderen zellulären Kinasen zu unterscheiden. Ein zellenpermeabler Inhibitor mit enger Bindung (IC50 = 430 nM} von dieser Mutantenkinase wurde entworfen und synthetisiert, welcher Kinasen vom Wildtyp nicht inhibiert. Versuche in vitro und an ganzen Zellen stellten die eindeutige Spezifität des Paars Mutante v-Src/Inhibitor fest. Dieser Inhibitor kehrt die Transformationseffekte der zellulären Expression des konstruierten v-Src um, aber unterbricht die durch Wildtyp-v-Src vermittelte zelluläre Transformation nicht. Diese Zellinien unterscheiden sich nur durch eine einzelne Aminosäure in einer einzelnen Proteinkinase, was feststellt, daß die drastischen Änderungen der Zellensignalisierung direkt der spezifischen Inhibierung der konstruierten Kinase zugeschrieben werden können. Die Allgemeingültigkeit dieses Verfahrens wurde durch Konstruieren von einer anderen Proteintyrosinkinase getestet. Die Allgemeingültigkeit dieses Verfahrens wurde durch Konstruieren einer anderen Proteintyrosinkinase, Fyn, so daß sie die entsprechende ruhige Mutation enthielt, getestet. Es wurde festgestellt, daß dieselbe Verbindung ebenso ein potenter Inhibitor (IC50 I 830 nM) dieser Mutantenkinase ist, was die Allgemeingültigkeit der Strategie zur Herstellung von allelspezifischen Inhibitoren von mehreren Proteintyrosinkinasen bestätigt.
  • Allelspezifische zellenpermeable Inhibitoren von individuellen Src-Familien-Kinasen können unter Verwendung einer kombinierten chemischen und genetischen Methode schnell entwickelt werden. Die Behandlung von Mutanten-v-Src transformierten NIH3T3-Fibroblasten mit einem eindeutig spezifischen v-Src kehrt die morphologischen Kennzeichen der Transformation um. Der Inhibitor. zeigt keine Auswirkungen auf Zellen, die durch das v-Src-Allel vom Wildtyp transformiert wurden, was stark darauf hindeutet, daß der durch die Inhibitorbehandlung eingeführte Phänotyp ein Ergebnis eines einzigen inhibitorischen Ereignisses ist. Die Fähigkeit, schnell kinasespezifische Inhibitoren in einer verallgemeinerbaren Weise zu erzeugen, ist für die Entfaltung von durch Kinase vermittelten Zellenwegen und für die Validierung von neuen Kinasen als gute Ziele für die Arzneimittelentdeckung sowohl in vitro als auch in vivo nützlich.
  • Wie vorher angegeben, wurde eine kombinierte chemische und genetische Strategie entwickelt, die die Erzeugung von "chemisch empfindlichen" Mutantenkinasen ermöglicht, die durch einen rational entworfenen Inhibitor mit kleinem Molekül eindeutig inhibiert werden. Die Methode beinhaltet die Konstruktion einer eindeutigen Tasche an der aktiven Stelle der interessierenden Kinase mit einer funktional ruhigen Mutation. Ein spezifischer Inhibitor der konstruierten Kinase wird dann durch Derivatisieren eines bekannten Kinaseinhibitors mit einer voluminösen Gruppe, die dazu ausgelegt ist, in die neue Tasche der aktiven Stelle zu passen, synthetisiert. Die voluminöse Gruppe tötet die Leistungsfähigkeit des Inhibitors für Kinasen vom Wildtyp. Eine erfolgreiche komplementäre Konstruktion führt daher zu günstigen Bindungswechselwirkungen, die nur in dem konstruierten Kinase/Inhibitor-Komplex möglich sind. Die Transfektion von Zellen mit dem Gen, das die konstruierte Kinase codiert, erzeugt eine Zelle, in der nur eine Kinase durch den entworfenen Inhibitor blockiert werden kann (siehe 13).
  • Da die Mutantenkinase derselben Funktion dient wie die Kinase vom Wildtyp, beeinflußt ein Inhibitor der Mutante bedeutenderweise die Zellsignalisierung in derselben Weise wie ein selektiver Inhibitor der Kinase vom Wildtyp in nicht-transfektierten Zellen. Die Fähigkeit, den Phänotypen der Zellen nach der selektiven Inhibierung irgendeiner Proteinkinase zu beobachten, stellt ein schnelles Verfahren zum Bestimmen der eindeutigen Rollen von Individuen in Signalumsetzungskaskaden bereit.
  • Die src-Familien-Proteintyrosinkinasen wurden aufgrund ihrer allgegenwärtigen Bedeutung bei der Vermittlung der Zellfunktion auf eine spezifische Inhibitorkonstruktion abgezielt. Trotz einer intensiven Untersuchung waren die Rollen von individuellen src-Familien-Mitgliedern aufgrund der zellulären Colokalisierung und ihrer hohen Sequenzidentitäten schwierig zu bewerten. Obwohl einige potente Inhibitoren von src-Familien-Kinasen bekannt sind, wurde kein Molekül, das wirksam zwischen diesen eng verwandten Enzymen unterscheiden kann (20-fache Selektivität für ein src-Familien-Mitglied), identifiziert. Zwei funktional bedeutende src-Kinasen, v-Src und Fyn, wurden als Hauptziele der Mutantenkinase/Inhibitor-Paar-Konstruktion gewählt. Die Src-Kinase ist aufgrund ihrer Bedeutung bei der Onkogenese von Brust-, Lungen- und Dickdarmkrebsen als führendes Arzneimittelziel aufgekommen. Obwohl v-Src für onkogene Proteintyrosinkinasen der Prototyp ist, wurden keine Inhibitoren mit kleinen Molekülen, die für diese Kinase hochselektiv sind, entdeckt. Fyn ist eine src-Familien-Proteintyrosinkinase, die bei der durch T-Zellenrezeptoren vermittelten Lymphozytenaktivierung wichtig ist. Src und Fyn teilen sich eine ähnliche Domänenstruktur und weisen ungefähr 85% Aminosäureidentität in ihren katalytischen Domänen auf. Die enge strukturelle Beziehung der src-Familien-Mitglieder stellt den idealen Test der Fähigkeit bereit, die Enzym/Inhibitor-Spezifität zwischen sehr homologen Kinasen zu konstruieren. Wenn man zwischen diesen eng verwandten src-Mitgliedern unter Verwendung eines zellenpermeablen Inhibitors unterscheiden kann, ist es wahrscheinlich, daß die Spezifität für Mitglieder von anderen Proteinkinasefamilien auch unter Verwendung einer ähnlichen Methode erreicht werden kann.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Chemische Synthese: Alle Ausgangsmaterialien und synthetischen Reagenzien wurden von Aldrich erworben, wenn nicht anders angegeben. Alle Verbindungen wurden durch 1N-NMR und Massenspektrometrie mit hoher Auflösung charakterisiert. 4-Amino-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (2, 14) wurde gemäß Hanefeld et al. synthetisiert.
  • Allgemeines Verfahren für die N-4-Acylierung von Verbindung 2 (3a–3g, 14B). Zu einer Lösung von 3 (100 mg), gelöst in 2 ml Pyridin, wurden 10 Äquivalente des gewünschten Acylchlorids bei 0°C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen lassen und für 12 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 25 ml Wasser gelöscht. Das resultierende Gemisch wurde mit Et2O extrahiert und die vereinigten Et2O-Extrakte wurden mit 1N HCl und 5% NaHCO3 gewaschen. Die Et2O-Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und verdampft. Der Rückstand wurde durch Flashchromatographie an 25g Kieselgel durch Elution mit 1:1 Et2O/Hexanen unter Gewinnung von reinem 3a–3g gereinigt.
  • 4-Cyclobutylamido-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (3a): Ausbeute 0,0116 g (16%); weißes Pulver; HRMS (EI) Molekularion berechnet für C20H23N5O 349,19049, gefunden 349,18762; 1HNMR (300 MHz, CDCl3, ppm) d 1,86 (9H, s), 1,89–2,27 (6H, m), 3,58 (1H, m), 7,26–7,67 (5H, m), 8,69 (1H, s).
  • 4-Cyclopentylamido-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (3b): Ausbeute 0,0456 g (68%), weißes Pulver; HRMS (EI) Molekularion berechnet für C20H25N5O 363,20615, gefunden 363,20398; 1H NMR (270 MHz, CDCl3, ppm) d 1,41–1,91 (8H, m), 1,87 (9H, s), 2,97 (1H, m) 7,51–7,67 (5H, m), 8,70 (1H, s).
  • 4-Cyclohexylamido-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (3c): Ausbeute 0,0575 g (84%), weißes Pulver; HRMS (EI) Molekularion berechnet für C22H27N5O; 1H NMR (270 MHz, CDCl3, ppm) d 1,21–1,93 (10H, m), 1,86 (9H, s), 2,43 (1H, m) 7,51–7,67 (5H, m), 8,70 (1H, s).
  • 4-2'-Furylamido-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (3d): Ausbeute 0,0342 g (60%), weißes Pulver; HRMS (EI) Molekularion berechnet für C20H19N5O2 361,15407, gefunden 361,15254; 1H NMR (270 MHz, CDCl3, ppm) d 1,87 (9H, s), 6,52 (1H, d), 7,23 (1H, d), 7,43–7,53 (5H, m), 7,95 (1H, s), 8,59 (1H, s).
  • 4-Benzamido-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (3e): Ausbeute 0,1309 g (56%), weißes Pulver; HRMS (EI) Molekularion berechnet für C22H21N5O 371,17933, gefunden 371,17324; 1H NMR (270 MHz, CDCl3, ppm) d 1,41–1,91 (8H, m), 7,22–8,11 (10H, m), 8,48 (1H, s).
  • 4-(p-Methyl)benzamido-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (3f): Ausbeute 0,0751 g (33%), weißes Pulver; HRMS (EI) Molekularion berechnet für C23H23N5O 385,19499, gefunden 385,18751; 1H NMR (270 MHz, CDCl3, ppm) d 1,88 (9H, s), 2,42 (3H, s), 7,19 (2H, d), 7,41–8,11 (7H, m), 8,49 (1H, s).
  • 4-(p-tert-Butyl)benzamido-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (3g): Ausbeute 0,1050 g (42%), weißes Pulver; HRMS (EI) Molekularion berechnet für C26H29N5O 427,23747, gefunden 427,23474; 1H NMR (270 MHz, CDCl3, ppm) d 1,35 (9H, s), 1,88 (9H, s), 7,38–7,99 (9H, m), 8,50 (1H, s).
  • Allgemeines Verfahren für die Reduktion von N-4-Acylverbindungen zu N-4-Methylenverbindungen (4b, 4d, 4e, 14). Ein Rundkolben wurde mit 30 mg LiAlH4 gefüllt. Der Kolben war mit einem Druckausgleichs-Tropftrichter ausgestattet und wurde mit trockenem Argon gespült. Das LiAlH4 wurde in 3 ml THF über einem Eisbad suspendiert. Ungefähr 100 mg des entsprechenden Analogen von N-4-Acyl 2 wurde in 5 ml THF gelöst und tropfenweise zu der Suspension von LiAlH4 zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min. auf einem Eisbad gerührt und anschließend für 30 min, auf Rückfluß erhitzt. Die Reaktion wurde durch die sequentiellen, tropfenweisen Zugaben von 1 ml EtOAc, 1 ml Wasser und 1 ml 6N NaOH gelöscht. Nach Rühren für fünf Minuten wurde das Reaktionsgemisch durch eine Celitefilterschicht filtriert, mit Wasser verdünnt und mit Et2O verdünnt. Die Et2O-Extrakte wurden vereinigt, über MgSO4 getrocknet und verdampft. Der Rückstand wurde durch Flashchromatographie an 10 g Kieselgel durch Elution mit 4:1 Hexanen/EtOAc gereinigt.
  • 4-Cyclopentylmethylamino-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (4b): Ausbeute 0/0649 g (75%), klares Öl; HRMS (EI) Molekularion berechnet für C21H27N5 349,22691, gefunden 349,22420; 1H NMR (270 MHz, CDCl3, ppm) d 1,1–2,14 (9H, m), 1,84 (9H, s), 3,54 (2H, d), 5,51 (1H, s), 7,46–7,67 (5H, m), 8,43 (1H, s).
  • 4-2'-Furylmethylamino-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (4d): Ausbeute 0,0620 g (66%), beiges Pulver; HRMS (EI) Molekularion berechnet für C20H21N5O 347,17483, gefunden 371,17330; 1H NMR (270 MHz, CDCl3, ppm), d 1,83 (9H, s), 4,75 (2H, d), 5,64 (1H, s), 6,25 (2H, d), 7,34–7,63 (6H, m), 8,45 (1H, s).
  • 4-Benzylamino-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (4e): Ausbeute 0,0520 g (54%), weißes Pulver; HRMS (EI) Molekularion berechnet für C22H23N5 357,19559, gefunden 357,19303; 1H NMR (270 MHz, CDCl3, ppm) d 1,82 (9H, s,) 4,76 (2H, d), 5,63 (1H, s), 7,28–7,63) (10H, m), 8,44 (1H, s).
  • Proteinexpression und -reinigung: stellengerichtete Mutagenese und Klonen der Gene für die Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine von WT v-Src SH1-Domäne. I338G v-Src SH1, WT Fyn, T339G Fyn und WT Abl in dem pGEX-KT-Plasmid wurde wie vorher beschrieben ausgeführt. Diese Kinasen wurden in DH5αE. Coli exprimiert und an immobilisierten Glutathionkügelchen (Sigma) gereinigt. PKA wurde erworben (Pierce) und ohne weitere Reinigung verwendet. PKCd wurde als 6-His-Konstrukt unter Verwendung des Bac-zu-Bac (Expressionssystem (pFastBac-B-Vektor)). PKCd wurde unter Verwendung einer QIA-Express (Ni-NTA Agarosesäule gereinigt.
