CN106701711B - 一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体及其应用 - Google Patents

一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体，所述的Ppmar1转座酶S171A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码所述Ppmar1转座酶S171A突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。是将野生型Ppmar1转座酶171位置上的丝氨酸突变为丙氨酸。该Ppmar1转座酶S171A突变体催化转座子转座的活性是野生型转座酶的活性的10倍，为利用MLE转座子开发基因标签奠定了基础，为后基因组时代大规模分离和标记基因，研究基因的功能提供了新工具。

Description

一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体及其应用。
背景技术
转座子(transposon)是指在基因组上能从一个位点转移到另一个位点的一段DNA序列。自20世纪40年代美国遗传学家McClintock首先在玉米中发现转座子(Ac/Ds)以来，科学家们发现了多种类型的转座子，它们广泛存在于细菌、酵母和高等动植物中。随着人们在分子水平上对转座子结构和功能认识的不断深化，一些转座子已被改造为基因标签应用于基因分析，并逐渐成为大规模分离基因的重要手段之一。
Mariner-Like转座子(Mariner-Like Elements，MLE)是转座子中一个重要家族，最早是在研究毛里塔尼亚果蝇(Drosophila mauristiana)白眼基因的一个不稳定突变时发现的。此后在其他动物以及植物基因组中也发现了大量MLE转座子的存在。与其它转座子相比较，MLE转座子具有结构简单、异源转座率高、在基因组插入位点接近随机等特点，在开发基因标签，分离基因，研究基因功能上，远远优于其他转座子。
MLE转座子由两端反向重复序列(Terminal Inverted Repeats，TIRs)和编码转座酶的基因组成，转座酶负责催化转座子转座，因此转座酶的活性是影响转座子的转座频率的主要因素。然而自然界分离的MLE转座酶由于在进化过程中“垂直失活”效应积累了或多或少的突变，部分或全部丧失了催化转座能力，成为低活性或非活性的转座酶，严重影响了MLE转座子的应用，因此人工构建高活性的转座酶就显得十分重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体及其应用，解决了现有自然界分离的MLE转座酶催化活性较低或者不具备催化活性的问题。
本发明提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体，所述的Ppmar1转座酶S171A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种编码所述Ppmar1转座酶S171A突变体的基因，编码所述Ppmar1转座酶S171A突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有编码所述Ppmar1转座酶S171A突变体的基因。
本发明还提供了一种工程菌株，所述工程菌株携带有上述重组质粒。
本发明还提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体在构建酵母突变体中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体，具有以下有益效果：
本发明从毛竹中克隆到的活性转座酶，对其进行人工改造之后获得较高活性的MLE转座酶突变体(Ppmar1转座酶S171A突变体)，Ppmar1转座酶S171A突变体催化转座子转座的活性是野生型转座酶的活性的10倍，为利用MLE转座子开发基因标签奠定了基础，为后基因组时代大规模分离和标记基因，研究基因的功能提供了新工具。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，如Sambrook等主编的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照试剂盒陈述的步骤进行操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
一、野生型MLE转座酶和去除转座酶的非自主性转座子的获得
步骤1.1，采集新鲜的毛竹叶片(Phyllostachyspubescens，采集于浙江农林大学植物园，北纬N30°15′14.67″东经E119°43′33.47″)，利用CTAB法提取毛竹基因组DNA，根据MLE转座子TIR保守序列设计引物Ppmar1-5-3(Ppmar1-5-3的序列信息见表1)，进行PCR扩增，得到MLE转座子扩增产物。
PCR扩增的体系为20μl，包括0.2μl rTaq Polymerase(5U/μl)，1μl Ppmar1-5-3(10μmol/L)，2μl 10×rTaq Buffer(Mg2+plus)，1.6μl dNTP mix(2.5mmol/L)，100ng毛竹基因组DNA，加无菌水补齐20μl。
PCR扩增的反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，60℃30s，延伸72℃40s，35个循环；72℃2min，4℃10min。
步骤1.2，扩增出序列后，采用TaKaRa公司pMDTM18-T Vector Cloning Kit试剂盒的方法将步骤1.1的MLE转座子扩增产物连接到pMD18-T载体，测序确认后，命名为Ppmar1转座子，Ppmar1转座子全长序列如SEQ ID NO.3所示。
