DE69333261T2

DE69333261T2 - KLONIERUNG UND EXPRESSION VON DEM beta APP-C100 REZEPTOR

Info

Publication number: DE69333261T2
Application number: DE69333261T
Authority: DE
Inventors: Susan P. Manly; Michael R. Kozlowski; Rachael L. Neve
Original assignee: Mclean Hospital Corp; Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Mclean Hospital Corp; Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1992-08-31
Filing date: 1993-08-31
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2013-09-01
Also published as: EP0659217B1; AU4843493A; ATE252636T1; AU689441B2; HUT70456A; FI950883A; EP0659217A1; EP0659217A4; WO1994005811A1; JPH08500491A; NZ256188A; US5854392A; FI950883A0; DE69333261D1; CA2143325A1; ES2208643T3; HU9500619D0; CA2143325C

Description

1. Einleitung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung des Rezeptors für den Carboxyterminus des β-Amyloidvorläuferproteins (einschließlich der Amyloiddomäne), der vorliegend als C 100-R bezeichnet wird, und genetisch hergestellte Wirtszellen, die den C 100-R exprimieren. Diese hergestellten Zellen können dafür verwendet werden, Arzneimittel und Analoge des β-Amyloidvorläuferproteins (β-APP) auszuwerten und zu durchmustern, die für die Diagnose und/oder Behandlung der Alzheimer-Erkrankung verwendet werden können.
2. Hintergrund der Erfindung
Die Alzheimer-Erkrankung ist eine neurodegenerative Erkrankung, die die am meisten vorkommende Ursache der Demenz unter älteren Individuen ist. Die Erkrankung ist durch die Anhäufung vom Amyloid enthaltenen Plaques im Gehirn, insbesondere in der temporalen Cortex und Hippocampus und entlang der Wände der Gehirngefäße (Roch et al., 1966, Nature 209; 109–110; Terry et al., 1981, Ann. Neurol. 10: 184–192; Glenner G. G., 1983, Arch Pathol. Lab. Med. 107: 281–282; Katzman, R., 1983, Babury Report 15, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring, N. Y.) charakterisiert.
Das Amyloidpeptid (βA4), das in den Plaques des Gehirns gefunden wird, stammt von einem Protein, das als das Amyloid (oder β-Amyloid)-Vorläuferprotein (βAPP) bezeichnet wird. Das βAPP wird normalerweise innerhalb der Amyloiddomäne gespalten, die in der Nähe seines C-Terminus liegt, so dass kein intaktes Amyloid hergestellt wird. Ein alternativer Reifungsweg führt zur Spaltung des βAPP-N-Terminus in die Amyloiddomäne, wobei der gesamte C-Terminus freigesetzt wird, aus dem das intakte Amyloidpeptid (βA4) des Amyloidproteinvorläufers hergestellt werden kann (Glenner and Wong, 1984, Biochem Biophy Res. Commun. 120: 885–890, Masters et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4245–4249).
Die neueste Evidenz schlägt vor, dass die abweichende Reifung von β-APP der neuronalen Degeneration unterliegt, die bei der Alzheimer-Erkrankung auftritt. Neve und Mitarbeiter haben vorgeschlagen, dass das primäre βAPP-Reifungsereignis bei der Alzheimer-Erkrankung die Spaltung des Aminoterminus der β/A4-Sequenz ist, wobei ein Carboxy-terminales βAPP-Fragment von 100 Aminosäureresten (βAPP-C100) produziert wird, das von einer cDNA-Sequenz, die für den Carboxyterminus von 104 Aminosäuren von βAPP (Yankner et al., 1989, Science 245: 417–420) kodiert, exprimiert wurde. Danach wird dieses βAPP-Fragment als βAPP-C100 bezeichnet, ungeachtet dessen, ob es von einer cDNA, die für den Carboxyterminus von 100 oder 104 Aminosäureresten von βAPP kodiert, exprimiert ist. Die Expression des βAPP-C100-Peptids in Primatenzellen hat gezeigt, dass sie zu der Produktion eines Proteins führt, das in ablagerungsähnlichen Strukturen aggregiert und akkumuliert, die zur Bildung von amyloidähnlichen Fibrillen (Wolf et al., 1990 EMBO J. 9: 2079–2084) führt. Eine retrovirale Rekombinante, die auf die Expression von βAPP-100 gerichtet ist, hat sich ebenfalls als neurotoxisch gezeigt, wenn sie in PC-12-Zellen transfiziert wird, die dazu induziert worden sind, durch Zugabe von NGF (Nervenwachstumsfaktor) zu differenzieren. Weiterhin ist das konditionierte Medium aus den transfizierten Zellen gegenüber differenzierten Neuroblastomzellen und Nervenzellen toxisch, und die Neurotoxizität kann aus dem Medium durch Immunabsorption mit einem Antikörper gegen βAPP-0100 entfernt werden, was den Schluss zulässt, dass βAPP-C100 durch die transfizierten Zellen sezerniert wird, und neurotoxisch ist (Yankner et al., 1989, Science 245; 417–420). Die Toxizität von βAPP-C100 ist weiterhin durch Transplantation von Zellen, die das Peptid in die Gehirne von neugeborenen Mäusen exprimieren und durch Schaffung von transgenen Mäusen für den humanen βAPP-C100 (Neve et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3448–3452) gezeigt worden. Insgesamt zeigt die Evidenz eine Rolle für βAPP-C100 bei der Entwicklung der Neurodegeneration bei der Alzheimer-Erkrankung.
Trotz des intensiven Interesses an dem βAPP-C100-Peptid und seiner biologischen Rolle bei der Entwicklung bei der Alzheimer Erkrankung ist nur sehr wenig über die Proteine, Rezeptoren und andere Gewebeelemente bekannt, mit denen das βAPP-C100-Peptid unter Erzeugung von Neurotoxizität interagiert. Erst kürzlich ist die hochaffine Bindung von βAPP-C100 an die Oberfläche von differenzierten PC-12-Zellen gezeigt worden und mit Neurotoxizität in Zusammenhang gebracht (Kozlowski et al., 1992. J. of Neuroscience 12: 1679–1687). Sowohl die Bindungsinteraktion als auch das Auftreten der neurotoxischen Antwort besitzen die gleiche pH-Abhängigkeit. Zusätzlich entwickeln sich die Bindung und die Neurotoxizitätsempfindlichkeit in ähnlichen Zeitverläufen während der NGF-induzierten Differenzierung. Darüber hinaus produziert eine einzige Aminosäureänderung in dem βAPP-C100-Peptid (Tyr₆₈₇ bis Phe), was den neurotoxischen Effekt beseitigt, ebenfalls einen Verlust der Bindungsfähigkeit. Allerdings ist die Molekülspezies, die für die Bindung verantwortlich ist, noch nicht identifiziert oder charakterisiert. Die Isolierung eines cDNA-Klones, der für die βAPP-C100-Bindungsstelle oder -rezeptor kodiert, würde Studien für die Bestimmung der biologischen Funktion von C100-R und seine Rolle bei der Entwicklung der Alzheimer-Erkrankung erleichtern. Dieses ist bisher noch nicht zustande gebracht worden.
3. Zusammnenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft C100-R-Gene und Proteine. Die neurotoxischen Effekte, die aus der Interaktion zwischen β-APP-C100 und dem C100-R herrühren, legen nahe, dass therapeutische Anwendungen für die Blockierung dieser besonderen Rezeptor/Liganden-Interaktion für die Behandlung der Alzheimer-Erkrankung geeignet sein können. Die hier offenbarten DNA-Sequenzen können in Expressionssysteme gentechnisch eingeschleust werden, die für die Produktion von C100-R und/oder Zelllinien, die C100-R exprimieren, ausgestaltet sind. Diese Zellliniert können in vorteilhafterweise für das Durchmustern und die Identifizierung von βAPP-Analogen, einschließlich Agonisten und Antagonisten, verwendet werden. Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung können die C100-R-DNA, antisense-Olignukleotidsequenzen oder Antagonisten, einschließlich Antikörper gegen C100-R bei der Diagnose und Therapie der Alzheimer-Erkrankung verwendet werden. Transgene Tiere, die das C100-R-Transgen enthalten, können als Tiermodelle für die Bewertung von βAPP-C100-Analogen in vivo verwendet werden.
Die Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, Identifizierung und der Klonierung einer βAPP-C100-Bindungsstelle, die auf der Zelloberfläche von neuronal abgeleiteten Zellen exprimiert wird. Die Bindungsstelle, die hier als C100-R bezeichnet wird, hat Eigenschaften, die anzeigen, dass sie bei der Vermittlung der neurotoxischen Effekte des Peptids βAPP-C100 beteiligt sind.
Die Erfindung basiert ebenfalls auf der Isolierung und Charakterisierung eines cDNA-Klons, der für C100-R kodiert, der für die Diagnose und für die Herstellung von Arzneimitteln für die Behandlung der Alzheimer-Erkrankung von therapeutischem Wert sein kann.
4. Kurze Beschreibung der Figuren
1 – Repräsentative Kurve, die die Inhibierung der ³⁵S-βAPP-C100-Bindungsstelle an (A) NGF-behandelte (5d) PC12-Zellen und (B) SK-N-MC-Zellen durch β-APP-C100 zeigt.
2 – Repräsentative Sättigungsisotherme (oberes Diagramm) und Auftragung nach Scatchard (unteres Diagramm) von der ³⁵S-βAPP-C100-Bindung an NGF-behandelte (6d) PC12-Zellen. Die Linien wurden durch einen Computer erzeugt und stellen die beste Interpretation der Daten dar.
3 – Durchmustern von λgt11 cDNA-Bibliotheken der Ratte unter Anwendung der Direktbindungsmethode.
4 – Nukleotidsequenz der cDNA-Insertion des C100-R-Klons der Ratte, AB 1R. Der unterstrichene Bereich stellt die SER/THR-Kinase-"Signatur" oder die konservierte katalytische Kernsequenz dar.
5 – Sequenzhomologie zwischen C100-R und (A) Calciumkanälen vom "B"-Typ, (B) Calretuculin und (C) Ryanodin-Calciumkanal.
6 – Southernblotanalyse der AB1R-cDNA. Die Spur A ist mit EcoRI verdaute humane DNA. Die Spur B ist mit EcoRI verdaute Maus-DNA. Die Spur C ist mit HindI-II verdaute Maus-DNA. Die Spur D ist mit HindIII verdaute humane DNA. Man ließ λ/HindIII Marker laufen, um die Molekulargewichte zu ermitteln.
7 – Repräsentative Audioradiographen der spezifischen Bindung an Rattengehirnsektionen an (A) anterioren und (B) mittleren bis posterioren Stellen. Die Bilder wurden digitalisiert und verstärkt, so dass die Bereiche mit höheren Bindungsgehalten heller sind. Es wird bemerkt, dass gewisse Geruchstuberkel (unterer Teil der Sektionen in (A) und Hippocampus (mittel-lateraler Teil des Bereichs in (B) gegen die relativ gleichmäßige Markierung des Rests der grauen Substanz herausstehen.
8 – Repräsentative Autoradiographien der in situ Hybridisierung der pABIR antisense-Sonde. Die Lokalisie rung der Sektionen und die Reproduktionsmethode sind die gleichen wie in 7. Es wird bemerkt, dass die Bereiche mit starker Markierung (hellste Bereiche) in dem Geruchstuberkel und Hypocampus mit den Ergebnissen aus der Bindungsautoradiographie ( 7) übereinstimmen.
9 – Nukleotidsequenz der cDNA-Insertion des C100-R-Klons der Ratte, AB2R. Das EcoRI-Fragment von Nukleotid 31 bis Nukleotid 409 wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek eines menschlichen Hypocampus durchzumustern.
10 – Nukleotidsequenz des C100-R-Klons der Ratte. Die offenbarte Sequenz ist das Ergebnis der Klonierung und Sequenzierung einer Anzahl von überlappenden RattencDNA-Klonen. Das * über Nukleotid 686 zeigt die Verbindung zur Ratten-C100-R-Nukleotidsequenz, die in 4 (Nukleotid 40) gezeigt ist.
11 – Nukleotidsequenz von cDNA-Insertionen des menschlichen c100-R-Klons. Das mit M bezeichnete Nukleotid ist entweder A oder C, das mit K bezeichnete Nukleotid ist entweder T oder G.
12A – Sequenzhomologie zwischen dem menschlichen C100-R und dem C100-R der Ratte. Die menschliche # 4.t3-Sequenz stimmt mit der C100-Requenz von der Ratte, die in 9 gezeigt ist, überein und beginnt beim Nukleotid 544.
12B – Sequenzhomologie zwischen dem humanen C100-R und dem C100-R der Ratte. Der humane Klon HABIR #1#4 stimmt mit der Ratten-C100-R Sequenz, die in 4 gezeigt ist, überein und beginnt bei Nukleotid bei 182.
12C – Sequenzhomologie zwischen dem humanen C100-R und dem C100-R der Ratte. Der humane Klon #1#1T3 stimmt mit der C100-R-Sequenz der Ratte, die in 4 gezeigt ist, überein und beginnt bei Nukleotid 1868.
