JP2003526608A

JP2003526608A - 再分布及び／又は標的化での干渉によって得られる特異的治療の介入

Info

Publication number: JP2003526608A
Application number: JP2000576864A
Authority: JP
Inventors: アルクハンマー，ペル，オー．，ジー．; テリー，ベルナード，ロバート; スカッダー，カート，マーシャル; ビョーン，サラ，ペターゼン; サストラップ，オレ
Original assignee: バイオイメージエイ／エス
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2003-09-09
Also published as: EP1146888A2; AU6189999A; WO2000023091A3; WO2000023091A2; CA2346937A1

Abstract

(57)【要約】この出願は、新規な作用メカニズム、つまりcGMP又はcAMPを切断する能力を有するI-カッパ-キナーゼ又はサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ(PDE)の特異的な効果のモジュレーションを記載する。作用の好ましい様式は、細胞内の固定部位からのPDE4、PDE5又はI-カッパ-キナーゼの特異的なイソ型又はスプライス変異型の再分布での標的又は干渉の転位、崩壊であり、それにより、それらの酵素能力ではなく、それらの特異的な有効性をモジュレートする。化学物は、PDE4、PDE5又はI-カッパ-キナーゼの特異的な有効性をモジュレートすることによって減少又は破壊され得る有害な症状の危機にある動物、好ましくはヒトにおいて予防又は治療するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の要約この出願は、細胞における標的化又は局在の調節によりI-カッパBキナーゼ（I
KK）もしくはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（PDE:s）の効果
を調節することによって減少あるいは破壊される有害な症状を予防あるいは治療
するための、化学物の新規な作用メカニズムを記載する。求められる作用の好ま
しい形態は、IKKもしくはPDE:sの特異的イソ型の転位又は標的化との干渉及び細
胞内部のそれらの固定部位との干渉であり、それによって直接的にそれらの酵素
能力ではなく、それらの特異的な効果を減少させる。

【０００２】その最も広い見地では、この出願は、cAMPもしくはcGMPを切断する能力を有す
る１以上のIKKもしくはPDE:sの活性を調節することによって減少あるいは破壊さ
れる有害な症状を、それらの危機にある動物において予防あるいは治療するため
の新規な方法に関する。その方法は、動物の細胞内部におけるそれらの空間分布
を調節することによってIKKもしくはPDE:sの特異的効果を調節することからなる
。IKKは、IKKα、IKKβ、IKKγ及びNIKからなる群から選択される。ひとつの具
体例では、IKKβは好ましいイソ型である。PDE:sは、PDE1、PDE2、PDE3、PDE4、
PDE5、PDE6、PDE7、PDE8、PDE9及びPDE10からなる群から選択される。より詳細
には、この方法は、PDE4と、PDE4Dのようなそれらのイソ型、及びPDE4D1、PDE4D
2、PDE4D3、PDE4D4及びPDE4D5のようなPDE4Dのスプライス変異型に関する。有害
な症状を有する動物は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであろう。この発明のひとつの具体例では、PDEの特異的な効果の調節は、細胞内部にお
ける天然の位置からのPDEの転位である。この発明の別の具体例では、PDEの特異的効果の調節は、その細胞内部におけ
る天然の位置への標的化の破壊を伴う。

【０００３】この発明の別の具体例では、PDEの特異的効果の調節は、PDEの再分布との干渉
を伴い、その再分布は、PDEの特異的効果の増加又は減少に関連するものである
。PDEの特異的効果の調節は、細胞内部でその機能を果たすためのPDEの効果のア
ップレギュレーション又はダウンレギュレーションの両方を伴うであろう。この発明は、特異的IKKの誤-標的化及び／又は再分布の調節によってNF-カッ
パBの活性化を修飾するための組成物及び方法を提供する。ひとつの具体例では、我々は特別にIKKβの標的化を調節する。我々は、関連
細胞系における発現系に基づいて内因性IKKβをその固定部位から転位させる2つ
の分子プローブPS473及びPS474を開発した。実施例１に示されるように、誤-標
的化は、サイトカインの減少した能力とNFカッパBを活性化する他の刺激に関連
しうる有意な機能上の結果をもたらす。こうして我々は、細胞質から核へのNFカ
ッパBのIL-1によって誘導される輸送が効果的に阻害されることを示し、さらに
その結果として、NFカッパBによって誘導される転写活性化が阻害されることを
見出した。

【０００４】 NFカッパBは、TNFαのようなプロ炎症性（pro-inflammatory）サイトカインに
暴露されたときに受けるアポトーシスから形質転換細胞を救うことが示されてい
る｛Baichwal, V.R. 及び Baeuerle, P.A. (1997) Curr Biol 7, R94-6｝。IKK
βの誤-標的化がIKKβの機能的効果を阻害する有効な方法であることを実証する
ために、PS473がTNFαによって誘導されるアポトーシスに影響を及ぼしうるかど
うか分析した。実施例１に見られるように、プローブ（PS473）は、アポトティ
ック刺激（apoptotic stimuli）に対して細胞を過敏化することが見出された。別の具体例では、この発明は、IKKsの標的化及び／又は再分布を調節する薬剤
を提供する。そのような薬剤には、IKKβの推定上のロイシンジッパー領域から
なるポリペプチドが含まれる。記載したペプチドをエンコードするDNA分子及び
発現ベクターが包含され、さらに、安定もしくは一時的発現系で上記ペプチドを
発現する宿主細胞が提供される。

【０００５】別の具体例では、この発明は、IKKβ及びそれらの誘導体の標的化及び再分布
を調節する化合物を見出す方法を提供する。その方法は、IKKβ（もしくは他のI
KK）の１以上の多重標的化部位を調節することによってI-カッパBキナーゼβの
機能的活性を調節し、それによってNF-カッパB活性化の部分的な阻害あるいは完
全な阻害のいずれかを引き起こす化合物をスクリーニングするものである。この
方法により、特異的細胞型において上記標的化又は再分布を調節する化合物の同
定が可能になるであろう。提示された新規な作用メカニズムは、以下の疾患／健康状態の治療に有用であ
ろう：慢性炎症、喘息及び非喘息病因の慢性気管支反応亢進症（hyperreactivit
y）、リウマチ性関節炎及び骨盤脊椎炎、潰瘍性大腸炎及びクローン病、真性糖
尿病タイプＩ、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、グレーブス病
及び免疫血小板減少性紫斑病、急性呼吸困難症候群（ARDS）及び敗血性ショック
ならびにうつ病。

【０００６】背景慢性炎症は、炎症性サイトカインの平衡を失った産生及び持続した産生の結果
である。サイトカインはカスケードで産生され、プロ炎症性TNFα及びIL-1βは
しばしば、さらなるサイトカインのより一般的な産生を生じる過程を引き起こす
原因である。このカスケードの遺伝子発現は、主としてNF-カッパB、すなわち多
重炎症性及び免疫性遺伝子の発現を調節することによって宿主防御及び慢性炎症
性疾患に重要な役割を果たす偏在性転写因子の制御下にある（Sen 及び Baltimo
re, 1986; Mukaida ら, 1990; Begら, 1993; Cogswellら, 1993）。NF-カッパB
は、サイトカインのみならず反応性酸素種（ROS）、ウイルス及びある範囲の他
の一般的に有害かつ病原性の刺激によっても活性化される（Blackwellら, 1997;
Schulzwe-Osthoffら, 1997）。ROSによるNF-カッパBの活性化は、パーキンソン
病及びアルツハイマー病のような神経変性障害（Lesoualc'hら, 1998; O'Neill
ら, 1997）、及びさらには炎症性腸疾患（Jourd'heuilら, 1997）にも関連づけ
られている。X線に対する組織の炎症反応は、NF-カッパBによって直接的に仲介
される（Hallahanら. 1995）。NF-カッパBの活性化は、平滑筋細胞のアテローム
性動脈硬化障害（atherosclerotic lesions）の産生（Bourcierら, 1997）、及
び心臓の炎症性障害（Hattoriら, 1997）に関連づけられている。NF-カッパB／R
el転写因子はまた、ある腫瘍、特に造血起源のものの病因論において役割を果た
すことも知られており（Neumannら, 1997）、NF-カッパBの本質的（自己分泌）
活性化は、アポトティック刺激に対する耐性を促進することが知られている（Gi
riら, 1998）。NF-カッパBの阻害剤は、抗癌化学療法における細胞毒性効能を増
加させるであろう（Bours ら, 1998）。

【０００７】炎症経路は複雑なことで有名であるが、NF-カッパB活性の調節によって炎症反
応を減少もしくは除去できることが、いくつかの異なる細胞ですでに論証されて
いる（Makarovら, 1997）。転写活性化因子のNF-カッパB／Rel群及びそれらと共に発達した調節タンパク
質、カッパBの阻害剤（I-カッパB類）は、細胞間伝達の制御、胚の発達、遺伝子
の細胞型特異的発現の維持、ならびにストレッサー（stressors）及びウイルス
感染に対する炎症反応の同時調整を含む脊椎動物における多くの細胞シグナルプ
ロセスにおいて重要な役割を果たす（Wulczynら, 1996）。この制御システムに
関与する主たるタンパク質は、異なる群に分類される：a)DNAを結合するもの。
これらは、転写因子のRelファミリーに属し（Ghoshら, 1990）、p50、p65、p52/
49、p75/Rel及びRelBを含む。二量体のみがDNAを結合するが、これらはホモ二量
体もしくはヘテロ二量体であってもよい。p65/p50ヘテロ二量体が最も豊富であ
り、遺伝子発現の調節において他の因子よりも精巧な役割を果たす（Baldwin, 1
996）。b)阻害性I-カッパBα及びI-カッパBβ分子（Bauerle 及び Baltimore, 1
988）、及び前駆体分子p105（Naumannら, 1993）を含む細胞質におけるDNA結合
サブユニットと相互作用するもの。c)Bcl3（Nolanら, 1993; Watanabeら, 1997
）及びCbp/p300（Zhongら, 1998）のような核におけるDNA結合サブユニットと相
互作用するそれらの転写共活性化因子。d)I-カッパBα及びβサブユニットI-カ
ッパBキナーゼのプロテアソーム破壊を活性化するキナーゼ（Begら, 1993）。e)
PKA（Zhongら., 1998）、カゼインキナーゼII（Bird ら, 1997）及び他のもの（
Hayashiら, 1993; Schulze-Osthoffら, 1997）のような、DNA結合サブユニット
の活性を調節するために細胞質及び核においてDNA結合サブユニットを直接的に
リン酸化するキナーゼ。

【０００８】不活性p65/p50NF-カッパB二量体は、p65サブユニットを介して阻害性I-カッパ
B分子（α及びβイソ型）に結合して細胞質中に保持される。活性化されたI−カ
ッパBキナーゼ（IKK）は、阻害剤をリン酸化し、ユビキチン化とその後のプロテ
アソーム消化に対してそれらを標的化させる（Beg ら, 1993）。放出されたサブ
ユニットは核に転位し、そこで転写を活性化する。Ｉ−カッパキナーゼ（IKK-α、IKK-β及びIKK-γ）は、大きいマルチコンポー
ネント複合体の一部分であることが示されている（Chenら, 1996; Rothwarf ら,
1998）。IKK複合体の集合及び分解はIKK-複合体関連タンパク質、IKAPと呼ばれ
るスカホールドタンパク質によって制御されていると考えられる（Cohenら. 199
8）。複合体の強固な集合は、IKKがNF-カッパB誘導キナーゼ（NIH）によって活
性化されるのに必要であり、それによってI−カッパBサブユニットのリン酸化反
応が誘導されるものと予測される。興味深いことに、IKAPに対するIKK-βの親和
性は、NIKによるIKK-βのリン酸化反応によって弱まる。

【０００９】グルココルチコイド（GC）は、非常に有効な炎症のモジュレーターであるが、
感染に対する必要な保護反応を抑制し、いくつかの本質的な治癒過程を減少させ
る潜在的な危険を有する。それらは、ゲノムメカニズムの組み合わせによってサ
イトカイン発現を調節する。活性化されたGC-レセプター複合体は、(i)AP-1もし
くはNF−カッパBに結合して不活性化し、(ii)GC反応成分によってI−カッパB産
生をアップレギュレートし、(iii)サイトカインmRNAの半減期を減少させること
ができる（Brattsand & Linden 1996）。しかし、ステロイド治療は、全てのリ
ンパ細胞からの全てのサイトカイン産生を広く減少させるので、炎症性サイトカ
インのレベルを低下させるのみならず、抗炎症性IL-10のレベルも低下させる。T
h-1型経路の特異的な調節は、この計画の最初の目標であろう。いくつかの繊維
芽細胞NF−カッパB仲介反応は、炎症の進行における調製器と思われるので、そ
のような反応の阻害は有害な効果をもたらすことも知られている（Smithら, 199
7）。適当なフィードバック系を維持するが、不適当なサイトカイン産生を調節
する治療が、満たされていない医学的な要求である。慢性炎症状態の治療に用いられる魅力的な治療上の介入は、I−カッパB分解の
阻害である。ユビキチンプロテアソーム経路（PharmaProjects, Accession no.
023654及び027675）をブロックすることにより、この分解を直接的に阻害するこ
とができる。追求される別のメカニズムは、IKKもしくはNIKいずれかの酵素活性
阻害である｛Signal Pharmaceuticalsからの公開所説｝。

【００１０】非常に多くの細胞外シグナルが、媒介物もしくは二次メッセンジャーとしてサ
イクリックヌクレオチドサイクリックアデノシンモノホスフェート（cAMP）及び
サイクリックグアノシンモノホスフェート（cGMP）を用いる細胞内系を介して変
換される。cAMP及びcGMPによって仲介される過程には、平滑筋緊張の制御、学習
、視覚、細胞分化、プロ炎症性媒介物の産生及び作用の制御、アポトーシス、脂
肪生成、グリコーゲン分解及び糖新生、日周期リズム、心臓機能、及びノルアド
レナリン作用性の相乗作用によるムードコントロールが含まれる。サイクリックヌクレオチドは、ATP及びGTP、プロテインキナーゼのようなcAMP
依存性エフェクタータンパク質及びcGMP依存性エフェクタータンパク質（各々cA
K及びcGK）に対するシグナル、及びあるイオンチャンネルからアデニル酸及びグ
アニル酸シクラーゼ（各々ACs及びGCs）によって生じる。cAMP及びcGMPは、ホス
ホジエステラーゼ（PDE:s）によって除去される。これらの系によって生じるシ
グナルの必要とされる特異性は、型の多様性、組織特異的発現及び関連する酵素
の細胞内配置から生じる。例えば、公知のACsの9つのイソ型とさらなるスプライ
ス変異型、GCsの可溶性及び膜配置型、cAK及びcGKキナーゼの多重イソ型、及びP
DE:sの非常に多くのイソ型（30以上が同定されている）がある（Perry 及び Hig
gs, 1998; Houslay 及び Milligan, 1997; Beavo, 1995）。さらなる特異性は、
細胞内部の制限された位置に特定のシグナル酵素を標的化させることから生じる
；これは、AKAPファミリーのようなスカホールド及び固定タンパク質の機能であ
り、それらは、それらの基質のすぐ近くに酵素を配置するのみならず、機能的な
シグナルユニット中に多重酵素を補充するのにも役立つであろう（Pawson 及び
Scott, 1997）。

【００１１】 cAMP/cGMPの不活性化は、PDEsによって触媒される3'-エステル結合の加水分解
によって生じる。PDEsは、サイクリックヌクレオチドシグナル系の主たる成分で
あり、隣接した組織間、隣接した細胞間、まさに単一の細胞内部でさえも細胞質
の異なる容量間でサイクリックヌクレオチドメッセンジャーの局所濃度を異なら
せることを可能にする。cAMPのような一般に共有されるシグナル分子の濃度分布
においてそのような不均一性を生じる能力は、特異的シグナルプロセスの本質で
ある。治療価値のためには、所定の細胞選択性を有するサイクリックヌクレオチ
ドの制御が達せられなければならない（Perry 及び Higgs, 1998）。それが、こ
の出願に関するいくつかのPDE:sによって提供される治療の機会である。 PDE:sの10個のファミリーが同定され、単純にPDE1〜PDE10と命名された。各々
のファミリーのなかには、２以上の関連するけれども別個の遺伝子産物（A、B、
Cなど）があり、これらの各々に関して、代わりのmRNAプロセシングにより多重
スプライス変異型が生じ、それらは最も新しい命名法勧告に従って追加のアラビ
ア数字によって同定されている（Molecular Pharmacology 46:399-405, 1994）
。これまでに同定された全てのPDE遺伝子産物は、分子あたり2つの機能的ドメイ
ン（１つは触媒性であり、1つは調節性である）を有する。触媒ドメインは、各
々のPDEタンパク質のカルボン酸末端側に存在し、PDEファミリー間で最も大きな
相同性（アミノ酸レベルで75％より大きい相同性）を有する（Perry及びHiggs,
1998）。それにもかかわらず、30より多い公知のPDE:sの各々は、それぞれ別々
の基質特異性、動力学特性、調節特性、及び細胞及び細胞下分布を有する（Hous
lay 及び Milligan, 1997）。

【００１２】 PDE:s4、7及び8は、cAMPに対して非常に特異的である。PDE:s5、6、9及び10は
、cGMPに対して選択的である。PDE3sは同様の親和性でcAMP及びcGMPを結合する
が、最も効果的にcAMPを加水分解し、やや不完全にcGMPを加水分解する。従って
、PDE3sは、それらのcAMP加水分解能がcGMPによってネガティブに調節される。P
DE:s1及び2は、cAMP及びcGMPの両方を加水分解するが、PDE1については、相対的
効率はアイソザイムのサブタイプによって異なる（Perry 及び Higgs, 1998）。
PDE:sのアミノ末端は、ファミリー間及びファミリー内の変異型間の両方で非常
に異なる調節ドメインからなる。この領域はさまざまに：PDE1においてはCa²⁺-
カルモジュリン（CaM）に対する結合ドメイン；PDE:s2、5及び6においては非触
媒性cGMP-結合部位；PDE6においてはシグナルG-タンパク質トランスデューシン
に対する結合ドメインを含む。アミノ末端領域はまた、いくつかのPDE3:s及びPD
E4:sにおいてタンパク標的化配列及び膜標的化配列も含み、PDE:s1、3、4及び5
においてプロテインキナーゼリン酸化部位も含む。これらのリン酸化部位は、触
媒活性及び／又は細胞下の位置の調節に重要であると思われる（Perry 及び Hig
gs, 1998）。

【００１３】ここで我々は、cAMPを分解するホスホジエステラーゼの中で公知の最も大きく
かつ最も多様なファミリーであるPDE4:sに着目した。PDE4酵素は、そのアミノ酸
配列から推論されるように共通の構造を共有する（Beavo 及び Reifsnyder, 199
0; Bolger ら., 1993, Houslay, Sullivan 及び Bolger, 1998）。各々の遺伝子
ファミリーのメンバー（PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D）は、共通のC-末端領域（
各々のファミリーで異なる）及び全てのPDE4イソ型において非常に類似する触媒
ドメイン（全てのPDE4:sに渡る約360アミノ酸に関して84％の相同性； Houslay,
Sullivan 及び Bolger, 1998）を共有する。N-末端から触媒領域まで、「ロン
グフォーム」のPDE4sにおける配列は、5つの領域に分割することができる。その
3つはイソ型特異的（N-末端領域、リンカー領域1及び2つまりLR1及びLR2）であ
り、2つは全てのイソ型間で広く類似するより保存された領域、すなわち上流の
保存領域1及び2（UCR1及びUCR2）である。「ショートフォーム」のPDE4:s、例え
ばPDE4A1、PDE4B2、PDE4D1、PDE4D2は、UCR1及びLR1に加えてN-末端領域の量が
異なるUCR2を欠いている。PKA（例えばヒトPDE4D3におけるSer54）、マイトジェ
ン活性化プロテインキナーゼ（例えばヒトPDE4B2のSer487）、カゼインキナーゼ
II（例えばPDE4B2のSer489）及びカルシウム-ジアシルグリセロール依存性プロ
テインキナーゼを含む種々のキナーゼに対する可能なリン酸化部位は、全ての領
域にわたっている（Houslay, Sullivan 及び Bolger, 1998）。これらの部位の
いくつかにおけるリン酸化反応は、PDEs（例えばSer54）を活性化し、他のもの
は阻害するのに役立つことが示された。いくつかのリン酸化反応が、異なる１つ
の部位もしくは複数の部位でのさらなるリン酸化反応による次の活性化のために
用意される酵素を提供するのに役立つ証拠もある（Houslay, Sullivan 及び Bol
ger, 1998）。他の自己調節部位は、あるPDE4:sのN-末端配列に見られるであろ
う（Bolgerら, 1996, McPheeら, 1995）。

