JP4361971B2 - 改変tn5トランスポザーゼを使用したインビトロ転位用システム - Google Patents
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Description
本特許出願は、”インビトロ転位用システム”と題する特許出願(1997年3月11日出願)の部分継続出願である。当該出願については出願番号は未だ付与されていない。出願人らは、親出願に1996年9月9日の出願日が付与されるよう申請している。
連邦政府助成研究または開発に関する記述
適用なし。
発明の背景
本発明は、一般に転位性核酸の分野に関し、より具体的には改変されたトランスポザーゼの製造、および核酸に遺伝的変化を導入するシステムで当該改変トランスポザーゼを使用することに関する。
転位性遺伝因子は、ゲノム内の1つの場所から別の場所へ移動または転位することができる、広範囲の原核生物および真核生物で見出されるDNA配列である。インビボでは、染色体と別の非染色体性遺伝物質との間の転位と同様に染色体内転位が知られている。いくつかの系では、転位は、典型的には転位性遺伝因子によってコードされる転移酵素の制御下にあることが分かっている。種々の転位性遺伝因子の遺伝子構造および転位メカニズムは、例えば”転位性遺伝因子”(「分子生物学辞典(The Encyclopedia of Molecular Biology)”より、Kendrew & Lawrence編、Blackwell Science,Ltd.,刊、オックスフォード(1994)、この文献は参照により本明細書に含まれる)に要約されている。
バクテリオファージMuの特定の転位性遺伝因子および細菌のトランスポゾンTn10を利用するインビトロ転位システムが、それぞれキヨシ・ミズウチおよびナンシー・クレックナー(Nancy Kleckner)の研究グループによって記載された。
バクテリオファージMu系は最初以下の人々によって記載された:K.Mizuuchi,Cell:785-794(1983),”細菌ファージMuのインビトロ転位:新規な複製反応への生化学的アプローチ”;およびR.Craigieら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:7570-7574(1985),”バクテリオファージMuの転位開始におけるDNA鎖転移反応のための規定系;タンパク質およびDNA基質要求”。Muのインビトロ反応のためのDNAドナー基質(ミニMu)は、通常6つのMu転移酵素結合部位(各末端に3つの30bpをもつ)およびその左端から約1kbの位置にあるエンハンサー配列を要求する。このドナープラスミドは高次コイル化されていなければならない。要求されるタンパク質は、MuによってコードされるAおよびBタンパク質、並びにホストによってコードされるHUおよびIHFタンパク質である(B.D.Lavoie & G.Chaconas,Curr.Topics Microbiol.Immunol.,204:83-99(1995),”ファージMuDNAの転位”)。このMu由来系は、Mu終端部(terminus)が複雑で精密であるために、さらに転位がトランスポザーゼ以外の新たなタンパク質を要求するためにインビトロ転位システムとして用いるには有利ではない。
Tn10系は以下の人々によって記載された:D.Morisato & N.Kleckner,Cell,51:101-111(1987),”インビトロにおけるTn10転位と環形成”;およびH.W.Benjamin & N.Kleckner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4648-4652(1992),”転位時のTn10のドナー部位からの切り出しはトランスポゾン終端部の二本鎖フラッシュ切断によって生じる”。このTn10系は、転位性遺伝因子を含む高次コイル化環状DNA分子(または直線状DNA分子+大腸菌IHFタンパク質)を必要とする。この転位性遺伝因子の範囲は、逆方向繰り返し配列に近いIHF結合部位をもつ複雑な42bp末端配列によって明らかにされる。実際には報告された実験ではもっと長い(81bp)Tn10端が用いられた(J.Sakaiら、E.M.B.J.,14:4374-4383(1995),”Tn10転位の初期中間体である切断前接合複合体の特定と性状決定”)。このTn10系では、トランスポザーゼタンパク質の化学処理が活発な転位を得るために必須である。さらに、Tn10遺伝因子の終端部は、普遍化されたインビトロ転位システムでの用途を限定する。
Mu由来およびTn10由来インビトロ転位システムは両方とも共有結合による閉環高次コイルのDNA標的に対してのみ活性を有するという点でさらに制限を受ける。要求されることは、より短くてより範囲が明らかな終端部を利用し、いかなる構造(直線状、弛緩型環状、および高次コイル環状DNA)の標的DNAに対しても活性を有する、より広範囲に適用可能なインビトロ転位システムである。
発明の要旨
本発明の骨子は、細菌のトランスポゾンTn5の適切に改変されたトランスポザーゼ調製物、転位性遺伝因子を含むドナーDNA分子、転位性遺伝因子をその中に転位させることができる標的DNA分子(これらは全て適切な緩衝液中に提供される)を含むインビトロ転位システムである。
ドナーDNA分子の転位性遺伝因子は、対象となる転位性DNA配列として特徴付けられる。この対象となるDNA配列は、Tn5トランスポザーゼによってトランス型態様(in trans)で作用される短い繰り返し配列とその5’および3’末端で接する。
本発明はさらに、この適切に改変された変異酵素は野生型Tn5のトランスポザーゼと2種類の相違を有すると要約される。ここで各々の種類は、酵素の全体的な転位活性に対してそれぞれ別々の測定可能な作用を有し、さらに両方の改変が存在する場合はより大きな効果が認められる。適切に改変された酵素は、(1)野生型Tn5のトランスポザーゼよりも大きなアビディティーでドナーDNAの繰り返し配列と結合し(“クラス(1)変異”)、さらに(2)不活性なマルチマー形をとる可能性が野生型タンパク質より低い(“クラス(2)変異”)。クラス(1)およびクラス(2)の両改変を含む本発明の適切に改変されたTn5トランスポザーゼは、インビボ共役アッセイで一緒に調べた場合、野生型酵素より少なくとも約100倍(±10%)の転位を誘導する。インビボ共役アッセイは文献に記載されたとおりである(Weinreich,Genes and Development,8:2363-2374(1994),”Tn5トランスポザーゼのシス型優先性は非生産性マルチマー化によってもたらされることを示す証拠”、この文献は参照により本明細書に含まれる)。最適な条件下では、改変トランスポザーゼを用いる転位がより高いであろう。クラス(1)変異のみを含む改変トランスポザーゼは、野生型Tn5トランスポザーゼよりも十分に強いアビディティーで繰り返し配列と結合し、そのようなTn5トランスポザーゼは、インビボで測定した場合野生型酵素よりも約5から50倍強い転位を誘発する。クラス(2)変異のみを有する改変トランスポザーゼは、マルチマー形をとる可能性が野生型Tn5トランスポザーゼより十分に低く、そのようなTn5トランスポザーゼは、インビボで測定した場合野生型酵素よりまた約5から50倍強い転位を誘発する。
別の特徴では、本発明の骨子は、転位性遺伝因子をドナーDNAから標的DNAにインビトロで転位させる方法であり、当該方法は、適切に改変されたTn5トランスポザーゼタンパク質、ドナーDNAおよび標的DNAを適切な反応緩衝液中で一緒に混合し、当該酵素をドナーDNAの隣接する繰り返し配列と0℃より高いが約28℃より低い温度で結合させ、さらに切断および鎖の転位が生じる生理学的温度(約37℃)に当該温度を上昇させる工程を含む。
本発明の目的は、構造的要求が少なく高い効率をもつ有用なインビトロ転位システムを提供することである。
本発明の別の目的は種々の用途に広く応用できる方法を提供することである。これら種々の用途は、例えば、絶対欠損変異体を作出し、選択マーカーを標的DNAに提供し、相同性を有する移動性領域を標的DNAに提供し、標的DNAへの特定のDNA配列の挿入を促進し、DNA配列決定のためにプライマー結合部位または標識を提供し、遺伝子発現研究およびタンパク質ドメインのマッピングのために遺伝子融合の生成を促進し、さらにまた他の所望の組み合わせのDNA配列を合体させること(寄せ集め遺伝子)である。
本発明の特色は、当該改変トランスポザーゼ酵素は野生型Tn5トランスポザーゼより堅固にDNAに結合するということである。
