HUT70456A - Cloning and expression of b-app-c100 receptor - Google Patents

Description

A találmány tárgya a β-amiloid prekurzor fehérje Cterminálisa (beleértve az amiloid domént is) receptorának, amelynek jele expresszáló, a továbbiakban C100-R, klónozása, és a ClOO-R-t génsebészeti úton megváltoztatott gazdasejtek előállítása.

Az ilyen, génsebészeti előállított sejtek használhatók β-amiloid prekurzor fehérje (β-ΑΡΡ) hatóanyagainak és kiértékelésére és szűrővizsgálatára, amelyek az

Alzheimer betegség diagnosztizálásában és/vagy kezelésében használhatók.

Az Alzheimer betegség egy neurodegeneratív rendellenesség, amely az idősebb korosztálynál a szellemi leépülés leggyakoribb oka. A betegséget amiloid-tartalmú tárfoltok megjelenése jellemzi az agyban, különösen a temporális kortexben és a hippokampuszban, és az agyi vaszkulatúra fala mentén [ Roche és munkatársai., Natúré, 209, 109-110, Terry és munkatársai., Ann. Neurol., 10, 184-192 (1981); Glenner, G.G. Arch. Pathol . Láb. Med., 107, 184-192 (1983); Katzman, R., Banbury Report 15, Cold

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, N.Y. (1983)] .

Az agyban levő tarfoltokban talált amiloid peptid (BA4) az amiloid (vagy béta-amiloid) néven ismert prekurzor fehérjéből (βΑΡΡ) származik. A βΑΡΡ normális körülmények között az amilod doménben hasad, amely a C-terminális közelében található, és így nem keletkezik érintetlen amiloid. Egy másik processzálási út eredménye a βΑΡΡ hasadása az amilod dómén N-terminálisánál, ezzel felszabadítva a teljes C-terminálist, amiből az amiloid fehérje prekurzor intakt amiloid peptidje (βΑΡΡ) keletkezhet [Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 120, 885-890 f » - 3 - ··* ·*· ’··* · ’··* (1984); Masters és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 4245-4249 (1985)] .

A legfrissebb eredmények arra utalnak, hogy a β-ΑΡΡ rendellenes processzálása aláhúzza az Alzheimer betegségben előforduló neuronális degenerációt. Neve és munkatársai azt javasolják, hogy az Alzheimer betegségben a primer βΑΡΡ processzálási esemény a β/Α4 szekvencia hasadása, ezáltal egy 100 aminosavból álló C-terminális βΑΡΡ fragment keletkezése (βΑΡΡ-100), amelyet a βΑΡΡ104 C-terminális aminosavját kódoló cDNS szekvenciáról expresszáltak [ Yankner és munkatársai., Science, 245, 417-420 (1989)] . A továbbiakban ezt a βΑΡΡ fragmentet βΑΡΡ-100 néven említjük, függetlenül attól, hogy a βΑΡΡ 100 vagy 104 aminosav csoportját kódoló cDNS-ről expresszálódik vagy sem. A BAPP-C100 peptid magasabbrendű emlősök sejtjeiben való expressziójáról kimutatták, hogy egy olyan fehérje felhalmozásához vezet, amely aggregálódik és depozit-szerű struktúrákban akkumulálódik, aminek az az eredménye, hogy amiloid-szerű szálak jönnek létre [ Wolf és munkatársai., EMBO J., 9, 2079-2084 (1990)] . Egy retrovirális rekombinánsról, amely a βΑΡΡ-ClOO expresszióját vezérli, szintén kimutatták, hogy neurotoxikus, ha olyan PC-12 sejtekbe transzfektáljuk, amelyeket/ NGF (idegnövekedési faktor) hozzáadásával differenciálódásra indukáltunk. Emellett, az ezekből a transzfektált sejtekből származó kondicionált tápközeg toxikus a differenciálódott neuroblasztóma és neurális sejtekre, és a neurotoxicitás eltávolítható a közegből, ha a 5APP-C100 elleni antitesttel immunabszorpciót hajtunk végre, • · ♦ · ami arra utal, hogy a βΑΡΡ-ClOO-át a transzfektált sejtek szekretálják, és neurotoxikus [Yankner és munkatársai., Science, 245, 417-420 (1989)] . A βΑΡΡ-ClOO toxicitását tovább lehet demonstrálni a peptidet expresszáló sejteknek újszülött egerek agyába való transzplantációjával, és így olyan egerek készíthetők, amelyek a humán βΑΡΡ-ClOO-ra transzgenikusak [ Neve és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 8 9, 3448-3452 (1992)] . Az előbbieket összegezve a bizonyítékok arra utalnak, hogy a βΑΡΡ-ClOO szerepet játszik az Alzheimer betegségben a neurodegeneráció kifejlődésében.

A βΑΡΡ-ClOO pepiiddel szemben megnyilvánuló intenzív érdeklődés, valamint az Alzheimer betegség kifejlődésében játszott szerepe ellenére nagyon keveset tudunk a fehérjékről, receptorokról, vagy más

C100 kölcsönhatásba lép, szöveti elemekről, amelyekkel a βΑΡΡ és ennek eredménye a neurotoxicitás.

Újabban a βΑΡΡ-ClOO-nak a differenciálódott

PC-12 sejtekhez való nagy kötődését mutatták kapcsolatba a neurotoxicitással [ Kozlowski és munkatársai. , J.

of Neuroscience, 12, 1679-1687 (1992)] . Mind a kötődési kölcsönhatásnak, mind a neurotoxikus válasznak ugyanaz a pHfüggése. Emellett a PC-12 sejtekben mind a kötődés, mind a neurotoxicitásra való érzékenység indukált differenciálódás során hasonló időpontban fejlődik ki.

Emellett a βΑΡΡ-ClOO pepiidben egyetlen aminosav megváltoztatása (TyrgQ7

Phe-re), amely eliminálja,' a neurotoxikus hatását, a kapcsolódási képesség elvesztését is eredményezi. Azonban a kötődésért felelős molekulákat eddig még nem azonosították vagy jellemezték. Egy, a βΑΡΡ-ClOO kötőhelyet vagy receptort kódoló cDNS klón izolálása megkönnyítené a vizsgálatokat, amelyek arra irányulnak, hogy meghatározzuk a C100-R biológiai funkcióját és szerepét az Alzheimer betegség kifejlődésében. Ez azonban még nem sikerült.

A jelen találmány tárgyát C100-R gének és fehérjék képezik. A neurotoxikus hatások, amelyek a βΑΡΡ-ClOO és a C100R közötti kölcsönhatásból származnak, arra utalnak, hogy azok a terápiás alkalmazások, amelyeket arra terveztek, hogy blokkolják ezeket a receptor/ligand kölcsönhatásokat, hasznosak lehetnek az Alzheimer betegség kezelésében. Az ismertetett DNS szekvenciákat úgy változtathatjuk meg, hogy egy olyan expressziós rendszerek jöjjenek létre, amelyeket arra terveztünk, hogy

ClOO-R-t termeljenek, és/vagy olyan sejtvonalak jöjjenek létre, amelyek a ClOO-R-t expresszálják.

Az ilyen sejtvonalakat előnyösen lehet alkalmazni a β-ΑΡΡ analógok szűrővizsgálatában és azonosításában, beleértve az agonistákat és antagonistákat is. A találmány egyéb szempontjai alapján a C100-R DNS, az antiszensz oligonukleotid szekvenciák, vagy az antagonisták, beleértve a C100-R elleni antitesteket is, használhatók az Alzheimer betegség diagnosztizálásában és kezelésében. A C100-R trahszgént tartalmazó transzgénikus állatok állatmodellként használhatók a βΑΡΡ-ClOO analógok in vívó kiértékelésében.

A találmány alapját Részben a βΑΡΡ-ClOO kötőhely felfedezése, azonosítása és klónozása képezi, ami a neuron eredetű sejtek felszínén expresszálódik. A kötőhely, amelyet a • · továbbiakban C100-R néven említünk, 'olyan jellemzőkkel rendelkezik, amelyek azt mutatják, hogy a hAPP-C100 peptid neurotoxikus hatásainak közvetítésében játszik szerepet.

A találmány alapját képezi továbbá egy olyan cDNS klón izolálása és jellemzése, amely a

ClOO-R-t kódolja, és amelynek terápiás értéke lehet az

Alzheimer betegség diagnosztizálásában, és a kezelésben használható gyógyszerek tervezésében.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábrán egy reprezentatív görbe látható, amely a ³³s βΑΡΡ-ClOO-nek (A) NGF-fel kezelt (5d) PC12 sejtekhez és (B) SKN-MC sejtekhez kötődésének PAPP-ClOO-vel való gátlását mutatja.

A 2. ábrán a ³⁵S-fiAPP-C100-nek NGF-fel kezelt (6d) PC12 sejtekhez való kötődésének egy jellemző telítési izotermája (felső panel) és egy Scatchard ábrázolása (alsó panel) látható. A görbéket számítógéppel készítettük, és az adatok legjobb értelmezését mutatják.

A 3. ábrán a Xgtll patkány cDNS könyvtárak szűrővizsgálata látható, a közvetlen kötődési módszer alkalmazásával.

A 4. ábrán a patkány C100-R klón, az AB1R cDNS inszertjének nukleotid szekvenciája látható. Az aláhúzott régió a SER/THR kináz szignatúrá.f vagy a konzervált katalitikus magszekvenciát képviseli.

Az 5. ábrán a C100-R és (A) a B típusú kalciumcsatorna, (B) calreticulin ép (C) Ryanodin kalcium-csatorna közötti szekvencia homológia látható.

♦ ·

A 6. ábrán az AB1R cDNS Southern-blot ' elemzése látható. Az

A csíkban EcoRI restrikciós enzimmel emésztett humán DNS látható. A C csíkban Hindin restrikciós enzimmel emésztett egér DNS látható. A D csíkban Hindin restrikciós enzimmel emésztett humán DNS látható. A λ/HindIII markereket a molekulasúlyok megállapítása céljából futtatjuk.

A 7. ábrán a patkányagy különböző szekcióihoz (A) elülső és (B) középső vagy hátsó szintjeihez való specifikus kötődés jellemző autoradiogrammjai láthatók.

A képeket digitalizáltuk és felerősítettük, úgy, hogy nagyobb kötődést mutató területek fényesebbek.

Meg kell jegyeznünk, hogy az olfaktorikus gumó (a szekciók hippokampusz alsó rész megkülönböztethetők a szürkeállomány egyéb részeinek viszonylag egyenletes jelzésével szemben.

A 8. ábrán a pABÍR antiszensz próbával végzett in situ hibridizáció reprezentatív autoradiogrammjai láthatók. A szekciók elhelyezkedése és a reprodukció módszere ugyanaz, mint a 7. ábránál. Meg kell jegyeznünk, hogy az erős jelzéssel rendelkező területek (a legfényesebb területek) az olfaktorikus gumóban és a hippokampuszban ugyanazok, mint amelyeket a kötési autoradiográfiával kaptunk (7'. ábra) .

A 9. ábrán a patkány C100-R klón (AB2R) nukleotid szekvenciája látható. A 31-es nukleotidtól a 409-es nukleotidig terjedő EcoRI fragmentet használjuk a humán hippokampuszból származó cDNS könyvtár átvizsgálására.

A 10. ábrán a patkány C100-R klón nukleotid szekvenciája látható. Az ismertetett szekvencia számos átlapoló patkány cDNS klón klónozásával és szekvenálásával kapott eredmény. A 686-os nukleotid felett látható * a

R nukleotid szekvenciával

4. ábrán ismertetett patkány C100 való kapcsolódás pontja (40-es nukleotid).

A 11. ábrán a humán

C100-R klón cDNS inszertjének nukleotid szekvenciája látható. Az

M-mel jelzett nukleotid lehet A is és C is, a K-val jelzetű nukleotid lehet T is és G is.

A 12A.

ábrán a humán C100-R és a patkány C100-R közötti szekvencia homológia látható. A humán #4.3t szekvencia illeszkedik ábrán ismertetett patkány

C100-R szekvenciához, a 182-es nukleotidnál indulva.

A 12C.

ábrán a humán

C100-R és a patkány

ClOO-r szekvenciák közötti homológia látható. A humán #1#1T3 kiónt a

4. ábrán ismertetett patkány

C100-R szekvenciához illesztjük, az 1868-as nukleotid szekvenciánál kezdődően.

A jelen találmány tárgya a C100-R klónozása és expresszálása. A ClOO-R-t eredetileg kötőhelyként jellemezték, amely a neuronális eredetű sejtek felszínén található, és amely specifikusan kötődik a βΑΡΡ-/5100 eredetű amiloid pepiidhez. A βΑΡΡ-ClOO amiloid peptid expressziójáról állati modellekben sikerült kimutatni, hogy korrelációban van az olyan típusú specifikus neuronális degenerációval, amely az Alzheimer betegségben előfordul. A találmány szerinti előállított C100-Rt használhatjuk a β-ΑΡΡ olyan gyógyszereinek és analógjainak • ·· ········ • · · · · « « ·« * « kiértékelésére, amelyeket az Al'zheimer betegség diagnosztizálásában és/vagy kezelésében használhatunk.

A kiindulási patkány C100-R cDNS kiónt, jele XABIR, a λ gtll patkányagy expressziós könyvtárnak a βΑΡΡ-ClOO 35g_ metioninnal vagy egy peptid epitop flag szekvenciával, mint liganddal vizsgáljuk át, a 6. szekcióban ismertetett módon. A kiindulási kiónról, jele pABIR-patkány, kiderült, hogy egy 1970 bp méretű inszertet tartalmaz, amelyben megtalálható a 4. ábrán ismertetett nukleotid kódoló szekvencia és az abból következő aminosav szekvencia. Egy megfelelő cDNS kiónt az ATCC-nél helyeztünk letétbe, a letéti számot a 7. szekcióban közöljük. A szekvencia elemzésből kiderül, hogy a klón tartalmazza a gén Cterminális szekcióját, és 1395 bázispár kódoló szekvenciát, valamint 575 bázispár 3' nem-transzlálódó szekvenciát tartalmaz (4. ábra).