【００１４】 PDE4:sの有効な阻害剤としてのロリプラム（rolipram）(Schering AG, Berlin
, Germany)の同定（Wachtel, 1982, Nemozら, 1985 ）は、異なる細胞型におい
てPDE4:sの役割を決定するための重要な道具を与えた。向神経剤として初めに開
発されたロリプラムは、抑うつ性疾患の制御におけるPDE4阻害の治療的可能性を
示した。ロリプラムの薬学的特性の分析、及びこれらの特性をカバーする800を
超える刊行物は1993〜1998年の間に単独で現れ、現在では特異的PDE4の阻害が非
常に広い範囲の疾患分野に有用であることが示されている。これらには、喘息、
アトピー性皮膚炎、抑うつ病、リパフュージョン（reperfusion）障害、敗血性
ショック、中毒性ショック、自己免疫性糖尿病、AIDS、クローン病、多発生硬化
症、脳虚血、乾癬、同種移植片拒絶、再発狭窄症、潰瘍性大脳炎、悪液質、脳性
マラリア、アレルギー性リノコンジャンクティビティス（rhinoconjunctivitis
）、骨関節炎、リウマチ性関節炎、自己免疫性脳脊髄炎が含まれる（Houslay, S
ullivan 及び Bolger, 1998）。喘息の分野では、PDE4阻害は、気管支平滑筋にc
AMPを増加させるのに役立ち、それによって呼吸困難症状を軽減するのに有用な
適当な気管支拡張効果を生じる。しかしおそらく最も重要なことに、PDE4:sの阻
害は現在、免疫及び炎症細胞反応を抑制するための認められた方法である（Hugh
esら, 1997; Torphy, 1998; Teixeiraら, 1997）。

【００１５】 PDE4:sは、炎症過程に関与する実質的にすべての細胞型の活性を調節すること
において主要な役割を果たす。免疫及び炎症状態は、血液コンパートメントから
組織中への白血球の供給が制御されないか、不適当であるか、延長されるかある
いは自己に対して指向されるかのいずれかであるときに生じる。喘息、リウマチ
性関節炎及び多発性硬化症においては、炎症細胞による組織の浸潤は延長されか
つ強烈であり、最終的に深刻な｛かつ自己永久的な｝機能の損傷及び損失を生じ
る。免疫系の急性の不調節（disregulation）は、そのような状態に急性呼吸困
難症候群（ARDS）として生じ、それは不可抗力で全身に広がった炎症反応がしば
しば死に至らしめうるものである。炎症が少なくとも脳及び肺において虚血後の
リパフュージョンから生じる損傷の範囲を定義することにおいて役割を果たすこ
とを示唆する実質的証拠もある（Entman 及び Smith, 1994）。喘息のような慢
性炎症状態は、現在ステロイドによって治療可能であるが、長期間の治療は、免
疫抑制、代謝障害及び高血圧症を含む避けがたい副作用をもたらす（Teixeiraら
, 1997）。リウマチ性関節炎の症状は、非ステロイド系抗炎症剤（NSAIDS）によ
って軽減されうるが、またそれらの副作用も非常に心配である。ARDSのような急
性の状態には、そのような現行の治療はなく、援助的ケアしかない。不調節反応
を制御できるがNSAIDS及びステロイドに関連する副作用がない有効な抗炎症剤は
、まだ見出されていない。

【００１６】喘息の範囲内では、PDE阻害による細胞内cAMPの上昇は、リンパ細胞、単核細
胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、好塩基球、内皮細胞及び肺
上皮細胞を含む炎症反応に関与する種々の細胞型の機能阻害に関連している（Ni
cholson 及び Shahid, 1994）；PDE4:sは、好中球、好塩基球、好酸球及びマス
ト細胞において最も有力な役割を果たすように思われ、PDE3sは単核細胞／マク
ロファージ及びリンパ細胞において最も有力である。PDE3s及びPDE4:sの阻害剤
はしばしば、喘息モデルで炎症反応の制御において共力的に相互作用する（Teix
eiraら, 1997）。他のPDE:sは、炎症細胞において重要であるが、それらの関係
はまだ明らかにされていないし、論証されていない。増加したcAMPは、弛緩を引き起こすミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）活性を調節
し、これが気管支平滑筋における主要な効果である。有用な化合物は、気管支平
滑筋をゆっくり弛緩し、持続された期間弛緩を維持するが、アレルゲンに対する
炎症性免疫反応の減少も促進するであろう。PDE3及びPDE4アイソザイムの組み合
わされた阻害はヒトにおいて気管支平滑筋を最も効果的に弛緩するように思われ
るが（Raeburn 及び Advenier, 1995）、心血管における合併症の可能性がPDE3
阻害剤の使用によって増加され、実際にロリプラムのようなPDE4阻害剤は、単独
あるいはサルブタモルのようなβ２アドレナリン受容体のアゴニストとの組み合
わせで、有効な気管支弛緩薬である。

【００１７】生体内でのPDE4阻害による抗炎症の恩恵に関連する可能なメカニズム（Teixei
raら, 1997）には: - 炎症性媒介物／サイトカインの産生及び放出の阻害、 - 血球移動の阻害、 - 抑制活性を有するサイトカインの誘導、 - 白血球活性化の阻害（脱顆粒、呼吸性バースト）、 - 細胞接着分子の発現／アップレギュレーションの阻害、 - 炎症細胞中におけるアポトーシスの誘導、 - 内因性ステロイド及びカテコールアミン放出の刺激（Pettipherら, 1996）が含まれる。おそらく選択的PDE4阻害の生体内における最も重要な結果は、ケモカイン産生
、特に白血球の化学誘引物質であるものの産生を阻害することであろう（Teixei
raら, 1997）。PDE4阻害剤は、生体外においてサイトカイン産生の有効なサプレ
ッサーであり、敗血性ショックの動物モデルにおいて腫瘍壊死因子α（TNF-α）
の血清レベルを減少させる（Sekutら, 1995; Pettipherら, 1996; Prabhakarら,
1994）。TNF-α産生の阻害は、炎症状態の治療におけるPDE4阻害の有利な効果
の主要なものであるが、α-ケモカインインターロイキン-８及びリピドロイコト
リエン（LT）B₄のような化学誘引物質の放出阻害もまた、炎症部位への白血球供
給を減少させるのに重要であろう（Turnerら, 1994; Griswoldら, 1993）。

【００１８】しかしながら、TNF-α及び他のプロ炎症性媒介物の放出と作用の阻害から全く
区別されるPDE4阻害に関する保護効果があることも知られている。TNF-αの放出
阻害に必要な濃度よりも高い濃度で、ロリプラムは好酸球（Teixeiraら, 1994）
及び好酸球増加症に直接的な効果を有するように思われる。PDE4阻害はまた、生
体外においてリポ多糖によって要求されるときに抗炎症性サイトカインインター
ロイキン10（IL-10）を産生及び放出させるためにマクロファージを刺激し（Kam
bayashiら, 1995; Jilgら, 1996）、この同じ効果は、敗血性ショックのマウス
モデルにおいて、一般的なPDE阻害剤であるメチルキサンチンの保護作用に関与
している可能性がある（Jilgら, 1996）。生体内における好中球活性化の阻害はまた、PDE4阻害がマウスモデルにおいて
LPSとそれに続くザイモサンによって誘導される急性肺傷害に対して保護する仕
方でもあり（Miotlaら, 1995）、喘息の動物モデルにおいては、PDE4阻害は、マ
スト細胞脱顆粒の阻害とともに好酸球活性化の阻害によってアレルギー性炎症を
抑制するように思われる（Hughesら, 1996）。 PDE4阻害はまた、生体外において微小血管系の内皮細胞によるE-セレクチンの
ような細胞接着分子の発現及び提示に影響を及ぼすことも示され（Bleaseら, 19
98; Morandiniら, 1996）、増加したcAMPはまた、好酸球及び好中球の表面上で
β２インテグリンの媒介物によって誘導されるアップレギュレーションを防止す
る（Teixeiraら, 1996）。白血球の供給及び炎症細胞による組織浸潤の開始を招
く細胞接着成分の阻害は、炎症状態に対する治療的制御の重要な見地である。cA
MP上昇剤もまた、生体外において種々の白血球のアポトティッククリアランスを
高め（Hallsworthら, 1996）、このこともまた、PDE4阻害による炎症の制御にお
いて有用な効果であろう。

【００１９】主要なcGMP分解PDEはタイプ1、2、5、6、9及び10であるが、ここで我々はPDE5
に着目した。それは、これが気道及び血管平滑筋において見出された主要なcGMP
特異的PDEであり、cGMP特異的PDEsのよく実証されたファミリーの１つであるか
らである。最近発見されたPDE9及びPDE10イソ型の役割に関してはまだあまり知
られておらず（Soderling ら, 1998; Fisherら, 1998; Soderlingら, 1999; Fuj
ishigeら, 1999）、これらに関しては今までのところ良好な阻害剤が知られてい
ないので、その状況はPDE2sと同様である（Perry 及び Higgs, 1998）。PDE5は
、cAK及び（10倍より早い）cGKによって活性化される（Thomasら, 1990）。PDE5
のリン酸化反応は、cGMPの存在で増強され、明らかに10倍まで酵素のV_maxを増加
させる（Burnsら, 1992）。PDE3と結合して、これらの相互作用はcGMPシグナル
を制限するためのフィードバック系（増加したcGMPは、PDE3の阻害によってcAMP
を増加させ、高いcAMPは、高められたcGMPの存在下でPDE5を活性化させるcAKを
活性化し、従ってcGMPの分解を刺激するであろう）を形成する。cAMPのレベルは
、PDE3の再活性化によって、cGMPが低下するにつれてベースラインに戻る。最近
の証拠（Pyneら, 1996; Lochheadら, 1997）では、PDE5がPDE6のガンマサブユニ
ットに類似のものに関連する追加のタンパク質成分を有することが示唆されてい
る。PDE6γサブユニットは、Gタンパク質トランスデューシンの活性化をPDEの活
性化にリンクさせるのに役立つ。その後、それらはトランスデューシンGTPアー
ゼの活性化を促進することによってシグナルの産生に関与する。PDE5の場合には
、これらの関連タンパク（14〜18kDa）は、cGK及びcAKによる酵素の活性化を遮
断するのに役立ち、これらのポリペプチドの遮断能力は、Gタンパク質が調節す
るキナーゼによって制御されるものと思われる（Pyneら, 1996）。

【００２０】 cGMPを分解するPDEsは、まさにcAMP PDE:sとアデニル酸シクラーゼがともに細
胞のcAMPレベルを制御するように、グアニル酸シクラーゼの作用と関係して作用
する。GCsの２つの群（可溶性のもの及び膜に配置するもの）が哺乳動物おいて
知られている。両方の群のGCsは、血圧の全身性制御における主要なものである
。可溶性GCsは、カルジオミオサイト（cardiomyocytes）、血管平滑筋細胞（VSM
Cs）、内皮細胞及び血小板を含む心血管系のほとんど全ての細胞型で発現される
（Drewett 及び Garbers, 1994）。可溶性GCsは、NO（及びCO）を結合し、酵素
の活性化を生じる補綴ヘム基を含む：NOの血管作用特性は、このようにしてcGMP
経路によって仲介される。膜配置GCsは、種々のリガンド｛それらの中で、ナト
リウム排泄増加ペプチド及びグアニリン（guanylin）｝のレセプターとして作用
する。ナトリウム排泄増加ホルモンレセプターのcGMPによって仲介される機能に
は、血管平滑筋弛緩ならびに血液容量の調節が含まれる（Bennerら, 1990）。

【００２１】 cGMPは、いくつかの異なるエフェクタータンパク質： a)例えば光受容体及び嗅覚細胞、さらには心臓及び腎臓におけるあるイオンチ
ャンネル（Lincoln & Cornwell, 1993; Bielら, 1994; Lightら, 1990）; b)cGMP依存性プロテインキナーゼ（cGKI及びcGKII）（サイトゾルのcGKIは心
血管系において優勢であり、少なくとも２つのスプライス変異型、α及びβを有
する。cGKIαは、β変異型より10倍高いcGMP親和性を有する。両方のcGKI変異型
は、血管平滑筋に存在する。）（Keibachら, 1992, Hofmannら, 1992）； c)高い濃度で、cAMP依存性プロテインキナーゼ（cAK）｛まさにその逆も正し
いので、cGKsに類似のものはcGMPに対してある親和性を有する（Vaandrager 及
び de Jonge, 1996）。経路間におけるこの可能なクロストークの機能的意義は
まだ十分に知られていないが、cGMPの抗増殖効果と関連しているかもしれない（
Lincolnら, 1994）。｝； d)cGMP調節PDEs：｛cGMPは、PDE2の非触媒部位に結合し、cAMPに関するそのK_m を低下させ、それによってその酵素によって達することができるcAMPのベースラ
インレベルを低下させる。cAMPに関するPDE3触媒作用は、cGMPによって効果的に
阻害され（Pyneら, 1987）、このようにしてPDE3が優勢である細胞においては、
増加したcGMPによって増加したcAMPを生じる。｝; と相互作用する。

【００２２】平滑筋は、以下のミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）のCa²⁺-カルモジュリン活性
化を請け負う。cGK1は細胞質の遊離Ca²⁺レベルを低下させることによって平滑筋
を弛緩させるが、このことが達せられる主要な方法は、平滑筋の型、動物種、及
び拮抗する収縮性刺激の性質間でかなり異なる（Vaandrager 及び de Jonge, 19
96）。cGKIは：ホスホリパーゼCβのG-タンパク質活性化の阻害；原形質膜及び
筋小胞体（SR）におけるCa²⁺-ATPアーゼ活性の活性化；Ca²⁺活性化K⁺チャンネル
の活性化による膜電位の過分極；電圧作用性Ca²⁺チャンネルの阻害；Na⁺/Ca²⁺交
換器の刺激；SRIP₃レセプターの阻害に関連している。これらの作用の全てには
、正常な細胞質のcGKsが膜配置ターゲットを見出すことが必要であり、特異的ア
ンカータンパク質が関与するであろう。cGKIは、細胞骨格の特異的アンカータン
パクに標的化されることがすでに知られており（MacMillan-Crow 及び Lincoln,
1994）、さらなる相互作用の発見が見込まれている。

【００２３】医学的治療を必要とする程度までの血圧の上昇は、しばしば成人集団の15％ま
でに見出される。これらの10〜15％のみに、高血圧症の明確な原因を見出すこと
ができ、その残りにおいては、根底にある疾患の治癒に対する望みなく「本質的
な高血圧症」を治療しなければならない。全くゆるやかでさえも、血圧の長年の
上昇は、心臓、腎臓及び脳の血管に損傷を与え、冠状動脈心疾患、腎不全及びス
トークに対する危険を劇的に増加させる。高血圧症の有効な薬学的治療は、これ
らの状態からの罹患率と死亡率を実質的に減少させることが示されている。内皮
細胞が、グアニリルシクラーゼを活性化して、次いで血管平滑筋細胞の緊張を減
少させるcGMPを増加させる酸化窒素（NO）として同定された局所血管弛緩因子を
産生するという発見は、cGMPの細胞レベルの調節に基づく血圧調節／血管弛緩に
関する新しい可能性を開発した。cGMP系のいくつかの成分は、組織特異的分布を
示す（Vaandrager 及び de Jonge, 1996; Pyneら, 1996）。このことは、従来の
ものの代わりに抗高血圧治療に対するターゲットとしてこれらを用いるときに、
改良された薬学的特異性とより少ない副作用に対する可能性を増加させる。それ
は、cGMPの細胞内効果を仲介すると考えられるcGMP依存性プロテインキナーゼ（
PKG）（Vaandrager 及び de Jonge, 1996）である。cGMP依存性及び特異性ホス
ホジエステラーゼは、cAMP系に対するコネクター及びcGMP効果のターミネーター
として役立つことができる（Pyne ら, 1996）。

【００２４】 PDE5は、cAMPに対するcGMPの分解に対して選択的であるので注意された。PDE5
のイソ型特異的阻害剤は、いくつかの会社によって開発されており、ファイザー
からの１つの化合物であるシルデナフィル（Sildenafil）は、PDE5に対する選択
性を立証し、現在インポテンスに対する治療として市場に出ている｛バイアグラ
（Viagra）｝｛最初は副作用が海綿体（corpus cavernosum）の血管弛緩から生
じる｝。しかしながら、現在用いられるスクリーニング手順は、PDEの直接的酵
素阻害剤のみを追求するもので、見出される化合物はしばしば選択的ではなく、
例えばPDE1及び5の両方を阻害する｛例えば、ザプリナスト（Zaprinast）(M&B22
948RPR), Sch 59498及びSch 51866｝。この明細書に記載した方法によって及び
添付物A内に、それ自体は酵素作用の阻害剤ではなく、主としてPDE作用の特異的
モジュレーターである新規な化学物を見出すことができる。好ましい化合物は、
cGMPを加水分解するPDEsの部位特異的固定を阻害し、それによって生細胞内部で
のcGMP局所濃度の制御におけるそれらの効果を減少させるであろう。 cGMP関連PDE作用に対する選択的モジュレーターの治療上の可能性は、平滑筋
細胞の弛緩に限定されず、血小板活性化の阻害（Chiuら, 1997: Vemulapalliら,
1996）、血管作用物質に対する反応における内皮透過性増加の阻害（Raeburn
及び Karlsson, 1993）、破骨細胞の分化の阻害（Hollidayら, 1997）及び日周
期リズムの光によって誘導されるリセッティング（Mathurら, 1996; Liuら 1997
）のようなPKGが原因となる他の効果も包含される。

【００２５】特異的PDE:s（特にPDE:s4及び5に関して）の触媒活性に対する化学的阻害剤の
追求は、現在薬学研究の最も集中的分野の１つである。PDE:sの特定のファミリ
ーに対する選択的活性を有することが知られているいくつかの化合物により、こ
の分野において大きな進歩がなされた（Perry及びHiggs, 1998; Hughes ら, 199
7; Teixeiraら, 1997を再検討）。しかしながら、同じファミリー内のアイソザ
イム間を選択できる化合物のクラス（最も大きな機会が見出されるところである
）はまだ見出されていない。イソ型特異性がないと、PDE:sの酵素阻害剤の使用
において、ある難点が予測できる。これらの難点のいくつかを、以下に概説する
。一般的に、PDE:sの特定クラスの触媒活性に対する公知の阻害剤がサイクリッ
クヌクレオチドレベルに関して有する効果は、しばしば異なる細胞型間で異なる
。このことに関する理由はいくつかあるが：異なる細胞型におけるシクラーゼ活
性の根本的レベルの相違、cAMP系とcGMP系間のクロストーク、及び単一の競合的
酵素阻害剤によって得ることができる阻害の程度に影響を及ぼす細胞内基質の局
所濃度の相違が含まれる（Perry及びHiggs, 1998）。

