CN104611341A - 斑节对虾热休克蛋白10基因及其编码的蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了斑节对虾热休克蛋白10基因及其编码的蛋白，该基因为研究斑节对虾热休克蛋白10在斑节对虾中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的对各种理化刺激应答效应从分子层面提供理论基础；其技术要点，该基因序列如SEQ ID NO:1所示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；属于生物基因技术领域。
Description
技术领域
本发明公开了斑节对虾热休克蛋白10基因及其编码的蛋白，属于生物基因技术领域。
背景技术
热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)又称应激蛋白，是机体细胞在一些应激原(如环境高温、缺氧、重金属中毒、氧化应激、感染、饥饿、创伤、代谢毒物等)的诱导下，使HSP基因被激活，且高效表达的一组在进化上高度保守的蛋白质，对机体免受应激因素的损害具有重要作用。
HSP10是小分子质量HSP家族的重要一员，它作为一种分子伴侣蛋白时，与HSP60一端或两端连接，扩大HSP60分子内腔对蛋白质进行初步折叠。HSP10也有促进细胞增殖、抑制凋亡的作用，2010年He等人研究表明HSP10具有抑制生殖细胞凋亡的作用。高表达HSP10可抑制生殖细胞凋亡；HSP10在细胞受到高温、紫外线、药物、缺氧等刺激下大量表达，是调节细胞凋亡的关键信号通路，抑制细胞凋亡的发生，发挥保护细胞作用。在生殖方面，HSP10参与卵巢颗粒细胞凋亡的调节，进而可能影响卵泡及卵母细胞的发育成熟；2008年Walsh等人发现HSP10通过直接组装精子表面的透明带受体复合物，参与精子与透明带的识别过程，进而影响精子与卵母细胞的受精过程。此外，HSP10还参与炎症、免疫过程以及生殖相关。
近年来随着生态环境的恶化，水产养殖行业受到了严重的影响，而水产养殖对环境的稳定性要求相对较高，特别是斑节对虾的繁育与养殖。因此，为了繁育出高抗逆性优良品质的斑节对虾，对其生长、生死、免疫相关分子机理的研究显得尤为重要。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾热休克蛋白10基因的全表达序列；该序列不仅为研究斑节对虾热休克蛋白10在斑节对虾中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的对各种理化刺激应答效应从分子层面提供理论基础。
本发明提供的热休克蛋白10基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。
该基因的制备方法依次包括下述步骤：
1、总RNA的提取
取健康斑节对虾，解剖，取卵巢组织，并将组织于1mL Trizol(Invitrogen，日本)中匀 浆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。
2、cDNA第一链的合成
取上述斑节对虾总RNA 2μL与反转录引物(oligo-dT/adaptor(5′-GGCCACGCGACTAGTAC(T)16-3′)1μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链，反应条件：42℃60min，70℃15min。
3、引物设计依据，引物合成的方法
根据已有的斑节对虾热休克蛋白10的EST序列设计引物：
Pm-HSP10cDNA全长扩增及表达所用的引物
引物设计后提交华大基因公司进行合成。
4、斑节对虾热休克蛋白10基因的PCR扩增、克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，利用cDNA末端快速扩增技术对目的基因的3ˊ末端进行PCR扩增。
在3ˊRACE中，利用降落PCR方法，用接头引物5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC<3)和HSP10-F1、HSP10-F2进行PCR扩增。
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提交上海英骏生物技术有限公司进行测序。
5、斑节对虾热休克蛋白10基因的测定
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序，结果如SEQ ID NO:1所示。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾热休克蛋白10基因同源序列。
6、斑节对虾热休克蛋白10利用大肠杆菌进行体外重组表达