5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung und Expression von C100-R. Der C100-R wurde anfangs als Bindungsstelle charakterisiert, die auf der Oberfläche von neuronal abgeleiteten Zellen vorhanden ist, und spezifisch an das Amyloidpeptid βAPP-C100 bindet. Die Expression des Amyloidpeptids βAPP-C100 hat in Tiermodellen gezeigt, dass es mit dem spezifischen Typ der neuronalen Degeneration, die bei der Alzheimer-Erkrankung auftritt, korreliert. Das hier produzierte C100-R kann dafür verwendet werden, Arzneimittel und Analoge von βAPP zu bewerten und durchzumustern, die bei der Diagnose und/oder Behandlung der Alzheimererkrankung verwendet werden können.
5.1 Die kodierende Sequenz von C100-R
Der erste cDNA-Klon C100-R der Ratte, bezeichnet als λAB1R, wurde erhalten, indem eine λgt11 Expressionsbibliothek des Rattengehirns mit dem Liganden β-APP-C100, der mit ³⁵S-Methionin markiert war oder einer "Flaggen"-Sequenz des Peptidepitops, die in Abschnitt 6, infra, beschrieben ist, durchgemustert wurde. Der erste Klon, der mit pABIR-Ratte bezeichnet wurde, enthielt eine 1.970 by Insertion, die die kodierende Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz, die in 4 gezeigt ist, umfasste. Ein entsprechender cDNA-Klon wurde bei ATCC hinterlegt und erhielt die in Abschnitt 7, infra, beschriebenen Nummern. Die Sequenzanalyse hat ergeben, dass der Klon den Carboxyterminusbereich des Gens umfasst und 1.395 Basenpaare der kodierenden Sequenz und 575 by der 3'-nichttranslatierten Sequenz (4) enthält.
Unter Verwendung von aus Rattengehirn hergestellter RNA und einem Primer, der für den größten Teil des 5'-Ende der cDNA-Insertion ABIR spezifisch ist, wurde eine erste Strangsynthese in einer Umkehrtranskriptasereaktion durchgeführt. Nach der zweiten Strangsynthese wurde die zweite cDNA in das Bakterienplasmid Blueskript (Stratagene) eingesetzt. Es wurden weitere cDNA-Klone C100-R der Ratte isoliert und sequenziert ( 9 und 10). Die neuen Sequenzen überlappen mit den Rattensequenzen, die in 4 gezeigt sind und erstrecken sich über den kodierenden Bereich zum aminoterminalen Ende des Proteins C100-R (10). Die in 9 beschriebene Sequenz weicht stromaufwärts von Nukleotid 106 von der in 10 gezeigten Rattensequenz ab, was anzeigt, dass alternativ gespleißte mRNAs für den Klon C100-R existieren können.
Eine Recherche der Genbank für Nukleotidsequenzdaten als Basis für Homologien zu C100-R hat eine Anzahl von Übereinstimmungen mit den Calciumkanälen vom "B"-Typ und dem hochaffinen Calciumbindeprotein, Calreticulin (5) gezeigt. Die Homologie zwischen C100-R und den Calciumkanälen ist mit der ungewöhnlichen pH-Abhängigkeit der Bindung und der Beobachtung, dass die Störung der Calciumgehalte in den Neurons, insbesondere in Cortex und im Hypocampus, zu Neurotoxizität führt, konsistent. Die cDNA-Sequenz von C100-R enthält ebenfalls Homologien zur SER/THR-Kinase-"Signatur" oder eine konservierte katalytische Kernsequenz, die von Hanks et al. (1988, Science 241: 42–52), 4 beschrieben ist.
Wie durch den Nachweis einer 11 kb C100-R-mRNA auf Northern-Blots gezeigt wurde, ist die in 4 gezeigte Nukleotidsequenz nur eine Teilrepräsentation des C100-R-Gens. Die cDNA-Sequenz von C100-R der Ratte in voller Länge kann unter Anwendung einer Anzahl verschiedener Methoden erhalten werden. Beispielsweise können Sonden, die für den größten Teil der 5'-Sequenz des Rattenklons spezifisch ist, verwendet werden, um die cDNA-Bibliotheken der Ratte wieder durchzumustern. Mit jeder erfolgreichen Durchmusterrunde können neue 5'-Sonden erhalten werden, die verwendet werden, um die Bibliotheken erneut durchzumustern, bis die ganze Sequenz erhalten worden ist.
Die PCR-Technologie kann ebenfalls verwendet werden, um das C100-R-Gen der Ratte in voller Länge zu isolieren. Unter Verwendung von RNA, die aus einer geeigneten Quelle der Ratte hergestellt ist, kann ein Primer, der für den größten Teil des 5'-Endes der cDNA-Insertion der Ratten spezifisch ist, verwendet werden, um die erste Stransynthese in einer Umkehrtranskriptasereaktion zu primen. Der RNA/DNA-Hybrid kann dann mit Guaninen unter Verwendung von terminaler Transferase, verdaut mit RNAse H "getailed" werden, wonach eine zweite Strangsynthese, die mit einem Poly-C-Primer geprimt ist, folgt. Unter Verwendung von Primern mit spezifischen Restriktionsstellen, die darin inkorporiert sind, können diese "Klon spezifischen" cDNAs ohne weiteres in einem geeigneten Plasmidvektor eingesetzt und sequenziert werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls C100-R-Gene, die aus anderen Spezien isoliert sind, einschließlich Menschen, worin eine C-100-R-Aktivität existiert. Die Mitglieder der C100-R-Familie werden hierin als solche Rezeptoren definiert, die βAPP-C100 oder Fragmente des Peptids binden. Diese Rezeptoren können etwa 20% Homologie auf dem Nukleotidlevel zeigen, und sogar 90 Homologie auf dem Aminosäurelevel in wesentlichen Abschnitten der DNA-Sequenz. Es kann eine Bakteriophagen-cDNA-Bibliothek durchgemustert werden, bei Bedingungen reduzierter Stringenz, unter Verwendung eines radiaktiv markierten Fragments des Klons C100-R der Ratte. Alternativ kann die C100-R-Sequenz der Ratte dafür verwendet werden, degenerierte oder vollständig degenerierte Oligonukleotidsonden herzustellen, die als PCR-Sonden verwendet werden können, oder um BakteriophagencDNA-Bibliotheken durchzumustern. Die Strategie auf der Basis der Polymerasekettenreaktion (PCR) kann dafür angewendet werden, um humanen C100-R zu klonieren. Zwei Pools von degenerierten Oligonukleotiden, die konservierten Motiven zwischen C100-R der Ratte und den Calciumkanälen entsprechen, können dafür hergestellt werden, um als Primer in einer PCR-Reaktion zu dienen. Die Matrize für die Reaktion ist cDNA, die durch reverse Transkription von mRNA, die aus Zelllinien oder Gewebe, das dafür -bekannt ist, dass es humanen APP-R exprimiert, hergestellt ist, hergestellt wird. Das PCR-Produkt kann subkloniert und srequenziert werden, um sicherzustellen, dass die amplifizierten Sequenzen die C100-R-Sequenzen repräsentieren. Das PCR-Fragment kann dafür verwendet werden, um einen C100-R-cDNA-Klon voller Länge zu isolieren, indem das amplifizierte Fragment radiaktiv markiert wird und eine Bakteriopha gen-cDNA-Bibliothek durchgemustert wird. Alternativ kann das markierte Fragment dafür verwendet werden, eine genomische Bibliothek durchzumustern. Für einen Überblick der Klonierungsstrategien, die angewendet werden können, siehe hierzu beispielsweise Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.: und Ausubel et al., 1989, Current Protokols in Molecular Biology. (Grenn Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).
Eine cDNA-Bibliothek kann ebenfalls in einem Säugerexpressionsvektor, wie pcDNA1, konstruiert werden, der einen SW40-Ursprung für Replikationssequenzen enthält, was eine Expression des Plasmids in hoher Kopienanzahl ermöglicht, wenn er in COS-Zellen übertragen worden ist. Die Expression von C100-R auf der Oberfläche von transfizierten COS-Zellen kann auf vielfache Weise nachgewiesen werden, wozu die Verwendung eines markierten Liganden, wie βAPP-C100 oder ein βAPP-C100-Agonist, der mit einer Radiomarkierung, einer Fluoreszenzmarkierung oder einem Enzym markiert ist, zählt. Die Zellen, die den humanen C100-R exprimieren können, angereichert werden, indem die transfizierten Zellen einer FACS (flourescent activated cell sorter)-Sortierung unterworfen werden.
In einer hier beschriebenen spezifischen Ausführungsform wurde eine cDNA-Bibliothek des Hippocampus eines Erwachsenen mit einem markierten Nukleotidfragment von dem Klon C100-R der Ratte durchgemustert. Das große EcoRI-Fragment, das sich vom Nukleotid 31 bis zum Nukleotid 409 des AB2R-Klons der Ratte (9) erstreckt, wurde verwendet, um die humane cDNA-Bibliothek durchzumustern. Es wurden verschiedene Klone erhalten, und die cDNA-Insertionen wurden sequenziert. Die humane C100-R-Sequenz ist in 11 gezeigt, und die Bereiche der Homologie zwi schen den C100-R-Sequenzen der Ratte und des Menschen sind in 12 gezeigt.
Jede der oben beschriebenen Methoden für die Isolierung der C100-R-Klone der Ratte in voller Länge kann in gleicher Weise gut für die Isolation der humanen C100-R-Klone des Menschen angewendet werden. Beispielsweise können Sonden, die spezifisch für den größten Teil der 5'-Sequenz des humanen Klons sind, verwendet werden, um die humane cDNA-Bibliothek wieder durchzumustern. Mit jeder erfolgreichen Sequenzierungsrunde können neue 5'-Proben erhalten werden und dafür verwendet werden, die Bibliotheken wieder durchzumustern, bis man die gesamte Sequenz erhalten hat.
Erfindungsgemäß können die Nukleotidsequenzen, die C100-R, Fragmente, Fusionsproteine oder funktionelle Äquivalente davon kodieren, verwendet werden, um rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen, die auf die Expression von C100-R oder eines funktionell aktiven Peptids, Fusionsproteins oder funktionellen Äquivalenz davon in geeigneten Wirtszellen gerichtet sind. Alternativ können ebenso Nukletidsequenzen, die an Bereiche der C100-R-Sequenz hybridisieren, ebenfalls in Nukleinsäurehybridisierungsassays, Southern- und Northern-Blotanalysen, etc. verwendet werden.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, die im wesentlichen für die C100-R-Aminosäuresequenz, beispielsweise wie die in 4 gezeigte Rattensequenz oder ein funktionelles Äquivalent, kodieren, in der Praxis der vorliegenden Erfindung für die Klonierung und Expression von C100-R verwendet werden. Diese DNA-Sequenzen umfassen solche, die in der Lage sind, an die C100-R-Sequenz der Ratte oder des Menschen unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, oder solche, die in der Lage sein können, unter stringenten Bedingungen, allerdings für die Degeneration des genetischen Codes, zu hybridisieren. Die stringenten Bedingungen, können auf vielfache Weise eingestellt werden. Wenn beispielsweise Polymerasekettenreaktionen (PCR) durchgeführt werden, kann die Temperatur, bei der die Bindung der Primer an die Matrize stattfindet oder die Konzentration von MgCl₂ im Reaktionspuffer eingestellt werden. Bei der Verwendung von radiaktiv markierten DNA-Fragmenten oder Nukleotiden an Sondenfiltern kann die Stringenz durch Änderungen der Ionenstärke der Waschlösungen oder durch eine sorgfältige Kontrolle der Temperatur, bei der die Filterwaschungen durchgeführt werden, eingestellt werden.
Veränderte DNA-Sequenzen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von verschiedenen Nukleotidresten, die zu einer Sequenz führen, die für das gleiche oder ein funktionell äquivalentes Genprodukt kodieren. Das Genprodukt selbst kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der C100-R-Sequenz enthalten, die zu einer stummen Änderung unter Herstellung eines funktionell äquivalenten C100-R führen, enthalten. Diese Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis der Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipatischen Natur der beteiligten Reste hergestellt worden sein. Zum Beispiel, negativ geladene Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilizitätswerten umfassen die folgenden: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Anilin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Typrosin. Vorliegend betrifft ein funktionell äquivalenter C100-R einen Rezeptor, der an β-APP-C100 oder Fragmente bindet, jedoch nicht notwendigerweise mit der gleichen Bindungsaffinität seines nativen Gegenspielers C100-R.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können gentechnisch hergestellt werden, um die kodierende C100-R-Sequenz für eine Vielzahl von Enden zu verändern, wozu, allerdings ohne Einschränkungen darauf, Veränderungen zählen, die die Reifung und Expression des Genprodukts modifizieren. Zum Beispiel können Mutationen unter Verwendung von Techniken eingeführt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, beispielsweise die Stellen gerichtete Mutagenese, um neue Restriktionsstellen einzusetzen und die Änderung von Glykosylierungsmustern, die Phosphorylierung, etc. zu verändern. Beispielsweise können Wirtszellen, in entsprechenden Expressionssystemen, wie Hefe, das Genprodukt überglykolisieren. Bei der Verwendung eines solches Expressionssystems, kann es bevorzugt sein, die kodierende C100-R-Sequenz zu verändern, um die N-verknüpfte Glykolisierungsstelle zu eliminieren. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung, kann der C100-R oder eine modifizierte C100-R Sequenz mit einer heterologen Sequenz ligiert werden, um für ein Fusionsprotein zu kodieren. Das Fusionsprotein kann so gentechnisch hergestellt sein, dass es eine Spaltungsstelle zwischen der C100-R-Sequenz und der heterologen Proteinsequenz enthält, so dass der C100-R aus der heterologen Einheit abgespaltet werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung könnte die kodierende Sequenz von C100-R als ganzes oder teilweise unter Anwendung chemischer Methoden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, synthetisiert werden. Siehe beispielweise Caruthers, et al., 1980, Nuc. Acids Res. Letters 21: 719; und Chow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12): 2807–2817. Alternativ könnte das Protein selbst unter Verwendung chemischer Methoden hergestellt werden, um die C100-R-Aminosäuresequenz im Ganzen oder teilweise zu synthetisieren. Beispielsweise können Peptide durch Festphasentechniken synthetisiert werden, von dem Harz abgespalten werden und durch präparative Hochleistungsflüssigchromatograhie gereinigt werden (siehe beispielsweise Creighton, 1983, Proteins Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N.Y. S. 50–60). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch Aminosäureanalyse oder Sequenzierung (beispielsweise der Edman-Abbau; siehe Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N.Y., S. 34–49) bestätigt werden.
