RU2603074C2 - Способ и продукт для локализованной или пространственной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани - Google Patents

Способ и продукт для локализованной или пространственной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани Download PDF

Info

Publication number
RU2603074C2
RU2603074C2 RU2013148909/10A RU2013148909A RU2603074C2 RU 2603074 C2 RU2603074 C2 RU 2603074C2 RU 2013148909/10 A RU2013148909/10 A RU 2013148909/10A RU 2013148909 A RU2013148909 A RU 2013148909A RU 2603074 C2 RU2603074 C2 RU 2603074C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
chip
tissue sample
region
capture
dna
Prior art date
Application number
RU2013148909/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013148909A (ru
Inventor
Йонас ФРИСЕН
Патрик СТОХЛЬ
Йоаким ЛУНДЕБЕРГ
Original Assignee
Спейшел Транскриптомикс Аб
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44123034&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2603074(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Спейшел Транскриптомикс Аб filed Critical Спейшел Транскриптомикс Аб
Publication of RU2013148909A publication Critical patent/RU2013148909A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2603074C2 publication Critical patent/RU2603074C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics
    • G16B50/20—Heterogeneous data integration
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics
    • G16B50/30—Data warehousing; Computing architectures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y600/00—Ligases (6.)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к способам и продуктам для локализованной или пространственной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани и, в частности, к способу локализованной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани, включающему: (а) предоставление чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера в реакции удлинения или лигирования праймера, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′: (1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и (2) захватывающую область; (б) приведение указанного чипа в контакт с образцом ткани таким образом, что положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани, и предоставление возможности нуклеиновой кислоте образца ткани гибридизоваться с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах; (в) синтез молекул ДНК на основе захваченных молекул нуклеиновой кислоты с использованием указанных захватывающих зондов в качестве праймеров удлинения или лигирования, где указанные удлиненные или лигированные молекулы ДНК являются мечеными благодаря позиционной области; (г) возможно синтез комплементарной нити указанной меченой ДНК и/или возможно амплификацию указанной меченой ДНК; (д) высвобождение по меньшей мере части меченых молекул ДНК и/или их комплементов или ампликонов с поверхности чипа, где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент; и (е) прямой или опосредованный анализ последовательности высвобожденных молекул ДНК. 3 н. и 52 з.п. ф-лы, 31 ил., 2 табл., 12 пр.