A patkányagyból készített RNS és az ABIR cDNS inszert legszélső 5' végére specifikus indító molekula felhasználásával egy első szál szintézist végzünk egy reverz transzkriptáz reakcióban. A második szál szintézisét követően a cDNS-t a Bluescript baktérium plazmidba (Stratagene) építjük be. További patkány C100-R cDNS kiónokat izolálunk és szekvenálunk (9. és /

10. ábra). Az új szekvenciák átfednek a 4. ábrán bemutatott patkány szekvenciákkal, és a kódoló régiót a C100-R fehérje Nterminális vége felé meghosszabbítják (10.ábra) . A 9. ábrán ismertetett szekvencia a 106-ros nukleotid előtt eltér a 10. ábrán bemutatott patkány szekvenciától, jelezve, hogy a C100-R klónnál eltérő érési eljáráson áteső mRNS-ek létezhetnek.

- 10 A Genebank nukleotid szekvencia homológok után végzett keresés számos típusú kalcium csatornákkal, csatornával, és a nagy « ···· ··· • · • · 4 adatbázisban a C100-R illeszkedést fed fel a a Ryanidine kalcium affinitású kalcium-kötő fehérjével, a calreticulinnal (5. ábra). A C100-R és a kalcium csatornák között felfedett homológia megegyezik azzal, hogy a kötésnek szokatlan pH-dependenciája van, és azzal a megfigyeléssel, hogy a neuronokbán, főleg a kortexben és a hippokampuszban a kalcium szintek elrontása neurotoxicitást eredményez. A C100-R cDNS szekvenciája is tartalmaz homológiákat a SER/THR kináz szignatúrával vagy a Hanks és munkatársai által leírt katalitikus és munkatársai., Science,

241, 42-52

Amint azt a Northern biottokon mRNS kimutatásával ki lehet mutatni, a 4.ábrán ismertetett nukleotid szekvencia csak részlegesen reprezentálja a C100-R gént. Teljes hosszúságú patkány C100-R cDNS szekvenciát számos különböző módszer alkalmazásával kaphatunk.

Például, a patkány klón legszélső 5' szekvenciájára specifikus próbák használhatók a patkány cDNS könyvtárak újra átvizsgálására. Minden egyes sikeres új átvizsgálással új 5' próbák tervezhetők, ameddig a teljes szekvenciát megkapjuk/

PCR technológia is használható a teljes hosszúságú patkány izolált

C100-R gén izolálására. Egy megfelelő patkény forrásból

RNS, és egy, a patkpny legszélső 5' szekvenciájára specifikus indító molekula alkalmazásával az első szál szintézisét egy reverz transzkriptáz reakcióban hajthatjuk

-11végre. Az RNS/DNS hibridet azután guanino'kkal f arkazhat juk , terminális transzferázt használva, majd RNáz

H-vel emészthetjük, és ezután egy második szál szintézist végezhetünk, amelyhez egy poli-C indító molekulát használunk. A megfelelő restrikciós hasítási helyeket tartalmazó indító molekulák alkalmazásával ezeket a klón-specifikus cDNS-eket könnyen beépíthetjük egy megfelelő plazmid vektorba és szekvenciajukat meghatározhatjuk.

A találmány tárgyai továbbá más faj okból, beleértve az embert is, amelyekben létezik a C100-R aktivitás, izolált C100R gének. A

C100-R család tagjain az alábbiakban úgy határozzuk meg, mint azokat receptorokat,amelyek kötik a βΑΡΡ-ClOO a receptorok nukleotid szinten körülbelül mutathatnak, aminosav szinten még 90%-os homológi CL V 3 1 Is rendelkezhetnek a DNS szekvencia jelentős hosszában. Egy bakteriofág könyvtárat enyhített körülmények között átvizsgálhatunk, a patkány C100-R klón radioaktív izotóppal jelzett fragmentjét használva. Egy másik módszer szerint a patkány C100-R szekvenciát használhatjuk arra, hogy degenerált, vagy teljesen degenerált oligonukleotid próbákat tervezzünk, amelyek PCR próbákként használhatók, illetve /bakteriofág cDNS könyvtárak átvizsgálására használhatók. Egy polimeráz láncreakció (PCR) alapú stratégia használható a humán C100-R klónozására. Két degenerált oligonukleotid pool,' tervezhető, amelyek megfelelnek a patkány C100-R és a kalcium csatornák megőrzött motívumainak, hogy egy PCR reakcióban indító molekulaként szerepeljenek. A

- 12 • · · · ···«···« ·« · # · » 4 · • · ♦ · · « • · · · · V · • · · · ·4 ·-* 9 · * reakcióban használt templát sejtvonalakból vagy olyan szövetekből, amelyekről ismert, hogy humán APP-R-t expresszálnak, kapott mRNS. A PCR terméket szubklónozni és szekvenálni lehet, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy az amplifikált szekvenciák a C100-R szekvenciákat reprezentálják. A PCR fragment használható arra, hogy teljes hosszúságú C100-R cDNS kiónt izoláljunk, radioaktív izotóppal jelezve az amplifikált fragmentet, és egy bakteriofág cDNS könyvtárat átvizsgálva. Egy másik módszer szerint a jelzett fragment használható egy genomiális könyvtár átvizsgálására. A használható klónozási stratégiák összefoglalását szakkönyvekben találhatjuk [ Sambrook és munkatársai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edr.. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989); Ausubel és munkatársai., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (1989)] .

Egy cDNS könyvtár elkészíthető egy emlős expressziós vektorban is, például a pcDNAl-ben, amely SV40 replikációs origó szekvenciákat tartalmaz, amely lehetővé teszi, hogy ha a plazmidot COS sejtekbe visszük át, akkor nagy kópiaszámban expresszáljon. A ClOO-R-nek a transzfektált COS sejtek felszínén való expresszi.éj át számos különböző módon kimutathatjuk, beleértve egy jelzett ligandum, például a BAPPC100 vagy egy BAPP-C100 agonista fluoreszcencia markerrel vagyjenzimmel radioaktív izotóppal, jelzett variánsának az alkalmazását.

A humán ClOO-R-et expresszáló sej teket dúsíthatjuk, oly módon, transzfektált sejteket FACS

- 13 (fluoreszcenciával aktivált sejtszortírozó) elválasztásnak vetjük alá.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, amelyet az alábbiakban ismertetünk, egy felnőtt hippokampusz cDNS könyvtárat vizsgálunk át egy patkány C100-R kiónból származó jelzett nukleotid fragmenttel. A nagy EcoRI fragmentet, amely az AB2R patkány klón (9. ábra) 31-es nukleotidjától a 409-es nukleotidjáig terjed, használjuk a humán cDNS könyvtár átvizsgálására. Számos kiónt kaptunk, és a cDNS inszertek szekvenciáját meghatároztuk. A humán C100-R szekvenciáját a 11. ábrán mutatjuk be, és a patkány valamint a humán C100-R szekvenciák közötti hcmológia régiókat a 12. ábrán mutatjuk be.

Bármely, az előzőkben a teljes hosszúságú patkány C100-R kiónok izolálására ismertetett módszer egyformán használható a teljes hosszúságú humán C100-R kiónok izolálására. Például, a humán klón legszélső 5' szekvenciáira specifikus próbák használhatók a humán cDNS könyvtár átvizsgálására. Minden egyes sikeres szekvenálási kísérlet után új 5' próbák tervezhetők, és használhatók arra, hogy újra átvizsgáljuk a könyvtárakat, egészen addig, ameddig a teljes szekvenciát megkapjuk.

A találmány szerint a^z ClOO-R-t, f ragment j eit, fúziós fehérjéit vagy azok funkcionális ekvivalenseit kódoló nukleotid szekvenciák használhatók olyan rekombináns DNS molekulák készítésére, amelyek a ClOO-β, fragmentjei, fúziós fehérjéi vagy azok funkcionális ekvivalensei expresszióját vezérlik, megfelelő gazdasejtekben. Egy másik módszer szerint a C100-R ··♦ ··« ·4 * ·· szekvenciák használhatók nukleinsav hibridizációs kísérletekben, Southern- és Northern biottokban, stb.

A genetikai kód degenerációja következtében, más DNS szekvenciák is, amelyek lényegében a C100-R aminosav szekvenciáját kódolják, mint például a 4. ábrán bemutatott patkány szekvencia, illetve annak egy funkcionális ekvivalense, használható a jelen találmány gyakorlatában a C100-R klónozására és expresszálására. Az ilyen DNS szekvenciák közé tartoznak azok, amelyek képesek a patkány vagy humán C100-R szekvenciával hibridizálódni szigorú körülmények között, illetve amelyek képesek lennének szigorú körülmények között hibridizálódni, csak a genetikai kód degeneráltsága akadályozza meg ebben. A körülmények szigorúságának mértékét számos különböző módon lehet szabályozni. Például, ha polimeráz láncreakciót (PCR) hajtunk végre, akkor változtathatjuk azt a hőmérsékletet, amelyen az indító molekuláknak a templáthoz való illeszkedése lejátszódik, illetve változtathatjuk a MgC12 koncentrációját a reakciópufferben. Ha radioaktív izotóppal jelzett DNS fragmenteket vagy oligonukleotidokat használunk a szűrők átvizsgálására, akkor a körülmények szigorúságát a mosó oldat ionerősségének változtatásával, illetve a szűrőmosás hőmérsékletének óvatos szabályozásával változtathatjuk.

A találmány szerinti használható megváltoztatott DNS szekvenciák tartalmazhatnak deléciókat, különböző nukleotid csoportok addícióját vagy szubsztitúcióját, ezzel egy olyan DNS szekvenciát eredményezve, amelyik ugyanazt, vagy funkcionálisan ekvivalens terméket kódol. A géntermék önmagában tartalmazhatja

- 15 • ··· ·· aminosav csoportok delécióját, addícióját á C100-R szekvencián belül, aminek az eredménye lehet egy csendes változás, és egy funkcionálisan ekvivalens C100-R keletkezése. Az ilyen aminosav változtatásokat végezhetjük a polaritásban, töltésben, oldhatóságban, hidrofobicitásban, és/vagy a bevont csoportok amfipatikus természetében való hasonlóság alapján. Például a negatívan töltött aminosavak közé tartozik az aszparaginsav és a glutaminsav; a pozitívan töltött aminosavak közé tartozik a lizin és az arginin; a töltés nélküli oldallánccal és hasonló hidrofilitási értékkel rendelkező aminosavak közé tartoznak az alábbiak: leucin, izoleucin, valin; glicin, alanin; aszparagin, glutamin; szerin, treonin; fenilalanin, tirozin. A továbbiakban a funkcionálisan ekvivalens C100-R kifejezés olyan receptorra utal, amely köti a βΑΡΡ-ClOO-t vagy fragmentjeit, de nem szükségszerűen ugyanazzal a kötő affinitással mint a természetes C100-R.

A találmány szerinti DNS szekvenciákat megváltoztathatjuk, azzal a céllal, hogy megváltoztassuk a C100-R kódoló szekvenciáját. Ennek számos következménye lehet, például, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, olyan változtatások, amelyek módosítják a géntermék processzálását és expresszióját.

i

Például mutációkat vihetünk b'e, olyan technikák alkalmazasaval, amely a szakterületen jártas szakember számára jól ismertek, például helyspecifikus mutagenezissel, azzal a céllal hogy új hasítási helyeket vigyünk \ be, hogy megváltoztassuk a glikozilezési mintázatot, a foszforilezést, stb. Például bizonyos expressziós rendszerekben, mint például az • · ··

- 16 • ·< ·· ·· ♦· •

• · «« ··· ··9 élesztőkben, a gazdasejtek túlglikozilezhetik a génterméket. Ha ilyen expressziós rendszert használunk, akkor előnyös lehet, ha a C100-R kódoló szekvenciáját megváltoztatjuk, hogy az összes

N-kapcsolt glikozilezést elimináljuk. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a C100-R vagy egy módosított szekvencia egy heterológ szekvenciához ligálható, hogy így egy fúziós fehérjét kapjunk. A fúziós fehérjét úgy változtathatjuk meg, hogy a C100-R szekvencia és a heterológ fehérjeszekvencia között egy hasítási helyet tartalmazzon, oly módon, hogy a

C100-R lehasítható legyen a heterológ részről.

találmány egy másik megvalósítási módja szerint a C100-R kódoló teljes egészében vagy részeiben megszintetizálható, a szakterületen jártas szakember számára jól ismert módszerek alkalmazásával [Caruthers és munkatársai.,

Nucleic Acids Research

Symp. Ser., Ί_, 215-233

Horn, Nucleic Acids

Matteucci and

Caruthers, Tetrahedron

Chow and Kempe, módszer szerint a fehérjét magát lehet kémiai módszerekkel előállítani, a C100-R teljes aminosav szekvenciáját, vagy annak egy részét megszintetizálva. Például a peptideket szilárd fázisú technikákkal lehet megszintetizálni, a gyantáról le lehet hasítani, és nagynyomású preparatív folyadékkromatográfiával lehet megtisztítani

Protein Structures and Molecujlar

Principles, W.H.

Freeman and összetételét aminosav elemzéssel vagy szekvenálással lehet meghatározni

- 17 ·· *··· ···· • · · · * · « · [ Edman degradációs eljárás; Creighton, Protein Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., 34-49 (1983)] .

