JP2017513479A - 改善された挿入配列バイアスおよび拡大されたdnaインプット許容差のための修正トランスポザーゼ - Google Patents
改善された挿入配列バイアスおよび拡大されたdnaインプット許容差のための修正トランスポザーゼ Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017513479A JP2017513479A JP2016562588A JP2016562588A JP2017513479A JP 2017513479 A JP2017513479 A JP 2017513479A JP 2016562588 A JP2016562588 A JP 2016562588A JP 2016562588 A JP2016562588 A JP 2016562588A JP 2017513479 A JP2017513479 A JP 2017513479A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- transposase
- mutation
- dna
- library
- substitution mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 title claims abstract description 258
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 title claims abstract description 258
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 103
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 74
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 74
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 54
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 266
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 232
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 158
- 108010012306 Tn5 transposase Proteins 0.000 claims description 129
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 121
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 110
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 51
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 48
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 37
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 35
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 34
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 25
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 12
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 11
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 10
- 102220483600 Troponin I, cardiac muscle_E54V_mutation Human genes 0.000 claims description 10
- 102220483514 Troponin I, cardiac muscle_L372P_mutation Human genes 0.000 claims description 10
- 102220483626 Troponin I, cardiac muscle_M56A_mutation Human genes 0.000 claims description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 10
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 claims description 10
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 claims description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 claims description 8
- 102000016470 mariner transposase Human genes 0.000 claims description 8
- 108060004631 mariner transposase Proteins 0.000 claims description 8
- 108010063460 elongation factor T Proteins 0.000 claims description 7
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 claims description 3
- 125000003290 L-leucino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 3
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 40
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 abstract description 16
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 abstract description 16
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 88
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 69
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 37
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 30
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 21
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 21
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 19
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 19
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 16
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 15
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 14
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 101100310856 Drosophila melanogaster spri gene Proteins 0.000 description 13
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 238000001847 surface plasmon resonance imaging Methods 0.000 description 13
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 12
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 12
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 12
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 9
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 9
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 9
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101000707471 Homo sapiens Serine incorporator 3 Proteins 0.000 description 8
- 102100031727 Serine incorporator 3 Human genes 0.000 description 8
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 8
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 108010009127 mu transposase Proteins 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108010002459 HIV Integrase Proteins 0.000 description 5
- 241000405147 Hermes Species 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 241001660259 Cereus <cactus> Species 0.000 description 4
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 4
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 4
