JP2019506170A - オリゴヌクレオチド介在性遺伝子修復を利用した標的遺伝子修飾の効率を上昇させるための方法および組成物 - Google Patents

オリゴヌクレオチド介在性遺伝子修復を利用した標的遺伝子修飾の効率を上昇させるための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本明細書で提供されるものは、ＤＮＡ配列への標的変化を作製するための方法および組成物を含む。様々な態様および実施形態において、細胞（植物、細菌、酵母、真菌、藻類、または哺乳動物細胞など）中のＤＮＡ配列を修飾するための方法および組成物が、提供される。幾つかの態様および実施形態において、ＤＮＡの修飾は、遺伝子修復オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡカッターなどの標的細胞遺伝子修復機構の成分の利用可能性を増大するアプローチと組み合わせることを含む。
【選択図】図１

Description

本出願は、全ての表、図および特許請求の範囲をはじめとする全体が参照により本明細書に組み入れられ、優先権が主張されている、２０１６年２月９日出願の米国特許仮出願第６２／２９３，２７８号の利益を主張するものである。
発明の分野
本開示は、少なくとも一部として、標的遺伝子突然変異および修飾を行うための方法および組成物を含む、そのような突然変異および修飾に関する。
背景
以下の議論は、単に読み手による本開示の理解を助けるために提供されており、本開示の先行技術を記載または構成することを承認するものではない。
米国特許第６，２７１，３６０号には、所定の変化をコードするオリゴデオキシヌクレオチドを導入することによる生存細胞の標的遺伝子における所定の遺伝子変化の導入のための方法および組成物が開示されている。該オリゴデオキシヌクレオチドは、哺乳動物、鳥類、植物および細菌細胞において効果的である。
米国特許第８，７７１，９４５号には、一部がＣＲＩＳＰＲ複合体の１種または複数の成分をコードする、ベクターおよびベクター系と、そのようなベクターの設計および使用のための方法が開示されている。
米国特許第８，４７０，９７３号では、「ポリペプチドによりＤＮＡ配列中の塩基対を選択的に認識するための方法、ＤＮＡ配列中の１つまたは複数の塩基対を特異的に認識する修飾されたポリペプチド、ポリペプチドにより特異的に認識され得るように修飾されたＤＮＡ、ならびに特異的ＤＮＡを標的化する際のポリペプチドおよびＤＮＡの使用に加え、細胞における標的遺伝子の発現をモジュレートする方法が参照される。」
概要
本明細書で提供されるものは、細胞中のＤＮＡの標的遺伝子変化を実行するための方法および組成物を包含する。特定の態様および実施形態は、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列における特異的位置への修飾の標的化の効率を改善することに関する。本明細書に記載された通り、ゲノムへの特異的変化を指導する核酸は、修飾の標的とされる細胞の中に存在する天然の修復系の成分の利用可能性を増大する様々なアプローチと組み合わせることができる。
第一の態様において、提供されるのは、遺伝子修復オリゴヌクレオベース（ＧＲＯＮ）介在性突然変異を植物細胞中の標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に導入するための方法である。特定の実施形態において、該方法は、特に、植物細胞へのＧＲＯＮの送達の前および／もしくは送達と同時に１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復工程を増加させる条件下で、該植物細胞を培養すること；ならびに／または植物細胞への、１５塩基長よりも大きなＧＲＯＮの送達、を含み得、該ＧＲＯＮは、標的ＤＮＡへの導入のために１つもしくは複数、または２つ以上の突然変異部位を場合により含む。
本明細書で用いられる「遺伝子修復オリゴヌクレオチド」または「ＧＲＯＮ」は、特定の条件下でのＤＮＡ配列への１つの、または幾つかの実施形態において複数の、ヌクレオチド欠失、挿入または置換を指向し得るオリゴヌクレオベース（例えば、混合型デュプレックスオリゴヌクレオチド、非ヌクレオチド含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、および他の遺伝子修復分子）を意味する。ゲノムのこのオリゴヌクレオチド介在性遺伝子修復の編集は、非相同性に基づく修復系（例えば、非相同性末端結合）および相同性に基づく修復系（例えば、相同組換え修復）の両方を含み得る。該ＧＲＯＮは、典型的には設計されたミスマッチ（複数可）以外のゲノム標的と位置関係が合うように設計されている。これらのミスマッチは、細胞の内在性ＤＮＡ修復系の１つまたは複数を利用することにより認識および修正され得る。幾つかの実施形態において、ＧＲＯＮまたはオリゴヌクレオチドは、生物体の標的配列と比較して、複数の差異を含むように設計され得る。これらの差異は、前記標的配列から翻訳されたタンパク質配列に影響を及ぼすとは限らず、１つまたは複数の例ではサイレント変化として知られる。ＧＲＯＮ構造、化学的性質および機能の数多くの変異が、本明細書の他の箇所に記載される。様々な実施形態において、本明細書で用いられるＧＲＯＮは、１つまたは複数の修飾を有し得る。例えば本明細書で用いられるＧＲＯＮは、ＤＮＡ修復機構を標的とする（ミスマッチ）部位に引きつけ、そして／または標的ＤＮＡ配列のゲノムＤＮＡへのＧＲＯＮ（所望の標的欠失（複数可）、挿入（複数可）、置換（複数可）以外など）の一部もしくは全ての組換えを防止し、そして／またはＧＲＯＮの安定性を上昇させる、１つまたは複数の修飾を有し得る。
様々な実施形態において、ＧＲＯＮは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両ヌクレオチド、ならびに／またはヌクレオベースの他の型を有し得る。幾つかの実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドの１つまたは複数は、修飾を含む。
一態様において、提供されるのは、植物細胞中で遺伝子変化を引き起こす方法であって、該細胞をＤＮＡカッターおよびＧＲＯＮ、例えば本明細書で企図される通り修飾されたＧＲＯＮに暴露することを含む、方法である。幾つかの実施形態において、該ＧＲＯＮは、Ｃｙ３基、３ＰＳ基、２’Ｏ−メチル基、または本明細書で企図されるような他の修飾で修飾され得る。別の態様において、提供されるのは、ＤＮＡカッターおよびＧＲＯ、例えばＣｙ３基、３ＰＳ基、２’Ｏ−メチル基、または他の修飾で修飾されたＧＲＯを含む植物細胞である。幾つかの実施形態において、該ＤＮＡカッターは、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガー、メガヌクレアーゼ、およびＤＮＡ切断性抗生物質から選択される１つまたは複数である。幾つかの実施形態において、該ＤＮＡカッターは、ＣＲＩＳＰＲである。幾つかの実施形態において、該ＤＮＡカッターは、ＴＡＬＥＮである。幾つかの実施形態において、該ＧＲＯＮは、１５〜６０ヌクレオベース長の間、または３０〜４０ヌクレオベース長の間；または３５〜４５ヌクレオベース長の間；または２０〜７０ヌクレオベース長の間；または２０〜２００ヌクレオベース長の間；または３０〜１８０ヌクレオベース長の間；または５０〜１６０ヌクレオベース長の間；または７０〜１５０ヌクレオベース長の間；または７０〜２１０ヌクレオベース長；または８０〜１２０ヌクレオベース長の間；または９０〜１１０ヌクレオベース長の間；または９５〜１０５ヌクレオベース長の間；または８０〜３００ヌクレオベース長の間；または９０〜２５０ヌクレオベース長の間；または１００〜１５０ヌクレオベース長の間；または１００〜２００ヌクレオベース長の間；または１００〜２１０ヌクレオベース長の間；または１００〜３００ヌクレオベース長の間；または１５０〜２００ヌクレオベース長の間；または２００〜３００ヌクレオベース長の間；または２５０〜３５０ヌクレオベース長の間；または５０〜１１０ヌクレオベース長の間；または５０〜２００ヌクレオベース長の間；または１５０〜２１０ヌクレオベース長の間；または２０〜１０００ヌクレオベース長の間；または１００〜１０００ヌクレオベース長の間；または２００〜１０００ヌクレオベース長の間；または３００〜１０００ヌクレオベース長の間；または４００〜１０００ヌクレオベース長の間；または５００〜１０００ヌクレオベース長の間；または６００〜１０００ヌクレオベース長の間；または７００〜１０００ヌクレオベース長の間；または８００〜１０００ヌクレオベース長の間；または９００〜１０００ヌクレオベース長の間；または３００〜８００ヌクレオベース長の間；または４００〜６００ヌクレオベース長の間；または５００〜７００ヌクレオベース長の間；または６００〜８００ヌクレオベース長；または３０を超えるヌクレオベース長；または３５を超えるヌクレオベース長；または４０を超えるヌクレオベース長；または５０を超えるヌクレオベース長；または６０を超えるヌクレオベース長；または６５を超えるヌクレオベース長；または７０を超えるヌクレオベース長；または７５を超えるヌクレオベース長；または８０を超えるヌクレオベース長；または８５を超えるヌクレオベース長；または９０を超えるヌクレオベース長；または９５を超えるヌクレオベース長；または１００を超えるヌクレオベース長；または１１０を超えるヌクレオベース長；または１２５を超えるヌクレオベース長；１５０を超えるヌクレオベース長；または１６５を超えるヌクレオベース長；または１７５を超えるヌクレオベース長；または２００を超えるヌクレオベース長；または２５０を超えるヌクレオベース長；または３００を超えるヌクレオベース長；または３５０を超えるヌクレオベース長；または４００を超えるヌクレオベース長；または４５０を超えるヌクレオベース長；または５００を超えるヌクレオベース長；または５５０を超えるヌクレオベース長；または６００を超えるヌクレオベース長；または７００を超えるヌクレオベース長；または８００を超えるヌクレオベース長；または９００を超えるヌクレオベース長である。
ＧＲＯＮは、標的遺伝子の非コード（ＮＣ）領域およびコード（Ｃ）領域の両方で標的にされ得る。例として図２７および２８はそれぞれ、ＡＣＣａｓｅ遺伝子への以下のアミノ酸置換の１つまたは複数を導入するために、イネゲノム中に突然変異を導入するのに適したＣ−ＧＲＯＮおよびＮＣ−ＧＲＯＮを表す。慣習では、ノスズメノテッポウ（アロペキュラス・ミオスロイデス；Ａｍ）由来のプラスチド型ＡＣＣａｓｅのアミノ酸番号付けシステムを参照として使用する。本明細書で用いられるＡＣＣａｓｅ番号付けは、ノスズメノテッポウ参照配列ＡＣＣａｓｅタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の、またはＡＣＣａｓｅパラログ（Ｖ＝ＣＹ３；Ｈ＝３’ＤＭＴ ｄＣ ＣＰＧ）中の類似アミノ酸残基での、番号付けに基づく。以下の表は、アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ（ｃｌｏｆｏｐ）、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−Ｐ、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップ−Ｐ、ハロキシホップ、ハロキシホップ−Ｐ、イソキサピリホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ−Ｐ、トリホップ、ピノキサデン、これらの除草剤のいずれかの農学的に許容できる塩およびエステル、ならびにそれらの抵抗性表現型の組み合わせのうちの１つまたは複数を生成するＡＣＣａｓｅ突然変異を列挙している。
Figure 2019506170
Figure 2019506170
同様に、図２９および３０はそれぞれ、ＥＰＳＰＳ遺伝子（大腸菌ＡｒｏＡタンパク質（原核生物ＥＰＳＰＳ均等物）のアミノ酸配列に比較して全ての番号付けを有する）への以下のアミノ酸置換の１つまたは複数を導入するためにアマゲノム中に突然変異を導入するのに適した（コード）Ｃ−ＧＲＯＮおよび（非コード）ＮＣ−ＧＲＯＮを表す（米国特許第８，２６８，６２２号に記載されるものなど）。（Ｖ＝ＣＹ３；Ｈ＝３’ＤＭＴ ｄＣ ＣＰＧ）。以下の表は、グリホサート、これらの除草剤のいずれかの農学的に許容できる塩およびエステル、ならびにそれらの抵抗性表現型の組み合わせを生成するＥＰＳＰＳ突然変異を列挙している。
Figure 2019506170
本明細書で用いられる用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、エレメント、即ちｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子、転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサー配列（クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）、ＳＰＩＳＲ：スペーサーが散在したダイレクトリピート（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔｓ）としても知られる）を指し、細胞内で効率的に存在すれば、または発現されれば、例えばＣｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３３９ ｎｏ ６１２１ ｐｐ．８１９−８２３（２０１３）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３３７：８１６−８２１（２０１３）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．９０３−９１３（２００８）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６１，ｐｐ．２０−２７（２０１３）；Ｚｈａｎｇら、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３号；およびＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒら、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２５８９号に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ細胞機構を介して標的ＤＮＡ配列の切断を実行し得る。幾つかの実施形態において、例えば真核細胞中で使用されるＣＲＩＳＰＲなど、本明細書で企図されるＣＲＩＳＰＲは、１つまたは複数の機能的な核局在化シグナルのための配列を含むさらなるエレメントも含み得る。本明細書で企図されるＣＲＩＳＰＲは、多くのやり方または表現（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ）のいずれでも細胞内で発現され得、細胞へ投与され得、そして／または細胞内に存在し得る。例えば本明細書で企図されるＣＲＩＳＰＲは、以下のようなプラスミド上のＣＲＩＳＰＲ、プラスミド上のＣＲＩＳＰＲニッカーゼ、プラスミド上のＣＲＩＳＰＲａ、またはプラスミド上のＣＲＩＳＰＲｉのうちの１つまたは複数を含み得る、または必要とし得る。
プラスミド上のＣＲＩＳＰＲ：
（ｉ） ａ．標的ＤＮＡ中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一のセグメント（例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的な修飾ポリペプチドと相互作用する第二のセグメント（例えば、トランス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）、
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、ガイドＲＮＡ）と、
（ｉｉ） ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；および
ｂ．標的ＤＮＡ内で二本鎖切断を引き起こす活性部分（例えば、ＮＵＣローブ）であって、該標的ＤＮＡ内の該二本鎖切断の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、活性部分、
を含む、該部位特異的な修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ遺伝子）と、
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のＣＲＩＳＰＲニッカーゼ：
（ｉ） ａ．標的ＤＮＡ中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一のセグメント（例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的な修飾ポリペプチドと相互作用する第二のセグメント（例えば、トランス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）、
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、ガイドＲＮＡ）と、
（ｉｉ） ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；および
ｂ．標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を引き起こす活性部分（例えば、ＮＵＣローブ）であって、該標的ＤＮＡ内の該一本鎖切断の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、活性部分、
を含む、該部位特異的な修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ遺伝子）と、
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のＣＲＩＳＰＲａ：
（ｉ） ａ．標的ＤＮＡ中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一のセグメント（例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的な修飾ポリペプチドと相互作用する第二のセグメント（例えば、トランス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）、
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、ガイドＲＮＡ）と、
（ｉｉ） ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；および
ｂ．標的ＤＮＡ内で転写をモジュレートする活性部分（例えば、ＮＵＣローブ；特定の実施形態において、転写を増進する）であって、該標的ＤＮＡ内の該転写モジュレーションの部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、活性部分、
を含む、該部位特異的な修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ遺伝子）と、
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のＣＲＩＳＰＲｉ：
（ｉ） ａ．標的ＤＮＡ中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一のセグメント（例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的な修飾ポリペプチドと相互作用する第二のセグメント（例えば、トランス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）、
を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、ガイドＲＮＡ）と、
（ｉｉ） ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；および
ｂ．標的ＤＮＡ内で転写／翻訳をモジュレートする活性部分（例えば、ＮＵＣローブ；幾つかの実施形態において、転写／翻訳を低減する）であって、該標的ＤＮＡ内の該転写／翻訳モジュレーションの部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、活性部分、
を含む、該部位特異的な修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ遺伝子）と、
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のＣＲＩＳＰＲ、プラスミド上のＣＲＩＳＰＲニッカーゼ、プラスミド上のＣＲＩＳＰＲａ、およびプラスミド上のＣＲＩＳＰＲｉのそれぞれは、幾つかの実施形態において、あるいはプラスミド上よりもむしろＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質としての細胞中で投与、発現される、または存在する１つまたは複数の適当なエレメントを有し得る。保護されたｍＲＮＡの送達は、Ｋａｒｉｋｏらの米国特許第８，２７８，０３６号に記載された通りであり得る。
幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａのそれぞれは、失活されたｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含み得る。失活されたｃａｓ９は、依然として標的ＤＮＡに結合するが、切断活性を有さない。ヌクレアーゼ欠損ｃａｓ９は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ点突然変異から生じ得、その２つの触媒ドメインを不活性化する。
幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲｉは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの立体障害を介して転写開始または伸長を阻害する。ＣＲＩＳＰＲｉは、ｄＣａｓ９タンパク質のＣ末端への強力なレプレッサードメインの融合により場合により増強され得る（ＣＲＩＳＰＲｅｉ）。幾つかの実施形態において、リプレッサドメインは、クロマチン修飾因子を動員および利用する。幾つかの実施形態において、該リプレッサドメインは、Ｋａｇａｌｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．６ ｎｏ ２ ｐｐ１４１−１４６（２０１１）に記載されたドメインを包含し得るが、これらに限定されない：
１．ＬＤＬＮＲＰＰＰＶＥＮ − ＯｓＥＲＦ３リプレッサドメイン（ＬｘＬｘＰＰモチーフ）
２．ＬＲＬＦＧＶＮＭ − ＡｔＢＲＤリプレッサドメイン（Ｒ／ＫＬＦＧＶモチーフ）
３．ＬＫＬＦＧＶＷＬ − ＡｔＨｓｆＢ１リプレッサドメイン（Ｒ／ＫＬＦＧＶモチーフ）
４．ＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ − ＡｔＳＵＰリプレッサドメイン（ＥＡＲモチーフ）
５．ＥＲＳＮＳＩＥＬＲＮＳＦＹＧＲＡＲＴＳＰＷＳＹＧＤＹＤＮＣＱＱＤＨＤＹＬＬＧＦＳＷＰＰＲＳＹＴＣＳＦＣＫＲＥＦＲＳＡＱＡＬＧＧＨＭＮＶＨＲＲＤＲＡＲＬＲＬＱＱＳＰＳＳＳＳＴＰＳＰＰＹＰＮＰＮＹＳＹＳＴＭＡＮＳＰＰＰＨＨＳＰＬＴＬＦＰＴＬＳＰＰＳＳＰＲＹＲＡＧＬＩＲＳＬＳＰＫＳＫＨＴＰＥＮＡＣＫＴＫＫＳＳＬＬＶＥＡＧＥＡＴＲＦＴＳＫＤＡＣＫＩＬＲＮＤＥＩＩＳＬＥＬＥＩＧＬＩＮＥＳＥＱＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ＊ − 完全長ＡｔＳＵＰ遺伝子含有リプレッサドメイン（ＥＡＲモチーフ）。
幾つかの実施形態において、転写によるＣＲＩＳＰＲａ活性化は、融合されたＣ末端転写活性化因子を含有するｄＣａｓ９タンパク質の利用により実現された。幾つかの実施形態において、活性化は、Ｃｈｅｎｇ，ＡＷ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐｐ１−９（２０１３）；Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１０ ｐｐ９１３−９７６（２０１３）；Ｍａｅｄｅｒ，ＭＬ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１０ ｐｐ９７７−９７９（２０１３）、およびＭａｌｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．３１ ｐｐ８３３−８３８（２０１３）に記載されるようなＶＰ６４（４Ｘ ＶＰ１６）、ＡｔＥＲＦ９８活性化ドメイン、またはＡｔＥＲＦ９８ｘ４コンカテマーを包含し得るが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、該ＣＲＩＳＰＲは、ニッカーゼを含む。特定の実施形態において、２つ以上のＣＲＩＳＰＲニッカーゼが、用いられる。幾つかの実施形態において、該２つ以上のニッカーゼは、標的核酸の相対する鎖を切断する。別の実施形態において、該２つ以上のニッカーゼは、標的核酸の同じ鎖を切断する。
本明細書で用いられる「リプレッサタンパク質」または「リプレッサ」は、それぞれＤＮＡのオペレータに、またはＲＮＡに結合して転写または翻訳を防止するタンパク質を指す。
本明細書で用いられる「リプレッサ」は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ上の特異的部位へのリプレッサタンパク質の結合による転写または翻訳の阻害を指す。幾つかの実施形態において、リプレッサは、少なくとも１．５倍の、別の実施形態において少なくとも２倍の、別の実施形態において少なくとも５倍の転写または翻訳レベルにおける有意な変化を含む。
遺伝子転写および／または翻訳に関して本明細書で用いられる「活性化タンパク質」または「活性化因子」は、それぞれＤＮＡのオペレータに、またはＲＮＡに結合して転写または翻訳を増進または増加させるタンパク質を指す。
遺伝子転写および／または翻訳に関して本明細書で用いられる、遺伝子転写および／または翻訳に関する「活性化」は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ上の特異的部位への活性化タンパク質の結合により転写または翻訳を増進または増加させることを指す。幾つかの実施形態において、活性化は、少なくとも１．５倍、幾つかの実施形態において少なくとも２倍、幾つかの実施形態において少なくとも５倍の転写または翻訳レベルにおける有意な変化を含む。
特定の実施形態において、１つまたは複数の細胞内ＤＮＡ修復工程を増進する条件は、塩基除去修復のための標的であるＧＲＯＮまたは植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、非相同性末端結合のための標的であるＧＲＯＮまたは植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、マイクロホモロジー媒介末端結合のための標的であるＧＲＯＮまたは植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、相同組換えのための標的であるＧＲＯＮまたは植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、および修復を実行するための標的であるＧＲＯＮまたは植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入（例えば、塩基除去修復（ＢＥＲ）、相同組換え修復（ＨＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、古典的および代替的非相同性末端結合修復（ＮＨＥＪ）をはじめとするＮＨＥＪ、およびヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ））のうちの１つまたは複数を包含し得る。
本明細書に記載された通り、本明細書での使用のためのＧＲＯＮは、従来のＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチドからの以下の改変のうちの１つまたは複数を含み得る：
１つまたは複数の脱塩基ヌクレオチド；
１つまたは複数の８’オキソｄＡおよび／または８’オキソｄＧヌクレオチド；
３’末端の逆塩基；
１つまたは複数の２’Ｏ−メチルヌクレオチド；
１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチド；
５’末端の１つまたは複数の、そして幾つかの実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多いＲＮＡヌクレオチド（該ＲＮＡヌクレオチドの１つまたは複数は、さらに修飾され得る）；３’末端の１つまたは複数の、そして幾つかの実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多いＲＮＡヌクレオチド（該ＲＮＡヌクレオチドの１つまたは複数は、さらに修飾され得る）；
５’末端の１つまたは複数の、そして幾つかの実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多い２’Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド；
挿入色素；
５’末端キャップ；
ホスホチオアート修飾、リン酸メチル修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）修飾、ｄｉＰＳ修飾、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾からなる群から選択される骨格修飾；
１つまたは複数の鎖内架橋；
コンジュゲートされていて、幾つかの実施形態においてＧＲＯＮの５’または３’末端にある１つまたは複数の蛍光色素；ならびに
ハイブリダイゼーションエネルギーを増大する１つまたは複数の塩基。このリストは、限定を意味するものではない。
本明細書で用いられる用語「ゆらぎ塩基」は、参照ヌクレオチド配列の１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化を指し、該変化は、参照配列に対してヌクレオチドによりコードされたアミノ酸の配列を変化させない。
本明細書で用いられる用語「非ヌクレオチド」または「脱塩基ヌクレオチド」は、糖および／またはリン酸塩置換基のいずれかを含む１つまたは複数のヌクレオチド単位の代わりに核酸のチェーンに組み込むことができ、残留する塩基に酵素活性を呈示させる、任意の基または化合物を指す。該基または化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなどの一般に認識されたヌクレオチド塩基を含有しないという点で脱塩基である。それは、当該技術分野および本明細書に記載される通り、２’または３’ＨまたはＯＨへの置換を有し得る。
本明細書に記載される通り、特定の実施形態におけるＧＲＯＮの品質および変換効率は、２量体、３量体、４量体などのヌクレオチド多量体を用いてＧＲＯＮの全てまたは一部を合成し、その純度を改善することにより、改善され得る。
特定の実施形態において、該標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列は、植物細胞中にあり、例えば該標的ＤＮＡ配列は、植物細胞ゲノム中にある。該植物細胞は、非トランスジェニックまたはトランスジェニックであり得、該標的ＤＮＡ配列は、植物細胞のトランスジーンまたは内在性遺伝子であり得る。
特定の実施形態において、１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復工程を増進する条件は、ＧＲＯＮを植物細胞中に送達する前、送達するのと同時、または送達した後に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を植物細胞中に誘導する１つまたは複数の化合物を導入することを含む。例示的な化合物が、本明細書に記載されている。
本明細書に記載された方法および組成物は、一般には植物に適用可能である。例にすぎないが、植物の種は、既に具体的に言及されていない限り、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、トウモロコシ、コムギ（非限定的にトリチカム種、トリチカム・アエスチブム、トリチカム・デュラム、トリチカム・チモフェービ、トリチカム・モノコッカム、トリチカム・スペルタ、トリチカム・ズコフスキーおよびトリチカム・ウラルツ、ならびにそれらのハイブリッドなど）、オオムギ（非限定的にホルデウム・ブルガレ Ｌ、ホルデウム・コモサム、ホルデウム・デプレッサム、ホルデウム・インテルセデンス、ホルデウム・ジュバタム、ホルデウム・マリナム、ホルデウム・マリナム、ホルデウム・パロジ、ホルデウム・プシラム、ホルデウム・セカリナム、およびホルデウム・スポンタネウムなど）、イネ（非限定的に、オリザ・サティバ亜種インディカ、オリザ・サティバ亜種ジャポニカ、オリザ・サティバ亜種ジャバニカ、オリザ・サティバ亜種グルチノサ（もち米）、オリザ・サティバ・アロマチカ群（例えば、バスマティ）、およびオリザ・サティバ（浮稲群）など）、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、エンドウマメ、ヒヨコマメ、サヤエンドウ、ソラマメ、レンズマメ、カブ、ルタバガ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、フィールドビーン（ｆｉｅｌｄ ｂｅａｎｓ）、ポプラ、マツ、ユーカリ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ（非限定的に、セカレ・シルベストレ、セカレ・ストリクタム、セカレ・セレアレ、セカレ・バビロビ、セカレ・アフリカナム、セカレ・シリアトグルム、セカレ・アンセストラレ、およびセカレ・モンタナムなど）、オートムギ、シバ（非限定的に、ゾイシア・ジャポニカ、アグロストリス・パルストリス、ポア・プラテンシス、ポア・アヌア、デジタリア・サンギナリス、シペルス・ロタンダス、キリンガ・ブレビフォリア、シペルス・アムリカス、エリゲロン・カナデンシス、ヒドロコチレ・シブトルピオイデス、クメロウィア・ストリアタ、ユーフォビア・フミフサ、およびビオラ・アルベンシスをはじめとするシバなど）、およびイネ科牧草、アマ、ナタネ、ワタ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、ホウセンカ、コショウ、ナス、マリーゴールド、スイレン、キャベツ、ヒナギク、カーネーション、チューリップ、アイリス、ユリ、および堅果産生植物からなる群から選択され得る。これらはまた、全体または一部として、非限定的に細菌、酵母、真菌、藻類、および哺乳動物細胞、ならびにそれらのオルガネラ（例えば、ミトコンドリアおよびクロロプラスト）をはじめとする全ての他の生物系に適用され得る。幾つかの実施形態において、該生物体または細胞は、大腸菌、マイコバクテリウム・スメグマチス、枯草菌、クロレラ、バチルス・スリンギエンシス、サッカロマイセス・セレビシエ、ヤロウィア・リポリティカ、クラミドモナス・ラインハーディー、ピキア・パストリス、コリネバクテリウム、アスペルギルス・ニガー、およびネウロスポラ・クラッサからなる群から選択される種である。幾つかの実施形態において、該酵母は、ヤロウィア・リポリティカである。別の実施形態において、該酵母は、サッカロマイセス・セレビシエではない。幾つかの実施形態において、該植物または植物細胞は、アラブドプシス・サリアナ、ソラナム・ツベローサム、ソラナム・フレジャ、オリザ・サティバ、グリシンマックス、アマランサス・ツベルクラタス、リナム・ウシタチッシマム、およびジーメイズからなる群から選択される種である。該植物の種は、イネ科ポアケアの単子葉植物からなる群から選択され得る。該イネ科ポアケアは、２つの主なクレード、つまりタケ亜科、エールハルタ亜科、およびイチゴツナギ亜科を含むクレード（ＢＥＰクレード）と、キビ亜科、ダンチク亜科、ヒゲシバ亜科、ラッパグサ亜科、ミクライア亜科、アリスチドイデア（Ａｒｉｓｔｉｄｏｉｄｅａｅ）亜科、およびダントニオイデア（Ｄａｎｔｈｏｎｉｏｉｄｅａｅ）亜科を含むクレード（ＰＡＣＣＭＡＤクレード）に分別することができる。タケ亜科は、イネ連を包含する。該植物種は、ＢＥＰクレードの植物、詳細にはタケ亜科およびエールハルタ亜科の植物に関係し得る。ＢＥＴクレードは、タケ亜科、エールハルタ亜科、およびコムギの群を包含し、他のイチゴツナギ亜科は包含しない。ＢＥＴの作物は、ＢＥＴサブクレードのメンバー、例えばオオムギ、コーンなどの食物または飼料のために生育された植物である。
特定の実施形態において、該方法は、植物細胞からのＧＲＯＮにより導入された突然変異を有する植物を再生することをさらに含み、植物から種子を採取することを含み得る。
関連の態様において、本開示は、本明細書に記載された方法に従ってＧＲＯＮにより導入されたゲノム修飾を含む植物細胞、本明細書に記載された方法に従ってＧＲＯＮにより導入されたゲノム修飾を含む植物、もしくは本明細書に記載された方法に従ってＧＲＯＮにより導入されたゲノム修飾を含む種子、または本明細書に記載された方法に従ってＧＲＯＮにより導入されたゲノム修飾を含む種子の子孫に関する。
本開示の別の実施形態は、以下の詳細な記載、例示的実施形態、および特許請求の範囲から明白となろう。
