JP2001507565A - 改変tn5トランスポザーゼを使用したインビトロ転位用システム - Google Patents
改変tn5トランスポザーゼを使用したインビトロ転位用システムInfo
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.以下を含む、転位性DNA配列をインビトロで転位させるシステム: 野生型Tn5トランスポザーゼを改変したTn5トランスポザーゼであって 、当該改変トランスポザーゼが、野生型Tn5トランスポザーゼよりも強いア ビディティーでTn5外側端繰り返し配列に当該改変トランスポザーゼを結合 させる当該野生型Tn5トランスポザーゼに対する変化、および当該改変トラ ンスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を当該野生型トランスポザ ーゼよりも低下させる野生型Tn5トランスポザーゼに対する変化を含む前記 改変Tn5トランスポザーゼ; 転位性DNA配列を含むドナーDNA分子であって、当該転位性DNA配列 がその5'および3'末端でTn5外側端繰り返し配列と接している前記ドナー DNA分子;および、 当該転位性遺伝因子がその中に転位することができる標的DNA分子。 2.より強いアビディティーで当該改変トランスポザーゼを結合させる変化が、 野生型トランスポザーゼの54位における置換変異という特徴を有する、請求項 1に記載のシステム。 3.54位がリジンである、請求項2に記載のシステム。 4.当該改変トランスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を低下させ る変化が、当該野生型トランスポザーゼの372位における置換変異という特徴 を有する、請求項1に記載のシステム。 5.372位がプロリンである請求項4に記載のシステム。 6.当該改変トランスポザーゼがさらに野生型トランスポザーゼの56位に置換変 異を含む、請求項1に記載のシステム。 7.56位がアラニンである、請求項6に記載のシステム。 8.当該ドナーDNA分子がその5'および3'末端で、10位にヌクレオチドA、 11位にヌクレオチドTおよび12位にヌクレオチドAを含む18または19塩基対の 隣接DNA配列と接する、請求項1に記載のシステム。 9.当該フランキング配列がさらに、AおよびTからなる群から選ばれるヌクレ オチドを4位に含む、請求項8に記載のシステム。 10.当該フランキング配列がさらに、GおよびCからなる群から選ばれるヌクレ オチドを15位に含む、請求項8に記載のシステム。 11.当該フランキング配列がさらに、AおよびTからなる群から選ばれるヌクレ オチドを17位に含む、請求項8に記載のシステム。 12.当該フランキング配列がさらに、GおよびCからなる群から選ばれるヌクレ オチドを18位に含む、請求項8に記載のシステム。 13.当該フランキング配列が配列5'−CTGTCTCTTATACACATC T−3'を有する、請求項8に記載のシステム。 14.当該フランキング配列が配列5'−CTGTCTCTTATACAGATC T−3'を有する、請求項8に記載のシステム。 15.以下の変化を含む、野生型Tn5トランスポザーゼを改変したTn5トラン スポザーゼ: 野生型Tn5トランスポザーゼよりも強いアビディティーでドナーDNAの Tn5外側端繰り返し配列に当該改変トランスポザーゼを結合させる野生型T n5トランスポザーゼに対する変化;および、 当該改変トランスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を当該野生 型トランスポザーゼよりも低下させる野生型Tn5トランスポザーゼに対する 変化。 16.当該改変トランスポザーゼを強いアビディティーで結合させる当該変化が、 当該野生型トランスポザーゼの54位における置換変異という特徴を有する、請 求項15に記載の改変Tn5トランスポザーゼ。 17.54位がリジンである、請求項16に記載の改変Tn5トランスポザーゼ。 18.当該改変トランスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を低下させ る当該変化が、当該野生型トランスポザーゼの372位における置換変異という 特徴を有する、請求項15に記載の改変Tn5トランスポザーゼ。 19.372位がプロリンである請求項18に記載の改変Tn5トランスポザーゼ。 20.さらに野生型トランスポザーゼの56位に置換変異を含む、請求項15に記載の 改変Tn5トランスポザーゼ。 21.56位がアラニンである、請求項20に記載の改変Tn5トランスポザーゼ。 22.Tn5外側端の繰り返しに対して強いアビディティーを有し、さらに野生型 Tn5トランスポザーゼよりも不活性なマルチマー形をとる可能性が低いTn 5トランスポザーゼをコードすることができるヌクレオチド配列を含む遺伝的 構築物。 