5.2. A C100-R expressziója

Ahhoz, hogy biológiailag aktív ClOO-R-t expresszáljunk, a ClOO-R-t kódoló nukleotid szekvenciát, vagy annak egy, az 5.1. szekcióban ismertetett funkcionális ekvivalensét egy megfelelő expressziós vektorba illesztjük be, azaz egy olyan vektorba, amely tartalmazza a beépített szekvencia transzkripciójához és transzlációjához szükséges elemeket. A C100-R géntermékeket valamint a rekombináns C100-R expressziós vektorokkal transzfektált vagy transzformált gazdasejteket vagy sejtvonalakat számos különböző célra lehet használni. Ezek közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a receptorhoz kötődő antitestek (monoklonális vagy poliklonális) készítése, beleértve azokat is, amelyek kompetitíven gátolják a kötődést és semlegesítik a β-ΑΡΡ vagy a β-ΑΡΡ fragmentek βΑΡΡ aktivitását, valamint azoknak a β-ΑΡΡ analógoknak vagy gyógyszereknek az átvizsgálása és szelekciója, amelyek a C100R-en keresztül hatnak; stb.

/

5.2.1. Expressziós rendszerek

A szakterületen jártas szakember számára jól ismert módszerek használhatók olyan gxpressziós vektorok készítésére, amelyek a C100-R kódoló szekvenciát és a megfelelő transzkripciós és transzlációs kontroll szignálokat is

- 18 • · · · ········ • · · · · · · · « β * · · · tartalmazzák. Ezek közé a módszerek közé tartoznak az in vivő rekombináns DNS technikák, a szintetikus technikák, valamint az in vivő rekombináció/ genetikai rekombináció [ Sambrook és munkatársai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989); Ausubel és munkatársai., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (1989)] .

Számos különböző gazda-vektor rendszer használható a C100R kódoló szekvencia expresszálására. Ezek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a mikroorganizmusok, azaz például a C100-R kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns bakteriofág DNS, plazmid DNS, kozmid DNS expressziós vektorokkal transzformált baktériumok; a C100-R kódoló szekvenciát tartalmazó élesztő rekombináns expressziós vektorokkal transzformált élesztők, C100-R kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns vírus expressziós vektorokat (például bakulovírus) hordozó rovarsejt rendszerek; a C100-R kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns vírus expressziós vektorral fertőzött növényi sejtrendszerek (például karfiol mozaikvírus, CaMV; dohány mozaikvírus, TMV), vagy a C100-R kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns plazmid expressziós vektorokkal (például Ti p/íazmiddal) trans z formált növényi sejtrendszerek; illetve olyan állati sejtrendszerek, amelyeket rekombináns vírus expressziós vektorokkal (például adenovírussal, vakcínia vírussal) fertőztünk, beleértve azokat a sejtvonalakat is, amelyeket úgy változtattunk meg, hogy a C100-R DNS több kópiáját tartalmazzák, akár stabilan amplifikált (például CHO/dhfr) vagy instabilan amplifikált formában double-minute kromoszómákban (például rágcsáló sej tvonalak) .

Ezeknek erősségükben a rendszereknek az expressziós elemei eltérnek és specifitásukban. A használt gazda/vektor rendszertől függően számos megfelelő transzkripciós és transzlációs elem, beleértve a konstitutív és indukálható promotereket is, használható az expressziós vektorban. Például, ha baktérium rendszerekben klónozunk, akkor indukálható promoterek, mint például a / bakteriofág pL promotere, a piac, ptrp, ptac (ptrp-lac hibrid promoter) és hasonló promoterek használhatók; ha rovarsejt rendszerekben klónozunk, akkor például a bakulovirus polihedrin promotere használható; ha növényi sejtrendszerekben klónozunk, akkor a növényi sejtek genomjából származó (például hősokk promoterek; a RUBISCO kis alegységének promotere; a klorofill a/b kötő fehérje) , vagy a növényi vírusokból származó (például a CaMV 35S RNS promotere;

a TMV burokfehérje promotere) promoterek használhatók; ha emlős sejtvonalakban klónozunk, akkor az emlős sejtek genomjából származó promoterek (például a metallotionein promoter), vagy az emlős vírusokból származó promoterek (például az adenovírus késői promotere, a vakolnia vírus 7,5K promotere) használhatók;

ha olyan sejtvonalakat állítunk elő, amelyek több példányban tartalmazzák a C100-R DNS-t, akkor SV40-, BPV és EBV alapú vektorok használhatók egy [megfelelő szelekciós markerrel együtt.

- 20 A bakteriális rendszerekben számos különböző expressziós vektor használható előnyösen, függően az expresszált C100-R felhasználási céljától. Például, ha nagy mennyiségű C100-R előállítására van szükség antitestek készítéséhez, akkor olyan vektorok használata lehet előnyös, amelyek könnyen tisztítható fúziós fehérjék nagy mennyiségben való előállítását vezérlik. Ilyen vektorok, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az Escherichia coli pUR278 expressziós vektor [ Ruther és munkatársai., EMBO J., 2, 1791 (1983)], amelyben a C100-R kódoló szekvencia a lacZ kódoló szekvenciával van leolvasási fázisba ligáivá, és így hibrid ClOO-R/lacZ fehérje termelődik; a pIN vektorok [ Inouye & Inouye, Nucleic Acids Research, 13, 3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, Journal of Biological Chemistry, 264, 5503-5509 (1989)]; és hasonlók. A pGEX vektorok is használhatók idegen polipeptidek expresszálására, a glutation-S-transzferázzal (GST) képezett fúziós fehérjék formájában. Az ilyen fúziós fehérjék általában oldhatók és könnyen tisztíthatok a lizált sejtekből affinitás kromatográfiával, azaz például glutation-agaróz gyöngyökre való adszorpcióval, utána pedig szabad glutation jelenlétében való elúcióval. A pGEX vektorokat arra tervezték, hogy trombin vagy Xa faktor proteáz hasítási helyeket tartalmazzanak, és így a számunkra érdekes, klónozott polipeptid lehasítható a GST egységről. [ Booth és munkatársai., Immunoi. Lett., 19, 65-70 (1988); Gardella és munkatársai., Journal of Biological Chemistry, 265, 15854-15859 (1990); Pritchett és munkatársai.,

Biotechniques, 7, 580 (1989)] .

- 21 Az élesztőben számos, konstitutív· vagy indukálható promotert tartalmazó vektor használható. A szakirodalomban számos összefoglaló mű jelent meg [ Ausubel és munkatársai., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (1989); Grant és munkatársai., Expression and Secretion Vectors fór Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossmann, Acad. Press, N.Y., 153, 516-544 (1987), Glover, DNA Cloning, II, IRL Press, Washington D.C., Ch. 3 (1986); Bittér, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., 152, 673-684 (1987); Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern és munkatársai., Cold Spring Harbor Press, J és II (1982)] .

Azokban az esetekben, amikor növényi expressziós vektorokat használunk, a C100-R kódoló szekvencia expresszióját számos különböző promoter vezérelheti. Például virális promoterek, úgymint a CaMV 3oS RNS és 19S RNS promoterei [ Brisson és munkatársai., Natúré, 310, 511-514 (1984)] , vagy a

TMV burokfehérje promotere [ Takamatsu és munkatársai., EMBO J., _6, 307-311 (1987)] is használhatók; másik eljárás szerint növényi promoterek azaz például a RUBISCO kis alegységének promotere [ Coruzzi és munkatársai.,

EMBO J., 3, 1671-1680 (1984); Broglie és munkatársai·/ Science, 224, 838-843 (1984)]; vagy hősokk promoterek, azaz például a szójabab hspl7.5-E vagy hspl7.3-B promotere [ Gurley és munkatársai., Mól. Cell. Bioi., _6, 559-565 (1986)] használhatók. Ezeket a konstrukciókat Ti plazmidok, Ri plazmidok, növényi vírus vektorok, közvetlen DNS transzformáció, mikroinjekciózás, elektroporáció, stb.

segítségével juttathatjuk be a növényi sejtekbe. Az ilyen technikákat is összefoglalták a szakirodalomban [ Weissbach &

Weissbach, Methods fór Plánt

Molecular Biology, Academic Press,

NY, Section VIII,

421-463 (1988); Grierson & Corey, Plánt

Molecular Biology,

Blackie, London, Ch. 7-9

Egy alternatív expressziós rendszer, amelyet a C100-R expressziójára lehet használni, a rovar rendszer.

Az egyik ilyen rendszerben az Autographa californica nukleáris polihedrózis vírust expresszálására. A (AcNPV) használjuk vektorként idegen gének vírust Spodoptera frugiperda sejtekben szaporítjuk. A C100-R kódoló szekvenciát a vírus nem esszenciális régióiba klónozhatjuk (például a polihedrin génbe) és egy AcNPV promoter (például a polihedrin promoter) szabályozása alá helyezhetjük. A C100-R kódoló szekvencia sikeres beépítésének az az eredménye, hogy a polihedrin gén inaktiválódik, és nem-okkludált rekombináns vírus keletkezik (azaz, a vírusról hiányzik a polihedrin gén által kódolt fehérjeszerű burok). Ezeket a rekombináns vírusokat használjuk azután a Spodoptera frugiperda sejtek fertőzésére,amelyekben a bevitt gént expresszáljuk [ Smith és munkatársai., J. Virol., 4 6, 584 (1983); Smith, Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, száma/4,215,051] .

Emlős gazdaszervezetekben számos vírusalapú expressziós rendszer használható. Azokban az esetekben, amikor egy adenovírust használunk expressziós vektorként, a C100-R kódoló szekvenciát egy adenovírus transzkripciós/transzlációs kontroll komplexhez ligálhatjuk, azaz például a késői promoter és

- 23 háromrészes leader szekvenciához. Ezt a' kiméra gént lehet azután az adenovírus genomba beilleszteni in vitro vagy in vivő rekombinációval. A vírus genom egy nem-esszenciális régiójába (azaz például az El vagy E3 régióba) való inszerció egy olyan rekombináns vírust eredményez, amely életképes, és képes a C100-R expressziójára fertőzött gazdaszervezetekben [ Logan & Shenk, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81, 4655-3659 (1984)] . Egy másik módszer szerint a vakcínia 7.5K promoterét használhatjuk [ Mackett és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 7 9, 74157419 (1982); Mackett és munkatársai., J. Virol., 4 9, 857-864 (1984); Panicali és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 7 9, 4927-4931 (1982)] .

Specifikus iniciációs szignálokra is szükség lehet a beépített C100-R kódoló szekvenciák hatékony transzlációjához. Ilyen szignál például az ATG iniciációs kodon és a szomszédos szekvenciák. Azokban az esetekben, amikor a teljes C100-R gént, beleértve a saját iniciációs kodonját és a szomszédos szekvenciákat is, beépítjük a megfelelő expressziós vektorba, akkor esetleg nincs szükség további transzlációs kontroll szignálokra. Azokban az esetekben azonban, amikor a C100-R kódoló szekvenciának csak /egy részét építjük be, külső transzlációs kontroll szekvenciákra van szükség, beleértve az ATG iniciációs kodont is. Emellett az iniciációs kodonnak leolvasási fázisban kell lennie a C100-R kódoló szekvenciával, hogy a teljes inszert transzlációját biztosítsuk. Ezek a külső transzlációs kontroll szignálok és iniciációs kodonok különböző

4· *··· ···· • · · • · · ·

- 24 eredetűek lehetnek, beleértve a természetes és szintetikus forrást is. Az expresszió hatékonyságát fokozni lehet, ha megfelelő transzkripciós fokozó elemeket, transzkripciós terminátorokat, stb. is hozzáadunk a rendszerhez [Bittér és munkatársai.,

Methods in

Enzymol., 153,

Emellett egy olyan gazdasejt törzs választható meg, amely modulálj a beépített szekvencia expresszióját, illetve módosttja vagy processzálja a génterméket, a kívánt specifikus módon. A fehérjetermék ilyen módosításai (azaz például glikozilezés) és processzálásai (azaz például hasítás) fontosak lehetnek a fehérje működése szempontjából. A különböző gazdasejteknek jellemző és specifikus mechanizmusai vannak a fehérjék poszt-transzlációs processzálására és módosítására. A megfelelő sejtvonalak vagy gazdarendszerek megválaszthatok, hogy biztosítsuk az expresszált idegen fehérje helyes módosítását és processzálását. Ebből a célból olyan eukarióta gazdasej teket alkalmazunk, amelyek rendelkeznek a primer transzkriptum megfelelő módosításához, illetve a géntermék glikozilezéséhez és foszforilezéséhez szükséges sejtmechanizmusokkal. Ilyen emlős gazdasejt lehet, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a CHO, VERŐ,

BHK, HeLa, COS,

MDCK, 293, WI38 és egyéb sejték.

A rekombináns fehérjék hosszútávú, magas szintű expresszálásához stabil expresszió az előnyös. Például olyan sejtvonalak állíthatók elő, amelyek stabilan expresszálják a

ClOO-R-t. Ahelyett, hogy olyan expressziós vektorokat használnánk, amelyek virális replikációs origót tartalmaznak, a

- 25 gazdasejteket olyan C100-R DNS-sel lehet transzformálni, amely a megfelelő expressziós kontroll elemeket (azaz például promotert, fokozó szekvenciákat, transzkripciós terminátorokat, poliadenilezési helyeket, stb.) és egy szelekciós markert tartalmaznak. Az idegen DNS bejuttatását követően a megváltoztatott sejteket hagyjuk 1-2 napig növekedni dúsított tápközegben, majd egy szelektív táptalajra váltunk át. A rekombináns plazmidban levő szelekciós marker rezisztenciát biztosít a szelekcióhoz, és hagyja, hogy a sejtek stabilan integrálják a plazmidokat a kromoszómájukba, fókuszokat hozzanak létre, amelyeket azután klónozni lehet és sejtvonalakká lehet felszaporítani. Ezt a módszert előnyösen alkalmazhatjuk olyan sejtvonalak előállításához, amelyek a ClOO-R-t a sejt felszínén expresszálják és válaszolnak a βΑΡΡC100 által közvetített szignál transzdukcióra. Az ilyen megváltoztatott sejtvonalak különösen jól használhatók a βΑΡΡC100 analógok szűrővizsgálatában.

