CN105567865A - 与日本囊对虾耐热性相关的snp标记及其检测方法 - Google Patents

Abstract

与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记及其检测方法，涉及水产养殖中的虾类耐热群体的检测。首先利用直接测序法提供一种与日本囊对虾热耐受性相关的SNP标记，所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记是核酸序列为SEQ？ID？NO.1的HSP60基因的第3289位点，其碱基为A或G。检测方法：日本囊对虾耐热性实验步骤；热耐受值的计算步骤；利用PCR-RFLP技术进行基因分型步骤；不同基因型日本囊对虾个体热耐受性分析步骤。利用直接测序法、PCR-RFLP法给出MjHSP60基因多态性，并对SNP多态性与日本囊对虾热耐受性进行关联分析，为筛选耐高温的SNP分子标记，开展日本囊对虾耐热品系的分子育种提供理论参考。

Description

与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记及其检测方法

技术领域

本发明涉及水产养殖中的虾类耐热群体的检测，尤其是涉及一种与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记及其检测方法。

背景技术

日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)的英文名为Kurumashrimp，俗称斑节虾、竹节虾、花尾虾、蓝尾虾，是中国海水虾类养殖的重要种类。日本囊对虾属亚热带种类，最适温度范围为25～30℃，在8～10℃停止摄食,5℃以下死亡,高于32℃生活不正常。日本囊对虾的养殖受温度影响明显，超过一定的水温临界值，会造成较大面积死亡，在南方地区夏季高温养殖受限。近年来,为了提高日本囊对虾的生长速度和养殖效率,已有养殖户尝试在高温后期适当提前放苗,但目前缺少耐高温性状的评价方法以及高温养殖的技术标准,提前放苗的养殖结果很不稳定。因此亟需深入了解日本囊对虾的耐高温性状,为南方地区的高温季节养殖和耐高温品系的选育积累生物学资料。

国内外关于虾类的耐温研究见于南极磷虾、罗氏沼虾、中国对虾等，开展了温度对虾类代谢率、临界温度、耗氧率等影响的研究。在日本囊对虾方面，有学者报道了温度对消化酶活性、生长和成活率(江敏,臧维玲.温度对日本对虾幼虾生长与耗氧的影响[J].渔业现代化,2002(3):14-16.)的影响以及成虾和仔虾(李润寅,陈介康,姜洪亮,等.日本对虾仔虾的温度适宜性实验研究[J].水产科学,2001,20(3):17-18)对温度适应性的差异。单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphisms，SNP)即指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，作为第三代分子标记，具有数量众多、分布广泛、遗传稳定性更高、分型方法简易等优势，已经在育种领域具有十分重要的应用价值。在水产动物中研究人员筛选了一系列跟生长、抗病、抗逆相关的SNP分子标记。在日本囊对虾耐热方面的研究中，很少有耐热相关SNP筛选与检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记及其检测方法。

本发明首先利用直接测序法提供一种与日本囊对虾热耐受性相关的SNP标记，所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记是核酸序列为SEQIDNO.1的HSP60基因的第3289位点，其碱基为A或G。

本发明还提供一种聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(Polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)检测方法，对直接测序法得到的MjHSP60基因3289A/G进行检测，确定该位点与热耐受性状的相关性。

用于PCR-RFLP检测的引物，其上下游序列分别为：

HSP60NF5：CCGTGGCTACATCTCGC；

HSP60NR5：TCTTCAAGCGGTTCACTACA。

与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，包括以下步骤：

1)日本囊对虾耐热性实验步骤；

2)热耐受值(Upperthermaltolerance,UTT)的计算步骤；

3)利用PCR-RFLP技术进行基因分型步骤；

4)不同基因型日本囊对虾个体热耐受性分析步骤。

在步骤1)中，所述日本囊对虾耐热性实验步骤如下：

将日本囊对虾在33℃水体中暂养1d后，以1℃/2h的速率升温直至所有对虾死亡，找出38℃为死亡率较高拐点；以33℃为初始温度，选取经1d暂养正常的个体放入实验池，以1℃/2h的速率升温至38℃；38℃之后以0.5℃/4h的速率升温直至所有日本囊对虾死亡；实验中保持充气，以确保水池中各个部位温度同步；对虾死亡标准为对虾背部朝下倒于水体无法恢复正常的姿势或躯体始终保持90°弯曲；记录死亡时间、死亡温度、体重，然后装入封口袋中，以供实验结束后保存样品，保证每10min捞取一次死虾并做好记录，当池子中对虾死亡总数达到100％时结束耐热实验。