23.当該トランスポザーゼのアミノ酸54にリジン残基をコードするヌクレオチド 配列を含む、請求項22に記載の遺伝的構築物。 24.当該トランスポザーゼのアミノ酸372にプロリン残基をコードするヌクレオ チド配列を含む、請求項22に記載の遺伝的構築物。 25.当該トランスポザーゼのアミノ酸54にリジン残基、および当該トランスポザ ーゼのアミノ酸372にプロリン残基をコードするヌクレオチド配列を含む、請 求項22に記載の遺伝的構築物。 26.配列番号:1のヌクレオチド配列を含む、請求項22に記載の遺伝的構築物。 27.10位にヌクレオチドA、11位にヌクレオチドTおよび12位にヌクレオチドA を含む18または19塩基対の隣接DNA配列がその5'および3'端に隣接してい る転位性DNA配列を含む遺伝的構築物。 28.TおよびAからなる群から選ばれるヌクレオチドをさらに当該フランキング 配列の4位に含む、請求項27の構築物。 29.GおよびCからなる群から選ばれるヌクレオチドをさらに当該フランキング 配列の15位に含む、請求項27の構築物。 30.TおよびAからなる群から選ばれるヌクレオチドをさらに当該フランキング 配列の17位に含む、請求項27の構築物。 31.GおよびCからなる群から選ばれるヌクレオチドをさらに当該フランキング 配列の18位に含む、請求項27の構築物。 32.当該フランキング配列が、配列5'−CTGTCTCTTATACACAT CT−3'を有する、請求項27に記載の構築物。 33.当該フランキング配列が、配列5'−CTGTCTCTTATACAGAT CT−3'を有する、請求項27に記載の構築物。 34.インビトロ転位方法であって、 その5'および3'端にTn5外側端繰り返し配列が隣接している問題の転位 性DNA配列を含むドナーDNA分子を、標的DNA分子および野生型Tn5 トランスポザーゼを改変したTn5トランスポザーゼとともに適切な反応緩衝 液中で生理学的温度より低い温度で、当該改変トランスポザーゼが当該外側端 繰り返し配列と結合するまで混合する工程一緒;および、 当該酵素がインビトロ転位を触媒するために十分な時間、当該温度を生理学 的温度に上昇させる工程、 からなる方法であって、当該改変トランスポザーゼが、野生型Tn5トランス ポザーゼよりも強いアビディティーで当該Tn5外側端繰り返し配列に当該改 変トランスポザーゼを結合させる野生型Tn5トランスポザーゼに対する変化 、および当該改変トランスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を当 該野生型トランスポザーゼよりも低下させる野生型Tn5トランスポザーゼに 対する変化を含んでいることを特徴とする方法。 35.当該改変トランスポザーゼを強いアビディティーで結合させる当該変化が、 当該野生型トランスポザーゼの54位における置換変異という特徴を有する、請 求項34に記載の方法。 36.54位がリジンである、請求項35に記載の方法。 37.当該改変トランスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を低下させ る当該変化が、当該野生型トランスポザーゼの372位における置換変異という 特徴を有する、請求項34に記載の方法。 38.372位がプロリンである、請求項37に記載の方法。 39.当該改変トランスポザーゼがさらに野生型トランスポザーゼの56位に置換変 異を含む、請求項34に記載の方法。 40.56位がアラニンである請求項39に記載の方法。 41.10位にヌクレオチドA、11位にヌクレオチドTおよび12位にヌクレオチドA を含む18または19塩基対の隣接DNA配列が、当該問題のDNA配列の5'お よび3'端に隣接している、請求項34に記載の方法。 42.当該フランキング配列が、さらにAおよびTからなる群から選ばれるヌクレ オチドを4位に含む、請求項41に記載の方法。 43.当該フランキング配列が、さらにGおよびCからなる群から選ばれるヌクレ オチドを15位に含む、請求項41に記載の方法。 44.当該フランキング配列が、さらにAおよびTからなる群から選ばれるヌクレ オチドを17位に含む、請求項41に記載の方法。 45.当該フランキング配列が、さらにGおよびCからなる群から選ばれるヌクレ オチドを18位に含む、請求項41に記載の方法。 46.当該フランキング配列が、配列5'−CTGTCTCTTATACACAT CT−3'を有する、請求項41に記載の方法。 47.当該フランキング配列が、配列5'−CTGTCTCTTATACAGAT CT−3'を有する、請求項41に記載の方法。
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