5.2 Expression von C100-R
Um ein biologisch aktives C100-R zu exprimieren, wird die Nukleotidsequenz, die für C100-R oder ein funktionelles Äquivalent, wie in Abschnitt 5.1 supra beschrieben, kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor eingesetzt, das heißt in einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der eingesetzten kodierenden Sequenz enthält. Die C100-R-Genprodukte und die Wirtszellen oder Zelllinien, die mit den rekombinanten C100-R-Expressionsvektoren transfiziert oder transformiert sind, können für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Diese umfassen, allerdings ohne Einschränkung darauf, die Erzeugung von Antikörpern (das heißt monoklonal oder polyklonal), die an den Rezeptor binden, einschließlich solche, die die Bindung kompetitiv inhibieren und die βAPP-Aktivität von βAPP oder Fragmenten von βAPP "neutralisieren", und das Durchmustern und die Selektion von β-APP-Analogen oder Arzneimitteln, die über den C100-R wirken, etc.
5.2.1. Expressionssysteme
Methoden, die dem Fachmann gut bekannt sind, können angewendet werden, um Expressionsvektoren, die die kodierende C100-R-Sequenz und geeignete Transkriptions/Translationssteuersignale enthalten, zu konstruieren. Diese Methoden umfassen in vitro rekombinante DNA-Techniken, synthetische Techniken und die in vivo Rekombination/genetische Rekombination. Siehe hier beispielsweise die Techniken, die in Maniatis et al., 1989, Molecular Clonin A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. beschrieben sind.
Eine Vielzahl von Wirt-Expressionsvektorsystemen können angewendet werden, um die kodierende C100-R-Sequenz zu exprimieren. Diese umfassen, allerdings ohne Einschränkung darauf, Mikroorganismen, wie Bakterien, die mit rekombinanter bakteriophagen-DNA transformiert sind, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, die die kodierende C100-R-Sequenz enthalten; Hefe, die mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren, die die kodierende C100-R-Sequenz enthalten, transformiert sind; Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Baculovirus), die die kodierende C100-R-Sequenz enthalten, infiziert sind; Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Cauliflower Mosaic Virus, CaMV; Tobacco Masaic Virus, TMV) infiziert sind oder mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid), die die kodierende C100-R-Sequenz enthalten, transformiert sind oder Tierzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Adenovirus, Vacciniavirus) infiziert sind, einschließlich Zelllinien, die gentechnisch hergestellt sind und multiple Kopien der C100-R-DNA, entweder stabil amplifiziert (z. B. CHO/dhfr) oder instabil amplifiziert in doppelt winzigen Chromosomen (z. B. murine Zelllinien) enthalten.
Die Expressionselemente dieser Systeme können hinsichtlich ihrer Stärke und Spezifitäten variieren. In Abhängigkeit des Wirt/Vektor-Systems, kann jeweils eine Anzahl geeigneter Transkriptions- und Translationselemente, einschließlich konstitutive und induzierbare Promotoren, im Expressionsvektor verwendet werden. Beispielsweise können bei der Klonierung in bakteriellen Systemen induzierbare Promotoren, wie pL des bakteriophagen λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybrid-Promotor) und dergleichen verwendet werden; bei der Klonierung in Insektenzellsystemen können Promotoren, wie der Baculoviruspolyhedrin-Promotor verwendet werden; bei der Klonierung in Pflanzenzellsystemen können Promotoren, die aus dem Genom von Pflanzenzellen (z. B. Hitzeschockpromotoren; der Promotor für die kleine Subeinheit von RUBISCO; der Promotor für das Chlorophyll a/b-Bindungsprotein) oder von Pflanzenviren (z. B. der 35S RNA-Promotor von CaMV; der Hüllenproteinpromotor von TMW) verwendet werden; bei der Klonierung von Zellsystemen von Säugern können Promotoren, die aus dem Genom von Säugerzellen stammen (z. B. Metallthionein-Promotor oder von Säugerviren (z. B. der spätere Adenovirus-Promotor; the Vacciniavirus 7,5 K Promotor) verwendet werden; bei der Herstellung von Zelllinien, die multiple Kopien der C100-R-DANN enthalten, können SV 40-, BPV- und EBV-basierende Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren Marker verwendet werden.
In bakteriellen Systemen kann eine Anzahl von Expressionsvektoren mit Vorteil in Abhängigkeit der beabsichtigten Verwendung für den exprimierten C100-R ausgewählt werden. Wenn beispielsweise große Mengen von C100-R für die Erzeugung von Antikörpern verwendet werden sollen, können Vektoren, die auf die Expression von hohen Gehalten an Fusionsproteinprodukte, die ohne weiteres zu reinigen sind, gerichtet sind, wünschenswert sein. Solche Vektoren umfassen, allerdings ohne Einschränkung darauf, den E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), in dem die kodierende C100-R-Sequenz in den Vektor in Leserichtung mit der lacZ kodierenden Region ligiert sein kann, so dass ein C100-R/lacZ-Proteinhybrid hergestellt wird; pIN Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nuclein acids Res. 13: 3101–3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503–5509); und dergleichen. PGEX-Vektoren können ebenfalls dafür verwendet werden, fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutation S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind diese Fusionsproteine löslich und können ohne weiteres aus den lysierten Zellen durch Affinitätschromatographie gereinigt werden, beispielsweise durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Perlen, gefolgt durch Elution in Gegenwart von freiem Glutation. Die pGEX-Vektoren sind so ausgestaltet, dass sie Thrombin- oder Faktor Xa-Protease-Spaltungsstellen umfassen, so dass das klonierte Polypeptid von Interesse aus der GST-Einheit freigesetzt werden kann. Siehe ebenfalls Booth et al., 1988, Immunol. Lett. 19: 65–70 und Gardella et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 15854-15859; Pritchett et al., 1989, Biotechniques 7: 580.
In Hefe kann eine Anzahl von Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, verwendet werden. Als Übersicht hierzu siehe Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant et al., 1987, Expression und Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, S. 516–544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; and Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vo. 152, S. 673–684 und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I und II.
In den Fällen, wo Pflanzenexpressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression der für C100-R-kodierenden Sequenz durch jeweils eine Anzahl von Promotoren angetrieben werden. Beispielsweise können virale Promotoren, wie die 35S RNA- und 19S RNA-Promotoren von CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310: 511–514) oder der Hüllenproteinpromotor von TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307–311) verwendet werden; alternativ können Pflanzenpromotoren, wie die kleine Subeinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3: 1671–1680; Broglie et al., 1984, Science 224; 838–843); oder Hitzeschockpromotoren, beispielsweise- hsp 17.5-E oder hsp 17.3-B der Sojabohne (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 559–565) verwendet werden. Diese Konstrukte können in die Pflanzenzellen unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzenvirusvektoren, direkter DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation, etc. eingeführt werden. Hinsichtlich eines Überblicks dieser Techniken, siehe beispielsweise Weissbach & Weissbach, 1988, 1988. Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sektion VIII, S. 421–463; und Griedson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7–9.
Ein alternatives Expressionssystem, das zur Exprimierung von C100-R verwendet werden könnte, ist ein Insektensystem. Bei diesem System wird der Autographa californica Nuklearpolyhidrosisvirus (AcNPV) als Vektor für die Exprimierung fremder Gene verwendet. Der Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die für C-100-R kodierende Sequenz kann in nichtessentielle Bereiche (beispielsweise das Polyhedringen) des Virus kloniert werden und unter Steuerung eines AcNPV-Promotors (beispielsweise der Polyhedrinpromotor) gestellt werden. Die erfolgreiche Insertion der für C100-R kodierenden Sequenz führt zu einer Inaktivierung des Polyhedringens und Produktion von nicht-okkludiertem rekombinanten Virus (das heißt, ein Virus, dem die proteinhaltige Hülle fehlt, der durch das Polyhedringen kodiert wird). Diese rekombinanten Viren werden dann dafür verwendet, Spodoptera fruigperda Zellen zu infizieren, worin das eingesetzte Gen exprimiert wird (siehe beispielsweise Smith et al., 1983, J. Viol. 46: 584; Smith, U.S. Patent No. 4,215,051).
In Wirtszellen von Säugern können eine Anzahl von auf Viren basierenden Expressionssystemen verwendet werden. In den Fällen, wo ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die für C100-R kodierende Sequenz mit einem Adenoviurs-Transpriktions/Translations-Kontrollkomplex, z. B. der späte Promotor und die dreiteilige Leadersequenz, ligiert werden. Dieses chimere Gen kann dann in das Adenovirusgenom durch in vitro oder in vivo Rekombination eingesetzt werden. Die Inser tion in einen nicht-essentiellen Bereich des viralen Genoms (z. B. Bereich E1 oder E3) führt zu einem rekombinanten Virus, der lebt und in der Lage ist, C100-R in infizierten Wirten zu exprimieren (siehe beispielsweise Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 3655–3659). Alternativ kann der Vaccinia 7,5 K-Promotor verwendet werden (z. B. siehe Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 79: 7415–7419; Macket et al., 1984, J. Virol. 49: 857–864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4927–4931).
Spezifische Initiationssignale können ebenfalls für die effiziente Translation von eingesetzten für C100-R kodierenden Sequenzen erforderlich sein. Diese Signale umfassen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. In den Fällen, wo das gesamte C100-R-Gen, einschließlich sein eigenes Initiationscodon und angrenzende Sequenzen, in den geeigneten Expressionsvektor eingesetzt wird, sind keine zusätzlichen Translationssteuersignale unbedingt erforderlich. In Fällen, wo allerdings nur ein Teil der für C100-R kodierenden Sequenz eingesetzt wird, müssen exogene Translationssteuersignale, einschließlich das ATG-Initiationscodon, vorgesehen werden. Des weiteren muss das Initiationscodon in Phase mit dem Leseraster der für C100-R kodierenden Sequenz sein, um die Translation der gesamten Insertion sicherzustellen. Diese exogenen Translationssteuersignale und Initiationscodons können unterschiedlichen Ursprungs, natürlich wie synthetisch, sein. Die Effizienz der Expression kann durch Einschluss geeigneter Transkriptionsverstärkerelemente, Transkriptionsterminatoren, etc. (siehe Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516– 544) verstärkt werden.
Außerdem kann ein Wirtszellenstamm gewählt werden, der die Expresion der eingesetzten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der gewünschten spezifischen Art modifiziert und reifen lässt. Diese Modifikationen (z. B. die Glykosylierung) und die Reifung (z. B. Abspaltung) von Proteinprodukten können für die Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Reifung und Modifikation von Proteinen. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die korrekte Modifikation und Reifung des exprimierten fremen Proteins sicherzustellen. Schließlich können außerdem eukaryotische Wirtszellen, die die Zellmaschinerie für eine geeignete Reifung des primären Transkripts, Glykolysierung und Phosphorylierung des Genprodukts besitzen, verwendet werden. Diese Säugerwirtszellen umfassen, allerdings ohne Einschränkung, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, etc.
Auf lange Sicht gesehen ist für eine Produktion von rekombinanten Proteinen in hoher Ausbeute eine stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können gentechnisch Zelllinien, die den C100-R stabil exprimieren, hergestellt werden. Anders als bei der Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit der C100-R-DNA transformiert werden, die durch geeignete Expressionssteuerelemente (z. B. Promotor, Verstärker, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen, etc. und einen geeigneten Marker gesteuert wird, transformiert werden. Nach der Einführung der fremden DNA lässt man die gentechnisch hergestellten Zellen für 1–2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen, und dann wird auf ein selektives Medium übergegangen. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht eine Selektionsresistenz und ermöglicht den Zellen, dass sie stabil das Plasmid in ihre Chromosomen integrieren und wachsen und Punkte bilden, die wiederum kloniert und in Zelllinien ausgebreitet werden können. Diese Methode kann in vorteilhafter Weise dafür verwendet werden, um gentechnisch Zelllinien herzustellen, die den C100-R auf der Zelloberfläche exprimieren und die auf die durch βAPP-C-100 vermittelte Signaltransduktion antworten. Diese gentechnisch hergestellten Zelllinien sind insbesondere bei der Durchmusterung auf βAPP-C-100-Analoge geeignet.