  • In Vitro Kinaseinhibierungsversuch: IC50 für mutmaßliche Kinaseinhibitoren wurden durch Messen der Zählwerte pro Minuten (cpm) von 32P, zu einem optimierten Peptidsubstrat für src-Familien-Kinasen überführt (IYGEFKKK (SEQ ID NR.: 12)), bestimmt. Verschiedene Konzentrationen an Inhibitor wurden mit 50 mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 1,6 mM Glutathion, 1 mg/ml BSA, 133 mM IYGEFKKK (SEQ ID NR.: 12), 3,5% DMSO, 0,05 mM Kinase und 11 nM (2 mCi) [g-32P] ATP (6000 Ci/mMol, NEN) in einem Gesamtvolumen von 30 ml für 30 Minuten inkubiert. Reaktionsgemische (25 ml) wurden auf eine Phosphozellulosescheibe getüpfelt, die in 10% HOAc eingetaucht war, und mit 0,5% H3PO4 gewaschen. Die Überführung von 32P wurde durch Standardszintillationszählung gemessen. IC50 wurde als Konzentration an Inhibitor, bei der das cpm 50% der Kontrollscheibe war, definiert. Wenn das IC50 zwischen zwei gemessenen Konzentrationen abfiel, wurde es auf der Basis der Annahme einer invers proportionalen Beziehung zwischen der Inhibitorkonzentration und cpm zwischen den zwei Datenpunkten berechnet. Da die Löslichkeitsgrenze der Inhibitoranalogen in wässerigen Lösungen 300 μM ist, konnten IC50-Werte bis (250 μM sind ungefähr als volle Titrationen) bis zur oberen Grenze der Inhibierung nicht getestet werden. IC50 für Nicht-src-Familien-Kinasen wurden äquivalent mit den folgenden Ausnahmen gemessen. Kemptide (Pierce, 133 mg/ml) wurde als Substrat für PKA verwendet. Ein optimiertes Abl; (EAIYAAPFAKKK (SEQ ID NR.: 13), 133 mg/ml) wurde für Abl-Versuche verwendet. PKCd-Versuche wurden in Gegenwart von 17 ng/ml Diacylglycerol (Sigma) und 17 ng/ml Phosphatidylserin (Sigma) mit 170 ng/ml Histone (Sigma) als Kinasesubstrat durchgeführt.
  • Mäuse-B-Zellen-Versuch: Milzlymphozyten wurden aus 6–20 Wochen alten Balb/c- oder C57/B6-Mäusen isoliert. Die Zellen wurden aus der Milz in RPMI-Medien ausgewaschen, die 1 mg/ml DNase enthielten, und die roten Blutkörperchen wurden in 17 mM Tris-Ammoniumchlorid, pH 7,2 lysiert. Ungefähr 4 × 106 Zellen wurden bei 37°C für 30 Minuten mit 100 μM von 3 g oder 2 in 1,1 DMSO inkubiert. B-Zellenstimulation wurde durch die Zugabe von 2 mg Ziegen-Anti-Maus-IgM (Jackson Immuno Research, Kat# 115-005-075) eingeleitet und anschließend Inkubation für 5 Minuten bei 37°C. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (13000 U/min, 2 min.) isoliert und lysiert (Lysepuffer: 1% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 7,4, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 100 mM PMSF, 2 mM Natriumorthovanadat, 10 mg/ml Leupeptin, 10 mg/ml Apoprotin). Die zelluläre Debris wurde dann bei 13000 U/min für 15 min. pelletisiert. Zelluläre Proteine wurden durch 10% Polyacylamid-Gelelektrophorese getrennt und durch Western-Blotting auf eine Nitrocellulosemembran überführt. Phosphotyrosin enthaltende Proteine wurden durch Immunoblotting mit Anti-Phosphortyrosin-Antikörper (Upstate Biotechnology, Inc.) visualisiert).
  • Retrovirale Infektion von NIH3T3-Fibroblasten: Gene, die WT und I338G v-Src codieren, wurden in eine Verpackungszellinie transfektiert und NIH3T3-Fibroblasten wurden unter Verwendung des pBabe-Vektors und eines auswählbaren Puromycin- (2,5 mg/ml) Markers retroviral infiziert, wie beschrieben (Shah, K., Liu, Y., Shokat, K.M., in Vorbereitung). WT und I338G v-Src transformierte Zellen wurden in DMEM/10% BCS, enthaltend 2,5 mg/ml Puromycin, kultiviert).
  • Inhibierung von v-Src in NIH3T3-Fibroblasten: Nicht-transformierte NIH3T3-Zellen, WT-v-Src-transformierte NIH3T3-Zellen und I338G-v-Src-transformierte NIH3T3-Zellen wurden bei 37°C mit 1,1% DMSO oder 100 μM 3g in 1,1 % DMSO inkubiert. Nach 12 Stunden wurden die Zellen mit PBS gewaschen und lysiert (Lysepuffer: 1% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 7,4, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 100 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 2 mM Natriumorthovanadat, 10 ml/ml Leupeptin, 10 mg/ml Apoprotin). Das Lysat wurde durch Zentrifugierung bei 13000 U/min für 15 Minuten geklärt. Lysatproteinkonzentrationen wurden normiert und gleiche Volumina des Lysats wurden elektrophoretisch aufgelöst und auf den Phosphotyrosingehalt analysiert, wie vorstehend beschrieben.
  • Mikroskopie: Nicht-transformierte, WT-v-Src-transformierte und I338G-v-Src-transformierte NIH3T3-Fibroblasten wurden in DMEM/10% BCS auf behandelten Gewebekultur-Objektträgern gezüchtet. V-Src exprimierende Zellen wurden entweder mit 1,1% DMSO oder 100 μM 3g in 1,1% DMSO behandelt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit einer Vergrößerung von 400× in einem Nikon TMS Lichtmikroskop photographiert. Unmittelbar nach der Lichtmikroskopie wurden die Zellen für 20 min. in 3,7% Formaldehyd/PBS fixiert und für 60 s in 0,2% Triton X-100/PBS permeabilisiert. Die permeabilisierten Zellen wurden mit 200 ng/ml Phalloidin-FITC/PBS für 20 min. inkubiert. Die Objektträger wurden mit PBS gespült und polymerisiertes Actin wurde durch Fluoreszenzmikroskopie mit einer Vergrößerung von 600× in einem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop visualisiert.
  • ERGEBNISSE
  • Enzymkonstruktion: Ein funktional konservierter Rest in der ATP-Bindungstasche von v-Src (Ile 338) wurde entwickelt, der ohne Veränderung der Phosphoakzeptorspezifität oder der biologischen Funktion der Kinase zu Glycin mutiert werden konnte. Die Platz erzeugende Mutation verursacht nur einen mäßigen Abfall des kcat, eine mäßige Zunahme des KM für ATP und keine quantitativen Änderungen des Niveaus an Fibroblastentransformation (Shah J, unveröffentlichte Ergebnisse). Die biologischen Substrate der Mutante v-Src sind unverändert und I338G v-Src führt dieselben biologischen Funktionen aus wie v-Src vom Wildtyp. Alle Kristallstrukturen von ATP-gebundenen Proteinkinasen haben eine enge Kontaktwechselwirkung zwischen dem Rest entsprechend 338 (Src-Numerierung) und ATP gezeigt. Die Analyse der Proteinkinase-Sequenzanordnungen bestätigten, daß der Rest 338 eine voluminöse Seitenkette (gewöhnlich Thr, Ile, Leu, Met oder Phe) in allen bekannten eukaryotischen Proteinkinasen enthält. Somit sollte eine Glycinmutation in der 338-Position eine neue Tasche erzeugen, die in irgendeiner Kinase vom Wildtyp nicht vorhanden ist. Aufgrund der erweiterten ATP-Bindungsstelle sollten die Glycinmutantenkinasen voluminöse Inhibitoren annehmen, die Kinasen vom Wildtyp nicht binden könnten. Unter Verwendung von Standardverfahren wurde das Glutathion-S-Transferase-(GST) Fusionsprotein der Katalysatoren Domänen von WT und I338G v-Src geklont, exprimiert und gereinigt, wie vorher beschrieben. WT Fyn, T339G Fyn (Src-Numerierung) und WT Abl wurden auch als GST-Fusionsproteine exprimiert und gereinigt.
  • Inhibitorkonstruktion und -synthese: Zum Testen der grundlegenden Konstruktionsstrategie wurden die Domänen von WT und I338G v-Src SH1 gegen ein vorher synthetisiertes Feld von N-6-substituierten Adenosinmolekülen zur selektiven Inhibierung von I338G v-Src gegenüber WT v-Src. Da Adenosin nur ein mäßiger Inhibitor von src-Familien-Proteintyrosinkinasen ist, wurde nicht erwartet, einen potenten Inhibitor der konstruierten Kinase zu entdecken. Wie erwartet, inhibierten alle der N-6-Adenosinanaloge I338G v-Src potenter als WT v-Src. Der potenteste Inhibitor, der bei dieser Selektion gefunden wurde, war N-6-Cyclopentyloxyadenosin (1, 14A) mit einer Inhibierungskonzentration von 50% (IC50) von 1 mM für I338G v-Src. Anschließende Versuche zum Testen auf Selektivität demonstrierten, daß N-6-Cyclopentyloxyadenosin keine nachweisbare Inhibierung in vitro von WT v-Src oder Fyn bei Konzentrationen bis zu 400 mM zeigte. Diese erste Selektion ermutigte uns, die Strategie der Entwicklung von neuen Inhibitoren von I338G v-Src zu verfolgen, da die Konstruktion uns ermöglicht hatte, leicht Selektivitätsbarrieren zu überwinden, die bei der herkömmlichen Inhibitorentdeckung die Hauptprobleme sind.
  • Als Inhibitoren sind Adenosinanaloge aufgrund der vielen Zellenfunktionen, die von Adenosin durchgeführt werden, sowie der großen Anzahl an zellulären Proteinen, die Adenosin binden, nicht ideal. Es wurde gezeigt, daß N-6-Adenosinanaloge als Adenosinrezeptoragonisten und -antagonisten wirken, und man kann sich N-6-Adenosinanaloge vorstellen, die als Substrate für Nukleosidkinasen wirken. Aus diesen Gründen wurde eine Klasse von bekannten Proteintyrosinkinase-Inhibitoren, die nicht direkte analoge von biologisch bekannten Molekülen sind, verwendet. Die Konstruktionsstrategie verlangte eine Kernstruktur, die eine potente Inhibierung von mehreren Kinasen vom Wildtyp zeigt und leicht synthetisiert wird. Die Bindungsorientierung des Moleküls an der aktiven Enzymstelle muß auch bekannt oder leicht vorhersagbar sein. Außerdem muß das Molekül in einer Weise binden, in der die Stelle, die auf Ile338 weist, leicht modifiziert werden kann. Als Kerninhibitorstruktur wurde 4-Amino-1-tert-butyl-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (2, 14B) verwendet. Dieses Molekül ist ein Derivat von 4-Amino-1-tert-butyl-3-(p-methylphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (PP1), das von Hanke und Mitarbeitern als potenter src-Familien-Kinaseinhibitor berichtet wurde. Auf der Basis der Cokristallstruktur der src-Familien-Kinase HCk, gebunden an den allgemeinen Kinaseinhibitor, Quercetin (5, 15A), wurde postuliert, daß 2 an src-Familien-Kinasen in einer Konformation ähnlich zu jener von ATP bindet. Die vorhergesagte Bindungsorientierung von 2 in Hck ist in einer Überlagerung mit den bekannten Hck-Cokristallstrukturen von AMP PNP (6) und Quercetin (15B) gezeigt. In dieser Konformation entspricht die leicht derivatisierbare N-4-Position von 2 dem N-6 von ATP (enger Kontakt mit Rest 338, 15C). Und der tert-Butyl-Anteil entspricht grob dem Ribosering von ATP. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß in dieser Orientierung der C-3-Phenylring von 2 in einer Tasche binden könnte, die das N-7 von ATP umgibt, wie in der Hck/Quercetin-Cokristallstruktur zu sehen. Diese Analyse führt uns zur Synthese eines kleinen Feldes von N-4-derivatisierten Analogen von 2 (14).
  • Identifikation eines eindeutig selektiven Inhibitors: Das Feld von Pyrazolo[3,4-d]pyrimidinen wurde gegen WT- und I338G v-Src-Kinasen selektiert. Alle Analogen sind bessere Inhibitoren des konstruierten v-Src im Vergleich zum Wildtyp, was die Vorhersage der Bindungsorientierung von 2 an der aktiven Kinasestelle bestätigt. Irgendeine Derivatisierung von 2 in der N-4-Position zerstört die inhibitorische Aktivität gegen WT v-Src (keine nachweisbare Inhibierung bei der Löslichkeitsgrenze, 300 mM). Alle 10 Analogen demonstrierten eine meßbare Inhibierung von I338G v-Src und verschiedene der Verbindungen weisen IC50 im niedrigen mM-Bereich auf. Das N-4-(p-tert-Butyl)benzamido-1-tert-butyl-3-phenyl-Analogon (3g von 14) ist der potenteste Inhibitor von I338G v- Src in dem Feld (IC50 = 430 nm). Dieses Molekül zeigt keine Inhibierung von WT v-Src bei 300 mM, was darauf hindeutet, daß 3g zumindest ein 1000-fach besserer Inhibitor der Mutante v-Src im Vergleich zum Wildtyp ist. Die große Größe der Derivatisierung, die erforderlich ist, um eine submikromolare Leistungsfähigkeit für die aktive Stelle von I338G v-Src zu erreichen, war eher unerwartet. Nur vier Kohlenstoffatome wurden von der ATP-Bindungsstelle entfernt und derivatisierten das Muttermolekül mit elf Kohlenstoffatomen. Diese Diskrepanz kann an einer Unvollkommenheit der Bindungsvorhersage liegen. Die Mutation von Ile zu Gly kann auch der aktiven Enzymstelle eine größere Flexibilität verleihen, was ermöglicht, daß die Mutantenkinase eine größeres Inhibitoranalogon annimmt als vorhergesagt. Um zu bestätigen, daß 3g I338G v-Src an der ATP-Bindungsstelle inhibiert, wurde seine Kinetik der Inhibierung bei verschiedenen ATP-Konzentrationen untersucht. Lineweaver-Burk-Analyse bestätigte, daß 3g I338G v-Src kompetitiv bezüglich ATP mit einer Inhibierungskonstante (Ki) von ungefähr 400 nM inhibiert.