步骤1.3，采用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒提取毛竹叶片RNA，通过Invitrogen公司的SuperScriptTMVILOTMcDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA，根据Ppmar1转座酶序列设计一对引物PpTpase1-5和PpTpase1-3(PpTpase1-5和PpTpase1-3的序列信息见表1)，进行PCR扩增，回收得到Ppmar1转座酶扩增产物，即为Ppmar1转座酶核苷酸序列。
PCR扩增的体系为20μl，包括0.2μl rTaq Polymerase(5U/μl)，0.5μl PpTpase1-5(10μmol/L)，0.5μl PpTpase1-3(10μmol/L)，2μl 10×rTaq Buffer(Mg2+plus)，1.6μl dNTPmix(2.5mmol/L)，10ng毛竹叶片cDNA，加无菌水补齐20μl。
PCR扩增的反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，55℃30s，延伸72℃40s，35个循环；72℃2min，4℃10min。
步骤1.4，采用TaKaRa公司pMDTM18-T Vector Cloning Kit试剂盒的方法将步骤1.3的Ppmar1转座酶核苷酸序列连接到pMD18-T载体克隆，测序确认，Ppmar1转座酶核苷酸序列和相应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
将含有Ppmar1转座子全长序列的pMD18-T载体用BseR I切除Ppmar1中间转座酶的大部分序列。
酶切体系为50μl，包括5μl 10×buffer，1μl BseR I(1U/μl)，1μg质粒(含有Ppmar1全长序列的pMD18-T载体)，加无菌水补齐50μl，37℃温浴6小时。回收质粒大片段，用T4DNA Ligase将质粒大片段自连接，得到Ppmar1的非自主性转座子pMD18-T-Ppmar1-Tn(Tn表示非自主性转座子)。
其中，自连接的体系为10μl，包括1μl 10×T4DNA Ligase buffer，1μl T4DNALigase(10U/μl),50ng质粒大片段，加无菌水补齐10μl，16℃温浴8小时。
Ppmar1的非自主性转座子的序列如SEQ ID NO.6所示。
二、酵母转座表达载体的构建
步骤2.1，Ppmar1转座酶表达载体的构建
将步骤1.3的Ppmar1转座酶核苷酸序列经Not I和EcoR V双酶切，回收Ppmar1转座酶酶切产物的大片段；将pAG413-gal-ccdB载体经Not I和EcoR V双酶切，回收pAG413-gal-ccdB载体酶切产物的大片段；且Ppmar1转座酶核苷酸序列的双酶切体系、双酶切条件与pAG413-gal-ccdB载体的双酶切体系、双酶切条件均相同；
其中双酶切体系为50μl，包括5μl 10×buffer，1μl Not I(1U/μl),1μl EcoR(1U/μl)，1μg质粒(Ppmar1转座酶核苷酸序列或者pAG413-gal-ccdB载体)，加无菌水补齐50μl，双酶切条件为：37℃温浴6小时。
将Ppmar1转座酶酶切产物的大片段和pAG413-gal-ccdB载体酶切产物的大片段相连接；
连接体系为10μl，包括1μl 10×T4DNA Ligase buffer，1μl T4DNA Ligase(10U/μl),50ng pAG413-gal-ccdB载体酶切产物的大片段，20ng Ppmar1转座酶酶切产物的大片段，加无菌水补齐10μl，16℃温浴8小时。
此时完成了用Ppmar1转座酶核苷酸序列替换pAG413-gal-ccdB质粒中的ccdB核苷酸序列，得到重组质粒pAG413-gal-Tpase(Tpase表示转座酶)；
该重组质粒pAG413-gal-Tpase即为Ppmar1转座酶表达载体，其携带有编码所述Ppmar1转座酶的基因。该表达载体具有His(组氨酸)筛选标记，使导入pAG413-gal-Tpase载体的宿主能够缺乏His的缺失培养基上生长。
步骤2.2，Ppmar1非自主转座子供体载体的构建
以步骤1.4的Ppmar1的非自主性转座子pMD18-T-Ppmar1-Tn为模板，利用Ppmar1-5-3引物扩增Ppmar1的非自主性转座子，进行PCR扩增，得到Ppmar1的非自主性转座子扩增产物。
PCR扩增的体系为20μl，包括0.2μl rTaq Polymerase(5U/μl)，1μl Ppmar1-5-3(10μmol/L)，2μl 10×rTaq Buffer(Mg2+plus)，1.6μl dNTP mix(2.5mmol/L)，10ng pMD18-T-Ppmar1-Tn，加无菌水补齐20μl。
PCR扩增的反应条件为:预变性94℃5min；变性94℃30s，60℃30s，延伸72℃40s，35个循环；72℃2min，4℃10min。
同时，将载体pWL89a用XhoⅠ酶切(酶切位点位于ADE2基因内)，回收载体pWL89a骨架。酶切体系为50μl，包括5μl 10×buffer，1μl XhoⅠ(1U/μl),1μg载体pWL89a，加无菌水补齐50μl，37℃温浴6小时。
然后用In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(TaKaRa公司，日本)将Ppmar1的非自主性转座子扩增产物插入到载体pWL89a骨架的ADE2基因中，导致报告基因ADE2插入失活，得到pWL89a-Tn重组质粒，即为Ppmar1非自主转座子供体载体。若转座子发生转座从ADE2基因上离开，那么ADE2基因阅读框得到回复。该载体具有URA3筛选标记，使导入pWL89a-Tn的宿主能够在缺乏Ura(尿素)的缺失培养基上生长。
三、Ppmar1转座酶S171A突变体的获得
将Ppmar1转座酶核苷酸序列与其他植物MLE转座酶的核苷酸序列进行同源性比对，选取Ppmar1转座酶核苷酸序列171位置上的丝氨酸开展突变，计划将其突变为丙氨酸(S171A)。