【００２６】まず第一に、PDE阻害は単に、それが依存性エフェクターの活性に適当な変化
、例えばcAMPの濃度が限界値レベルを超えて増加しうるときにcAKの活性化を生
じさせるならば有用である。濃度変化の割合は部分的に、サイクリックヌクレオ
チドを生じ、活性の根本的レベルがイソ型からイソ型まで、従っては細胞型から
細胞型まで異なるシクラーゼの活性に依存する。例えば脂肪細胞では、AC活性は
高く、cAMPレベルは単に同様に高いPDE活性のみによってベースラインで維持さ
れる。これに反して肝細胞はむしろ、低いAC活性を有する。両方の細胞型が同じ
ファミリーのPDE:sを共有し、そのファミリーを標的化する化学阻害剤で処理さ
れるならば、脂肪細胞内ではcAMPの迅速な増加とそれらのcAKsの活性化を生じる
であろう。しかし、肝細胞においては、ACも刺激されなければ活性化は生じない
。第二に、PDEの特定のイソ型の一般的な阻害は、cAMP系とcGMP系がしばしば密
接につながっているので、他のサイクリックヌクレオチド経路に関してある避け
がたい結果をもたらしうる。このクロストークの多くは、サイクリックヌクレオ
チドによるPDE調節から生じる。cGMPが血小板で増加するとき（例えば、以下の
可溶性GCの酸化窒素刺激、又はPDE5阻害）、それはPDE3を阻害し、cAMPの付随的
な増加を引き起こす（Ashida及びSakuma, 1992）。副腎糸球体細胞においては、
心房性ナトリウム排泄増加因子は、cGMPを上昇させるが、PDE2のcGMP刺激を介し
てcAMPによって刺激されるアルドステロン合成を阻害する（MacFarlandら, 1991
）。

【００２７】第三に、PDE阻害の予測される効果は、基質の局所濃度の相違によって修飾さ
れるであろう。その理由は、大部分のPDE作用の化学阻害剤が基質と競合するの
で、それらの治療プロフィールがミカエリス-メンテン平衡定数（K_M）とそれら
が作用している基質濃度の両方に依存するからである（Perry及びHiggs, 1998
）。通常、大部分の有効な阻害は最も低い基質レベルで生じるが、自然の結果と
して、局所的に増加した基質レベルは得られる阻害を減少させるであろう。阻害
剤に対するイソ型K_M値の微妙な相違と組み合わせて、細胞内のサイクリックヌク
レオチドレベルの望ましい空間的な調節は、触媒活性の単純な競合阻害によって
得るのは困難であろう。第四に、細胞が、サイクリックヌクレオチド濃度を増加させる薬剤の延長した
使用に対して内因性レベルの適当なホスホジエステラーゼの活性を増加させるこ
とによって反応し（Torphyら, 1995）、このことが生じるメカニズムの１つのク
ラスが、PDEタンパク質の発現レベルを増加させることによるものである（Swinn
enら, 1989, 1991）という証拠がますます増えている。異なるPDEファミリーの
選択的阻害剤｛例えば、PDE4:sに対するロリプラム、PDE3に対するシロスチマイ
ド（cilostimide）、PDE5に対するザプリナストなど｝を使用すると、触媒性の
阻害に対して特に阻害をうけているファミリー型のPDE:sをアップレギュレート
することによって細胞及び組織が反応するのが促進されることを示唆する証拠さ
えもある。従って、PDE:sの十分な触媒性阻害は、細胞が特異的PDE活性の欠如を
補おうとするので、目的に反する結果をまねくであろう。従って、サイクリック
ヌクレオチドの全体的なレベルにはあまり影響を及ぼさない転位もしくは再分布
の阻害による細胞内の局所サイクリックヌクレオチドレベルの慎重な調節が、長
期間の治療を達成するためのより良好かつ有効な手段であることがわかるであろ
う。

【００２８】この出願において以下で提案されるようなPDE作用との干渉に関する根本的に
異なる方法は、主として干渉はファミリー及びイソ型特異的であり、PDE:sの触
媒活性に対してではなく、細胞内部の空間的な構成に対して標的化されるので、
上で概説した多くの問題を避けるであろう。シグナル酵素の標的化は、感受性、特異性、精密性及び制御が細胞内シグナル
経路に導入される、認識されたメカニズムである（Pawson及びScott, 1997; Fau
x及びScott,1996）。現象としての標的化の重要性と発生が、添付物Aに記載され
かつ論議されている。それらの細胞内標的化との干渉によるシグナルPDE:sの効
果の調節が、この出願において主に重要なものである。すでに記載したように、
多くの公知のPDE:sは、多くの構造上の相同性を共有し、このことは特に、タン
パク質のカルボン酸末端側に見られる触媒領域内にあてはまる。アミノ末端にお
いては、PDE:sのファミリー間、ファミリー内のイソ型間、及び個々の遺伝子イ
ソ型由来のスプライス変異型間で、より多くの不均一性がみられる（Houslay及
びMilligan, 1997）。この不均一性の多くは、少なくともPDE4イソ型及び変異型
において標的化挙動の相違と関連しているように思われ（Scotlandら, 1998, Bo
lgerら, 1997）、他のPDEsは、全体的な特性において細胞シグナルにおいて類似
の役割を有する類似のタンパク質分子であるので、範囲を広げて他のPDEsにもあ
てはまるであろう。

【００２９】証拠は、PDE:sのアミノ末端領域がイソ型を特異的細胞内の部位へターゲット
するのに役立ちうること（Shakurら, 1995; McPheeら, 1995; Bolgerら, 1996;
Pooleyら, 1997）及びそれらが結合タンパク質との相互作用（Shakurら, 1995;
O'Connellら, 1996; Pyneら, 1996）かあるいはリン酸化反応（Sette及びConti,
1996）のいずれかによって触媒ユニットの機能を調節できることを示唆してい
る。標的化は、膜配置タンパク質あるいは細胞骨格配置タンパク質とのタンパク
質-タンパク質相互作用によって生じるように思われ（Houslay, Sullivan及びBo
lger, 1998）、これらの中で、膜関連タンパク質には完全及び周辺性の両方の接
着種が含まれる。そのような相互作用は、非イオン性界面活性剤の使用と高イオ
ン強度により全体的レベルで調べられている（Scotlandら, 1998）。

【００３０】４つの別々の遺伝子がヒト及びラットにおいてPDE4:sを産生することが知られ
ており（PDE4A-D）、これらの各々は、（98年6月に記載された20より多い）多重
スプライス変異型を産生し、多くはユニークアミノ末端領域を有する（Hustonら
, 1997; Bolgerら, 1997; Obernolteら, 1997）。いくつかの変異型は、まさに
触媒活性を除去すると言ってもよい程度まで広範囲にわたる欠失変異を有する（
Obernolteら, 1997）。現在、アミノ末端領域における相違は、PDE4アイソザイ
ムの中で、細胞下局在、阻害剤に対する活性及び感受性における相違を決定する
のに重要であると考えられている（Bolger, 1997; Scotlandら, 1998）。例とし
て、PDE4D1及びPDE4D2は、サイトゾル画分においてのみ見られ、PDE4D3、D4及び
D5は全て、サイトゾル画分と顆粒画分の両方において表される。PDE4D3及びD5は
両方とも、それらが顆粒画分に存在するときよりもサイトゾル相においてロリプ
ラム阻害に対して感受性である（Bolgerら, 1997）。３つの「B」アイソザイム
の中では、PDE4B2は、サイトゾルよりも顆粒画分においておよそ10倍ロリプラム
に対して感受性である（Hustonら, 1997）。あるPDE4アイソザイムは、制限され
た組織分布を有することが知られている。例えば、PDE4A8及びPDE4C-デルタ54は
精巣のみに存在し、PDE4C-791は肺及びメラノーマ細胞系G361に存在する（Bolge
rら, 1996; Obernolteら, 1997）。他の細胞においては、アイソザイムの発現は
細胞分化により変化する（Vergheseら, 1995; Giorgiら, 1997; Bolgerら, 1994
; Essayanら, 1997）。

【００３１】あるPDE4アイソザイムは膜と会合し、いくつかはSH3ドメインを有するタンパ
ク質と会合し、いくつかは純粋にサイトゾルに存在することが知られている（Sc
otlandら, 1998; Bolgerら, 1997）。ヒト甲状腺癌系に移入されたPDE4Aの変異
型（「RD1」）は、特にゴルジに蓄積され、同時にそれらの細胞における「天然
の」PDE1の全ての発現を阻害する（Pooleyら, 1997）。これらの異なる配置は、
特異的なホスホジエステラーゼの非常に異なる機能を反映すると信じられる。PD
E:sの機能分離に関する非常に明確な証拠が、腎のメサンギウム細胞においてみ
られた。これらの細胞における免疫炎症性の刺激は、反応性酸素代謝物（ROM）
の産生を増加させ、同時に増殖を増加させる。PDE4の特異的阻害は、ROM産生を
抑制するが、増殖は抑制しない。PDE3の特異的阻害は、増殖を阻害するが、ROM
産生は阻害しない（Chiniら, 1997）。両方の反応はPKAによって仲介されるが、
cAMPプールの制御は効果的に分離される。PDE:sの膜に対する配置は、それらの
リン脂質との接触をもたらす。あるPDE4アイソザイムは、ホスファチジルセリン
及びホスファチジン酸のような陰イオン性リン脂質によって活性化される（Disa
ntoら, 1995; Nemozら, 1997）。膜からの転位は、そのような活性化を阻害し、
リン脂質シグナル系とクロストークするであろう。PDE4:sの標的化もしくは固定
は、細胞内部のcAMPシグナルの区画形成性（compartmentalisation）によってそ
の最も大きな効果を有するように思われる（Houslay及びMilligan, 1997）。特
異的ACsならびにエフェクターcAKの特異的イソ型、又はcAMPによって作用するイ
オンチャンネルは、PDE4:sと関連するであろう。cAKsは、おそらく特異的AKAPs
（Aキナーゼ固定タンパク質）に付加されるであろう。これらの成分の特異的細
胞下分布は、細胞において地図化され（Houslay及びMilligan, 1997; Scott及び
Pawson, 1997; Coghlan ら, 1995）、細胞コンパートメント内で確立されるcAMP
の空間的及び一時的勾配を可能にする。ターゲットされたPDE4種は、特異的cAK
分子の周囲におけるcAMPの限界値レベルを制御するのに役立ち、それによってお
そらくあるタンパク質複合体はcAKによって仲介されるリン酸化反応から保護さ
れ、あるいはcAKの活性化が生じる前に必要とされるACsの活性レベルは操作され
るであろう。

【００３２】 PDE4ファミリーのメンバーを選択的に阻害することができる競合的化学阻害剤
が知られている。異なる遺伝子産物間もしくはPDE4ファミリーのスプライス変異
型間を効果的に選択できるものは知られていない（Perry及びHiggs, 1998）。こ
れは、触媒部位の周囲でこのファミリーのタンパク質内部における配列相同性の
程度が特に高いためであろう。スプライス変異型選択性がなければ、PDE4:sは明
らかに生物レベルでそのような広範囲の系に関連しているので、PDE4阻害剤の長
期間投与には、おそらく有意なCNS効果とともに（Teixeira ら, 1997）、免疫抑
制及び代謝障害のような問題があるように思われる。PDE4酵素のファミリーに関
して、ピロリドン化合物ロリプラムは、依然として「ゴールドスタンダード」の
参照阻害剤である。しかしながら、重大な副作用のプロフィールにより、ロリプ
ラムは臨床的に有用な化合物にはなれない。ロリプラムの主要な副作用は、頭痛
、吐き気、嘔吐及び胃酸分泌における受容できない増加である（Barnes, 1995）
。PDE4ファミリーは、ヒトにおいてすでに知られている20ほどのイソ型より多く
のイソ型からなるように思われる（Houslay, Sullivan及びMilligan, 1998）。
阻害に関する動態が複雑かつ感受性である、PDE4sの公知のイソ型の全てに対す
る有力な阻害剤は、イソ型からイソ型まで有意に異なり、個々のイソ型に関して
さえも異なる細胞背景もしくは細胞コンパートメントで有意に異なる（Bolger
ら., 1996; Huston ら, 1996; Jacobitz ら, 1996; McPhee ら, 1995; Owens ら
, 1997; Wilson ら, 1994）。ロリプラムの副作用は、一般的なPDE阻害に関連す
る潜在的問題を明らかに示している。一方、異なるイソ型感受性、及び異なる細
胞環境で変化する感受性は、多くの公知のPDE4イソ型における潜在的な機能上の
多様性を強調し、従って個々のイソ型の選択的阻害に見出される治療上の可能性
を強調するものである。

【００３３】これまで、２つのPDE5遺伝子のみが知られており、２つの酵素変異型が報告さ
れている。他のPDEイソ型と平衡して、より多くのスプライス変異型が各々の遺
伝子から予測される。酵素はホモダイマーで、各々のサブユニットは93kDaであ
る。ダイマーの構造上の構成は、cGKsのものと非常に類似している。 PDE5sは、２つの異なる形態で存在する：１つは膜結合のもの（mPDE5）であり
、１つはサイトゾルのもの（cPDE5）である(Pyne ら., 1996)。mPDE5はPKAによ
って活性化され、Gタンパク質依存性メカニズムによって阻害される。CPDE5は、
NOによって調節されるグアニル酸シクラーゼ及びPDE3とともに「シグナルカセッ
ト」の一部分であると推測される。後者の構造は非常に短命のメッセージを生じ
、一方前者は延長したcGMPシグナルの発生を可能にするであろう。 PDE5sの標的化もしくは固定は、細胞内のcGMPシグナルの区画形成性によって
その最も大きな効果を有するように思われる。特異的GCsならびにエフェクターc
GKの特異的イソ型、又はcGMPによって作用するイオンチャンネルは、PDE5sと関
連するであろう。cGKは、特異的Gキナーゼ固定タンパク質に付加されるであろう
。これらの成分の特異的細胞下分布は、細胞コンパートメント内で確立されるcG
MPの空間的及び一時的勾配を可能にするであろう。ターゲットされたPDE5種は、
特異的cGK分子の周囲におけるcGMPの限界値レベルを制御するのに役立ち、それ
によっておそらくあるタンパク質複合体はcGKによって仲介されるリン酸化反応
から保護され、あるいはcGKの活性化が生じる前に必要とされるGCsの活性レベル
は操作されるであろう。

【００３４】選択的にPDE5sを阻害することができる競合的化学阻害剤が知られている。PDE
5の比較的に少ないイソ型は、デート（date）することが知られている。PDE5は
むしろ、特に血管及び気道平滑筋に存在する。PDE5に対して5nM IC₅₀を有するシ
ルデナフィル（sildenafil）が血管平滑筋のサブセットにのみ影響を及ぼすこと
は、不思議に思われることであるが、おそらくシルデナフィルに対して異なる感
受性を有する多重PDE5イソ型もしくは状態のいずれかが異なる血管平滑筋に存在
するか、あるいはより有望なことには、他のcGMP加水分解PDEsが異なる血管平滑
筋において重要であることを強く示唆するものである。他の潜在的に重要なcGMP加水分解PDEターゲットに関しては、おそらくまだ発
見されていないものが多くある。PDE9:sは、1997年末以来単に知られているだけ
であり、PDE10:sは、1998年後期以来単に知られているだけである。PDE9:sはむ
しろ、一般的な分布（腎臓、脳、肺）を有し、cGMPに対する非常に高い親和性（
およそ70nM）を有し、PDE1/5阻害剤SCH51866（1.55μM）によって阻害されうる
が、「シルデナフィルによっては阻害されない」（7μM, Soderling ら, 1998）
。それらの生理学的役割及び調節は定義されていないが（Soderling ら, 1998;
Fisher ら, 1998）、それらが、活性化されたときに非常に低いレベルでcGMPを
維持することに関連し、腎臓においてはANPシグナルの終結に関連し、従って阻
害により血圧の有害な低下を引き起こすことなくナトリウム排泄増加の増強（po
tentiate）が促進されることが最もよく示唆されている（Soderling ら, 1998）
。

【００３５】 PDEsが、特にアミノ末端あるいは「調節」領域において不均一性を有すること
は明らかであり、この出願で概説されるアプローチは、制限されるべきもの及び
定義された治療効果を生じるためにイソ型及びスプライス変異型間のそれらの相
違を利用する。さらに、多くの場合、作用のターゲット部位からの活性酵素の転
位は、現在PDEフリーの作用部位において有意な増加が生じるかもしれないが、
それらの好ましいサイクリックヌクレオチド基質の平均細胞濃度に関してはほと
んど効果を有さないことが予測されるであろう。このことは、急性の短期間過程
が治療ターゲットである場所で重要性を有するが、統合的な遺伝子調節効果は、
一般的な非特異的PDE阻害及び細胞における全体的なサイクリックヌクレオチド
の増加に基づいて生じるであろう。

【００３６】詳細な開示この明細書及び特許請求の範囲において、用語「影響」には、細胞の反応が再
分布からなるあらゆる影響が包含される。従って、例えば加熱、冷却、高圧、低
圧、加湿又は乾燥が、生じる再分布を定量できる細胞反応に対する影響であるが
、おそらく最も重要な影響は、再分布を生じることが知られているかあるいは疑
われている物質、又は再分布の変化を修飾する物質と、細胞もしくは細胞類を接
触させるかあるいはインキュベートすることに関する影響である。この発明の別
の具体例では、影響は化合物薬物ライブラリーからの物質であってもよい。

【００３７】この明細書において、用語「緑蛍光タンパク質（GFP）」は、細胞によって発
現されるとき、正確な励起波長の光に暴露されることによって蛍光を発するタン
パク質を示すことを意図するものである｛Chalfie, M. ら,(1994) Science 263
, 802-805参照｝。以下において、１以上のアミノ酸が置換、挿入もしくは欠失
されているGFPはまた、「修飾GFP」とも呼ばれる。ここで用いられる「GFP」に
は、くらげエクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）由来の野生型GFP及び
Heimらによって開示されたGFPの青蛍光変異型のようなGFPの修飾体｛Heim, R.
ら. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:26, pp12501-12504｝、及びGFP蛍光の
スペクトル特性を変化させる他の修飾体、あるいは1997年3月27日にWO97/ 11094
号として公開され、ここに引用して導入されるPCT/DK96/00051に記載された、約
30℃を超える温度で細胞で発現される際に増加した蛍光を示し、エクオレア緑蛍
光タンパク質由来の蛍光タンパク質もしくはそれらのいずれかの機能的類似体（
この発明の蛍光タンパク質が細胞で発現されるときに蛍光強度を増加するよう、
発色団から上流の位置１におけるアミノ酸が突然変異されている）からなる修飾
体が含まれる。好ましいGFP変異型は、F64L-GFP、F64L-Y66H-GFP及びF64L-S65T-
GFPである。この発明の全ての見地において、用いられるGFPの特に好ましい変異
型は、EGFP（哺乳動物細胞での発現用に最適化したコドンを有するF64L-S65T変
異型であるEGFPをエンコードするDNAは、Clontech, Palo Altoから入手可能であ
り、EGFP DNA配列を含むプラスミドはGenBank 受託番号 U55762、U55763参照）
である。

【００３８】用語「細胞内シグナル経路」及び「シグナル変換経路」は、生細胞が細胞反応
に外部もしくは内部シグナルを変換する共同作用する細胞内プロセスを示すこと
を意図するものである。上記シグナル変換は酵素反応に関連するであろう。その
酵素には、プロテインキナーゼ、GTPアーゼ、ATPアーゼ、プロテインホスファタ
ーゼ、ホスホリパーゼ及びサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼが含
まれるがそれらに限定されない。細胞反応には、遺伝子転写、分泌、増殖、機械
的活性、代謝活性、細胞死が含まれるが、それらに限定されない。用語「第二メッセンジャー」は、細胞内シグナル変換経路の初期の事象に関与
する低分子量成分を示すために用いられる。用語「発光団」は、本質的にか、あるいは化学的もしくは物理的手段による刺
激に基づいてかのいずれかで、光を発する特性を有する化学物質を示すために用
いられる。これには、蛍光、生物発光、リン光、化学発光が含まれるが、それら
に限定されない。用語「機械的に無傷な生細胞」は、正常な膜電位の維持、エネルギー代謝、増
殖能のようなその特定の細胞型に対する標準的な基準に従って生きていると考え
られ、かつマイクロインジェクションのような細胞に外部物質を導入するために
設計される物理的に侵襲性のあらゆる処置も受けていない細胞を示すために用い
られる。