Eine Anzahl von Selektionssystemen kann hier angewendet werden, einschließlich, allerdings ohne Einschränkung darauf, die Herpes Simplex Virus Thymidinkinase- (Wigler, et al., 1977, Cell 11: 223), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoriboxyltransferase- (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und Adeninphosphoribosyltransferase- (Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817) und die Adeninphosphoribosyltransferase (Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817)-Gene können in tk^–-, hgprt- oder aprt-Zellen verwendet werden. Ebenso kann eine Antimetabolitresistenz als Basis für die Selektion von dhfr, das eine Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht, (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt-, das eine Resistenz gegenüber Mikrophenolsäure (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072) verleiht; neo-, das eine Resistenz gegenüber Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); und hygro-, das eine Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht (Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147)-Gene. Erst kürzlich sind weitere selektierbare Gene beschrieben worden, nämlich trpB, das den Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden; hisD, das den Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (85: 8047) zu verwenden und ODC (Ornithindecarboxylase), das eine Resistenz gegenüber den Ornithindecarboxylaseinhibitor, 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin, DFMO verleiht (McConlogue L., 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).
5.2.2. Identifizierung von Transfektanten oder Transformanten, die den C100-R exprimieren
Die Wirtszellen, die die kodierende Sequenz enthalten und die das biologisch aktive Genprodukt exprimieren, können durch mindestens vier allgemeine Methoden identifiziert werden: (a) DNA-DNA oder DNA-RNA-Hybridisierung; (b) die Gegenwart oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen; (c) das Feststellen des Transkriptionslevels, gemessen durch die Expression von C100-R-MNR-Transkripten in der Wirtszelle und (d) der Nachweis des Genprodukts, gemessen durch Immunassay oder durch seine biologische Aktivität.
Bei der ersten Methode kann die Gegenwart der für C100-R-kodierenden Sequenz, die in dem Expressionsvektor eingesetzt wird, durch DNA-DNA oder DNA-RNA-Hybridisierung nachgewiesen werden, unter Verwendung von Sonden, die die Nukleotidsequenzen umfassen und homolog zu der für C100-R kodierenden Sequenz oder von Teilen oder Derivaten davon sind.
Bei der zweiten Methode kann das rekombinante Expressionsvektor/Wirt-System identifiziert und selektiert werden auf der Basis der Gegenwart oder Abwesenheit gewisser "Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidinkinaseaktivität, Resistenz gegen über Antibiotika, Resistenz gegenüber Methotrexat, Transformationsphänotyp, Okklusionskörperbildung in Baculovirus, etc.). Beispielsweise, wenn die für C100-R kodierende Sequenz innerhalb einer Markergensequenz des Vektors eingesetzt ist, können die Rekombinanten, die die für C100-R kodierende Sequenz enthalten, durch die Abwesenheit der Markergenfunnktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen in Tandem mit der C100-R-Sequenz unter der Steuerung des gleichen oder eines anderen Promotors, der für die Steuerung der Expression der für C100-kodierenden Sequenz verwendet wurde, angeordnet werden. Die Expression des Markers als Antwort auf die Induktion oder Selektion zeigt die Expression der für C100-R kodierenden Sequenz an.
Bei der dritten Methode kann die Transkriptionsaktivität für die C100-R-kodierende Region durch Hybridisierungsassays festgestellt werden. Beispielsweise kann die RNA isoliert und durch Northern-Blot unter Verwendung einer Sonde, die homolog für die C100-R kodierende Sequenz oder spezielle Bereiche davon ist, analysiert werden. Alternativ können die gesamten Nukleinsäuren der Wirtszelle extrahiert werden und auf die Hybridisierung an diese Sonden untersucht werden.
Bei der vierten Methode kann die Expression des C100-R-Proteinprodukts immunologisch, beispielsweise durch Western-Blots, Immunoassays, wie Radioimmunfällung, enzymverknüpfte Immunassays und dergleichen festgestellt werden. Der ultimative Test auf den Erfolg des Expressionssystems involviert allerdings den Nachweis des biologisch aktiven C100-R-Genprodukts. Eine Anzahl von Assays können angewendet werden, um die Rezeptoraktivität nachzuweisen, wozu allerdings ohne Einschränkung darauf, βAPP-Bindungsassays und biologische βAPP- Assays unter Verwendung von gentechnisch hergestellten Zelllinien als Testsubstrat zählen.
5.2.3 Gewinnen von C100-R
Wenn einmal ein Klon, der hohe Gehalte an biologisch aktivem C100-R produziert, identifiziert ist, kann dieser Klon ausgestrichen werden und dafür verwendet werden, große Mengen Rezeptor zu produzieren, die unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, gereinigt werden können, wozu, allerdings ohne Einschränkung darauf, die Immunaffinitätsreinigung, chromatographische Methoden, einschließlich Hochleistungsflüssigchromatographie, Affinitätschromatographie unter Verwendung eines immobilisierten Liganden, wie βAPP-C-100 oder Analoge davon, gebunden an Perlen, die Immunaffinitätsreinigung unter Verwendung von Antikörper und dergleichen gehören.
Wenn die C100-R kodierende Sequenz gentechnisch hergestellt ist, um ein spaltbares Fusionsprotein zu kodieren, kann die Reinigung ohne weiteres unter Anwendung von Affinitätsreinigungstechniken durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Collagenasespaltungserkennungskonsensussequenz gentechnisch zwischen dem Carboxyterminus von C100-R und Protein A hergestellt werden. Das erhaltene Fusionsprotein kann ohne weiteres unter Verwendung einer igG-Säule, die die Protein A-Einheit bindet, gereinigt werden. Nichtfusionierter C100-R kann ohne weiteres aus der Säule durch Behandlung mit Collagenase freigesetzt werden. Ein anderes Beispiel wäre die Verwendung von pGEX-Vektoren, die fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutation S-Transferase (GST) exprimieren. Das Fusionsprotein kann gentechnisch mit entweder Thrombin- oder Faktor Xa-Spaltstellen zwischen dem klonierten Gen und der GST-Einheit hergestellt werden. Das Fusionsprotein kann ohne weiteres aus den Zellextrakten durch Adsorption an Glutahionagaroseperlen gereinigt werden, wonach dann in Gegenwart von Glutathion eluiert wird. Bei diesem Aspekt der Erfindung kann jede Spaltungsstelle oder Enzymspaltungssubstrat zwischen die C100-R-Sequenz und ein zweites Peptid oder Protein, das einen Bindungspartner, der für die Reinigung verwendet werden könnte, aufweist, gentechnisch hergestellt werden, z. B. jedes Antigen, für das eine Immunaffinitätssäule hergestellt werden kann.
5.3 Herstellung von Antikörpern, die den C100-R definieren
Verschiedene Prozeduren, die im Stand der Technik bekannt sind, können für die Produktion von Antikörpern an Epitope des rekombinanten C100-R angewendet werden. Neutralisierende Antikörper, das heißt solche, die mit der βAPP-C-100-Bindungsstelle des Rezeptors konkurrieren, sind insbesondere für die Diagnose und Therapie bevorzugt. Diese Antikörper umfassen, allerdings ohne Einschränkung darauf, polyklonale, monoklonale, chimere, einzelkettige, Fab-Fragmente und Fragmente, die aus einer Fab-Expressionsbibliothek hergestellt sind.
Für die Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirttiere durch Injektion mit C100-R immunisiert werden, wozu, allerdings ohne Einschränkung darauf, Kaninchen, Mäuse, Ratten, etc. zählen. Verschiedene Adjuvanzien können verwendet werden, um die immunologische Antwort, je nach Wirtspezies, verwendet werden, wozu zählen, allerdings ohne Einschränkung darauf, das Freud'sche (komplett und inkomplett), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronpolyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, das Schlüssellochhämocyanin der Napfschnecke, Dinitrophenol und potentiell geeignete humane Adjuvanzien, wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Es kann jede Technik angewendet werden, mit der die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur hergestellt werden können. Dazu gehören, allerdings ohne Einschränkung darauf, die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Kohler und Milstein (Nature, 1975, 256: 495–497) beschrieben wurde, die humane B-Zellen-Hybridomtechnik (Kosbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80-2026-2030) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77–96). Außerdem können Techniken, die für die Produktion von "chimeren Antikörpern" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851–6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604–608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452– 454) entwickelt worden sind, angewendet werden, wobei die Gene von einem Mausantikörpermolekül mit geeigneter Antigenspezifität zusammen mit den Genen von einem humanen Antikörpermolekül mit geeigneter biologischer Aktivität gesplict werden.
Antikörperfragmete, die die spezifischen Bindungsstellen von C100-R enthalten, können nach bekannten Techniken hergestellt werden. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, allerdings ohne Einschränkung darauf: die F(ab')₂-Fragmente, die durch Pepsinverdauung des Antikörpermoleküls hergestellt werden können und die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')₂-Fragmente hergestellt werden können. Al ternativ können Fab-Expressionsbibliotheken konstruiert werden (Huse et al., 1989, Science, 246; 1275–1281), um eine schnelle und einfache Identifikation der monoklonalen Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität gegenüber C100-R zu ermöglichen.
5.4. Antisense-RNA und Ribozyme
Ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung sind Oligoribonucleotidsequenzen, die die antisense-RNA und DNA-Moleküle und Ribozyme, die in der Weise funktionieren, dass die Translation von C100-R-mRNA inhibiert wird, umfassen. Die antisense-RNA und DNA-Moleküle wirken in der Weise, dass die Translation der mRNA direkt blockiert wird, wobei an die Ziel-mRNA gebunden wird und damit die Proteintranslation verhindert wird. Im Hinblick auf die antisense-DNA, sind Oligodesoxyribonukleotide, die von der Translationsinitiationsstelle stammen, z. B. zwischen den Bereichen –10 und +10 der C-100-R-Nukleotidsequenz, bevorzugt.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die die spezifische Spaltung der RNA katalysieren können. Der Mechanismus der Ribozymwirkung involviert die Sequenz spezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an die komplementäre Ziel-RNA, wonach eine endonukleolytische Spaltung folgt. Innerhalb des Umfangs der Erfindung sind gentechnisch hergestellte Hammerkopfmotivribozymmoleküle, die die endonukleolytische Spaltung der C100-R-RNA-Sequenzen spezifisch und effizient katalysieren.
Spezifische Ribozymspaltungsstellen innerhalb eines potentiellen RNA-Ziels werden anfangs identifiziert, indem das Zielmolekül auf Ribozymspaltungsstellen überprüft wird, die die folgenden Sequenzen umfassen: GUA, GUU und GUC. Nach der Identi fikation können kurze RNA-Sequenzen von zwischen 15 und 20 Ribonukleotiden, die dem Bereich des Zielgens, das die Spaltungsstelle enthält, entsprechen, auf die vorhergesagten Strukturmerkmale, wie Sekundärstruktur, die die Nukleotidsequenz ungeeignet machen kann, bewertet werden. Die Eignung der Kandidatenziele kann ebenfalls durch Austesten ihrer Hybridisierungsfähigkeit mit komplementären Oligonukleotiden unter Anwendung von Ribonukleaseschutzassays bewertet werden.
Sowohl die antisense-RNA- und -DNA-Moleküle und die Ribozyme der vorliegenden Erfindung können nach jedem Verfahren, das im Stand der Technik für die Synthese von RNA-Molekülen bekannt ist, hergestellt werden. Diese umfassen Techniken für die chemische Synthese von Oligodesoxiribonukleotiden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie beispielsweise die chemische Festphasen-Phosphoramiditsynthese. Alternativ können die RNA-Moleküle durch in vitro und in vivo Transkription von DNA-Sequenzen, die das antisense-RNA-Molekül kodieren, hergestellt werden. Diese DNA-Sequenzen können in eine große Vielzahl von Vektoren eingesetzt werden, die geeignete RNA-Polymerasepromotoren, wie die T7- oder SP6-Polymerasepromotoren, enthalten. Alternativ können antisense-cDNA-Konstrukte, die die Antisense-RNA konstitutiv oder induktiv in Abhängigkeit des verwendeten Promotors synthetisieren, stabil in die Zelllinien eingeführt werden.
Verschiedene Modifikationen an den DNA-Molekülen können eingeführt werden, um die intrazelluläre Stabilität und die Halbwertszeit zu erhöhen. Mögliche Modifikationen umfassen, allerdings ohne Einschränkung darauf, die Addition von flankierenden Sequenzen von Ribo- oder Desoxynukleotiden an die 5'-und/oder 3'-Enden des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorothioat oder 2'-0-Methyl, eher als die Phosphodiesteraseverknüpfungen innerhalb der Oligodesoxyribonukleotidhauptkette.
5.5. Verwendungen des C100-R, der DNA und der genetisch hergestellten Zelllinien
Die C100-R-DNA, die antisense-Oligonukleotide und Ribozyme, die APP-R-Expressionsprodukte, Antikörper und genetisch hergestellten Zelllinien, die oben beschrieben sind, weisen eine Anzahl von Anwendungen für die Diagnose und Behandlung der Alzheimer-Erkrankung auf.