步骤3.1，根据QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司，美国)试剂盒说明书，设计定点突变引物S171A-F和S171A-R(S171A-F和S171A-R的序列信息见表1)，按照QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit试剂盒方法，以步骤2.1的重组质粒pAG413-gal-Tpase为模板，利用PfuTurboTMDNA polymerase重新合成含有Ppmar1转座酶S171A突变体的质粒DNA；
步骤3.2，然后在合成的质粒DNA中加入2μL的Dpn I限制性内切酶，于37℃条件下反应5min，将原始模板序列彻底降解。将新合成的质粒DNA测序确认后得到Ppmar1转座酶S171A突变体；
Ppmar1转座酶S171A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述Ppmar1转座酶S171A突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
四、转座酶活性的检测
实验组是将步骤3.1的含有Ppmar1转座酶S171A突变体的质粒DNA和步骤2.2的pWL89a-Tn重组质粒，用PEG/LiAc法共同转化到酵母中，用His/Ura双缺固体培养基上进行选择培养。用半乳糖诱导转座酶表达，促使非自主转座子发生转座。
以野生型Ppmar1转座酶为对照组，步骤2.1的带有野生型的Ppmar1转座酶的重组质粒pAG413-gal-Tpase和步骤2.2的pWL89a-Tn重组质粒，用PEG/LiAc法共同转化到酵母中，用His/Ura双缺固体培养基上进行选择培养。用半乳糖诱导转座酶表达，促使非自主转座子发生转座。
实验组和对照组的经诱导培养的酵母用缺失His/Ura/Ade固体培养基上进行选择培养，计算培养基上长出的酵母菌斑。如果转座发生，pWL89a-Tn重组质粒上的ADE2基因就能表达，因此阳性酵母株能够在缺乏腺嘌呤的培养基上生长。
以野生型Ppmar1转座酶为对照，比较转化有Ppmar1转座酶S171A突变体的酵母菌落数目，筛选出较高活性的转座酶突变株，结果如表2所示。
由表2可知，野生型Ppmar1转座酶的阳性酵母菌落数量明显小于Ppmar1转座酶S171A突变体，且Ppmar1转座酶S171A突变体催化转座能力提高到原来的1000％。这个高活性人工改造的Ppmar1转座酶S171A突变体将为利用Ppmar1转座子开发基因标签奠定了重要基础。
表1本发明应用的引物序列
Figure BDA0001215522990000081
Figure BDA0001215522990000091
表2不同转座酶诱导的阳性酵母菌落数量和催化活性
Figure BDA0001215522990000092
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Figure BDA0001215522990000101
Figure BDA0001215522990000111
Figure BDA0001215522990000121
Figure BDA0001215522990000131
Figure BDA0001215522990000141
Figure BDA0001215522990000151
Figure BDA0001215522990000161
Figure BDA0001215522990000171
Figure BDA0001215522990000181
Figure BDA0001215522990000191
Figure BDA0001215522990000201
Figure BDA0001215522990000211
Figure BDA0001215522990000221
序列表
<110> 浙江农林大学
<120> 一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Asp Pro Ile Asp Ser Gly Phe Asp Leu Asn Val Arg Leu Glu
1 5 10 15
Glu Asp Asp Asp Gly Asn Leu Pro Phe Asp Leu Asn Glu Pro Ile Leu
20 25 30
Glu Asp His Asn Asn Gly Ile Asp Leu Asn Leu Pro Leu Asp Glu Phe
35 40 45
Gly Ala Val Asp Phe Asp Tyr Val Gln Asn Leu Ala Glu Gln Asp Val
50 55 60
Glu Ala Pro Val Gln Val His Pro Pro Lys His Asp Tyr Pro Glu His
65 70 75 80
Val Arg Lys Leu Val Tyr Gln Ala Leu Leu Met Arg Ser Lys Asn Gly
85 90 95
Lys Leu Gly Asn His Asp Thr Thr Ile Val Ser Ser Gln Phe Gly Val
100 105 110
Lys Ile Arg Ser Val Gln Arg Ile Trp Lys Gln Gly Lys Asn Gln Leu
115 120 125
Ala Gln Asn Ile Pro Val Val Val Ala Asn Leu Lys Lys Gly Arg Ser
130 135 140
Gly Arg Lys Ala Thr Pro Leu Asp Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ile Pro
145 150 155 160
Leu Lys Gln Arg Met Thr Ile Glu Asp Val Ala Ser Arg Leu Gly Ile
165 170 175
Ser Lys Ser Arg Ile Gln Arg Tyr Leu Lys Lys Gly Leu Leu Arg Arg