ホスホチオアート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮ（ＧＲＯＮの各末端の３ＰＳ部分を有する）および５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮにより媒介されるＢＦＰからＧＦＰへの変換を表す。 図２Ａは、本明細書で「２’−Ｏ−メチルＧＲＯＮ」と称されるＲＮＡ／ＤＮＡを含むＧＲＯＮを表す。図２Ｂは、本明細書で「２’−Ｏ−メチルＧＲＯＮ」と称されるＲＮＡ／ＤＮＡを含むＧＲＯＮを表す。 ＢＦＰ５ ＣＲＩＳＰＲが標的とするｂｆｐ遺伝子上の位置の略図である。 ＢＦＰトランスジェニックアラビドプシス・タリアナモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換の割合％に及ぼす、様々な長さのＣｙ３または３ＰＳ ＧＲＯＮのいずれかを導入されたＣＲＩＳＰＲの影響の結果を示す。 ＢＦＰトランスジェニックアラビドプシス・タリアナモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換の割合％に及ぼす、様々な長さの３ＰＳ ＧＲＯＮを導入されたＣＲＩＳＰＲの影響の結果を示す。 実施例９で用いられたＧＲＯＮ「ｇｃｕｇｃｃｃｇｕｇ」を開示している。 実施例９で用いられたＧＲＯＮ「ｇｇｇｃｇａｇｇｇｃ」を開示している。 ７１量体ＧＲＯＮからのフローサイトメトリーにより決定されたアラビドプシス・タリアナＢＦＰトランスジェニックモデル系からのＧＦＰ陽性プロトプラストの平均割合％の測定を示す。 ２０１量体ＧＲＯＮからのフローサイトメトリーにより決定されたアラビドプシス・タリアナＢＦＰトランスジェニックモデル系からのＧＦＰ陽性プロトプラストの測定を示す。 ＢＦＰトランスジェニックアラビドプシス・タリアナモデル系のＧＦＰ養成細胞の平均割合％に及ぼす、コードおよび非コードＧＲＯＮを導入されたＣＲＩＳＰＲの影響を示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体に一本鎖ＧＲＯＮまたは二本鎖ＤＮＡをつなぐことの略図である。 異なる長さのスペーサーのＢＦＰトランスジェニックアラビドプシス・タリアナモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を媒介する際のＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮの影響の結果を示す。 プラスミド（ｇＲＮＡプラスミド）上でコードされた、またはアンプリコン（ｇＲＮＡアンプリコン）として使用された、スペーサーのＢＦＰトランスジェニックアラビドプシス・タリアナモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を媒介する際のＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮの影響の結果を示す。 非修飾４１量体ＧＲＯＮと３ＰＳ修飾された４１量体ＧＲＯＮを対比させた、ＢＦＰトランスジェニックアラビドプシス・タリアナモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を媒介する際のＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮの影響の結果を示す。 Ｔ＝０にＣＲＩＳＰＲプラスミドで処置された茎頂プロトプラストＰＥＧに由来する３週齢および６週齢リナム・ウシタチッシマム（アマ）マイクロカルスの次世代シークエンシングの結果を示す。 Ｔ＝０にＣＲＩＳＰＲプラスミドで処置された茎頂プロトプラストＰＥＧに由来する３週齢および６週齢リナム・ウシタチッシマムマイクロカルスの次世代シークエンシングの結果を示す。 図１６ａは、送達後７２時間目にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミド（ＢＣ−１）で処置されたプロトプラスト中のディーブシンクエンシングにより決定されたサイズに基づくインデルの分布を示す。インデルは、全ての読み出しの０．７９％に相当する。図１６ｂは、プラスミド（ＢＣ−１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−６）の送達後７２時間目のフローサイトメトリーにより同定されたＧＦＰ蛍光プロトプラストの割合％により測定されたＢＦＰからＧＦＰへの編集を示す。表されたデータは、トランスフェクション効率に正規化されていない。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝９）である。 図１７ａは、プラスミド（ＢＣ−１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−１）または（ＣＧ−２）の送達後７２時間目にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集における３ＰＳおよび非修飾ＧＲＯＮの比較を示す。図１７ｂは、プラスミド（ＢＣ−２）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−５）または（ＣＧ−８）の送達後７２時間目にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集におけるＧＲＯＮ長の比較を示す。図１７ｃは、プラスミド（ＢＣ−１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−６）、（ＣＧ−９）または（ＣＧ−１０）の送達後７２時間目にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集についての２’−Ｏ−Ｍｅ ＧＲＯＮへの３ＰＳの比較を示す。図１７ｄは、プラスミド（ＢＣ−３）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−３）または（ＣＧ−４）の送達後７２時間目にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集におけるＣｙ３ ＧＲＯＮへの３ＰＳ ＧＲＯＮの比較を示す。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）である。（ＣＧ−１）：非修飾のＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ；（ＣＧ−２）：修飾されたＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ ３ＰＳ；（ＣＧ−３）：修飾されたＢＦＰセンス４１ｎｂ ３ＰＳ；（ＣＧ−４）：修飾されたＢＦＰセンス４１ｎｂ ３ＰＳ；（ＣＧ−５）：修飾されたＢＦＰセンス６０ｎｂ ３ＰＳ；（ＣＧ−６）：修飾されたＢＦＰアンチセンス２０１ｎｂ ３ＰＳ；（ＣＧ−８）：修飾されたＢＦＰセンス２０１ｎｂ ３ＰＳ；（ＣＧ−９）：最初の５’ＲＮＡ塩基上のＢＦＰアンチセンス２０１ｎｂ ２’−Ｏ−Ｍｅ修飾；（ＣＧ−１０）：最初の５’ＲＮＡ塩基上のＢＦＰアンチセンス２０１ｎｂ ２’−Ｏ−Ｍｅ修飾。 図１８ａは、送達後７２時間目にＴＡＬＥＮプラスミド（ＢＴ−１）で処置されたアラビドプシス・プロトプラスト中のディープシークエンシングにより決定されたサイズに基づくインデルの分布を示す。インデルは、全ての読み出しの０．５１％に相当する。図１８ｂは、プラスミド（ＢＣ−１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−７）の送達後４８時間目のフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集を示す。図１８ｃは、送達後７日目にＥＰＳＰＳ遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮ（ＬｕＥＴ−１）で処置されたＬ．ウシタチッシマム・プロトプラスト中のｂｐ長に基づくインデルの代表的な分布を示す。インデルの総頻度は、０．５０％である。図１８ｄは、プロトプラスト中へのプラスミド（ＬｕＥＴ−１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−１１）の送達後７日目にディープシークエンシングにより測定されたＬ．ウシタチッシマムＥＰＳＰＳ遺伝子編集を示す。全ての読み出しに対する割合％は、Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａ編集の両方を含む読取の数を、全ての読み出しに対する割合％として表す。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）である。（ＣＧ−７）：修飾されたＢＦＰセンス２０１ｎｂ ３ＰＳ；（ＣＧ−１１）：修飾されたＥＰＳＰＳセンス１４４ｎｂ Ｃｙ３； トランスジェニックＡ．サリアナ・プロトプラストにおけるＢＦＰからＧＦＰへの編集に及ぼす、抗生物質ゼオシンおよびフレオマイシンを誘導する二本鎖切断の影響を示す。プロトプラストは、ＧＲＯＮ（ＣＧ２）のＰＥＧ導入前９０分間に、ゼオシンまたはフレオマイシンで処置された。編集の成功により、ＧＦＰ蛍光が得られた。緑色蛍光プロトプラストを、Ａｔｔｕｎｅ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを利用して定量した。 図２０は、ＢＦＰからＧＦＰへの変換を標的とするＢＦＰトランスジェニックプロトプラストへのＧＲＯＮ送達後５日目の変換されたＢＦＰトランスジェニックＡ．サリアナ細胞を示す。緑色蛍光は、ＢＦＰ−ＧＦＰ編集の指標である。Ａ．明視野画像；Ｂ．青色光での同じ視野。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）である。（ＣＧ２）：修飾されたＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ ３ＰＳ；（ＣＧ１２）：修飾された非標的のＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ ３ＰＳ；画像は、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国カリフォルニア州サニーベール所在）で取得した。スケールバー＝２０μｍ。 図２１ａは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドの略図を示す。マンノピンシンターゼ（Ｍａｓ）プロモーターは、高級植物に最適化されたコドンであるＣａｓ９遺伝子の転写を駆動している。このＣａｓ９遺伝子は、遺伝子の末端および２Ｘ ＦＬＡＧエピトープタグのいずれかに２つのＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。Ａ．サリアナ Ｕ６プロモーターは、ｇＲＮＡスカフォールドの転写を駆動しており、転写は、ポリ（Ｔ）シグナルを利用して終結している。図２１ｂは、ＴＡＬＥＮプラスミドの略図である。Ｍａｓプロモーターは、２Ａリボソームスキッピング配列と互いに連結された右および左のテールアーム（ｔａｌｅ ａｒｍ）の転写を駆動している。Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼが、各テールアームの３’末端に連結されている。左テールの５’末端は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）およびＶ５エピトープタグを含む。ｒｂｃＴは、ピサム・サチバムＲＢＣＳＥ９遺伝子ターミネーターである。 図２２ａは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプロトスペーサー、ＢＣ−１、ＢＣ−２およびＢＣ−３、ならびにＴＡＬＥＮ ＢＴ−１、左および右テールアームのためのＢＦＰ遺伝子標的領域を示す。ＰＡＭ配列が、赤色で示されている。ＴＡＬＥＮ結合部位は、太字であり下線が付されている。ＢＦＰからＧＦＰへの編集ＣＡＣ→ＴＡＣ（Ｈ６６Ｙ）の部位は、太字の緑色である。図２２ｂは、ＴＡＬＥＮ、ＬｕＥＴ−１、左および右テールアームのためのＥＰＳＰＳ遺伝子標的領域を示す。ＥＰＳＰＳ変換の部位ＡＣＡ＞ＡＴＡおよびＣＣＧ＞ＧＣＧ（Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａ）が、緑色である。 アロペキュラス・ミオスロイデス（ノスズメノテッポウ）ＡＣＣａｓｅ遺伝子産物のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。 大腸菌ＥＰＳＰＳ遺伝子産物のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。 例示的な類似ＥＰＳＰＳ位置を示す。 アロペキュラス・ミオスロイデス・プラスチド型ＡＣＣａｓｅ ｃＤＮＡ配列を示す。 アロペキュラス・ミオスロイデス・プラスチド型ＡＣＣａｓｅアミノ酸配列を示す。 オリザ・サティバ・プラスチド型ＡＣＣａｓｅ ｃＤＮＡ配列を示す。 オリザ・サティバ・プラスチド型ＡＣＣａｓｅアミノ酸配列を示す。 オリザ・サティバ・プラスチド型ＡＣＣａｓｅ ゲノムＤＮＡ配列を示す。 オリザ・サティバ・プラスチド型ＡＣＣａｓｅタンパク質配列を示す。 オリザ・サティバＡＣＣａｓｅタンパク質配列を示す。 ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミド、ＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１の図解を示す。マンノピンシンターゼ（Ｍａｓ）プロモーターは、Ｎ−およびＣ−末端の２つのＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）と、Ｎ−末端の３Ｘ ＦＬＡＧエピトープタグと、を含む植物コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子の転写を駆動する。ＡｔＵ６−２６プロモーターは、ポリ（Ｔ）で終結されたｇＲＮＡスカフォールドの転写を駆動する。 ＢＦＰトランスジーンの遺伝子座Ｈ６６を標的とするために用いられるアプローチを表した図解を示す。ＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１プロトスペーサー：黒色線；ＰＡＭ：赤色線。編集されたヌクレオチド変化（Ｃ＞Ｔ）は、それぞれ青色および緑色のフォントで示されたＢＦＰ蛍光からＧＦＰ蛍光への変換をもたらした。赤色フォントのヌクレオチドは、サイレント突然変異である。 ディープシークエンシング（ｎ＝１）により決定されたサイズに基づくインデルの分布を示す。 ＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１のためのオフターゲット解析を示す。小文字の赤色フォントであるディープシークエンシング（ｎ＝１）により決定されたインデルは、ティール色のフォントであるＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１標的配列ＰＡＭへのミスマッチである。 フローサイトメトリーにより分析されたＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１およびＢＦＰ／４１ ＧＲＯＮによるＢＦＰからＧＦＰへの編集を示す。Ｒ２ゲートは、ＧＦＰ（＋）事象と見なし、エラーバーは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝５）。 フローサイトメトリーにより分析されたＢＦＰからＧＦＰの精密遺伝子編集（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）における３ＰＳ修飾（ＢＦＰ／４１／３ＰＳ）および非修飾（ＢＦＰ／４１）ＧＲＯＮの比較を示す。Ｒ２ゲートは、ＧＦＰ（＋）事象と見なし、エラーバーは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝５）。 フローサイトメトリーにより分析されたＢＦＰからＧＦＰへの精密遺伝子編集における３ＰＳ修飾を用いた、および用いない、２つのＧＲＯＮ長、４１ｎｂおよび１０１ｎｂの比較を示し、エラーバーは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝３）。 この試験で用いられたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドＥＰＳＰＳ＿ｓｇＲＮＡ−２の図解を示す（詳細は図１に記載）。 遺伝子編集のワークフローにおける組織ステージを示す：１−アマのプロトプラストでバーは１０μｍ；２〜３週目のマイクロコロニーでバーは５０μｍ；３〜７週目のミコカルス（ｍｉｃｏｃａｌｌｉ）でバーは１００μｍ；４−カルスからの発芽でバーは０．５ｃ；５−再生された芽でバーは０．５ｃｍ；６−土壌中で再生された植物。 再生植物Ｙ２３およびＺ１５中で編集されたＥＰＳＰＳ対立遺伝子の配列確認を示す。囲まれた領域は、遺伝子特異的単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）およびＡＣＡ＞ＡＴＡ；ＣＣＧ＞ＧＣＧ編集を示す。クロマトグラムは、各芽からの複数のｇＤＮＡ抽出の代表例である。 アマのカルスおよび再生植物への除草剤耐性を示す。（ａ）アマ野生型（ｗｔ）カルスと、ＥＰＳＰＳ遺伝子中にＴ９７ＩおよびＰ１０１Ａ編集を含むカルスＹ２３を、６ウェルプレート中のグリホサート含有培地で培養した。画像は、処置開始の６日後に取得した。（ｂ）１４日後にグリホサートで処置されたｗｔおよびＹ２３カルスの平均新鮮重±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）。（ｃ）温室で強化されたｗｔおよびＹ２３全植物を、スプレー塗布のみにより１０．５または２１．０ｍＭグリホサートまたは界面活性剤で処置した。画像は、グリホサート塗布の６日後に取得した。この実験を複数回繰り返し、類似の結果が得られた。バー＝２ｃｍ アラビドプシスにおけるＢＦＰからＧＦＰへの変換に適用されたＲＴＤＳ技術を示す。（ａ）ＲＴＤＳ技術の代表例。（ｂ）ＲＴＤＳによる本発明者らのＢＦＰトランスジェニック株におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を表す略図。遺伝子座Ｈ６６（ＣＡＣ）からＹ６６（ＴＡＣ）への変換により、トランスジーンの蛍光特性が青色から緑色へ変化する。 アラビドプシスにおけるＲＴＤＳが媒介したＢＦＰからＢＦＰへの変換に及ぼすフレオマイシンの前処置の影響を示す。（ａ）プロトプラストを、０、２５０または１０００μｇ／ｍＬフレオマイシンで９０分間前処置し、その後、ＧＲＯＮ ＢＦＰ／４１またはＢＦＰ／４１／ＮＴのいずれかを用いてＲＴＤＳに供した。エラーバーは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝４）。（ｂ）ＧＲＯＮ送達の５日後の変換されたＡ．サリアナ細胞。緑色蛍光は、ＢＦＰからＧＦＰへの編集の指標である。Ａ．明視野画像；Ｂ．青色光での同じ視野。画像は、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国カリフォルニア州サニーベール所在）で取得した。スケールバー＝２０μｍ。 ＢＴ−１ ＴＡＬＥＮの設計および標的領域を示す。（ａ）ＢＴ−１ ＴＡＬＥＮプラスミド。ＭＡＳ− マンノピンシンターゼプロモータ；Ｖ５− Ｖ５エピトープタグ；ＮＬＳ− ＳＶ４０核局在化シグナル；Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼは、各テールアームの３’末端に連結されている；ｒｂｃＴ ピサム・サチバムＲＢＣＳＥ９遺伝子ターミネーター。（ｂ）ＢＦＰ遺伝子上のＢＴ−１ ＴＡＬＥＮ標的部位を表す略図。（ｃ）ＢＴ−１ ＴＡＬＥＮの設計および標的の図解。マンノピンシンターゼ（ＭＡＳ）プロモーターは、ＴＡＬＥＮ単量体の発現を駆動する。ｒｂｃＴ（ピサム・サチバム）ＲＢＣＳＥ９は、遺伝子ターミネーターとして働く。Ｖ５エピトープタグおよびＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、Ｎ末端に存在する。ＢＦＰ標的領域の略図。ＢＴ−１テール左および右結合ドメインに、下線が付されている。ＢＦＰからＧＦＰへの変換（Ｃ＞Ｔ）の部位は、青色になっている。ＢＴ−１活性は、ＮＨＥＪにより、またはｓｓＯＤＮを通して修復されて、それぞれ欠失および挿入、またはＢＦＰからＧＦＰへの精密編集を得ることができるＤＳＢを生成する。赤色の塩基は、変換後にＢＴ−１活性を防止するために用いられたサイレント置換である。 図３４は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物の設計および標的領域の図解を示す。Ａ．マンノピンシンターゼ（Ｍａｓ）プロモーターは、Ｎ−およびＣ−末端の２つのＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）と、Ｎ−末端の３Ｘ ＦＬＡＧエピトープタグと、を含む植物コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子の転写を駆動する。ｒｂｃＴ（ピサム・サチバム）ＲＢＣＳＥ９は、遺伝子ターミネーターとして働く。ＡｔＵ６−２６プロモーターは、ポリ（Ｔ）で終結されたｇＲＮＡ足場の転写を駆動する。Ｂ．ＢＣ−１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＢＦＰトランスジーンを標的とするために用いられたアプローチ。プロトスペーサーは、黒色の線として示され、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、赤色の線として示される。ＢＦＰからＧＦＰへの変換をもたらす編集されたヌクレオチド変化（Ｃ＞Ｔ）は、それぞれ青色および緑色フォントとして示される。赤色ヌクレオチドは、変換されたＧＦＰトランスジーン上のＢＣ−１活性を阻止するために用いられたサイレント突然変異である。 アラビドプシス・プロトプラスト中のＢＣ−１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９活性を示す。Ａ．非精密ＮＨＥＪは、アンプリコンディープサイレンシング（ｎ＝１）により決定された通りＢＣ−１で処置されたプロトプラスト中の事象を修復する。Ｂ．非精密ＮＨＥＪ事象の割合％により決定された、アラビドプシス・プロトプラスト中のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＢＣ−１と対比させたＴＡＬＥＮ ＢＴ−１の活性。Ｃ．ＢＣ−１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のためのオフターゲット分析。ＢＣ−１標的配列と相同性の５つの遺伝子座での非精密ＮＨＥＪ事象を、アンプリコンディープシークエンシングにより測定した（ｎ＝１）。小文字の赤色フォントの塩基は、ＢＣ−１標的配列へのミスマッチである。Ｄ．ｓｓＯＤＮは、ＢＣ−１で処置されたアラビドプシス・プロトプラスト中でのＢＦＰからＧＦＰへの編集を増進する。プロトプラストを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて、および用いずにＢＦＰ／４１もしくはＢＦＰ／１０１で、またはＢＣ−１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のみで処置した。ＢＦＰからＧＦＰへの編集は、送達の７２ｈ後にフローサイトメトリーにより測定した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝５）を表す。 アラビドプシス・プロトプラスト中のＢＴ−１ ＴＡＬＥＮ活性を示す。（ａ）ディープシークエンシングにより測定された７２時間のＢＴ−１ ＴＡＬＥＮで処置されたアラビドプシス・プロトプラスト中の修復事象の分布。（ｂ）ｂｐ長に関する合計欠失および挿入修復事象の割合％。（ｃ）２０ｂｐ長以下の合計欠失の割合％。（ｄ）２０ｂｐ長以下の合計挿入の割合％。エラーバーは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝４）。 アラビドプシス・プロトプラスト中でＢＦＰをＧＦＰに編集するためのＢＴ−１ ＴＡＬＥＮと組み合わせたＲＴＤＳを示す。（ａ）ＲＴＤＳによるＢＦＰからＧＦＰへの編集のためのＢＦＰ標的領域の略図。遺伝子座Ｈ６６（青色フォント；ＣＡＣ）からＹ６６（緑色フォント；ＴＡＣ）への変換により、トランスジーンの蛍光特性が青色から緑色へ変化する。赤色の塩基は、改良されたＧＦＰトランスジーン上のＢＴ−１ ＴＡＬＥＮ活性を阻止するために用いられたサイレント突然変異である。（ｂ）導入の７２時間後のＢＴ−１ ＴＡＬＥＮと、ＢＦＰ／４１、ＢＦＰ／１０１またはＢＦＰ／２０１ ＧＲＯＮのいずれかと、で処置されたアラビドプシス・プロトプラストにおける細胞数測定（ｃｙｔｏｍｅｔｙ）により決定されたＢＦＰからＧＦＰへの変換頻度。ＧＦＰゲートは、ＧＦＰ（＋）事象と見なし、エラーバーは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（ｎ＝３）。 アマ中のＥＰＳＰＳ遺伝子座を編集するためのＬｕＥＴ−１ ＴＡＬＥＮと組み合わせたＲＴＤＳを示す。（ａ）ＬｕＥＴ−１ ＴＡＬＥＮプラスミドの設計。ＭＡＳ− マンノピンシンターゼプロモータ；Ｖ５− Ｖ５エピトープタグ；ＮＬＳ− ＳＶ４０核局在化シグナル；Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼは、各テールアームの３’末端に連結されている；ｒｂｃＴ− ピサム・サチバムＲＢＣＳＥ９遺伝子ターミネーター。（ｂ）２つのアマＥＰＳＰＳ遺伝子座の保存された配列上のＬｕＥＴ−１ ＴＡＬＥＮ標的部位を表す略図。遺伝子座Ｔ９７（青色フォント；ＡＣＡ）からＩ９７（赤色フォント；ＡＴＡ）への変換、およびＰ１０１（青色フォント；ＣＣＧ）からＡ１０１（赤色フォント；ＧＣＧ）への変換が、グリホサート耐性を付与する。（ｃ）導入の６、２４および４８時間後のアマプロトプラストにおけるＬｕＥＴ−１ ＴＡＬＥＮ一過性発現のウエスタンブロット分析。ロード対照として用いられた可逆的染色。抗体は、Ｖ５エピトープに対するものであった。 アマプロトプラストにおけるＬｕＥＴ−１ ＴＡＬＥＮ活性を示す。（ａ）ディープシークエンシングにより測定された７日後のＬｕＥＴ−１ ＴＡＬＥＮで処置されたアマ・マイクロコロニーにおける修復事象の分布。（ｂ）ｂｐ長に関する合計欠失および挿入修復事象の割合％。（ｃ）２０ｂｐ長以下の合計欠失の割合％。（ｄ）２０ｂｐ長以下の合計挿入の割合％。（ｎ＝１）。 ディープシークエンシング分析のためのアンプリコンを作製するために用いられたＴＡＬＥＮ標的領域を表す図式（ｉａｇｒａｍ）を示す。（ａ）ＢＦＰトランスジーン上のＢＴ−１標的領域。ＢＦＰＦ−１およびＢＦＰＲ−１プライマーが、ＢＴ−１ ＴＡＬＥＮ結合領域に隣接する２０６ｂｐ長の領域を増幅する。（ｂ）ＬｕＥＴ−１標的領域。ＬｕＥＰＦ−１およびＬｕＥＰＲ−１は、ＥＰＳＰＳ遺伝子１および２における保存された領域から増幅して、１９４ｂｐ長のＴＡＬＥＮ結合領域に隣接するアンプリコンを生成する。アンプリコン内のＳＮＰは、遺伝子１および２特異性を提供する。
詳細な記載
オリゴヌクレオチドに媒介された標的遺伝子異修飾は、欠失、短い挿入および点突然変異を作製するためにＤＮＡの短い伸長の特異的改変に使用される貴重な技術である。これらの方法は、ＤＮＡ対合／アニーリングと、その後のＤＮＡ修復／組換え事象を含む。最初、核酸が、細胞内タンパク質因子により媒介された工程で、二本鎖ＤＮＡ中の相補鎖と共にアニーリングする。このアニーリングは、中心に配置されたミスマッチ塩基対（点突然変異の場合）を作製して、内在性タンパク質機構を刺激する可能性が最も高い構造摂動をもたらし、修復工程の第二のステップ：染色体配列の、および／またはオルガネラ（例えば、ミトコンドリアおよびクロロプラスト）内で、部位特異的な修復を開始する。この新たに導入されたミスマッチが、ＤＮＡ修復機構を誘導して、第二の修復事象を実施し、標的部位の最終修正に導く。本明細書に開示された様々な態様および実施形態における本発明の方法および組成物は、ＤＮＡ修復要素の利用可能性を増大する新規なアプローチを提供し、これにより標的核酸への遺伝子修復介在性修飾の効率および再現性を増大させることにより、該方法を改善し得る。
部位特異的なゲノム修飾のための効率的方法は、研究、臨床遺伝子療法、工業的微生物学、および農業に望ましい。１つのアプローチは、配列特異的手法でデュプレックスＤＮＡに第三の鎖として結合するトリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を利用して、特異的な突然変異誘発を媒介する。そのようなＴＦＯは、ソラレンもしくはクロラムブシルなどのつながれた突然変異源を送達すること（Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７８７９−７８８３，１９９３；Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：７３２３−７３３１，１９９３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５：１７５９−１７６８，１９９５；Ｔａｋａｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６０２−５６０６，１９９１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３４４０−３４４４，１９９７）により、またはエラーを起こしやすい修復を先導するのに充分な親和性で結合すること（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：８０２−８０５，１９９６）により、作用し得る。
ゲノム修飾のための別の方策は、外因性ＤＮＡフラグメントと標的遺伝子の間の相同組換えの誘導を含む。このアプローチは、哺乳動物細胞内で選択された遺伝子を標的化および破壊するための使用に成功しており、特異的遺伝子ノックアウトを担うトランスジーンマウスの産生を可能にした（Ｃａｐｅｅｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２，１９８９；Ｗａｇｎｅｒ、米国特許第４，８７３，１９１号）。このアプローチは、所望の組換え体の単離を可能にする選択可能なマーカの転位を含む。選択しなければ、典型的な遺伝子転位実験におけるトランスフェクトされたＤＮＡの相同的組み込みと非相同的組み込みの比率は低く、通常は１：１０００以下の範囲内である（Ｓｅｄｉｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）。相同的組み込みのこの低い効率は、実験使用または遺伝子療法のための遺伝子転位の有用性を限定する。相同組換えの頻度は、ＵＶ照射および選択された発癌物質による標的部位への損傷により（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８：１９６−２０２，１９８８）、そして部位特異性エンドヌクレアーゼにより（Ｓｅｄｉｖｙ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６０６４−６０６８，１９９４；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８０６−８１０，１９９５）増強され得る。加えて、トリプレックス指向性ソラレン光付加体により誘導されたＤＮＡ損傷が、染色体外ベクター内、および染色体外ベクター間の組換えを刺激し得る（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８０６−８１０，１９９５；Ｆａｒｕｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６：６８２０−６８２８，１９９６；Ｇｌａｚｅｒ，米国特許第５，９６２，４２６号）。
直鎖状のドナーフラグメントは、円形の対応物よりも組換え誘導性である（Ｆｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２：１３７２−１３８７，１９８２）。組換えは、特定の実施形態において、ドナーおよび標的部位の両方の間の非断続的な相同性の長さにより影響を受けることができ、短いフラグメントは多くの場合、無効な組換え基質になるようである（Ｒｕｂｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４：２２５３−２２５８，１９８４）。それにもかかわらず、遺伝子修正のためのＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの短いフラグメントの使用が、様々な方策の中心になっている（Ｋｕｎｚｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３：８５９−８６７，１９９６）。
本明細書で用いられる「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそれらのフラグメントまたな一部を指し、一本鎖または二本鎖であり得、センスまたはアンチセンス鎖を表し得る、ゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、少なくとも１０ヌクレオベース、および約１０００もの多量のヌクレオベースのポリマーを指す。
本明細書で用いられる用語「ＤＮＡ修飾分子」および「ＤＮＡ修飾試薬」は、細胞のゲノム内の核酸配列を認識してそれに特異的に結合することが可能であり、ゲノム内の標的ヌクレオチド配列を修飾することが可能である分子を指し、該ＤＮＡ修飾分子の認識および核酸配列への特異的結合は、タンパク質非依存性である。ＤＮＡ修飾分子に関連して本明細書で用いられる用語「タンパク質非依存性」は、ＤＮＡ修飾分子が、核酸配列の認識および／または核酸配列への特異的結合のために、タンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要としないことを意味する。ＤＮＡ修飾分子は、例示されており、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリアミド、および遺伝子変換を促進することを意図されたオリゴヌクレオチドに限定されない。本開示のＤＮＡ修飾分子は、特定の実施形態において、相同組換えに用いられる先行技術の核酸配列がタンパク質依存性であるという点で、相同組換えに用いられる先行技術の核酸配列と識別される（Ｗｏｎｇ ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２２９４−２２９５，１９８７）。本明細書で分子に関連して用いられる用語「タンパク質依存性」は、ＤＮＡ修飾分子が、核酸配列の認識および／または核酸配列への該分子の特異的結合のために、該分子がタンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要とすることを意味する。ＤＮＡ修飾分子が、核酸配列の認識および／または核酸配列への特異的結合のために、タンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要とするか否かを決定する方法は、当該技術分野の技能に含まれる（例えば、Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：４７３４−４７４２，１９９９参照）。例えば、該ＤＮＡ修飾分子は、任意のタンパク質および／または酵素の非存在下で核酸配列と共にインビトロでインキュベートされ得る。該ＤＮＡ修飾分子と該核酸配列の間の特異的結合の検出により、該ＤＮＡ修飾分子がタンパク質非依存性であることが実証される。その一方で、該ＤＮＡ修飾分子と該核酸配列の間の特異的結合に非存在により、ＤＮＡ修飾分子がタンパク質依存性であること、および／またはさらなる因子を必要とすることが実証される。
「トリプレックス形成オリゴヌクレオチド」（ＴＦＯ）は、デュプレックスＤＮＡまたはＲＮＡらせんの主溝（ｍａｊｏｒ ｇｒｏｖｅ）の中で結合して三重らせんを形成することが可能なＤＮＡまたはＲＮＡの配列と定義される。ＴＦＯは、任意の特定の長さに限定されないが、ＴＦＯの好ましい長さは、２５０ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、または１００ヌクレオチド以下、または５〜５０ヌクレオチド、または１０〜２５ヌクレオチド、または１５〜２５ヌクレオチドである。ＴＦＯとデュプレックスＤＮＡの間の一定度合いの配列特異性が、三重らせんの形成に必要であるが、三重らせんが形成可能である限り、特定の度合いの特異性は必要でない。同様に、三重らせんが形成可能である限り、ＴＦＯとデュプレックスらせんの間に、特定の度合いの結合能または親和性は必要でない。ＴＦＯが特異的に結合するヌクレオチド配列の長さを限定する意図はないが、一実施形態において、ＴＦＯが特異的に結合するヌクレオチド配列は、１〜１００、幾つかの実施形態において５〜５０、別の実施形態において１０〜２５、別の実施形態において１５〜２５ヌクレオチドである。加えて、「三重らせん」は、二重らせん核酸内の標的配列に結合されたオリゴヌクレオチドを有する該二重らせん核酸と定義される。「二重らせん」核酸は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡとＲＮＡの混合型デュプレックスを含む任意の二本鎖核酸であり得る。該二本鎖核酸は、任意の特定の長さに限定されない。しかし、好ましい実施形態において、それは、５００ｂｐを超える、幾つかの実施形態において１ｋｂを超える、幾つかの実施形態において約５ｋｂを超える長さを有する。多くの適用において、該二重らせん核酸は、細胞内ゲノム核酸である。該トリプレックス形成オリゴヌクレオチドは、平行的または非平行的方式で標的配列に結合し得る。
「ペプチド核酸」、「ポリアミド」または「ＰＮＡ」は、リン酸骨格がＮ−アミノエチルグリシンに基づくポリアミド構造で置き換えられた核酸である。ＰＮＡは、ワトソン・クリック塩基対合則に従って天然の対応物よりも高い、相補的核酸への親和性を有する。ＰＮＡは、以下の化学量論：（ＰＮＡ）２．ＤＮＡで、ＤＮＡと高度に安定した三重らせん構造を形成し得る。ペプチド核酸およびポリアミドは、任意の特定の長さに限定されないが、ペプチド核酸およびポリアミドの好ましい長さは、２００ヌクレオチド以下、幾つかの実施形態において１００ヌクレオチド以下、幾つかの実施形態において５〜５０ヌクレオチド長である。ペプチド核酸およびポリアミドが特異的に結合するヌクレオチド配列の長さを限定する意図はないが、幾つかの実施形態において、ペプチド核酸およびポリアミドが特異的に結合するヌクレオチド配列は、１〜１００、幾つかの実施形態において５〜５０、さらに別の実施形態において５〜２５、別の実施形態において５〜２０ヌクレオチドである。
