CN108265101A - 一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法，包括以下步骤：（1）测活底物同转座酶和反应缓冲液混合（2）进行转座反应（3）加入变性剂（如SDS、盐酸胍等）使转座酶变性，分离转座酶和DNA片段（4）加入够识别底物标记的介质，结合未反应的底物（5）通过选择性手段（如离心、过滤、浓缩等）去除结合了底物的介质（6）检测释放出的带标记的DNA的含量，同标准数值比较，得到Tn5转座酶的活性。该测活方法操作简便、快速，结果重复性好，十分适合于大批量生产中Tn5转座酶的酶活检测。

Description

一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法。

背景技术

随着测序技术的发展，高通量测序已经广泛的应用于基因组学、转录组学、和医学检测等多个领域，高通量测序技术服务及其相关的测序建库试剂耗材已经成为商业化生物技术产业的一个重要的分支。高通量测序技术包括建库，测序反应和数据处理三个步骤，建库步骤处理待测序的DNA，制备可用于测序的DNA片段；测序反应利用DNA聚合酶的合成反应，结合荧光检测技术，测定DNA片段的序列；数据处理步骤比对和拼接所得的DNA片段序列，最终获得完整的DNA序列。在这三个步骤中，测序反应步骤的自动化程度最高，主要步骤全部由测序仪器完成；数据处理步骤其次，由各类生物信息学软件完成比对和拼接，部分较为困难的数据辅助人工分析和判断；建库步骤是自动化程度最低的步骤，需要大量的人工和试剂。

由于目前的高通量测序技术只能检测短片段的DNA（约150-300bp），测定长片段DNA序列时，需要将长片段的DNA打断成150-300bp的短片段，在片段两端连接特定组合的接头以便于测序数据的分析和拼接。这个过程就是建库。根据打断方法的不同，可以将建库方法分为物理法和酶法，物理法包括雾化和超声打断DNA，酶法包括DNA片段化酶（Fragmentase）、DNA剪切酶（Shearase）和转座酶（Tn5 Transposase）等，除转座酶外，其他的所有建库方法都包含打断DNA，修复DNA片段和DNA片段加接头几个步骤，其中DNA片段加接头一般通过DNA连接酶，需要耗费较多的时间。使用转座酶建库时，上述的三个步骤整合成为一体，仅一步就可以完成打断DNA和DNA片段加接头，可以使建库反应在2个小时内完成。

Tn5转座酶是IS4家族的复合转座子Tn5内部由IS50序列编码的转座酶，包含476个氨基酸残基，分子量53kDa。转座酶能够识别成对的末端序列（End sequence），经过“剪切和粘贴”的方式，完成转座反应。转座酶的转座反应包括以下几个步骤（图1）：

首先，Tn5转座酶识别供体DNA片段中的末端序列，两个Tn5转座酶分子结合，形成活性二聚体；活性二聚体在末端序列的外侧切割双链DNA，将末端序列和其间的DNA从供体DNA上切割下来；之后，活性二聚体同受体DNA结合，二聚体切割受体DNA，形成9bp的粘性末端；活性二聚体随后催化末端序列同受体DNA片段的粘性末端连接，完成转座反应。在体外的反应条件下，完成反应的Tn5转座酶依然同受体DNA片段紧密结合，需要使用变性剂等失活Tn5转座酶才能将其同受体DNA片段分离。目前在体内介导这一分离过程的机理还不太清楚。

目前已知的能够被转座酶识别的末端序列有OE（Outer end，SEQ ID NO 1），IE（Inner end，SEQ ID NO 2）和ME（Mosaic end，SEQ ID NO 3），OE和IE分别是Tn5转座子中IS50序列的外末端序列和内末端序列，转座酶对于OE的选择性高于IE；ME序列是经过突变优化后的序列，转座酶对于ME的选择性高于OE序列。

酶制剂生产过程中不同生产批次间酶活稳定是保证产品品质的重要条件，这就使得酶活测定成为转座酶生产过程中的重要环节。目前已有的转座酶酶活定量测定方法全部是基于阳性菌斑计数的方法，例如Pulkkinen E et al. An assay to monitor theactivity of DNA transposition complexes yields a general quality controlmeasure for transpositional recombination reactions. Mob Genet Elements.2014. 4(5):1-8.和Pajunen MI et al. Universal platform for quantitativeanalysis of DNA transposition. Mob DNA. 2010. 1(1):24.报道的方法。这些方法都是使用转座反应，将报告基因（催化显色反应的酶，有毒蛋白等）导入到细菌细胞（如大肠杆菌等），通过检测细菌（或显色细菌）菌斑数量来间接检测转座酶的活性。这些检测过程均使用转化方法使转座酶和报告基因进入细菌细胞内部，这就使得测试结果（阳性菌斑）同转化效率密切相关；而转化实验本身的稳定性较差，转化的结果同感受态细胞的效价有很大关系，在具体的实验操作过程中，即便是保存在-80°C，想要长时间保证感受态细胞效价的稳定性也是十分困难的。同时由于涉及到细菌培养，整体测活反应时间较长。这就使得Tn5转座酶的生产中，不同生产批次间酶活测定和比较成为一个麻烦的问题。

发明内容

有鉴于此，开发快速稳定的Tn5转座酶活性测定方法是十分必要的。本发明的目的是提供一种Tn5转座酶活性测定方法，此方法直接通过检测经过转座反应释放出的标记性DNA的含量，得到Tn5转座酶的活性，无需转化和细菌培养，操作快速，重复性好。