180 185 190
His Ser Ser Ser Ile Lys Pro Tyr Leu Thr Asp Ala Asn Lys Lys Thr
195 200 205
Arg Leu Lys Trp Cys Ile Asp Met Ile Glu Gln Gly Leu Val Asp Asp
210 215 220
Pro Lys Phe Arg Asp Leu Phe Asp Phe Val Phe Ile Asp Glu Lys Trp
225 230 235 240
Phe Asn Leu Ser Gln Lys Ser Glu Arg Tyr Tyr Leu Leu Pro Asp Glu
245 250 255
Asp Glu Pro His Arg Thr Cys Lys Asn Lys Asn Tyr Ile Pro Arg Ile
260 265 270
Met Phe Leu Cys Val Cys Ala Arg Pro Arg Phe Arg Asn Gly Glu Cys
275 280 285
Val Phe Asp Gly Lys Ile Gly Cys Phe Pro Leu Val Thr Phe Glu Gln
290 295 300
Ala Ile Arg Gly Ser Gln Asn Arg Leu Arg Gly Glu Gln Val Ile Lys
305 310 315 320
Pro Ile Gln Ser Ile Asn Arg Glu Val Ile Arg Asp Phe Met Ile Asn
325 330 335
Arg Val Leu Pro Ala Ile Arg Ala Lys Trp Pro Arg Glu Asp Val His
340 345 350
Lys Pro Ile Phe Ile Gln Gln Asp Asn Val Pro Ser His Leu Lys Val
355 360 365
Asp Asp Pro Gln Phe Arg Glu Val Ala Lys Gln Asp Gly Phe Asp Ile
370 375 380
Arg Leu Ile Cys Gln Pro Pro Asn Ser Pro Asp Phe Asn Ile Leu Asp
385 390 395 400
Leu Gly Phe Phe Arg Ala Ile Gln Ala Ile Gln Tyr Lys Lys Asp Ala
405 410 415
Lys Thr Leu Lys Asp Leu Ile Pro Ala Val Gln Gln Ala Phe Leu Glu
420 425 430
Tyr Ser Pro Trp Lys Ala Asn Arg Ile Phe Val Thr Leu Gln Thr Val
435 440 445
Leu Lys Glu Ala Met Lys Ile Lys Gly Cys Asn Lys Ile Lys Ile Pro
450 455 460
His Ile Gln Lys Gln Arg Leu Glu Arg Glu Asp Arg Leu Pro Leu Gln
465 470 475 480
Ile Pro Cys Glu Ala Ser Leu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ser Leu Pro
485 490 495
Ala Ala Asn
<210> 2
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggctgacc caatagattc tggcttcgat ctgaacgttc ggttagaaga agatgatgac 60
ggcaatcttc cctttgatct caacgagcca atattggaag atcacaacaa tggaattgat 120
ttgaacttgc cattagatga gtttggtgcc gtcgacttcg actatgtaca aaacctcgct 180
gaacaagatg ttgaggctcc cgttcaagta caccctccga agcatgacta tcctgaacat 240
gttagaaaac tagtgtacca agcattgttg atgagaagca agaatgggaa actaggcaat 300
catgatacaa caattgtttc cagtcaattt ggagtaaaga ttcgatcagt tcagcgcata 360
tggaagcaag gtaaaaacca acttgctcaa aacattccgg tcgtggttgc taatctaaag 420
aaaggtagaa gtggccgtaa agcaacccct cttgatttgg aacaattgcg caacattcct 480
ctcaagcaaa gaatgaccat agaagatgtg gctagtagac ttggtattag caaatctagg 540
atacaaaggt atttgaaaaa gggtttgctt aggcgccact ctagtagcat aaaaccttac 600
ctcaccgatg ctaacaagaa gactaggttg aagtggtgca ttgacatgat tgagcaaggt 660
ttggttgatg atccaaagtt cagggatttg tttgactttg tgtttattga tgagaagtgg 720
ttctacctct ctcaaaaatc cgagagatac tacttgctac ccgacgaaga tgaaccacat 780
cgcacttgca agaacaagaa ttacatccct aggatcatgt ttttgtgtgt ttgtgctcgg 840
ccaagattta gaaatggaga atgtgtgttt gatggcaaaa taggttgttt tccactagtc 900