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000007482 whole exome sequencing Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- -1 0.01 mM to 0.05 mM Chemical class 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 2
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 2
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000012361 double-strand break repair Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000033607 mismatch repair Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N (4R,5S)-dethiobiotin Chemical compound C[C@@H]1NC(=O)N[C@@H]1CCCCCC(O)=O AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 241000224489 Amoeba Species 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000034286 G proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006612 Transducin Human genes 0.000 description 1
- 108010087042 Transducin Proteins 0.000 description 1
- 108010028230 Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 102000054999 human core Human genes 0.000 description 1
- 108700026469 human core Proteins 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000012177 large-scale sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000004094 preconcentration Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108010066533 ribonuclease S Proteins 0.000 description 1
- 210000004358 rod cell outer segment Anatomy 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 101150091813 shfl gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013024 troubleshooting Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本出願は、2014年4月15日に出願された米国仮特許出願第61/979,871号、2014年10月9日に出願された同第62/062,006号、2014年11月17日に出願された同第62/080,882号の優先権を主張し、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、2015年4月13日作成のIP-1198-TW_Sequencelisting.txtというファイルで提供され、サイズは103Kbである。配列表の電子フォーマットの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、本明細書では、野生型とトランスポザーゼと比較し修正した変異トランスポザーゼを提示する。改変トランスポザーゼは、下記の表1に記載の残基に機能的に同等な位置において、少なくとも1つのアミノ酸置換変異を含むことが可能である。表1は、トランスポザーゼ残基における置換変異を記載し、これは改善された挿入バイアスをもたらすことが示されている。表1に記載するように、本明細書で示す置換変異は、本明細書で配列番号1として例示する野生型Tn5トランスポザーゼ、または、他の部位に更なる変異を有するトランスポザーゼといった、任意の機能的トランスポザーゼバックボーンに存在し得、これには、過活動Tn5トランスポザーゼとして知られ、本明細書では配列番号11として例示するトランスポザーゼ配列にあるもの、例えば、米国特許第5925545号明細書、同第5965443号明細書、同第7083980号明細書、および同第7608434号明細書に組み込まれた事項に記載される1つまたは複数の変異が含まれる。
様々な型の突然変異誘発を本開示で任意に用いて、例えば、上記のトランスポザーゼモデルおよびモデル予測に従って、または、ランダムもしくは半ランダムな変異アプローチを用いて、例えば、トランスポザーゼを修飾して多様体を生成する。通常、任意の利用可能な突然変異誘発手順を、トランスポザーゼ変異体を作成するために用いることが可能である。このような突然変異誘発手順には、対象の1つまたは複数のアクティビティ(例えば、改善された挿入バイアス)のために、変異核酸および変異ポリペプチドを選択することが任意で含まれる。用いることが可能な手順には、部位特異的点突然変異誘発、ランダム点突然変異誘発(random point mutagenesis)、in vitroまたはin vivoの相同組み換え(DNAシャッフリングおよびコンビナトリアルオーバーラップPCR)、テンプレートを含むウラシルを用いた突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修正DNA突然変異誘発、ギャップ付き二重DNAを用いた突然変異誘発、点不一致修復、欠損修復宿主株を用いた突然変異誘発、制約選択および制約精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、縮重PCR、二重鎖切断修復、ならびに、当業者に既知の他の多くのものが含まれるが、これらに限定されない。変異用開始トランスポザーゼは本明細書に記載のもののうち何れかとすることが可能であり、これには、例えば、米国特許第5925545号明細書、同第5965443号明細書、同第7083980号明細書、および同第7608434号明細書、ならびにGoryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367 (1998) の開示内容(これらはそれぞれ、参照によりその全体が組み込まれる)で特定されるものといった、利用可能なトランスポザーゼ変異体が含まれる。
概して、本明細書に提示するトランスポザーゼをコードする核酸は、クローニング、組み換え、in vitro合成、in vitro増幅、および/または他の利用可能な方法により作成することが可能である。種々の組み換え方法を、本明細書に提示するトランスポザーゼをコードする発現ベクターを発現するために用いることが可能である。組み換え核酸を作成する方法、発現産物を発現する方法、および発現産物を単離する方法は、当技術分野では周知であり、記載されている。多くの例示的変異および変異の組み合わせ、ならびに所望の変異を設計するための方法を本明細書では記載する。トランスポザーゼの触媒ドメインにおいて変異を作成し選択する方法は、本明細書にあるほか、米国特許第5925545号明細書、同第5965443号明細書、同第7083980号明細書、および同第7608434号明細書で例示されており、これらはその全体が参照により組み込まれる。
本明細書で提示する改変トランスポザーゼは、in vitro転移技法などの配列決定手順において用いることが可能である。簡潔に言うと、in vitro転移は、トランスポソーム複合体と標的DNAを接触させることにより開始することが可能である。本開示のトランスポザーゼとともに用いるのに容易に適応させることが可能な例示的な転移手順および系は、例えば、国際公開第10/048605;米国特許出願公開第2012/0301925号明細書;同第2013/0143774号明細書に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書では、タグメント化反応用の、反応条件およびバッファを提示する。一部の実施形態では、二価カチオンをタグメント化反応バッファに含む。特定の実施形態では、二価カチオンは、例えば、Co2+、Mn2+、Mg2+、Cd2+、またはCa2+とすることが可能である。二価カチオンは、塩化物塩といった任意の適切な塩の形態で、例えば、CoCl2、MnCl2、MgCl2、酢酸マグネシウム、CdCl2、またはCaCl2として含めることが可能である。特定の実施形態では、下記の実施例で例示するようにタグメント化バッファはCoCl2を含む。実施例5の実験証拠により示すように、タグメント化バッファ配合におけるCoCl2の追加は、驚くべきことにタグメント化中の配列バイアスを改善する。
本明細書ではさらに、本明細書で提示する改変トランスポザーゼ酵素をコードする核酸分子を提示する。トランスポザーゼの変異バージョンである任意の所定改変トランスポザーゼであって、該改変トランスポザーゼのアミノ酸配列と、好適には、該トランスポザーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列も既知である、改変トランスポザーゼについては、分子生物学の基本原則に従って変異をコードするヌクレオチド配列を得ることが可能である。例えば、Tn5トランスポザーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列が既知である場合、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する、Tn5の任意の所定変異バージョンをコードするヌクレオチド配列を、標準遺伝子コードを用いて推定することが可能である。同様に、ヌクレオチド配列は、他のトランスポザーゼの変異バージョンについても容易に導き出すことが可能である。その後、必要なヌクレオチド配列を有する核酸分子を、当技術分野で既知の標準分子生物学を用いて構築することができる。
アッセイ法および条件の概略
以下の段落に下記に提示する実施例で用いるアッセイ条件の概略を記載する。
このセクションでは、トランスポザーゼの挿入バイアスをモニタリングするために、下記の実施例で用いるタグメント化アッセイについて記載する。簡潔に言うと、50ngのヒトゲノムDNAを、10mMTris酢酸、pH7.6、25mM酢酸マグネシウムにおいて、5μLのTDE1と共に5分間55℃でインキュベーションした。その後、125mMのHEPES、pH7.5、1MのNaCl、50mMのMgCl2の反応体積の1/5を加え、続いて、Tn5トランスポソームを100nMまで加え、60分間30℃でインキュベーションした。反応物はその後、Illumina社のNextera手順に記載されているように浄化および増幅し、HiSeq2000機器を用いた配列決定向けに提出した。
