JP2003505104A

JP2003505104A - 変異体ｔｎ５トランスポザーゼ酵素及びその使用方法

Info

Publication number: JP2003505104A
Application number: JP2001513619A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムエスレズニコフ; トッドエイナウマン
Original assignee: ウイスコンシンアラムニリサーチファンデーション
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2003-02-12
Also published as: AU775043B2; CA2380850A1; AU6396700A; WO2001009363A1; PL353241A1; CN1367840A; RU2002105508A; EP1198583A1

Abstract

(57)【要約】トランスポゾンＴｎ５の外側端よりも内側端に優先性を有する修飾Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質が開示される。当該タンパク質は、内側端よりも外側端を優先するトランスポザーゼ酵素と組み合わせて、インビボ又はインビトロにおける端部特異的定方向転位法に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願のクロスリファレンス本出願は、１９９９年８月２日出願のＵＳ仮特許出願６０／１４６，６８６号
（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）の利益を請求するも
のである。連邦支援研究又は開発に関する言及本発明は、ＮＩＨより与えられた米国政府支援（助成番号ＧＭ５０６９２）に
よりなされたものである。米国政府は本発明について一定の権利を有する。発明の背景細菌性トランスポゾン、例えばＴｎ５は、低い移動度レベルを維持することに
より細胞内で進化した。低い移動度レベルは、トランスポゾンを生存させるため
に必要であるが、これは、研究者が分子転位プロセスを詳しく調べること並びに
、例えば新規な診断用及び治療用資源の開発に使用するための転位プロセスの開
発を阻害してきた。Ｔｎ５は、ＩＳ４ファミリーの保存的「カット・アンド・ペ
ースト」トランスポゾンであり（Rezsohazy, R., Hallet, B., Delcour, J., 及
び Mahillon, J, "The IS4 family of insertion sequences: evidence for a c
onserved transposase motif," Mol Microbiol. 9: 1283-1295 (1993)）、当該
トランスポゾンの移動の原因となる５３ｋＤのトランスポザーゼタンパク質（Ｔ
ｎｐ）をコードしている。野生型Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸及び核酸配
列は公知である（Ahmed, A. 及び Podemski, L. The Revised Sequence of Tn5.
Gene 154 (1), 129-130 (1995)（参照することにより、その内容の全体が本明
細書に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる））。野生型Ｔｎ５
トランスポザーゼをコードする核酸配列は、配列番号１として添付されている。
配列番号１の核酸配列によりコードされるポリペプチド配列は、野生型Ｔｎ５ト
ランスポザーゼに対応するものであり、配列番号２として添付されている。

【０００２】Ｔｎｐタンパク質は、最初の外側端（outside end）（ＯＥ、配列番号３）と
呼ばれる２つの１９ｂｐ特異的結合配列の各々に結合し、続いてシナプス（syna
pse）と呼ばれる核タンパク質構造の形成、各端部の平滑末端的切断、標的ＤＮ
Ａとの会合（associate）及び鎖転位へと続くことにより、要素全体の移動を促
進する（Reznikoff, W.S., Bhasin, A., Davies, D.R., Goryshin, I.Y., Mahnk
e, L.A., Naumann, T., Rayment, I., Steiniger-White, M., 及び Twining, S.
S., "Tn5: A molecular window on transposition," Biochem. Biophvs. Res. C
ommun. 266: 729-34 (1999)）。Ｔｎ５トランスポザーゼは、ＯＥ及び内側端（i
nside end）（ＩＥ、配列番号４）配列との組み合わせを使用することにより、
単一の挿入配列の移動を促進することができる。ＩＥは、長さ１９ｂｐであり、
１９の部位のうち１２はＯＥと同一である（図１）。インビボで、Ｔｎ５トラン
スポザーゼは、大腸菌（E.coli）において、ＯＥに対して顕著な優先性（prefer
ence）を示す。ＩＥに対するトランスポザーゼの認識及び結合は、大腸菌におい
て、内側端配列につき４つのメチル基を付加する（ＩＥ^ME、配列番号４として示
される。メチル化は示さず。）２つのｄａｍメチル化部位（ＧＡＴＣパリンドロ
ーム）の存在により阻害される（Yin, J.C.P., Krebs, M.P., 及び Reznikoff,
W.S., "Effect of dam Methylation on Tn5 Transposition," J. Mol Biol., 19
9: 35-45 (1988)（参照することにより、その内容の全体が本明細書に記載され
ているかのように、本明細書に組み込まれる））。このメチル化は、タンパク質
−ＤＮＡの一次認識を減少させることにより転位を減少させる（Jilk, R.A., Yo
rk, D., 及び Reznikoff, W.S., "The organization of the outside end of tr
ansposon Tn5," J. Bacteriol. 178: 1671-1679 (1996)）。Ｔｎ５がどのようにして転位するかということについての理解に対する主要な
障害は、精製した野生型Ｔｎｐがインビトロで検出可能な活性を有しないという
事実である。最近になって、インビトロで転位反応の全過程を促進するトランス
ポザーゼの二重変異過剰活性（hyperactive）形態（「ＴｎｐＥＫ／ＬＰ」）
が開発された。ＴｎｐＥＫ／ＬＰタンパク質は、野生型Ｔｎ５Ｔｎｐと、部
位５４（GluからLysへの変異）及び部位３７２（LeuからProへの変異）において
異なり、更に、いわゆる阻害タンパク質の産生を阻害する、必須ではないが有利
な部位５６における改変の点でも異なる。修飾された過剰活性Ｔｎｐタンパク質
は、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼが有するＯＥ（又はＯＥ様）端に対する劇的
な優先性を保持している。ＴｎｐＥＫ／ＬＰは、以前はインビボにおいて適切
にアドレス可能ではなかったＴｎ５転位の多数の側面を明らかにした。インビトロにおけるポリヌクレオチド転位は、ランダムな又は標的化した変異
をゲノムへ導入するための強力なツールである。Ｔｎ５トランスポゾンに基づく
有用なインビトロ転位システムは、米国特許第５，９２５，５４５号及び国際公
開第ＷＯ００／１７３４３号（参照することにより、これらの内容があたかも本
明細書に記載されているかのように、その全体が本明細書に組み込まれる）に開
示されている。ＩＥとＯＥとを識別する能力を有し、かつ、ＩＥの結合に対する優先性を有す
るＴｎｐタンパク質は、定方向の核酸転位を許容するため、かつ、ＯＥについて
単一の特異性を有するＴｎｐを用い、今まで利用可能であった前記の特許及び出
願に開示されるタイプよりもより複雑な転位及び遺伝子操作戦略を促進するため
に望まれている。