Description

Настоящее изобретение относится главным образом к локализованной или пространственной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани. Нуклеиновая кислота может представлять собой РНК или ДНК. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложены способы детекции и/или анализа РНК, например РНК-транскриптов, или геномной ДНК для получения пространственной информации о локализации, распределении или экспрессии генов или, фактически, о локализации или распределении любой геномной вариации (необязательно в гене) в образце ткани, например в отдельной клетке. Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает условия для развития пространственной геномики и пространственной транскриптомики.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу определения и/или анализа транскриптома или генома и особенно общего транскриптома или генома образца ткани. В частности, данный способ относится к количественному и/или качественному методу анализа распределения, локализации или экспрессии геномных последовательностей в образце ткани, при этом картина пространственной экспрессии или распределения либо локализации в образце ткани сохраняется. Таким образом, этот новый способ представляет собой способ осуществления "пространственной транскриптомики" или "пространственной геномики", который дает возможность пользователю одновременно определять картину экспрессии или картину локализации/распределения экспрессированных генов, либо генов или геномных локусов, присутствующих в образце ткани.
В основе данного изобретения лежит, в частности, технология чипов в сочетании с высокопроизводительными технологиями секвенирования ДНК, которая дает возможность для захвата и мечения позиционной меткой молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекул РНК или ДНК) в образце ткани, в частности, мРНК или ДНК. За этой стадией следует синтез молекул ДНК, которые подвергают секвенированию и анализу, чтобы определить, какие гены экспрессируются в какой-либо части и во всех частях образца ткани. Преимущественно, что индивидуальный, отдельный и специфический транскриптом каждой клетки в образце ткани можно получить одновременно. Таким образом, можно сказать, что способы по изобретению обеспечивают получение высокопараллельных исчерпывающих отличительных характеристик транскриптома индивидуальных клеток в образце ткани без потери пространственной информации в указанном исследованном образце ткани. Согласно изобретению также предложен чип для осуществления способа по изобретению и способы изготовления чипов по изобретению.
Организм человека содержит свыше 100 триллионов клеток и состоит более чем из 250 разных органов и тканей. Развитие и организация таких сложных органов, как головной мозг, далеки от понимания, и существует потребность в анализе экспрессии генов в таких тканях с использованием количественных способов для изучения и определения генов, которые регулируют развитие и функционирование таких тканей. Сами эти органы представляют собой смесь дифференцированных клеток, которые дают возможность всем функциям организма, таким как транспорт питательных веществ, защита и т.д., быть согласованными и поддерживаться. Следовательно, функционирование клеток зависит от расположения клетки внутри конкретной тканевой структуры и взаимодействий с другими клетками в ткани, в которых она участвует как непосредственно, так и опосредованно. Таким образом, существует потребность в том, чтобы определить на транскрипционном уровне как эти взаимодействия влияют на каждую клетку в ткани.
Полученные недавно данные с использованием глубокого секвенирования РНК продемонстрировали, что большинство транскриптов можно детектировать в линии клеток человека, и что большая часть (75%) генов человека, кодирующих белки, экспрессируется в большинстве тканей. Аналогичным образом, детальное изучение 1% человеческого генома показало, что хромосомы транскрибируются повсеместно и что большая часть всех оснований включается в первичные транскрипты. Ввиду этого, аппарат транскрипции на общем уровне может быть описан как случайный.
Хорошо известно, что транскрипты являются всего лишь показателем присутствия белка, поскольку скорости трансляции, деградации и т.д. РНК будут оказывать влияние на количество белка, произведенного из одного транскрипта. В этом отношении, недавний основанный на использовании антител анализ человеческих органов и тканей подтверждает, что тканевая специфичность достигается за счет точной регуляции уровней белка в пространстве и времени, и что разные ткани в организме приобретают свои уникальные характеристики не посредством контроля того, какие белки экспрессируются, а посредством контроля того, сколько каждого из них производится.
Однако в последующих общих исследованиях при сравнении корреляций между транскриптомом и протеомом было показано, что экспрессируется большая часть всех генов. Интересно, что была показана строгая корреляция между изменениями в уровнях РНК и белка для продуктов индивидуальных генов, что указывает на биологическую бесполезность изучения транскриптома в отдельных клетках в контексте функциональной роли белков.
Действительно, анализ гистологии и картины экспрессии в тканях является краеугольным камнем в области биомедицинских исследований и диагностики. Гистология более чем столетие назад с использованием разных методов окрашивания первой выявила основы структурной организации здоровых органов и те изменения, которые происходят при общих патологиях. Результатом разработок в этой области явилась возможность изучения распределения белков с помощью иммуногистохимии, а также экспрессии генов посредством гибридизации in situ.
Однако параллельное развитие более современных методов гистологии и экспрессии генов привело к разделению визуализации и транскриптомного анализа, и до появления способов по настоящему изобретению не существовало никакого подходящего способа, пригодного для общего транскриптомного анализа с пространственным разрешением.
В качестве альтернативы или в дополнение к методам in situ были разработаны способы для анализа белков и нуклеиновых кислот in vitro, т.е. в результате выделения молекул из образцов целой ткани, отдельных типов клеток или даже из единственной клетки и количественного определения конкретного типа молекул в указанных экстрактах, например с использованием ELISA, количественной ПЦР (полимеразной цепной реакции) и т.д.
Недавние достижения в анализе экспрессии генов привели к тому, что появилась возможность оценки полного транскриптома ткани с использованием микрочипов или секвенирования РНК, и такое развитие событий сыграло важную роль в понимании биологических процессов и для диагностики. Однако транскриптомный анализ в типичном случае осуществляют на мРНК, выделенной из целых тканей (или даже целых организмов), и способы отбора небольших участков тканей или индивидуальных клеток для транскриптомного анализа как правило являются трудоемкими, дорогостоящими и характеризуются низкой точностью.
Следовательно, в большинстве исследований генной экспрессии, основанных на использовании микрочипов или секвенировании РНК следующего поколения, применяется репрезентативный образец, содержащий большое количество клеток. Таким образом, результаты представляют собой средние уровни экспрессии исследуемых генов. Разделение клеток, являющихся фенотипически различными, использовалось в некоторых случаях вместе с платформами для исследования общей экспрессии генов (Tang F. et al., Nat. Protoc., 2010, 5: 516-35; Wang D. & Bodovitz S., Trends Biotechnol., 2010, 28: 281-90) и привело к получению очень точной информации о межклеточных вариациях. Однако, высокопроизводительные способы изучения транскрипционной активности с высоким разрешением в интактных тканях до сих пор недоступны.
Таким образом, существующие методы анализа картин экспрессии генов дают информацию о пространственной локализации транскрипции только для одного гена или небольшого числа генов одновременно либо предоставляют информацию о транскрипции для всех генов в образце за счет потери информации о положении. Поэтому очевидно, что существует необходимость в способах одновременного, раздельного и специфического определения транскриптома каждой клетки в образце, т.е. способах, позволяющих осуществлять общий анализ экспрессии генов в образцах ткани, результатом применения которых является получение информации о транскриптоме с пространственным разрешением, и настоящее изобретение направлено на решение этой задачи.
В новом подходе, относящемся к способам и продуктам по настоящему изобретению, используется твердо установившаяся в настоящее время технология чипов и секвенирования, дающая возможность получения информации о транскрипции для всех генов в образце с сохранением информации о положении каждого транскрипта. Специалисту в данной области будет очевидно, что это является ключевой точкой в области наук о живой природе. Эта новая технология открывает новую область так называемой "пространственной транскриптомики", которая по всей вероятности будет иметь глубокие последствия для нашего понимания развития тканей и функционирования тканей и клеток во всех многоклеточных организмах. Очевидно, что такие методики будут особенно полезны для нашего понимания причин и развития болезненных состояний и для разработки эффективных методов лечения таких заболеваний, как например рак. Способы по изобретению также найдут применение в диагностике многочисленных медицинских состояний.
Несмотря на то что первоначально они задуманы с целью проведения транскриптомного анализа, как подробно описано ниже, принципы и способы по настоящему изобретению могут быть применены также для анализа ДНК и, следовательно, также для геномных анализов ("пространственной геномики"). Соответственно, в самом широком его понимании настоящее изобретение относится к детекции и/или анализу нуклеиновых кислот в целом.
Технология чипов, в частности микрочипов, возникла в результате исследований в Стэндфордском университете, когда небольшие количества олигонуклеотидов ДНК были успешно присоединены к поверхности стекла в упорядоченном расположении, на так называемом "чипе", и использованы для мониторинга транскрипции 45 генов (Schena M. et al., Science, 1995, 270: 368-9, 371).
С тех пор исследователями во всем мире опубликовано более 30000 научных работ с использованием технологии микрочипов. Были разработаны многочисленные типы микрочипов для различных применений, например для детекции однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), или для генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов, и важным применением технологии микрочипов является ее использование для исследования экспрессии генов. Действительно, микрочип для генной экспрессии был создан как средство для анализа уровня экспрессированного генетического материала в конкретном образце с реальной возможностью использования для сравнения уровней экспрессии многих генов одновременно. Имеется несколько коммерческих платформ микрочипов для экспериментов такого типа, но также есть возможность создания чипов на заказ для анализа экспрессии генов.
Несмотря на то, что применение микрочипов в исследованиях экспрессии генов сейчас широко распространено, очевидно, что набирают ход новые и более совершенные, так называемые технологии "секвенирования ДНК следующего поколения" (NGS), для замены ДНК-микрочипов во многих практических применениях, например при использовании в глубоком транскриптомном анализе.
Разработка технологий NGS для ультра-быстрого секвенирования генома является ключевой точкой в области наук о живой природе (Petterson E. et at., Genomics, 2009, 93: 105-11). Эти новые технологии существенно снизили стоимость секвенирования ДНК и сделали возможным определение генома высших организмов с беспрецедентной скоростью, включая геномы конкретных индивидуумов (Wade CM. et al., Science, 2009, 326: 865-7; Rubin J. et al., Nature, 2010, 464: 587-91). Эти новые достижения высокопроизводительной геномики изменили ландшафт биологических исследований и, в дополнение к полному определению характеристик геномов, также появилась возможность для исследования полного транскриптома в цифровом и количественном отношении. Средства биоинформатики для визуализации и объединения этих обширных наборов данных были также значительно улучшены в последние годы.
Однако неожиданно оказалось, что уникальная комбинация гистологических методов, методов с использованием микрочипов и NGS-методов может обеспечить получение обширной транскрипционной или геномной информации из многочисленных клеток в образце ткани, информации характеризующейся двумерным пространственным разрешением. Так, в одном предельном случае способы по настоящему изобретению могут быть использованы для анализа экспрессии единичного гена в одной клетке образца с сохранением клетки в пределах ее окружения в образце ткани. В другом предельном случае и в предпочтительном аспекте изобретения данные способы могут быть использованы для определения экспрессии каждого из генов в каждой клетке или по существу во всех клетках в образце одновременно, т.е. для определения картины общей пространственной экспрессии в образце ткани. Очевидно, что способы по изобретению также позволяют проводить промежуточные анализы.
В своей простейшей форме изобретение может быть проиллюстрировано следующим кратким изложением. Изобретение предусматривает наличие праймеров для обратной транскрипции (ОТ), которые также содержат уникальные позиционные метки (области), которые должны быть расположены на целевой подложке, например стеклянном слайде, с целью создания "чипа". Уникальные позиционные метки соответствуют локализации ОТ-праймеров на чипе (элементы чипа). На данный чип помещают тонкие срезы ткани и проводят реакцию обратной транскрипции в срезе ткани на целевом слайде. ОТ-праймеры, с которыми РНК из образца ткани связывается (или гибрид изуется), удлиняют, используя связавшуюся РНК в качестве матрицы, с получением кДНК, которая ввиду этого оказывается связанной с поверхностью чипа. Как следствие наличия уникальных позиционных меток в ОТ-праймерах, каждая нить кДНК несет информацию о расположении матричной РНК в срезе ткани. Срез ткани может быть визуализирован, или может быть получено его изображение, например, срез ткани может быть окрашен и сфотографирован до или после стадии синтеза кДНК, чтобы позиционная метка в молекуле кДНК коррелировала с расположением в образце ткани. Проводят секвенирование кДНК, в результате чего получают транскриптом с полной информацией о положении. Схема данного способа показана на Фиг.1. Данные о последовательностях затем могут быть сопоставлены с расположением в образце ткани, что дает возможность осуществить визуализацию, например с использованием компьютера, данных о последовательностях вместе со срезом ткани, например для отображения картины экспрессии какого-либо представляющего интерес гена в целом по ткани (Фиг.2). Подобным же образом можно отметить разные области среза ткани на экране компьютера и получить информацию о дифференциально экспрессируемых генах между любыми представляющими интерес выбранными областями. Очевидно, что применение способов по изобретению приводит к получению данных, которые резко контрастируют с данными, полученными с использованием современных способов исследования популяций мРНК. Например, способы, основанные на гибридизации in situ, обеспечивают получение только относительной информации в виде транскриптов единичной мРНК. Таким образом, способы по настоящему изобретению обладают очевидными преимуществами по сравнению с современными технологиями in situ. Информация об общей экспрессии генов, которую можно получить с использованием способов по изобретению, также дает возможность получения информации о совместной экспрессии и количественных оценок присутствия транскриптов. Очевидно, что это будет широко применимая стратегия, подходящая для анализа любой ткани из любых видов, например животного, растения, гриба.
Из того, что отмечалось выше и описано более подробно ниже, будет очевидно, что эта основная методология без труда может быть распространена на анализ геномной ДНК, например для идентификации клеток в образце ткани, которые содержат одну или более чем одну конкретную мутацию. Например, геномную ДНК можно фрагментировать и предоставить ей возможность гибридизоваться с праймерами (эквивалентными ОТ-праймерам, описанным выше), которые способны захватывать фрагментированную ДНК (например, с фрагментированной ДНК может быть лигирован адаптер, имеющий последовательность, которая комплементарна праймеру, или фрагментированная ДНК может быть удлинена, например с использованием фермента, для встраивания дополнительных нуклеотидов на конце последовательности, например поли(А)-хвоста, для создания последовательности, которая комплементарна праймеру), и праймировать синтез нитей, комплементарных захватывающим молекулам. Остальные стадии анализа могут быть такими, как описано выше. Таким образом, конкретные воплощения изобретения, описанные ниже в случае транскриптомного анализа, также могут быть применены в способах анализа геномной ДНК там, где это целесообразно.
Из приведенных выше объяснений будет очевидно, что огромное значение имеет сочетание информации о положении с информацией о транскриптоме или геноме. Например, это дает возможность проведения общего картирования генной экспрессии с высоким разрешением, что будет полезно в многочисленных практических применениях, включая, например, исследования рака и диагностику.
Кроме того, очевидно, что способы, изложенные в данном описании, значительно отличаются от описанных ранее способов анализа общего транскриптома образца ткани, и эти отличия дают многочисленные преимущества. Настоящее изобретение основывается на неожиданном открытии того, что применение срезов тканей не нарушает синтеза ДНК (например, кДНК), праймированного праймерами (например, праймерами обратной транскрипции), которые присоединены к поверхности чипа.
Таким образом, в его первом и наиболее широком аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ локализованной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани, включающий:
(а) предоставление чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера в реакции удлинения или лигирования праймера, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область;
(б) приведение указанного чипа в контакт с образцом ткани таким образом, что положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани, и предоставление возможности нуклеиновой кислоте образца ткани гибридизоваться с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах;
(в) синтез молекул ДНК на основе захваченных молекул нуклеиновой кислоты с использованием указанных захватывающих зондов в качестве праймеров удлинения или лигирования, где указанные удлиненные или лигированные молекулы ДНК являются мечеными благодаря позиционной области;
(г) возможно синтез комплементарной нити указанной меченой ДНК и/или возможно амплификацию указанной меченой ДНК;
(д) высвобождение по меньшей мере части меченых молекул ДНК и/или их комплементов или ампликонов с поверхности чипа, где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент;
(е) прямой или опосредованный анализ последовательности высвобожденных молекул ДНК.
Способы по изобретению представляют собой значительный шаг вперед по сравнению с другими способами пространственной транскриптомики, известными в данной области. Например, способы, изложенные в данном описании, позволяют получить общий и пространственный профиль всех транскриптов в образце ткани. Кроме того, может быть осуществлено количественное определение экспрессии каждого гена для каждого положения или элемента на чипе, что дает возможность осуществления большого числа анализов на основе данных одного анализа. Таким образом, способы по настоящему изобретению дают возможность детекции и/или количественного определения пространственной экспрессии всех генов в единичном образце ткани. Кроме того, поскольку визуализация присутствия транскриптов не производится непосредственно, например, с использованием флуоресценции, как в случае стандартного микрочипа, то возможно одновременное измерение экспрессии генов в единичном образце даже в том случае, когда указанные транскрипты присутствуют в том же образце в очень разных концентрациях.
Соответственно, можно отметить, что во втором и более конкретном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ определения и/или анализа транскриптома образца ткани, включающий:
(а) предоставление чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера обратной транскриптазы (ОТ), где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область;
(б) приведение указанного чипа в контакт с образцом ткани таким образом, что положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани, и предоставление возможности РНК образца ткани гибридизоваться с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах;
(в) синтез молекул кДНК на основе захваченных молекул РНК с использованием указанных захватывающих зондов в качестве ОТ-праймеров и возможно амплификацию указанных молекул кДНК;
(г) высвобождение по меньшей мере части молекул кДНК и/или возможно их ампликонов с поверхности чипа, где указанная высвобожденная молекула может представлять собой первую нить и/или вторую нить молекулы кДНК или ее ампликон, и где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент;
(д) прямой или опосредованный анализ последовательности высвобожденных молекул.
Как описано более подробно ниже, на стадии анализа может быть использован любой метод анализа нуклеиновой кислоты. В типичном случае он может включать секвенирование, но нет необходимости проводить фактическое определение последовательности. Например, можно использовать специфичные к последовательности методы анализа. Например, может быть осуществлена специфичная к последовательности реакция амплификации, например с использованием праймеров, специфичных к позиционной области и/или к специфической целевой последовательности, например конкретной целевой ДНК, детекцию которой необходимо осуществить (т.е. соответствующей конкретной кДНК/РНК или гену и т.д.). Типичным методом анализа является специфичная к последовательности ПЦР-реакция.
Информация из анализа последовательности на стадии (д) может быть использована для получения пространственной информации об РНК в образце. Другими словами, информация из анализа последовательности может обеспечить получение информации о локализации РНК в образце. Эта пространственная информация может вытекать из природы информации, полученной из анализа последовательности, например, она может отражать наличие конкретной РНК, которая сама может быть информативна в пространственном отношении в случае используемого образца ткани, и/или пространственная информация (например, пространственная локализация) может вытекать из положения образца ткани на чипе, в сочетании с информацией, полученной в результате секвенирования. Таким образом, способ может включать только сопоставление информации из анализа последовательностей с положением в образце ткани, например, на основании позиционной метки и ее корреляции с положением в образце ткани. Однако, как описано выше, пространственная информация соответственно может быть получена посредством сопоставления данных из анализа последовательности с изображением образца ткани, и это представляет собой одно из предпочтительных воплощений изобретения. Соответственно, в предпочтительном воплощении способ также включает стадию:
(е) сопоставления информации из анализа указанной последовательности с изображением указанного образца ткани, где изображение образца ткани получают до или после стадии (в).
В своем самом широком смысле способ по изобретению может быть использован для локализованной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани. Таким образом, в одном из воплощений способ по изобретению может быть использован для определения и/или анализа всего транскриптома или генома образца ткани, например общего транскриптома образца ткани. Однако, способ этим не ограничен и охватывает определение и/или анализ всего или части транскриптома или генома. Таким образом, способ может включать в себя определение и/или анализ части или подмножества транскриптома или генома, например транскриптома, соответствующего подмножеству генов, например набору конкретных генов, например имеющих отношение к конкретному заболеванию или состоянию, типу ткани и т.д.
С точки зрения другого аспекта, изложенные выше стадии способа можно рассматривать в качестве предложения способа получения определяемого в пространстве транскриптома или генома и в частности определяемого в пространстве общего транскриптома или генома образца ткани.
С альтернативной точки зрения способ по изобретению можно рассматривать как способ локализованной или пространственной детекции нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, в образце ткани либо локализованного или пространственного определения и/или анализа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в образце ткани. В частности, данный способ можно использовать для локализованной или пространственной детекции либо определения и/или анализа экспрессии генов или геномной вариации в образце ткани. Термин "локализованная/пространственная детекция/определение/анализ" означает, что РНК или ДНК может быть локализована в соответствии с ее природным положением или природной локализацией внутри клетки или ткани в образце ткани. Так, например, РНК или ДНК может быть локализована в клетке, или группе клеток, или типе клеток в образце либо в конкретных участках областей в образце ткани. Можно определить природную локализацию или природное положение РНК или ДНК (или другими словами, локализацию или положение РНК или ДНК в образце ткани), например экспрессированного гена или геномного локуса.
Также можно отметить, что согласно изобретению предложен чип для применения в способах по изобретению, содержащий подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера обратной транскриптазы (ОТ), где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область для захвата РНК образца ткани, который контактирует с указанным чипом.
В родственном аспекте согласно настоящему изобретению также предложено применение чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающего зонда, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера обратной транскриптазы (ОТ), где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область;
для захвата РНК образца ткани, который контактирует с указанным чипом.
Предпочтительно, указанное применение предназначено для определения и/или анализа транскриптома и, в частности, общего транскриптома образца ткани, и дополнительно содержит стадии:
(а) синтеза молекул кДНК на основе захваченных молекул РНК с использованием указанных захватывающих зондов в качестве ОТ-праймеров и возможно амплификации указанных молекул кДНК;
(б) высвобождения по меньшей мере части молекул кДНК и/или возможно их ампликонов с поверхности чипа, где указанная высвобожденная молекула может представлять собой первую нить и/или вторую нить молекулы кДНК или ее ампликон, и где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент;
(в) прямого или опосредованного анализа последовательности высвобожденных молекул; и возможно
(г) сопоставления информации, полученной из указанного анализа последовательности, с изображением указанного образца ткани, при этом изображение образца ткани получают до или после стадии (а).
В силу вышесказанного можно отметить, что чип по настоящему изобретению может быть использован для захвата РНК, например мРНК, образца ткани, который контактирует с указанным чипом. Данный чип также можно использовать для определения и/или анализа частичного или общего транскриптома образца ткани или для получения определяемого в пространстве частичного или общего транскриптома образца ткани. Способы по данному изобретению могут, таким образом, рассматриваться как способы количественного определения пространственной экспрессии одного или более генов в образце ткани. Выражаясь по-другому, способы по настоящему изобретению могут быть использованы для детекции пространственной экспрессии одного или более генов в образце ткани. Иными словами, способы по настоящему изобретению могут быть использованы для одновременного определения экспрессии одного или более генов в одном или более положениях в образце ткани. Более того, данные способы можно рассматривать как способы частичного или общего транскриптомного анализа образца ткани с двумерным пространственным разрешением.
РНК может представлять собой любую молекулу РНК, которая может присутствовать в клетке. Так, она может представлять собой мРНК, тРНК (транспортная РНК), рРНК (рибосомальная РНК), вирусную РНК, малую ядерную РНК (мяРНК), малую ядрышковую РНК (мякРНК), микроРНК, малую интерферирующую РНК (миРНК), РНК, взаимодействующую по piwi-типу (piRNA), РНК рибозимов, антисмысловую РНК или некодирующую РНК. Однако предпочтительно, чтобы она представляла собой мРНК.
Считается, что стадия (в) приведенного выше способа (соответствующая стадии (а) в формулировке предпочтительного применения, изложенного выше) синтеза кДНК на основании захваченной РНК относится к синтезу кДНК. Она будет включать в себя стадию обратной транскрипции захваченной РНК, удлинения захватывающего зонда, действующего как ОТ-праймер, использование захваченной РНК в качестве матрицы. В результате осуществления этой стадии синтезируется так называемая первая нить кДНК. Как будет описано более подробно ниже, синтез второй нити кДНК возможно может происходить на чипе или может происходить как отдельная стадия после высвобождения первой нити кДНК с чипа. Так же, как более подробно описано ниже, в некоторых воплощениях синтез второй нити может происходить на первой стадии амплификации высвобожденной первой нити молекулы кДНК.
Ниже рассмотрены и описаны чипы для применения в случае анализа нуклеиновых кислот в целом и анализа ДНК в частности. Конкретные детали и воплощения, изложенные в данном описании в отношении чипов и захватывающих зондов для применения в случае РНК, в равной степени применимы (там, где это целесообразно) ко всем подобным чипам, включая таковые для применения с ДНК.
Как использовано в данном описании, термин "многочисленный" означает два или более, либо по меньшей мере два, например 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 400, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 или более и т.д. Так, например, число захватывающих зондов может представлять собой любое целое число в любом диапазоне между любыми двумя вышеупомянутыми числами. Однако, следует иметь в виду, что предполагается возможность использования чипов традиционного типа со многими сотнями, тысячами, десятками тысяч, сотнями тысяч или даже миллионами захватывающих зондов.
Таким образом, в способах, изложенных в данном описании, используют чипы с высокой плотностью нуклеиновых кислот, содержащие "захватывающие зонды" для захвата и мечения транскриптов из всех одиночных клеток в образце ткани, например в тонком слое образца ткани или "срезе". Образцы ткани или срезы для анализа получают строго параллельным образом, так что пространственная информация в срезе сохраняется. Захваченные молекулы РНК (предпочтительно мРНК) для каждой клетки или "транскриптомы" транскрибируются в кДНК, и полученные молекулы кДНК анализируют, например, с использованием высокопроизводительного секвенирования. Полученные данные могут быть сопоставлены с изображениями исходных образцов ткани, например срезов, с использованием так называемых штрихкодовых последовательностей (или ID-меток, определенных в данном описании как позиционные области), введенных в образующие чип нуклеиновокислотные зонды.
Чипы с высокой плотностью нуклеиновых кислот или микрочипы являются основным компонентом способа пространственного мечения транскриптома, изложенного в данном описании. Технология микрочипов представляет собой мультиплексную технологию, используемую в молекулярной биологии. Типичный микрочип состоит из образующей чип серии микроскопических пятен олигонуклеотидов (в один чип могут быть введены сотни тысяч пятен, как правило, десятки тысяч). Определенное положение каждого пятна нуклеиновой кислоты (олигонуклеотида) (каждой разновидности олигонуклеотида/молекулы нуклеиновой кислоты) известно как "элемент" (и, следовательно, в изложенных выше способах каждая разновидность захватывающего зонда может рассматриваться как специфический элемент чипа; каждый элемент занимает определенное положение на чипе) и в типичном случае каждый отдельный элемент содержит в пикомольном диапазоне (10-12 моль) молекулы ДНК с конкретной последовательностью ("разновидности"), которые известны как "зонды" (или "репортеры"). В типичном случае они могут представлять собой короткий участок гена или другой элемент нуклеиновой кислоты, с которым образец кДНК или кРНК (или "мишень") может гибридизоваться в строгих условиях. Однако, как описано ниже, зонды по настоящему изобретению отличаются от зондов стандартных микрочипов.
В микрочипах, предназначенных для анализа экспрессии генов, гибридизацию зонд-мишень как правило детектируют и количественно определяют путем детекции оптического сигнала, например от флуорофора, иона серебра или хемилюминесцентной метки, которые были введены во все мишени. Интенсивность оптического сигнала коррелирует с относительным содержанием каждой целевой нуклеиновой кислоты в образце. Поскольку чип может содержать десятки тысяч зондов, в эксперименте с использованием микрочипов можно выполнять много генетических тестов параллельно.
В стандартных микрочипах зонды присоединены к твердой поверхности или подложке посредством ковалентной связи с химическим матриксом, например эпоксисиланом, аминосиланом, лизином, полиакриламидом и т.д. Подложка обычно представляет собой стеклянный, пластмассовый или кремниевый чип или слайд, хотя известны и другие платформы для микрочипов, например микроскопические гранулы.
Зонды могут быть присоединены к чипу по изобретению с использованием любых подходящих способов. В предпочтительном воплощении зонды иммобилизуют на подложке чипа путем химической иммобилизации. Она может быть результатом взаимодействия между подложкой (материалом подложки) и зондом, основанного на химической реакции. Подобная химическая реакция обычно не зависит от поступления энергии в виде тепла или света, но может быть ускорена либо в результате использования тепла, например при определенной оптимальной для химической реакции температуре, либо использования света определенной длины волны. Например, химическая иммобилизация может происходить в результате взаимодействия между функциональными группами на подложке и соответствующими функциональными элементами зондов. Такие соответствующие функциональные элементы зондов могут либо представлять собой собственную химическую группу зонда, например гидроксильную группу, либо могут быть введены дополнительно. Примером такой функциональной группы является аминогруппа. Обычно иммобилизуемый зонд содержит функциональную аминогруппу или химически модифицирован так, чтобы содержать функциональную аминогруппу. Средства и способы для такой химической модификации хорошо известны.
Локализация указанной функциональной группы в предназначенном для иммобилизации зонде может быть использована для того, чтобы регулировать и формировать протекание процесса связывания зонда и/или ориентацию зонда, например, функциональная группа может быть расположена на 5′- или 3′-конце зонда или внутри последовательности зонда. Типичная подложка для иммобилизации зонда содержит группировки, которые способны связываться с такими зондами, например нуклеиновыми кислотами с функционализированными аминогруппами. Примерами таких подложек являются карбокси-, альдегид- или эпокси-содержащие подложки. Подобные материалы известны специалисту в данной области. Функциональные группы, обеспечивающие протекание реакции присоединения между зондами, которые являются химически реакционноспособными благодаря введению аминогруппы, и подложками чипов, известны специалисту в данной области.
Альтернативные подложки, на которых могут быть иммобилизованы зонды, можно химически активировать, например, посредством активации функциональных групп, доступных на подложке чипа. Термин "активированная подложка" относится к материалу, в котором взаимодействующие или реакционноспособные химические функциональные группы были созданы или в который они были включены с использованием методик химической модификации, известных специалисту в данной области. Например, подложка, содержащая карбоксильные группы, должна быть активирована перед применением. Кроме того, имеются доступные подложки, содержащие функциональные группы, которые могут реагировать со специфическими группировками, уже имеющимися в нуклеиновокислотных зондах.
Альтернативно, зонды могут быть синтезированы непосредственно на подложке. Подходящие способы для такого подхода известны специалисту в данной области. Примерами являются производственные методы, разработанные в Agilent Inc., Affymetrix Inc., Roche Nimblegen Inc. или Flexgen BV. В типичном случае используют лазеры и набор зеркал, которые специфически активируют пятна, в которые должны быть добавлены нуклеотиды. Применение такого подхода может обеспечить, например, получение пятен с размером (т.е. с размером элемента) примерно 30 мкм или больше.
Таким образом, подложкой может являться любая подходящая подложка, известная специалисту в данной области. Подложка может иметь любую подходящую форму или формат, например она может быть плоской, изогнутой, например выпуклой или вогнутой по отношению к области, где происходит взаимодействие между образцом ткани и подложкой. Особенно предпочтительно, когда подложка является плоской, т.е. плоским чипом или слайдом.
В типичном случае подложка представляет собой твердую подложку, и это дает возможность осуществлять точное и контролируемое расположение зондов на подложке. Примером подложки является твердый материал или подложка, содержащая функциональные химические группы, например аминогруппы или амин-функционализированные группы. Подложка, предусмотренная настоящим изобретением, представляет собой непористую подложку. Предпочтительными непористыми подложками являются стекло, кремний, покрытый поли-L-лизином материал, нитроцеллюлоза, полистирол, сополимеры циклических олефинов (СОС), полимеры циклических олефинов (СОР), полипропилен, полиэтилен и поликарбонат.
Может быть использован любой подходящий материал, известный специалисту в данной области. В типичном случае используют стекло или полистирол. Полистирол является гидрофобным материалом, подходящим для связывания отрицательно заряженных макромолекул, поскольку он в норме содержит небольшое количество гидрофильных групп. Для нуклеиновых кислот, иммобилизованных на стеклянных слайдах, также известно, что их иммобилизация может быть улучшена в результате увеличения гидрофобности поверхности стекла. Подобная оптимизация условий может позволить получить относительно более плотную упаковку. В дополнение к нанесению покрытия или обработке поверхности поли-L-лизином, подложка, в частности стеклянная, может быть обработана посредством силанирования, например, обработана эпоксисиланом или аминосиланом, или посредством силинирования, или обработана полиакриламидом.
В продаже имеется ряд стандартных чипов и как количество элементов, так и размер элемента может варьировать. Согласно настоящему изобретению расположение элементов может быть изменено в соответствии с размером и/или плотностью клеток, присутствующих в разных тканях или организмах. Например, животные клетки в типичном случае характеризуются поперечным сечением в диапазоне 1-100 мкм, в то время как размер поперечного сечения растительных клеток в типичном случае может лежать в диапазоне 1-10000 мкм. Следовательно, имеющиеся в продаже чипы от Nimblegen®, содержащие до 2,1 миллиона элементов, или до 4,2 миллиона элементов, и с размерами элемента 13 микрометров, могут быть предпочтительными для образцов ткани из животного или гриба, в то время как другие форматы, например содержащие 8×130 т (тысяч) элементов, могут быть достаточными для образцов растительной ткани. Кроме этого, в продаже имеются выпускаемые промышленностью чипы, которые используют в области анализа последовательностей и, в частности, в области NGS-технологий. Такие чипы также могут быть использованы в качестве поверхностей чипов по настоящему изобретению, например, может быть использован чип фирмы Illumina на основе гранул. В дополнение к имеющимся в продаже чипам, которые сами по себе могут быть изготовлены на заказ, на заказ можно изготовить нестандартные чипы "собственной разработки" и способы создания чипов хорошо известны. В способах по изобретению можно использовать как стандартные, так и нестандартные чипы, содержащие зонды, как определено ниже.
Зонды на микрочипе могут быть иммобилизованы, т.е. присоединены к чипу или связаны с чипом предпочтительно через 5′- или 3′-конец в зависимости от химического матрикса чипа. В типичном случае, для имеющихся в продаже чипов, зонды присоединяют связью через 3′-конец, при этом 5′-конец остается свободным. Однако также доступны чипы, содержащие зонды, присоединенные к подложке связью через 5′-конец, при этом свободным остается 3′-конец, и они могут быть синтезированы с использованием стандартных методов, которые хорошо известны в данной области и изложены в другом месте данного описания.
Ковалентную связь, используемую для присоединения нуклеиновокислотного зонда к подложке чипа, можно рассматривать как в качестве непосредственной, так и в качестве опосредованной связи, в том смысле, что, несмотря на то, что зонд соединен "непосредственной" ковалентной связью, может существовать химическая группировка или линкер, отделяющие "первый" нуклеотид нуклеиновокислотного зонда от, например, стеклянной или кремниевой подложки, т.е. в этом случае связь является опосредованной. Для решения задач настоящего изобретения зонды, которые иммобилизованы на подложке с использованием ковалентной связи и/или химического линкера, в целом рассматриваются как иммобилизованные или присоединенные непосредственно к подложке.
Как будет описано более подробно ниже, захватывающие зонды по изобретению могут быть иммобилизованы на чипе или могут взаимодействовать с чипом непосредственно или опосредованно. Так, нет необходимости в непосредственном связывании захватывающих зондов с чипом, но они могут взаимодействовать опосредованно, например, в результате связывания с молекулой, которая сама связывается непосредственно или опосредованно с чипом (например, захватывающий зонд может взаимодействовать (например, связываться или гибридизоваться) с партнером захватывающего зонда по связыванию, т.е. поверхностным зондом, который сам связан с чипом непосредственно или опосредованно). В целом, однако, захватывающий зонд будет непосредственно или опосредованно (через одно или более чем одно промежуточное соединение) связан с чипом или иммобилизован на чипе.
Применение, способ и чип по изобретению могут содержать зонды, которые иммобилизованы через свой 5′- или 3′-конец. Однако, в тех случаях когда захватывающий зонд иммобилизован непосредственно на подложке чипа, он может быть иммобилизован только таким образом, что 3′-конец захватывающего зонда является свободным для того, чтобы было возможным его удлинение, например иммобилизован через свой 5′-конец. Захватывающий зонд может быть иммобилизован опосредованно, таким образом, чтобы он имел свободный, т.е. удлиняемый 3′-конец.
Под удлиненным или удлиняемым 3′-концом понимают то, что дополнительные нуклеотиды могут быть добавлены к последнему 3′-нуклеотиду молекулы нуклеиновой кислоты, например к захватывающему зонду, для увеличения длины молекулы нуклеиновой кислоты, т.е. для удлинения молекул нуклеиновой кислоты может быть использована стандартная реакция полимеризации, например матричной полимеризации, катализируемая полимеразой.
Так, в одном из воплощений чип содержит зонды, которые иммобилизованы непосредственно через свой 3′-конец, так называемые поверхностные зонды, которые определены ниже. Каждая разновидность поверхностного зонда содержит область, комплементарную каждой разновидности захватывающего зонда, так что захватывающий зонд может гибридизоваться с поверхностным зондом, в результате получается захватывающий зонд, содержащий свободный удлиняемый 3′-конец. В предпочтительном аспекте изобретения, когда чип содержит поверхностные зонды, захватывающие зонды синтезируют in situ на данном чипе.
Зонды чипа могут быть составлены из рибонуклеотидов и/или дезоксирибонуклеотидов, а также из остатков синтетических нуклеотидов, способных участвовать во взаимодействиях пар оснований по типу Уотсона-Крика или аналогичных им. Так, нуклеиновокислотная область может представлять собой ДНК или РНК или любую их модификацию, например ПНК (пептидо-нуклеиновая кислота) или другие производные, содержащие ненуклеотидые остовы. Однако, в случае транскриптомного анализа, захватывающая область захватывающего зонда должна быть способна праймировать реакцию обратной транскрипции с образованием кДНК, которая комплементарна захваченным молекулам РНК. Как более подробно описано ниже, в случае анализа генома, захватывающая область захватывающего зонда должна быть способна связываться с фрагментами ДНК, что может включать в себя связывание со связывающей областью, которая была добавлена к фрагментированной ДНК. В некоторых воплощениях захватывающая область захватывающего зонда может праймировать реакцию удлинения ДНК (полимераза) с образованием ДНК, которая комплементарна захваченным молекулам ДНК. В других воплощениях захватывающая область может служить матрицей для реакции лигирования между захваченными молекулами ДНК и поверхностным зондом, который непосредственно или опосредованно иммобилизован на подложке. В других воплощениях захватывающая область может быть лигирована с одной нитью захваченных молекул ДНК.
В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере захватывающая область захватывающего зонда содержит дезоксирибонуклеотиды (dNTP) или состоит из дезоксирибонуклеотидов. В особо предпочтительном воплощении весь захватывающий зонд содержит дезоксирибонуклеотиды или полностью состоит из дезоксирибонуклеотидов.
В предпочтительном воплощении изобретения захватывающие зонды иммобилизованы на подложке чипа непосредственно, т.е. через свой 5′-конец, в результате чего они имеют свободный удлиняемый 3′-конец.
Захватывающие зонды по изобретению содержат по меньшей мере две области, захватывающую область и позиционную область (метку или область идентификации элемента; позиционная область может альтернативно быть определена как идентификационная (ID) область или метка или как позиционная метка). Захватывающий зонд может дополнительно содержать универсальную область, как определено далее ниже. Когда захватывающий зонд опосредованно присоединяется к поверхности чипа в результате гибридизации с поверхностным зондом, необходимо, чтобы захватывающий зонд содержал последовательность (например, часть или область), которая комплементарна последовательности поверхностного зонда. Такая комплементарная последовательность может быть комплементарной к позиционной/идентификационной области и/или универсальной области поверхностного зонда. Другими словами, позиционная область и/или универсальная область могут составлять участок или часть зонда, которая комплементарна последовательности поверхностного зонда. Однако захватывающий зонд может также содержать дополнительную область (или участок, часть или последовательность), которая комплементарна последовательности поверхностного зонда. Как описано более подробно ниже, такой участок, комплементарный последовательности поверхностного зонда, может быть предусмотрен для простоты синтеза, как часть или как результат удлинения захватывающей области (как часть или результат удлинения, которые не будут использоваться для связывания с целевой нуклеиновой кислотой, например РНК, или не способны к такому связыванию).
Захватывающая область в типичном случае локализована на 3′-конце захватывающего зонда и содержит свободный 3′-конец, который может быть удлинен, например, посредством матричной полимеризации. Захватывающая область содержит нуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, например РНК (предпочтительно мРНК), присутствующей в клетках образца ткани, контактирующего с чипом.
Предпочтительно, захватывающая область может быть выбрана или сконструирована так, чтобы связываться (или, в более общем смысле, чтобы быть способной к связыванию) избирательно или специфически с конкретной нуклеиновой кислотой, например РНК, которую желательно детектировать или анализировать. Например, захватывающая область может быть выбрана или синтезирована для избирательного захвата мРНК. Как хорошо известно в данной области, это можно осуществить на основе гибридизации с поли(А)-хвостом мРНК. Таким образом, в предпочтительном воплощении захватывающая область содержит поли(Т)-ДНК-олигонуклеотид, т.е. серии следующих один за другим остатков дезокситимидина, соединенных фосфодиэфирными связями, который способен гибридизоваться с поли(А)-хвостом мРНК. Альтернативно, захватывающая область может содержать нуклеотиды, которые являются функционально или структурно аналогичными поли(Т), т.е. способными избирательно связываться с поли(А), например поли(U)-олигонуклеотид или олигонуклеотид, содержащий аналоги дезокситимидина, при этом указанный олигонуклеотид сохраняет функциональное свойство связываться с поли(А). В конкретном предпочтительном воплощении захватывающая область или более конкретно, поли(Т)-элемент захватывающей области, содержит по меньшей мере 10 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов. В следующем воплощении, захватывающая область или более конкретно, поли(Т)-элемент захватывающей области содержит по меньшей мере 25, 30 или 35 нуклеотидов.
Для захвата нуклеиновой кислоты также могут быть использованы случайные последовательности, как известно в данной области, например случайные гексамеры или сходные последовательности и, следовательно, такие случайные последовательности могут быть использованы для формирования всей захватывающей области или ее части. Например, случайные последовательности могут быть использованы вместе с поли(Т)-(или аналогичными поли(Т)- и т.д.) последовательностями. Так, когда захватывающая область содержит поли(Т)- (или "поли(Т)-подобный") олигонуклеотид, она также может содержать случайную олигонуклеотидную последовательность. Она может, например, быть расположена в 5′- или 3′-направлении по отношению к поли(Т)-последовательности, например на 3′-конце захватывающего зонда, но точное местоположение такой случайной последовательности не является критическим. Подобная конструкция может облегчать захват начальной части поли(А)-хвоста мРНК. Альтернативно, захватывающая область может целиком представлять собой случайную последовательность. Кроме этого могут быть использованы вырожденные захватывающие области, в соответствии с принципами, известными в данной области.
Захватывающая область может быть способна к избирательному связыванию с желаемым подтипом или подклассом нуклеиновой кислоты, например РНК, например конкретным типом РНК, таким как мРНК или рРНК и т.д., как приведено выше, или с конкретным подклассом данного типа РНК, например, конкретной разновидностью мРНК, например соответствующей конкретному гену или группе генов. Такой захватывающий зонд может быть выбран или синтезирован на основании последовательности РНК, которую желательно захватить. Так, он может представлять собой специфичный к последовательности захватывающий зонд, специфичный к конкретной РНК-мишени или группе мишеней (целевой группе и т.п.). Так, в его основе может лежать последовательность конкретного гена или последовательность конкретного мотива или общая/консервативная последовательность и т.д., в соответствии с принципами, хорошо известными в данной области.
В тех воплощениях, где захватывающий зонд иммобилизован на подложке чипа опосредованно, например в результате гибридизации с поверхностным зондом, захватывающая область может дополнительно содержать расположенную "вверх по течению" последовательность (в направлении 5′ по отношению к последовательности, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой, например с РНК образца ткани), которая способна гибридизоваться с 5′-концом поверхностного зонда. Саму по себе захватывающую область захватывающего зонда можно рассматривать как олигонуклеотид захватывающей области, который может быть использован в синтезе захватывающего зонда в воплощениях, когда захватывающий зонд иммобилизован на чипе опосредованно.
Позиционная область (область идентификации элемента или метка) захватывающего зонда локализована непосредственно или опосредованно "вверх по течению", т.е. ближе к 5′-концу захватывающего зонда - молекулы нуклеиновой кислоты, по отношению к захватывающей области. Предпочтительно, позиционная область непосредственно примыкает к захватывающей области, т.е. между захватывающей областью и позиционной областью нет промежуточной последовательности. В некоторых воплощениях позиционная область формирует 5′-конец захватывающего зонда, который может быть иммобилизован непосредственно или опосредованно на подложке чипа.
Как обсуждалось выше, каждый элемент (определенное положение) чипа содержит пятно с разновидностью нуклеиновокислотного зонда, при этом позиционная область каждого элемента является уникальной. Таким образом, "разновидность" захватывающего зонда определяется со ссылкой на его позиционную область; одна и та же разновидность захватывающего зонда будет иметь одну и ту же позиционную область. Однако, не требуется, чтобы каждый представитель разновидности захватывающего зонда имел одну и ту же последовательность на всей своей протяженности. В частности, поскольку захватывающая область может представлять собой или может содержать случайную или вырожденную последовательность, захватывающие области индивидуальных зондов в пределах разновидности могут варьировать. Соответственно, в некоторых воплощениях, в которых захватывающие области захватывающих зондов являются одинаковыми, каждый элемент содержит одну последовательность зонда. Однако в других воплощениях, в которых последовательность захватывающего зонда варьирует, представители разновидности зонда не будут иметь в точности одинаковую последовательность, хотя последовательность позиционной области каждого представителя разновидности будет одной и той же. Требуется, чтобы каждый элемент или каждое положение чипа содержал(о) захватывающий зонд одной разновидности (в частности, чтобы каждый элемент или каждое положение содержал(о) захватывающий зонд, имеющий идентичную позиционную метку, т.е. чтобы каждому элементу или положению соответствовала одна позиционная область). Каждая разновидность имеет свою позиционную область, которая определяет принадлежность к данной разновидности. Однако, каждый представитель разновидности может в некоторых случаях, которые изложены более подробно в настоящем описании, иметь свою захватывающую область, поскольку захватывающая область может быть случайной или вырожденной, либо содержать случайный или вырожденный компонент. Это означает, что в пределах данного элемента или положения, захватывающие области зондов могут отличаться друг от друга.
Таким образом, в некоторых, но необязательно во всех воплощениях, нуклеотидная последовательность любой молекулы зонда, иммобилизованой в конкретном элементе, будет такой же, как и у молекул других зондов, иммобилизованных в том же элементе, но нуклеотидная последовательность зондов каждого элемента отличается, не совпадает или отличима от нуклеотидной последовательности зондов, иммобилизованых в каждом другом элементе. Предпочтительно, каждый элемент содержит свою разновидность зонда. Тем не менее, в некоторых воплощениях может быть преимущественным для группы элементов содержать одну и ту же разновидность зонда, т.е. эффективным является получение элемента, перекрывающего область чипа, превышающую область, перекрываемую одним элементом, например с целью уменьшения разрешения чипа. В других воплощениях чипа, нуклеотидная последовательность позиционной области любой молекулы зонда, иммобилизованной в конкретном элементе, может быть такой же, как и у других молекул зонда, иммобилизованных в этом же элементе, но захватывающая область может отличаться. Захватывающая область может, однако, быть синтезирована так, чтобы захватывать один и тот же тип молекул, например мРНК в целом.
Позиционная область (или метка) захватывающего зонда содержит последовательность, которая является уникальной для каждого элемента и выполняет функцию позиционного или пространственного маркера (идентификационной метки). Таким образом, каждый участок или каждую область образца ткани, например каждую клетку в ткани, можно будет идентифицировать в результате пространственного разрешения по всему чипу, связывающему нуклеиновую кислоту, например РНК (например, транскрипты) из определенной клетки, используя уникальную последовательность позиционной области в захватывающем зонде. Благодаря позиционной области, положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани, например оно может быть сопоставлено с положением клетки в образце. Таким образом, позиционную область захватывающей области можно рассматривать как нуклеиновокислотную метку (идентификационную метку).
Любая подходящая последовательность может быть использована в качестве позиционной области в захватывающих зондах по изобретению. Под подходящей последовательностью понимают то, что позиционная область не должна мешать взаимодействию между РНК образца ткани и захватывающей областью захватывающего зонда (т.е. ингибировать или искажать это взаимодействие). Например, позиционная область должна быть синтезирована таким образом, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты в образце ткани не гибридизовались специфически с позиционной областью. Предпочтительно, нуклеиновокислотная последовательность позиционной области захватывающих зондов имеет менее 80% идентичности последовательности с нуклеиновокислотными последовательностями в образце ткани. Предпочтительно, позиционная область захватывающего зонда имеет менее 70%, 60%, 50% или менее 40% идентичности последовательности с последовательностями значительной части молекул нуклеиновых кислот в образце ткани. Идентичность последовательностей может быть определена с использованием любого соответствующего способа, известного в данной области, например, с использованием выравнивания с применением алгоритма BLAST.
В предпочтительном воплощении позиционная область каждой разновидности захватывающего зонда содержит уникальную штрихкодовую последовательность. Штрихкодовые последовательности могут быть получены с использованием генератора случайных последовательностей. Генерированные случайным образом последовательности могут далее быть подвергнуты строгому фильтрованию посредством сравнения с картами геномов всех общих эталонных видов и при заранее заданных интервалах Tm, содержании GC-пар и с определенной дистанцией отличия от других штрихкодовых последовательностей, чтобы гарантировать, что данные штрихкодовые последовательности не будут мешать захвату нуклеиновой кислоты, например РНК, из образца ткани и будут различимы между собой без затруднений.
Как упоминалось выше, и в предпочтительном воплощении, захватывающий зонд содержит также универсальную область (или линкерную область или метку). Универсальная область захватывающего зонда локализована непосредственно или опосредованно "вверх по течению", т.е. ближе к 5′-концу захватывающего зонда - молекулы нуклеиновой кислоты, по отношению к позиционной области. Предпочтительно, универсальная область непосредственно примыкает к позиционной области, т.е. между позиционной областью и универсальной областью нет промежуточной последовательности. В воплощениях, где захватывающий зонд содержит универсальную область, данная область будет формировать 5′-конец захватывающего зонда, который может быть иммобилизован непосредственно или опосредованно на подложке чипа.
Универсальная область может быть использована различным образом в способах и применениях по изобретению. Например, способы по изобретению включают стадию высвобождения (например, удаления) по меньшей мере части синтезированных (т.е. удлиненных или лигированных) молекул нуклеиновой кислоты, например кДНК, с поверхности чипа. Как изложено в другом месте данного описания, это может быть достигнуто с использованием ряда способов, один из которых состоит в отщеплении молекулы нуклеиновой кислоты, например кДНК, от поверхности чипа. Таким образом, универсальная область может сама содержать область расщепления, т.е. последовательность, которая может быть расщеплена специфически, либо химически, либо, предпочтительно, ферментативно.
Таким образом, область расщепления может содержать последовательность, которая узнается одним или более чем одним ферментом, способным расщеплять молекулу нуклеиновой кислоты, т.е. способным разрывать фосфодиэфирную связь между двумя или более чем двумя нуклеотидами. Например, область расщепления может содержать последовательность, распознаваемую эндонуклеазой рестрикции (рестрикционным ферментом). Рестрикционные ферменты разрезают двунитевую или однонитевую ДНК в специфически распознаваемых нуклеотидных последовательностях, известных как сайты рестрикции, и подходящие ферменты хорошо известны в данной области. Например, особые преимущества дает применение редкощепящих рестрикционных ферментов, т.е. ферментов с протяженным сайтом распознавания (длиной по меньшей мере 8 пар оснований), для снижения вероятности расщепления в другом месте молекулы нуклеиновой кислоты, например кДНК. В этом отношении будет очевидно, что для удаления или высвобождения по меньшей мере части молекулы нуклеиновой кислоты, например кДНК, требуется высвобождение части, содержащей позиционную область нуклеиновой кислоты, например кДНК, и всей последовательности, расположенной "вниз по течению" по отношению к данной области, т.е. всей последовательности, которая расположена в 3′-направлении по отношению к позиционной области. Следовательно, расщепление молекулы нуклеиновой кислоты, например кДНК, должно осуществляться в 5′-направлении по отношению к позиционной области.
В качестве примера, область расщепления может содержать поли(U)-последовательность, которая может быть расщеплена в результате действия смеси урацил-ДНК-гликозилазы (UDG) и ДНК-гликозилазы-лиазы эндонуклеазы VIII, известной под торговым названием как USER™ enzyme.
Следующий пример области расщепления может быть использован в воплощениях, когда захватывающий зонд иммобилизован на подложке чипа опосредованно, т.е. через поверхностный зонд. Область расщепления может содержать один или более чем один ошибочно спаренный нуклеотид, т.е. когда комплементарные части поверхностного зонда и захватывающего зонда не являются комплементарными на 100%. Такое ошибочное спаривание узнается, например, ферментами MutY и Т7 эндонуклеазой I, что приводит к расщеплению молекулы нуклеиновой кислоты в положении этого ошибочного спаривания.
В некоторых воплощениях изобретения позиционная область захватывающего зонда содержит область расщепления, при этом указанная область расщепления локализована на 5′-конце позиционной области.
Универсальная область может содержать также область амплификации. Она может содержаться в дополнение к области расщепления или вместо области расщепления. В некоторых воплощениях изобретения, как изложено в другом месте данного описания, может иметь преимущество амплифицирование молекул нуклеиновой кислоты, например кДНК, например после того, как они будут высвобождены (например, удалены или отщеплены) с подложки чипа. Следует иметь в виду, однако, что начальный цикл амплификации или, в действительности, любой или все последующие циклы амплификации, также могут происходить in situ на чипе. Область амплификации содержит определенную последовательность, с которой может гибридизоваться амплификационный праймер. Область амплификации универсальной области захватывающего зонда предпочтительно одинакова для каждой разновидности захватывающего зонда. Следовательно, одной реакции амплификации будет достаточно для амплифицирования всей нуклеиновой кислоты, например молекул кДНК (которые могут быть высвобождены с подложки чипа, либо могут не быть высвобождены с подложки чипа перед амплификацией).
Любая подходящая последовательность может быть использована в качестве области амплификации в захватывающих зондах по изобретению. Под подходящей последовательностью понимают то, что область амплификации не должна мешать взаимодействию между нуклеиновой кислотой, например РНК образца ткани, и захватывающей областью захватывающего зонда (т.е. ингибировать или искажать это взаимодействие). Кроме того, область амплификации должна содержать последовательность, которая не является одинаковой или по существу одинаковой с любой последовательностью в нуклеиновой кислоте, например РНК образца ткани, так, чтобы праймер, используемый в реакции амплификации, мог бы гибридизоваться только с областью амплификации в условиях реакции амплификации.
Например, область амплификации должна быть синтезирована так, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты в образце ткани не гибридизовались специфически с областью амплификации или ее комплементом. Предпочтительно, нуклеиновокислотная последовательность области амплификации захватывающих зондов и ее комплемент имеют менее 80% идентичности с нуклеиновокислотными последовательностями в образце ткани. Предпочтительно, позиционная область захватывающего зонда имеет менее 70%, 60%, 50% или менее 40% идентичности последовательности с последовательностями значительной части молекул нуклеиновых кислот в образце ткани. Идентичность последовательностей может быть определена с использованием любого подходящего способа, известного в данной области, например с использованием выравнивания с применением алгоритма BLAST.
Таким образом, саму по себе универсальную область захватывающего зонда можно рассматривать как олигонуклеотид универсальной области, который может быть использован в синтезе захватывающего зонда в воплощениях, когда захватывающий зонд иммобилизован на чипе опосредованно.
В одном из репрезентативных воплощений изобретения только позиционная область каждой разновидности захватывающего зонда является уникальной. Поэтому захватывающие области и универсальные области (если они присутствуют) являются в одном из воплощений одинаковыми для каждой разновидности захватывающего зонда для любого конкретного чипа для обеспечения того, чтобы захват нуклеиновой кислоты, например РНК из образца ткани, происходил равномерно по всему чипу. Однако, как обсуждалось выше, в некоторых воплощениях захватывающие области могут отличаться вследствие включения в них случайных или вырожденных последовательностей.
В тех воплощениях, когда захватывающий зонд иммобилизован на подложке чипа опосредованно, например, в результате гибридизации с поверхностным зондом, захватывающий зонд может быть синтезирован на чипе, как описано ниже.
Поверхностные зонды иммобилизованы на подложке чипа непосредственно, например, через свой 3′-конец или на своем 3′-конце. Каждая разновидность поверхностного зонда является уникальной по отношению к каждому элементу (определенному положению) чипа и частично комплементарной захватывающему зонду, определенному выше.
Следовательно, поверхностный зонд содержит на своем 5′-конце область (комплементарную захватывающую область), комплементарную части захватывающей области, которая не связывается с нуклеиновой кислотой, например РНК образца ткани. Другими словами, он содержит область, которая может гибридизоваться по меньшей мере с частью олигонуклеотида захватывающей области. Поверхностный зонд дополнительно содержит область (комплементарную позиционную область или комплементарную область идентификации элемента), которая является комплементарной позиционной области захватывающего зонда. Комплементарная позиционная область локализована непосредственно или опосредованно "вниз по течению" (т.е. на 3′-конце) по отношению к комплементарной захватывающей области, т.е. может иметься промежуточная или линкерная последовательность, разделяющая комплементарную позиционную область и комплементарную захватывающую область. В воплощениях, когда захватывающий зонд синтезируют на поверхности чипа, поверхностные зонды чипа всегда содержат область (комплементарную универсальную область) на 3′-конце поверхностного зонда, т.е. непосредственно или опосредованно "вниз по течению" по отношению к позиционной области, которая комплементарна универсальной области захватывающего зонда. Другими словами, он содержит область, которая может гибридизоваться по меньшей мере с частью олигонуклеотида универсальной области.
В некоторых воплощениях изобретения последовательность поверхностного зонда демонстрирует 100% комплементарности или идентичности последовательности с позиционной и универсальной областями и частью захватывающей области, которая не связывается с нуклеиновой кислотой, например РНК образца ткани. В других воплощениях, последовательность поверхностного зонда может демонстрировать менее 100% идентичности с последовательностями областей захватывающего зонда, например, менее 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% или 90%. В особо предпочтительном воплощении изобретения, комплементарная универсальная область имеет менее 100% идентичности последовательности с универсальной областью захватывающего зонда.
В одном из воплощений изобретения захватывающий зонд синтезируют или создают на подложке чипа. В репрезентативном воплощении (см. Фиг.3) данный чип содержит поверхностные зонды, как определено выше. Олигонуклеотиды, которые соответствуют захватывающей области и универсальной области захватывающего зонда, приводят в контакт с чипом и дают им возможность гибридизоваться с комплементарными областями поверхностных зондов. Избыток олигонуклеотидов может быть удален посредством промывки чипа в стандартных условиях гибридизации. Полученный чип содержит частично однонитевые зонды, причем оба конца, 5′-и 3′-конец, поверхностного зонда являются двунитевыми, а комплементарная позиционная область является однонитевой. Данный чип может быть обработан ферментом полимеразой для удлинения 3′-конца олигонуклеотида универсальной области зависимым от матрицы образом, с тем, чтобы синтезировать позиционную область захватывающего зонда. 3′-конец синтезированной позиционной области затем лигируют, например, используя фермент лигазу, с 5′-концом олигонуклеотида захватывающей области, чтобы синтезировать захватывающий зонд. В этом отношении будет очевидно, что 5′-конец олигонуклеотида захватывающей области является фосфорилированным, чтобы дать возможность осуществиться лигированию. Поскольку каждая разновидность поверхностного зонда содержит уникальную комплементарную позиционную область, каждая разновидность захватывающего зонда будет содержать уникальную позиционную область.
Термин "гибридизация" или "гибридизуется", как он использован в данном описании, относится к образованию дуплекса между нуклеотидными последовательностями, которые являются в достаточной степени комплементарными для образования дуплексов посредством взаимодействия пар оснований по типу Уотсона-Крика. Две нуклеотидные последовательности являются "комплементарными" одна другой, когда эти молекулы обладают гомологией организации пар оснований. "Комплементарные" нуклеотидные последовательности в силу специфичности будут объединяться с образованием стабильного дуплекса в соответствующих условиях гибридизации. Например, две последовательности являются комплементарными, когда участок первой последовательности может связываться с участком второй последовательности в антипараллельном направлении, причем 3′-конец каждой из последовательностей связывается с 5′-концом другой последовательности и каждый из A, T(U), G и С одной последовательности затем выстраивается напротив T(U), А, С и G, соответственно, другой последовательности. РНК-последовательности могут также включать комплементарные пары оснований G=U или U=G. Таким образом, две последовательности не обязательно должны иметь идеальную гомологию, для того, чтобы быть "комплементарными" согласно изобретению. Обычно две последовательности являются в достаточной мере комплементарными, когда по меньшей мере примерно 90% (предпочтительно по меньшей мере примерно 95%) нуклеотидов обладают соответствующей друг другу организацией пар оснований на протяжении заданной длины молекулы. Области захватывающих и поверхностных зондов, таким образом, содержат участок комплементарности. Кроме того, захватывающая область захватывающего зонда содержит участок комплементарности нуклеиновой кислоте, например РНК (предпочтительно мРНК) образца ткани.
Захватывающий зонд также может быть синтезирован на подложке чипа с использованием удлинения полимеразой (аналогично тому, как описано выше) и с использованием фермента концевой трансферазы для добавления "хвоста", который может составлять захватывающую область. Это описано далее в примере 7, ниже. Применение концевых трансфераз для добавления нуклеотидных последовательностей к концу олигонуклеотида известно в данной области, например с целью введения гомополимерного хвоста, например поли(Т)-хвоста. Соответственно, при проведении такого синтеза, олигонуклеотид, который соответствует универсальной области захватывающего зонда, может быть приведен в контакт с чипом, и ему дают возможность гибридизоваться с комплементарной областью поверхностных зондов. Избыток олигонуклеотидов может быть удален посредством промывки чипа в стандартных условиях гибридизации. Полученный чип содержит частично однонитевые зонды, причем 5′-концы поверхностных зондов являются двунитевыми, а комплементарная позиционная область является однонитевой. Данный чип может быть обработан ферментом полимеразой для удлинения 3′-конца олигонуклеотида универсальной области зависимым от матрицы образом, с тем, чтобы синтезировать позиционную область захватывающего зонда. Для синтеза захватывающего зонда затем с использованием концевой трансферазы, добавляющей поли(Т)-хвост, может быть введена захватывающая область, например содержащая поли(Т) последовательность.
Типичный чип по изобретению и для применения в способах по изобретению может содержать многочисленные пятна или "элементы". Элемент может быть определен как область или определенное положение на подложке чипа, в которой(м) иммобилизована единственная разновидность захватывающего зонда. Следовательно, каждый элемент будет содержать большое количество молекул зонда одной и той же разновидности. В данном контексте следует понимать, что, несмотря на то, что считается, что каждый захватывающий зонд одной и той же разновидности может иметь одну и ту же последовательность, это необязательно соответствует действительности. Каждая разновидность захватывающего зонда будет иметь одну и ту же позиционную область (т.е. каждый представитель разновидности и, следовательно, каждый зонд в элементе, будут одинаково "помеченными"), но последовательность каждого представителя элемента (разновидности) может иметь отличия, поскольку последовательность захватывающей области может варьировать. Как описано выше, могут быть использованы случайные или вырожденные захватывающие области. Таким образом, захватывающие зонды внутри элемента могут содержать различные случайные или вырожденные последовательности. Количество и плотность элементов чипа будет определять разрешение чипа, т.е. уровень детализации, с которой транскриптом или геном образца ткани может быть проанализирован. Следовательно, более высокая плотность элементов будет, как правило, увеличивать разрешение чипа.
Как обсуждено выше, размер и количество элементов чипа по изобретению будут зависеть от природы образца ткани и требуемого разрешения. Так, если желательно определение транскриптома или генома только для участков клеток в образце ткани (или если образец содержит большие клетки), то количество и/или плотность элементов чипа могут быть уменьшены (т.е. меньше, чем возможное максимальное количество элементов) и/или размер элементов может быть увеличен (т.е. площадь каждого элемента может быть больше, чем площадь наименьшего из возможных элементов), например как на чипе, содержащем небольшое количество больших элементов. Альтернативно, если желательно определение транскриптома или генома индивидуальных клеток в образце, может понадобиться применение максимально возможного количества элементов, что потребует использования минимально возможного размера элемента, например как на чипе, содержащем много небольших элементов.
Хотя разрешение на уровне одной клетки может представлять собой предпочтительный и преимущественный признак настоящего изобретения, его достижение не является необходимым, и разрешение на уровне группы клеток также представляет интерес, например для детекции или распознавания конкретного типа клеток или участка ткани, например для установления различий между нормальными и опухолевыми клетками.
В репрезентативных воплощениях изобретения чип может содержать по меньшей мере 2, 5, 10, 50, 100, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000, 10000, 20000, 40000, 50000, 75000, 100000, 150000, 200000, 300000, 400000, 500000, 750000, 800000, 1000000, 1200000, 1500000, 1750000, 2000000, 2100000, 3000000, 3500000, 4000000 или 4200000 элементов. Хотя 4200000 представляет собой максимальное количество элементов, доступное в настоящее время на выпускаемых промышленностью чипах, предполагается, что могут быть изготовлены чипы с количеством элементов, превышающим это число, и такие чипы представляют интерес с точки зрения настоящего изобретения. Как отмечено выше, размер элемента может быть уменьшен, и это может позволить размещать большее количество элементов в пределах одной и той же или аналогичной площади. В качестве примера, эти элементы могут быть размещены в пределах площади менее, чем примерно 20 см2, 10 см2, 5 см2, 1 см2, 1 мм2 или 100 мкм2.
Таким образом, в некоторых воплощениях изобретения площадь каждого элемента может быть от примерно 1 мкм2, 2 мкм2, 3 мкм2, 4 мкм2, 5 мкм2, 10 мкм2, 12 мкм2, 15 мкм2, 20 мкм2, 50 мкм2, 75 мкм2, 100 мкм2, 150 мкм2, 200 мкм2, 250 мкм2, 300 мкм2, 400 мкм2 или 500 мкм2.
Будет очевидно, что в способах по изобретению можно использовать образец ткани из любого организма, например растения, животного или гриба. Чип по изобретению позволяет захватывать любую нуклеиновую кислоту, например молекулы мРНК, которые имеются в клетках, способных к транскрипции и/или трансляции. Чипы и способы по изобретению, в частности, подходят для выделения и анализа транскриптома или генома клеток в образце, когда желательным является получение пространственного разрешения транскриптомов или геномов, например, когда клетки являются взаимосвязанными или непосредственно контактируют с соседними клетками. Однако специалисту в данной области будет очевидно, что способы по изобретению также могут быть полезными для анализа транскриптома или генома различных клеток или типов клеток в образце, даже когда указанные клетки не взаимодействуют непосредственно, например в образце крови. Другими словами, нет необходимости, чтобы клетки находились в составе ткани, и они могут быть нанесены на чип в виде отдельных клеток (например, клеток, выделенных из нефиксированной ткани). Такие отдельные клетки, необязательно фиксированные в определенном положении в ткани, тем не менее, могут быть нанесены в определенное положение на чипе и индивидуально идентифицированы. Таким образом, в случае анализа клеток, которые не взаимодействуют непосредственно или не находятся в составе ткани, могут быть применены пространственные параметры описанных способов для получения или считывания уникальной или независимой информации о транскриптоме или геноме индивидуальных клеток.
Таким образом, образец может представлять собой отобранный на анализ или взятый на биопсию образец ткани или, возможно, образец культивируемой ткани. Репрезентативные образцы включают клинические образцы, например цельную кровь или извлеченные из крови продукты, клетки крови, ткани, биоптаты или культивируемые ткани или клетки и т.д., включая клеточные суспензии. Искусственные ткани, например, могут быть получены из клеточной суспензии (включая, например, клетки крови). Клетки можно заключить в матрикс (например, гелевый матрикс, например агар, агарозу и т.д.) и далее традиционным образом можно приготовить их срезы. Такие методики известны в области иммуногистохимии (см., например, Andersson et al., 2006, J. Histochem. Cytochem. 54(12): 1413-23. Epub 2006 Sep 6).
Способ приготовления ткани и обработки полученного образца может влиять на транскриптомный или геномный анализ в способах по изобретению. Кроме того, различные образцы ткани будут иметь разные физические характеристики, и от квалификации специалиста в данной области зависит выполнение необходимых манипуляций для получения образца ткани для применения в способах по изобретению. Однако, из описаний, изложенных в данном изобретении, очевидно, что для получения образца ткани, подходящего для применения в способах по изобретению, может быть использован любой способ приготовления образца. Например, в способах по изобретению можно использовать любой слой клеток толщиной приблизительно в 1 клетку или меньше. В одном из воплощений толщина образца ткани может составлять менее 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 или 0,1 части поперечного сечения клетки. Однако, поскольку, как отмечалось выше, настоящее изобретение не ограничено разрешением на уровне единичной клетки, то следовательно нет необходимости в том, чтобы образец ткани имел толщину, равную диаметру одной клетки или меньше; при желании можно использовать образцы ткани большей толщины. Например, можно использовать криостатные срезы, толщина которых может составлять, например 10-20 мкм.
Приготовление образца ткани может быть осуществлено любым подходящим или желаемым способом, и изобретение не ограничено каким-либо конкретным типом приготовления ткани. Можно использовать свежие, замороженные, фиксированные или нефиксированные ткани. Для фиксации или заливки образца ткани может быть использована любая желаемая подходящая методика, которая описана и известна в данной области. Следовательно, могут быть использованы любые известные фиксаторы или вещества для заливки тканей.
В качестве первого репрезентативного примера образца ткани для применения в данном изобретении, приготовление ткани можно осуществить посредством глубокого замораживания при температуре, подходящей для поддержания или сохранения целостности (т.е. физических характеристик) структуры ткани, например, менее -20°С и предпочтительно менее -25, -30, -40, -50, -60, -70 или -80°С. Можно приготовить срезы, т.е. тонко нарезанные слои, замороженного образца ткани на поверхности чипа с использованием любого подходящего средства. Например, образец ткани можно приготовить, используя охлажденный микротом, криостат с установленной температурой, подходящей для поддержания как структурной целостности образца ткани, так и химических свойств нуклеиновых кислот в этом образце, например, до температуры менее -15°С и предпочтительно менее -20 или -25°С. Таким образом, образец должен быть обработан таким образом, чтобы свести к минимуму разрушение или деградацию нуклеиновой кислоты, например РНК, в данной ткани. Такие условия хорошо известны в данной области и степень какой-либо деградации можно контролировать посредством выделения нуклеиновой кислоты, например, выделения суммарной РНК, и последующего качественного анализа на различных стадиях приготовления образца ткани.
Во втором репрезентативном примере приготовление ткани можно осуществить с использованием стандартных методов фиксации в формалине и заливки парафином (FFPE), которые хорошо известны в данной области. После фиксации образца ткани и заливки в парафиновый блок или блок из смолы можно приготовить срезы, т.е. тонко нарезанные слои, образцов ткани на чипе. Как отмечалось выше, могут быть использованы другие фиксаторы и/или вещества для заливки тканей.
Очевидно, что срез образца ткани необходимо будет обработать для удаления используемого для заливки вещества, например с целью депарафинизации, т.е. удаления парафина или смолы, из образца перед осуществлением способов по изобретению. Этого можно достичь любым подходящим способом, и способы удаления парафина или смолы или другого вещества из образцов ткани хорошо известны в данной области, например посредством инкубации образца (на поверхности чипа) в соответствующем растворителе, например ксилоле, например, дважды в течение 10 минут, затем промывки этанолом, например 99,5%-ным этанолом в течение 2 минут, 96%-ным этанолом в течение 2 минут и 70%-ным этанолом в течение 2 минут.
Специалисту будет очевидно, что РНК в срезах ткани, полученных с использованием метода FFPE или других методов фиксации и заливки, с большей вероятностью будет частично разрушена по сравнению со случаем использования замороженной ткани. Однако, без связи с какой-либо конкретной теорией, полагают, что это может выгодно в способах по изобретению. Например, если РНК в образце частично разрушена, средняя длина полинуклеотидов РНК будет меньше и в большей степени рандомизирована, чем в образце, не подвергшемся разрушению. Ввиду этого постулируется, что наличие частично разрушенной РНК будет приводить к более низкой систематической ошибке на различных стадиях обработки, изложенных в другом месте данного описания, например при лигировании адаптеров (областей амплификации), амплификации молекул кДНК и их секвенировании.
Таким образом, в одном из воплощений изобретения образец ткани, т.е. срез образца ткани, контактирующего с чипом, получают, используя метод FFPE или другие методы фиксации и заливки. Другими словами, можно осуществить фиксацию образца, например, фиксацию и заливку. В альтернативном воплощении изобретения образец ткани получают, используя глубокое замораживание. В другом воплощении можно использовать контактный отпечаток ткани в соответствии с методиками, известными в данной области. В других воплощениях может быть использован нефиксированный образец.
Толщина среза образца ткани для применения в способах по изобретению может зависеть от использованного способа приготовления образца и физических характеристик ткани. Таким образом, в способах по изобретению может быть использована любая подходящая толщина среза. В репрезентативных воплощениях изобретения толщина среза образца ткани будет составлять по меньшей мере 0,1 мкм, более предпочтительно, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,7, 1,0, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мкм. В других воплощениях толщина среза образца ткани составляет по меньшей мере 10, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 или 50 мкм. Однако толщина не является критичной, и эти значения приведены только в качестве примера. Можно использовать образцы большей толщины, если это желательно или удобно, например 70 или 100 мкм или более. В типичном случае толщина среза образца ткани находится в диапазоне 1-100 мкм, 1-50 мкм, 1-30 мкм, 1-25 мкм, 1-20 мкм, 1-15 мкм, 1-10 мкм, 2-8 мкм, 3-7 мкм или 4-6 мкм, но, как упомянуто выше, можно использовать образцы большей толщины.
При контакте среза образца ткани с чипом, например, после удаления вещества заливки, например депарафинизации, молекулы нуклеиновой кислоты, например РНК, в образце ткани будут связываться с иммобилизованными на чипе захватывающими зондами. В некоторых воплощениях может оказаться выгодным облегчение гибридизации молекул нуклеиновой кислоты, например РНК, с захватывающими зондами. Как правило, облегчение гибридизации включает в себя изменение условий, в которых проходит гибридизация. Основными условиями, которые могут быть изменены, являются продолжительность и температура инкубации среза ткани на чипе перед проведением стадии обратной транскрипции, которая изложена в другом месте данного описания.
Например, при контакте среза образца ткани с чипом можно проводить инкубацию чипа в течение по меньшей мере 1 часа, чтобы обеспечить возможность гибридизации нуклеиновой кислоты, например РНК, с захватывающими зондами. Предпочтительно чип можно инкубировать в течение по меньшей мере 2, 3, 5, 10, 12, 15, 20, 22 или 24 часов или до момента высыхания среза образца ткани. Продолжительность инкубации чипа не является критичной, и можно использовать любую удобную или желаемую продолжительность. Типичная продолжительность инкубации чипа может составлять до 72 часов включительно. Так, инкубацию можно осуществлять при любой подходящей температуре, например при комнатной температуре, хотя в предпочтительном воплощении срез образца ткани инкубируют на чипе при температуре по меньшей мере 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или 37°С. Температура инкубации до 55°С включительно является обычной в данной области техники. В особо предпочтительном воплощении срез образца ткани оставляют высыхать на чипе при 37°С в течение 24 часов. После высыхания среза образца ткани чип можно хранить при комнатной температуре до проведения стадии обратной транскрипции. Очевидно, что если срез образца ткани оставляют высыхать на поверхности чипа, то будет необходимо провести его регидратацию перед проведением дальнейших манипуляций с захваченной нуклеиновой кислотой, например перед стадией обратного транскрибирования захваченной РНК.
Таким образом, способ по изобретению может включать дополнительную стадию регидратации образца ткани после приведения образца в контакт с чипом.
В некоторых воплощениях может оказаться выгодным блокировать (например, маскировать или модифицировать) захватывающие зонды перед приведением в контакт образца ткани с чипом, в частности, когда нуклеиновая кислота в образце ткани является предметом способа модификации до ее захвата на чипе. В частности, может оказаться выгодным блокировать или модифицировать свободный 3′-конец захватывающего зонда. В конкретном воплощении нуклеиновая кислота в образце ткани, например фрагментированная геномная ДНК, может быть модифицирована таким образом, чтобы она могла быть захвачена захватывающим зондом. В качестве примера и как описано более подробно ниже, к концу нуклеиновой кислоты, например фрагментированной геномной ДНК, может быть добавлена адаптерная последовательность (содержащая связывающую область, способную к связыванию с захватывающей областью захватывающего зонда). Этого можно достичь, например, посредством лигирования адаптера или удлинения нуклеиновой кислоты, например с использованием фермента для встраивания дополнительных нуклеотидов в конец последовательности, например поли(А)-хвоста. Перед приведением в контакт образца ткани с чипом необходимо осуществить блокирование или модификацию захватывающих зондов, в частности, свободного 3′-конца захватывающего зонда, чтобы избежать модификации захватывающих зондов, например избежать добавления поли(А)-хвоста к 3′-концу захватывающих зондов. Предпочтительно, чтобы встраивание блокирующей области в захватывающий зонд могло быть осуществлено в процессе его синтеза. Однако блокирующую область можно встраивать в захватывающий зонд после его синтеза.
В некоторых воплощениях захватывающие зонды могут быть блокированы любым подходящим и обратимым способом, который будет препятствовать модификации захватывающих областей в процессе модификации нуклеиновой кислоты образца ткани, который происходит после того, как образец ткани приведен в контакт с чипом. Другими словами, можно обратимо маскировать или модифицировать захватывающие зонды таким образом, чтобы захватывающая область захватывающего зонда не содержала свободного 3′-конца, т.е. таким образом, чтобы 3′-конец был удален или модифицирован либо сделан недоступным, чтобы захватывающий зонд стал невосприимчивым к способу, который используют для модификации нуклеиновой кислоты образца ткани, например лигированию или удлинению, или можно удалить дополнительные нуклеотиды, чтобы демаскировать и/или восстановить 3′-конец захватывающей области захватывающего зонда.