Tn5を、25mMのHEPES、pH7.6、125mMのKCl、18.75mMのNaCl、0.375mMのEDTA、31.75%のグリセロールにおいて、30分間室温で、アニール化トランスポゾンと共に20μMまでインキュベーションした。
トランスポゾンを、10mMのTrisHCl、pH7.5、50mMのNaCl、1mMのEDTAにおいて、反応物を94℃まで加熱し、それをゆっくりと室温まで冷却することにより、40μMまで別々にアニールした。Tn5−ME−Aでは、Tn5モザイク端配列A14(Tn5MEA)をTn5非移動配列(NTS)にアニールし、Tn5−ME−Bでは、Tn5端配列B15(Tn5MEB)をTn5非移動配列(NTS)にアニールした。これらの配列を以下に示す。
Tn5MEA: 5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’
Tn5MEB: 5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’
Tn5 NTS: 5’- CTGTCTCTTATACACATCT-3’
このセクションでは、下記の実施例で用いる様々なトランスポザーゼ変異体のクローニングおよび発現で用いるアプローチについて記載する。
挿入配列バイアスの分析を、IVC−プロットデータ(強度対サイクル)を用いて実行した。このデータは、各DNAトランスポザーゼを用いて生成したDNAライブラリを配列決定した後に、利用可能に生成した。簡潔に言うと、突然変異誘発および発現を上記のように実行した。トランスポザーゼを上記のトランスポゾンAおよびトランスポゾンBを用いてインキュベーションし、大腸菌ゲノムDNAと共にインキュベーションして、DNAライブラリを生成した。各ライブラリを、製造業者の指示書に従い、MiSeq Fast chemistry(Illumina社、カリフォルニア州、サンディエゴ)を行うIllumina社のGenome Analyzerにおいて、少なくとも35サイクルほど配列決定した。Illumina RTA ソフトウェアを用いて、各サイクルでベースコール(base call)と強度値を生成した。IVCプロットを生成するため、配列決定リードを大腸菌参照ゲノムに位置合わせし、各サイクルで4つの塩基それぞれの強度(発生)を、位置合わせした全ての配列決定リードの全強度値の画分としてプロットした。
挿入バイアスに対するTn5トランスポザーゼ変異の特定
この実施例は、IVC−プロットデータ(強度対サイクル)を用いた挿入配列バイアスの分析について記載する。このデータは、各DNAトランスポザーゼを用いて生成したDNAライブラリを配列決定した後に利用可能となった。この分析は、安定した結果をもたらすのにいくらかの配列決定リード(20k〜40k)のみを必要とし、各Tn5トランスポザーゼ多様体を発現するのに用いる大腸菌細胞溶解物で実行することが可能で、HTS(ハイスループットスクリーニング)目的に適っていた。
細菌gDNAにおける全ゲノム配列決定
これらの実験は、a)推定ライブラリサイズ/多様性およびb)AT/GC−ドロップアウトについて、様々なトランスポザーゼ変異体を比較するために行った。これらの実験は、精製し、アクティビティを正規化したTn5トランスポザーゼ多様体を用いて行った。これらの実験は、500k〜1Mの配列決定リード/実験を必要とする。
ヒトgDNAについてのNextera Rapid Capture Enrichment実験
以下の実験を、実施例3で上記したものと同じ、精製し、アクティビティを正規化したTn5トランスポザーゼ多様体を用いて行った。これらの実験は、典型的には40M〜100Mの配列決定リード/実験を必要とし、配列決定データを分析して、a)多様性、b)濃縮、c)カバレッジ、d)カバレッジ均一性、e)ペナルティスコアを比較した。
Tn5アクティビティに対するタグメント化バッファ組成物の効果
以下の実験を行い、ライブラリアウトプットおよび配列決定測定基準に対する、Tn5タグメント化バッファ組成物の効果および反応条件を特徴付けた。
Mos1アクティビティに対するタグメント化バッファ組成物の影響
以下の実験を行い、ライブラリアウトプットおよび配列決定測定基準に対する、Tn5タグメント化バッファ組成物の効果および反応条件を特徴付けた。
TS−Tn5059ライブラリ調製およびエクソーム濃縮プロトコル
一実施形態では、本発明の方法は、Tn5トランスポソームベースのエクソームライブラリの調製および濃縮に対し、合理化ワークフローを提供する。
TS−Tn5059挿入バイアス
トランスポザーゼは、タグメント化反応において、ある挿入部位(DNA配列)バイアスを有する場合がある。DNA配列バイアスは、ゲノムのある領域(例えば、GC−リッチ、またはAT−リッチ)をタグメント化ライブラリからドロップさせ得る。例えば、Tn5トランスポザーゼは、ゲノムのGC−リッチ領域に対しあるバイアスを有する。その結果、ゲノムのAT領域はTn5タグメント化ライブラリにおいてドロップする場合がある。より完全なゲノムカバレッジを提供するため、最少の配列バイアスが望ましい。
TS−Tn5059DNAインプット許容差
タグメント化ライブラリの調製に、酵素DNA断片化ステップ(例えば、トランスポソーム仲介タグメント化)を用いることから、例えば機械的断片化方法と比較し、DNAインプットに対しより影響を受けやすい場合がある。一実施例では、現在のNextera(登録商標) Rapid Capture Enrichmentプロトコルは、50ngの総ゲノムDNAインプットに対し最適化されている。より高質量のゲノムDNAインプットは、不完全なタグメント化およびより大きい挿入サイズをもたらす可能性があり、これは、次の濃縮動作に影響を与え得る。より低質量のゲノムDNAインプットまたは低品質のゲノムDNAは、タグメント化反応において、予想より小さい挿入サイズを生成する可能性がある。より小さい挿入物は、次の浄化ステップ中に失われ、ライブラリ多様性が低下する場合がある。
Claims (85)
- 野生型Tn5トランスポザーゼと比較し修正され、位置Asp248で変異を含む、変異Tn5トランスポザーゼ。
- 位置Asp248での前記変異は置換変異である、請求項1に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Asp248での前記置換変異には、Tyr、Thr、Lys、Ser、Leu、Ala、Trp、Pro、Gln、Arg、Phe、およびHisからなる群から選択される残基への変異が含まれる、請求項2に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Asp248における前記変異は、位置Asp248の後ろでの挿入変異である、請求項1に記載のトランスポザーゼ。
- 前記挿入変異は、位置Asp248の後ろへの疎水性残基の挿入を含む、請求項4に記載のトランスポザーゼ。
- 前記挿入変異は、位置Asp248の後ろへのバリン残基の挿入を含む、請求項5に記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼはさらに、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54および/またはMet56および/またはLeu372と機能的に同等な位置で置換変異を含む、請求項1〜6の何れかに記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼは、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54Lysおよび/またはMet56Alaおよび/またはLeu372Proに対し相同な置換変異を含む、請求項7に記載のトランスポザーゼ。
- 野生型Tn5トランスポザーゼと比較し修正され、位置Asp119で変異を含む、変異Tn5トランスポザーゼ。
- 位置Asp119での前記変異は置換変異である、請求項9に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Asp119での前記置換変異は疎水性残基への変異を含む、請求項10に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Asp119での前記置換変異は親水性残基への変異を含む、請求項10に記載のトランスポザーゼ。
- Asp119での前記置換変異は、Leu、Met、Ser、Ala、およびValからなる群から選択される残基への変異を含む、請求項10に記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼはさらに、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54および/またはMet56および/またはLeu372と機能的に同等の位置で置換変異をさらに含む、請求項9〜13の何れかに記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼは、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54Lysおよび/またはMet56Alaおよび/またはLeu372Proに対し相同な置換変異を含む、請求項14に記載のトランスポザーゼ。
- 野生型Tn5トランスポザーゼと比較し修正され、位置Trp125で変異を含む、変異Tn5トランスポザーゼ。
- 位置Trp125での前記変異は置換変異である、請求項16に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Trp125での前記置換変異はメチオニン残基への変異を含む、請求項17に記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼはさらに、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54および/またはMet56および/またはLeu372と機能的に同等な位置で置換変異を含む、請求項16〜18の何れかに記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼは、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54Lysおよび/またはMet56Alaおよび/またはLeu372Proに対し相同な置換変異を含む、請求項19に記載のトランスポザーゼ。
- 野生型Tn5トランスポザーゼと比較し修正され、位置Lys120で変異を含む、変異Tn5トランスポザーゼ。