Beispielsweise kann die C100-R-DNA-Sequenz in Hybridisierungsassays von Biopsien oder Autopsien verwendet werden, um Abnormalitäten der C100-R-Expression zu diagnostizieren; z. B. in der Southern- oder Northern-Analyse, einschließlich in situ Hybridisierungsassays. Bei therapeutischen Anwendungen können antisense-Moleküle oder Ribozymmoleküle, die auf der Basis der C100-R-DNA-Sequenz entsprechend hergestellt worden sind, verwendet werden, um die Transkription und Expression des C100-R-Genprodukts zu blockieren. Alternativ könnte die C100-R-DNA in der Gentherapie verwendet werden, um das normale rekombinante Gen in die defekten Zellen eines Individiums einzuführen oder eine endogene Mutation zu korrigieren, um den C100-R und seine Funktion wieder herzustellen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können Antikörper, die spezifisch für den C100-R sind, verwendet werden, um das Muster der Rezeptorexpression in einem Biopsiegewebe zu bestimmen oder in vivo diagnostisch abzubilden; bei diesen Anwendungen können "neutralisierende" Antikörper bevorzugt sein.
Beispielsweise könnte ein Antikörper, der im Hinblick auf eine abbildende Verbindung konjugiert ist, an einen Patienten verabreicht werden, um den Ort und die Verteilung von C100-R in vivo "zu kartieren".
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung könnte der APP selbst oder ein Fragment, das seine βAPP-C100-Bindungsstelle enthält, in vivo verabreicht werden. Der freie C100-R oder das Peptidfragment könnten kompetitiv an βAPP binden und somit seine Wechselwirkung mit dem nativen Rezeptor in vivo zu inhibieren.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die genetisch hergestellten Zelllinien, die den gesamten C100-R oder seine Ligandenbindungsdomäne exprimieren, dafür verwendet werden, aktive J3APP-C100-Agonisten oder -Antagonisten durchzumustern und zu identifizieren. Alternativ können Zelllinien, die den C100-R exprimieren, für diesen Zweck verwendet werden; beispielsweise Neuroblastomzelllinien, wie SK-N-MC, die vorliegend als Beispiel angegeben werden. βAPP-abgeleitete Peptide, andere Peptide, synthetische Verbindungen, natürliche Produkte und andere Quellen von potentiell biologisch aktiven Materialien können auf die folgenden Weisen durchgemustert werden. Die Fähigkeit einer Testverbindung, die Bindung von βAPP-C100 (die beispielsweise mit ³⁵Met oder einer "Flaggen"-Sequenz markiert sein kann oder mit Antikörpern gegen das Peptid nachgewiesen werden kann) an den C100-R zu inhibieren und damit ihr Potential, als Agonist oder Antagonist zu wirken, kann gemessen werden. Als Quelle für den Rezeptor können Zellhomogenate, die den gesamten C100-R exprimieren oder subzellulare Fraktionen verwendet werden. Die Bindung kann durch Anwendung von standardmäßigen Rezeptorbindungstechniken, wie solche, die im Abschnitt 6.1.3 beschrieben sind, gemessen werden. Die Fähigkeit der Mittel, die Effekte von βAPP-C100 auf die Signaltransduktionantworten in den C100-R-exprimierenden Zellen zu verhindern oder nachzuahmen, kann gemessen werden. Beispielsweise können Antworten, wie Änderungen der Cytosolkonzentrationen von Calcium, die Aktivierung von spezifischen Proteinkinasen, eine veränderte Sekretion von Hormonen oder Neurotransmittern, eine Modulation der zweiten Messengerproduktion oder Änderungen des Zellmetabolismus überwacht werden. Diese Assays können in den gesamten Zellen oder in Membranpräparaten unter Anwendung konventioneller Techniken, die für diesen Zweck entwickelt worden sind, durchgeführt werden. In genetisch hergestellten Zellen oder Zelllinien, die auf die toxischen Effekte von βAPP-C100 antworten, kann die Fähigkeit von Substanzen, die Toxizität zu induzieren oder zu verhindern, gemessen werden. Die Toxizität kann, wie sie in der Literatur (Yankner et al., 1989, Science 245: 417–420) beschrieben ist, oder nach anderen etablierten Techniken überwacht werden.
Transgene Tiere, die die C100-R-DNA als Transgen enthalten, können gentechnisch hergestellt werden, um die in vivo Effekte der βAPP-C100-Agonisten oder -Antagonisten, die wie oben beschrieben oder in anderen Durchmusterungen gefunden werden, zu bestimmen oder um andere Mittel, die für die Alzheimer-Erkrankung potentiell von therapeutischem Nutzen sind, entsprechend herzustellen.
Erst kürzlich sind Computer hergestellte Modelle für die Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen entwickelt worden, und in einer spezifischen Ausführungsform kann die Information, die aus einer Computermodellierung von C100-R stammt, dafür verwendet werden, den Rezeptor-Agonisten oder -Antagonisten zu gestalten. Die Änderungen, die in den C100-R-Sequenzen vorgenommen worden sind, wobei beispielsweise Techniken für die stellengerichtete Mutagenese angewendet werden und die Expression der mutanten Rezeptoren in Zelllinien können dafür verwendet werden, um weiterhin die funktionelle Rolle von besonderen Rezeptorbereichen und -resten zu definieren.
6. Beispiele
Der Unterabschnitt unten beschreibt zunächst die Charakterisierung eines APP-Bindungsproteins, das mit neuronal abgeleiteten Zellen exprimiert worden ist und die Klonierung und Sequenzierung einer komplementären DNA, die ein Teil des C100-R der Ratte darstellt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von C100-R zeigt verschiedene Motive, die gemeinsam mit Calciumkanälen vom "B-"Typ, Ryanodine-Calciumkanälen, Calreticulin und Serin/Thronin-Proteinkinasen geteilt werden.
6.1 Material und Methoden
6.1.1 In vitro Translation von Flaggen-βAPP-C100
Das folgende, eine "Flaggen"-Sequenz enthaltendes Oligonukleotid wurde synthetisiert und in pGEM7 eingesetzt; ACC ATG GAC TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA TCG AT MET ASP TYR LYS ASP ASP RSP ASP LYS SER (Immunex; Prickett et al., 1989 BioTechniques 7: 580). Außerdem liefert, vor dem MET-Codon, das ACC-Triplett eine Konsensussequenz für den eucaryotischen Translationsstart, und es wurde eine ClaI-Stelle nach der Flaggense quenz für die Klonierung als HindIII-Linker am fünf-Primeende des Oligos hinzugefügt. Das pGEM7-Flaggenkonstrukt wurde mit SmaI und ClaI geschnitten, und die ClaI-Stelle wurde aufgefüllt. Das BglI/SmaI-Fragment aus βAPP-695 wurde in dieses Konstrukt kloniert. Es wurden Klone mit der richtigen Orientierung ausgewählt. Diese Rekombinante wurde verwendet, um ein ³⁵S-βAPP-C100-Peptid auf zwei Weisen herzustellen. Erstens, in das gekoppelte Transkriptions-/Translationssystem, ein TNT-gekoppeltes Reticulocytenlysatsystem (Promega Corp.). Die geschlossene kreisförmige Plasmid-DNA wurde zusammen mit ³⁵S-Methionin (6 μC₁) in das Lysat gegeben, wonach dann die empfohlene Prozedur folgte. Zweitens, in nicht gekoppelten Reaktionen wurde die Rekombinante mit Spe I linearisiert, und es wurden 5 μg DNA verwendet, um die RNA in vitro (≈ 20–30 μg) nach der Anweisung des Herstellers (Promega Corp.) herzustellen. 1 –5 μg dieser RNA wurde entweder in einem Weizenkeimsystem oder in einem Reticulocytentranslationssystem vom Kaninchen nach dem Protokoll des Herstellers (Promega Corp.) translatiert. Die in vitro Translationen wiesen entweder ein Zehntel Volumen von 100 mMol N-Acetylglycosamin (Sigma) hinzugefügt auf und wurden in Aliquots verbracht und bei –80°C gefroren und vor der Verwendung dialysiert; wurden in Aliquots verbracht und direkt gefroren, dann dialysiert und vor der Verwendung in einem Röhrchen über die Zentrifuge gereinigt (Boehringer-Mannheim); oder wurden unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Flaggenantikörpers (Ca⁺⁺-abhängige Bindung M1 Ab, IBI), gekoppelt an Affigel 10 (Biorad) affinitätsgereinigt. Die Affinitätschromatographie wurde durch Aufgeben der in vitro Translationen über die Affigel 10-gekoppelte M1-Antikörpersäule (1 ml Bettvolumen), äquilibriert in PBS (120 mMol NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mMol Phosphatpuffer, pH 7,4) mit 0,5 mMol CaCl₂ durchgeführt. Nach einem sorgfältigen Waschen (5– 10 Säulenvolumen) wurde das Peptid von der Säule mit PBS mit Na₂EDTA (2 mMol) eluiert. Das Peptid eluierte als scharfer 0,7 ml Peak. EDTA wurde durch Dialyse für die Verwendung bei der Bindung oder in der Autoradiographie entfernt. Das Flaggen-βAPP-C100-Konstrukt wurde sequenziert, und das Produktpeptid aus der in vitro Translation wurde im Hinblick auf die Aminosäurezusammensetzung durch massenspektroskopische Techniken analysiert, um seine Identität zu bestätigen.
6.1.2. Zellkultur
Man ließ PC12-Zellen (ATCC) für die Bindungsassays in RPMI1640, das mit 10% Hitze inaktiviertem Pferdeserum und 5 fötalem Rinderserum ergänzt war, wachsen. Es wurden T-175-Flaschen mit 5 × 10⁵ Zellen/ml in 60 ml Wachstumsmedium, das 10 ng/ml NGF enthielt, geimpft. Weitere 60 ml dieses Mediums wurden alle 2 Tage hinzugegeben, bis die Zellen geerntet wurden (in der Regel bei 6 Tagen). Wo es angezeigt war, wurden die PC 12-Zellen wie oben kultiviert, mit der Ausnahme, dass kein NGF vorhanden war. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 138 × g für 8 Minuten gesammelt. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 5 ml Wachstumsmedium resuspendiert. Die Zellen wurden 3 mal durch eine 23 g Nadel, die an einer 10 cc Spritze befestigt war, trituriert, um eine Einzelzellensuspension oder höchstens kleine Zellaggregate herzustellen. Die Exklusion mit Trypanblaufarbstoff zeigte an, dass über 99% der Zellen lebten.
Es wurden SK-N-MC-Zellen (ATCC) in DME, der mit 10% Kalbsserum ergänzt war, wachsen gelassen. Die SK-N-MC Zellen wurden wie bei den PC-12-Zellen kultiviert, mit der Ausnahme, dass NGF enthalten war.
6.1.3. Bindung an die Zellen
Für βAPP-C-100 Bindungsexperimente wurden die PC-12 oder SK-N-MC-Zellen, die wie oben beschrieben gewachsen und hergestellt worden sind, gezählt, durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit (138 × g) gesammelt und in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) mit 1% BSA und 1% Glukose (PBG) resuspendiert. Eine 0,08 ml Volumen Zellsuspension, die 2 × 10⁶ Zellen enthielt, wurde mit 0,01 ml ³⁵S-βAPP-C100 und 0,01 ml PBG oder PBG, der jeweils nicht markiertes βAPP-C100 oder sein Vehikel enthielt, vermischt. Für kinetische Experimente und Inhibierungsexperimente betrug die Konzentration von ³⁵S-βAPP-C100 entweder 25 pMol oder 50 pMol. Für Sättigungsexperimente lag die Ligandenkonzentration im Bereich von 15 pMol bis 6 nMol. Die Mischung wurde bei 4°C für 3 Stunden inkubiert, falls nichts anderes angegeben ist. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 138 × g für 90 s pelletisiert, der Überstand (der den ungebundenen Liganden enthielt) wurde entfernt, und es wurden 0,2 ml frischer, eisgekühlter PBG hinzugegeben. Die Zellen und der frische Puffer wurden kurz bewegt und wieder zentrifugiert und in frischem, eiskalten Puffer wie oben suspendiert. Schließlich wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletisiert, durch BSA (0,1%) behandelte Filter filtriert und mit 41 ml Spülungen mit eisgekühltem PBS mit 0,1% BSA gewaschen. Die Dauer zwischen der Resuspension der Zellen in frischem, eiskalten Puffer und die Filtration der Zellen betrug weniger als 10 Min. Bei den Dissoziationsexperimenten wurden die Zellen, um eine Probe mit gebundenem Liganden zu sammeln, in dem Puffer, der als zweite Waschung hinzugegeben wurde, für bis zu 3 Stunden inkubiert, um zu ermöglichen, dass der gebundene Ligand dissoziiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation pelletisiert, und der Überstand, (der den gebundenen Liganden, der dissoziiert hatte, enthielt) wurde entfernt. Die Zellen wurden dann wieder gewaschen und wie oben geerntet. Die Radioaktivität, die durch die Filter zurückgehalten wurde, wurde durch Scintillationszählen gemessen. Als nicht-spezifische Bindung wurde die angenommen, die in Gegenwart von einem Überschuss βAPP-C100 (3,2 nMol bis 18 nMol) auftrat. Die Sättigungsdaten wurden mit einem Computer unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Software analysiert. Das Bindungsmodell, das am besten mit den experimentellen Daten übereinstimmte, wurde durch den F-Test (p < 0,5) bestimmt.