Например, с захватывающими зондами могут быть гибридизованы блокирующие зонды, чтобы маскировать свободный 3′-конец захватывающей области, например зонды в форме шпилек или частично двунитевые зонды, подходящие примеры которых известны в данной области. Блокирование свободного 3′-конца захватывающей области можно осуществить посредством химической модификации, например путем добавления азидометильной группы в качестве химически обратимой кэппирующей группировки, с тем, чтобы захватывающие зонды не содержали свободного 3′-конца. Подходящие альтернативные кэппирующие группировки хорошо известны в данной области, например, концевой нуклеотид захватывающей области может представлять собой обратимый терминирующий нуклеотид, который может быть включен в захватывающий зонд во время или после синтеза зонда.
Альтернативно или в дополнение к этому, захватывающая область захватывающего зонда может быть модифицирована с возможностью последующего удаления любых модификаций захватывающего зонда, например дополнительных нуклеотидов, которые присутствуют, когда молекулы нуклеиновой кислоты образца ткани модифицируют. Например, захватывающие зонды могут содержать дополнительную последовательность, расположенную "вниз по течению" по отношению к захватывающей области, т.е. в 3′-направлении по отношению к захватывающей области, а именно, блокирующую область. Она может быть в форме, например последовательности, распознаваемой эндонуклеазой рестрикции, или последовательности нуклеотидов, расщепляемой под действием ферментов, обладающих специфической активностью, например, быть в форме урацил-содержащей последовательности. После модификации нуклеиновой кислоты образца ткани захватывающие зонды могут быть подвергнуты ферментативному расщеплению, что позволит осуществить удаление блокирующей области и любых дополнительных нуклеотидов, добавленных к 3′-концу захватывающего зонда во время осуществления процесса модификации. Удаление блокирующей области будет демаскировать и/или восстанавливать свободный 3′-конец захватывающей области захватывающего зонда. Блокирующую область можно синтезировать как часть захватывающего зонда или можно добавлять к захватывающему зонду in situ (т.е. в качестве модификации существующего чипа), например путем лигирования блокирующей области.
Блокирование захватывающих зондов можно осуществить, используя любую комбинацию описанных выше механизмов блокирования.
После того, как нуклеиновая кислота образца ткани, например фрагментированная геномная ДНК, модифицирована с целью придания ей способности гибридизоваться с захватывающей областью захватывающего зонда, захватывающий зонд должен быть разблокирован, например посредством диссоциации блокирующего олигонуклеотида, удаления кэппирующей группировки и/или блокирующей области.
Чтобы сопоставить результаты анализа последовательности или информацию о транскриптоме или геноме, полученную от каждого элемента чипа, с участком (т.е. областью или клеткой) образца ткани, образец ткани ориентируют по отношению к элементам чипа. Другими словами, образец ткани помещают на чип таким образом, чтобы положение захватывающего зонда на чипе можно было сопоставить с положением в образце ткани. Посредством этого можно определить, какому положению в образце ткани соответствует положение каждой разновидности захватывающего зонда (или каждого элемента чипа). Другими словами, можно идентифицировать, какому месту в образце ткани соответствует положение каждой разновидности захватывающего зонда. Это может быть выполнено благодаря позиционным маркерам, присутствующим на чипе, как описано ниже. В целях удобства, но это необязательно, можно осуществить визуализацию образца ткани после приведения его в контакт с чипом. Это можно выполнить до или после обработки нуклеиновой кислоты образца ткани, например, до или после стадии синтеза кДНК в соответствии со способом, в частности стадии синтеза первой нити кДНК с использованием обратной транскрипции. В предпочтительном воплощении визуализацию образца ткани осуществляют до высвобождения захваченной и синтезированной (т.е. удлиненной или лигированной) ДНК, например кДНК, с чипа. В особо предпочтительном воплощении визуализацию ткани осуществляют после обработки нуклеиновой кислоты образца ткани, например, после стадии обратной транскрипции и удаления любой оставшейся ткани (например, промывки) с чипа перед высвобождением молекул, например кДНК, с чипа. В некоторых воплощениях стадия обработки захваченной нуклеиновой кислоты, например стадия обратной транскрипции, может способствовать удалению оставшейся ткани с поверхности чипа, например при использовании ткани, приготовленной путем глубокого замораживания. В таком случае визуализацию образца ткани можно осуществлять перед проведением стадии обработки, например стадии синтеза кДНК. Вообще говоря, визуализацию можно осуществлять в любой момент времени после приведения образца ткани в контакт с поверхностью, но до проведения любой стадии, на которой может произойти разрушение или удаление образца ткани. Как отмечалось выше, это может зависеть от образца ткани.
Предпочтительно, чип может содержать маркеры для облегчения ориентации образца ткани или его изображения относительно элементов чипа. Для маркировки чипа можно использовать любые подходящие средства, которые поддаются детектированию при визуализации образца ткани. Например, можно иммобилизовать молекулы, например флуоресцентные молекулы, генерирующие сигнал, предпочтительно видимый сигнал, непосредственно или опосредованно на поверхности чипа. Предпочтительно, чтобы чип содержал по меньшей мере два маркера в разных положениях на поверхности чипа, также предпочтительно по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 маркеров. Для удобства можно использовать несколько сотен или даже несколько тысяч маркеров. Может быть предусмотрена схема размещения маркеров, например, они могут быть размещены на внешней кромке чипа, например по всему внешнему ряду элементов чипа. Могут быть использованы другие информативные схемы размещения, например линии, разделяющие чип на секции. Это может способствовать выравниванию изображения образца ткани по отношению к чипу или даже в целом сопоставлению элементов чипа с образцом ткани. Таким образом, маркер может представлять собой иммобилизованную молекулу, с которой дающая сигнал молекула может взаимодействовать для генерирования сигнала. В репрезентативном примере чип может содержать маркерный элемент, например нуклеиновокислотный зонд, иммобилизованный на подложке чипа, с которым может гибридизоваться меченая нуклеиновая кислота. Например, молекула меченой нуклеиновой кислоты или маркерной нуклеиновой кислоты может быть соединена или связана с химической группировкой, способной флуоресцировать, когда ее подвергают воздействию света определенной длины волны (или диапазона длин волн), т.е. возбуждают. Такая молекула маркерной нуклеиновой кислоты может быть приведена в контакт с чипом до окрашивания, одновременно с окрашиванием или после окрашивания образца ткани, чтобы осуществить визуализацию или получить изображение образца ткани. Однако маркер должен быть детектируемым при осуществлении визуализации образца ткани. Таким образом, в предпочтительном воплощении детекцию маркера можно осуществить, применяя те же условия визуализации, которые используются для визуализации образца ткани.
В особо предпочтительном воплощении изобретения чип содержит маркерные элементы, с которыми гибридизуется меченая, предпочтительно меченная флуоресцентной меткой, молекула маркерной нуклеиновой кислоты, например олигонуклеотид.
На стадии визуализации ткани можно применять любые подходящие гистологические способы, известные в данной области, например световую, светлопольную, темнопольную, фазово-контрастную, флуоресцентную, отражательную, интерференционную, конфокальную микроскопию или их комбинацию. В типичном случае образец ткани окрашивают перед визуализацией для обеспечения контраста между разными участками, например клеток, образца ткани. Тип используемого красящего средства будет зависеть от типа ткани и участка клеток, подлежащих окрашиванию. Такие протоколы окрашивания известны в данной области. В некоторых воплощениях может быть использовано более чем одно красящее средство для визуализации (получения изображения) разных аспектов образца ткани, например разных участков образца ткани, специфических клеточных структур (например, органелл) или разных типов клеток. В других воплощениях можно осуществить визуализацию или получить изображение образца ткани без окрашивания образца, например, если образец ткани уже содержит пигменты, обеспечивающие получение достаточного контраста, или если используются конкретные типы микроскопии.
В предпочтительном воплощении визуализацию или получение изображения образца ткани осуществляют, используя флуоресцентную микроскопию.
Образец ткани, т.е. любую оставшуюся ткань, которая сохраняется в контакте с подложкой чипа после стадии обратной транскрипции и, возможно, визуализации, если визуализация желательна и не была осуществлена перед проведением обратной транскрипции, предпочтительно удаляют перед стадией высвобождения молекул кДНК с чипа. Таким образом, способы по изобретению могут включать стадию промывки чипа. Удаление оставшегося образца ткани может быть осуществлено с использованием любых подходящих способов и будет зависеть от образца ткани. В самом простом воплощении чип можно промывать водой. Вода может содержать различные вспомогательные вещества, например поверхностно-активные вещества (например, детергенты), ферменты и т.д., для облегчения удаления ткани. В некоторых воплощениях чип промывают раствором, содержащим фермент протеазу (и подходящий буфер), например протеазу К. В других воплощениях этот раствор также или альтернативно может содержать ферменты целлюлазу, гемицеллюлазу или хитиназу, например, если источником для образца ткани являются растения или грибы. В следующих воплощениях температура раствора, используемого для промывки чипа, может составлять, например, по меньшей мере 30°С, предпочтительно по меньшей мере 35, 40, 45, 50 или 55°С. Очевидно, что при применении промывочного раствора следует свести к минимуму разрушение иммобилизованных молекул нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых воплощениях молекулы нуклеиновой кислоты могут быть иммобилизованы на подложке чипа опосредованно, например, путем гибридизации захватывающего зонда и РНК и/или захватывающего зонда и поверхностного зонда, поэтому стадия промывки не должна мешать взаимодействию между молекулами, иммобилизованными на чипе, т.е. не должна вызывать денатурации молекул нуклеиновой кислоты.
После стадии приведения чипа в контакт с образцом ткани в условиях, достаточных для осуществления гибридизации между нуклеиновой кислотой, например РНК (предпочтительно мРНК), образца ткани с захватывающими зондами, осуществляют стадию закрепления (связывания) гибридизованной нуклеиновой кислоты. Закрепление или связывание захваченной нуклеиновой кислоты включает в себя ковалентное присоединение комплементарной нити гибридизованной нуклеиновой кислоты к захватывающему зонду (т.е. посредством межнуклеотидной связи, фосфодиэфирной связи между расположенными рядом 3′-гидроксильным и 5′-фосфатным концами двух непосредственно примыкающих друг к другу нуклеотидов), тем самым захваченная нуклеиновая кислота метится или маркируется позиционной областью, специфичной к элементу, на котором нуклеиновая кислота захвачена.
В некоторых воплощениях закрепление гибридизованной нуклеиновой кислоты, например однонитевой нуклеиновой кислоты, может включать удлинение захватывающего зонда с получением копии захваченной нуклеиновой кислоты, например синтез кДНК на основе захваченной (гибридизованной) РНК. Понятно, что речь идет о синтезе комплементарной нити гибридизованной нуклеиновой кислоты, например синтезе кДНК на основе захваченной РНК-матрицы (РНК, гибридизованной с захватывающей областью захватывающего зонда). Таким образом, на начальной стадии удлинения захватывающего зонда, например синтеза кДНК, захваченная (гибридизованная) нуклеиновая кислота, например РНК, действует в качестве матрицы на стадии удлинения, например, обратной транскрипции. В других воплощениях, как описано ниже, закрепление гибридизованной нуклеиновой кислоты, например, частично двунитевой ДНК, может включать ковалентное связывание гибридизованной нуклеиновой кислоты, например фрагментированной ДНК, с захватывающим зондом, например лигирование с захватывающим зондом комплементарной нити нуклеиновой кислоты, гибридизованной с захватывающим зондом, в реакции лигирования.
Термин "обратная транскрипция" относится к стадии синтеза кДНК (комплементарной или копийной ДНК) по РНК, предпочтительно мРНК (матричной (или информационной) РНК), с использованием обратной транскриптазы. Таким образом, кДНК можно рассматривать как копию РНК, присутствующей в клетке на момент отбора образца ткани, т.е. она соответствует всем или некоторым генам, которые были экспрессированы в указанной клетке на момент выделения.
Захватывающий зонд, конкретно, захватывающая область захватывающего зонда, действует в качестве праймера для получения комплементарной нити нуклеиновой кислоты, гибридизованной с захватывающим зондом, например праймера для обратной транскрипции. Таким образом, молекулы нуклеиновой кислоты, например кДНК, синтезированные в реакции удлинения, например реакции обратной транскрипции, включают в себя последовательность захватывающего зонда, т.е. реакция удлинения, например реакция обратной транскрипции, может рассматриваться как путь опосредованного мечения нуклеиновой кислоты, например транскриптов, образца ткани, который находится в контакте с каждым элементом чипа. Как упомянуто выше, каждая разновидность захватывающего зонда содержит позиционную область (идентификационную метку элемента), которая представляет собой уникальную последовательность для каждого элемента чипа. Таким образом, все молекулы нуклеиновой кислоты, например кДНК, синтезированные в пределах конкретного элемента, будут содержать одну и ту же нуклеиновокислотную "метку".
Молекулы нуклеиновой кислоты, например кДНК, синтезированные в пределах каждого элемента чипа, могут представлять геном участка или области образца ткани, находящейся в контакте с этим элементом, например ткани или типа клеток либо их группы или подгруппы, либо гены, экспрессируемые в этом участке или области образца ткани, и также могут представлять гены, экспрессируемые в конкретных условиях, например в конкретный момент времени, в определенном окружении, на определенной стадии развития или в ответ на стимул и т.д. Таким образом, кДНК в пределах любого единичного элемента может представлять гены, экспрессируемые в одной клетке, или, если этот элемент находится в контакте с образцом в области межклеточных контактов, кДНК может представлять гены, экспрессируемые более чем в одной клетке. Аналогично, если одна клетка находится в контакте со многими элементами, то каждый элемент может представлять часть генов, экспрессируемых в указанной клетке. Аналогично, в тех воплощениях, в которых захваченная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, любой единичный элемент может быть типичным представителем генома одной клетки или более чем одной клетки. Альтернативно, геном одной клетки может быть представлен многими элементами.
Стадия удлинения захватывающего зонда, например стадия обратной транскрипции, может быть проведена с использованием любых подходящих ферментов, и в данной области существует много протоколов, как подробно описано ниже. Однако, будет очевидно, что нет необходимости в предоставлении праймера для синтеза первой нити нуклеиновой кислоты, например кДНК, поскольку захватывающая область захватывающего зонда действует в качестве праймера, например праймера обратной транскрипции.
Предпочтительно, что в контексте настоящего изобретения закрепленную нуклеиновую кислоту (т.е. нуклеиновую кислоту, ковалентно присоединенную к захватывающему зонду), например кДНК, обрабатывают таким образом, чтобы она содержала двунитевую ДНК. Однако, в некоторых воплощениях, захваченная ДНК может уже содержать двунитевую ДНК, например, когда с захватывающим зондом лигируют частично двунитевую фрагментированную ДНК. Обработка захваченной нуклеиновой кислоты для получения двунитевой ДНК может быть осуществлена в одной реакции с синтезом только второй нити ДНК, например кДНК, т.е. с получением двунитевых молекул ДНК без увеличения числа двунитевых молекул ДНК, либо в реакции амплификации с получением большого числа копий второй нити, которые могут быть в форме однонитевой ДНК (например, при линейной амплификации) или двунитевой ДНК, например кДНК (например, при экспоненциальной амплификации).
Стадия синтеза второй нити ДНК, например кДНК, может протекать in situ на чипе либо в виде отдельной стадии синтеза второй нити, например с использованием случайных праймеров, как описано более подробно ниже, либо на начальной стадии реакции амплификации. Альтернативно, первая нить ДНК, например кДНК, (нить, содержащая, т.е. включающая в себя захватывающий зонд) может быть высвобождена с чипа, а синтез второй нити, независимо от того, происходит ли он в виде отдельной стадии или в реакции амплификации, может осуществляться позже, например в реакции, проводимой в растворе.
В том случае, когда синтез второй нити протекает на чипе (т.е. in situ), данный способ может включать возможную стадию удаления захваченной нуклеиновой кислоты, например РНК, перед синтезом второй нити, например с использованием расщепляющего РНК фермента (РНКазы), например РНКазы Н. Применяемые для этого методики хорошо известны и описаны в данной области. Однако обычно в этом нет необходимости, и в большинстве случаев РНК разрушается естественным образом. Удаление образца ткани с чипа обычно будет приводить к удалению РНК с чипа. При желании для повышения надежности удаления РНК можно использовать РНКазу Н.
Например, в образцах ткани, которые содержат большие количества РНК, на стадии синтеза двунитевой кДНК можно получить достаточное количество кДНК, которая может быть секвенирована непосредственно (после высвобождения с чипа). В этом случае синтез второй нити кДНК может быть выполнен любым способом, известным в данной области, и как описано ниже. Реакция синтеза второй нити может быть осуществлена на чипе непосредственно, т.е. пока кДНК иммобилизована на чипе, или, предпочтительно, после высвобождения кДНК с подложки чипа, как описано ниже.
В других воплощениях потребуется увеличить, т.е. амплифицировать, количество закрепленной нуклеиновой кислоты, например синтезированной кДНК, чтобы получить количества, достаточные для секвенирования ДНК. В этом воплощении первая нить закрепленных молекул нуклеиновой кислоты, например кДНК, которые также содержат захватывающий зонд элементов чипа, действует в качестве матрицы для реакции амплификации, например полимеразной цепной реакции. Первый продукт реакции амплификации будет представлять собой вторую нить ДНК, например кДНК, которая сама будет действовать в качестве матрицы для следующих циклов реакции амплификации.
В любом из описанных выше воплощений вторая нить ДНК, например кДНК, будет содержать участок, комплементарный последовательности захватывающего зонда. Если захватывающий зонд содержит универсальную область и, в частности, область амплификации в пределах данной универсальной области, то это можно использовать для последующей амплификации ДНК, например кДНК, например подвергаемая амплификации реакционная смесь может содержать праймер с той же последовательностью, что и область амплификации, т.е. праймер, который является комплементарным участку, комплементарному области амплификации, т.е. гибридизуется с ним. Учитывая тот факт, что область амплификации расположена "вверх по течению" по отношению к позиционной области захватывающего зонда (в закрепленной нуклеиновой кислоте, например первой нити кДНК), данный участок, комплементарный позиционной области, будет встроен во вторую нить молекул ДНК, например кДНК.
В тех воплощениях, где вторую нить ДНК, например кДНК, синтезируют в одной реакции, синтез второй нити может быть осуществлен любым подходящим способом. Например, первая нить кДНК предпочтительно, но необязательно, высвобожденная с подложки чипа, может быть инкубирована со случайными праймерами, например гексамерными праймерами, и ДНК-полимеразой, предпочтительно полимеразой, обладающей активностью замещения нити, например фрагментом Кленова (экзо), в условиях, достаточных для осуществления матричного синтеза ДНК. В результате этого процесса будут получены двунитевые молекулы кДНК различной длины, и маловероятно получение полноразмерных молекул кДНК, т.е. молекул кДНК, которые соответствуют целой мРНК, на основе которой они были синтезированы. Случайные праймеры будут гибридизоваться с первой нитью молекул кДНК в случайном положении, т.е. скорее в пределах последовательности, чем на конце последовательности.
Если желательно синтезировать полноразмерные молекулы ДНК, например кДНК, т.е. молекулы, которые соответствуют целой захваченной молекуле нуклеиновой кислоты, например молекуле РНК (если нуклеиновая кислота, например РНК, была частично разрушена в образце ткани, то захваченные молекулы нуклеиновой кислоты, например РНК, не будут "полноразмерными" транскриптами или не будут иметь ту же длину, что и начальные фрагменты геномной ДНК), то 3′-конец закрепленных молекул нуклеиновой кислоты, например первой нити кДНК, может быть модифицирован. Например, с 3′-концом молекул кДНК может быть лигирован линкер или адаптер. Этого можно достичь, используя ферменты, осуществляющие лигирование одной нити, такие как Т4 РНК-лигаза или Circligase™ (Epicentre Biotechnologies).
Альтернативно, вспомогательный зонд (частично двунитевая молекула ДНК, способная гибридизоваться с 3′-концом первой нити молекулы кДНК), может быть лигирован с 3′-концом закрепленной молекулы нуклеиновой кислоты, например первой нитью кДНК, с использованием фермента, осуществляющего лигирование двух нитей, такого как Т4 ДНК-лигаза. Другие ферменты, подходящие для стадии лигирования, известны в данной области и включают, например Tth ДНК-лигазу, Taq ДНК-лигазу, ДНК-лигазу Thermococcus sp.(штамм 9°N) (ДНК-лигазу 9°N™, New England Biolabs) и Ampligase™ (Epicentre Biotechnologies). Вспомогательный зонд также содержит специфическую последовательность, которая может праймировать синтез второй нити ДНК, например кДНК, с использованием праймера, комплементарного части вспомогательного зонда, лигированного с закрепленной нуклеиновой кислотой, например первой нитью кДНК. Другая альтернатива заключается в применении фермента с активностью концевой трансферазы для встраивания полинуклеотидного хвоста, например поли(А)-хвоста, по 3′-концу закрепленных молекул нуклеиновой кислоты, например первой нити кДНК. Синтез второй нити можно праймировать, используя поли(Т)-праймер, который также может содержать специфическую область амплификации для последующей амплификации. Другие способы синтеза молекул "полноразмерной" двунитевой ДНК, например кДНК (или синтеза второй нити максимальной длины), хорошо известны в данной области.
В некоторых воплощениях для синтеза второй нити можно использовать метод переключения матрицы, например, применяя технологию SMART™ от Clontech®. Технология SMART (Switching Mechanism at 5′ End of RNA Template, механизм переключения на 5′-конце матрицы РНК) хорошо известна в данной области и основана на открытии того, что ферменты обратные транскриптазы, например Superscript® II (Invitrogen), способны добавлять несколько нуклеотидов к 3′-концу удлиняемой молекулы кДНК, т.е. создавать гибрид ДНК/РНК с однонитевым выступом ДНК на 3′-конце. Наличие выступа ДНК может обеспечить получение целевой последовательности, с которой может гибридизоваться олигонуклеотидный зонд, создавая дополнительную матрицу для дальнейшего удлинения молекулы кДНК. Предпочтительно, олигонуклеотидный зонд, который гибридизуется с выступом кДНК, содержит последовательность области амплификации, комплемент которой встроен в синтезированный продукт, первую нить кДНК. Праймеры, содержащие последовательность области амплификации, которые будут гибридизоваться с последовательностью, комплементарной области амплификации, встроенной в первую нить кДНК, могут быть добавлены к реакционной смеси с целью праймирования синтеза второй нити с использованием подходящего фермента полимеразы и первой нити кДНК в качестве матрицы. Этот способ позволяет избежать необходимости лигирования адаптеров с 3′-концом первой нити кДНК. Несмотря на то, что метод переключения матрицы первоначально был разработан для полноразмерных мРНК, которые имеют 5′-кэппированную структуру, позже было продемонстрировано, что он одинаково хорошо работает в случае укороченных мРНК, не имеющих кэппированной структуры. Таким образом, в способах по изобретению можно использовать метод переключения матрицы для синтеза полноразмерных и/или неполных или укороченных молекул кДНК. Таким образом, в предпочтительном воплощении изобретения для синтеза второй нити можно применить метод переключения матрицы или синтеза второй нити можно добиться, применяя метод переключения матрицы. В особо предпочтительном воплощении реакцию переключения матрицы, т.е. последующее удлинение первой нити кДНК для встраивания участка, комплементарного области амплификации, осуществляют in situ (пока захватывающий зонд все еще присоединен, непосредственно или опосредованно, к чипу). Предпочтительно, реакцию синтеза второй нити также проводят in situ.
В тех воплощениях, когда может оказаться необходимым или выгодным увеличить количество, обогатить или амплифицировать молекулы ДНК, например кДНК, в молекулы ДНК, например кДНК, могут быть встроены области амплификации. Как обсуждалось выше, первая область амплификации может быть встроена в закрепленные молекулы нуклеиновой кислоты, например первую нить молекул кДНК, когда захватывающий зонд содержит универсальную область, содержащую область амплификации. В этих воплощениях в процессе синтеза второй нити может быть встроена вторая область амплификации. Например, праймеры, используемые для синтеза второй нити кДНК, например случайные гексамерные праймеры, поли(Т)-праймер, праймер, комплементарный вспомогательному зонду, могут содержать на своем 5′-конце область амплификации, т.е. нуклеотидную последовательность, с которой может гибридизоваться амплифицирующий праймер. Таким образом, полученная двунитевая ДНК может содержать область амплификации при каждом 5′-конце или в направлении каждого 5′-конца двунитевых молекул ДНК, например кДНК. Эти области амплификации можно использовать в качестве мишеней для праймеров, применяемых в реакции амплификации, например ПЦР. Альтернативно, линкер или адаптер, лигированный с 3′-концом молекул закрепленной нуклеиновой кислоты, например молекул первой нити кДНК, может содержать вторую универсальную область, содержащую вторую область амплификации. Аналогично, вторую область амплификации можно встроить в первую нить молекул кДНК, используя метод переключения матрицы.
В тех воплощениях, где захватывающий зонд не содержит универсальной области, в частности, содержащей область амплификации, вторая нить молекул кДНК может быть синтезирована в соответствии с приведенным выше описанием. Полученные молекулы двунитевой ДНК могут быть модифицированы с целью встраивания области амплификации по 5′-концу первой нити ДНК, например кДНК, (первая область амплификации) и, если она не встроена на стадии синтеза второй нити ДНК, например кДНК, то по 5′-концу второй нити ДНК, например кДНК, (вторая область амплификации). Такие области амплификации могут быть встроены, например, путем лигирования двунитевых адаптеров с концами молекул ДНК, например кДНК. Ферменты, подходящие для стадии лигирования, известны в данной области и включают, например Tth ДНК-лигазу, Taq ДНК-лигазу, ДНК-лигазу из Thermococcus sp.(штамм 9°N) (ДНК-лигазу 9°N™, New England Biolabs), Ampligase™ (Epicentre Biotechnologies) и Т4 ДНК-лигазу. В предпочтительном воплощении первая и вторая области амплификации содержат разные последовательности.
Таким образом, на основании изложенного выше очевидно, что универсальные области, которые могут содержать область амплификации, можно добавить к закрепленным (т.е. удлиненным или лигированным) молекулам ДНК, например, к молекулам кДНК, или к их комплементам (например, второй нити), используя различные способы и методики и комбинации таких методик, известные в данной области, например посредством применения праймеров, включающих в себя такую область, лигирования адаптеров, применения ферментов-концевых трансфераз, и/или посредством применения методов переключения матрицы. Как очевидно из приведенного в данном описании обсуждения, такие области могут быть добавлены до или после высвобождения молекул ДНК с чипа.
На основании изложенного выше описания будет очевидно, что все молекулы ДНК, например кДНК, из одного чипа, которые синтезированы способами по изобретению, могут содержать одни и те же первую и вторую области амплификации. Следовательно, одной реакции амплификации, например ПЦР, может быть достаточно, чтобы амплифицировать все молекулы ДНК, например кДНК. Таким образом, в предпочтительном воплощении способ по изобретению может включать стадию амплификации молекул ДНК, например кДНК. В одном из воплощений стадию амплификации осуществляют после высвобождения молекул ДНК, например кДНК, с подложки чипа. В других воплощениях амплификация может быть осуществлена на чипе (т.е. in situ на чипе). В данной области известно, что реакции амплификации можно проводить на чипах, и для проведения таких реакций имеются термоциклеры для чипов. Так, в одном из воплощений в качестве основных чипов по настоящему изобретению могут быть использованы чипы, которые известны в данной области как платформы для секвенирования или для применения в каком-либо виде анализа последовательностей (например, в технологиях или с использованием технологий секвенирования следующего поколения) (например, чипы на основе гранул от Illumina и т.д.).
Для синтеза второй нити ДНК, например кДНК, предпочтительно использовать полимеразу замещения нити (например, Ф29 ДНК-полимеразу, Bst ДНК-полимеразу (экзо-), ДНК-полимеразу Кленова (экзо-)), если высвобожденная с подложки чипа кДНК содержит молекулу частично двунитевой нуклеиновой кислоты. Например, высвобожденные нуклеиновые кислоты будут по меньшей мере частично двунитевыми (например, гибрид ДНК:ДНК, ДНК:РНК или ДНК:ДНК/РНК) в тех воплощениях, где захватывающий зонд иммобилизован опосредованно на подложке чипа через поверхностный зонд, и стадия высвобождения молекул ДНК, например кДНК, включает стадию отщепления. Полимераза замещения нити необходима для обеспечения того, чтобы при синтезе второй нити кДНК во вторую нить ДНК, например кДНК, был встроен участок, комплементарный позиционной области (область идентификации элемента).
Очевидно, что стадия высвобождения по меньшей мере части молекул ДНК, например кДНК, или их ампликонов с поверхности или подложки чипа может быть осуществлена с использованием ряда способов. Первоочередной задачей стадии высвобождения является получение молекул, в которых позиционная область захватывающего зонда (или его комплемента) встроена (или включена) таким образом, чтобы молекулы ДНК, например кДНК, или их ампликоны были бы "мечены" соответственно их элементу (или положению) на чипе. Таким образом, в результате осуществления стадии высвобождения, молекулы ДНК, например кДНК, или их ампликоны, удаляются с чипа, причем молекулы ДНК, например кДНК, или ампликоны включают в себя позиционную область или ее комплемент (посредством которых они встроены в закрепленную нуклеиновую кислоту, например первую нить кДНК, в результате, например удлинения захватывающего зонда, и, возможно, скопированы во вторую нить ДНК, если синтез второй нити происходит на чипе, или скопированы в ампликоны, если амплификация происходит на чипе). Следовательно, чтобы получить данные из анализа последовательностей, которые могут быть соотнесены с различными участками в образце ткани, необходимо, чтобы высвобожденные молекулы содержали позиционную область захватывающего зонда (или ее комплемент).
Поскольку высвобожденная молекула может представлять собой молекулу первой и/или второй нити ДНК, например кДНК, или ампликон, и поскольку захватывающий зонд может быть иммобилизован на чипе опосредованно, очевидно, что хотя стадия высвобождения может включать стадию отщепления молекулы ДНК, например кДНК, от чипа, необходимости в стадии отщепления для стадии высвобождения нуклеиновой кислоты нет; молекула ДНК, например кДНК, или ампликон может просто высвобождаться в результате денатурации двунитевой молекулы, например в результате отсоединения второй нити кДНК от первой нити кДНК, или отсоединения ампликона от его матрицы, или отсоединения молекулы первой нити кДНК (т.е. удлиненного захватывающего зонда) от поверхностного зонда. Соответственно, молекула ДНК, например кДНК, может высвобождаться с чипа в результате отщепления нуклеиновой кислоты и/или в результате денатурации (например, под действием нагревания для денатурации двунитевой молекулы). В том случае, когда амплификацию осуществляют in situ на чипе, это несомненно будет относиться к высвобождению ампликонов в результате денатурации в циклически повторяющейся реакции.
В некоторых воплощениях, молекулы ДНК, например кДНК, высвобождаются в результате ферментативного расщепления области расщепления, которая может быть локализована в универсальной области или позиционной области захватывающего зонда. Как упомянуто выше, область расщепления должна быть локализована "вверх по течению" (на 5′-конце) относительно позиционной области, чтобы высвобожденные молекулы ДНК, например кДНК, содержали позиционную (идентификационную) область. Подходящие ферменты для расщепления нуклеиновых кислот включают эндонуклеазы рестрикции, например Rsal. Другие ферменты, например смесь урацил-ДНК-гликозилазы (UDG) и ДНК-гликозилазы-лиазы и эндонуклеазы VIII (USER™ enzyme) или комбинация ферментов MutY и Т7 эндонуклеазы I, относятся к предпочтительным воплощениям способов по изобретению.
В альтернативном воплощении, молекулы ДНК, например кДНК, могут высвобождаться с поверхности или с подложки чипа физическим способом. Например, в тех воплощениях, где захватывающий зонд иммобилизован на подложке чипа опосредованно, например, в результате гибридизации с поверхностным зондом, может быть достаточно разрушить взаимодействие между молекулами нуклеиновой кислоты. Способы разрушения взаимодействия между молекулами нуклеиновой кислоты, например денатурация двунитевых молекул нуклеиновой кислоты, хорошо известны в данной области. Эффективный способ высвобождения молекул ДНК, например кДНК, (т.е. отделения от чипа синтезированных молекул ДНК, например кДНК) заключается в использовании раствора, который служит помехой водородным связям в двунитевых молекулах. В предпочтительном воплощении изобретения, молекулы ДНК, например кДНК, могут высвобождаться посредством применения нагретой воды, например воды или буфера, нагретых по меньшей мере до 85°С, предпочтительно по меньшей мере до 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99°С. Как альтернатива или в дополнение к применению температуры, достаточной для разрушения водородных связей, раствор может содержать соли, поверхностно-активные вещества и т.д., которые также могут дестабилизировать взаимодействие между молекулами нуклеиновой кислоты, приводя к высвобождению молекул ДНК, например кДНК.
Очевидно, что применение раствора с повышенной температурой, например воды при 90-99°С, может оказаться достаточным, чтобы разрушить ковалентную связь, использованную для иммобилизации захватывающего зонда или поверхностного зонда на подложке чипа. Таким образом, в предпочтительном воплощении, молекулы ДНК, например кДНК, могут высвобождаться в результате подведения горячей воды к чипу с целью разрушения ковалентно иммобилизованных захватывающих или поверхностных зондов.
Подразумевается, что высвобожденные молекулы ДНК, например кДНК (раствор, содержащий высвобожденные молекулы ДНК, например кДНК) собирают для дальнейшей работы, например, для синтеза и/или амплификации второй нити. Тем не менее, можно отметить, что способ по изобретению включает стадию сбора или извлечения высвобожденных молекул ДНК, например кДНК. Как указано выше, в случае амплификации in situ высвобожденные молекулы могут включать ампликоны закрепленной нуклеиновой кислоты, например кДНК.
В воплощениях способов по изобретению может оказаться желательным удалить любые неудлиненные или нелигированные захватывающие зонды. Это можно сделать, например, после стадии высвобождения молекул ДНК с чипа. Для такого удаления можно использовать любой желаемый или подходящий способ, включая, например, применение фермента для разрушения неудлиненных или нелигированных зондов, например экзонуклеазы.
Молекулы ДНК, например кДНК, или ампликоны, высвобожденные с чипа, которые могут быть модифицированы, как обсуждалось выше, анализируют исследовательских целях (например, чтобы определить их последовательность, хотя, как указано выше, необходимости в фактическом определении последовательности нет, можно использовать любой метод анализа последовательности). Таким образом, можно использовать любой метод анализа нуклеиновых кислот. На стадии анализа последовательности можно идентифицировать позиционную область и вследствие этого осуществить локализацию положения анализируемой молекулы в образце ткани. Аналогично, можно определить основные свойства или особенности анализируемой молекулы. Таким образом можно определить нуклеиновую кислоту, например РНК, в заданном положении на чипе и вследствие этого в образце ткани. Следовательно, стадия анализа может включать или на стадии анализа можно использовать любой метод идентификации анализируемой молекулы (и вследствие этого "целевой молекулы") и ее позиционной области. В общем случае таким методом будет специфичный к последовательности метод. Например, в данном способе можно использовать специфичные к последовательности праймеры или зонды, в частности, праймеры или зонды, специфичные к позиционной области и/или к молекуле конкретной нуклеиновой кислоты, детекцию или анализ которой необходимо провести, например к молекуле ДНК, которая соответствует молекуле нуклеиновой кислоты, например РНК или кДНК, детекцию которой необходимо провести. Обычно в таком методе могут быть использованы специфичные к последовательности амплификационные праймеры, например ПЦР-праймеры.
В некоторых воплощениях может оказаться желательным провести анализ подкласса или семейства молекул, родственных целевым молекулам, например всех последовательностей, которые кодируют конкретную группу белков, характеризующихся сходством последовательности и/или наличием консервативных доменов, например семейства рецепторов. Следовательно, в способах амплификации и/или анализа, изложенных в данном описании, можно применять вырожденные или специфичные к семейству генов праймеры или зонды, которые гибридизуются с подклассом захваченных нуклеиновых кислот или происходящих из них нуклеиновых кислот, например с ампликонами. В особо предпочтительном воплощении в способах амплификации и/или анализа можно применять универсальный праймер (т.е. праймер, общий для всех захваченных последовательностей) в комбинации с вырожденным или специфичным к семейству генов праймером, специфичным для подкласса целевых молекул.
Таким образом, в одном из воплощений используют основанные на амплификации, в частности, основанные на ПЦР, способы анализа последовательностей.
Однако, на стадиях модифицикации и/или амплификации высвобожденных молекул ДНК, например кДНК, в образец могут вводиться дополнительные компоненты, например ферменты, праймеры, нуклеотиды и т.д. Таким образом, способы по изобретению могут дополнительно включать стадию очистки образца, содержащего высвобожденные молекулы ДНК, например кДНК, или ампликоны, перед проведением анализа последовательностей, например для удаления олигонуклеотидных праймеров, нуклеотидов, солей и т.д., которые могут препятствовать реакциям секвенирования. Можно использовать любой подходящий метод очистки молекул ДНК, например молекул кДНК.
Как указано выше, анализ последовательностей высвобожденных молекул ДНК может быть непосредственным или опосредованным. Так, объектом для анализа последовательности (который можно рассматривать как молекулу, которую подвергают стадии или процессу анализа последовательности) может непосредственно быть молекула, которая высвобождается с чипа, или это может быть происходящая из нее молекула. Таким образом, например, в случае стадии анализа последовательности, которая включает в себя реакцию секвенирования, матрицей для секвенирования может быть молекула, которая высвобождается с чипа, или это может быть происходящая из нее молекула. Например, первая и/или вторая нить молекулы ДНК, например кДНК, высвобожденной с чипа, может быть непосредственно подвергнута анализу последовательности (например, секвенированию), т.е. может непосредственно принимать участие в реакции или процессе анализа последовательности (например, в реакции секвенирования или процессе секвенирования, или быть молекулой, которую секвенируют или идентифицируют иным способом). В случае амплификации in situ высвобожденная молекула может представлять собой ампликон. Альтернативно, высвобожденная молекула может быть подвергнута стадии синтеза или амплификации второй нити перед проведением анализа последовательности (например, перед секвенированием или идентификацией другими способами). Таким образом, объект анализа последовательности (например, матрица) может представлять собой ампликон или вторую нить молекулы, которая непосредственно высвобождается с чипа.
Анализу последовательности (например, секвенированию) можно подвергнуть обе нити двунитевой молекулы, но данное изобретение этим не ограничивается, и можно провести анализ однонитевых молекул (например, кДНК) (например, секвенировать их). Например, можно использовать различные технологии секвенирования для секвенирования отдельной молекулы, например технологии Helicos или Pacbio либо разрабатываемые технологии секвенирования на основе нанопор. Так, в одном из воплощений секвенированию может быть подвергнута первая нить ДНК, например кДНК. Для первой нити ДНК, например кДНК, может потребоваться модификация по 3′-концу, дающая возможность осуществлять секвенирование одинарной молекулы. Это может быть выполнено с использованием методик, аналогичных таковым для обработки второй нити ДНК, например кДНК. Подобные методики известны в данной области.
В предпочтительном аспекте изобретения, с использованием анализа последовательности будет идентифицирована или раскрыта часть последовательности захваченной нуклеиновой кислоты, например последовательности РНК, и последовательность позиционной области. Последовательность позиционной области (или метки) будет определять элемент, которым молекула нуклеиновой кислоты, например мРНК, была захвачена. Последовательность захваченной молекулы нуклеиновой кислоты, например РНК, можно сравнить с базой данных последовательностей того организма, из которого происходит образец, чтобы определить ген, которому она соответствует. В результате установления того, какой участок (например, клетка) образца ткани был в контакте с данным элементом, можно определить, в каком участке образца ткани происходила экспрессия указанного гена (или содержался данный ген, например, в случае пространственной геномики). Такой анализ может быть проведен для всех молекул ДНК, например кДНК, синтезированных способами по изобретению, с получением данных о пространственном транскриптоме или геноме образца ткани.
В качестве репрезентативного примера можно провести анализ данных секвенирования с целью сортировки последовательностей по конкретным разновидностям захватывающего зонда, т.е. в соответствии с последовательностью позиционной области. Это можно осуществить, например, используя штрихкодовый сплиттер с применением формата FASTQ пакета FastX-toolkit (FastX toolkit FASTQ Barcode splitter tool) с целью сортировки последовательностей по отдельным файлам для соответствующих последовательностей позиционных областей (меток) захватывающих зондов. Для определения идентичности транскриптов можно провести анализ последовательностей каждой разновидности, т.е. из каждого элемента. Например, последовательности могут быть идентифицированы с использованием, например, программного обеспечения Blastn для сравнения последовательностей с одной или более чем одной из баз данных по геномам, предпочтительно с базой данных для того организма, из которого образец ткани был получен. Идентичность последовательности из базы данных с наибольшим сходством с последовательностью, синтезированной способами по изобретению, будет отнесена к указанной последовательности. В общем случае, только совпадения с достоверностью по меньшей мере 1е-6, предпочтительно 1е-7, 1е-8 или 1е-9, будут считаться успешно идентифицированными.
Очевидно, что в способах по изобретению может быть использован любой метод секвенирования нуклеиновых кислот. Однако, в настоящем изобретении особое применение найдут так называемые методы "секвенирования следующего поколения". Высокопроизводительное секвенирование особенно полезно в способах по изобретению, поскольку оно позволяет провести частичное секвенирование большого количества нуклеиновых кислот за очень короткий промежуток времени. С учетом недавнего быстрого роста числа полностью или частично секвенированных геномов нет необходимости в секвенировании полной последовательности синтезированных молекул ДНК, например кДНК, чтобы установить ген, которому каждая молекула соответствует. Например, первых 100 нуклеотидов с каждого конца молекул ДНК, например кДНК, должно быть достаточно для идентификации как элемента, которым нуклеиновая кислота, например мРНК, была захвачена (т.е. ее локализации на чипе), так и экспрессированного гена. В результате проведения реакции секвенирования начиная с "конца захватывающего зонда" молекул ДНК, например кДНК, получают данные о последовательности позиционной области и данные по меньшей мере о примерно 20 основаниях, предпочтительно 30 или 40 основаниях специфичной к транскрипту последовательности. В результате проведения реакции секвенирования с "конца незахватывающего зонда" можно получить данные о примерно 70 основаниях, предпочтительно 80, 90 или 100 основаниях специфичной к транскрипту последовательности.
В качестве репрезентативного примера, реакция секвенирования может быть основана на применении таких обратимых красителей-терминаторов, которые использованы в технологии Illumina™. Например, сначала молекулы ДНК присоединяют к праймерам, например на стеклянном или кремниевом слайде, и амплифицируют, в результате чего образуют локальные кластерные колонии (мостиковая амплификация). Добавляют четыре типа ddNTP и не встроившиеся нуклеотиды отмывают. В отличие от пиросеквенирования, ДНК может быть удлинена за один раз только на один нуклеотид. С помощью камеры регистрируют флуоресцентно меченные нуклеотиды, затем из ДНК удаляют химическим способом краситель вместе с блокатором 3′-конца, давая возможность протеканию следующего цикла. Это можно повторять до тех пор, пока не будут получены необходимые данные о последовательности. С использованием этой технологии можно секвенировать одновременно на одном слайде тысячи нуклеиновых кислот.
Для способов по изобретению в равной степени могут быть приемлемы другие высокопроизводительные методы секвенирования, например пиросеквенирование. В этом способе ДНК амплифицируют внутри капель воды в масляном растворе (эмульсионная ПЦР), при этом каждая капля содержит единственную матрицу ДНК, присоединенную к одной покрытой праймером грануле, которая затем образует клональную колонию. Установка для секвенирования содержит много лунок пиколитрового объема, каждая из которых содержит одну гранулу и ферменты, используемые для секвенирования. В пиросеквенировании используют люциферазу для генерирования света с целью детекции индивидуальных нуклеотидов, добавляемых к растущей ДНК, и объединенные данные используют для считывания последовательности.
Один из примеров разрабатываемой технологии основан на детекции ионов водорода, которые высвобождаются в процессе полимеризации ДНК. В микролунку, содержащую в качестве матрицы нить ДНК, подлежащую секвенированию, помещают нуклеотид одного типа. Если введенный нуклеотид комплементарен первому нуклеотиду матрицы, он встраивается в растущую комплементарную нить. Это приводит к высвобождению иона водорода, который запускает гиперчувствительный ионный сенсор, и это указывает на то, что реакция осуществилась. Если в последовательности матрицы присутствуют гомополимерные повторы, то за один цикл будут встраиваться несколько нуклеотидов. Это приводит к высвобождению соответствующего количества ионов водорода и пропорционально более высокому электронному сигналу.
Таким образом, ясно, что постепенно становятся доступными перспективные форматы секвенирования с более короткой продолжительностью рабочего цикла, как одной из основных особенностей этих платформ, и очевидно, что в способах по изобретению будут полезны другие технологии секвенирования.
Существенным признаком настоящего изобретения, как описано выше, является стадия закрепления комплементарной нити захваченных молекул нуклеиновой кислоты на захватывающем зонде, например стадия обратного транскрибирования захваченных молекул РНК. Реакция обратной транскрипции хорошо известна в данной области, и в репрезентативных реакциях обратной транскрипции реакционная смесь включает в себя обратную транскриптазу, dNTP и подходящий буфер. Реакционная смесь может содержать другие компоненты, например ингибитор(ы) РНКаз. Праймеры и матрица представляют собой захватывающую область захватывающего зонда, а захваченные молекулы РНК описаны выше. В способах, являющихся объектом изобретения, каждый dNTP обычно будет представлен в концентрации, находящейся в пределах от примерно 10 до 5000 мкМ, обычно от примерно 20 до 1000 мкМ. Очевидно, что для синтеза комплементарной нити захваченной молекулы ДНК можно провести аналогичную реакцию, используя фермент с ДНК-полимеразной активностью. Реакции такого типа хорошо известны в данной области и описаны более подробно ниже.
Желаемую активность обратной транскриптазы можно обеспечить путем использования одного или более чем одного из различных ферментов, подходящими примерами которых являются: ферменты M-MLV (вирус мышиного лейкоза Молони), MuLV (вирус лейкоза мышей), AMV (вирус миелобластоза птиц), ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), ArrayScript™, MultiScribe™, ThermoScript™ и Superscript® I, II и III.
Реакция с использованием обратной транскриптазы может быть проведена при любой подходящей температуре, которая будет зависеть от свойств фермента. Обычно реакции с использованием обратной транскриптазы проводят при 37-55°С, хотя также могут быть целесообразны температуры за пределами этого диапазона. Продолжительность реакции может составлять от всего 1, 2, 3, 4 или 5 минут до 48 часов включительно. Обычно реакцию проводят в течение 5-120 минут, предпочтительно 5-60, 5-45 или 5-30 минут либо 1-10 или 1-5 минут согласно выбору. Продолжительность реакции не является критичной, и может быть использована любая желаемая продолжительность реакции.
Как указано выше, некоторые воплощения способов включают стадию амплификации, на которой количество копий синтезированных молекул ДНК, например кДНК, увеличивают, например, для обогащения образца для получения улучшенного представления нуклеиновых кислот, например транскриптов, захваченных из образца ткани. По желанию, амплификация может быть линейной или экспоненциальной, при этом представляющие интерес репрезентативные протоколы амплификации включают, без ограничения ими: полимеразную цепную реакцию (ПЦР); изотермальную амплификацию и т.д.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) хорошо известна в данной области, причем она описана в патентах США №: 4683202, 4683195, 4800159, 4965188 и 5512462, описания которых включены сюда посредством ссылки. В репрезентативных реакциях амплификации методом ПЦР реакционную смесь, которая включает в себя описанные выше высвобожденные молекулы ДНК, например кДНК, с чипа, объединяют с одним или более праймерами, которые применяют в реакции удлинения праймеров, например, ПЦР-праймерами, которые гибридизуются с первой и/или второй областями амплификации (такими как прямой и обратный праймеры, используемые в геометрической (или экспоненциальной) амплификации, или единственный праймер, используемый в линейной амплификации). Олигонуклеотидные праймеры, с которыми контактируют высвобожденные молекулы ДНК, например кДНК (далее для удобства называемые как матричная ДНК), будут иметь достаточную длину для обеспечения гибридизации с комплементарной матричной ДНК в условиях отжига (описанных более подробно ниже). Длина праймеров будет зависеть от длины областей амплификации, но как правило будет составлять по меньшей мере 10 п.о. в длину, обычно по меньшей мере 15 п.о. в длину и чаще всего по меньшей мере 16 п.о. в длину и может составлять до 30 п.о. в длину или более, при этом длина праймеров как правило будет находиться в диапазоне от 18 до 50 п.о. в длину, обычно от примерно 20 до 35 п.о. в длину. Матричная ДНК может быть приведена в контакт с одним праймером или набором из двух праймеров (прямого и обратного праймеров), в зависимости от того, что является желательным: удлинение праймера либо линейная или экспоненциальная амплификация матричной ДНК.
Помимо указанных выше компонентов реакционная смесь, приготовленная в способах, являющихся объектом изобретения, обычно включает в себя полимеразу и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP). Желаемую полимеразную активность можно обеспечить путем использования одного или более чем одного из различных ферментов полимераз. Во многих воплощениях реакционная смесь включает в себя по меньшей мере полимеразу семейства А, при этом репрезентативные представляющие интерес полимеразы семейства А включают, без ограничения ими: полимеразы Thermus aquaticus, в том числе природную полимеразу (Taq) и ее производные и гомологи, такие как Klentaq (как описано в Barnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 2216-2220); полимеразы Thermus thermophilus, в том числе природную полимеразу (Tth) и ее производные и гомологи, и тому подобное. В некоторых воплощениях, где проводимая реакция амплификации представляет собой реакцию с высокой точностью воспроизведения, реакционная смесь может дополнительно включать в себя фермент полимеразу, обладающую 3′-5′-экзонуклеазной активностью, например, что можно обеспечить путем использования полимеразы семейства В, при этом представляющие интерес полимеразы семейства В включают, без ограничения ими: ДНК-полимеразу Thermococcus litoralis (Vent), которая описана в Perler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 5577-5581; Pyrococcus species GB-D (Deep Vent); ДНК-полимеразу Pyrococcus furiosus (Pfu), которая описана в Lundberg et al., Gene (1991) 108: 1-6; Pyrococcus woesei (Pwo) и тому подобные. Если реакционная смесь включает в себя полимеразу как семейства А, так и семейства В, то полимераза семейства А может быть представлена в реакционной смеси в большем количестве, чем полимераза семейства В, причем разница в активности обычно будет по меньшей мере 10-кратной и чаще всего по меньшей мере примерно 100-кратной. Обычно реакционная смесь будет включать в себя четыре разных типа dNTP, т.е. dATP, dTTP, dCTP и dGTP, соответствующих имеющимся четырем природным основаниям. В способах, являющихся объектом изобретения, каждый dNTP обычно будет представлен в концентрации, находящейся в пределах от примерно 10 до 5000 мкМ, обычно от примерно 20 до 1000 мкМ.
Реакционные смеси, приготовленные на стадиях с использованием обратной транскриптазы и/или амплификации в способах, являющихся объектом изобретения, могут дополнительно включать водную буферную среду, в состав которой входят источник одновалентных ионов, источник двухвалентных катионов и буферный агент. Можно использовать любой подходящий источник одновалентных ионов, такой как KCL, K-ацетат, NH4-ацетат, K-глутамат, NH4Cl, сульфат аммония и тому подобные. Двухвалентным катионом может быть катион магния, марганца, цинка и тому подобных, причем обычно катионом будет магний. Можно использовать любой подходящий источник катиона магния, в том числе MgCl2, Mg-ацетат и тому подобные. Концентрация Mg2+, присутствующего в буфере, может находиться в пределах от 0,5 до 10 мМ, однако предпочтительно будет находиться в пределах от примерно 3 до 6 мМ и в идеальном случае будет составлять примерно 5 мМ. Репрезентативные буферные агенты или соли, которые могут присутствовать в буфере, включают трис, трицин, HEPES (N-2-гидроксиэтил-пиперазин-N-2-этансульфоновая кислота), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота) и тому подобное, где концентрация буферного агента в типичном случае будет находиться в пределах от примерно 5 до 150 мМ, обычно от примерно 10 до 100 мМ и чаще всего от примерно 20 до 50 мМ, причем в некоторых предпочтительных воплощениях буферный агент будет присутствовать в количестве, достаточном для получения рН в диапазоне от примерно 6,0 до 9,5, где наиболее предпочтительным является рН 7,3 при 72°С. Другие агенты, которые могут присутствовать в буферной среде, включают хелатирующие агенты, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), EGTA (этиленгликоль-тетрауксусная кислота) и тому подобное.
При приготовлении реакционной смеси для обратной транскриптазы, удлинения или амплификации ДНК на стадиях способов, являющихся предметом изобретения, различные составляющие компоненты могут быть объединены в любом удобном порядке. Например, буфер в реакции амплификации можно объединить с праймером, полимеразой и затем матричной ДНК или можно единовременно объединить все разнообразные составляющие компоненты с получением реакционной смеси.
Как обсуждалось выше, в предпочтительном воплощении изобретения, молекулы ДНК, например кДНК, могут быть модифицированы посредством добавления областей амплификации к концам молекул нуклеиновой кислоты, что может включать реакцию лигирования. Реакция лигирования также необходима для синтеза in situ захватывающего зонда на чипе, когда захватывающий зонд иммобилизуют на поверхности чипа опосредованно.
Как известно в данной области, лигазы катализируют образование фосфодиэфирной связи между расположенными рядом З′-гидроксильным и 5′-фосфатным концами двух непосредственно примыкающих друг к другу нуклеиновых кислот. Можно использовать любую подходящую лигазу, при этом представляющие интерес репрезентативные лигазы включают, без ограничения ими, термочувствительные и термостабильные лигазы. Термочувствительные лигазы включают, без ограничения ими, ДНК-лигазу бактериофага Т4, лигазу бактериофага Т7 и лигазу Е. coli. Термостабильные лигазы включают, без ограничения ими, Taq-лигазу, Tth-лигазу и Pfu-лигазу. Термостабильная лигаза может быть получена из термофильных или гипертермофильных организмов, включая, без ограничения ими, прокариотические организмы, эукариотические организмы или археи. В способах по изобретению также могут быть применены некоторые РНК-лигазы.
На этой стадии лигирования подходящую лигазу и все необходимые и/или желательные реагенты объединяют с реакционной смесью и поддерживают в условиях, достаточных для того, чтобы произошло лигирование релевантных олигонуклеотидов. Условия реакции лигирования хорошо известны специалистам в данной области. Во время лигирования реакционную смесь в некоторых воплощениях можно поддерживать при температуре в диапазоне от примерно 4°С до примерно 50°С, как например от примерно 20°С до примерно 37°С, в течение периода времени в диапазоне от примерно 5 секунд до примерно 16 часов, как например от примерно 1 минуты до примерно 1 часа. В других воплощениях реакционную смесь можно поддерживать при температуре в диапазоне от примерно 35°С до примерно 45°С, как например от примерно 37°С до примерно 42°С, например, при температуре, равной или составляющей примерно 38°С, 39°С, 40°С или 41°С, в течение периода времени в диапазоне от примерно 5 секунд до примерно 16 часов, как например от примерно 1 минуты до примерно 1 часа, в том числе от примерно 2 минут до примерно 8 часов. В репрезентативном воплощении смесь для проведения реакции лигирования включает в себя 50 мМ Трис рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT (дитиотреит), 1 мМ АТФ (аденозинтрифосфат), BSA (бычий сывороточный альбумин) (25 мг/мл), ингибитор РНКаз (0,25 единицы/мл) и Т4 ДНК-лигазу (0,125 единицы/мл). В еще одном репрезентативном воплощении применяют ионы магния (2,125 мМ), ингибитор РНКаз (0,2 единицы/мл) и ДНК-лигазу (0,125 единицы/мл). Количество адаптера в реакции будет зависеть от концентрации ДНК, например кДНК, в образце и, как правило, будет находиться в диапазоне 10-100-кратного молярного избытка по отношению к ДНК, например кДНК.
В качестве репрезентативного примера способ по изобретению может включать следующие стадии:
(а) приведение чипа в контакт с образцом ткани, где чип содержит подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера обратной транскриптазы (ОТ), где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область;
так что РНК образца ткани гибридизуется с указанными захватывающими зондами;
(б) визуализация образца ткани на чипе;
(в) обратное транскрибирование захваченных молекул мРНК для синтеза молекул кДНК;
(г) промывка чипа для удаления оставшейся ткани;
(д) высвобождение по меньшей мере части молекул кДНК с поверхности чипа;
(е) проведение синтеза второй нити кДНК на высвобожденных молекулах кДНК;
(ж) анализ последовательности (например, секвенирование) молекул кДНК.
В качестве альтернативного репрезентативного примера способ по изобретению может включать следующие стадии:
(а) приведение чипа в контакт с образцом ткани, где чип содержит подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы по меньшей мере две разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера обратной транскриптазы (ОТ), где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область;
так что РНК образца ткани гибридизуется с указанными захватывающими зондами;
(б) возможно регидратация образца ткани;
(в) обратное транскрибирование захваченных молекул мРНК для синтеза первых нитей молекул кДНК и возможно синтез вторых нитей молекул кДНК;
(г) визуализация образца ткани на чипе;
(д) промывка чипа для удаления оставшейся ткани;
(е) высвобождение по меньшей мере части молекул кДНК с поверхности чипа;
(ж) амплификация высвобожденных молекул кДНК;
и
(з) анализ последовательности (например, секвенирование) амплифицированных молекул кДНК.
В качестве еще одного репрезентативного примера способ по изобретению может включать следующие стадии:
(а) приведение чипа в контакт с образцом ткани, где чип содержит подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера обратной транскриптазы (ОТ), где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область;
так что РНК образца ткани гибридизуется с указанными захватывающими зондами;
(б) возможно визуализация образца ткани на чипе;
(в) обратное транскрибирование захваченных молекул мРНК для синтеза молекул кДНК;
(г) возможно визуализация образца ткани на чипе, если она еще не проведена, как на стадии (б);
(д) промывка чипа для удаления оставшейся ткани;
(е) высвобождение по меньшей мере части молекул кДНК с поверхности чипа;
(ж) проведение синтеза второй нити кДНК на высвобожденных молекулах кДНК;
(з) амплификация двунитевых молекул кДНК;
(и) возможно очистка молекул кДНК для удаления компонентов, которые могут служить помехой проведению реакции секвенирования;
и
(к) анализ последовательности (например, секвенирование) амплифицированных молекул кДНК.
Настоящее изобретение включает любую подходящую комбинацию стадий в вышеописанных способах. Очевидно, что данное изобретение также охватывает вариации этих способов, например те, где амплификацию осуществляют на чипе in situ. Также охвачены способы, в которых пропущена стадия визуализации.
Также можно отметить, что данное изобретение включает способ изготовления или получения чипа (1) для применения в захвате мРНК из образца ткани, который приводят в контакт с указанным чипом; или (2) для применения в определении и/или анализе (например, частичного или общего) транскриптома образца ткани, причем указанный способ включает иммобилизацию многочисленных разновидностей захватывающего зонда непосредственно или опосредованно на подложке чипа, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе; и
(2) захватывающую область.
Кроме того, способ изготовления чипа по изобретению можно определить как способ, где каждая разновидность захватывающего зонда иммобилизована в виде элемента на чипе.
Способ иммобилизации захватывающих зондов на чипе может быть осуществлен с использованием любого подходящего средства, как изложено в данном описании. В том случае, когда захватывающие зонды иммобилизованы на чипе опосредованно, захватывающий зонд может быть синтезирован на чипе. Указанный способ может включать любую одну или более чем одну из следующих стадий:
(а) иммобилизация многочисленных поверхностных зондов непосредственно или опосредованно на подложке чипа, где поверхностные зонды содержат:
(1) область, способную к гибридизации с частью олигонуклеотида захватывающей области (частью, не вовлеченной в захват нуклеиновой кислоты);
(2) комплементарную позиционную область; и
(3) комплементарную универсальную область;
(б) гибридизация олигонуклеотидов захватывающих областей и олигонуклеотидов универсальных областей с поверхностными зондами, иммобилизованными на чипе;
(в) удлинение олигонуклеотидов универсальных областей, посредством матричной полимеризации, для синтеза позиционной области захватывающего зонда;и
(г) лигирование позиционной области с олигонуклеотидом захватывающей области для получения захватывающего олигонуклеотида.
Лигирование на стадии (г) может происходить одновременно с удлинением на стадии (в). Таким образом, нет необходимости проводить его в виде отдельной стадии, хотя при желании такое, несомненно, осуществляют.
Элементы чипа, изготовленного указанным выше способом изготовления чипа по изобретению, также могут быть определены в соответствии с приведенным выше описанием.
Несмотря на то, что данное изобретение описано выше со ссылкой на детекцию или анализ РНК и транскриптомный анализ или детекцию, будет очевидно, что описанные принципы аналогичным образом могут быть приемлемы в детекции или анализе ДНК в клетках и в геномных исследованиях. Таким образом, при более широком рассмотрении можно считать, что данное изобретение главным образом применимо для детекции нуклеиновых кислот в целом и в другом более конкретном аспекте, как предоставляющее способы для анализа или детекции ДНК. Пространственная информация может быть полезной также в случае геномики, т.е. детекции и/или анализа молекул ДНК с пространственным разрешением. Этого можно достичь, используя геномное мечение по настоящему изобретению. Такие способы локализованной или пространственной детекции могут быть полезны, например, в случае изучения геномных вариаций в различных клетках или участках ткани, например при сравнении нормальных и больных клеток или тканей (например, нормальных и опухолевых клеток или тканей) или при изучении изменений в геноме при прогрессировании заболеваний и т.д. Например, опухолевые ткани могут содержать гетерогенную популяцию клеток, которые могут отличаться вариантами генома, которые они содержат (например, мутациями и/или другими генетическими аберрациями, например хромосомными перестройками, хромосомными амплификациями/делециями/инсерциями и т.д.). Детекция геномных вариаций или разных геномных локусов в различных клетках по месту локализации может быть полезна в этом контексте, например для изучения пространственного распределения геномных вариаций. Принципиальным было бы применение такого способа в анализе опухолей. В контексте настоящего изобретения может быть получен чип, сконструированный, например, для захвата генома целой клетки на одном элементе. Таким образом можно сравнивать разные клетки в образце ткани. Несомненно, данное изобретение не ограничено такой конструкцией, и возможны другие варианты, где детекцию ДНК осуществляют по месту локализации и положение захваченной на чипе ДНК сопоставляют с положением или локализацией в образце ткани.
Соответственно, можно отметить, что в более общем аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ локализованной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани, включающий:
(а) предоставление чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера в реакции удлинения или лигирования праймера, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область;
(б) приведение указанного чипа в контакт с образцом ткани таким образом, что положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани, и предоставление возможности нуклеиновой кислоте образца ткани гибридизоваться с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах;
(в) синтез молекул ДНК на основе захваченных молекул нуклеиновой кислоты с использованием указанных захватывающих зондов в качестве праймеров удлинения или лигирования, где указанные удлиненные или лигированные молекулы ДНК являются мечеными благодаря позиционной области;
(г) возможно синтез комплементарной нити указанной меченой ДНК и/или возможно амплификацию указанной меченой ДНК;
(д) высвобождение по меньшей мере части меченых молекул ДНК и/или их комплементов или ампликонов с поверхности чипа, где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент; и
(е) прямой или опосредованный анализ последовательности (например, секвенирование) высвобожденных молекул ДНК.
Как описано более подробно ниже, на стадии анализа может быть использован любой метод анализа нуклеиновой кислоты. В типичном случае он может включать секвенирование, но необходимости в фактическом определении последовательности нет. Например, можно использовать специфичные к последовательности методы анализа. Например, может быть осуществлена специфичная к последовательности реакция амплификации, например с использованием праймеров, специфичных к позиционной области и/или к специфической целевой последовательности, например конкретной целевой ДНК, детекцию которой необходимо осуществить (т.е. соответствующей конкретной кДНК/РНК или гену, или варианту гена, или геномному локусу, или геномному варианту и т.д.). Типичным методом анализа является специфичная к последовательности ПЦР-реакция.
Информация из анализа последовательности (например, секвенирования) на стадии (е) может быть использована для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце. Другими словами, информация из анализа последовательности может обеспечить получение информации о локализации нуклеиновой кислоты в образце. Эта пространственная информация может вытекать из природы информации, полученной из анализа последовательности, например, из определенной и идентифицированной последовательности, например, она может отражать наличие конкретной молекулы нуклеиновой кислоты, которая сама может быть информативна в пространственном отношении в случае используемого образца ткани, и/или пространственная информация (например, пространственная локализация) может вытекать из положения образца ткани на чипе, в сочетании с информацией, полученной в результате секвенирования. Однако, как описано выше, пространственная информация соответственно может быть получена посредством сопоставления данных из анализа последовательности с изображением образца ткани, и это представляет собой одно из предпочтительных воплощений изобретения.
Соответственно, в предпочтительном воплощении данный способ также включает стадию:
(ж) сопоставления информации из анализа указанной последовательности с изображением указанного образца ткани, где изображение образца ткани получают до или после стадии (в).
Реакция удлинения праймера, упомянутая на стадии (а), может быть определена как катализируемая полимеразой реакция удлинения нити, и ее результатом является получение комплементарной нити молекулы захваченной нуклеиновой кислоты, которая присоединена ковалентно к захватывающему зонду, т.е. путем синтеза комплементарной нити с использованием захватывающего зонда в качестве праймера и захваченной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы. Другими словами, это может быть любая реакция удлинения праймеров, осуществляемая любым ферментом полимеразой. Нуклеиновой кислотой может быть РНК или ей может быть ДНК. Соответственно, полимеразой может быть любая полимераза. Это может быть обратная транскриптаза или это может быть ДНК-полимераза. Реакция лигирования может быть проведена с помощью любой лигазы, и ее результатом является закрепление комплементарной нити захваченной молекулы нуклеиновой кислоты на захватывающем зонде, т.е. когда захваченная молекула нуклеиновой кислоты (гибридизованной с захватывающим зондом) является частично двунитевой и комплементарная нить лигирована с захватывающим зондом.
Одним из предпочтительных воплощений такого способа является способ, описанный выше для определения и/или анализа транскриптома или для детекции РНК. В альтернативном предпочтительном воплощении детектируемой молекулой нуклеиновой кислоты является ДНК. В таком воплощении согласно изобретению предложен способ локализованной детекции ДНК в образце ткани, включающий:
(а) предоставление чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера в реакции удлинения или лигирования праймера, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область;
(б) приведение указанного чипа в контакт с образцом ткани таким образом, что положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани, и предоставление возможности ДНК образца ткани гибридизоваться с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах;
(в) фрагментацию ДНК в указанном образце ткани, которую осуществляют до, в процессе или после приведения чипа в контакт с образцом ткани на стадии (б);
(г) удлинение указанных захватывающих зондов в реакции удлинения праймеров с использованием захваченных фрагментов ДНК в качестве матриц для синтеза удлиненных молекул ДНК или лигирование захваченных фрагментов ДНК с захватывающими зондами в реакции лигирования для синтеза лигированных молекул ДНК, где указанные удлиненные или лигированные молекулы ДНК являются мечеными благодаря позиционной области;
(д) возможно синтез комплементарной нити указанной меченой ДНК и/или возможно амплификацию указанной меченой ДНК;
(е) высвобождение по меньшей мере части меченых молекул ДНК и/или их комплементов и/или ампликонов с поверхности чипа, где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент;
(ж) прямой или опосредованный анализ последовательности высвобожденных молекул ДНК.
Данный способ может дополнительно включать стадию:
(з) сопоставления информации из анализа указанной последовательности с изображением указанного образца ткани, где изображение образца ткани получают до или после стадии (г).
В случае пространственной геномики, где целевой нуклеиновой кислотой является ДНК, предпочтительным в некоторых обстоятельствах может быть включение стадий визуализации и сопоставления изображений.
В тех воплощениях, где осуществляется захват ДНК, эта ДНК может представлять собой любую молекулу ДНК, которая может встречаться в клетке. Таким образом, это может быть геномная, т.е. ядерная, ДНК, митохондриальная ДНК или пластидная ДНК, например ДНК хлоропластов. В предпочтительном воплощении ДНК представляет собой геномную ДНК.
Очевидно, что если фрагментацию осуществляют после приведения в контакт на стадии (б), т.е. после помещения образца ткани на чип, то фрагментация происходит до того, как ДНК гибридизуется с захватывающей областью. Другими словами, с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах гибридизуются фрагменты ДНК (или более конкретно, имеют возможность гибридизоваться).
Предпочтительно, но необязательно, в конкретном воплощении этого аспекта изобретения во фрагментах ДНК образца ткани может быть предусмотрена связывающая область, чтобы обеспечить или облегчить их захват захватывающими зондами на чипе. Соответственно, эта связывающая область способна гибридизоваться с захватывающей областью захватывающего зонда. Поэтому такую связывающую область можно рассматривать как комплемент захватывающей области (т.е. она может считаться комплементарной захватывающей областью), хотя абсолютной комплементарности между захватывающей и связывающей областями не требуется, необходимо лишь, чтобы связывающая область была комплементарна в достаточной степени для осуществления продуктивной гибридизации, т.е. чтобы фрагменты ДНК в образце ткани были способны гибридизоваться с захватывающей областью захватывающих зондов. Обеспечение такой связывающей области может гарантировать, что ДНК, находящаяся в образце, не свяжется с захватывающими зондами до окончания стадии фрагментации. Снабжение фрагментов ДНК связывающей областью можно осуществить с использованием методик, хорошо известных в данной области, например, путем лигирования с адаптерной или линкерной последовательностями, которые могут содержать связывающую область. Например, можно использовать линкерную последовательность с выступающим концом. Связывающая область может находиться в однонитевой части такого линкера, так что после лигирования линкера с фрагментами ДНК такая однонитевая часть, содержащая связывающую область, будет доступна для гибридизации с захватывающей областью захватывающих зондов. Альтернативно и в предпочтительном воплощении связывающую область можно ввести, используя фермент концевую трансферазу, применяемую для введения полинуклеотидного хвоста, например гомополимерного хвоста, такого как поли(А)-область. Это может быть осуществлено с использованием методики, аналогичной описанной выше для введения универсальной области в случае методов с использованием РНК. Таким образом, в предпочтительных воплощениях можно ввести общую связывающую область. Другими словами, связывающую область, которая является общей для всех фрагментов ДНК и которая может быть использована для достижения захвата фрагментов на чипе.
Если реакцию наращивания хвоста проводят для введения (общей) связывающей области, то захватывающие зонды на чипе могут быть защищены от реакции наращивания хвоста, т.е. захватывающие зонды могут быть блокированы или замаскированы, как описано выше. Этого можно достичь, например, посредством гибридизации блокирующего олигонуклеотида с захватывающим зондом, например с выступающим концом (например, однонитевой частью) захватывающего зонда. Когда захватывающая область содержит, например, поли(Т)-последовательность, таким блокирующим олигонуклеотидом может быть поли(А)-олигонуклеотид. Блокирующий олигонуклеотид может иметь блокированный 3′-конец (т.е. конец, который невозможно удлинить или нарастить). Захватывающие зонды также можно защитить, т.е. блокировать, посредством химических и/или ферментативных модификаций, как подробно описано выше.
Если обеспечение связывающей области осуществляют посредством лигирования линкера, как описано выше, будет очевидно, что вместо удлинения захватывающего зонда для синтеза комплементарной копии захваченного фрагмента ДНК, который содержит позиционную метку праймера захватывающего зонда, фрагмент ДНК можно лигировать с 3′-концом захватывающего зонда. Как указано выше, для осуществления лигирования необходимо, чтобы подлежащий лигированию 5′-конец был фосфорилирован. Соответственно, в одном из воплощений 5′-конец добавленного линкера, а именно, подлежащий лигированию с захватывающим зондом конец (т.е. невыступающий конец линкера, добавленного к фрагментам ДНК), будет фосфорилирован. В таком воплощении с использованием лигирования, соответственно, будет видно, что линкер может быть лигирован с фрагментами двунитевой ДНК, причем указанный линкер имеет однонитевой выступающий 3′-конец, который содержит связывающую область. При контакте с чипом выступающий конец гибридизуется с захватывающей областью захватывающих зондов. В результате этой гибридизации 3′-конец захватывающего зонда приходит в непосредственную необходимую для лигирования близость с 5′-концом (невыступающим концом) добавленного линкера. Таким образом, захватывающий зонд и, следовательно, позиционная область встраивается в захваченный фрагмент ДНК в результате этого лигирования. Подобное воплощение показано схематично на Фиг.21.
Таким образом, способ по этому аспекту изобретения в более конкретном воплощении может включать:
(а) предоставление чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера в реакции удлинения или лигирования праймера, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область;
(б) приведение указанного чипа в контакт с образцом ткани таким образом, что положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани;
(в) фрагментацию ДНК в указанном образце ткани, которую осуществляют до, в процессе или после приведения чипа в контакт с образцом ткани на стадии (б);
(г) обеспечение указанных фрагментов ДНК связывающей областью, которая способна гибридизоваться с указанной захватывающей областью;
(д) предоставление возможности указанным фрагментам ДНК гибридизоваться с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах;
(е) удлинение указанных захватывающих зондов в реакции удлинения праймеров с использованием захваченных фрагментов ДНК в качестве матриц для синтеза удлиненных молекул ДНК или лигирование захваченных фрагментов ДНК с захватывающими зондами в реакции лигирования для синтеза лигированных молекул ДНК, где указанные удлиненные или лигированные молекулы ДНК являются мечеными благодаря позиционной области;
(ж) возможно синтез комплементарной нити указанной меченой ДНК и/или возможно амплификацию меченой ДНК;
(з) высвобождение по меньшей мере части меченых молекул ДНК и/или их комплементов и/или ампликонов с поверхности чипа, где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент;
(и) прямой или опосредованный анализ последовательности высвобожденных молекул ДНК.
Данный способ возможно может включать дополнительную стадию:
(к) сопоставления информации из анализа указанной последовательности с изображением указанного образца ткани, где изображение образца ткани получают до или после стадии (е).
В приведенных выше способах детекции нуклеиновой кислоты или ДНК возможная стадия синтеза комплементарной копии меченой нуклеиновой кислоты/ДНК или амплификации меченой ДНК может включать в себя применение фермента полимеразы замещения нити согласно принципам, разъясненным выше в отношении способов анализа/детекции РНК/транскриптома. Подходящие полимеразы замещения нити рассмотрены выше. Это необходимо для того, чтобы гарантировать копирование позиционной области с образованием комплементарной копии или ампликона. В частности, это будет в том случае, когда захватывающий зонд иммобилизован на чипе посредством гибридизации с поверхностным зондом.
Однако, применение полимеразы замещения нити на этой стадии не является обязательным. Например, вместе с лигированием олигонуклеотида, который гибридизуется с позиционной областью, можно использовать полимеразу, не обладающую активностью замещения нити. Такая методика аналогична методике, описанной выше для синтеза захватывающих зондов на чипе.
В одном из воплощений способ по изобретению может быть использован для определения и/или анализа всего генома образца ткани, например общего генома образца ткани. Однако, способ этим не ограничивается и охватывает определение и/или анализ всего или части генома. Таким образом, способ может включать в себя определение и/или анализ части или подмножества генома, например частичного генома, соответствующего подмножеству или группе генов или хромосом, например набору конкретных генов или хромосом либо конкретному участку или части генома, например имеющих отношение к конкретному заболеванию или состоянию, типу ткани и т.д. Таким образом, данный способ может быть использован для детекции или анализа геномных последовательностей или геномных локусов из опухолевой ткани в сравнении с нормальной тканью или даже в пределах разных типов клеток в образце ткани. Можно исследовать наличие или отсутствие либо распределение или локализацию разных геномных вариантов или локусов в различных клетках, группах клеток, тканях или частях или типах ткани.
С точки зрения другого аспекта, изложенные выше стадии способа можно рассматривать в качестве предложения способа получения информации о пространственной локализации, касающейся нуклеиновых кислот, например геномных последовательностей, вариантов или локусов образца ткани. Другими словами, способы по изобретению могут быть использованы для введения метки в геномы (или мечения геномов), в частности, отдельные или пространственно-распределенные геномы.
С альтернативной точки зрения способ по изобретению можно рассматривать как способ пространственной детекции ДНК в образце ткани, или способ детекции ДНК с пространственным разрешением, или способ локализованного или пространственного определения и/или анализа ДНК в образце ткани. В частности, данный способ можно использовать для локализованной или пространственной детекции либо определения и/или анализа генов или геномных последовательностей либо геномных вариантов или локусов (например, распределения геномных вариантов или локусов) в образце ткани. Термин "локализованная/пространственная детекция/определение/анализ" означает, что ДНК может быть локализована в соответствии с ее природным(ой) положением или локализацией внутри клетки или ткани в образце ткани. Так например, ДНК может быть локализована в клетке, или группе клеток, или типе клеток в образце либо в конкретных участках областей в образце ткани. Можно определить природную(ое) локализацию или положение ДНК (или другими словами, локализацию или положение ДНК в образце ткани), например геномного варианта или локуса.
В силу вышесказанного можно отметить, что чип по настоящему изобретению может быть использован для захвата нуклеиновой кислоты, например ДНК, образца ткани, который приводят в контакт с указанным чипом. Данный чип также можно использовать для определения и/или анализа частичного или общего генома образца ткани или для получения определяемого в пространстве частичного или общего генома образца ткани. Таким образом, способы по изобретению можно рассматривать как способы количественного определения пространственного распределения одной или более геномных последовательностей (или вариантов или локусов) в образце ткани. Выражаясь по-другому, способы по настоящему изобретению могут быть использованы для детекции пространственного распределения одной или более геномных последовательностей либо одного или более геномных вариантов или геномных локусов в образце ткани. Иначе, способы по настоящему изобретению могут быть использованы для одновременного определения локализации или распределения одной или более геномных последовательностей либо одного или более геномных вариантов или геномных локусов в одном или более положениях в образце ткани. Более того, данные способы можно рассматривать как способы частичного или общего анализа нуклеиновой кислоты, например ДНК, образца ткани с пространственным разрешением, например, с двумерным пространственным разрешением.
Также можно отметить, что согласно изобретению предложен чип для применения в способах по изобретению, содержащий подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера удлинения или лигирования, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область для захвата нуклеиновой кислоты образца ткани, который приводят в контакт с указанным чипом.
В одном из аспектов подлежащей захвату молекулой нуклеиновой кислоты является ДНК. Захватывающая область может быть специфичной к конкретной подлежащей детекции ДНК или к конкретному классу или группе ДНК, например вследствие специфичной гибридизации со специфической последовательностью мотива в целевой ДНК, например консервативной последовательностью, по аналогии со способами, описанными выше в случае детекции РНК. Альтернативно, подлежащая захвату ДНК может быть снабжена связывающей областью, например общей связывающей областью, как описано выше, при этом связывающая область может распознаваться захватывающей областью захватывающих зондов. Так, как указано выше, связывающая область может представлять собой, например, гомополимерную последовательность, например поли(А). Опять же, такая связывающая область может быть предусмотрена согласно или аналогично принципам и способам, описанным выше в отношении способов для анализа или детекции РНК/транскриптома. В этом случае захватывающая область может быть комплементарна связывающей области, введенной в молекулы ДНК образца ткани.
Так же, как описано выше в случае РНК, захватывающая область может представлять собой случайную или вырожденную последовательность. Таким образом, ДНК может быть захвачена неспецифично посредством связывания со случайной или вырожденной захватывающей областью или с захватывающей областью, которая содержит по меньшей мере частично случайную или вырожденную последовательность.
В родственном аспекте согласно настоящему изобретению также предложено применение чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающего зонда, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера удлинения или лигирования, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе; и
(2) захватывающую область;
для захвата нуклеиновой кислоты, например ДНК или РНК, образца ткани который приводят в контакт с указанным чипом.
Предпочтительно, указанное применение относится к локализованной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани и дополнительно включает стадии:
(а) синтеза молекул ДНК на основе захваченных молекул нуклеиновой кислоты с использованием указанных захватывающих зондов в качестве праймеров удлинения или лигирования, где указанные удлиненные или лигированные молекулы являются мечеными благодаря позиционной области;
(б) возможно синтеза комплементарной нити указанной меченой нуклеиновой кислоты и/или амплификации указанной меченой нуклеиновой кислоты;
(в) высвобождения по меньшей мере части меченых молекул ДНК и/или их комплементов или ампликонов с поверхности чипа, где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент;
(г) прямого или опосредованного анализа последовательности высвобожденных молекул ДНК; и возможно
(д) сопоставления информации, полученной из указанного анализа последовательности, с изображением указанного образца ткани, где изображение образца ткани получают до или после стадии (а).
Стадия фрагментирования ДНК в образце ткани может быть проведена с использованием любой желаемой методики, известной в данной области. Так, можно использовать физические методы фрагментации, например разрушение ультразвуком или обработку ультразвуком. Также известны химические методы. Помимо этого можно использовать ферментативные методы фрагментации, например с применением эндонуклеаз, например, ферментов рестрикции. Опять же, используемые для этого методы и ферменты хорошо известны в данной области. Фрагментация может быть осуществлена до, во время или после приготовления образца ткани для размещения его на чипе, например, приготовления среза ткани. В целях удобства фрагментация может быть осуществлена на стадии фиксации ткани. Так, например, фиксация формалином может приводить к фрагментации ДНК. Применение других фиксаторов может давать аналогичные результаты.