  • Das Feld der Inhibitoranaloge wurde als nächstes gegen WT Fyn selektiert, um ihr Potential zur Kreuzreaktion mit dieser Kinase zu untersuchen. WT Fyn wurde als Kontrolle des "schlimmsten Falls" von Kinasen vom Wildtyp gewählt, da das veröffentlichte Muttermolekül PP1 und 2 (14) sehr potente (niedriges nM) Fyn-Inhibitoren sind. Viele der 10 synthetischen Analoge zeigten keine hohe Selektivität für die Zielkinase. Die N-Acyl-Analogen mit gesättigten Ringsystemen (3a–3c, 14) inhibieren wirksam Fyn vom Wildtyp. Die N-Methylenverbindungen (4b, 4d, 4e, 14) sind ausreichend orthogonal zu WT Fyn, aber zeigen nur schlechte bis mäßige Inhibierung des konstruierten v-Src. Bedeutenderweise inhibierte 3g (14), der potenteste Inhibitor der Mutante v-Src, WT Fyn sehr schwach (IC50 = 300 mM). Somit inhibiert 3g das konstruierte v-Src über 700-mal wirksamer als WT Fyn, was wahrscheinlich die zelluläre Kinase vom Wildtyp ist, die am stärksten in der Lage ist, das Molekül zu binden. Andere getestete Nicht-src-Familien-Kinasen wurden durch 3g in vitro zufällig inhibiert.
  • Die Serin/Threonin-Kinasen PKCd und PKA wurden bei Konzentrationen von bis zu 300 mM nicht nachweisbar inhibiert. Ebenso zeigte 3g nur schwache Inhibierung (IC50 > 300 mM) der Abl-Proteintyrosinkinase. Daher erfüllte 3g alle anfänglichen Konstruktionsanforderungen für die potente selektive Inhibierung der einen konstruierten Kinase.
  • Selektivität in ganzen Zellen: Um weiter zu demonstrieren, daß 3g (14) Proteintyrosinkinasen vom Wildtyp nicht inhibiert, wurden die Effekte einer 3g-Behandlung auf die durch den B-Zellen-Rezeptor (BCR) vermittelte Phosphorylierungskaskade untersucht. Es ist bekannt, daß Proteintyrosinkinasen (Brk, Syk) der Src-Familie (Fyn, Lyn, Lck, Blk) und der Nicht-src-Familie bei BCR-Vernetzung aktiviert werden. Aufgrund der verstärkenden Art der durch BCR vermittelten Kaskade würde die Inhibierung von irgendeiner dieser Kinasen die Verteilung und Intensität von Postaktivierungs-Zellphosphotyrosin drastisch ändern. Da 3g so konstruiert wurde, daß es sterisch mit den aktiven Stellen von Kinasen vom Wildtyp inkompatibel ist, sollte es die von der Tyrosinphosphorylierung abhängige Signalisierung in B-Zellen vom Wildtyp nicht unterbrechen. Die Behandlung von 100 μm 3g mit Antigenrezeptor, der mit Mäuse-B-Zellen vernetzt ist, hat keine Wirkung auf das Phosphotyrosinmuster der B-Zellen-Stimulation. Die Signalintensitäten aller Hauptbänder sind unverändert und nur eine geringfügige Verarmung von gewissen unbedeutenden Bändern ist nachweisbar, was bestätigt, daß 3g nicht merklich das Feld von Proteintyrosinkinasen inhibiert, die durch BCR-Vernetzung aktiviert werden. Die Behandlung von B-Zellen mit 100 mM 2 verursacht jedoch eine signifikante Verringerung der Tyrosinphosphorylierung, die mit ihrer potenten Inhibierung von src-Familien-Kinasen vom Wildtyp konsistent ist.
  • Selektive Inhibierung von I338G v-Src in NIH3T3-Zellen: Um den selektiven Inhibitor zu verwenden, um einen durch Src vermittelten Weg zu untersuchen, wurde sowohl WT als auch I338G v-Src retroviral in NIH3T3-Fibroblasten eingeführt. Diese Zellen nehmen einen transformierten Phänotyp an, der von der v-Src-Expression abhängt. Es wurde gezeigt, daß 3g (14) selektiv den Src-abhängigen Signalumsetzungsweg von I338G v-Src-transformierten Zellen stören konnte, während WT-transformierte Zellen nicht beeinflußt wurden. Die Behandlung von mit WT v-Src infizierten Zellen (100 μM 3g) verursacht keinen Verlust der Tyrosinphosphorylierung im Vergleich zu den mit DMSO-behandelten Kontrollbahnen (16), was demonstriert, daß der konstruierte Inhibitor WT v-Src oder irgendwelche der anderen Proteintyrosinkinasen, die von durch v-Src vermittelte zelluläre Transformation aktiviert werden, nicht inhibiert. Eine äquivalente Behandlung von I338G v-Src-transformierten Zellen verursacht eine drastische Verminderung der Tyrosinphosphorylierung des mutmaßlichen v-Src-Substrats p36 sowie eine mäßige Gesamtverringerung des Zellenniveaus von Phosphotyrosin. Vorher wurde gezeigt, daß die Behandlung von v-Src-transformierten Zellen mit allgemeinen Proteintyrosinkinase-Inhibitoren eine Verringerung der Tyrosinphosphorylierung eines Proteins mit 36 Kohlendioxid verursacht. Es wird angenommen, daß p36 einer spezifischen Phosphotyrosinphosphatase zugeordnet ist, was möglicherweise seine schnelle Dephosphorylierung in mit Inhibitor behandelten Zellen erklärt. Das 3g IC50 für p 36 Phosphotyrosinsignal in I338G v-Src exprimierenden Zellen (50 mM) ist ungefähr 100-mal der Wert in vitro. Dies liegt wahrscheinlich an der Tatsache, daß der Inhibitor mit millimolaren Konzentrationen von ATP für die aktive Kinasestelle in den Zellenversuchen konkurrieren muß.
  • Selektive Inhibierung von I338G Mutante v-Src kehrt transformierte Zellenmorphologie um: V-Src-Aktivität ist für die Rous-Sarkomvirustransformation von Säugerzellen erforderlich. Die Behandlung der I338G v-Src exprimierenden NIH3T3-Zellen mit 100 μM 3g (14) verursachte drastische Änderungen in der Zellenmorphologie, die mit der Umkehr der Transformation konsistent sind (17). Die Mutantenzellen, die mit Inhibitor 3g behandelt wurden, erschienen flach und zeigten keine Wachstumseigenschaften von transformierten Zellen (d.h. die Fähigkeit, aufeinander zu wachsen). Unter identischen Bedingungen demonstrierten mit WT v-Src infizierte Zellen die prototypische abgerundete Morphologie und überlappenden Wachstumsmuster von transformierten Zellen.
  • Um die selektive Umkehr der Zellenmorphologie weiter zu demonstrieren, wurde Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um mit 3g behandelte Zellen nach dem Anfärben des zellulären polymerisierten Actins mit Phalloidin-FITC (17) zu betrachten. Nicht-transformierte NIH3T3-Zellen zeigen lange Aktinspindeln, die sich über den Zellen bilden. V-Src-transformierte Zellen (sowohl WT als auch I338G) erscheinen abgerundet ohne unterscheidbares Muster einer Actinbildung. In Übereinstimmung mit den Lichtmikroskopiedaten erscheinen mit Inhibitor behandelte WT v-Src exprimierende Zellen von unbehandelten WT-Zellen ununterscheidbar. Mit 3g behandelte I338G v-Src exprimierende Zellen haben jedoch polymerisierte Actinketten definiert, die stark den Actinformationen von nicht-transformierten NIH3T3-Fibroblasten ähneln. Diese mit Inhibitor behandelten Zellen weisen eine übertriebene abgeflachte Morphologie auf und zeigen eine periphere Actinfärbung, die in den nicht-transformierten NIH3T3-Zellen nicht vorliegt. Diese Daten zeigen, daß 3g eindeutig morphologische Änderungen in Zellen induzieren kann, die so konstruiert sind, daß sie eine einzelne Aminosäureänderung in der interessierenden Kinase enthalten. Dies ist die erste Demonstration, daß ein Inhibitor mit kleinem Molekül, der für ein Proteintyrosinkinase-Onkogenprodukt selektiv ist, die morphologischen Änderungen, die mit der Zellentransformation verbunden sind, umkehren kann. Es wurde kürzlich gezeigt, daß vorherige Beispiele der morphologischen Umkehr der Transformation durch Herbimycin A (und andere Benzochinonansamycine) über einen Mechanismus arbeiten, der mit der Kinaseinhibierung nicht in Zusammenhang steht, welcher aus einem durch Wärmeschockprotein (hps90) vermittelten Abzielung der onkogenen Proteintyrosinkinase auf das Proteasom besteht.
  • Verallgemeinerung auf andere Kinasen: Der Vorteil der Verwendung der Mutagenese zur Bereitstellung einer eindeutigen molekularen Differenz zwischen dem interessierenden Enzym und allen anderen besteht darin, daß aufgrund der konservierten Kinasefaltung die Methode über die Kinase-Superfamilie erweiterbar sein sollte. Fast alle bekannten Proteinkinasen enthalten eine voluminöse Seitenkette in der Position, die dem Rest 338 von v-Src entspricht. Daher sollte eine Platz erzeugende Mutation in dieser Position mehrere Kinasen für eine selektive Inhibierung zugänglich machen. Um dies zu testen, wurde die Inhibierung der Analogen gegen T339G Fyn gemessen. Es besteht eine verblüffende Ähnlichkeit in den Strukturaktivitätsbeziehungen der Analoge für I338G v-Src und T339G Fyn. In Übereinstimmung mit den Daten für I338G v-Src war 3g das potenteste Inhibitoranalog gegen T339G Fyn, der ein IC50 von 830 nM aufweist. Dies entspricht einer mehr als 300-fachen Selektivität für T339G Fyn gegenüber WT Fyn. Die Bedeutung dieser Daten besteht darin, daß mehrere Proteintyrosinkinasen systematisch konstruiert werden können, um bevorzugt ein Inhibitoranalogon anzunehmen, ohne den Bedarf, große Bibliotheken von mutmaßlichen Inhibitoren zu selektieren.
  • Das obige beschreibt eine neue Methode zur selektiven Proteinkinaseinhibierung durch die komplementäre Konstruktion von chemisch empfindlichen Kinasen und rational konstruierten Inhibitoren. Es wurde demonstriert, daß die hohe Selektivität für die Zielkinase in ganzen Zellen erreicht werden kann und daß die Inhibierung aktiver Stellen einer onkogenen Proteintyrosinkinase für die Unterbrechung einer transformierten Zellenmorphologie ausreichen kann. Da die Methode leicht verallgemeinert wird, sollte sie weitreichende Anwendungen bei der Entfaltung der Signalumsetzungswege sowie Gültigkeit von Kinasen als Ziele für die Arzneimittelkonstruktion haben. Der Schritt der wirksamen Arzneimittelentdeckung ist durch die Identifikation und Validierung von bedeutenden Arzneimittelzielen begrenzt. Dies ist kein triviales Problem in einer Umgebung von 2000 homologen Proteinen. Die Verwendung von chemisch empfindlichen Mutanten von Proteinkinasen erweitert die Fähigkeit, die zellulären und physiologischen Effekte der pharmakologischen Kinaseinhibierung zu testen. Da transfektierte Zellinien und auch "Einschalt"-Mäuse nun schnell erzeugt werden können, sollte die Methode den Fortschritt des Testens der Effekte der selektiven Inhibierung einer gegebenen Kinase in einer ganzen Zelle oder einem Tiermodell erheblich beschleunigen. Da mehr Inhibitor-gebundene Proteinkinase-Kristallstrukturen verfügbar werden, ermöglicht diese Strategie die systematische Untersuchung der Effekte der zeit- und dosisabhängigen Inhibierung von irgendeiner gegebenen Kinase im Umfang einer gesamten Signalumsetzungskaskade.