本発明の利点は、当該改変トランスポザーゼは、(インビボで測定したとき)野生型トランスポザーゼを用いた場合に達成されるよりも少なくとも約100倍高いインビトロ転位反応率を達成するということである。野生型Tn5トランスポザーゼは、本発明のシステムでは検出可能なインビトロ活性を示さないということは特記されるべきである。したがって、活性増加の上限を算出することが困難であるが、インビトロ転位の生成物をインビボでアッセイした場合に数千でないとしても数百のコロニーが観察される。
本発明の別の利点は、本システムを用いるインビトロ転位は、環状または直線状のドナーDNAおよび標的DNAを用いることができるということである。
本発明のまた別の利点は、本システムを用いるインビトロ転位は、外部の高エネルギー供給源を必要とせず、さらに当該改変トランスポザーゼ以外の他のタンパク質も必要としないことである。
本発明の他の目的、特色および利点は、以下の詳細な説明を熟考するにつれて明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
図1は、1対のTn5外側端終端部の間に位置する転位性遺伝因子のインビトロ転位を示すために本明細書で用いられるテストプラスミドpRZTL1を表す。プラスミドpRZTL1はまた配列番号:3に記載されている。
図2は、インビトロ転位の前後におけるプラスミドpRZTL1の電気泳動分析を示す。環状および直線状プラスミド基質の両方を用いて得た結果を示す。
図3は、インビトロ転位後のプラスミドpRZTL1の電気泳動分析を示す。これには環状および直線状プラスミド基質を用いて得られる分子種の更なる分析が含まれる。
図4は、本明細書で詳しく述べるプラスミドpRZ1496、pRZ5451およびpRZTL1を示す。
図5は、EK54/MA56トランスポザーゼに対してインビボでテストした種々の変異OE配列について時間の経過にしたがってコロニー当たりのパピラの出現を図表に示す。
図6は、EK54/MA56トランスポザーゼに対してテストした種々の変異OE配列について時間の経過にしたがってコロニー当たりのパピラの出現を図5よりもY軸の数値がより小さい図表で示す
図7は、MA56・Tn5トランスポザーゼに対してテストした種々の変異OE配列について時間の経過にしたがってコロニー当たりのパピラの出現を図表に示す。
図8は、MA56およびEK54/MA56トランスポザーゼに対してテストした、2つの好ましい変異体を用いたインビボ転位を示す。
発明の詳細な説明
本技術が、ドナーDNAからいずれの転位性遺伝因子をも標的DNAに導入することができる単純なインビトロシステムを提供することは理解されよう。Tn5の転位は1対のOE終端部(転位性遺伝因子のいずれかの側に位置する)のみを必要とすることは一般に理解されている。これらのOE終端部は、一般に長さが18または19塩基で互いに逆方向の繰り返しとなっている(R.C.Johnson & W.S.Reznikoff,Nature,304:280(1983)、この文献は参照により本明細書に含まれる)。このTn5の逆方向繰り返し配列(たとえそれらがドナーDNA分子の終端部に存在する必要がなくともこれを“終端部”と呼ぶ)は、周知であり理解されている。
所望の転位性遺伝因子が標準的なTn5外側端(”OE”)の終端部と隣接しなければならないことを除けば、ドナーDNAまたは標的DNAのいずれかに関する他の用件はほとんど無いと考えられる。Tn5は挿入部位について存在するとしてもほんの僅かの優先性しかもたないので、所望の配列を標的DNAにランダムに導入するために当該システムを使用することが可能である。したがって、本方法(本明細書に開示する改変トランスポザーゼおよび単純なドナーDNAを用いる)は広範囲に応用が可能で、いかなる標的DNAにもそのヌクレオチドの配列に関係なく変化を導入することができる。したがって、分子生物学分野の人々にとって興味のある多くの問題に応用できるであろう。
本方法では、改変トランスポザーゼタンパク質は、ドナーDNAおよび標的DNAと適切な反応緩衝液中で混合される。適切な反応緩衝液は転位反応を惹起させる。好ましい(必ずしも最適というわけではない)緩衝液は、DNAを凝縮させるためのスペルミジン、グルタミンおよびマグネシウムを界面活性剤とともに含む。界面活性剤は、好ましくは3−〔(3−コラミドプロピル)ジメチル−アンモニオ〕−1−プロパンスルホネート(”CHAPS”)である。混合物は、当該OE終端部への酵素の結合を促進するために0℃より高く、高くとも約28℃の温度で保温することができる。実施例で発明者らが用いた緩衝液の条件下では、30℃の予備処理温度は適切ではなかった。好ましい温度範囲は16℃から28℃である。最も好ましい予備処理温度は約20℃である。しかしながら異なる緩衝液の条件下では、この結合工程のためには生理的温度以下の異なる温度を用いることも可能であろう。短時間の予備処理(最適化されてはいなかったが、短くとも30分、長くとも2時間、典型的には1時間)の後、反応混合物を2容の適切な反応緩衝液で希釈し、生理学的条件に移してさらに数時間(例えば2−3時間)切断および鎖の移動を惹起させる。37℃またはその周辺の温度が適切である。約3時間後、転位率は顕著に低下する。反応はフェノール・クロロホルム抽出によって停止させ、続いてエタノール沈澱によって脱塩することができる。
DNAを通常の精製手段を用いて精製した場合は、インビトロ転位法ではより単純な反応条件を用いることが可能である。分子生物学の実験室で現在一般的に用いられているタイプの樹脂(例えばキアゲン(Qiagen)プラスミド精製キット(カタログ番号12162)のキアゲン樹脂)にDNA調製物を通すことによって、十分に高い純度のDNAを調製することができる。そのような高品質DNAを用いた場合は、CHAPSは反応緩衝液から省略できる。CHAPSが反応緩衝液から除外される場合は、反応物を上記のように希釈する必要はない。また、上記に特記した低温保温工程を除外して、切断および鎖の移動のための生理的条件での保温のみにすることができる。37℃で3時間の保温で十分である。
反応とそれに続く抽出工程の後で、核酸反応生成物を適切な細菌性ホスト細胞(例えば大腸菌K12株DH5α細胞(recA-);ライフテクノロジー社(Life Technologies(Gibco-BRL)から市販)に好ましくは電気的穿孔(Dowerら、Nuc.Acids Res.,16:6127(1988))によって導入し、さらに本明細書の他の箇所に記載したように転位の証をモニターすることによって転位をアッセイすることができる。
当業者は、本明細書に特記した変化を除けば、この転位反応はインビボ反応で見出されたものとほとんど同じ条件下で進行することを理解しえよう。しかも、本明細書に開示する改変トランスポザーゼは、以前には不可能であったインビトロでの転位反応の実施を可能にするほど転位活性レベルを上昇させる。反応率は、この改変トランスポザーゼを本明細書に特記する最適化緩衝液および温度条件と組み合わせたとき一層高くなる。
本発明のまた別の特徴は改変Tn5トランスポザーゼの調製である。本改変酵素は野生型Tn5トランスポザーゼと以下の点で異なっている:改変トランスポザーゼは、(1)野生型Tn5トランスポザーゼより強いアビディティーでドナーDNAの繰り返し配列と結合し、さらに(2)野生型よりも不活性なマルチマー形をとる可能性が少ない。これらの用件を満たす酵素を、ホスト細胞で活性なプロモーターの制御下にある改変酵素のための発現性遺伝子を含む細菌ホスト細胞から得ることができる。改変Tn5トランスポザーゼをコードする遺伝物質は、当該遺伝物質の発現を支持することができる適切な細菌ホスト細胞に(例えば電気的穿孔によって)導入することができる。他のTn5トランスポザーゼ変異体の過剰産生および調製のための既知の方法が適切に利用される。例えば、上掲書(M.D.Weinreichら)は適切なTn5トランスポザーゼの過剰産生方法を記している。Tn5トランスポザーゼを精製する第二の方法はデラクルツらが記載している(N.B.de la Cruzら、J.Bact.,175:6932-6938(1993),”Tn5トランスポザーゼおよび抑制タンパク質の性状決定:転位抑制のモデル”、この文献もまた参照により本明細書に含まれる)。誘発は37℃より低い温度で実施されることは特記されるべきである。これはデラクルツらが用いた温度である。少なくとも33から37℃の範囲の温度が適切である。本発明者らは、種々の調製手段を用いて等しく成功が得られたので、本発明の改変トランスポザーゼの調製方法は、本発明の方法の成功にとって重要ではないと結論した。
また別には、このタンパク質質は、配列番号:2として本明細書に手引として添付したアミノ酸配列を用いて当技術分野で既知の態様で化学的に合成できる。また、分子生物学者にとって周知の標準的組換えDNA法を用いて当該改変タンパク質(並びに付随転写および翻訳シグナル)をコードする遺伝子構築物を調製することも可能である。そのような構築物を調製するために有用な遺伝物質は、現在存在するTn5構築物から得ることができるし、また遺伝物質に変異を導入する既知の方法(例えば、ランダム変異誘発PCRまたは位置特異的変異誘発)を用いて調製してもよいが、両方の方法を組み合わせることもできる。配列番号:2に示したタンパク質をコードする遺伝子配列は配列番号:1で示す。