Что касается подробностей приготовления и использования чипов в соответствии с этими аспектами изобретения, то будет понятно, что описание и подробности, приведенные выше в случае способов для РНК, точно так же применимы к более общим способам детекции нуклеиновых кислот и ДНК, изложенным в данном описании. Таким образом, все аспекты и подробности, рассмотренные выше, применимы аналогично. Например, обсуждение, касающееся праймеров для обратной транскриптазы и реакций с ее участием и т.д. аналогичным образом может быть применено к любому аспекту в отношении праймеров удлинения, полимеразной реакции и т.д., упомянутых выше. Подобным же образом, ссылки на синтез первой и второй нити «ДНК могут быть применены аналогично к меченой молекуле ДНК и ее комплементу. Можно использовать способы анализа последовательности, которые рассмотрены выше.
В качестве примера, захватывающая область может быть такой, как она описана выше для захватывающих зондов. Например, можно использовать захватывающую область в виде поли(Т) или области, содержащей поли(Т), когда фрагменты ДНК снабжены связывающей областью, содержащей поли(А)-последовательность.
Захватывающие зонды/меченые молекулы ДНК (т.е. меченые удлиненные или лигированные молекулы) могут быть снабжены универсальными областями, как описано выше, например, для амплификации и/или расщепления.
Далее изобретение будет описано следующими неограничивающими примерами со ссылкой на приведенные ниже графические материалы, в которых:
на Фиг.1 показана общая концепция использования организованных в виде чипа "штрихкодовых" олиго(dT)-зондов для захвата мРНК из срезов тканей для проведения транскриптомного анализа;
на Фиг.2 показана схема визуализации присутствия транскриптов для соответствующих срезов ткани;
на Фиг.3 показано строение ориентированного от 3′ к 5′ поверхностного зонда и синтез ориентированных от 5′ к 3′ захватывающих зондов, которые иммобилизованы на поверхности чипа опосредованно;
на Фиг.4 показана гистограмма, демонстрирующая эффективность высвобождения под действием ферментов (USER или Rsal) с чипов собственной разработки и под действием воды (99°С) с чипов производства Agilent, по результатам измерений гибридизации зондов, меченных флуоресцентной меткой, с поверхностью чипов после высвобождения зондов;
на Фиг.5 показано флуоресцентное изображение после опосредованного водой (99°С) высвобождения ДНК поверхностных зондов с промышленных чипов производства Agilent. Гибридизацию флуоресцентного детектирующего зонда осуществляли после обработки горячей водой. Верхний чип представляет собой не подвергнутый обработке контроль;
на Фиг.6 показан фиксированный срез ткани головного мозга мыши на поверхности захватывающего чипа для анализа транскриптома после синтеза кДНК и обработки красителями, окрашивающими цитоплазму (вверху) и ядра (посередине), соответственно, и совмещенное изображение, демонстрирующее оба типа окрашивания (внизу);
на Фиг.7 показана таблица, в которой перечислены результаты считываний, отсортированных относительно их исходного положения, по всему ДНК-захватывающему чипу низкой плотности собственной разработки, как показано схематическим представлением;
на Фиг.8 показана FFPE-ткань головного мозга мыши со специфичными к ядрам и Мар2 (белок, ассоциированный с микротрубочками) красителями с использованием штрихкодового микрочипа;
на Фиг.9 показана FFPE-ткань обонятельной луковицы головного мозга мыши с окрашиванием ядер (белый цвет) и различимой морфологией;
на Фиг.10 показана FFPE-ткань обонятельной луковицы головного мозга мыши (прибл. 2×2 мм) с окрашиванием ядер (белый цвет), с наложением полученной теоретически картины расположения пятен для чипа низкого разрешения;
на Фиг.11 показана FFPE-ткань обонятельной луковицы головного мозга мыши (прибл. 2×2 мм) с окрашиванием ядер (белый цвет), с наложением полученной теоретически картины расположения пятен для чипа умеренно высокого разрешения;
на Фиг.12 показана FFPE-ткань обонятельной луковицы головного мозга мыши при увеличении клубочковой зоны (правый верхний угол Фиг.9);
на Фиг.13 показан продукт, полученный в результате высвобождения под действием USER в процессе амплификации с использованием случайного гексамерного праймера (R6), соединенного с "В_ручкой", (B_R6); продукт, зарегистрированный на биоанализаторе;
на Фиг.14 показан продукт, полученный в результате высвобождения под действием USER в процессе амплификации с использованием случайного октамерного праймера (R8), соединенного с "В_ручкой", (B_R8); продукт, зарегистрированный на биоанализаторе;
на Фиг.15 показаны результаты эксперимента, проведенного на FFPE-ткани головного мозга, покрывающей весь чип.ID5 (слева) и ID20 (справа) амплифицированы с использованием ID-специфичных и ген-специфичных праймеров (экзон 4 гена В2М) после синтеза и высвобождения кДНК с поверхности; ID5 и ID20 амплифицированы;
на Фиг.16 показана схематическая иллюстрация принципа способа, описанного в примере 4, т.е. применения микрочипов с иммобилизованными ДНК-олигонуклеотидами (захватывающими зондами), несущими последовательности с маркирующими метками для пространственной локализации (позиционные области). Каждый элемент из олигонуклеотидов микрочипа несет 1) уникальную маркирующую метку (позиционную область) и 2) захватывающую последовательность (захватывающую область);
на Фиг.17 показаны результаты описанного в примере 5 протокола пространственной геномики, выполненного с использованием геномной ДНК, предварительно фрагментированной до среднего размера 200 п.о. Внутренние продукты амплифицированы на меченной и синтезированной на чипе ДНК. Зарегистрированный пик соответствует ожидаемому размеру;
на Фиг.18 показаны результаты описанного в примере 5 протокола пространственной геномики, выполненного с использованием геномной ДНК, предварительно фрагментированной до среднего размера 700 п.о. Внутренние продукты амплифицированы на меченной и синтезированной на чипе ДНК. Зарегистрированный пик соответствует ожидаемому размеру;
на Фиг.19 показаны результаты описанного в примере 5 протокола пространственной геномики, выполненного с использованием геномной ДНК, предварительно фрагментированной до среднего размера 200 п.о. Продукты амплифицированы с использованием одного внутреннего праймера и одной универсальной последовательности, содержащейся в поверхностном олигонуклеотиде. Амплификацию проводили на меченной и синтезированной на чипе ДНК. Изображение ожидаемого продукта является размытым ввиду того, что в результате случайной фрагментации и мечения геномной ДНК концевой трансферазой будет образовываться пул разнообразных образцов;
на Фиг.20 показаны результаты описанного в примере 5 протокола пространственной геномики, выполненного с использованием геномной ДНК, предварительно фрагментированной до среднего размера 700 п.о. Продукты амплифицированы с использованием одного внутреннего праймера и одной универсальной последовательности, содержащейся в поверхностном олигонуклеотиде. Амплификацию проводили на меченной и синтезированной на чипе ДНК. Изображение ожидаемого продукта является размытым ввиду того, что в результате случайной фрагментации и мечения геномной ДНК концевой трансферазой будет образовываться пул разнообразных образцов;
на Фиг.21 показана схематическая иллюстрация лигирования линкера с фрагментом ДНК для введения связывающей области для гибридизации с поли(Т)-содержащей захватывающей областью и последующего лигирования с захватывающим зондом;
на Фиг.22 показано строение ориентированных от 5′ к 3′ захватывающих зондов, использованных на захватывающих чипах высокой плотности;
на Фиг.23 показана рамка чипов высокой плотности, которую используют для ориентации образца ткани, с визуализацией посредством гибридизации флуоресцентных маркерных зондов;
на Фиг.24 показаны захватывающие зонды, отщепленные и неотщепленные от чипа высокой плотности, при этом рамочные зонды не отщеплены, поскольку не содержат урациловых оснований. Захватывающие зонды метили флуорофорами, присоединенными к поли(А)-олигонуклеотидам;
на Фиг.25 показано зарегистрированное с использованием биоанализатора изображение полученной библиотеки для секвенирования, содержащей транскрипты, захваченные из обонятельной луковицы мыши;
на Фиг.26 показана визуализация захваченных транскриптов из суммарной РНК, выделенной из обонятельной луковицы мыши, полученная с использованием Matlab;
на Фиг.27 показаны транскрипты Olfr (обонятельного рецептора; англ. olfactory receptor), визуализированные по всему захватывающему чипу с применением Matlab-визуализации после захвата из ткани обонятельной луковицы мыши;
на Фиг.28 показана картина печати для содержащих 41-ID-метку микрочипов собственной разработки;
на Фиг.29 показана библиотека пространственной геномики, созданная на основе специфической транслокации А431 после захвата геномных фрагментов с поли(А)-хвостом на захватывающем чипе;
на Фиг.30 показана детекция специфической транслокации А431 после захвата перенесенных 10% и 50% геномных фрагментов А431 с поли(А)-хвостами в геномные фрагменты U2OS с поли(А)-хвостами на захватывающем чипе;
на Фиг.31 показана Matlab-визуализация захваченных ID-меченных транскриптов из ткани обонятельной луковицы мыши на содержащих 41-ID-метку чипах собственной разработки с наложением изображения ткани. Для наглядности, конкретные элементы, на которых были идентифицированы конкретные гены, обведены кружком.
Пример 1
Изготовление чипа
В приведенных далее экспериментах демонстрируется, как можно присоединить олигонуклеотидные зонды к подложке чипа через 5′- или 3′-конец, чтобы получить чип с захватывающими зондами, способными гибридизоваться смРНК.
Изготовление печатного микрочипа собственной разработки с ориентированными от 5′ к 3′ зондами
На стеклянные слайды наносили в виде пятен 20 РНК-захватывающих олигонуклеотидов с содержащими индивидуальные метки последовательностями (метки 1-20, Таблица 1) в качестве захватывающих зондов. Зонды синтезировали таким образом, чтобы они содержали на 5′-конце аминолинкер с С6-спейсером. Все зонды были синтезированы в Sigma-Aldrich (St. Louis, МО, USA). РНК-захватывающие зонды суспендировали в концентрации 20 мкМ в 150 мМ фосфате натрия, рН 8,5, и наносили в виде пятен, используя наноплоттер (nanoplotter) NP2.1/E (Gesim, Grosserkmannsdorf, Germany), на активированные слайды для микрочипов CodeLink™ (7,5 см×2,5 см; Surmodics, Eden Prairie, MN, USA). После печати осуществляли блокирование поверхности в соответствии с инструкциями производителя. Печать зондов выполняли в виде 16 идентичных чипов на слайде, и каждый чип имел предварительно определенную картину печати. Эти 16 подчипов были отделены друг от друга в процессе гибридизации посредством состоящего из 16 ячеек экрана (ChipClip™, Schleicher & Schuell BioScience, Keene, NH, USA).
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Изготовление печатного микрочипа собственной разработки с ориентированными от 3′ к 5′ зондами и синтез ориентированных от 5′ к 3′ захватывающих зондов
Печать олигонуклеотидов поверхностного зонда осуществляли, как и в приведенном выше случае с ориентированными от 5′ к 3′ зондами, используя линкер амино-С7 на 3′-конце, как показано в Таблице 1.
Чтобы осуществить гибридизацию праймеров для синтеза захватывающих зондов, раствор для гибридизации, содержащий 4×SSC (раствор хлорида и цитрата натрия) и 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), 2 мкМ праймер удлинения (олигонуклеотид универсальной области) и 2 мкМ праймер для соединения нитей (олигонуклеотид захватывающей области) инкубировали в течение 4 мин при 50°С. За это время прикрепляли чип собственной разработки к ChipClip (Whatman). Далее этот чип инкубировали при 50°С в течение 30 мин на шейкере при 300 об./мин вместе с 50 мкл раствора для гибридизации на одну лунку.
После инкубации чип извлекали из ChipClip и промывали, используя 3 приведенные ниже стадии: 1) 50°С, раствор 2×SSC с 0,1% SDS в течение 6 мин на шейкере при 300 об./мин; 2) 0,2×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин; и 3) 0,1×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин. Затем чип сушили в центрифуге и помещали обратно в ChipClip.
Для осуществления реакции удлинения и лигирования (с целью создания позиционной области захватывающего зонда) 50 мкл ферментативной смеси, содержащей 10× буфер для лигазы Ampligase, 2,5 ед. фрагмента Стоффеля AmpliTaq ДНК-полимеразы (Applied Biosystems), Юед. лигазы Ampligase (Epicentre Biotechnologies), dNTP (2 мМ каждый; Fermentas) и воду, вносили в каждую лунку с помощью пипетки. Затем этот чип инкубировали при 55°С в течение 30 мин. После инкубации чип промывали в соответствии с описанным ранее способом промывки чипа, но продолжительность первой стадии составляла 10 мин вместо 6 мин.
Способ проиллюстрирован на Фиг.3.
Подготовка ткани
Приведенные далее эксперименты демонстрируют, как можно изготовить срезы образцов ткани для применения в способах по изобретению.
Подготовка свежезамороженной ткани и изготовление срезов для нанесения на чипы. содержащие захватывающие зонды
Свежую нефиксированную ткань головного мозга мыши обрезали, если необходимо, и замораживали в охлажденном до -40°С изопентане и после этого монтировали на криостате для приготовления срезов толщиной 10 мкм. Срез ткани помещали на поверхность каждого предназначенного для использования чипа, содержащего захватывающие зонды.
Приготовление фиксированной в формалине залитой парафином (FFPE) ткани
Ткань головного мозга мыши фиксировали в 4%-ном формалине при 4°С в течение 24 ч. После этого ее инкубировали следующим образом: 3× инкубация в 70%-ном этаноле в течение 1 часа; 1х инкубация в 80%-ном этаноле в течение 1 часа; 1× инкубация в 96%-ном этаноле в течение 1 часа; 3× инкубация в 100%-ном этаноле в течение 1 часа; и 2× инкубация в ксилоле при комнатной температуре в течение 1 ч.
Дегидратированные образцы далее инкубировали в жидком низкоплавком парафине при 52-54°С в течение не более 3 часов включительно, за это время один раз проводили замену парафина, чтобы отмыть от оставшегося ксилола. Готовые блоки ткани далее хранили при КГ (комнатная температура). Затем, используя микротом, делали срезы в парафине толщиной 4 мкм для нанесения на поверхность каждого предназначенного для использования чипа, содержащего захватывающие зонды.
Срезы сушили при 37°С на слайдах чипов в течение 24 часов и хранили при КГ.
Депарафинизация FFPE-ткани
Фиксированные в формалине парафинизированные срезы головного мозга мыши толщиной Юмкм, нанесенные на поверхность слайдов CodeLink, дважды подвергали депарафинизации в ксилоле в течение 10 мин; в 99,5%-ном этаноле в течение 2 мин; в 96%-ном этаноле в течение 2 мин; в 70%-ном этаноле в течение 2 мин; и затем сушили на воздухе.
Синтез кДНК
Приведенные далее эксперименты демонстрируют, что мРНК, захваченная на чипе из срезов образцов ткани, может быть использована в качестве матрицы для синтеза кДНК.
Синтез кДНК на чипе
16-Луночный экран и держатель слайдов Chip Clip от Whatman прикрепляли к слайду CodeLink. При осуществлении синтеза кДНК использовали систему одностадийной ОТ-ПЦР Superscript™ III с Platinum® Taq ДНК-полимеразой от Invitrogen. Для проведения каждой реакции смешивали 25 мкл 2× реакционной смеси (система одностадийной ОТ-ПЦР Superscript™ III с Platinum® Taq ДНК-полимеразой, Invitrogen), 22,5 мкл НзО и 0,5 мкл 100×BSA и нагревали до 50°С. В реакционную смесь добавляли смесь ферментов Superscript Ill/Platinum Taq, по 2 мкл на одну реакцию, и по 50 мкл этой реакционной смеси добавляли в каждую лунку на чипе. Чип инкубировали при 50°С в течение 30 мин (термосмеситель Comfort, Eppendorf).
Реакционную смесь удаляли из лунок и слайд промывали, используя: 2×SSC, 0,1% SDS при 50°С в течение 10 мин; 0,2×SSC при комнатной температуре в течение 1 мин и 0,1×SSC при комнатной температуре в течение 1 мин. Затем этот чип сушили в центрифуге.
В случае срезов FFPE-ткани эти срезы теперь можно было окрашивать и визуализировать, после чего удалить ткань, см. ниже раздел, касающийся визуализации.
Визуализация
Гибридизация флуоресцентных маркерных зондов перед окрашиванием
Перед наложением ткани флуоресцентные маркерные зонды гибридизовали с элементами, содержащими маркерные олигонуклеотиды, отпечатанные на чипе, содержащем захватывающие зонды. Флуоресцентные маркерные зонды способствуют ориентации полученного изображения после визуализации ткани, давая возможность комбинировать это изображение с полученными профилями экспрессии для индивидуальных, несущих "метку" (позиционную область) захватывающих зондов, последовательностей, полученных после секвенирования. Чтобы осуществить гибридизацию флуоресцентных зондов, раствор для гибридизации, содержащий 4×SSC и 0,1% SDS, 2 мкМ детектирующий зонд (Р), инкубировали в течение 4 мин при 50°С. В это время прикрепляли чип собственной разработки к ChipClip (Whatman). Далее этот чип инкубировали при 50°С в течение 30 мин на шейкере при 300 об./мин вместе с 50 мкл раствора для гибридизации на одну лунку.
После инкубации чип извлекали из ChipClip и промывали, используя 3 приведенные ниже стадии: 1) 50°С, раствор 2×SSC с 0,1% SDS в течение 6 мин на шейкере при 300 об/мин, 2) 0,2×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин и 3) 0,1×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин. Затем чип сушили в центрифуге.
Общее гистологическое окрашивание срезов FFPE-ткани до или после синтеза кДНК
Срезы FFPE-ткани, иммобилизованные на чипах, содержащих захватывающие зонды, промывали и регидратировали после депарафинизации перед синтезом кДНК, как описано ранее, или промывали после синтеза кДНК, как описано ранее. Далее их обрабатывали, как приведено ниже: инкубировали в течение 3 минут в гематоксилине; промывали деионизованной водой; инкубировали в течение 5 минут в водопроводной воде; быстро окунали от 8 до 12 раз в подкисленный этанол; промывали 2 раза по 1 минуте в водопроводной воде; промывали 2 минуты в деонизованной воде; инкубировали 30 секунд в эозине; промывали 3х5 минут в 95%-ном этаноле; промывали 3×5 минут в 100%-ном этаноле; промывали 3×10 минут в ксилоле (может быть выполнено в течение ночи); помещали покровное стекло на слайды, используя DPX (ди-н-бутилфталат в ксилоле); сушили слайды в вытяжном шкафу в течение ночи.
Общее иммуногистохимическое окрашивание целевого белка в срезах FFPE-ткани до или после синтеза кДНК
Срезы FFPE-ткани, иммобилизованные на чипах, содержащих захватывающие зонды, промывали и регидратировали после депарафинизации перед синтезом кДНК, как описано ранее, или промывали после синтеза кДНК, как описано ранее. Далее их обрабатывали, как приведено ниже, не позволяя высыхать в течение всего процесса окрашивания: срезы инкубировали с первичным антителом (разбавленным первичным антителом в блокирующем растворе, содержащем 1×забуференный трисом физиологический раствор (TBS) (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7,6), 4% сыворотки осла и 0,1% тритона-х) 103 в камере с увлажнением в течение ночи при КГ; промывали три раза 1×TBS; инкубировали срез с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с флуорохромом (FITC (флуоресцеинизотиоцианат), Cy3 или Cy5) в камере с увлажнением при КГ в течение 1 часа. Промывали 3 раза, используя 1×TBS, удаляли TBS в той степени, насколько это возможно, заключали срез в ProLong Gold+DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол) (Invitrogen) и анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа и подбора подходящих наборов фильтров.
Удаление оставшейся ткани
Замороженная ткань
Чтобы полностью удалить ткань в случае свежезамороженной ткани головного мозга мыши, было достаточно стадии промывки сразу после синтеза кДНК.
FFPE-ткань
Слайды с фиксированными в формалине парафинизированными срезами ткани головного мозга мыши прикрепляли к держателям слайдов ChipClip и 16-луночным экранам (Whatman). На каждые 150 мкл буфера для переваривания протеиназой К из набора RNeasy FFPE (Qiagen) добавляли по 10 мкл раствора протеиназы К (Qiagen). В каждую лунку добавляли по 50 мкл конечной смеси, и слайд инкубировали при 56°С в течение 30 мин.
Высвобождение захватывающих зондов (кДНК)
Высвобождение захватывающих зондов с использованием смеси расщепляющего по урацилам Фермент USER enzyme с буфером для ПНР (ковалентно присоединенных зондов)
16-Луночный экран и слайд CodeLink прикрепляли к держателю ChipClip (Whatman). 50 мкл смеси, содержащей 1× реакционный буфер FastStart High Fidelity (HiFi) (для быстрых реакций с высокой точностью) с 1,8 мМ MgCl2 (Roche), 200 мкМ dNTP (New England Biolabs) и USER Enzyme (0,1 ед./1 мкл; New England Biolabs), нагревали до 37°С, добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 30 мин с перемешиванием (3 секунды при 300 об./мин, 6 секунд в неподвижном состоянии) (термосмеситель Comfort; Eppendorf). Реакционную смесь, содержащую высвобожденные кДНК и зонды, затем извлекали из лунок с помощью пипетки.
Высвобождение захватывающих зондов с использованием смеси расщепляющего по урацилам USER enzyme с буфером для TdT (концевой трансферазы) (ковалентно присоединенных зондов)
50 мкл смеси, содержащей: 1× буфер для TdT (20 мМ Трис-ацетат (рН 7,9), 50 мМ ацетат калия и 10 мМ ацетат магния) (New England Biolabs, www.neb.com); BSA (0,1 мкг/мкл) (New England Biolabs); и USER Enzyme (0,1 ед./мкл; New England Biolabs), нагревали до 37°С, добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 30 мин с перемешиванием (3 секунды при 300 об./мин, 6 секунд в неподвижном состоянии) (термосмеситель Comfort; Eppendorf). Реакционную смесь, содержащую высвобожденные кДНК и зонды, затем извлекали из лунок с помощью пипетки.
Высвобождение захватывающих зондов с использованием кипящей воды (ковалентно присоединенных зондов)
16-Луночный экран и слайд CodeLink прикрепляли к держателю ChipClip (Whatman). В каждую лунку с помощью пипетки вносили по 50 мкл воды (99°С). Эту воду (99°С) оставляли для взаимодействия в течение 30 минут. Реакционную смесь, содержащую высвобожденные кДНК и зонды, затем извлекали из лунок с помощью пипетки.
Высвобождение захватывающих зондов с использованием нагретого буфера для ПЦР (захватывающих зондов, синтезированных посредством гибридизации in situ, т.е. захватывающих зондов, гибридизованных с поверхностными зондами)
50 мкл смеси, содержащей: 1х буфер для TdT (20 мМ Трис-ацетат (рН 7,9), 50 мМ ацетат калия и 10 мМ ацетат магния) (New England Biolabs, www.neb.com); BSA (0,1 мкг/мкл) (New England Biolabs); и USER Enzyme (0,1 ед./мкл; New England Biolabs), предварительно нагревали до 95°С. Затем эту смесь добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 5 минут при 95°С с перемешиванием (3 секунды при 300 об./мин, 6 секунд в неподвижном состоянии) (термосмеситель Comfort; Eppendorf). Реакционную смесь, содержащую высвобожденные зонды, затем извлекали из лунок.
Высвобождение захватывающих зондов с использованием нагретого буфера для TdT (концевой трансферазы) (захватывающих зондов, синтезированных посредством гибридизации in situ, т.е. захватывающих зондов, гибридизованных с поверхностными зондами)
50 мкл смеси, содержащей: 1× буфер для TdT (20 мМ Трис-ацетат (рН 7,9), 50 мМ ацетат калия и 10 мМ ацетат магния) (New England Biolabs, www.neb.com); BSA (0,1 мкг/мкл) (New England Biolabs); и USER Enzyme (0,1 ед./мкл; New England Biolabs), предварительно нагревали до 95°С. Затем эту смесь добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 5 минут при 95°С с перемешиванием (3 секунды при 300 об./мин, 6 секунд в неподвижном состоянии) (термосмеситель Comfort; Eppendorf). Реакционную смесь, содержащую высвобожденные зонды, затем извлекали из лунок.
Эффективность обработки чипа с использованием USER enzyme и воды, нагретой до 99°С, можно увидеть на Фиг.3. Ферментативное расщепление с применением USER enzyme и фермента Rsal проводили, используя чипы "собственной разработки", описанные выше (Фиг.4). Опосредованное горячей водой высвобождение ДНК поверхностных зондов проводили, используя промышленные чипы производства Agilent (см. Фиг.5).
Сбор зондов и введение линкеров
Результаты экспериментов показывают, что первая нить кДНК, высвобожденная с поверхности чипа, может быть модифицирована с получением двунитевой ДНК и в дальнейшем амплифицирована.
Амплификация целого транскриптома с использованием набора для амплификации целого генома Picoplex (последовательности захватывающих зондов, включающие последовательности позиционных областей (меток), не сохранены на конце полученной днДНК (двунитевая ДНЮ)
Захватывающие зонды высвобождали с использованием смеси расщепляющего по урацилам USER enzyme с буфером для ПЦР (ковалентно присоединенные захватывающие зонды) или с использованием нагретого буфера для ПЦР (захватывающие зонды, синтезированные посредством гибридизации in situ, т.е. захватывающие зонды, гибридизованные с поверхностными зондами).
Высвобожденную кДНК амплифицировали, применяя метод амплификации целого генома с использованием случайных праймеров Picoplex (Rubicon Genomics), который осуществляли в соответствии с инструкциями производителя.
Амплификация целого транскриптома посредством наращивания (dA)-хвоста с использованием концевой трансферазы (TdT) (последовательности захватывающих зондов, включающие последовательности позиционных областей (меток), сохранены на конце полученной днДНК)
Захватывающие зонды высвобождали с использованием смеси расщепляющего по урацилам USER enzyme с буфером для концевой трансферазы (TdT) (ковалентно присоединенные захватывающие зонды) или нагретого буфера для TdT (концевой трансферазы) (захватывающие зонды, синтезированные посредством гибридизации in situ, т.е. захватывающие зонды, гибридизованные с поверхностными зондами).
38 мкл смеси после отщепления помещали в чистую пробирку для ПЦР емкостью 0,2 мл. Смесь содержала: 1× буфер для TdT (20 мМ Трис-ацетат (рН 7,9), 50 мМ ацетат калия и 10 мМ ацетат магния) (New England Biolabs, www.neb.com), BSA (0,1 мкг/мкл) (New England Biolabs); USER Enzyme (0,1 ед./мкл; New England Biolabs) (не для высвобождения нагреванием); высвобожденную кДНК (удлиненную с поверхностных зондов); и высвобожденные поверхностные зонды. В пробирку для ПЦР добавляли 0,5 мкл РНКазы Н (5 ед./мкл, конечная концентрация 0,06 ед./мкл), 1 мкл TdT (20 ед./мкл, конечная концентрация 0,5 ед./мкл) и 0,5 мкл dATP (100 мМ, конечная концентрация 1,25 мМ). Для наращивания (dA)-хвоста пробирку инкубировали в термоциклере (Applied Biosystems) при 37°С в течение 15 мин, после чего инактивировали TdT при 70°С в течение 10 мин. После наращивания (dA)-хвоста готовили мастер-микс (master mix) для ПЦР. Смесь содержала: 1× буфер для ПЦР Faststart HiFi (рН 8,3) с 1,8 мМ MgCl2 (Roche); dNTP (0,2 мМ каждый; Fermentas); праймеры (0,2 мМ каждый): А (комплементарный области амплификации захватывающего зонда) и B_(dT)24 (Eurofins MWG Operon) (комплементарный поли(А)-хвосту, который должен быть добавлен к 3′-концу первой нити кДНК); и ДНК-полимеразу (0,1 ед./мкл) Faststart HiFi (Roche). По 23 мкл мастер-микс для ПЦР помещали в девять чистых пробирок для ПЦР емкостью 0,2 мл. В восемь пробирок добавляли по 2 мкл смеси для наращивания (dA)-хвоста, тогда как в последнюю пробирку добавляли 2 мкл воды (без РНКазы/ДНКазы) (отрицательный контроль). ПЦР-амплификацию проводили по следующей программе: горячий старт при 95°С в течение 2 минут, синтез второй нити при 50°С в течение 2 минут и при 72°С в течение 3 минут, амплификация за 30 циклов ПЦР при 95°С в течение 30 секунд, 65°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 3 минут и окончательное удлинение при 72°С в течение 10 минут.
Очистка и анализ после проведения реакции
Четыре продукта амплификации объединяли вместе, обрабатывали с использованием колонки Qiaquick для очистки после ПЦР (Qiagen) и элюировали в 30 мкл ЕВ (элюирующего буфера) (10 мМ Трис-Cl, рН 8,5). Продукт анализировали на биоанализаторе (Agilent). Использовали набор DNA 1000 в соответствии с инструкциями производителей.
Секвенирование
Секвенирование по Illumina
Секвенирование по Illumina библиотеки днДНК с использованием индексирования образцов осуществляли в соответствии с инструкциями производителей. Секвенирование проводили на платформе HiSeq2000 (Illumina).
Биоинформатика
Получение цифровой информации о транскриптоме из данных секвенирования библиотек для целого транскриптома. полученных амплификацией с применением подхода с наращиванием (dA)-хвоста концевой трансферазой
Данные секвенирования сортировали, используя штрихкодовый сплиттер с применением формата FASTQ пакета FastX-toolkit, по отдельным файлам для соответствующих последовательностей позиционных областей (меток) захватывающих зондов. Данные по меченным индивидуальными метками последовательностям затем анализировали посредством сравнения с картами генома мыши, используя программу для картирования Tophat. Полученный SAM-файл обрабатывали для подсчета транскриптов посредством программного обеспечения HTseq-count.
Получение цифровой информации о транскриптоме из данных секвенирования библиотек для целого транскриптома. полученных амплификацией с применением подхода с использованием набора для амплификации целого генома Picoplex
Данные секвенирования преобразовывали из формата FASTQ в формат FASTA, используя конвертер FASTQ-to-FASTA пакета FastX-toolkit. Проводили выравнивание прочтений последовательностей с последовательностями позиционных областей (меток) захватывающих зондов, используя Blastn, и прочтения с совпадениями лучшими, чем 1е-6 в отношении одной из содержащих метку последовательностей отсортировывали в индивидуальные файлы для каждой меченой последовательности, соответственно. Затем с использованием Blastn проводили выравнивание прочтений содержащих метку последовательностей из данного файла с транскриптомом мыши и отбирали совпадения.
Совмещение данных визуализации и профилей экспрессии
Проводили совмещение профилей экспрессии для индивидуальных последовательностей позиционных областей (меток) захватывающих зондов с пространственной информацией, полученной из срезов тканей посредством окрашивания. Тем самым можно путем прямого сравнения проанализировать данные о транскриптоме из клеточных компартментов среза ткани, что дает возможность устанавливать различия между особенностями экспрессии для разных клеточных подтипов в данном структурном контексте.
Пример 2
На Фиг.8-12 показаны результаты успешной визуализации окрашенных срезов FFPE-ткани головного мозга мыши (обонятельной луковицы) на поверхности штрихкодового захватывающего чипа для анализа транскриптома согласно общей методике, описанной в примере 1. По сравнению с экспериментом со свежезамороженной тканью, приведенном в примере 1, на Фиг.8 показана более хорошая морфология при использовании FFPE-ткани. На Фиг.9 и 10 показано, как ткань может располагаться на чипах с различной плотностью зондов.
Пример 3
Амплификация целого транскриптома посредством синтеза второй нити с использованием случайных праймеров с последующей амплификацией с применением универсальной ручки (последовательности захватывающих зондов, включающие меченые последовательности, сохранены на конце полученной днДНК)
- после высвобождения захватывающих зондов с использованием смеси расщепляющего по урацилам USER enzyme с буфером для ПЦР (ковалентно присоединенных зондов)
или
- после высвобождения захватывающих зондов с использованием нагретого буфера для ПЦР (захватывающих зондов, синтезированных посредством гибридизации in situ).
1 мкл РНКазы Н (5 ед./мкл) добавляли в каждую из двух пробирок (конечная концентрация 0,12 ед./мкл), содержащих по 40 мкл 1х буфера для ПЦР Faststart HiFi (pH 8,3) с 1,8 мМ MgCl2 (Roche, www.roche-applied-science.com), dNTP (0,2 мМ каждый) (Fermentas, www.fermentas.com), BSA (0,1 мкг/мкл) (New England Biolabs, www.neb.com), USER Enzyme (0,1 ед./мкл; New England Biolabs), высвобожденую кДНК (удлиненную с поверхностных зондов) и высвобожденные поверхностные зонды. Пробирки инкубировали при 37°С в течение 30 мин, затем при 70°С в течение 20 мин в термоциклере (Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com). В эти две пробирки добавляли по 1 мкл фрагмента Кленова (от 3′ к 5′ экзо-минус) (Illumina, www.illumina.com) и по 1 мкл соединенного с "ручкой" случайного праймера (10 мкМ) (Eurofins MWG Operon, www.eurofinsdna.com) (B_R8 (октамер) в одну из пробирок и B_R6 (гексамер) в другую пробирку), конечная концентрация 0,23 мкМ. Эти две пробирки инкубировали при 15°С в течение 15 мин, 25°С в течение 15 мин, 37°С в течение 15 мин и в конце при 75°С в течение 20 мин в термоциклере (Applied Biosystems). После инкубации в обе пробирки добавляли по 1 мкл каждого праймера, А_Р и В (10 мкМ) (Eurofins MWG Operon), конечная концентрация каждого 0,22 мкМ. В обе пробирки также добавляли по 1 мкл (5 ед./мкл) ДНК-полимеразы Faststart HiFi (Roche), конечная концентрация 0,11 ед./мкл. ПЦР-амплификацию осуществляли в термоциклере (Applied Biosystems) в соответствии со следующей программой: горячий старт при 94°С в течение 2 мин, затем 50 циклов при 94°С в течение 15 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 68°С в течение 1 минуты и окончательное удлинение при 68°С в течение 5 минут. После амплификации очищали по 40 мкл из каждой из этих двух пробирок, используя колонку Qiaquick для очистки после ПЦР (Qiagen, www.qiagen.com), и элюировали в 30 мкл ЕВ (10 мМ Трис-Cl, рН 8,5). Очищенные продукты анализировали на биоанализаторе (Agilent, www.home.agilent.com), с использованием набора DNA 7500. Результаты показаны на Фиг.13 и 14.
Этот пример демонстрирует применение синтеза второй нити с использованием случайного гексамера и случайного октамера с последующей амплификацией с целью создания популяции из высвобожденных молекул кДНК.
Пример 4
Амплификация IP-специфичных и ген-специфичных продуктов после синтеза кДНК и сбора зондов
- после высвобождения захватывающих зондов с использованием смеси расщепляющего по урацилам USER enzyme с буфером для ПЦР (ковалентно присоединенных зондов).
Отщепленную кДНК амплифицировали в конечных реакционных объемах 10 мкл. 7 мкл отщепленной матрицы, 1 мкл ID-специфичного прямого праймера (2 мкМ), 1 мкл ген-специфичного обратного праймера (2 мкМ) и 1 мкл ферментативной смеси FastStart High Fidelity в 1,4х реакционном буфере FastStart High Fidelity с 1,8 мМ MgCl2 смешивали, получая конечную реакционную смесь объемом 10 мкл с 1× реакционным буфером FastStart High Fidelity с 1,8 мМ MgCl2 и 1 ед. ферментативной смеси FastStart High Fidelity. ПЦР-амплификацию осуществляли в термоциклере (Applied Biosystems) в соответствии со следующей программой: горячий старт при 94°С в течение 2 мин, затем 50 циклов при 94°С в течение 15 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 68°С в течение 1 минуты и окончательное удлинение при 68°С в течение 5 минут.
Последовательности праймеров, использованные для получения продукта длиной приблизительно 250 п.о.:
бета-2-микроглобулиновый праймер (В2М):
5′-TGGGGGTGAGAATTGCTAAG-3′ (SEQ ID NO:43),
ID-1 праймер:
5′-ССТТСТССТТСТССТТСАСС-3′ (SEQ ID NO:44),
ID-5 праймер:
5′-GTCCTCTATTCCGTCACCAT-3′ (SEQ ID NO:45),
ID-20 праймер:
5′-CTGCTTCTTCCTGGAACTCA-3′ (SEQ ID NO:46).
Результаты показаны на Фиг.15. Показана успешно проведенная амплификация ID-специфичных и ген-специфичных продуктов из ткани головного мозга, покрывающей все эти зонды, с использованием двух разных ID-содержащих праймеров (т.е. праймера, специфичного к ID-меткам, расположенным в разных местах на микрочипе, и равным образом ген-специфичного праймера). Соответственно, в этом эксперименте установлено, что продукты могут быть идентифицированы по реакции амплификации, специфичной в отношении ID-метки или в отношении целевой нуклеиновой кислоты. Также установлено, что можно провести различение разных ID-меток. Во втором эксперименте с использованием ткани, покрывающей только половину ID-содержащих зондов (т.е. захватывающих зондов) на чипе, положительный результат (продукт ПЦР) получили для пятен, которые были покрыты тканью.
Пример 5
Пространственная геномика
Общие положения. Задачей этого способа является захват молекул ДНК из образца ткани с сохранением пространственного разрешения, что дает возможность определить, из какой части ткани конкретный фрагмент ДНК происходит.
Способ. Принцип данного способа заключается в применении микрочипов с иммобилизованными ДНК-олигонуклеотидами (захватывающими зондами), несущими последовательности с маркирующими метками для пространственной локализации (позиционные области). Каждый элемент из олигонуклеотидов микрочипа несет 1) уникальную маркирующую метку (позиционную область) и 2) захватывающую последовательность (захватывающую область). Отслеживание того, в каком месте и какая маркирующая метка размещается на поверхности чипа, дает возможность извлечь информацию о положении в двух измерениях от каждой маркирующей метки. Фрагментированную геномную ДНК добавляют к микрочипу, например путем добавления тонкого среза FFPE-обработанной ткани. Геномная ДНК в этом срезе ткани предварительно фрагментирована в результате фиксирующей обработки.
Как только срез ткани помещен на чип, проводят универсальную реакцию наращивания хвоста, применяя фермент концевую трансферазу. В результате реакции наращивания хвоста к выступающим 3′-концам фрагментов геномной ДНК в ткани добавляются поли(dA)-хвосты. Олигонуклеотиды на поверхности блокируют от наращивания хвоста под действием концевой трансферазы посредством использования гибридизованного и Заблокированного nonn(dA)-зонда.
После наращивания хвоста под действием концевой трансферазы фрагменты геномной ДНК получают способность гибридизоваться с олигонуклеотидами, несущими пространственную метку близко друг к другу, в результате встречи поли(dA)-хвоста с поли(dT)-содержащей захватывающей последовательностью поверхностных олигонуклеотидов. По завершении гибридизации полимераза замещения нити такая как фрагмент Кленова (экзо-), может использовать олигонуклеотид на поверхности в качестве праймера для создания новой нити ДНК, комплементарной гибридизованному фрагменту геномной ДНК. Новая нить ДНК будет теперь также содержать информацию о положении маркирующей метки олигонуклеотида на поверхности.
На последней стадии вновь синтезированные меченые нити ДНК отщепляют от поверхности, используя или ферментативные методы, или денатурацию, или физические методы. Затем нити собирают, и весь набор нитей может быть подвергнут амплификации в направлении "вниз по течению" с использованием введения универсальных "ручек", амплификации специфических ампликонов и/или подвергнут секвенированию.
Фиг.16 представляет собой схематическую иллюстрацию этого способа.
Материалы и методы
Изготовление печатного микрочипа собственной разработки с от ориентированными 5′ к 3′ зондами
На стеклянные слайды наносили в виде пятен 20 ДНК-захватывающих олигонуклеотидов с содержащими индивидуальные метки последовательностями (Таблица 1) в качестве захватывающих зондов. Зонды синтезировали таким образом, чтобы они содержали на 5′-конце аминолинкер с С6-спейсером. Все зонды были синтезированы в Sigma-Aldrich (St. Louis, МО, USA). ДНК-захватывающие зонды суспендировали в концентрации 20 мкМ в 150 мМ фосфате натрия, рН 8,5, и наносили в виде пятен, используя наноплоттер (nanoplotter) NP2.1/E (Gesim, Grosserkmannsdorf, Germany), на активированные слайды для микрочипов CodeLink™ (7,5 см×2,5 см; Surmodics, Eden Prairie, MN, USA). После печати осуществляли блокирование поверхности в соответствии с инструкциями производителя. Печать зондов выполняли в виде 16 идентичных чипов на слайде, и каждый чип имел предварительно определенную картину печати. Эти 16 подчипов были отделены друг от друга в процессе гибридизации посредством состоящего из 16 ячеек экрана (ChipClip™, Schleicher & Schuell BioScience, Keene, NH, USA).
Изготовление печатного микрочипа собственной разработки с ориентированными от 3′ к 5′ зондами и синтез ориентированных от 5′ к 3′ захватывающих зондов
Печать олигонуклеотидов осуществляли, как и в приведенном выше случае с ориентированными от 5′ к 3′ зондами.
Чтобы осуществить гибридизацию праймеров для синтеза захватывающих зондов, раствор для гибридизации, содержащий 4×SSC и 0,1% SDS, 2 мкМ праймер удлинения (А_праймер) и 2 мкМ праймер для соединения нитей (P_поли_dT) инкубировали в течение 4 мин при 50°С. За это время прикрепляли чип собственной разработки к ChipClip (Whatman). Далее этот чип инкубировали при 50°С в течение 30 мин на шейкере при 300 об./мин вместе с 50 мкл раствора для гибридизации на одну лунку.
После инкубации чип извлекали из ChipClip и промывали, используя 3 приведенные ниже стадии: 1) 50°С, раствор 2×SSC с 0,1% SDS в течение 6 мин на шейкере при 300 об./мин; 2) 0,2×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин; и 3) 0,1×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин. Затем чип сушили в центрифуге и помещали обратно в ChipClip.
Для осуществления реакции удлинения и лигирования 50 мкл ферментативной смеси, содержащей 10×буфер для лигазы Ampligase, 2,5 ед. фрагмента Стоффеля AmpliTaq ДНК-полимеразы (Applied Biosystems), 10 ед. лигазы Ampligase (Epicentre Biotechnologies), dNTP 2 мМ каждый (Fermentas) и воду, вносили в каждую лунку с помощью пипетки. Затем этот чип инкубировали при 55°С в течение 30 мин. После инкубации чип промывали в соответствии с описанным ранее способом промывки чипа, но продолжительность первой стадии составляла 10 мин вместо 6 мин.
Гибридизация поли(dA)-зонда для защиты захватывающих последовательностей поверхностных олигонуклеотидов от наращивания (dA)-хвоста
Чтобы осуществить гибридизацию 3′-биотин-блокированного поли(с)А)-содержащего зонда для защиты захватывающих последовательностей поверхностных олигонуклеотидов, раствор для гибридизации, содержащий 4×SSC и 0,1% SDS, 2 мкМ 3′-биотин-поли(dA), инкубировали в течение 4 мин при 50°С. За это время прикрепляли чип собственной разработки к ChipClip (Whatman). Далее этот чип инкубировали при 50°С в течение 30 мин на шейкере при 300 об./мин вместе с 50 мкл раствора для гибридизации на одну лунку.
После инкубации чип извлекали из ChipClip и промывали, используя 3 приведенные ниже стадии: 1) 50°С, раствор 2×SSC с 0,1% SDS в течение 6 мин на шейкере при 300 об./мин; 2) 0,2×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин; и 3) 0,1×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин. Затем чип сушили в центрифуге и помещали обратно в ChipClip.
Приготовление фиксированной в формалине залитой парафином (FFPE) ткани
Ткань головного мозга мыши фиксировали в 4%-ном формалине при 4°С в течение 24 ч. После этого ее инкубировали следующим образом: 3× инкубация в 70%-ном этаноле в течение 1 часа; 1× инкубация в 80%-ном этаноле в течение 1 часа; 1× инкубация в 96%-ном этаноле в течение 1 часа; 3× инкубация в 100%-ном этаноле в течение 1 часа; и 2х инкубация в ксилоле при комнатной температуре в течение 1 ч.
Дегидратированные образцы далее инкубировали в жидком легкоплавком парафине при 52-54°С в течение до 3 часов включительно, за это время один раз проводили замену парафина, чтобы отмыть от оставшегося ксилола. Готовые блоки ткани далее хранили при КГ. Затем, используя микротом, делали срезы в парафине толщиной 4 мкм для нанесения на поверхность каждого предназначенного для использования чипа, содержащего захватывающие зонды.
Срезы сушили при 37°С на слайдах чипов в течение 24 часов и хранили при КТ.
Депарафинизация FFPE-ткани
Фиксированные в формалине парафинизированные срезы головного мозга мыши толщиной 10 мкм, нанесенные на поверхность слайдов CodeLink, дважды подвергали депарафинизации в ксилоле в течение 10 мин, в 99,5%-ном этаноле в течение 2 мин, в 96%-ном этаноле в течение 2 мин, в 70%-ном этаноле в течение 2 мин и затем сушили на воздухе.
Наращивание универсального хвоста в геномную ДНК
Для наращивания (dA)-хвоста готовили 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1х буфер для TdT (20 мМ Трис-ацетат (рН 7,9), 50 мМ ацетат калия и 10 мМ ацетат магния) (New England Biolabs, www.neb.com), BSA (0,1 мкг/мкл) (New England Biolabs), 1 мкл TdT (20 ед./мкл) и 0,5 мкл dATP (100 мМ). Смесь добавляли на поверхность чипа и чип инкубировали в термоциклере (Applied Biosystems) при 37°С в течение 15 мин, после чего инактивировали TdT при 70°С в течение 10 мин. После этого температуру снова понижали до 50°С, чтобы обеспечить возможность гибридизации геномных фрагментов, содержащих (dA)-хвосты, с захватывающими областями поверхностных олигонуклеотидов.
После инкубации чип извлекали из ChipClip и промывали, используя 3 приведенные ниже стадии: 1) 50°С, раствор 2×SSC с 0,1% SDS в течение 6 мин на шейкере при 300 об./мин; 2) 0,2×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин; и 3) 0,1×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин. Затем чип сушили в центрифуге.
Удлинение меченой ДНК
Реакционную смесь объемом 50 мкл, содержащую 1х буфер Кленова, 200 мкМ dNTP (New England Biolabs) и 1 мкл фрагмента Кленова (от 3′ к 5′ экзо-минус), нагревали до 37°С, добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 30 мин с перемешиванием (3 секунды при 300 об./мин; 6 секунд в неподвижном состоянии) (термосмеситель Comfort; Eppendorf).
После инкубации чип извлекали из ChipClip и промывали, используя 3 приведенные ниже стадии: 1) 50°С, раствор 2×SSC с 0,1% SDS в течение 6 мин на шейкере при 300 об./мин, 2) 0,2×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин и 3) 0,1×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин. Затем чип сушили в центрифуге.
Удаление оставшейся ткани
Слайды с фиксированными в формалине парафинизированными срезами ткани головного мозга мыши прикрепляли к держателям слайдов ChipClip и 16-луночным экранам (Whatman). На каждые 150 мкл буфера для переваривания протеиназой К из набора RNeasy FFPE (Qiagen) добавляли по 10 мкл раствора протеиназы К (Qiagen). В каждую лунку добавляли по 50 мкл конечной смеси и слайд инкубировали при 56°С в течение 30 мин.
Высвобождение захватывающих зондов с использованием смеси расщепляющего по урацилам USER enzyme с буфером для ПЦР (ковалентно присоединенных зондов)
16-луночный экран и слайд CodeUnk прикрепляли к держателю ChipClip (Whatman). 50 мкл смеси, содержащей 1× реакционный буфер FastStart High Fidelity с 1,8 мМ MgCl2 (Roche), 200 мкМ dNTP (New England Biolabs) и USER Enzyme (0,1 ед./1 мкл; New England Biolabs), нагревали до 37°С, добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 30 мин с перемешиванием (3 секунды при 300 об./мин, 6 секунд в неподвижном состоянии) (термосмеситель Comfort; Eppendorf). Реакционную смесь, содержащую высвобожденные кДНК и зонды, затем извлекали из лунок с помощью пипетки.
Амплификация ID-специсЬичных и ген-специфичных продуктов после синтеза кДНК и сбора зондов
- после высвобождения захватывающих зондов с использованием смеси расщепляющего по урацилам USER enzyme с буфером для ПЦР (ковалентно присоединенных зондов).
Отщепленную кДНК амплифицировали в конечных реакционных объемах 10 мкл. 7 мкл отщепленной матрицы, 1 мкл ID-специфичного прямого праймера (2 мкМ), 1 мкл ген-специфичного обратного праймера (2 мкМ) и 1 мкл ферментативной смеси FastStart High Fidelity в 1,4х реакционном буфере FastStart High Fidelity с 1,8 мМ MgCl2 смешивали, получая конечную реакционную смесь объемом 10 мкл с 1× реакционным буфером FastStart High Fidelity с 1,8 мМ MgCl2 и 1 ед. ферментативной смеси FastStart High Fidelity. ПЦР-амплификацию осуществляли в термоциклере (Applied Biosystems) в соответствии со следующей программой: горячий старт при 94°С в течение 2 мин, затем 50 циклов при 94°С в течение 15 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 68°С в течение 1 минуты и окончательное удлинение при 68°С в течение 5 минут.
Амплификация целого генома посредством синтеза второй нити с использованием случайных праймеров с последующей амплификацией с применением универсальной ручки (последовательности захватывающих зондов, включающие меченые последовательности, сохранены на конце полученной днДНК)
- после высвобождения захватывающих зондов с использованием смеси расщепляющего по урацилам USER enzyme с буфером для ПЦР (ковалентно присоединенных зондов).
Готовили реакционную смесь, содержащую 40 мкл 1× буфера для ПЦР (рН 8,3) FastStart HiFi с 1,8 мМ MgCl2 (Roche, www.roche-applied-science.com), dNTP (0,2 мМ каждый) (Fermentas, www.fermentas.com), BSA (0,1 мкг/мкл) (New England Biolabs, www.neb.com), USER Enzyme (0,1 ед./мкл; New England Biolabs), высвобожденную ДНК (удлиненную с поверхностных зондов) и высвобожденные поверхностные зонды. Пробирку инкубировали при 37°С в течение 30 мин, затем при 70°С в течение 20 мин в термоциклере (Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com). В эту пробирку добавляли 1 мкл фрагмента Кленова (от 3′ к 5′ экзо-минус) (Illumina, www.illumina.com) и 1 мкл соединенного с "ручкой" случайного праймера (10 мкМ) (Eurofins MWG Орегоп, www.eurofinsdna.com). Пробирку инкубировали при 15°С в течение 15 мин, при 25°С в течение 15 мин, при 37°С в течение 15 мин и в конце при 75°С в течение 20 мин в термоциклере (Applied Biosystems). После инкубации в пробирку добавляли по 1 мкл каждого праймера, А_Р и В (10 мкМ) (Eurofins MWG Operon). В пробирку также добавляли 1 мкл (5 ед./мкл) ДНК-полимеразы FastStart HiFi (Roche). ПЦР-амплификацию осуществляли в термоциклере (Applied Biosystems) в соответствии со следующей программой: горячий старт при 94°С в течение 2 мин, затем 50 циклов при 94°С в течение 15 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 68°С в течение 1 минуты и окончательное удлинение при 68°С в течение 5 минут. После амплификации проводили очистку 40 мкл из пробирки, используя колонки Qiaquick для очистки после ПЦР (Qiagen, www.qiagen.com), и элюировали в 30 мкл ЕВ (10 мМ Трис-Cl, рН 8,5). Очищенный продукт анализировали на биоанализаторе (Agilent, www.home.agilent.com), с использованием набора DNA 7500.
Визуализация
Гибридизация флуоресцентных маркерных зондов перед окрашиванием
Перед наложением ткани флуоресцентные маркерные зонды гибридизовали с предусмотренными маркерными последовательностями, отпечатанными на чипе, содержащем захватывающие зонды. Флуоресцентные маркерные зонды способствуют ориентации полученного изображения после визуализации ткани, давая возможность комбинировать это изображение с полученными профилями экспрессии для индивидуальных, несущих "метку" захватывающих зондов, последовательностей, полученных после секвенирования. Чтобы осуществить гибридизацию флуоресцентных зондов, раствор для гибридизации, содержащий 4xSSC и 0,1% SDS, 2 мкМ детектирующий зонд (Р), инкубировали в течение 4 мин при 50°С. За это время прикрепляли чип собственной разработки к ChipClip (Whatman). Далее этот чип инкубировали при 50°С в течение 30 мин на шейкере при 300 об./мин вместе с 50 мкл раствора для гибридизации на одну лунку.
После инкубации чип извлекали из ChipClip и промывали, используя 3 приведенные ниже стадии: 1) 50°С, раствор 2×SSC с 0,1% SDS в течение 6 мин на шейкере при 300 об./мин; 2) 0,2×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин; и 3) 0,1×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин. Затем чип сушили в центрифуге.
Общее гистологическое окрашивание срезов FFPE-ткани до или после синтеза меченой ДНК
Срезы FFPE-ткани, иммобилизованные на чипах, содержащих захватывающие зонды, промывали и регидратировали после депарафинизации перед синтезом меченой ДНК, как описано ранее, или промывали после синтеза меченой ДНК, как описано ранее. Далее их обрабатывали, как приведено ниже: инкубировали в течение 3 минут в гематоксилине; промывали деионизованной водой; инкубировали в течение 5 минут в водопроводной воде; быстро окунали от 8 до 12 раз в подкисленный этанол; промывали 2 раза по 1 минуте в водопроводной воде; промывали 2 минуты в деонизованной воде; инкубировали 30 секунд в эозине; промывали 3×5 минут в 95%-ном этаноле; промывали 3×5 минут в 100%-ном этаноле; промывали 3×10 минут в ксилоле (может быть выполнено в течение ночи); помещали покровное стекло на слайды, используя DPX; сушили слайды в вытяжном шкафу в течение ночи.
Общее иммуногистохимическое окрашивание целевого белка в срезах FFPE-ткани до или после синтеза меченой ДНК
Срезы FFPE-ткани, иммобилизованные на чипах, содержащих захватывающие зонды, промывали и регидратировали после депарафинизации перед синтезом меченой ДНК, как описано ранее, или промывали после синтеза меченой ДНК, как описано ранее. Далее их обрабатывали, как приведено ниже, не позволяя высыхать в течение всего процесса окрашивания:
разбавляли первичное антитело в блокирующем растворе (1×TBS (забуференный трисом физиологический раствор (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 7,6), 4% сыворотки осла и 0,1% тритона-х), инкубировали срезы с первичным антителом в камере с увлажнением в течение ночи при КГ, промывали 3 раза, используя 1×TBS; инкубировали срез с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с флуорохромом (FITC, Cy3 или Cy5) в камере с увлажнением при KT в течение 1 часа, промывали 3 раза, используя 1×TBS, удаляли TBS в той степени, насколько это возможно, заключали срез в Prolong Gold+DAPI (Invitrogen) и анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа и подбора подходящих наборов фильтров.
Пример 6
Этот эксперимент проводили, следуя принципам примера 5, но с использованием на чипе фрагментированной геномной ДНК, а не ткани. Геномную ДНК предварительно фрагментировали до среднего размера 200 п.о. и 700 п.о. соответственно. Этот эксперимент показывает, что данный принцип работает. Фрагментированная геномная ДНК в данном случае очень похожа на FFPE-ткань.
Амплификация ген-специфичных внутренних продуктов после синтеза меченой ДНК и сбора зондов
- после высвобождения захватывающих зондов с использованием смеси расщепляющего по урацилам USER enzyme с буфером для ПЦР (ковалентно присоединенных зондов), содержащей 1× реакционный буфер FastStart High Fidelity с 1,8 мМ MgCl2 (Roche), 200 мкМ dNTP (New England Biolabs) и USER Enzyme (0,1 ед./1 мкл; New England Biolabs).
Отщепленную ДНК амплифицировали в конечном реакционном объеме 50 мкл. К 47 мкл отщепленной матрицы добавляли 1 мкл ID-специфичного прямого праймера (10 мкМ), 1 мкл ген-специфичного обратного праймера (10 мкМ) и 1 мкл ферментативной смеси FastStart High Fidelity. ПЦР-амплификацию осуществляли в термоциклере (Applied Biosystems) в соответствии со следующей программой: горячий старт при 94°С в течение 2 мин, затем 50 циклов при 94°С в течение 15 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 68°С в течение 1 минуты и окончательное удлинение при 68°С в течение 5 минут.
Амплификация специфичных к метке и ген-специсЬичных продуктов после синтеза меченой ДНК и сбора зондов
- после высвобождения захватывающих зондов с использованием смеси расщепляющего по урацилам USER enzyme с буфером для ПЦР (ковалентно присоединенных зондов), содержащей 1× реакционный буфер FastStart High Fidelity с 1,8 мМ MgCl2 (Roche), 200 мкМ dNTP (New England Biolabs) и USER Enzyme (0,1 ед./1 мкл; New England Biolabs).
Отщепленную ДНК амплифицировали в конечном реакционном объеме 50 мкл. К 47 мкл отщепленной матрицы добавляли 1 мкл специфичного к метке прямого праймера (10 мкМ), 1 мкл ген-специфичного обратного праймера (10 мкМ) и 1 мкл ферментативной смеси FastStart High Fidelity. ПЦР-амплификацию осуществляли в термоциклере (Applied Biosystems) в соответствии со следующей программой: горячий старт при 94°С в течение 2 мин, затем 50 циклов при 94°С в течение 15 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 68°С в течение 1 минуты и окончательное удлинение при 68°С в течение 5 минут.
Прямой праймер - праймер для геномной ДНК человека:
B′-GACTGCTCTTTTCACCCATC-S′ (SEQ ID NO:47);
Обратный праймер - праймер для геномной ДНК человека:
5′-GGAGCTGCTGGTGCAGGG-3′ (SEQ ID NO:48);
P - праймер, специфичный к метке:
5′-ATCTCGACTGCCACTCTGAA-3′ (SEQ ID NO:49).
Результаты показаны на Фиг.17-20. На этих рисунках показаны внутренние продукты, амплифицированные на чипе, - зарегистрированные пики на Фиг.17 и 18 соответствуют ожидаемому размеру. Таким образом, этот результат демонстрирует, что существует возможность захвата и амплификации геномной ДНК. На Фиг.19 и 20 изображение ожидаемого продукта является размытым ввиду того, что в результате случайной фрагментации и мечения геномной ДНК концевой трансферазой будет образовываться пул очень разнообразных образцов.
Пример 7
Альтернативный синтез ориентированных от 5′ к 3′ захватывающих зондов с использованием удлинения под действием полимеразы и наращивания хвоста под действием концевой трансферазы
Чтобы осуществить гибридизацию праймеров для синтеза захватывающих зондов, раствор для гибридизации, содержащий 4×SSC и 0,1% SDS и 2 мкМ праймер для удлинения (А_праймер) инкубировали в течение 4 мин при 50°С. За это время прикрепляли чип собственной разработки (см. пример 1) к ChipClip (Whatman). Далее этот чип инкубировали при 50°С в течение 30 мин на шейкере при 300 об./мин вместе с 50 мкл раствора для гибридизации на одну лунку.
После инкубации чип извлекали из ChipClip и промывали, используя 3 приведенные ниже стадии: 1) 50°С, раствор 2×SSC с 0,1% SDS в течение 6 мин на шейкере при 300 об./мин, 2) 0,2×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин и 3) 0,1×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин. Затем чип сушили в центрифуге и помещали обратно в ChipClip.
1 мкл фрагмента Кленова (от 3′ к 5′ экзо-минус) (Illumina, www.illumina.com) вместе с 10× буфером Кленова, dNTP (2 мМ каждый; Fermentas) и водой смешивали в 50 мкл реакционной смеси и вносили с помощью пипетки в каждую лунку.
Чип инкубировали при 15°С в течение 15 мин, при 25°С в течение 15 мин, при 37°С в течение 15 мин и в конце при 75°С в течение 20 мин в термосмесителе от Eppendorf.
После инкубации чип извлекали из ChipClip и промывали, используя 3 приведенные ниже стадии: 1) 50°С, раствор 2×SSC с 0,1% SDS в течение 6 мин на шейкере при 300 об./мин, 2) 0,2×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин и 3) 0,1×SSC в течение 1 мин на шейкере при 300 об./мин. Затем чип сушили в центрифуге и помещали обратно в ChipClip.
Для наращивания (dT)-хвоста готовили 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1× буфер для TdT (20 мМ Трис-ацетат (рН 7,9), 50 мМ ацетат калия и 10 мМ ацетат магния) (New England Biolabs, www.neb.com), BSA (0,1 мкг/мкл) (New England Biolabs), 0,5 мкл РНКазы Н (5 ед./мкл), 1 мкл TdT (20 ед./мкл) и 0,5 мкл dTTP (100 мМ). Смесь добавляли на поверхность чипа и чип инкубировали в термоциклере (Applied Biosystems) при 37°С в течение 15 мин, после чего инактивировали TdT при 70°С в течение 10 мин.
Пример 8
Пространственная транскриптомика с использованием ориентированных от 5′ к 3′ чипов с высокой плотностью зондов и фиксированной в формалине замороженной (FF-замороженной) ткани с применением системы расщепления USER и амплификации с использованием концевой трансферазы
Изготовление чипов
Стандартные микрочипы высокой плотности были заказаны у Roche-Nimblegen (Madison, WI, USA). Каждый использованный чип с захватывающими зондами содержал 135000 элементов, из которых 132640 содержали уникальную меченую ID-меткой последовательность (позиционную область) и захватывающий участок (захватывающую область). Размер каждого элемента составлял 13×13 мкм. Захватывающие зонды имели направление от 56 к 3′ и состояли из универсальной области, содержащей пять dUTP оснований, (области расщепления) и общей области амплификации, ID-метки (позиционной области) и захватывающего участка (захватывающей области) (Фиг.22 и Таблица 2). Каждый чип также был снабжен рамкой маркерных зондов (Фиг.23), несущих характерную последовательность из 30 п.о. (Таблица 2), дающую возможность гибридизоваться флуоресцентным зондам для помощи в ориентации во время визуализации чипа.
Подготовка ткани: приготовление фиксированной в формалине замороженной ткани
Животное (мышь) перфузировали, используя 50 мл PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) и 100 мл 4%-ного раствора формалина. После иссечения обонятельной луковицы эту ткань помещали в баню с 4%-ным формалином для последующей фиксации в течение 24 ч. Затем ткань обрабатывали сахарозой, используя 30%-ную сахарозу, растворенную в PBS, в течение 24 ч для стабилизации морфологической картины и для удаления избытка формалина. Ткань замораживали до -40°С при регулируемой скорости и хранили при -20°С между экспериментами. Аналогичным образом готовили препарат ткани с последующей фиксацией в течение 3 ч или без последующей фиксации для получения параллельного контрольного образца. Кроме того, успешно использовали перфузию 2%-ным формалином без последующей фиксации. Точно так же может быть опущена стадия обработки сахарозой. Ткань закрепляли в криостате для приготовления срезов толщиной 10 мкм. Срез ткани помещали на поверхность каждого предназначенного для использования чипа, содержащего захватывающие зонды. Для лучшей адгезии ткани чип с чипом возможно помещали на 50°С на 15 минут.
Возможный контроль: получение суммарной РНК из срезов ткани
Суммарную РНК выделяли из одного среза ткани (10 мкм), используя набор RNeasy FFPE (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Эту суммарную РНК, полученную из среза ткани, использовали в контрольных экспериментах для сравнения с экспериментами, в которых РНК была захвачена на чипе непосредственно из среза ткани. Соответственно, в том случае, когда на чип наносили суммарную РНК, стадии окрашивания, визуализации и деградации ткани опускали.
Реакции на чипе
Гибридизацию маркерного зонда с рамочными зондами, обратную транскрипцию, окрашивание ядер, переваривание ткани и расщепление зондов - все эти реакции проводили в 16-луночной кассете с силиконовой прокладкой (Arraylt, Sunnyvale, CA, USA) в реакционном объеме 50 мкл на одну лунку. Чтобы предотвратить испарение, кассеты покрывали приспособлением для запечатывания планшетов (In Vitro AB, Stockholm, Sweden).
Необязательная стадия: пермеабилизация ткани перед синтезом кДНК
Для пермеабилизации с использованием протеиназы К выполняли разбавление протеиназы К (Qiagen, Hilden, Germany) до 1 мкг/мкл в PBS. Раствор добавляли в лунки, и слайд инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут, затем температуру постепенно повышали до 80°С в течение 10 минут. Слайд быстро промывали в PBS перед проведением реакции обратной транскрипции.
Альтернативно, что касается пермеабилизации с использованием микроволнового излучения, то после прикрепления ткани слайд помещали на дно стеклянного сосуда, содержащего 50 мл 0,2×SSC (Sigma-Aldrich), и нагревали в микроволновой печи в течение 1 минуты при 800 Вт. Сразу после обработки микроволновым облучением слайд помещали на бумажную ткань и сушили в течение 30 минут в камере, защищенной от нежелательного воздействия воздуха. По окончании сушки слайд быстро погружали в воду (не содержащую РНКаз/ДНКаз) и окончательно сушили в центрифуге перед инициацией синтеза кДНК.
Синтез кДНК
Для проведения реакции обратной транскрипции использовали систему одностадийной ОТ-ПЦР Superscript™ III с Platinum® Taq ДНК-полимеразой (Life Technologies/lnvitrogen, Carlsbad, CA, USA). Реакционные смеси для обратной транскрипции содержали реакционную смесь (1×), 1× BSA (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) и 2 мкл смеси Superscript III RT/Platinum Taq в конечном объеме 50 мкл. Этот раствор нагревали до 50°С, после чего наносили на срезы ткани и проводили реакцию при 50°С в течение 30 минут. Раствор для проведения обратной транскрипции затем удаляли из лунок, и слайд оставляли высыхать на воздухе в течение 2 часов.
Визуализация ткани
После синтеза кДНК проводили одновременно окрашивание ядер и гибридизацию маркерного зонда с рамочными зондами (зондами, присоединенными к подложке чипа, чтобы иметь возможность провести ориентацию образца ткани на чипе). Готовили раствор с DAPI в концентрации 300 нМ и маркерным зондом в концентрации 170нМ в PBS. Этот раствор добавляли в лунки, и слайд инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут, затем быстро промывали в PBS и сушили в центрифуге.
Альтернативно, перед тем, как поместить ткань на чип, проводили гибридизацию маркерного зонда с рамочными зондами. Затем маркерный зонд разбавляли до 170 нМ в буфере для гибридизации (4×SSC; 0,1% SDS). Этот раствор нагревали до 50°С, после чего наносили на чип и проводили гибридизацию при 50°С в течение 30 минут при 300 об./мин. По окончании гибридизации слайд промывали в 2×SSC с 0,1% SDS при 50°С и 300 об./мин в течение 10 минут, 0,2×SSC при 300 об./мин в течение 1 минуты и 0,1×SSC при 300 об./мин в течение 1 минуты. В этом случае окрашивающий раствор после синтеза кДНК содержал только краситель клеточных ядер DAPI, разбавленный до 300 нМ в PBS. Раствор вносили в лунки, и слайд инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут с последующей быстрой промывкой в PBS и сушкой в центрифуге.
Срезы изучали под микроскопом, используя Zeiss Axio Imager Z2, и обрабатывали, применяя программное обеспечение MetaSystems.
Удаление ткани
Срезы тканей переваривали с использованием протеиназы K, разбавленной до 1,25 мкг/мкл в буфере PKD (Proteinase K Digestion Buffer; буфер для переваривания протеиназой K) из набора RNeasy FFPE (оба от Qiagen), при 56°С в течение 30 минут с интервальным перемешиванием при 300 об./мин в течение 3 секунд, затем 6 секунд в неподвижном состоянии. Слайд последовательно промывали в 2×SSC с 0,1% SDS при 50°С и 300 об./мин в течение 10 минут, 0,2×SSC при 300 об./мин в течение 1 минуты и 0,1×SSC при 300 об./мин в течение 1 минуты.
Высвобождение зондов
16-Луночную кассету для гибридизации с силиконовой прокладкой (Arraylt) предварительно нагревали до 37°С и присоединяли к слайду Nimblegen. В каждую из лунок, содержащих иммобилизованную на поверхности кДНК, добавляли смесь для расщепления объемом 50 мкл, предварительно нагретую до 37°С, состоящую из лизирующего буфера неизвестной концентрации (Takara), USER Enzyme (0,1 ед./мкл; NEB) и BSA (0,1 мкг/мкл). После удаления пузырьков слайд герметично закрывали и инкубировали при 37°С в течение 30 минут в термосмесителе Comfort в режиме периодического встряхивания при 300 об./мин в течение 3 секунд и перерывами в 6 секунд между встряхиваниями. По окончании инкубации из каждой используемой лунки отбирали по 45 мкл смеси после отщепления и помещали в пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл (Фиг.24).
Создание библиотеки
Обработка экзонуклеазой
После охлаждения растворов на льду в течение 2 минут добавляли экзонуклеазу I (NEB) до конечного объема 46,2 мкл и конечной концентрации 0,52 ед./мкл, чтобы удалить неудлиненные кДНК-зонды. Пробирки инкубировали в термоциклере (Applied Biosystems) при 37°С в течение 30 минут, затем проводили инактивацию экзонуклеазы при 80°С в течение 25 минут.
Наращивание (аА)-хвоста с использованием концевой трансферазы
После стадии обработки экзонуклеазой к каждому из образцов добавляли по 45 мкл смеси для наращивания поли(А)-хвоста, состоящей в соответствии с инструкциями производителя из буфера для TdT (Takara), 3 мМ dATP (Takara) и TdT-содержащей ферментативной смеси от производителя (TdT и РНКаза Н) (Takara). Смеси инкубировали в термоциклере при 37°С в течение 15 минут, затем проводили инактивацию TdT при 70°С в течение 10 минут.
Синтез второй нити и ПЦР-амплификация
После наращивания (dA)-хвоста в четыре новые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл помещали по 23 мкл мастер-микс для ПЦР из расчета на один образец, в каждую пробирку добавляли по 2 мкл образца в качестве матрицы. Конечные ПЦР-смеси содержали: 1× буфер для Ex Taq (Takara), dNTP (200 мкМ каждый, Takara), 600 нМ А_праймер (MWG), 600 нМ B_dT20VN_праймер (MWG) и E× Taq-полимеразу (0,025 ед./мкл; Takara) (Таблица 2). Образование второй нити кДНК осуществлялось в результате прохождения одного цикла в термоциклере при 95°С в течение 3 минут, 50°С в течение 2 минут и 72°С в течение 3 минут. Далее образцы амплифицировали, проводя 20 циклов (для создания библиотеки) или 30 циклов (для подтверждения присутствия кДНК) при 95°С в течение 30 секунд, 67°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 3 минут, с последующим окончательным удлинением при 72°С в течение 10 минут.
Очистка библиотеки
После проведения амплификации четыре ПЦР-смеси (100 мкл) смешивали с 500 мкл буфера для связывания (Qiagen), наносили на колонку Qiaquick для очистки после ПЦР (Qiagen) и центрифугировали в течение 1 минуты при 17900хд для связывания амплифицированной кДНК с мембраной. Мембрану затем промывали буфером для промывки (Qiagen), содержащим этанол, и окончательно элюировали в 50 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
Очищенный и концентрированный образец дополнительно очищали и концентрировали, используя СА-очистку (очистку на суперпарамагнитных гранулах, конъюгированных с карбоновой кислотой) с применением робота MBS (Magnetic Biosolutions). Для удаления фрагментов меньше 150-200 п.о. использовали ПЭГ (полиэтиленгликоль) в конечной концентрации 10%. Амплифицированную кДНК оставляли связываться с СА-гранулами (Invitrogen) в течение 10 мин и затем элюировали в 15 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
Анализ качества библиотеки
Образцы, амплифицированные в результате проведения 30 циклов, анализировали с использованием биоанализатора Agilent (Agilent) для подтверждения наличия библиотеки амплифицированной кДНК; в зависимости от количества материала использовали набор DNA High Sensitivity или набор DNA1000.
Создание библиотеки для секвенирования
Индексирование библиотеки
Образцы, амплифицированные в результате проведения 20 циклов, использовали далее для создания библиотек для секвенирования. Для каждого образца готовили помеченный индексом мастер-микс для ПЦР и по 23 мкл помещали в шесть пробирок объемом 0,2 мл. В каждую из шести ПЦР-смесей добавляли по 2 мкл амплифицированной и очищенной кДНК в качестве матрицы, в результате ПЦР-смеси содержали 1× мастер-микс Phusion (Fermentas), 500 нМ InPE1.0 (Illumina), 500 нМ Index 1-12 (IIIumina) и 0,4 нМ InPE2.0 (Illumina). Образцы амплифицировали в термоциклере, проводя 18 циклов при 98°С в течение 30 секунд, 65°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты, с последующим окончательным удлинением при 72°С в течение 5 минут.
Очистка библиотеки для секвенирования
После проведения амплификации шесть ПЦР-смесей (150 мкл) смешивали с 750 мкл буфера для связывания, наносили на колонку Qiaquick для очистки после ПЦР (Qiagen) и центрифугировали в течение 1 минуты при 17900хд для связывания амплифицированной кДНК с мембраной (ввиду большого объема образца (900 мкл), образец центрифугировали в два приема (каждый раз по 450 мкл), и связывание осуществляли за две отдельные стадии). Мембрану затем промывали буфером для промывки, содержащим этанол, и окончательно элюировали в 50 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
Очищенный и концентрированный образец дополнительно очищали и концентрировали, используя СА-очистку с применением робота MBS. Для удаления фрагментов меньше 300-350 п.о. использовали ПЭГ в конечной концентрации 7,8%. Амплифицированную кДНК оставляли связываться с СА-гранулами в течение 10 мин и затем элюировали в 15 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5. Образцы анализировали с использованием биоанализатора Agilent с целью подтверждения наличия и размера полученных библиотек; в зависимости от количества материала в соответствии с инструкциями производителя использовали набор DNA High Sensitivity или набор DNA 1000 (Фиг.25).
Секвенирование
Библиотеки секвенировали на Hiseq2000 или Miseq от Illumina в зависимости от желаемой пропускной способности данных в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых случаях для прочтения 2 использовали изготовленный на заказ секвенирующий праймер В_r2, чтобы избежать секвенирования посредством гомополимерного удлинения 20Т.
Анализ данных
В прочтении 1 были удалены 42 основания с 5′-конца. В прочтении 2 были удалены 25 оснований с 5′-конца (в результате прочтения 2 при применении изготовленного на заказ праймера возможно отсутствие какого-либо удаления оснований). Затем эти прочтения сопоставляли с картой целого генома мыши Mus musculus 9 с маскированными повторами, используя программу bowtie, и выходные данные форматировали в формате SAM-файлов. Получали картированные прочтения и аннотировали их, используя аннотации генов UCSC refGene. Индексы считывали с использованием "indexFinder" (программного обеспечения собственной разработки для считывания индексов). Затем создавали базу данных Mongo DB, содержащую информацию обо всех обнаруженных транскриптах и их положении на чипе соответственно индексу.
Применение matlab сочеталось с базой данных и создавало возможность для пространственной визуализации и анализа данных (Фиг.26).
По желанию, проводили сопоставление полученных визуализацией данных и полученного с помощью микроскопа изображения с использованием меченных флуоресцентной меткой рамочных зондов для строгого выравнивания и обеспечения условий получения данных относительно пространственной транскриптомики.
Пример 9
Пространственная транскриптомика с использованием ориентированных от 3′ к 5′ чипов с высокой плотностью зондов и FFPE-ткани вместе с расщеплением системой MutY и амплификацией с использованием TdT
Изготовление чипов
Стандартные микрочипы высокой плотности были заказаны у Roche-Nimblegen (Madison, WI, USA). Каждый использованный чип с захватывающими зондами содержал 72 тыс.элементов, из которых 66022 содержали уникальную меченую ID-меткой комплементарную последовательность. Размер каждого элемента составлял 16×16 мкм. Захватывающие зонды имели направление от 3′ к 5′, так же как зонды, использованные на печатных ориентированных от 3′ к 5′ чипах собственной разработки, за исключением 3 дополнительных оснований, которые добавляют к верхней (Р′) общей "ручке" зонда, чтобы получить длинную версию Р′, LP′ (Таблица 2). Каждый чип также был снабжен рамкой зондов, несущих стандартную последовательность из 30 п.о., дающую возможность гибридизоваться флуоресцентным зондам для помощи в ориентации во время визуализации чипа.
Синтез ориентированных от 5′ к 3′ захватывающих зондов
Синтез ориентированных от 5′ к 3′ захватывающих зондов на чипах высокой плотности проводили так же, как в случае печатных чипов собственной разработки, за исключением того, что стадии удлинения и лигирования осуществляли при 55°С в течение 15 мин, затем при 72°С в течение 15 мин. Зонд А-"ручка" (Таблица 2) включал ошибочное спаривание A/G, позволяющее осуществить описанное ниже последующее высвобождение зондов с использованием ферментативной системы MutY. Р-зонд был заменен на более длинную версию LP для соответствия более длинным зондам на поверхности.
Приготовление фиксированной в формалине залитой парафином ткани и депарафинизация
Эту процедуру проводили, как описано выше, в соответствии с протоколом собственной разработки.
Синтез кДНК и окрашивание
Синтез кДНК и окрашивание проводили так же, как описано в протоколе для ориентированных от 5′ к 3′ чипов высокой плотности Nimblegen, за исключением того, что меченные биотином dCTP и dATP добавляли во время синтеза кДНК вместе с четырьмя обычными dNTP (каждый из которых присутствовал в 25-кратном избытке по сравнению с таковым, меченным биотином).
Удаление ткани
Удаление ткани проводили таким же образом, как описано в протоколе для ориентированных от 5′ к 3′ чипов высокой плотности Nimblegen, приведенном в примере 8.
Отщепление зондов с использованием MutY
16-Луночную кассету для инкубации с силиконовой прокладкой (Arraylt) предварительно нагревали до 37°С и присоединяли к слайду CodeLink. В каждую из лунок, содержащих иммобилизованную на поверхности кДНК, добавляли смесь для расщепления объемом 50 мкл, предварительно нагретую до 37°С, состоящую из буфера для эндонуклеазы VIII (NEB), MutY (10 ед./мкл) (Trevigen), эндонуклеазы VIII (10 ед./мкл; NEB) и BSA (0,1 мкг/мкл). После удаления пузырьков слайд герметично закрывали и инкубировали при 37°С в течение 30 минут в термосмесителе Comfort в режиме периодического встряхивания при 300 об./мин в течение 3 секунд и с перерывами в 6 секунд между встряхиваниями. По окончании инкубации приспособление для запечатывания планшетов удаляли, и из каждой используемой лунки отбирали по 40 мкл смеси после отщепления и помещали в планшет для ПЦР.
Создание библиотеки
Биотин-стрептавидин-опосредованная очистка библиотеки
Для удаления неудлиненных кДНК зондов и для замены буфера образцы очищали посредством связывания меченной биотином кДНК с покрытыми стрептавидином С1-гранулами (Invitrogen) и промывки гранул 0,1 М NaOH (свежеприготовленным). Очистку проводили с применением робота MBS (Magnetic Biosolutions); меченную биотином кДНК оставляли связываться с С1-гранулами в течение 10 мин и затем элюировали в 20 мкл воды посредством нагревания суспензии гранулы-вода до 80°С для нарушения связывания биотин-стрептавидин.
Наращивание (dA)-хвоста с использованием концевой трансферазы
После проведения стадии очистки по 18 мкл каждого образца помещали в новые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл и смешивали с 22 мкл мастер-микс для наращивания поли(А)-хвоста, получая в результате 40 мкл реакционной смеси, в соответствии с инструкциями производителя состоящей из лизирующего буфера (набор для амплификации целого транскриптома Cellamp, Takara), буфера для TdT (Takara), 1,5 мМ dATP (Takara) и TdT-содержащей ферментативной смеси (TdT и РНКаза Н) (Takara). Смеси инкубировали в термоциклере при 37°С в течение 15 минут, затем проводили инактивацию при 70°С в течение 10 минут.
Синтез второй нити и ПЦР-амплификация
После наращивания (dA)-хвоста в четыре новые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл помещали по 23 мкл мастер-микс для ПЦР из расчета на один образец, в каждую пробирку добавляли по 2 мкл образца в качестве матрицы. Конечные ПЦР-смеси состояли из: 1× буфера для ExTaq (Takara), dNTP (200 мкМ каждый; Takara), 600 нМ А_праймера (MWG), 600 нМ B_dT20VN_праймера (MWG) и E× Taq-полимеразы (0,025 ед./мкл; Takara). Образование второй нити кДНК осуществлялось в результате прохождения одного цикла в термоциклере при 95°С в течение 3 минут, 50°С в течение 2 минут и 72°С в течение 3 минут. Далее образцы амплифицировали, проводя 20 циклов (для создания библиотеки) или 30 циклов (для подтверждения наличия кДНК) при 95°С в течение 30 секунд, 67°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 3 минут, с последующим окончательным удлинением при 72°С в течение 10 минут.
Очистка библиотеки
После проведения амплификации четыре ПЦР-смеси (100 мкл) смешивали с 500 мкл буфера для связывания (Qiagen), наносили на колонку Qiaquick для очистки после ПЦР (Qiagen) и центрифугировали в течение 1 минуты при 17900×g для связывания амплифицированной кДНК с мембраной. Мембрану затем промывали буфером для промывки (Qiagen), содержащим этанол, и окончательно элюировали в 50 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
Очищенный и концентрированный образец дополнительно очищали и концентрировали, используя СА-очистку (очистку на суперпарамагнитных гранулах, конъюгированных с карбоновой кислотой) с применением робота MBS (Magnetic Biosolutions). Для удаления фрагментов меньше 150-200 п.о. использовали ПЭГ в конечной концентрации 10%. Амплифицированную кДНК оставляли связываться с СА-гранулами (Invitrogen) в течение 10 мин и затем элюировали в 15 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
Вторая ПЦР-амплиФикация
Конечные ПЦР-смеси состояли из: 1х буфера для ExTaq (Takara), dNTP (200 мкМ каждый; (Takara), 600 нМ А_праймера (MWG), 600 нМ В_праймера (MWG) и E× Taq-полимеразы (0,025 ед./мкл; Takara). Образцы нагревали до 95°С в течение 3 минут и затем амплифицировали, проводя 10 циклов при 95°С в течение 30 секунд, 65°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 3 минут, с последующим окончательным удлинением при 72°С в течение 10 минут.
Вторая очистка библиотеки
После проведения амплификации четыре ПЦР-смеси (100 мкл) смешивали с 500 мкл буфера для связывания (Qiagen), наносили на колонку Qiaquick для очистки после ПЦР (Qiagen) и центрифугировали в течение 1 минуты при 17900×g для связывания амплифицированной кДНК с мембраной. Мембрану затем промывали буфером для промывки (Qiagen), содержащим этанол, и окончательно элюировали в 50 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
Очищенный и концентрированный образец дополнительно очищали и концентрировали, используя СА-очистку (очистку на суперпарамагнитных гранулах, конъюгированных с карбоновой кислотой) с применением робота MBS (Magnetic Biosolutions). Для удаления фрагментов меньше 150-200 п.о. использовали ПЭГ в конечной концентрации 10%. Амплифицированную кДНК оставляли связываться с СА-гранулами (Invitrogen) в течение 10 мин и затем элюировали в 15 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
Создание библиотеки для секвенирования
Индексирование библиотеки
Образцы, амплифицированные в результате проведения 20 циклов, использовали далее для создания библиотек для секвенирования. Для каждого образца готовили помеченный индексом мастер-микс для ПЦР и по 23 мкл помещали в шесть пробирок объемом 0,2 мл. В каждую из шести ПЦР-смесей добавляли по 2 мкл амплифицированной и очищенной кДНК в качестве матрицы, в результате ПЦР-смеси содержали 1× мастер-микс Phusion (Fermentas), 500 нМ InPE1.0 (Illumina), 500 нМ Index 1-12 (Illumina) и 0,4 нМ InPE2.0 (Illumina). Образцы амплифицировали в термоциклере, проводя 18 циклов при 98°С в течение 30 секунд, 65°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты, с последующим окончательным удлинением при 72°С в течение 5 минут.
Очистка библиотеки для секвенирования
После проведения амплификации образцы очищали и концентрировали, используя СА-очистку с применением робота MBS. Для удаления фрагментов меньше 300-350 п.о. использовали ПЭГ в конечной концентрации 7,8%. Амплифицированную кДНК оставляли связываться с СА-гранулами в течение 10 мин и затем элюировали в 15 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
По 10 мкл амплифицированных и очищенных образцов помещали на чип Caliper XT и вырезали фрагменты от 480 п.о. до 720 п.о., используя Caliper XT (Caliper). Образцы анализировали с использованием биоанализатора Agilent с целью подтверждения наличия и размера полученных библиотек; использовали набор DNA High Sensitivity.
Секвенирование и анализ данных
Секвенирование и биоинформатический анализ данных проводили таким же образом, как описано в протоколе для ориентированных от 5′ к 3′ чипов высокой плотности Nimblegen, как описано в примере 8. Однако, при анализе данных прочтение 1 в картировании транскриптов не использовали. С использованием Matlab-визуализации можно было отсортировать специфичные транскрипты Olfr (Фиг.27).
Пример 10
Пространственная транскриптомика с использованием печатного содержащего 41 метку микрочипа собственной разработки с ориентированными от 5′ к 3′ зондами и фиксированной в формалине замороженной (FF-замороженной) ткани с применением пермеабилизации с использованием протеиназы К или микроволнового излучения, с применением расщепления системой USER и амплификации с использованием TdT
Изготовление чипов
Чипы собственной разработки печатали, как описано ранее, но с включением содержащих 41 уникальную ID-метку зондов того же состава, что и зонды на ориентированном от 5′ к 3′ чипе высокой плотности в примере 8 (Фиг.28).
Все другие стадии осуществляли таким же образом, как описано в протоколе, приведенном в примере 8.
Пример 11
Альтернативный способ проведения стадии синтеза кДНК
Синтез кДНК на чипе, который описан выше, также можно объединить со стадией переключения матрицы с целью создания второй нити путем добавления праймера переключения матрицы к реакционной смеси для синтеза кДНК (Таблица 2). Вторую область амплификации вводят посредством связывания ее с концевыми основаниями, добавленными с использованием обратной транскриптазы на 3′-конец первой нити кДНК, и инициируют синтез второй нити. Эта библиотека может быть легко амплифицирована сразу после высвобождения двунитевого комплекса с поверхности чипа.
Пример 12
Пространственная геномика с использованием печатного содержащего 41 метку микрочипа собственной разработки с ориентированными от 5′ к 3′ зондами и фрагментированной гДНК с наращенным поли(А)-хвостом, с применением отщепления системой USER и амплификации посредством наращивания хвоста с использованием TdT или специфических для транслокации праймеров
Изготовление чипов
Чипы собственной разработки печатали, используя слайд CodeLink (Surmodics), как описано ранее, но с включением содержащих 41 уникальную ID-метку зондов того же состава, что и зонды на ориентированном от 5′ к 3′ чипе высокой плотности в примере 8.
Получение суммарной ДНК из клеток
Фрагментация ДНК
Геномную ДНК (гДНК) из клеточных линий А431 и U2OS выделяли, используя набор DNeasy (Qiagen), в соответствии с инструкциями производителя. ДНК фрагментировали до 500 п.о. на ультразвуковом аппарате Covaris (Covaris) в соответствии с инструкциями производителя.
Образец очищали и концентрировали, используя СА-очистку (очистку на суперпарамагнитных гранулах, конъюгированных с карбоновой кислотой) с применением робота MBS (Magnetic Biosolutions). Для удаления фрагментов меньше 150-200 п.о. использовали ПЭГ в конечной концентрации 10%. Фрагментированную ДНК оставляли связываться с СА-гранулами (Invitrogen) в течение 10 мин и затем элюировали в 15 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
Возможный контроль: перенос разных клеточных линий
Посредством переноса ДНК А431 в ДНК U2OS можно измерить разные уровни чувствительности захвата, например, в зависимости от переноса 1%, 10% или 50% ДНК А431.
Наращивание (dA)-XBOCTa с использованием концевой трансферазы
45 мкл смеси для наращивания поли(А)-хвоста, состоящей в соответствии с инструкциями производителя из буфера для TdT (Такага), 3 мМ dATP (Такага) и TdT-содержащей ферментативной смеси (TdT и РНКаза Н) (Такага), добавляли к 0,5 мкг фрагментированной ДНК. Смеси инкубировали в термоциклере при 37°С в течение 30 минут, затем проводили инактивацию TdT при 80°С в течение 20 минут.Фрагменты с наращенными (dA)-хвостами затем очищали на колонке Qiaquick (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя и концентрацию измеряли, используя систему Qubit (Invitcogen) в соответствии с инструкциями производителя.
Эксперименты на чипе
Реакции гибридизации, синтеза второй нити и отщепления проводили на чипе в 16-луночной кассете с силиконовой прокладкой (Arraylt, Sunnyvale, CA, USA). Чтобы предотвратить испарение, кассеты покрывали приспособлением для запечатывания планшетов (In Vitro AB, Stockholm, Sweden).
Гибридизация
117 нг ДНК вносили в лунку на предварительно нагретый чип (50°С) в общем объеме 45 мкл, состоящем из 1× буфера от NEB (New England Biolabs) и 1×BSA. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 50°С в термосмесителе Comfort (Eppendorf), оснащенном блоком МТР (титрационные микропланшеты), со встряхиванием при 300 об./мин.
Синтез второй нити
Не удаляя смесь после гибридизации, в лунку добавляли 15 мкл смеси для реакции удлинения с использованием фрагмента Кленова, состоящей из 1,5 мкл полимеразы Кленова в 1× буфере от NEB и 3,75 мкл dNTP (по 2 мМ каждого). Реакционную смесь инкубировали в термосмесителе Comfort (Eppendorf) при 37°С в течение 30 мин без встряхивания.
Затем слайд промывали в 2×SSC с 0,1% SDS при 50°С и 300 об./мин в течение 10 минут, 0,2×SSC при 300 об./мин в течение 1 минуты и 0,1×SSC при 300 об./мин в течение 1 минуты.
Высвобождение зондов
Смесь объемом 50 мкл, содержащую 1× реакционный буфер FastStart High Fidelity с 1,8 мМ MgCl2 (Roche), 200 мкМ dNTP (New England Biolabs), 1×BSA и USER Enzyme (0,1 ед.Л мкл; New England Biolabs), нагревали до 37°С, добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 30 мин с перемешиванием (3 секунды при 300 об./мин, 6 секунд в неподвижном состоянии) (термосмеситель Comfort; Eppendorf). Реакционную смесь, содержащую высвобожденную кДНК, затем извлекали из лунок с помощью пипетки.
Создание библиотеки
Реакция амплификации
Амплификацию проводили в реакционных смесях по Юмкл, состоящих из 7,5 мкл высвобожденного образца, 1 мкл каждого праймера и 0,5 мкл фермента (Roche, ПЦР-система FastStart HiFi). Реакцию проводили в следующем циклическом режиме: 94°С в течение 2 мин, один цикл при 94°С в течение 15 с, 55°С в течение 2 мин, 72°С в течение 2 мин, 30 циклов при 94°С в течение 15 с, 65°С в течение 30 с, 72°С в течение 90 с и окончательное удлинение при 72°С в течение 5 мин.
При создании библиотеки для секвенирования использовали два праймера, состоящие из А-"ручки" поверхностного зонда и либо специфического для транслокации праймера (для А431), либо специфического для SNP праймера, связанного с Выручкой" (Таблица 2).
Очистка библиотеки
Очищенный и концентрированный образец дополнительно очищали и концентрировали, используя СА-очистку (очистку на суперпарамагнитных гранулах, конъюгированных с карбоновой кислотой) с применением робота MBS (Magnetic Biosolutions). Для удаления фрагментов меньше 150-200 п.о. использовали ПЭГ в конечной концентрации 10%. Амплифицированную кДНК оставляли связываться с СА-гранулами (Invitrogen) в течение 10 мин и затем элюировали в 15 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
Анализ качества библиотеки
Образцы анализировали с использованием биоанализатора Agilent (Agilent) с целью подтверждения наличия библиотеки амплифицированной ДНК; в зависимости от количества материала использовали набор DNA High Sensitivity или набор DNA 1000.
Индексирование библиотеки
Образцы, амплифицированные в результате проведения 20 циклов, использовали далее для создания библиотек для секвенирования. Для каждого образца готовили помеченный индексом мастер-микс для ПЦР и по 23 мкл помещали в шесть пробирок объемом 0,2 мл. В каждую из шести ПЦР-смесей добавляли по 2 мкл амплифицированной и очищенной кДНК в качестве матрицы, в результате ПЦР-смеси содержали 1× мастер-микс Phusion (Fermentas), 500 нМ InPE1.0 (Illumina), 500 нМ Index 1-12 (Illumina) и 0,4 нМ InPE2.0 (Illumina). Образцы амплифицировали в термоциклере, проводя 18 циклов при 98°С в течение 30 секунд, 65°С в течение 30 секунд и 72°С в течение 1 минуты, с последующим окончательным удлинением при 72°С в течение 5 минут.
Очистка библиотеки для секвенирования
Очищенный и концентрированный образец дополнительно очищали и концентрировали, используя СА-очистку с применением робота MBS. Для удаления фрагментов меньше 300-350 п.о. использовали ПЭГ в конечной концентрации 7,8%. Амплифицированную ДНК оставляли связываться с СА-гранулами (Invitrogen) в течение 10 мин и затем элюировали в 15 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5. Образцы анализировали с использованием биоанализатора Agilent с целью подтверждения наличия и размера полученных библиотек; в зависимости от количества материала в соответствии с инструкциями производителя использовали набор DNA High Sensitivity или набор DNA 1000 (Фиг.29).
Секвенирование
Секвенирование проводили тем же способом, что и в протоколе для ориентированных от 5′ к 3′ чипов высокой плотности от Nimblegen, описанных в примере 8.
Анализ данных
Анализ данных проводили с целью определения чувствительности захвата организованных в чип ID-содержащих захватывающих зондов. Прочтение 2 сортировали на основе содержания в нем праймеров, специфических либо для транслокации, либо для SNP. Эти прочтения далее сортировали по их ID, содержащихся в прочтении 1.
Возможный контроль: прямая амплификация специфических для клеточных линий транслокаций
Это использовали для измерения чувствительности захвата перенесенных клеточных линий непосредственно с применением ПЦР. Прямой и обратный праймеры (Таблица 2) для транслокаций А431 использовали для исследования и детекции наличия транслокации во второй нити скопированного и высвобожденного материала (Фиг.30).
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Figure 00000008

