JP2009520498A - プロピニル修飾オリゴヌクレオチドにより改善された標的化ヌクレオチド交換 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
−アクセプター鎖、又は交換されるヌクレオチドの周囲の少なくとも1つの配列セクションの配列を決定する。これは、典型的には、好ましくはミスマッチの各々の側でミスマッチに隣接する少なくともほぼ10ヌクレオチド程度、好ましくは15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド又は30ヌクレオチドであり得る(例えばGGGGGGXGGGGGG、ここでXはミスマッチである);
−ミスマッチに隣接する1つ又は両方のセクションに対して相補的で、交換される所望のヌクレオチドを含むドナーオリゴヌクレオチドをデザインする(例えばCCCCCCYCCCCCC);
−所望の位置でのプロピン修飾を有するドナーオリゴヌクレオチドを(例えば合成によって)提供する。修飾は状況に依存して、大きく変化してもよい。実施例は、CmCmCmCmCmCmYCmCmCmCmCmCm、CmCCmCCmCYCmCCmCCmC、CCCCCCYCmCmCmCmCmCm、CmCmCmCmCmCmYCCCCCC、CCCCCCmYCmCCCCC、CmCCCCCYCmCCCCC、CmCCCCCYCCCCCCm、CmCCCCCYCCCCCC等であり、ここで、Cmはプロピン修飾ヌクレオチド残基を表わす。異なるアクセプター配列(例えばATGCGTACXGTCCATGAT)に関しては、上で概要を述べられたような可変的な修飾により、対応するドナーオリゴヌクレオチド(例えばTACGCATGYCAGGTACTA)をデザインすることができる;
−標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質、例えば、及び特に、細胞のミスマッチ修復機構において機能的なタンパク質の存在下におけるドナーオリゴヌクレオチドによりDNAを修飾する。
C5−プロピンピリミジンを含んでいるオリゴヌクレオチドを、Trilink Biotech社又はジーンリンク(GeneLink)社から購入した。使用されるオリゴヌクレオチドの配列は以下に示される。実験において使用されるプラスミドは、カナマイシン耐性及びカルベニシリン耐性の両方を付与する遺伝子を含むpCR2.1(インビトロゲン(Invitrogen)社)の誘導体であった。インフレームの終止コドン及び欠失を、先に記述される(非特許文献32)ように、カナマイシン及びカルベニシリン中へと導入した。プラスミドKmY22stopは、カナマイシンORF中のコドンY22でTATからTAGへの変異を有する。一方、プラスミドCbY44stopは、カルベニシリンORF中のコドンY44でTACからTAGへの変換を有する。プラスミドKmY22.において、Y22コドンの3番目のヌクレオチド(TAT)が、フレームシフトを与えるように削除された。
コドンが正しいアミノ酸を再びコードするように、KmY22stop及びCbY44stopのカナマイシンORF又はカルベニシリンORFの中へ導入された終止コドン(TAG)で、単一のヌクレオチド置換を生じさせるオリゴヌクレオチドのデザインを行なった。プラスミドKmY22.では、オリゴヌクレオチドは単一ヌクレオチドを付加する、したがってORFを回復するようにデザインされた。C5−プロピンピリミジンの最適数を確立するために、一連のオリゴヌクレオチドを作成した。オリゴヌクレオチドK1は、ミスマッチヌクレオチドに隣接する2つのC5−プロピンピリミジンを含む。オリゴヌクレオチドK2では、全てのシトシンヌクレオチドは5−プロピニルデオキシシチジンに置き換わる。オリゴヌクレオチドK3では、全てのチミジンヌクレオチドは5−プロピニルデオキシウラシルに置き換わる。オリゴヌクレオチドK4及びオリゴヌクレオチドC4では、全てのピリミジンはC5−プロピンピリミジンに置き換わる。各実験において、未修飾DNAオリゴヌクレオチド及びC5−プロピン修飾オリゴヌクレオチドは並行して実行された。各実験で、正常DNAオリゴヌクレオチドを使用して得たTNE効率を任意に1に設定し、続いてC5−プロピン修飾オリゴヌクレオチドのTNE効率を正常DNAオリゴヌクレオチドに対する倍増加(fold increase)として表わした。図3に示すように、本分析において、C5−プロピン修飾オリゴヌクレオチドは、正常DNAオリゴヌクレオチドよりも効率的に働く。置換及び挿入のいずれの効率も増進された。置換の全修復効率は挿入に対してよりも高かった。認められた促進は存在するC5−プロピンヌクレオチドの割合に依存する。2つの(K1)、7つの(K2)、又は5つの(K3)C5−プロピンピリミジンを含むオリゴヌクレオチド(24量体)は全て、DNAオリゴヌクレオチドに対して2〜3倍の増加を示した。しかし、修復効率における最大の増進(6〜10倍)は、12のピリミジンヌクレオチドの全てがC5−プロピンピリミジンに置き換わったオリゴヌクレオチド(K4及びC4)の使用において認められた。この効果は、KmY22.の修復に限定されず、C5−プロピン修飾オリゴヌクレオチドを使用した場合には、CbY44の終止コドンの修復も促進されることに留意することが大切である。
Claims (28)
- 二重鎖DNA塩基配列の標的化改変のためのオリゴヌクレオチドであって、該二重鎖DNA塩基配列が、第1のDNA塩基配列、及び該第1のDNA塩基配列の相補物である第2のDNA塩基配列を含み、該オリゴヌクレオチドが、前記第1のDNA塩基配列に対してハイブリダイズすることができるドメインであって、前記第1のDNA塩基配列に関して少なくとも1つのミスマッチを含むドメインを含み、該オリゴヌクレオチドが、天然に存在するA、C、T又はGのヌクレオチドと比較して、より高い結合親和性を有する少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも1つのセクションを含み、該少なくとも1つの修飾ヌクレオチドが、前記第1のDNA塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに対して相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、前記第1のDNA塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合し、前記修飾ヌクレオチドがC7−プロピンプリン又はC5−プロピンピリミジンである、二重鎖DNA塩基配列の標的化改変のためのオリゴヌクレオチド。