6.1.4 Bindungsautoradiographie
Sprague-Dawley-Ratten wurden durch Hypercapnia getötet und auf Eis gelegt, bis ihre Gehirne entfernt werden konnten (weniger als 1 Stunde). Die Gehirne wurden schnell gefroren, in Isopentan auf –20°C mit Trockeneis gekühlt und entweder gleich verwendet oder bei –80°C bis zur Verwendung aufbewahrt. Die Gehirne wurden auf den Probenhalter eines Kryostats befestigt, und es wurden 25 μMol coronale Sektionen auf Gelatine beschichtete Mikroskopträger gesammelt. Die Sektionen wurden entweder über Nacht bei –80°C gefroren oder gleich verwendet. Die Bereiche wurden bei 4°C an der Luft getrocknet und dann mit dem Bindungspuffer (PBS 1% BSA) für 30 Minuten bei 4°C vorinkubiert. Der Puffer wurde durch frischen Puffer, der entweder den Liganden allein (35 S-βAPP-C100, 0,01 mMol) oder den Liganden mit bis zu einem 10-fachen Überschuss an nicht markiertem βAPP-C100 oder sein Vehikel enthielt, ersetzt. Die Inkubation wurde für 3 h für 4°C fortgesetzt. Der Liganden enthaltende Puffer wurde dann entfernt, und die Sektionen wurden zweimal mit frischem Puffer (15 Min und 1 Min, 4°C) gewaschen. Die Sektionen wurden dann in eiskaltes destilliertes Wasser 10 mal getaucht und unter einem Luftstrom bei Raumtemperatur getrocknet. Die Sektionen wurden dann auf eine Folie eines Röntgenstrahlfilms für einen Zeitraum von 1 bis 14 Tage gelegt, und der Film wurde entwickelt. Einige Sektionen wurden mit Cresylviolett für die Identifikation der Gehirnbereichs gefärbt. Die optischen Dichten der Bereiche des Autoradiographie wurden quantitativ mit einem Bildanalysesystem bestimmt.
6.1.5. Durchmustern auf C100-R cDNA durch Expressionsklonie rung
Es wurde eine cDNA aus mRNA von embryonischem Gehirn von 18 Tage alten Ratten nach dem Protokoll von Neve et al. (1986; im Einzelnen dargelegt von Klickstein und Neve in Current Protocols in Molecular Biology) konstruiert. λgt11-Bibliotheken (Rattengehirn-cDNR-Bibliothek, RL Neve; humane Gehirn-cDNA-Bibliothek, Clontech) wurden auf Y1090 E. coli Zellen bei 150.000 pfu/150 mm Platte ausplattiert. Die Platten wurden bei 42°C für 3 h inkubiert, bei welcher Zeit die Plaques gerade einmal sichtbar waren. Die Platten wurden mit Schleicher und Schuell 132 mm Nitrocellulosefiltern, die mit 10 mM IPTG (Isopropyl-β,D-thiogalactosid) gesättigt worden waren, bedeckt und leicht an der Luft getrocknet. Die Platten ließ man bei 37°C für 3 Stunden, und der Filter wurde entfernt und in TBS (50 mMol Tris, pH 7,7, 150 mMol NaCl) gegeben. Ein zweiter, doppelter, IPTG-getränkter Nitrocellulosefilter wurde dann auf die Plattenoberfläche gegeben und für 2 Stunden darauf gelassen. Der zweite Filter wurde entfernt und in TBS gegeben. Man ließ die Filter in TBS ohne ein Blockierungsmittel für mindestens 12 Stunden und bis zu vier Tagen, um ein Wiederauffalten zu ermöglichen. Die Filter wurden in TBS mit 5% Magermilchpulver für Zeiträume im Bereich von 2 h bis über Nacht blockiert. Die Filter wurden in Bindungspuffer (50 Mol Tris-HCl, pH 7,7, 50 mMol NaCl 2 mMol MgCl₂, 1 mMol Dithiothreit) gewaschen. Die Filter wurden mit in vitro translatiertem ³⁵β-βAPP-C100 bei 3 nMol für 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Es wurden 3 Minuten lange Waschungen (4°C) durchgeführt, um nicht gebundenes markiertes Peptid zu entfernen: (i) mit Bindungspuffer allein, (ii) mit Bindungspuffer + 0,1% NP40 und (iii) Bindungspuffer. Die Filter wurden sofort aus dem Waschvorgang entfernt und an der Luft getrocknet. Die verarbeiteten Filter wurden zur Belichtung auf einen X-OMAT RP-Film mit einer Abschirmung für 6 Tage bis 2 Wochen gelegt. Es wurde festgestellt, dass nasse Platten notwendig waren, um einen ausreichenden Protein/Plaque zu bekommen und damit ein signifikantes Signal. Ebenfalls war es während der Prozedur notwendig, viel mehr Phagen auszuplattieren als routinemäßig in einem vergleichbaren Stadium der Reinigung für Nukleinsäuresonden notwendig ist. Selbst wenn eine "Plaque"-reine Phagenpopulation, die die βAPP-C100-Bindungsproteinstelle enthielt, wie oben ausplattiert wurde, gab es nur eine niedrige Prozentzahl an Plaques, die an βAPP-C100 gebunden waren, was wahrscheinlich auf das Erfordernis einer richtigen Faltung für die Bindung zurückzuführen ist.
Die doppelten Filter wurden verglichen, um Plaqueexpressionsproteine zu identifizieren, die an den ³⁵S-βAPP-C100 binden. Positive Plaques wurden gepickt und durch weitere Runden der Bindung und Reinigung gegeben. Sechs Isolationsrunden waren erforderlich, um einen einzigen positiven Klon aus der RattencDNA-Bibliothek zu erhalten. Dieser Rattenklon wird als λAB1R bezeichnet. Fünf Isolationsrunden waren erforderlich, um fünf positive Klone aus einer humanen Gehirn-cDNA Bibliothek zu isolieren.
Die Insertion aus λAB1R wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von λgt11-Sequenzierungsprimern, die die Restriktionsenzymstellen (Sal I und Not I) enthalten, subkloniert. Das amplifizierte Fragment wurde gereinigt, mit den Restriktionsenzymen nach der Beschreibung des Herstellers geschnitten und in Sal I/Not I-geschnittenen Blueskript (Sk+, Stratagene) subkloniert. Der Rattensubklon wurde als pAB1R-Ratte bezeichnet.
Eine zweite Klonierungsstrategie wurde entwickelt unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Antikörpers gegen das "Flaggen"-Ende. Es wurden Bibliotheken plattiert, Filterlifts hergestellt, verarbeitet, geprobt und wie oben beschrieben, gewaschen, mit der Ausnahme, dass der βAPP-C100 nicht mit ³⁵S-Methionin markiert war. Die Filter wurden in einem Stratalinker-Vernetzer (Stratagene) vernetzt und durch eine zweistündige Inkubation in TBS mit 5% fettfreier Milch blockiert. Die Filter wurden dann mit einem kommerziellen Antiflaggenantikörper bei 10 μg/ml (M2, IBI) in TBS geprobt. Überschüssiger Antikörper wurde durch drei 10 minütige Waschungen in TBS (4°C) entfernt, wobei die mittlere Waschlösung mit 0,1% NP40 ergänzt war. Die Filter wurden mit einem zweiten Antikörper, einem Antimaus-IgG(schwere und leichte Kette)-Biokonjugat von der Ziege (NEN) in der gleichen Weise wie bei dem ersten Antikörper inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Filter mit [¹²⁵I]- Avidin (NEN) bei 0,5 μC₁/ml in Bindungspuffer wie oben inkubiert. Die letzten drei Waschvorgänge waren in TBS, mit dem mittleren Waschvorgang, der 0,1% NP 40 enthielt. Die Filter wurden an der Luft getrocknet und für die Belichtung auf einen XOMAT-RP-Film mit einer Abschirmung bei –70°C für 6 Tage bis 3 Wochen gelegt. Die Autoradiographien der Filter wurden im Hinblick auf die Duplikate verglichen. Die positiven Plaques wurden gepickt und durch weitere Runden der Durchmusterung gebracht.
Die Phagen, die den humanen Verwandten des βAPP-C100-Bindungsproteins enthielten, wurden sowohl durch die Direktbindungsmethode als auch durch die Flaggenantikörpermethoden kloniert. Diese cDNAs wurden subkloniert und dann sequenziert.
6.1.6 cDNA-Charakterisierung
Die cDNAs wurden entweder in Plasmidvektoren mit hoher Kopienzahl subkloniert und in Bakterien transformiert, oder sie wurden direkt aus den Phagenrekombinanten durch die Polymerasekettenreaktion amplifiziert. Im ersten Fall wurde doppelsträngige Minipräp-DNA unter Verwendung von Sequenase (U.S. Biochemicals) sequenziert; im letzteren Fall wurden die PCR-Produkte gereinigt und mit dem Femtomole-Sequenzierungssystem (Promega) sequentiert.
Die Sequenzierung der Klone wurde durch die standardmäßige Didesoxymethode (Sequenase; USBiochem) durchgeführt. Die Computeranalyse wurde primär mit GenePro (Riverside Scentific Enterprises) und PCGene (Intelligenics) durchgeführt.
Die Southern-Übertragungen von humaner DNA oder DNA von der Ratte (PC 12) wurden mit einem ³²P-markierten 200 by Fragment (Eco RI/ScaI), das das 5'-Ende der AB1R-cDNA repräsentiert, geprobt. 8 μg DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten, auf einem 0,8% Agarosegel laufen gelassen und auf Nylon oder Nitrocellulose übertragen.
Die Northern-Analyse wurde mit der isolierten gesamten zellulären RNA mit der Guanidiumthiocyanatmethode (Chirgwin et al. 1979 Biochemiytry 18 5294) durchgeführt. Es wurden Glyoxalgele, Formaldehyd-Agarosegele und Punktblots verwendet, um die RNA unter verschiedenen Bedingungen und aus verschiedenen Quellen (Tanzu et al., 1987, Science 235, 880–884; Tanzi et al., 1988, Neture 331: 528–530) zu quantifizieren und zu bewerten. Die RNA aus den PC 12-Zellen, die mit Nervenwachstumsfaktor für verschiedene Zeiträume behandelt worden war, die RNA von Gehirnen von Patienten mit der Alzheimer-Erkrankung und dem Down-Syndrom, die RNA von Gehirnsubbereichen, die RNA von verschiedenen Entwicklungsstadien, etc. wurden laufen gelassen. Die Proben von AD- oder Downs-Gehirnen wurden von dem Children's-Hospital (Boston) Pathology Dept. und vom McLean Hospital Brain Tissue Ressource erhalten.
Ein Lysogen mit 1985 by AB1R-cDNA in λgt11 wurde in Y1089 durch Infizieren von Y1089 Bakterien mit dem rekombinanten Phagen bei einem Moi von 10.000 : 1 und durch Identifizierung der Temperatur empfindlichen Klone aus den unlysierten Bakterien konstruiert. Das Lysogen wurde mit Hitze und IPTG induziert, und das erhaltene Zelllysat wurde in einem Laemmil-Gelprobenpuffer resuspendiert. Ein Teil der Probe wurde auf 10% PAGE elektrophoretisiert, auf Nitrocellulose übertragen und in jeweils aufeinanderfolgenden verdünnteren Konzentrationen von Harnstoff in PBS Triton-X bei 4°C über zwei Tage nach der Methode von Kageyama und Pastan (1989, Cell 59: 815) inkubiert. Die Bindung an ³⁵S-βAPP-C100 wurde dann nach dem Protokoll durchgeführt, das für die Isolierung des AB1-R-Klons aus den cDNA-Bibliotheken verwendet wurde, mit der Veränderung, dass PBS anstelle von TBS verwendet wurde.
Die cDNA-Insertion aus λAB1R wurde in den Säugerexpressionsvektor pCDNA1 in antisense-Orientierung subkloniert, und die PC 12-Zellen wurden durch Elektroporation transfiziert. Diese transienten Zellen ließ man in DME-Medium für 3 Tage wachsen, die dann mit NGF behandelt wurden und auf ihre Fähigkeit getestet wurden, ³⁵S-markierten βAPP-0100 zu binden. Stabile transfizierte Zellen wurden durch Einschluss von G418 in dem Medium selektiert, und die Neomycin resistenten Zellen wurden anschließend in dem Bindungsassay auf ihre Fähigkeit getestet, den markierten βAPP-C100 nach der Behandlung mit NGF zu binden.
6.1.7. in situ Hybridisierung unter Verwendung der βAPP-C100-Bindungsproteinsonde
Es wurden Hybridisierungssonden durch Markieren des pAB1R-Rattenkonstrukts, das an verschiedenen Restriktionsstellen linearisiert war, hergestellt. Es wurden antisense-RNA-Sonden aus der Plasmidmatrize, die an der Ncol-Stelle linearisiert war, unter Verwendung des T3-Promotors von Blueskript hergestellt, und es wurden sense-Kontroll-RNA-Sonden aus dem Plasmid, das an der BamHI-Stelle linearisiert war, unter Verwendung des T7-Promotors von Blueskript hergestellt. Die Sonden wurden auf verschiedene Weisen hergestellt. Es wurde die in vitro Transkription angewendet, um die RNA-Sonden zu produzie ren. Die RNA wurde entweder mit ³⁵S-UTP (Promega-Reagenzien) oder Digoxigenin-UTP (Beohringer-Mannheim-Reagenzien) markiert. Die Digoxigenin-markierten DNA-Sonden wurden durch PCR hergestellt (Lanzillo, 1991; M. McKenna und J. Carlson, Persönliche Mitteilung); die PCR-Primer wurden hergestellt, um die geeigneten Fragmente zu produzieren (Genosys Biotechnologies, Inc.).