【０００３】発明の要約本発明は、本明細書に開示される野生型Ｔｎ５Ｔｎｐに対して修飾されたト
ランスポザーゼタンパク質が、野生型Ｔｎ５トランスポゾンの外側端（ＯＥ）で
はなく内側端（ＩＥ）に隣接する標的配列の転位を、ＩＥ配列がメチル化されて
いるか否かに関係なく優先的に促進する点に要約される。関連する側面において、本発明は、本明細書に記載される野生型Ｔｎ５Ｔｎ
ｐに対して修飾されたトランスポザーゼが、ＯＥよりもＩＥに対して優先性を有
し、かつ、転位頻度に関して過剰活性である点に要約される。別の関連する側面において、本発明は、本明細書に記載される野生型Ｔｎ５
Ｔｎｐに対して修飾されたトランスポザーゼが、ＯＥよりもＩＥに対して優先性
を有し、かつ、ＩＥ配列がメチル化されるときでさえ転位を高レベルで触媒する
点に要約される。対照的に、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼは、メチル化ＩＥ配
列を効率的に認識しない。更に別の関連する側面において、本発明は、本発明のトランスポザーゼが、野
生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対する変異であって、（１）ＤＮＡ端部（DNA te
rmini）へのトランスポザーゼの結合を変化させる変異、（２）転位を増強する
変異、又は（３）その両方の変異を含んでいる点に要約される。変異は、端部−
配列−特異的（end-sequence-specific）（ＤＮＡ結合を変化させる実施態様の
場合）又は非特異的（転位を増強させる実施態様の場合）であることができる。更に別の関連する側面において、本発明は、本発明のトランスポザーゼが、（
１）ＯＥよりもＩＥに対して高い優先性を有し、かつ、（２）アミノ酸５８、ア
ミノ酸３４４及びアミノ酸３７２からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミ
ノ酸において、野生型Ｔｎｐとは異なっている点に要約される。更に別の関連する側面において、本発明は、本発明のトランスポザーゼが、ア
ミノ酸５８におけるグルタミン酸からバリンへの変異、アミノ酸３４４における
グルタミン酸からリジンへの変異及びアミノ酸３７２におけるロイシンからグル
タミン酸への変異のうち少なくとも１つ含んでいる点で野生型Ｔｎｐとは異なっ
ている点に要約される。

【０００４】別の関連する側面において、本発明は、本発明のトランスポザーゼは、ＯＥに
対する優先性を減少させることにより、ＩＥに対する高い優先性を示すことがで
きる点に要約される。アミノ酸部位８における野生型トランスポザーゼに対する
変異は、トランスポザーゼのＯＥに対する優先性を減少させ、これによりＩＥに
対するみかけの優先性を増加させる。アルギニンからシステインへの変異は、こ
の修飾を達成することができる。本発明のトランスポザーゼは、インビボ又はインビトロにおけるＩＥ隣接標的
配列の転位を、野生型Ｔｎ５よりも促進することができる。インビトロにおいて
トランスポザーゼ酵素活性を決定する適切な方法は、本明細書及び米国特許第５
，９２５，５４５号（参照することにより、当該文献の全体が本明細書に組み込
まれる）に開示されている。インビボにおいてトランスポザーゼ活性を決定する
適切な方法は、本明細書に開示されている。本発明の修飾Ｔｎ５Ｔｎｐは、あるアミノ酸部位おける少なくとも１つの変
化により野生型Ｔｎ５Ｔｎｐとは異なっている。当該アミノ酸部位における変
化は、（１）アミノ酸部位５８における変化であって、Ｔｎｐとメチル化ＤＮＡ
残基との間の負の相互作用を減少又は除去する変化及び（２）アミノ酸部位３４
４における変化であって、ＤＮＡ結合を変化させる変化からなる群より選ばれる
。本明細書で注目する変化に加えて、本発明の修飾Ｔｎｐは、部位５６における
変化（例えば、MetからAlaへの変化）であって、転位を妨害するいわゆる阻害タ
ンパク質の産生を防ぐ変化を含むことができる。変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ
タンパク質は、前記で注目した変異に加えて更に変異を含むことができる。野生
型Ｔｎ５Ｔｎｐに対する追加の変異は後述する。各変異の効果は後述される。
更に、出願人が当該トランスポザーゼタンパク質の機能に直接影響を与えるアミ
ノ酸残基を同定したこと、及び、同一部位におけるその他の修飾は、内側端につ
いてのタンパク質の優先性について注目した効果と比べて大きい又は小さい比較
可能な効果を及ぼすことができることが理解される。野生型Ｔｎ５トランスポザ
ーゼのアミノ酸配列は、配列表中に示されている。野生型トランスポザーゼに対
する例示的な変化は、本出願の記載中に示されている。

【０００５】更に本発明は、転位可能要素ＤＮＡがいずれかの側で、互いに逆方向の関係に
あるＩＥ端によって隣接されるときに、当該転位可能要素をドナーＤＮＡから標
的ＤＮＡへ導入するための単純なインビトロシステム及び方法を、本明細書に開
示される酵素が促進する点に要約される。ドナーＤＮＡ又は標的ＤＮＡのいずれ
かについてのその他幾つかの要件が想定される。Ｔｎ５が挿入部位について（も
しあるならば）幾つかの優先性を有する場合、所望の配列を標的ＤＮＡへランダ
ムに導入するシステムを使用することが可能になることが考えられる。それゆえ
、本明細書に記載される修飾トランスポザーゼ及び単純なドナーＤＮＡを用いる
本発明のシステム及び方法は、ヌクレオチド配列に関係なく、あらゆる標的ＤＮ
Ａへ変化を導入するために広範に適用可能であると考えられる。したがって、当
該システム及び方法は、分子生物学分野の当業者にとって興味の対象となる多数
の問題に適用されるだろう。最後に、本明細書において注目した変化は、タンパク質レベルの変化の点から
開示されるけれども、本発明の修飾タンパク質をコードするために、Ｔｎ５トラ
ンスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾することは、十分
に当業者の能力の範囲内にある。更に当業者は、遺伝子コードの縮重を理解し、
かつ、複数のコドンを単一アミノ酸残基の生産に向けることができることを理解
する。本発明は、添付図面と共に以下の詳細な説明の記載を考慮して、十分に理解さ
れるだろう。

【０００６】好ましい態様の詳細な説明Ｔｎｐ遺伝子について行ったランダム変異誘発研究は、転位速度を増加させる
タンパク質内の変異を単離することができることを実証した（Krebs 及び Rezni
koff, 1988; DeLong, A., 及び Syvanen, M.,"Trans-acting transposase mutan
t from Tn5,"P.N.A.S. U.S.A. 88: 6072-6 (1991); Wiegand, T.W., 及び Rezni
koff, W.S.,"Characterization of two hypertransposing Tn5 mutants,"J. Bac
teriol. 174: 1229-1239 (1992); Weinreich, M.D., Gasch, A., & Reznikoff,
W.S.,"Evidence that the cis preference of the Tn5 transposase is caused
by nonproductive multimerization," Genes. Dev. 8: 2363-2374 (1994); Zhou
, M., & Reznikoff, W.S.,"Tn5 mutants that alter DNA binding specificity,
"J. Mol. Biol. 271: 362-73. (1997),（参照することにより、これらの文献の
全体が本明細書に開示されているかのように組み込まれる））。このことは、イ
ンビボ活性に対して最大限に進化していると考えられるほとんどの酵素性タンパ
ク質と比較して、トランスポザーゼをユニークなものとしている。これは、高い
転位速度はトランスポゾンの生存にとって有害であり、それゆえトランスポザー
ゼは最大の到達可能レベルよりも非常に低い「最適」レベルを有するように進化
したという事実によるものであろう。本件出願人は、転位システムにおいて、メチル化部位を有しないためメチル化
されない外側端（ＯＥ）よりも内側端（ＩＥ）及びある場合にはメチル化された
内側端（ＩＥ^ME）に対して優先性を示す点で野生型Ｔｎ５トランスポザーゼとは
異なる、関連変異体トランスポザーゼタンパク質のセットを単離した。変異体ト
ランスポザーゼの端部優先性は、（１）標的ポリヌクレオチドがＯＥ及びＩＥ^ME 端のいずれかに隣接しているシステム中で、当該トランスポザーゼを使用すると
きに観察されるインビボ転位頻度、又は（２）標的ポリヌクレオチドがＯＥ及び
ＩＥ^ME端のそれぞれに隣接しているシステムのペアにおいて、当該トランスポザ
ーゼを使用するときに観察されるインビボ転位頻度の比のいずれかにより特徴付
けることができる。本件出願人は、１、４、５及び７つの変異において野生型Ｔ
ｎ５Ｔｎｐとは異なっている多数のトランスポザーゼタンパク質を例示するけ
れども、分析によって、特定の個々の変異の効果を合理的に予想することができ
る。