  • BEISPIEL 16
  • Erzeugung von mutantenspezifischen nanomolaren Proteintyrosinkinase-Inhibitoren über eine chemische genetische Methode
  • Auf der Basis der Versuche hierin hat die gerichtete Konstruktion von Kinase/Inhibitor-Paaren auf Strukturbasis mutantenspezifische zellenpermeable Inhibitoren von konstruierten Src-Familien-Kinasen mit Leistungsfähigkeiten ergeben, die mit herkömmlichen Inhibitorselektionsverfahren nicht erreichbar waren. Durch Mutieren der aktiven Stelle von v-Src wurde nicht nur eine Proteinkinase von allen anderen Differenziert, sondern gleichzeitig eine neu zugänglich Bindungsstelle zur Verwendung bei der Konstruktion von potenteren Inhibitoren erzeugt. Somit kann man sowohl die Leistungsfähigkeit als auch Selektivität im Vergleich zu herkömmlichen Inhibitorkonstruktiansstrategien erhöhen. Die Konstruktion ist stark verallgemeinerbar infolge der Konservierung von Kinasen an der Stelle entsprechend Ile338 in v-Src. Tatsächlich hat die neueste Arbeit gezeigt, daß die Empfindlichkeit von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPKs) gegen Pyridinylimidazol-Inhibitoren größtenteils durch die Seitenkette des Rests 106 gesteuert wird, der 338 von Src entspricht. Der Hauptvorteil der Methode für die Konstruktion von selektiven Kinaseinhibitoren für die Untersuchung der Proteinkinasefunktion ist die Fähigkeit, die interessierende Kinase für die eindeutige Inhibierung durch ein kleines Molekül genetisch zu "programmieren". Dies ermöglicht die eindeutige Zuordnung der Aktivität einer spezifischen Kinase zum induzierten Phänotyp. Die Kombination der Genmanipulation und der Steuerung der Enzymaktivität mit kleinen Molekülen sollte weitreichende Anwendungen bei der pharmakologischen Validierung von Proteinkinasen als wertvolle Arzneimittelziele in Zellen sowie ganzen Organismen haben.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Proteinexpression und -reinigung: Ortsgerichtete Mutagenese und Klonen der Gene für die Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine der katalytischen v-Src-Domäne vom Wildtyp, I338G v-Src SH1 und WT Fyn zu dem pGEX-KT-Plasmid wurden wie vorher beschrieben ausgeführt. Diese Kinasen wurden in DH5α E. Coli exprimiert und an immobilisierten Glutathionkügelchen (Sigma) gereinigt.
  • In Vitro Kinaseinhibierungsversuch: IC50 für mutmaßliche Kinaseinhibitoren wurden durch Messen der Zählwerte pro Minuten (cpm) von 32P, zu einem optimierten Peptidsubstrat für src-Familien-Kinasen überführt (IYGEFKKK (SEQ ID NR.: 12)), bestimmt. Verschiedene Konzentrationen an Inhibitor wurden mit 50 mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 1,6 mM Glutathion, 1 mg/ml BSA, 100 mM IYGEFKKK (SEQ ID NR.: 12), 3,3% DMSO, der entsprechenden Kinase und 11 nM (2 mCi) [γ-32P] ATP (6000 Ci/mMol, NEN) in einem Gesamtvolumen von 30 ml für 30 Minuten inkubiert. Reaktionsgemische (25 ml) wurden auf eine Phosphozellulosescheibe getüpfelt, die in 10% HOAc eingetaucht war, und mit 0,5% H3PO4 gewaschen. Die Überführung von 32P wurde durch Standardszintillationszählung gemessen. IC50 wurde als Konzentration an Inhibitor, bei der das cpm 50% der Kontrollscheibe war, definiert. Wenn das IC50 zwischen zwei gemessenen Konzentrationen abfiel, wurde es auf der Basis der Annahme einer invers proportionalen Beziehung zwischen der Inhibitorkonzentration und cpm zwischen den zwei Datenpunkten berechnet.
  • Chemische Synthese: Alle Ausgangsmaterialien und synthetischen Reagenzien wurden von kommerziellen Lieferanten erworben, wenn nicht anders angegeben. Säurechloride, die nicht leicht kommerziell erhältlich waren (3c, 3d, 3e, 3h, 3i) wurden durch Behandeln der entsprechenden Carbonsäuren mit überschüssigem Oxalylchlorid und katalytischem DMF in Diethylether synthetisiert. Alle PP1-Analoge wurden gemäß Hanefeld et al. synthetisiert.
  • 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(1-naphthyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6a, 18). Weißes Pulver; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) d 1,92 (s, 9H), 5,04 (m, 2H), 7,43–7,73 (m, 4H), 7,92–8,02 (m, 3H), 8,34 (s, 1H); HRMS (EI) Molekularion berechnet für C19H19N5 317,16427, gefunden 317,16247.
  • 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(2'-naphthyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6b, 18). Weißes Pulver; 1H NMR (270 MHz, CDCl3 d 1,88 (s, 9H), 5,55 (m, 2H), 7,56–8,00 (m, 6H), 8,16 (s, 1H), 8,39 (s, 1H); HRMS (EI) Molekularion berechnet für C19H19N5 317,16427, gefunden 317,16359.
  • 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(m-phenoxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6c, 18). Weißes Pulver; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) d 1,83 (s, 9H), 5,61 (m, 2H), 7,08–7,49 (m, 9H), 8,35 (s, 1H), HRMS (EI) Molekularion berechnet für C21H21N5 359,17483, gefunden 359,17325.
  • 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(m-benzyloxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6d, 18). Weißes Pulver; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) d 1,85 (s, 9H), 5,17 (s, 2H), 5,55 (m, 2H), 5,74 (s, 2H), 7,10 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,27–7,48 (m, 8H), 8,34 (s, 1H), HRMS (EI) Molekularion berechnet für C22H23N5O 373,19049, gefunden 373,18833.
  • 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(m-(2',6'-dichlor)benzyloxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6e, 18). Weißes Pulver; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) d 1,85 (s, 9H), 5,36 (m, 2H), 5,74 (s, 2H), 7,11–7,51 (m, 7H), 8,36 (s, 1H), HRMS (EI) Molekularion berechnet für C11H21Cl2N5O 441,11263, gefunden 441,11050.
  • 4-Amino-l-(tert-butyl)-3-piperonylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6f, 18). Weißes Pulver; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) d 1,83 (s, 9H), 5,70 (m, 2H), 6,05 (s, 2H), 6,96 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,13–7,27 (m, 2H), 8,34 (s, 1H), HRMS (EI) Molekularion berechnet für C16H17N5O2 311,13841, gefunden 311,13777.
  • 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(p-tert-butylphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6g, 18). Weißes Pulver; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 1,38 (s, 9H), 1,84 (m, 9H), 5,83 (s, 2H), 7,58 (dd, J = 8 Hz, 12 Hz, 4H), 8,33 (s, 1H), HRMS (EI) Molekularion berechnet für C19H25N5 323,21125, gefunden 323,21024.
  • 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(1'-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6h, 18). Weißes Pulver 1H NMR (270 MHz, CDCl3) d 1,85 (s, 9H), 4,76 (s, 2H), 5,04 (s, 2H), 7,19 (d, J = 6 Hz, 1H), 7,39 (t, J = 8 Hz, 1H), 7,55 (t, J = 4 Hz, 2H), 7,79–7,92 (m, 2H), 8,20 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,24 (s, 1H); HRMS (EI) Molekularion berechnet für C20H21N5 331,17993, gefunden 331,17951.
  • 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-(1'-naphthoxymethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (6i, 18). Beiges Pulver 1H NMR (270 MHz, CDCl3) d 1,83 (s, 9H), 5,57 (m, 2H), 6,12 (s, 2H), 7,07 (d, J = 6 Hz, 1H), 7,39–7,54 (m, 4H), 7,84 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,25 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,35 (s, 1H); HRMS (EI) Molekularion berechnet für C20H21N5O gefunden 347,17483, gefunden 347,17408.
  • ERGEBNISSE
  • Inhibitorkonstruktion und -modellierung: Anfänglich wurde das exozyklische N4-Amin des Src-Familien-Kinaseinhibitors 4-Amino-1-(tert-butyl)-3-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (1, 19) als chemischer Haken verwendet, an den voluminöse Gruppen gebunden werden konnten, um die Affinität des Moleküls für Kinasen vom Wildtyp zu zerstören (1 ist ein des-Methyl-modifiziertes Analogon von PP1, berichtet von Hanke et al.). Obwohl diese Methode einen sehr selektiven Inhibitor (2, 19) der konstruierten v-Src-Kinase (I338G v-Src) ergab, war er nicht vollständig zufriedenstellend, da mehr als eine Größenordnung an Bindungsenergie von der Ausgangsaffinität des Muttermoleküls für Src-Familien-Kinasen vom Wildtyp verloren ging (siehe 19).
  • Um die Leistungsfähigkeit der Inhibitoren zu steigern, wurde die Bindung von 1 an der aktiven Stelle der Src-Familien-Kinase Hck modelliert. Unter Verwendung des Molekülgraphikprogramms GRASP wurde das Protein mit der Oberflächenkarte der ATP-Bindungstasche von Hck mit der entsprechenden vorhergesagten Karte der erweiterten Tasche in der konstruierte Proteinkinase T338G Hck verglichen. Aus diesem Modell wurde abgeleitet, daß die Derivatisierung von N4 nicht das einzige Mittel zum Erzeugen von Komplementären Van-der-Waals-Wechselwirkungen mit der eindeutigen Bindungstasche von I338G v-Src war. Aus der Oberflächenkarte war zu sehen, daß die Derivatisierung des c3-Phenylrings von 1 (Bsp.: Phenylring gegen Naphthylringsystem ausgetauscht, Verbindung 6a) mit einer voluminösen Gruppe zu einer sterischen Kollision zwischen dem derivatisierten Inhibitor und der durch Thr338 erzeugten Moleküloberfläche führt. Die Mutation des Rests 338 zu Glycin erzeugt eine eindeutige Bindungstasche, die als groß genug vorhergesagt wird, um das Naphthylanalogon von 1 anzunehmen. Die Derivatisierung dieser Phenylgruppe mit hydrophoben Substituenten liefert Verbindungen, die die entsprechende aktive Stelle von I338G v-Src ergänzen, ohne irgendwelche potentiellen Wasserstoffbindungswechselwirkungen bei N4 zu unterbrechen. Außerdem verursacht diese hinzugefügte Masse am C3-Anteil, daß diese Moleküle mit den aktiven Stellen von Proteintyrosinkinasen vom Wildtyp sterisch inkompatibel sind, was eine hohe Spezifität für das geeignet konstruierte v-Src liefert.
  • Inhibitorsynthese und -selektion: Ein kleines Feld von C3-derivatisierten PP1-Analogen (6a–6i) wurde wie in 18 gezeigt synthetisiert. Die Gruppe von modifizierten Inhibitoren wurde gegen die katalytische Domäne der Zielkinase I338G v-Src selektiert, die in Bakterien exprimiert wurde, und als Glutathion-S-Transferase- (GST) Fusionsprotein gereinigt. Alle der C3-derivatisierten Analoge sind potentere Inhibitoren von I338G v-Src als das potenteste Molekül (2, IC50 = 430 nM), das aus dem ersten Generationsfeld von N4-derivatisierten Verbindungen identifiziert wurde (siehe Tabelle 3). Vier der Moleküle (6a, 6b, 6d, 6h) inhibieren die Zielkinase bei niedrigen nM-Konzentrationen, wobei die zwei Naphthylisomere (6a, 6b) die größte Leistungsfähigkeit (IC50 = 1,5 nM) aufweisen. Unter den Bedingungen des Versuchs inhibierte das Muttermolekül PP1 sein optimales Ziel Fyn mit nur IC50 = 30 nM). Dieses Datenelement zeigt, daß eine Inhibitorkonstruktionsstrategie, die Enzymkonstruktion mit gerichteter Synthese von kleinen Molekülen nicht nur die Leistungsfähigkeit von Molekülen, die durch Selektion von großen Bibliotheken identifiziert werden, anpassen kann, sondern auch zu einer signifikanten Zunahme (20-fach im Fall von 6a, 6b) der Affinität gegenüber vorher optimierten Inhibitoren von Kinasen vom Wildtyp führen kann. Verbindungen mit der Formel 6a und 6b sind die potentesten Inhibitoren von irgendeiner Src-Familien-Proteintyrosinkinase, die bis jetzt berichtet wurden.
  • Tabelle 3 50% Inhibierungskonzentrationen (IC50) von C3-derivatisierten PP1-Analogen für konstruierte und Wildtyp-Src-Familien-Proteintyrosinkinasen
    Figure 01020001
  • Figure 01030001
  • Bedeutenderweise zeigen alle neun Moleküle eine verblüffende Selektivität für I338G v-Src bezüglich des Wildtypenzyms. Die Selektivitäten in vitro reichen von 120 für die Piperonylverbindung (6f) bis zu nicht weniger als >6500 für das Naphthoxymethyl-Derivat (6i). Dieser Bereich ist ähnlich zu den Selektivitäten, die durch Derivatisierung von N4 erzeugt werden, was weiter sowohl die Vorhersage der Bindungsorientierung für den Mutterinhibitor als auch die Modellierung der erweiterten Bindungsstelle von I338G v-Src für gültig erklärt. Diese Selektivitäten schneiden gegenüber jenen von anderen Strategien, die Proteinkonstruktion mit der Erkennung kleiner Moleküle kombinieren, sowie Strategien, die Selektionsverfahren verwenden, um enge Bindungsproteine von großen Reservoirs von Mutanten zu identifizieren, gut ab.
  • Um die Selektivität für die Zielkinase weiter zu bestätigen, wurde das Feld gegen Fyn vom Wildtyp selektiert (Tabelle 3). Dies ist vermutlich eine strengere Steuerinhibierung von v-Src vom Wildtyp, da Fyn durch PP1 potenter inhibiert wird. Drei der vier potentesten Inhibitoren (6a, 6d, 6h, 18) zeigten ausreichend Selektivität für die Zielkinase (100-fach) bezüglich Fyn vom Wildtyp. Der potenteste Inhibitor von I338G v-Src, 6a, bindet Fyn vom Wildtyp mit 600 nM, was eine 400-fache Selektivität für das gewünschte Ziel darstellt.