- 位置Lys120での前記変異は置換変異である、請求項21に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Lys120での前記置換変異は嵩高い芳香族残基への変異を含む、請求項22に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Lys120での前記置換変異は、Tyr、Phe、Trp、およびGluからなる群から選択した残基への変異を含む、請求項22に記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼはさらに、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54および/またはMet56および/またはLeu372と機能的に同等な位置で置換変異を含む、請求項21〜24の何れかに記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼは、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54Lysおよび/またはMet56Alaおよび/またはLeu372Proに対し相同な置換変異を含む、請求項25に記載のトランスポザーゼ。
- 野生型Tn5トランスポザーゼと比較し修正され、Lys212および/またはPro214および/またはAla338の位置で変異を含む、変異Tn5トランスポザーゼ。
- Lys212および/またはPro214および/またはAla338の位置で前記変異は置換変異である、請求項27に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Lys212での前記置換変異はアルギニンへの変異を含む、請求項28に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Pro214での前記置換変異はアルギニンへの変異を含む、請求項28に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Ala338での前記置換変異はバリンへの変異を含む、請求項28に記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼはさらに、Gly251での置換変異を含む、請求項27〜31の何れかに記載のトランスポザーゼ。
- 位置Gly251での前記置換変異はアルギニンへの変異を含む、請求項32に記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼはさらに、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54および/またはMet56および/またはLeu372と機能的に同等な位置で置換変異を含む、請求項27〜33の何れかに記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼは、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54Lysおよび/またはMet56Alaおよび/またはLeu372Proに対し相同な置換変異を含む、請求項34に記載のトランスポザーゼ。
- 野生型Tn5トランスポザーゼと比較し修正され、Glu146および/またはGlu190および/またはGly251の位置で変異を含む、変異Tn5トランスポザーゼ。
- Glu146および/またはGlu190および/またはGly251の位置での前記変異は置換変異である、請求項36に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Glu146での前記置換変異はグルタミンへの変異を含む、請求項37に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Glu190での前記置換変異はグリシンへの変異を含む、請求項37に記載のトランスポザーゼ。
- 位置Gly251での前記置換変異はアルギニンへの変異を含む、請求項37に記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼはさらに、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54および/またはMet56および/またはLeu372と機能的に同等な位置で置換変異を含む、請求項36〜40の何れかに記載のトランスポザーゼ。
- 前記トランスポザーゼは、前記Tn5トランスポザーゼのアミノ酸配列のGlu54Lysおよび/またはMet56Alaおよび/またはLeu372Proに対し相同な置換変異を含む、請求項41に記載のトランスポザーゼ。
- 配列番号2〜10、12〜20、25、および26の何れか一つのアミノ酸配列を含む、変異Tn5トランスポザーゼ。
- ポリペプチド融合ドメインに融合した、野生型トランスポザーゼまたは変異トランスポザーゼを含む、修正トランスポザーゼ。
- 前記ポリペプチド融合ドメインは前記トランスポザーゼのN末端に融合する、請求項44に記載の修正トランスポザーゼ。
- 前記ポリペプチド融合ドメインは前記トランスポザーゼのC末端に融合する、請求項44に記載の修正トランスポザーゼ。
- 前記ポリペプチド融合ドメインは精製タグを含む、請求項44に記載の修正トランスポザーゼ。
- 前記ポリペプチド融合ドメインは可溶性を高めるタグを含む、請求項44に記載の修正トランスポザーゼ。
- 前記ポリペプチド融合ドメインは、マルトース結合タンパク質(MBP)、伸長因子Ts(Tsf)、5−メチルシトシン結合ドメイン、およびタンパク質Aから選択されるドメインを含む、請求項44に記載の修正トランスポザーゼ。
- 請求項1〜49の何れかで定義される変異Tn5トランスポザーゼをコードする、核酸分子。
- 請求項50に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項51のベクターを含む、宿主細胞。
- 次の構成要素:(i)請求項1〜49の何れか一項に記載の変異Tn5トランスポザーゼを含むトランスポソーム複合体と;(ii)標的DNAとが、相互作用することを可能にするステップを含む、in vitro転移のための方法。
- 標的DNAを配列決定するための方法であって、
(a)前記標的DNAをトランスポソーム複合体と共にインキュベーションするステップであって、該トランスポソーム複合体は、
(1)請求項1〜47の何れか一項に記載の変異Tn5トランスポザーゼと;
(2)第1ポリヌクレオチドとを含み、該第1ポリヌクレオチドは、
(i)トランスポゾン端配列を有する3’部分と、
(ii)第1配列決定タグドメインを有する第1タグとを備え、
該ステップは、前記標的DNAを断片化し、そして、前記第1ポリヌクレオチドの3’トランスポゾン端配列を前記断片の5’端に移動させる条件下で行われ、
それにより、二本鎖断片が生成され、ここにおいて前記5’端は前記第1タグでタグ付けされ、前記5’タグ付き鎖の3’端には一本鎖ギャップがある、ステップと;
(b)第2タグが前記5’タグ付き鎖の3’端に付着する条件下で、前記断片を核酸修飾酵素と共にインキュベーションするステップと;
(c)ポリメラーゼおよび前記第1ポリヌクレオチドの一部分に対応する増幅プライマーを提供することにより、前記断片を任意に増幅し、それにより、前記5’端に前記第1タグを、前記3’端に第2タグを有する、2つタグ付けされた断片の代表ライブラリを生成するステップと;
(d)前記第1配列決定タグドメインに対応する部分を含む第1配列決定プライマーを提供するステップと;
(e)前記第1配列決定プライマーを伸長し、並行して、2つタグ付けされた断片の前記代表ライブラリの第1配列決定タグドメインに隣接するヌクレオチドの同一性を検出するステップと、を含む方法。 - (1)請求項1〜49の何れか一項に記載の変異Tn5トランスポザーゼと;
(2)トランスポゾン端配列を有する3’部分を備えるポリヌクレオチドとを備えたトランスポソーム複合体を含む、in vitro転移反応を実行するためのキット。 - 配列番号21のアミノ酸配列を含む半保存されたドメインへの置換変異を含み、前記置換変異は、位置2におけるTrp、Asn、Val、またはLys以外の任意の残基への変異を含む、改変トランスポザーゼ。
- 前記変異にはMetへの置換を含む、請求項56に記載の改変トランスポザーゼ。
- トランスポザーゼ酵素およびCo2+を、Mg2+を含むバッファ中の同一酵素と比較し、GCバイアスを縮小するのに十分効果的な濃度で含む、タグメント化反応バッファ。
- 前記Co2+は、約5mM〜約40mMの範囲の濃度である、請求項58に記載のタグメント化反応バッファ。
- 前記Co2+は約5mM〜約20mMの範囲の濃度である、請求項58に記載のタグメント化反応バッファ。
- 前記Co2+は約8mM〜約12mMの範囲の濃度である、請求項58に記載のタグメント化反応バッファ。
- 前記Co2+は約10mMの濃度である、請求項58に記載のタグメント化反応バッファ。
- 次の構成要素:(i)トランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体と;(ii)標的DNAと、(iii)トランスポザーゼ酵素およびCo2+を、Mg2+を含むバッファ中の同一酵素と比較し、GCバイアスを縮小するのに十分効果的な濃度で含む、タグメント化反応バッファとが、相互作用することを可能にするステップを含む、in vitro転移のための方法
- 前記Co2+は約5mM〜約40mMの範囲の濃度である、請求項63に記載の方法。
- 前記Co2+は約5mM〜約20mMの範囲の濃度である、請求項63に記載の方法。
- 前記Co2+は約8mM〜約12mMの範囲の濃度である、請求項63に記載の方法。
- 前記トランスポザーゼ酵素は、請求項1〜49の何れか一項に記載の変異Tn5トランスポザーゼを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記トランスポザーゼ酵素はMos−1トランスポザーゼを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記トランスポザーゼ酵素は、過活動Tn5トランスポザーゼを含む、請求項63に記載の方法。
- 野生型Tn5トランスポザーゼと比較しDNAインプット許容差の拡大を呈す、変異Tn5トランスポザーゼ。
- 前記変異トランスポザーゼは配列番号19のアミノ酸配列を含む、請求項70の変異Tn5トランスポザーゼ。
- 前記変異Tn5トランスポザーゼは、nM変異Tn5トランスポザーゼ:ngインプットDNAが≧2.4の比率で、DNAインプット許容差の拡大を呈す、請求項71に記載の変異Tn5トランスポザーゼ。
- ある範囲の標的DNAインプット量にわたり、均一な断片サイズを生成する方法であって、
標的DNAを提供するステップと、
前記標的DNAをトランスポザーゼとインキュベーションするステップとを含み、
前記標的DNAの量はある範囲の標的DNA量から選択され、前記トランスポザーゼのアミノ酸配列は、配列番号10のC末端から最後少なくとも400個のアミノ酸を含み、前記トランスポザーゼは、前記標的DNAを断片化し、均一な断片サイズを生成する、方法。 - 前記標的DNAはゲノムDNAである、請求項73に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAは原核生物DNAである、請求項74に記載の方法。