用語「細胞」は、単一細胞を指す。用語「細胞（複数）」は、細胞集団を指す。該集団は、１つの細胞型を含む純粋な集団であり得る。同様に該集団は、１つよりも多い細胞型を含み得る。本開示において、細胞集団が含み得る細胞型の数に限定はない。本明細書で用いられる細胞としては、植物カルス細胞、細胞壁を有する細胞、細胞壁を有さない細胞、原核細胞、および真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞の試料を指す場合の用語「同調する」もしくは「同調された」、または「同調された細胞」もしくは「同調された細胞集団」は、細胞集団を細胞周期の同じ期間に入らせるように処置された複数の細胞を指す。試料中の細胞の全てが同調される必要はない。少しの割合の細胞が、試料中の細胞の大部分と同調していない場合がある。同調される細胞の好ましい範囲は、１０〜１００％の間である。より好ましい範囲は、３０〜１００％の間である。同じく、細胞が単一細胞型の純粋な集団である必要はない。１種よりも多くの細胞型が、試料に含まれる場合がある。これに関連して、１つの細胞型のみが、同調されてもよく、または試料中の別の細胞型に比較して、細胞周期の異なる期間にあってもよい。
単一細胞を参照した時の用語「同調された細胞」は、細胞が操作前の細胞の細胞周期期間と異なる細胞周期期間にあるように操作されていることを意味する。あるいは「同調された細胞」は、対照細胞（例えば、操作を行っていない細胞）に比較して、細胞が操作前であった細胞周期の持続時間を改変する（即ち、増加または減少させる）ように操作された細胞を指す。
用語「細胞周期」は、細胞が分裂している（即ち、増殖している）時に受ける生理学的および形態学的な変化の進行を指す。細胞周期は一般に、「間期」、「前期」、「中期」、「後期」、および「終期」と称される期間で構成されると認識されている。加えて、細胞周期の一部は、「Ｍ（有糸分裂）」、「Ｓ（合成）」、「Ｇ０」、「Ｇ１（ギャップ１）」および「Ｇ２（ギャップ２）」と称され得る。さらに細胞周期は、先の名称の期間の中間である進行時期を含む。
用語「細胞周期阻害」は、細胞または細胞集団における細胞周期進行の中断を指す。細胞周期阻害は通常、細胞生理学の態様と干渉して細胞周期の連続を妨害する物質（化学物質、タンパク質性物質、その他）に細胞を暴露することにより誘導される。
「増殖」または「細胞成長」は、２個の娘細胞に繰返し分裂し、それにより集団において細胞の全体的増加をもたらす親細胞の能力を指す。細胞集団は、生物体内または細胞装置内にあり得る。
用語「ＤＮＡを修飾することが可能」または「ＤＮＡ修飾手段」は、ＤＮＡの標的セグメントのヌクレオチド配列への変化を誘導する能力を有する、または該変化の誘導を補助し得る、手順、ならびに内在性または外因性の物質または試薬を指す。そのような変化は、標的ＤＮＡセグメント上の１つまたは複数の塩基の欠失、付加または置換により行われ得る。ＤＮＡ配列の変化が、標的配列によりコードされた任意の遺伝子に機能的変化を付与する必要はない。さらに、ＤＮＡへの変化が、細胞の任意の特定部分または割合に行われる必要はない。
用語「該当するヌクレオチド配列」は、操作が任意の理由で当業者に望ましいと思われ得る、任意のヌクレオチド配列を指す。そのようなヌクレオチド配列としては、構造遺伝子（例えば、レポータ遺伝子、選択マーカ遺伝子、発癌遺伝子、薬物耐性遺伝子、増殖因子など）のコード配列、ｍＲＮＡまたはタンパク質生成物をコードしない非コード調節配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサ配列、ポリアデニル化配列、集結配列、ｍｉＲＮＡなどの調節ＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
「アミノ酸配列」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド配列」および「ペプチド」は、アミノ酸の配列を指すために本明細書で互換的に用いられる。
本明細書で用いられる「標的配列」は、８ヌクレオチド長よりも大きく２０１ヌクレオチド長よりも小さい配列を含む二重らせん核酸を指す。幾つかの実施形態において、該標的配列は、８〜３０塩基の間である。該標的配列は一般に、二重らせん核酸上の鎖の１つのヌクレオチド配列により定義される。
本明細書で用いられる、二重らせん核酸配列の鎖の１つのヌクレオチド配列に関連づけられた場合の「プリンリッチ配列」または「ポリプリン配列」は、標的配列のヌクレオチドの５０％より多くがプリン塩基を含む、該ヌクレオチドの連続配列と定義される。しかし、プリンリッチ標的配列が６０％より多くのプリンヌクレオチド、幾つかの実施形態において７５％より多くのプリンヌクレオチド、別の実施形態において９０％より多くのプリンヌクレオチド、さらに別の実施形態において１００％のプリンヌクレオチドを含むことが、好ましい。
本明細書で用いられる、二重らせん核酸配列の鎖の１つのヌクレオチド配列に関連づけられた場合の「ピリミジンリッチ配列」または「ポリピリミジン配列」は、標的配列のヌクレオチドの６０％より多くがピリミジン塩基を含む、該ヌクレオチドの連続配列と定義される。しかし、ピリミジンリッチ標的配列が、６０％より多くのピリミジンヌクレオチド、幾つかの実施形態において７５％より多くのプリンヌクレオチドを含むことが、好ましい。幾つかの実施形態において、該配列は、９０％より多くのピリミジンヌクレオチドを含み、別の実施形態において１００％のプリンヌクレオチドである。
第一のヌクレオチド配列の「バリアント」は、第一のヌクレオチド配列とは異なる（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて、またはＤＮＡシークエンシングを用いて検出され得る１つまたは複数の欠失、挿入、または置換を有することによる）ヌクレオチド配列と定義される。この定義に含まれるのは、第一のヌクレオチド配列のゲノム配列への改変または修飾の検出である。例えばハイブリダイゼーションアッセイは、（１）ゲノムに含まれる場合の第一のヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションを可能にする制限酵素フラグメントのパターンの改変（即ち、ＲＦＬＰ分析）、（２）第一のヌクレオチド配列の選択された部分が、第一のヌクレオチド配列を含むゲノムＤＮＡの試料にハイブリダイズする能力がないこと（例えば、対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプローブを用いる）、（３）第一のヌクレオチド配列のための通常の染色体遺伝子座以外の遺伝子座へのハイブリダイゼーションなど、不適当な、または予想外のハイブリダイゼーション（例えば、中期染色体スプレッドなどへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いる）、を検出するために用いられ得る。バリアントの一例は、突然変異した野生型配列である。
本明細書で用いられる用語「核酸」および「非修飾核酸」は、公知の４種のデオキシリボ核酸塩基（即ち、グアニン、アデニン、シトシン、およびチミン）のうちの任意の１つを指す。用語「修飾された核酸」は、非修飾核酸の構造に比較して構造が改変された核酸を指す。そのような修飾の例示は、アミノ窒素および環窒素のアルキル化、ならびに二重結合の飽和など、塩基の置換共有結合修飾（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）である。
本明細書で用いられる、核酸配列に関連して用いられる場合の用語「突然変異」および「修飾」およびそれらの文法的均等物は、付加体の欠失、挿入、置換、鎖切断、および／または導入を指すために互換的に用いられる。「欠失」は、１つまたは複数のヌクレオチドが存在しない、核酸配列の変化と定義される。「挿入」または「付加」は、１つまたは複数のヌクレオチドの付加をもたらした核酸配列の変化である。「置換」は、交換された１つまたは複数のヌクレオチドと異なる分子である分子による１つまたは複数のヌクレオチドの交換から得られる。例えば、シトシン、アデニン、グアニン、またはウリジンによるチミンの交換により例示される通り、核酸は、異なる核酸により交換され得る。ピリミジンからピリミジンへ（例えば、ＣからＴ、またはＴからＣへのヌクレオチド置換）またはプリンからプリンへ（例えば、ＧからＡ、またはＡからＧへのヌクレオチド置換）は、転位と称されるが、ピリミジンからプリンへ、またはプリンからピリミジンへ（例えば、ＧからＴ、またはＧからＣ、またはＡからＴ、またはＡからＣ）は、転換と称される。あるいはチミジングリコールによるチミジンの交換により例示される通り、核酸は、修飾された核酸により交換され得る。突然変異は、ミスマッチを生じ得る。用語「ミスマッチ」は、各核酸が異なるポリ核酸配列上に存在し、塩基対合則に従わない、２つの核酸の間の非共有結合性相互作用を指す。例えば一部が相補的な配列５’−ＡＧＴ−３’および５’−ＡＡＴ−３’の場合、Ｇ−Ａミスマッチ（転位）が、存在する。用語「付加体の導入」または「付加体形成」は、連結によりＤＮＡ複製および／または転写のレベルの低下（幾つかの実施形態において１０％〜１００％、別の実施形態において５０％〜１００％、幾つかの実施形態において７５％〜１００％）が得られるように、ＤＮＡ配列中の１つまたは複数のヌクレオチドへの分子の共有結合性または非共有結合性の連結を指す。
用語「ＤＮＡカッター」は、鎖切断を実行する部分を指す。非限定的例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ／ＴＡＬＥＮ、抗生物質、亜鉛フィンガーおよびＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系が挙げられる。
二本鎖核酸配列に関連づけられた場合の用語「鎖切断」は、一本鎖切断および／または二本鎖切断を包含する。一本鎖切断（ニック）は、二本鎖核酸配列の２つの鎖の一方の中断を指す。これは、平滑末端または付着末端をもたらし得る、二本鎖核酸配列の両方の鎖の中断を指す二本鎖切断とは対照的である。鎖切断は、直接的（例えば、電離放射線照射または特定の化学物質での処置による）または間接的（例えば、核酸塩基での酵素性切除による）のいずれかで二本鎖核酸配列に導入され得る。
用語「突然変異細胞」および「修飾細胞」は、細胞のゲノム配列に少なくとも１つの修飾を含む細胞を指す。
ヌクレオチド配列に関連して用いられる場合の用語「部分」は、そのヌクレオチド配列のフラグメントを指す。該フラグメントは、５つのヌクレオチド残基から（全ヌクレオチド配列−１核酸残基）までのサイズの範囲内であり得る。
１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がホスホジエステル結合を介して一方向に隣接する３’酸素に付着するような手法で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを生成するため、ＤＮＡ分子は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われる。それゆえ、５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結しない場合には、オリゴヌクレオチドの末端は、「５’末端」と称される。３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結しない場合には、オリゴヌクレオチドの末端は、「３’末端」と称される。本明細書で用いられる核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にあったとしても、５’および３’末端を有すると言うこともできる。直鎖状または環状ＤＮＡ分子において、分離したエレメントは、「上流」または下流の５’側または３’エレメントであると称される。この用語法は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’方向に進行することを反映している。連結された遺伝子の転写を指向するプロモーターおよびエンハンサエレメントは一般に、コード領域の５’側または上流に位置する。しかし、エンハンサエレメントは、プロモーラエレメントおよびコード領域の３’側に位置する場合でも、影響を発揮し得る。転写終結およびポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’側または下流に位置する。
本明細書で用いられる用語「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学の技術を用いて互いに接合されたＤＮＡのセグメントで構成されたＤＮＡ分子を指す。
本明細書で用いられる用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ分子を用いて発現されるタンパク質分子を指す。
本明細書で用いられる用語「ベクター」および「ビヒクル」は、ＤＮＡセグメント（複数可）を１つの細胞から別の細胞へ転位させる核酸分子に関連して互換的に用いられる。
本明細書で用いられる用語「動作可能な組み合わせ」、「動作可能な順序」および「動作可能に連結された」は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指導することが可能な核酸分子が生成されるような手法での核酸配列の連結を指す。この用語はまた、機能的タンパク質が生成されるような手法でのアミノ酸配列の連結を指す。
本明細書で用いられる用語「トランスフェクション」は、細胞への外来ＤＮＡの導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥデキストラン介在性トランスフェクション、ポリブレン介在性トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクチン、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、バイオリスティック（即ち、粒子衝撃）などの当該技術分野で知られる種々の手段により遂行され得る。
本明細書で用いられる用語「相補的な」または「相補性」は、塩基対合則により関連する「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」（ヌクレオチドの配列を参照する互換的な用語である）を照会して用いられる。例えば配列「５’−ＣＡＧＴ−３’」は、配列「５’−ＡＣＴＧ−３’」と相補的である。相補性は、「部分的」または「全体的」であり得る。「部分的」相補性は、１つまたは複数の核酸塩基が塩基対合則に従ってマッチされない場合である。核酸の間の「全体的」または「完全な」相補性は、塩基対合則の下であらゆる核酸塩基が別の塩基とマッチする場合である。核酸鎖の間の相補性の度合いは、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度への有意な影響を有し得る。これは、増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出方法では特に重要になり得る。簡便にするために、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシドを含む分子を包含する。
ヌクレオチド配列に関連して本明細書で用いられる用語「相同性」および「相同性のある」は、他のヌクレオチド配列との相補性の度合いを指す。部分的相同性または完全相同性（即ち、同一性）があり得る。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関連して用いられる場合、用語「実質的に相同性のある」は、先に記載された通り低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列のいずれかまたは両方の鎖にハイブリダイズし得る任意の核酸配列（例えば、プローブ）を指す。核酸配列に部分的に相補的である、即ち「実質的に相同性の」ヌクレオチド配列は、完全に相補的な配列が標的核酸配列にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するものである。標的配列への、完全に相補的な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）など）を利用して検査され得る。実質的に相同性の配列またはプローブは、低ストリンジェンシーの条件下で標的配列への完全に相同性の配列の結合（即ち、ハイブリダイゼーション）と拮抗してそれを阻害する。これは、低ストリンジェンシーの条件が非特異的結合を許容するようにする、と言っているのではなく、低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いへの結合が特異的（即ち、選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的結合が無いことは、相補的な部分的度合いさえも欠如した（例えば、約３０％未満の同一性の）第二の標的配列の使用によりテストすることができ、非特異的結合の非存在下では、プローブが第二の非相補的標的にハイブリダイズしないであろう。
低ストリンジェンシー条件は、約１００〜約１０００ヌクレオチド長のプローブが用いられる場合には、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、０．１％ ＳＤＳ、５×デンハルト試薬（５０×デンハルト試薬は５００ｍｌあたりにＦｉｃｏｌｌ（タイプ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）５ｇ、ＢＳＡ（フラクションＶ；Ｓｉｇｍａ）５ｇを含有）および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡからなる溶液中、６８℃で結合またはハイブリダイズした後、２．０×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、室温で洗浄するのと同等の条件を含む。
加えて、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ステップの温度を上昇させること、ハイブリダイゼーション溶液中でのホルムアミドの使用など）は、当該技術分野で周知である。核酸ハイブリダイゼーションに関連して用いられる場合の高ストリンジェンシーの条件は、約１００〜約１０００ヌクレオチド長のプローブが用いられる場合に、５×ＳＳＰＥ、１％ ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡからなる溶液中、６８℃で結合またはハイブリダイズした後、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６８℃で洗浄するのと同等の条件を含む。
数多くの同等条件が低ストリンジェンシー条件を含んで利用され得ることは、当該技術分野で周知であり、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、標的の性質（溶液中に存在する、または固定された、ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの有無）、ならびにハイブリダイゼーション溶液の成分などの因子は、先に列挙された条件と異なるが同等である低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件を作製するために変動させ得る。
該当するハイブリダイゼーション条件に関係するためハイブリダイゼーション条件に関連づけられた場合の用語「同等の」は、ハイブリダイゼーション条件および該当するハイブリダイゼーション条件が、相同性率（％）の同じ範囲を有する核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらすことを意味する。例えば、該当するハイブリダイゼーション条件が、第一の核酸配列と、第一の核酸配列への５０％〜７０％相同性を有する他の核酸配列と、のハイブリダイゼーションをもたらす場合、別のハイブリダイゼーション条件もまた、第一の核酸配列と、該第一の核酸配列への５０％〜７０％相同性を有する別の核酸配列と、のハイブリダイゼーションをもたらすのであれば、この別のハイブリダイゼーション条件は、該当するハイブリダイゼーション条件と均等であると言われる。
本明細書で用いられる用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対合を通して相補鎖と接合してハイブリダイゼーション複合体を形成する任意の工程を利用した、相補的核酸の対合に関連して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（即ち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の度合い、含まれる条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの因子による影響を受ける。
本明細書で用いられる用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧ塩基とＣ塩基の間、および相補的なＡ塩基とＴ塩基の間の水素結合の形成により２つの核酸配列の間に形成された複合体を指し、これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用によりさらに安定化され得る。該２つの相補的核酸配列は、逆平行の構成の水素結合である。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成され得るか（例えば、ＣｏｔまたはＲｏｔ解析）、または溶液中に存在する１つの核酸と、固体担体（例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ドットブロッティングで用いられるナイロン膜もしくはニトロセルロースフィルター、またはＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）などのインサイチュハイブリダイゼーションで用いられるガラススライド）に固定された別の核酸配列との間に形成され得る。
本明細書で用いられる用語「Ｔｍ」は、「融解温度」に関連して用いられる。該融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半分解離されて一本鎖になる温度である。核酸のＴｍを算出するための等式は、当該技術分野で周知である。標準参照に示される通り、核酸が１Ｍ ＮａＣｌの水溶液中に存在する場合、Ｔｍ値の簡単な推定は、等式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）により算出され得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１９８５参照）。他の参照には、Ｔｍの算出のために構造的および配列的特徴を考慮した、より洗練された計算が含まれる。
本明細書で用いられる用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼーションが実施される、温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在の条件に関連して用いられる。「ストリンジェンシー」は、典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブの融解温度の５℃下）からＴｍの約２０℃〜２５℃下までの範囲内で起こる。当業者に理解される通り、ストリンジェントハイブリダイゼーションは、同一ポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出するため、または類似もしくは関連のポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出するために用いられ得る。
第一のヌクレオチド配列を第二のヌクレオチド配列に結合させることに関連づけられた場合の用語「特異的結合」、「結合特異性」およびその文法的均等物は、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列の間の相互作用に比較した、第一のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列の間の優先的相互作用を指す。特異的結合は、結合の絶対的特異性を必要としない相対的用語であり、言い換えれば用語「特異的結合」は、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列の間の相互作用の非存在下で、第二のヌクレオチド配列が第一のヌクレオチド配列と相互作用することを必要としない。むしろ、第一のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列の間の相互作用のレベルが、第二のヌクレオチド配列と第三のヌクレオチド配列の間の相互作用よりも大きければ十分である。第一のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列の「特異的結合」はまた、第一のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列の間の相互作用が第一のヌクレオチド配列上の、または第一のヌクレオチド配列内の特定構造の存在に依存すること、言い換えれば第二のヌクレオチド配列が一般的に核酸またはヌクレオチドよりもむしろ第一のヌクレオチド配列上、または第一のヌクレオチド配列内の特異的構造を認識し、それに結合することを意味する。例えば第二のヌクレオチド配列が、第一のヌクレオチド配列上または第一のヌクレオチド配列内にある構造「Ａ」に特異的であれば、構造Ａを含む第三のヌクレオチド配列の存在が、第一のヌクレオチド配列に結合された第二のヌクレオチド配列の量を低減するであろう。
本明細書で用いられる用語「増幅可能な核酸」は、任意の増幅方法により増幅され得る核酸に関連して用いられる。「増幅可能な核酸」が通常、「試料テンプレート」を含むことが、企図される。
用語「異種性核酸配列」または「異種性ＤＮＡ」は、本質的にライゲートされない核酸配列、または本質的に異なる位置でライゲートされる核酸配列、にライゲートされるヌクレオチド配列を指すために互換的に用いられる。異種性ＤＮＡは、導入される細胞に内在性でなく、別の細胞から得られている。必ずではないが一般には、そのような異種性ＤＮＡは、発現される細胞により正常に生成されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種性ＤＮＡの例としては、レポータ遺伝子、転写および翻訳調節配列、選択マーカタンパク質（例えば、薬物耐性を付与するタンパク質）などが挙げられる。
「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの生成と定義され、一般には当該技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて実施される（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ Ｃ Ｗ ａｎｄ Ｇ Ｓ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５） ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）。本明細書で用いられる用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、クローニングまたは精製を行わずにゲノムＤＮＡ混合物中の標的配列のセグメント濃度を増加させるための方法を記載した、参照により本明細書に組み入れられるＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号の方法を指す。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、互いに対する２つのオリゴヌクレオチドプライマーの相対的位置により決定され、それゆえこの長さは、制御可能なパラメータである。該工程の反復する態様により、該方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）と称される。標的配列の所望の増幅されたセグメントは、混合物中の主な（濃度に関して）配列になるため、それらは、「ＰＣＲ増幅された」と言われる。
ＰＣＲを用いて、ゲノムＤＮＡ内の特異的な標的配列の単一コピーを、複数の異なる方法論（例えば、標識されたプローブでのハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの取り込みと、続くアビジン−酵素コンジュゲート検出；増幅されたセグメントへの、ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の取り込み）により検出可能なレベルまで増幅させることが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列は、プライマー分子の適当なセットで増幅され得る。特に、ＰＣＲ工程そのものにより作製された増幅セグメントは、それ自体が次のＰＣＲ増幅のための効率的なテンプレートになる。
特に商業的な適用のための、そのような好ましい方法の１つは、広く使用されているＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ技術に基づいており、対立遺伝子特異的ＰＣＲをブロッキング試薬と組み合わせて（ＡＳＢ−ＰＣＲ）野生型対立遺伝子の増幅を抑制する。ＡＳＢ−ＰＣＲは、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍標本など、任意のタイプの組織から抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかにおける生殖系または体細胞の突然変異の検出に用いられ得る。１０００倍またはより大きな、野生型対立遺伝子のバックグランドに対する単一の点置換、挿入、または欠失の感度の高い選択的検出を可能にする、試薬セットの設計ルールが開発されている（Ｍｏｒｌａｎ Ｊ，Ｂａｋｅｒ Ｊ，Ｓｉｎｉｃｒｏｐｉ Ｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ａ Ｓｉｍｐｌｅ，Ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４（２）：ｅ４５８４，２００９）。
用語「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」および「ＲＴ−ＰＣＲ」は、ｃＤＮＡ配列の混合物を作製し、次にクローニングまたは精製を行わずに混合物中の転写されたｃＤＮＡ配列の所望のセグメントの濃度を上昇させる、ＲＮＡ配列の逆転写のための方法を指す。典型的にはＲＮＡは、２種のプライマーを用いて転写ＤＮＡの所望のセグメントのＰＣＲ増幅前に単一プライマー（例えば、オリゴ−ｄＴプライマー）を用いて逆転写される。
本明細書で用いられる用語「プライマー」は、精製された制限消化物中と同様に天然由来であるか、または合成で生成されるかのいずれに関わらず、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に（即ち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの導入剤の存在下、ならびに適切な温度およびｐＨで）配置されると、合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。幾つかの実施形態において、該プライマーは、増幅における最大効率のために一本鎖であるが、あるいは二本鎖の場合もある。二本鎖であれば、該プライマーは、伸長産物を調製するために用いられる前に、最初は鎖を分離するために処置される。幾つかの実施形態において、該プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。該プライマーは、導入剤の存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分、長くなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度、プライマー源、および該方法の用途など、多くの因子に依存するであろう。
本明細書で用いられる用語「プローブ」は、精製された制限消化物中と同様に天然由来であるか、または合成、組換えもしくはＰＣＲ増幅により生成されるか、のいずれに関わらず、該当する別のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得る。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。本開示で用いられる任意のプローブが、任意の「レポータ分子」で標識され、それにより非限定的に酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、および酵素に基づく組織化学的アッセイ）、蛍光、放射性、および発光システムをはじめとする任意の検出システムで検出可能であることが企図される。本開示が任意の特定の検出システムまたは標識に限定されることは、意図していない。
本明細書で用いられる用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、それぞれが特異的ヌクレオチド配列、例えばＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインで、またはその付近で二本鎖または一本鎖ＤＮＡを切断する、または刻む、細菌酵素を指す（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６：１ １５６−６０により教示される通り、ＦｏｋＩが用いられ得る）。
本明細書で用いられる用語「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」は、遺伝子のコード配列を含む核酸配列、即ち遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。該コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ形態のいずれかで存在し得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、該オリゴヌクレオチドは、一本鎖（即ち、センス鎖）または二本鎖であり得る。加えて、「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」は、必要に応じて、適当な転写開始を可能にし、そして／または一次ＲＮＡ転写産物のプロセシングを修正するために、エンハンサ、プロモーター、スプライスジャンクション、ポリアデニル化シグナルなどの適切な制御エレメントを含み得る。さらに、本開示のコード領域は、内在性エンハンサ、スプライスジャンクション、介在配列、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。
真核生物内の転写制御シグナルは、「エンハンサ」エレメントを含む。エンハンサは、転写に関与する細胞内タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイからなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７，１９８７）。エンハンサエレメントは、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、ならびにウイルス中の遺伝子をはじめとする種々の真核生物供給源から単離された。特定のエンハンサの選択は、どの細胞型が該当するタンパク質を発現させるのに用いられるかに依存する。
発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在は多くの場合、組換え体転写産物のより高レベルの発現をもたらす。スプライシングシグナルは、一次ＲＮＡ転写産物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナーおよびアクセプタ部位からなる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１６．７−１６．８，１９８９）。一般的に用いられるスプライスドナーおよびアクセプタ部位は、ＳＶ４０の１６Ｓ ＲＮＡからのスプライスジャンクションである。
真核細胞中の組換えＤＮＡ配列の効率的発現は、得られた転写産物の効率的終結およびポリアデニル化を指導するシグナルの発現を必要とする。転写終結シグナルは一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出され、数百ヌクレオチド長である。本明細書で用いられる用語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、新生ＲＮＡ転写産物の終結およびポリアデニル化の両方を指導するＤＮＡ配列を表す。ポリＡテールが欠如した転写産物は、不安定で急速に分解するため、組換え体転写産物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクター中で用いられるポリＡシグナルは、「異種性」または「内在性」であり得る。内在性ポリＡシグナルは、天然にはゲノム内の所与の遺伝子のコード領域の３’末端で見出されるものである。異種性ポリＡシグナルは、１つの遺伝子から単離されて、別の遺伝子の３’に配置されるものである。
本明細書で用いられる用語「プロモーター」、「プロモータエレメント」または「プロモーター配列」は、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に配置されると（即ち、進行すると）、ｍＲＮＡへのオリゴヌクレオチド配列の転写を制御することが可能になるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、典型的にはオリゴヌクレオチド配列の５’側（即ち、上流）に位置し、ｍＲＮＡへの転写を制御し、ＲＮＡポリメラーゼによる特異的結合のため、そして転写開始のための部位を提供する。
核酸配列に関連づけられた場合の用語「プロモーター活性」は、ｍＲＮＡへのオリゴヌクレオチド配列の転写を開始する核酸配列の能力を指す。