  • Zelluläre Inhibierung der Zielkinase: Zwei Zellkultursysteme wurden verwendet, um den Nutzen der Verbindung 6a als spezifischen Kinaseinhibitor im Zusammenhang mit einer ganzen Zelle zu untersuchen. Zuerst wurden NIH3T3- Fibroblasten-Zellinien, die entweder Wildtyp- oder I338G v-Src exprimieren, durch retrovirale Infektion erzeugt. Da v-Src eine hochaktivierte, onkogene Proteintyrosinkinase ist, ist die Mehrheit der Tyrosinphosphorylierung in diesen Zellen ein Ergebnis der v-Src-Expression. Um die selektive Inhibierung des konstruierten v-Src zu untersuchen, wurden sowohl Wildtyp als auch I338G v-Src exprimierende Zellen mit variierenden Konzentrationen von 6a inkubiert. Anti-Phosphotyrosin-Blots von Lysaten, die von diesen Zellen abgeleitet wurden, demonstrieren, daß 6a die Tyrosinphosphorylierung in einer konzentrationsabhängigen Weise innerhalb Minuten stark vermindert (20, Bahnen 3–8). In Übereinstimmung mit den Leistungsfähigkeiten in vitro ist die Abnahme des Phosphotyrosinsignals von 6a viel schneller und vollständiger als jene, die durch das potenteste N4-derivatisierte Analogon in derselben Zellinie verursacht wird. Wildtyp-v-Src exprimierende Zellen in Gegenwart von 500 nM 6a zeigen keinen Verlust des Phosphotyrosinsignals (Bahnen 1 und 2) und können in Gegenwart der Verbindung für Tage ohne Verlust der Tyrosinphosphorylierung oder eine scheinbare Zytotoxizität gezüchtet werden.
  • Um die Selektivität von 6a weiter zu bestätigen, wurden Jurkat-Zellen (eine vom Menschen abgeleitete T-Zellinie ohne konstruierte Kinasen) mit dem allgemeinen Proteintyrosinphosphatase-Inhibitor, Pervanadat, behandelt, der kovalent an ein katalytisch wesentliches Cystein an der aktiven Stelle von Phosphotyrosinphosphatasen bindet. Die Anwesenheit von Pervanadat verschiebt effektiv das Zellengleichgewicht von Phosphotyrosin, was eine große Zunahme der Tyrosinphosphorylierung verursacht (siehe 20, vergleiche Bahn 10 mit Bahn 9). Wenn diese Zellen mit 500 nM 6a (Bahn 11) behandelt werden, ist keine nachweisbare Abnahme der Phosphorylierung vorhanden, was darauf hindeutet, daß keine der Proteintyrosinkinasen vom Wildtyp in Jurkat-Zellen durch den konstruierten Inhibitor scheinbar inhibiert wird. PP1 wurde als positive Kontrolle für die Inhibierung von Kinasen vom Wildtyp bei 10 μM (Bahn 12) verwendet, die Konzentration, bei der vorher gezeigt wurde, daß sie durch T-Zellenrezeptoren vermittelte Tyrosinphosphorylierung stark unterdrückt.
  • Selektive Unterbrechung der Zellentransformation: Die schnelle Erzeugung von hochselektiven Kinaseinhibitoren sollte weitreichende Anwendungen bei der pharmakologischen Validierung von Proteinkinasen als brauchbare Arzneimittelziele haben. Um diese Idee zu testen, wurde untersucht, ob die Verbindung 6a (18) selektiv die onkogene Transformation in Zellen, die die Zielkinase exprimierten, unterbrechen konnte oder nicht. Normale NIH3T3-Fibroblasten weisen lange Fasern aus polymerisiertem Actin über den Zellen auf, die durch Anfärben der Zellen mit Phalloidin, konjugiert an Rhodamin, visualisiert werden können (21A). Zellen, die ein onkogenes Protein (entweder Wildtyp oder I338G v-Src) exprimieren, sind abgerundet und weisen daher ein diffuses Muster von Actin auf (21B). v-Src exprimierende Zellen vom Wildtyp, die mit 6a behandelt werden, erscheinen von unbehandelten Zellen vom Wildtyp ununterscheidbar, was darauf hindeutet, daß 6a keine Wirkung auf diese Nicht-Mutanten-Zellinie aufweist. Zellen, die die Zielkinase exprimieren, weisen jedoch klare Actinfasern auf und erscheinen von normalen NIN3T3-Fibroblasten ununterscheidbar, wenn sie mit 250 nM 6a für 16 Stunden inkubiert werden. Aus diesen Daten ist klar, daß die Inhibierung der katalytischen Aktivität von v-Src mit kleinen Molekülen ausreicht, um seine Rolle bei der Onkogenese zu blockieren.
  • Beispiel 17
  • Entwicklung des allgemeinen chemischen Schalters zum Abzielen irgendeiner Proteinkinase der Wahl auf die spezifische Inhibierung
  • In den obigen Beispielen wurden Src-Familien-Proteintyrosinkinasen so konstruiert, daß sie ein eindeutige Bindungstasche enthalten, die in irgendeiner Proteinkinase vom Wildtyp nicht vorhanden ist. Diese Mutanten sind eindeutig empfindlich gegen ein Derivat des selektiven Src-Familien-Inhibitors PP1 (10, 28) (85–87), das modifiziert wurde, um die Erweiterung der aktiven Stelle der Mutante zu ergänzen. Alle bis jetzt identifizierten Proteinkinasen besitzen das Merkmal der konservierten aktiven Stelle, das durch diese Methode ausgenutzt wird (88). Da jedoch das PP1-Gerüst für Src-Familien-Kinasen selektiv ist, würde es vermutlich nicht eine umfangreich verallgemeinerbare Strategie zum Inhibieren von Kinasen über die Superfamilie bereitstellen (nicht die ideale Mutterverbindung für breite Anwendungen über divergente Kinasefamilien sein) (85). Daher ist es erwünscht, einen allgemeinen chemischen Schalter auf der Basis eines vermischteren Kinaseinhibitors zu entwickeln, der verwendet werden könnte, um schnell irgendeine Proteinkinase der Wahl auf die spezifische Inhibierung abzuzielen.
  • Indolocarbazol-Naturprodukt (+)K252a und Mutantenkinasen: Um die Kinase/Inhibitor-Schnittstelle neu zu konstruieren, wurde das Indolocarbazol-Naturprodukt (+)K252a (1, 22A) ausgewählt. Das Produkt erfüllt drei wichtige Konstruktionskriterien: 1) 1 inhibiert viele verschiedenen Familien von Proteinkinasen; 2) die Bindungsorientierung von 1 ist leicht vorhersagbar; 3) rational derivatisierte Analoge von 1 sind synthetisch zugänglich. K252a ist ein sehr altgemeiner Proteinkinaseinhibitor, von dem vorhergesagt wurde, daß er aktive Kinasestellen in einer Orientierung bindet, die zu jener der eng verwandten Verbindung Staurosporin (2, 22A) identisch ist. Es wurde berichtet, daß K252a ein potenter (IC50 ≤ 30 nM) Inhibitor von Proteinkinase C, Proteinkinase A, cGMP-abhängiger Proteinkinase, Mysinlichtkettenkinase und Trk-Familien-Tyrosinkinasen ist (89, 90). Dieses Beispiel zeigt, daß dasselbe Molekül Src-Familien-Kinasen, cyclinabhängige Kinasen und calmodulinabhängige Kinasen effizient inhibieren kann (27). Die Strukturen von 2 (22A), die an Proteinkinase A (91), cyclinabhängige Kinase 2 (CDK2) (92) und Lck (93) gebunden sind, wurden kürzlich gelöst, was die Konstruktion auf Strukturbasis ermöglicht, um die eindeutige Empfindlichkeit gegen die Indolocarbazolklasse von Kinaseinhibitoren zu konstruieren (22B).
  • Wie in den obigen Beispielen gezeigt, war die Mutation von I338 an Glycin ausreichend, um einem PP1-Derivat die eindeutige Inhibitorempfindlichkeit zu verleihen. Der entsprechende Rest in CDK2 ist F80, der nahe (3,7 Å) C(7) (K252a-Numerierung) von 2 (22A) in der Kristallstruktur von CDK2, gebunden an Staurosporin (22B) liegt (92). Somit wurde erwartet, daß die Entwicklung von eindeutigen auf Indolocarbazol basierenden Inhibitoren unserer sensibilisierten Kinasen eine selektive Manipulation von C(7) entweder in 1 oder 2 erfordern würde (22A). Um diese Hypothese zu erforschen, eine Gesamtsynthese und die kürzlich entwickelte Methode, die die modulare Anordnung von 1 (22A) ermöglicht, sowie Derivate von 1, die stereospezifisch an C(7) modifiziert sind (94, 95).
  • Ein kleines Feld von C(7)-substituierten K252a-Derivaten wurden synthetisiert. Vorausgesetzt, daß F80 von CDK2 nicht mit dem Indolocarbazolring (22B) koplanar ist, wurde erwartet, daß Synthesen unter Verwendung von S-(L)-Aminosäuren K252a-Derivate ergeben würden, die die Platz erzeugende Mutation von F80 zu Glycin oder Alanin am besten ergänzen würden. Zusätzlich zu den S(C7)-Analogen wurde R-C(7)-Benzyl(+)-K252a (6, 27) hergestellt, von dem auf der Basis der Bindungsmodusvorhersage angenommen wurde, daß es konstruierte Proteinkinasen weniger potent inhibiert als das entsprechende S-Diastereomer (27).
  • Die unmittelbar vorstehend beschriebenen K252a-Analoge wurden auf Inhibierung gegen ein Feld von Proteinkinasen selektiert, das sowohl aus Tyrosin. als auch Serin/Threonin-Kinasen bestand. Die Inhibierung in vitro von mindestens einer Proteinkinase von vier verschiedenen und physiologisch bedeutenden Unterfamilien (26A; Src-Familie (v-Src, Fyn) (96, 97), Abl-Familie (c-Able) (98), Ca2+/Calmodulin-abhängige Familie (CAMK IIa) (99) und Cyclin-abhängige Familie (CDK2) (100). Die Aminosäure entsprechend 338 von v-Src wurde zu einem kleinen Rest (Glycin oder Alanin) für alle der obigen Proteinkinasen mutiert (24B, für c-Abl war die T315G-Mutante instabil (101)), um die folgenden inhibitorempfindlichen Kinasen zu erzeugen; I338G v-Src, T339G Fyn, T315A Abl, F89G CAMK IIα und F80G CDK2. Kinasen, die gegen K252a empfindlich sind, und eine, die dies nicht ist (c-Abl), wurden ausgewählt, um beide Klassen von Zielkinasen darzustellen (27).
  • Die K252a-Analoge wurden gegen die Wildtyp- und konstruierten Proteinkinasen auf die Inhibierung der Phosphorylierung eines exogenen Substrats in vitro selektiert. Wie vorhergesagt, waren alle der C(7)-substituierten K252a-Derivate viel weniger effizient als 1 (22A) bei der Inhibierung des Feldes von Proteinkinasen vom Wildtyp (27). Von den fünf Kinasen vom Wildtyp ist CAMK IIα die am meisten zugängliche für die Inhibierung durch die K252a-Derivate, was nicht überraschend ist, da sie auch gegen K252a selbst die am meisten empfindliche ist. Für jede der Kinasen nahmen die IC50-Werte der K252a-Analoge in Gegenwart der Mutation ab, was unsere Vorhersage der Bindungsorientierung von 1 bestätigte. Ein derivatisierter Partner für jede der Mutantenkinasen wurde derart gefunden, daß die Bindung sich entweder der Affinität des Wildtyp-Kinase/1-Paars näherte oder diese überstieg. Verblüffenderweise band das 2-Methyl-propyl-Analogon (4, 27) an die konstruierten Src-Familien-Kinasen (v-src und c-Fyn) mit subnanomolaren IC50-Werten (230 pM bzw. 550 pM) ungefähr zwei Größenordnungen geringer als die Werte für 1 gegen dieselben Kinasen vom Wildtyp. Diese Werte stellen die potenteste Inhibierung für irgendeine bis jetzt berichtete Src-Familien-Kinase dar. Potente (IC50 < 50 nM) und selektive (≥ 15-fach im Vergleich zu allen Kinasen vom Wildtyp in dem Feld) Übereinstimmungen wurden für alle Mutantenkinasen außer für c-Abl gefunden. Abl ist die einzige Proteinkinase vom Wildtyp in dem Feld, die durch K252a nicht wirksam inhibiert wird, was darauf hindeutet, daß die Empfindlichkeit gegen 1 eine vorhersagende Bestimmungsgröße dafür ist, ob andere Kinasen (nicht in 26) für die Inhibierung durch K252a-Analoge gut geeignet wären oder nicht.
  • Anfänglich war es unklar, ob die schwache Inhibierung von T315A c-Abl an der β-Methylgruppe der Alaninseitenkette oder an der intrinsischen Unempfindlichkeit von c-Abl gegen die Inhibierung durch 1 (22A) lag. Um die Wirkung der β-Methylgruppe direkter zu testen, prüften wir eine andere Kinase mit einer Ala-Substitution. Wir maßen die Inhibierung der zwei potentesten I338G v-Src-Inhibitoren 4 und 7 (27) gegen I338A v-Src. Die Alaninmutante von v-Src weist IC50-Werte von 0,024 bzw. 0,43 μM für diese Verbindungen auf, die ungefähr 100mal größer sind als die Werte für I338G. Die Inhibierungswerte unterscheiden sich jedoch zwischen I338G v-Src und T315A c-Abl um mehr als 10000-fach, was impliziert, daß c-Abl durch Analoge von 1 intrinsisch weniger inhibierbar ist.