- 前記原核生物DNAは細菌DNAである請求項75に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAは真核生物ゲノムDNAである、請求項74に記載の方法。
- 前記真核生物ゲノムDNAはヒトゲノムDNAである、請求項77に記載の方法。
- 前記標的DNA量は約1ng〜200ngの範囲である、前記請求項73〜78の何れかに記載の方法。
- 標的DNAを、ある範囲の標的DNAインプット量にわたって配列決定するための方法であって、
(a)前記標的DNAをトランスポソーム複合体と共にインキュベーションするステップであって、該トランスポソーム複合体は、
(1)配列番号19のアミノ酸配列を備える変異Tn5トランスポザーゼと;
(2)第1ポリヌクレオチドとを含み、該第1ポリヌクレオチドは、
(i)トランスポゾン端配列を有する3’部分と、
(ii)第1配列決定タグドメインを有する第1タグとを備え、
ここにおいて標的DNAの量は、ある範囲の標的DNA量から選択され、
該ステップは、前記標的DNAを断片化し、そして、前記第1ポリヌクレオチドの3’トランスポゾン端配列を前記断片の5’端に移動させる条件下で行われ、
それにより、二本鎖断片が生成され、ここにおいて前記5’端は前記第1タグでタグ付けされ、前記5’タグ付き鎖の3’端には一本鎖ギャップがある、ステップと;
(b)第2タグが前記5’タグ付き鎖の3’端に付着する条件下で、前記断片を核酸修飾酵素と共にインキュベーションするステップと;
(c)ポリメラーゼおよび前記第1ポリヌクレオチドの一部分に対応する増幅プライマーを提供することにより、前記断片を任意に増幅し、それにより、前記5’端に前記第1タグを、前記3’端に第2タグを有する2つタグ付けされた断片の代表ライブラリを生成するステップと;
(d)前記第1配列決定タグドメインに対応する部分を含む第1配列決定プライマーを提供するステップと;
(e)前記第1配列決定プライマーを伸長し、並行して、2つタグ付けされた断片の前記代表ライブラリの第1配列決定タグドメインに隣接するヌクレオチドの同一性を検出するステップと、を含む方法。 - 前記標的DNAの量は、約1ng〜200ngの範囲である、請求項80に記載の方法。
- 前記nM変異Tn5トランスポザーゼ:ngインプットDNAの比率は、≧2.4である、請求項81に記載の方法。
- エクソーム濃縮のために使用される、請求項73に記載の方法。
- 配列番号26のアミノ酸配列を有する、請求項70に記載の変異Tn5トランスポザーゼ。
- 配列番号2〜10、12〜20、25、および26の何れか一つのうち、少なくとも400アミノ酸配列というアミノ酸配列を含む、変異Tn5トランスポザーゼ。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461979871P | 2014-04-15 | 2014-04-15 | |
US61/979,871 | 2014-04-15 | ||
US201462062006P | 2014-10-09 | 2014-10-09 | |
US62/062,006 | 2014-10-09 | ||
US201462080882P | 2014-11-17 | 2014-11-17 | |
US62/080,882 | 2014-11-17 | ||
PCT/US2015/025889 WO2015160895A2 (en) | 2014-04-15 | 2015-04-15 | Modified transposases for improved insertion sequence bias and increased dna input tolerance |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017513479A true JP2017513479A (ja) | 2017-06-01 |
JP2017513479A5 JP2017513479A5 (ja) | 2018-05-31 |
JP6490710B2 JP6490710B2 (ja) | 2019-03-27 |
Family
ID=53008897
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016562588A Active JP6490710B2 (ja) | 2014-04-15 | 2015-04-15 | 改善された挿入配列バイアスおよび拡大されたdnaインプット許容差のための修正トランスポザーゼ |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US9790476B2 (ja) |
EP (2) | EP3132029A2 (ja) |
JP (1) | JP6490710B2 (ja) |
CN (2) | CN113005108A (ja) |
AU (2) | AU2015247779B2 (ja) |
CA (1) | CA2946046A1 (ja) |
SG (1) | SG11201608585RA (ja) |
TW (1) | TWI682997B (ja) |
WO (1) | WO2015160895A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020534803A (ja) * | 2017-08-30 | 2020-12-03 | カパ バイオシステムズ, インコーポレイテッド | トランスポザーゼ組成物、製造方法およびスクリーニング方法 |
Families Citing this family (109)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10221442B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US10584381B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-03-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10752949B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
CN113528634A (zh) | 2012-08-14 | 2021-10-22 | 10X基因组学有限公司 | 微胶囊组合物及方法 |
US10323279B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10273541B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-04-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US11591637B2 (en) | 2012-08-14 | 2023-02-28 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US9951386B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
EP3567116A1 (en) | 2012-12-14 | 2019-11-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10533221B2 (en) | 2012-12-14 | 2020-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
KR102190198B1 (ko) | 2013-02-08 | 2020-12-14 | 10엑스 제노믹스, 인크. | 폴리뉴클레오티드 바코드 생성 |
EP4234716A3 (en) | 2013-06-25 | 2023-12-06 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
WO2015157567A1 (en) | 2014-04-10 | 2015-10-15 | 10X Genomics, Inc. | Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same |
TWI682997B (zh) | 2014-04-15 | 2020-01-21 | 美商伊路米納有限公司 | 用於改善插入序列傾向及增加dna輸入耐受度之經修飾的轉位酶 |
EP3715468A1 (en) | 2014-06-13 | 2020-09-30 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for preparing sequencing libraries |
EP3161160B1 (en) | 2014-06-26 | 2021-10-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations |
WO2016003814A1 (en) | 2014-06-30 | 2016-01-07 | Illumina, Inc. | Methods and compositions using one-sided transposition |
JP2017532042A (ja) | 2014-10-29 | 2017-11-02 | 10エックス ゲノミクス,インコーポレイテッド | 標的化核酸配列決定のための方法及び組成物 |
WO2016073690A1 (en) * | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Illumina, Inc. | Transposase compositions for reduction of insertion bias |
US9975122B2 (en) | 2014-11-05 | 2018-05-22 | 10X Genomics, Inc. | Instrument systems for integrated sample processing |
US10900065B2 (en) | 2014-11-14 | 2021-01-26 | University Of Washington | Methods and kits for labeling cellular molecules |
SG11201705615UA (en) | 2015-01-12 | 2017-08-30 | 10X Genomics Inc | Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same |
US10988805B2 (en) | 2015-02-20 | 2021-04-27 | The Regents Of The University Of California | Methods related to DNA sequencing |