野生型Tn5トランスポザーゼの核酸およびアミノ酸配列は既知で刊行物に発表されている(N.C.B.I.受託番号はU0004 L19385で、参照により本明細書に含まれる)。
好ましい実施態様では、OE終端部(クラス(1)変異)の繰り返し配列に対する改変トランスポザーゼのアビディティーの改善は、アミノ酸54(野生型Tn5トランスポザーゼではグルタミン酸)にリジン残基を提供することによって達成できる。この変異は、OE終端部に対するトランスポザーゼの指向性を内側(“IE”)終端部とは反対に強力に変化させる。この変異(EK54として知られている)のOE終端部との強い結合性は、野生型トランスポザーゼで観察されるよりも約10倍高い転位率をもたらす。54位のバリンへの同様な変更(変異体EV54)はまた、47位のスレオニンからプロリンへの変更の場合のように、OE終端部に対するいくらか増加した結合性/転位をもたらす。OE終端部に対する結合アビディティーを増加させるトランスポザーゼの他の匹敵する変異(1つまたは2つ以上のアミノ酸の変異)もまた得ることができる(これら変異は本明細書で述べるインビトロアッセイで同様にまたはより良好に機能するであろう)。
当業者はまた、ドナーDNAの短い繰り返し配列のヌクレオチド配列に対する変更が当該トランスポザーゼの結合領域内または結合領域近くの他の変異と協調的に作用して、同じような結合作用の増加を生じ、5から50倍の転位率の増加をもたらすことを理解しえよう。したがって、出願人らは例示のトランスポザーゼの結合性を改善する変異の1事例を例証したが、トランスポザーゼまたは短い繰り返し配列またはその両方における他の変異もまた、本発明の範囲内に包含されるトランスポザーゼを生じるであろうということは理解されるところである。Tn5のOE終端部に対する相対的アビディティーを決定する適切な方法は文献に記載されている(R.A.Jilkら、J.Bact.,178:1671-79(1996),”トランスポゾンTn5の外側端の機構”)。
本発明のトランスポザーゼはまた、野生型タンパク質よりも不活性なマルチマー形をとる可能性が低い。好ましい実施態様では、野生型のクラス(2)変異は、野生型Tn5トランスポザーゼのアミノ酸372(ロイシン)をプロリンに改変することによって(および同様にプロリンをコードする対応するDNAを改変することによって)達成できる。この変異(LP372と呼ぶ)は、以前にトランスポザーゼの二量体形成における変異として性状が明らかにされた(Weinreichら、上掲書)。372位のこの変異は、Tn5の転位抑制物質との相互反応に必須であることが以前に示された領域にマッピングされることがワインリッヒら(Weinreichら)によって記載された。この抑制物質は、当該トランスポザーゼをコードする同じ遺伝子によってコードされるタンパク質であるが、このトランスポザーゼと比較してタンパク質のN−末端で切りとられている。マルチマー形成度を決定するワインリッヒらのアプローチは、変異が本遺伝因子の範囲内に包含されるか否かを決定するために適している。
野生型Tn5トランスポザーゼがマルチマーを形成する場合、トランス型活性は減少する。おそらく、二量体形成領域における変異はマルチマー形成を減少させるかまたは防止し、それによって抑制活性を低下させ、さらに野生型トランスポザーゼで認められる場合より5から50倍高い転位レベルをもたらす。LP372変異は野生型より約10倍高い転位レベルを達成する。同様に、トランスポザーゼのマルチマー形成活性を低下させる他の変異(1つまたは2つ以上のアミノ酸の変異を含む)もまた372位のただ1つの変異と同じ態様で機能し、本発明のトランスポザーゼとしてまた適切であろう。さらに、いわゆる二量体形成領域における野生型の配列を変更することなく、例えば当該システムに別のタンパク質または二量体形成部位を封鎖する非タンパク質性薬剤を添加することによって、Tn5トランスポザーゼのマルチマー形成能を低下させることもまた可能である。また別には、二量体形成領域をトランスポザーゼタンパク質から完全に除去することもできるであろう。
前記に記したように、抑制タンパク質(トランスポザーゼと部分的にオーバーラップする配列によってコードされる)はトランスポザーゼ活性に干渉することができる。そこで、抑制タンパク質量は、インビボで野生型で観察される量よりも少ないことが望ましいであろう。本アッセイのためには、トランスポザーゼは精製形で用いられ、使用前に(例えばサイズの違いによって)抑制物質からトランスポザーゼを分けることが可能であろう。しかしながら、トランスポザーゼをコードする遺伝子からその開始コドンを取り除くことによって、存在する一切の夾雑抑制タンパク質を含む可能性を遺伝学的に排除することもまた可能である。
トランスポザーゼのアミノ酸56のメチオニンをコードする、野生型Tn5トランスポザーゼ遺伝子のAUGは抑制タンパク質の最初のコドンである。しかしながら、56位のメチオニンの置換はトランスポザーゼ活性に対して明白な影響をもたないが、同時に抑制タンパク質の翻訳を防止し、したがっていくらか高い転位率をもたらすことは既に示されている(T.W.Weigand & W.S.Reznikoff,J.Bact.,174:1229-1239(1992),”2つの高転位性Tn5変異体の性状決定”、この文献は参照により本明細書に含まれる)。特に、本発明者らは、好ましい実施態様でメチオニンをアラニンで置換した(さらにメチオニンをコードするAUGコドンをアラニンをコードするGCCで置換した)。したがって、本発明の好ましいトランスポザーゼは、アミノ酸の56位にメチオニン以外のアミノ酸を含む。しかしこの変更は単に技術的に有利であるだけで(なぜならば、それはインビトロシステムに抑制物質が存在しないことを確認させるからである)、本発明にとって本質的ではないと考えられる(なぜならば、インビトロシステムから抑制タンパク質を排除するために他の手段も用いることができるからである)。
本発明者らが認識している最も好ましいトランスポザーゼのアミノ酸配列は、アミノ酸54位、56位および372位で野生型と異なっている。54位および372位の変異は、それぞれ別個にインビボ転位反応率について約10倍の増加をもたす。標準的な組換え技術によって両クラスの変異を含む単一の分子中に変異がまとめられたとき、野生型トランスポザーゼを用いて達成できるよりも少なくとも約100倍高い反応率が、インビトロシステムの生成物をインビボで調べた場合に観察される。56位の変異はトランスポザーゼ活性に直接は影響を与えない。
インビトロでの高いトランスポザーゼ活性に貢献するであろうと考えられる、野生型を基にした変異には、110位のグルタミン酸からリジンへの変異および345位のグルタミン酸からリジンへの変異が含まれるが、これらに限定されるものではない。
もちろん、これらの特記した位置とは別に他の変更が、当該トランスポザーゼ活性に悪影響を与えることなく、改変トランスポザーゼに対して(または改変トランスポザーゼをコードする構築物に対して)実施できることは理解されるところである。例えば、そのようなトランスポザーゼをコードする構築物が、コードされるアミノ酸が本明細書で述べるものと異ならないようなコドンの第三位の変更を含むことができることは十分に理解されよう。さらに、ある種のコドンの変更は、コードされるタンパク質の転位活性に対してほとんどまたは全く機能的影響をもたない。最終的に、より一層高い転位活性を提供する他の変更をコードされるタンパク質に導入することができる。変異を結合させることによって本明細書の実例よりもさらに高い転位活性を有する改変トランスポザーゼをコードするようにまとめることができることもまた具体的に想定できるであろう。これらの変更は全て本発明の範囲内である。しかしながら、EK110およびEK345変異(上掲書(Weingard & Reznikoff)に両方とも記載)は、いずれかの変異を単独で含むトランスポザーゼよりも低いトランスポザーゼ活性を有することは特記されるべきである。
上掲書に記載されたように酵素を調製し精製した後、上記に記載したインビトロ転位反応で当該酵素を用いて、所望するいずれの転位性遺伝因子をもドナーDNAから標的DNAへと導入することができる。ドナーDNAは環状でも直線状でもよい。ドナーDNAが直線状の場合、転位性遺伝因子と隣接する繰り返し配列は当該直線状フラグメントの終端部に存在するべきではなく、繰り返し配列と隣接する領域から上流および下流にいくらかのDNAを含むべきである。