【００３９】この明細書において、用語「透過性の生細胞」は、ストレプトリジンOもしく
はスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus Aureus）α-トキシンのよ
うな細孔形成剤が適用され、それによって細胞の原形質膜中に導入されている細
胞を示すために用いられる。これは、暴露された細胞の原形質膜中に所定の細孔
サイズを有するタンパク性細孔を生じる。細孔はまた、エレクトロポレーション
、すなわち細胞を高電圧放電に暴露すること（必要な膜タンパク質を凝固させる
ことによって原形質膜中に小さい穴を生じる手順）によってもなされるであろう
。サポニンのような穏やかな界面活性剤での処理によって、同じことが得られる
であろう。これらの処置全てに共通なことは、細胞質構成成分及びオルガネラの
完全性に影響を及ぼすことなく原形質膜にのみ細孔が形成されることである。こ
の明細書において用語、生（living）の用語は、細胞内環境をまねた溶液につけ
られている透過性の細胞もしくは細胞類が、依然として活発に呼吸するミトコン
ドリア及びカルシウムイオンを吸収しかつ放出できる小胞体のような機能的オル
ガネラ、及び機能的構成成分を有することを意味する。ひとつの具体例において
、この方法は、通常原形質膜を通過できないが、細胞内に影響を及ぼすと思われ
る物質を導入でき、それらの影響を試験するように用いられる。別の具体例では
、この方法は、同時に多くの細胞からの影響に対する反応を記録するために用い
られる。

【００４０】この明細書において、用語「透過性化」は、サイトゾルにおいて自由に移動で
きる可溶性物質が細胞の内側から喪失されるような、原形質膜バリアーの選択的
破壊を示すことを意図するものである。透過性化は、「透過性の生細胞」に関す
る上記のように、あるいは注意深く滴定された量でトリトンX-100又はジギトニ
ンのような他の化学的界面活性剤を用いることによって達することができる。用語「生理的に関連した」は、発光特性又は分布の変化によって測定されるよ
うな細胞内成分の実験的に測定した再分布に対して適用されるとき、上記再分布
が再分布を生じる基礎となる生物学的現象に関して説明できることを示すために
用いられる。用語「イメージプロセシング」及び「イメージ分析」は、整理された数字配列
（イメージ）をそれらの整理された数字配列を記載する定量的情報に縮小する、
大きなデジタルデータ分析技術又はそのような技術の組み合わせを記載するため
に用いられる。従って、上記の整理された数字配列が物理的プロセスからの測定
値を表すとき、誘導される定量的情報は、したがって物理的プロセスの定量であ
る。

【００４１】用語「哺乳動物細胞」は、哺乳動物起源のいずれかの生細胞を示すことを意図
するものである。細胞は、その多くがAmerican Type Culture Collection （ATC
C, Virginia, USA）から入手できる確立された細胞系、又はトランスジェニック
動物由来組織を含む哺乳動物組織由来の寿命の限られた始原細胞、あるいはトラ
ンスジェニック組織を含む哺乳動物組織由来の新規に確立された不死細胞系、あ
るいは哺乳動物起源の異なる細胞型を融合することによって誘導されるハイブリ
ッド細胞もしくは細胞系（例えばハイブリドーマ細胞系）であってもよい。細胞
は任意に、蛍光プローブより先にあるいは蛍光プローブに加えて、1以上の非天
然の遺伝子産物（例えばレセプター、酵素、酵素基質）を発現してもよい。好ま
しい細胞系には、線維芽細胞起源のもの（例えばBHK、CHO、BALB）、あるいは内
皮起源のもの｛例えばHUVEC、BAE（ウシ動脈内皮）、CPAE（雌牛肺動脈内皮）、
HLMVEC（ヒト肺微小血管内皮細胞）｝、あるいは気道上皮起源のもの（例えばBE
AS-2B）、あるいは膵臓起源のもの（例えばRIN、INS-1、MIN6、bTC3、aTC6、bTC
6、HIT）、あるいは造血起源のもの（例えば最初に分離されたヒト単核細胞、マ
クロファージ、好中球、好塩基球、好酸球及びリンパ球集団、AML-14、AML-193
、HL-60、RBL-1、U937、RAW、JAWS）、あるいは脂肪細胞起源のもの（例えば3T3
-L1、ヒト前脂肪細胞）、あるいは神経内分泌起源のもの｛例えばAtT20、PC12、
GH3、筋肉起源（例えばSKMC、A10、C2C12）、腎臓起源（例えばHEK293、LLC-PK1
）｝、あるいは神経細胞起源のもの｛例えばSK-N-DZ、SK-N-BE(2)、HCN-1A、NT2
/D1｝が含まれるが、それらに限定されない。

【００４２】用語「ハイブリッドポリペプチド」は、２つのタンパク質の各々の少なくとも
１部分の融合（この場合は、緑蛍光タンパク質の少なくとも1部分とプロテイン
キナーゼの触媒及び／又は調節ドメインの少なくとも１部分）であるポリペプチ
ドを示すことを意図するものである。さらに、ハイブリッドポリペプチドは、融
合がそれぞれCarey, KLら及びGuiliano, KAらによって開示されたグルココルチ
コイドレセプター-GFPではないという条件で、GFPもしくは機能的発蛍光団を含
む緑蛍光タンパク質の少なくとも1部分と、この明細書で定義されたような生物
学的に活性なポリペプチドの少なくとも１部分とからなる融合ポリペプチドを示
すことを意図するものである。このように、GFPは、任意に１以上のアミノ酸の
配列からなるリンカー部分もしくはリンカーペプチドによって、生物学的に活性
なポリペプチドに対してN-あるいはC-末端に標識されていてもよい。ハイブリッ
ドポリペプチドもしくは融合ポリペプチドは、上記ハイブリッドポリペプチドの
発現を可能にする条件下でハイブリッドポリペプチドをエンコードするDNA配列
を保持する機械的に無傷な生細胞もしくは透過性の生細胞における蛍光プローブ
として作用するであろう。

【００４３】用語、ハイブリッドポリペプチド又は融合ポリペプチドは、用語「蛍光プロー
ブ」を含むことも意図するものであり、後者は、任意に１以上のアミノ酸残基か
らなるペプチドリンカーによって、この明細書で定義されたような生物学的に活
性なポリペプチドにN-もしくはC-末端で融合されているGFPもしくはそれらのい
ずれかの機能的な部分からなる蛍光融合ポリペプチドを示すために用いられる。
ここで、蛍光プローブの望ましい機能が維持される限り、リンカーペプチドの大
きさはそれ自体重要ではない。この発明による蛍光プローブは、細胞で発現され
、融合ポリペプチドにおける生物学的に活性なポリペプチド部分の生理学的挙動
に根本的に似ている。用語「キナーゼ」は、細胞成分をリン酸化することができる酵素を示すことを
意図するものである。用語「プロテインキナーゼ」は、ペプチド及び／又はタンパク質中のセリン及
び／又はトレオニン及び／又はチロシンをリン酸化することができる酵素を示す
ことを意図するものである。用語「ホスファターゼ」は、ペプチド及び／又はタンパク質中のホスホセリン
及び／又はホスホトレオニン及び／又はホスホチロシンを脱リン酸化することが
できる酵素を示すことを意図するものである。用語「サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ」は、3'-エステル結
合の加水分解によって二次メッセンジャー cAMP及びcGMPを不活性化することが
できる酵素を示すことを意図するものである。

【００４４】この明細書において、用語「生物学的に活性なポリペプチド」は、細胞内プロ
セスで活性な酵素もしくは生物学的機能を有するかあるいは細胞系において生物
学的効果を及ぼす望ましいアミノ酸配列からなるそれらの一部分のような、活性
化により細胞内プロセスに影響を及ぼすポリペプチドを示すことを意図するもの
である。ポリペプチドにおいては、その生物学的機能を変えるために、例えば触
媒部位を不活性化することによって、あるいは標的化配列を破壊することによっ
て、１つもしくはいくつかのアミノ酸が、欠失、挿入及び／又は置換されていて
もよい。別の具体例では、１つもしくはいくつかのアミノ酸は、ポリペプチドの
生物学的機能を変えることなく（すなわち、生物学的に同等のままで）、欠失、
挿入及び／又は置換されていてもよい。好ましくは、生物学的に活性なポリペプ
チドは、この明細書で定義されたようなキナーゼ、プロテインキナーゼ、及びホ
スホリラーゼを含む細胞内リン酸化プロセス及び脱リン酸化反応プロセスに関与
する酵素のような細胞内シグナル経路に加わるタンパク質からなる群から選択さ
れるが、細胞骨格を構成するタンパク質もまた、細胞内シグナル変換に重要な役
割を果たし、従ってこの明細書の「生物学的に活性なポリペプチド」の意味に含
まれる。より好ましくは生物学的に活性なポリペプチドは、好ましくはシグナル
変換経路における中間成分のような、活性化もしくは非活性化された状態に従っ
て細胞内局在を変えるタンパク質である。生物学的に活性なポリペプチドのこの
好ましい群には、cAMP依存性プロテインキナーゼ、「NF-カッパBの阻害剤」キナ
ーゼ、及びサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼが含まれる。

【００４５】用語「物質」は、生物学的機能を有するかあるいは細胞系において生物学的効
果を及ぼすいずれかの試料を示すことを意図するものである。試料は、血液、血
漿、唾液、乳、尿を含む体液の試料又は微生物もしくは植物抽出物のような生物
学的材料の試料、汚染物質（重金属もしくは毒素を含む）含む環境試料であって
もよく、有機合成又は遺伝子技術によって調製された化合物もしくは化合物の混
合物を含む試料であってもよい。表現「蛍光におけるいずれかの変化」は、波長及び強度のような吸収特性にお
けるいずれかの変化、あるいは波長、蛍光寿命、強度もしくは極性の変化ような
放射光のスペクトル特性におけるいずれかの変化、あるいは発蛍光団の細胞内局
在におけるいずれかの変化を意味する。このようにして、それは、特定の細胞成
分（例えばオルガネラ、膜、細胞骨格、分子構造）に局在してもよく、細胞もし
くは細胞の一部分の至るところに均一に分布されていてもよい。この明細書に用いられる用語「生物」は、好ましくは原生動物を含む動物界に
由来するいずれかの単細胞もしくは多細胞生物を示すが、藻類のような植物界の
メンバーである生物、真菌、ブリオフィテス（bryophytes）、及び維管束植物も
また、この定義に含まれる。

【００４６】用語「核酸」は、DNA配列、cDNA配列もしくはRNA配列のようないずれかの型の
ポリ又はオリゴ核酸配列を示すことを意図するものである。タンパク質に関連する用語「生物学的に等しい」は、２つのタンパク質の細胞
機能が互いに置換できる場合、例えば２つのタンパク質が異なる遺伝子によって
エンコードされる密接に関連したイソ型である場合、それらがスプライス変異型
もしくは同じ遺伝子由来の対立遺伝子変異型である場合、それらが異なる細胞型
又は異なる種において同一の細胞機能を果たす場合に、第一タンパク質が第二タ
ンパク質に等価であることを意味するものである。DNAに関する用語「生物学的
に等しい」は、２つの遺伝子によってエンコードされる機能的タンパク質が生物
学的に等しい場合に、ポリペプチドをエンコードする第一DNA配列がポリペプチ
ドをエンコードする第二DNA配列に等しいことを意味するものである。用語「固定細胞」は、グルタルアルデヒドもしくはホルムアルデヒドのような
細胞固定液で処理した細胞を意味するために用いられ、その処理は、可溶性及び
不溶性タンパク質を細胞の構造内で化学的に架橋させ、固定させるのに役立つ。
ひとたびこの状態になれば、そのようなタンパク質は、現在の死細胞の構造から
喪失されることはできない。

【００４７】この明細書において、「定量的蛍光再分布アッセイ」は、完全な１つの生細胞
もしくは複数の細胞又は透過性の生細胞の内部で発光団によって遺伝的もしくは
化学的に標識された生物学的に活性なポリペプチドもしくはそれらの一部分の細
胞下局在及び可能な再分布を観察及び定量することができるアッセイを示すこと
を意図するものである。細胞下の位置及び再分布は、蛍光顕微鏡又は蛍光イメー
ジング顕微鏡を用いてモニターされるが、改良されたスループット用に蛍光イメ
ージングプレートリーダー又は蛍光プレートリーダーを用いてモニターするのが
好ましい。より詳細な記載は、添付物Aに示す。この明細書において、「致死細胞系」は、正しい条件であれば生体外で増殖す
ることができるが、現在ではそれを超えては生を維持することができない、細胞
分裂の数もしくは日、週間又は月からなる明確な寿命を有する動物細胞を示すた
めに用いられる。この明細書において、「不死細胞系」は、細胞の寿命及び細胞分裂数に関する
通常の限定が適用されない動物起源の細胞を示すために用いられる。特に、その
ような細胞は、限定されない期間つまり非常に長い期間（何10年に至るまで）生
きて、増殖することができかつ分裂することができる。

【００４８】用語「標的化配列」は、生物学的に活性なポリペプチドにおける天然の細胞内
結合部位との会合に必要な実際の１つの構造もしくは複数の構造を含む生物学的
に活性なポリペプチドのアミノ酸配列を示すために用いられる。用語「標的化配
列」はまた、生物学的に活性なポリペプチドにおけるタンパク質との会合に必要
な実際の１つの構造もしくは複数の構造を含むタンパク質のアミノ酸配列を示す
ためにも用いられる。用語「標的化」は、空間分布したタンパク質が細胞内の部位に指向され、細胞
内の部位で維持され、通常それに固定されるかあるいは会合される過程を示すた
めに用いられる。これらの固定部位は、通常、タンパク質が細胞に対して最適な
機能を有する細胞内部位であるものと思われる。用語「転位する」及びそれらの派生語は、細胞内に空間的に分布したタンパク
質が、固定もしくは会合部位での別の（好ましくはより小さい）化合物の介在の
ために、細胞におけるその通常の固定もしくは会合構造から強いて分離される過
程を示すために用いられる。これは通常、細胞内でのタンパク質の最適機能が喪
失もしくは減少され、タンパク質分子のより大きい分子が細胞質内で自由に移動
できることを意味する。この明細書において、「スクリーニングアッセイ」は、材料、細胞、器具、化
学薬品、試薬、検出単位、細胞内経路に対する影響に関連した機械的に無傷であ
るか又は透過性の細胞からの反応を測定するために用いられる較正及び定量手順
を含むあらゆる測定プロトコルを意味するものである。

【００４９】この明細書において、「一次スクリーニングアッセイ」は、アッセイにおける
化合物の定量効果に従って計画に利用できるすべての化合物を選択及び分類する
ために用いられる発見計画における最初のスクリーニングアッセイを示すために
用いられる。この明細書において、「カウンタースクリーン」は、発見計画の観点からは望
ましくない現象に関連するスクリーニングアッセイを意味するものである。この明細書において、「発見計画」は、細胞内シグナル経路を調節するために
用いることができる新規化合物を見出し、それによって動物好ましくはヒトに対
して致命的、変性、性能減少もしくはまさに厄介である健康状態もしくは疾患に
関連した症状を治療、減少あるいは破壊するために、細胞内シグナル経路を調節
する方法についての一般的あるいは特別な考えが開発される過程を意味するもの
である。発見計画の目的は、動物好ましくはヒトにおいて可能性のある薬物とし
て試験することができる候補薬物を製造することである。用語「発見計画」には
また、実際の個体群、スクリーニングアッセイ、試験、機械類、細胞、動物及び
計画の異なる見地に関与する化合物も包含される。

【００５０】用語「標識する」は、発光団が発見計画トに重要なタンパク質もしくはタンパ
ク質の一部分に遺伝的あるいは化学的に付加される過程を示すために用いられる
。用語「一次ヒット」は、発見計画で特定された望ましい効果の少なくとも最低
レベルを有するとして一次スクリーニングアッセイで同定された化合物を示すた
めに用いられる。用語「一次リード化合物」は、発見計画によって予め決定された望ましい効力
及び特異性の少なくとも最低レベルを有する一次ヒットを示すために用いられる
。この明細書において、用語「用量-反応相関」は、化合物のような影響の適用
に対するスクリーニングアッセイにおける細胞の定量反応と、適用した影響の濃
度との明らかな相関関係を意味するものである。影響に対する反応は、スクリー
ニングアッセイに用いられる定量パラメーターのアップレギュレーション及びダ
ウンレギュレーションの両方であってもよい。

【００５１】この明細書において、用語「効力」は、研究中の過程に及ぼす影響の能力を意
味するものである。研究中の過程は、例えばスクリーニングアッセイ、あるいは
動物における特定の生理学的もしくは病態生理学的反応であろう。この明細書において、用語「選択性」は、発見計画の目的において、スクリー
ニングアッセイのような望ましい過程、及びカウンタースクリーンのような望ま
しくない過程に関する効力の相違を意味するものである。影響又は化合物は、望
ましい過程における効力が望ましくない過程におけるものより高い場合に選択性
を示すと言われる。この明細書において、用語「構造-活性相関」つまり「SAR」は、１以上のスク
リーニングアッセイにおいて、化合物と化合物に対してなされた修飾、及び化合
物の活性と化合物に対してなされた修飾との間に直接の相関関係が存在する状態
を意味するものである。SARを築く過程は、最初の化合物より高い効力と選択性
を有する新規化合物の化学構造に目を向けさせるために用いられるであろう。用語「候補薬物リード」は、計画の最終結果のために可能性のある候補として
発見計画によって追跡される化合物を示すために用いられる。

【００５２】この明細書において、用語「効能」は、研究中の過程あるいは状態に影響を及
ぼす化合物の能力を意味するものである。それは、用語「効力」に密接に関連す
るが、この明細書においては、一次スクリーニングアッセイ又はカウンタースク
リーンよりも複雑なスクリーニングアッセイにおける化合物の効果に関するとき
、及び動物における化合物の効果に関するときに用いられる。この明細書において、用語「毒性」は、ある点で化合物が、細胞、組織又は動
物に対して毒性であることを意味するものである。毒性はある点で、化合物が十
分な濃度で適用される場合に、細胞、組織又は動物が傷つけられることを意味す
る。最終的にその効果は、細胞、組織又は動物の死、あるいは正常な状態に比べ
て限定された寿命をもたらすであろう。この明細書において、用語「生理学」は、細胞内部、細胞間及び完全な生物も
しくは動物における生物学的及び生化学的過程の正常な機能を意味するものであ
る。この明細書において、用語「病態生理学」は、健康状態又は疾患の一部分であ
る、細胞内部、細胞間及び完全な生物もしくは動物における生物学的及び生化学
的過程の正常な機能からの逸脱を意味するものである。この明細書において、用語「病因論」は、最終的に少なくとも一部分は動物に
おける健康状態又は疾患に関連した明白な病態生理学を説明できる、遺伝的、生
物学的、生化学的、化学的あるいは環境的な過程を意味するものである。

【００５３】この明細書において、用語「分割細胞（fractionated cells）」は、ある型の
ホモジナイザーまはたソニケーターを用いて物理的に、あるいは浸透的に｛低浸
透性ショック｝、又は界面活性剤、毒素又はエレクトロポレーションによって原
形質膜のある種の透過性を介するいずれかで、細胞を原形質膜破壊に付した後、
最初に機械的に無傷な生細胞を２つの画分、顆粒画分（10000×gより高く、かつ
100000×gを超えないで10分間遠心分離することによって沈殿しうる成分）及び
可溶性画分（可溶性成分及び沈殿しない小さい膜フラグメント）に単純分割した
結果を意味するものである。用語「非経口投与経路」は、動物の血管、好ましくは静脈の１つに挿入される
注射針によって動物の血流中に薬物もしくは化合物を注射あるいは点滴すること
による、哺乳動物又はヒトのような動物に対する溶液中の薬物もしくは化合物の
投与を示すために用いられる。用語「経口投与経路」は、動物自体が薬物もしくは化合物を飲み込むことがで
きるように、あるいはそれを挿管法によって胃又は腸に運ぶことができるように
動物の口に薬物もしくは化合物を置くことによる、哺乳動物又はヒトのような動
物に対する溶液又は固体としての薬物もしくは化合物の投与を示すために用いら
れる。薬物もしくは化合物が胃及び腸に入るとき、それは粘膜を通して血流中に
吸収され、血流を介してその効果を及ぼすべき組織及び臓器に投与されるか、あ
るいはそれは胃及び腸において局所的に作用するであろう。