根据扩增所得的热休克蛋白10基因序列的全长，在开放阅读框内设计原核表达的引物H10-F和H10-R，引物中加入Nde I和Hind III酶切位点和保护碱基。进行PCR扩增，然后用NdeI和HindIII酶切热休克蛋白10目的基因，同样酶切pET21a质粒，凝胶电泳回收热休 克蛋白10基因片段和pET21a，用T4连接酶进行酶切片段的连接，16℃过夜。转化大肠杆菌DH5α，于含氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，阳性克隆再用PCR反应、测序鉴定，结果如SEQ ID NO:1所示。将正确的阳性克隆进行热休克蛋白10-Pet21a重组质粒的提取，转化大肠杆菌BL21，涂板、挑单克隆、测序结果如SEQ ID NO:1所示。取重组菌液接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养2h左右，使菌液OD值达到0.4-0.6之间，加入异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)至最终浓度为0.6mmol/L，28℃继续培养诱导表达。每2h取2.0ml样品，离心回收菌体，加200ul的PBS重悬菌体，混匀，加50ul的上样缓冲液，置沸水浴中煮沸10min，10000×g离心1min，取上清15ul于12％的SDS-PAGE上电泳，考马斯亮蓝染色，白光灯下拍照记录结果，参阅图1，其中，图1PET21a-pmHSP10SDS-PAGE，1、2、3分别为PET21a空质粒未诱导、诱导3h、诱导6h结果；4、5、6分别为PET21a-pmHSP10未诱导、诱导3h、诱导6h结果。
上述的热休克蛋白10基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示
该氨基酸序列以SEQ ID NO:1103bp处的起始密码子ATG编码至409bp处的终止密码子TAA，编码102个氨基酸序列。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
1、本发明提供的基因不仅为研究斑节对虾热休克蛋白10在斑节对虾中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的对各种理化刺激应答效应从分子层面提供理论基础。
2、本发明提供的蛋白可作为一种疫苗，诱导斑节对虾精子与卵子结合，对增加斑节对虾育种过程中受精卵的成活率、提高子代虾苗质量有着重要的意义。
3、本发明提供的蛋白可在斑节对虾性腺成熟时期进行注射，抑制生殖细胞的凋亡，对缩短斑节对虾育种周期有着重要的意义。
附图说明
图1斑节对虾热休克蛋白10利用大肠杆菌进行体外重组表达检测图；
其中：1、2、3分别为PET21a空质粒未诱导、诱导3h结果、诱导6h；4、5、6分别为PET21a-pmHSP10未诱导、诱导3h、诱导6h结果
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要 求保护范围之内。
以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。
实施例1
本发明提供的斑节对虾热休克蛋白10基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。
其制备方法如下
1.总RNA的提取
试验所用的雌雄斑节对虾(鲜重200g左右)均取自于海南三亚，室内水族箱内暂养三天，水温控制在24～25℃之间。取所需组织约50mg用剪刀剪碎加入1ml的Trizol(美国invitrogen公司)进行匀浆，并按以下步骤提取总RNA。
总RNA提取步骤：
(1)加200μL预冷氯仿，涡旋振荡1min混匀，静置5min，12000g，4℃，15min。
(2)取三分之一上清溶液，加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上放置10min，12000g，4℃，10min。
(3)倒掉上清，加1mL 75％乙醇重悬沉淀，7500g，4℃离心5min。
(4)重复步骤3一次，并用枪头吸出上清，干燥5～10min
(5)加40μLddH2O溶解沉淀
(6)RNA的电泳检测：将电泳槽、梳齿等置于3％H2O2过夜浸泡，配置1.5％的琼脂糖凝胶(用0.5×TBE溶液配制)，取5μL总RNA加1μL上样缓冲液，进行30min电泳检测，对提取的RNA质量进行测定，最后置于-80℃保存。
2.cDNA第一链的合成
取上述斑节对虾总RNA 4μL与反转录引物(oligo-dT/adaptor(5′-GGCCACGCGACTAGTAC(T)16-3′)2μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链。
cDNA的反转录实验按照相关试剂盒(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa))操作方法进行。
轻微混匀，70℃温育10min后冰浴2min，离心数秒后放回冰上
混和均匀并短暂离心；PCR仪42℃反应1h后，70℃，15min取出放置冰上，-20℃保存备用。
3.引物设计依据，引物合成的方法
以实验室高通量测序所得的EST序列为模板进行RACE引物设计。得引物如下所示：
