CN103602654B - 人工改造的高活性Mariner-Like转座酶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Mariner-Like转座酶，本发明将毛竹中克隆到的活性转座酶和对其进行分子优化之后获得较高活性的植物MLE转座酶，为利用MLE转座子开发基因标签奠定了基础，为后基因组时代大规模分离和标记基因功能提供了有力保障。

Description

人工改造的高活性Mariner-Like转座酶
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体而言，涉及几种高活性Mariner-Like转座酶。
背景技术
转座子(transposon)是指在基因组上能从一个位点转移到另一个位点的一段DNA序列。自20世纪40年代美国遗传学家McClintock首先在玉米中发现转座子(Ac/Ds)以来，科学家们发现了多种类型的转座子，它们广泛存在于细菌、酵母和高等动植物中。随着人们在分子水平上对转座子结构和功能认识的不断深化，一些转座子已被改造为基因标签应用于基因分析，并逐渐成为大规模分离植物基因的重要手段之一。
Mariner-Like转座子(Mariner-LikeElements,MLE)是转座子中一个重要家族，最早是在研究毛里塔尼亚果蝇(Drosophilamauristiana)白眼基因的一个不稳定突变时发现的。此后在其他动物以及植物基因组中也发现了大量MLE转座子的存在。与其它转座子相比较，MLE转座子具有结构简单、异源转座率高、在基因组插入位点接近随机等特点，使其在开发基因标签，分离基因，研究基因功能上，远远优于其他转座子。
MLE转座子由两端反向重复序列(TerminalInvertedRepeats,TIRs)和编码转座酶的基因组成，转座酶负责催化转座子转座，因此转座酶的活性是影响转座子的转座频率的主要因素。MLE转座子具有结构简单、异源转座率高、在基因组插入位点接近随机等特点使其在开发基因标签，分离基因，研究基因功能上，远远优于其他转座子。然而自然界分离的MLE转座酶由于在进化过程中“垂直失活”效应积累了或多或少的突变，部分或全部丧失了催化转座能力，成为低活性或非活性的转座酶，严重影响了MLE转座子的应用，因此人工构建高活性的转座酶就显得十分重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种高活性Mariner-Like转座酶，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种Mariner-Like转座酶，其特征在于所述的Mariner-Like转座酶的氨基酸序列为SEQIDNO.3或者SEQIDNO.3定点突变所得到的序列，所述的定点突变是指E65A，G68F，P70V，G73R，E75V，D76Q，A78I，P79W，A83K，A106R，F243R，T253D，T272R和/或N289R。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的Mariner-Like转座酶的氨基酸序列为SEQIDNO.5所表示的氨基酸序列在S253D和E75V同时定点突变的氨基酸序列，以及SEQIDNO.6所表示的氨基酸序列在E75V定点突变的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，本发明还涉及上述Mariner-Like转座酶所对应的核苷酸。
在本发明的另一方面，本发明还涉及一种Mariner-Like转座子，其特征在于所述的Mariner-Like转座子包括上述核苷酸序列。
在本发明的一个方面，所述的Mariner-Like转座子的基因序列为SEQIDNO.1。
本发明将毛竹中克隆到的高活性转座酶或对其进行分子优化之后获得较高活性的植物MLE转座酶，为利用MLE转座子开发基因标签奠定了基础，为后基因组时代大规模分离和标记基因功能提供了有力保障。
附图说明
图1MLE转座酶表达载体的构建流程图：MLE转座酶插入到表达载体pAG413-gal-ccdB中NotI和EcoRV两个酶切位点之间，得到重组质粒pAG413-gal-Tpase(Tpase表示转座酶)。MLE转座酶由GAL1启动子控制。载体上同时含有抗生素筛选标记基因氨苄霉素(Ampicillin)和组氨酸His筛选标记基因；
图2MLE非自主转座子供体载体的构建流程图：Ppmar2的非自主性转座子插入到pWL89a载体的HpaI酶切位点上，得到非自主转座子供体载体pWL89a-Tn(Tn表示非自主性转座子)。载体上同时含有抗生素筛选标记基因氨苄霉素(Ampicillin)和尿素(Ura)筛选标记基因，分别由相应的启动子启动。载体上还含有腺嘌呤(ADE2)标记基因，非自主性转座子刚好插在ADE基因内部的HpaI酶切位点上使该基因失活，若非自主性转座子转座离开可使ADE2基因恢复表达。
具体实施方式
下面结合具体实施步骤进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非特别指出，下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook.等主编的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照试剂盒陈述的步骤进行操作。