【０００７】実施例概要多数の関連する方法を使用して、本明細書に開示される変異体のファミリーを
得た。第一の方法において、本件出願人は、野生型トランスポザーゼによっては
基質として認識されない変異端部結合配列に対して、インビボ転位活性を回復し
た変異体を得た。第二の方法において、本件出願人は、第一の方法による特定の
産物に定方向変異を導入し、本発明の変異体トランスポザーゼの好ましい構造を
決定した。第一の方法において、変異体ＩＥ端部結合配列は、部位１２においてチミンに
変わってアデニンを含んでいる（「ＩＥ１２Ａ」、配列番号５）。ＩＥ１２Ａに
おけるチミンからアデニンへの変化は、野生型ＩＥの２つのメチル化部位のうち
の１つを破壊する。本件出願人は、ｓＰＣＲ、コンビナトリアル、ランダム方向
変異誘発技術を使用して、ＩＥ１２Ａに隣接するポリヌクレオチドに対する転位
活性を回復することができる修飾トランスポザーゼタンパク質を得た。ｓＰＣＲ
はStemmer, W.P.により開発され、以下の文献：Stemmer, W.P.,"Rapid evolutio
n of a protein in vitro by DNA shuffling,"Nature 370: 389-391 (1994) 及
び Stemmer, W.P., "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:
in vitro recombination for molecular evolution,"Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 91: 10747-10751 (1994)（両文献ともに、参照することにより、これら
の文献の全体が本明細書に開示されているかのように組み込まれる）に記載され
ている。要約すると、ＤＮＡをｓＰＣＲ法においてインビトロで操作して、点変
異を導入し、変異体配列集団内のランダム組替えを許容する。変異した遺伝子を
プラスミドへクローニングして、インビボで増加した活性について選択すること
ができる。所望の表現型を、更に改良された表現形のための次ラウンドの変異誘
発／組替え及び選択の基質として使用する。

【０００８】ｓＰＣＲ法は、１ラウンドにつき控えめな数（modest number）のコロニー（
〜１０⁴）を分析するスクリーニングと共に使用することができる（Crameri, A.
, Whitehorn, E.A., 及び Stemmer, W.P.,"Improved green fluorescent protei
n by molecular evolution using DNA shuffling,"Nat. Biotechnol. 14: 315-3
19 (1996), 及び Zhang, J.H., Dawes, G., 及び Stemmer, W.P.,"Directed evo
lution of a fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screeni
ng,"Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4504-4509 (1997)（両文献ともに、参
照することにより、これらの文献の全体が本明細書に開示されているかのように
組み込まれる））。後述の実施例に記載されるパピレーション（papillation）
アッセイを、ＩＥ１２Ａに隣接するポリヌクレオチドに対する転位活性を回復す
るトランスポザーゼ変異体のスクリーニングとして使用した。パピレーションア
ッセイは、文献：Krebs, M.P., 及び Reznikoff, W.S., "Use of a Tn5 derivat
ive that creates lacZ translational fusions to obtain a transposition mu
tant,"Gene 63: 277-85 (1988)（参照することにより、これらの文献が本明細書
に開示されているかのようにその全体が組み込まれる）に記載されるアッセイを
修飾したものである。パピレーションアッセイにおいて、フレーム内における活
動的に発現した遺伝子への生産的転位は、β−Ｇａｌ融合タンパク質の形成を引
き起こした。これらの細胞は青色（Ｘ−ｇａｌの存在による）になり、コロニー
内で増加した速度で増殖した（ラクトースの利用）。パピラーエ（papillae）が
形成する速度を利用して、変異タンパク質により促進された転位速度を比較する
ことができる。本件出願人は、第一の方法を使用して同定された変異体トランスポザーゼにつ
いて、ｄａｍ株内において野生型ＯＥ又は野生型ＩＥ（すなわち、核酸はメチル
化されていない）のいずれかに隣接するポリヌクレオチドのインビボでの転位を
触媒する能力を決定した。前記の方法を使用して同定された変異体の中で、本件
出願人は、ＯＥ隣接ポリヌクレオチドに対しては野生型に近い活性を保持するが
、ＩＥ隣接ポリヌクレオチドに対しては非常に高い活性を有し、更にｄａｍ＋株
（すなわち、核酸がメチル化されている。「ＩＥ^ME」）においてテストしたとき
にＩＥ隣接ポリヌクレオチドに対しても高い活性を有する変異体トランスポザー
ゼ（「ＴｎｐｓＣ７」）を同定した。ＴｎｐｓＣ７は、野生型トランスポザ
ーゼに対して７つの変異を含んでいる。

【０００９】第二の方法では、続いて、ＴｎｐｓＣ７の７つの変異のうち４つのみを有す
る関連変異体トランスポザーゼ（「ＴｎｐｓＣ７ｖ２．０」）が、更に高い
ＩＥ^ME：ＯＥ活性比を示したことを測定した。ＴｎｐｓＣ７及びＴｎｐｓＣ
７ｖ２．０は共に、ＯＥ関連活性を阻害する変異（Ｒ８Ｃ）、ＩＥ^ME関連活性
を特異的に増加させる２つの変異（Ｅ５８Ｖ、Ｅ３４４Ｋ）及びＩＥ^ME又はＯＥ
が隣接するポリヌクレオチドの転位を増加させる変異（Ｌ３７２Ｑ）を含んでい
る。変異体Ｔｎｐの取得生産的転位についてのスクリーニングに使用する修飾パピレーションアッセイ
は、図２に示されかつ説明されている。使用した第一のプラスミド（「ｐＲＺ９
９０４（ＩＥ１２Ａ／ＩＥ１２Ａ）」）において、逆方向にあるＩＥ１２Ａ端の
対は、ｌａｃＺ遺伝子を含むがプロモーター及び翻訳開始部位を欠いているポリ
ヌクレオチドに隣接している。当該アッセイにおいて使用する第二のプラスミド
（「ｐＲＺ９９０５」）は、ｌａｃＺ含有ポリヌクレオチドを移動させることが
できるトランスポザーゼをコードしている。これらの性状を有するプラスミドは
、当業者により容易に構築されることができる。材料及び方法を以下に詳述する
。５つのランダム変異体は、端部配列の変異が抑制されており、かつ、変異誘発
／組替えの最初のサイクル後にパピラーエを与えるものであった。次いで、これ
らの変異体トランスポザーゼの各々をコードするプラスミドの等量を、変異誘発
／組替えの第二ラウンド用の最初の基質として使用した。この第二ラウンドに続
いて、変異トランスポザーゼ遺伝子をベクターＤＮＡにクローニングし、パピレ
ーションスクリーニングにより、ＩＥ１２Ａで定義されるポリヌクレオチドとの
転位活性について２回目のスクリーニングを行った。この第二ラウンドより、総
数６の活性な変異体が単離された。変異誘発／組替えの第三ラウンドを行い、続
いて変異体の端部配列についての活性をスクリーニングした。今度は、何百もの
コロニーがパピレーションについて陽性であった。これらのなかで、７つは、そ
の他のものよりも活性が明らかに高く、これらを単離し、第四ラウンド用の鋳型
として役立てた。第四ラウンドのスクリーニングにおいては、何百もの転位コロ
ニーがスクリーニング過程の間に可視化された。しかしながら、これらの中には
、変異誘発／組替えの第三ラウンドに由来する最も活性が高い変異体（Ｔｎｐ
ｓＣ６）と同等の活性を有するものは存在しなかった。