Számos különböző szelekciós rendszer használható, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a herpesz szimplex timidin-kináz [ Wigler és munkatársai., Cell, 11, 223 (1977)], a hipoxantin-guanin-foszforiboziltranszferáz [ Szybalska & Szybalski, Procéedings of the National Academy of Sciences, USA, 4 8, 2026 (1962)] és az adeninfoszforiboziltranszferáz [ Lowy és munkatársai., Cell, 22, 817 (1980)] gén használható tk^_> hgprt^- vagy aprt^- sejtekben.

Emellett antimetabolit rezisztencia is használható a dhfr szelekció alapjaként, ami metotrexát rezisztenciát biztosít [ Wigler és munkatársai., Proceedings of the National Academy of

Sciences, USA, 77, 3567

0'Hare és munkatársai.,

Proceedings of the National

Academy of Sciences, (1981)], a gpt gén, ami mikofenolsav elleni rezisztenciát biztosít [ Mulligan & Berg,

Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 7 8, 2072 (1981)] ; a neo gén, ami a G-418 aminoglikozid elleni rezisztenciát biztosítja [ Colberre-Garapin és munkatársai., J. Mól. Bioi., 150, 1 (1981)] ; és a hygro gén, ami higromicin elleni rezisztenciát biztosít [ Santerre és munkatársai., Gene, 30, 147 (1984)] . Újabban további szelekciós géneket is ismertettek, nevezetesen a trpB-t, ami lehetővé teszi, hogy a sejtek triptofán helyett indolt használjanak, a hisD-t, ami lehetővé teszi, hogy a sejtek hisztidin helyett hisztinolt használjanak [ Hartman & Mulligan, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 8047 (1988)] , és az ODCt (ornitin-dekarboxiláz), ami az ornitin-dekarboxiláz inhibitor (2-(difluormetil)-DL-ornitin, DFMO) elleni rezisztenciát biztosít [ McConlogue L., In: Current Communications in

Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)] .

5.2.2. A ClOO-R-t expresszáló transzfektánsok vagy transzfopmánsok azonosítása

A kódoló szekvenciát tartalmazó, és a biológiailag aktív génterméket expresszáló gazdasejtek legalább négy általános megközelítés alapján azonosíthatók: (a) DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizáció; (b) a marker gén funkciók jelenléte vagy hiánya alapján; (c) a transzkripció szintjének megbecslésével, amit a

- 27 C100-R mRNS transzkriptumnak a gazdasejtban való expressziójával lehet mérni; és (d) a géntermék kimutatása, amit immunesszével vagy a biológiai aktivitása alapján lehet elvégezni.

Az első megközelítés szerint az expressziós vektorba illesztett C100-R kódoló szekvencia jelenlétét lehet kimutatni DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizációval, olyan próbákat alkalmazva, amelyek homológok a C100-R kódoló szekvenciával, illetve annak egy részével vagy származékaival.

A második megközelítés szerint a rekombináns expressziós gazda/vektor rendszer azonosítható és szelektálható, bizonyos marker gén funkciók jelenléte vagy távoliéta alapján (azaz például timidin-kináz aktivitás, antibiotikum rezisztencia, metotrexát rezisztencia, transzformációs fenotípus, okklóziós test képződése bakulovírusban, stb.) . Ha például a C100-R kódoló szekvenciát a vektor egy marker gén szekvenciájába építjük be, akkor a C100-R kódoló szekvenciát tartalmazó rekombinánsok azonos!thatól a hiányzó marker gén funkció alapján. Egy másik módszer szerint egy marker gént helyezhetünk el a C100-R szekvencia után, azonos, vagy eltérő promoter vezérlése alatt, mint amelyet a C100-R kódoló szekvencia expressziójának '' szabályozására használunk. Az indukcióra vagy szelekcióra adott válaszként expresszálódó marker jelzi a C100-R kódoló szekvencia expresszióját.

A harmadik megközelítés \ szerint a C100-R kódoló régió transzkripciós aktivitása hibridizációs vizsgálatok alapján becsülhető meg. Például RNS izolálható és elemezhető Northern • · ··*« 4«

4 4 · ·4

4 4 « · ·· • · · · ♦-· · · « · · blottal, olyan próbát alkalmazva, amely homológ a C100-R kódoló szekvenciával, illetve annak egy adott részével. Egy másik módszer szerint a gazdasejt teljes nukleinsav tartalmát extrahálhatjuk és vizsgálhatjuk az ilyen próbával adott hibridizációját.

A negyedik megközelítés szerint a C100-R fehérje expressziója immunológiai módszerekkel becsülhető meg, például Western blottal, egyéb immunológiai módszerekkel, mint például radio-immunprecipitációval, enzimhez kapcsolt immunesszével és hasonlókkal. Az expressziós rendszer sikeres működésének végső vizsgálata azonban magába foglalja a biológiailag aktív C100-R géntermék kimutatását. Számos különböző vizsgálat használható a ezekre korlátoznánk valamint a β-ΑΡΡ kimutatására, beleértve, magunkat, a β-ΑΡΡ kötési biológiai vizsgálatokat, anélkül, hogy vizsgálatokat, génsebészeti módszereket alkalmazva teszt szubsztrátként.

5.2.3.

A C100-R kinyerése

Ha egyszer azonosítottunk egy kiónt, amely nagy mennyiségben termel biológiailag aktív ClOO-R-t, akkor a kiónt elszaporíthatjuk és arra használhatjuk, hogy nagy mennyiségben

termeljük a	receptort, amelyet a szakterületen jól ismert
módszerekkel	megtisztíthatunk, beleértve, anélkül, hogy ezekre
korlátoznánk	magunkat, az immunaffinitási módszereket, a

kromatográfiás módszereket,, beleértve a nagynyomású folyadékkromatográfiás módszereket, immobilizált ligandumot, azaz például βΑΡΡ-ClOO-at vagy analógját gyöngyökhöz kötve

- 29 ·»»♦ · · alkalmazó affinitáskromatográfiát, immunaffinitás tisztítást antitestek felhasználásával és hasonlókat.

Amikor a C100-R kódoló szekvenciát úgy változtatjuk meg, hogy egy lehasítható fúziós fehérjét kódoljon, akkor a tisztítást könnyen végrehaj thatj uk affinitástisztítási technikák alkalmazásával. Például egy kollagenáz hasítás felismerő konszenzus szekvencia építhető a

C100-R és a proteinA C-terminálisa közé. A kapott fúziós fehérje tisztítható egy IgG oszlopon, amely megköti a protein könnyen

A részt.

A fúzionálatlan C100-R könnyen felszabadítható az oszlopról, kollagenázos kezeléssel. Egy másik példa a pGEX vektorok alkalmazása, amelyek az idegen fehérjéket a glutation-Stranszferázzal (GST) képzett fúziós fehérje formájában expresszálják. A fúziós fehérjét úgy alakíthatjuk ki génsebészeti módszerekkel, hogy a klónozott gén és a GST egység között vagy trombin vagy Xa hasítási helyeket tartalmazzon. A fúziós fehérjét könnyen tisztíthatjuk a sejtkivonatokból, glutation-agaróz gyöngyökhöz való adszorpcióval, majd glutation jelenlétében való elúcióval. A találmány ilyen megközelítése szerint bármely hasítási hely vagy enzim hasítási szubsztrát beépíthető a C100-R szekvencia és egy második peptid vagy fehérje közé, amelynek a /tisztításban használható kötési partnere van, azaz például egy olyan antigén, amelyre lehet immunaffinitási oszlopot készíteni.

5.3. A ClOO-R-t meghatározó antitestek készítése

Különböző, a szakterületen jártas szakember számára ismert eljárások használhatók a rekombináns módszerekkel termelt C100R epitopjai elleni antitestek készítésére. A diagnosztizálásban és a terápiában különösen előnyösek a semlegesítő antitestek, azaz azok, amelyek a receptor βΑΡΡ-ClOO kötőhelyéért versengenek. Az ilyen antitestek közé tartoznak ezekre korlátoznánk magunkat, a poliklonális, anélkül, hogy monoklonális, kiméra, egyláncú antitestek, a Fab fragmentek és a Fab expressziós könyvtárral készített fragmentek.

Az antitestek előállításához különböző gazdaállatokat immunizálhatunk a C100-R injekciózásával, beleértve, de anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a nyulakat, egereket, patkányokat, stb. Különböző adjuvánsok használhatók az immunválasz fokozására, a gazdafajtól függően, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a Freund féle (komplett és inkomplett) adjuvánst, az ásványi géleket, azaz például az alumínium-hidroxidot, a felületaktív anyagokat, azaz például a lizolecitint, többszörös poliolokat, polianionokat, peptideket, olajemulziókat, fúrócsiga hemocianint, dinitrofenolt és a potenciálisán hasznos humán adjuvánsokat, mint például a BCG-t (Bacille Calmette-Guerin) és a Corynebacterium parvum-ot, bármely olyan technikát alkalmazva, amellyel tenyészetben folyamatos sejtvonallal antitest molekulákat lehet előállítani. Ezek közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat a Kohler és Milstein által

- 31 eredetileg leírt hibridóma technika [ Kohler and Milstein,

Natúré, 256, 495-497 (1975)] , a humán B-sejt hibridóma technika [Kosbor és munkatársai., Immunology Today, £, 72 (1983); Cote és munkatársai., Proceedings of the National Academy of

Sciences, USA, technika [ Colé

80, 2026-2030 (1983)] és az EBV-hibridóma és munkatársai., Monoclonal Antibodies and

Cancer Therapy,

Alán R.

használhatók még kiméra antitestek termelésére kifejlesztett technikák

Morrison és munkatársai. , Proceedings of the National Academy és munkatársai., Natúré, 314 , 452-454 (1985)] , amelyek abban állnak, hogy egér antitest molekulát kódoló géneket egy megfelelő biológiai aktivitással rendelkező humán antitest molekulát kódoló génekkel illesztünk össze.

A ClOO-R-re specifikus kötőhelyeket tartalmazó antitest fragmenteket ismert módszerekkel állíthatunk elő. Ilyen fragmentek lehetnek például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, amelyeket az valamint összekötő molekula pepszines emésztésével lehet a Fab fragmentek, /'amelyeket diszulfid hidak redukálásával előállítani, fragmenteket lehet előállítani. Egy másik módszer szerint Fab expressziós könyvtárak készíthetők [ Huse és munkatársai., Science·, 246, 1275-1281 (1989)] , amelyek lehetővé teszik a C100-R ellen a keresett specifitással • 9 »r ·«<>« «··· • •••vb · >

······ • · · · 9 « « ··· ··· »· · ·« rendelkező monoklonális Fab fragmentek' gyors és könnyű azonosítását.

5.4. Antiszensz RNS és ribozimek

A találmány oltalmi körébe tartoznak még az olyan oligoribonukleotid szekvenciák, amelyek lehetnek antiszensz RNS és DNS molekulák valamint ribozimek, amelyek úgy működnek, hogy gátolják a C100-R mRNS transzlációját. Az antiszensz RNS és DNS molekulák úgy működnek, hogy közvetlenül blokkolják a mRNS transzlációját, a megcélzott mRNS-hez kötődve, és ezzel megakadályozzák a fehérje transzlációt. Ami az antiszensz DNS-t illeti, a transzlációs iniciácics helyből, azaz a C100-R nukleotid szekvencia -10 és + 10 régiój ából származó oligodezoxiribonukleotidok az

A ribozimek enzimatikus tulajdonságokkal rendelkező RNS molekulák, amelyek képesek az RNS specifikus hasítását katalizálni.

ribozim működésének mechanizmusa magában foglalj a ribozim molekula szekvenciaspecifikus hibridizációját a komplementer cél majd az endonukleolitikus hasítást. A találmány oltalmi körébe tartoznak a génsebészeti ütőn előállított kalapácsfej motívumot tartalmazó ribozim molekulák, amelyek specifikusan és hatékonyan katalizálj ák

C100-R

RNS szekvenciák endonukleolitikus hasítását.

Bármely potenciális RNS icélpontban specifikus ribozim hasítási helyeket először úgy azonosítjuk, hogy végigpásztázzuk a molekulát ribozim hasítási helyeket keresve, amelyek az

alábbi szekvenciákat tartalmazzák: GUA, GUU és GUC. Miután azonosítottuk, akkor a cél génnek megfelelő, a hasítási helyet tartalmazó 15-20 ribonukleotidból álló rövid RNS szekvenciákat értékelünk ki, hogy van-e előre látható szerkezeti tulajdonságuk, azaz például szekunder struktúrájuk, amely az oligonukleotid szekvenciát instabillá teheti. A jelölt célpontok alkalmasságát úgy is értékelhetjük, hogy vizsgáljuk hibridizálhatóságukat a komplementer oligonukleotidokkal, ribonukleáz protekciós vizsgálatot alkalmazva.

A találmány szerinti antiszensz RNS és DNS molekulák valamint ribozimek előállíthatok bármely, a szakirodalomban az RNS molekulák szintézisére ismertetett módszerrel. Ezek közé tartozik a szakterületen jól ismert módszer az oligodezoxiribonukleotidok kémiai eljárással való szintézisére, például szilárd fázisú foszforamidit kémiai szintézissel. Egy másik módszer szerint az RNS molekulákat elő lehet állítani az antiszensz RNS molekulát kódoló DNS szekvenciák in vitro és in vivő transzkripciójával. Az ilyen DNS molekulákat számos különböző, olyan vektorba beépíthetjük, amely megfelelő RNS polimeráz promotert tartalmaz, mint például a T7 vagy SP6 polimeráz promotert. Egy másik módszer szerint olyan antiszensz konstrukciókat, amelyek ^za használt promotertől függően konstitutív vagy indukálható módon szintetizálnak antiszensz RNS-t, stabilan be lehet juttatni a sejtvonalakba.