Claims (55)

1. Способ локализованной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани, включающий:
(а) предоставление чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера в реакции удлинения или лигирования праймера, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, содержащую штрихкодовую последовательность, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область для захвата нуклеиновой кислоты образца ткани, который приводят в контакт с указанным чипом;
(б) приведение указанного чипа в контакт с образцом ткани таким образом, что положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани, и предоставление возможности нуклеиновой кислоте образца ткани гибридизоваться с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах;
(в) синтез молекул ДНК на основе захваченных молекул нуклеиновой кислоты с использованием указанных захватывающих зондов в качестве праймеров удлинения или лигирования, где указанные удлиненные или лигированные молекулы ДНК являются мечеными благодаря позиционной области;
(г) возможно синтез комплементарной нити указанной меченой ДНК и/или возможно амплификацию указанной меченой ДНК;
(д) высвобождение по меньшей мере части меченых молекул ДНК и/или их комплементов или ампликонов с поверхности чипа, где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент;
(е) прямой или опосредованный анализ последовательности высвобожденных молекул ДНК; и
(ж) сопоставление информации из анализа последовательности с положением в образце ткани.
2. Способ по п. 1, где стадия (ж) включает сопоставление информации из анализа указанной последовательности с изображением указанного образца ткани, где изображение образца ткани получают до или после стадии (в).
3. Способ по п. 1, представляющий собой способ определения и/или анализа транскриптома образца ткани, включающий:
(а) предоставление чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера обратной транскриптазы (ОТ), где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, содержащую штрихкодовую последовательность, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе; и
(2) захватывающую область для захвата нуклеиновой кислоты образца ткани, который приводят в контакт с указанным чипом;
(б) приведение указанного чипа в контакт с образцом ткани таким образом, что положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани, и предоставление возможности РНК образца ткани гибридизоваться с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах;
(в) синтез молекул кДНК на основе захваченных молекул РНК с использованием указанных захватывающих зондов в качестве ОТ-праймеров и возможно амплификацию указанных молекул кДНК;
(г) высвобождение по меньшей мере части молекул кДНК и возможно их ампликонов с поверхности чипа, где указанная высвобожденная молекула может представлять собой первую нить и/или вторую нить молекулы кДНК или ее ампликон и где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент;
(д) прямой или опосредованный анализ последовательности высвобожденных молекул ДНК; и
(е) сопоставление информации из анализа последовательности с положением в образце ткани, предпочтительно где информацию из анализа указанной последовательности сопоставляют с изображением указанного образца ткани, где изображение образца ткани получают до или после стадии (в).
4. Способ по п. 1, где захватывающие зонды представляют собой молекулы ДНК.
5. Способ по п. 1, где разновидность захватывающего зонда содержит захватывающие области с отличающимися последовательностями.
6. Способ по п. 1, где захватывающие зонды дополнительно содержат универсальную область, которая расположена ближе к 5′-концу относительно позиционной области, где указанная универсальная область содержит:
(1) область амплификации для амплифицирования синтезированных молекул ДНК; и/или
(2) область расщепления для высвобождения синтезированных молекул ДНК с поверхности чипа.
7. Способ по п. 1, где позиционная область каждой разновидности захватывающего зонда содержит уникальную штрихкодовую последовательность.
8. Способ по п. 1, где захватывающая область содержит поли(Т)-ДНК-олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере 10 остатков дезокситимидина, и/или случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность.
9. Способ по п. 1, где захватывающая область содержит последовательность, специфичную к конкретному целевому гену или группе генов.
10. Способ по п. 1, где захватывающие зонды иммобилизованы непосредственно на поверхности чипа через их 5′-конец.
11. Способ по п. 1, где захватывающие зонды иммобилизованы опосредованно на поверхности чипа в результате гибридизации с поверхностным зондом, где захватывающая область захватывающих зондов содержит расположенную "вверх по течению" последовательность, способную гибридизоваться с 5′-концом поверхностных зондов, которые иммобилизованы на чипе.
12. Способ по п. 11, где поверхностные зонды иммобилизованы на поверхности чипа через их 3′-конец.
13. Способ по п. 11, где поверхностные зонды содержат последовательность, комплементарную:
(1) по меньшей мере части захватывающей области;
(2) позиционной области; и
(3) по меньшей мере части универсальной области амплификации.
14. Способ по п. 1, где указанную комплементарную нить или указанную вторую нить молекулы кДНК синтезируют до или после высвобождения указанных меченых молекул ДНК или указанных молекул кДНК с поверхности чипа.
15. Способ по п. 1, где для синтеза нити, комплементарной второй нити кДНК, используют полимеразу замещения нити.
16. Способ по п. 1, где для синтеза комплементарной нити или второй нити кДНК используют случайные праймеры.
17. Способ по п. 16, где случайные праймеры содержат область амплификации.
18. Способ по п. 17, где область амплификации случайных праймеров состоит из нуклеотидной последовательности, отличающейся от области амплификации захватывающего зонда.
19. Способ по п. 1, где к одному или обоим концам меченых молекул или их комплементов или молекул кДНК лигируют адаптеры.
20. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию амплификации меченых молекул или молекул кДНК до проведения анализа последовательности.
21. Способ по п. 20, где стадию амплификации осуществляют после высвобождения меченых молекул ДНК или кДНК с подложки чипа или где стадию амплификации осуществляют на чипе in situ.
22. Способ по п. 20, где стадия амплификации включает ПЦР (полимеразную цепную реакцию).
23. Способ по п. 1, где молекулы высвобождают с поверхности чипа посредством:
(1) отщепления нуклеиновой кислоты;
(2) денатурации; и/или
(3) физического способа.
24. Способ по п. 23 (1), где молекулы высвобождают посредством ферментативного расщепления области расщепления, которая локализована в универсальной области или позиционной области захватывающего зонда.
25. Способ по п. 23 (2) или (3), где молекулы высвобождают посредством подведения горячей воды или буфера к чипу.
26. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию очистки высвобожденных молекул до секвенирования.
27. Способ по п. 1, где подложка выбрана из группы, состоящей из стекла, кремния, покрытого поли-L-лизином материала, нитроцеллюлозы, полистирола, сополимеров циклических олефинов (СОС), полимеров циклических олефинов (СОР), полипропилена, полиэтилена и поликарбоната.
28. Способ по п. 1, где образец ткани представляет собой срез ткани.
29. Способ по п. 28, где срез ткани получают с использованием фиксированной ткани, например фиксированной в формалине залитой парафином (FFPE) ткани, или ткани после глубокого замораживания.
30. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию регидратации образца ткани после приведения образца в контакт с чипом и до стадии (в).
31. Способ по п. 1, где образец ткани происходит из растения, животного или гриба.
32. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию промывки чипа для удаления оставшейся ткани, где указанную стадию осуществляют до высвобождения молекул с чипа.
33. Способ по п. 1, где чип содержит по меньшей мере один позиционный маркер, позволяющий осуществлять ориентацию образца ткани на чипе.
34. Способ по п. 33, где чип содержит по меньшей мере 10, 50, 100, 200, 500, 1000 или 2000 позиционных маркеров в определенных положениях на поверхности чипа.
35. Способ по п. 33, где позиционные маркеры способны гибридизоваться с меченой, предпочтительно меченной флуоресцентной меткой, маркерной молекулой нуклеиновой кислоты.
36. Способ по п. 2, где изображение образца ткани получают с использованием световой, светлопольной, темнопольной, фазово-контрастной, флуоресцентной, отражательной, интерференционной или конфокальной микроскопии или их комбинации.
37. Способ по п. 36, где изображение образца ткани получают с использованием флуоресцентной микроскопии.
38. Способ по п. 1, где стадия анализа последовательности включает стадию секвенирования и, предпочтительно, где стадия секвенирования включает реакцию секвенирования, основанную на обратимых красителях-терминаторах.
39. Способ по п. 1, где подложка чипа является подходящей для применения в качестве платформы для секвенирования.
40. Способ по п. 39, где подложка чипа является подходящей для применения в технологиях секвенирования следующего поколения.
41. Способ по п. 1, где захватывающие зонды иммобилизованы на чипе посредством мостиковой амплификации.
42. Способ по п. 1, где каждая разновидность захватывающего зонда иммобилизована на подложке чипа посредством мостиковой амплификации с образованием кластерной колонии захватывающего зонда, так что каждая разновидность захватывающего зонда занимает определенное положение на подложке чипа.
43. Способ по п. 1, где чип представляет собой чип на основе гранул.
44. Способ по п. 43, где каждая разновидность захватывающего зонда иммобилизована на отличной грануле, так что каждая разновидность захватывающего зонда занимает определенное положение на подложке чипа.
45. Способ изготовления или получения чипа для применения в локализованной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани, включающий иммобилизацию многочисленных разновидностей захватывающего зонда непосредственно или опосредованно на подложке чипа, где каждая разновидность захватывающего зонда занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера в реакции удлинения или лигирования праймера, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, содержащую штрихкодовую последовательность, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе; и
(2) захватывающую область для захвата нуклеиновой кислоты образца ткани, содержащую:
а) поли(Т)-ДНК-олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере 10 остатков дезокситимидина, и/или случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или
б) последовательности, специфичные к группе генов.
46. Способ по п. 45, дополнительно включающий любую одну или более чем одну из следующих стадий:
(а) иммобилизация многочисленных поверхностных зондов непосредственно или опосредованно на подложке чипа, где поверхностные зонды содержат:
(1) область, способную гибридизоваться с частью олигонуклеотида захватывающей области (частью, не вовлеченной в захват нуклеиновой кислоты);
(2) комплементарную позиционную область; и
(3) комплементарную универсальную область;
(б) гибридизация олигонуклеотидов захватывающих областей и олигонуклеотидов универсальных областей с поверхностными зондами, иммобилизованными на чипе;
(в) удлинение олигонуклеотидов универсальных областей посредством матричной полимеризации для синтеза позиционной области захватывающего зонда; и
(г) лигирование позиционной области с олигонуклеотидом захватывающей области для получения захватывающего олигонуклеотида.
47. Чип для применения в локализованной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани, содержащий подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера удлинения или лигирования, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, содержащую штрихкодовую последовательность, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область для захвата нуклеиновой кислоты образца ткани, содержащую:
а) поли(Т)-ДНК-олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере 10 остатков дезокситимидина, и/или случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или
б) последовательности, специфичные к группе генов.
48. Чип по п. 47, где подложка чипа является подходящей для применения в качестве платформы для секвенирования.
49. Чип по п. 48, где подложка чипа является подходящей для применения в технологиях секвенирования следующего поколения.
50. Чип по п. 47, где захватывающие зонды иммобилизованы на чипе посредством мостиковой амплификации.
51. Чип по п. 47, где каждая разновидность захватывающего зонда иммобилизована на подложке чипа посредством мостиковой амплификации с образованием кластерной колонии захватывающего зонда, так что каждая разновидность захватывающего зонда занимает определенное положение на подложке чипа.
52. Чип по п. 47, где чип представляет собой чип на основе гранул.
53. Чип по п. 52, где каждая разновидность захватывающего зонда иммобилизована на отличной грануле, так что каждая разновидность захватывающего зонда занимает определенное положение на подложке чипа
54. Способ по п. 1, представляющий собой способ локализованной детекции ДНК в образце ткани, включающий:
(а) предоставление чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера в реакции удлинения или лигирования праймера, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, содержащую штрихкодовую последовательность, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область для захвата нуклеиновой кислоты образца ткани, который приводят в контакт с указанным чипом;
(б) приведение указанного чипа в контакт с образцом ткани таким образом, что положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани, и предоставление возможности ДНК образца ткани гибридизоваться с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах;
(в) фрагментацию ДНК в указанном образце ткани, которую осуществляют до, в процессе или после приведения чипа в контакт с образцом ткани на стадии (б);
(г) удлинение указанных захватывающих зондов в реакции удлинения праймеров с использованием захваченных фрагментов ДНК в качестве матриц для синтеза удлиненных молекул ДНК или лигирование захваченных фрагментов ДНК с захватывающими зондами в реакции лигирования для синтеза лигированных молекул ДНК, где указанные удлиненные или лигированные молекулы ДНК являются мечеными благодаря позиционной области;
(д) возможно синтез комплементарной нити указанной меченой ДНК и/или возможно амплификацию указанной меченой ДНК;
(е) высвобождение по меньшей мере части меченых молекул ДНК и/или их комплементов и/или ампликонов с поверхности чипа, где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент;
(ж) прямой или опосредованный анализ последовательности (например, секвенирование) высвобожденных молекул ДНК; и
(з) сопоставление информации из анализа последовательности с положением в образце ткани, предпочтительно где информацию из анализа указанной последовательности сопоставляют с изображением указанного образца ткани, где изображение образца ткани получают до или после стадии (г).
55. Способ по п. 54, включающий:
(а) предоставление чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера в реакции удлинения или лигирования праймера, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′:
(1) позиционную область, содержащую штрихкодовую последовательность, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и
(2) захватывающую область для захвата нуклеиновой кислоты образца ткани, который приводят в контакт с указанным чипом;
(б) приведение указанного чипа в контакт с образцом ткани таким образом, что положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани;
(в) фрагментацию ДНК в указанном образце ткани, которую осуществляют до, в процессе или после приведения чипа в контакт с образцом ткани на стадии (б);
(г) обеспечение указанных фрагментов ДНК связывающей областью, которая способна гибридизоваться с указанной захватывающей областью;
(д) предоставление возможности указанным фрагментам ДНК гибридизоваться с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах;
(е) удлинение указанных захватывающих зондов в реакции удлинения праймеров с использованием захваченных фрагментов ДНК в качестве матриц для синтеза удлиненных молекул ДНК или лигирование захваченных фрагментов ДНК с захватывающими зондами в реакции лигирования для синтеза лигированных молекул ДНК, где указанные удлиненные или лигированные молекулы ДНК являются мечеными благодаря позиционной области;
(ж) возможно синтез комплементарной нити указанной меченой ДНК и/или возможно амплификацию меченой ДНК;
(з) высвобождение по меньшей мере части меченых молекул ДНК и/или их комплементов и/или ампликонов с поверхности чипа, где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент;
(и) прямой или опосредованный анализ последовательности (например, секвенирование) высвобожденных молекул ДНК; и
(к) сопоставление информации из анализа последовательности с положением в образце ткани, предпочтительно где информацию из анализа указанной последовательности сопоставляют с изображением указанного образца ткани, где изображение образца ткани получают до или после стадии (е).
RU2013148909/10A 2011-04-13 2012-04-13 Способ и продукт для локализованной или пространственной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани RU2603074C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1106254.4 2011-04-13
GBGB1106254.4A GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-04-13 Method and product
PCT/EP2012/056823 WO2012140224A1 (en) 2011-04-13 2012-04-13 Method and product for localised or spatial detection of nucleic acid in a tissue sample