Die Sektionen für die in situ Hybridisierung wurden in der gleichen Weise wie bei der Bindungsautoradiographie hergestellt, wobei allerdings RNAse freie Bedingungen angewendet wurden. Vor der Hybridisierung wurden die Sektionen bei drei minütigen Waschungen mit Phosphatpuffer (0,1 Mol), der Glyzin (0,75 g/ml) enthielt, unterworfen, wonach zwei 15 minütige Waschungen mit Phosphatpuffer allein folgten. Sie wurden dann mit Proteinnase K (1 μg/1 ml in 15 mMol Tris-HCl, pH 7,5 und 15 mMol EDTA) für 30 Min. bei 37°C behandelt und mit Essigsäureanhydrid (0,25% in 0,1 Mol Triethanolamin, pH 7,5) für 10 Min gewaschen. Danach folgten zwei 15-minütige Waschungen mit SSC (0,15 Mol NaCl, 0,015 Mol Natriumcitrat, pH 7,0) bei doppelter normaler Konzentration (2 ×), ein Entfetten mit EtOH und Chloroform und das Trocknen an der Luft. Die Hybridisierungssonde, die wie oben beschrieben, hergestellt wurde, wurde dann auf die Sektionen in einer Lösung, die 50% Formamid, 20 × Denhardt's Reagenz, 300 μg/ml einzelsträngige DNA, 150 mg/ml tRNA, 20 mMol β-Mercaptoethanol (BME) und 2 × SSC enthielt, gelegt. Es wurden Deckplättchen über die Sektionen und Hybridiserungslösung gelegt und an die Objektträger mit Kautschukzement versiegelt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 60°C durchgeführt. Die Deckplättchen wurden dann entfernt und die Sektionen wurden zweimal für 30 Minuten bei 160°C mit 4 × SSC, der mit 300 mMol BME ergänzt war, gewaschen. Danach wurden sie mit RNRse (20 μg/ml in 2 × SSC, 20 Mol BME) für 30 Min. bei 45°C behandelt. Die Sektionen wurden dann 4 × mit 2 × SSC (60 Min., 30 Min., 30 Min. und 30 Min. bei 60°C) gewaschen, einmal mit SSE (30 Min, 60°C) gewaschen und über Nacht in 2 × SSC gelassen. Am folgenden Tag wurden die Sektionen schnell in 0,05 Mol Phosphatpuffer gespült und dann mit destilliertem Wasser. Sie wurden dann an der Luft getrocknet und in Kontakt mit einem Röntgenstrahlfilm gebracht. Die Filme wurden einen Tag bis 2 Wochen später entwickelt und dafür verwendet, die grobe Verteilung der hybridisierten Sonde festzustellen. Eine feinere Lokalisierung der Sonde wurde erreicht, indem die Sektionen mit einer Photoemulsion beschichtet wurden, dann die Emulsion entwickelt wurde und die Korndichten über die Zellkörper in verschiedenen Gehirnsektionen gemessen wurden.
6.1.8. Klonierung von APP-4 der Ratte in voller Länge
Um den C100-R in voller Länge zu erhalten, wurden Rattenbibliotheken mit verschiedenen Sonden, die aus pAB1R-Ratte hergestellt wurden, durchgemustert. Diese Sonden waren spezifisch für den größten Teil der 5'-Sequenz des Rattenklons. Nach dem mehr Rattensequenz erhältlich war, wurden aufeinanderfolgende Durchmusterungsrunden unter Verwendung von Sonden, die spezifisch für den größten Teil der 5'-Sequenz waren und in jeder Durchmusterungsrunde erhältlich waren, durchgeführt. Außerdem wurde eine zweite cDNA-Bibliothek aus Rattengehirn in λZAP (Stratagene) mit einem Primer, der spezifisch für den 5'-Bereich der cDNA-Insertion war, konstruiert. Die Bibliothek wurde unter Verwendung des RAGE-Protokolls (rapid amplification cDNA ends) Frohmann et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 8998–9002) mit den folgenden Modifikationen konstruiert: (1) die cDNA-Synthese wurde mit AB1RT3-1 oder mit AB1RT3-3, die spezifisch für 3'-UTR der AB1R-mRNA sind, anstelle mit Oligo (dT) geprimed. (2) Die mRNA wurde mit Methylquecksilberhydroxid vor der cDNA-Synthese denaturiert. (3) Es wurde MMLV reverse Transkriptase ("Superscript", Bethesda Research Labs) anstelle von AMW reverser Transkriptase verwendet. (4) Es wurden NotI-Adaptoren anstelle von EcoRI-Linkern an die Enden der cDNAs gebunden, so dass keine nachfolgende Verdauung der cDNA vor der Klonierung notwendig war. Die cDNAs wurden in verdautes NotI kloniert und teilweise in λZAP II gefüllt, um jeweils zwei Bibliotheken mit etwa 10⁵ cDNA herzustellen. Diese Bibliothek wird nun mit Sonden, die spezifisch für den größten Teil der 5'-Sequenz waren und bei jeder Klonierungsrunde erhältlich waren, durchmustert.
6.2. Ergebnisse
6.2.1. Radioligandenbindung
Weil βAPP-C100 gegenüber NGF-differenzierten PC12-Zellen toxisch ist, haben wir die Bindung des in vitro synthetisierten βAPP-C100-Fragments an die Oberfläche der PC12-Zellen, die mit NGF (Kozlowski et al., 1992 J. Neuroscience 12: 1679) behandelt worden waren, getestet. Die ³⁵SβAPP-C100-Bindung an die differenzierten PC12-Zellen war durch nicht markierten βAPP-C100 (1A) inhibierbar. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der Neuroblastomzellline, SK-N-MC (siehe 1B) erhalten.
In den NGF-12-Zellen betrug die inhibierbare Bindungsfraktion 40%–60% der gesamten Bindung. Der IC₅₀-Wert für die inhibierbare Bindung betrug 1,7 ± 0,7 nMol (n = 5). Die inhibierbare Bindung erreichte ein Maximum nach drei Stunden Inkubation und war vollständig dissoziierbar (2). Sättigungsexperimente zeigten das Vorhandensein einer einzelnen Klasse von Bindungsstellen mit einem Kd-Wert von 0,81 ± nMol an, in annähernder Übereinstimmung mit dem oben bestimmten IC₅₀-Wert, und einen B_max-Wert von 0,37 ± 0,05 f Mol/10⁶ Zellen. Die Bindung von ³⁵5-βAPP-C100 an NGF-behandelte PC12-Zellen wurde durch andere Peptide, einschließlich einer Anzahl von Tachykininen, nicht signifikant inhibiert. In den Rattengehirnsektionen wurden die höchsten Gehalte spezifischer Bindung in Regionen des Hypocampus und des Geruchstuberkels gefunden.
Die Menge inhibierbarer ³⁵5-βAPP-C100-Bindung war von der Dauer der Aussetzung der PC12-Zellen in NGF abhängig. PC12-Zellen, die nicht NGF ausgesetzt waren, zeigten eine geringe inhibierbare Bindung, während solche, die in Gegenwart von NGF für 4 oder 6 Tage kultiviert worden waren, progressiv größere Mengen an Bindung zeigten. Eine andere Variable, die die Bindung beeinflusst, war der pH. Die maximale Menge an Bindung trat bei pH 7 auf. Die Bindung betrug nur 25% des Maximums bei pH 6 und nur 52% des Maximums bei pH 8,5.
Zur Feststellung der Stabilität von ³⁵5-βAPP-C100 in den Assaybedingungen, wurden Proben mit freiem Liganden am Ende der Inkubationszeit (ungebunden) und mit Ligand, der an die Zellen gebunden wurde und freigesetzt wurde, durch SDS-Polyacrylamidgeldelektrophorese (PAGE) untersucht. Vor der Zugabe in den Assay war die meiste Radioaktivität in einer einzelnen Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 15 kDA enthalten. Dieses repräsentiert das Monomer βAPP-C100. Eine kleine Menge Material war ebenfalls in zweiten diffusen Banden vorhanden. Eine wanderte bei etwa 2 × dem Molekulargewicht der Hauptban de, und sie repräsentiert wahrscheinlich ein Dimer von βAPP-C100. Die andere Bande hatte ein viel höheres Molekulargewicht und kann ein Aggregat sein. Das Gelprofil des ungebundenen Liganden am Ende der Inkubationszeit war identisch zu demjenigen des Liganden vor der Inkubation, was anzeigt, dass der Ligand nicht degradiert war. In ähnlicher Weise hatte der Ligand, der aus der Bindung freigesetzt wurde, das gleiche Profil wie der Ligand, der ursprünglich hinzugegeben wurde, mit der möglichen Ausnahme einer geringen Reduktion der Menge an Material mit hohem Molekulargewicht. Diese Daten zeigen, dass die Bindung des βAPP-C100-Liganden nicht seine Modifikation verursacht.
Eine Mutation von Tyrosin in βAPP-C100, die gemacht wurde, um die Wichtigkeit einer Konsensussequenz für Phosphotyrosin (Tyr₆₈₇ bis Phe) zu untersuchen produzierte ein Peptid das nicht toxisch gegenüber differenzierten PC-12-Zellen war. Phe₆₈₇-βAPP-C100 inhibiert die ³⁵S-βAPP-C100-Bindung bei Konzentrationen bis zu 14 nMol (n = 3) nicht signifikant, was den Liganden an der βAPP-C100-Bindungsstelle mindestens um das 20-fache weniger stark macht als die native Form.
6.2.2. Klonierung und Charakterisierung von C100-R
Die autoradiographischen Signale von der ³⁵S-βAPP-C100-Bindung an λgt11-Plaques, die induziert waren, um das Protein im späten lytischen Zyklus zu exprimieren, waren atypisch und variabel. Wir verwendeten den XOMAT-RP-Film hoher Auflösung und lange Belichtungen, um klare Duplikate auf den Autoradiographien (3) herzustellen.
Die Größe der cDNA-Insertion des Rattenklons, λAB1R, betrug 1970 bp. Die vollständige Sequenz ist in 4 (SEQ. ID. NRN.: 1–2) gezeigt. Die gezeigte Sequenz umfasst einen Teil des von den Vektoren stammenden β-Gal-Gens, λgt11 und Blueskript. Das offene Leseraster des Klons deckt sich nicht mit dem β-Gal-Gen, somit wird der Klon als Nonfusionsprotein exprimiert. Das ATG bei Position 175 hat eine angrenzende Sequenz acht Basenpaare weg, die als eine E. coli ribosomale Bindungsstelle, -AGAAA (die kanonische Stelle ist AGGA) dienen könnte. Die Translation des offenen Leserasters, das an diesem Methionin anfängt, könnte ein Protein mit 407 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 45.253 D ergeben. Diese Expression wäre wahrscheinlich ein Reinitiationsprodukt, das bereits zuvor für die Expression eines 100-kD Nonfusionsproteins (Yang C. H. Lambie, E. J. und Snyder, M. J. of Cell Biology 116: 1303 –1317) beschrieben wurde. Die Sequenzanalyse hat ergeben, dass der Klon 1349 Basenpaare des Carboxyterminusbereichs des Gens (1.395 minus β-Gal-Sequenz) und 575 Basenpaare eines 3'-nicht-translatierten Bereichs enthält. Die Nukleinsäuresequenzanalyse zeigt eine Homologie mit Calciumkanälen vom "B"-Typ, dem Ryanodine-Calciumkanal und dem hochaffinitätscalciumsbindungsprotein, Calreticulin (5). Die Analyse der translatierten Proteinsequenz zeigt verschiedene potentielle Phosphorylierungsstellen (verschiedene Kinasezielstellen), einschließlich cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinasen (Proteinkinase C, Caseinkinase II), potentielle N-Glykosylierungsstellen, potentielle N-Myristolylierungsstellen, Tyrosinsulfatierungsstellen und eine Serin/Threonin-Proteinkinase spezifische Signatur. Diese Ser/Thr-Kinase"Signatur" oder konservierte katalytische Kernsequenz findet sich im AB1R-Klon von 246–258 in der translatierten Sequenz (4) . Die Signatur passt in das -[LIVMFYC]-x-[HY]-D[LIVMFY]- K-X(2)-N-[LIVMFC] Konsensusmuster, das von Hunter und seinen Kollegen (Hanks, S: K., Quinn, A. M. und Hunter, T. (1988) Science 241 42–52) gefunden wurde. In dem AB1R-Klon der Ratte ist die Sequenz V-I-H-R-D-I-K-S-D-N-I-L-L (4).
Eine Anzahl zusätzlicher Ratten-cDNA-Klone ist isoliert und sequenziert worden (9). Die neue Sequenzinformation erstreckt sich in die 5'-Richtung, dem kodierenden Bereich von c100-R, was in 4 dargestellt ist. Das * über dem Nukleotid 686 in 9 zeigt die Verbindung mit der Rattensequenz, wie in 4 gezeigt, beim Nukleotid 40.