A DNS molekulákba > különböző módosításokat lehet bejuttatni, a fokozott intracelluláris stabilitás és felezési idő eszközeiként. A lehetséges módosítások, anélkül, hogy • · · · ········ • · · · · · · ·

- 34 ezekre korlátoznánk magunkat, ribo- vagy dezoxinukleotidokból álló határoló szekvenciák hozzáadása a molekula 5' és/vagy 3' végéhez, illetve a foszfodiészteráz kötések helyett foszforotioát vagy 2'-0-metil kötések használata az oligodezoxiribonukleotid láncban.

5.5. A C100-R DNS és a megváltoztatott sejtvonalak használata

Az előzőkben ismertetett C100-R DNS, az antiszensz oligonukleotidok és ribozimek, az APP-R expressziós termékek,

antitestek és megváltoztatott sejtek számos	különböző
alkalmazási móddal rendelkeznek az Alzheimer	betegség

diagnosztizálásában és kezelésében.

A C100-R DNS szekvencia például biopsziák és autopsziák hibridizációs vizsgálataiban használható, hogy diagnosztizáljuk a C100-R expresszió abnormalitásait; például Southern vagy Northern biot elemzéssel, beleértve az in situ hibridizációs vizsgálatokat is. A gyógyászati alkalmazásokban a C100-R DNS szekvencia alapján tervezett antiszensz vagy ribozim molekulák arra használhatók, hogy blokkoljuk a C100-R géntermékek transzkripcióját és expresszióját. Egy másik módszer szerint a C100-R DNS használható a génterápiában, hogy ezzel normális rekombináns gént juttassunk be egy beteg hibás sejtjeibe, vagy korrigáljunk egy endogén mutációt, azzal a céllal, hogy helyreállítsuk a ClOO-R-t és működését.

A tm egy másik megvalósítási módja szerint a ClOO-R-re specifikus antitestek használhatók arra, hogy meghatározzuk a • · ·· ········ • · · · · · • · · · ♦ · · . - 35 receptor expresszió mintázatát biopszia szövetekben, illetve arra, hogy in vivő diagnosztikus leképezést végezzünk vele; az ilyen alkalmazásokban semlegesítő antitestek az előnyösek. Például egy képalkotásra használható vegyülethaz konjugált antitest beadható egy betegnek, hogy így in vivő térképezzük a C100-R helyét és eloszlását.

A találmány másik megvalósítási módja szerint az APP-R-t önmagában, illetve a βΑΡΡ-ClOO kötőhelyet tartalmazó fragmentet in vivő adhatjuk be. A szabad C100-R, vagy a peptid fragment kompetitíve kapcsolódhat a β-ΑΡΡ-hez, és gátolhatja a natív receptorral való in vivő kölcsönhatását.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a génsebészeti úton megváltoztatott sejtvonalak, amelyek a teljes ClOO-R-t vagy annak ligandumkötő doménjét expresszálják használhatók arra, hogy kiszűrjük és azonosítsuk az aktív βΑΡΡC100 agonistákat vagy antagonistákat. Egy másik módszer szerint a ClOO-R-t endogén módon expresszáló sejtvonalak használhatók erre a célra; például neuroblasztóma sejtvonalak, mint például az SK-N-MC, amely a továbbiakban példaként szerepel. A βΑΡΡ eredetű peptidek, más peptidek, szintetikus vegyületek, természetes vegyületek, és a potenciálisan biológilag aktív anyagok egyéb forrásai is átvizsgálhatok az alábbi módokon. A vizsgált vegyületnek mérhető az a képessége, hogy gátolja a βΑΡΡ-ClOO-nek (amely lehet jelezve, például ³³Met, vagy flag szekvenciával, illetve a peptid elleni antitesttel ki lehet mutatni) a ClOO-R-hez való kötődését, és ezáltal azt a potenciálját, hogy vagy agonistaként, vagy antagonistaként

- 36 működjön. A receptor forrásaként vagy- a teljes C100-R expresszáló sejthomogenizátumokat, vagy szubcelluláris frakciókat lehet használni. A kötődést mérhetjük standard receptorkötési technikákkal, például olyanokkal, amelyeket a 6.1.3. szekcióban ismertettünk. Az anyagoknak az a képessége mérhető, hogy megelőzik, utánozzák a βΑΡΡ-ClOO hatásait a szignál transzdukció válaszokra a ClOO-R-t expresszáló sejtekben. Olyan válaszok követhetők például, mint a kalcium citoszól koncentrációjának megváltozása, a specifikus proteinkinázok aktiválódása, a hormonok vagy neurotranszmitterek megváltozott szekréciója, a másodlagos hírvivő molekulák termelődésének megváltozása, illetve a celluláris metabolizmus megváltozásai. Ezeket a vizsgálatokat elvégezhetjük teljes sejteken illetve membrán készítményeken, az ezekre a célokra kifejlesztett szokványos módszerek alkalmazásával. A génsebészeti úton megváltoztatott sejtekben, amelyek választ adnak a βΑΡΡ-ClOO toxikus hatásaira, mérhető az anyagoknak a toxicitást indukáló vagy megelőző képessége. A toxicitást a szakirodalomban ismertetett módon követhetjük [ Yankner és munkatársai., Science, 245, 417-420 (1989)], illetve más, kialakított technikákkal.

A C100-R DNS-t transzgénként tartalmazó transzgenikus állatokat génsebészeti úton úgy változtathatjuk meg, hogy meghatározzuk a βΑΡΡ-ClOO-nek az előzőkben ismertetett vagy egyéb szűrővizsgálatokban talált agonistái vagy antagonistái in vivő hatásait, illetve jellemezzünk más ágenseket, amelyek az • ·

- 37 Alzheimer betegségben potenciálisan gyógyító hatással rendelkeznek.

Újabban a ligandum-receptor kölcsönhatások számítógéppel generált modelljét fejlesztették ki, majd a találmány egy specifikus megvalósítási módja szerint a C100-R számítógépes modelljéből származó információt használhatjuk a receptor agonisták vagy antagonisták tervezésére.

A C100-R szekvenciákban végrehajtott változtatások, például a helyspecifikus mutagenezis technikákkal végzettek, valamint a mutáns receptorok expressziója a sejtvonalakban használható arra, hogy tovább határozzuk meg bizonyos receptor régiók és csoportok funkcionális szerepét.

6. PÉLDÁK

Az alábbi alszekcióban ismertetjük egy, neuronális eredetű sejtek felszínén expresszálódó APP kötőfehérje kezdeti jellemzését, valamint egy komplementer DNS klónozását és szekvenálását, amely a patkány C100-R egy részét képezi. A C100-R levezetett aminosav szekvenciája a B típusú kalciumcsatornák , a Ryanodine kalciumcsatornák, a calreticulin és a fehérje Szerin/Treonin kinázok között számos közös motívumra derít fényt. ^z

6.1. Anyagok és módszerek

6.1.1. A flag-ŰAPP-ClOO in vitro transzlációja

Az alábbi flag szekvenciát tartalmazó oligonukleotidot szintetizáltuk meg, és illesztettük be a pGEM7 plazmidba:

ACC ATG	GAC	TAC AAA	GAC	GAT GAC GAT AAA	TCG AT
Met	Asp	Tyr Lys	Asp	Asp Asp Asp Lys	Ser
[ Immunex;	Prickett	és	munkatársai .,	BioTechniques

(1989)] . Emellett,a Met kodon előtt az ACC kodon konszenzus szekvenciát szolgáltat az eukarióta transzlációs starthoz, valamint a Clal hasítási hely a flag szekvencia után klónozási céllal került be, csakúgy, mint a Hindin linker az oligonukleotid 5' végén. A pGEM7 flag konstrukciót Smal és Clal restrikciós enzimekkel emésztettük, majd feltöltöttük. A βΑΡΡ

695 BglI/Smal fragmentjét klónoztuk ebbe a konstrukcióba. A megfelelő orientációjú kiónokat választottuk ki. Ezt a a rekombinánst használtuk arra, hogy két különböző úton előállítsuk a ^ög-p^pp-Q^QQ peptidet. Először a csatolt transzkripciós/transzlációs rendszerben a TNT csatolt retikulocita lizátum rendszerben (Promega Corp.). Zártláncú cirkuláris plazmid DNS-t adtunk a lizátumhoz a 355__metp_ony_nnap együtt (6 pCi), az alábbi eljárást követve. Másodszor, egy nem csatolt reakcióban, a rekombinánst Spel restrikciós enzimmel lineari záltuk, majd 5 pg DNS-t használtunk az RNS in vitro előállítására («20-30 pg) , a gyártó által megadott leírást követve. Ebből az RNS-ből 1-5 pg-ot vagy búzacsíra vagy nyúl retikulocita lizátum rendszerben transzlációs reakcióba viszünk, a gyártó (Promega Corp.) leírása szerint. Az in vitro transzlációkhoz vagy egytized térfogatú, 100 mmol/1 N-acetilglükózamint (Sigma) adunk, majd alikvot részekre osztjuk szét és -80°-ra lefagyasztjuk, majd felhasználás előtt dializáljuk; vagy alikvot részekre osztjuk szét és közvetlenül • ·

- 39 lefagyasztjuk, utána dializáljuk és forgatott oszlopon tisztítjuk felhasználás előtt (boehringer-Mannheim) ; vagy affinitás-tisztításnak vetjük alá, a kereskedelmi forgalomban levő, Affigel 10-hez (Biorad) kapcsolt Flag Anti-body felhasználásával (Ca⁺⁺ függő Ml Ab kötődés, IBI) . Az affinitáskromatográfiát úgy hajtjuk végre, hogy az in vitro transzlációkat az Affigel 10-hez kapcsolt Ml antitest oszlopon bocsátjuk át (1 ml-es agytérfogat), amelyet PBS-ben hoztunk egyensúlyba (120 mmol/1 NaCl, 2,7 mmol/1 KC1, 10 mmol/1 foszfát puffer pH=7,4) 0,5 mmol/1 CaCÍ2-vel. Alapos mosás után (5-10 oszloptérfogat) a peptidet 2mmol/l Na2EDTA-t tartalmazó PBSsel oldjuk le az oszlopról. A peptid éles, 0,7 ml-es csúcs formájában eluálódik. A kötési vagy autoradiográfiás vizsgálatokhoz az EDTA-t dialízissel eltávolítjuk. A flag-βΑΡΡC100 konstrukciót szekvenáljuk, majd az in vitro transzlációból származó terméknek, a pepiidnek az aminosav összetételét tömegspektroszkópiás módszerekkel vizsgáljuk, az azonosságuk igazolása céljából.

6.1.2. Sejttenyésztés

A kötési vizsgálatokhoz a PC12 sejteket (ATCC) 10% hővel /

inaktivált lószérummal és 5% ^zborjúmagzat szérummal kiegészített RPMI1640 táptalajban szaporítjuk. Τ-175-ös lombikokban levő 60 ml szaporító táptalajt, amely 10 ng/ml NGF-et tartalmaz, 5x10^ sejt/ml koncentrációban oltunk be. Ebből a táptalajból további 60 ml-t adunk a tenyészethez minden második nap, ameddig a sejteket kinyerjük (általában 6 nap elteltével) . Ahol külön • · · ♦ *··*♦··· • · «··· · · • · · · · ·

- 40 jelezzük, ott a PC12 sejteket a fentiek szerint szaporítjuk, azzal az eltéréssel, hogy nincs jelen NGF. A sejteket centrifugálással nyerjük ki (138 x g, 8 perc). A felülúszót elöntjük, majd az üledéket 5 ml szaporító táptalajban szuszpendáljuk. A sejteket háromszor trituráljuk egy 10 ml-es fecskendőhöz illesztett 23G tűn keresztül, hogy egysejtes szuszpenziót kapjunk, vagy legalábbis kis sejtaggregátumokat tartalmazó szuszpenziót. A tripánkék kizárás azt mutatta, hogy a sejteknek több mint 99%-a életképes.

SK-N-MC sejteket (ATCC) szaporítunk 10% borjúmagzat szérummal kiegészített DME-ben. Az SK-N-MC sejteket az előzőkben a PC-12 sejtekre ismertetett módon tenyésztjük, azzal a különbséggel, hogy NGF-et nem adunk a tenyészethez.