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013148909A RU2013148909A (ru) 2015-05-20
RU2603074C2 true RU2603074C2 (ru) 2016-11-20

Family

ID=44123034

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013148909/10A RU2603074C2 (ru) 2011-04-13 2012-04-13 Способ и продукт для локализованной или пространственной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани

Country Status (13)

Country Link
US (12) US10030261B2 (ru)
EP (4) EP4206333A1 (ru)
JP (1) JP5916166B2 (ru)
KR (1) KR101994494B1 (ru)
CN (3) CN115896252A (ru)
AU (1) AU2012241730B2 (ru)
BR (1) BR112013026502A2 (ru)
CA (1) CA2832678C (ru)
GB (1) GB201106254D0 (ru)
MX (1) MX340330B (ru)
NZ (1) NZ616407A (ru)
RU (1) RU2603074C2 (ru)
WO (1) WO2012140224A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2816708C2 (ru) * 2018-10-25 2024-04-03 Иллюмина, Инк. Способы и композиции для определения лигандов на матрицах с использованием индексов и штрихкодов

Families Citing this family (289)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
PL2556171T3 (pl) 2010-04-05 2016-04-29 Prognosys Biosciences Inc Oznaczenia biologiczne kodowane przestrzennie
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
GB201106254D0 (en) * 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
EP2766498B1 (en) 2011-10-14 2019-06-19 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
EP4249605A3 (en) 2011-12-22 2023-11-15 President And Fellows Of Harvard College Methods for analyte detection
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
CA2865575C (en) 2012-02-27 2024-01-16 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
ES2776673T3 (es) 2012-02-27 2020-07-31 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y usos para etiquetas moleculares
EP2647426A1 (en) * 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
WO2013184754A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes
EP2881465B1 (en) * 2012-07-30 2018-07-04 Hitachi, Ltd. Tag-sequence-attached two-dimensional cdna library device, and gene expression analysis method and gene expression analysis apparatus each utilizing same
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20150376609A1 (en) 2014-06-26 2015-12-31 10X Genomics, Inc. Methods of Analyzing Nucleic Acids from Individual Cells or Cell Populations
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2886974C (en) * 2012-10-17 2021-06-29 Spatial Transcriptomics Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
WO2014093825A1 (en) * 2012-12-14 2014-06-19 Chronix Biomedical Personalized biomarkers for cancer
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP3578666A1 (en) 2013-03-12 2019-12-11 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
WO2014185960A2 (en) * 2013-05-14 2014-11-20 Genomics Usa, Inc. Composition and methods for entrapping a protein on a surface
US9868979B2 (en) 2013-06-25 2018-01-16 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
EP3013978B1 (en) * 2013-06-29 2019-11-20 Firmenich SA Methods of identifying, isolating and using odorant and aroma receptors
SG10201806890VA (en) 2013-08-28 2018-09-27 Cellular Res Inc Massively parallel single cell analysis
EP3055676A1 (en) 2013-10-07 2016-08-17 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
WO2015058052A1 (en) * 2013-10-18 2015-04-23 The Broad Institute Inc. Spatial and cellular mapping of biomolecules in situ by high-throughput sequencing
US9834814B2 (en) 2013-11-22 2017-12-05 Agilent Technologies, Inc. Spatial molecular barcoding of in situ nucleic acids
WO2015085274A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for sequencing nucleic acids
EP3628747B1 (en) 2013-12-05 2022-10-05 Centrillion Technology Holdings Corporation Fabrication of patterned arrays
CN105940024B (zh) 2013-12-05 2019-03-15 生捷科技控股公司 修饰的表面
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
EP2883963A1 (en) * 2013-12-16 2015-06-17 Alacris Theranostics GmbH Method for generating of oligonucleotide arrays using in situ block synthesis approach
WO2015118551A1 (en) 2014-02-10 2015-08-13 Technion Research & Development Foundation Limited. Method and apparatus for cell isolation, growth, replication, manipulation, and analysis
US11060139B2 (en) 2014-03-28 2021-07-13 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for sequencing nucleic acids
CN106460052B (zh) * 2014-05-14 2021-07-16 海德堡鲁普雷希特卡尔斯大学 双链核酸的合成
GB201411624D0 (en) 2014-06-30 2014-08-13 Ge Healthcare Uk Ltd Spatial molecular profiling of solid biological masses and profile storage
KR101634553B1 (ko) * 2014-08-06 2016-06-30 가천대학교 산학협력단 통합형 pc 마이크로 디바이스, 그 제조방법 및 이를 이용한 연속적 dna 정제-증폭 방법
CN106661637B (zh) * 2014-09-05 2021-04-27 郑直 检测核酸的方法和其应用
US9897791B2 (en) 2014-10-16 2018-02-20 Illumina, Inc. Optical scanning systems for in situ genetic analysis
CN107407638B (zh) 2014-12-03 2021-01-12 伊索普莱西斯公司 细胞分泌特征的分析和筛选
CN112126675B (zh) 2015-01-12 2022-09-09 10X基因组学有限公司 用于制备核酸测序文库的方法和系统以及用其制备的文库
GB201501907D0 (en) * 2015-02-05 2015-03-25 Technion Res & Dev Foundation System and method for single cell genetic analysis
CN107250379B (zh) 2015-02-19 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 结合蛋白质组信息和基因组信息的高通量单细胞分析
EP3262192B1 (en) 2015-02-27 2020-09-16 Becton, Dickinson and Company Spatially addressable molecular barcoding
CN107532219B (zh) * 2015-03-25 2023-05-02 安戈欧洲有限公司 使用链置换聚合酶的固相靶核酸捕获和复制
ES2934982T3 (es) 2015-03-30 2023-02-28 Becton Dickinson Co Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios
US10876106B2 (en) 2015-04-09 2020-12-29 Hitachi, Ltd. Gene analysis system
ES2955916T3 (es) 2015-04-10 2023-12-11 Spatial Transcriptomics Ab Análisis múltiplex de especímenes biológicos de ácidos nucleicos espacialmente distinguidos
BR112017021993A2 (pt) 2015-04-14 2018-07-31 Koninklijke Philips Nv método para detecção espacial de ácidos nucleicos em uma amostra de tecido
US20180057873A1 (en) * 2015-04-17 2018-03-01 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for performing spatial profiling of biological materials
WO2016172373A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
AU2016295158B2 (en) 2015-07-17 2021-02-25 Nanostring Technologies, Inc. Simultaneous quantification of gene expression in a user-defined region of a cross-sectioned tissue
CN108138225B (zh) * 2015-07-27 2022-10-14 亿明达股份有限公司 核酸序列信息的空间定位
US10619186B2 (en) 2015-09-11 2020-04-14 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for library normalization
WO2017075293A1 (en) * 2015-10-28 2017-05-04 Silicon Valley Scientific, Inc. Method and apparatus for encoding cellular spatial position information
AU2016349288A1 (en) 2015-11-03 2018-05-31 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
WO2017096158A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
CN105505755A (zh) * 2015-12-23 2016-04-20 杭州谷禾信息技术有限公司 空间转录组建库测序方法及所用装置
US11542498B2 (en) * 2015-12-28 2023-01-03 Pathogendx, Inc. Microarray based multiplex pathogen analysis and uses thereof
WO2017189525A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
EP4269616A3 (en) 2016-05-02 2024-02-14 Becton, Dickinson and Company Accurate molecular barcoding
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
EP3465502B1 (en) 2016-05-26 2024-04-10 Becton, Dickinson and Company Molecular label counting adjustment methods
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
WO2017222453A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Hauling Thomas Nucleic acid sequencing
EP3507364A4 (en) * 2016-08-31 2020-05-20 President and Fellows of Harvard College METHODS OF GENERATING NUCLEIC ACID SEQUENCE LIBRARIES FOR IN SITU FLUORESCENT SEQUENCING DETECTION
WO2018045186A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 President And Fellows Of Harvard College Methods of combining the detection of biomolecules into a single assay using fluorescent in situ sequencing
EP3516400B1 (en) 2016-09-26 2023-08-16 Becton, Dickinson and Company Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
EP3526348A4 (en) * 2016-10-17 2020-06-24 Lociomics Corporation HIGH RESOLUTION GENOME SPATIAL ANALYSIS OF TISSUE AND CELL AGGREGATES
JP7228510B2 (ja) 2016-11-08 2023-02-24 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 細胞標識分類の方法
EP3539035B1 (en) 2016-11-08 2024-04-17 Becton, Dickinson and Company Methods for expression profile classification
JP7348066B2 (ja) 2016-11-11 2023-09-20 アイソプレキシス コーポレイション 単一細胞のゲノム、トランスクリプトームおよびプロテオームの同時解析のための組成物および方法
GB201619458D0 (en) * 2016-11-17 2017-01-04 Spatial Transcriptomics Ab Method for spatial tagging and analysing nucleic acids in a biological specimen
US11525783B2 (en) 2016-11-22 2022-12-13 IsoPlexis Corporation Systems, devices and methods for cell capture and methods of manufacture thereof
WO2018102064A1 (en) * 2016-11-30 2018-06-07 Microsoft Technology Licensing, Llc. Dna random access storage system via ligation
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10722880B2 (en) 2017-01-13 2020-07-28 Cellular Research, Inc. Hydrophilic coating of fluidic channels
RU2665631C2 (ru) * 2017-01-25 2018-09-03 Общество с ограниченной ответственностью "Секвойя Дженетикс" Способ специфической идентификации последовательностей днк
EP3545089B1 (en) 2017-01-30 2022-03-09 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
WO2018144240A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Cellular Research, Inc. Selective amplification using blocking oligonucleotides
CN111051526A (zh) * 2017-05-23 2020-04-21 生捷科技控股公司 用于实施生物分子空间分布分析的方法
JP2020522262A (ja) 2017-06-05 2020-07-30 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 単一細胞用のサンプルインデックス付加
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
EP3668998A1 (en) 2017-10-06 2020-06-24 Cartana AB Rna templated ligation
EP4241882A3 (en) 2017-10-27 2023-12-06 10X Genomics, Inc. Methods for sample preparation and analysis
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
CN111492068A (zh) 2017-12-19 2020-08-04 贝克顿迪金森公司 与寡核苷酸相关联的颗粒
EA202091673A1 (ru) 2018-01-29 2021-02-03 Ст. Джуд Чилдрен'С Рисерч Хоспитал, Инк. Способ амплификации нуклеиновых кислот
AU2019216973A1 (en) 2018-02-12 2020-08-27 Nanostring Technologies, Inc Biomolecular probes and methods of detecting gene and protein expression
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
EP3788170A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Becton, Dickinson and Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
KR102103719B1 (ko) * 2018-05-18 2020-04-23 주식회사 바이나리 등온핵산 증폭을 이용한 생체조직의 3차원 핵산영상 분석 방법
BR112020023227A2 (pt) * 2018-05-18 2021-02-23 Microbix Biosystems Inc. composições de controle de qualidade e materiais de controle de organismo inteiro para uso em teste de ácido nucleico
AU2019274469A1 (en) * 2018-05-21 2020-11-26 The Regents Of The University Of California Single cell mapping and transcriptome analysis
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
EP3824098A1 (en) 2018-07-18 2021-05-26 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Method for analyzing cell sample heterogeneity
US20210317528A1 (en) * 2018-07-23 2021-10-14 Genomics Usa, Inc. Blood typing using dna
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
CN109136372A (zh) * 2018-08-08 2019-01-04 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 一种基于illumina平台的乳腺癌分型检测建库试剂盒
CN109097467A (zh) * 2018-08-08 2018-12-28 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒及应用
CN113366117A (zh) 2018-08-28 2021-09-07 10X基因组学股份有限公司 用于生物样品中转座酶介导的空间标记和分析基因组dna的方法
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US20210317524A1 (en) 2018-08-28 2021-10-14 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays
US11639517B2 (en) 2018-10-01 2023-05-02 Becton, Dickinson And Company Determining 5′ transcript sequences
WO2020076979A1 (en) * 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Surface capture of targets
WO2020086746A1 (en) * 2018-10-25 2020-04-30 Illumina, Inc. Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes
JP2022506546A (ja) 2018-11-08 2022-01-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析
CN109576357A (zh) * 2018-11-20 2019-04-05 上海欧易生物医学科技有限公司 一种全长转录本水平高通量检测单细胞中基因突变的方法
WO2020117914A1 (en) * 2018-12-04 2020-06-11 Roche Sequencing Solutions, Inc. Spatially oriented quantum barcoding of cellular targets
US20230242976A1 (en) * 2018-12-10 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
EP3894592A2 (en) 2018-12-10 2021-10-20 10X Genomics, Inc. Generating spatial arrays with gradients
CA3122494A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Dna Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
CN113195717A (zh) 2018-12-13 2021-07-30 贝克顿迪金森公司 单细胞全转录组分析中的选择性延伸
GB201820341D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 10X Genomics Inc Method for transposase-mediated spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen
GB201820300D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 10X Genomics Inc Method for spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen
EP3899029A1 (en) * 2018-12-21 2021-10-27 Illumina, Inc. Nuclease-based rna depletion
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
CN109762728A (zh) * 2019-01-07 2019-05-17 东南大学 一种空间转录组检测芯片及方法
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
WO2020150356A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
EP4242322A3 (en) 2019-01-23 2023-09-20 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
US20220119871A1 (en) * 2019-01-28 2022-04-21 The Broad Institute, Inc. In-situ spatial transcriptomics
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
WO2020168013A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
WO2020176788A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
US20230159995A1 (en) * 2019-02-28 2023-05-25 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
CN113767178A (zh) * 2019-03-11 2021-12-07 10X基因组学有限公司 用于处理光学标签化珠粒的系统和方法
WO2020190509A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
WO2020198071A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
CN114174532A (zh) * 2019-04-05 2022-03-11 德克萨斯大学系统董事会 细胞条形码编码的方法和应用
WO2020214642A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
CA3140512A1 (en) * 2019-05-15 2020-11-19 Bgi Shenzhen Array and method for detecting spatial information of nucleic acids
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
AU2020282024A1 (en) 2019-05-31 2021-11-11 10X Genomics, Inc. Method of detecting target nucleic acid molecules
US11739316B2 (en) 2019-06-21 2023-08-29 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Oligonucleotide-tethered nucleotides
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
WO2021016379A1 (en) * 2019-07-23 2021-01-28 University Of Washington Method for spatially barcoding cells in tissue slices
WO2021066465A1 (ko) * 2019-10-01 2021-04-08 (주)컨투어젠 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 2차원의 위치 정보를 유지한 채 추출하는 방법 및 장치, 이를 이용한 위치정보를 포함하는 유전체 분석 방법
US11514575B2 (en) 2019-10-01 2022-11-29 10X Genomics, Inc. Systems and methods for identifying morphological patterns in tissue samples
CN110804654A (zh) * 2019-10-30 2020-02-18 东南大学 一种空间转录组测序方法
US20210130881A1 (en) 2019-11-06 2021-05-06 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
JP2023500679A (ja) 2019-11-08 2023-01-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 免疫レパートリーシーケンシングのための完全長ｖ（ｄ）ｊ情報を得るためのランダムプライミングの使用
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
US20230002812A1 (en) 2019-11-13 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
WO2021102003A1 (en) 2019-11-18 2021-05-27 10X Genomics, Inc. Systems and methods for tissue classification
US20210155982A1 (en) 2019-11-21 2021-05-27 10X Genomics, Inc. Pipeline for spatial analysis of analytes
US11501440B2 (en) 2019-11-22 2022-11-15 10X Genomics, Inc. Systems and methods for spatial analysis of analytes using fiducial alignment
EP4073241A2 (en) 2019-12-11 2022-10-19 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants
EP3891300B1 (en) 2019-12-23 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
EP4087945B1 (en) 2020-01-10 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
EP4090763A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Becton Dickinson and Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US20230047782A1 (en) * 2020-02-07 2023-02-16 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
JP2023512781A (ja) * 2020-02-12 2023-03-29 ユニバーサル シーケンシング テクノロジー コーポレイション 細胞内バーコード化および空間的バーコード化のための方法
WO2021168278A1 (en) 2020-02-20 2021-08-26 10X Genomics, Inc. METHODS TO COMBINE FIRST AND SECOND STRAND cDNA SYNTHESIS FOR SPATIAL ANALYSIS
JP2023514749A (ja) 2020-02-21 2023-04-07 １０エックス ジェノミクス インコーポレイテッド 統合型インサイチュ空間的アッセイのための方法および組成物
AU2021224760A1 (en) 2020-02-21 2022-09-15 10X Genomics, Inc. Capturing genetic targets using a hybridization approach
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
US20210277460A1 (en) * 2020-03-05 2021-09-09 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial transcriptomics with sequencing readout
KR102482668B1 (ko) * 2020-03-10 2022-12-29 사회복지법인 삼성생명공익재단 고유 분자 식별자의 표지 정확도를 증진하는 방법
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
US20230265491A1 (en) 2020-05-04 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomic transfer modes
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
EP4150118A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Becton Dickinson and Company Primers for immune repertoire profiling
CN116134308A (zh) 2020-05-19 2023-05-16 10X基因组学有限公司 电泳盒和仪器
AU2021275906A1 (en) 2020-05-22 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021237056A1 (en) * 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Rna integrity analysis in a biological sample
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
EP4158054A1 (en) * 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
WO2021247543A2 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
EP4162074B1 (en) 2020-06-08 2024-04-24 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252576A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using blocker oligonucleotides
EP4165207A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
CN116034166A (zh) 2020-06-25 2023-04-28 10X基因组学有限公司 Dna甲基化的空间分析
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
WO2022013094A1 (en) 2020-07-15 2022-01-20 Dna Script Massively parallel enzymatic synthesis of polynucleotides
US20240043913A1 (en) 2020-07-17 2024-02-08 The Regents Of The University Of Michigan Materials and methods for localized detection of nucleic acids in a tissue sample
EP4189110A1 (en) 2020-07-31 2023-06-07 10X Genomics, Inc. De-crosslinking compounds and methods of use for spatial analysis
US11492662B2 (en) 2020-08-06 2022-11-08 Singular Genomics Systems, Inc. Methods for in situ transcriptomics and proteomics
EP4121557A4 (en) 2020-08-06 2024-05-01 Singular Genomics Systems, Inc. SPATIAL SEQUENCING
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US20220065787A1 (en) * 2020-08-31 2022-03-03 Applied Materials, Inc. Methods of mfish using alignment beads
JP2023541449A (ja) 2020-09-14 2023-10-02 シンギュラー・ゲノミクス・システムズ・インコーポレイテッド 多次元撮像のための方法およびシステム
WO2022060798A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 10X Genomics, Inc. Methods of releasing an extended capture probe from a substrate and uses of the same
CN116507739A (zh) 2020-09-16 2023-07-28 10X基因组学有限公司 使用多个孔确定生物样品中分析物位置的方法
US20240033743A1 (en) 2020-09-18 2024-02-01 10X Genomics, Inc. Sample handling apparatus and fluid delivery methods
EP4214678A2 (en) 2020-09-18 2023-07-26 10X Genomics, Inc. Sample handling apparatus and image registration methods
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
WO2022081643A2 (en) 2020-10-13 2022-04-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for generating recombinant antigen binding molecules from single cells
AU2021366701A1 (en) 2020-10-22 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification
AU2021376399A1 (en) * 2020-11-06 2023-06-15 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for binding an analyte to a capture probe
WO2022109181A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing immune infiltration in cancer stroma to predict clinical outcome
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
CN116635533A (zh) 2020-11-20 2023-08-22 贝克顿迪金森公司 高表达的蛋白和低表达的蛋白的谱分析
US20220186300A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for multimodal in situ analysis
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
CN116601469A (zh) 2020-12-21 2023-08-15 奇异基因组学系统公司 用于多色成像的系统和方法
WO2022147005A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 10X Genomics, Inc. Methods for analyte capture determination
WO2022147296A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 10X Genomics, Inc. Cleavage of capture probes for spatial analysis
AU2022209365A1 (en) * 2021-01-21 2023-07-20 Nautilus Subsidiary, Inc. Systems and methods for biomolecule preparation
WO2022164615A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 10X Genomics, Inc. Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample
EP4298244A1 (en) 2021-02-23 2024-01-03 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
EP4301870A1 (en) 2021-03-18 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
WO2022216688A1 (en) 2021-04-05 2022-10-13 10X Genomics, Inc. Recombinant ligase composition and uses thereof
EP4305196A1 (en) 2021-04-14 2024-01-17 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
WO2022226057A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 10X Genomics, Inc. Methods for assessing sample quality prior to spatial analysis using templated ligation
WO2022232571A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 10X Genomics, Inc. Fusion rt variants for improved performance
WO2022236054A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 10X Genomics, Inc. Methods for increasing resolution of spatial analysis
CN117642515A (zh) 2021-05-19 2024-03-01 马克思-德布鲁克-分子医学中心亥姆霍兹联合会 组织基因表达数据三维重建的方法和系统
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2022265965A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants for improved performance
US20220403462A1 (en) 2021-06-18 2022-12-22 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method of spatial sequencing of genes from tissue using padlocks with gaps on substrate
WO2022271820A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 10X Genomics, Inc. Spatial detection of sars-cov-2 using templated ligation
CN117651855A (zh) 2021-07-13 2024-03-05 10X基因组学有限公司 用于制备具有可控厚度的聚合基质的方法
WO2023287765A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted probe silencing
CN113604547B (zh) * 2021-08-06 2023-05-02 吉林大学 一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法
WO2023018799A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 10X Genomics, Inc. Methods, compositions and systems for identifying antigen-binding molecules
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023044071A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 10X Genomics, Inc. Systems and methods for image registration or alignment
EP4155416B1 (en) 2021-09-23 2024-01-10 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method for obtaining spatial and sequencing information of m-rna from tissue
CN113930847B (zh) * 2021-09-26 2024-05-28 东南大学 一种空间转录组位置信息编码芯片及其制备方法和应用
WO2023076345A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna capture
WO2023086880A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
WO2023086824A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods for identification of antigen-binding molecules
WO2023102313A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Systems and methods for identifying regions of aneuploidy in a tissue
WO2023102118A2 (en) 2021-12-01 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
WO2023114473A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 10X Genomics, Inc. Recombinant reverse transcriptase variants for improved performance
WO2023122033A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Self-test for pathology/histology slide imaging device
WO2023122746A2 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 The General Hospital Corporation Compositions and methods for end to end capture of messenger rnas
WO2023116373A1 (zh) * 2021-12-24 2023-06-29 深圳华大生命科学研究院 一种生成标记的核酸分子群的方法及其试剂盒
WO2023115536A1 (zh) * 2021-12-24 2023-06-29 深圳华大生命科学研究院 一种生成标记的核酸分子群的方法及其试剂盒
WO2023150163A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing analytes from lymphatic tissue
WO2023150098A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 10X Genomics, Inc. Methods, kits, compositions, and systems for spatial analysis
WO2023150171A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing analytes from glioblastoma samples
WO2023159028A1 (en) 2022-02-15 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Systems and methods for spatial analysis of analytes using fiducial alignment
WO2023172670A2 (en) 2022-03-11 2023-09-14 10X Genomics, Inc. Sample handling apparatus and fluid delivery methods
CN114369650B (zh) * 2022-03-21 2022-06-17 深圳市仙湖植物园(深圳市园林研究中心) 捕获探针的设计方法、捕获探针及其应用
WO2023201235A2 (en) 2022-04-12 2023-10-19 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for generating and characterizing recombinant antigen binding molecules
WO2023215612A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 10X Genomics, Inc. Analysis of antigen and antigen receptor interactions
WO2023215552A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 10X Genomics, Inc. Molecular barcode readers for analyte detection
WO2023225519A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 10X Genomics, Inc. Modified transposons, compositions and uses thereof
WO2023229988A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 10X Genomics, Inc. Tissue sample mold
WO2023229982A2 (en) 2022-05-24 2023-11-30 10X Genomics, Inc. Porous structure confinement for convection suppression
WO2023250077A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US20240060127A1 (en) 2022-06-29 2024-02-22 10X Genomics, Inc. Methods and systems for light-controlled surface patterning using photomasks
WO2024006797A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for refining feature boundaries in molecular arrays
WO2024006816A1 (en) * 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for oligonucleotide inversion on arrays
WO2024006832A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Click chemistry-based dna photo-ligation for manufacturing of high-resolution dna arrays
US20240167077A1 (en) 2022-06-29 2024-05-23 10X Genomics, Inc. Covalent attachment of splint oligonucleotides for molecular array generation using ligation
EP4370242A1 (en) 2022-06-29 2024-05-22 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for generating molecular arrays using oligonucleotide printing and photolithography
WO2024006814A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Method of generating arrays using microfluidics and photolithography
WO2024006798A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. High definition molecular array feature generation using photoresist
WO2024006830A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for patterned molecular array generation by directed bead delivery
WO2024015862A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Methods for characterization of antigen-binding molecules from biological samples
WO2024015578A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
WO2024031068A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 10X Genomics, Inc. Systems and methods for immunofluorescence quantification
WO2024036191A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 10X Genomics, Inc. Systems and methods for colocalization
WO2024035844A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 10X Genomics, Inc. Methods for reducing capture of analytes
WO2024044703A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for antigenic epitope mapping in biological samples
WO2024081212A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 10X Genomics, Inc. In vitro transcription of spatially captured nucleic acids
US20240191297A1 (en) 2022-10-14 2024-06-13 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for assessing biological sample quality
WO2024086167A2 (en) 2022-10-17 2024-04-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
WO2024102809A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of multiple analytes in a biological sample
CN117385477A (zh) * 2023-03-10 2024-01-12 深圳赛陆医疗科技有限公司 用于空间转录组学测序的芯片及其制备方法、空间转录组学测序方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2145635C1 (ru) * 1989-05-18 2000-02-20 Чирон Корпорейшн Олигомер (варианты), способ обнаружения последовательности hcv (варианты), набор для обнаружения, способ получения крови
US20020168645A1 (en) * 1998-04-16 2002-11-14 Seth Taylor Analysis of polynucleotide sequence
RU2270254C2 (ru) * 2004-04-30 2006-02-20 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа
US20060211001A1 (en) * 2005-03-18 2006-09-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Microdissection-based methods for determining genomic features of single chromosomes
WO2007030373A2 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 St. Jude Children's Research Hospital Method for in situ hybridization analysis