一、野生型MLE转座酶和去除转座酶的非自主性转座子的获得
以新鲜的毛竹叶片(Phyllostachyspubescens，采集于浙江农林大学植物园，北纬N30°15′14.67″东经E119°43′33.47″)为材料，采用CTAB法提取毛竹基因组DNA,根据MLE转座子TIR保守序列设计引物(Ppmar2-5-3，序列详细信息见表1)，用该引物在毛竹基因组中扩增得到MLE转座子的全长Ppmar2(Ppmar2序列见SEQ.NO.1)，连接到pGEM-TVector(Promega公司)克隆测序。经NetGene2和GenScan生物信息学软件预测转座酶的内含子和外显子，将外显子拼接，得到剔除内含子的转座酶编码序列。Ppmar2转座酶核苷酸序列和相应的氨基酸序列分别见SEQ.NO.2和SEQ.NO.3。
将含有毛竹Ppmar2全长序列的pGEM-T载体用HinfI切除Ppmar2中间转座酶的大部分序列，再将载体自连后分别得到Ppmar2的非自主性转座子(pGEM-Ppmar2-Tn)。Ppmar2的非自主性转座子序列见SEQ.NO.4。
二、酵母转座表达载体的构建
1.MLE转座酶表达载体的构建
用酶切位点修饰的引物(PpTpase2-5和PpTpase2-3，序列详细信息见表1)扩增拼接后的Ppmar2转座酶。分别将Ppmar2转座酶扩增序列和pAG3-gal-ccdB载体经NotI和EcoRV双酶切后，将转座酶酶切产物和pAG413-gal-ccdB载体大片段相连，即转座酶替换pAG413-gal-ccdB载体中的ccdB，得到重组载体pAG413-gal-Tpase(Tpase表示转座酶)，流程图见图1。该载体具有His(组氨酸)筛选标记，使导入pAG413-gal-Tpase载体的宿主能够缺乏His的缺失培养基上生长。
2.MLE非自主转座子供体载体的构建
以pGEM-Ppmar2-Tn为模板，利用Ppmar2-5-3引物扩增Ppmar2的非自主性转座子，同时将载体pWL89a用HpaI酶切(酶切位点位于ADE2基因内)，回收载体骨架。然后用In-FusionAdvantagePCRCloningKit(TaKaRa公司，日本)将非自主性转座子插入到载体pWL89a的ADE2基因中，导致报告基因ADE2插入失活，得到pWL89a-Tn(Tn表示非自主性转座子)，载体构建流程请见图2。若转座子发生转座从ADE2基因上离开，那么ADE2基因阅读框得到回复。该载体具有URA3筛选标记，使导入pWL89a-Tn的宿主能够在缺乏Ura(尿素)的缺失培养基上生长。
三、共转化酵母和诱导转座
将pAG413-gal-Tpase重组质粒和pWL89a-Tn重组质粒，用PEG/LiAc法共同转化到酵母中，用His/Ura双缺固体培养基上进行选择培养。用半乳糖诱导转座酶表达，促使非自主转座子发生转座。
四、定点突变MLE转座酶
根据Ppmar2转座酶与其他植物MLE转座酶进行同源性比对，选取转座酶关键位点的氨基酸进行突变。Ppmar2转座酶确定了14个氨基酸突变位点，它们分别是：E65A，G68F，P70V，G73R，E75V，D76Q，A78I，P79W，A83K，A106R，F243R，T253D，T272R，N289R。
按照QuikChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene公司，美国)试剂盒说明书，设计定点突变引物(序列详细信息见表1)，以pAG413-gal-Tpase为模板，利用PfuTurboTMDNApolymerase重新合成DNA。然后在合成产物中加入2μL的DpnI限制性内切酶，于37℃条件下反应5min，将原始模板序列彻底降解。将酶切后的合成产物转化大肠杆菌DH5α，对转化子进行菌落PCR验证，并提取质粒测序，对测序正确的质粒保藏备用。
五、转座酶活性的检测和高活性毛竹MLE转座子的筛选
经诱导培养的酵母在缺失His/Ura/Ade固体培养基上进行筛选培养，计算培养基上长出的酵母菌斑。如果转座发生，酵母携带质粒pWL89a-Tn上的ADE2基因就能表达，因此阳性酵母株能够在缺乏腺嘌呤的培养基上生长，通过公式(转座频率＝阳性菌落数/总菌数)就能计算出MLE转座子的转座频率。以野生型Ppmar2转座酶为对照，比较各转座酶突变株的酵母菌落数目，筛选出较高活性的转座酶突变株。
分析Ppmar2转座酶14个突变位点中，在G73R，E75V，F243R和T253D突变的转座酶在催化转座能力均有不同程度的提高，将G68F和E83K两个突变位点组合起来，转座酶在催化转座能力提高到原来的198％，将T253D和E75V两个突变位点组合起来，转座酶在催化转座能力提高到原来的322％活性(表2)。这些高活性人工改造的转座酶将为利用MLE转座子开发基因标签奠定了重要基础。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种Mariner-Like转座酶，所述的Mariner-Like转座酶的氨基酸序列为分别为SEQIDNO.5或SEQIDNO.6。
2.权利要求1所述的Mariner-Like转座酶所对应的核苷酸序列。
3.一种Mariner-Like转座子，其特征在于所述的Mariner-Like转座子包括权利要求2所述的核苷酸序列。
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