EP4286516A3 (en) | 2015-02-24 | 2024-03-06 | 10X Genomics, Inc. | Partition processing methods and systems |
WO2016138148A1 (en) | 2015-02-24 | 2016-09-01 | 10X Genomics, Inc. | Methods for targeted nucleic acid sequence coverage |
CA2982146A1 (en) | 2015-04-10 | 2016-10-13 | Spatial Transcriptomics Ab | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
WO2016196358A1 (en) * | 2015-05-29 | 2016-12-08 | Epicentre Technologies Corporation | Methods of analyzing nucleic acids |
CN108431232B (zh) | 2015-12-04 | 2022-10-14 | 10X 基因组学有限公司 | 用于核酸分析的方法和组合物 |
SG11201807444PA (en) * | 2016-03-10 | 2018-09-27 | Univ Leland Stanford Junior | Transposase-mediated imaging of the accessible genome |
US11932847B2 (en) * | 2016-04-19 | 2024-03-19 | Kapa Biosystems, Inc. | Transposase competitor control system |
WO2017197338A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Microfluidic systems and methods of use |
CN106222164B (zh) * | 2016-07-28 | 2020-04-21 | 元码基因科技(北京)股份有限公司 | 利用转座子酶进行体外核酸单向扩增的方法、组合物和试剂盒 |
EP4435116A2 (en) | 2016-08-05 | 2024-09-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Second strand direct |
EP3553180B1 (en) * | 2016-12-07 | 2022-05-04 | MGI Tech Co., Ltd. | Method for constructing single cell sequencing library and use thereof |
CN110139932B (zh) | 2016-12-19 | 2024-05-17 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 液滴加标的相邻性保留的标签化dna |
CN106754811B (zh) * | 2016-12-21 | 2019-05-14 | 南京诺唯赞生物科技有限公司 | 一种突变型Tn5转座酶及其制备方法和应用 |
US10011872B1 (en) | 2016-12-22 | 2018-07-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10815525B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-10-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10550429B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
CN106801044B (zh) * | 2017-01-09 | 2021-03-23 | 北京全式金生物技术有限公司 | 一种环状转座子复合物及其应用 |
CN117512066A (zh) | 2017-01-30 | 2024-02-06 | 10X基因组学有限公司 | 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统 |
KR102607830B1 (ko) | 2017-02-21 | 2023-12-01 | 일루미나, 인코포레이티드 | 링커를 갖는 고정된 트랜스포좀을 사용한 태그먼트화 |
US10400235B2 (en) | 2017-05-26 | 2019-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
CN109526228B (zh) | 2017-05-26 | 2022-11-25 | 10X基因组学有限公司 | 转座酶可接近性染色质的单细胞分析 |
JP7241069B2 (ja) | 2017-09-25 | 2023-03-16 | フレッド ハッチンソン キャンサー センター | 高効率標的in situゲノムワイドプロファイリング |
WO2019084043A1 (en) | 2017-10-26 | 2019-05-02 | 10X Genomics, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS |
EP3704247B1 (en) | 2017-11-02 | 2023-01-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Transposase-based genomic analysis |
EP3625361A1 (en) | 2017-11-15 | 2020-03-25 | 10X Genomics, Inc. | Functionalized gel beads |
US10829815B2 (en) | 2017-11-17 | 2020-11-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles |
CN108285494B (zh) * | 2018-02-11 | 2021-09-07 | 北京大学 | 一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法 |
CN112005115A (zh) | 2018-02-12 | 2020-11-27 | 10X基因组学有限公司 | 表征来自单个细胞或细胞群体的多种分析物的方法 |
WO2019184044A1 (zh) * | 2018-03-27 | 2019-10-03 | 上海欣百诺生物科技有限公司 | 一种转座酶-抗体结合蛋白的融合蛋白及其制备与应用 |
WO2019195166A1 (en) | 2018-04-06 | 2019-10-10 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for quality control in single cell processing |
US11932899B2 (en) | 2018-06-07 | 2024-03-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules |
CN108913712B (zh) * | 2018-07-17 | 2021-04-02 | 厦门生命互联科技有限公司 | 一种重组Tn5转座酶的表达纯化方法 |
US11479816B2 (en) | 2018-08-20 | 2022-10-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions |
FI3887540T3 (fi) | 2018-11-30 | 2023-09-14 | Illumina Inc | Useiden analyyttien analyysi käyttäen yhtä määritystä |
US20220049294A1 (en) | 2018-12-10 | 2022-02-17 | 10X Genomics, Inc. | Imaging system hardware |
KR20210104650A (ko) | 2018-12-17 | 2021-08-25 | 일루미나, 인코포레이티드 | 서열분석용 라이브러리를 제작하기 위한 방법 및 수단 |
US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
US11845983B1 (en) | 2019-01-09 | 2023-12-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for multiplexing of droplet based assays |
KR20210114918A (ko) | 2019-01-11 | 2021-09-24 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 복합체 표면-결합 트랜스포좀 복합체 |
EP3924505A1 (en) | 2019-02-12 | 2021-12-22 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
US11467153B2 (en) | 2019-02-12 | 2022-10-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
US20220042078A1 (en) | 2019-04-29 | 2022-02-10 | Illumina, Inc. | Identification and analysis of microbial samples by rapid incubation and nucleic acid enrichment |
EP3976820A1 (en) | 2019-05-30 | 2022-04-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
CN113226519A (zh) | 2019-07-12 | 2021-08-06 | Illumina剑桥有限公司 | 使用电泳制备核酸文库 |
WO2021092433A2 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
CN110938610B (zh) * | 2019-12-16 | 2020-12-01 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种转座酶突变体、融合蛋白、其制备方法和应用 |
ES2946357T3 (es) | 2019-12-23 | 2023-07-17 | 10X Genomics Inc | Métodos para el análisis espacial usando ligación con molde de ARN |