acttttgaac aagctattag aggaagccaa aaccgtcttc gtggagaaca agtaatcaag 960
ccaattcaat caattaatag ggaagtgata agagatttca tgataaatag agtgttgcct 1020
gcaattagag caaagtggcc aagagaagat gtacacaagc caattttcat acaacaagat 1080
aatgttccat ctcatttaaa ggtggatgat cctcagtttc gtgaggttgc taagcaagat 1140
gggtttgaca ttaggctcat atgtcaacca cccaattctc cagattttaa cattctagat 1200
ttgggttttt ttcgagctat tcaagcaatt caatacaaga aagatgctaa gacattgaaa 1260
gatctaattc cagcagtcca acaggcattt ttggagtact ctccatggaa agcaaatagg 1320
atatttgtga cactacaaac tgttttgaag gaagcaatga agataaaagg ttgcaacaaa 1380
atcaaaattc ctcacatcca gaaacaaaga cttgagagag aagataggct gccattgcaa 1440
atcccttgtg aagcttcctt gctagccgaa gcacttgcaa gccttcctgc agctaattag 1500
<210> 3
<211> 3435
<212> DNA
<213> 毛竹基因组
<400> 3
tactccctcc atacccgaaa ttcctgacgt ttaggacatg attgtggtaa ccaaggagtg 60
attaattagg ggttagtttt ccatctttgc ccctaataaa tatggttacg ggtgctcttt 120
gtacgagaaa gtaaaccagc tcgactggct agcgcgcgga ggcctcagtc ctgtggtgcg 180
cgttcgatac ctcgcggacg caggtttttt tcttgttgct gtttattcat ttttgcatgg 240
cactgtttag gcaacgcacg tcgcgcgcgc ttagccgctg cgggcgttag ttttcgagtg 300
gatttgggcc tggcgcacgg aggaggttgc atggctgccc gaaaatttcg ttgcatgcac 360
tggattttca aaattttgtc ctcgcgctgt ggaggctcgt ttgaggccgc gttttttttc 420
atctggcgcg ctggaaggcc gacgtttgga gtgctcgttg cttgttctat ttaaacgcct 480
ggaaccttcc ttgttgtctt cctatgccgg actcctgtac tatggctgac ccaatagatt 540
ctggcttcga tctgaacgtt cggttagaag aagatgatga cggcaatctt ccctttgatc 600
tcaacgagcc aatattggaa gatcacaaca atggtaagca aaaacgtcaa attagtttct 660
cagtttctcg tttccttttt tctttactga gcttgtcgtt tcctttttcg ataggaattg 720
atttgaactt gccattagat gagtttggtg ctgtcgactt cgactatgta caaaacctcg 780
ctggtaagca tggctagtat tatgaattcg cttgtttttt tatttccttt tgctggaaca 840
tgccgtgaat aatagtatta tgaactcgct tgttttttat ttccttttac tagaacatgt 900
gcttgtttta ttcctatagc tagatcatga cgtcaatact ttttacgatg aatatgctcg 960
ttacagtata gctagaacat gccgtgacta catagtagta tgaatatgct tgttttattt 1020
ctataactat aacatgccgt gagtatattt agatcatgcc gtgagtacta agtactatta 1080
aaatgcttgt tttttatttc cttttgctag aacaagatgt tgaggctccc gttcaagtac 1140
accctccgaa gcatgactat cctgaacatg ttagaaaact agtgtaccaa gcattgttga 1200
tgagaagcaa gaatgggaaa ctaggcaatc atgatacaac aattgtttcc agtcaatttg 1260
gagtaaagat tcgatcagtt cagcgcatat ggaagcaagg taaaaaccaa cttgctcaaa 1320
acattccggt cgtggttgct aatctaaaga aaggtagaag tggccgtaaa gcaacccctc 1380
ttgatttgga acaattgcgc aacattcctc tcaagcaaag aatgaccata gaagatgtgt 1440
ctagtagact tggtattagc aaatctagga tacaaaggta tttgaaaaag ggtttgctta 1500
ggcgccactc tagtagcata aaaccttacc tcaccgatgc taacaagaag actaggttga 1560