【００５４】用語「肺投与経路」は、動物自体が薬物もしくは化合物のエアゾールを吸収で
きるように薬物もしくは化合物の容器を動物の口及び／又は鼻の近くかあるいは
動物の口及び／又は鼻と接触して置くことによる、固体又は液体粒子のいずれか
を有するエアゾールとしての動物、例えば哺乳動物又はヒトに対する薬物もしく
は化合物の投与を示すために用いられる。薬物もしくは化合物が末梢の細気管支
及び肺胞に入るとき、それは肺胞膜を通して血流中に吸収され、血流を介してそ
の効果を及ぼすべき組織及び臓器に投与されるか、あるいはそれは肺において局
所的に、肺、血管及び筋肉細胞ならびにそこに存在するあらゆる他の細胞型に対
して作用するであろう。用語「皮膚経路投与」は、溶液中に溶かした又は固体としての薬剤又は化合物
を哺乳類やヒトなどの動物の皮膚上に配することによる、薬剤又は化合物の動物
への投与を示すのに用いられる。薬剤は、その後、皮膚に浸透し皮膚下の血管に
入り、血流に取り込まれ、血流を介して、その効果の発揮される組織及び臓器に
投与される。薬剤はまた、皮膚上の適用部位で局所的にその効果を発揮してもよ
い。用語「直腸経路投与」は、溶液中に溶かした又は固体としての薬剤又は化合物
を哺乳類やヒトなどの動物の直腸腔中に配することによる、薬剤又は化合物の動
物への投与を示すのに用いられる。薬剤又は化合物は、粘膜を介して血流中に取
り込まれ、血流を介して、その効果の発揮される組織及び臓器に投与されるか、
又は、直腸及び大腸の一部に局所的に作用する。

【００５５】いくつかのIKK及び非常に多数のホスホジエステラーゼ（PDE:s）が知られてい
る。それらは機能上の基準に従いファミリーにグループ分けされている。各ファ
ミリーには、異なる遺伝子でエンコードされたいくつかのメンバーであるイソ型
が存在する。各イソ型は、いくかのスプライス変異体を生じてもよい。この階層
は、配列レベルで明らかにされている。イソ型は、他のファミリーのメンバーよ
り互いに類似している。スプライス変異体は、他のPDE:sより互いに類似してい
る。それぞれの特定のPDEには、従って、それ自体に固有の配列、及び、イソ型
間及び／又はファミリー間で共通の配列が含まれている。標的IKK及びPDEの細胞
内分布に影響を及ぼす薬物を同定するためのプログラムを立ち上げる際には、ま
ず既知のIKK又はPDE:sから標的を選択する必要がある。これは様々な基準に従っ
て行ってもよい。第1の基準は、標的のIKK又はPDEが、薬物の効果を発揮させよ
うしている組織又は細胞タイプに存在することが必須であるという基準である。
第2の基準は、標的、又は特定の固定部位／標的部位が、薬理効果が所望されな
い組織又は細胞タイプに存在しないことが望ましいという基準である。

【００５６】組織又は細胞タイプに関係してIKK及びPDE:sの発現パターンを確立するには、
mRNAの検出法、例えば十分に確立された手順であるノーザン解析を用いるのが最
もよい。簡潔には、所定の源から単離したmRNAを、配列がｍRNA又は興味あるｍR
NAのある領域に相補的である標識クレオチドでプロービングする。このアッセイ
では、研究者が、プロービングの厳格性を決定することができ、即ち、得られた
シグナルと配列類似性との関連を明らかにすることができる。第1の工程として、IKK又はPDE:sのヌクレオチド配列を編集し調べ、それによ
り、特定のIKK又はPDE:sに固有の領域、及び、いくつかの又は多くの又は全ての
IKK間又はPDE;s間で共通の領域を同定する。ヌクレオチド配列は、遺伝情報、例
えば周知の情報源であるGenBankの預託に見出されるかもしれない。配列を調べ
るのに、いくつかの又は多数の配列をアラインするように開発されたコンピュー
タープログラムを利用し、類似した領域やその欠失に注目するのがよいかもしれ
ない。こうしたことの多くは、例えば、S.R.Swindell編集の配列データ解析ガイ
ドブック、Methods in Molecular Biology vol.70（1997）Humana press Inc. T
otowa, New Jerseyに非常に詳細に記載され説明されている。１個のIKK又はPDE
に固有の配列、又は、いくつか又は多くのIKK間又はPDE:s間でそれぞれ共通の配
列を同定する際、これらの配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを設計し合
成してもよい。これらのプローブをmRNA検出に用いることは、研究コミュニティ
ーで十分に確立されている（例えば、A.J.Harwood編集のBasic DNA and RNA Pro
tocols、Methods in Molecular Biology vol.58（1996）Humana press Inc. Tot
owa, New Jersey参照）。例えば、生命工学により、特定されたオリゴヌクレオ
チドが合成されている。

【００５７】オリゴヌクレオチドプローブに加え、関心のある組織及び細胞型から抽出され
た、好ましくはノーザン解析に用いやすい形態のmRNAが必要である。いくつかの
の会社、例えばInvitrogen及びClontechが、このような材料を提供している。簡
潔には、それらの会社は、膜に固定させた非常に多くのヒト及び非ヒト組織又は
細胞タイプから抽出されたRNAを、アレイ分別又はサイズ分別されたRNAとして提
供している。次の工程では、検出可能な標識をオリゴヌクレオチドプローブに付ける必要が
ある。標識は、従来的には放射性同位体の形態であるが、化学発光試薬又は蛍光
性薬剤であるのが有利かもしれない。例えば、Keller及びManakによるDNA Probe
s（1993）Macmillan出版社を参照されたい。いくつかの会社、例えばAmbion Pro
be（Austin, Texas）及びMolecular Probe（Eugene, Oregon）が、ヌクレオチド
プローブを標識する試薬を提供している。実際のプロービングの手順には、固定
させたmRNAをプローブに接触させること、結合していないプローブを洗い流すこ
と、及び、試験条件下で結合しているプローブからのシグナルを検出することが
含まれ、ポジティブシグナルは、試験した試料にプローブの標的が存在していた
ことを示す。試験は、最も簡単な形では、「1対1」であり、即ち、ｍRNAのそれ
ぞれの試料がそれぞれのプローブに曝される。しかしながら、IKK又はPDE:sの配
列階層を活用し、まず、複数の源からのmRNAのアレイをファミリー特異的プロー
ブでプロービングし、次いで、第1のポジティブを同位体特異的プローブで調べ
、その後、第2のポジティブを非常に特異的プローブで詳細に調べるのが有利か
もしれない。プローブに異なる弁別可能な蛍光性標識を付加すれば、プロービン
グを増やすこともでき、一回の実験で複数のプローブから情報が得られる。

【００５８】解析の成果は、IKK及びPDE:sの発現パターンに関する情報である。発現パターンに基づき、さらなる検討のため、特定のIKK及び／又はPDE:sが選
択され、遺伝子プローブが構築される。一般的に、遺伝子プローブ、即ち、「GeneX」-GFP融合又はGFP-「GeneX」融合
は、「GeneX」特異的プライマーを用いたPCRを経て、クローニング工程に付され
、「GeneX」をGFPとインフレームで融合して、構築される。融合には、「GeneX
」とGFPとの間（例えば、プラスミドにおけるマルチクローニング部位領域の一
部）にショートベクター由来の配列が含まれ、これは、得られた融合タンパク質
において「GeneX」とGFPとのペプチドリンカーとなる。融合は、通常の研究室の
方法であるポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて行ってもよい（例えば、B.A.Whit
e編集のPCR Protocols／Methods in Molecular Biology vol.15（1993）Humana
press Inc. Totowa, New Jersey参照）。

【００５９】より詳細には、上記工程には、 − 遺伝子特異的プライマーの設計。遺伝子配列を調べることにより、PCR反応
に用いる遺伝子特異的プライマーを設計することができる。代表的には、遺伝子
をGFPの後で融合する場合、即ちGFP-「GeneX」融合の場合、トップ鎖プライマー
には、遺伝子のATG開始コドンとそれに続く約20ヌクレオチドが含まれ、ボトム
鎖プライマーには、終止コドンとそれに先立つ約20ヌクレオチドが含まれる。遺
伝子をGFPの前で融合する場合、即ち「GeneX」-GFP融合の場合、終止コドンを回
避しなければならない。任意には、GeneXの全長配列を融合に用いず、シグナル
への応答でGeneXのような局在化し再分布する部分のみを用いてもよい。遺伝子特異的配列に加え、プライマーには、制限酵素に対する少なくとも1個
の認識配列が含まれ、それにより、PCR産物のその後のクローニングが可能とな
る。部位は、PCR産物において固有でかつクローニングベクターの部位に適合す
るように選択する。さらに、融合遺伝子の正しいリーディングフレーム及び／又
は翻訳開始コンセンサス配列を確立するためには、制限酵素部位と遺伝子特異的
配列との間に正確な数のヌクレオチドが含まれる必要がある。最後に、プライマ
ーには常に制限酵素部位の前に2、3個のヌクレオチドが含まれ、その酵素で効率
的に消化が行われるようになっている。

【００６０】 − 増幅されるべき遺伝子の源の同定が含まれる。PCR反応により遺伝子特異的
プライマーで産物を生産するためには、遺伝子配列が、反応物に例えばcDNAの形
態で最初に存在しなければならない。先に行われた伸長発現解析の結果から、ど
の組織が源材料として有用であるかということに関する明らかな情報が得られる
であろう。様々な種由来の非常に多様な組織又は細胞型からのcDNAライブラリー
が、例えばClontech（Palo Alto）、Stratagene（La Jolla）及びInvitrogen（S
an Diego）から市販されている。多くの遺伝子もクローンの形態で、American T
ype Tissue Collection（Virginia）から入手可能である。 − PCR反応を最適化することが含まれる。いくつかの因子が、プライマーのア
ニーリング温度、反応物中のイオン濃度、注目に値するところではMg²⁺及びK⁺濃
度ならびに反応物のpHを含むPCR反応の効率及び特異性に影響することが知られ
ている。PCR反応の結果が満足すべきものでない場合、上記のパラメーターが最
適でないためかもしれない。種々のアニーリング温度を、例えばStratagene（La
Jolla）から入手可能な温度勾配内臓のPCR装置を用いて試験し、並びに／ある
いは、種々の緩衝液組成物、例えばStratagene（La Jolla）から入手可能なOpti
Prime 緩衝液系を試みるべきである。 − PCR産物をクローニングすることが含まれる。プライマーを設計する場合、
増幅させた遺伝子産物をクローンし、GFPと融合させたベクターについては既に
考慮されている。ベクターを選択する際には、プローブがその後、どの細胞型で
発現するかを少なくとも考慮し、プローブのプロモータ制御発現が細胞に適合す
るようにする必要がある。殆どの発現ベクターには、1以上の選択マーカー、例
えば、安定なトランスフェクタントの生産を所望する際の有用な特徴である、薬
剤耐性付与も含まれる。その選択マーカーもまた、用いる細胞に適合性であるべ
きである。

【００６１】 PCR産物の実際のクローニングは、一般的に2個の異なる制限酵素で消化したフ
ラグメントをその同じ2個の酵素で消化したベクターに一工程でクローニングす
るため、当業者には困難ではないはずである。このクローニングに問題が生じる
とすれば、それは、制限酵素がPCRフラグメントと十分に作用しなかったためで
あるかもしれない。この場合、プライマーの末端に長い伸長部を付加して、フラ
グメント末端に近くで生じ得る不消化を克服するか、又は制限酵素での消化に基
づかない中間的なクローニング工程を導入することが可能である。いくつかの会社、例えばInvitrogen（San Diego）及びClontech（Palo alto）
は、この方法のためのシステムを提供している。遺伝子をクローニングし、そのプロセスにおいてGFP遺伝子と融合した後は、
通常はプラスミドである得られた生成物を、注意深くチェックし、予想された通
りであることを確認すべきである。最も正確な試験は、融合遺伝子のヌクレオチ
ド配列を得ることであろう。

【００６２】プローブのためのDNA構築物を生成した後は、構築物を以下の試験に付すこと
により、その機能性及び有用性を試験してもよい。 − プローブを発現できる細胞にそれをトランスフェクトする。細胞の蛍光を、
直後に、一般的には翌日に調べる。この時点で、細胞蛍光の2つの特徴に注意す
る。 − 強度が、細胞中の非融合GFPの強度と少なくとも同等である。そうでない場
合、プローブDNAの配列又は質が誤っている可能性があり、注意深くチェックす
べきである。 − 細胞下局在化は、プローブが良好に働くか否かの指標である。それが、問題の遺伝子に予想されるように局在化している場合、例えば核から
排除されている場合、直ちに機能試験に付すことができる。トランスフェクショ
ン手順直後にプローブが局在化しない場合、この時点における過剰発現のためで
あるかもしれない。というのは、細胞が通常、非常に多数のプラスミドのコピー
を取り、局在化が、プラスミドのコピー数及び発現レベルの低減に従い、例えば
2、3週間内に生じるからである。局在化が、時間を延長しても生じない場合、そ
れは、GFPへの融合が局在化機能を破壊したため、例えば、その正常細胞固定-タ
ンパク質との相互作用に不可欠なタンパク質配列をマスクしたためである可能性
がある。この場合、例えばGeneX-GFPが働かない場合にGFP-GeneXが働く、という
ように反対の融合が働くが、これは、GeneXの異なる2個の部分が、GFPへの近位
性に影響されるためである。反対の融合が働かない場合、いずれかの末端でのGF
Pの近位性に問題があるかもしれない。DNA構築物中でのGeneXとGFPとの間により
長いリンカーを組み込むことにより、距離を伸ばすようにすることができる。

【００６３】局在化の事前知識がなく、局在化が観察されない場合は、プローブがこの時点
で局在化される必要がないからで、そのことがGFPに融合したタンパク質の性質
であるからかもしれない。これは、次いで機能試験に付すべきである。機能試験では、プローブを発現している細胞を、既知の少なくとも1個の化合
物で処理し、通常は、細胞内で再分布させることによりプローブがレポートする
と予想されるシグナル経路を活性化して、攪拌(perturb)する。再分布が予想された通りである場合、例えば、事前知識により、位置Xから位
置Yまで、再分布を転位させるべきである場合には、それを第1の臨界試験に付す
。この場合、さらに応答の特徴づけと定量化に付す。

【００６４】再分布が予想されたように働かない場合には、細胞が、シグナル経路の少なく
とも1成分、例えば細胞表面受容体を欠いているためであるかもしれない。又は
、例えばプローブがヒト遺伝子産物の配列情報に基づいてモデル設計されたもの
であり、かつ、細胞がハムスター由来である場合には、種間不適合性が存在する
ためであるかもしれない。いずれの例においても、これらの問題が生じない試験
プロセスで他の細胞型を同定する必要がある。再分布のパターンについての事前
知識がない場合、再分布の解析をより徹底して行い、何が必須でかつ指示的特徴
か、いつそれが明らかになるのか、ということについての同定を行い、応答のさ
らなる特徴づけ及び定量化に付す必要がある。再分布の特徴が同定されない場合、上に述べた問題点が生じるかもしれず、従
って、より最適な細胞条件下でプローブを再試験する必要がある。

【００６５】現在の発見計画でのcDNAライブラリーのクローニングのためのライブラリーは
、当然、計画の標的組織に関する。喘息治療に有用なリード化合物を最終的に見
出すため、1以上の以下の組織又は細胞型：気管支平滑筋、肺微小血管内皮細胞
、好酸性顆粒球、Th1又はTh2リンパ球、及び肺胞マクロファージから、クローニ
ングライブラリーを得ることが好ましい。慢性炎症性疾患治療に有用なリード化合物を最終的に見出すためには、1以上
の以下の組織又は細胞型：Th1又はTh2リンパ球、Tリンパ球、Bリンパ球、単球、
好酸性顆粒球、好中性顆粒球、好塩基性顆粒球、組織特異性マクロファージ(例
えば肝クッパー細胞及び皮膚ラングハンス細胞)、微小血管内皮細胞、血管内皮
細胞、抗原提示細胞、関節結合細胞、及び滑膜細胞から、クローニングライブラ
リーを得ることが好ましい。うつ病治療に有用なリード化合物を最終的に見出す
ためには、ノルアドレナリン作用性ニューロンを含む脳の種々の1以上の組織領
域から、クローニングライブラリーを得ることが好ましい。時差ぼけ又は概日リ
ズムリセット治療に有用なリード化合物を最終的に見出すためには、松果体、視
床下部、黒質のような脳の種々の1以上の組織からクローニングライブラリーを
得ることが好ましい。高血圧及び低血圧及び勃起不全治療に有用なリード化合物
を最終的に見出すためには、1以上の以下の組織又は細胞型：血管平滑筋、脈管
系の動脈側の抵抗血管からの血管平滑筋、脈管系の静脈側の容量血管からの血管
平滑筋、小動脈、細動脈、細静脈又は静脈、T/G HA-VSMCA10及びA7r5のような血
管平滑細胞系から、クローニングライブラリーを得ることが好ましい。

【００６６】細胞は常に動物由来、最も可能性のあるものとしては哺乳類由来、好ましくは
ヒト由来であるべきである。細胞は、正常な組織由来、又は、計画に関して関心
のある疾病もしくは症状を有する個体動物の組織由来であってもよい。細胞は、
始原細胞クローンが上記組織又は細胞型に由来する、致死細胞系又は不死細胞系
であってもよい。発見計画に応じてスクリーニングアッセイに興味ある細胞は様
々であるが、上記カテゴリーから選択してもよい。関心のあるタンパク質と以下「オリジナル蛍光プローブ」と称する発光団とを
含有する遺伝子構築物を、「クローニングライブラリーのための好ましい細胞タ
イプ」と上で記載したような、関連細胞型にトランスフェクトした後に、空間的
分布又はランダム分布された細胞内蛍光の様子について細胞をモニターする。実
際のタンパク質の分布に関する事前知識に基づき、種々のパターンが予想できる
。例えば、先の研究により、分別した細胞の微粒子画分にのみ関連するタンパク
質が見出された場合、原形質膜、内部膜／オルガネラ構造又は微小管及び微細線
維のような構造的細胞質顆粒要素へのオリジナル蛍光プローブの空間分布が見出
されると予想される。他方、先の研究により、タンパク質が、分別した細胞の可
溶画分に主として見出されることが報告される場合、細胞質全て、そしておそら
く核にもオリジナルプローブの同種分布又は非同種分布が見出されると予想され
る。先の研究により、分別した細胞の微粒子画分及び可溶性画分に混合局在化が
見出されたタンパク質では、オリジナル蛍光プローブに関する上記の2個の分布
パターンにおけるいずれかの混合が予想される。事前知識が手元にないタンパク
質では、簡単な細胞分別及びウェスタンブロッティング法を行うことができ、関
連する固定細胞の免疫組織化学を用いるか、又は、オリジナル蛍光プローブにつ
いて観察された分布に依存することを決定することができる。計画のこの段階に
おいて、上に概説した研究の後、オリジナル蛍光プローブの正常な分布パターン
が確立されるかもしれない。オリジナル蛍光プローブの分布パターンに関する、
生理学的に重要でかつ関連する細胞活性化の効果も確立される。分布パターンが
変化したか否か、即ち、オリジナル蛍光プローブの再分布が、生理学的に重要で
かつ関連する影響の適用の結果として生じたか否かも、明らかになる。

【００６７】ここに記載のストラテジーは、生物活性ポリペプチドとその固定／調節パート
ナーとの間で生じるタンパク質とタンパク質との相互作用に干渉し、それにより
、生物活性ポリペプチド作用の細胞環境内での効果と干渉し得る化学物を探すた
めに用いられる。このストラテジーは、異なる効果を有し、相互作用の性質に応
じてわずかに異なる発見方法を必要とする。その可能性は、以下の通りである。
１）生物活性ポリペプチドは永久的にその標的点に位置し、そこで永久的に
活性のままであるか、又は、その活性がリン酸化のような翻訳後修飾又はモジュ
レーターの非触媒調節部位への結合によって、なんらかの意味でモジュレートさ
れる。標的部位からの転位により、生物活性ポリペプチドが、作用の局所部位か
ら取り除かれ、その結果、その固有の触媒活性の失活にもつながる。２）生物活性ポリペプチドは永久的にその標的点に位置するものであり、そ
の活性が、リン酸化のような翻訳後修飾又はモジュレーターの非触媒調節部位へ
の結合により、なんらかの意味でモジュレートされるまでは不活性状態にとどま
る。標的部位からの転位により、生物活性ポリペプチドが、作用の局所部位から
取り除かれ、その最初の固定部位から離れているにも係わらず、その固有の触媒
活性の活性化にもつながる。