プロモーターに適用される場合の用語「組織特異性の」は、異なる型の組織における同じオリゴヌクレオチドの発現の相対的非存在下で、特異的型の組織へのオリゴヌクレオチド配列の選択的発現を指導することが可能なプロモーターを指す。プロモーターの組織特異性は、例えばレポータ遺伝子をプロモーター配列に動作可能に連結させてレポータ構築物を作製すること、レポータ構築物を植物または動物のゲノムに導入してレポータ構築物を得られたトランスジェニック動物の各組織に組み込むこと、およびトランスジェニック植物または動物の異なる組織中のレポータ遺伝子の発現を検出すること（例えば、レポータ遺伝子によりコードされたｍＲＮＡ、タンパク質、またはタンパク質の活性を検出すること）、により評価され得る。選択性が、絶対的である必要はない。他の組織中のレポータ遺伝子の発現レベルに対して、１つまたは複数の組織でより大きなレベルのレポータ遺伝子発現が検出されれば、プロモーターがより大きなレベルの発現が検出された組織に特異的であることが示される。
プロモーターに適用される用語「細胞型特異性の」は、同じ組織内の異なる細胞型における同じオリゴヌクレオチド配列の発現の相対的非存在下で特異的な細胞型におけるオリゴヌクレオチド配列の選択的発現を指導することが可能なプロモーターを指す。プロモーターに適用される場合の用語「細胞型特異性の」はまた、単一組織内の領域においてオリゴヌクレオチドの選択的発現を促進することが可能なプロモーターを意味する。また選択性は、絶対的である必要ではない。プロモーターの細胞型特異性は、当業者に周知の方法、例えば本明細書に記載された免疫組織学的染色を利用して評定され得る。手短に述べると、組織切片をパラフィンに包埋し、パラフィン切片を、プロモーターにより発現が制御されるオリゴヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド生成物に特異的な一次抗体と反応させる。パラフィン切片法の別法として、試料を凍結切片にすることができる。例えば切片を切り出し前および切り出し中に凍結し、これにより残留するパラフィンによる潜在的干渉を回避することができる。一次抗体に特異的な標識された（例えば、ペルオキシダーゼでコンジュゲートされた）二次抗体を、切り出された組織に結合させることができ、顕微鏡検査により特異的結合が検出される（例えば、アビジン／ビオチンを用いる）。
用語「選択的発現」、「選択的に発現する」およびその文法的均等物は、該当する２つ以上の領域内での相対的発現レベルの比較を指す。例えば、組織に関連して用いられる場合の「選択的発現」は、それぞれ別の組織中の同じ遺伝子の発現レベル、および該同じ遺伝子を発現する細胞の数に比較して、特定の組織中の該当する遺伝子の実質的により大きな発現レベル、または該組織中で遺伝子を発現する実質的により多い細胞数を指す（即ち、選択的は、絶対的である必要はない）。選択的発現は、特定組織中の該当する遺伝子の発現および別の組織中の同じ遺伝子の発現の全体的な非存在を含む場合がある、必要とはしない。同様に、細胞型に関連して本明細書で用いられる「選択的発現」は、それぞれ別の組織中の同じ遺伝子の発現レベル、および該遺伝子を発現する細胞の数に比較して、特定の組織中の該当する遺伝子の実質的により大きな発現レベル、または該遺伝子を発現する実質的により多い細胞数を指す。
２つ以上のヌクレオチド配列に関連して用いられる場合の用語「連続した」は、１つまたは複数の制御エレメントを含まない介在配列の非存在下、または介在配列の存在下で、ヌクレオチド配列が縦列にライゲートされていることを意味する。
本明細書で用いられる用語「コードする核酸分子」、「コードするヌクレオチド」、「コードするＤＮＡ配列」および「コードするＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序が、ポリペプチド（タンパク質）チェーンに沿ったアミノ酸の順序を決定する。こうしてＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードする。
「単離されたオリゴヌクレオチド」と同様に、核酸に関連して用いられる場合の用語「単離された」は、通常は天然供給源に会合された少なくとも１つの混入した核酸から分離された核酸配列を指す。単離された核酸は、天然に見出されるものと異なる形態または状況で存在する核酸である。対照的に非単離核酸は、天然に存在する状態で見出されるＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸である。例えば所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接する遺伝子の付近の宿主細胞染色体上に見出され、特異的タンパク質をコードする特異的なｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は、複数のタンパク質をコードする数多くの他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中で見出される。しかし、該当するポリペプチドをコードする単離された核酸は、例として、核酸が天然細胞と異なる染色体内もしくは染色体外の位置にある、または他の方法で天然に見出されるものと異なる核酸配列に隣接されている、通常は該当するポリペプチドを発現する細胞中のそのような核酸を含む。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖形態で存在し得る。単離された核酸は、種々の技術（例えば、ハイブリダイゼーション、ドットブロッティングなど）により即座に同定され得る（所望なら）。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドが、タンパク質を発現するために用いられる場合、該オリゴヌクレオチドは、最小でもセンス鎖またはコード鎖を含む（即ち、該オリゴヌクレオチドは、一本鎖であり得る）。あるいはそれは、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み得る（即ち、該オリゴヌクレオチドは、二本鎖であり得る）。
本明細書で用いられる用語「精製された」または「精製する」は、試料から１種または複数の（望ましくない）成分の除去を指す。例えば、組換えポリペプチドが、細菌宿主細胞中で発現される場合、該ポリペプチドは、宿主細胞タンパク質の除去により精製され、それにより試料中の組換えポリペプチドの割合％を増加させる。
本明細書で用いられる用語「実質的に精製された」は、自然環境から除去され、単離または分離されて、天然で会合された他の成分を少なくとも６０％含まない、幾つかの実施形態において７５％含まない、他の実施形態において９０％含まない、核酸またはアミノ酸配列のいずれかの分子を指す。それゆえ「単離されたポリヌクレオチド」は、実質的に精製されたポリヌクレオチドである。
構造遺伝子を照会して用いられる場合の本明細書で用いられる用語「コード領域」は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果、新生ポリペプチド中で見出されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。該コード領域は、真核生物において、一般にはイニシエータのメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」により５’側に、そして終止コドンを特定する３種のトリプレット（即ち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）のうちの１つにより３’側に、結合されている。
「コード配列」は、ｍＲＮＡ、および／またはそのポリペプチドもしくはフラグメントを生成するように転写および／または翻訳され得る核酸もしくはその相補体の配列、またはその一部を意味する。コード配列は、ゲノムＤＮＡまたは未熟な一次ＲＮＡ転写産物中にエキソンを含み、それが細胞の生化学的機構により互いに接合されて、成熟ｍＲＮＡを提供する。アンチセンス鎖は、そのような各酸の相補体であり、該コード配列は、そこから推測され得る。
「非コード配列」は、インビボでアミノ酸に転写されない、またはｔＲＮＡがアミノ酸を配置するように相互作用しない、もしくは配置しようと試みない、核酸もしくはその相補体の配列、またはその一部を意味する。非コード配列は、ゲノムＤＮＡもしくは未熟な一次ＲＮＡ転写産物中のイントロン配列、およびプロモーター、エンハンサ、サイレンサなどの遺伝子関連配列の両方を含む。
本明細書で用いられる用語「構造遺伝子」または「構造ヌクレオチド配列」は、他の遺伝子の発現を制御しないＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を指す。対照的に「調節遺伝子」または「調節配列」は、他の遺伝子の発現を制御する生成物（例えば、転写因子）をコードする構造遺伝子である。
本明細書で用いられる用語「調節エレメント」は、核酸配列の発現の幾つかの態様を制御する遺伝子エレメントを指す。例えばプロモーターは、動作可能に連結されたコード領域の転写開始を容易にする調節エレメントである。他の調節エレメントとしては、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどが挙げられる。
本明細書で用いられる用語「ペプチド転写因子結合部位」または「転写因子結合部位」は、タンパク質転写因子に結合し、それにより核酸配列の発現の幾つかの態様を制御するヌクレオチド配列を指す。例えばＳｐ−１およびＡＰ１（活性化タンパク質１）結合部位が、ペプチド転写因子結合部位の例である。
本明細書で用いられる用語「遺伝子」は、構造遺伝子のコード領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」はまた、該遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、５’末端と３’末端の両方のコード領域に隣接した位置にある非翻訳配列を含み得る。コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’側または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列で中断されたコード領域を含む。イントロンは、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサなどの調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または一次転写産物から除去または「スプライスアウト」され、それゆえイントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を特定するように機能する。遺伝子は、一般に単一遺伝子座である。通常の二倍体の生物体において、遺伝子は、２つの対立遺伝子を有する。しかし四倍体のジャガイモでは、各遺伝子が、４つの対立遺伝子を有する。十二倍体であるサトウキビでは、遺伝子あたりに１２の対立遺伝子が存在し得る。詳細な例としては、それぞれが２つの対立遺伝子を有するＥＰＳＰＳ遺伝子座を２つ有するアマ、および２つの対立遺伝子を有する単一ホモマープラスチド型ＡＣＣａｓｅを有するイネが挙げられる。
遺伝子のゲノム形態はまた、イントロンを含むことに加えて、ＲＮＡ転写産物上に存在する配列の５’および３’末端の両方に位置する配列を含み得る。これらの配列は、「フランキング」配列または領域と称される（これらのフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写産物上に存在する非翻訳配列に対して５’側または３’側に位置する）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御する、または該転写に影響を及ぼすプロモーターおよびエンハンサなどの調節配列を含み得る。３’フランキング領域は、転写の終結、転写後切断およびポリアデニル化を指導する配列を含み得る。
「非ヒト動物」は、ヒトでない任意の動物を指し、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、トリなどの脊椎動物が挙げられる。好ましい非ヒト動物は、げっ歯目から選択される。「非ヒト動物」は、追加として、両生類（例えば、アフリカツメガエル）、爬虫類、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）および他の非哺乳動物種を指す。
本明細書で用いられる用語「トランスジェニック」は、別の生物体から得られて、植物または動物の体細胞および／または生殖系細胞のいずれかのゲノムに組み込まれるようになるＤＮＡを有する生物体または細胞を指す。「トランスジーン」は、見出される植物もしくは動物に対して部分的もしくは全体的に異種性である（即ち、天然には存在しない）ＤＮＡ配列、または内在性配列（即ち、天然の動物内に見出される配列）と相同性であり天然由来配列と異なる位置で植物もしくは動物ゲノムに挿入されるＤＮＡ配列を意味する。１つまたは複数のトランスジーンを含むトランスジェニック植物または動物は、この開示の範囲内である。加えて、本明細書で用いられる「トランスジェニック」は、本開示の方法により、相同組換えにより、ＴＦＯ突然変異により、または類似の工程により、修飾および／または「ノックアウト」された（非機能的にされた、または低レベルで機能するように作製された、即ち「ノックアウト」突然変異）１つまたは複数の遺伝子を有した生物体を指す。例えば幾つかの実施形態において、トランスジェニック生物体または細胞は、外来プロモーターおよび／またはコード領域を含む挿入ＤＮＡを含む。
「形質転換細胞」は、複数の継代で細胞培養により生育する能力、軟寒天中で生育する能力、および／または細胞間接触により細胞生育を阻害させない能力を獲得した細胞または細胞株である。これに関して、形質転換は、細胞または生物体への外来遺伝子材料の導入を指す。形質転換は、細胞への核酸の導入を成功させ、導入された核酸の発現をもたらす、公知の任意方法により遂行され得る。「形質転換」としては、トランスフェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクションおよびリポフェクション（リポソーム介在性遺伝子転位）のような方法が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換は、任意の発現ベクターの使用を通して遂行され得る。例えば、外来核酸を昆虫細胞に導入するためのバクロウイルスの使用が、企図される。用語「形質転換」はまた、全昆虫のＰ因子介在性生殖系形質転換（Ｐ−ｅｌｅｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などの方法を包含する。加えて、形質転換は、通常は遺伝子突然変異を通して、自然に形質転換された細胞を指す。
本明細書で用いられる「内在性」は、タンパク質をコードする遺伝子が細胞内で正常に発現されないことを意味する。加えて「外因性」は、その遺伝子の発現の正常（即ち、天然）レベルを上昇させる細胞内にトランスフェクトされた細胞を指す。
ペプチド配列およびヌクレオチド配列は、「内在性」または「異種性」（即ち、「外来性」）であり得る。用語「内在性」は、天然由来配列に対する幾つかの修飾を含まない限り、導入される細胞内で自然に見出される配列を指す。用語「異種性」は、導入される細胞にとって内在性でない配列を指す。例えば、異種性ＤＮＡは、天然ではライゲートされない核酸配列にライゲートされる、もしくはライゲートされるように操作されている、または天然では異なる位置でライゲートされる、ヌクレオチド配列を含む。異種性ＤＮＡはまた、導入される細胞に天然で見出され、天然由来配列に対して幾つかの修飾を含む、ヌクレオチド配列を含む。必ずではないが一般には、異種性ＤＮＡは、導入される細胞により正常に生成されない異種性ＲＮＡおよび異種性タンパク質をコードする。異種性ＤＮＡの例としては、レポータ遺伝子、転写および翻訳調節配列、選択マーカタンパク質（例えば、薬物耐性を付与するタンパク質）をコードするＤＮＡ配列が挙げられる。
構築物
本明細書に開示された核酸分子（例えば、部位特異性ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲのためのガイドＲＮＡ）は、組換え核酸構築物の生成に用いられ得る。一実施形態において、本開示の核酸分子は、核酸構築物、例えば該当する植物、微生物、または動物中の発現のための発現カセット、の調製に用いられ得る。この発現は、例えば該構築物が宿主ゲノムに組み込まれない場合、または組み込まれるならば宿主ゲノム内のプロモーターおよび構築物の位置により提示される制御下で維持される場合には、一過性であり得る。
発現カセットは、本明細書に開示された部位特異性ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡ配列に動作可能に連結された調節配列を含み得る。該カセットは、生物体に同時形質転換される少なくとも１種の追加の遺伝子をさらに含み得る。あるいは該追加の遺伝子（複数可）は、複数の発現カセット上で提供され得る。
核酸構築物は、調節領域の転写調節下にある部位特異性ヌクレアーゼコード配列の挿入のための複数の制御部位と共に提供され得る。該核酸構築物は、選択マーカ遺伝子をコードする核酸分子をさらに含み得る。
任意のプロモーターが、核酸構築物の生成に用いられ得る。該プロモーターは、本明細書に開示された植物、微小生物もしくは動物宿主核酸配列にとってネイティブもしくは類似の、または外来もしくは異種性であり得る。加えて該プロモーターは、天然の配列、あるいは合成配列であり得る。該プロモーターが、植物、微小生物、または動物宿主にとって「外来性」または「異種性」である場合、該プロモーターは、プロモーターが導入されるネイティブ植物、微小生物、または動物中に見出されないものとする。本明細書で用いられるキメラ遺伝子は、コード配列にとって異種性である転写開始領域に動作可能に連結されたコード配列を含む。
本明細書に開示された部位特異性ヌクレアーゼ配列は、異種性プロモーターを用いて発現され得る。
植物、微小生物または動物における発現のための構成的プロモーター、組織好適性（ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｅｆｆｅｒｅｄ）プロモーター、誘導性プロモーターまたは他のプロモーターを提供するプロモーターなど、任意のプロモーターが、部位特異性ヌクレアーゼ配列の発現を制御するための構築物の調製に用いられ得る。構成的プロモーターとしては、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモータ、ならびにＷＯ９９／４３８３８および米国特許第６，０７２，０５０号に開示された他の構成的プロモーター；コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；１９８５）；イネのアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１，１９９０）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２，１９８９およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９，１９９２）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８，１９９１）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７２３−２７３０，１９８４）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などが挙げられる。他の構成的プロモーターとしては、例えば米国特許第５，６０８，１４９号；同第５，６０８，１４４号；同第５，６０４，１２１号；同第５，５６９，５９７号；同第５，４６６，７８５号；同第５，３９９，６８０号；同第５，２６８，４６３号；同第５，６０８，１４２号；および同第６，１７７，６１１号が挙げられる。
組織好適性プロモーターは、特定の植物組織中の部位特異性ヌクレアーゼ発現を指導するために用いられ得る。そのような組織好適性プロモーターとしては、葉好適性プロモーター、根好適性プロモーター、種子好適性プロモーター、および茎好適性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。組織好適性プロモーターは、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２（２）：２５５−２６５，１９９７；Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３，１９９７；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３，１９９７；Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８，１９９７；Ｒｉｎｅｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１ １２（３）：１３３１−１３４１，１９９６；Ｖａｎ Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１ １２（２）：５２５−５３５，１９９６；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４，１９９６；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８，１９９４；Ｌａｍ，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６，１９９４；Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８，１９９３；Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（２０）：９５８６−９５９０，１９９３；およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（３）：４９５−５０５，１９９３を包含する。
核酸構築物は、転写終結領域も含み得る。転写終結領域が、用いられる場合、任意の終結領域が、核酸構築物の調製に用いられ得る。例えば該終結領域は、別の供給源（即ち、プロモーターにとって外来性または異種性）に由来し得る。本開示の構築物中での使用のために利用可能な終結領域の例としては、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域などのＡ．ツメファシエンスのＴｉプラスミド由来のものが挙げられる。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４，１９９１；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｃｅｌｌ ６４：６７１−６７４，１９９１；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１−１４９，１９９１；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１−１２７２，１９９０；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ９１：１５１−１５８，１９９０；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３，１９８９；およびＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９，１９８７も参照されたい。
本明細書に開示された態様、実施形態、方法および／または組成物のいずれかと合わせて、該核酸を、形質転換植物中の発現増加のために最適化されることができる。即ち、部位特異性ヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸は、改善された発現のための植物好適性コドンを用いて合成され得る。例えば、宿主好適性コドン使用の議論に関するＣａｍｐｂｅｌｌおよびＧｏｗｒｉ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１，１９９０）を参照されたい。植物好適性遺伝子を合成するための方法は、当該技術分野で入手可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号および同第５，４３６，３９１号、ならびにＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８，１９８９を参照されたい。同じく、例えばＬａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：３３−４３，２０１４；Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５９：９４−１０２，２００８；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３４６−３５３，２００４を参照されたい。
加えて、他の配列修飾が、本明細書に開示された核酸配列に施され得る。例えば、細胞宿主中の遺伝子発現を増強するためのさらなる配列修飾は、公知である。これらには、疑似ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エキソン／イントロン・スプライス部位シグナル、トランスポゾン様リピート、および遺伝子発現に有害になり得る他のそのような特徴のはっきりした配列の排除がある。該配列のＧ−Ｃ量を、宿主細胞中で発現される既知の遺伝子を参照することにより算出される標的細胞宿主の平均レベルに適合させることもできる。加えて該配列は、予測されたヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避するように修飾することができる。
他の核酸配列もまた、例えば部位特異性ヌクレアーゼコード配列の発現を増強するために、本開示の構築物の調製に用いられ得る。そのような核酸配列としては、トウモロコシＡｄｈＩのイントロンであるイントロン１遺伝子（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １：１１８３−１２００，１９８７）ならびにタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トウモロコシ退緑斑紋ウイルスおよびアルファルファモザイクウイルス由来のリーダー配列（Ｗ配列）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：８６９３−８７１１，１９８７；およびＳｋｕｚｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６５−７９，１９９０）が挙げられる。トウモロコシのシュランケン１遺伝子座由来の第一のイントロンが、キメラ遺伝子構築物中の遺伝子の発現を増加させることが示された。米国特許第５，４２４，４１２号および同第５，５９３，８７４号には、遺伝子発現構築物中の特異的イントロンの使用が開示されており、Ｇａｌｌｉｅら（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：９２９−９３９，１９９４）はまた、イントロンが組織特異性の基板で遺伝子発現を調節するのに有用であることを示した。部位特異性ヌクレアーゼ遺伝子発現をさらに増強または最適化するために、本明細書に開示された植物発現ベクターはまた、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）を含有するＤＮＡ配列を含み得る。そのため、そのような修飾された発現系で形質転換された植物細胞は、本開示のヌクレオチド配列の過剰発現または構成的発現を示し得る。
本明細書に開示された発現構築物はまた、原核生物および真核生物の両方でクロロプラストまたは他のオルガネラおよび構造に部位特異性ヌクレアーゼ配列の発現を指導することが可能な核酸配列を含み得る。そのような核酸配列は、植物細胞クロロプラストに該当する遺伝子産物を指向するクロロプラストトランジットペプチドをコードするクロロプラスト標的配列を含む。そのようなトランジットペプチドは、当該技術分野で公知である。クロロプラスト標的配列に関して、「動作可能に連結された」は、トランジットペプチドをコードする核酸配列（即ち、クロロプラスト標的配列）が、本明細書に開示された部位特異性ヌクレアーゼ核酸分子に連結されることで、２つの配列が連続し、同じリーディングフレーム内になることを意味している。例えば、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６，１９９１；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０，１９８９；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８，１９８７；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１，１９９３；およびＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１，１９８６を参照されたい。
クロロプラスト標的配列は、当該技術分野で公知であり、リブロース−１，５−ビスホスホン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）（ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ Ｓｉｌｖａ Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：７６９−７８０，１９９６；Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（５）：３３３５−３３４２，１９９１）；５−（エノールピルビル）シキマート−３−リン酸塩シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）（Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２２（６）：７８９−８１０，１９９０）；トリプトファンシンターゼ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１１）：６０８１−６０８７，１９９５）；プラストシアニン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３）：２０３５７−２０３６３，１９９７）；コリスミ酸シンターゼ（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２７４４７−２７４５７，１９９３）；および集光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＬＨＢＰ）（Ｌａｍｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４９９６−１４９９９，１９８８）のクロロプラスト小サブユニット挙げられる。同じく、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６，１９９１；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０，１９８９；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８，１９８７；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１，１９９３；およびＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１，１９８６を参照されたい。
本明細書に開示された態様、実施形態、方法および／または組成物のいずれかと合わせて、核酸構築物を、植物細胞クロロプラストからの突然変異体部位特異性ヌクレアーゼコード領域の発現を指導するように調製することができる。クロロプラストの形質転換のための方法は、当該技術分野で公知である。例えばＳｖａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０，１９９０；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７，１９９３；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６０１−６０６，１９９３を参照されたい。該方法は、選択マーカを含むＤＮＡの粒子銃送達、および相同組換えを通したプラスミドゲノムへのＤＮＡの標的化に依存する。加えて、プラスミド形質転換は、核コード化およびプラスミド指向性ＲＮＡポリメラーゼの組織好適性発現によるサイレント型プラスチド担持トランスジーン（ｓｉｌｅｎｔ ｐｌａｓｔｉｄ−ｂｏｒｎｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）のトランス活性化により遂行され得る。そのような系は、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１−７３０５，１９９４に報告されている。
クロロプラストを標的とする該当する核酸は、植物の核およびこのオルガネラの間のコドン使用における差異の原因であるクロロプラスト中での発現のために最適化され得る。この手法では、該当する核酸は、クロロプラスト好適性コドンを利用して合成され得る。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，３８０，８３１号を参照されたい。
該核酸構築物は、植物細胞を形質転換して、部位特異性ヌクレアーゼコード配列を含むトランスジェニック植物を再生させるために用いることができる。数多くの植物形質転換ベクター、および植物を形質転換させるための方法が、利用可能である。例えば米国特許第６，７５３，４５８号、Ａｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８１：３０１−３０５，１９８６；Ｆｒｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．６：３２１−３２５，１９８７；Ｂｌｏｃｋ，Ｍ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．７６：７６７−７７４，１９８８；Ｈｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｄｌｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｍｐ．２０３２１２．２０３−２１２，１９９０；Ｃｏｕｓｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８：４８１−４９４，１９９１；Ｃｈｅｅ，Ｐ．Ｐ．ａｎｄ Ｓｌｉｇｈｔｏｍ，Ｊ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ．１１８：２５５−２６０，１９９２；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９−２４６，１９９２；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：３０９−３ １４，１９９２；Ｄｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：８１−８８，１９９２；Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１２１２−１１２１６，１９９３；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ ２９Ｐ：１ １９−１２４，１９９３；Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２：１８０−１８３，１９９３；Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｍｃ Ｈｕｇｈｅｎ，Ａ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９１：１３９−１４８，１９９３；Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｃ．Ｉ．ａｎｄ Ｔｒｉｅｕ，Ｔ．Ｎ．，Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１６７，１９９３；Ｇｏｌｏｖｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９０：４１−５２，１９９３；Ｇｕｏ Ｃｈｉｎ Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．３８：２０７２−２０７８；Ａｓａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３，１９９４；Ａｙｅｒｅｓ Ｎ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｄ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｓｃｉ．１３：２１９−２３９，１９９４；Ｂａｒｃｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：５８３−５９２，１９９４；Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：２９９−３０７，１９９４；Ｂｏｒｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ．１６：２２５− ２３０，１９９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．，Ａｇｒｏ．Ｆｏｏｄ．Ｉｎｄ．Ｈｉ Ｔｅｃｈ．５：１７−２７，１９９４；Ｅａｐｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３：５８２−５８６，１９９４；Ｈａｒｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：９１９９２３，１９９４；Ｒｉｔａｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３１７−３２５，１９９４；およびＷａｎ，Ｙ．Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｍａｕｘ，Ｐ．Ｇ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７４８，１９９４を参照されたい。該構築物はまた、相同組換えを用いて植物細胞中に形質転換され得る。