  • Verallgemeinerter Inhibitor, der in der Lage ist, irgendeine geeignet mutierte Kinase zu inhibieren: Bei einer Anstrengung, einen besser verallgemeinerbaren Inhibitor zu entwickeln, der irgendeine geeignet mutierte Kinase inhibieren könnte, wurde ein Feld von Wildtyp- und Mutantenkinasen gegen eine Gruppe von C(3)-Phenyl-modifizierten PP1-Analogen getestet. Obwohl PP1 Src-Familien-selektiv ist, wurde gefolgert, daß die Mutation der 338-Position (v-Src) in eine kleine Aminosäure anderen Kinasen eine eindeutige PP1-Analog-Empfindlichkeit verleihen kann, da gezeigt wurde, daß diese Aminosäure weitgehend für die Selektivität von PP1 selbst verantwortlich ist. Aus diesem Feld von Inhibitoren war entweder C(3)-1'-Naphthyl PP1 (9, 28) oder C(3)-1'-Naphthylmethyl PP1 (11, 28) der potenteste Inhibitor von jeder getesteten konstruierten Kinase. Die Analyse der PP1-Analogon-Inhibierungsdaten in 28 decken einige verblüftende Trends auf. PP1 ergab Analoge mit breiterem Nutzen im Zusammenhang mit den konstruierten Kinase/Inhibitor-Paaren. Jede der fünf Zielkinasen wurde durch PP1-Analoge bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen mit Zielspezifitäten im Bereich von 85- bis 400-fach inhibiert (gemessen gegen die am besten inhibierbare Kinase vom Wildtyp). Es besteht wenig oder keine Korrelation zwischen dem Wildtyp-PP1-IC50 und der PP1-Analogon-Empfindlichkeit derselben (konstruierten) Kinase. Dies ist bei den Ser/Thr-Kinasen CDK2 und CMK IIα am stärksten ersichtlich. Diese Enzyme vom Wildtyp besitzen beide schwache PP1 IC50 von mehr als 15 μ. Die konstruierten Versionen dieser Kinasen werden jedoch durch das PP1-Analogon sehr potent inhibiert (11; 5,0 nM bzw. 8,0 nM). Diese Dichotomie liegt höchstwahrscheinlich an einer Kombination der Bedeutung des Rests 338 bei der Bestimmung der PP1-Empfindlichkeit einer gegebenen Proteinkinase (86) und der Affinität des Naphthylrings für die erweiterte aktive Kinasestelle. Die IC50 für 11 für alle Glycinmutanten lagen innerhalb eines 3-fachen Bereichs (alle < 10 nM) zueinander, obwohl ihre Wildtyp-PP1-Empfindlichkeiten um mehr als 400-fach variieren. Bedeutenderweise werden keine der getesteten Kinasen vom Wildtyp bei Konzentrationen von weniger als 1 μM 11 inhibiert, was die hohe Zielselektivität dieser Verbindung demonstriert.
  • Die PP1-Analoge 10 und 11 (28) sind für verschiedene Platz erzeugenden Mutationen auf der Basis ihrer Größe und Flexibilität selektiv. Das starrere C(3)-1'Naphthyl PP1 (10) zeigt einen breiteren Bereich an Leistungsfähigkeit zwischen verschiedenen Kinaseglycinmutanten (28). Es inhibiert jedoch potent T315A c-Abl (7,0 nM) mit hoher Spezifität, was den ersten Mutanteninhibitor dieser Proteintyrosinkinase ergibt (102). Um festzustellen, ob 10 im allgemeinen verwendet werden könnte, um Proteinkinasen zu inhibieren die zu Alanin in der 338-Position mutiert sind, testeten wir seine Leistungsfähigkeit gegen I338A v-src. 10 inhibiert die Alaninmutante v-Src (IC50 = 1,0 nM) noch stärker als es die entsprechende Glycinmutante inhibiert, was darauf hindeutet, daß dieses Molekül ein allgemeines Schema für die Entwicklung von Mutanteninhibitoren für Proteinkinasen bereitstellt, deren Aktivität durch die Glycinmutation signifikant gefährdet wird (101).
  • Beispiel 18
  • PP1-Analogon-empfindliche Kinaseallele
  • Anschließend wurde die obige Strategie untersucht, um festzustellen, ob sie verwendet werden konnte, um "PP1-Analogon-empfindliche" (as) Kinaseallele mit Nutzen in vivo zu erzeugen. Wir haben diese Nomenklatur gewählt, da dieselben Mutantenkinasen verwendet werden können, um die direkten zellulären Substrate jeder Kinase unter Verwendung von orthogonalen ATP-Analogen zu identifizieren, die dazu ausgelegt sind, die "as"-Mutation zu ergänzen (154, 155).
  • Es wurde gezeigt, daß C(3)-derivatisierte PP1-Analoge für die zielspezifische Inhibierung von retroviral exprimiertem v-src in Mäusefibroblasten verwendet werden kann. Es ist jedoch interessanter, die Mutanteninhibierung von endogenen Kinasegenprodukten in einem Organismus zu demonstrieren, die einen breiten Nutzen bei herkömmlichen genetischen Selektionen hat. Die Sproßhefe Saccharomyces cerevisiae wird aufgrund ihrer Zugänglichkeit für Genmanipulation und ihres schnellen Wachstums umfangreich als einzelliger Modellorganismus in Genuntersuchungen verwendet (103). Das S. Cerevisiae Genom codiert ungefähr 120 Proteinkinasen, einschließlich Homologen von Proteinen von vielen Säugerkinasefamilien (104}. Die cyclinabhängige Hefekinase Cdc28 wurde als Anfangsziel für die Inhibierung in vivo gewählt. Dieses Enzym ist das Haupt-CDK in Sproßhefe und ist für die Zellenlebensfähigkeit bei START und die Mitose in dem S. Cerevisiae Zellzyklus wesentlich (105). Cdc28 ist zu 62% identisch zum menschlichen CDK2, was darauf hindeutet, daß das konstruierte F88G Cdc28, CDC28-as1 für eine Inhibierung durch C(3)-derivatisierte PP1-Analoge zugänglich sein sollte. Wildtyp-Cdc28 und Cdc28-as1 wurden exprimiert und die Empfindlichkeit der zwei Kinasen gegen PP1-Derivate in vitro wurde untersucht. Wie bei CDK2 ist 11 (28) ein sehr potenter Inhibitor des konstruierten Cdc28 (IC50 = 3,9 nM), aber es inhibiert das Protein vom Wildtyp nicht (IC50 = > 50 μM). Es wurde auch festgestellt, daß das Wachstum von Hefe, die Cdc28-as1 exprimiert, bei Konzentrationen von 11 vollständig gesenkt wurde, das keine Wirkung auf das Wachstum von Stämmen vom Wildtyp hatte. Aufgrund der Tatsache, daß sich diese Zellinien nur um eine Aminosäureseitenkette in einem Protein unterscheiden, ist diese selektive Zellenzyklusunterbrechung eindeutig zielspezifisch. Überdies ist die Fähigkeit von 11, die Hefezellwand leicht zu durchqueren, unüblich und vermeidet den Bedarf, äußerst hohe Konzentrationen des Inhibitors während Versuchen zuzugeben.
  • Um festzustellen, ob diese Strategie auf die Identifikation von analogen empfindlichen Allelen von anderen Familien von Proteinkinasen erweitert werden könnte, ohne jedes Enzym in vitro individuell zu reinigen und zu testen, wurde die Saccharomyces cerevisiae MAP Kinase, Fus3, die für die Induktion von induzierbaren Pheromongenen, den Zellenzyklushalt und die Zellenfusion während der Paarung erforderlich ist, ausgewählt (106). In Gegenwart von Paarungsfaktorpheromonen phosphoryliert Fus3 Far1 und Ste12. Diese Phosphorylierungsereignisse sind für den G1-Zellenzyklushalt und die Transkription von Genen, die für die Paarung erforderlich sind, erforderlich (107, 108). Keine temperaturempfindlichen (ts) Allele von Fus3 wurden isoliert, möglicherweise aufgrund der Temperaturempfindlichkeit des Paarungsprozesses (109).
  • Um ein analoges empfindliches Allel von fus3 zu erzeugen, wurde Glutamin 93 (entsprechend I338 in v-Src) zu Glycin mutiert (D93G Fus 3, Fus-as1) und dieses Enzym wurde in Sproßhefe exprimiert, der Fus3 vom Wildtyp fehlt. Die fus3-as1-Mutante ergänzte die Gendeletion vollständig, wie durch die Paarung von gleichen Zahlen von haploiden Wildtyp- oder fus3-as1-Zellen (URA3 his3) mit einem Stamm fus1Δfus2Δura3 HIS3 gezeigt, gefolgt von Auswahl nach diploider Nachkommenschaft an Medien, denen Uracil und Histidin fehlt (23). Fus3 und Fus3-as1 exprimierende Stämme ergaben beide ungefähr 7,5 × 104 Kolonie bildende Einheiten (cfu)/ml, während die Paarung eines fus3Δ-Stamms nur 0–100 cfu/ml unter denselben Auswahlbedingungen ergab. Wenn die Paarung eines fus3-as1-Stamms in Gegenwart von 50 μM 10 (28) ausgeführt wurde, war die Menge an gebildeten Diploiden von einem fus3Δ-Stamm ununterscheidbar (23B–23C). Selbst bei 500 nM 10 ergab der fus3-as1-Stamm nur 1,7 × 103 cfu/ml, eine 44-fache Abnahme gegenüber äquivalenten Kontrollzellen (23C). Aufgrund der Konkurrenz mit millimolaren Mengen von ATP in der Hefezelle impliziert diese starke Inhibierung bei 500 nM 10 ein IC50 in vitro für Fus3-as1 im niedrigen nanomolaren Bereich. 11 (28) unterbrach auch die durch Fus3-as1 vermittelte Paarung, aber mit weniger Leistungsfähigkeit (85-fache Verringerung bei 50 μM). Im Gegensatz dazu wurde keine Abnahme der Paarungseffizient beobachtet, wenn fus3 exprimierende Zellen vom Wildtyp mit 10 oder 11 behandelt wurden (0,6–1,1 × 105) cfu/ml bei allen Konzentrationen bis zu 50 μM, 23C). Daher stellt fus3-as1 das erste konditionelle Allel des MAPK, fus3, dar. Durch die Zugabe von 10 in vivo kann die Aktivität des fus3-Genprodukts selektiv, schnell und in einer dosisabhängigen Weise gesteuert werden.
  • Die hier beschriebenen analogen empfindlichen Allele halten eine Anzahl von Vorteilen gegenüber herkömmlichen ts-Allelen. Sie unterliegen einer stöchiometrischen und zeitlichen Steuerung. Die Zugabe eines eindeutig spezifischen Inhibitors sollte die Stabilität des Enzymziels oder seiner Protein-Protein-Wechselwirkungen nicht unterbrechen. Gegen den Inhibitor sensibilisierte Stämme können für Gene erzeugt werden, die in Zellenprozessen wirken, die von Natur aus temperaturempfindlich sind (Actinzytoskelettumordnung, Paarung usw.) (109, 110). Außerdem kann die Proteinkinaseaktivität spezifisch gesteuert werden, ohne die nicht-spezifischen Transkriptionseffekte zu verursachen, die durch Wärmeschock induziert werden (111).
  • Beispiel 19
  • Cdc28-Mutantenkinase-empfindliche zellenpermeable Inhibitoren
  • VERFAHREN
  • Reinigung von Cdc28-Hiss, Cdc28-as1-Hiss, MBP-Clb2: Lysat wurde aus Insektenzellen hergestellt, die mit Baculoviren coinfiziert wurden, die Cdc28-His6 oder Cdc28-as1-His6 und Cak1-HA3 codieren (151). Cdc28-His6 und Cdc28-as1-His6 wurden durch Metallaffinitätschromatographie gereinigt, wie beschrieben (152), gefolgt von Anionenaustausch (Pharmacia SP Sepharose Fast Flow) und Kationenaustausch (Pharmacia Q Sepharose Fast Flow). MBP-Clb2 wurde aus Lysaten von Bakterien, die MBP-Clb2 (ein Geschenk von R. Deshaies) exprimieren, an einer Amylosesäule (NEBL) gereinigt, gefolgt von Anionenaustausch-Chromatographie (Pharmacia Q Sepharose Fast Flow).
  • Gereinigtes Cdc28-His6 (1 nM Endkonzentration) und MBP-Clb2 (3 nM Endkonzentration wurden für 10 min. bei 23°C in einem 25 μl Reaktionsgemisch inkubiert, das 5 μg Histone H1, 1 μCi γ-32P-ATP (1 μCi/10 μM und 1 μCi/1 mM) und verschiedene Konzentrationen an 1-NM-PP1 in Kinasepuffer (41) enthielt. Die Reaktionsprodukte wurden durch 15% SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie, analysiert. Der Phosphateinschluß wurde bei jeder Inhibitorkonzentration durch Szintillationszählung bestimmt. Die Inhibitorkonzentration als Funktion des Phosphateinschlusses wurde aufgetragen und die 1-NM-PP1-Konzentration, bei der der Phosphateinschluß 50% von jenem der Kontrolle ohne Inhibitor war, wurde als IC50 angegeben.
  • Hefeplasmid und Stammkonstruktion: Medien und genetische und mikrobielle Verfahren waren im wesentlichen wie beschrieben (148, 153). Alle Stämme waren Derivate von W30-3 (ura3-a, leu2-3, 112, trpl-1, his3-11,15 ade2-I, can1-100, Gal+). Alle Stämme wurden bei 23°C gezüchtet, wenn nicht anders angegeben. Um cdc28-as1 zu erzeugen, wurde die CDC28 codierende Sequenz und 400 bp von 5'- und 386 bp von 3'-flankierender DNA von genomischer DNA PCR-erweitert und in pRS306 ligiert, um pJAU1 herzustellen. Die F88G-Mutation wurde durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese von pJAU1 konstruiert. Das Plasmid wurde in den Wildtyp-CDC28-Genort nach dem AfIII-Abbau durch eine Eingabe-Ausgabe-Strategie integriert, wie beschrieben (148, 153).