Die Northern-Analyse zeigt, dass die Messenger-RNA, die dieser cDNA entspricht, überall im Gehirn hoch exprimiert wird. Die cDNA hybridisiert an eine prominente Bande bei 11 kb und schwächer an Banden bei etwa 3 kb. Es gibt eine NGF-induzierbare hybridisierende Bande in PC 12-Zellen bei 9,5 kb. Es gibt ebenfalls eine 4,4 kb hybridisierende Bande in PC 12-Zellen, die bei längerer Kultur und mit NGF-Behandlung auftritt. Diese schwächeren Hybridisierungsbanden mit niedrigerem Molekulargewicht können eine Kreuzhybridisierung an Messenger-RNAs, die für Moleküle wie Calreticulin repräsentieren können, die eine Homologie auf Nukleinsäureebene zeigen, repräsentieren. Die Northern-Analyse von RNA aus Gehirnen der Alzheimer-Erkrankung zeigen an, dass das βAPP-C100-Bindungsprotein nicht bei einem höheren oder niedrigeren Gehalt als in den Kontrollen exprimiert wird.
Die Southern-Analyse von humaner genomischer DNA und genomischer Ratten-DNA zeigt, dass die AB1R-cDNA an eine kleine Anzahl von Banden hybridisiert, was mit der AB1R, die ein Gen in einer einzigen Kopie darstellt, konsistent ist (6). Eine stark hybridisierende Bande bei 3,0 kb und zwei schwächere hybridisierende Banden, eine bei 8,5 kb und eine Bande mit hohem Molekulargewicht zwischen 25 und 30 kb wurden, in Abhängigkeit der Spezies, beobachtet.
6.2.3. in situ-Hybridisierung
In Rattengehirnsektionen waren die Hybridisierungsgrade größer als der Hintergrund nur im Hypocampus und im Geruchstuberkel (8). Das stimmt mit der Verteilung der Bindungsstellen, wie sie autoradiographisch bestimmt worden sind (7), überein.
7. Beispiel: Klonierung von humanen C100-R
Es wurde eine humane Hypocampus-cDNA-Bibliothek eines Erwachsenen in Lambda ZAP11 (Stratagene) unter Verwendung eines markierten Fragments aus der C100-R-cDNA-Insertion der Ratte durchgemustert. Das markierte Fragment repräsentiert das EcoI-Fragment, von Nukleotid 31–409, in 9. Das Ratten-C100-R-EcoRI-Fragment wurde unter Verwendung einer zufälligen Primingreaktion markiert, und die Bibliothek wurde unter stringenden Bedingungen unter Anwendung von Methoden, die routinemäßig vom Fachmann eingesetzt werden, durchgemustert. Hinsichtlich eines Überblicks der Durchmusterungsstrategien, siehe z. B. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. N.Y. Verschiedene Klone wurden erhalten, im Bereich von 600 bis 1.500 Basenpaaren in der Länge. Die Ergebnisse aus der Teilsequenzierung des 1.500 Basenpaarklons sind in 11 gezeigt. Die Bereiche mit Sequenzhomolo gie zwischen der humanen C100-R-Sequenz und der Ratten-C100-R-Sequenz sind in 12 gezeigt.
8. Hinterlegung von Mikroorganismen
Die folgenden Mikroorganismen sind bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland hinterlegt worden und bekamen die folgenden Hinterlegungs-Nrn.:
Die vorliegende Erfindung ist hinsichtlich ihres Umfangs nicht auf die hinterlegten Mikroorganismen eingeschränkt, weil die hinterlegten Ausführungsformen als Illustrationen von Einzelaspekten der Erfindung gedacht sind, und jeder Mikroorganismus, der funktionell äquivalent ist, liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung soll hinsichtlich ihres Umfangs nicht durch die beispielhaften Ausführungsformen eingeschränkt sein, die lediglich als Erläuterungen von Einzelaspekten der Erfindung gedacht sind und jeder Klon und jede DNA oder jede Aminosäuresequenz, die funktionell äquivalent sind, liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Tatsächlich, verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu denjenigen ..... Fachmann aus der vorangegangenen Beschreibung und den anliegenden Zeichnungen. Diese Modifikationen sollen innerhalb des Umfangs der anliegenden Patentansprüche fallen.
Es ist ebenfalls selbstverständlich, dass alle Basenpaargrößen für die Nukleotide ungefähre Werte sind, die zum Zweck der Beschreibung verwendet worden sind.
Internationale Anmeldung Nr.: PCT
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein C100-R-Protein kodiert und die Nukleinsäure von SEQ ID NR: I umfasst (4).
Isolierte und gereinigte Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an die C100-R-Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1 hybridisieren kann und für ein C100-Peptid oder Polypeptid, das an das β-APP-C100 Peptid bindet, kodiert, worin die stringenten Hybridisierungsbedingungen eine gesteuerte Ionenstärke und/oder eine gesteuerte Temperatur sind.
Isolierte und gereinigte Nukleinsäure, die die Nukleinsäuren HABIR #1 4, #1 #1 T3 oder #4.t3 von 11 umfasst.
Rekombinanter DNA-Vektor, der die Nukleinsäure von Anspruch 1, 2 oder 3 umfasst.
Rekombinanter DNA-Vektor, der eine Nukleinsäure umfasst, die für ein C100-R-Fusionsprotein kodiert, wobei die Nukleinsäure die Nukleinsäure von Anspruch 1, 2 oder 3, verbunden mit einer heterologen Nukleinsäure, umfasst.
Rekombinanter DNA-Vektor von Anspruch 4, worin die C100-R-Nukleinsäure operativ mit einer Regulatorsequenz, die die Genexpression in einer Wirtszelle steuert, verbunden ist.
Rekombinanter DNA-Vektor von Anspruch 5, worin die Nukleinsäure für das C100-R-Fusionsprotein operativ mit einer Regulatorsequenz, die die Genexpression in einer Wirtszelle steuert, verbunden ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, 2, 4, 5 oder 6, worin die C100-R-Sequenz natürlich in Rattenzellen oder von Ratten abstammenden Zellen kodiert wird.
Nukleinsäure nach Anspruch 2, 4, 5 oder 6, worin die C100-R-Sequenz natürlich in menschlichen Zellen oder vom Menschen abstammenden Zellen kodiert wird.
Gentechnisch veränderte Wirtszelle, die den rekombinanten DNA-Vektor von Anspruch 4, 5, 6 oder 7 enthält.
Gentechnisch veränderte Zelllinie, die den rekombinanten DNA-Expressionsvektor von Anspruch 6 enthält und ein C100-R Peptid oder Polypeptid exprimiert, das an das βAPP-C100 Peptid bindet.
Gentechnisch veränderte Zelllinie von Anspruch 11, die das C100-R auf der Oberfläche der Zelle exprimiert.
Gentechnisch veränderte Zelllinie von Anspruch 11 oder 12, die menschliches C100-R exprimiert.
Gentechnisch veränderte Zelllinie, die den rekombinanten DNA-Expressionsvektor von Anspruch 7 enthält und ein C100-R-Fusionsprotein, das an das βAPP-C100 bindet, exprimiert.
Gentechnisch veränderte Zelllinie von Anspruch 14, die das C100-R-Fusionsprotein an der Oberfläche der Zelle exprimiert.
Gentechnisch veränderte Zelllinie von Anspruch 14 oder 15, die ein C100-R-Fusionsprotein exprimiert, worin die Nukleinsäure, die für das C100-R-Protein des Fusionsproteins kodiert, natürlich in menschlichen oder vom Menschen stammenden Zellen kodiert wird.
Verfahren zur Herstellung von rekombinantem C100-R, das die Schritte aufweist: (a) Kultivieren einer Wirtszelle, die mit dem rekombinanten DNA-Expressionsvektor von Anspruch 6 transformiert ist und ein C100-R Fusionsprotein, das an das βAPP-0100-Feptid bindet, exprimiert; und (b) Gewinnen des C100-R Genprodukts aus der Zellkultur.
Verfahren nach Anspruch 17, worin C100-R hergestellt wird, das natürlich in menschlichen oder vom Menschen abstammenden Zellen kodiert wird.
Verfahren zur Herstellung von rekombinantem C100-R, das die Schritte aufweist: (a) Kultivieren einer Wirtszelle, die mit dem rekombinanten DNA-Expressionsvektor von Anspruch 7 transformiert ist und ein C100-R-Fusionsprotein, das an das βAPP-C100-Peptid bindet, exprimiert und (b) Gewinnen des C100-R Genprodukts aus der Zellkultur.
Verfahren nach Anspruch 17, worin ein C100-R-Fusionsprotein produziert wird und die Nukleinsäure, die für das C100-R-Protein des Fusionsproteins kodiert, natürlich in menschlichen oder vom Menschen stammenden Zellen kodiert wird.
Isoliertes und gereinigtes C100-R, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 (4) umfasst.
Isoliertes und gereinigtes, in Säugetieren natürlich vorkommendes C100-R-Protein, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an die Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1 hybridisiert und an das βAPP-C100-Peptid bindet.
Isoliertes und gereinigtes C100-R-Peptid oder Polypeptid von einem Säuger, das von einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an die Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1 hybridisiert und an das βAPP-C100-Peptid bindet, kodiert wird.
Fusionsprotein, das ein in Säugern natürlich vorkommendes C100-R-Protein umfasst, das von einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an die Nukleinsäure der SEQ ID NR: 1 hybridisiert und an das βAPP-C100-Peptid bindet und mit einem heterologen Polypeptid verbunden ist, kodiert wird.
Fusionsprotein, das ein C100-R Peptid oder Polypeptid vom Säuger umfasst, das von einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an die Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1 hybridisiert und an das βAPP-C100-Peptid bindet und an ein heterologes Polypeptid gebunden ist, kodiert wird.
Isoliertes und gereinigtes Protein, das eine C100-R-Serin/Threonin-Kinase konservierte katalytische Kernsequenz, die die folgenden Aminosäuren umfasst: VIHRDIKSDNILL (Aminosäuren 304–316 von SEQ ID NR: 2) enthält, welches Protein an das βAPP-C100-Peptid bindet.
Isoliertes und gereinigtes C100-R-Peptid oder Polypeptid, das eine C100-R Serin/Threonin-Kinase konservierte katalytische Kernsequenz, die die folgenden Aminosäuren: VIHRDIKSDNILL (Aminosäuren 304–316 von SEQ ID NR: 2) umfasst, enthält, welches Protein an das βAPP-C100-Peptid bindet.
Fusionsprotein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, gebunden an ein heterologes Polypeptid, umfasst.
Fusionsprotein, das ein isoliertes C100-R-Polypeptid, das die Aminosäuren: VIHRDIKSDNILL (Aminosäuren 304–316 von SEQ ID NR: 2), gebunden an ein heterologes Polypeptid, umfasst, enthält, welches Fusionsprotein an das βAPP-C100-Peptid bindet.
Oligonukleotid, das für eine Antisense-Sequenz, die komplementär zu einem Teil der C100-R-Nukleinsäure von Anspruch 1, 2 oder 3 ist, kodiert, so dass die Antisense-Sequenz die Translation des C100-R-Gens in einer Zelle inhibiert.
Oligonukleotid von Anspruch 30, das komplementär zu einer Nukleinsäure, die für die terminale Aminoregion von C100-R kodiert, ist.
Monoklonaler Antikörper, der an das C100-R der Ansprüche 21 bis 28 bindet.
Monoklonaler Antikörper von Anspruch 32, der die Bindung von βAPP-C100 an das C100-R kompetitiv inhibiert.
Monoklonaler Antikörper nach den Ansprüchen 32 oder 33, der an das C100-R bindet, das natürlich in einer menschlichen oder vom Menschen stammenden Zelle kodiert wird.
Verfahren zum Überprüfen und Identifizieren von Antagonisten des βAPP-C100-Liganden, das die Schritte aufweist: (a) Inkontaktbringen einer Zelllinie, die ein C100-R-Peptid oder Polypeptid nach den Ansprüchen 21 bis 25 exprimiert, mit einer Testverbindung in Gegenwart des βAPP-C100-Liganden und (b) Bestimmen, ob die Testverbindung die Bindung und cytotoxischen Wirkungen des βAPP-C100-Liganden auf der Zelllinie inhibiert, wobei die Antagonisten als solche Verbindungen identifiziert werden, die sowohl die Bindung als auch die cytotoxischen Wirkungen des βAPP-C100-Liganden auf der Zelllinie inhibiert.
Verfahren zum Überprüfen und Identifizieren von Antagonisten des βAPP-C100-Liganden, das die Schritte aufweist: (a) Inkontaktbringen einer Zelllinie, die ein C100-RPeptid oder Polypeptid nach den Ansprüchen 21 bis 25 exprimiert, mit einer Testverbindung in Gegenwart des βAPP-C100-Liganden; (b) Bestimmen, ob die Testverbindung die Bindung und cytotoxischen Wirkungen des βAPP-C100-Liganden auf der Zelllinie inhibiert, und (c) Bestimmen, ob in Gegenwart des βAPP-C100-Liganden, die Testverbindung die cytotoxischen Wirkungen des βAPP-C100 Liganden auf der Zelllinie nachahmt, wobei die Antagonisten als solche Verbindungen identifiziert werden, die sowohl die Bindung als auch die cytotoxischen Effekte des βAPP-C100-Liganden auf der Zelllinie inhibiert.
Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, worin die Zelllinie eine genetisch veränderte Zelllinie ist.
Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, worin die Zelllinie das C100-R endogen exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, worin die Zelllinie eine Neuroplastom-Zelllinie ist.
Verfahren nach Anspruch 39, worin die Neuroplastom-Zelllinie SK-N-MC ist.