【００６８】３）生物活性ポリペプチドは、その非結合形態又は非標的形態では不活性で
あり、（上の「１」で記載したように）活性化又は部分活性化された場合、細胞
内で再分布し、その標的部位に結合する。その活性は、固定部位に拘束され、か
つ、固定タンパク質もしくはなんらかの関連因子との相互作用により高められる
可能性があり、又は、固定タンパク質もしくは関連調節因子により後に阻害され
る可能性がある。生物活性ポリペプチドがその固定部位又は標的部位と結合する
のを妨げるいずれかの薬剤により、生物活性ポリペプチドが、好ましい作用部位
に位置することが妨げられる。また、適切な刺激により、生物活性ポリペプチド
が、非ターゲッティング状態である間は、十分に活性化することが妨げられるか
もしれない。４）生物活性ポリペプチドは、その非結合形態又は非標的形態では活性であ
り、（上の「１」で記載したように）不活性化又は部分不活性化された場合、細
胞内で再分布し、その標的部位に結合し、それにより、その活性は、固定タンパ
ク質もしくはなんらかの関連因子との相互作用により阻害される。それに続く刺
激により、生物活性ポリペプチドが活性化され、放出されてもよい。生物活性ポ
リペプチドがその固定部位又は標的部位と結合するのを妨ぐいずれかの薬剤によ
り、生物活性ポリペプチドが、固定部位に再位置することが妨げられ、生物活性
ポリペプチドが、不活性化することも妨げられるかもしれない。さらに、生物活
性ポリペプチドがその固定部位に標的する場合、その後、生物活性ポリペプチド
が非標的状態において適切に活性化されることは可能でないかもしれない。

【００６９】 GFPベースのIKK又はPDEプローブの特異的細胞下分布を同定する際、IKK又はPD
Eのどの部分が、この作用の原因となったかを絞り込むことが有利であるかもし
れない。有利な点には２つの面がある。絞り込むことにより、ペプチドリードの
設計が暗示され、最終的に結合パートナーを定義する助けとなるかもしれない。
特異的結合に係わる両パートナーの知識により、特異的結合を阻害するスクリー
ニングのための化合物ライブラリーを選択する助けとなるかもしれない。特異的結合に係わるIKK又はPDEの領域を同定するため、IKK又はPDEの次第に短
くなる部分とのGFPベースの融合を形成し、これらの構築物の細胞分布を調べて
もよい。機能的ドメインの事前知識があれば、細胞下構造に特異的結合を付与す
ると考えられるドメインから開始してもよい。試験される構築物の生産は、GFP
に融合するIKK又はPDEの特定部分を選択することからなるか、又は融合のIKK又
はPDE部分におけるインフレーム欠失の生成を伴ってもよい。分子遺伝子学研究
では、両方の方法が広く用いられている。

【００７０】 IKK又はPDEに特異的細胞下分布が付与される原因となったと思われる領域を同
定する際、より詳細な解析、例えば、それらを1個ずつ例えばアラニン残基で置
換する、分子遺伝子研究でも広く用いられているいわゆるAlaスキャンにより、
この形質にとって最も重要なアミノ酸残基を同定してもよい。 IKK又はPDEの特異的分布に関与する細胞タンパク質の同一性を同定するため、
細胞下分布の原因となったIKK又はPDEの領域に関する知識を活用してもよい。例
えば、IKK又はPDEの領域を遺伝子上の2ハイブリッドスクリーンにおけるおとり
（bait）として用い、その結合パートナーを引き出してもよい。いくつかの会社
、例えばLife Technologiesが、2ハイブリッドシステムを提供している。オリジナル蛍光プローブの正常な分布についての知識を用いることにより、末
端アミノ酸配列（又は全アミノ酸配列）のどの部分がこの蛍光プローブを細胞下
内構造へ結合させるのに重要であるかが判明し、細胞内における特異的な空間分
布パターンを得て、このパターンがこの蛍光プローブの正常分布としていつ確立
されるかが確認される。これは、オリジナル蛍光プローブの短いN又はC末端配列
又は内部配列の組織的な欠失（DNA塩基数）がなされている新しい蛍光プローブ
を作ることにより、行ってもよい。オリジナル蛍光プローブ構築物のこれらの新
しいより短い変異体を関心のある細胞にトランスフェクトし、次いで、それらの
細胞について、オリジナル蛍光プローブに関して上記した新しい蛍光プローブの
空間分布を調べる。新しい蛍光プローブ分布パターンがオリジナル蛍光プローブ
分布パターンとは異なるそれらの細胞では、一部又は全体の標的配列が欠失され
ていることは明らかである。失われた部分のDNA配列又はアミノ酸配列には、従
って、オリジナル蛍光プローブとその細胞内結合部位との結合に必要な構造情報
が含まれている。

【００７１】オリジナル蛍光プローブについて確立された正常分布阻害のためのポリペプチ
ドを、試験するアミノ酸配列オリジナル蛍光プローブにおける誘導された標的配
列が、無傷の生細胞におけるオリジナル蛍光プローブの実際の空間分布に重要な
配列である、という仮説に従って設計する。これは、誘導された標的配列又はそ
の一部と同一のアミノ酸配列のペプチドを生産し、マイクロ注入又は一時又は永
久透過によってオリジナル蛍光プローブを含む細胞の細胞質にそれらを導入し、
その後、細胞中のオリジナル蛍光プローブの空間分布をモニターすることにより
行う。推測される標的配列(類)が完全な生細胞におけるオリジナル蛍光プローブ
の実際の空間分布に重要である場合、導入したペプチドは、オリジナル蛍光プロ
ーブの固定部位と自己結合し、それによりオリジナル蛍光プローブの正常分布が
破壊される。この効果を生じるためには、ペプチドの導入によりオリジナル分布
パターンを変化すべきであり、導入前のパターンに比較して10％以上の蛍光の減
少が検出できる。これは、ペプチド投与前後に同じ細胞を観察することにより行
われる。この基準を満たすペプチドが見出された際、それらを「ペプチドリード
」と称したので、以後この表現を用いる。これらのペプチドリードは、オリジナ
ル蛍光プローブの空間分布を破壊するのに最終的に用いられ得る有機分子の設計
の基礎としてのみならず、スクリーニングアッセイにおける対照化合物として、
現在用いることができる。

【００７２】 PS473及びその誘導体は、上記プローブの標的化をモジュレートする化合物の
スクリーニングに価値のあるアッセイシステムの確立を可能とする不連続な分子
内位置を示す。IKKβは、IカッパB複合体の複数の成分と相互作用する。記載さ
れたアッセイシステムの構造により、特定の又は複数の標的部位と相互作用する
化合物をスクリーニングすることができる。この方法は、IKKβ（又は他のIKK）
の複数の標的部位の1つ（又はいくつか）の変調を介して、NF-カッパB活性の一
部又は完全な抑制を生じる化合物の開発を可能にする。さらに、細胞特異的固定
により、所定の細胞型にのみ影響を及ぼす化合物の設計が可能となる。ペプチドリードを明らかにする上記工程に平行して、オリジナル蛍光プローブ
に対して見出される分布パターンを、オリジナル蛍光プローブがベースになって
いるタンパク質の天然に存在する空間分布に比較する。これは、関心のある組織
から分離された又は関心のある組織中に未だ存在する固定された始原細胞とオリ
ジナル蛍光プローブを含む固定細胞を観察することにより、行う。その後、通常
の免疫細胞化学及び免疫組織化学の方法を用いてタンパク質を染色し、この染色
手順により明らかにされる空間分布を、オリジナル蛍光プローブの空間分布と比
較する。この工程で得られた2個のパターン間に高い相関関係が観察されること
が望ましいが、必ずしもそうでなくてもよい。

【００７３】一次スクリーニングアッセイの確立は通常、オリジナル蛍光プローブを含む関
心のある細胞を、スクリーングアッセイの基礎として利用することにより行われ
る。細胞を生理学関連の影響に付す際にオリジナル蛍光プローブの挙動に関して
得られた知識に応じて、アッセイ手順は選択される：1．蛍光プローブが通常、
特定の部位にターゲットされ、細胞内経路の刺激の間にこれらの部位に結合した
状態でとどまる場合、アッセイは、物理的に無傷の又は透過された生細胞の標的
部位からのオリジナル蛍光プローブの転位を検出するように設計されていること
が好ましい。このアッセイでは、影響に曝した後数分のうちに転位が検出され、
検出の時間フレーム及び細胞を影響に曝す時間を、それに合うように選択する必
要がある。2．既に標的化されている蛍光プローブを転位することよりも実際の
標的化事象を破壊することが望ましい場合、影響により検出可能な応答を生じる
には、数時間が必要であるかもしれない。オリジナル蛍光プローブの正常な分布
パターンに比べ、蛍光又は発光分布パターンにおいて依然として変化している実
際の測定は、2つの時間点：影響によりなんらかの作用が生じる前後に行われて
もよい。このアッセイでは、影響の作用により検出可能な応答を生じるには数時
間が必要であるかもしれず、検出の時間フレームと細胞を影響に曝す時間を、そ
れに合うように選択する必要がある。3．蛍光プローブが、細胞内経路の活性化
に際して2個の細胞内部位内に正常に再分布する場合、最初の標的化の破壊又は
その最初もしくは残りの固定部位からのオリジナル蛍光プローブの転位を所望し
てもよい。この場合、上の手順１を用いてもよい。オリジナル蛍光プローブと部
位との結合抑制が望ましい場合、細胞内経路の活性化の間にそれを再分布し、こ
の部位の標的配列をリードペプチド生成の焦点とすべきである。このアッセイで
は、再分布が、影響に曝した後数分のうちに検出され、検出の時間フレーム及び
細胞を影響に曝す時間を、それに合うように選択する必要がある。さらに、その
再分布に際してオリジナル蛍光プローブの標的化を抑制するために、細胞内経路
の活性化前に細胞をいずれかの影響に曝す必要がある。

【００７４】オリジナル蛍光プローブ及びペプチドリードを、実際の一次スクリーニングア
ッセイに用いる間、影響を及ぼさないことが望ましいタンパク質イソ型に指向し
たカウンタースクリーンを行うことも望ましい。これを行うため、GFPで標識し
たタンパク質イソ型をエンコードする新しい蛍光プローブのための構築物をつく
る。これらの構築物を、次いで、関心のある細胞にトランスフェクトする。新し
い蛍光プローブが細胞で発現すると、細胞のいくつかを、カウンタースクリーン
に用いることのできる新しい細胞系の基礎として選択する。この目的に適したプローブは、IKKα、IKKβ、IKKγ又はNIK及びGFP；PDE1、P
DE2、PDE3、PDE4、PDE5、PDE6、PDE7、PDE8、PDE9又はPDE10及びGFP；PKA触媒サ
ブユニット及びGFPの形態からなる融合ペプチドをエンコードするDNA構築物を含
む。好ましい具体例において、DNA構築物は、イソ型のIKKβ、PDE4、mPDE5、PKA触
媒サブユニット及びGFPからなる融合ペプチドをエンコードする。非常に好ましい具体例において、DNA構築物は、表１から選択される。

【表１】ここに記載した名称ならびに構築物及び全長アミノ酸配列をエンコードするDNA
配列の関連SEQ ID NOによるこの発明の融合構築物のリスト

【００７５】関心のあるタンパク質の所望のイソ型をその同じタンパク質の他のイソ型に比
較してより特異的に転位させるペプチドリードを確立するために、一次スクリー
ン及びカウンタースクリーンのために確立した細胞系を用いる。ペプチドリード
を上記の細胞に導入し、オリジナル蛍光プローブ及びカウンタースクリーン蛍光
プローブの空間分布の変化を定量し、用量−応答関係を各リードペプチドについ
て確立する。その後、用量−応答関係を比較する。カウンタースクリーンにおい
て少なくとも10％の蛍光プローブを転位させるのに必要なペプチドの用量が、10
％のオリジナル蛍光プローブを転位させるのに必要な用量の少なくとも2倍であ
る場合に、ペプチドリードは、オリジナル蛍光プローブに特異的であると考えら
れる。一次スクリーンの用量−応答関係とカウンタースクリーンの用量−応答関
係とを比較した場合の用量の違いが最も大きいリードペプチドを、発見計画の次
の工程の基礎として選択する。ある具体例において、一次スクリーニングアッセイにおいてオリジナル蛍光プ
ローブの転位、標的化の破壊又は再分布の抑制を生じるペプチドリードの能力と
、カウンタースクリーンにおいて新しい蛍光プローブの転位、標的化の破壊又は
再分布の抑制を生じるペプチドリードの能力とを比較する手順を用いてペプチド
リードの特異性を明らかにするために、一次スクリーニングアッセイ及びカウン
タースクーンを用いる。

【００７６】好ましい具体例において、一次スクリーニングアッセイで少なくとも10％のオ
リジナル蛍光プローブについて定量される転位、標的化の破壊又は再分布の抑制
を生じるのに必要なペプチドリードの用量は、カウンタースクリーンで少なくと
も10％の新しい蛍光プローブについて定量される転位、標的化の破壊又は再分布
の抑制を生じるのに必要な用量の50％又はそれよりも少ない。この発明により、
一次スクリーニングアッセイの結果が始めにくるようにして、一次アッセイで最
大半分効果を生じるのに必要な用量をカウンタースクリーンで最大半分作用を生
じるのに必要な用量と比較した、数値関係を示す特異性指数が得られる。ある具体例において、発見計画でさらに用いられるために選択されたペプチド
リードは、1〜2の特異性指数を有する。別の具体例において、発見計画でさらに用いられるために選択されたペプチド
リードは、1〜2及び1〜10の特異性指数を有する。さらに別の具体例において、発見計画でさらに用いられるために選択されたペ
プチドリードは、1〜11及び1〜100の特異性指数を有する。さらに別の好ましい具体例において、発見計画でさらに用いられるために選択
されたペプチドリードは、1〜100よりも多い特異性指数を有する。

【００７７】リードペプチドを用いることにより、この計画で関心のある状態又は疾病を処
置する薬剤として有用な生物活性物質を見出すためのスクリーニングアッセイに
有用であり得る小さな有機分子のライブラリーをつくり、選択することができる
。この工程において、リードペプチド又はペプチドに関するアミノ酸配列情報及
び他の構造情報は、オリジナル蛍光プローブの正常な空間分布パターンでのリー
ドペプチドの作用を模する生物活性有機分子を見出し及び/又は明確にし、かつ
合成するのに有用な情報を引き出すために、用いられる。こうした化合物は、こ
の計画で関心のある状態又は疾病を処置する薬剤として有用であるかもしれない
。この発見計画により選択されるペプチドリードは、従来の化学知識及び推定上
の化学的方法を用い、リードペプチドに固有の構造及び化学情報に基づいて化合
物ライブラリーを設計し組立てるのに用いられる。これにより、化合物が、IKK
β、PDE4D X又はmPDE5の標的配列に相互作用又は結合する能力を付与する構造を
有し、その後、一次スクリーニングアッセイにおいて10又は100μmolの各化合物
濃度で化合物ライブラリーが試験される。

【００７８】化合物のライブラリーが明らかにされ、手元にあれば、一次スクリーニングを
開始する。この手順において、オリジナル蛍光プローブを含む細胞を化合物に接
触させる。これらの化合物は全て、ただ1つの濃度又は2、3の濃度、通常は10及
び100μmol濃度で、定量蛍光再分布アッセイを用いて非常に平行した状態で試験
する。アッセイの定量応答における変化（0（再分布に変化なし）〜100％で定義
される応答スケール）が所定値より大きく、代表的には、10〜100％である化合
物は、「一次ヒット」であると考えられる。この一次ヒットはさらに：1．一次
クリーニングアッセイを用いてリードペプチドに比較される用量−応答関係を確
立することによって効能について特徴づけされ、2．カウンタースクリーニング
における用量−応答関係を確立することによって選択性について特徴づけられる
。代表的には、一次アッセイにおける化合物の最大半分作用が10〜100μmol濃度
の化合物で得られる場合に低い効能を有する一次ヒットは、発見計画のこの工程
以降で用いられる可能性が低いため、カウンタースクリーンでの試験が必要でな
いかもしれない。カウンタースクリーニングと比べ、一次スクリーニングアッセ
イで効能が同等又は低い一次ヒットは、非選択的とみなされ、発見計画のこの工
程以降に用いられる可能性が低い。カウンタースクリーンにおいて最大半分作用
を付与する50％又はそれより低い濃度で一次スクリーニングアッセイにおいてな
んらかの選択性、代表的には最大半分作用示す一次ヒットは、化合物の新しいラ
イブラリーのさらなる化学合成又は構築の基礎として注目すべきものと考えられ
、以下「一次リード化合物」と称する。

【００７９】一次スクリーニングアッセイでペプチドリードに観察される応答の欠如及び最
大応答に基づく0〜100％の応答スケールで、アッセイの定量応答において所定値
以上に変化をもたらす化合物を選択し、「一次ヒット」と称する。ある具体例において、所定値は、10％である。別の具体例において、所定値は、50％である。さらに別の具体例において、所定値は、70％である。ある具体例において、一次ヒットはさらに、効能及び最大作用については、用
量−応答関係を確立して、それを一次スクリーニングアッセイを用いたリードペ
プチドの作用と比較することによって、及び、選択性については、カウンタース
クリーンにおける用量−応答関係を確立することによって特徴づけられる。一次ヒットは、10μmol濃度より高い濃度に対応する用量で最大半分効能を示
す場合、又は1〜2未満の特異性指数を示すために、発見計画によりはずされるか
もしれない。一次ヒットは、10μmol濃度又はそれよりも低い濃度に対応する用量で最大半
分効能を示す場合、又は、1〜2より大きい特異性指数を示すために、発見計画に
より選択され得る。これらの化合物を、以下「一次リード化合物」と称する。

【００８０】構造−活性関係（SAR）は、化合物ライブラリー組成物の繰り返し、及び、薬
剤候補リードを明らかにするためのスクリーニングにより構築される。この工程
は、この計画で関心のある疾病又は状態を処置するための望ましい特性を有する
生物活性化合物を見出す可能性をさらに高めるために、含まれる。一次リード化
合物がここで用いられることにより、組成又は新しい振り向けられた化合物ライ
ブラリーの化学合成の基礎として使用できる化学構造情報が与えられる。1以上
の一次リード化合物構造の一部の組織的な化学修飾により、新しいライブラリー
が組み立てられる。化合物のこれらの新しいライブラリーも、一次スクリーニン
グアッセイ及びカウンタースクリーンを用いて研究される。好ましくは、用量−
応答関係が、一次リード化合物の各化学修飾について記録され、一次リード化合
物それ自体に比較される。このようにして、SARが確立される。新しい化合物の
うち、この工程において、効能と特異性の最適な組合せを有するものが、化合物
ライブラリー合成又は組成の新しいラウンドの基礎として、又は、SAR確立プロ
セスの最終工程として、この計画で関心のある根源的な生理プロセス及び病理生
理プロセスに関連するアッセイシステム及び動物での実際の薬理作用のための化
合物として選択される。後者の化合物は、以後、「薬剤候補リード」と称する。

【００８１】ある具体例において、薬剤候補リードは、1μmolより低い濃度に対応する用量
及び1〜2よりも高い選択性指標で最大半分効能を有する。ある具体例において、薬剤候補リードは、1μmolより低い濃度に対応する用量
及び1〜10よりも高い選択性指標で最大半分効能を有する。ある具体例において、薬剤候補リードは、1μmolより低い濃度に対応する用量
及び1〜100よりも高い選択性指標で最大半分効能を有する。ある具体例において、薬剤候補リードは、0,1μmolより低い濃度に対応する用
量及び1〜2よりも高い選択性指標で最大半分効能を有する。好ましい具体例において、薬剤候補リードは、0,1μmolより低い濃度に対応す
る用量及び1〜10よりも高い選択性指標で最大半分効能を有する。別の好ましい具体例において、薬剤候補リードは、0,1μmolより低い濃度に対
応する用量及び1〜100よりも高い選択性指標で最大半分効能を有する。