ペプチド配列およびヌクレオチド配列に関連づけられた場合の用語「野生型」は、天然由来の供給源から単離された場合にペプチド配列およびヌクレオチド配列の特徴を有する、それぞれペプチド配列およびヌクレオチド配列（遺伝子座／遺伝子／対立遺伝子）を指す。野生型ペプチド配列およびヌクレオチド配列は、集団で最も頻繁に観察されるものであり、したがってそれぞれペプチド配列およびヌクレオチド配列の「正常な」または「野生型の」形態と恣意的に称される。「野生型」はまた、特定のヌクレオチド位置もしくは位置（複数）の配列、または特定のコドン位置もしくは位置（複数）の配列、または特定のアミノ酸位置もしくは位置（複数）の配列を指し得る。
「コンセンサス配列」は、配列の少なくとも２５％について同一のアミノ酸もしくはヌクレオチド、または機能的に同等なアミノ酸もしくはヌクレオチドを含むアミノ酸またはヌクレオチドの配列と定義される。同一または機能的に同等なアミノ酸またはヌクレオチドは、連続である必要はない。
本明細書で用いられる用語「アブラナ」は、アブラナ属の植物を指す。例示的なアブラナの種としては、Ｂ．カリナタ、Ｂ．エロンゲータ（Ｂ．ｅｌｏｎｇａｔｅ）、Ｂ．フルチキュロサ（Ｂ．ｆｒｕｔｉｃｕｌｏｓａ）、Ｂ．ジュンセア、Ｂ．ナプス、Ｂ．ナリノサ、Ｂ．ニグラ、Ｂ．オレラセア、Ｂ．ペルビリディス、Ｂ．ラパ（シンＢ．カンペストリス）、Ｂ．ルペストリス、Ｂ．セプチセプス、およびＢ．トルネフォルチイが挙げられるが、これらに限定されない。
ヌクレオベースは、塩基であり、特定の好ましい実施形態においてはプリン、ピリミジン、またはその誘導体もしくは類似体である。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル部分、例えば場合により置換されたリボシドまたは２’−デオキシリボシドを含むヌクレオベースである。ヌクレオシドは、複数の連結部分の１つにより連結され得、リンを含む場合、または含まない場合がある。非置換ホスホジエステル結合により連結されたヌクレオシドは、ヌクレオチドと称される。本明細書で用いられる用語「ヌクレオベース」は、ペプチド核酸のサブユニットであるペプチドヌクレオベース、およびモルホリンヌクレオベースに加え、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含する。
オリゴヌクレオベースは、ヌクレオベースを含むポリマーであり、幾つかの実施形態において、その少なくとも一部は、相補的配列を有するＤＮＡへのワトソン・クリック塩基対合によりハイブリダイズし得る。オリゴヌクレオベースチェーンは、ポリマーの最終的なヌクレオベースである単一５’および３’末端を有し得る。特定のオリゴヌクレオベースチェーンは、全ての型のヌクレオベースを含有し得る。オリゴヌクレオベース化合物は、相補的でワトソン・クリック塩基対合によりハイブリダイズされ得る、１つまたは複数のオリゴヌクレオベースチェーンを含む化合物である。リボタイプヌクレオベースは、２’炭素がヒドロキシル、アルキルオキシ、またはハロゲンで置換されたメチレンである、ヌクレオベースを含むペントースフラノシルを含む。デオキシリボタイプヌクレオベースは、リボタイプヌクレオベース以外のヌクレオベースであり、ペントースフラノシル部分を含まない全てのヌクレオベースを包含する。
特定の実施形態において、オリゴヌクレオベース鎖は、オリゴヌクレオベースチェーンと、オリゴヌクレオベースチェーンのセグメントまたは領域と、の両方を包含し得る。オリゴヌクレオベース鎖は、３’末端および５’末端を含み得、オリゴヌクレオベース鎖が、チェーンと共に伸長する場合、該鎖の３’および５’末端は、該チェーンの３’および５’末端でもある。
本明細書で用いられる用語「コドン」は、タンパク質合成の際のポリペプチドチェーンにおける特異的アミノ酸の挿入、またはタンパク質合成を停止するシグナルを決定する遺伝子コードを構成する３つの隣接するヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）の配列を指す。用語「コドン」はまた、元のＤＮＡが転写されるメッセンジャーＲＮＡにおける３つのヌクレオチドの対応する（そして相補的な）配列を指すために用いられる。
本明細書で用いられる用語「相同性」は、タンパク質およびＤＮＡの間の配列類似性を指す。用語「相同性」または「相同的な」は、同一性の度合いを指す。部分的な相同性または完全な相同性が存在し得る。部分的に相同的な配列は、別の配列と比較して１００％未満の配列同一性を有するものである。
「ヘテロ接合性の」は、相同性染色体セグメント中の１つまたは複数の遺伝子座に異なる対立遺伝子を有することを指す。本明細書で用いられる「ヘテロ接合性の」はまた、１つまたは複数の遺伝子座で異なる対立遺伝子が検出され得る試料、細胞、細胞集団または生物体を指し得る。ヘテロ接合性の試料は、例えば核酸シークエンシングなど、当該技術分野で公知の方法を介して決定することもできる。例えばシークエンシング電気泳動図が、単一遺伝子座で２つのピークを示し、両方のピークが、概ね同じサイズである場合、試料は、ヘテロ接合性と特徴づけられ得る。または１つのピークが、他方よりも小さいが、大きなピークのサイズの少なくとも約２５％である場合、試料は、ヘテロ接合性と特徴づけられ得る。幾つかの実施形態において、小さなピークが、大きなピークの少なくとも約１５％である。別の実施形態において、小さなピークが、大きなピークの少なくとも約１０％である。別の実施形態において、小さなピークが、大きなピークの少なくとも約５％である。別の実施形態において、小さなピークの最小限の量が、検出される。
本明細書で用いられる「ホモ接合性の」は、相同性染色体セグメント中の１つまたは複数の遺伝子座で同一の対立遺伝子を有することを指す。「ホモ接合性の」はまた、１つまたは複数の遺伝子座で同じ対立遺伝子が検出され得る試料、細胞、細胞集団または生物体を指し得る。ホモ接合性の試料は、例えば核酸シークエンシングなど、当該技術分野で公知の方法を介して決定することができる。例えばシークエンシング電気泳動図が、特定の遺伝子座で単一ピークを示す場合、その試料は、その遺伝子座に関して「ホモ接合性」と称され得る。
用語「ヘミ接合性の」は、第二の対立遺伝子が検出されるため、または相同性染色体セグメント上に存在しないため、細胞または生物体の遺伝子型に１回だけ存在する遺伝子または遺伝子セグメントを指す。本明細書で用いられる「ヘミ接合性の」は、１つまたは複数の遺伝子座の対立遺伝子が、遺伝子型で１回だけ検出され得る、試料、細胞、細胞集団、または生物体を指すこともできる。
本明細書で用いられる用語「接合状態」は、当該技術分野で公知の、そして本明細書に記載されたテスト方法ことにより決定される、ヘテロ接合性、ホモ接合性またはヘミ接合性と考えられる試料、細胞集団、または生物体を指す。用語「核酸の接合状態」は、核酸の供給源がヘテロ接合性、ホモ接合性またはヘミ接合性と考えられるか否かを決定することを意味する。「接合状態」は、配列内の単一ヌクレオチド位置の差異を指し得る。幾つかの方法において、単一突然変異に関する試料の接合状態は、ホモ接合性野生型、ヘテロ接合性（即ち、１つの野生型対立遺伝子および１つの突然変異体対立遺伝子）、ホモ接合性突然変異体、またはヘミ接合性（即ち、野生型または突然変異体対立遺伝子の単一コピー）と分類され得る。
本明細書で用いられる用語「ＲＴＤＳ」は、Ｃｉｂｕｓにより開発されたＴｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｉｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＲＴＤＳ）を指す。ＲＴＤＳは、外来遺伝子または制御配列の取り込みを行わずに遺伝子配列の精密な変化を作製するのに効果的である部位特異的な遺伝子修飾システムである。
本明細書で用いられる用語「約」は、量的用語プラスまたはマイナス１０％を意味する。例えば「約３％」は、２．７〜３．３％を包含し、「約１０％」は、９〜１１％を包含する。その上、「約」が、本明細書において量的用語と共に用いられている場合、その値プラスまたはマイナス１０％に加えて、量的用語の厳密な値が企図および記載されることが、理解されなければならない。例えば用語「約３％」は、厳密に３％を明白に企図、記載および包含する。
ＲＴＤＳおよび修復オリゴヌクレオチド（ＧＲＯＮ）
本開示は一般に、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列中の特異的位置に修飾を標的化させることの効率を改善する新規な方法に関する。加えて本開示は、本明細書に開示されたアプローチにより修飾、突然変異または標識された標的ＤＮＡに関する。本開示は、開示の方法により修飾された細胞、組織、および生物体にも関する。本開示は、一部が有効な変換システム：Ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｉｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＤＳ（商標）、Ｃｉｂｕｓ ＵＳ ＬＬＣ）に関係する組成物および方法の開発に基づいている。
ＲＴＤＳは、遺伝子配列をインサイチュで特異的に修飾し、外来ＤＮＡおよび遺伝子発現制御配列を挿入しない、細胞自身の遺伝子修復システムを利用することにより標的遺伝子を改変することに基づく。この手順は、遺伝子配列の精密な変化を実行するが、ゲノムの残りは、不変のままである。従来のトランジェニックＧＭＯとは対照的に、外来遺伝子材料の組み込みはなく、植物中に残留する任意の外来遺伝子材料もない。ＲＴＤＳにより導入された遺伝子配列の変化は、無作為に挿入されない。影響を受けた遺伝子が、ネイティブの位置に残っているため、発現の無作為な、非制御な、または有害なパターンが起こらない。
この変化を実行するＲＴＤＳは、ＤＮＡおよび修飾ＲＮＡ塩基の両方、ならびに他の化学的部分で構成され得、標的遺伝子位置でハイブリダイズしてミスマッチ塩基対（複数可）を作製するように設計されている、本明細書に記載された化学合成オリゴヌクレオチド（ＧＲＯＮ）である。このミスマッチ塩基対は、細胞自身の天然遺伝子修復システムをその部位に引き付けて、遺伝子内の指定されたヌクレオチド（複数可）を修正（交換、挿入または欠失）するためのシグナルとして作用する。修正工程が完了したら、ＲＴＤＳ分子が分解され、たった今修飾された、または修復された遺伝子が、遺伝子の正常な内在性制御機構の下で発現される。
本明細書に開示された方法および組成物は、本明細書および以下に詳細に記載されるコンフォメーションおよび化学的性質を有する「遺伝子修復オリゴヌクレオベース」（ＧＲＯＮ）で実行または作製され得る。本明細書で企図される「遺伝子修復オリゴヌクレオベース」はまた、「組換え誘導性オリゴヌクレオベース」、「ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド」、「キメラオリゴヌクレオチド」、「混合型デュプレックスオリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）」、「ＲＮＡ ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＤＯ）」、「遺伝子標的オリゴヌクレオチド」、「ジェノプラスト（ｇｅｎｏｐｌａｓｔ）」、「一本鎖修飾オリゴヌクレオチド」、「一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド突然変異ベクター」（ＳＳＯＭＶ）、「デュプレックス突然変異ベクター」および「ヘテロデュプレックス突然変異ベクター」などの他の名称を用いて、発表された科学文献および特許文献中に記載される。該遺伝子修復オリゴヌクレオベースは、非限定的にマイクロキャリア（バイオリスティック送達）、マイクロファイバー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在性の取り込み、電気穿孔、およびマイクロインジェクションをはじめとする、当該技術分野で一般に用いられる任意の方法を用いて植物細胞に導入され得る。
一実施形態において、該遺伝子修復オリゴヌクレオベースは、混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドであり、該混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドのうちのＲＮＡタイプのヌクレオチドは、２’−ヒドロキシルをフルオロ、クロロもしくはブロモ官能基で置き換えること、または２’−Ｏに置換基を置くことにより、ＲＮａｓｅ耐性にされる。適切な置換としては、Ｋｍｉｅｃ ＩＩにより教示される置換基が挙げられる。別の置換としては、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，３３４，７１１号（Ｓｐｒｏａｔ）により教示される置換基、および特許公報ＥＰ６２９３８７およびＥＰ６７９６５７（集合的にＭａｒｔｉｎ出願）により教示される置換基を含む。本明細書で用いられる、リボヌクレオチドの２−フルオロ、クロロもしくはブロモ誘導体、またはＭａｒｔｉｎ出願もしくはＳｐｒｏａｔに記載される置換基で置換されたＴ−ＯＨを有するリボヌクレオチドは、「Ｔ−置換リボヌクレオチド」と称される。本明細書で用いられる用語「ＲＮＡタイプヌクレオチド」は、非置換のホスホジエステル結合またはＫｍｉｅｃ ＩもしくはＫｍｉｅｃ ＩＩにより教示される非天然の結合のいずれかによって、混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドに連結されたＴ−ヒドロキシルまたは２’−置換ヌクレオチドを意味する。本明細書で用いられる用語「デオキシリボタイプのヌクレオチド」は、非置換のホスホジエステル結合またはＫｍｉｅｃ ＩもしくはＫｍｉｅｃ ＩＩにより教示される非天然の結合のいずれかによって、遺伝子修復オリゴヌクレオベースの他のヌクレオチドに連結され得るＴ−Ｈを有するヌクレオチドを意味する。
本開示の特定の実施形態において、該遺伝子修復オリゴヌクレオベースは、非置換ホスホジエステル結合のみにより連結された混合型デュプレックスオリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）である。別の実施形態において、その結合は、Ｋｍｉｅｃ ＩＩにより教示された通り、置換されたホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体および非リンベースの結合によるものである。さらに別の実施形態において、混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドにおける各ＲＮＡタイプのヌクレオチドは、２’−置換ヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドの詳細な好ましい実施形態は、２’−フルオロ、Ｔ−メトキシ、２’−プロピルオキシ、２’−アリルオキシ、２’−ヒドロキシルエチルオキシ、２’−メトキシエチルオキシ、Ｔ−フルオロプロピルオキシおよび２’−トリフルオロプロピルオキシで置換されたリボヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドのより好ましい実施形態は、２’−フルオロ、２’−メトキシ、２’−メトキシエチルオキシ、および２’−アリルオキシ置換ヌクレオチドである。別の実施形態において、該混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドは、非置換ホスホジエステル結合により連結される。
唯一の単一タイプの２’−置換ＲＮＡタイプのヌクレオチドを有する混合型デュプレックスオリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）は、より簡便に合成されるが、本発明の方法は、２つ以上のタイプのＲＮＡタイプヌクレオチドを有する混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドを用いて実践され得る。ＲＮＡセグメントの機能は、２つのＲＮＡタイプのトリヌクレオチドの間にデオキシヌクレオチドを導入することにより生じる中断によっては影響を受けない場合があり、したがって用語ＲＮＡセグメントは、「中断されたＲＮＡセグメント」などの用語を包含する。中断されていないＲＮＡセグメントは、連続したＲＮＡセグメントと称される。別の実施形態においては、ＲＮＡセグメントは、交互に並んだＲＮａｓｅ耐性ヌクレオチドと非置換２’−ＯＨヌクレオチドを含み得る。混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドは、幾つかの実施形態において１００未満のヌクレオチド、別の実施形態において８５未満のヌクレオチドであるが５０を超えるヌクレオチドを有する。第一および第二の鎖は、ワトソン・クリック塩基対合される。一実施形態において、混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドの鎖は、第一および第二の鎖が、１つの３’および１つの５’末端を有する１つのオリゴヌクレオチドチェーンのセグメントになるように、一本鎖のヘキサ、ペンタ、またはテトラヌクレオチドなどのリンカーにより共有結合される。３’および５’末端は「ヘアピンキャップ」の付加により保護され得、それにより３’および５’末端ヌクレオチドが隣接するヌクレオチドとワトソン・クリック対合される。第一および第二の鎖の間のワトソン・クリック対合が、安定されるように、第二のヘアピンキャップがさらに、３’および５’末端から離れた第一の鎖と第二の鎖の間の接合部に配置され得る。
第一および第二の鎖は、標的遺伝子／対立遺伝子の２つのフラグメントと相同的な、即ち標的遺伝子／対立遺伝子と同じ配列を有する、２つの領域を含む。相同的領域は、ＲＮＡセグメントのヌクレオチドを含み、連結するＤＮＡセグメントの１つまたは複数のＤＮＡタイプのヌクレオチドを含み得、介在するＤＮＡセグメントの内部にないＤＮＡタイプのヌクレオチドを含み得る。相同性を有する２つの領域は、標的遺伝子の配列と異なる配列を有する「非相同性領域」と称される領域により分離され、その領域に該２つの領域それぞれが隣接する。非相同性領域は、１、２または３個のミスマッチヌクレオチドを含み得る。ミスマッチヌクレオチドは、連続的であり得、あるいは標的遺伝子／対立遺伝子と相同的な１つまたは２つのヌクレオチドにより分離され得る。あるいは非相同性領域はまた、挿入、または１、２、３もしくは５つもしくはより少ないヌクレオチドを含み得る。あるいは混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドの配列は、混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドからの１、２、３もしくは５個もしくはより少ないヌクレオチドの欠失によって、標的遺伝子／対立遺伝子と異なり得る。この場合、非相同性領域の長さおよび位置は、非相同性領域内に混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドが存在しない場合であっても、欠失の長さであると考えられる。置換または複数の置換が意図される場合に、２つの相同性領域に相補的な標的遺伝子のフラグメントの間の距離は、非相補的領域と同一である。非相同性領域が、挿入を含む場合、相同性領域は、それにより混合型デュプレックスオリゴヌクレオチド中で、前記遺伝子／対立遺伝子中の相補的な相同性フラグメントよりもさらに遠くに分離され、非相同性領域が欠失をコードする場合には、逆のことがあてはまり得る。
混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドのＲＮＡセグメントは、それぞれが相同性領域、即ち、標的遺伝子のフラグメントと配列が同一である領域の一部であり、幾つかの実施形態においてそれらのセグメントは、共に少なくとも１３個のＲＮＡタイプのヌクレオチド、幾つかの実施形態において１６〜２５個のＲＮＡタイプのヌクレオチド、またはさらに別の実施形態において１８〜２２個のＲＮＡタイプのヌクレオチド、または幾つかの実施形態において２０個のヌクレオチドを含む。一実施形態において、相同性領域のＲＮＡセグメントは、介在するＤＮＡセグメントにより分離され、そして隣接される、即ち「連結される」。一実施形態において、非相同性領域の各ヌクレオチドは、介在するＤＮＡセグメントのヌクレオチドである。混合型デュプレックスオリゴヌクレオチドの非相同性領域を含む介在するＤＮＡセグメントは、「突然変異誘発セグメント」と称される。
本開示の別の実施形態において、遺伝子修復オリゴヌクレオベース（ＧＲＯＮ）は、全体として参照により組み入れられる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７、米国特許第６，２７１，３６０号、同第６，４７９，２９２号、および同第７，０６０，５００号中に開示される通り、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド突然変異ベクター（ＳＳＯＭＶ）である。ＳＳＯＭＶの配列は、米国特許第５，７５６，３２５号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，０１２号、同第５，８８８，９８３号、同第５，７９５，９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第６，００４，８０４号、および同第６，０１０，９０７号ならびに国際出願ＷＯ９８／４９３５０、ＷＯ９９／０７８６５、ＷＯ９９／５８７２３、ＷＯ９９／５８７０２、およびＷＯ９９／４０７８９中に記載される突然変異ベクターと同様の原理に基づく。ＳＳＯＭＶの配列は、突然変異誘発領域と称される所望の遺伝子改変を含む領域により分離された標的配列と相同的な２つの領域を含む。突然変異誘発領域は、標的配列中の相同性領域を分離する配列と同じ長さであるが、異なる配列を有する配列を有し得る。そのような突然変異誘発領域は、置換をもたらし得る。あるいは、ＳＳＯＭＶ中の相同性領域は、互いに連続し得るが、同じ配列を有する標的遺伝子中の領域は、１、２、またはより多いヌクレオチドにより分離されている。そのようなＳＳＯＭＶは、ＳＳＯＭＶに存在しないヌクレオチドの標的遺伝子からの欠失をもたらす。最後に、相同性領域と同一の標的遺伝子の配列は、標的遺伝子中で隣接し得るが、ＳＳＯＭＶの配列中では１、２、またはより多くのヌクレオチドにより分離され得る。そのようなＳＳＯＭＶは、標的遺伝子の配列において挿入をもたらす。特定の実施形態において、ＳＳＯＭＶは、それ自身にアニーリングしない。
ＳＳＯＭＶのヌクレオチドは、３’末端および／または５’末端のヌクレオチド間結合、あるいは２つの３’末端および／または５’末端のヌクレオチド間結合が、ホスホロチオアートまたはホスホアミダートであり得る場合を除き、非修飾ホスホジエステル結合により連結されたデオキシリボヌクレオチドである。本明細書で用いられるヌクレオチド間結合は、ＳＳＯＭＶのヌクレオチド間の結合であり、３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドとブロック置換の間の結合を含まない。特定の実施形態において、ＳＳＯＭＶの長さは、２１〜５５の間のデオキシヌクレオチドであり、相同性領域の長さは、それに応じて全長で少なくとも２０デオキシヌクレオチドであり、少なくとも２つの相同性領域は、それぞれ少なくとも８デオキシヌクレオチドの長さを有さなければならない。
ＳＳＯＭＶは、標的遺伝子のコード鎖または非コード鎖のいずれかに相補的であるよう設計することができる。所望の変異が、単独塩基の置換である場合、突然変異誘発ヌクレオチドおよび標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが、好ましい。所望の機能的結果の実現に合致する程度に、相補鎖において突然変異誘発ヌクレオチドおよび標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが、好ましい。特に好ましいのは、転換突然変異をコードするＳＳＯＭＶであり、即ち、ＣまたはＴ突然変異誘発ヌクレオチドが、それぞれ相補鎖におけるＣまたはＴヌクレオチドとミスマッチしている。
岡崎フラグメント／２’−ＯＭＥ ＧＲＯＮの設計。様々な実施形態において、ＧＲＯＮは、ＲＮＡとＤＮＡの両方のヌクレオチドならびに／または他の型のヌクレオベースを有し得る。幾つかの実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドのうちの１つまたは複数が、修飾を含む。特定の実施形態において、最初の５’ヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチドであり、残りのヌクレオチドは、ＤＮＡである。さらなる実施形態において、最初の５’ＲＮＡヌクレオチドは、２−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。他の実施形態において、最初の２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはより多くの５’ヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチドであり、残りのヌクレオチドは、ＤＮＡである。さらなる実施形態において、最初の２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはより多くの５’ＲＮＡヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、２−Ｏ−Ｍｅで修飾されている。植物細胞においては、ＤＮＡ中での二本鎖切断は、典型的にはＮＨＥＪ ＤＮＡ修復経路によって修復される。この経路は、ＤＮＡを修復するためのテンプレートを必要とせず、したがって誤りがちである。植物細胞に関してＤＮＡを修復するためにこの経路を使用する利点は、それが迅速で遍在的であり、最も重要なこととして細胞がＤＮＡ複製を受けていない時に起こり得るということである。植物細胞における複製フォークの外側の二本鎖切断を修復する際に機能する別のＤＮＡ修復経路は、相同組換え（ＨＲ）と呼ばれるが、ＮＨＥＪ経路とは異なり、この型の修復は精密で、ＤＮＡテンプレート（ＧＲＯＮ）の使用を必要とする。これらのＧＲＯＮは、標的遺伝子のＤＮＡ複製フォークにおいて岡崎フラグメントを模倣するため、二本鎖ＤＮＡカッターと共にそれらを使用することは、当業者には自明ではない。
効率の改善
本開示は、修復オリゴヌクレオチドを使用する、標的遺伝子の変換の有効性を高めるための複数のアプローチを提供し、それらは単独でまたは互いに組み合わせて使用することができる。これらは以下を含む：
１．ＤＮＡ修復機構を標的（ミスマッチ）部位に引きつける修復オリゴヌクレオチドに修飾を導入すること。
Ａ．オリゴヌクレオチド（例えば、１０塩基以内、幾つかの実施形態において所望ミスマッチ部位の５塩基）における１つまたは複数の脱塩基部位の導入により、塩基切除修復（ＢＥＲ）中の中間体である損傷が生じ、それによってＢＥＲ機構を修復オリゴヌクレオチドによる変換の標的とされる部位の近辺に引きつける。ｄＳｐａｃｅｒ（脱塩基フラン）修飾オリゴヌクレオチドは、例えばＴａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１０１７１−７９，１９８７中に記載されたように調製することができる。
Ｂ．オリゴヌクレオチド中への、またはオリゴヌクレオチドと一緒のいずれかの、一本鎖または二本鎖切断を誘導する化合物の含有によって、ＮＨＥＪ、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、および相同組換えにより修復される損傷が生じる。例として、ブレオマイシンファミリーの抗生物質、亜鉛フィンガー、ＦｏｋＩ（または任意のＩＩＳ型クラスの制限酵素）および他のヌクレアーゼは、修復オリゴヌクレオチドによる変換の標的とされる部位の近辺に二本鎖切断を導入するために、修復オリゴヌクレオチドの３’または５’末端に共有結合され得る。ブレオマイシンファミリーの抗生物質は、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンなどを含むＤＮＡ切断性糖ペプチドである。
Ｃ．オリゴヌクレオチド（例えば、１０塩基以内、および幾つかの実施形態において所望ミスマッチ部位の５塩基）に取り込まれる１つまたは複数の８’オキソｄＡまたはｄＧの導入によって、活性酸素種によって生成される損傷と類似した損傷が生じる。これらの損傷は、いわゆる「押込み修復（ｐｕｓｈｉｎｇ ｒｅｐａｉｒ）」系を誘導する。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７：６５７−６２，２００４を参照されたい。
２．修復オリゴヌクレオチドの安定性の増大：
修復オリゴヌクレオチド上に３’ブロッキング末端を作製するためのオリゴヌクレオチドの３’末端における逆向き塩基（ｉｄＣ）の導入。
修復オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端におけるハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる１つまたは複数の２’Ｏ−メチルヌクレオチドまたは塩基の導入（例えば、ＷＯ２００７／０７３１４９参照）。
修復オリゴヌクレオチドの５’末端における１つまたは複数の２’Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチドの導入により、所望のミスマッチ部位をもたらすＤＮＡ塩基が生じ、それによって岡崎フラグメント様核酸構造を生成する。
アクリジン、ソラレン、臭化エチジウムおよびＳｙｂｅｒ染色剤などのコンジュゲートされた（５’または３’）挿入色素。
Ｔ／Ａクランプ、コレステロール部分、ＳＩＭＡ（ＨＥＸ）、リボＣおよびアミダイトなどの５’末端キャップの導入。
ホスホチオアート、２’Ｏ−メチル、メチルホスホナート、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＭＯＥ（メトキシエチル）、ｄｉＰＳおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの骨格修飾。
例えばシスプラチンおよびマイトマイシンＣなどの鎖間架橋試薬による、修復オリゴヌクレオチドの架橋。
Ｃｙ３、ＤＹ５４７、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５およびＤＹ６４７などの蛍光色素とのコンジュゲーション。
３．ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる塩基の取り込みによる、修復オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションエネルギーの増大（例えば、ＷＯ２００７／０７３１４９参照）。
４．合成用の構成単位としてヌクレオチド多量体（２量体、３量体、４量体など）を使用することによる、修復オリゴヌクレオチド合成の品質の向上。これによって、構成単位からの完全長産物のより少ないカップリングステップおよびより容易な分離をもたらす。
５．長鎖修復オリゴヌクレオチド（即ち、例えば１個もしくは複数の突然変異、または修復オリゴヌクレオチド中で標的化された２個以上の突然変異を有する、例えば本明細書に記載された長さなど、５５ヌクレオチド長を超える）の使用。
前述のアプローチの例を、表１に提供する。
Figure 2019506170
Figure 2019506170
前述の修飾は、メチル化、５’挿入色素、５’および３’末端への修飾、骨格修飾、架橋剤、環化、および「キャップ」、ならびにイノシンなどの類似体による１つまたは複数の天然由来ヌクレオチドの置換など、公知のヌクレオチド修飾も包含し得る。ヌクレオチドの修飾は、アクリジン、アミン、ビオチン、カスケードブルー、コレステロール、Ｃｙ３＠、Ｃｙ５＠、Ｃｙ５．５＠、Ｄａｂｏｙｌ、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、Ｅｄａｎｓ、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、３’−グリセリル、ＨＥＸ、ＩＲＤ−７００、ＩＲＤ−８００、ＪＯＥ、ホスファートソラレン、ローダミン、ＲＯＸ、チオール（ＳＨ）、スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＡＭＣＡ−Ｓ’’、ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ°、マリーナブルー＠、パシフィックブルー＠、オレゴングリーン＠、ローダミングリーン＠、ローダミンレッド＠、ロドールグリーン＠およびテキサスレッド＠の付加を包含する。ポリヌクレオチド骨格修飾としては、メチルホスホナート、２’−ＯＭｅメチルホスホナートＲＮＡ、ホスホロチオラート、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅＲＮＡが挙げられる。塩基修飾としては、２−アミノ−ｄＡ、２−アミノプリン、３’−（ｄｄＡ）、３’ｄＡ（コルジセピン）、７−デアザ−ｄＡ、８−Ｂｒ−ｄＡ、８−オキソ−ｄＡ、Ｎ６−Ｍｅ−ｄＡ、脱塩基部位（ｄＳｐａｃｅｒ）、ビオチンｄＴ、２’−ＯＭｅ−５Ｍｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｃ、３’−（５−Ｍｅ−ｄＣ）、３’−（ｄｄＣ）、５−Ｂｒ−ｄＣ、５−１−ｄｕｃ、５−Ｍｅ−ｄＣ、５−Ｆ−ｄＣ、カルボキシ−ｄＴ、変換可能ｄＡ、変換可能ｄＣ、変換可能ｄＧ、変換可能ｄＴ、変換可能ｄＵ、７−デアザ−ｄＧ、８−Ｂｒ−ｄＧ、８−オキソ−ｄＧ、Ｏ６−Ｍｅ−ｄＧ、Ｓ６−ＤＮＰ−ｄＧ、４−メチル−インドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−イノシン、２’−ｄｌ、ｏ６−フェニル−ｄｌ、４−メチル−インドール、２’−デオキシネブラリン、５−ニトロインドール、２−アミノプリン、ｄＰ（プリン類似体）、ｄＫ（ピリミジン類似体）、３−ニトロピロール、２−チオ−ｄＴ、４−チオ−ｄＴ、ビオチン−ｄＴ、カルボキシ−ｄＴ、０４−Ｍｅ−ｄＴ、０４−トリアゾール−ｄＴ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｕ、５−Ｂｒ−ｄＵ、２’−ｄＵ、５−Ｆ−ｄＵ、５−ｌ−ｄＵ、０４−トリアゾール−ｄＵが挙げられる。前記用語は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、その骨格が糖ではなくＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からなる擬似ペプチドであるＤＮＡ類似体も包含する。ＰＮＡは、ＤＮＡの挙動を模倣し、相補的核酸鎖と結合する。ＰＮＡの中性骨格は、通常得られるものより強い結合と高い特異性をもたらす。さらに、ＰＮＡの独自の化学的、物理的および生物学的性質が、強力な生体分子ツール、アンチセンスおよびアンチジーン物質、分子プローブ、ならびにバイオセンサーを生成するために活用されている。
オリゴヌクレオベースは、ニック（複数可）、ギャップ（複数可）、修飾オリゴヌクレオチド骨格、脱塩基ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド、または他の化学的部分を有し得る。さらなる実施形態において、オリゴヌクレオベースの少なくとも１本の鎖は、少なくとも１つのさらなる修飾ヌクレオチド、例えばＭＯＥ（メトキシエチル）などの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオアート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド（ヌクレオベースが欠失状態であるか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ＧｌｅｎＲｅｐｏｒｔｓ／ＧＲ２１−１４．ｈｔｍｌ参照）、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダイト、および非天然塩基含有ヌクレオチドを含む。様々な塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えばホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホナート、５’−アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートをはじめとするメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、３’−アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダート、チオノホスホロアミダートをはじめとするホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノホスファートおよびボラノホスファート、これらの２’−５’結合類似体、ならびに反転極性（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｐｏｌａｒｉｔｙ）を有し１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’または２’−２’結合である骨格が挙げられる。反転極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合に１つの３’−３’結合、即ち脱塩基であり得る（ヌクレオベースが欠失状態であるか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）１つの反転ヌクレオシド残基を含む。結合反転（ｌｉｎｋａｇｅ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）の最も一般的な用途は、ホスホロチオアート骨格を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの末端に３’−３’結合を付加することである。３’−３’結合は、２個の５’−ＯＨ末端を有し３’−ＯＨ末端を有さないオリゴヌクレオチドを作製することによって、エキソヌクレアーゼ分解に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに安定化させる。結合反転は、「逆ホスホロアミダイト」を使用することによって、オリゴヌクレオチド合成中に特定位置に導入され得る。これらの試薬は、５’−ＯＨ位置のホスホロアミダイト基、および３’−ＯＨ位置のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を有する。通常、ＤＭＴ保護基は、５’−ＯＨ上にあり、ホスホロアミダイト基は、３’−ＯＨ上にある。
