JP2009520499A - Lna修飾オリゴヌクレオチドにより改善された標的化ヌクレオチド交換 - Google Patents
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Abstract
Description
−アクセプター鎖、又は交換されるヌクレオチドの周囲の少なくとも1つの配列セクションの配列を決定する。これは、典型的には、好ましくはミスマッチの各々の側でミスマッチに隣接する少なくともほぼ10ヌクレオチド程度、好ましくは15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド又は30ヌクレオチドであり得る(例えばGGGGGGXGGGGGG、ここでXはミスマッチである);
−ミスマッチに隣接する1つ又は両方のセクションに対して相補的で、交換される所望のヌクレオチドを含むドナーオリゴヌクレオチドをデザインする(例えばCCCCCCYCCCCCC);
−所望の位置でのLNA修飾を有するドナーオリゴヌクレオチドを(例えば合成によって)提供する。修飾は状況に依存して、大きく変化してもよい。実施例は、CCCmCCmCYCCmCCCmC、CCCmCCCYCCCmCCC、CCCCCCYCCCmCmCmCm、CmCmCmCmCmCYCCCCCC、CCCCCmCYCCCmCCCCC等であり、ここで、CmはLNA修飾ヌクレオチド残基を表わす。異なるアクセプター配列(例えばATGCGTACXGTCCATGAT)に関しては、上で概要を述べられたような可変的な修飾により、対応するドナーオリゴヌクレオチド(例えばTACGCALGYCLGGTACTA(L=LNA))をデザインすることができる;
−標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質、例えば、及び特に、細胞のミスマッチ修復機構において機能的なタンパク質の存在下におけるドナーオリゴヌクレオチドによりDNAを修飾する。
LNAヌクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチドを、ユーロジェンテック(Eurogentec)社から購入した。使用されるオリゴヌクレオチドの配列は以下に示される。実験において使用されるプラスミドは、カナマイシン耐性及びカルベニシリン耐性の両方を付与する遺伝子を含むpCR2.1(インビトロゲン(Invitrogen)社)の誘導体であった。インフレームの終止コドン及び欠失を、先に記述される(非特許文献23)ように、カナマイシンORF及びカルベニシリン中へと導入した。プラスミドKmY22stopは、カナマイシンORF中のコドンY22でTATからTAGへの変異を有する。プラスミドKmY22.において、Y22コドンの3番目のヌクレオチド(TAT)が、フレームシフトを与えるように削除された。
コドンが正しいアミノ酸を再びコードするように、カナマイシンORFの中へ導入された終止コドン(TAG)で、単一のヌクレオチド置換(KmY22stop)又は単一のヌクレオチド挿入(KmY22Δ)を生じさせるオリゴヌクレオチドのデザインを行なった。
Claims (27)
- 二重鎖DNA塩基配列の標的化改変のためのオリゴヌクレオチドであって、該二重鎖DNA塩基配列が、第1のDNA塩基配列、及び該第1のDNA塩基配列の相補物である第2のDNA塩基配列を含み、該オリゴヌクレオチドが、前記第1のDNA塩基配列に対してハイブリダイズすることができるドメインであって、前記第1のDNA塩基配列に関して少なくとも1つのミスマッチを含むドメインを含み、該オリゴヌクレオチドが、天然に存在するA、C、T又はGのヌクレオチドと比較して、より高い結合親和性を有する少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも1つのセクションを含み、該少なくとも1つの修飾ヌクレオチドが、前記少なくとも1つのミスマッチから少なくとも1ヌクレオチドの距離で位置するLNAであり、任意で該オリゴヌクレオチドが、多くとも約75%のLNA修飾ヌクレオチドを含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 請求項1に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、少なくとも2ヌクレオチド、好ましくは少なくとも3ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも4ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも5ヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも6ヌクレオチドが、LNAであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 請求項1又は2に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記LNAが、前記ミスマッチの両側から多くとも10ヌクレオチド、好ましくは多くとも8ヌクレオチド、より好ましくは多くとも6ヌクレオチド、さらにより好ましくは多くとも4ヌクレオチド、3ヌクレオチド又は2ヌクレオチドの距離で独立して配置されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、2ヌクレオチド、好ましくは3ヌクレオチド、より好ましくは4ヌクレオチド、さらにより好ましくは5ヌクレオチド、及び最も好ましくは6ヌクレオチドが、LNAであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記オリゴヌクレオチドの前記修飾ヌクレオチドの多くとも50%、好ましくは多くとも40%、より好ましくは多くとも30%、さらにより好ましくは多くとも20%、及び最も好ましくは多くとも10%が、LNA誘導体であることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドが、前記ミスマッチの5’側及び/又は3’側に独立して位置することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記ミスマッチの5’側又は3’側のうちの一側に配置された2つのLNA修飾ヌクレオチドが、少なくとも1塩基対、好ましくは少なくとも2塩基対によって互いに分けられることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記ミスマッチの位置の前記ヌクレオチドが修飾されないことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチドが、前記ミスマッチに隣接した位置になく、好ましくは前記ミスマッチの2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、又は10ヌクレオチド内にあることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、10〜500ヌクレオチド長を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜10のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチドにおいて、前記(修飾された)セクションがドメインであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- ドナーオリゴヌクレオチドと二重鎖アクセプターDNA塩基配列を組み合わせることを含む、二重鎖アクセプターDNA塩基配列の標的化改変のための方法であって、該二重鎖アクセプターDNA塩基配列が、第1のDNA塩基配列及び該第1のDNA塩基配列の相補物である第2のDNA塩基配列を含み、前記ドナーオリゴヌクレオチドが、改変される前記二重鎖アクセプターDNA塩基配列に関して、好ましくは前記第1のDNA塩基配列に関して、少なくとも1つのミスマッチを含むドメインを含み、前記オリゴヌクレオチドが、天然に存在するA、C、T又はGと比較して、より高い結合親和性を有する少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含むセクションを含み、該修飾ヌクレオチドが、標的化ヌクレオチド交換を可能にするタンパク質の存在下で、前記第1のDNA塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに対して相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、前記第1のDNA塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合し、前記修飾オリゴヌクレオチドが請求項1〜11の内のいずれかに記載のヌクレオチドであることを特徴とする方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記改変が、好ましくは植物細胞、真菌細胞、げっ歯類細胞、霊長類細胞、ヒト細胞又は酵母細胞から成る群から選択される細胞内のものであることを特徴とする方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記タンパク質が細胞抽出物に由来することを特徴とする方法。
- 請求項14に記載の方法において、前記細胞抽出物が、植物細胞抽出物、真菌細胞抽出物、げっ歯類細胞抽出物、霊長類細胞抽出物、ヒト細胞抽出物又は酵母菌抽出物から成る群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記改変が、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、置換又は挿入であることを特徴とする方法。
- 請求項12〜16のいずれか一項に記載の方法において、前記細胞が、真核生物細胞、植物細胞、ヒト以外の哺乳類細胞又はヒト細胞であることを特徴とする方法。
- 請求項12〜17のいずれか一項に記載の方法において、前記標的DNAが、真菌、細菌、植物、哺乳類又はヒト由来であることを特徴とする方法。
- 請求項12〜18のいずれか一項に記載の方法において、前記二重鎖DNAが、ゲノムDNA、線状DNA、哺乳類人工染色体、バクテリア人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、オルガネラ染色体DNA、エピゾームDNA由来であることを特徴とする方法。
- 請求項12〜19のいずれか一項に記載の方法において、細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾のために用いられることを特徴とする方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用であって、細胞の改変、野生型への復帰による変異の修正、変異の誘導、コード領域の破壊による酵素の不活性化、コード領域の改変による酵素の生物活性の修飾、コード領域の破壊によるタンパク質の修飾、ミスマッチ修復、遺伝子変異を含む(植物の)遺伝物質の標的化改変、標的化遺伝子修復及び遺伝子ノックアウトのために用いられることを特徴とするオリゴヌクレオチドの使用方法。
- 二重鎖DNA塩基配列の促進された標的化改変のための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用であって、前記二重鎖DNA塩基配列が、第1のDNA塩基配列及び該第1のDNA塩基配列の相補物である第2のDNA塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドが、前記第1のDNA塩基配列にハイブリダイズすることができるドメインであって、前記第1のDNA塩基配列に関して少なくとも1つのミスマッチを含むドメインを含み、前記オリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含むセクションを含み、該修飾ヌクレオチドが、天然に存在するA、C、T又はGと比較してより高い結合親和性を有し、前記修飾ヌクレオチドが、前記第1のDNA塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドに対して相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して、前記第1のDNA塩基配列中の向かい合った位置のヌクレオチドにより強く結合し、前記修飾ヌクレオチドがLNAであることを特徴とするオリゴヌクレオチドの使用方法。
- 植物に対して除草剤抵抗性を提供する方法において、請求項1〜11のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とするオリゴヌクレオチドの使用方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
- 請求項12〜20のいずれか一項に記載の方法により産生されることを特徴とする修飾された遺伝物質。
- 請求項25に記載の、前記修飾された遺伝物質を含むことを特徴とする細胞。
- 請求項12〜20のいずれか一項に記載の方法により産生される植物若しくは植物の一部分、又は請求項25に記載の前記遺伝物質を含む植物若しくは植物の一部分からなることを特徴とする植物構成体。
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