Family Cites Families (812)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US468319A (en) 1892-02-09 Reuben m
US4683A (en) 1846-08-08 waring and richard e
US4514388A (en) 1983-03-22 1985-04-30 Psaledakis Nicholas G Proteolytic enzymes in the zymogen form to treat sarcoma cells
US4574729A (en) 1984-08-06 1986-03-11 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Chamber block for a cytocentrifuge having centrifugal force responsive supernatant withdrawal means
US5061049A (en) 1984-08-31 1991-10-29 Texas Instruments Incorporated Spatial light modulator and method
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4883867A (en) 1985-11-01 1989-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes, RNA or DNA
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5589173A (en) 1986-11-04 1996-12-31 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US4968601A (en) 1988-02-09 1990-11-06 The United States Of America As Represented By The Dept. Of Health & Human Services Method for diagnosing latent viral infection
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US4988617A (en) 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
AU2684488A (en) 1988-06-27 1990-01-04 Carter-Wallace, Inc. Test device and method for colored particle immunoassay
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5002882A (en) 1989-04-27 1991-03-26 New England Biolabs, Inc. Method for producing the XmaI restriction endonuclease and methylase
EP0450060A1 (en) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dna sequencing
US5494810A (en) 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
US5559032A (en) 1990-06-29 1996-09-24 Pomeroy; Patrick C. Method and apparatus for post-transfer assaying of material on solid support
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
US5183053A (en) 1991-04-12 1993-02-02 Acuderm, Inc. Elliptical biopsy punch
WO1993004199A2 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Scientific Generics Limited Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids
US5474796A (en) 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US6872816B1 (en) 1996-01-24 2005-03-29 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection kits
US6759226B1 (en) 2000-05-24 2004-07-06 Third Wave Technologies, Inc. Enzymes for the detection of specific nucleic acid sequences
EP0605655B1 (en) 1991-09-16 1997-05-07 Molecular Probes, Inc. Dimers of unsymmetrical cyanine dyes
US5321130A (en) 1992-02-10 1994-06-14 Molecular Probes, Inc. Unsymmetrical cyanine dyes with a cationic side chain
US5308751A (en) 1992-03-23 1994-05-03 General Atomics Method for sequencing double-stranded DNA
US5503980A (en) 1992-11-06 1996-04-02 Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
US5472881A (en) 1992-11-12 1995-12-05 University Of Utah Research Foundation Thiol labeling of DNA for attachment to gold surfaces
US5410030A (en) 1993-04-05 1995-04-25 Molecular Probes, Inc. Dimers of unsymmetrical cyanine dyes containing pyridinium moieties
US5658751A (en) 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
US5436134A (en) 1993-04-13 1995-07-25 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US5837832A (en) 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
EP0711303B2 (en) 1993-07-30 2009-06-10 Affymax, Inc. Biotinylation of proteins
US6401267B1 (en) 1993-09-27 2002-06-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for efficient nucleic acid sequencing
US5610287A (en) 1993-12-06 1997-03-11 Molecular Tool, Inc. Method for immobilizing nucleic acid molecules
SE9400522D0 (sv) 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
US5512462A (en) 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
US5677170A (en) 1994-03-02 1997-10-14 The Johns Hopkins University In vitro transposition of artificial transposons
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
CA2185239C (en) 1994-03-16 2002-12-17 Nanibhushan Dattagupta Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
US5552278A (en) 1994-04-04 1996-09-03 Spectragen, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5641658A (en) 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
WO1996006190A2 (en) 1994-08-19 1996-02-29 Perkin-Elmer Corporation Coupled amplification and ligation method
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
KR960022566A (ko) 1994-12-30 1996-07-18 김충환 신규한 아미노올리고당 유도체 및 그의 제조방법
US5736351A (en) 1995-01-09 1998-04-07 New Horizons Diagnostics Corporation Method for detection of contaminants
US5959098A (en) * 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
US5648245A (en) 1995-05-09 1997-07-15 Carnegie Institution Of Washington Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication
US5928928A (en) 1995-06-07 1999-07-27 Universiteit Van Amsterdam Human chitinase, its recombinant production, its use for decomposing chitin, its use in therapy or prophylaxis against infection diseases
SE504798C2 (sv) 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
ATE328069T1 (de) 1995-10-13 2006-06-15 Harvard College Phosphopantethenyltransferasen und deren verwendungen
US5716825A (en) 1995-11-01 1998-02-10 Hewlett Packard Company Integrated nucleic acid analysis system for MALDI-TOF MS
US5763175A (en) * 1995-11-17 1998-06-09 Lynx Therapeutics, Inc. Simultaneous sequencing of tagged polynucleotides
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6300063B1 (en) 1995-11-29 2001-10-09 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5962271A (en) * 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US6875572B2 (en) 1996-01-24 2005-04-05 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection assays
US6913881B1 (en) 1996-01-24 2005-07-05 Third Wave Technologies, Inc. Methods and compositions for detecting target sequences
US5985557A (en) 1996-01-24 1999-11-16 Third Wave Technologies, Inc. Invasive cleavage of nucleic acids
CA2244891C (en) 1996-02-09 2008-12-30 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6852487B1 (en) 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
EP2369007B1 (en) 1996-05-29 2015-07-29 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US20050003431A1 (en) 1996-08-16 2005-01-06 Wucherpfennig Kai W. Monovalent, multivalent, and multimeric MHC binding domain fusion proteins and conjugates, and uses therefor
US5925545A (en) 1996-09-09 1999-07-20 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
US5965443A (en) 1996-09-09 1999-10-12 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
US6221654B1 (en) 1996-09-25 2001-04-24 California Institute Of Technology Method and apparatus for analysis and sorting of polynucleotides based on size
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
DE19639673A1 (de) 1996-09-27 1998-04-09 Daimler Benz Ag In einem Kraftfahrzeug im Bereich der Frontscheibe angeordnetes Display
US6083761A (en) 1996-12-02 2000-07-04 Glaxo Wellcome Inc. Method and apparatus for transferring and combining reagents
US6060240A (en) 1996-12-13 2000-05-09 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
US5837466A (en) 1996-12-16 1998-11-17 Vysis, Inc. Devices and methods for detecting nucleic acid analytes in samples
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
WO1998030575A1 (en) 1997-01-08 1998-07-16 Proligo Llc Bioconjugation of macromolecules
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
US8207093B2 (en) 1997-01-21 2012-06-26 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
EP0971946B1 (en) 1997-01-21 2006-07-05 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
US6261804B1 (en) 1997-01-21 2001-07-17 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
US5837860A (en) 1997-03-05 1998-11-17 Molecular Tool, Inc. Covalent attachment of nucleic acid molecules onto solid-phases via disulfide bonds
US6023540A (en) 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
KR20010005544A (ko) 1997-03-21 2001-01-15 그레그 펄쓰 Ｖｎｔｒ 대립 유전자의 추출 및 이용방법
JP2001517948A (ja) 1997-04-01 2001-10-09 グラクソ、グループ、リミテッド 核酸配列決定法
ES2563643T3 (es) 1997-04-01 2016-03-15 Illumina Cambridge Limited Método de secuenciación de ácido nucleico
US6143496A (en) 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US6969488B2 (en) 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US5919626A (en) 1997-06-06 1999-07-06 Orchid Bio Computer, Inc. Attachment of unmodified nucleic acids to silanized solid phase surfaces
WO1999005295A1 (en) 1997-07-25 1999-02-04 Thomas Jefferson University Composition and method for targeted integration into cells
CN1273609A (zh) 1997-08-15 2000-11-15 希斯克有限公司 检测或量化核酸物类的方法和组合物
GB9718455D0 (en) 1997-09-02 1997-11-05 Mcgregor Duncan P Chimeric binding peptide library screening method
AU737174B2 (en) * 1997-10-10 2001-08-09 President & Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US7456012B2 (en) 1997-11-06 2008-11-25 Cellectricon Ab Method and apparatus for spatially confined electroporation
US6054274A (en) 1997-11-12 2000-04-25 Hewlett-Packard Company Method of amplifying the signal of target nucleic acid sequence analyte
AU2003200718B2 (en) 1997-12-15 2006-10-19 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic biochip
US6242246B1 (en) 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip
US6844158B1 (en) 1997-12-22 2005-01-18 Hitachi Chemical Co., Ltd. Direct RT-PCR on oligonucleotide-immobilized PCR microplates
EP1865074B1 (en) 1997-12-22 2011-04-20 Hitachi Chemical Co., Ltd. Direct RT-PCR on oligonucleotide-immobilized PCR microplates
US7427678B2 (en) 1998-01-08 2008-09-23 Sigma-Aldrich Co. Method for immobilizing oligonucleotides employing the cycloaddition bioconjugation method
ATE464946T1 (de) 1998-02-23 2010-05-15 Wisconsin Alumni Res Found Verfahren und vorrichtung zur synthese von dan- sonderanordnungen
US6699710B1 (en) 1998-02-25 2004-03-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tumor tissue microarrays for rapid molecular profiling
ATE347102T1 (de) 1998-02-25 2006-12-15 Us Health Zellulare anordnungen für schnelle molekulare profilidentifizierung
DK1715340T3 (da) 1998-02-25 2009-01-26 Us Health Fremgangsmåde og apparat til forberedelse af vævspröver til parallel analyse
US6906245B1 (en) 1998-04-30 2005-06-14 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing transgenic plants resistant to weed control compounds which disrupt the porphyrin pathways of plants
US6358475B1 (en) 1998-05-27 2002-03-19 Becton, Dickinson And Company Device for preparing thin liquid for microscopic analysis
AU4333799A (en) 1998-06-04 1999-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Digital optical chemistry micromirror imager
JP2000010058A (ja) 1998-06-18 2000-01-14 Hamamatsu Photonics Kk 空間光変調装置
EP1090293B2 (en) 1998-06-24 2019-01-23 Illumina, Inc. Decoding of array sensors with microspheres
WO2000000637A2 (en) 1998-06-26 2000-01-06 Visible Genetics Inc. Method for sequencing nucleic acids with reduced errors
US20040106110A1 (en) 1998-07-30 2004-06-03 Solexa, Ltd. Preparation of polynucleotide arrays
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US20030022207A1 (en) 1998-10-16 2003-01-30 Solexa, Ltd. Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis
IL141749A0 (en) 1998-09-18 2002-03-10 Micromet Ag Dna amplification of a single cell
US6159736A (en) 1998-09-23 2000-12-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for making insertional mutations using a Tn5 synaptic complex
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6573043B1 (en) 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
US6337472B1 (en) 1998-10-19 2002-01-08 The University Of Texas System Board Of Regents Light imaging microscope having spatially resolved images
WO2000024940A1 (en) 1998-10-28 2000-05-04 Vysis, Inc. Cellular arrays and methods of detecting and using genetic disorder markers
US6391937B1 (en) 1998-11-25 2002-05-21 Motorola, Inc. Polyacrylamide hydrogels and hydrogel arrays made from polyacrylamide reactive prepolymers
US6416950B1 (en) 1998-12-02 2002-07-09 Phylos, Inc. DNA-protein fusions and uses thereof
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6232075B1 (en) 1998-12-14 2001-05-15 Li-Cor, Inc. Heterogeneous assay for pyrophosphate detection
US6830884B1 (en) 1998-12-15 2004-12-14 Molecular Staging Inc. Method of amplification
EP1144684B1 (en) 1999-01-06 2009-08-19 Callida Genomics, Inc. Enhanced sequencing by hybridization using pools of probes
GB9901475D0 (en) 1999-01-22 1999-03-17 Pyrosequencing Ab A method of DNA sequencing
US6565727B1 (en) 1999-01-25 2003-05-20 Nanolytics, Inc. Actuators for microfluidics without moving parts
DE69913092T2 (de) 1999-01-27 2004-09-09 Commissariat à l'Energie Atomique Microassay zur Serienanalyse der Genexpression und Anwendungen davon
US6157432A (en) 1999-01-29 2000-12-05 Hewlett-Packard Company Heated ferroelectric liquid crystal spatial light modulator with improved contrast, improved grayscale resolution, and decreased pixel sticking when operated in a non-DC balanced mode
US20020150909A1 (en) 1999-02-09 2002-10-17 Stuelpnagel John R. Automated information processing in randomly ordered arrays
US6294063B1 (en) 1999-02-12 2001-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for programmable fluidic processing
US6153389A (en) 1999-02-22 2000-11-28 Haarer; Brian K. DNA additives as a mechanism for unambiguously marking biological samples
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
ATE553219T1 (de) 1999-04-20 2012-04-15 Illumina Inc Erkennung von nukleinsäurereaktionen auf bead- arrays
US20050191698A1 (en) 1999-04-20 2005-09-01 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US6673620B1 (en) 1999-04-20 2004-01-06 Cytologix Corporation Fluid exchange in a chamber on a microscope slide
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
WO2000065094A2 (en) 1999-04-22 2000-11-02 The Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Assay of gene expression patterns by multi-fluor fish
US7276336B1 (en) 1999-07-22 2007-10-02 Agilent Technologies, Inc. Methods of fabricating an addressable array of biopolymer probes
US20010055764A1 (en) 1999-05-07 2001-12-27 Empedocles Stephen A. Microarray methods utilizing semiconductor nanocrystals
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
US6620584B1 (en) 1999-05-20 2003-09-16 Illumina Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US8080380B2 (en) * 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US6136592A (en) 1999-06-25 2000-10-24 Leighton; Stephen B. Multiple micro-arrays
US7501245B2 (en) 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US6465183B2 (en) 1999-07-01 2002-10-15 Agilent Technologies, Inc. Multidentate arrays
WO2001006012A1 (en) 1999-07-14 2001-01-25 Packard Bioscience Company Derivative nucleic acids and uses thereof
DE60028393T2 (de) * 1999-07-26 2007-06-14 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Schichtvorrichtung mit einfangbereichen zur zellulären analyse
JP2003505104A (ja) 1999-08-02 2003-02-12 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 変異体ｔｎ５トランスポザーゼ酵素及びその使用方法
US6403319B1 (en) 1999-08-13 2002-06-11 Yale University Analysis of sequence tags with hairpin primers
US7604996B1 (en) 1999-08-18 2009-10-20 Illumina, Inc. Compositions and methods for preparing oligonucleotide solutions
EP1212599A2 (en) 1999-08-30 2002-06-12 Illumina, Inc. Methods for improving signal detection from an array
CA2384838C (en) 1999-09-13 2006-07-18 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
ATE346156T1 (de) 1999-09-17 2006-12-15 Whitehead Biomedical Inst Umkehrtransfektionsverfahren
US6291180B1 (en) 1999-09-29 2001-09-18 American Registry Of Pathology Ultrasound-mediated high-speed biological reaction and tissue processing
US6677160B1 (en) 1999-09-29 2004-01-13 Pharmacia & Upjohn Company Methods for creating a compound library and identifying lead chemical templates and ligands for target molecules
EP1218543A2 (en) 1999-09-29 2002-07-03 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
EP1218544B1 (en) 1999-10-04 2009-06-03 The University of Medicine and Dentistry of New Jersey TAR RNA binding peptides
AU1075701A (en) 1999-10-08 2001-04-23 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for performing large numbers of reactions using array assembly
CA2386193A1 (en) 1999-10-13 2001-04-19 Signature Bioscience, Inc. System and method for detecting and identifying molecular events in a test sample
US7585632B2 (en) 1999-10-29 2009-09-08 Hologic, Inc. Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
US6569674B1 (en) 1999-12-15 2003-05-27 Amersham Biosciences Ab Method and apparatus for performing biological reactions on a substrate surface
WO2001042796A1 (en) 1999-12-13 2001-06-14 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services, The National Institutes Of Health High-throughput tissue microarray technology and applications
US6248535B1 (en) 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens
US6485926B2 (en) 1999-12-22 2002-11-26 Fuji Photo Film Co., Ltd. Method for measuring protease activity
DE60135092D1 (de) 2000-01-31 2008-09-11 Univ Texas Tragbare vorrichtung mit einer sensor-array-anordnung
GB0002389D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Solexa Ltd Molecular arrays
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7361488B2 (en) 2000-02-07 2008-04-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6812005B2 (en) 2000-02-07 2004-11-02 The Regents Of The University Of California Nucleic acid detection methods using universal priming
US8076063B2 (en) 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
EP1990428B1 (en) 2000-02-07 2010-12-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US20010026919A1 (en) 2000-02-08 2001-10-04 Alex Chenchik Nucleic acid assays employing universal arrays
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
EP1198596A1 (en) 2000-02-15 2002-04-24 Lynx Therapeutics, Inc. Data analysis and display system for ligation-based dna sequencing
US7306904B2 (en) 2000-02-18 2007-12-11 Olink Ab Methods and kits for proximity probing
JP2001284267A (ja) 2000-04-03 2001-10-12 Canon Inc 排気処理方法、プラズマ処理方法及びプラズマ処理装置
CA2403296A1 (en) 2000-04-10 2001-10-18 Benjamin F. Cravatt Proteomic analysis using activity-based probe libraries
US6368801B1 (en) 2000-04-12 2002-04-09 Molecular Staging, Inc. Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase
US7001792B2 (en) 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
US6291187B1 (en) 2000-05-12 2001-09-18 Molecular Staging, Inc. Poly-primed amplification of nucleic acid sequences
US6828098B2 (en) 2000-05-20 2004-12-07 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing a DNA library using positional amplification based on the use of adaptors and nick translation
US6511809B2 (en) 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
WO2001098765A1 (en) 2000-06-21 2001-12-27 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis
EP1305595A2 (en) 2000-06-22 2003-05-02 Clinomics Laboratories, Inc. Frozen tissue microarrays and methods for using the same
US6323009B1 (en) 2000-06-28 2001-11-27 Molecular Staging, Inc. Multiply-primed amplification of nucleic acid sequences
EP2100971A3 (en) 2000-07-07 2009-11-25 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
GB0018120D0 (en) 2000-07-24 2000-09-13 Fermentas Ab Nuclease
US8529743B2 (en) 2000-07-25 2013-09-10 The Regents Of The University Of California Electrowetting-driven micropumping
US7613571B2 (en) 2000-07-28 2009-11-03 Doyle Michael D Method and system for the multidimensional morphological reconstruction of genome expression activity
CA2419490C (en) 2000-08-15 2010-01-26 Discerna Limited Functional protein arrays
US20030191063A1 (en) 2000-08-21 2003-10-09 Wraith David Cameron Peptide selection method
US6713257B2 (en) 2000-08-25 2004-03-30 Rosetta Inpharmatics Llc Gene discovery using microarrays
US6773566B2 (en) 2000-08-31 2004-08-10 Nanolytics, Inc. Electrostatic actuators for microfluidics and methods for using same
US6942970B2 (en) 2000-09-14 2005-09-13 Zymed Laboratories, Inc. Identifying subjects suitable for topoisomerase II inhibitor treatment
US20020168639A1 (en) * 2000-09-22 2002-11-14 Muraca Patrick J. Profile array substrates
US6897023B2 (en) 2000-09-27 2005-05-24 The Molecular Sciences Institute, Inc. Method for determining relative abundance of nucleic acid sequences
AT411066B (de) 2000-10-24 2003-09-25 Steiner Georg E Verfahren und anordnung zur untersuchung von zellen
EP1348034B1 (en) 2000-11-15 2016-07-20 Minerva Biotechnologies Corporation Oligonucleotide identifiers
EP1343973B2 (en) 2000-11-16 2020-09-16 California Institute Of Technology Apparatus and methods for conducting assays and high throughput screening
WO2002044425A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
AR031640A1 (es) 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
US20030215936A1 (en) 2000-12-13 2003-11-20 Olli Kallioniemi High-throughput tissue microarray technology and applications
US20030017451A1 (en) 2000-12-21 2003-01-23 Hui Wang Methods for detecting transcripts
US7135296B2 (en) 2000-12-28 2006-11-14 Mds Inc. Elemental analysis of tagged biologically active materials
JP4061043B2 (ja) 2000-12-28 2008-03-12 株式会社ポストゲノム研究所 ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系によるペプチド等の製造方法
JP4880188B2 (ja) 2001-01-23 2012-02-22 プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ 核酸プログラム型タンパク質アレイ
US20030087232A1 (en) 2001-01-25 2003-05-08 Fred Christians Methods for screening polypeptides
ATE546545T1 (de) 2001-01-25 2012-03-15 Luminex Molecular Diagnostics Inc Polynukleotide zur verwendung als tags und tag komplemente, herstellung und verwendung derselben
KR20020063359A (ko) 2001-01-27 2002-08-03 일렉트론 바이오 (주) 핵산 및 올리거뉴클레오티드의 상보적 이중결합의 특정서열에 특이적으로 반응하는 절단기법을 이용한 핵산 혼성분석 방법 및 장치
US20070020625A1 (en) 2001-02-07 2007-01-25 Eric Duchaud Sequence of the photorhabdus luminescens strain tt01 genome and uses
US6573051B2 (en) 2001-03-09 2003-06-03 Molecular Staging, Inc. Open circle probes with intramolecular stem structures
EP1368497A4 (en) 2001-03-12 2007-08-15 California Inst Of Techn METHOD AND DEVICE FOR ANALYZING POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES BY ASYNCHRONOUS BASE EXTENSION
AU785425B2 (en) 2001-03-30 2007-05-17 Genetic Technologies Limited Methods of genomic analysis
CA2445881C (en) 2001-04-30 2010-06-22 Ventana Medical Systems, Inc. Reagents and methods for automated hybridization
AU2002322457A1 (en) * 2001-06-28 2003-03-03 Illumina, Inc. Multiplex decoding of array sensors with microspheres
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
AU2002319613A1 (en) 2001-07-19 2003-03-03 Signet Laboratories, Inc. Human tissue specific drug screening procedure
US20040091857A1 (en) 2001-07-20 2004-05-13 Nallur Girish N. Gene expression profiling
GB0118031D0 (en) 2001-07-24 2001-09-19 Oxford Glycosciences Uk Ltd Self assembled protein nucleic acid complexes and self assembled protein arrays
US7297778B2 (en) 2001-07-25 2007-11-20 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
DE60210014T2 (de) 2001-07-31 2006-09-21 Pfizer Products Inc., Groton Auf Zellen gegründetes Phosphodiesterase-10A-Assay und Sequenzen
US6696271B2 (en) 2001-08-23 2004-02-24 The Regents Of The University Of California Frozen tissue microarray technology for analysis of RNA, DNA, and proteins
JP4768224B2 (ja) 2001-09-10 2011-09-07 メソ スケイル テクノロジーズ，エルエルシー １つの試料について複数の測定を実施する方法及び装置
US20060188875A1 (en) 2001-09-18 2006-08-24 Perlegen Sciences, Inc. Human genomic polymorphisms
US20040019005A1 (en) 2001-10-01 2004-01-29 Jeffrey Van Ness Methods for parallel measurement of genetic variations
US7195913B2 (en) 2001-10-05 2007-03-27 Surmodics, Inc. Randomly ordered arrays and methods of making and using
WO2003031591A2 (en) 2001-10-10 2003-04-17 Superarray Bioscience Corporation Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
US6942972B2 (en) 2001-10-24 2005-09-13 Beckman Coulter, Inc. Efficient synthesis of protein-oligonucleotide conjugates
US20030175947A1 (en) 2001-11-05 2003-09-18 Liu Robin Hui Enhanced mixing in microfluidic devices
US20030124595A1 (en) 2001-11-06 2003-07-03 Lizardi Paul M. Sensitive coded detection systems
AU2002359436A1 (en) 2001-11-13 2003-06-23 Rubicon Genomics Inc. Dna amplification and sequencing using dna molecules generated by random fragmentation
GB0127564D0 (en) 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
JP2005510347A (ja) 2001-11-26 2005-04-21 ケック グラデュエイト インスティテュート 化学、生化学、および生物学的アッセイ等のためにエレクトロウェッティングを介してマイクロ流体制御する方法、装置、および物
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
US7098041B2 (en) 2001-12-11 2006-08-29 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Methods to view and analyze the results from diffraction-based diagnostics
AU2003232881A1 (en) 2002-01-16 2003-09-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Method and apparatus for image-guided therapy
US7731909B1 (en) 2002-01-22 2010-06-08 Grace Bio-Labs, Inc. Reaction surface array diagnostic apparatus
AU2003215240A1 (en) * 2002-02-14 2003-09-04 Illumina, Inc. Automated information processing in randomly ordered arrays
US20040002090A1 (en) 2002-03-05 2004-01-01 Pascal Mayer Methods for detecting genome-wide sequence variations associated with a phenotype
US20030170637A1 (en) 2002-03-06 2003-09-11 Pirrung Michael C. Method of analyzing mRNA splice variants
US7166441B2 (en) 2002-03-12 2007-01-23 Perseptive Biosystems Inc. Method and apparatus for the identification and quantification of biomolecules
US7223371B2 (en) 2002-03-14 2007-05-29 Micronics, Inc. Microfluidic channel network device
JP2005538695A (ja) 2002-04-15 2005-12-22 ザ リージェント オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 概日リズム障害を治療するためのスクリーニング法および治療法
AU2003225085A1 (en) 2002-04-19 2003-11-03 California Institute Of Technology Unnatural amino acid containing display libraries
DK2151250T3 (da) 2002-05-06 2013-12-16 Endocyte Inc Vitamin-targetede billeddannelsesmidler
JP2005537030A (ja) 2002-05-09 2005-12-08 ユー．エス． ジェノミクス， インコーポレイテッド 核酸を分析する方法
ES2346646T5 (es) 2002-05-30 2018-02-15 The Scripps Research Institute Ligación catalizada con cobre de azidas y acetilenos
EP1520045A1 (en) 2002-06-03 2005-04-06 PamGene B.V. Novel high density arrays and methods for analyte analysis
US7108976B2 (en) 2002-06-17 2006-09-19 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA by locus specific amplification
JP2005530151A (ja) 2002-06-18 2005-10-06 インヴィトロジェン コーポレーション プレキャスト水和可能分離媒体の低抵抗電気泳動のための方法および装置
FR2841063B1 (fr) 2002-06-18 2004-09-17 Commissariat Energie Atomique Dispositif de deplacement de petits volumes de liquide le long d'un micro-catenaire par des forces electrostatiques
US7223592B2 (en) 2002-06-21 2007-05-29 Agilent Technologies, Inc. Devices and methods for performing array based assays
US20050019776A1 (en) 2002-06-28 2005-01-27 Callow Matthew James Universal selective genome amplification and universal genotyping system
US20050118616A1 (en) 2002-08-16 2005-06-02 Kawashima Tadashi R. Amplification of target nucleotide sequence without polymerase chain reaction
US7205128B2 (en) 2002-08-16 2007-04-17 Agilent Technologies, Inc. Method for synthesis of the second strand of cDNA
JP2006509040A (ja) 2002-08-23 2006-03-16 ソレックサ リミテッド 修飾されたヌクレオチド
US20040038385A1 (en) 2002-08-26 2004-02-26 Langlois Richard G. System for autonomous monitoring of bioagents
US20070166725A1 (en) 2006-01-18 2007-07-19 The Regents Of The University Of California Multiplexed diagnostic platform for point-of care pathogen detection
US6905585B2 (en) 2002-09-11 2005-06-14 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Automated system for high-throughput electrophoretic separations
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
US7282328B2 (en) 2002-09-20 2007-10-16 New England Biolabs, Inc. Helicase dependent amplification of nucleic acids
US7662594B2 (en) 2002-09-20 2010-02-16 New England Biolabs, Inc. Helicase-dependent amplification of RNA
US6911132B2 (en) 2002-09-24 2005-06-28 Duke University Apparatus for manipulating droplets by electrowetting-based techniques
US8349276B2 (en) 2002-09-24 2013-01-08 Duke University Apparatuses and methods for manipulating droplets on a printed circuit board
EP2298448A3 (en) 2002-09-25 2012-05-30 California Institute of Technology Microfluidic large scale integration
EP1578432A4 (en) 2002-10-03 2008-07-30 Epimmune Inc HLA BINDING PEPTIDES AND USES THEREOF
US20040259105A1 (en) 2002-10-03 2004-12-23 Jian-Bing Fan Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples
US20040067492A1 (en) 2002-10-04 2004-04-08 Allan Peng Reverse transcription on microarrays
EP2237013B1 (en) 2002-10-31 2012-06-06 University of Massachusetts Rapid cell block embedding method and apparatus
US7122384B2 (en) 2002-11-06 2006-10-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Resonant light scattering microparticle methods
AU2003297996A1 (en) 2002-12-12 2004-07-09 Chiron Corporation Identification of oligonucleotides for the capture, detection and quantitation of west nile virus
WO2004059283A2 (en) 2002-12-18 2004-07-15 West Virginia University Research Corporation Apparatus and method for edman degradation using a microfluidic system
KR20040062847A (ko) 2003-01-03 2004-07-09 삼성전자주식회사 핵산 어레이의 복제방법
US7547380B2 (en) 2003-01-13 2009-06-16 North Carolina State University Droplet transportation devices and methods having a fluid surface
EP2159285B1 (en) 2003-01-29 2012-09-26 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
GB0302058D0 (en) 2003-01-29 2003-02-26 Univ Cranfield Replication of nucleic acid arrays
JP4691014B2 (ja) 2003-02-26 2011-06-01 カリダ ゲノミクス，インコーポレーテッド ハイブリダイゼーションによるランダムアレイｄｎａ分析
JP4773338B2 (ja) 2003-03-07 2011-09-14 ルビコン ゲノミクス， インコーポレイテッド Ｄｎａ重合プロセスにより生成される全ゲノムおよび全トランスクリプトームライブラリーの増幅および分析
CA2518569C (en) 2003-03-10 2011-11-15 Expression Pathology, Inc. Liquid tissue preparation from histopathologically processed biological samples, tissues and cells
FR2852317B1 (fr) 2003-03-13 2006-08-04 Biopuces a sondes et leurs methodes d'utilisation
CN1300333C (zh) 2003-04-17 2007-02-14 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 炭疽菌诊断基因芯片的制备及应用
WO2004093645A2 (en) 2003-04-17 2004-11-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Tn5 transposase mutants and the use thereof
US7267994B2 (en) 2003-04-28 2007-09-11 Regents Of The University Of California Element-coded affinity tags
US20040219588A1 (en) 2003-04-30 2004-11-04 Masaru Furuta Method for dispensing reagents onto biological samples and method for analyzing biological samples
KR20060015612A (ko) 2003-05-23 2006-02-17 으뻬에프엘-에꼴 뽈리떼끄니끄 페데랄르 드 로잔느 아실 캐리어 단백질을 기본으로 한 단백질 라벨링 방법
US20050026188A1 (en) 2003-05-30 2005-02-03 Van Kessel Andrew G. Methods of identifying, characterizing and comparing organism communities
JP2007502435A (ja) 2003-05-30 2007-02-08 アプレラ コーポレイション ハイブリダイゼーションおよびｓｐｒ検出のための装置および方法
US7255994B2 (en) 2003-06-10 2007-08-14 Applera Corporation Ligation assay
US20060216775A1 (en) 2003-06-17 2006-09-28 The Regents Of The University Of Califoenia Compositions and methods for analysis and manipulation of enzymes in biosynthetic proteomes
EP1636337A4 (en) 2003-06-20 2007-07-04 Illumina Inc METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR THE AMPLIFICATION AND GENOTYPING OF THE GENOME
US20070128656A1 (en) 2003-06-26 2007-06-07 University Of South Florida Direct Fluorescent Label Incorporation Via 1st Strand cDNA Synthesis
US7627171B2 (en) 2003-07-03 2009-12-01 Videoiq, Inc. Methods and systems for detecting objects of interest in spatio-temporal signals
NZ545000A (en) 2003-07-03 2008-08-29 Univ California Genome mapping of functional DNA elements and cellular proteins
EP1641809B2 (en) 2003-07-05 2018-10-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
US20050079520A1 (en) 2003-07-21 2005-04-14 Jie Wu Multiplexed analyte detection
US20050031176A1 (en) 2003-08-08 2005-02-10 Hertel Sarah R. Method and apparatus of multi-modality image fusion
AU2004265635A1 (en) 2003-08-08 2005-02-24 Thomas Jefferson University Method for rapid identification of alternative splicing
US20050037362A1 (en) 2003-08-11 2005-02-17 Eppendorf Array Technologies, S.A. Detection and quantification of siRNA on microarrays
DK1664345T3 (da) 2003-09-02 2015-06-22 Keygene Nv OLA-baserede fremgangsmåder til detektion af target-nukleinsyresekvenser
US20050095627A1 (en) 2003-09-03 2005-05-05 The Salk Institute For Biological Studies Multiple antigen detection assays and reagents
ATE461292T1 (de) 2003-09-10 2010-04-15 Althea Technologies Inc Erstellung von expressionsprofilen unter verwendung von mikroarrays
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
WO2005026329A2 (en) 2003-09-12 2005-03-24 Cornell Research Foundation, Inc. Methods for identifying target nucleic acid molecules
EP1670939B1 (en) 2003-09-18 2009-11-04 Nuevolution A/S A method for obtaining structural information concerning an encoded molecule and method for selecting compounds
US20050226780A1 (en) 2003-09-19 2005-10-13 Donald Sandell Manual seal applicator
US7541166B2 (en) 2003-09-19 2009-06-02 Microfluidic Systems, Inc. Sonication to selectively lyse different cell types
US20050064435A1 (en) * 2003-09-24 2005-03-24 Xing Su Programmable molecular barcodes
CA2541536A1 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Protein Discovery, Inc. Methods and devices for concentration and purification of analytes for chemical analysis including matrix-assisted laser desorption/ionization (maldi) mass spectrometry (ms)
JP4773360B2 (ja) 2003-11-17 2011-09-14 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ 流体を操作するためのシステム
CN1882689A (zh) 2003-11-21 2006-12-20 艾尼纳制药公司 产生嗅觉gpcr的方法
WO2005059509A2 (en) 2003-12-12 2005-06-30 Saint Louis University Biosensors for detecting macromolecules and other analytes
US7259258B2 (en) 2003-12-17 2007-08-21 Illumina, Inc. Methods of attaching biological compounds to solid supports using triazine
US20050136414A1 (en) 2003-12-23 2005-06-23 Kevin Gunderson Methods and compositions for making locus-specific arrays
US20050147976A1 (en) 2003-12-29 2005-07-07 Xing Su Methods for determining nucleotide sequence information
US20070014810A1 (en) 2003-12-31 2007-01-18 Denise Baker Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
EP3673986A1 (en) 2004-01-07 2020-07-01 Illumina Cambridge Limited Improvements in or relating to molecular arrays
WO2005067648A2 (en) 2004-01-08 2005-07-28 Vanderbilt University Multiplex spatial profiling of gene expression
US7569392B2 (en) 2004-01-08 2009-08-04 Vanderbilt University Multiplex spatial profiling of gene expression
CA2552858A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Lingvitae As Improving polynucleotide ligation reactions
FR2866493B1 (fr) 2004-02-16 2010-08-20 Commissariat Energie Atomique Dispositif de controle du deplacement d'une goutte entre deux ou plusieurs substrats solides
WO2005089508A2 (en) 2004-03-18 2005-09-29 Atom Sciences, Inc. Dna sequence detection by limited primer extension
FR2868638B1 (fr) 2004-03-30 2006-05-19 Sagem Procede d'echange d'informations entre deux reseaux fonctionnant sous des protocoles de routages differents
KR100624420B1 (ko) 2004-04-10 2006-09-19 삼성전자주식회사 마이크로어레이에 대한 정보가 스팟의 형태로 저장되어있는 마이크로어레이, 그를 제조하는 방법 및 그를이용하는 방법
CA2563168A1 (en) 2004-04-14 2005-11-17 President And Fellows Of Harvard College Nucleic-acid programmable protein arrays
JP4592060B2 (ja) 2004-04-26 2010-12-01 キヤノン株式会社 Ｐｃｒ増幅反応装置、ならびに、該装置を利用するｐｃｒ増幅反応方法
DE102004022263A1 (de) 2004-05-06 2005-12-15 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
US7618780B2 (en) 2004-05-20 2009-11-17 Trillion Genomics Limited Use of mass labelled probes to detect target nucleic acids using mass spectrometry
JP4751650B2 (ja) 2004-06-11 2011-08-17 株式会社リコー 微小光学素子、この微小光学素子を用いた空間光変調装置及びプロジェクタ装置
US7906276B2 (en) 2004-06-30 2011-03-15 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Enzymatic detection techniques
FR2872715B1 (fr) 2004-07-08 2006-11-17 Commissariat Energie Atomique Microreacteur goutte
FR2872809B1 (fr) 2004-07-09 2006-09-15 Commissariat Energie Atomique Methode d'adressage d'electrodes
US7608434B2 (en) 2004-08-04 2009-10-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Mutated Tn5 transposase proteins and the use thereof
WO2006073504A2 (en) 2004-08-04 2006-07-13 President And Fellows Of Harvard College Wobble sequencing
JP2006058031A (ja) 2004-08-17 2006-03-02 Hitachi High-Technologies Corp 化学分析装置
US7776547B2 (en) 2004-08-26 2010-08-17 Intel Corporation Cellular analysis using Raman surface scanning
US20060228758A1 (en) 2004-09-13 2006-10-12 Xencor, Inc. Analysis of MHC-peptide binding interactions
US20060073506A1 (en) * 2004-09-17 2006-04-06 Affymetrix, Inc. Methods for identifying biological samples
CN100396790C (zh) 2004-09-17 2008-06-25 北京大学 溶液识别、表面寻址蛋白质芯片及其制备和检测方法
US7315019B2 (en) 2004-09-17 2008-01-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of optical confinements and uses thereof
US7524672B2 (en) 2004-09-22 2009-04-28 Sandia Corporation Microfluidic microarray systems and methods thereof
US7527970B2 (en) 2004-10-15 2009-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of identifying active chromatin domains
EP1816192B1 (en) 2004-10-15 2012-12-12 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology LINKER FOR CONSTRUCTING mRNA-PUROMYCIN-PROTEIN CONJUGATE
US8173611B2 (en) 2004-11-12 2012-05-08 Asuragen Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US7183119B2 (en) 2004-11-15 2007-02-27 Eastman Kodak Company Method for sensitive detection of multiple biological analytes
US7745143B2 (en) 2004-11-19 2010-06-29 Plexera, Llc Plasmon resonance biosensor and method
WO2006053571A2 (en) 2004-11-22 2006-05-26 Peter Birk Rasmussen Template directed split and mix systhesis of small molecule libraries
ITPD20040301A1 (it) 2004-11-26 2005-02-26 Dimensional Srl P Metodo ed apparato per la separazione simultanea di molecole biologiche mediante elettroforesi bidimensionale
GB0427236D0 (en) 2004-12-13 2005-01-12 Solexa Ltd Improved method of nucleotide detection
WO2006064199A1 (en) 2004-12-13 2006-06-22 Solexa Limited Improved method of nucleotide detection
US20060292586A1 (en) 2004-12-17 2006-12-28 Schroth Gary P ID-tag complexes, arrays, and methods of use thereof
EP1879906A4 (en) 2005-01-05 2009-07-22 Advanced Genetic Analysis Corp REVERSIBLE NUCLEOTIDE TERMINATORS AND USES THEREOF
KR100682920B1 (ko) 2005-01-20 2007-02-15 삼성전자주식회사 다중 바이오어세이용 미세유체 칩 및 그 제조방법
US7579153B2 (en) 2005-01-25 2009-08-25 Population Genetics Technologies, Ltd. Isothermal DNA amplification
US7458661B2 (en) 2005-01-25 2008-12-02 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for promoting the complete transfer of liquid drops from a nozzle
EP3444751A3 (en) 2005-01-27 2019-02-27 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Classifying image features
CA2596496A1 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Agencourt Bioscience Corp. Reagents, methods, and libraries for bead-based sequencing
AU2006210551A1 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Perkinelmer Las, Inc. Ultra-sensitive detection systems using multidimension signals
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US20060199207A1 (en) 2005-02-24 2006-09-07 Matysiak Stefan M Self-assembly of molecules using combinatorial hybridization
GB0504774D0 (en) 2005-03-08 2005-04-13 Lingvitae As Method
US7727721B2 (en) 2005-03-08 2010-06-01 California Institute Of Technology Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging
US7601498B2 (en) 2005-03-17 2009-10-13 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection and associated technology
US7776567B2 (en) 2005-03-17 2010-08-17 Biotium, Inc. Dimeric and trimeric nucleic acid dyes, and associated systems and methods
US7229769B2 (en) 2005-03-25 2007-06-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting protease activity
PL1712639T3 (pl) 2005-04-06 2009-02-27 Maurice Stroun Sposób diagnozowania nowotworu przez wykrywanie krążącego DNA i RNA
GB0508983D0 (en) 2005-05-03 2005-06-08 Oxford Gene Tech Ip Ltd Cell analyser
US8623628B2 (en) 2005-05-10 2014-01-07 Illumina, Inc. Polymerases
WO2006124644A2 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protein and antibody profiling using small molecule microarrays
CA2607221A1 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Panomics, Inc. Multiplex branched-chain dna assays
GB0509833D0 (en) 2005-05-16 2005-06-22 Isis Innovation Cell analysis
US8337851B2 (en) 2005-05-18 2012-12-25 Novartis Ag Methods of monitoring the efficacy of anti-CD40 antibodies in treating a subject for a CD40-expressing cancer
US20060263789A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
CN100526453C (zh) 2005-05-20 2009-08-12 麦克奥迪实业集团有限公司 激光显微切割后细胞收集方法
WO2006128010A2 (en) 2005-05-26 2006-11-30 The Trustees Of Boston University Quantification of nucleic acids and proteins using oligonucleotide mass tags
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
WO2007145612A1 (en) 2005-06-06 2007-12-21 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
EP1891426B1 (en) 2005-06-07 2011-10-12 Centre National De La Recherche Scientifique -Cnrs- Use of ionic matrices for maldi mass spectrometry analysis of tissue sections
GB0511717D0 (en) 2005-06-09 2005-07-13 Babraham Inst Repeatable protein arrays
EP3492602A1 (en) 2005-06-15 2019-06-05 Complete Genomics, Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
US20090264299A1 (en) 2006-02-24 2009-10-22 Complete Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on DNA arrays
US20070087360A1 (en) 2005-06-20 2007-04-19 Boyd Victoria L Methods and compositions for detecting nucleotides
ES2434915T3 (es) 2005-06-20 2013-12-18 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Detección múltiplex de ácidos nucleicos
US7873193B2 (en) 2005-06-21 2011-01-18 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Serial section analysis for computer-controlled microscopic imaging
ATE557105T1 (de) 2005-06-23 2012-05-15 Keygene Nv Strategien für eine hohe durchsatzidentifikation und erkennung von polymorphismen
WO2007005649A2 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Applera Corporation Proximity probing of target proteins comprising restriction and/or extension field
US7883848B2 (en) 2005-07-08 2011-02-08 Olink Ab Regulation analysis by cis reactivity, RACR
JP4822753B2 (ja) 2005-07-11 2011-11-24 一般社団法人オンチップ・セロミクス・コンソーシアム 細胞構成物質分取チップならびに細胞構成物質解析システム及びこれらを用いる細胞構成物質解析法
GB0514936D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Preparation of templates for nucleic acid sequencing
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
US20070023292A1 (en) 2005-07-26 2007-02-01 The Regents Of The University Of California Small object moving on printed circuit board
US7805081B2 (en) 2005-08-11 2010-09-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for monitoring multiple optical signals from a single source
WO2007027653A1 (en) 2005-09-01 2007-03-08 Promega Corporation Cell-based luminogenic and nonluminogenic proteasome assays
JP2007074967A (ja) 2005-09-13 2007-03-29 Canon Inc 識別子プローブ及びそれを用いた核酸増幅方法
US7741106B2 (en) 2005-09-21 2010-06-22 Moyle William R Sensors for biomolecular detection and cell classification
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
DK1929039T4 (en) 2005-09-29 2014-02-17 Keygene Nv High throughput-screening af mutageniserede populationer
WO2007041689A2 (en) 2005-10-04 2007-04-12 President And Fellows Of Harvard College Methods of site-specific labeling of molecules and molecules produced thereby
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
US20070116612A1 (en) 2005-11-02 2007-05-24 Biopath Automation, L.L.C. Prefix tissue cassette
EP1951905B1 (en) 2005-11-10 2012-04-11 Affymetrix, Inc. Detection of nucleic acids through amplification of surrogate nucleic acids
WO2007120208A2 (en) 2005-11-14 2007-10-25 President And Fellows Of Harvard College Nanogrid rolling circle dna sequencing
EP1969137B1 (en) 2005-11-22 2011-10-05 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Multiplex nucleic acid detection
CN101313218A (zh) 2005-11-25 2008-11-26 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于酶活性确定的磁性生物传感器
US8092784B2 (en) 2005-11-30 2012-01-10 Biotium, Inc. Enzyme substrate comprising a functional dye and associated technology and methods
US20070161029A1 (en) 2005-12-05 2007-07-12 Panomics, Inc. High throughput profiling of methylation status of promoter regions of genes
US7803751B2 (en) 2005-12-09 2010-09-28 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting phosphomonoester
DE102005060738A1 (de) 2005-12-16 2007-06-21 Qiagen Gmbh Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen aus fixierten Geweben
US20070178503A1 (en) 2005-12-19 2007-08-02 Feng Jiang In-situ genomic DNA chip for detection of cancer
US20070141718A1 (en) 2005-12-19 2007-06-21 Bui Huy A Reduction of scan time in imaging mass spectrometry
CA3006231C (en) 2005-12-21 2022-04-12 Meso Scale Technologies, Llc Assay modules having assay reagents and methods of making and using same
EP1966394B1 (en) 2005-12-22 2012-07-25 Keygene N.V. Improved strategies for transcript profiling using high throughput sequencing technologies
ES2882401T3 (es) 2005-12-22 2021-12-01 Keygene Nv Método de detección de polimorfismos basado en AFLP de alto rendimiento
EP1963531B1 (en) 2005-12-23 2011-09-21 Nanostring Technologies, Inc. Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof
US8986926B2 (en) 2005-12-23 2015-03-24 Nanostring Technologies, Inc. Compositions comprising oriented, immobilized macromolecules and methods for their preparation
CN101346971B (zh) 2005-12-23 2011-05-18 艾利森电话股份有限公司 用于解决数据分组业务拥塞的方法和设备
DE602007009634D1 (de) 2006-01-04 2010-11-18 Si Lok Verfahren zur zuordnung von nukleinsäuren und zur identifikation fein strukturierter variationen in nukleinsäuren sowie hilfsmittel dafür
US7537897B2 (en) 2006-01-23 2009-05-26 Population Genetics Technologies, Ltd. Molecular counting
WO2007087310A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
US20070251824A1 (en) 2006-01-24 2007-11-01 Perkinelmer Las, Inc. Multiplexed analyte quantitation by two-dimensional planar electrochromatography
WO2007092538A2 (en) 2006-02-07 2007-08-16 President And Fellows Of Harvard College Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis
CA2643700A1 (en) 2006-02-24 2007-11-22 Callida Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on dna arrays
JP5237126B2 (ja) 2006-03-01 2013-07-17 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ ライゲーションアッセイを用いてハイスループットシークエンスに基づき遺伝子関連配列を検出する方法
WO2007107710A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Solexa Limited Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays
JP2007248396A (ja) 2006-03-17 2007-09-27 Toshiba Corp 核酸検出用デバイスおよび核酸検出装置
GB0605584D0 (en) 2006-03-20 2006-04-26 Olink Ab Method for analyte detection using proximity probes
WO2007111937A1 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Applera Corporation Directed enrichment of genomic dna for high-throughput sequencing
US8975216B2 (en) 2006-03-30 2015-03-10 Pacific Biosciences Of California Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same
CN101460953B (zh) 2006-03-31 2012-05-30 索雷克萨公司 用于合成分析的序列的系统和装置
US20090253581A1 (en) 2006-04-04 2009-10-08 Keygene N.V. High Throughput Detection of Molecular Markers Based on AFLP and High Throughput Sequencing
WO2007120241A2 (en) 2006-04-18 2007-10-25 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based biochemistry
US7439014B2 (en) 2006-04-18 2008-10-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based surface modification and washing
US8383338B2 (en) 2006-04-24 2013-02-26 Roche Nimblegen, Inc. Methods and systems for uniform enrichment of genomic regions
US20070254305A1 (en) 2006-04-28 2007-11-01 Nsabp Foundation, Inc. Methods of whole genome or microarray expression profiling using nucleic acids prepared from formalin fixed paraffin embedded tissue
WO2007133703A2 (en) 2006-05-10 2007-11-22 Dxterity Diagnostics Detection of nucleic acid targets using chemically reactive oligonucleotide probes
JP2007304043A (ja) 2006-05-15 2007-11-22 Canon Inc プローブ固定担体の製造方法
ES2620398T3 (es) 2006-05-22 2017-06-28 Nanostring Technologies, Inc. Sistemas y métodos para analizar nanoindicadores
US20080132429A1 (en) 2006-05-23 2008-06-05 Uchicago Argonne Biological microarrays with enhanced signal yield
EP3260863B1 (en) 2006-05-27 2021-03-10 Fluidigm Canada Inc. Method for performing multiplex analysis of two or more analytes
EP2032686B1 (en) 2006-06-23 2022-01-12 Illumina, Inc. System and method for creation of dna cluster arrays
WO2008066965A2 (en) 2006-06-23 2008-06-05 The Regents Of The University Of California Articles comprising large-surface-area bio-compatible materials and methods for making and using them
US8178316B2 (en) 2006-06-29 2012-05-15 President And Fellows Of Harvard College Evaluating proteins
US20090253582A1 (en) 2006-06-29 2009-10-08 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Chamber apparatus
US7312029B1 (en) 2006-06-30 2007-12-25 Searete Llc Method of combing an elongated molecule
US8362242B2 (en) 2006-06-30 2013-01-29 Dh Technologies Development Pte. Ltd. Analyte determination utilizing mass tagging reagents comprising a non-encoded detectable label
AT503862B1 (de) 2006-07-05 2010-11-15 Arc Austrian Res Centers Gmbh Pathogen-identifizierung anhand eines 16s oder 18s-rrna mikroarray
CN101490562B (zh) 2006-07-10 2012-12-19 株式会社日立高新技术 液体输送设备
WO2008097257A2 (en) 2006-07-10 2008-08-14 California Institute Of Technology Method for selectively anchoring large numbers of nanoscale structures
EP1878502A1 (en) 2006-07-14 2008-01-16 Roche Diagnostics GmbH Instrument for heating and cooling
CN101522915A (zh) 2006-08-02 2009-09-02 加州理工学院 用于检测和/或分选靶标的方法和系统
WO2008021123A1 (en) 2006-08-07 2008-02-21 President And Fellows Of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
WO2008022332A2 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Board Of Regents, The University Of Texas System System, method and kit for replicating a dna array
US20080047835A1 (en) 2006-08-22 2008-02-28 Macconnell William P Genomic DNA Purifier
WO2008028160A2 (en) 2006-09-01 2008-03-06 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates, systems and methods for analyzing materials
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
US8568979B2 (en) 2006-10-10 2013-10-29 Illumina, Inc. Compositions and methods for representational selection of nucleic acids from complex mixtures using hybridization
AU2007309504B2 (en) 2006-10-23 2012-09-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
US9266076B2 (en) 2006-11-02 2016-02-23 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for real-time feedback control of electrical manipulation of droplets on chip
US20080108804A1 (en) 2006-11-02 2008-05-08 Kabushiki Kaisha Dnaform Method for modifying RNAS and preparing DNAS from RNAS
WO2008069906A2 (en) 2006-11-14 2008-06-12 The Regents Of The University Of California Digital expression of gene analysis
US9201063B2 (en) 2006-11-16 2015-12-01 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US7655898B2 (en) 2006-11-30 2010-02-02 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Optical filter assembly with selectable bandwidth and rejection
EP2857526B1 (en) 2006-12-13 2016-08-17 Luminex Corporation Systems and methods for multiplex analysis of PCR in real time
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
EP2092322B1 (en) 2006-12-14 2016-02-17 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
CN101221182A (zh) * 2007-01-08 2008-07-16 山东司马特生物芯片有限公司 一种荧光蛋白质芯片血清肿瘤系列诊断新方法
EP2121983A2 (en) 2007-02-02 2009-11-25 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
WO2008098100A2 (en) 2007-02-07 2008-08-14 Perscitus Biosciences, Llc Detection of molecule proximity
US9080256B2 (en) 2007-02-12 2015-07-14 Proteonova, Inc. Generation of library of soluble random polypeptides linked to mRNA
KR100819006B1 (ko) 2007-02-13 2008-04-03 삼성전자주식회사 마이크로 어레이용 마스크 세트, 이의 제조 방법, 및마스크 세트를 이용한 마이크로 어레이의 제조 방법
US7919631B2 (en) 2007-02-14 2011-04-05 Eastman Chemical Company Production of ionic liquids
KR101017808B1 (ko) 2007-04-04 2011-02-28 엔에이치엔(주) 편집 파일 자동 생성 방법 및 그 장치
AU2008237018B2 (en) 2007-04-10 2014-04-03 Nanostring Technologies, Inc. Methods and computer systems for identifying target-specific sequences for use in nanoreporters
CA2684217C (en) 2007-04-13 2016-12-13 Sequenom, Inc. Comparative sequence analysis processes and systems
AU2008256851A1 (en) 2007-05-23 2008-12-04 Oregon Health & Science University Microarray systems and methods for identifying DNA-binding proteins
CN101720359A (zh) 2007-06-01 2010-06-02 454生命科学公司 从多重混合物中识别个别样本的系统和方法
WO2008151127A1 (en) 2007-06-04 2008-12-11 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for chemical ligation
EP2425894B1 (en) 2007-06-21 2016-12-28 Gen-Probe Incorporated Instruments and method for exposing a receptacle to multiple thermal zones
CN101679932A (zh) 2007-06-27 2010-03-24 数字化生物系统 用于热交换化学过程的基于数字微流体的装置
WO2009031054A2 (en) 2007-06-29 2009-03-12 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
US7534991B2 (en) 2007-07-10 2009-05-19 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Athermalized birefringent filter apparatus and method
US20100112590A1 (en) 2007-07-23 2010-05-06 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing Fetal Chromosomal Aneuploidy Using Genomic Sequencing With Enrichment
JP2010534836A (ja) 2007-07-27 2010-11-11 アンサンブル ディスカバリー コーポレイション 検出アッセイとそれらの使用
JP2009036694A (ja) 2007-08-03 2009-02-19 Tokyo Medical & Dental Univ 空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法
US20090093378A1 (en) 2007-08-29 2009-04-09 Helen Bignell Method for sequencing a polynucleotide template
ITBO20070627A1 (it) 2007-09-14 2009-03-15 Twof Inc Metodo per la preparazione di dna microarray con sonde ad alta densita' lineare
US9388457B2 (en) * 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
EP2201143B2 (en) 2007-09-21 2016-08-24 Katholieke Universiteit Leuven Tools and methods for genetic tests using next generation sequencing
US8330087B2 (en) 2007-10-16 2012-12-11 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Spectral imaging system with dynamic optical correction
EP2053132A1 (en) 2007-10-23 2009-04-29 Roche Diagnostics GmbH Enrichment and sequence analysis of geomic regions
US8518640B2 (en) 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
US20090181375A1 (en) * 2008-01-11 2009-07-16 Peter Brian J Method for detection of nucleic acid barcodes
EP3360972B1 (en) 2008-01-17 2019-12-11 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes
KR20090081260A (ko) * 2008-01-23 2009-07-28 삼성전자주식회사 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법
JP5395098B2 (ja) 2008-02-15 2014-01-22 バイオ−ラッド ラボラトリーズ，インコーポレイティド 自動調整する蓋を有するサーマルサイクラー
DE102008014687A1 (de) 2008-03-18 2009-09-24 Smartrac Ip B.V. Lagenverbund für einen Kartenkörper und Verfahren zur Herstellung des Lagenverbunds
GB2470672B (en) * 2008-03-21 2012-09-12 Nugen Technologies Inc Methods of RNA amplification in the presence of DNA
US20090253163A1 (en) 2008-04-02 2009-10-08 General Electric Company Iterative staining of biological samples
DE102008023438B4 (de) 2008-05-14 2011-06-30 Bruker Daltonik GmbH, 28359 Verfahren zur Analyse von Gewebeschnitten
US8093064B2 (en) 2008-05-15 2012-01-10 The Regents Of The University Of California Method for using magnetic particles in droplet microfluidics
DE102008025656B4 (de) 2008-05-28 2016-07-28 Genxpro Gmbh Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
WO2009148560A2 (en) 2008-05-30 2009-12-10 Board Of Regents, The Universtiy Of Texas System Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US8199999B2 (en) 2008-06-17 2012-06-12 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Image classifier training
GB0811574D0 (en) 2008-06-24 2008-07-30 Trillion Genomics Ltd Characterising planar samples by mass spectrometry
EP2291533B2 (en) 2008-07-02 2020-09-30 Illumina Cambridge Limited Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
US20100035249A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
CA2733609C (en) 2008-08-14 2018-03-06 Nanostring Technologies, Inc. Stable nanoreporters
CA2734868C (en) 2008-08-26 2019-09-10 Fluidigm Corporation Assay methods for increased throughput of samples and/or targets
US20100055733A1 (en) 2008-09-04 2010-03-04 Lutolf Matthias P Manufacture and uses of reactive microcontact printing of biomolecules on soft hydrogels
EP2163900A1 (en) 2008-09-04 2010-03-17 Commissariat A L'energie Atomique New method of imaging by mass spectrometry and new mass tag associated trityl derivatives
US8586310B2 (en) 2008-09-05 2013-11-19 Washington University Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction
US20110244448A1 (en) 2008-09-08 2011-10-06 Masataka Shirai Dna detecting apparatus, dna detecting device and dna detecting method
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
DK2350648T3 (en) 2008-09-22 2017-05-22 Ventana Med Syst Inc SELECTIVE PROCESSING OF BIOLOGICAL MATERIAL ON A MICROARRAY SUBSTRATE
AU2009298501A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Abbvie Inc. Improved antibody libraries
WO2010042766A1 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Sage Science, Inc. Multichannel preparative electrophoresis system
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
WO2010062310A1 (en) 2008-10-28 2010-06-03 Millipore Corporation Biological culture assembly
CA2742272C (en) 2008-10-30 2018-05-29 Sequenom, Inc. Products and processes for multiplex nucleic acid identification
RU2011122459A (ru) 2008-11-03 2012-12-10 Стихтинг Санквин Блудворзининг Определение в образце клеток, отвечающих на антиген
GB2477439B (en) 2008-11-07 2012-02-15 Sequenta Inc Methods for correlating clonotypes with a disease in a patient
US9394567B2 (en) 2008-11-07 2016-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
EP2370803A2 (en) 2008-12-03 2011-10-05 The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Pressure-assisted molecular recovery (pamr) of biomolecules, pressure-assisted antigen retrieval (paar), and pressure-assisted tissue histology (path)
US20110275077A1 (en) 2009-01-12 2011-11-10 William James Oligonucleotide-Coated Affinity Membranes and Uses Thereof
US8790873B2 (en) 2009-01-16 2014-07-29 Affymetrix, Inc. DNA ligation on RNA template
KR101059565B1 (ko) 2009-02-11 2011-08-26 어플라이드 프레시젼, 인코포레이티드 밝은 기준점 표지를 갖는 마이크로어레이 및 그로부터 광 데이터를 수집하는 방법
US8481698B2 (en) 2009-03-19 2013-07-09 The President And Fellows Of Harvard College Parallel proximity ligation event analysis
EP3002337B1 (en) * 2009-03-30 2018-10-24 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells
AU2010232439C1 (en) 2009-04-02 2017-07-13 Fluidigm Corporation Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids
CN102625850B (zh) 2009-04-03 2014-11-26 蒂莫西·Z·刘 多重核酸检测方法和系统
WO2010127186A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
EP2425240A4 (en) 2009-04-30 2012-12-12 Good Start Genetics Inc METHOD AND COMPOSITION FOR EVALUATING GENETIC MARKERS
EP2449103B1 (en) 2009-06-29 2016-08-03 California Institute of Technology Isolation of unknown rearranged t-cell receptors from single cells
RU2410439C1 (ru) 2009-07-06 2011-01-27 Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации Способ абляции целевой днк с поверхности днк-биочипов
WO2011008831A2 (en) 2009-07-14 2011-01-20 University Of Florida Research Foundation, Inc. Mass tags for spectrometric analysis of immunoglobulins
GB0912909D0 (en) 2009-07-23 2009-08-26 Olink Genomics Ab Probes for specific analysis of nucleic acids
KR101029343B1 (ko) 2009-07-30 2011-04-13 한국과학기술연구원 면역분석 기반의 항원 검출용 키트 및 항원 검출 방법
US20120129248A1 (en) 2009-07-31 2012-05-24 Prognosys Biosciences, Inc. Assay tools and methods of use
US9416409B2 (en) 2009-07-31 2016-08-16 Ibis Biosciences, Inc. Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests
EP3029141A1 (en) 2009-08-20 2016-06-08 Population Genetics Technologies Ltd. Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement
EP2473842A4 (en) 2009-09-01 2014-03-19 Univ Oregon Health & Science ELECTROPHORESIS DEVICE WITH REVERSIBLE STROM GEL FOR THE SEPARATION OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES
SG169918A1 (en) 2009-10-02 2011-04-29 Fluidigm Corp Microfluidic devices with removable cover and methods of fabrication and application
CN102612555A (zh) 2009-10-09 2012-07-25 因威瑟堡善迪诺有限公司 用于检测抗原的装置及其应用
US9714937B2 (en) 2009-10-13 2017-07-25 Nanostring Technologies, Inc. Protein detection via nanoreporters
US9005891B2 (en) 2009-11-10 2015-04-14 Genomic Health, Inc. Methods for depleting RNA from nucleic acid samples
JP5611363B2 (ja) 2009-11-13 2014-10-22 ベンタナ メディカル システムズ， インコーポレイテッド 調整可能な体積を収容する薄膜処理装置
US20120277113A1 (en) 2009-11-18 2012-11-01 Ruo-Pan Huang Array-based proximity ligation association assays
CN102639716A (zh) 2009-12-04 2012-08-15 株式会社日立制作所 使用二维cDNA文库的基因表达解析方法
EP2510127B1 (en) 2009-12-07 2015-06-10 Prognosys Biosciences, Inc. Peptide display arrays
EP2510126B1 (en) 2009-12-07 2017-08-09 Illumina, Inc. Multi-sample indexing for multiplex genotyping
DE112010004821T5 (de) 2009-12-15 2012-10-04 Agency For Science, Technology And Research Prozessierung amplifizierter DNA-Fragmente zur Sequenzierung
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US8889416B2 (en) 2010-01-21 2014-11-18 California Institute Of Technology Methods and devices for micro-isolation, extraction, and/or analysis of microscale components
EP2529030B1 (en) 2010-01-29 2019-03-13 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Methods of in situ detection of nucleic acids
EP2354242A1 (en) 2010-02-03 2011-08-10 Epiontis GmbH Assay for determining the type and/or status of a cell based on the epigenetic pattern and the chromatin structure
US9714446B2 (en) 2010-02-11 2017-07-25 Nanostring Technologies, Inc. Compositions and methods for the detection of small RNAs
US9945786B2 (en) 2010-02-18 2018-04-17 Bima Limited Immobilised-bead immunomultiplex assay
US10266876B2 (en) 2010-03-08 2019-04-23 California Institute Of Technology Multiplex detection of molecular species in cells by super-resolution imaging and combinatorial labeling
JP5665021B2 (ja) 2010-03-08 2015-02-04 国立大学法人東京農工大学 融合ｍｈｃ分子連結磁気微粒子、抗原ペプチドのスクリーニング方法、組換えベクター、及び磁性細菌の形質転換体
WO2011112634A2 (en) 2010-03-08 2011-09-15 California Institute Of Technology Molecular indicia of cellular constituents and resolving the same by super-resolution technologies in single cells
US20110245101A1 (en) 2010-04-05 2011-10-06 Prognosys Biosciences, Inc. Co-localization affinity assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
PL2556171T3 (pl) 2010-04-05 2016-04-29 Prognosys Biosciences Inc Oznaczenia biologiczne kodowane przestrzennie
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US8462981B2 (en) 2010-04-07 2013-06-11 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Spectral unmixing for visualization of samples
US10240194B2 (en) 2010-05-13 2019-03-26 Gen9, Inc. Methods for nucleotide sequencing and high fidelity polynucleotide synthesis
US20130059741A1 (en) 2010-05-13 2013-03-07 Illumina, Inc. Binding assays for markers
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
EP3425062B1 (en) 2010-06-09 2023-08-02 Keygene N.V. Combinatorial sequence barcodes for high throughput screening
DK2588144T3 (en) 2010-07-02 2018-07-23 Ventana Med Syst Inc Detection of targets using mass markers and mass spectrometry
US20130211249A1 (en) 2010-07-22 2013-08-15 The Johns Hopkins University Drug eluting hydrogels for catheter delivery
EP2601513B1 (en) 2010-08-05 2014-05-14 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Enhancing visual assessment of samples
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
GB201013767D0 (en) 2010-08-17 2010-09-29 Isis Innovation Identification of ligands and their use
PT2623613T (pt) 2010-09-21 2016-10-11 Population Genetics Tech Ltd Aumento da confiança da designação de alelos por contagem molecular
EP2619329B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
US9110079B2 (en) 2010-09-29 2015-08-18 Biomerieux Method and kit for establishing an in vitro prognosis on a patient exhibiting SIRS
EP2625320B1 (en) 2010-10-08 2019-03-27 President and Fellows of Harvard College High-throughput single cell barcoding
WO2012049316A1 (en) 2010-10-15 2012-04-19 Olink Ab Dynamic range methods
CN103429755A (zh) 2010-10-21 2013-12-04 领先细胞医疗诊断有限公司 用于原位检测核酸的超灵敏方法
AU2011316807C1 (en) 2010-10-22 2018-01-25 Cold Spring Harbor Laboratory Varietal counting of nucleic acids for obtaining genomic copy number information
EP2632593B1 (en) 2010-10-27 2021-09-29 Illumina, Inc. Flow cells for biological or chemical analysis
EP2633080B1 (en) * 2010-10-29 2018-12-05 President and Fellows of Harvard College Method of detecting targets using fluorescently labelled nucleic acid nanotube probes
CA2821299C (en) 2010-11-05 2019-02-12 Frank J. Steemers Linking sequence reads using paired code tags
US20120258881A1 (en) 2010-11-22 2012-10-11 The University Of Chicago Methods and/or Use of Oligonucleotide Conjugates for Assays and Microscopy/Imaging Detections
US20140121118A1 (en) 2010-11-23 2014-05-01 Opx Biotechnologies, Inc. Methods, systems and compositions regarding multiplex construction protein amino-acid substitutions and identification of sequence-activity relationships, to provide gene replacement such as with tagged mutant genes, such as via efficient homologous recombination
WO2012083225A2 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Gigagen, Inc. System and methods for massively parallel analysis of nycleic acids in single cells
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
WO2012092426A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Foundation Medicine, Inc. Optimization of multigene analysis of tumor samples
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
AU2012209074A1 (en) 2011-01-25 2013-07-11 Almac Diagnostics Limited Colon cancer gene expression signatures and methods of use
JP5881746B2 (ja) 2011-02-15 2016-03-09 ライカ バイオシステムズ ニューキャッスル リミテッド ｍＲＮＡの局在インサイチュー検出のための方法
EP2689028B1 (en) 2011-03-23 2017-08-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Isolation of polymerase-nucleic acid complexes and loading onto substrates
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
WO2012139110A2 (en) 2011-04-08 2012-10-11 Prognosys Biosciences, Inc. Peptide constructs and assay systems
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
CN110016499B (zh) 2011-04-15 2023-11-14 约翰·霍普金斯大学 安全测序系统
US8946389B2 (en) 2011-04-25 2015-02-03 University Of Washington Compositions and methods for multiplex biomarker profiling
WO2012151111A1 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Quantitative nuclease protection assay (qnpa) and sequencing (qnps) improvements
CN108342453A (zh) 2011-05-09 2018-07-31 富鲁达公司 基于探针的核酸检测
CN106434871B (zh) 2011-05-17 2020-08-18 德克斯特里蒂诊断公司 用于检测目标核酸的方法与组合物
JP6040227B2 (ja) 2011-05-19 2016-12-07 アジーナ バイオサイエンス， インコーポレイテッド マルチプレックス核酸同定のための製品およびプロセス
US9005935B2 (en) 2011-05-23 2015-04-14 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases
GB201108678D0 (en) 2011-05-24 2011-07-06 Olink Ab Multiplexed proximity ligation assay
RU2013153507A (ru) 2011-06-06 2015-07-20 Биокарти Нв Селективный лизис клеток с помощью ионных поверхностно-активных веществ
CN103874913B (zh) 2011-06-17 2017-04-26 罗氏血液诊断股份有限公司 用于生物样品的组织加工的溶液
US8728987B2 (en) 2011-08-03 2014-05-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Filtering small nucleic acids using permeabilized cells
WO2013033271A2 (en) 2011-08-29 2013-03-07 Derren Barken Method to augment immune system in response to disease or injury
US9494588B2 (en) 2011-08-30 2016-11-15 Jacobs University Bremen Ggmbh Gene coded for a MHC class I molecule, plasmid, expression system protein, multimer, reagent and kit to analyze a T cell frequency
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
EP2768972B2 (en) 2011-09-23 2020-07-22 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
EP2766498B1 (en) 2011-10-14 2019-06-19 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
US8987174B2 (en) 2011-10-28 2015-03-24 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for manufacturing molecular arrays
WO2013063382A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
EP2776165A2 (en) 2011-11-07 2014-09-17 Illumina, Inc. Integrated sequencing apparatuses and methods of use
DK2788499T3 (en) 2011-12-09 2016-03-21 Illumina Inc Enhanced root for polymer tags
US20150031553A1 (en) 2011-12-13 2015-01-29 Sequenta, Inc. Method of measuring immune activation
EP4249605A3 (en) 2011-12-22 2023-11-15 President And Fellows Of Harvard College Methods for analyte detection
US9803188B2 (en) 2011-12-22 2017-10-31 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
US9598728B2 (en) 2012-02-14 2017-03-21 Cornell University Method for relative quantification of nucleic acid sequence, expression, or copy changes, using combined nuclease, ligation, and polymerase reactions
PT3363901T (pt) 2012-02-17 2021-01-22 Hutchinson Fred Cancer Res Composições e métodos para identificar mutações com precisão
NO2694769T3 (ru) 2012-03-06 2018-03-03
CA2867293C (en) 2012-03-13 2020-09-01 Abhijit Ajit PATEL Measurement of nucleic acid variants using highly-multiplexed error-suppressed deep sequencing
AU2013232131B2 (en) 2012-03-13 2018-09-20 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods and compositions for size-controlled homopolymer tailing of substrate polynucleotides by a nucleic acid polymerase
EP4234713A3 (en) 2012-03-20 2024-02-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods of lowering the error rate of massively parallel dna sequencing using duplex consensus sequencing
CN104350158A (zh) 2012-03-26 2015-02-11 约翰霍普金斯大学 快速非整倍性检测
CA3138752C (en) 2012-04-03 2024-02-06 Illumina, Inc. Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing
EP2647426A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
CN104395481A (zh) 2012-04-13 2015-03-04 赛昆塔公司 免疫组库分析中样品污染的检测和定量
WO2013158936A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Sequenta, Inc Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in b-cell acute lymphoblastic leukemia
EP2659977B1 (en) 2012-05-02 2019-04-24 IMEC vzw Microfluidics system for sequencing
AU2013266419B2 (en) 2012-05-22 2018-09-27 British Columbia Cancer Agency Branch NANO46 genes and methods to predict breast cancer outcome
WO2013184754A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
WO2014015187A1 (en) 2012-07-18 2014-01-23 Biological Dynamics, Inc. Manipulation of microparticles in low field dielectrophoretic regions
EP2881465B1 (en) 2012-07-30 2018-07-04 Hitachi, Ltd. Tag-sequence-attached two-dimensional cdna library device, and gene expression analysis method and gene expression analysis apparatus each utilizing same
CN104350372B (zh) 2012-08-09 2018-03-02 斯坦福大学托管董事会 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20150376609A1 (en) 2014-06-26 2015-12-31 10X Genomics, Inc. Methods of Analyzing Nucleic Acids from Individual Cells or Cell Populations
US9388465B2 (en) 2013-02-08 2016-07-12 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014028537A1 (en) 2012-08-14 2014-02-20 10X Technologies, Inc. Microcapsule compositions and methods
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
CN104704348A (zh) 2012-08-21 2015-06-10 剑桥研究和仪器设备股份有限公司 细胞的可视化和测量
US20150275267A1 (en) 2012-09-18 2015-10-01 Qiagen Gmbh Method and kit for preparing a target rna depleted sample
US9732390B2 (en) 2012-09-20 2017-08-15 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma
CN105189779B (zh) 2012-10-01 2018-05-11 适应生物技术公司 通过适应性免疫受体多样性和克隆性表征进行的免疫能力评估
US9518980B2 (en) 2012-10-10 2016-12-13 Howard Hughes Medical Institute Genetically encoded calcium indicators
CA2886974C (en) 2012-10-17 2021-06-29 Spatial Transcriptomics Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
EP2722105A1 (en) 2012-10-22 2014-04-23 Universität Wien Method of in situ synthesizing microarrays
WO2014076209A1 (en) 2012-11-14 2014-05-22 Olink Ab Localised rca-based amplification method
WO2014085725A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Tufts University Biopolymer-based inks and use thereof
CN105531375B (zh) 2012-12-10 2020-03-03 分析生物科学有限公司 靶向基因组分析的方法
US10964001B2 (en) 2013-01-10 2021-03-30 Akoya Biosciences, Inc. Multispectral imaging systems and methods
EP2943932B1 (en) 2013-01-10 2019-09-11 Akoya Biosciences, Inc. Whole slide multispectral imaging systems and methods
US9758828B2 (en) 2013-01-31 2017-09-12 Cornell University Methods to detect, treat and prevent acute cellular rejection in kidney allografts
WO2014130576A1 (en) 2013-02-19 2014-08-28 Biodot, Inc. Automated fish analysis of tissue and cell samples using an isolating barrier for precise dispensing of probe and other reagents on regions of interest
EP3674406A1 (en) 2013-02-25 2020-07-01 Biocartis N.V. Isolation of nucleic acids
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
EP3578666A1 (en) 2013-03-12 2019-12-11 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
CA2898453C (en) 2013-03-13 2021-07-27 Illumina, Inc. Multilayer fluidic devices and methods for their fabrication
WO2014152397A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Selective purification of rna and rna-bound molecular complexes
US9273349B2 (en) 2013-03-14 2016-03-01 Affymetrix, Inc. Detection of nucleic acids
WO2014152281A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Ribosomal ribonucleic acid hybridization for organism identification
CN113337604A (zh) 2013-03-15 2021-09-03 莱兰斯坦福初级大学评议会 循环核酸肿瘤标志物的鉴别和用途
GB2525568B (en) 2013-03-15 2020-10-14 Abvitro Llc Single cell barcoding for antibody discovery
WO2014149629A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Subtyping lung cancers
US10656149B2 (en) 2013-03-15 2020-05-19 The Trustees Of Princeton University Analyte detection enhancement by targeted immobilization, surface amplification, and pixelated reading and analysis
EP3415626B1 (en) 2013-03-15 2020-01-22 Lineage Biosciences, Inc. Methods and compositions for tagging and analyzing samples
US9868979B2 (en) 2013-06-25 2018-01-16 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
MX361481B (es) 2013-06-27 2018-12-06 10X Genomics Inc Composiciones y metodos para procesamiento de muestras.
ES2899618T3 (es) 2013-07-01 2022-03-14 Illumina Inc Funcionalización de superficie exenta de catalizador e injerto de polímero
US9834814B2 (en) 2013-11-22 2017-12-05 Agilent Technologies, Inc. Spatial molecular barcoding of in situ nucleic acids
AU2015243445B2 (en) 2014-04-10 2020-05-28 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
WO2015184386A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 The Regents Of The University Of California Subcellular western blotting of single cells
DK3152232T3 (da) 2014-06-06 2020-02-24 Immudex Aps Bestemmelse af antigen-genkendelse ved stregkodning af MHC-multimerer
EP3155426B1 (en) 2014-06-13 2023-07-19 Immudex ApS General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
US10179932B2 (en) 2014-07-11 2019-01-15 President And Fellows Of Harvard College Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy
EP3262192B1 (en) 2015-02-27 2020-09-16 Becton, Dickinson and Company Spatially addressable molecular barcoding
ES2955916T3 (es) 2015-04-10 2023-12-11 Spatial Transcriptomics Ab Análisis múltiplex de especímenes biológicos de ácidos nucleicos espacialmente distinguidos
US10059990B2 (en) 2015-04-14 2018-08-28 Massachusetts Institute Of Technology In situ nucleic acid sequencing of expanded biological samples
WO2017013170A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Identification of antigen epitopes and immune sequences recognizing the antigens
US10768141B2 (en) 2015-09-11 2020-09-08 The Regents Of The University Of California Isoelectric focusing arrays and methods of use thereof
WO2018045186A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 President And Fellows Of Harvard College Methods of combining the detection of biomolecules into a single assay using fluorescent in situ sequencing
EP3507364A4 (en) 2016-08-31 2020-05-20 President and Fellows of Harvard College METHODS OF GENERATING NUCLEIC ACID SEQUENCE LIBRARIES FOR IN SITU FLUORESCENT SEQUENCING DETECTION
CN114875125A (zh) 2016-10-19 2022-08-09 10X基因组学有限公司 用于条形码化单个细胞或细胞群的核酸分子的方法和系统
US20190177800A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP3545089B1 (en) 2017-01-30 2022-03-09 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
US10821442B2 (en) 2017-08-22 2020-11-03 10X Genomics, Inc. Devices, systems, and kits for forming droplets
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
WO2019195166A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US20210317524A1 (en) 2018-08-28 2021-10-14 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays
US20210324457A1 (en) 2018-08-28 2021-10-21 Eswar Prasad Ramachandran Iyer Methods for Generating Spatially Barcoded Arrays
CN113366117A (zh) 2018-08-28 2021-09-07 10X基因组学股份有限公司 用于生物样品中转座酶介导的空间标记和分析基因组dna的方法
EP4345453A3 (en) 2018-09-28 2024-06-05 10X Genomics, Inc. High throughput epitope identification and t cell receptor specificity determination using loadable detection molecules
WO2020076979A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Surface capture of targets
US20220049293A1 (en) 2018-12-10 2022-02-17 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a biological analyte in a biological sample
US20230242976A1 (en) 2018-12-10 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
EP3894592A2 (en) 2018-12-10 2021-10-20 10X Genomics, Inc. Generating spatial arrays with gradients
US20210189475A1 (en) 2018-12-10 2021-06-24 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
DE102018132378A1 (de) 2018-12-17 2020-06-18 Hamm Ag Bodenbearbeitungsmaschine
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US20220267844A1 (en) 2019-11-27 2022-08-25 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a biological analyte in a biological sample
WO2020167862A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for transfer of reagents between droplets
WO2020176788A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
US20230159995A1 (en) 2019-02-28 2023-05-25 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
EP3930900A1 (en) 2019-02-28 2022-01-05 10X Genomics, Inc. Devices, systems, and methods for increasing droplet formation efficiency
US20220145361A1 (en) 2019-03-15 2022-05-12 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
WO2020190509A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
WO2020198071A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US20220017951A1 (en) 2019-03-22 2022-01-20 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
WO2020219901A1 (en) 2019-04-26 2020-10-29 10X Genomics, Inc. Imaging support devices
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US20210140982A1 (en) 2019-10-18 2021-05-13 10X Genomics, Inc. Identification of spatial biomarkers of brain disorders and methods of using the same
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
US20230002812A1 (en) 2019-11-13 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US20210199660A1 (en) 2019-11-22 2021-07-01 10X Genomics, Inc. Biomarkers of breast cancer
CN115038794A (zh) 2019-12-23 2022-09-09 10X基因组学有限公司 在基于分区的测定中使用固定生物样品的组合物和方法
EP3891300B1 (en) 2019-12-23 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
CN115135984A (zh) 2019-12-23 2022-09-30 10X基因组学有限公司 可逆固定试剂及其使用方法
US20210198741A1 (en) 2019-12-30 2021-07-01 10X Genomics, Inc. Identification of spatial biomarkers of heart disorders and methods of using the same
US20220348992A1 (en) 2020-01-10 2022-11-03 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
EP4087945B1 (en) 2020-01-10 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
US20210214785A1 (en) 2020-01-13 2021-07-15 Spatial Transcriptomics Ab Methods of decreasing background on a spatial array
US20210223227A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Spatial Transcriptomics Ab Electrophoretic system and method for analyte capture
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US20210222253A1 (en) 2020-01-21 2021-07-22 10X Genomics, Inc. Identification of biomarkers of glioblastoma and methods of using the same
US20210230681A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using proximity ligation
US20210237022A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US20210238664A1 (en) 2020-02-03 2021-08-05 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US20230047782A1 (en) 2020-02-07 2023-02-16 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
WO2021168278A1 (en) 2020-02-20 2021-08-26 10X Genomics, Inc. METHODS TO COMBINE FIRST AND SECOND STRAND cDNA SYNTHESIS FOR SPATIAL ANALYSIS
AU2021224760A1 (en) 2020-02-21 2022-09-15 10X Genomics, Inc. Capturing genetic targets using a hybridization approach
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
WO2021207610A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 10X Genomics, Inc. Cold protease treatment method for preparing biological samples
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
US20230265491A1 (en) 2020-05-04 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomic transfer modes
CN116134308A (zh) 2020-05-19 2023-05-16 10X基因组学有限公司 电泳盒和仪器
AU2021275906A1 (en) 2020-05-22 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021237056A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Rna integrity analysis in a biological sample
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
EP4158054A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
WO2021247543A2 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
EP4162074B1 (en) 2020-06-08 2024-04-24 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252576A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using blocker oligonucleotides
EP4165207A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
CN116034166A (zh) 2020-06-25 2023-04-28 10X基因组学有限公司 Dna甲基化的空间分析
EP4189110A1 (en) 2020-07-31 2023-06-07 10X Genomics, Inc. De-crosslinking compounds and methods of use for spatial analysis
WO2022060798A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 10X Genomics, Inc. Methods of releasing an extended capture probe from a substrate and uses of the same
CN116507739A (zh) 2020-09-16 2023-07-28 10X基因组学有限公司 使用多个孔确定生物样品中分析物位置的方法
AU2021366701A1 (en) 2020-10-22 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification
WO2022098810A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 10X Genomics, Inc. Assay support devices
AU2021376399A1 (en) 2020-11-06 2023-06-15 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for binding an analyte to a capture probe
EP4244379A1 (en) 2020-11-13 2023-09-20 10X Genomics, Inc. Nano-partitions (encapsulated nucleic acid processing enzymes) for cell-lysis and multiple reactions in partition-based assays
WO2022109181A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing immune infiltration in cancer stroma to predict clinical outcome
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
WO2022147005A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 10X Genomics, Inc. Methods for analyte capture determination
WO2022147296A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 10X Genomics, Inc. Cleavage of capture probes for spatial analysis
WO2022164615A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 10X Genomics, Inc. Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample
WO2022178267A2 (en) 2021-02-19 2022-08-25 10X Genomics, Inc. Modular assay support devices
EP4301870A1 (en) 2021-03-18 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
EP4305196A1 (en) 2021-04-14 2024-01-17 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
WO2022226057A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 10X Genomics, Inc. Methods for assessing sample quality prior to spatial analysis using templated ligation
US20220333192A1 (en) 2021-04-20 2022-10-20 10X Genomics, Inc. Methods and devices for spatial assessment of rna quality
WO2022236054A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 10X Genomics, Inc. Methods for increasing resolution of spatial analysis
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2022271820A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 10X Genomics, Inc. Spatial detection of sars-cov-2 using templated ligation
US20230014008A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for improving spatial performance
WO2023287765A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted probe silencing
US20230034216A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Multiplexed spatial capture of analytes
US20230034039A1 (en) 2021-08-02 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Methods of preserving a biological sample
US20230042817A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 10X Genomics, Inc. Analyte capture from an embedded biological sample
WO2023018799A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 10X Genomics, Inc. Methods, compositions and systems for identifying antigen-binding molecules
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023076345A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna capture
US20230135010A1 (en) 2021-11-03 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Sequential analyte capture
WO2023086880A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
WO2023102118A2 (en) 2021-12-01 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
US20230175045A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2145635C1 (ru) * 1989-05-18 2000-02-20 Чирон Корпорейшн Олигомер (варианты), способ обнаружения последовательности hcv (варианты), набор для обнаружения, способ получения крови
US20020168645A1 (en) * 1998-04-16 2002-11-14 Seth Taylor Analysis of polynucleotide sequence
RU2270254C2 (ru) * 2004-04-30 2006-02-20 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа
US20060211001A1 (en) * 2005-03-18 2006-09-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Microdissection-based methods for determining genomic features of single chromosomes
WO2007030373A2 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 St. Jude Children's Research Hospital Method for in situ hybridization analysis