4.斑节对虾热休克蛋白10基因cDNA全序列的克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用设计的RACE引物进行PCR扩增，在3’RACE中，利用Semi-nested(半巢式)PCR方法进行扩增反应，首先分别由HSP10-F1与接头引物AP进行PCR对扩反应，所得产物进行100倍稀释后，取1μL作为模板，利用HSP10-F2和Adaptor primer进行PCR二次扩增。
(1)一扩PCR反应体系配方：10×Ex Taq Buffer 2.5μL；dNTP Mixture(2.5mM)2μL；HSP10-F1(10μM)1μL；Adaptor primer(10μM)1μL；Ex Taq(5U/μL)0.25μL；MgCL21.5μL；cDNA 1μL；ddH2O 15.75μL；Total 25μL。
一扩PCR实验的反应程序如下所示：
(2)二扩PCR反应体系配方：10×Ex Taq Buffer 2.5μL；dNTP Mixture(2.5mM)2μL； HSP10-F2(10μM)1μL；Adaptor primer(10μM)1μL；MgCL21.5μL；Ex Taq(5U/μL)0.25μL；稀释100倍的一扩PCR产物1μL；ddH2O 15.75μL；Total 25μL。
二扩PCR实验的反应程序如下所示：
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提交上海英骏生物技术有限公司进行测序。
5.斑节对虾热休克蛋白10基因的测定
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，进行测序，结果如SEQ ID NO:1所示。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾热休克蛋白10基因的同源序列。
6、斑节对虾热休克蛋白10利用大肠杆菌进行体外重组表达
根据扩增所得的热休克蛋白10基因序列的全长，在开放阅读框内设计原核表达的引物H10-F和H10-R，引物中加入Nde I和Hind III酶切位点和保护碱基。进行PCR扩增，然后用NdeI和HindIII酶切热休克蛋白10目的基因，同样酶切pET21a质粒，凝胶电泳回收热休克蛋白10基因片段和pET21a，用T4连接酶进行酶切片段的连接，16℃过夜。转化大肠杆菌DH5α，于含氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，阳性克隆再用PCR反应、测序鉴定，结果如SEQ ID NO:1所示。将正确的阳性克隆进行热休克蛋白10-Pet21a重组质粒的提取，转化大肠杆菌BL21，涂板、挑单克隆、测序结果如SEQ ID NO:1所示。取重组菌液接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养2h左右，使菌液OD值达到0.4-0.6之间，加入异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)至最终浓度为0.6mmol/L，28℃继续培养诱导表达。每2h取2.0ml样品，离心回收菌体，加200ul的PBS重悬菌体，混匀，加50ul的上样缓冲液，置沸水浴中煮沸10min，10000×g离心1min，取上清15ul于12％的SDS-PAGE上电泳，考马斯亮蓝染色，白光灯下拍照记录结果，参阅图1，其中，图2PET21a-pmHSP10SDS-PAGE，1、2、3分别为PET21a空质粒未诱导、诱导3h、诱导6h结果；4、5、6分别为PET21a-pmHSP10 未诱导、诱导3h、诱导6h结果。
上述的热休克蛋白10基因序列编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示
该氨基酸序列以SEQ ID NO:1基因序列的103bp处的起始密码子ATG编码至409bp处的终止密码子TAA，编码102个氨基酸序列，具体编码氨基酸的基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
Claims (7)
1.斑节对虾热休克蛋白10基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的斑节对虾热休克蛋白10基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.含权利要求1或2所述基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为将权利要求1或2所述基因插入pET21a质粒的多克隆位点得到的重组质粒。
5.含有权利要求1或2所述基因的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4所述重组质粒转化大肠杆菌BL21得到的。
7.权利1或2所述的斑节对虾热休克蛋白10在大肠杆菌中体外重组表达。
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