本发明中，我们构建了一种快速稳定的Tn5转座酶测活方法。所述Tn5转座酶测活方法使用一种易于检测的Tn5转座酶底物，当Tn5转座酶和测活底物混合后，Tn5转座酶识别测活底物序列中的末端序列，进而催化转座反应，将底物DNA切断，释放带有标记的DNA片段。未反应的底物可以通过能够识别底物标记的介质，经过介质吸附和介质移除的方式去除。通过检测被释放的DNA片段的含量，同标准数据比对，来计算出Tn5转座酶的酶活。

本发明所述的测活反应，包括一下步骤：

（1）测活底物同转座酶和反应缓冲液混合

（2）进行转座反应

（3）加入变性剂（如SDS、盐酸胍等）使转座酶变性，分离转座酶和DNA片段

（4）加入够识别底物标记的介质，结合未反应的底物

（5）通过选择性手段（如离心、过滤、浓缩等）去除结合了底物的介质

（6）检测释放出的带标记的DNA的含量，同标准数值比较，得到Tn5转座酶的活性

本发明所述的测活底物为线性DNA，两端使用不同的标记物标记，其中一端的标记为固定用标记，标记后的DNA片段能够同珠子、膜或填料等结合，方便标记后的DNA的收集。所述测活底物固定用标记可以选择生物素、抗体和地高辛等，优选生物素标记。所述测活底物的另一端的标记为检测性标记，标记后的DNA片段，能够发光、荧光、催化显色反应和具有放射性等，方便标记后DNA片段含量的检测。所述测活底物的检测性标记可以选择过氧草酸酯类、荧光素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和放射性同位素等，优选荧光素标记。本发明所述的测活底物，其序列中包含有可以被Tn5转座酶识别的末端序列。所述末端序列可以时IE、OE和ME序列或者这些序列的组合，优选的末端序列为ME。所述测活底物中所包含的末端序列的数量不限，优选1个或2个末端序列。当测活底物中含有1个末端识别序列时，两分子测活底物同两分子Tn5转座酶结合，完成转座反应；当测活底物中含有2个末端识别序列时，一分子测活底物同两分子Tn5转座酶结合，完成转座反应。

本发明所述的测活反应，反应缓冲液为天津强微特生物生产的Tn5转座酶的反应缓冲液，包括5xLM缓冲液和10xTPS缓冲液。本发明所述的测活反应，也可以使用其他有文献报道的，能够发挥Tn5转座酶活性的缓冲液。本发明所述的测活反应温度可以从20摄氏度至56摄氏度，当在低温反应时，反应时间需要相应的延长，例如在37摄氏度反应时，反应时间为2小时，在56度反应时，反应时间为10分钟。本发明所述的测活反应，优选56度反应10分钟。

本发明所述的测活方法中，用于分离Tn5转座酶和DNA片段的变性剂包括尿素、SDS和盐酸胍等，优选SDS。所述变性剂SDS在反应体系中的终浓度要求大于0.1%，优选0.5%。

本发明所述的测活方法中，测活反应结束后用于除去未反应底物的介质是能够同测活底物固定用标记特异性结合的介质，包括珠子、膜和填料等介质，优选珠子。本发明所述的去除结合未反应底物介质的方法，包括离心、浓缩和过滤等方法，优选离心方法。

本发明所述的检测被释放的DNA片段的含量的方法，依据测活底物检测性标记的类型而定，包括显色反应、化学发光检测、荧光检测和放射性检测等，优选荧光检测。

附图说明

图1，Tn5转座酶的反应机理。

图2，Tn5测活方法的反应机理。

具体实施方式

结合具体实施例进行说明。

实施例1

1.Tn5转座酶的活性测定实验参数：

测活底物两端分别采用生物素和荧光素标记，包含2个ME序列。

（1）在100μL的反应体系中，准备以下测活反应体系：

5xLM缓冲液 20μL

10xTPS缓冲液 10μL

测活底物 2μg

Tn5转座酶（活性待测） 5μL

去离子水 至100μL

（2）56度反应10分钟

（3）向反应中加入5μL的10%SDS溶液，混合均匀

（4）加入5μg链霉亲和素珠子，混合均匀，室温放置20分钟

（5）12000g离心取上清，去除链霉亲和素珠子

（6）测量上清溶液的荧光值，同标准数值比较，得到溶液中转座酶的活性。

序列表

<110> 天津强微特生物科技有限公司

<120> 一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法

<160> 3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 转座子Tn5

<400> 1

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<213> 转座子Tn5

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Claims (2)

1.一种Tn5转座酶的酶活测定方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）测活底物同转座酶和反应缓冲液混合（2）进行转座反应（3）加入变性剂（如SDS、盐酸胍等）使转座酶变性，分离转座酶和DNA片段（4）加入够识别底物标记的介质，结合未反应的底物（5）通过选择性手段（如离心、过滤、浓缩等）去除结合了底物的介质（6）检测释放出的带标记的DNA的含量，同标准数值比较，得到Tn5转座酶的活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物为线性DNA，两端分别包含固定用标记和检测性标记，固定用标记优选生物素，检测性标记优选荧光素，所述底物的序列中包含有不限数量的、可以被Tn5转座酶识别的末端序列，末端序列优选ME序列，数量优选2个。