上記に記したように、Tn5転位は長さが18または19塩基の1対の終端部を必要とする。野生型Tn5の外側端(OE)配列(5’-CTGACTCTTATACACAAGT-3’)(配列番号:7)は既に記載されている。構築物の終端部が10位、11位および12位にそれぞれ塩基ATAを、野生型OEとIEとの間で(例えば1−3位、5−9位、13位、14位、16位および場合によって19位)共通のヌクレオチドとともに含む場合は、野生型OEのトランスポザーゼ触媒インビトロ転位頻度と少なくとも同じ頻度が達成されることが分かった。4位、15位、17位および18位のヌクレオチドは、野生型OEまたは野生型IEのこれらの位置に見出されるヌクレオチドと一致していてもよい。4位のヌクレオチドがTの場合は、野生型OEの転位頻度よりも頻度が強化されることは特記されるべきである。転位頻度に対するこれら特定の塩基の重要性は以前には明らかではなかった。
これらの変更はOEの全ての望ましい改変を包含しようとするものではないことは特記されるべきである。本明細書の他の場所に記載したように、許容可能な終端部のこれら改変の属性は、IEとOE終端部間でランダム化された相違をもつ変異体をスクリーニングすることによって特定された。終端部に一定のヌクレオチドが存在することが有利であることを本明細書で示したが、一方、本明細書で調べた位置以外の位置における変更を有する大量の縮退変異体とともに本明細書に記載したスクリーニングでは検査されなかったヌクレオチドを含む変異体をスクリーニングすることによって、望ましい他の終端部配列もなお得ることができる。さらに、異なるトランスポザーゼが用いられる場合は、当該特定のトランスポザーゼにより適合した他の終端部変種を選別することが可能であることは当業者には明白であろう。
望ましく、かつ本発明の範囲内であることが示された変異体のうちで、とりわけ高い活性を有するインビボで特定された2つの変異OE配列がある。ここでは一本鎖配列として提示したが、実際には野生型および変異OE配列は相補的な第二の鎖を含む。第一の高活性変異体(5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’)(配列番号:8)は、野生型OE配列とは5’末端から数えて4位、17位および18位で異なっているが、10−12位でATAを保持している。第二の変異体(5’-CTGTCTCTTATACAGATCT-3’)(配列番号:9)は野生型OE配列とは4位、15位、17位および18位で異なっているが、また10−12位でATAを保持している。これら2つの高活性変異OE配列は15位でのみ互いに相違するが、15位ではGまたはCのいずれかが存在する。変異配列が10位、11位および12位にATAを含むときに、OE様活性(または高活性)が当該配列で観察される。殆どまたは全く影響を与えずにOE配列の長さを19から18ヌクレオチド対に減少させることができる。
特定したこの変異OE配列の1つが基質DNAに隣接するとき、EK54/MA56トランスポザーゼのインビボ転位頻度は、野生型OE終端部が転位性DNAに隣接するときに認められる頻度よりも約40−60倍増加する。EK54/MA56トランスポザーゼは、野生型OE終端部を用いた場合、野生型トランスポザーゼより約8−10倍高いインビボ転位頻度を有することが既に知られている。EK54/MA56変異を有するTn5トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼよりも強いアビディティーでOEと結合し、さらに野生型トランスポザーゼよりも弱いアビディティーでTn5内側端(IE)と結合することが知られている。
対応するプラスミド内に野生型OEを含むコロニーで認められるものより多いパピラ(papillae)を対応する時間(例えば68時間)内にコロニー当たり生じるということにより、本発明のアッセイで使用する構築物内の適切な変異体終端部の性状を生物学的に調べた。本明細書の他の箇所で記載するようにEK54/MA56トランスポザーゼを用いるパピラ形成アッセイで平板培養後68時間して測定したとき、野生型OEはコロニー当たり約100個のパピラをを生じることができる。同じアッセイおよび同じ時間枠で測定したとき、好ましい変異体はコロニー当たり約200から3000、より好ましい変異体はコロニー当たり約1000から3000のパピラを生じるであろう。同じ条件下でアッセイしたとき、最も好ましい変異体はコロニー当たり約2000から3000のパピラを生じるであろう。パピラ形成レベルはコロニー当たり3000より高いかもしれない(しかしそのようなレベルでは定量は困難であろう)。
基質DNAが好ましい変異OE配列と隣接し、さらに最も好ましい変異トランスポザーゼ(EK54/MA56/LP372変異を含む)が用いられるとき、本発明のインビトロ転位アッセイでは転位頻度はまた実質的に強化される。これらの条件下では本質的には全ての基質DNAが転位生成物に変換される。
高活性終端部を用いて認められるインビトロ転位率は、本発明者らの経験では転位発生について選択する必要がないほど十分に高い。さらなる研究のために形質転換後ランダムに選択した全コロニーは転位発生の証拠を示した。
この進歩は時間と実験室労力の顕著な節約を示す。例えば、トランスポザーゼを改変するよりもDNAを改変することによってインビトロ転位頻度を改善することができるのは特に有利である。なぜならば、トランスポザーゼ活性はホスト細胞で増加するので、トランスポザーゼを有する細胞は異常なDNA転位の結果として死ぬ可能性が高くなるからである。対照的に、改変OE終端部を含む問題のDNAは当該トランスポザーゼとは完全に別の供給源で増殖でき、したがってホスト細胞を危険に曝さない。
本発明の範囲を制限しようとするものではないが、このテストした高活性終端部は、野生型OE終端部より強いアビディティーでトランスポザーゼと結合するものではないことは明白である。したがって、高活性終端部によってもたらされるこの高い転位頻度はトランスポザーゼとの結合の強化によるものではない。
終端部の間の転位性遺伝因子は所望するいずれのヌクレオチド配列も含むことができる。終端部間の転位性遺伝因子の長さは少なくとも約50塩基対であるべきである(ただしより小さな挿入物も機能するかもしれない)。挿入物のサイズの上限は不明である。しかしながら、長さが約300ヌクレオチドのドナーDNA部分が良好に機能できることは知られている。非制限的な例であるが、転位性遺伝因子は、付随する調節遺伝因子(例えばプロモーター、ターミネーターなど)をもつか、または調節因子をもたない、検出可能または選別可能タンパク質をコードするコード領域を含むことができる。
遺伝因子が、プロモーターをもたないそのような検出可能または選別可能なコード領域を含む場合は、プロモーターの下流の位置に当該コード領域を転位させ、続いて転位部位から上流の核酸配列を分析することによって、露出される標的DNA内でプロモーターを特定しマッピングすることが可能であろう。
同様に、標的DNAに転位させることができるプライマー結合部位を遺伝因子に含ませ、配列決定または、当該標的遺伝物質内に分布するプライマーを使用することによって成り立つ他の方法を促進させることができる。同じように、本方法は、標的に所望の制限酵素部位またはポリリンカーを導入するために、または別のタイプの組換えに適した部位(例えばcre-lox)を導入するために用いることができる。
本発明は、例示であって本発明を限定しない以下の実施例を熟考することによって一層理解されるであろう。
実施例
54位で改変されたトランスポザーゼを得るために、Tn5トランスポザーゼをコードするが抑制タンパク質(MA56)はコードしない現存のDNAクローンのコード領域の最初の1/3を既知の方法にしたがって変異させ、当該変異部分を含むDNAフラグメントをクローニングして、完全な長さのトランスポザーゼ遺伝子を含むプラスミドクローンライブラリーを作製した。ライブラリーを構成するクローンで大腸菌K12株MDW320を形質転換し、この細菌を平板培養してコロニーに増殖させた。個々のプラスミドによって細菌に供給された転位性遺伝因子は不完全なlacZ遺伝子を含んでいた。この分離プラスミド(pOXgen386)はワインリッヒらが記載した(M.Weinreichら、J.Mol.Biol.,241:166-177(1993),”Tn5トランスポザーゼの機能的分析:DNA結合および二量体化に必要なドメインの特定”、この文献は参照により本明細書に含まれる)。トランスポザーゼ活性が上昇したコロニーを、X−galの存在下で増殖させた白色コロニー中の青色(LacZ)スポットを目当てにスクリーニングして選別した。このパピラ形成アッセイは上掲書(Weinreich,1993)に記載された。そのようなコロニーのTn5トランスポザーゼの5’側の1/3の配列決定を実施して、変異がトランスポザーゼ活性の増加の原因であったか否かを決定した。54位がリジン(K)に変異したことがトランスポザーゼ活性の増加とよく相関しているとの結論が得られた。プラスミドpRZ5412-EK54は、既に述べた56位のアラニンとともに54位にリジンを含む。