【００８２】薬剤候補リードは、生体外で有効性及び毒性を確認できる、組織ベース、細胞
ベース及び生化学アッセイでさらに特徴づけられる。薬剤候補リードの有効性を
試験するには多くの方法がある。好ましくは、薬剤候補リードは、この計画で関
心のある疾病又は状態の病因及び病理学に関与する根源的な生理学的プロセス及
び病理生理学的プロセスに高度に関連するアッセイシステムで試験される。同様
に、薬剤候補リードは、毒性作用、好ましくは遺伝的作用（DNAの完全性及び配
置への作用）、代謝作用（細胞代謝プロセスへの影響）、及び細胞毒作用（細胞
完全性及びオルガネラ完全性への影響）について試験される。適切な有効性を示
さない又は毒性を示す薬剤候補リードが発見計画のこの工程以降に用いられない
可能性は高い。というのは、こうした化合物が、動物に用いられる実際の薬剤と
してはあまり適しているとは考えられないからである。ある具体例では、発見計
画により選択された薬剤候補リードは、低血圧症や炎症に係わる根源的な生理学
的及び病理生理学的プロセスに非常に関連するアッセイシステムで有効性につい
て、また毒性、好ましくは遺伝的作用、代謝作用及び細胞毒作用について生体外
で試験される。その後、有効性が最も高くかつ毒性が最も低いか全くない薬剤候
補リードが、動物試験に用いられる候補に選択される。別の具体例では、発見計
画により選択される薬剤候補リードは、炎症性気道疾病に係わる根源的な生理学
的及び病理生理学的プロセスに非常に関連するアッセイシステムで有効性につい
て、また毒性、好ましくは遺伝的作用、代謝作用及び細胞毒作用について生体外
で試験され、その後、有効性が最も高く、かつ毒性が最も低いか全くない薬剤候
補リードが、動物試験に用いられる候補に選択される。

【００８３】別の具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードは、炎症性関
節病に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非常に関連するアッ
セイシステムで有効性について、また毒性、好ましくは遺伝的作用、代謝作用、
及び細胞毒作用について生体外で試験され、その後、有効性が最も高く、かつ毒
性が最も低いか全くない薬剤候補リードが、動物試験に用いられる候補に選択さ
れる。別の具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードは、炎症性腸
疾病に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非常に関連するアッ
セイシステムで有効性について、また毒性、好ましくは遺伝的作用、代謝作用及
び細胞毒作用について生体外で試験され、その後、有効性が最も高く、かつ毒性
が最も低いか全くない薬剤候補リードが、動物試験に用いられる候補に選択され
る。別の具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードは、自己免疫
疾病に係わる根源的な生理学及び病理生理学上のプロセスに非常に関連するアッ
セイシステムで有効性について、また毒性、好ましくは遺伝的作用、代謝作用及
び細胞毒作用について生体外で試験され、その後、有効性が最も高く、かつ毒性
が最も低いか全くない薬剤候補リードが、動物試験に用いられる候補に選択され
る。

【００８４】この発明の好ましい具体例において、I-カッパBの変質は、新規の機構、即ち
、特定のIKKの誤-標的化及び/又は再分布のモジュレーションにより阻害される
。IKKに係わる先の介入とは反対に、この発明には、IKK酵素活性の直接阻害が含
まれない。 IKK複合体の全体的な作用を抑制する全く新規のこの機構は、より高いIKKイソ
型選択性及び治療の高い細胞選択性が与えられるという点で明らかに有利である
。さらに、細胞特異的固定により、所定の細胞型にのみ作用する化合物の設計が
可能となる。この発明のひとつの観点は有機化合物である。有機化合物は、その中の中性分
子が、アニオン(負に帯電した分子)とプロトン(水素イオン)に可逆的に解離し得
る弱酸である。別の観点では、有機化合物は、中性分子がプロトンと組合わせる
ことによってカチオン(陽に帯電した分子)を形成し得る弱塩基である。標的配列
の官能基には、標的配列のアミノ酸の一部として、メチル基、イソプロピル基、
イソブチル基、ヒドロキシル基、チオール基、ベンジル基、ベンジロイル基、メ
チルインドリル基、メチルイミダゾリル基、アミン基、イミン基、カルボキシル
基及びアセトアミド基からなる群から選択される官能基が含まれる。

【００８５】この発明の別の観点において、有機化合物は、サイクリックヌクレオチドホス
ホジエステラーゼ又はI-カッパBキナーゼの天然の固定化部位について標的配列
の1以上の官能基と相互作用し得る1以上の化学ドメインを有する化合物である。
さらに別の観点では、有機化合物は、サイクリックヌクレオチドホスホジエステ
ラーゼ又はI-カッパBキナーゼの天然の固定化部位について標的配列の少なくと
も2つの官能基と相互作用しうる少なくとも2つの化学ドメインを有する化合物で
ある。さらなる観点では、有機化合物は、サイクリックヌクレオチドホスホジエ
ステラーゼ又はI-カッパBキナーゼの天然の固定化部位について標的配列の少な
くとも3つの官能基と相互作用しうる少なくとも3つの化学ドメインを有する化合
物である。この発明のひとつの観点において、有機化合物は、サイクリックヌクレオチド
ホスホジエステラーゼの標的配列の少なくとも2つの官能基と相互作用しうる少
なくとも2つの化学ドメインを有する化合物である。詳細な具体例では、有機化
合物は、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの標的配列の少なくと
も3つの官能基と相互作用しうる少なくとも3つの化学ドメインを有する化合物で
ある。

【００８６】発見プロセスの次の部分において、薬剤候補リードを、マウス及びラットのよ
うな動物での毒性及び有害反応に関し生体内で試験する。薬剤候補リードを、こ
の計画で関心のある状態又は疾病に高度に関連している状態又は疾患の動物での
有効性についても試験する。薬剤候補リードを、この計画で関心のある状態又は
疾病に高度に関連する疾病又は状態を有するように処置した動物での有効性につ
いても試験する。1以上のこうした動物試験で有効性を示し、満足すべき有効性
を付与する用量レベルより好ましくは2〜10倍高いレベルで見かけ上何らの毒性
も示さない薬剤候補リードを、さらなる動物試験及びヒトでの最初の試験での使
用を考慮される最終的薬剤候補に選択する。これらの化合物を、以下、「発見計
画リード」と称する。ある具体例において、発見計画により選択された薬剤候補リードを、うつ病に
係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非常に関連するアッセイシ
ステムで有効性について及び毒性、好ましくは遺伝的作用、代謝作用ならびに細
胞毒作用について生体外で試験し、その後、有効性が最も高く、毒性が最も低い
か全くない薬剤候補リードを、動物試験に用いる候補に選択する。

【００８７】別の具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、時差ぼけ
に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非常に関連するアッセイ
システムで有効性について、また毒性、好ましくは遺伝的作用、代謝作用、及び
細胞毒作用について生体外で試験し、その後、有効性が最も高く、毒性が最も低
いか全くない薬剤候補リードを、動物試験に用いる候補に選択する。別の具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、勃起不全
に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非常に関連するアッセイ
システムで有効性について、また毒性、好ましくは遺伝的作用、代謝作用、及び
細胞毒作用について生体外で試験し、その後、有効性が最も高く、毒性が最も低
いか全くない薬剤候補リードを、動物試験に用いる候補に選択する。ある具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、健康な動
物、及び高血圧症に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非常に
関連する状態の動物において有効性について、また毒性及び所望されない副作用
について試験し、その後、有効性が最も高く、毒性又は所望されない副作用が最
も低いか全くない薬剤候補リードを、動物試験及びヒトでの試験にさらに用いら
れる、発見計画リードと称される候補に選択する。

【００８８】ある具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、健康な動
物、及び炎症に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非常に関連
する状態の動物において有効性について、また毒性及び所望されない副作用につ
いて試験し、その後、有効性が最も高く、毒性又は所望されない副作用が最も低
いか全くない薬剤候補リードを、動物試験及びヒトでの試験にさらに用いられる
、発見計画リードと称される候補に選択する。ある具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、健康な動
物、及び高血圧症に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非常に
関連する状態の動物において有効性について、また毒性及び所望されない副作用
について試験し、その後、有効性が最も高く、毒性又は所望されない副作用が最
も低いか全くない薬剤候補リードを、動物試験及びヒトでの試験にさらに用いら
れる、発見計画リードと称される候補に選択する。ある具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、健康な動
物、及び時差ぼけ並びに概日リズムリセットに係わる根源的な生理学的及び病理
生理学的プロセスに非常に関連する状態の動物において有効性について、また毒
性及び所望されない副作用について試験し、その後、有効性が最も高く、毒性又
は所望されない副作用が最も低いか全くない薬剤候補リードを、動物試験及びヒ
トでの試験にさらに用いられる、発見計画リードと称される候補に選択する。

【００８９】ある具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、健康な動
物、及び勃起不全に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非常に
関連する状態の動物において有効性について、また毒性及び所望されない副作用
について試験し、その後、有効性が最も高く、毒性又は所望されない副作用が最
も低いか全くない薬剤候補リードを、動物試験及びヒトでの試験にさらに用いら
れる、発見計画リードと称される候補に選択する。ある具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、健康な動
物、及び炎症性気道疾病に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに
非常に関連する状態の動物において有効性について、また毒性及び所望されない
副作用について試験し、その後、有効性が最も高く、毒性又は所望されない副作
用が最も低いか全くない薬剤候補リードを、動物試験及びヒトでの試験にさらに
用いられる、発見計画リードと称される候補に選択する。ある具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、健康な動
物、及び炎症性関節病に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非
常に関連する状態の動物において有効性について、また毒性及び所望されない副
作用について試験し、その後、有効性が最も高く、毒性又は所望されない副作用
が最も低いか全くない薬剤候補リードを、動物試験及びヒトでの試験にさらに用
いられる、発見計画リードと称される候補に選択する。

【００９０】ある具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、健康な動
物、及び炎症性腸疾病に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非
常に関連する状態の動物において有効性について、また毒性及び所望されない副
作用について試験し、その後、有効性が最も高く、毒性又は所望されない副作用
が最も低いか全くない薬剤候補リードを、動物試験及びヒトでの試験にさらに用
いられる、発見計画と称される候補に選択する。ある具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、健康な動
物、及び自己免疫疾病に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非
常に関連する状態の動物において有効性について、また毒性及び所望されない副
作用について試験し、その後、有効性が最も高く、かつ、毒性又は所望されない
副作用が最も低いか全くない薬剤候補リードを、動物試験及びヒトでの試験にさ
らに用いられる、発見計画リードと称される候補に選択する。ある具体例において、発見計画により選択される薬剤候補リードを、健康な動
物、及びうつ病に係わる根源的な生理学的及び病理生理学的プロセスに非常に関
連する状態の動物において有効性について、また毒性及び所望されない副作用に
ついて試験し、その後、有効性が最も高く、毒性又は所望されない副作用が最も
低いか全くない薬剤候補リードを、動物試験及びヒトでの試験にさらに用いられ
る、発見計画リードと称される候補に選択する。

【００９１】この発明のいずれの化合物の投与経路も、口腔経路、非口腔経路、皮膚経路、
鼻経路、直腸経路、膣経路、眼球経路により治療的濃度に対応して血中濃度に濃
度をみちびく適切な経路であればいずれの経路であってもよい。当業者であれば
、投与経路が、問題の化合物に依存し、特に、投与経路の選択が、化合物の物理
化学的特性や患者の年齢及び体重、特定の疾病及びその重度に依存することは明
らかであろう。この発明の化合物は、医薬組成物中にいずれかの適切な量、一般的には組成物
の全重量中約１〜95重量％含まれる。組成物は、例えば、タブレット剤、カプセ
ル剤、ピル剤、粉末剤、顆粒剤、懸濁液剤、乳濁液剤、液剤、ヒドロゲルを含む
ゲル剤、ペースト、軟膏、クリーム、硬膏、飲薬、デリバリーデバイス、坐剤、
浣腸剤、注入薬、挿入物、スプレー、エアロゾルの形態、及びその他の適切な形
態であってもよい。医薬組成物は、従来の製薬プラクティスに従い調製してもよい（例えば、「Re
mington's Pharmaceutical Sciences」及び「Encyclopedia of Phramaceutical
Technology」参照）。

【００９２】この発明の医薬組成物は、投与時実質的に直ぐに、又は投与後実質的になんら
かの所定の時間後に主化合物が放出されるように調製してもよい。後者の型の組
成物は、一般的に制御放出製剤として知られる。制御放出製剤は、「持効性放出
」、「持続性放出」、「プログラム化放出」、「時間放出」、「速度制御」及び
／又は「標的放出」製剤と称してもよい。この明細書において、全ての医薬組成物は、投与の際、作用薬剤物質が生体に
提示されるので、実際的な薬剤デリバリーシステムである。この発明の化合物は、好ましくは、1日当たり体重1kgにつき約0.1〜30mg、例
えば1日当たり体重1kg当たり約0.5〜15mgの量で投与される。問題の化合物は、
タブレット、カプセル、エリキシル又はシロップの形態では経口で、坐剤の形態
では直腸経路で投与されてもよい。この発明の化合物の非経口投与は、化合物を
食塩水に溶した形態で、又はリポソームに化合物を組み込んで、適切に行われる
。化合物それ自体に十分な可溶性がない場合、塩基性化合物の酸付加塩を用いる
か、エタノールのような可溶化剤を用いてもよい。

【００９３】経口投与全身に用いる経口投与用組成物の場合、通常、1回当たり1mg〜1gの用
量を、1日に1〜4回、処置する疾病に依存して1週間、12ヶ月又は生涯投与される
。直腸投与直腸投与用組成物の場合、幾分多い、1日当たり体重1kgにつき約1mg
〜100mgの化合物を用いるのが好ましい。非経口投与非経口投与の場合、１日当たり体重1kgにつき約0.1mg〜約50mgの用
量が好都合である。静脈内投与の場合、１日当たり体重1kgにつき約0.1mg〜約20
mgの用量である。関節内投与の場合、１日当たり体重1kgにつき約0.1mg〜約20mg
の用量が、通常好ましい。非経口投与の場合一般に、有効成分が0.5〜2％又はそ
れより多い水性媒質溶液を用いてもよい。皮膚投与皮膚への代表的な投与の場合、約1mg〜約5gの用量を1日1〜10回投与
するのが通常、好ましい。

【００９４】実施例実施例１：PDE4D転位検出用プローブこれらは、GFPに融合される特異的PDE4D変異体である。現在、5個のPDE4Dスプ
ライス変異体：PDE4D1、PDE4D2、PDE4D3、PDE4D4及びPDE4D5が知られている。こ
れらは全て、C末端配列を共有しているが、N-末端が異なる。化学文献を調べると、PDE4D1及びPDE4D2サブタイプは細胞質画分のみに見出さ
れるが、PDE4D3、PDE4D4及びPDE4D5サブタイプは、細胞構造のなんらかの形態に
結合しているらしいことが分かる。PDE4Dの標的配列は現在、N-末端ドメインに
位置していると考えられている。これに従えば、PDE4D1及びPDE4D2は、PDE4D3、
PDE4D4及びPDE4D5よりもはるかに短いN-末端ドメインを有している。PDE4Dの正
常分布を最も良好に保存するため、PDE4D種のC-末端とGFPのN-末端との間で融合
を行う。 PDE4D-GFP融合を構築するため、下の表に示される特異的トッププライマー及
び下の表に示される共通のボトムプライマーを用いて標準的プロトコルに従いPC
Rを用いてPDE4D配列を増幅する。PCR産物は、制限酵素Hind3及びEcoR1で消化し
、Hind3及びEcoR1で消化したpEGFP-N1（Clontech, palo Alto; GenBank 受託番
号 U55762）に連結する。これにより、CMVプロモーターの制御下、PDE4D-EGFP融
合（SEQ ID NO: 5及び6 (PDE4D5-EGFP) SEQ ID NO: 3及び4 (PDE4D4 -EGFP) SEQ
ID NO: 1及び2(PDE4D3 -EGFP)）が作られる。

【００９５】トッププライマー全てには、ATGに続く特異的配列、コザック(Kozak)配列、及
びクローニング部位（Hind3）が含まれる。ボトムプライマーには、終止コドン
のない共通のC末端配列、EcoR1クローニング部位、及びEGFP-N1にリーディング
フレームを保存するエキストラヌクレオチドが含まれる。トッププライマーの配列： PDE4D3A及びPDE4D3Bに特異的(GenBank 受託番号 L20970 & U50159) PDE4D4Aに特異的(GenBank 受託番号 L20969) PDE4D5Aに特異的(GenBank 受託番号 AF012073) 共通のボトムプライマーの配列：

【００９６】得られたプラスミドを、適当な細胞系、例えばMVLECにトランスフェクトする
。休止させた状態、及び、正常分布に影響を及ぼす又は及ぼさないフォルスコリ
ン(forskolin)などでアデニル酸シクラーゼを活性化させcAMPを上昇させた状態
で、プローブの細胞下分布を、蛍光顕微鏡で注意深く調べる。

【００９７】実施例２：PDE5転位検出用プローブこれらは、GFPに融合させた特異的PDE5変異体である。現在、主要なヒト変異
型は１個だけ知られている（GenBank 受託番号 AJ004865及びD89094）。化学文献を調べると、触媒ドメインがタンパク質のC-末端部に含まれており、
従って、PDE5の潜在的標的配列がN-末端部に位置するかもしれないことが分かる
。PDE5の正常分布を最も良好に保存するため、PDE5種のC-末端とGFPのN-末端と
で最初の融合を行う。 PDE5-GFP融合を構築するため、下の表に示される特異的プライマーで標準的プ
ロトコルに従いPCRを用いてPDE5配列を増幅する。PCR産物は制限酵素EcoR1及びA
cc651で消化し、EcoR1及びAcc651で消化したpEGFP-N1（Clontech, palo Alto; G
enBank 受託番号 U55762）に連結する。これにより、CMVプロモータの制御下、P
DE5-EGFP融合（SEQ ID NO: 7及び8）が作られる。

【００９８】トッププライマーには、ATGに続く特異的配列、コザック配列、及びクローニ
ング部位（EcoR1）が含まれる。ボトムプライマーには、終止コドンのない特異
的C-末端配列、Acc65Iクローニング部位、及びEGFP-N1にリーディングフレーム
で保存するための2個のエキストラヌクレオチドが含まれる。 PDE5-トップ： PED5-ボトム：得られたプラスミドを、適当な細胞系、例えばMVLECにトランスフェクトする
。休止させた状態、及び、正常分布に影響を及ぼす又は及ぼさないNO又はニトロ
プルシドなどでシクラーゼを活性化させcGMPを上昇させた状態で、プローブの細
胞下分布を蛍光顕微鏡で注意深く調べる。

【００９９】実施例３：IKK再分布検出用プローブ誤-標的化によるIKKβ再分布のモジュレーションにより、サイトカイン誘発NF
カッパB活性化の阻害が引き起こされる。この実施例において、IKKβの特異的な
誤-標的化により、サイトカイン誘発NFカッパB活性化が阻害されることが示され
る。内因性IKKβの、その固定部位からの転位は、IKKβのC-末端部（PS473）の
発現により達成される。GFP融合であるPS473プローブにより、その局在化及び再
分布を同時にモニターすることができる。 PS473プローブの発現は、NF-カッパBのサイトカイン誘発活性化に明らかな阻
害活性を有する。IKKβをそのキナーゼ活性に直接に影響を及ぼすことなく転位
させることにより、NFカッパBの機能活性が効果的に阻害されることは、ここで
初めて示された。IKKβの誤-標的化と欠失しているNFカッパB活性との因果関係
は、異なる2つのシステム：a) 細胞質から核へのNFカッパB転位の即時測定、及
びb) NFカッパB誘導性転写活性の測定で研究されている。