agtggtgcat tgacatgatt gagcaaggtt tggttgatga tccaaagttc agggatttgt 1620
ttgactttgt gtttattgat gagaagtggt tctacctctc tcaaaaatcc gagagatact 1680
acttgctacc cgacgaagat gaaccacatc gcacttgcaa gaacaagaat tacatcccta 1740
ggatcatgtt tttgtgtgtt tgtgctcggc caagatttag aaatggagaa tgtgtgtttg 1800
atggcaaaat aggttgtttt ccactagtca cttttgaaca agctattaga ggaagccaaa 1860
accgtcttcg tggagaacaa gtaatcaagc caattcaatc aatcaatagg gaagtgataa 1920
gagatttcat gataaataga gtgttgcctg caattagagc aaagtggcca agagaagatg 1980
tacacaagcc aattttcata caacaagata atgctccatc tcatttaaag gtggatgatc 2040
ctcagttttg tgaggttgct aagcaagatg ggtttgacat taggctcata tgtcaaccac 2100
ccaattctcc agattttaac attctagatt tgggtttttt tcgagctatt caagcaattc 2160
aatacaagaa agatgctaag acattgaaag atctaattcc agcagtccaa caggtaaatg 2220
atcatccatt acagtgttta aattgatctt gaacaaataa tataatcact gatcttgaac 2280
atgttttgta ggcatttttg gagtactctc catggaaagc aaataggata tttgtgacac 2340
tacaaactgt tttgaaggaa gcaatgaaga taaaaggttg caacaaaatc aaaattcctc 2400
acatccagaa acaaagactt gagagagaag ataggctgcc attgcaaatc ccttgtgaag 2460
cttccttgct agccgaagca cttgcaagcc ttcctgcggc taattagaag atgcaagcat 2520
gttactcttt tgcagcagca agcatgtaag aagacgcgag catgttagta gcaaactatg 2580
aacaaactag tttatgcatg tagtagtatg ttagcttgtg caccttagtc atctcgtccc 2640
aaccgcttga taacatgctc aggaagaagt attgtgtcac catccatttc aagtttctcc 2700
acatcaggaa tgtagacctc acaatcaaac ttttccatgt catcgagcca cttcgctgtc 2760
atgtcgtagt cttcatgtaa aaggccacaa cgggcacaca tgcgagcttc gcggcgagct 2820
tggtagcagg cttctccgaa gacgccgccg gcgtggaacg taacacagcg aggacacaga 2880
gactcgacgg agtcgggatc gacggtgtcg ggcaccatct cgagggagtc tgcaaccatg 2940
tcgacggagt ccggcagctc ctcgacggag tccggcacca tgtcgacggt gtccggcagc 3000
tcctcgacgg agtctggcac ctcctgcggc gccatgtcca cggtgtccag cgacgctatg 3060
gagcccgacg agatgtcctg cacggcgacg tccagcgccg caacggactc cgtcgtttcc 3120
atctgatccg acgaggcatc gacgtcctgc gacgagcgtg gcggcgagag cacggcgagc 3180
gggcaggcga gcgggcaggc gagcgagcca ttcgcgcgag cgatgaatgc gagctgctgt 3240
accaggcgca cacacgcgca atcaatgcgg gcgagtaacg atgcgagcat gcgcggcgga 3300
agcgcaacag acgggcagca gcgcatggcc aggggcaaac gcgtgaaaag aagaccacgc 3360
gaggccacaa cgtcagcttt tgcgcaaacg ggcacttcgc ctagaacgtc aggaatttcg 3420
ggtatggagg gagta 3435
<210> 4
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggctgacc caatagattc tggcttcgat ctgaacgttc ggttagaaga agatgatgac 60
ggcaatcttc cctttgatct caacgagcca atattggaag atcacaacaa tggaattgat 120
ttgaacttgc cattagatga gtttggtgcc gtcgacttcg actatgtaca aaacctcgct 180
gaacaagatg ttgaggctcc cgttcaagta caccctccga agcatgacta tcctgaacat 240
gttagaaaac tagtgtacca agcattgttg atgagaagca agaatgggaa actaggcaat 300