US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
US12076701B2 (en) | 2020-01-31 | 2024-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics |
US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
CN115916999A (zh) | 2020-04-22 | 2023-04-04 | 10X基因组学有限公司 | 用于使用靶向rna耗竭进行空间分析的方法 |
EP4414459A3 (en) | 2020-05-22 | 2024-09-18 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
WO2021237087A1 (en) | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
US12031177B1 (en) | 2020-06-04 | 2024-07-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods of enhancing spatial resolution of transcripts |
EP4162074B1 (en) | 2020-06-08 | 2024-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
EP4172362B1 (en) | 2020-06-25 | 2024-09-18 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of dna methylation |
US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
CN116171330A (zh) | 2020-08-06 | 2023-05-26 | Illumina公司 | 使用小珠连接的转座体制备rna和dna测序文库 |
WO2022040176A1 (en) | 2020-08-18 | 2022-02-24 | Illumina, Inc. | Sequence-specific targeted transposition and selection and sorting of nucleic acids |
US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
CN112164419A (zh) * | 2020-09-04 | 2021-01-01 | 云舟生物科技(广州)有限公司 | 在orf中插入蛋白标签的方法以及计算机存储介质 |
EP4211238A4 (en) * | 2020-09-11 | 2024-09-18 | Fred Hutchinson Cancer Center | ENHANCED HIGHLY EFFICIENT TARGETED IN-SITU PANGENOME PROFILING |
US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
MX2023004461A (es) | 2020-10-21 | 2023-05-03 | Illumina Inc | Plantillas de secuenciacion que comprenden multiples insertos y composiciones y metodos para mejorar la productividad de secuenciacion. |
US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
EP4121555A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-01-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
AU2022212231A1 (en) | 2021-01-29 | 2023-08-03 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample |
EP4288534A1 (en) * | 2021-02-05 | 2023-12-13 | Ospedale San Raffaele S.r.l. | Engineered transposase and uses thereof |
CN112795563A (zh) * | 2021-03-23 | 2021-05-14 | 上海欣百诺生物科技有限公司 | 生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC-seq产物中的用途及方法 |
WO2022212269A1 (en) | 2021-03-29 | 2022-10-06 | Illumina, Inc. | Improved methods of library preparation |
AU2022246579A1 (en) | 2021-03-30 | 2023-09-21 | Illumina, Inc. | Improved methods of isothermal complementary dna and library preparation |
MX2023011218A (es) | 2021-03-31 | 2023-10-02 | Illumina Inc | Métodos de preparación de genotecas de secuenciación de tagmentación direccional usando tecnología basada en transposón con identificadores moleculares únicos para la corrección de errores. |
EP4334442A1 (en) * | 2021-05-03 | 2024-03-13 | European Molecular Biology Laboratory | Methods for isolating and/or obtaining captured polynucleotide fragments |
WO2022256503A1 (en) | 2021-06-03 | 2022-12-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis |
WO2023034489A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-03-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
CN114807084B (zh) * | 2022-04-26 | 2023-05-16 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 突变型Tn5转座酶及试剂盒 |
WO2023225519A1 (en) | 2022-05-17 | 2023-11-23 | 10X Genomics, Inc. | Modified transposons, compositions and uses thereof |
CN115948363B (zh) * | 2022-08-26 | 2024-02-27 | 武汉影子基因科技有限公司 | Tn5转座酶突变体及其制备方法和应用 |
CN115785283B (zh) * | 2022-11-02 | 2024-05-31 | 武汉影子基因科技有限公司 | PAG-Tn5突变体及其应用 |
WO2024137934A1 (en) * | 2022-12-21 | 2024-06-27 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Use of pa-tn5 to generate dna libraries |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5925545A (en) * | 1996-09-09 | 1999-07-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation | System for in vitro transposition |
JP2003505104A (ja) * | 1999-08-02 | 2003-02-12 | ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 変異体tn5トランスポザーゼ酵素及びその使用方法 |
WO2004093645A2 (en) * | 2003-04-17 | 2004-11-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Tn5 transposase mutants and the use thereof |
US7608434B2 (en) * | 2004-08-04 | 2009-10-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Mutated Tn5 transposase proteins and the use thereof |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5677170A (en) | 1994-03-02 | 1997-10-14 | The Johns Hopkins University | In vitro transposition of artificial transposons |
US5965443A (en) | 1996-09-09 | 1999-10-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | System for in vitro transposition |
US6159736A (en) * | 1998-09-23 | 2000-12-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for making insertional mutations using a Tn5 synaptic complex |
US7262056B2 (en) * | 2001-11-08 | 2007-08-28 | Mirus Bio Corporation | Enhancing intermolecular integration of nucleic acids using integrator complexes |
KR100890187B1 (ko) | 2007-09-06 | 2009-03-25 | 고려대학교 산학협력단 | Tsf를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 |