在步骤2)中，所述热耐受值(Upperthermaltolerance,UTT)的计算按以下公式：

$UTT=\underset{i=1}{\overset{k}{\Σ}}(T_i-T_0)$

式中，i为分钟数，T_i为在第i分钟的温度，T₀为实验初始温度33℃，k为个体存活的分钟数。

在步骤3)中，所述利用PCR-RFLP技术进行基因分型的具体方法可为：

a)随机选取40～80尾体重在2.3～3.3g之间的已获得热耐受性状评定指标UTT值的日本囊对虾，取每尾虾的背部肌肉，置于无水乙醇中，-20℃保存，用于基因组DNA的提取。提取基因组DNA后，利用特异性引物HSP60F5和HSP60R5进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶BstXⅠ酶切，根据酶切后电泳条带确定不同的基因型。酶切体系如下：

反应条件：37℃水浴，15min；

b)利用PCR-RFLP方法对SNP标记3289A/G进行分型，经BstXⅠ酶切后，3289A型等位基因产生长度分别为333bp和68bp的两种片段，而3289G由于不能为BstXⅠ酶所识别，基因片段长度仍为401bp；酶切产物经1.5％电泳检测后，发现存在2种基因型：3289AA基因型和3289AG基因型。

在步骤4)中，所述不同基因型日本囊对虾个体热耐受性分析的具体方法为：

对具不同基因型的日本囊对虾个体(2.3～3.3g)进行热耐受性方差分析对比。

本发明利用直接测序法、PCR-RFLP法给出MjHSP60基因多态性，并对SNP多态性与日本囊对虾热耐受性进行关联分析，为筛选耐高温的SNP分子标记，开展日本囊对虾耐热品系的分子育种提供理论参考。

附图说明

图1为日本囊对虾及拟穴青蟹HSP60基因组织结构图对比。在图1中，方框代表外显子，直线代表内含子。

图2为位点3289A/G不同基因型电泳结果图。

具体实施方式

本发明根据日本囊对虾MjHSP60mRNA(GenBank登录号：JQ972715.1)和拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)HSP60基因全序列(GenBank登录号:JX262230.1)，在相邻外显子两端设计引物，最后利用交叉引物验证是否有未扩出的内含子。通过对所有扩增片段的重叠比对和拼接获得MjHSP60基因。该基因DNA全长4637bp，共含8个外显子和7个内含子，其中ORF长度为1740bp，编码579个氨基酸。

本发明根据MjHSP60基因SNP多态性与日本囊对虾热耐受性的相关性，初步筛选出第3289位点，其碱基为A或G。并利用PCR-RFLP技术对其验证，其结果可为日本囊对虾耐热遗传育种奠定基础。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：日本囊对虾HSP60基因cDNA和DNA序列克隆，包括以下步骤：

1)日本囊对虾肌肉DNA的提取；

2)HSP60基因内含子的扩增；

3)获得MjHSP60目的基因全长序列。

在步骤1)中，所述日本囊对虾肌肉DNA的提取的具体方法可为：用酚/氯仿抽提，再琼脂糖TBE凝胶电泳检测DNA。

在步骤2)中，所述HSP60基因内含子的扩增的具体方法可为：

a)引物设计

根据日本囊对虾MjHSP60mRNA(GenBank登录号：JQ972715.1)和拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)HSP60基因全序列(GenBank登录号:JX262230.1)，在相邻外显子两端设计引物，最后利用交叉引物验证是否有未扩出的内含子。MjHSP60内含子扩增所用引物序列如表1所示。

表1

b)PCR扩增,反应体系如下：

c)PCR扩增程序：①95℃5min；②30个循环:94℃30sec，退火温度30sec，72℃30sec；③72℃10min；④4℃Pause。注：PCR扩增根据不同的引物分别设置相应的退火温度。取5μLPCR加样于1.5％琼脂糖凝胶，在0.5×TBE的缓冲体系中以160V电压进行电泳，30min后，通过凝胶成像系统观察拍照，查看目的条带。

d)PCR产物的回收和纯化、感受态细胞的制备、目的片段与pMD19-TVector连接、重组质粒的转化；

e)重组子的PCR鉴定与序列测定

每个目的片段的克隆平板随机挑取8个菌落，分别置于含有Amp(100μg/mL)的700μLLB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养4h，以每管菌液作为模板，采用pMD19-T通用引物进行PCR扩增鉴定。反应体系如下：

f)PCR扩增程序：①95℃5min；②30个循环:94℃30sec，55℃30sec，72℃1min；③72℃10min；④4℃Pause。PCR检测阳性菌液送交华大基因公司进行测序，通过对所有扩增片段和引物序列的重叠比对和拼接获得MjHSP60基因编码区全长序列。

在步骤3)中，所述获得MjHSP60目的基因全长序列的具体方法可为：

通过对所有扩增片段的重叠比对、拼接获得MjHSP60基因编码区全长序列(参见图1)。该基因共含8个外显子和7个内含子，其基因组织结构图与拟穴青蟹较为一致，从图1中可以看出，二者的外显子分布和大小几乎一致，对两者外显子进行BLAST比对发现相似度达94％，而内含子差异较大。

实施例2：日本囊对虾HSP60基因中与耐热性相关SNP标记的筛选，包括步骤如下：

1)实验对虾

基因组DNA的提取(同上)

2)不同群体日本囊对虾MjHSP60基因SNP检测

a)利用直接测序法进行SNP的筛选

根据获得的MjHSP60基因编码区全长序列共设计7对引物(MjHSP60基因SNP检测所用引物序列如表2所示)，尽量覆盖该基因全长。实验对虾包括4个地理群体：澎湖(PH),诏安(ZA),北海(BH),三亚(SY)各30尾，通过观察其头胸甲侧部斜纹全延伸与否发现，诏安、澎湖为形态变异类型Ⅰ群体(热敏感群体)，北海、三亚为形态变异类型Ⅱ群体(耐热群体)。提取每尾虾的背部肌肉基因组DNA后，利用基因特异性引物进行PCR扩增基因序列，将扩增产物纯化后进行测序分析，根据测序峰图的不同确定不同的基因型。

表2

b)选取测序峰图良好的MjHSP60基因各段序列，用VectorNTISuite11.0对其进行对比分析，寻找SNP位点。外显子多态性位点所在区域用PrimerPremier5.0软件进行翻译，鉴定同义突变和非同义突变(MjHSP60基因外显子区非同义突变统计如表3所示)。在MjHSP60基因组序列中筛选得到第3289位点，其碱基为A或G。

表3

c)利用SHEsis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)对多态性位点进行哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinbergequilibrium,HWE)检验，分析多态位点与日本囊对虾热耐受性的相关性，并检测多态性位点之间的连锁不平衡性，差异显著水平为P<0.05，极显著水平为P<0.01。

d)MjHSP60基因第3289SNP标记与日本囊对虾热耐受性的相关性

在对MjHSP60基因第3289SNP标记进行HWE检测后发现(MjHSP60基因SNP的等位基因和基因型在不同群体中的分布如表4所示)，该位点在两个群体中的分布符合HWE。对其不同等位基因及基因型在2种形态变异类型中的分布频率进行统计分析表明：该位点不同等位基因及基因型在2种形态变异类型中的分布差异显著，因此MjHSP60基因的第3289SNP标记与日本囊对虾热耐受性相关。

表4

实施例3：热耐受性相关SNP标记的检测方法，包括步骤如下：

1)实验材料准备；

2)利用PCR-RFLP技术进行基因分型；

3)不同基因型日本囊对虾个体热耐受性分析。

在步骤1)中，所述实验材料准备具体步骤为：

a)日本囊对虾耐热性实验

升温实验设在5m²的水泥池中，升温方法借鉴刘宝锁等(刘宝锁,张天时,孔杰,等.大菱鲆生长和耐高温性状的遗传参数估计[J].水产学报,2011,35(11):1601-1606)并加以改进。在正式实验之前首先进行了预实验，日本囊对虾在33℃水体中暂养1d后，以1℃/2h的速率升温直至所有对虾死亡，找出38℃为死亡率较高拐点。正式实验以33℃为初始温度，选取经1d暂养正常的个体放入实验池，以1℃/2h的速率升温至38℃；38℃之后以0.5℃/4h的速率升温直至所有对虾死亡。水温采用精确度为0.1℃的温控加热器进行控制，实验中保持充气，以确保水池中各个部位温度同步。对虾死亡标准为机体失去运动平衡能力(FryEJ.Theeffectsofenvironmentalfactorsonthephysiologyoffish[J],FishPhysiology,1971,6:1-98)，本发明具体标准为对虾背部朝下倒于水体无法恢复正常的姿势或躯体始终保持90°弯曲(NelonD.H,HooperD.K.ThermaltoleranceandpreferenceofthefreshwatershrimpPalaemoneteskadiakensis[J].ThermalBiology,1982(7):183-187)。记录死亡时间、死亡温度、体重，然后装入事先标记好的封口袋中，以供实验结束后保存样品，保证每10min捞取一次死虾并做好记录，当池子中对虾死亡总数达到100％时结束耐热实验。

b)热耐受值(Upperthermaltolerance,UTT)的计算

$UTT=\underset{i=1}{\overset{k}{\&Sigma;}}(T_i-T_0)$

式中，i为分钟数，T_i为在第i分钟的温度，T₀为实验初始温度33℃，k为个体存活的分钟数。

在步骤2)中，所述利用PCR-RFLP技术进行基因分型的具体方法可为：

a)随机选取60尾体重在2.3～3.3g之间的日本囊对虾(已获得热耐受性状评定指标UTT值)，取每尾虾的背部肌肉，置于无水乙醇中，-20℃保存，用于基因组DNA的提取。提取基因组DNA后，利用特异性引物HSP60F5和HSP60R5(表2)进行PCR扩增(步骤同实施例1)，扩增产物经限制性内切酶BstXⅠ酶切，根据酶切后电泳条带确定不同的基因型。酶切体系如下：

反应条件：37℃水浴，15min。

b)利用PCR-RFLP方法对SNP标记3289A/G进行分型，经BstXⅠ酶切后，3289A型等位基因产生长度分别为333bp和68bp的两种片段，而3289G由于不能为BstXⅠ酶所识别，所以基因片段长度仍为401bp。酶切产物经1.5％电泳检测后，发现存在2种基因型：3289AA基因型和3289AG基因型，该结果与直接测序法结果一致。

在步骤3)中，所述不同基因型日本囊对虾个体热耐受性分析的具体方法为：

对不同基因型日本囊对虾个体热耐受性进行方差分析，不同基因型日本囊对虾热耐受性状方差分析结果见表5，可以看出不同基因型日本囊对虾个体UTT值差异显著(P<0.05)。对具不同基因型的日本囊对虾个体(2.3～3.3g)进行热耐受性对比，两种基因型个体的UTT值描述性统计量见表6。

表5

表6

从表6中可以看出，具有基因型AA的个体平均UTT值高于AG型个体。该结果与表4中的结果相一致，即3289AA在热耐受性较强的VarietyII群体中的分布频率显著高于VarietyI群体。

Claims (7)

1.与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记，其特征在于其核酸序列为SEQIDNO.1的HSP60基因的第3289位点，其碱基为A或G。

2.聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性检测方法，其特征在于对直接测序法得到的MjHSP60基因3289A/G进行检测，确定该位点与热耐受性状的相关性；

用于PCR-RFLP检测的引物，其上下游序列分别为：

HSP60NF5：CCGTGGCTACATCTCGC；

HSP60NR5：TCTTCAAGCGGTTCACTACA。

3.如权利要求1所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)日本囊对虾耐热性实验步骤；

2)热耐受值的计算步骤；

3)利用PCR-RFLP技术进行基因分型步骤；

4)不同基因型日本囊对虾个体热耐受性分析步骤。

4.如权利要求3所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述日本囊对虾耐热性实验步骤如下：

将日本囊对虾在33℃水体中暂养1d后，以1℃/2h的速率升温直至所有对虾死亡，找出38℃为死亡率较高拐点；以33℃为初始温度，选取经1d暂养正常的个体放入实验池，以1℃/2h的速率升温至38℃；38℃之后以0.5℃/4h的速率升温直至所有日本囊对虾死亡；实验中保持充气，以确保水池中各个部位温度同步；对虾死亡标准为对虾背部朝下倒于水体无法恢复正常的姿势或躯体始终保持90°弯曲；记录死亡时间、死亡温度、体重，然后装入封口袋中，以供实验结束后保存样品，保证每10min捞取一次死虾并做好记录，当池子中对虾死亡总数达到100％时结束耐热实验。

5.如权利要求3所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述热耐受值的计算按以下公式：

$UTT=\underset{i=1}{\overset{k}{\&Sigma;}}(T_i-T_0)$

式中，i为分钟数，T_i为在第i分钟的温度，T₀为实验初始温度33℃，k为个体存活的分钟数。

6.如权利要求3所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述利用PCR-RFLP技术进行基因分型的具体方法为：

a)随机选取40～80尾体重在2.3～3.3g之间的已获得热耐受性状评定指标UTT值的日本囊对虾，取每尾虾的背部肌肉，置于无水乙醇中，-20℃保存，用于基因组DNA的提取；提取基因组DNA后，利用特异性引物HSP60F5和HSP60R5进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶BstXⅠ酶切，根据酶切后电泳条带确定不同的基因型；酶切体系如下：

反应条件：37℃水浴，15min；

b)利用PCR-RFLP方法对SNP标记3289A/G进行分型，经BstXⅠ酶切后，3289A型等位基因产生长度分别为333bp和68bp的两种片段，而3289G由于不能为BstXⅠ酶所识别，基因片段长度仍为401bp；酶切产物经1.5％电泳检测后，发现存在2种基因型：3289AA基因型和3289AG基因型。

7.如权利要求3所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述不同基因型日本囊对虾个体热耐受性分析的具体方法为：

对具不同基因型的日本囊对虾个体(2.3～3.3g)进行热耐受性方差分析对比。