修飾塩基の例としては、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリルピレン−ウリジン、２’−アミノウリジン、２’−デオキシウリジン、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２，６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジン、５−ブロモ−ウリジン、５−フルオロ−シチジン、５−フルオロウリジン、５−インド−ウリジン、５−メチル−シチジン、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、７−デアザ−グアニン、８−アミノヘキシル−アミノ−アデニン、６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン、２−チオ−チミン、５−ヨード−ウリジン、５−ヨード−シチジン、８−ブロモ−グアニン、８−ブロモ−アデニン、７−デアザ−アデニン、７−ジアザ−グアニン、８−オキソ−グアニン、５，６−ジヒドロ−ウリジン、および５−ヒドロキシメチル−ウリジンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの合成単位は、市販されており（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙから購入可能）、化学合成によりＤＮＡに組み込むことができる。
糖部分の修飾の例は、３’−デオキシ化（３’−ｄｅｏｘｙｌａｔｉｏｎ）、２’−フッ素化、およびアラビノシド化（ａｒａｂａｎｏｓｉｄａｔｉｏｎ）であるが、これらに限定されると解釈すべきでない。ＤＮＡ中へのこれらの組み込みもまた、化学合成により可能である。
５’末端修飾の例は、５’−アミノ化、５’−ビオチン化、５’−フルオレセイン化、５’−テトラフルオロ−フルオレセイン化、５’−チオン化（５’−ｔｈｉｏｎａｔｉｏｎ）、および５’−ダブシル化であるが、これらに限定されると解釈すべきでない。
３’末端修飾の例は、３’−アミノ化、３’−ビオチニル化、２，３−ジデオキシ化、３’−チオン化、３’−ダブシル化、３’−カルボキシル化、および３’−コレステリル化であるが、これらに限定されると解釈すべきでない。
好ましい一実施形態において、該オリゴヌクレオベースは、リンカーを介して５’末端炭素に付着した５’ブロッキング置換基を含有し得る。該リンカーの化学的性質は、その長さ以外は重要ではなく、長さは幾つかの実施形態において、少なくとも６原子長でなければならず、リンカーは、柔軟性でなければならない。ビオチン、コレステロールもしくは他のステロイドなどの種々の非毒性置換基、または非挿入カチオン性蛍光色素を、使用することができる。オリゴヌクレオベースを作製するのに特に好ましい試薬は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｖａ．（現在ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってＣｙ３（商標）およびＣｙ５（商標）として販売されている試薬であり、これらは、オリゴヌクレオチドへの組み込みによって、３，３，３’，３’−テトラメチルＮ，Ｎ’−イソプロピル置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニン色素をそれぞれ生成するブロックされたホスホロアミダイトである。Ｃｙ３が、特に好ましい。インドカルボシアニンが、Ｎ−オキシアルキル置換されている場合、それは、簡便には５’末端リン酸を有するホスホジエステルとしてオリゴデオキシヌクレオチドの５’末端に連結され得る。市販のＣｙ３ホスホロアミダイトが、指導された通り用いられる場合、得られた５’修飾は、ブロッキング置換基とリンカーからなり、それらは一緒になってＮ−ヒドロキシプロピル，Ｎ’−ホスファチジルプロピル３，３，３’，３’−テトラメチルインドモノカルボシアニンになっている。企図される他の色素としては、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、スルホローダミン１０１、メロシアニン５４０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５５０２６、Ｃｙ３．５、Ｄｙ５４７、Ｄｙ５４８、Ｄｙ５４９、Ｄｙ５５４、Ｄｙ５５５、Ｄｙ５５６、Ｄｙ５６０、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙおよびｍＣｈｅｒｒｙが挙げられる。
好ましい実施形態において、該インドカルボシアニン色素は、インドール環の３および３’位で四置換されている。理論について限定されないが、これらの置換基は、色素が挿入色素になるのを防止する。これらの位置における該置換基の同一性は、重要ではない。
本明細書に記載されたオリゴ設計はまた、非限定的に亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはクラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）による部位特異的相同組換えを使用する遺伝子標的化をはじめとする他のＤＮＡ編集または組換え技術と組み合わせて、より効率的なドナーテンプレートとして用いられ得る。
本開示は、特定の態様および実施形態においては、一般に、ゲノム細胞ＤＮＡの効率的な修飾および／または細胞のゲノムＤＮＡへのＤＮＡの組換えのための方法に関する。任意の特定の使用に限定されないが、本明細書で提供する幾つかの方法は、特定の実施形態においては、例えば、細胞に及ぼす修飾の影響を決定する目的で細胞のゲノム中に修飾を導入する際に有用であり得る。例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列に修飾を導入して、修飾が酵素の酵素活性を改変するか否かを決定すること、および／または酵素の触媒領域の位置を決定することができる。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質のコード配列に修飾を導入して、タンパク質のＤＮＡ結合活性が改変されるか否かを決定することができ、したがってタンパク質内の特定ＤＮＡ結合領域を描くことができる。さらに別の代替法は、非コード調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサ、調節ＲＮＡ配列（ｍｉＲＮＡ）など）と動作可能に連結された第２の配列の発現レベルに及ぼす修飾の影響を決定するために、該非コード調節配列に修飾を導入することである。これは例えば、調節活性を有する特定配列を画定するのに望ましくなり得る。
ＤＮＡカッター
標的遺伝子破壊をもたらすための一方策は、部位特異性エンドヌクレアーゼなどのＤＮＡカッターを使用する一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断の発生によるものである。エンドヌクレアーゼは、藻類、植物、およびヒトをはじめとする大動物モデルなどの、より従来型の遺伝子標的法を伝統的に受けにくい生物体における標的遺伝子破壊に最も頻繁に使用される。例えば、ＨＩＶ感染を処置および予防するための、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを含む目下進行中のヒト臨床試験がある。さらに、エンドヌクレアーゼ操作は、作物中に望ましくない表現型をもたらす遺伝子を破壊する試みにおいて現在使用されている。
亜鉛フィンガー
人工エンドヌクレアーゼの１クラスが、亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼである。亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼは、典型的にはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの、非特異的切断ドメインと、特異的ＤＮＡ配列と結合するように操作された亜鉛フィンガータンパク質ドメインを組み合わせる。亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼのモジュラー構造によって、それらはゲノムに部位特異的二本鎖切断をもたらす用途の広い基盤となる。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼは、２量体として切断するため、オフターゲット切断事象を予防するための一方策は、隣接する９塩基対部位で結合する亜鉛フィンガードメインを設計することであった。それぞれが全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２８５，４１６号；同第７，５２１，２４１号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２７３，９２３号；同第７，２６２，０５４号；同第７，２２０，７１９号；同第７，０７０，９３４号；同第７，０１３，２１９号；同第６，９７９，５３９号；同第６，９３３，１１３号；同第６，８２４，９７８号も参照されたい。
ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮは、特異的ＤＮＡ部位に一本鎖および二本鎖切断を誘導し、その後、切断部位に配列改変を作製するのに活用され得るメカニズムにより修復されるために用いられる標的化可能なヌクレアーゼである。
ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合領域を操作するのに用いられる基本的なビルディングブロックは、キサントモナス種プロテオバクテリアによりコードされた天然由来のＴＡＬＥから得られる高度に保存された反復ドメインである。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ結合は、反復単位のアミノ末端とカルボキシ末端でさらなるＴＡＬＥ由来ドメインと隣接した、高度に保存された３３〜３５アミノ酸反復単位のアレイによって媒介される。
これらのＴＡＬＥ反復単位は、ＤＮＡの一塩基と特異的に結合し、その同一性は、反復単位の位置１２と１３に典型的に見出される２つの超可変残基と、所望の標的核酸の長さに対応するアレイ中の反復単位の数、標的核酸配列とマッチするように選択された反復単位の同一性によって決定される。幾つかの実施形態において、該標的核酸は、標的部位の選択性を最大にするために、１５〜２０塩基対の間である。標的核酸の切断は、典型的にＴＡＬＥＮ結合の５０塩基対以内で起こる。ＴＡＬＥＮ認識部位設計に関するコンピュータプログラムは、当該技術分野で記載されている。例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１１ Ｊｕｌｙ；３９（１２）：ｅ８２を参照されたい。
所望の標的配列とマッチするよう設計されたら、ＴＡＬＥＮを組換え技術によって発現させ、外因性タンパク質としてプロトプラストに導入するか、またはプロトプラスト内でプラスミドから発現させるか、またはｍＲＮＡとして投与することが可能である。
メガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼとしても知られるホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの大きな（例えば、１４ｂｐを超える）切断部位のため、高度の特異性でゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断を発生させる配列特異性エンドヌクレアーゼである。それらの標的部位に対するホーミングエンドヌクレアーゼの特異性によって、誘導型ＤＮＡ切断の精密な標的化が可能になるが、ホーミングエンドヌクレアーゼの切断部位は、希少であり、標的遺伝子中で天然由来の切断部位を見出す可能性は低い。
人工エンドヌクレアーゼの別のクラスが、操作型メガヌクレアーゼである。操作型ホーミングエンドヌクレアーゼは、既存のホーミングエンドヌクレアーゼの特異性を修飾することにより生成される。一アプローチでは、天然由来のホーミングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列に変異を導入し、その後、得られた操作型ホーミングエンドヌクレアーゼをスクリーニングして、標的結合部位を切断する機能性タンパク質を選択する。別のアプローチでは、２つの異なるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位を組み合わせて、各ホーミングエンドヌクレアーゼの半分の部位で構成された新たな認識部位を作製することによって、キメラホーミングエンドヌクレアーゼを操作する。例えば、米国特許第８，３３８，１５７号を参照されたい。
ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、３つの基本設計要素：１）Ｃａｓ遺伝子、転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質；２）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；ならびに３）外来ＤＮＡ部位（例えば、内在性ＤＮＡ標的領域）およびＣＲＩＳＰＲ反復単位の一部に相補的である「プロトスペーサー」領域を担持する、ＣＲＩＳＰＲ反復単位アレイをコードするＲＮＡ転写産物からプロセシングされるＲＮＡセグメントであるｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を含有する。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ／２０１４／０９３６６１およびＷＯ／２０１３／１７６７７２を参照されたい。
Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子、転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質
プラスミドベクターからの一過性Ｃａｓ発現は、Ｃａｓタンパク質の送達を指導し、そして／または植物細胞へのＣａｓ ｍＲＮＡの送達を指導する。Ｃａｓ遺伝子は、高等植物、藻類または酵母における発現のためにコドン最適化され、適用可能ならば、構成的、誘導性、組織特異的または種特異的プロモーターのいずれかによって駆動される。Ｃａｓ転写産物の終結およびポリアデニル化シグナルは、ＮｏｓＴ、ＲＢＣＴ、ＨＳＰ１８．２Ｔまたは他の遺伝子特異性もしくは種特異性ターミネーターのいずれかである。Ｃａｓ遺伝子カセットまたはｍＲＮＡは、イントロンをネイティブで、または遺伝子特異的プロモーターおよび／もしくは合成プロモーターと共に、含有し得る。Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数の核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）、突然変異、欠失、改変またはトランケーションを含有し得る。一過性発現系では、Ｃａｓ遺伝子カセットを、同じ一過性発現ベクター上のｇＲＮＡカセットなどのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の他の成分と組み合わせることができる。あるいは、Ｃａｓ遺伝子カセットを、ｇＲＮＡカセットとは独立した構築物から、またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の他の成分から配置および発現させることができる。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子は、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼおよびポリメラーゼなどの種々の予測された核酸操作活性を有するタンパク質をコードする。Ｃａｓ遺伝子は、ｃａｓ９を含む。Ｃａｓ９は、予測されたＲｕｖＣ様およびＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを含有する大きなタンパク質をコードする遺伝子であり、ほとんどの古細菌および多くの細菌中に存在するＣＲＩＳＰＲ適応免疫系と関連する。Ｃａｓ９タンパク質は、２つのローブからなる：
１）認識（ＲＥＣ）ローブ−３つのドメイン：
ａ）ＢＨ（架橋らせん）
ｂ）ＲＥＣ１−ＲＮＡ先導型ＤＮＡ標的化を容易にする
ｃ）ＲＥＣ２−ＲＮＡ先導型ＤＮＡ標的化を容易にする
からなる；
２）ヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブ−３つのドメイン：
ａ）ＲｕｖＣ−ＲＮＡ先導型ＤＮＡ標的化を容易にする；エンドヌクレアーゼ活性
ｂ）ＨＮＨ−エンドヌクレアーゼ活性
ｃ）ＰＩ−ＰＡＭ相互作用
からなる。
他の実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ、ＲＥＣおよびＢＨドメインが高度に保存されたｃａｓ９の相同体であり得る。幾つかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、以下の種に由来するものである。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡと、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列の一部との融合体として操作され、プロトスペーサー領域に相補的である特異的な標的ＤＮＡ配列にＣａｓ９を先導する。ガイドＲＮＡは、長いトレーサーＲＮＡハイブリッド、短いｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドまたはネイティブＣＲＩＳＰＲアレイ＋ｔｒａｃｒＲＮＡコンフォメーションを有するキメラＲＮＡ設計を含有する発現カセットを含み得る。キメラｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化特異性と、単一転写産物へのｔｒａｃｒＲＮＡの足場化特性とを組み合わせたものである。ｇＲＮＡの一過性発現は、Ｕ６またはＵ３ ｓｎＲＮＡ遺伝子ファミリー（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００８）に由来するものなどの種特異性高等植物ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより制御される。ｇＲＮＡ転写産物の終結は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００８によりポリｄＴの６〜２０ヌクレオチド域によって制御される。ｇＲＮＡ発現カセットは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の他の成分に由来する同一または異なる一過性発現ベクター上に位置する。ｇＲＮＡ転写産物は、インビトロで合成されて、ｇＲＮＡ一過性発現ベクターとは独立して、またはそれと共に、植物細胞中に直接送達することができる。
標的領域
ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的領域に対する特異性を定義する２つの成分：プロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含有する。典型的には２０ヌクレオチドであるがＤＮＡ標的に基づいて変動し得るプロトスペーサー配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体へのＤＮＡ配列特異性を提供する。ＤＮＡ標的はまた、ＮＮＧまたはＮＡＧトリヌクレオチド配列（ＰＡＭ）（ここでＮは、プロトスペーサーのすぐ３’側または下流の任意のヌクレオチドを表す）も含有する。
一成分法
Ｌｅ Ｃｏｎｇら（２０１３）などと同様に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子編集の単純化された「一成分法」は、単一の一過性発現構築物がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の全ての成分、即ちｇＲＮＡとＣａｓ発現カセットの両方を含有するものである。これにより、任意の所与の植物または作物において単一または複数の遺伝子座を標的にするための容易なモジュラー設計が可能になる。複数の遺伝子座の標的化は、単に標的特異性ｇＲＮＡカセット中でスワップすることによって実現され得る。さらに、種特異性プロモーター、ターミネーターまたは他の発現強化エレメントを、「一成分法」の一過性ベクター中に、および該ベクターから容易にシャトルして、種特異的手法でｇＲＮＡとＣａｓタンパク質の両方の最適な発現を可能にすることができる。
二成分法
二成分法においては、ＣａｓおよびｇＲＮＡ発現カセットは、異なる一過性発現ベクター上に位置する。これにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ編集成分の別々の送達が可能になり、同じ細胞内で異なるｇＲＮＡ：Ｃａｓ比が可能になる。一成分法と同様に、二成分法もまた、プロモーター、ターミネーターまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ成分の発現に影響を及ぼす他のエレメントを容易に改変させ、種特異的手法でＤＮＡの標的化を可能にする。
抗生物質
エンドヌクレアーゼの別のクラスは、ブレオマイシンファミリーの抗生物質などのＤＮＡ切断性糖ペプチドである抗生物質であり、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよび本明細書にさらに記載される他のものを含むＤＮＡ切断性糖ペプチドである。
他のＤＮＡ修飾分子を、標的遺伝子組換えにおいて用いることができる。例えば、ペプチド核酸を使用して、標的細胞または複数の標的細胞のゲノムに対する修飾を誘導することができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＥｃｋｅｒの米国特許第５，９８６，０５３号参照）。手短に述べると、少なくとも部分的なペプチド骨格を含む合成ヌクレオチドを用いて、相同性ゲノムヌクレオチド配列を標的にする。二重らせんＤＮＡとの結合によって、またはペプチド核酸にライゲートされた変異原性物質を介して、標的ＤＮＡ配列の修飾および／または組換えが起こるよう誘導される。標的特異性は、標的配列とゲノム配列の間の配列相同性の度合いによって決定される。
さらに本開示は、ゲノム配列の修飾を実施するために本明細書で用いられる個々の方法に限定されない。実際には、複数の方法が企図される。例えば、三重らせん形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を使用して、遺伝子を標的にすることができる。ＴＦＯは合成により、例えばＰＣＲにより、または遺伝子合成装置の使用により作製することができる。加えて、適切な天然配列が見出される場合、ＴＦＯをゲノムＤＮＡから単離することができる。例えば、非限定的にソラレンまたはクロラムブシルなどの変異原性物質へつなぐことによるなど、ＴＦＯを複数の方法に使用することができる（例えば、Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７８７９−７８８３，１９９３；Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ６７：７３２３−７３３１，１９９３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５：１７５９−１７６８，１９９５；Ｔａｋａｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６０２−５６０６，１９９１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ２５：３４４０−３４４４，１９９７参照）。さらに例えば、ＴＦＯは、ドナーデュプレックスＤＮＡにつなぐことができる（例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：１１５４１−１１５４８，１９９９参照）。ＴＦＯは、謝りがちな修復を誘発するのに十分な親和性で結合することにより作用することもできる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：８０２−８０５，１９９６）。
本明細書に開示される方法は、使用されるＤＮＡ修復試薬の性質または型に必ずしも限定されない。例えば、そのようなＤＮＡ修復試薬は、ラジカルを放出して、ＤＮＡ鎖切断をもたらす。あるいは、該試薬は、ＤＮＡをアルキル化して、複製および転写を遮断する付加体を形成する。別の代替法では、該試薬は、細胞酵素を阻害する架橋または分子をもたらし、鎖切断に導く。オリゴヌクレオチドに連結してＴＦＯを形成したＤＮＡ修復試薬の例としては、インドロカルバゾール、ナフタレンジイミド（ＮＤＩ）、トランスプラチン、ブレオマイシン、シクロプロパピロールインドールの類似体、およびフェナントジヒドロジオキシンが挙げられるが、これらに限定されない。特に、インドロカルバゾールは、トポイソメラーゼＩ阻害剤である。これらの酵素の阻害は、鎖切断およびＤＮＡタンパク質付加体形成をもたらす（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．８，７７７，２０００）。ＮＤＩは、グアニンを酸化することができる光酸化剤であり、これはグアニン残基の部位に突然変異を引き起こす可能性がある（Ｎｕｎｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，６１９０，２０００）。ＴＦＯが該試薬に連結されると、トランスプラチンが、三本鎖標的中のＤＮＡと反応することが示されている。この反応は、突然変異誘発性であるＤＮＡ付加体の形成を引き起こす（Ｃｏｌｕｍｂｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：４５１９，１９９６）。ブレオマイシンは、放射線模倣体として広く使用されているＤＮＡ切断物質である。それは、オリゴヌクレオチドに連結し、その形式で切断物質として活性があることが示されている（Ｓｅｒｇｅｙｅｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２３，４４００，１９９５；Ｋａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１６７１５，１９９５）。シクロプロパピロロインドールの類似体は、ＴＦＯに連結され、トリプレックス標的配列中のＤＮＡをアルキル化することが示されている。したがって該アルキル化ＤＮＡは、突然変異誘発性である化学的付加体を含有する（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５，５０７７，１９９７）。フェナントジヒドロジオキシンは、光活性化によりラジカル種を放出するマスクドキノンである。それらはＴＦＯに連結され、光活性化によりデュプレックスＤＮＡに切断を導入することが示されている（Ｂｅｎｄｉｎｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．９，５５５，１９９８）。
修飾および／または組換えを誘導する他の方法が、本開示により企図される。例えば別の実施形態は、外因性ＤＮＡフラグメントと標的遺伝子の間の（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８−１２９２，１９８９参照）、または標的部位への親和性を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用による、相同組換えの誘導を含む。さらに他の方法は、ポリアミドによる配列特異的ＤＮＡ認識および標的化（例えば、Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ３：６８８−６９３，１９９９；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８：２１４３−２１５１，１９９９参照）、ならびに部位特異的活性を有するヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲ）の使用を含む。
本開示は、任意の特定の修飾および／または組換えの頻度に限定されない。幾つかの実施形態において、本明細書に開示された方法は、標的ヌクレオチド配列において０．２％〜３％の修飾頻度をもたらす。それでもなお、任意の（即ち、０％〜１００％の間の）修飾および／または組換え頻度が、本開示の範囲内にあることが企図される。修飾および／または組換え頻度は、修飾および／または組換えを誘導するために用いられる方法、使用される細胞型、標的にされる特異的遺伝子、および存在する場合には使用されるＤＮＡ突然変異誘発試薬に依存する。加えて、修飾および／または組換えを検出するために用いられる方法は、検出法における制約のため、全ての修飾および／または組換えの出現を検出できるわけではない。その上、一部の修飾および／または組換え事象が、サイレントであり、修飾および／または組換えが生じたことの検出可能な指標を与えない場合がある。サイレントの修飾および／または組換え事象の検出不能は、修飾および／または組換えの人為的に低い推定値をもたらす。これらの理由などから、本開示は、任意の特定の修飾および／または組換え頻度に必ずしも限定されない。一実施形態において、修飾および／または組換え頻度は、０．０１％〜１００％の間である。別の実施形態において、修飾および／または組換え頻度は、０．０１％〜５０％の間である。さらに別の実施形態において、修飾および／または組換え頻度は、０．１％〜１０％の間である。他のさらに別の実施形態において、修飾および／または組換え頻度は、０．１％〜５％の間である。
細胞のゲノム中の標的部位に突然変異を導入することが可能なＤＮＡ修飾分子で処置される細胞集団に関連して本明細書で用いられる用語「突然変異の頻度」は、ＤＮＡ修飾分子で処置される細胞の総数と比較した、標的部位に突然変異を含有する処置集団中の細胞数を指す。例えば、細胞のゲノム中の標的部位に突然変異を導入するように設計されたソラレンにつながれたＤＮＡ修飾分子ＴＦＯで処置された細胞集団に関しては、５％の突然変異の頻度は、ＴＦＯ−ソラレンで処置された細胞の合計１００個のうち、５個が標的部位に突然変異を含有することを意味する。
本開示は、細胞中のＤＮＡの修飾および／または組換えにおける任意の精度に必ずしも限定されないが、本開示の幾つかの実施形態は、所望の結果に応じてより高い精度を必要とすることが企図される。例えば、遺伝子修復に必要とされる特異的配列変化（例えば、特定塩基の変化）は、遺伝子破壊のみが必要な遺伝子ノックアウトの発生と比較して、より高い精度を必要とする。本開示の方法によれば、先行技術の方法を用いるより、高精度の修飾および／または相同組換え技法を得る可能性が高くなる。
植物細胞への遺伝子修復オリゴヌクレオベースの送達
植物細胞を形質転換するのに用いられる任意の一般に知られる方法を、遺伝子修復オリゴヌクレオベースの送達に使用することができる。例示的な方法を、以下に列挙する。本明細書の方法および組成物は、ＤＮＡ修飾試薬または複数の該試薬で細胞をトランスフェクトするための任意の多くの方法を含み得る。細胞または複数の細胞にＤＮＡ修飾試薬を導入するための方法は、当該技術分野で周知であり、マイクロインジェクション、電気穿孔、受動吸着、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、リポソーム融合、リポフェクチン、ヌクレオフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、バイオリスティック（即ち、微粒子銃）などが挙げられるが、これらに限定されない。
投射浸透によりセルロース細胞壁を有する植物細胞に大きなＤＮＡフラグメントを導入するための金属製マイクロキャリア（ミクロスフェア）の使用は、関連技術の当業者に周知である（以後、バイオリスティック送達）。米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，１００，７９２号および同第５，２０４，２５３号には、それらの投射用マイクロキャリアおよびデバイスを選択するための一般的な技術が記載される。
本明細書に開示された方法におけるマイクロキャリアの使用に関する具体的条件は、国際公開ＷＯ９９／０７８６５に記載された条件を含み得る。例示的一技法において、氷冷マイクロキャリア（６０ｍｇ／ｍＬ）、混合型デュプレックスオリゴヌクレオチド（６０ｍｇ／ｍＬ）、２．５Ｍ ＣａＣｌ２および０．１Ｍ スペルミジンをこの順序で添加し、例えばボルテックスにより、混合物を穏やかに１０分間撹拌し、その後、室温で１０分間放置し、ここでマイクロキャリアを５倍容量のエタノールに希釈し、遠心分離して、１００％エタノールに再懸濁させる。８〜１０μｇ／μＬマイクロキャリア、１４〜１７μｇ／ｍＬ混合型デュプレックスオリゴヌクレオチド、１．１〜１．４ＭＣａＣｌ２および１８〜２２ｍＭスペルミジンの接着溶液中濃度で良好な結果を得ることができる。８μｇ／μＬマイクロキャリア、１６．５μｇ／ｍＬ混合型デュプレックスオリゴヌクレオチド、１．３ＭＣａＣｌ２および２１ｍＭスペルミジンの条件下で、最適な結果が観察された。
細胞壁および細胞膜を透過するマイクロファイバーを使用して、遺伝子修復オリゴヌクレオベースを植物細胞に導入することもできる。Ｃｏｆｆｅｅらへの米国特許第５，３０２，５２３号には、ブラックメキシカンスイートトウモロコシの懸濁培養物の形質転換を容易にするための炭化ケイ素繊維の使用が記載される。マイクロファイバーを使用した植物細胞の形質転換のためのＤＮＡ導入に使用され得る任意の機械的技術を用いて、トランスミューテーション用の遺伝子修復オリゴヌクレオベースを送達することができる。
遺伝子修復オリゴヌクレオベースのマイクロファイバー送達に関する例示的な技術は、以下の通りである。滅菌マイクロファイバー（２μｇ）を、混合型デュプレックスオリゴヌクレオチド約１０μｇを含有する植物培養培地１５０μＬに懸濁させる。懸濁培地を沈殿させ、同容量の充填細胞および滅菌ファイバー／ヌクレオチド懸濁液を１０分間ボルテックスにかけて、播種する。個々の形質に適するように、選択培地を直後に、または最大約１２０時間遅延させて適用する。
代わりの実施形態において、植物の一部に由来するプロトプラストの電気穿孔により、遺伝子修復オリゴヌクレオベースを植物細胞に送達することができる。当業者に周知の技術に従い、プロトプラストを植物の一部、特に葉の酵素処置によって形成させる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ５５：８９−１０７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．の中のＧａｌｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１３３：２１３−２２１，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪの中のＫｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照されたい。電気穿孔前に、プロトプラストを増殖培地中で培養する必要はない。電気穿孔に関する例示的な条件は、総容量０．３ｍＬ中に３００，０００プロトプラスト、および０．６〜４μｇ／ｍＬの間の遺伝子修復オリゴヌクレオベース濃度である。
代わりの実施形態において、当業者に周知の技術に従い、核酸を膜修飾物質ポリエチレングリコールの存在下で、植物プロトプラストに取り込ませる。別の代わりの実施形態において、遺伝子修復オリゴヌクレオベースをマイクロキャピラリーで植物細胞またはプロトプラストに注入することにより、それを送達させ得る。
代わりの実施形態において、アルギン酸カルシウムで構成されるマイクロビーズ中に、核酸を包埋し、膜修飾物質ポリエチレングリコールの存在下で植物プロトプラストに取り込ませる（例えば、Ｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００４参照）。
代わりの実施形態において、核酸を水中で凍結させ、微粒子の形態の衝撃により植物細胞に導入される（例えば、Ｇｉｌｍｏｒｅ，１９９１，米国特許第５，２１９，７４６号；Ｂｒｉｎｅｇａｒ ｅｔ ａｌ．参照）。
代わりの実施形態において、ナノ粒子を含有する懸濁液中での細胞のインキュベーションによって（例えば、Ｐａｓｕｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，２００８参照）、または微粒子銃を介してインタクト細胞に、もしくはコインキュベーションによりプロトプラストに送達することにより（例えば、Ｔｏｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００７を参照）、該ナノ粒子に付着された核酸が該インタクト植物細胞中に導入される。
代わりの実施形態において、核酸が、浸透ペプチドと複合体形成し、コインキュベーションにより細胞に送達される（例えば、Ｃｈｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＷＯ２００８１４８２２３Ａ１；Ｅｕｄｅｓ ａｎｄ Ｃｈｕｇｈ参照）。
代わりの実施形態において、核酸が、電気穿孔を介してインタクト細胞に導入される（例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８、ＵＳ２００３／０１１５６４１Ａｌ、Ｄｏｂｒｅｓ ｅｔ ａｌ．参照）。
代わりの実施形態において、核酸は、核酸を含む溶液中に乾燥胚の細胞を浸漬することにより、該細胞に送達されるか（例えば、Ｔｏｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｓｅｎａｒａｔｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９１参照）、または他の実施形態において、Ｃｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅ（ＳＱＺ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により導入される。