- 前記プリンが、アデノシン又はグアノシンであり、及び/又は前記ピリミジンがシトシン、ウラシル、又はチミジンである、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ピリミジン及び/又は前記プリンの少なくとも10%が、好ましくは少なくとも50%が、より好ましくは少なくとも75%が、及び最も好ましくは少なくとも90%が、各々のプロピニル化された誘導体に置き換わる、請求項1又は2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記修飾ヌクレオチドがピリミジンである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記修飾ヌクレオチドがプリンである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、独立して少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3、4、5、6、7、8、9、又は10の修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも2つのセクション、好ましくは少なくとも3つのセクションを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記セクションが、3’末端、5’末端の近く、又は3’末端、5’末端に位置し、且つ/或いはミスマッチの位置を含むか、又はミスマッチの位置に隣接する、請求項1〜6のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ミスマッチの位置の前記ヌクレオチドが修飾されない、請求項1〜7のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドが、前記ミスマッチに隣接した位置に、好ましくは前記ミスマッチの2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、又は10ヌクレオチド内にある、請求項1〜8のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 10〜500ヌクレオチド長を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記(修飾された)セクションがドメインである、請求項1〜10のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- ドナーオリゴヌクレオチドと二重鎖アクセプターDNA塩基配列を組み合わせることを含む、二重鎖アクセプターDNA塩基配列の標的化改変のための方法であって、該二重鎖アクセプターDNA塩基配列が、第1のDNA塩基配列及び該第1のDNA塩基配列の相補物である第2のDNA塩基配列を含み、前記ドナーオリゴヌクレオチドが、改変される前記二重鎖アクセプターDNA塩基配列に関して、好ましくは前記第1のDNA塩基配列に関して、少なくとも1つのミスマッチを含むドメインを含み、前記オリゴヌクレオチドが、天然に存在するA、C、T又はGと比較して、より高い結合親和性を有する少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含むセクションを含み、該修飾ヌクレオチドが、標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質の存在下で、前記第1のDNA塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに対して相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、前記第1のDNA塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合し、前記修飾オリゴヌクレオチドが請求項1〜12において定義される、二重鎖アクセプターDNA塩基配列の標的化改変のための方法。
- 前記改変が、好ましくは植物細胞、真菌細胞、げっ歯類細胞、霊長類細胞、ヒト細胞又は酵母細胞から成る群から選択される細胞内のものである、請求項13に記載の方法。
- 前記タンパク質が細胞抽出物に由来する、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞抽出物が、植物細胞抽出物、真菌細胞抽出物、げっ歯類細胞抽出物、霊長類細胞抽出物、ヒト細胞抽出物又は酵母菌抽出物から成る群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記改変が、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、置換又は挿入である、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞が、真核生物細胞、植物細胞、ヒト以外の哺乳類細胞又はヒト細胞である、請求項13〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的DNAが、真菌、細菌、植物、哺乳類又はヒト由来である、請求項13〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重鎖DNAが、ゲノムDNA、線状DNA、哺乳類人工染色体、バクテリア人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、オルガネラ染色体DNA、エピゾームDNA由来である、請求項13〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾のための、請求項13〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用であって、細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾、ミスマッチ修復、遺伝子変異を含む(植物の)遺伝物質の標的化改変、標的化遺伝子修復及び遺伝子ノックアウトのための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 二重鎖DNA塩基配列の促進された標的化改変のための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用であって、前記二重鎖DNA塩基配列が、第1のDNA塩基配列及び該第1のDNA塩基配列の相補物である第2のDNA塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドが、前記第1のDNA塩基配列にハイブリダイズすることができるドメインであって、前記第1のDNA塩基配列に関して少なくとも1つのミスマッチを含むドメインを含み、前記オリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含むセクションを含み、該修飾ヌクレオチドが、天然に存在するA、C、T又はGと比較してより高い結合親和性を有し、前記修飾ヌクレオチドが、前記第1のDNA塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに対して相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、前記第1のDNA塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合し、前記修飾ヌクレオチドがC7−プロピンプリン又はC5−プロピンピリミジンである、請求項1〜12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 植物に対して除草剤抵抗性を提供する方法における、請求項1〜12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
- 請求項13〜21のいずれか一項に記載の方法により産生される修飾された遺伝物質。
- 請求項26に記載の、前記修飾された遺伝物質を含む細胞。
- 請求項13〜21のいずれか一項に記載の方法により産生される植物若しくは植物の一部分、又は請求項26に記載の前記遺伝物質を含む植物若しくは植物の一部分。
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