LP372変異を含むフラグメントを制限酵素NheIおよびBglIIを用いてpRZ4870(Weinreichら、1994))から単離し、NheI-BglII切断pRZ5412-EK54に連結して組換え遺伝子を作製した。当該組換え遺伝子は、配列番号:1に示され、さらに本明細書でも説明されるように54位、56位および372位に変異を有する。この遺伝子を検査したところ、野生型Tn5トランスポザーゼと比較して活性が少なくとも約100倍増加していることが示された。54位単独および372位単独の変異ではそれぞれトランスポザーゼ活性が約10倍増加した。
市販のT7発現ベクターpET-21D(ノバゲン社(Novagen,ウィスコンシン州、マジソン)から市販ルートで入手可能)のNhoI/XhoIフラグメントにBspHI/SalIフラグメントを挿入することによって、3重変異組換え遺伝子によりコードされる改変トランスポザーゼタンパク質をこのpET-21Dベクターに移した。このクローニングによって、改変トランスポザーゼ遺伝子は、当該トランスポザーゼ遺伝子の天然のプロモーターではなくT7プロモーターの制御下に置かれる。細胞増殖が完了した後で醗酵工程で特殊な誘発を実施することによって、この遺伝子生成物をBL21(DE3)pLysS細菌ホスト細胞(これは当該酵素の結合部位を含まない)で過剰産生した(F.W.Studierら、Methods Enzymol.,185:60-89(1990),”クローン化遺伝子の発現を誘導するためのT7・RNAポリメラーゼの使用”)。33または37℃で過剰産生を誘発することによってデラクルツ(de la Cruz)の方法を改変したものを用いて、このトランスポザーゼを部分的に精製した。精製後、酵素調製物を保存緩衝液(10%グリセロール、0.7MのNaCl、20mMのトリス−HCl(pH7.5)、0.1%トリトン−X100および10mMCHAPS)で−70℃で使用まで保存した。この保存緩衝液は例示であって最適なものというわけではない。
単一プラスミド(pRZTL,図1)を構築し、本実施例のドナーDNAおよび標的DNAとして用いた。pRZTL1プラスミドDNAの完全な配列は配列番号:3に示す。プラスミドpRZTL1は、互いに逆方向にある2つのTn5の19塩基対OE終端部を含んでいる。1つのOE配列の直ぐ隣がテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子(上流のプロモーターを欠いている)である。しかしながら、この遺伝子はテトラサイクリン耐性遺伝子が転写領域の下流に(例えば、pRZTL1にも存在しているクロラムフェニコール耐性遺伝子の転写を促進するプロモーターの制御下に)配置される場合、テトラサイクリン耐性遺伝子が発現される。したがって、このテストプラスミドpRZTL1は、インビトロ反応の後でインビボでアッセイして転位が発生したことを確認できる。プラスミドpRZTL1はまた、転位性遺伝因子の複製開始点を含み、これによって全ての転位生成物は、ホスト細胞内に導入後複製できるプラスミドであることが保証される。
以下の成分を典型的な20μlのインビトロ転位反応で用いた:
改変トランスポザーゼ:保存緩衝液(10%グリセロール、0.7MのNaCl、20mMのトリス−HCl(pH7.5)、0.1%トリトン−X100および10mMCHAPS)で2μl(約0.1μg酵素/μl)
ドナー/標的DNA:反応緩衝液(最終反応濃度0.1Mグルタミン酸カリウム、25mMのトリス−酢酸(pH7.5)、10mMの酢酸マグネシウム2+、50μg/mlのBSA、0.5mMのβ−メルカプトエタノール、2mMのスペルミジン、100μg/mlのtRNA)で18μl(約1−2μg)
20℃で約60分、このトランスポザーゼをpRZTL1・DNAと一緒にした。続いて、2容の反応緩衝液を加えて反応容積を増加させ、温度を37℃に2−3時間上昇させ、切断と鎖の移動を惹起させた。
効率的なインビトロ転位がインビボ法およびインビトロ法で生じたことが示された。インビボでは、反応の核酸生成物をDH5α細菌細胞に移した後で多くのテトラサイクリン耐性コロニーが認められた。特記したように、転位性遺伝因子が当該プラスミドのいずれかの位置にある活性なプロモーターの下流に転位された場合にのみ、このシステムではテトラサイクリン耐性が生じる。典型的な転位頻度はプラスミドDNAを受容した細胞の0.1%であった(クロラムフェニコール耐性コロニーを数えることにより決定)。しかしながら、この検出系では標的が全体の1/16に制限されるので、この数字は総転位頻度より少ない値である。
さらにまた、精製コロニーから単離したインビトロ電気泳動分析およびDNA配列分析によって、分子内および分子間事象を含む真の転位事象の生成物が明らかにされた。環状プラスミドpRZTL1基質を用いた典型的な反応の結果はレーン4および5に示す。図2のレーン6は直線状プラスミドpRZTL1基質を用いて得られた結果を示す。
バンドはSYBRグリーン(FMC Bioproducts)で染色して1%アガロースゲル上に表示し、フルオロイメージャー(Fluorimager)SI(Molecular Dynamics)で走査した。図2で、レーン1はpRZTL1の弛緩型環状、直線状および閉鎖環状を示す。レーン2および3は、pRZTL1のインビトロ転位後のそれぞれ分子内および分子間転位生成物を示す。これら生成物は、電気穿孔DH5α細胞から精製し、サイズおよび配列分析によって真の転位生成物であることが証明された。レーン4および5は、閉鎖環状および弛緩型環状テストプラスミド基質の混合物を用いた2つの別々のインビトロ反応の生成物を示す。レーン6では、直線状pRZTL1(XhoI切断)が反応基質であった。レーン7は、分子量標準物としてラムダDNAのBstEIIの消化物を含む。
図3は図2のレーン4、5および6を再生し、二次制限消化実験、再電気穿孔およびDNA配列決定を基にした種々の生成物の分析を示す。遊離されたドナーDNAは、2つのOE配列の間のカナマイシン耐性遺伝子を含むpRZTL1のフラグメントに対応するか、または直線状基質の場合はOE−XhoIフラグメントに対応する。分子間転位生成物は、リラックスDNA環としてのみ認められる。分子内転位生成物は梯子状のものとして認められ、これは最初の基質の高次螺旋からDNA塊に変換されることにより生じる。反応は、分子間事象と分子内事象の結合したものである二重転位事象を達成するために十分に効率的である。
転位反応に必要とされる終端部の特性を調べるために予備的実験を実施した。野生型Tn5のOEおよびIE配列を比較し、これらヌクレオチドを異なる7つの位置の各々でランダム化を試みた。異なる各位置に関してオリゴヌクレオチド縮退物集団を作製した。したがって、集団の個々のオリゴヌクレオチドは、野生型OEまたは野生型IE配列のいずれかのヌクレオチドを含んでいた。このスキームでは、27(128)のそれぞれ異なるオリゴヌクレオチドを通常の手段を用いて合成した。OEおよびIEの両方の配列特性を有するオリゴヌクレオチドは本明細書ではOE/IE様配列と呼ぶ。オリゴヌクレオチドがOEおよびIE野生型配列との間の中間体であるために生じる命名に関する問題を回避するために、特に記載がなければ、選択したヌクレオチド配列は野生型IEではなく野生型OEと比較することをここで明記する。IEを参照点として選択する場合、その違いは同一であるが、異なる態様で特定される。
以下は、この変異体作製スキームで変化する位置(x)を示す。野生型OEは配列番号:7で、野生型IEは配列番号:10でも示されている。
縮退OE/IE様配列の他に、長さが37塩基の当該合成オリゴヌクレオチドはまた、縮退オリゴヌクレオチドのプラスミドベクターへの簡便なクローニングのために、末端SphIおよびKpnI制限酵素認識および切断部位を含んでいた。したがって、ランダム化終端部ライブラリーは27(128)種の縮退オリゴヌクレオチド集団から作製された。
図4はpRZ1496を示し、その完全な配列は配列番号:11に提示されている。以下の特徴がその配列に記されている:
図4に示すIEカセットはSphIおよびKpnIを用いて切り出し、標準的な切断・連結方法を用いてOE/IE様部分を含む合成終端部カセットで置き換えた。固定した野生型OE配列とクローン化OE/IE様配列との間に、プラスミドpRZ1496は、その活性が検出可能な(すなわちLacZYA)遺伝子を選択可能マーカー(tetr)とともに含んでいる。LacZ遺伝子は、適切な転写および翻訳開始シグナルを欠いているという点で不完全である。LacZ遺伝子は、そのようなシグナルの下流の位置に転位された場合にのみ転写され翻訳される。