植物の選択
様々な実施形態において、本明細書で開示される植物は、高木もしくは低木として成長する任意の樹木植物種、任意の草本植物種、または食用果実、種子もしくは野菜を生成する任意の種、または有色もしくは芳香性品種の花を生成する任意の種をはじめとする、任意の種の双子葉植物、単子葉植物または裸子植物であり得る。例えば該植物は、それらが既に具体的に言及されていない限り、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、エンドウマメ、ヒヨコマメ、サヤエンドウ、ソラマメ、レンズマメ、カブ、ルタバガ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、フィールドビーン、ポプラ、マツ、ユーカリ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、シバと飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、ホウセンカ、コショウ、ナス、マリーゴールド、スイレン、キャベツ、ヒナギク、カーネーション、チューリップ、アイリス、ユリ、および堅果産生植物からなる群の植物種から選択され得る。
植物および植物細胞は、当該技術分野で一般に知られる方法を使用して、例えば除草剤の存在下で植物または植物細胞を成長させ、除草剤の非存在下での成長速度と比較した成長速度を測定することにより、除草剤に対する抵抗性または耐性に関して試験され得る。
本明細書で用いられる、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な成長は、該当する野生型タンパク質を発現する対応する植物、植物器官、植物組織、または植物細胞における成長速度または細胞分裂速度の少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７５％である、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の成長速度または細胞分裂速度と定義される。
本明細書で用いられる、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な発生は、野生型タンパク質を発現する対応する植物、植物器官、植物組織、または植物細胞で起こる事象と実質的に同一の植物、植物器官、植物組織または植物細胞における１つまたは複数の発生事象の出現と定義される。
特定の実施形態において、本明細書で提供する植物器官としては、葉、茎、根、枝芽、花芽、分裂組織、胚、子葉、内胚乳、がく片、花弁、めしべ、心皮、おしべ、やく、小胞子、花粉、花粉管、胚珠、子房および果実、またはこれらから得られる切片、薄片もしくは薄板が挙げられるが、これらに限定されない。植物組織としては、カルス組織、地下組織、脈管組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、苗条組織、根組織、菌こぶ組織、植物腫瘍組織、および生殖組織が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞としては、細胞壁を有する単離細胞、様々なサイズのそれらの凝集体、およびプロトプラストが挙げられるが、これらに限定されない。
植物が、除草剤を施用されて、同様に施用された非耐性の類似植物によって与えられる曲線と比較して右に移動した用量／反応曲線を与えた場合、該植物は、関連除草剤に実質的に「耐性がある」。そのような用量／反応曲線は、Ｘ軸にプロットされた「用量」、およびＹ軸にプロットされた「殺傷率％」、「除草効果」などを有する。耐性植物は、所与の除草効果をもたらすのに、非耐性の類似植物より多量の除草剤を必要とする。除草剤に実質的に「抵抗性がある」植物は、原野の雑草を殺傷するため農薬散布地域により典型的に利用される濃度と割合で除草剤を施用すると、あるとしてもわずかな壊死、溶解、萎黄病または他の損傷を示す。除草剤に抵抗性がある植物は、除草剤耐性でもある。
植物の作製
植物種の様々な組織の組織培養、およびそこからの植物の再生は、公知である。例えば、組織培養によるキャノーラ品種の繁殖は、以下のいずれかに記載されるが、以下のいずれかに限定されるわけではない：Ｃｈｕｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，” Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ４：４−６，１９８５；Ｂａｒｓｂｙ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ，” Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇ，１９９６）；Ｋａｒｔｈａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐｌａｎｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｓｔｅｍ Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｒａｐｅ，” Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，３１：２１７−２２０，１９７４；Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｈｏｏｔ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒｙ Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａｓ，” Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇ １９８８）；Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｅ．，“Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６，Ｃｈａｐｔｅｒ １７，ｐ．１５９，１９９０。
変種のさらなる生殖は、組織培養および再生によって行うことができる。ダイズの様々な組織の組織培養およびそこからの植物の再生は、周知であり、広く発表されている。例えば、Ｋｏｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｘ Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｓｏｙｂｅａｎｓ，” Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３１：３３３−３３７，１９９１；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，“Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｐｌａｎｔｓ，” Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８２：６３３−６３５，１９９１；Ｋｏｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｓ ａｓ Ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｓｕｃｒｏｓｅ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ Ｓｏｙｂｅａｎｓ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｇｒａｃｉｌｉｓ Ｓｋｖｏｒｔｚ ａｎｄ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．） Ｍｅｒｒ．” Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ，２８：１０３−１１３，１９９２；Ｄｈｉｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｔｉｌｅ Ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．Ｍｅｒｒ．）；Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，” Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １１：２８５−２８９，１９９２；Ｐａｎｄｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，“Ｐｌａｎｔ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｌｅａｆ ａｎｄ Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｗｉｇｈｔｉｉ（Ｗ．ａｎｄ Ａ．） ＶＥＲＤＣ．ｖａｒ．ｌｏｎｇｉｃａｕｄａ，” Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．４２：１−５，１９９２；およびＳｈｅｔｔｙ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｈｏｏｔ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｍｅｒｒｉｌｌ．） ｂｙ Ａｌｌａｎｔｏｉｎ ａｎｄ Ａｍｉｄｅｓ，” Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８１：２４５−２５１，１９９２を参照することができる。１９９１年６月１８日に発行されたＣｏｌｌｉｎｓらへの米国特許第５，０２４，９４４号および１９９１年４月１６日に発行されたＲａｎｃｈらへの米国特許第５，００８，２００号の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
例示的実施形態
本開示の他の箇所に記載および提供される態様および実施形態に加えて、特定の実施形態の以下の非限定的リストが具体的に企図される。
１．細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、細胞をＤＮＡカッターおよび修飾されたＧＲＯＮに暴露することを含む、方法。
２．ＤＮＡカッターおよびＧＲＯＮを含む細胞。
３．前記細胞が植物、細菌、酵母、真菌、藻類、および哺乳動物からなる群から選択される１つまたは複数の種の細胞である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
４．前記細胞が大腸菌、マイコバクテリウム・スメグマチス、枯草菌、クロレラ、バチルス・スリンギエンシス、サッカロマイセス・セレビシエ、ヤロウィア・リポリティカ、クラミドモナス・ラインハーディー、ピキア・パストリス、コリネバクテリウム、アスペルギルス・ニガー、ネウロスポラ・クラッサ、アラブドプシス・サリアナ、ソラナム・ツベローサム、ソラナム・フレジャ、オリザ・サティバ、グリシンマックス、アマランサス・ツベルクラタス、リナム・ウシタチッシマム、およびジーメイズからなる群から選択される１つまたは複数の種の細胞である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
５．前記細胞が、ヤロウイア・リポリティカである、前記実施形態のいずれか記載の方法または細胞。
６．前記細胞が、サッカロマイセス・セレビシエではない酵母細胞である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
７．植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＤＮＡカッターおよび修飾されたＧＲＯＮに暴露することを含む、方法。
８．ＤＮＡカッターおよび修飾されたＧＲＯＮを含む植物細胞。
９．植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＤＮＡカッターと、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むＧＲＯＮと、に暴露することを含む、方法。
１０．ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはタンパク質を含むＤＮＡカッターを含む植物細胞。
１１．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置で、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基で、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が、前記細胞を修飾されたＧＲＯＮに暴露することを含む、方法。
１２．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置で、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基で、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が、前記細胞をＤＮＡカッターおよび修飾されたＧＲＯＮに暴露することを含む、方法。
１３．植物または植物細胞を生成するための方法であって、植物細胞中に、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴヌクレオベース（ＧＲＯＮ）を導入して、ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むＡＣＣａｓｅタンパク質を発現するＡＣＣａｓｅ遺伝子を有する植物細胞を生成することを含む、方法。
１４．植物または植物細胞を生成するための方法であって、植物細胞中に、ＤＮＡカッターと、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴヌクレオベース（ＧＲＯＮ）と、を導入して、ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むＡＣＣａｓｅタンパク質を発現するＡＣＣａｓｅ遺伝子を有する植物細胞を生成することを含む、方法。
１５．ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく２０７８位に、またはアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）パラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むタンパク質をコードするＡＣＣａｓｅ遺伝子を含む、稔性植物。
１６．ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく２０７８位に、またはアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）パラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むタンパク質をコードするＡＣＣａｓｅ遺伝子を含む、稔性イネ植物。
１７．ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく２０７８位に、またはアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）パラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むタンパク質をコードするＡＣＣａｓｅ遺伝子を含み、ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むタンパク質をコードするＡＣＣａｓｅ遺伝子をさらに含む、植物細胞。
１８．ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく２０７８位に、またはアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）パラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むタンパク質をコードするＡＣＣａｓｅ遺伝子を含み、ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）パラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むタンパク質をコードするＡＣＣａｓｅ遺伝子をさらに含む、稔性植物。
１９．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく２０７８位で、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基で、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が、前記細胞を修飾されたＧＲＯＮに暴露することを含む、方法。
２０．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく２０７８位で、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基で、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が、前記細胞をＤＮＡカッターおよび修飾されたＧＲＯＮに暴露することを含む、方法。
２１．アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の前記突然変異または変化が、存在する場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからアラニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからロイシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからメチオニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからアスパラギン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからセリン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからトレオニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからバリン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８３位に対応する位置のグリシンからシステイン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８６位に対応する位置のアラニンからプロリン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からグリシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からリシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からトレオニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０７９位に対応する位置のセリンからフェニルアラニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８０位に対応する位置のリシンからグルタミン酸；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからフェニルアラニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからグリシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからヒスチジン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからリシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからロイシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからアスパラギン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからプロリン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからグルタミン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからアルギニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからセリン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからトレオニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからバリン；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからトリプトファンからなる群から選択される１つまたは複数を含むアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質をもたらす、前記実施形態のいずれかに記載の方法、植物または細胞。
２２．前記植物または細胞が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからアラニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからロイシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからメチオニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからアスパラギン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからセリン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからトレオニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからバリン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８３位に対応する位置のグリシンからシステイン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１７８６位に対応する位置のアラニンからプロリン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からグリシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からリシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からトレオニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０７９位に対応する位置のセリンからフェニルアラニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８０位に対応する位置のリシンからグルタミン酸；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからフェニルアラニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからグリシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからヒスチジン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからリシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからロイシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからアスパラギン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからプロリン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからグルタミン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからアルギニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからセリン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからトレオニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからバリン；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２０８８位に対応する位置のシステインからトリプトファンからなる群から選択される１つまたは複数を含むアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質を含む、前記実施形態のいずれかに記載の植物もしくは細胞、または前記実施形態に記載の方法のいずれかにより作製された植物もしくは植物細胞。
２３．前記植物または植物細胞が、ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含む、前記実施形態のいずれかに記載の植物もしくは細胞、または前記実施形態に記載の方法のいずれかにより作製された植物もしくは細胞。
２４．前記植物または細胞が、ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく２０７８位に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含み、ノスズメノテッポウ参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子をさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の植物もしくは細胞、または前記実施形態に記載の方法のいずれかにより作製された植物もしくは細胞。
前記ＡＣＣａｓｅの実施形態１１〜２４のそれぞれにおいて、方法、植物、細胞、または別のもののいずれでも、以下のものがその中での使用のための適切な突然変異である。
Figure 2019506170
Figure 2019506170
代替的な突然変異としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2019506170
実施形態１１〜２４に関して、ノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１ｍ、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、および２０８０に対応する位置は、当該技術分野で周知であり、適切な配列データベースから即座に入手可能である。例として、以下の表は、イネＡＣＣａｓｅ配列中の対応する位置を示す：
Figure 2019506170
 Ａｍ：アロペキュラス・ミオスロイデス；ＯｓＩ：オリザ・サティバ・インディカ変種；ＯｓＪ：オリザ・サティバ・ジャポニカ変種

２５．突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物または植物細胞を生成する方法であって、植物細胞中に、５−エノールピルビルシキマート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴヌクレオベース（ＧＲＯＮ）を導入して、大腸菌参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列の番号付けに基づく９６、９７および１０１からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはＥＰＳＰＳパラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現するＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物細胞を生成することを含む、方法。
２６．突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物または植物細胞を生成する方法であって、植物細胞中に、ＤＮＡカッターと、５−エノールピルビルシキマート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴヌクレオベース（ＧＲＯＮ）と、を導入して、大腸菌参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列の番号付けに基づく９６、９７および１０１からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはＥＰＳＰＳパラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現するＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物細胞を生成することを含む、方法。
２７．突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物または細胞であって、植物細胞中に、ＤＮＡカッターと、５−エノールピルビルシキマート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴヌクレオベース（ＧＲＯＮ）と、を導入して、大腸菌参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列の番号付けに基づく９６、９７および１０１からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはＥＰＳＰＳパラログ中の類似アミノ酸残基に、突然変異を含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現するＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物細胞を生成する方法により作製される、植物または細胞。
２８．植物または植物細胞が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の９６位に対応する位置のグリシンからアラニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１０１位に対応する位置のプロリンからアラニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１０１位に対応する位置のプロリンからセリン；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１０１位に対応する位置のプロリンからトレオニンからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置の突然変異を含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現する、前記実施形態のいずれかに記載の植物もしくは細胞、または前記実施形態に記載の方法のいずれかにより作製された植物もしくは細胞。
２９．植物または植物細胞が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１０１位に対応する位置のプロリンからアラニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１０１位に対応する位置のプロリンからアラニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１０１位に対応する位置のプロリンからセリン；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１０１位に対応する位置のプロリンからトレオニンからなる群から選択される突然変異の組み合わせを含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現する、前記実施形態のいずれかに記載の植物もしくは細胞、または前記実施形態に記載の方法のいずれかにより作製された植物もしくは細胞。
実施形態２５〜３０に関して、大腸菌参照配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の番号付けに基づく９６、９７および１０１に対応する位置は、当該技術分野で周知であり、適切な配列データベースから即座に入手可能である。例えば、米国特許第８，２６８，６２２号を参照されたい。例として、以下の表は、アマＥＰＳＰＳ配列中の対応する位置を示す：
Figure 2019506170
大腸菌ＥＰＳＰＳ配列は、配列：
ＭＥＳＬＴＬＱＰＩＡＲＶＤＧＴＩＮＬＰＧＳＫＴＶＳＮＲＡＬＬＬＡＡＬＡＨＧＫＴＶＬＴＮＬＬＤＳＤＤＶＲＨＭＬＮＡＬＴＡＬＧＶＳＹＴＬＳＡＤＲＴＲＣＥＩＩＧＮＧＧＰＬＨＡＥＧＡＬＥＬＦＬＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬＡＡＡＬＣＬＧＳＮＤＩＶＬＴＧＥＰＲＭＫＥＲＰＩＧＨＬＶＤＡＬＲＬＧＧＡＫＩＴＹＬＥＱＥＮＹＰＰＬＲＬＱＧＧＦＴＧＧＮＶＤＶＤＧＳＶＳＳＱＦＬＴＡＬＬＭＴＡＰＬＡＰＥＤＴＶＩＲＩＫＧＤＬＶＳＫＰＹＩＤＩＴＬＮＬＭＫＴＦＧＶＥＩＥＮＱＨＹＱＱＦＶＶＫＧＧＱＳＹＱＳＰＧＴＹＬＶＥＧＤＡＳＳＡＳＹＦＬＡＡＡＡＩＫＧＧＴＶＫＶＴＧＩＧＲＮＳＭＱＧＤＩＲＦＡＤＶＬＥＫＭＧＡＴＩＣＷＧＤＤＹＩＳＣＴＲＧＥＬＮＡＩＤＭＤＭＮＨＩＰＤＡＡＭＴＩＡＴＡＡＬＦＡＫＧＴＴＲＬＲＮＩＹＮＷＲＶＫＥＴＤＲＬＦＡＭＡＴＥＬＲＫＶＧＡＥＶＥＥＧＨＤＹＩＲＩＴＰＰＥＫＬＮＦＡＥＩＡＴＹＮＤＨＲＭＡＭＣＦＳＬＶＡＬＳＤＴＰＶＴＩＬＤＰＫＣＴＡＫＴＦＰＤＹＦＥＱＬＡＲＩＳＱＡＡ
を有するＡｒｏＡである。
アマ遺伝子１の配列は、配列：
ＭＡＬＶＴＫＩＣＧＧＡＮＡＶＡＬＰＡＴＦＧＴＲＲＴＫＳＩＳＳＳＶＳＦＲＳＳＴＳＰＰＳＬＫＱＲＲＲＳＧＮＶＡＡＡＡＡＡＰＬＲＶＳＡＳＬＴＴＡＡＥＫＡＳＴＶＰＥＥＶＶＬＱＰＩＫＤＩＳＧＩＶＴＬＰＧＳＫＳＬＳＮＲＩＬＬＬＡＡＬＳＥＧＴＴＶＶＤＮＬＬＮＳＤＤＶＨＹＭＬＧＡＬＫＴＬＧＬＮＶＥＨＳＳＥＱＫＲＡＩＶＥＧＣＧＧＶＦＰＶＧＫＬＡＫＮＤＩＥＬＦＬＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬＴＡＡＶＴＡＡＧＧＮＳＳＹＩＬＤＧＶＰＲＭＲＥＲＰＩＧＤＬＶＶＧＬＫＱＬＧＡＤＶＴＣＳＳＴＳＣＰＰＶＨＶＮＧＱＧＧＬＰＧＧＫＶＫＬＳＧＳＩＳＳＱＹＬＴＡＬＬＭＡＡＰＬＡＬＧＤＶＥＩＥＩＶＤＫＬＩＳＶＰＹＶＤＭＴＬＫＬＭＥＲＦＧＶＡＶＥＨＳＧＳＷＤＲＦＦＶＫＧＧＱＫＹＫＳＰＧＮＡＹＶＥＧＤＡＳＳＡＳＹＦＬＡＧＡＡＩＴＧＧＴＩＴＶＥＧＣＧＴＳＳＬＱＧＤＶＫＦＡＥＶＬＥＫＭＧＡＫＶＩＷＴＥＮＳＶＴＶＴＧＰＰＲＤＡＳＧＲＫＨＬＲＡＶＤＶＮＭＮＫＭＰＤＶＡＭＴＬＡＶＶＡＬＹＡＤＧＰＴＡＩＲＤＶＡＳＷＲＶＫＥＴＥＲＭＩＡＩＣＴＥＬＲＫＬＧＡＴＶＥＥＧＰＤＹＣＩＩＴＰＰＥＫＬＮＩＡＥＩＤＴＹＤＤＨＲＭＡＭＡＦＳＬＡＡＣＡＤＶＰＶＴＩＲＤＰＧＣＴＫＫＴＦＰＤＹＦＥＶＬＥＲＹＴＫＨ
を有するｌｃｌ−ｇ４１４５２＿１３３３である。
アマ遺伝子２の配列は、配列：
ＭＡＱＶＴＫＩＣＧＧＡＮＡＶＡＬＰＡＴＦＧＴＲＲＴＫＳＩＳＳＳＶＳＦＲＳＳＴＳＰＰＳＬＫＱＲＲＬＬＧＮＶＡＡＡＡＡＡＡＰＬＲＩＳＡＳＬＡＴＡＡＥＫＡＳＴＶＰＥＥＩＶＬＱＰＩＫＤＩＳＧＩＶＴＬＰＧＳＫＳＬＳＮＲＩＬＬＬＡＡＬＳＥＧＫＴＶＶＤＮＬＬＮＳＤＤＶＨＹＭＬＧＡＬＫＴＬＧＬＮＶＥＨＳＳＥＱＫＲＡＩＶＥＧＲＧＧＶＦＰＶＧＫＬＧＫＮＤＩＥＬＦＬＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬＴＡＡＶＴＡＡＧＧＮＳＳＹＩＬＤＧＶＰＲＭＲＥＲＰＩＧＤＬＶＶＧＬＫＱＬＧＡＤＶＳＣＳＳＴＳＣＰＰＶＨＶＮＡＫＧＧＬＰＧＧＫＶＫＬＳＧＳＩＳＳＱＹＬＴＡＬＬＭＡＡＰＬＡＬＧＤＶＥＩＥＩＶＤＫＬＩＳＶＰＹＶＤＭＴＬＫＬＭＥＲＦＧＶＡＶＥＨＳＧＳＷＤＲＦＦＶＫＧＧＱＫＹＫＳＰＧＮＡＹＶＥＧＤＡＳＳＡＳＹＦＬＡＧＡＡＩＴＧＧＴＩＴＶＥＧＣＧＴＳＳＬＱＧＤＶＫＦＡＥＶＬＥＫＭＧＡＫＶＴＷＴＥＴＳＶＴＶＴＧＰＰＲＤＡＳＧＫＫＨＬＲＡＶＤＶＮＭＮＫＭＰＤＶＡＭＴＬＡＶＶＡＬＹＡＤＧＰＴＡＩＲＤＶＡＳＷＲＶＫＥＴＥＲＭＩＡＶＣＴＥＬＲＫＬＧＡＴＶＥＥＧＰＤＹＣＩＩＴＰＰＥＫＬＳＩＡＥＩＤＴＹＤＤＨＲＭＡＭＡＦＳＬＡＡＣＡＤＶＰＶＴＩＲＤＰＧＣＴＫＫＴＦＰＤＹＦＥＶＬＥＲＹＴＫＨ
を有するｌｃｌ−ｇ４０５４７＿１２７１である。
３０．前記ＤＮＡカッターが、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガー、メガヌクレアーゼ、およびＤＮＡ切断性抗生物質から選択される１つまたは複数である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
３１．前記ＤＮＡカッターが、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
３２．前記ＤＮＡカッターが、ＣＲＩＳＰＲである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
３３．前記ＤＮＡカッターが、ＴＡＬＥＮである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