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2816708C2 (ru) * 2018-10-25 2024-04-03 Иллюмина, Инк. Способы и композиции для определения лигандов на матрицах с использованием индексов и штрихкодов

Also Published As

Publication number Publication date
US11788122B2 (en) 2023-10-17
EP4183887A1 (en) 2023-05-24
AU2012241730B2 (en) 2016-08-11
US10030261B2 (en) 2018-07-24
RU2013148909A (ru) 2015-05-20
US20230242973A1 (en) 2023-08-03
NZ616407A (en) 2014-12-24
CN103781918A (zh) 2014-05-07
US20140066318A1 (en) 2014-03-06
EP3677692A1 (en) 2020-07-08
CA2832678A1 (en) 2012-10-18
US11352659B2 (en) 2022-06-07
CN115896252A (zh) 2023-04-04
JP2014513523A (ja) 2014-06-05
BR112013026502A2 (pt) 2016-11-29
US11479809B2 (en) 2022-10-25
CN108796058B (zh) 2023-04-07
US20190264268A1 (en) 2019-08-29
WO2012140224A1 (en) 2012-10-18
US20220213526A1 (en) 2022-07-07
KR101994494B1 (ko) 2019-06-28
EP2697391B1 (en) 2019-10-30
US20190024154A1 (en) 2019-01-24
US20190024153A1 (en) 2019-01-24
MX2013011737A (es) 2014-03-27
US20220090058A1 (en) 2022-03-24
MX340330B (es) 2016-07-06
CN108796058A (zh) 2018-11-13
KR20140024378A (ko) 2014-02-28
CA2832678C (en) 2021-03-09
US20240084365A1 (en) 2024-03-14
US20190017106A1 (en) 2019-01-17
JP5916166B2 (ja) 2016-05-11
EP4206333A1 (en) 2023-07-05
US20230100497A1 (en) 2023-03-30
CN103781918B (zh) 2018-06-01
US11795498B2 (en) 2023-10-24
US20220127659A1 (en) 2022-04-28
GB201106254D0 (en) 2011-05-25
US20240093274A1 (en) 2024-03-21
AU2012241730A1 (en) 2013-10-31
EP2697391A1 (en) 2014-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2603074C2 (ru) Способ и продукт для локализованной или пространственной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани
EP3916108B1 (en) Method for spatial tagging and analysing nucleic acids in a biological specimen
US9593365B2 (en) Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample

Legal Events

Date Code Title Description
HC9A Changing information about inventors
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20200414