6.1.3. Kötődés a sejtekhez

A βΑΡΡ-ClOO kötési kísérletekhez PC-12 vagy SK-N-MC sejteket szaporítunk és készítünk elő az előzőkben leírt módon, megszámláljuk őket, kissebességű centrifugálással összegyűjtjük (138 x g) , majd 1% BSA-t és 1% glükózt tartalmazó foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS, pH=7,4) (PBG) szuszpendáljuk. A sejtszuszpenzió 0,08 ml-es térfogatát, amely 10^ sejtet tartalmaz, 0,01 ml ^^S-OAP.É-ClOO-zal és 0,01 ml PBG-vel, illetve jelzetlen βΑΡΡ-ClOO-át vagy hordozóját tartalmazó PBGvel keverjük össze. A kinetikai és inhibíciós kísérletekhez a 35s-BAPP-C100 koncentrációját 25 vagy 50 pmol/l-re állítjuk. A telítési kísérletekhez a ligandum koncentrációja 15 pmol/1 és 6 nmol/1 között változik. A keveréket 3 óra hosszat inkubáljuk 4

- 41 °C-on, hacsak másképpen nem jelezzük. Az. inkubálási periódus végén a sejteket centrifugálással ülepítjük (138 x g, 90 mp), a felülúszót (amely a megkötetlen ligandumot tartalmazza) eltávolítjuk, majd 0,2 ml friss, jéghideg PBG-t adunk hozzá. A sejteket és a friss puffért röviden összekeverjük, majd ismét centrifugáljuk és friss, jéghideg pufferben szuszpendáljuk, az előzőkben leírt módon. Végezetül a sejteket centrifugálással ülepítjük, 0,1%-os BSA-vel kezelt szűrőlapokon szűrjük át, majd 4 x 1 ml 0,1% BSA-t tartalmazó jéghideg PBS-sel mossuk. A sejtek friss, jéghideg pufferben való szuszpendálása és a sejtek szűrése között eltelt idő 10 percnél kevesebb. A disszociációs kísérletekben, valamint a megkötött ligandum mintáinak a vételéhez a sejteket a második mosásnál hozzáadott pufferben 3 óra hosszat mkubáljuk, hogy hagyjuk a megkötött ligandumokat disszociálni. A sejteket azután centrifugálással ülepítjük, majd a felülúszót (amely a ledisszociált megkötött ligandumot tartalmazza) eltávolítjuk. A sejteket újra mossuk, és az előzőkben leírt módon kinyerjük. A szűrőlapokon visszamaradt radioaktivitást szcintillációs számlálóval mérjük. Aspecifikus kötésnek azt tekintjük, amely fölöslegben levő (3,2 nmol - 18 nmol) βΑΡΡ-ClOO jelenlétében lép fel. A telítési adatokat számítógéppel, /kereskedelmi forgalomban levő szoftverrel számítjuk ki. A kísérleti adatokhoz legjobban illeszkedő kötési modellt F-teszttel határozzuk meg (p<0,05).

• · · «·· ·· 4 ·«

- 42 6.1.4 . Kötési autoradiográfia

Sprague-Dawley patkányokat hypercapnia-val (a vér széndioxid tartalmának növelése) pusztítjuk el, majd jégre tesszük őket, ameddig agyuk eltávolítható lesz (egy óránál kevesebb idő). Az agyakat gyorsan szárazjéggel -20 °C-ra hűtött izopentánban fagyasztjuk le, majd vagy azonnal használjuk, vagy felhasználásig -80 °C-on tároljuk. Az agyakat egy kriosztát mintatartójához rögzítjük, majd 25 pm-es koronális szekciókat gyűjtünk zselatinnal borított mikroszkóp lemezekre. A szekciókat vagy éjszakán át -80 °C-ra fagyasztjuk, vagy azonnal felhasználjuk. A szekciókat levegőn megszárítjuk 4 °C-on, majd a kötő pufferben (PBS, 1% BSA) 30 percig 4 °C-on előinkubáljuk. Ezt a puffért friss pufferrel helyettesítjük, amely vagy csak a ligandumot (³⁵S-ÜAPP-C100-at, 0,01 nmol), vagy a ligandumot és egészen tízszeres feleslegben levő 5APP-C100-at vagy hordozóját tartalmazza. Az inkubálást 3 óra hosszat folytatjuk 4 °C-on. A ligandumot tartalmazó puffért azután eltávolítjuk, és a szekciókat kétszer mossuk friss pufferrel (15 perc és 1 perc, 4 °C) . A szekciókat tízszer jéghideg desztillált vízbe merítjük, majd szobahőmérsékleten levegőáramban szárítjuk. A szekciókat azután Röntgen-filmre exponáljuk 1-14 napig, és a filmet !

előhívjuk. Néhány szekciót Cresyl-violettel festünk az agyi régiók azonosítása céljából. Az autoradiogrammok optikai sűrűségét mennyiségileg meghatározzuk, képelemző rendszer alkalmazásával. ‘

6.1.5. A C100-R cDNS keresése expressziós klónozással

A cDNS-t 18 embrionális napos patkányagy mRNS-ből készítjük, Neve és munkatársai [Neve és munkatársai., részletes leírás: Klickstein and Neve, In: Current Protocils in Molecular Biology (1986)] . kgtll könyvtárakat (patkányagy cDNS konstans, RL Neve; Humán cDNS könyvtár, Clontech) szélesztünk Escherichia coli Y1090 sejtekre 150,000 pfu/150 mm-es lemez sűrűségben. A lemezeket 3 óra hosszat 42 °C~on inkubáljuk, mialatt a tarfoltok éppen láthatóvá válnak. A lemezeket Schleicher and Schüll 132 mm-es nitrocellulóz szűrőlapokra fektetjük, amelyeket 10 mmol/l IPTG-vel (izopropil-β,D-tiogalaktozid) telítettünk, maja levegőn enyhén megszárítjuk. A lemezeket 3 órára 37 °C-ra tesszük, majd az első szűrőlapot eltávolítjuk, és TBS-be tesszük (50 mmol/1 TRIS, pH=7,7, 150 mmol/1 NaCl).

Egy második, duplikátum IPTG-vel átitatott nitrocellulóz szűrőlapot teszünk a lemezre, majd két órára otthagyjuk. A második szűrőlapot eltávolítjuk és TBS-be tesszük. Ά lemezekett blokkoló ágens nélkül legalább 12 óra hosszat, illetve legfeljebb négy napig hagyjuk a TBS-ben, hogy e természetes térszerkezet kialakulhasson. A szűrőlapokat 5%-os zsírmentes y fölözött tejet tartalmazó TBS-ben blokkoljuk 2 órán illetve egy éjszakán át. A szűrőlapokat kötő pufferrel mossuk (50 mmol/1 TRIS-HC1, pH=7,7, 50 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgC12< 1 mmol/1 ditiotreitol). A szűrőlapokat‘ 3 nmol in vitro transzlációval előállított 3^S-5APP-C100-zal inkubáljuk két óra hosszat 4 °Con. Három háromperces mosást használunk (4 °C) a megkötetlen *»·« jelzett peptid eltávolítására (i) csak a kötő puffer, (ii) kötő puffer + 0,1% NP40, és (iii) kötő puffer. A szűrőlapokat azonnal eltávolítjuk a mosófolyadékból· és levegőn megszárítjuk. A processzált szűrőlapokat Χ-ΟΜΆΤ RP filmre exponáljuk erősítő fóliával (-70 °C, 6-14 nap) . Kiderült, hogy nedves lemezek kellenek ahhoz, hogy kielégítő fehérje/tarfolt ot kapjunk a szignifikáns jelhez. Emellett az eljárás során arra is szükség volt, hogy a nukleinsav próbák tisztításának megfelelő lépésében rutinszerűen szükségesnél lényegesen több fágot szélesszünk. Még akkor is, amikor a βΑΡΡ-ClOO kötőfehérje helyet tartalmazó tarfolt-tiszta fágpopulációt szélesztettünk az előzőkben leírt módon, a fágoknak csak kis százaléka kötődött a βΑΡΡ-ClOO-hez, valószínűleg a kötéshez szükséges helyes térszerkezet igénye miatt.

A másolat szűrőlapokat összehasonlítottuk, hogy azonosítsuk azokat a fágokat, amelyek a -^^S-hAPP-ClOO-hoz kötődő fehérjéket expresszálnak. A pozitív fágokat kiválasztjuk, és további kötési és tisztítási lépseken visszük át. Hat tisztítási lépésre van szükség ahhoz, egyetlen pozitív kiónt kapjunk egy patkányagy cDNS könyvtárból. Ennek a patkányklónnak a jele ÁABIR. Öt izolálási lépésre volt szükség ahhoz, hogy egy humán cDNÖ könyvtárból öt pozitív kiónt izoláljunk.

A ÁABIR inszertját PCR amplifikálással szubklónozzuk, λ gtll szekvenáló indító molekulákat alkalmazva, amelyek restrikciós enzim hasítási helyeket tartalmaznak (Sáli és

NotI) . Az amplifikált fragmentet tisztítjuk, a restrikciós • ·

- 45 enzimekkel a gyártó előírásai szerint emésztjük, majd Sall/NotI enzimekkel emésztett Bluescript plazmidba (SK+, Stratagene) szubklónozzuk. A patkány szubklón jele pABlR.

Egy második klónozási stratégiát dolgoztunk ki, a kereskedelmi forgalomban levő, flag jelzés elleni antitest alkalmazásával.

könyvtárakat megszélesztjük, szűrőlapmásolatokat készítünk, feldolgozzuk őket, majd mossuk, az előzőkben leírt módon, azzal az eltéréssel, hogy a BAPPClOO-t nem jelezzük

35s-Metioninnal. A szűrőlapokban keresztkötéseket hozunk létre

Stratalinker keresztkötés majd 5% zsírmentes tejet tartalmazó blokkoljuk. A szűrőlapokat azután kereskedelmi forgalomban levő anti-flag antitesttel

TBS

A fölösleges antitestet három tízperces TBS mosással eltávolítjuk, a második mosás során a TBS-t 0,1% NP40-nel egészítjük ki. A szűrőlapokat egy második antitesttel inkubáljuk (kecske anti-egér IgG, nehéz és könnyű lánc, biotin konjugátum, NEN), ugyanúgy, mint az első antitesttel. A mosás után a szűrőlapokat [ 12 5jj -Avidinnel (NEN) inkubáljuk 0,5 pCi/ml koncentrációban, kötőpufferben, az előzőkben leírt módon. Az utolsó három mosást TBS-sel végezzük, a második mosásnál a TBS 0, 11.7 NP40-et tartalmaz. A szűrőlapokat levegőn megszárítjuk, majd XOMAT-RP filmre exponáljuk -70 °C on, erősítő fólia alkalmazásával 6-21 nap alatt. A duplikátum szűrőlapok autoradiogrammjait ^összehasonlítjuk. Kiválasztjuk a pozitív tarfoltokat, majd további szűrővizsgálati lépéseken visszük át.

- 46 A βΑΡΡ-ClOO kötőfehérje humán rokonát tartalmazó fágot mind a direkt kötési módszerrel, mind a flag-antitest módszerrel klónozzuk. Ezeket a cDNS-eket szubklónozzuk, majd szekvenáljuk.

6.1.6. cDNS jellemzés

A cDNS-eket vagy nagy kópiaszámú vektorokba szubklónozzuk és baktériumokba transzformáljuk, vagy közvetlenül amplifikáljuk a fág rekombinánsokról, a polimeráz láncreakció segítségével. Az előbbi esetben a kétszálú miniprep DNS-t szekvenáljuk Sequenase (US Biochemicals) alkalmazásával; az utóbbi esetben a PCR termékeket megtiszítitjuk és a femtomól szekvenáló rendszerrel (Promega) szekvenáljuk.

A kiónok szekvenálását a standard didezoxi módszerrel végezzük (Sequenase; US Biochemicals). A számítógépes elemzést elsősorban GenePro (Riverside Scientific Enterprises) és PCGene (Intelligenetics) programokkal végezzük.

A humán DNS vagy patkány DNS (PC12) Southern transzferéit egy 32p__vep jelzett 260 bp méretű (EcoRI/Scal) fragmenttel vizsgáljuk meg, amely az AB1R cDNS 5' végét képviseli. 8 pg DNS-t hasítunk különböző restrikciós enzimekkel, 0,8%-os agaróz j

gélen futtatjuk, majd nylon vagy nitrocellulóz szűrőlapra visszük át.

A Northern elemzést a guanidium-tiocianát módszerrel [ Chirgwin és munkatársai., ^Biochemistry, 18, 5294 (1979)] izolált össz-celluláris RNS-sel végezzük. Glioxál géleket, formaldehid-agaróz géleket és dót biottokat használunk a

- 47 különböző forrásokból származó RNS mennyiségi mérésére és kiértékelésére [ Tanzi és munkatársai., Science, 235, 880-884 (1987); Tanzi és munkatársai., Natúré, 331, 528-530 (1988)] . Az idegnövekedési faktorral különböző ideig kezelt PC12 sejtekből származó RNS-t, az Alzheimer betegségben és Down szindrómában szenvedő betegek agyából származó RNS-t, az agy különböző régióiból származó RNS-t, a különböző fejlődési állapotokból származó RNS-t, stb. futtatjuk. Az AD vagy Down agyakat a kaptuk, illetve a McLellan Hospital agyszövet bankjából.

?\.gtll-ben levő 1985 bp lizogén oly módon, hogy az baktériumokat a rekombináns fággal fertőzzük,

10,000:1 arányban, majd azonosítjuk a nem lizált baktériumok hőmérséklet érzékeny kiónokat. A lizogént hővel és között a

IPTG-vel indukáljuk, majd a keletkező sejtlizátumot Laemmli mintafelvivő pufferben szuszpendáljuk. A minta egy részét 10%-os PAGE-n elektroforetizáljuk, nitrocellulózra visszük át, majd egyre alacsonyabb koncentrációjú karbamid oldatban inkubáljuk 4 °Con, amely oldat összetétele: PBS-Triton-X, több

Kageyama és Pastan módszerével [ Cell, 59, 815 mint két napig,

A ³⁵SβΑΡΡ-ClOO-hez való /

kötődést⁷ azután az AB1R kiónnak a cDNS könyvtárakból való izolálására használt eljárás szerint végezzük el, azzal az eltéréssel, hogy PBS helyett

TBS-t használunk.

A ÁABlR-ből származó cDNS inszertet a pCDNAl emlős expressziós vektorba szubklónozzuk antiszensz orientációban,

- 48 majd a PC12 sejteket elektroporációval transzfektáljuk. Ezeket a tranziens sejteket DME táptalajon növesztjük 3 napig, NGFfel kezeljük, majd vizsgáljuk azt a képességüket, hogy megkötik-e a 35g__sey jelzett βΑΡΡ-ClOO-t. A stabil transzfektáns sejteket kiválasztjuk, oly módon, hogy G418 antibiotikumot teszünk a táptalajba, és a neomicin rezisztens sejteket ezt követően megvizsgáljuk a kötési módszerrel, hogy képesek-e megkötni a jelzett βΑΡΡ-ClOO-t, NGF-fel való kezelés után.