catgatacaa caattgtttc cagtcaattt ggagtaaaga ttcgatcagt tcagcgcata 360
tggaagcaag gtaaaaacca acttgctcaa aacattccgg tcgtggttgc taatctaaag 420
aaaggtagaa gtggccgtaa agcaacccct cttgatttgg aacaattgcg caacattcct 480
ctcaagcaaa gaatgaccat agaagatgtg tctagtagac ttggtattag caaatctagg 540
atacaaaggt atttgaaaaa gggtttgctt aggcgccact ctagtagcat aaaaccttac 600
ctcaccgatg ctaacaagaa gactaggttg aagtggtgca ttgacatgat tgagcaaggt 660
ttggttgatg atccaaagtt cagggatttg tttgactttg tgtttattga tgagaagtgg 720
ttctacctct ctcaaaaatc cgagagatac tacttgctac ccgacgaaga tgaaccacat 780
cgcacttgca agaacaagaa ttacatccct aggatcatgt ttttgtgtgt ttgtgctcgg 840
ccaagattta gaaatggaga atgtgtgttt gatggcaaaa taggttgttt tccactagtc 900
acttttgaac aagctattag aggaagccaa aaccgtcttc gtggagaaca agtaatcaag 960
ccaattcaat caattaatag ggaagtgata agagatttca tgataaatag agtgttgcct 1020
gcaattagag caaagtggcc aagagaagat gtacacaagc caattttcat acaacaagat 1080
aatgttccat ctcatttaaa ggtggatgat cctcagtttc gtgaggttgc taagcaagat 1140
gggtttgaca ttaggctcat atgtcaacca cccaattctc cagattttaa cattctagat 1200
ttgggttttt ttcgagctat tcaagcaatt caatacaaga aagatgctaa gacattgaaa 1260
gatctaattc cagcagtcca acaggcattt ttggagtact ctccatggaa agcaaatagg 1320
atatttgtga cactacaaac tgttttgaag gaagcaatga agataaaagg ttgcaacaaa 1380
atcaaaattc ctcacatcca gaaacaaaga cttgagagag aagataggct gccattgcaa 1440
atcccttgtg aagcttcctt gctagccgaa gcacttgcaa gccttcctgc agctaattag 1500
<210> 5
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Ala Asp Pro Ile Asp Ser Gly Phe Asp Leu Asn Val Arg Leu Glu
1 5 10 15
Glu Asp Asp Asp Gly Asn Leu Pro Phe Asp Leu Asn Glu Pro Ile Leu
20 25 30
Glu Asp His Asn Asn Gly Ile Asp Leu Asn Leu Pro Leu Asp Glu Phe
35 40 45
Gly Ala Val Asp Phe Asp Tyr Val Gln Asn Leu Ala Glu Gln Asp Val
50 55 60
Glu Ala Pro Val Gln Val His Pro Pro Lys His Asp Tyr Pro Glu His
65 70 75 80
Val Arg Lys Leu Val Tyr Gln Ala Leu Leu Met Arg Ser Lys Asn Gly
85 90 95
Lys Leu Gly Asn His Asp Thr Thr Ile Val Ser Ser Gln Phe Gly Val
100 105 110
Lys Ile Arg Ser Val Gln Arg Ile Trp Lys Gln Gly Lys Asn Gln Leu
115 120 125
Ala Gln Asn Ile Pro Val Val Val Ala Asn Leu Lys Lys Gly Arg Ser
130 135 140
Gly Arg Lys Ala Thr Pro Leu Asp Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ile Pro
145 150 155 160
Leu Lys Gln Arg Met Thr Ile Glu Asp Val Ser Ser Arg Leu Gly Ile
165 170 175
Ser Lys Ser Arg Ile Gln Arg Tyr Leu Lys Lys Gly Leu Leu Arg Arg
180 185 190
His Ser Ser Ser Ile Lys Pro Tyr Leu Thr Asp Ala Asn Lys Lys Thr
195 200 205
Arg Leu Lys Trp Cys Ile Asp Met Ile Glu Gln Gly Leu Val Asp Asp
210 215 220
Pro Lys Phe Arg Asp Leu Phe Asp Phe Val Phe Ile Asp Glu Lys Trp
225 230 235 240