【００１０】各ラウンドに由来する最も活性の高い単離物について配列決定し、定量的パピ
レーションアッセイにおいて、ＩＥ１２Ａで定義されるトランスポゾンについて
の転位活性について試験した（図３Ａ及び３Ｂを参照）。図３Ａは、野生型Ｔｎ
ｐに対する変異体であるｓＡ５（第一ラウンドの最良パピレーター（papillator
））、ｓＢ２（第二ラウンドの最良パピレーター）、ｓＣ６（第三ラウンドの最
良パピレーター）及びｓＤ５（第四ラウンドの最良パピレーター）を示している
。図３Ｂは、パピレーションアッセイにおける、４つの単離物についてのインビ
ボでの転位活性を示している。ＴｎｐＷＴも試験したが、単一の検出可能な転
位事象を促進することはできなかった。変異Ｑ８１Ｈは、第三ラウンドにて単離
された最も活性の高い変異体ｓＣ６と第二ラウンドにて単離された著しく活性の
低い変異体ｓＢ２とを区別する唯一の変異である。第三ラウンドから単離された
第二の単離物、ＴｎｐｓＣ７は、２つの追加の変異（Ｄ２１７Ａ及びＥ３４４
Ｋ）を有していることを除いて第四ラウンド単離物ｓＤ５に類似している。Ｔｎ
ｐｓＣ７のＩＥ１２Ａで定義されたトランスポゾンとの反応性は、第四ラウン
ド単離物ｓＤ５の反応性と類似している（データは示さず）。

【００１１】変異体ＴｎｐはＯＥ−及びＩＥ−で定義されたトランスポゾンの転位を促進することができる前記の変異体Ｔｎｐは最初の興味の対象であった。なぜなら、前記の変異体は
、野生型Ｔｎｐの存在下では不活性であった、ＩＥ１２Ａ端に隣接するトランス
ポゾンに対する転位活性を回復することができたからである。トランスポザーゼ
変異体は、これらのトランスポゾンに対してますます良好に作用したが、転位速
度は、インビトロで要求される活性レベルに接近しなかった。実際に、Ｔｎｐ
ｓＣ６のＩＥ１２Ａ端に対するインビボ活性は、ＴｎＰＷｔのＯＥにより定義
されるトランスポゾンに対する活性に類似したレベルに回復したのみであった（
データは示さず）。しかしながら、興味深いことに、単離された変異体のほとんどが、未変性の端
部配列（ＩＥ又はＯＥ）の少なくとも１つにより定義されるトランスポゾンに対
して過剰活性であった。これらの転位優先性を、ｄａｍ−（メチル化されていな
いＤＮＡ）株において、メイティング・アウト（mating out）アッセイ（Gorysh
in, I.Y., Kil, Y.V., 及び Reznikoff, W.S.,"DNA length, and twisting cons
traints on IS50 transposition,"Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91: 10834-10838
(1994)（参照することにより、文献の全体が本明細書に開示されているかのよ
うに組み込まれる））を使用して決定した。図４は、野生型Ｔｎｐの活性に対して標準化（６．５×１０^-5を１に標準化）
した、ｄａｍ−株についてのメイティング・アウトアッセイにおける、２５の変
異体ＴｎｐのＩＥ及びＯＥで定義されるトランスポゾンついてのインビボ転位活
性を示している。ｄａｍ−環境下での当該アッセイにおいては、ＴｎｐＷＴは
、基質ポリヌクレオチドがＩＥ又はＯＥと隣接していようとなかろうと、一般的
に同一の活性レベルを示す。一方、多数の変異体はＯＥよりもＩＥに対して高い
活性を示した。これは驚くべきことではない。なぜなら、変異体は、ＩＥとはわ
ずか１ヌクレオチドが異なっているＩＥ１２Ａを使用したスクリーニングにおい
て得られたものだからである。対照的に、ＯＥはＩＥ１２Ａと６つのヌクレオチ
ドで異なっている。特に１つの変異体ＴｎｐｓＣ７は、非常に興味深い表現型
を示した。これは、ＩＥトランスポゾンについて著しく過剰活性であったが、Ｏ
Ｅトランスポゾンの移動頻度においてはわずかな変化を示した。ＩＥとＯＥとを
識別する能力は重要である。なぜなら、この能力はＩＥ及びＯＥ端を別々に用い
るマルチパート転位を促進し、ここではＩＥ又はＯＥを好むトランスポザーゼ提
供することにより、反応を一方向又は他方向へ向けることができるからである。
ＩＥに対する優先性がＯＥに対する優先性よりも約５倍より大きいことが適切で
あろう。ＩＥに対する優先性がＯＥに対する優先性よりも約１０倍より大きいこ
とが好ましい。約２０倍より大きい優先性が更に好ましい。図４は、当業者が、
本明細書に記載される方法を使用して前記の変異体トランスポザーゼを取得する
ことができることを実証している。特に、変異体ｓＢ１、ｓＣ６、ｓＣ７、ｓＤ
１及びｓＤ３は前記の変異体の例示である。

【００１２】しかしながら、更に有意なことに、ＴｎＰｓＣ７及びＴｎｐＷｔの両方に
ついてｄａｍ＋株ではＯＥに対する転位活性が低下したことを示す表１のメイテ
ィング・アウト結果に示されるように、ＴｎｐｓＣ７は、転位活性について、
メチル化ＩＥ（ＴｎｐＷＴレベルを〜１０２まで低下させる）により阻害され
ないだけではなく、ＩＥに隣接するトランスポゾンよりもＩＥ^MEトランスポゾン
を実際に優先する。ＴｎｐのＯＥへの結合はｄａｍメチル化により影響を受けな
いので、この差異は、ｄａｍ＋株とｄａｍ−株との間の転位活性における差異の
みを反映している。この減少にもかかわらず、ＴｎｐｓＣ７により促進される
、ＩＥで定義される転位の速度は、端部におけるメチル化の存在によりｄａｍ＋
株において更に高い。対照的に、端部配列のメチル化は、野生型トランスポザー
ゼによる認識を阻害する。ＩＥとＯＥとを識別する能力に基づいて、及び、ＩＥ
のメチル化に対する非感受性により、後の注目はＴｎｐｓＣ７へ向けられた。

【００１３】表１．ＴｎｐＷｔ及びＴｎｐｓＣ７のインビボ転位速度

【表１】

【００１４】個々のＴｎｐｓＣ７変異の転位活性における役割個々の変異がタンパク質活性にどのように影響しするかを理解し、タンパク質
の活性及びＩＥ^MEとＯＥとを識別する能力を最大化する努力のために、本件出願
人は、前記で注目した野生型トランスポザーゼに対して７つ変異を含むｓＣ７か
ら得た情報を使用して、更なる変異トランスポザーゼを戦略的に作成した。７つ
の変異の可能なすべての組み合わせ（１２８の可能な組み合わせ）の包括的な試
験は扱いにくいので、それぞれ７つの変異体からなる２つのクラスを操作した。
第一のクラスの各変異体においては、ｓＣ７に由来する唯一の変異を操作して、
当該変異を野生型に復帰させた。「−１（マイナス１）」変異体トランスポザー
ゼと呼ばれるこのセットは、７つの変異のうち６つを有するすべての可能な変異
体を含んでいた。第二のクラスの各変異体では、野生型トランスポザーゼを操作
して、ｓＣ７由来の７つの変異のうち１つを正確に含ませた。「＋１（プラス１
）」変異体トランスポザーゼと呼ばれるこのセットは、７つの変異のうち１つの
みを有するすべての可能な変異体を含んでいた。これらの変異タンパク質のすべ
てを、メイティング・アウトアッセイによりＩＥ^ME及びＯＥに対するインビボ転
位活性についてアッセイした。分析結果を表２に示す。表２．「−１／＋１分析」