US9080211B2 (en) * | 2008-10-24 | 2015-07-14 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
ES2743029T3 (es) * | 2008-10-24 | 2020-02-18 | Epicentre Tech Corporation | Composiciones de extremo del transposón y métodos para modificar ácidos nucleicos |
US9005935B2 (en) | 2011-05-23 | 2015-04-14 | Agilent Technologies, Inc. | Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases |
US20130143774A1 (en) | 2011-12-05 | 2013-06-06 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for generating polynucleic acid fragments |
TWI682997B (zh) | 2014-04-15 | 2020-01-21 | 美商伊路米納有限公司 | 用於改善插入序列傾向及增加dna輸入耐受度之經修飾的轉位酶 |
-
2015
- 2015-04-15 TW TW104112180A patent/TWI682997B/zh active
- 2015-04-15 EP EP15719091.9A patent/EP3132029A2/en active Pending
- 2015-04-15 US US14/686,961 patent/US9790476B2/en active Active
- 2015-04-15 AU AU2015247779A patent/AU2015247779B2/en active Active
- 2015-04-15 CN CN202110295229.2A patent/CN113005108A/zh active Pending
- 2015-04-15 SG SG11201608585RA patent/SG11201608585RA/en unknown
- 2015-04-15 WO PCT/US2015/025889 patent/WO2015160895A2/en active Application Filing
- 2015-04-15 EP EP20208323.4A patent/EP3845640A3/en active Pending
- 2015-04-15 CA CA2946046A patent/CA2946046A1/en active Pending
- 2015-04-15 JP JP2016562588A patent/JP6490710B2/ja active Active
- 2015-04-15 CN CN201580027103.XA patent/CN106507677B/zh active Active
-
2017
- 2017-10-12 US US15/782,757 patent/US10035992B2/en active Active
-
2018
- 2018-06-28 US US16/021,417 patent/US10385323B2/en active Active
-
2019
- 2019-04-29 US US16/397,542 patent/US10544403B2/en active Active
-
2021
- 2021-09-22 AU AU2021236488A patent/AU2021236488B2/en active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5925545A (en) * | 1996-09-09 | 1999-07-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation | System for in vitro transposition |
JP2003505104A (ja) * | 1999-08-02 | 2003-02-12 | ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 変異体tn5トランスポザーゼ酵素及びその使用方法 |
WO2004093645A2 (en) * | 2003-04-17 | 2004-11-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Tn5 transposase mutants and the use thereof |
US7083980B2 (en) * | 2003-04-17 | 2006-08-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Tn5 transposase mutants and the use thereof |
US7608434B2 (en) * | 2004-08-04 | 2009-10-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Mutated Tn5 transposase proteins and the use thereof |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
FEMS MICROBIOL. LETT., vol. 274, JPN6019004909, 2007, pages 132 - 138, ISSN: 0003977611 * |
JBC, vol. 273, no. 13, JPN6019004906, 1998, pages 7367 - 7374, ISSN: 0003977609 * |
JMB, vol. 271, JPN6019004908, 1997, pages 362 - 373, ISSN: 0003977610 * |
MOL. MICROBIOL., vol. 67, no. 3, JPN6019004904, 2008, pages 528 - 540, ISSN: 0003977608 * |
SCIENCE, vol. 289, JPN6019004902, 2000, pages 77 - 85, ISSN: 0003977607 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020534803A (ja) * | 2017-08-30 | 2020-12-03 | カパ バイオシステムズ, インコーポレイテッド | トランスポザーゼ組成物、製造方法およびスクリーニング方法 |
JP7402156B2 (ja) | 2017-08-30 | 2023-12-20 | カパ バイオシステムズ, インコーポレイテッド | トランスポザーゼ組成物、製造方法およびスクリーニング方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SG11201608585RA (en) | 2016-11-29 |
TWI682997B (zh) | 2020-01-21 |
US9790476B2 (en) | 2017-10-17 |
US10385323B2 (en) | 2019-08-20 |
US20180171311A1 (en) | 2018-06-21 |
EP3132029A2 (en) | 2017-02-22 |
AU2021236488A1 (en) | 2021-10-21 |
TW201621048A (zh) | 2016-06-16 |
AU2015247779A1 (en) | 2016-11-03 |
US20150291942A1 (en) | 2015-10-15 |
AU2021236488B2 (en) | 2024-06-20 |
US20190359955A1 (en) | 2019-11-28 |
WO2015160895A2 (en) | 2015-10-22 |
AU2015247779B2 (en) | 2021-06-24 |
EP3845640A2 (en) | 2021-07-07 |
US10035992B2 (en) | 2018-07-31 |
CN106507677B (zh) | 2021-03-12 |
US20180298356A1 (en) | 2018-10-18 |
WO2015160895A3 (en) | 2016-01-14 |
JP6490710B2 (ja) | 2019-03-27 |
EP3845640A3 (en) | 2021-09-01 |
CN113005108A (zh) | 2021-06-22 |
US10544403B2 (en) | 2020-01-28 |
CN106507677A (zh) | 2017-03-15 |
CA2946046A1 (en) | 2015-10-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6490710B2 (ja) | 改善された挿入配列バイアスおよび拡大されたdnaインプット許容差のための修正トランスポザーゼ | |
JP5389882B2 (ja) | Dnaインサート増殖およびファージディスプレイ法のためのタンパク質発現の切り離し | |
US10344269B2 (en) | Recombinase mutants | |
JP6921829B2 (ja) | リコンビナーゼ変異体 | |
US20080318298A1 (en) | Uncoupling of DNA insert propagation and expression of protein for phage display | |
US6818410B2 (en) | Methods of isolating RNA-binding proteins and compositions related to the same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180413 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180413 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190213 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190219 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190227 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6490710 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |