CN104630232A - 斑节对虾热休克蛋白60基因及其编码的蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了斑节对虾热休克蛋白60基因及其编码的蛋白，该基因为研究斑节对虾热休克蛋白60在斑节对虾中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的对各种理化刺激应答效应从分子层面提供理论基础；其技术要点，该基因序列如SEQ ID NO:1所示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；属于生物基因技术领域。
Description
技术领域
本发明公开了斑节对虾热休克蛋白60基因及其编码的蛋白，属于生物基因技术领域。
背景技术
热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是高水平基础表达的一种蛋白，占在正常生长条件下所有类型细胞中蛋白总量的5％-10％。当细胞处于应激条件时(如重金属、热休克、周围气温的变化、糖分损失、游离自由基的作用、病原体传染、组织损伤、精神和生理逆境等)热休克蛋白表达量明显提高。根据分子量的不同，热休克蛋白主要划分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、和smHSP五个家族。
HSP60作为一种分子伴侣，其重要的生物功能已日益引起人们的重视，尤其是在细胞保护方面。HSP60提高细胞的“应急耐受”能力，帮助变性、不可溶的凝聚蛋白重新恢复天然构象。此外，HSP60在许多病原体传染过程中都是一种免疫优势抗原，在先天免疫中发挥重要的作用。
免疫分子机理的研究对斑节对虾养殖有着举足轻重的地位，对HSP参与的免疫原理进行探究，阐明病害的发生机制，对斑节对虾的繁育和养殖有着重要的作用。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾热休克蛋白60基因的全表达序列；此外通过斑节对虾热休克蛋白60基因设计原核表达引物，对热休克蛋白60在体外进行重组表达，为研究斑节对虾热休克蛋白60在斑节对虾中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的对各种理化刺激应。
本发明提供的热休克蛋白60基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。
该基因的制备方法依次包括下述步骤：
1、总RNA的提取
取健康斑节对虾，解剖，取卵巢组织，并将组织于1mL Trizol(Invitrogen，日本)中匀浆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。
2、cDNA第一链的合成
取上述斑节对虾总RNA 2μL与反转录引物(oligo-dT/adaptor(5′-GGCCACGCGACTAGTAC(T)16-3′)1μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链，反应条件：42℃60min，70℃15min。
3、引物设计依据，引物合成的方法
根据已有的斑节对虾热休克蛋白60的EST序列设计引物：
Pm-HSP60cDNA全长扩增及表达所用的引物
引物设计后提交华大基因公司进行合成。
4斑节对虾热休克蛋白60基因的PCR扩增、克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板,利用cDNA末端快速扩增技术对目的基因的3ˊ末端进行PCR扩增。
在3ˊRACE中，利用降落PCR(touchdown PCR)方法，用接头引物：
5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC<3和HSP60-F1、HSP60-F2进行PCR扩增。
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提交上海英骏生物技术有限公司进行测序。
5、对斑节对虾热休克蛋白60基因的测定
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序，序列如SEQ ID NO:1所示。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾热休克蛋白60基因同源序列。
6、斑节对虾热休克蛋白60利用大肠杆菌进行体外重组表达
根据扩增所的的热休克蛋白60基因序列全长，在开放阅读框内设计原核表达的引物H60-F和H60-R，引物中加入Nde I和BamH I酶切位点和保护碱基。进行PCR扩增，然后用NdeI和BamH I酶切热休克蛋白60目的基因，同样酶切pET21a质粒，凝胶电泳回收热休克蛋白60基因片段和pET21a，用T4连接酶进行酶切片段的连接，16℃过夜。转化大肠杆菌DH5α，于含氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，阳性克隆再用PCR反应、测序鉴定。将正确的阳性克隆进行热休克蛋白60-Pet21a重组质粒的提取，转化大肠杆菌BL21，涂板、挑单克隆、测序。取重组菌液接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养2h左右，使菌液OD值达到0.4-0.6之间，加入异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)至最终浓度为0.6mmol/L，28℃继续培养诱导表达。每2h取2.0ml样品，离心回收菌体，加200ul的PBS重悬菌体，混匀，加50ul的上样缓冲液，置沸水浴中煮沸10min，10000×g离心1min，取上清15ul于12％的SDS-PAGE上电泳，考马斯亮蓝染色，白光灯下拍照记录结果。
上述的热休克蛋白60基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示
该氨基酸序列以SEQ ID NO:1130bp处的起始密码子ATG编码至1867bp处的终止密码子TAA，编码578个氨基酸序列。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
1、本发明提供的基因的得不仅为研究斑节对虾热休克蛋白60在斑节对虾中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的对各种理化刺激应；
2、本专利中合成的蛋白可作为斑节对虾免疫蛋白，在养殖过程中对斑节对虾进行HSP60蛋白免疫，可提高斑节对虾对环境应激的耐受性，这在斑节对虾人工养殖中具有十分重要的实践意义。
3、用本发明提供的HSP60蛋白对虾育种、养殖中斑节虾免疫，可提高斑节对虾对病原菌的抵抗能力，这对对虾生产有重要意义。
附图说明
图1斑节对虾热休克蛋白60利用大肠杆菌进行体外重组表达检测图；
其中：1、2、3分别为PET28a空质粒未诱导、诱导3h结果、诱导6h，4、5、6分别为PET2a-pmHSP60未诱导、诱导3h、诱导6h结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。
实施例1
本发明提供的斑节对虾热休克蛋白60基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。
其制备方法如下
1、总RNA提取步骤：
试验所用的雌雄斑节对虾(鲜重200g左右)均取自于海南三亚，室内水族箱内暂养三天，水温控制在24～25℃之间。取所需组织约50mg用剪刀剪碎加入1ml的Trizol(美国invitrogen公司)进行匀浆，并按以下步骤提取总RNA。
(1)加200μL预冷氯仿，涡旋振荡1min混匀，静置5min，12000g，4℃，15min。
(2)取三分之一上清溶液，加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上放置10min，12000g，4℃，10min。
(3)倒掉上清，加1mL 75％乙醇重悬沉淀，7500g，4℃离心5min。
(4)重复步骤3一次，并用枪头吸出上清，干燥5～10min
(5)加40μLddH2O溶解沉淀
(6)RNA的电泳检测：将电泳槽、梳齿等置于3％H2O2过夜浸泡，配置1.5％的琼脂糖凝胶(用0.5×TBE溶液配制)，取5μL总RNA加1μL上样缓冲液，进行30min电泳检测，对提取的RNA质量进行测定。
2、cDNA第一链的合成
cDNA的反转录实验按照相关试剂盒(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa))操作方法进行。
轻微混匀，70℃温育10min后冰浴2min，离心数秒后放回冰上
混和均匀并短暂离心；PCR仪42℃反应1h后，70℃，15min取出放置冰上，-20℃保存备用。
3、引物设计依据，引物合成的方法
以实验室高通量测序所得的EST序列为模板进行RACE引物设计。得引物如下所示：
4、斑节对虾热休克蛋白60基因cDNA全序列的克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用设计的RACE引物进行PCR扩增，在3’RACE中，利用Semi-nested(半巢式)PCR方法进行扩增反应，首先分别由HSP60-F1与AP(接头引物：Adaptor primer)进行PCR对扩反应，所得产物进行100倍稀释后，取1μL作为模板，利用HSP60-F2和Adaptor primer进行PCR二次扩增。
(1)一扩PCR反应体系配方：10×Ex Taq Buffer 2.5μL；dNTP Mixture(2.5mM)2μL；HSP60-F1(10μM)1μL；Adaptor primer(10μM)1μL；Ex Taq(5U/μL)0.25μL；MgCL21.5μL；cDNA 1μL；ddH2O 15.75μL；Total 25μL。
一扩PCR实验的反应程序如下所示：
(2)二扩PCR反应体系配方：10×Ex Taq Buffer 2.5μL；dNTP Mixture(2.5mM)2μL；HSP60-F2(10μM)1μL；Adaptor primer(10μM)1μL；MgCL21.5μL；Ex Taq(5U/μL)0.25μL；稀释100倍的一扩PCR产物1μL；ddH2O 15.75μL；Total 25μL。
二扩PCR实验的反应程序如下所示：
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提交上海英骏生物技术有限公司进行测序。
5、对斑节对虾热休克蛋白60基因的测定
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾热休克蛋白60基因的同源序列。
6、斑节对虾热休克蛋白60利用大肠杆菌进行体外重组表达
根据扩增所的的热休克蛋白60基因序列全长，在开放阅读框内设计原核表达的引物H60-F和H60-R，引物中加入Nde I和BamH I酶切位点和保护碱基。进行PCR扩增，然后用NdeI和BamH I酶切热休克蛋白60目的基因，同样酶切pET21a质粒，凝胶电泳回收热休克蛋白60基因片段和pET21a，用T4连接酶进行酶切片段的连接，16℃过夜。转化大肠杆菌DH5α，于含氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，阳性克隆再用PCR反应、测序鉴定。将正确的阳性克隆进行热休克蛋白60-Pet21a重组质粒的提取，转化大肠杆菌BL21，涂板、挑单克隆、测序。取重组菌液接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养2h左右，使菌液OD值达到0.4-0.6之间，加入异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)至最终浓度为0.6mmol/L，28℃继续培养诱导表达。每2h取2.0ml样品，离心回收菌体，加200ul的PBS重悬菌体，混匀，加50ul的上样缓冲液，置沸水浴中煮沸10min，10000×g离心1min，取上清15ul于12％的SDS-PAGE上电泳，考马斯亮蓝染色，白光灯下拍照记录结果。
按照常规的方法对IPTG诱导前和诱导后的样品进行SDS-PAGE，然后转膜、封闭、洗膜、抗体孵育、显色、拍照。所用的抗体是华安生物公司的6×His Tag HRP抗体试剂盒，显色反应检测用的是HRP-DAB增强型显色试剂盒。具体参阅图1，左图PET21a-pmHSP60SDS-PAGE，1、2、3分别为PET28a空质粒未诱导、诱导3h结果、诱导6h，4、5、6分别为PET2a-pmHSP60未诱导、诱导3h、诱导6h结果；右图为pmHSP60western blot结果。
上述的热休克蛋白60基因序列编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示
该氨基酸序列以SEQ ID NO:1基因序列的130bp处的起始密码子ATG编码至1867bp处的终止密码子TAA，编码578个氨基酸序列，具体编码氨基酸的基因片段的核苷酸序列为SEQID NO:3。
Claims (7)
1.斑节对虾热休克蛋白60基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的斑节对虾热休克蛋白60基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.含权利要求1或2所述基因的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组载体为将权利要求1或2所述基因插入pET21a质粒的多克隆位点得到的重组质粒。
5.含有权利要求1或2所述基因的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4所述重组质粒转化大肠杆菌BL21得到的。
7.权利1或2所述的斑节对虾热休克蛋白60在大肠杆菌中体外重组表达。
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|---|---|---|---|---|
| CN105567865A (zh) * | 2016-03-23 | 2016-05-11 | 厦门大学 | 与日本囊对虾耐热性相关的snp标记及其检测方法 |
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JUN ZHOU等: "Expression of HSP60 and HSP70 in white shrimp,Litopenaeus vannamei in response to bacterial challenge", 《JOURNAL OF INVERTEBRATE PATHOLOGY》 * |
| ZHOU J.等: "登录号：ACN30235.1", 《GENBANK》 * |
| ZHOU J.等: "登录号：FJ710169.1", 《GENBANK》 * |
| 刘海超等: "唐鱼热休克蛋白60基因cDNA克隆及表达", 《华中农业大学学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105567865A (zh) * | 2016-03-23 | 2016-05-11 | 厦门大学 | 与日本囊对虾耐热性相关的snp标记及其检测方法 |
| CN105567865B (zh) * | 2016-03-23 | 2019-02-01 | 厦门大学 | 与日本囊对虾耐热性相关的snp标记及其检测方法 |
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