Phe Tyr Leu Ser Gln Lys Ser Glu Arg Tyr Tyr Leu Leu Pro Asp Glu
245 250 255
Asp Glu Pro His Arg Thr Cys Lys Asn Lys Asn Tyr Ile Pro Arg Ile
260 265 270
Met Phe Leu Cys Val Cys Ala Arg Pro Arg Phe Arg Asn Gly Glu Cys
275 280 285
Val Phe Asp Gly Lys Ile Gly Cys Phe Pro Leu Val Thr Phe Glu Gln
290 295 300
Ala Ile Arg Gly Ser Gln Asn Arg Leu Arg Gly Glu Gln Val Ile Lys
305 310 315 320
Pro Ile Gln Ser Ile Asn Arg Glu Val Ile Arg Asp Phe Met Ile Asn
325 330 335
Arg Val Leu Pro Ala Ile Arg Ala Lys Trp Pro Arg Glu Asp Val His
340 345 350
Lys Pro Ile Phe Ile Gln Gln Asp Asn Val Pro Ser His Leu Lys Val
355 360 365
Asp Asp Pro Gln Phe Arg Glu Val Ala Lys Gln Asp Gly Phe Asp Ile
370 375 380
Arg Leu Ile Cys Gln Pro Pro Asn Ser Pro Asp Phe Asn Ile Leu Asp
385 390 395 400
Leu Gly Phe Phe Arg Ala Ile Gln Ala Ile Gln Tyr Lys Lys Asp Ala
405 410 415
Lys Thr Leu Lys Asp Leu Ile Pro Ala Val Gln Gln Ala Phe Leu Glu
420 425 430
Tyr Ser Pro Trp Lys Ala Asn Arg Ile Phe Val Thr Leu Gln Thr Val
435 440 445
Leu Lys Glu Ala Met Lys Ile Lys Gly Cys Asn Lys Ile Lys Ile Pro
450 455 460
His Ile Gln Lys Gln Arg Leu Glu Arg Glu Asp Arg Leu Pro Leu Gln
465 470 475 480
Ile Pro Cys Glu Ala Ser Leu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ser Leu Pro
485 490 495
Ala Ala Asn
<210> 6
<211> 779
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tactccctcc atacccgaaa ttcctgacgt ttaggacatg attgtggtaa ccaaggagtg 60
attaattagg ggttagtttt ccatctttgc ccctaataaa tatggttacg ggtgctcttt 120
gtacgagaaa gtaaaccagc tcgactggct agcgcgcgga ggcctcagtc ctgtggtgcg 180
cgttcgatac ctcgcggacg caggtttttt tcttgttgct gtttattcat ttttgcatgg 240
cactgtttag gcaacgcacg tcgcgcgcgc ttagccgctg cgggcgttag ttttcgagtg 300
gatttgggcc tggcgcacgg aggaggttgc atggctccgg cagctcctcg acggagtctg 360
gcacctcctg cggcgccatg tccacggtgt ccagcgacgc tatggagccc gacgagatgt 420
cctgcacggc gacgtccagc gccgcaacgg actccgtcgt ttccatctga tccgacgagg 480
catcgacgtc ctgcgacgag cgtggcggcg agagcacggc gagcgggcag gcgagcgggc 540
aggcgagcga gccattcgcg cgagcgatga atgcgagctg ctgtaccagg cgcacacacg 600
cgcaatcaat gcgggcgagt aacgatgcga gcatgcgcgg cggaagcgca acagacgggc 660
agcagcgcat ggccaggggc aaacgcgtga aaagaagacc acgcgaggcc acaacgtcag 720
cttttgcgca aacgggcact tcgcctagaa cgtcaggaat ttcgggtatg gagggagta 779

Claims (5)

1.一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体，其特征在于，所述的转座酶S171A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述Ppmar1转座酶S171A突变体的基因，其特征在于，编码所述转座酶S171A突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带有权利要求2所述的编码所述Ppmar1转座酶S171A突变体的基因。
4.一种工程菌株，其特征在于，所述工程菌株携带有权利要求3所述的重组质粒。
5.根据权利要求1所述的具有高催化活性的Ppmar1转座酶S171A突变体在构建酵母突变体中的应用。
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