6.1.7. In situ hibridizáció, βΑΡΡ-ClOO kötő fehérje próba alkalmazásával

A hibridizációs próbákat különböző restrikciós hasítási helyeken linearizált pABlR-patkány konstrukció jelzésével készítjük el. Az antiszensz RNS próbákat az Ncol hasítási helyen linearizált plazmid templátból készítjük, a Bluescript

T3 promoterének alkalmazásával, az értelmes kontroll RNS próbákat a BamHI hasítási helyen linearizált plazmádból készítjük, a Bluescript T7 promoterének alkalmazásával. A próbákat különböző módokon készítettük. In vitro transzkripciót használtunk az RNS próbák előállítására. Az RNS-t vagy 35g_uTPvel (Promega reagensek) vágj? digoxigenin-UTP-vel (BoehringerMannheim reagensek) jeleztük. A digoxigeninnel jelzett DNS próbákat PCR-rel állítjuk elő [ Lanzillo, 1991; McKenna and J. Carlson, személyes közlés];> a PCR indító molekulákat a megfelelő fragmentek előállításához készítettük el (Genoa

Biotechnologies, Inc.) .

- 49 Az in situ hibridizáláshoz a szekciókat ugyanúgy készítjük elő mint a kötő autoradiográf iához, csak RNáz mentes körülményeket alkalmazunk. A hibridizálás előtt a szekciókat kétszer három percig mossuk 0,75 g/ml glicint tartalmazó 0,1 mol/1 koncentrációjú foszfát pufferrel, majd kétszer 15 percig mossuk csak foszfát pufferrel.. Ezután proteináz K-val kezeljük (1 pg/ml 15 mmol/l TRIS-HC1 pH=7,5 és 15 mmol/l EDTA összetételű pufferben) 30 percig 37 °C-on, majd ecetsavanhidriddel mossuk (0,25% 0,1 mol/1 trietanolaminban pH=7,5) 10 percig. Ezután kétszer 15 percig mossuk SSC-vel (0,15 mol/1 NaCl, 0,015 mcl/1 nátrium-citrát, pH=7,0), de a normálisnál kétszer töményebb koncentrációban, etanollal zsírmentesítjük, majd levegőn szárítjuk. A hibridizációs próbát, amelyet az előzőkben leírt módon állítottunk elő, a szekciókra tesszük 50% formamidot, 20X Denhardt reagenst, 300 μ g/ml egyszálú DNS-t, 150 pg/ml tRNS-t, 20 mmol/l β-merkaptoetanolt (BME) és 2X SSC-t tartalmazó oldatban. A szekciókra és hibridizáló oldatokra fedőlemezeket teszünk, majd a lemezeket gumicementtel lezárjuk. A hibridizálást éjszakán át végezzük 60 °C-on. A fedőlemezeket azután eltávolítjuk és a szekciókat kétszer 30 percig mossuk 60 °C-on 4X SSC-vel, amelyet 300 mmol/l BME-vel egészítettünk ^zki . Ezután RNázzal kezeljük ( 20 pg/ml 2X SSC, 20 mmol/l BME) 30 percig 45 °C-on. A szekciókat azután négyszer mossuk 2X SSC-vel ( 60 perc, 30 perc, 30 perc és 30 perc 60 °C-on), majd egyszer mossuk IX SSC-vel (30 perc, 60 °C), végül éjszakán át hagyjuk állni 2X SSC-ben. A következő napon a szekciókat gyorsan Leöblítjük 0,05 mol/1 koncentrációjú

- 50 foszfát pufferrel, majd desztillált ' vízzel. Levegőn megszárítjuk, majd Röntgen filmre helyezzük. A filmeket 1-2 héttel később hívjuk elő, majd ezek alapján megállapítjuk a hibridizált próba eloszlását. A próba végső lokalizálását úgy érjük el, hogy a szekciókat egy fotoemulzióval borítjuk, majd előhívjuk az emulziókat és mérjük a sejttestek fölötti szemcsesűrűséget a különböző agyi régiókban.

6.1.8. A teljes hosszúságú patkány APP-4 klónozása

Ahhoz, hogy megkapjuk a teljes hosszúságú ClOO-R-t, a patkány könyvtárakat pABlR-patkányból készített különböző próbákkal vizsgáljuk át. Ezek a próbák a patkány klón 5' végére

specifikusak. Miután

már több patkány szekvencia áll

rendelkezésünkre, a vizsgálatok következő lépéseiben az éppen

ismert legszélső 5'	szekvencia alapján készített próbákat
alkalmazzuk. Emellett	egy második patkányagy cDNS könyvtárat
hozunk létre λΖΑΡ-ben	(Stratagene) , egy olyan indító molekula

alkalmazásával, amely a cDNS inszert 5' régiójára specifikus. A könyvtárata RACE (a cDNS végek gyors amplifikálása) protokoll szerint végezzük [ Frohmann és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 8998-9002 (1988)] , az alábbi módosításokkal: (1/ a cDNS szintézishez indító molekulaként az oligo(dT) helyett az ABlRT3-l-et vagy az ABlRTR-3-t használtuk, amely az AB1R mRNS 3' UTR-re specifikus;

(2) a mRNS-t a cDNS szintézis előtt metil-merkuri-hidroxiddal denaturáltuk; (3) az AMV reverz transzkriptáz helyett MMLV reverz transzkriptázt (Superscript , Bethesda Research Labs) használunk; (4) a cDNS-ek végéhez az EcoRI linkerek helyett NotI adaptereket kapcsolunk, ezért a cDNS ezután való emésztésére nincs szükség a klónozás előtt. A cDNS-eket NotI restrikciós enzimmel emésztett, részlegesen feltöltött λΖΑΡ IIbe klónozzuk, így két könyvtárat állítunk elő, mindegyik körülbelül 10⁵ cDNS kiónt tartalmaz. Ezt a könyvtárat olyan próbákkal vizsgáljuk át, amelyek az egyes klónozási lépésekben éppen elérhető legszélső 5' szekvenciákat tartalmazzák.

Egy másik megközelítés a teljes hosszúságú gén klónozásában a PCR technológia alkalmazása

Hippokampusz mRNS használatakor a cDNS inszert 5' végére specifikus indító molekulát használunk, és végrehajtjuk a reverz transzkriptáz reakciót. Az RNS/DNS hibridet azután guaninokkal farkazzuk terminális transzferáz enzim alkalmazásával, az RNS-t RNáz H val emésztjük, és a második szál szintéziséhez indító molekulaként poli-C-t használunk. Beléjük épített restrikciós hasítási helyeket tartalmazó indító molekulák alkalmazásával ezeket a klón-specifikus cDNS-eket klónozzuk és szekvenáljuk. Az eljárást többször megismételjük, egészen addig, ameddig a teljes 11 kb méretű szekvenciát megkapjuk [ Frohmann és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 8998-9002 (1988)] . /

6.2. Eredmények

6.2.1.	Radiologand kötődés
Mivel a	βΑΡΡ-ClOO toxikus az NGF-re differenciálódó PC12

sejtekre, ezért megvizsgáltuk az in vitro szintetizált βΑΡΡ-

- 52 C100 fragmentnek az olyan PC12 sejtek felszínéhez való tapadását, amelyeket NGF-fel kezeltünk [ Kozlowski és munkatársai., J. Neuroscience, 12, 1679 (1992)] . A ³³S-BAPPClOO-nak a differenciálódott PC12 sejtekhez való kötődése gátolható volt a jelöletlen βΑΡΡ-ClOO-zal (IA. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk az SK-N-MC neuroblasztóma sejtvonallal (lásd 1B. ábra).

Az NGF-fel kezelt PC12 sejtekben a frakciója a teljes kötés gátolható ki. A gátolható kötés IC5Q értéke l,7±0,7 nmol (n=5). A gátolható kötés maximumát háromórás inkubálás után értük el, és ez teljesen disszociálható volt

A telítési kísérletek azt mutatták, hogy egyetlen osztályba tartozó kötési helyek vannak jelen, értékük 0,81±0,37 nmol, ami hozzávetőlegesen megegyezik az előzőkben meghatározott IC5Q értékkel, a B_max érték 0,37±0,05 femtomól/10⁶ sejt. A ³⁵S-BAPP-C100-nek az NGF fel kezelt PC12 sejtekhez való kötődését nem gátolják lényegesen az egyéb peptidek, beleértve számos tachikinint is. A patkányagy szekciókban a specifikus kötés legmagasabb szintjét a hippokampusznak és az olfaktorikus gumónak a régióiban találtuk meg.

A gátolható ³³S-BAPP-CÍ00 kötés mennyisége függ attól, hogy a PC12 sejtek mennyi ideig voltak érintkezésben az NGFfel. Azok a PC12 sejtek, amelyek nem voltak érintkezésben az NGF-fel, csak csekély mértékű gátolható kötést mutatnak, míg azok, amelyeket 4-6 napig inkubáltunk NGF jelenlétében, jelentős mértékben megnövekedett kötődést mutatnak. Egy másik • · · · * · · változó, amely érinti a kötődést, az a pH. ,A kötődés maximális mértéke ph=7-nél figyelhető meg. pH=6-nál a maximális kötésnek csak a 25%-a figyelhető meg, pH=8,5-nél a maximális kötésnek csak az 52%-a figyelhető meg.

Ahhoz, hogy megbecsüljük a ³5-BAPP-C100 stabilitását a vizsgálati körülmények között, mind az inkubációs periódus végen szabadon maradt ligandumokat (megkötetlen), mind azokat a ligandumokat, amelyek a sejtekhez kötődtek és utána felszabadultak, SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáljuk. Mielőtt a vizsgálati elegyhez tettük, a radioaktivitás legnagyobb része egyetlen csíkban volt található, amelynek látszólagos molekulasúlya 15 kDa volt. Ez a βΑΡΡ-ClOO monomer. Kismennyiségű anyag még jelen volt két további diffúz csík formájában. Az egyik körülbelül a fő csík molekulasúlya kétszeresének megfelelően vándorolt, és valószínűleg ez a βΑΡΡ-ClOO dimer. A másik csík molekulasúlya sokkal nagyobb volt, ez valószínűleg egy aggregátum. A megkötetlen ligandum gélprofilja az inkubációs periódus végén ugyanaz, mint az inkubálás előtti ligandumé, jelezve, hogy a ligandum nem degradálódott. Hasonlóképpen, a kötődésből felszabadult ligandumnak ugyanaz a profilja mint annak, amelyet eredetileg hozzáadtunk, azzaj/ a lehetséges eltéréssel, hogy a nagy molekulasúlyú anyag mennyisége kissé csökkent. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a βΑΡΡ-ClOO ligandum kötődése nem okozza a ligandum módosulását..

i

A tirozinnak egy mutációja a βΑΡΡ-ClOO-bán, amelyet azért vittünk be, hogy vizsgáljuk a foszfotirozin konszenzus *··* ·«·*

- 54 szekvencia jelentőségét (Tyrgg7 helyett' Phe), egy olyan peptidet eredményezett, amely nem volt toxikus a differenciálódott PC12 sejtekre. A Phegg7-BAPP-C100 nem gátolja lényegesen a ³³S-BAPP-C100 kötődését egészen 14 nmol/1 koncentrációig (n=3), és ez azt mutatja, hogy legalább hússzor kisebb aktivitású ligandum a βΑΡΡ-ClOO kötőhelyen mint a természetes forma.

6.2.2. A C100-R klónozása és jellemzése

A ³³S-ÚAPP-C100-r.ak a ?\.gtll tarfoltokhoz való kötődéséből származó autoradiográfiás jelek, amelyek a késői litikus fázisban való fehérje expresszióra utalnak atipusosak és változók. XOMAT-RP nagy feloldóképességű filmet és hosszú expozíciót használtunk hogy az aurorediogrammok tiszta duplikátumait kapjuk meg (3. ábra).

A patkány klón, a ?vABlR cDNS inszert mérete 1970 bp. A teljes szekvenciát a 4. ábrán adjuk meg (SEQ ID NO. 1-2) . A megadott szekvencia tartalmazza a vektorokból, a Xgtll-ből és a Bluescriptből származó β-gal gén egy részét is. A klón nyitott leolvasási kerete nincs fázisban a β-gal génnel, ezért a klón nem mint fúziós fehérje expresszálódik. A 175-ös pozícióban levő ATG-től nyolc bázispár távolságban van egy szomszédos szekvencia, amely Escherichia coli riboszómális kötőhelyként szolgálhat - AGAA (a kanonikus hely az AGGA) . Az ennél a metioninnál iniciálódó nyitott leolvasási keret transzlációja olyan fehérjét eredményez, amely 407 aminosavból áll, molekulasúlya 45,253 D. Ez az expresszió valószínűleg egy re*··· ·V·· • · ♦ · • · · « • · ♦ ·« • ·« « ··

- 55 iniciáció terméke lehet, és korábban egy 100 kD nem fúziós fehérje expressziójánál figyelték meg [ Yang C.H., Lambie, E.J. and Snyder, M., J. of Cell Biology, 116, 1303-1317] . A szekvencia elemzésébe: kiderült, hogy a klón tartalmaz 1349 bázispárt a gént C-terminális szekciójából (1395 mínusz β-gal szekvencia), és 575 bázispárt a 3' nem transzlálódó régióból. A nukleinsav szekvencia elemzés homológiát mutat a B típusú kalcium-csatornákkal, a Ryanodine kalcium-csatornával és a nagy affinitású kalciumkötő fehérjével, a calcireticulinnal (5. ábra) . A transzlálódott fehérje szekvencia számos potenciális foszforilezési helyet tartalmaz (különböző kináz célpontok, beleértve a cAMP- és cGMP-dependens fehérje kinázokat, a protein kináz C-t, és a kazein kináz Il-t), valamint potenciális N-glikozílezési helyeket, potenciális Nmirisztolilezési helyeket, tirozin-szulfatálási helyeket, valamint egy szerin/treonin protein kináz specifikus jelsorozatot. Ez a ser/thr kináz jelsorozat, vagy megőrzött katalitikus mag szekvencia a transzlálódott szekvenciában az AB1R kiónban található a 246-258-as aminosavak közötti régióban (4. ábra) . A jelsorozat illeszkedik a -[ LIVMFYC] -x-[ HY] D[ LIVMFY] -K-X(2)-N-[ LIVFMC] konszenzus mintázathoz, amelyet Hunter és kollégái találtak [Hanks, S.K., Quinn, A.M. and Hunter, T., Science, 241, 42-52 (1988)] . A patkány AB1R kiónban a szekvencia az alábbi: V-I-H-R-D-I-K-S-D-N-I-L-L (4. ábra).