【００１５】

【表２】

【００１６】ａ．「−１」は、示された部位を除いて、ＴｎｐｓＣ７に存在するすべての変
異を含んでいる。例えば、Ｒ８Ｃ「−１」は、部位８に野生型のアルギニンを含
んでいる。ｂ．「＋１」は、示されたアミノ酸がＴｎｐｓＣ７に存在する残基へ変異して
いる点を除いてＴｎＰＷＴである。例えば、Ｒ８Ｃ「＋１」は、アミノ酸部位
８にシステインを含んでいる。配列特異的変異変異Ｅ５８Ｖは、すべての変異の中で、ＴｎｐｓＣ７の活性に対して最も顕
著な効果を有していた。野生型バックグラウンドにおけるこの変異（Ｅ５８Ｖ「
＋１」）は、ＩＥ^ME関連転位を４００００倍に増加させたが、ＴｎｐｓＣ７か
らの変異の除去（Ｅ５８Ｖ「−１」）により、全体の活性は１０００倍を超える
程度までに低下した。この変異の影響は、ＯＥ関連活性に対しては比較的小さか
った。変異Ｅ３４４Ｋは、非常に弱いけれども、同様の配列特異的な影響を活性に対
して示した。ＴｎｐｓＣ７から除去したとき（Ｅ３４４Ｋ「−１」）、ＩＥ^ME 関連活性は５倍まで減少したが、ＯＥ関連活性は約５倍に刺激された。この結果
は、野生型バックグラウンドにおけるＥ３４４ＫはＩＥ^ME関連活性を４倍に刺激
し、かつＯＥ関連活性は約５倍に減少させる「＋１」データを反映している。配列非特異的変異変異Ｌ３７２Ｑは、ＩＥ^MEに対するＴｎＰｓＣ７活性を強く刺激した。ｓＣ
７から除去したとき、ＩＥ^ME及びＯＥ関連活性は同程度に減少した。野生型トラ
ンスポザーゼに追加したとき、その「＋１」表現型は、両方の基質についての活
性を刺激した。

【００１７】その他の変異変異Ｒ８Ｃは、残り４つの変異のなかで最も興味深いものであった。当該変異
を野生型トランスポザーゼに追加したとき、ＯＥ関連転位は、ほぼ１０倍まで減
少した。当該変異をｓＣ７から除去したとき、ＯＥ関連活性は約２倍に増強した
。宿主のメチル化において、当該変異のｓＣ７からの除去は、ＩＥ関連活性にわ
ずかに影響したが、それ自体で、ＩＥ^ME関連活性を検出可能なレベル未満へ減少
させた。残り３つの変異（Ａ１５７Ｔ、Ｔ１７１Ｓ、Ｄ２１７Ａ）のうち、当該
変異をｓＣ７から除去したときにＩＥ^ME又はＯＥ関連活性のいずれかに大きく影
響するものはなかった。これらの変異のすべての組み合わせが、ＯＥに優先する
ＩＥ^MEに対する特異性を犠牲にすることなしに、ＩＥ^ME関連活性の全体の増加を
導くか否かを決定するために、本件出願人は、三重復帰変異体だけでなく、これ
らの部位においてｓＣ７のペアの復帰を操作した。これらの変異の３つ全てを有
する構築物は、二番目に高いＩＥ^ME関連活性を有し、かつ、ＩＥ^MEとＯＥとの識
別において最高の能力を有していた（表３）。この４つの変異体構築物、Ｔｎｐ
（Ｒ８Ｃ、Ｅ５８Ｖ、Ｅ３４Ｋ、Ｌ３７２Ｑ）を、ＴｎｐｓＣ７ｖ２．０と
改名した。表３．インビボにおける、示した変異が野生型に復帰しているＴｎｐｓＣ７の
頻度（かっこ内の数は、野生型へ変化した部位を示す）

【００１８】

【表３】

【００１９】 α：ｓＣ７ｖ２．０に改名略号：ＯＥ＝外側端ＩＥ＝内側端ＩＥ^ME＝ｄａｍメチル化内側端ＴｎｐｓＣ７は、個々の変異の合計よりも少ない。ＴｎｐＥ５８Ｖ（Ｅ５
８Ｖ「＋１」）変異体は、ＴｎｐＷＴ単独に対して４×１０⁴倍増加した活性
を有している。Ｅ５８Ｖを除去した複合変異体（Ｅ５８Ｖ「−１」）は、Ｔｎｐ
ＷＴに対して１．８×１０²倍増加した活性を有している。加算性は、Ｔｎｐ
ｓＣ７が以下の活性増加を有するという予想であった。 (4×l0⁴)(1.8×l0²) = 7.2×10⁶ しかしながら、複合性変異の刺激は、実際は非常に小さい（２×１０⁵）。換
言すると、Ｅ５８Ｖをその他の変異に追加したことにより得られる増加は１．１
×１０³倍であったが、Ｅ５８Ｖを野生型バックグラウンドへ追加したことによ
る４×１０⁴倍の刺激は観察されなかった。これは、Ｅ５８Ｖ及びＥ３４４Ｋが
ともに同一過程（一次ＤＮＡ結合）を刺激するので、組み合わせたときに相加未
満になることによるものであろう。

【００２０】ＴｎｐｓＣ７ｖ２．０は、ＩＥ^MEで定義されるトランスポゾンをインビトロで効率的に転位するＴｎｐｓＣ７ｖ２．０が、ＩＥ^MEで定義されるトランスポゾンのインビト
ロでの転位を促進する能力を、ＯＥで定義されるトランスポゾンのＴｎｐＥＫ
／ＬＰによる移動について開発した条件と同一条件下で試験した（Goryshin, I.
Y., 及び Reznikoff, W.S.,"Tn5 in vitro transposition,"J. Biol. Chem. 273
: 7367-7374 (1998)（参照することにより、文献の全体が本明細書に開示されて
いるかのように組み込まれる））。適切なプラスミドｐＧＴ４（高コピー数のｐ
ＵＣ１９をベースとしたベクターであって、逆方向のＩＥ^ME端部配列がカナマイ
シン耐性遺伝子に隣接している）を、スーパーコイルモノマーとして単離した（
材料と方法の欄参照）。このプラスミドを、ＰｖｕＩＩ制限エンドヌクレアーゼ
による切断が、ドナーバックボーンＤＮＡからのトランスポゾンの遊離を引き起
こすように構築した（図５Ａ）。ＴｎｐｓＣ７ｖ２．０は、当該ヌクレオチ
ド配列を発現ベクターにクローニングし、宿主細胞中でタンパク質を発現させ、
当該タンパク質を宿主細胞由来の抽出物から単離することにより作成しかつ精製
した。これらの工程には、当業者に知られている標準的方法を使用した。ＴｎｐｓＣ７ｖ２．０とのインキュベーションにより、インキュベーショ
ン３時間後に、スーパーコイルプラスミドの６６％が転位生成物及び中間体へと
転換した。図５Ｂにおいて、レーン１は、反応を起こしていない基質ｐＧＴ４で
ある。ＴｎｐｓＣ７ｖ２．０により促進されるＩＥ^MEトランスポゾンに対す
る転位活性はレーン２に示される。レーン３は、ＰｖｕＩＩ制限エンドヌクレア
ーゼによるｐＧＴ４切断の結果である。この方法で行われる転位反応は、多数の異なるＤＮＡ生成物を導くことができ
るけれども、当該反応は、前出、Goryshin 及び Reznikoff (1998)により既に定
義されている特定の診断用断片を分析することにより解釈することができる。図
５Ｃは、図５Ｂのレーン２の複製である。バンド１は切除されたトランスポゾン
である。これは、プラスミドから二重の端部破壊（ended break）を受けたもの
であるが、鎖移動は受けていない中間体である。バンド２は、トランスポゾンの
二重端部切除のときに遊離するドナーバックボーンＤＮＡである。これらのバン
ドは、図５Ｂのレーン３に示すＰｖｕＩＩ切断の生成物と同一の分子量を有して
いる。バンド３は、１つのトランスポゾン端部で切断を受けた基質プラスミドを
表わしている。これは、直線化されたプラスミドと同一の位置に移動する（デー
タは示さず）。バンド４及び５は、２つの異なるタイプの鎖移動生成物である。
バンド４は、反応を起こしていないプラスミドへのトランスポゾンの分子間的挿
入の結果である。これにより、挿入されたトランスポゾンの長さの分、元の基質
プラスミドよりも長くなっている弛緩環状ＤＮＡを生じる。５として示されるバ
ンドは、分子内反転（intramolecular inversion）事象の結果である。これらの
転位生成物は、トランスポゾンの大きさであるが、環化されてない。これらの環
化された転位生成物は、異なる数のノード（node）を含み、それゆえゲル内の異
なる位置に移動することができる。