電気穿孔を用いて得られたクローンでdam-、LacZ-細菌細胞を形質転換した。この場合、当該細菌細胞はJCM101/pOXgen細胞で、標準的条件下でLB培地で37℃で増殖させた。damメチル化はIE利用を抑制し、さらに野生型IE配列は2つのdamメチル化部位を含むので、dam-株が好ましい。dam-株は、転位活性を評価する際の重要な事柄であるdamメチル化の可能性を排除する。選別されたTetr細胞はLacZ-であり、転位によって活性化されたLacの発現は陰性のバックグラウンドで容易に検出できた。pOXgenは、ホスト細胞に提供する必要がない非必須性のF因子派生因子である。
いくつかの実験では、EK54/MA56トランスポザーゼは形質転換されたpRZ1496プラスミドによって直接コードされた。他の実験では、固有のHindIII/EagIフラグメント(ヌクレオチド9112−12083)をプラスミドから欠落させることによってpRZ1496プラスミドを改変し、トランスポザーゼの産生を防止した。後者の実験では、ホスト細胞は、HindIII/EagIフラグメント欠失プラスミド(pRZ5451と呼ぶ、図4)およびEK54/Ma56トランスポザーゼをコードするクロラムフェニコール耐性プラスミドで同時形質転換を施した。いくつかの実験では、野生型Tn5トランスポザーゼをコードする類似プラスミドを比較のために用いた。
転位頻度はパピラ形成アッセイで調べた。このアッセイは、青色のスポットの数(Lac産生細胞または”パピラ”)をそうでなければ白色であるコロニーの中から測定するものである。形質転換細胞をグルコース最少ミラー培地(J.Miller,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory刊、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー(1972))で平板培養した(約50コロニー/平板)。当該培地は、0.3%カザミノ酸、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド(40μg/ml)およびフェニル−β−D−ガラクトシド(0.05%)を含んでいた。当該培地はテトラサイクリン(15μg/ml)および必要な場合にはクロラムフェニコール(20μg/ml)も含んでいた。選別から生き残ったコロニーをインビボの転位頻度について調べた。多くのパピラ形成を示すコロニーは裸眼でも極めて明瞭であったが、コロニー当たりの青色スポットの数は数日かけて決定した(平板培養後約90時間)。
コロニーが、野生型IEをプラスミド上に含む場合に観察されるより高いパピラ形成レベルを有するように見える場合、高パピラ形成表現型はプラスミドの末端変異によって付与されることを示すために、これらのコロニーを再塗抹した。塗抹培養平板から釣り上げたコロニーを培養した。標準的プロトコルを用いて培養細胞からDNAを採取し精製し、再び”未使用の”JCM101/pOXgen細胞を形質転換した。上記のアッセイでパピラ形成レベルを再度野生型IE含有プラスミドと比較し、同じ結果が得られた。
挿入オリゴヌクレオチドの配列決定用DNAを得るために、117の高パピラ形成コロニーの白色部分から培養を増殖させ、標準的なDNAミニプレップ法を用いて各コロニーからDNAを調製した。117のコロニーのOE/IE様部分のDNA配列を決定した(クローニング担体としてpRZ1496を用いた形質転換からは42個;クローニング担体としてpRZ5451を用いた形質転換からは75個)。多くの変異体が何度も単離された。最も高いパピラ形成頻度を示した全ての変異体が、10位、11位および12位にOE由来塩基を含む。これらの位置にOE様塩基が保持されていた場合、他の変化の転位に対する影響を測定することはできなかった。なぜならば、パピラ形成レベルは既に極めて高いからである。
1575個のコロニーを上記のようにスクリーニングした。可能性を有する128個の全変異体の配列がスクリーニングされた可能性は95%以上であった。したがって、より高い形質転換頻度に寄与する他の終端部がテストされたトランスポザーゼを用いて得られる可能性は殆どない。
表IおよびIIは、表示のハイブリッド末端配列または野生型OEもしくはIE末端配列を有する変異体構築物の定量的パピラ形成を示す。表では終端部の各位置の配列は、特に記載がなければ野生型IEに対応する。これら配列は速記表示法で表示されているが、当業者には全ての表示された変異体の完全な19塩基対配列の決定は容易であり、この明細はそのような完全な配列を全て含んでいると理解されるべきである。表Iは、EK54トランスポザーゼがトランス型態様で提供された場合の実験から得られたデータを含み、表IIは、EK54トランスポザーゼがシス型で提供された場合の実験からのものである。シス型で提供されたトランスポザーゼは、トランス型で提供されたトランスポザーゼよりも絶対的な意味でより高い活性を有しているが、トランスポザーゼのシス型またはトランス型供給源は、テストした終端部の相対的インビボ転位頻度は変化させない。
表IおよびIIはそれぞれ10位、11位および12位にATAを保持する全ての変異体は、野生型OE活性が中等度(表I、トランス型)であるかまたは高度(表II、シス型)であるかにかかわらず、野生型OEに匹敵するか、または野生型OEより高い活性を有することを示している。さらにまた、変異体の3塩基配列がATAでない場合はいつでも、当該変異体は野生型より低いパピラ形成活性を示した。4位がTである場合は、パピラ形成は、野生型OEに少なくとも匹敵するか、または野生型OEよりも顕著に高い傾向を有することもまた特記されるべきである。表示の相対レベル(非常に低い、低い、普通、高めの普通、および高い)を越えるパピラ形成レベルの定量分析は困難であった。しかしながら、当業者はOEのパピラ形成レベルを容易に理解し、匹敵するレベルまたはより高いレベルを有するコロニーは容易に認識することができよう。
観察されるパピラの数は、図5−7に示すように時間の経過にしたがって増加した。これらの図は、全く異なる合成終端部カセットまたは野生型OEもしくはIE終端部のいずれかを含む9クローンで別々に形質転換した細胞で認められたパピラ形成を大雑把に定量したものである。これら3つの図では、各変異体は、野生型IE配列との相違によって特定される。テストした変異体の中で、10A/11T/12Aの変異体のみが、野生型OEよりも高い転位パピラ形成レベルを有していたことに留意されたい。当該変異体(OEが参照配列である場合は変異体4/15/17/18と呼ぶ)は、10位、11位および12位にヌクレオチドATAを保持する、図5−7に示した変異体の中でただ1つの変異体であった。図5(y軸:0−1500個のパピラ)および図6(y軸:0−250個のパピラ)は、種々の変異体プラスIEおよびOEコントロール並びにEK54/MA56酵素を用いた場合のパピラ形成を示す。図7(y軸:0−250パピラ)は、同じ変異体配列を野生型(より正確にはMA56)トランスポザーゼに対してテストした場合のパピラ形成を示す。10A/11T/12A変異体(配列番号:9)によって、野生型OEを用いて90時間後に観察されたもの(約1500)よりもED54/MA56トランスポザーゼを用いてより短い時間(68時間)で顕著に高いパピラ形成(約3000)が得られた。IE様バックグラウンド上の15位におけるただ1つのOE様ヌクレオチドもまたパピラ形成頻度を増加させた。
インビボ転位頻度もまた、高レベルの高パピラ形成をもつ2つの配列を用いてテトラサイクリン耐性アッセイで定量した。これらの配列は5’−CTGTCTCTTATACACATCT−3’(配列番号:8)(これは5’末端から数えて4位、17位および18位で野生型OE配列と異なっている)、および5’−CTGTCTCTTATACAGATCT−3’(配列番号:9)(これは4位、15位、17位および18位で野生型OE配列と異なっている)であった。これらの配列は、EK54/MA56を含むトランスポザーゼまたはMA56を含むトランスポザーゼを用いるアッセイで好ましい変異体終端部と考えられる。プラスミドの2つの野生型OE配列の代わりにpRZtl1内に各配列を別々に挿入した。カナマイシン耐性遺伝子に接する所望の末端を含むPCR増幅フラグメントは、容易にpRZTL1の大きいHindIIIフラグメント中でクローニングできた。得られたプラスミドは、表示した末端を除いてpRZTL1と同一である。比較のために、pRZTL1および2つの野生型IE配列を含むpRZTL1の誘導物もまたテストした。アッセイでは、テストプラスミド(pRZTL1およびその誘導物)および高コピー数amprプラスミド(EK54/MA56トランスポザーゼもしくは野生型(MA56)トランスポザーゼのいずれかをコードする)でJCM101/pOXgen細胞を同時に形質転換した。ホスト細胞は、転位によってTetr遺伝子がプラスミドまたは染色体上のどこかにある適切な転写プロモーターの近傍の下流に運ばれたときにのみテトラサイクリン耐性となる。テストプラスミドを受容した細胞の総数はクロラムフェニコール耐性、アンピシリン耐性コロニーを数えることによって決定した。転位頻度はtetr/camramprコロニーの比を決定することによって算出した。野生型OEよりもインビボ転位で約40から60倍の増加が、変異終端部およびEK54/MA56トランスポザーゼのいずれかを用いた場合に認められた。2つの好ましい変異終端部のうちで、野生型OE配列に対して3位に変異を含むものはより高い増加をもたらした。