  • Cdc28 und Cdc28-as1 ATP-Kinetik: Gereinigtes Cdc28-His6 (1 nM Endkonzentration) und MBP-Clb2 (3 nM Endkonzentration) wurden für 10 min. bei 23°C in einem 25 μl Reaktionsgemisch inkubiert, das 5 μg Histone H1 und verschiedene Konzentrationen von γ-32P-ATP in Kinasepuffer (25 mM Hepes-NaOH, pH 7,4, 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2 und 1 mM Dithiothreitol (DTT)) enthielt. Die Reaktionsprodukte wurden durch 15% SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie, analysiert. Der Phosphateinschluß wurde bei jeder ATP-Konzentration durch Szintillationszählung bestimmt. Eadie-Hofstee-Diagramme wurden dann verwendet, um Km und kcat zu berechnen.
  • 1-NM-PP1 IC50-Werte: Gereinigtes Cdc28-His6 (1 nM Endkonzentration) und MBP-Clb2 (3 nM Endkonzentration) wurden für 10 min. bei 23°C in einem 25 μl Reaktionsgemisch inkubiert, das 5 μg Histone H1, 1 μCi γ-32P-ATP (1 μCi/10 μM und 1 μCi/1 mM) und verschiedene Konzentrationen von 1-NM-PP1 in Kinasepuffer enthielt.
  • Gereinigtes Cdc28-His6 (1 nM Endkonzentration) und MBP-Clb2 (3 nM Endkonzentration) wurden für 10 min. bei 23°C in einem 25 μl Reaktionsgemisch inkubiert, das 5 μg Histone H1 und verschiedene Konzentrationen von γ-32P-ATP in Kinasepuffer (25 mM Hepes-NaOH, pH 7,4, 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2 und 1 mM Dithiothreitol (DTT)) enthielt. Die Reaktionsprodukte wurden durch 15% SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie, analysiert. Der Phosphateinschluß wurde bei jeder ATP-Konzentration durch Szintillationszählung bestimmt. Eadie-Hofstee-Diagramme wurden dann verwendet, um Km und kcat zu berechnen.
  • Die Reaktionsprodukte wurden durch 15% SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie, analysiert. Der Phosphateinschluß wurde bei jeder Inhibitorkonzentration durch Szintillationszählung bestimmt. Die Inhibitorkonzentration als Funktion des Phosphateinschlusses wurde aufgetragen und die 1-NM-PP1-Konzentration, bei der der Phosphateinschluß 50% von jenem der Kontrolle ohne Inhibitor war, wurde als IC50 angegeben.
  • DNA-Durchflußzytometrie: Ungefähr 1 × 107 Zellen für jede Probe wurden in 70% Ethanol fixiert, in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, resuspendiert, kurz beschallt, mit 2 mg/ml RNase für 2 Stunden bei 37°C abgebaut und in 0,2 ml Proteaselösung (5 mg/ml Pepsin, 0,5% konzentrierte HCl) resuspendiert und 45 Minuten bei 37°C abgebaut. Die DNA wurde mit 1 μM Sytox-Grün (Molekularsonden) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, angefärbt und 20000 Zellen von jeder Probe wurden mit einem FACScan FACS-Gerät (Becton-Dickinson) abgetastet.
  • ERGEBNISSE
  • Cdc28-His6 und Cdc28-as-1-His6 wurden von Sf9-Insektenzellen exprimiert und gereinigt. Sie bildeten aktive Komplexe mit gereinigtem MBP-Clb2 von Bakterien. Lysat wurde aus Insektenzellen hergestellt, die mit Baculoviren coinfiziert waren, die Cdc28-His6 oder Cdc28-as1-His6 und Cak1-HA3 codierten (48). Cdc28-His6 und Cdc28-as1-His6 wurden durch Metallaffinitäts-Chromatographie gereinigt, wie beschrieben (49), gefolgt von Anionenaustausch (Pharmacia SP Sepharose Fast Flow) und Kationenaustausch (Pharmacia Q Sepharose Fast Flow). MBP-Clb2 wurde aus Lysaten von Bakterien, die MBP-Clb2 (ein Geschenk von R. Deshaies) exprimierten, an einer Amylosesäule (NEBL), gefolgt von Anionenaustausch-Chromatographie (Pharmacia Q Sepharose Fast Flow), gereinigt.
  • Relativ zu Wildtyp-Cdc28, zeigte Cdc28-as1 eine mäßige Verringerung der Aktivität, einschließlich einer 10-fachen Verringerung der Bindungsaffinität für ATP und einer 6-fachen Verringerung der maximalen ATP-Umsatzrate (Tabelle 4). Bedeutender war Cdc28-asi ausgezeichnet empfindlich gegen den Inhibitor 1-NM-PP1. In Gegenwart von 1 mM ATP, was sich grob der intrazellulären ATP- Konzentration annähert, war Cdc28-as1 etwa 15000-mal empfindlicher gegen 1-NM-PP1 als Cdc28 vom Wildtyp (IC50 ≈ 3 nM für Cdc28-as1 und 44000 nM für Cdc28). Somit führt der einzige Austausch eines Glycins gegen ein Phenylalanin zu einer Cdc28-Mutante, die sowohl hohe Affinität als auch Spezifität für 1-NM-PP1 zeigt.
  • Um die Funktion von Cdc28 in vivo zu untersuchen, wurde ein Hefestamm, in dem die Kopie vom Wildtyp von CDC28 gegen cdc28-as1 ausgetauscht wurde, konstruiert. Medien und genetische und mikrobielle Verfahren waren im wesentlichen wie beschrieben (148, 153). Alle Stämme waren Derivate von W303 (ura3-1, leu2-3, 112, trpl-1, his3-11,15 ade2-1, canl-100, GAL+). Alle Stämme wurden bei 23°C gezüchtet, wenn nicht anders angegeben. Um cdc28-as1 zu erzeugen, wurde die CDC28 codierende Sequenz und 400 bp von 5'- und 386 bp von 3'-flankierender DNA von genomischer DNA PCR-erweitert und in pRS306 ligiert, um pJAU1 herzustellen. Die F88G-Mutation wurde durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese von pJAU1 konstruiert. Das Plasmid wurde in den Wildtyp-CDC28-Genort nach dem AfII-Abbau durch eine Eingabe-Ausgabe-Strategie integriert, wie beschrieben (148, 153).
  • Bei Abwesenheit von 1-NM-PP1 zeigten cdc28-as1-Zellen normale Lebensfähigkeit und normales Wachstum auf Platten, obwohl sie hyperpolarisiert und größer waren als ein isogener CDC28-Stamm, und hatten eine 20% längere Verdopplungszeit in einer flüssigen Kultur. Eine Durchflußzytometeranalyse von asynchron teilenden Zellen deckte auf, daß die cdc28-as1- und CDC28-Stämme ähnliche DNA-Gehaltsprofile zeigten. Schließlich wurden synthetische Oligonukleotid-DNA-Anordnungen verwendet, um genomweite Transkriptionsunterschiede zwischen asynchronen Wildtyp- und cdc28-as1-Zellen zu messen (127).
  • Änderungen wurden als signifikant erachtet, wenn sie größer als oder gleich 2-fach waren oder wenn das Transkript den vorhandenen/abwesenden Zustand änderte (wie durch Affymetrix-Software angegeben) in den folgenden Vergleichen: für nicht-spezifische Arzneimitteleffekte: CDC28 + 1-NM-PP1 gegen CDC28; für cdc28-as1-Effekte: cdc28-as1 gegen CDC28. Für spezifische Cdc28-Inhibierungseftekte wurden Änderungen als signifikant erachtet, wenn sie größer als oder gleich 2,5-fach für cdc28-as1 1-NM-PP1 gegen cdc28-as1 waren UND eine Änderung von mehr als oder gleich 2,0-fach für cdc28-as1 1-NM-PP1 gegen CDC28 + 1-NM-PP1.
  • In zwei separaten Experimenten wurden größere als zweifache Änderungen in nur elf Transkripten (0,2% des Genoms) beobachtet. Größere als 2-fache Differenzen wurden in der Expression der folgenden Gene in einem Vergleich von Wildtyp- und cdc28-as1-Zellen beobachtet: Experiment 1: LEU2, YDL241W, YFL057C, YHR071W, CBP1 YJR130C, CWP1, YLL060c; ATR1 YML128C, YMR095C, YMR096W, YNL275W, YNR065C, ARG1, YOL101C, SPS4, SSU1, SVS1, OYE3, RLF2 und YPR203W, TWT1, YHR209W, YIL011W, YIL023C, DAL4, YKL218C, YLL060C, YL0108C, YLR237W, YLR437C, YML071C, ATR1, YMR095C, YMR096W, YNR065C, ARG1, YOR302W, SPS4, YPL088W, SVS1, YPR013C, CTR1.
  • Es wurde verdächtigt, daß der geringe Wachstumseffekt in cdc28-as1-Zellen an dem 6-mal niedrigeren kcat des Mutantenenzyms liegt, was zu einer 6-mal niedrigeren Aktivität bei den hohen ATP-Konzentrationen in vivo führen würde (die niedrigere ATP-Bindungsaffinität der Mutante sollte in vivo nicht relevant sein, wobei die ATP-Konzentration viel größer ist als Km). Somit ist cdc28-as1 ein geringfügig geschwächtes Allel von CDC28, das trotzdem den Zellenzyklusfortschritt unterstützen kann.
  • Als nächstes wurden die Effekte des Inhibitors 1-NM-PP1 auf das Zellenwachstum und die Morphologie analysiert. Die Proliferation von Zellen vom Wildtyp war durch den Inhibitor unbeeinflußt, außer bei sehr hohen Konzentrationen (50000 nM), wenn die Verdopplungszeiten etwa 2-fach zunahmen. Eine DNA-Mikroanordnungsanalyse deckte auf, daß die Transkription von nur 6 Genen (0,1%) um mehr als zweifach nach 30 Minuten Behandlung von Zellen vom Wildtyp mit 500 nM 1-NM-PP1 geändert wurde.
  • Von den sechs Transkripten, die sich in Zellen vom Wildtyp nach 30 Minuten Inhibitorbehandlung änderten, weisen drei keine bekannte Funktion auf (YGR035C, YLR346C, YPL222W) und die anderen haben Rollen beim Wärmeschock (SSA4), bei der osmotischen Spannungsreaktion (GRE2) und bei der Arzneimittelresistenz (YOR1). Die Transkription von nur einem dieser Gene (YGR035C) ist Zellzyklus-reguliert (150). Die Behandlung von Zellen vom Wildtyp mit Inhibitor für 120 Minuten führte zu Änderungen in nur 3 Genen (YGR035C und zwei Genen, die Ribosomproteine codieren: RPS26A und RPL26B).
  • Die Behandlung von Zellen für 120 Minuten verursachte noch weniger Transkriptionsreaktionen: größere als zweifache Änderungen wurden für nur drei Transkripte gesehen. Interessanterweise wurde keine signifikante Aktivierung von auf Spannung reagierenden Transkripten beobachtet, was mit dem Vorschlag konsistent war, daß viele Arzneimittel-empfindliche Mechanismen vielmehr auf die Funktion als die Anwesenheit des Arzneimittels reagieren (122). Daher wurde gefolgert, daß 500 nM 1-NM-PP1-Behandlung keine signifikanten Wirkungen auf die Physiologie von Zellen vom Wildtyp hat, was darauf hindeutet, daß sie eine Kinase vom Wildtyp oder ein anderes Enzym in Hefe nicht inhibiert oder stimuliert.
  • Die einzige Aminosäureänderung in der Cdc28-as1-Kinase macht sie gegen den Inhibitor 1-NM-PP1 in vivo übermäßig empfindlich. Das Wachstum des cdc28-as1-Stamms wurde bei 50 bis 100 nM Inhibitor zu 50% inhibiert; der vollständige Wachstumsstop trat oberhalb 500 nM auf. Die enge Übereinstimmung zwischen dem IC50 in vivo und jenen, die in Kinaseversuchen gemessen wurden (Tabelle 4) stellt die Wirksamkeit dar, mit der 1-NM-PP1 in eine Hefezelle eindringen kann, ein Merkmal, das von anderen CDK-Inhibitoren mit kleinem Molekül nicht gezeigt wird (122).
  • Tabelle 4 Vergleich der Aktivität von Cdc28 und Cdc28-as1 in Gegenwart eines Inhibitors
    Figure 01190001
  • Cdc28-as1 ist gegen 1-NM-PP1 in vitro sehr empfindlich und ist eine geringfügig abgeschwächte Kinase. Aktive Cyclin-Cdk-Komplexe wurden durch die Zugabe von überschüssigem MPB-Clb2 zu gereinigtem Cdc28-Hiss oder Cdc28-as1-His6 gebildet und ihre Fähigkeit, Histone H1 bei verschiedenen ATP-Konzentrationen zu phosphorylieren, wurde gemessen, um Km- und kcat-Werte zu erzeugen. Um IC50, die Inhibitorkonzentration, bei der die Kinase zu 50% inhibiert wird, zu bestimmen, maßen wir die Kinaseaktivität von Cdc28-MBP-Clb2 oder Cdc28-as1-MBP-Clb2 in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von 1-NM-PP1 bei zwei verschiedenen ATP-Konzentrationen.
  • Eine detaillierte Analyse des DNA-Gehalts und der Morphologie von cdc28-as1-Zellen deckte auf, daß niedrigere Konzentrationen von 1-NM-PP1 eine Verzögerung (50 nM) oder einen Stopp (500 nM) mit einem G2/M-DNA-Gehalt und großen hyperpolarisierten Sprossen verursachten. Höhere Inhibitorkonzentrationen (5000 nM) verursachten einen ungleichmäßigen Stopp, der G1-Zellen ohne Sprossen sowie G2/M-Zellen mit großen Sprossen umfaßte; die Sprossenhyperpolarisation war nicht mehr ersichtlich. Somit scheint es möglich, das Niveau der Cdc28-as1-Aktivität in vivo zu titrieren, was die Identifikation von Zellenzyklusereignissen ermöglicht, die gegen Abnahmen der katalytischen Aktivität von Cdc28 unterschiedlich empfindlich sind.
  • Wenn cdc28-as1-Zellen in G1 mit dem Hefepaarungspheromon, α-Faktor, synchronisiert wurden und dann in frische Medien freigesetzt wurden, die 500 nM 1-NM-PP1 enthielten, wurde die Einleitung der Sproßbildung und der DNA-Synthese um etwa 30 bis 60 Minuten verzögert, während die Ansammlung des mitotischen Cyclins Clb2 um 60 bis 90 Minuten verzögert wurde. Die Zellen fuhren bis zum Stopp mit mäßigen Clb2-Niveaus, stark hyperpolarisierten Sprossen und einem G2/M-DNA-Gehalt genau wie bei dem in asynchronen Zellen beobachteten Stopp fort. Eine Mikroskopanalyse von Mikrotubulen und DNA deckte auf, daß diesen Zellen eine mitotische Spindel fehlte und mit einer einzigen DNA-Masse stoppten, die korrekt am Sprossenhals angeordnet war. Somit werden mit niedrigen Konzentrationen an Inhibitor behandelte Zellen während des Fortschritts durch die frühen Stufen des Zellzyklus geringfügig verzögert, stoppen jedoch schließlich aufgrund des Mißlingens, eine mitotische Spindel anzuordnen und in die Mitose einzutreten.
  • Wenn GI-synchronisierte cdc28-as1-Zellen in Medien freigesetzt wurden, die 5000 nM 1-NM-PP1 enthielten, stoppten sie mit einem IC-DNA-Gehalt und anfänglich mißlang ihnen die Sproßbildung, was auf einen Stopp beim START hindeutet. Diese Zellen sprossen schließlich nach 180 bis 240 Minuten und stoppten mit einem 1C-DNA-Gehalt, großen hyperpolarisierten Sprossen, einer einzigen DNA-Masse in der Mutterzelle und einer Interphasen-Astralmikrotubulusanordnung.
  • Pho85, ein Cdk, das eng mit Cdc28 verwandt ist, wurde bei der Einleitung der Sproßbildung in S. cerevisiae impliziert (128, 129). Daher wurde die Sproßbildung, die in cdc28-as1-Zellen, die in 5000 nM 1-NM-PP1 freigesetzt wurden, aufgrund von restlicher Cdc28-as1-Aktivität oder aufgrund von Pho85-Aktivität beobachtet urde, untersucht. Ein cdc28-as1-Stamm, dem PCL1 und PCL2 fehlte, die die zwei Gi-aktivierenden Cycline von Pho85 codieren, wurde konstruiert. Wenn diese Zellen in G1 synchronisiert wurden und in 5000 nM 1-NM-PP1 freigesetzt wurden, stoppten sie mit 1 C-DNA-Gehalt und sprossen niemals, selbst nach 6 Stunden. Es wurde gefolgert, daß mit Pc11- und Pc12 verbundene Pho85-Aktivität und nicht die restliche Cdc28-Aktivität für die stark verzögerte Sproßbildung verantwortlich sind, die in cdc28-as1-Zellen, die mit hohen Konzentrationen an Inhibitor behandelt wurden, beobachtet wird.
  • Um den Zellenzyklusstopp, der durch die Inhibitorbehandlung verursacht wird, weiter zu charakterisieren, wurde eine genomweite Transkription nach der Behandlung von asynchronen cdc28-asl-Zellen mit 500 nM 1-NM-PP1 analysiert (25A–25D). Zwei Stunden Behandlung verursachten 2,5-fache oder größere Änderungen in der Transkription von 104 Genen (66 Abnahmen, 38 Zunahmen) (25B und 25C). Von den herabregulierten Transkripten sind 60 zellenzyklusreguliert und 32 weisen eine Spitzenexpression bei G2/M auf. Diese herabregulierte G2/M-Teilmenge enthält einen breiten Bereich von gut begründeten Mitoseregulatoren, einschließlich CLB2, SW15, CDC20 und CDC5. Verringerte Niveaus des CLB2-Transkripts sind mit der Verzögerung der Clb2-Akkumulation nach dem Lösen aus dem GI-Stopp konsistent. Die herabregulierte G21M-Teilmenge umfaßte auch 11 Transkripte mit unbekannter Funktion, diese Transkripte können G2IM-Regulatoren unter einer Transkriptionssteuerung durch Cdc28 codieren. 30 Minuten Behandlung mit I-NM-PP1 erzeugen einen ähnlichen G2/M-Transkriptionsblock (37 der 42 herabregulierten Gene sind zellenzyklusreguliert und 57% dieser weisen bei G2/M eine Spitze auf) (130).
  • Zwei Stunden Arzneimittelaussetzung erhöhte auch die Expression von 38 Transkripten über 2,5-fach (10 zellenzyklusreguliert) (25A–25D). Alle bis auf eines dieser zellenzyklusregulierten Transkripte werden mit Spitzenpegeln in G1 exprimiert. Diese Gruppe umfaßt Gene, die GI-Cycline (CIn2 und Pcl I) codieren. Dieses Ergebnis in Kombination mit der Beobachtung, daß der Cln-Cdc28-Inhibitor Far1 20-fach herabreguliert wurde, deutet darauf hin, daß eine verlängerte Cdc28-Inhibierung und G2/M-Stopp zu einem Transkriptionsprogramm führt, das die Aktivität von GI-Cyclin-Cdk-Komplexen verstärkt.
  • Um allgemeine Trends in der Transkriptionsreaktion auf die Cdc28-Inhibierung zu bewerten, wurden mittlere Änderungen in der Expression aller Gene von jeder der Hauptzellenzyklus-Genanhäufungen berechnet (25D). Diese Analyse bestätigte, daß die Inhibitorbehandlung von cd28-as1-Zellen hauptsächlich zu einer verringerten Expression von Genen führte, die normalerweise in den G2/M- und M/G1-Stufen des Zellenzyklus exprimiert werden.
  • Zusätzlich dazu, daß es für den Eintritt in die Mitose erforderlich ist, ist von Cdk1 auch bekannt, daß es den Austritt aus der Mitose steuert (131, 132). Die Cdk1-Aktivität inhibiert den Fortschritt von der Anaphase zu G1 und daher ist eine Cdk1-Inaktivierung (hauptsächlich durch Cyclinproteolyse) für den Austritt aus der Mitose erforderlich. Außerdem inhibiert Cdk1 seine eigene Inaktivierung bei der späten Mitose durch Phosphorylierung und inaktivierende Komponenten des die Anaphase fördernden Komplexes (APC), der Cycline für die Zerstörung abzielt (133, 134). Wenn Zellen bei der Mitose mit dem Mikrotubulusgift Nocodazol angehalten werden, können die Cyclinzerstörung und der Austritt aus der Mitose durch Überexpression des Cdk-Inhibierungsproteins Sic1 ausgelöst werden (135). Konsistent mit diesen Ergebnissen wurde festgestellt, daß eine Behandlung mit 500 nM I-NM-PP1 zu einer schnellen (< 60 min.) Cyclinzerstörung und erneuten Sproßbildung von cdcM-asl-Zellen, die bei der späten Mitose mit der cdc15-2-Mutation angehalten wurden, führt (136).
  • Obwohl Cdks den Fortschritt von der Anaphase zu G1 inhibieren, scheinen sie auch die APC-Aktivität und die Schwesterchromatidentrennung beim Übergang von der Metaphase zur Anaphase zu fördern (131, 132, 137). Der genetische Beweis deutet beispielsweise darauf hin, daß bestimmte schwache Allele von CDC28, einschließlich cdcM-asl, unbedeutende Defekte im Fortschritt durch die Anaphase zeigen (137); außerdem weist die ts-Mutante von CDC28 (cdc28-IN) einen Metaphasenstopp bei der einschränkenden Temperatur auf (138). Die Versuchsbedingungen, bei denen die Inhibitorbehandlung einen Metaphasenstopp in cdc28-as1-Zellen verursacht, wurden nicht bestimmt, vermutlich, da niedrige Inhibitorkonzentrationen entweder den Eintritt in die Mitose verhindern oder einen vorzeitigen Austritt aus der Mitose auslösen. Ferner kann der Metaphasenstopp in cdc28-IN-Zellen nicht an einer allgemeinen Abnahme der Kinaseaktivität liegen, sondern könnte statt dessen an einem begrenzten Defekt in der Aktivität zu Substraten liegen, die am Fortschritt von der Metaphase zur Anaphase beteiligt sind.
  • Beispiel 20
  • Erzeugung von mutantenspezifischen Inhibitoren von Lipidkinasen – Phosphatidylinositol-3-phosphatkinase (PI-3K) Alpha (α)
  • Eine Familie von Proteinkinasen, die Inositoltriphosphate in Zellen phosphorylieren, wird Phosphatidylinositol-3-phosphatkinasen (PI-3K's) genannt. Diese Proteine verwenden ATP als Phosphodonorsubstrat. Sie sind Schlüsselregulatoren der Zellensignalisierung, die bei Krebs wichtig ist.
  • Auf der Basis von vorherigen Beispielen wurden Reste in Proteinkinasen, die verändert werden können, um das Binden von Inhibitormolekülen zu ermöglichen, die keine Kinasen vom Wildtyp inhibieren, identifiziert. Unter Verwendung der vorher beschriebenen Verfahren wird eine Proteinsequenzanordnung zwischen Proteinkinasen und PI-3Kγ erzeugt. Auf der Basis der Strukturähnlichkeit zwischen PI-3Kγ und PI-3Kα und der Sequenzanordnung von Proteinkinasen und PI-3K's wird vorgeschlagen, daß der Rest I848 in PI-3Kα dem Rest I338 in v-Src entspricht. Daher erzeugt die Mutation von I848 zu Ala oder Gly die Mutante I848A PI-3-Kα oder I848G PI-3-Kα, von der erwartet wird, daß sie gegen die hierin offenbarten Inhibitoren empfindlich ist.
  • Beispiel 21
  • Erzeugung von mutantenspezifischen Inhibitoren von Aminoglycosidkinasen
  • Eine weitere Familie von Enzymen, die durch die vorher beschriebenen Verfahren konstruiert werden kann, sind die bakteriellen Kinasen, die Aminoglycosid-Antibiotika wie z.B. Kanamycin phosphorylieren. Ein Beispiel einer Aminoglycosidkinase ist APH(III-a').
  • Gemäß den vorher beschriebenen Verfahren wird eine Sequenzanordnung zwischen APH(III-a') und v-Src erzeugt. Diese Anordnung basiert auch auf der Kristallstruktur von APH(III-a'). Auf der Basis der Sequenzanordnung wird vorgeschlagen, daß der Methioninrest 90 in APH(III-a') I338 in v-Src entspricht. M90 in APH(III-a') wird zu Alanin und Glycin mutiert, um die Mutante M90A APH(III-a') oder M90G APH(III-a') zu erzeugen, von der erwartet wird, daß sie gegen die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung empfindlich ist.
  • Die vorangehende detaillierte Beschreibung wurde nur für die Klarheit des Verständnisses gegeben und aus dieser sollten keine unnötigen Begrenzungen verstanden werden, da Modifikationen für Fachleute offensichtlich sind.
  • BEZUGSQUELLEN
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Claims (19)

  1. Proteinkinaseinhibitor, der durch die folgende Formel I dargestellt ist:
    Figure 01330001
    wobei R 1'-Naphthyl; 2'-Naphthyl; m-Phenoxphenyl; m-Benzyloxyphenyl; m(2',6'-Dichlor)benzyloxphenyl; 3-Piperonyl; 1'-Naphthylmethyl; 1'-Naphthoxymethyl; oder 2'-Naphthylmethyl darstellt.
  2. Proteinkinaseinhibitor nach Anspruch 1, wobei R 1'-Naphthyl darstellt. 3. Proteinkinaseinhibitor nach Anspruch 1, wobei R 2'-Naphthyl darstellt.
  3. Proteinkinaseinhibitor nach Anspruch 1, wobei R 1'-Naphthylmethyl darstellt.
  4. Proteinkinaseinhibitor nach Anspruch 1, wobei R 2'-Naphthylmethyl darstellt.
  5. Zusammensetzung mit dem Proteinkinaseinhibitor nach einem der Ansprüche 1–5.
  6. Verfahren zum Inhibieren der Phosphorylierung eines Substrats einer Mutantenproteinkinase in vitro, umfassend das Inkubieren eines Proteinkinaseinhibitors nach Anspruch 1 mit einem die Proteinkinase und ihr Substrat enthaltenden Gemisch.
  7. Verfahren zum Inhibieren der katalytischen Aktivität einer Mutantenproteinkinase in vitro, umfassend das Inkubieren der Mutantenproteinkinase mit einem Inhibitor nach Anspruch 1.
  8. Verfahren zum Inhibieren des Wachstums einer Zelle, die eine Mutantenproteinkinase exprimiert, in vitro, umfassend das Inkubieren der Zelle mit einem Proteinkinaseinhibitor nach Anspruch 1.
  9. Verfahren zum Unterbrechen der Transformation in einer Zelle, die eine Mutantenproteinkinase exprimiert, in vitro, umfassend in Kontakt bringen der Zelle mit dem Proteinkinaseinhibitor nach Anspruch 1.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7–10, wobei die Mutantenproteinkinase eine Mutantenproteinkinase der Src-Familie ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Mutantenproteinkinase eine Mutante v-Src oder eine Mutante Fyn ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Mutante v-Src I338G v-Src ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Mutante Fyn T339G ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7–10, wobei die Mutantenproteinkinase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mutante c-Abl, Mutante CAMK IIa, Mutante CDK2, Mutante Cdc28 und Mutante Fus3 besteht.
  15. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Mutante c-Abl T315A Abl ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Mutante CAMK IIa F89G CAMK IIa ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Mutante CDK2 F80G CDK2 ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Mutante Cdc28 Cdc28-as1 ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Mutante Fus3 Fus-as1 ist.
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