【００２１】構造／機能分析過剰活性Ｔｎ５トランスポザーゼ変異体ＴｎｐｓＣ７ｖ２．０は、ＩＥ^ME 隣接トランスポゾンの転位を７．４×１０⁵倍に増加させ、かつ、部位８、５８
、３４４及び３７２のアミノ酸に変異を含んでいる。ＴｎｐｓＣ７の分析によ
り、Ｅ５８Ｖ及びＥ３４４Ｋの両方により与えられる過剰活性は、トランスポゾ
ンの端部配列に依存することが明らかになった。Ｅ５８Ｖについて起こる表現型
は驚くべきことではなかった。なぜなら、ＯＥ隣接トランスポゾンを用いて以前
に行ったランダム突然変異スクリーニングでは、配列特異的活性を有し、アミノ
酸４７又はアミノ酸５４に変異を有するタンパク質の単離を引き起こしたからで
ある（Zhou 及び Reznikoff, 1997; Zhou, M., Bhasin, A., 及び Reznikoff, W
.S.,"Molecular genetic analysis of transposase-end DNA sequence recognit
ion: cooperativity of three adjacent base-pairs in specific interaction
with a mutant Tn5 transposase,"J. Mol. Biol. 276: 913-925 (1997)）。しか
しながら、アミノ酸３４４の残基がトランスポゾン端部ＤＮＡと相互作用するこ
とを示唆する、アミノ酸３４４における変異の配列特異的活性は、実際に非常に
驚くべきものであった。最近になって、あらかじめ切断した（ドナーバックボーンのない）ＯＥＤＮ
Ａと複合体を形成したＴｎｐＥＫ／ＬＰを表わすタンパク質−ＤＮＡの共同結
晶（co-crystal）が解析された。この複合体において、アミノ酸５８は、部位１
０にてＯＥと特異的に相互作用することが示された。これにより、部位１２の近
傍にある変異体の残基を、抑制について最初に選択するヌクレオチド変異に位置
付けた。部位１０、１１及び１２は、ＩＥ及びＯＥとの間ですべて異なっており
、更に、ｄａｍメチラーゼによる主溝の修飾を含む２つの領域（上部鎖の部位１
１及び下部鎖の部位１２）の内、１つの近くに存在する。更にこの構造は、アミノ酸３４４が、ＯＥの部位７においてＤＮＡと相互作用
することを示している。部位７は、ＩＥとＯＥとを区別する７つの部位の１つで
はないが、部位４と、ＩＥとＯＥとを区別するヌクレオチド１０、１１及び１２
の領域との間に存在する。それゆえ、ＴｎｐＥ３４４ＫのＩＥ及びＯＥに対す
る活性の差異は、これら２つの領域の前後関係効果（context effect）に起因す
ることが考えられる。それゆえ、本件出願人は、変異Ｅ５８Ｖ及びＥ３４４Ｋの
両方は、端部配列ＤＮＡと相互作用し、一次的配列認識のレベルでトランスポザ
ーゼ機能を変化させることを提案する。

【００２２】ロイシンからグルタミンへの変異（Ｌ３７２Ｑ）は、配列決定されたすべての
変異体（ｓＡ５、ｓＢ２、ｓＣ６、ｓＣ７及びｓＤ５）に存在するが、このこと
はよく知られていることでありかつ驚くべきことであった。この部位における過
剰活性変異は既に単離されていたためであることはよく知られていた。以前に単
離された変異は、この部位においてロイシンからプロリンへの置換（Ｌ３７２Ｐ
）を引き起こした（Weinreich ら, 1994）ので、これは驚くべきことであった。
Ｌ３７２Ｐ変異は、αヘリックス中に２つの継続的なプロリン残基を生じさせる
。共同結晶において、この変異はアミノ酸３７２〜３９０を不安定化させる。こ
の変異は、Ｃ末端の二量体化ドメインに関連して触媒ドメインのコンホメーショ
ンの変化を引き起こすことが提案される。この変化は、Ｎ末端とＣ末端との間の
距離を増加させることにより活性を改善することができる。ＴｎｐＷｔにおい
てこれらの端部が近接していることは、ＴｎｐＷＴの転位速度を減少させるも
のと考えられる（Reznikoff ら, 1999）。初期の部分的Ｔｎｐ構造において見ら
れる野生型ロイシン残基（Davies, D.R., Braam, L.M., Reznikoff, W.S. 及び
Rayent, I.,"The three-dimensional structure of a Tn5 transposase-related
protein determined to 2.9-A resolution,"J Biol Chem. 274: 11904-11913 (
1999)）は、疎水性ポケット内に埋められている。グルタミンについての置換は
、この疎水性パッケージングを不安定化するだろう。コドンにおける単一のヌク
レオチド変化のみを引き起し、かつ、この残基において５つの異なるアミノ酸置
換（メチオニン、バリン、アルギニン、プロリン又はグルタミン）を作成するこ
とができるＰＣＲをベースとするランダム変異誘発技術により単離された、２つ
の異なる過剰活性変異体が与えられる場合、より直接的な変異誘発アプローチ、
例えばコドンランダム化により、その他の興味深い変異体を明らかにすることが
できると考えられる。ＯＥ関連転位を野生型バックグラウンドのほぼ１０倍に減少させ（Ｒ８Ｃ「＋
１」）、かつ、ｓＣ７バックグラウンドから除去したときは当該転位を約２倍に
増加させる（Ｒ８Ｃ「−１」）変異Ｒ８Ｃは、容易に解釈することができない。
共同結晶学的構造では、アルギニン残基はＤＮＡ接触領域に存在していない。し
かしながら、この構造は、切断が起こった後の複合体の静止画像を表わしている
ので、この領域が初期のシナプスにおいてＤＮＡと接触している可能性がある。

【００２３】ＩＥメチル化Ｔｎ５トランスポゾンの内側端は、各端部の主溝に４つのメチル基を追加する
２つのＧＡＴＣシグナル配列を含んでいる。本研究により、本件出願人は、この
結合阻害を克服するだけではなく、メチル基が存在するトランスポゾンに優先的
に機能すると考えられる（おそらくは、増加した結合親和性によるものであろう
）、単一の変異Ｅ５８Ｖを単離することができた。更に、あらかじめ切断したＤ
ＮＡと複合体を形成するＴｎｐＥＫ／ＬＰの共同結晶構造は、グルタメート（
glutamate）５８が、主溝内で、ＯＥの部位１０と直接的に相互作用することを
示している。この領域は、ＩＥ^MEの非移動鎖のアデニンに存在するメチル基の近
傍に存在している。単一のアミノ酸変化が、表現型におけるこの極端な変化を引
き起こすことができるという事実は、トランスポザーゼのＩＥ^MEへの結合阻害の
原因となる。ＴｎｐＷＴのＩＥ^MEへの結合の阻害は、このメチル基とグルタメ
ート５８の負に荷電した側鎖との間の相互作用により引き起こされると考えられ
る。この残基のバリンによる置換は、バリン残基の側鎖とこのメチル基との間の
疎水性パッケージングにより、この不利な相互作用を除去するだけでなく、結合
親和性の増加を誘導することができる。一般的な材料及び方法培地及び試薬パピレーションアッセイは、グルコース最小ミラー培地（Miller, J., Experi
ments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold S
pring Harbor, NY. (1992)）に、アンピシリン、クロラムフェニコール、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド及びフェニル−β−
Ｄ−ガラクトシドを前出の文献（Zhou, M., & Reznikoff, W.S.）に記載される
ようにして補充したもの（Ｔｒｐ−−ＸＧ−ＰＧプレート）を使用して行った。
部位特異的変異誘発の間、形質転換後に、細胞を、the altered sites protocol
（Promega）に示されるようにしてＳＯＣ培地中で増殖させた。その他すべての
細菌の増殖は、ルリア培地（Luria Broth）（Sambrook, J., Fritsch, E.F. & M
aniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.）中で行った。必要なとき
に、抗生物質（Sigma）を以下に示す濃度で添加した。アンピシリン：１００μ
ｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール：２０μｇ／ｍｌ、ナリジクス酸：２０μｇ／
ｍｌ、ゲンタマイシン：５μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン：１５μｇ／ｍｌ。Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ４リガーゼ、ｄＮＴＰ及びth
e Altered Sites Mutagenesisキットのその他の成分はPromegaより購入した。制
限酵素は、Promega 又は New England Biolabsより購入した。部位特異的変異誘
発、ｓＰＣＲ及び配列決定に使用したオリゴヌクレオチドは、Research Genetic
sより購入した。配列決定に使用した放射性ヌクレオチドは、Amershamより入手
した。

【００２４】プラスミドの構築プラスミドｐＧＴ４を、２つの内側端により隣接するカナマイシン耐性遺伝子
を含む高コピー数プラスミドとして構築した。プラスミドは、ＰｖｕＩＩによる
消化により、そのｐＵＣベクターバックボーンからトランスポゾンが遊離するよ
うに設計した。１４のｐＲＺ９９０５（ｓＣ７）誘導体及びｐＲＺ９９０５（ｓＣ７バージ
ョン２．０）を、ｐＲＺ９９０５とｐＲＺ９９０５（ｓＣ７）との間で制限断片
を交換することにより構築した。細菌株プラスミドのクローニング及び定方向進化プロセスは、ＪＭ１０９（Promega
）中で行った。部位特異的変異誘発プロトコールでは、ＥＳ１３０１（Promega
）及びＪＭ１０９を使用した。メイティング・アウトアッセイにおいて、トラン
スポザーゼプラスミドで株ＲＺ２１２[Δ(lac-proA,B), ara, str, recA56, srl
, thi/pOX38-Gen]を形質転換し、続いて１４Ｒ５２５[F-nalr]へコンジュゲート
した。定方向進化プロセスＴｎ５トランスポザーゼの定方向進化は、基本的に文献（Stemmer (1994)）に
記載されるようにしてｓＰＣＲにより行った。４０μｌ（〜４μｇ）のｐＲＺ９
９０５ミニプレップ（mini prep）（Wizard SV preps, Promega）を、１００ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．０）、５ｎＭＭｇＣｌ及び９０ｎｇのＤＮ
ａｓｅＩを含む５０μｌ容量中で部分消化した。室温下で７分間インキュベート
した後、ＥＤＴＡを１０ｍＭ添加することにより反応を停止させた。ローディン
グ色素（loading dye）（Sambrook ら, 1989）を添加した後、消化したＤＮＡを
２％ｐＧＥＭＤＮＡマーカー（Promega）の次に、ＮｕＳｉｅｖｅゲル（FMC
BioProducts）中での電気泳動に付した。大きさ２００〜６００ｂｐのＤＮＡ断
片を含むゲル切片及び大きさ６００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を含む第二の切
片を、ゲルから切除した。これら２つの切片由来のＤＮＡを、フェノールクロロ
ホルム抽出（Sambrook ら, 1989）により別々に精製した。エタノール沈澱後、
ＤＮＡペレットを乾燥し、５０μｌのアセンブリ（assembly）反応混合物中へ直
接再懸濁させた。アセンブリ混合物は、０．２ｍＭｄＮＴＰ、２．０ｍＭＭ
ｇＣｌ、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０（２５℃
））及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んでいた。０．５ユニットのＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼを添加した後、ＤＮＡを、以下の熱サイクルプログラム
：９４℃で３０秒間；９４℃で２０秒間、６５℃で１分間及び７２℃で２分間の
サイクルを５０回；及び４℃までの冷却により再アセンブルした。ＤＮＡ鋳型と
して５μｌのアセンブリ反応生成物を使用した、標準的ＰＣＲ増幅反応を各サン
プル（２００〜６００ｂｐ及び６００〜１０００ｂｐ）について行い、トランス
ポザーゼ遺伝子を増幅させた。このトランスポザーゼコード断片を消化して、Ａ
ｆＩＩＩ／ＢｇＩＩＩを用いて完成し、ｐＲＺ９９０５由来のＡｆＩＩＩ／Ｂｇ
ＩＩＩ消化ベクターＤＮＡに結合した。

【００２５】連結生成物で、プラスミドｐＲＺ９９０４（ＩＥ１２Ａ／ＩＥ１２Ａ）を含む
エレクトロコンピテント（electrocompetent）ＪＭ１０９細胞を形質転換した。
増殖後、細胞を、クロラムフェニコール及びアンピシリン選択と共にＴｒｐ−−
ＸＧ−ＰＧプレートへ撒いた。プレートを３２℃で１４日間インキュベートした
。このとき、少なくとも１つのパピラーエを示したすべてのコロニーに由来する
ｐＲＺ９９０５プラスミドＤＮＡを単離し、パピレーションアッセイを再形質転
換して、パピレーション＋表現型を確認した。（スクリーニングした２００００
のオリジナルコロニーのうち）総数５のｐＲＺ９９０５誘導体が、パピレーショ
ン＋であることを確認した。全５つのプラスミドの等量を、第二ラウンドの変異
誘発及びスクリーニングのための基質として使用した。このプロセスを、全４ラ
ウンドのスクリーニングについて繰り返した（〜２００００コロニー／ラウンド
）。定量的パピレーションアッセイＴｎｐＷＴ、ＴｎｐｓＡ５、ＴｎｐｓＢ２、ＴｎｐｓＣ６及びＴｎｐ
ｓＤ５のＩＥ１２Ａインビボ転位活性を、定量的パピレーションアッセイによ
り比較した。プラスミドｐＲＺ９９０４（ＩＥ１２Ａ／ＩＥ１２Ａ）を有する株
ＪＭ１０９のコンピテント細胞を、ｐＲＺ９９０５の適切なトランスポザーゼコ
ードバージョンで形質転換した。増殖後、形質転換細胞を、クロラムフェニコー
ル及びアンピシリンを有するＴｒｐ−−ＸＧ−ＰＧプレートに撒いた。コロニー
が現れ始めるまで（〜１８時間）、プレートを３２℃で維持し、増殖させた。個
々のコロニーを、殺菌したスティックで選び、４×４の格子パターン内の新鮮な
プレート上にスポット（spot）し、すべてのコロニーの間隔を均等にした。１６
コロニーからなる１つのプレートを、各タンパク質についてスポットした。プレ
ートを３２℃でインキュベートし、２４時間間隔でパピラーエの出現を観察する
ことにより転位について定量した。データは、コロニーあたりに存在するパピラ
ーエの平均数として表わした。