図8(これは転位頻度(×10-8)に対してテストプラスミドをプロットしたものである)に示すように、テストプラスミドが2つのIE終端部を含む場合は殆ど転位は認められなかった。テストプラスミドが2つのOE終端部を含む場合、特にEK54/MA56トランスポザーゼが用いられる場合に幾分高い転位が観察された。極めて対照的に、EK54/MA56トランスポザーゼと好ましい選択末端のいずれか(10位、11位および12位にのみ、または10位、11位、12位および15位にのみOE様塩基を含む)とを組み合わせた場合に野生型OE終端部よりも大きな増加がインビボ転位で得られた。
最も好ましい合成終端部配列(5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’)(配列番号:8)をもつ好ましい高活性変異終端部を、pRZTL1で両方のOE終端部の代わりに提供し(図4)、本明細書で述べた3重変異トランスポザーゼを用いて本発明のインビトロ転位アッセイでテストした。この変異終端部の転位頻度は第二の好ましい合成終端部よりも高いので、さらに当該終端部はdamメチル化部位を持たず、したがってdamメチル化は転位頻度にもはや影響を与えないので、この変異終端部を更なるインビトロ分析のために選んだ。反対に4/15/17/18変異体はdamメチル化部位を有する。
予備実験でCHAPSは反応から排除したが、予備保温工程は用いた。反応物を1時間20℃で予備保温し、続いて2倍に希釈し、その後37℃で3時間保温した。DNA約0.5μgおよびトランスポザーゼ0.4μgを用いた。転位生成物をゲルで観察した。変異終端部では、最初のDNAは極めてわずか観察された。一次および二次転位反応生成物を示す多数のバンドが観察された。反応混合物でDH5α細胞を形質転換し、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、またはカナマイシン含有平板で平板培養した。
640個のクロラムフェニコール耐性コロニーを観察した。これらは未反応プラスミドを示すことができるが、テストしたそのようなコロニーの全て(n=12)がカナマイシンに感受性を有し、このことはドナーのバックボーンDNAが失われていることを示唆している。さらにまた12のコロニーは全てサイズの異なるプラスミドを含んでいた:12コロニーのうちの9コロニーは欠失−倒置の特徴を示し、残りの3つは単純な倒置であった。79のテトラサイクリン耐性コロニーを観察したが、これらは転位によってtetr遺伝子の活性化を示した。
11のカナマイシン耐性コロニーを観察した。これによって、ドナーのバックボーンDNAを含む残余のプラスミドは低%であることが示された。
第二の同様なテストでは、約1μgのプラスミドDNAおよび0.2μgのトランスポザーゼを用いた。このテストでは、予備保温または希釈を行わずにCHAPSなしで反応物を37℃で3時間保温した。最初のDNAのいくらかが3時間の反応後にゲルで観察された。一晩保温した後では転位生成物のみが観察された。
3時間の反応の生成物でDH5α細胞を形質転換し、上記のように平板培養した。クロラムフェニコール耐性コロニーの約50%がカナマイシン感受性で、おそらく転位生成物であろう。
本発明は前述の実施例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲内に包含される全ての改変および変形例を含むものである。本明細書に特に記載した用途の他に、他の応用も当分子生物学関係業者には明白であろう。特に、所望の変異を原核細胞または真核細胞DNAに導入するための方法には非常に好ましい。例えば、現時点では、プラスミド上に存在する不活性型遺伝子との同種組換えによって機能的な真核細胞遺伝子をノックアウトすることは困難である。この困難さは、プラスミド上の遺伝子を広範囲の上流および下流の配列に隣接させねばならないことから生じる。しかしながら、このシステムを用いるならば、選択マーカー遺伝子(例えばneo)を含む不活性化用転位性遺伝因子を、不活性化させようとする遺伝子を含むプラスミドにインビトロで導入することができる。転位後に、生成物を適切なホスト細胞に導入することができる。標準的な選別手段を用いて、転位性遺伝因子を有するプラスミドを含む細胞コロニーのみを回収することができる。そのようなプラスミドを、例えば制限分析によってスクリーニングして破壊された遺伝子を含むものを回収できる。続いて、同種組換えのために、さらに同じマーカー遺伝子を用いる選別のために直接そのようなコロニーを真核細胞に導入できる。
さらにまた、このシステムを用いてPCR増幅DNAフラグメントをベクターに容易に挿入でき、したがって従来のクローニング工程を完全に回避できる。これは、(1)プライマーの配列特異的部分に近接するOE終端部を含む適切な1対のPCRプライマーを提供し、(2)所望の核酸フラグメントの標準的PCR増幅を実施し、(3)ドナーDNAとして二本鎖PCR増幅生成物を用いて本発明のインビトロ転位性反応を実施する。
配列表
(2)配列番号1に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:1534塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:2本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A)記載:/desc=修飾Tn5トランスポザーゼをコードする遺伝子
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:93..1523
(xi)配列:配列番号1
(2)配列番号2に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:477アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号2
(2)配列番号3に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:5838塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:2本鎖
(D)トポロジー:環状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A)記載:/desc=プラスミドDNA
(vii)直接の起源:
(B)クローン名:pRZTL1
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:insertion_seq
(B)存在位置:1..19
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:77..1267
(D)その他の情報:/機能=テトラサイクリン耐性
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:相補(2301..2960)
(D)その他の情報:/機能=クロラムフェニコール耐性
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:insertion_seq
(B)存在位置:4564..4582
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:4715..5530
(D)その他の情報:/機能=カナマイシン耐性
(xi)配列:配列番号3
(2)配列番号4に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:397アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号4
(2)配列番号5に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:220アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号5
(2)配列番号6に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:272アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号6