Számos további patkány cDNS kiónt izoláltak és i szekvenáltak (9. ábra). Az új szekvencia információ az 5' irányban terjed ki, a C100-R kódoló szekvenciáját a 4. ábrán

- 56 ···«»« • · · « · · ' ··· ·4· ·· · mutatjuk be. A * a 686-os nukleotid felett a kapcsolódási pontot mutatja a 4. ábrán a 40-es nukleotidnál bemutatott patkány szekvenciával.

A Northern biot azt mutatja, hogy az ennek a cDNS-nek megfelelő mRNS erősen expresszálódik az agyban. A cDNS egy 11 kb méretű erős sávhoz hibridizálódik, és jóval gyengébben hibridizálódik egy körülbelül 3 kb méretű sávhoz. A PC12 sejtekben van egy NGF-fel indukálható hibridizálódó sáv, amelynek mérete 9,5 kb. Emellett a PC12 sejtekben van egy 4,4 kb méretű hibridizálódó sáv, ami az ismételt tenyésztések és az NGF kezelés során lép fel. Ezek a jóval gyengébben hibridizálódó, alacsonyabb molekulasúlyú sávok azokat a mRNS molekulákkal való hibridizációt reprezentálhatják, amelyek például a calreticulint kódolják; ez a nukleinsav szintjén fennálló homológiára utal. Az Alz'neimer betegségben szenvedők agyából származó RNS Northern biot elemzése azt mutatja, hogy a βΑΡΡ-ClOO kötő fehérje nem expresszálódik magasabb vagy alacsonyabb szinten mint a kontrollok.

A humán és patkány genomiális DNS Southern biot elemzése azt mutatja, hogy az AB1R cDNS kisszámú csíkhoz hibridizálódik, ami megegyezik azzal, hogy az AB1R egyetlen génkópiát képvisel (6. ábra). Egy erősen hibridizálódó 3,0 kb méretű sáv, valamint két gyengébben hibridizálódó sáv figyelhető meg, az egyiknek a mérete 8,5 kb, a másiknak a mérete jóval nagyobb, 25 és 30 kb között van, fajtól függően.

•·· ··

- 57 6.2.3.

In situ hibridizáció háttérnél magasabb hibridizáció

A patkányagy szekcióban a csak a hippokampuszban és az olfaktorikus gumóban volt nyilvánvaló (8.

megegyezik a kötési helyek autoradiográfiás módszerekkel

7. Példa: A humán C100-R klónozása λΖΑΡΙΙ-ben (Stratagene) készített humán felnőtt cDNS könyvtárat vizsgálunk át, a patkány C100-R inszertből készített jelzett fragment felhasználásával. A jelzett fragmentet egy EcoRI fragment képviseli, a 9. ábrán láthatóan a 31-es és 409es nukleotidok közötti fragment formájába. A patkány C100-R EcoRI fragmentet random priming reakcióban jelezzük, majd a könyvtárat szigorú körülmények között vizsgáljuk át, a szakterületen jártas szakember számára jól ismert, rutinszerű módszerek alkalmazásával. A szűrővizsgálati módszerek Maniatis és munkatársai kézikönyvében vannak összefoglalva [ Sambrook és munkatársai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)] . Számos kiónt kaptunk, ezeknek mérete 600-1500 bázispár között van. Az 1500 bázispár méretű klón részleges szekvenálásának eredményei a 11. ábrán láthatók. A humán C100-R szekvencia és a patkány C100-R szekvencia közötti homológia régiói a 12. ábrán mutatjuk be. >

8. A mikroorganizmusok letétbe helyezése

Az alábbi mikroorganizmust helyeztük letétbe az American

Type Culture Collection-nél (ATCC, Rockville, Maryland), amely az alábbi letéti számot kapta:

Mikroorganizmus Letétbe helyezés időpontj a Letéti szám pABIR 1992. augusztus Ί. 69047

A találmány oltalmi körét nem korlátozza a letétbe helyezett mikroorganizmus, mivel a letétbe helyezett mikroorganizmust csak a találmány egy megvalósítási módja illusztrációjának szántuk, és bármely mikroorganizmus, amely funkcionálisan ekvivalens vele, tartozik.

A találmány oltalmi körét bemutatott megvalósítási módok, a találmány oltalmi körébe nem korlátozzák a példaként amelyeket a találmány egyes szempontjainak illusztrálására adtunk meg, és bármely klón, DNS vagy aminosav szekvencia, amely ezekkel funkcionálisan ekvivalens, a találmány oltalmi körébe tartozik. A szakterületen jártas szakember természetesen a találmány számos módosítását végezheti el a megadott leírásból és mellékelt ábrák alapján. Ezek a módosítások is a függelékben megadott igénypontok oltalmi körébe tartoznak.

Az is nyilvánvaló, hogy a nukleotidokra megadott bázispár méretek hozzávetőlegesek, és ,-a leírás céljára használjuk.

Az alábbiakban felsoroljuk a találmányban szereplő szekvenciákat.

- 59 1) Általános információk:

(i) Bejelentő: Manly, (ii) A találmány címe:

S . és munkatársai.

A βΑΡΡ-ClOO receptor (C100-R) klónozása és expresszálása (iii) Szekvenciák száma: 2 (iv) Levelezési cím:

(A)	Címzet	t: Pennie &	Edmonds
(B)	Utca:	1155 Avenue	of the Americas
(C)	Város:	New York
(D)	Állam:	New York
(E)	Ország	: USA
(F)	Irányítószám: 10036-2711

(v) Számítógéppel olvasható forma:

(A) Hordozó típusa: Floppi lemez (B) Számítógép: I3M PC kompatibilis (C) Operációs rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Program: Patentln Release #1,0, #1,25 verzió (vi) A jelenlegi bejelentés adatai:

(A) Bejelentés száma:

(B) Bejelentés időpontja:

(C) Osztályozás:

(viii) Ügyvéd/ügyvivő információ:

(A) Név: Misrock, S.) Leslie (B) Regisztrációs szám: 18,872 (C) Referencia szám: 6013-094

- 60 « (ix) Telekommunikációs információk:

(A) Telefon: 212 790-9090 (2) Információ a SEQ ID NO. 1-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 1971 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonságok:

(A) Név/kulcs: CDS (B) Hely: 1..1395 (xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO. 1:

(2) Információ a SEQ ID NO. 2ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 465 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO. 2:

Claims (30)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy ClOO-R-t kódoló cDNS.
2. 2. Rekombináns DNS vektor, azzal jellemezve, hogy egy ClOO-R-t kódoló nukleotid szekvenciát vagy egy C100-R fúziós fehérjét kódoló nukleotid szekvenciát tartalmaz.
3. 3. A 2. igénypont szerinti rekombináns DNS vektor, azzal jellemezve, hogy a C100-R nukleotid szekvenciát működés szempontjából egy olyan szabályozó szekvenciához kapcsoljuk, amely szabályozza a génnek a gazdaszervezetben való expressziój át.
4. 4. A 2. igénypont szerinti rekombináns DNS vektor, azzal jellemezve, hogy a C100-R fúziós fehérje nukleotid szekvenciát működés szempontjából egy olyan szabályozó szekvenciához kapcsoljuk, amely szabályozza a génnek a gazdaszervezetben való expresszióját.
5. 5. Az 1 - 4. igénypontok bármelyike szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy a C100-R szekvencia a patkány ClOO-R-t kódolja.
6. 6. Az 1 - 4. igénypontok bármelyike szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy a C100-R szekvencia a humán ClOO-R-t kódolja.

   2 Az 1 - 4. igénypontok bármelyike szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy hibridizációra képes szigorú körülmények között, illetve képes lenne szigorú körülmények közötti hibridizációra, ha a 4. ábrán látható, a C100-R DNS szekvenciát kódoló genetikai kód nem lenne degenerált (SEQ ID NO. 1).
7. 8. Egy génsebészeti úton megváltoztatott gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az 1 - 4. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS vektort tartalmazza.
8. 9. Egy génsebészeti úton megváltoztatott gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerinti DNS expressziós vektort tartalmazza és a ClOO-R-t expresszálja.
9. 10. A 9. igénypont szerinti, génsebészeti úton megváltoztatot sejtvonal, azzal jellemezve, hogy a ClOO-R-t a sejt felszínén expresszálja.
10. 11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti, génsebészeti úton megváltoztatott sejtvonal, azzal jellemezve, hogy a humán C100R-t expresszálja.
11. 12. Egy génsebészeti úton megváltoztatott sejtvonal, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerinti rekombináns DNS expressziós vektort tartalmazza, és a C100-R fúziós fehérjét expresszálja.
12. 13. A 12. igénypont szerinti, génsebészeti úton megváltoztatott sejtvonal, azzal jellemezve, hogy a C100-R fúziós fehérjét a sejt felszínén expresszálja.
13. 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti, génsebészeti úton megváltoztatott sejtvonal, azzal jellemezve, hogy a humán C100R fúziós fehérjét expresszálja.
14. 15. Eljárás rekombináns C100-R vagy C100-R fúziós fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy:

    (a) a 3. vagy 4. igénypont szerinti rekombináns DNS expressziós vektorral transzformált, a ClOO-R-t illetve C100-R fúziós fehérjét expresszáló gazdasejtet szaporítunk; és (b) a C100-R génterméket vagy a C100-R fúziós fehérjét kinyerjük a sejttenyészetből.
15. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán ClOO-R-t állítunk elő.
16. 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán C100-R fúziós fehérjét állítunk elő.

    18. Izolált rekombináns C100-R. 19. A 18. igénypont szerinti izolált C100-R, azzal jellemezve, hogy patkány C100-R aminosav szekvenciával rendelkezik. 20. A 18. igénypont szerinti izolált C100-R, azzal jellemezve, hogy humán C100-R aminosav szekvenciával

    rendelkezik.
17. 21. Fúziós fehérje, azzal jellemezve, hogy benne a C100-R egy heterológ fehérjéhez vagy peptid szekvenciához van kapcsolva.
18. 22. A 21. igénypont szerinti fúziós fehérje, azzal jellemezve, hogy benne a C100-R résznek patkány C100-R aminosav szekvenciája van.
19. 23. A 21. igénypont szerinti fúziós fehérje, azzal jellemezve, hogy benne a C100-R résznek humán C100-R aminosav szekvenciája van.
20. 24. Oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy a C100-R nukleotid szekvencia egy részével komplementer antiszensz • · · · · szekvenciát kódol, és gátolja a C100-R gén transzlációját egy sej tben.
21. 25. A 24. igénypont szerinti oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy komplementer a C100-R N-terminális régiója nukleotid szekvenciájával.
22. 26. Monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy immunspecifikus módon kötődik a C100-R egy epitopjához.
23. 27. A 26. igénypont szerinti monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy kompetitív módon gátolja a βΑΡΡ-ClOO kötődését a ClOO-R-hez.
24. 28. A 26. vagy 27. igénypont szerinti monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy a humán ClOO-R-hez kötődik.
25. 29. Eljárás a βΑΡΡ-ClOO ligandum antagonistáinak szűrővizsgálatára és azonosítására, azzal jellemezve, hogy:

    (a) egy, a ClOO-R-t expresszáló sejtvonalat érintkezésbe hozunk egy vizsgált vegyülettel, a βΑΡΡ-ClOO ligandum jelenlétében; és (b) meghatározzuk, hogy a vizsgált vegyület gátolja-e a βΑΡΡ-ClOO ligandum kötési és citotoxikus hatását a sejtvonalra, ezzel az antagonistákat úgy azonosítjuk, mint olyan vegyületeket, amelyek gátolják a βΑΡΡ-ClOO ligandumnak a sejtvonallal szemben mutatott kötési és citotoxikus hatásait is.
26. 30. Eljárás a βΑΡΡ-ClOO ligandum agonistáinak szűrővizsgálatára és azonosítására, azzal jellemezve, hogy:

    (a) egy, a ClOO-R-t expresszáló sejtvonalat érintkezésbe hozunk egy vizsgált vegyülettel, a βΑΡΡ-ClOO ligandum jelenlétében;

    (b) meghatározzuk, hogy a βΑΡΡ-ClOO jelenlétében a vizsgált vegyület gátolja-e a βΑΡΡ-ClOO ligandum kötődését a sejtvonalhoz; és (c) meghatározzuk, hogy a βΑΡΡ-ClOO ligandum távollétében a vizsgált vegyület utánozza-e a βΑΡΡ-ClOO ligandumnak a sejtvonalra gyakorolt citotoxikus hatását, ezzel az agonistákat úgy azonosítjuk, mint olyan vegyületeket, amelyek gátolják a βΑΡΡ-ClOO ligandumnak a sejtvonallal szemben mutatott kötődését, de utánozzák a βΑΡΡ-ClOO ligandumnak a sejtvonalra gyakorolt citotoxikus hatásait.
27. 31. A 29. vagy 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonal egy génsebészeti úton megváltoztatott sejtvonal.
28. 32. A 29. vagy 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonal endogén módon expresszálja a C100R-t.
29. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtvonal egy neuroblasztóma sejtvonal.
30. 34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a neuroblasztóma sejtvonal az SK-N-MC sejtvonal.