【００２６】メイティング・アウトアッセイメイティング・アウトアッセイは、既報（Yin ら, 1988; Goryshin ら, 1994
）に記載されるようにして行った。プラスミドｐＦＭＡ５２−１８７（２つのＯ
Ｅ又は２つのＩＥのいずれかを有する）及びＦ因子ｐｏｘ−Ｇｅｎを含むトラン
スポゾンを有する細菌を、適切なトランスポザーゼをコードするプラスミドｐＲ
Ｚ９９０５で形質転換した。ライブラリーのスクリーニングに使用したドナーは
、ＪＣＭ１０１[ΔlacZX74, raps, dam-3]であった。その他すべてのメイティン
グ・アウトは、大腸菌ＲＺ２１２株[Δ(lac-proA, B), ara, str, recA56, srl,
thi]にて行った。使用したレシピエント株は１４Ｒ５２５[F-nalr]であった。
総数３のアッセイを、トランスポザーゼと端部配列の各組み合わせについて行っ
た。報告される値は、これら３つのデータポイントの平均値である。インビトロ転位アッセイ基質プラスミドｐＧＴ４を、qiafilter plasmid mega kit（Qiagen）を使用し
て、ＤＨ５α細胞から単離した。スーパーコイルモノマープラスミドは、qiaqui
ck gel purification kit（Qiagen）を使用して１％アガロースゲルから単離
した。反応を、Reznikoff 及び Goryshin (1998)により決定された条件下、３７
℃で行った。ｐＧＴ４の濃度は３５．５ｎＭであった。ＴｎｐｓＣ７ｖ２．
０を、濃度２８０ｎＭまで添加した。前述の記載は、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。本発明
は、請求の範囲内にあるすべての改変及び修飾を含むものとして理解されるべき
である。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｔｎ５トランスポザーゼの構造並びにＴｎ５外側端（ＯＥ）、内側端
（ＩＥ）、メチル化内側端（ＩＥ^ME）及び修飾ＩＥ（ＩＥ１２Ａ）のヌクレオチ
ド配列を示している。

【図２】図２は、インビボでの転位を観察するためのパピレーションアッセイについて
の分子的な概略図である。

【図３Ａ】図３Ａは、変異誘発／組替えの連続４ラウンド（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）において観
察された変異の位置を示している。

【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａの各変異体のインビボ転位プロフィールを示している。

【図４】図４は、大腸菌ｄａｍ−株におけるＯＥ及びＩＥについての連続ラウンドの変
異誘発／組替えにおいて得られた、変異体トランスポザーゼの相対的優先性を示
している。

【図５Ａ】図５Ａは、インビトロ転位法における使用に適切なプラスミドを示している。

【図５Ｂ】図５Ｂは、インビトロで転位を触媒する本発明の変異トランスポザーゼを使用
して得られた、転位生成物を示している。

【図５Ｃ】図５Ｃは、図５Ｂのレーン２の生成物を更に特徴付けたものである。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年４月１０日（２００２．４．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項９

【補正方法】変更

【補正の内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ナウマントッドエイアメリカ合衆国ウィスコンシン州 53705 マディソンイーグルハイツ 608 アパートメントディーＦターム(参考） 4B024 AA20 BA10 CA02 DA06 GA25 HA01 4B050 CC03

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】野生型Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質に対して修飾され
た変異体Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質であって、該変異体トランスポザーゼは、アミノ酸５８及びアミノ酸３７２からなる群よ
り選ばれる部位において、該野生型タンパク質とは異なっており、該変異Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質はＴｎ５外側端よりもＴｎ５内側端
に優先性を有する、ことを特徴とする変異体Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質。
【請求項２】アミノ酸部位５８にバリンを含む、請求項１に記載の変異体
Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項３】アミノ酸部位３７２に変異を含む、請求項１に記載の変異体
Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項４】アミノ酸部位３７２にグルタミンを含む、請求項１に記載の
変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項５】前記変異体トランスポザーゼが、アミノ酸５８及び３７２に
おいて野生型タンパク質とは異なっている、請求項１に記載の変異体Ｔｎ５トラ
ンスポザーゼ。
【請求項６】アミノ酸部位５８にバリン及びアミノ酸部位３７２にグルタ
ミンを含む、請求項１に記載の変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項７】更に、アミノ酸８及びアミノ酸３４４からなる群より選ばれ
る部位において野生型タンパク質とは異なっている、請求項１に記載の変異体Ｔ
ｎ５トランスポザーゼ。
【請求項８】部位８のアミノ酸がシステインである、請求項７に記載の変
異体Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項９】部位３４４のアミノ酸がシステインである、請求項７に記載
の変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項１０】前記変異体トランスポザーゼが、アミノ酸部位８及びアミ
ノ酸部位３４４において野生型トランスポザーゼとは異なっている、請求項７に
記載の変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項１１】アミノ酸部位８にシステイン及びアミノ酸部位３４４にリ
ジンを含んでいる、請求項１に記載の変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項１２】アミノ酸部位８にシステイン、アミノ酸部位５８にバリン
、アミノ酸部位３４４にリジン及びアミノ酸部位３７２にグルタミンを含む、請
求項１に記載の変異体Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項１３】請求項１に記載のトランスポザーゼをコードするポリヌク
レオチド。
【請求項１４】請求項１２に記載のトランスポザーゼをコードするポリヌ
クレオチド。
【請求項１５】インビトロで転位可能なＤＮＡ配列を転位するためのシス
テムであって、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対して修飾された請求項１に記載の変異体Ｔ
ｎ５トランスポザーゼ、該転位可能なＤＮＡ配列を含むドナーＤＮＡであって、該ＤＮＡ配列が、その
５’及び３’末端において野生型ＩＥ配列により隣接されているＤＮＡ、及び、転位可能な要素が転位することができる標的ＤＮＡ分子、を含むことを特徴とするシステム。
【請求項１６】前記ＩＥ配列がメチル化されている、請求項１５に記載の
システム。
【請求項１７】インビトロ転位方法であって、興味の対象となる転位可能なＤＮＡ配列を含むドナーＤＮＡ分子であって、該
ＤＮＡ配列がその５’及び３’末端において野生型Ｔｎ５ＩＥ配列により隣接
されているＤＮＡ分子と、標的ＤＮＡ分子及び請求項１に記載の変異体Ｔｎ５ト
ランスポザーゼとを、適切な反応緩衝液中、生理学的温度未満の温度下で、該修
飾トランスポザーゼが該ＩＥ配列に結合するまで組み合わせる工程、及び、該酵素がインビトロ転位を触媒するのに十分な期間、生理学的温度まで温度を
上昇させる工程、を含むことを特徴とする方法。