(2)配列番号7に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:2本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A)記載:/desc=Tn5野生型外側端
(xi)配列:配列番号7
(2)配列番号8に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:2本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A)記載:/desc=Tn5変異体外側端
(xi)配列:配列番号8
(2)配列番号9に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:2本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A)記載:/desc=Tn5変異体外側端
(xi)配列:配列番号9
(2)配列番号10に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:2本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A)記載:/desc=Tn5野生型内側端
(xi)配列:配列番号10
(2)配列番号11に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19182塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:2本鎖
(D)トポロジー:環状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A)記載:/desc=プラスミドpRZ4196
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:repeat_unit
(B)存在位置:94..112
(D)その他の情報:/注=野生型OE配列
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:repeat_unit
(B)存在位置:12184..12225
(D)その他の情報:/注=カセットIE
(xi)配列:配列番号11
Claims (26)
- 以下を含む、転位性DNA配列をインビトロで転位させるためのキット:
野生型Tn5トランスポザーゼを54位及び372位で改変したTn5トランスポザーゼであって、当該改変トランスポザーゼが、野生型Tn5トランスポザーゼよりも強いアビディティーでTn5外側端繰り返し配列に当該改変トランスポザーゼを結合させる当該野生型Tn5トランスポザーゼに対する変化、および当該改変トランスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を当該野生型トランスポザーゼよりも低下させる野生型Tn5トランスポザーゼに対する変化を含み、当該改変Tn5トランスポザーゼの54位がリジンであり、当該改変Tn5トランスポザーゼの372位がプロリンである、前記改変Tn5トランスポザーゼ;
転位性DNA配列を含むドナーDNA分子であって、当該転位性DNA配列がその5’および3’末端でTn5外側端繰り返し配列と接している前記ドナーDNA分子;および、
当該転位性遺伝因子がその中に転位することができる標的DNA分子。 - 当該改変トランスポザーゼがさらに野生型トランスポザーゼの56位に置換変異を含む、請求項1に記載のキット。
- 56位がアラニンである、請求項2に記載のキット。
- 当該ドナーDNA分子がその5’および3’末端で、配列番号7を10、11及び12位以外の少なくとも一つの位置で変異したフランキングDNA配列と接する、請求項1に記載のキット。
- 当該フランキング配列がさらに、AおよびTからなる群から選ばれるヌクレオチドを4位に含む、請求項4に記載のキット。
- 当該フランキング配列がさらに、GおよびCからなる群から選ばれるヌクレオチドを15位に含む、請求項4に記載のキット。
- 当該フランキング配列がさらに、AおよびTからなる群から選ばれるヌクレオチドを17位に含む、請求項4に記載のキット。
- 当該フランキング配列がさらに、GおよびCからなる群から選ばれるヌクレオチドを18位に含む、請求項4に記載のキット。
- 当該フランキング配列が配列5’−CTGTCTCTTATACACATCT−3’を含む、請求項4に記載のキット。
- 当該フランキング配列が配列5’−CTGTCTCTTATACAGATCT−3’を含む、請求項4に記載のキット。
- 野生型Tn5トランスポザーゼを54位及び372位で改変したTn5トランスポザーゼであって、当該改変Tn5トランスポザーゼが以下の変化:
野生型Tn5トランスポザーゼよりも強いアビディティーでドナーDNAのTn5外側端繰り返し配列に当該改変トランスポザーゼを結合させる野生型Tn5トランスポザーゼに対する変化;および、
当該改変トランスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を当該野生型トランスポザーゼよりも低下させる野生型Tn5トランスポザーゼに対する変化を含み、54位がリジンであり、372位がプロリンである、前記改変Tn5トランスポザーゼ。 - さらに野生型トランスポザーゼの56位に置換変異を含む、請求項11に記載の改変Tn5トランスポザーゼ。
- 56位がアラニンである、請求項12に記載の改変Tn5トランスポザーゼ。
- 野生型Tn5トランスポザーゼを54位及び372位で改変した改変Tn5トランスポザーゼであって、Tn5外側端の繰り返しに対して強いアビディティーを有し、さらに野生型Tn5トランスポザーゼよりも不活性なマルチマー形をとる可能性が低く、当該改変Tn5トランスポザーゼの54位がリジンであり、当該改変Tn5トランスポザーゼの372位がプロリンである前記改変Tn5トランスポザーゼをコードすることができるヌクレオチド配列を含む遺伝的構築物。
- 配列番号:1のヌクレオチド配列を含む、請求項14に記載の遺伝的構築物。
- 請求項12記載の改変Tn5トランスポザーゼにより転位性DNA配列をインビトロで転位するための遺伝的構築物であって、以下の配列:
5’−CTGTCTCTTATACACATCT−3’ 又は
5’−CTGTCTCTTATACAGATCT−3’
を含むフランキングDNA配列がその5’および3’端に隣接している転位性DNA配列を含む遺伝的構築物。 - インビトロ転位方法であって、
その5’および3’端にTn5外側端繰り返し配列が隣接している問題の転位性DNA配列を含むドナーDNA分子を、標的DNA分子および野生型Tn5トランスポザーゼを54位及び372位で改変したTn5トランスポザーゼとともに適切な反応緩衝液中で生理学的温度より低い温度で、当該改変トランスポザーゼが当該外側端繰り返し配列と結合するまで混合する工程;および、
当該酵素がインビトロ転位を触媒するために十分な時間、当該温度を生理学的温度に上昇させる工程、
からなる方法であって、当該改変トランスポザーゼが、野生型Tn5トランスポザーゼよりも強いアビディティーで当該Tn5外側端繰り返し配列に当該改変トランスポザーゼを結合させる野生型Tn5トランスポザーゼに対する変化、および当該改変トランスポザーゼが不活性なマルチマー形をとる可能性を当該野生型トランスポザーゼよりも低下させる野生型Tn5トランスポザーゼに対する変化を含み、54位がリジンであり、372位がプロリンであることを特徴とする方法。 - 当該改変トランスポザーゼがさらに野生型トランスポザーゼの56位に置換変異を含む、請求項17に記載の方法。
- 56位がアラニンである請求項18に記載の方法。
- 配列番号7を10、11及び12位以外の少なくとも一つの位置で変異したフランキングDNA配列が、当該問題のDNA配列の5’および3’端に隣接している、請求項17に記載の方法。
- 当該フランキング配列が、さらにAおよびTからなる群から選ばれるヌクレオチドを4位に含む、請求項20に記載の方法。
- 当該フランキング配列が、さらにGおよびCからなる群から選ばれるヌクレオチドを15位に含む、請求項20に記載の方法。
- 当該フランキング配列が、さらにAおよびTからなる群から選ばれるヌクレオチドを17位に含む、請求項20に記載の方法。
- 当該フランキング配列が、さらにGおよびCからなる群から選ばれるヌクレオチドを18位に含む、請求項20に記載の方法。
- 当該フランキング配列が、配列5’−CTGTCTCTTATACACATCT−3’を含む、請求項20に記載の方法。
- 当該フランキング配列が、配列5’−CTGTCTCTTATACAGATCT−3’を含む、請求項20に記載の方法。
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