【０１００】これらは、GFPに融合される特異的IKKサブユニット変異体である。例えば、3
個のサブユニット：IKKα（GenBank 受託番号AF009225）、IKKβ（GenBank 受託
番号 AF031416）、IKKγ（GenBank 受託番号 AF074382）及びNIK（GenBank 受託
番号 NM003954）が選択される。化学文献を調べると、IKKβが、IKAP複合体から活性化中に一過的に解離し、
それにより、再分布検出用プローブの第1選択候補になっていることが分かる。 IKKβ-GFP融合を構築するため、下記の表に表される特異的トッププライマー
で標準的プロトコルに従ってPCRを用いてIKKβ配列を増幅する。PCR産物は、制
限酵素Hind3及びAcc651で消化し、Hind3及びAcc651で消化したpEGFP-N1（Clonte
ch, palo Alto; GenBank 受託番号 U55762）に連結する。これにより、CMVプロ
モーターの制御下、IKKβ-GFP融合（SEQ ID NO: 9及び10）が作られる。

【０１０１】トッププライマーには、ATGに続く特異的配列とクローニング部位（Hind3）が
含まれる。ボトムプライマーには、終止コドンのない特異的な共通のC-末端配列
、Acc651クローニング部位及びEGFP-N1にリーディングフレームを保存する2個の
エキストラヌクレオチドが含まれる。 IKKβ-トップ： IKKβ-ボトム：得られたプラスミドを、適当な細胞系にトランスフェクトする。蛍光顕微鏡に
より、休止させた状態及びTNFαなどで活性化させた状態で、プローブの細胞下
分布を注意深く調べる。

【０１０２】 NFカッパBシグナル変換経路の活性化検出用プローブプラスミドPS377には、NFkappaBp65-EGFP融合が含まれる。NFカッパBのp65サ
ブユニットのGenBank受託番号は、M62399である。これは、ヒトcDNA（Clontech
から入手）を特異的プライマーp65-トップ及びp65-ボトムでPCRを行うことによ
り、構築される。得られた約1.7 kbの PCR産物は、制限酵素Xho1及びHind3で切
断し、Xho1及びHind3で切断したpEGFP-N1（Clontechから入手）にクローンする
。これにより、CMVプロモーター制御下、NFカッパBp65-EGFP融合（SEQ ID NO: 1
1及び12）が作られる。 p65-トップ： p65-ボトム：

【０１０３】 NFカッパB誘発転写活性化のモニター用レポーター遺伝子アッセイの構築：プラスミドPS397には、選択可能なNFカッパBレポーター構築物が含まれる。こ
れは、2個のBamH1-Not1フラグメント：ルシフェラーゼ遺伝子及びNFカッパB応答
要素を含む、pNFカッパB-Luc（clontechから入手）からの2.4kbのフラグメント
、及び必須プラスミド要素と大腸菌ならびに哺乳動物細胞に用いられるゼオシン
(zeocin)選択マーカーを含むpZeoSV（Invitrogenから入手）からの2.8kbのBamH1
-Not1フラグメントの連結を介して構築される。生細胞でのIKKβ局在化、誤-標的化及び再分布のモニター用プローブの構築：プラスミドPS410には、EGFP-IKKβ融合が含まれる。IカッパBキナーゼのβサ
ブユニットのGenBank受託番号は、AF031416である。これは、ヒトcDNA（Clontec
hから入手）を特異的プライマーIKKβ-トップ及びIKKβ-ストップでPCRを行うこ
とにより、構築される。得られた2.2 kbの PCR産物は、制限酵素Hind3及びAcc65
1で切断し、Hind3及びAcc651で切断したpEGFP-C1（Clontech）中にクローニング
する。これにより、CMVプロモーターの制御下、EGFP-IKKβ融合（SEQ ID NO: 13
及び14）が作られる。 IKKβ-トップ： IKKβ-ストップ：

【０１０４】プラスミドPS472には、CMVプロモーターの制御下、全長IKKβが含まれる。こ
れは、EGFPをフランクする制限酵素Nhe1及びHind3でPS410を切断して構築される
。これにより、プラスミドからEGFP配列を切り出し、CMVプロモーターの直ぐ下
流にIKKβを配する。上記酵素により生じた突出端を、標準プロトコルに従いク
レノウポリメラーゼを用いて平滑にし、プラスミドをDNAリガーゼで再環状化さ
せる。 PS473には、IKKβのC-末端部に融合されたEGFPが含まれる。IKKβのこの部分
には推定上のロイシンジッパー領域が含まれるが、この機能がIKKβのN-末端部
に存在するので、触媒活性を有さない。これは、PS410にプライマーIKKβ-LZ-ト
ップ及びIKK-ストップでPCRを行うことにより構築される。IKKβ-LZ-トップには
、Hind3部位及び予測されたアミノ酸配列のアミノ酸位置455からの特異的IKKβ
配列が含まれる。これは、位置458の予測されたロイシンジッパーの最初のロイ
シンの殆ど直ぐ上流である。得られた0.9 kbのPCR産物は、制限酵素Hind3及びAc
c651で切断し、Hind3及びAcc651で切断したpEGFP-C1（Clontechから入手）にク
ローンする。これにより、CMVプロモーターの制御下、EGFP-IKKβ-LZドメイン融
合（SEQ ID NO: 15及び16）が作られる。

【０１０５】 IKKβ-LZ-トップ：プラスミドPS474には、CMVプロモーターの制御下、IKKβ C-末端部が含まれる
。これは、EGFPをフランクする制限酵素Age1及びBspE1でPS473を切断して構築さ
れる。これにより、プラスミドからEGFPを切り出し、CMVプロモーターの直ぐ下
流にIKKβ配列を配する。Age1及びBspE1が適合端をつくるので、プラスミドはDN
Aリガーゼで簡単に再環状化される。IKKβの予測されたアミノ酸配列の位置455
のATGメチオニンコドンは、この構築物の開始コドンして機能し得る。

【０１０６】トランスフェクション及び細胞培養条件：チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、ヒト上皮腎臓細胞（HEK293）、ヒ
ト上皮腺癌細胞（HeLa）を、FuGENEトランスフェクション試薬（Boehringer Man
nheim）を用い、上記プラスミドでトランスフェクトした。Life Technologies I
nc., Gaithersburg, MD, USAより購入した成長培地(1000mgグルコース/l、10％
ウシ胎児血清（FBS）、100μgペニシリン−ストレプトマイシン混合物/ml、2mM
L-グルタミン含有のDMEM（HEK293及びHeLa）又はHAM F12（CHO）)に、1000μgの
ゼオシン/ml（Invitrogen）又は500μgのG418/ml（Neo marker）を用い、安定し
たトランスフェクタントを選択した。蛍光顕微鏡検査のため、Lab-Tekのチェンバーカバーグラス（Nalge Nunc Int.
, Naperville, IL, USA）に細胞を少なくとも24時間付着させ、約80％の集密に
達するまで培養した。実験に先立ち、細胞は、選択圧をかけず、グルタマクス（
Life Technologies）、100μgペニシリン−ストレプトマイシン混合物/ml、及び
0.3％FBS含有のDMEM又はHAM F-12培地中で一晩培養した。この培地は、インキュ
ベータからの直接的な細胞蛍光顕微鏡検査を可能にする、低い自己蛍光を有する
。

【０１０７】生細胞での局在化及び再分布の顕微鏡画像化：生細胞の画像を、Fluar 40X, NA: 1.3油液浸系対物レンズ装着及び測光CH250
電荷結合素子（CCD）カメラ搭載のZeiss Axiovert 135M蛍光顕微鏡を用いて集め
た。細胞は、100W HBOアーク灯で照した。GFPベースプローブの画像化には、光
路に470±20nm励起フィルター、510nmダイクロイックミラー及び515±15nm放射
フィルターを挿入した。Hoechst33342（H1399、Molecular Probes）核染色の画
像化には、380±20nm励起フィルター、410nmダイクロイックミラー及び555±15n
m放射フィルターを用いた。細胞は、注文して作った段階ヒーターで37℃に維持し、モニターした。

【０１０８】 NF-カッパB再分布の数量化：細胞を、生体核染料Hoechstで染色する。 10秒の時間間隔での画像の配列が得られる。この時点で、配列は、1個のNF-カ
ッパB-GFP画像と、1個のHoechst染色核の画像とで構成されている。画像配列は、暗画像（カメラシャッターを開いていないことを除き、実際の画
像と同様の条件下で撮像した画像）の画素毎の減法を行うことにより、暗電流に
ついて補正する。画像配列を、フラットフィールド補正画像（均一蛍光試験片の実際の画像と同
様の条件下で撮像した画像）で画素毎の比をとることにより、照明の不均一性に
ついて補正する。各時点で、核におけるNFカッパBプローブの累積強度の比を、全細胞質強度に
ついてとる。核をマスクするためにHoechst画像を用いる。

【０１０９】結果：全長IKKβプローブ（PS410）は、CHO（図2）及びHEK293細胞に発現した場合、
細胞質全体にわたっての均等な分布を示す。PS473は、その発現後、類似の局在
化を示す（図3A）。しかしながら、興味深いことには、プローブにより、細胞が
、アポトーシスを誘発する刺激に曝されている。2時間の間、血清飢餓状態にさ
れたPS473発現細胞はアポトーシスを受けるが、非トランスフェクト細胞又はPS4
10発現細胞には同様の処理後に、アポトーシスの兆候は現れなかったことが観察
されている。このアポトーシスの誘発は、細胞質全体にわたっての均一な分布か
ら離散点状局在化へのPS473プローブの局在化の変化として映像化される（図3B
）。 PS473は、IKKβの誤-標的化を引き起こし、著しい機能結果を有した。IL-1誘
発NFカッパB再分布の顕著な抑制が観察された（図4）。さらに、上記ルシフェラ
ーゼレポーター構築物（PS397）でモニターされたような、NFカッパBの調節する
転写に関しIL-1及びTNFα誘発性活性が観察された（図5）。図面の簡単な説明図１生細胞におけるNFカッパB再分布をモニターするためのPS377を発現しているCH
O細胞。A）IL-1（10ng/ml）での刺激前、及びB）刺激10分後。図２全長IKKβプローブ（PS410）は、CHO細胞に発現した際に細胞質全体にわたっ
て均等な分布を示す。図３ CHO細胞に発現したPS473。（A）は、細胞質全体にわたる均等分布を、（B）は
細胞が血清飢餓から2時間後に観察されたアポトーシスを受けている際の分布変
化を示している。図４ PS473の発現は、CHO細胞においてNFカッパBのIL-1（0.5ng/ml）誘発再分布を
阻害する。図５ PS473の発現は、HEK293細胞においてIL-1（0.5ng/ml）及びTNF-α（0.5ng/ml
）が誘発するNFカッパB調節転写を阻害する。参考文献

【図面の簡単な説明】

【図１】生細胞におけるNFカッパB再分布をモニターするためのPS377を発現しているCH
O細胞。A）IL-1（10ng/ml）での刺激前、及びB）刺激10分後。

【図２】全長IKKβプローブ（PS410）は、CHO細胞に発現した際に細胞質全体にわたっ
て均等な分布を示す。

【図３】 CHO細胞に発現したPS473。（A）は、細胞質全体にわたる均等分布を、（B）は
細胞が血清飢餓から2時間後に観察されたアポトーシスを受けている際の分布変
化を示している。

【図４】 PS473の発現は、CHO細胞においてNFカッパBのIL-1（0.5ng/ml）誘発再分布を
阻害する。

【図５】 PS473の発現は、HEK293細胞においてIL-1（0.5ng/ml）及びTNF-α（0.5ng/ml
）が誘発するNFカッパB調節転写を阻害する。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１１月１６日（２０００．１１．１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/12 Ａ６１Ｐ 11/00 11/00 11/06 11/06 13/00 13/00 19/02 19/02 25/00 25/00 25/24 25/24 29/00 29/00 37/00 37/00 43/00 １０５ 43/00 １０５１１１１１１Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 1/44 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/48 Ｚ 1/44 1/68 Ｚ 1/48 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号ＰＡ１９９８０１３２３ (32)優先日平成10年10月15日(1998．10．15) (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者テリー，ベルナード，ロバートデンマーク、ディケイ−1820 フレデリクスベルグシー、１．，フレデリクスベルグアレ 15 (72)発明者スカッダー，カート，マーシャルデンマーク、ディケイ−2830 ヴィルム、ラヴェンデルハーヴェン 70 (72)発明者ビョーン，サラ，ペターゼンデンマーク、ディケイ−2800 リングビィ、クランペンボルグヴェイ 102 (72)発明者サストラップ，オレデンマーク、ディケイ−3460 ビルケラッド、ビルクヴェイ 37 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 CB01 CB17 DA20 DA77 FB01 4B024 AA01 AA11 BA10 BA11 BA80 CA02 CA07 CA20 DA02 DA03 EA04 FA02 GA11 GA18 GA25 HA11 4B063 QA01 QA05 QA20 QQ21 QQ27 QQ33 QQ41 QQ61 QQ79 QQ89 QR56 QR77 QR80 QS32 QS36 QS39 QX02 QX10 4C084 AA01 AA02 AA17 BA44 MA13 MA28 MA31 MA35 MA38 MA52 MA60 MA63 MA65 MA66 NA14 ZA012 ZA122 ZA362 ZA422 ZA432 ZA592 ZA682 ZA812 ZB112 ZB132 ZB152 ZC412 ZC542

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サイクリックAMPもしくはサイクリックGMPの切断能力を有
する１以上のサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの活性を調節する
か、又は１以上のI-カッパB活性を調節することによって減少あるいは破壊され
得る有害な症状を動物で予防又は治療する薬剤を製造するための、動物細胞内に
おけるサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ又はI-カッパBキナーゼ
の空間分布又は空間分布での変化を調節することによって、サイクリックヌクレ
オチドホスホジエステラーゼまたはI-カッパBキナーゼの特異的な有効性を調節
し得る物質の使用。
【請求項２】 I-カッパBキナーゼが、I-カッパBキナーゼα、I-カッパB
キナーゼβ、I-カッパBキナーゼγ及びNIKからなる群から選択される請求項１に
よる使用。
【請求項３】 I-カッパBキナーゼがI-カッパBキナーゼβである請求項２
による使用。
【請求項４】サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼが、PDE3
、PDE4、PDE7及びPDE8からなる群から選択される請求項１による使用。
【請求項５】サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼがPDE4で
ある請求項４による使用。
【請求項６】サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼが、PDE4
A、PDE4B、PDE4C及びPDE4Dからなる群から選択されるPDE4のスプライス変異型で
ある請求項５による使用。
【請求項７】 PDE4種が、PDE4Dのスプライス変異型である請求項６によ
る使用。
【請求項８】スプライス変異型が、PDE4D1、PDE4D2、PDE4D3、PDE4D4、
PDE4D5及びPDE4A1である請求項７による使用。
【請求項９】スプライス変異型が、PDE4D3、PDE4D4又はPDE4D5である請
求項８による使用。
【請求項１０】 PDE4スプライス変異型がPDE4A1である請求項６による使用
。
【請求項１１】有害な症状が慢性炎症のような炎症性疾患である前記請求
項のいずれかによる使用。
【請求項１２】有害な症状が、喘息及び非喘息病因の慢性気管支反応亢進
症のような慢性炎症性気道疾患である請求項１〜１０のいずれかによる使用。
【請求項１３】有害な症状が、リウマチ性関節炎及び骨盤脊椎炎のような
慢性炎症性関節疾患である請求項１〜１０のいずれかによる使用。
【請求項１４】有害な症状が、潰瘍性大腸炎及びクローン病のような慢性
炎症性腸疾患である請求項１〜１０のいずれかによる使用。
【請求項１５】有害な症状が、慢性炎症性の自己免疫疾患、例えばリウマ
チ性関節炎、真性糖尿病タイプＩ、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症、橋本甲状
腺炎、グレーブス病及び免疫血小板減少性紫斑病である請求項１〜１０のいずれ
かによる使用。
【請求項１６】有害な症状が、急性呼吸困難症候群（ARDS）及び敗血性シ
ョックのような免疫系の無制御を伴う請求項１〜１０のいずれかによる使用。
【請求項１７】有害な症状がうつ病である請求項１０による使用。
【請求項１８】サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼが、PDE1
、PDE2、PDE5、PDE6、PDE9及びPDE10からなる群から選択される請求項１による
使用。
【請求項１９】ヌクレオチドホスホジエステラーゼが、PDE5のスプライス
変異型である請求項１８による使用。
【請求項２０】有害な症状が、低血圧、高血圧、勃起機能不全、概日リズ
ムリセット又は時差ぼけである請求項１８又は１９による使用。
【請求項２１】動物が哺乳類である前記請求項のいずれかによる使用。
【請求項２２】哺乳類がヒトである請求項２１による使用。
【請求項２３】物質が、分子量が約3000Daの有機化合物である前記請求項
のいずれかによる使用。
【請求項２４】物質が、分子量が多くて1200Daの有機化合物である請求項
１〜２２による使用。
【請求項２５】物質が、分子量が多くて900Daの有機化合物である請求項
２４による使用。
【請求項２６】物質が、分子量が多くて600Daの有機化合物である請求項
２５による使用。
【請求項２７】物質が、分子量が多くて300Daの有機化合物である請求項
２６による使用。
【請求項２８】物質がペプチドである前記請求項のいずれかによる使用。
【請求項２９】物質が、炭素を含有する非ペプチドである請求項１〜２７
のいずれかによる使用。
【請求項３０】有機化合物が、サイクリックヌクレオチドホスホジエステ
ラーゼ又はIカッパBキナーゼの天然の固定部位の標的配列の１以上の官能基と相
互作用しうる１以上の化学ドメインを有する化合物である前記請求項のいずれか
による使用。
【請求項３１】物質が、転位するように標的配列又はその一部と相互作用
するか、又は定量的な蛍光再分布アッセイで測定されるような蛍光プローブの再
分布と相互作用する前記請求項のいずれかによる使用。
【請求項３２】サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ又はIカ
ッパBキナーゼの少なくとも一部をさらに含む蛍光プローブ(細胞又は細胞類に存
在し、影響の程度に関連して再分布することができ、及び/又は影響の程度に関
連して再分布されうる成分によってモジュレートされ得る)の一部である発光団
から発せられる空間分布において、機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生
細胞類に対する影響によって生ずる変化、発光団の発光特性をモジュレートする
結合を記録し、空間分散光において記録された変化を処理し、細胞反応に対する
影響の程度に空間分布を相関させる定量的情報を生じることからなる、細胞反応
に対する影響に関する定量的情報を引き出すための方法。
【請求項３３】請求項３２の方法を実施するためのスクリーニングアッセ
イ。
【請求項３４】蛍光プローブが、GFPコード配列を依然として完全に維持
する系統的方法で修飾され、新しい蛍光プローブが、推測される標的配列の部分
が変化している融合ポリペプチドである請求項３２又は３３によるスクリーニン
グアッセイ。
【請求項３５】推測される標的配列の修飾が、欠失である請求項３４によ
るスクリーニングアッセイ。
【請求項３６】蛍光プローブの空間分布が、標的配列を推測するために非
修飾の蛍光プローブの空間分布と比較される請求項３３〜３５のいずれかによる
スクリーニングアッセイ。
【請求項３７】定量蛍光再分布アッセイが、発見計画に用いられる一次ス
クリーニングアッセイである請求項３３〜３６のいずれかによるスクリーニング
アッセイ。
【請求項３８】 CMVプロモーターの制御下でCHO細胞中で発現される再に、
IKKβを転位しうる、SEQ ID NO:16のアミノ酸331-552に相当するタンパク質をエ
ンコードするヌクレオチド配列、又は25より多いその同一限界内のアミノ酸のい
ずれかのサブ配列。
【請求項３９】サブ配列が、SEQ ID NO:16のアミノ酸331-360に含まれる
推測されるロイシンジッパーである請求項３８によるヌクレオチド配列。
【請求項４０】蛍光プローブが、請求項３８又は３９によるヌクレオチド
配列を含む請求項３３〜３７のいずれかによるスクリーニングアッセイ。
【請求項４１】蛍光プローブが、CMVプロモーターの制御下のCHO細胞中で
発現される際にIKKβを転位し得る請求項３２による方法。
【請求項４２】動物の細胞内の空間分布をモジュレートすることによって
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ又はI-カッパBキナーゼの特異
的有効性をモジュレートすることからなる、サイクリックcAMPの切断能力を有す
る１以上のサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性をモジュレート
するか、あるいは１以上のI-カッパBキナーゼ活性をモジュレートすることによ
って減少もしくは破壊される有害な症状を、その危機にある動物で予防又は治療
するための方法。