３４．前記ＤＮＡカッターが、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシンおよびペプレオマイシンからなる群から選択される１つまたは複数のＤＮＡ切断性抗生物質である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
３５．前記ＤＮＡカッターが、ゼオシンである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
３６．前記ＧＲＯＮが、一本鎖である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
３７．該ＧＲＯＮが、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
３８．該ＧＲＯＮが、５’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
３９．該ＧＲＯＮが、３’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
４０．該ＧＲＯＮが、５’および３’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
４１．該ＧＲＯＮが、Ｃｙ３基、３ＰＳ基、ｉｄＣ基、および２’−Ｏ−メチル基から選択される１つまたは複数を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
４２．該ＧＲＯＮが、Ｃｙ３基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
４３．該ＧＲＯＮが、２個以上のＣｙ３基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
４４．該ＧＲＯＮが、５’末端の第１の（最後の）塩基にＣｙ３基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
４５．該ＧＲＯＮが、５’末端の第１の（最後の）塩基にｉｄＣ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
４６．該ＧＲＯＮが、３’末端の第１の（最後の）塩基にＣｙ３基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
４７．該ＧＲＯＮが、３’末端の第１の（最後の）塩基にｉｄＣ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
４８．該ＧＲＯＮが、３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
４９．該ＧＲＯＮが、２個以上の３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
５０．該ＧＲＯＮが、３個以上の３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
５１．該ＧＲＯＮが、５’末端の第１の（最後の）塩基に３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
５２．該ＧＲＯＮが、５’末端の第２の（最後から２番目の）塩基に３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
５３．該ＧＲＯＮが、５’末端の第３の（最後から３番目の）塩基に３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
５４．該ＧＲＯＮが、３’末端の第１の（最後の）塩基に３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
５５．該ＧＲＯＮが、３’末端の最後に対して第２の（最後から２番目の）塩基に３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
５６．該ＧＲＯＮが、３’末端の最後に対して第３の（最後から３番目の）塩基に３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
５７．該ＧＲＯＮが、５’および３’の両末端の第１の（最後の）塩基に３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
５８．該ＧＲＯＮが、５’および３’の両末端の最初の２つの塩基に３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
５９．該ＧＲＯＮが、５’および３’の両末端の最初の３つの塩基に３ＰＳ基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
６０．該ＧＲＯＮが、２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
６１．該ＧＲＯＮが、２つ以上の２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
６２．該ＧＲＯＮが、５’末端の第１の（最後の）塩基に２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
６３．該ＧＲＯＮが、５’末端の第１の塩基に２’−Ｏ−メチル基を有し、他のいずれの２’−Ｏ−メチル基も有さない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
６４．該ＧＲＯＮが、５’末端の最初の２個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
６５．該ＧＲＯＮが、５’末端の最初の３個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。。
６６．該ＧＲＯＮが、５’末端の最初の４個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
６７．該ＧＲＯＮが、５’末端の最初の５個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
６８．該ＧＲＯＮが、５’末端の最初の６個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
６９．該ＧＲＯＮが、５’末端の最初の７個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
７０．該ＧＲＯＮが、５’末端の最初の８個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
７１．該ＧＲＯＮが、５’末端の最初の９個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
７２．該ＧＲＯＮが、５’末端の最初の１０個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
７３．該ＧＲＯＮが、５’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＲＮＡ塩基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
７４．該ＧＲＯＮが、３’末端の第１の（最後の）塩基に２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
７５．該ＧＲＯＮが、３’末端の第１の塩基に２’−Ｏ−メチル基を有し、他のいずれの２’−Ｏ−メチル基も有さない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
７６．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の２個（最後および最後から２番目）またはより多くの塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
７７．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の３個（最後および最後から２番目および最後から３番目）またはより多くの塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
７８．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の４個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
７９．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の５個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
８０．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の６個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
８１．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の７個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
８２．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の８個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
８３．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の９個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
８４．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の１０個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
８５．該ＧＲＯＮが、３’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＲＮＡ塩基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
８６．前記ＧＲＯＮが、遺伝子変化のための標的配列に対してゆらぎ塩基対を有する、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
８７．前記ＧＲＯＮが、１５〜６０ヌクレオチド長の間である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
８８．前記ＧＲＯＮが、４１ヌクレオチド長である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
８９．前記ＧＲＯＮが、５０〜１１０ヌクレオチド長の間である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
９０．前記ＧＲＯＮが、１０１ヌクレオチド長である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
９１．前記ＧＲＯＮが、１５０〜２１０ヌクレオチド長の間である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
９２．前記ＧＲＯＮが、２０１ヌクレオチド長である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
９３．前記ＧＲＯＮが、７０〜２１０ヌクレオチド長の間である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
９４．前記ＧＲＯＮが、７０ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
９５．前記ＧＲＯＮが、１００ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
９６．前記ＧＲＯＮが、１６５ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
９７．前記ＧＲＯＮが、１７５ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
９８．前記ＧＲＯＮが、１８５ヌクレオチド長より長い前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
９９．前記ＧＲＯＮが、１９５ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１００．前記ＧＲＯＮが、２００ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１０１．前記ＧＲＯＮが、２１０ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１０２．前記ＧＲＯＮが、２２０ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１０３．前記ＧＲＯＮが、２３０ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１０４．前記ＧＲＯＮが、２４０ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１０５．前記ＧＲＯＮが、２５０ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１０６．前記ＧＲＯＮが、２６０ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１０７．前記ＧＲＯＮが、２７０ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１０８．前記ＧＲＯＮが、２８０ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１０９．前記ＧＲＯＮが、２９０ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１１０．前記ＧＲＯＮが、３００ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１１１．前記ＧＲＯＮが、４００ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１１２．前記ＧＲＯＮが、５００ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１１３．前記ＧＲＯＮが、６００ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１１４．前記ＧＲＯＮが、７００ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１１５．前記ＧＲＯＮが、８００ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１１６．前記ＧＲＯＮが、９００ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１１７．前記ＧＲＯＮが、１０００ヌクレオチド長より長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１１８．前記植物が、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、エンドウマメ、ヒヨコマメ、サヤエンドウ、ソラマメ、レンズマメ、カブ、ルタバガ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、フィールドビーン、ポプラ、マツ、ユーカリ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、シバと飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、ホウセンカ、コショウ、ナス、マリーゴールド、スイレン、キャベツ、ヒナギク、カーネーション、チューリップ、アイリス、およびユリからなる群から選択される、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１１９．前記植物が、キャノーラである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１２０．前記植物が、コーンである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１２１．前記植物が、トウモロコシである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１２２．前記植物が、イネである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１２３．前記植物が、モロコシである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１２４．前記植物が、ジャガイモである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１２５．前記植物が、ダイズである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１２６．前記植物が、アマである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１２７．前記植物が、ナタネである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１２８．前記植物が、キャッサバである前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１２９．前記植物が、ヒマワリである、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１３０．植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＣＲＩＳＰＲおよび修飾されたＧＲＯＮに暴露することを含む、方法。
１３１．複数の遺伝子変化が、生じる、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１３２．２つ以上のガイドＲＮＡが、使用される、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１３３．１より多いガイドＲＮＡのそれぞれが、遺伝子変化のための異なる標的と相補的である、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１３４．該ＣＲＩＳＰＲが、ニッカーゼを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１３５．該ＤＮＡカッターが、２つ以上のニッカーゼを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１３６．２つ以上のニッカーゼが、標的核酸配列の相対する鎖上を切断する、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１３７．２つ以上のニッカーゼが、標的核酸配列の同じ鎖上を切断する、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１３８．該ＧＲＯＮが、３’末端の第１の（最後の）塩基に２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１３９．該ＧＲＯＮが、３’末端の第１の（最後の）塩基に２’−Ｏ−メチル基を有し、他のいずれの２’−Ｏ−メチル基も有さない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１４０．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の２個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１４１．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の３個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１４２．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の４個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１４３．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の５個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１４４．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の６個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１４５．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の７個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１４６．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の８個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１４７．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の９個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１４８．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の１０個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１４９．該ＧＲＯＮが、３’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＲＮＡ塩基を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１５０．該ＧＲＯＮが、３’末端の第１の（最後の）塩基に２’−Ｏ−メチル基を含まない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１５１．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の２個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含まない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１５２．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の３個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含まない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１５３．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の４個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含まない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１５４．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の５個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含まない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１５５．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の６個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含まない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１５６．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の７個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含まない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１５７．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の８個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含まない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１５８．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の９個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含まない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１５９．該ＧＲＯＮが、３’末端の最初の１０個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含まない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１６０．該ＧＲＯＮが、３’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＲＮＡ塩基を含まない、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞。
１６１．前記実施形態のいずれか１つに記載の方法により作製された、または細胞に由来する、非トランスジェニック除草剤抵抗性または耐性植物。
１６２．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の遺伝子変化または突然変異を有し、オオムギ、トウモロコシ、キビ、オートムギ、ライムギ、イネ、モロコシ、サトウキビ、シバ、およびコムギからなる群から選択される、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１６３．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の遺伝子変化または突然変異を有し、１種または複数の除草剤に対して抵抗性または耐性がある、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１６４．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の遺伝子変化または突然変異を有し、１種または複数のＡＣＣａｓｅ阻害性除草剤に対して抵抗性がある、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１６５．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の遺伝子変化または突然変異を有し、アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−Ｐ、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップ−Ｐ、ハロキシホップ、ハロキシホップ−Ｐ、イソキサピリホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ−Ｐ、トリホップ、ピノキサデン、これらの除草剤のいずれかの農学的に許容できる塩およびエステル、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される１種または複数の除草剤に対して抵抗性がある、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１６６．前記植物細胞が、５−エノールピルビルシキマート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、前記植物細胞が、コーン、コムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、オートムギ、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、キャノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウマメ、レンズマメ、ブドウおよびシバからなる群から選択される、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１６７．前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキマート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞が、少なくとも１種の除草剤に対して抵抗性がある、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１６８．前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキマート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞が、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対して抵抗性がある、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１６９．前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキマート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞が、グリホサートに対して抵抗性がある、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１７０．前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキマート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞が、コーン、コムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、オートムギ、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、テンサイ、ナタネ、キャノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウマメ、レンズマメ、ブドウおよびシバからなる群から選択される、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１７１．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の１個の対立遺伝子で起こる、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１７２．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の２個の対立遺伝子で起こる、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１７３．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の３個の対立遺伝子で起こる、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１７４．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の４個の対立遺伝子で起こる、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１７５．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の対立遺伝子で起こる、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１７６．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の１個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１７７．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の２個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１７８．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の３個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１７９．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の４個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１８０．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１８１．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の１個の対立遺伝子で起こり、該遺伝子の第２の対立遺伝子が、該第２の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１８２．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の１個の対立遺伝子で起こり、該遺伝子の第２の対立遺伝子および第３の対立遺伝子が、前記第２の対立遺伝子および前記第３の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１８３．該細胞における遺伝子変化または突然変異が、該遺伝子の１個の対立遺伝子で起こり、該遺伝子の第２の対立遺伝子、第３の対立遺伝子、および第４の対立遺伝子が、前記第２の対立遺伝子、前記第３の対立遺伝子、および前記第４の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１８４．該細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異および別の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１８５．該細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異および少なくとも１個の他の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１８６．該細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異および少なくとも２個の他の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１８７．該細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異および少なくとも３個の他の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
１８８．該細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異および他の全ての対立遺伝子中のノックアウトを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
実施例
以下のものは実施例であり、本明細書に記載される方法および組成物を実践する手順を説明するものである。これらの実施例は限定的なものであると解釈されるべきではない。
実施例１：ＧＲＯＮの長さ
Ｓｏｍｍｅｒら（Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：１１５−２２，２００６）は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）バリアントの青色と緑色の蛍光を変換する単一ヌクレオチド変化に依存するｖｉｖｏの遺伝子変換の検出のためのレポータ系について記載している。ＧＲＯＮ媒介性変換の効率を評価するため、このレポータ系をシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）をモデル種に用いた以下の実験に適合させた。
簡潔に述べれば、この実施例およびそれに続く実施例のために、当業者に公知の方法（例えば、ＣｌｏｕｇｈおよびＢｒｅｎｔ，１９９８を参照されたい）により、複数コピーの青色蛍光タンパク質遺伝子を有するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）系列を作製した。この系列で根由来分裂組織の培養物を樹立し、これをプロトプラストの単離および培養に用いた（例えば、Ｍａｔｈｕｒら，１９９５を参照されたい）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介するプロトプラスト内へのＧＲＯＮ取込みによりプロトプラスト内へのＧＲＯＮ送達を実施した。ＦｕｊｉｗａｒａおよびＫａｔｏ（２００７）により記載されているものと同様に９６ウェルディッシュフォーマットからなる方法を用いた。そのプロトコルを以下で簡潔に説明する。記載される体積は、９６ウェルディッシュの個々にウェルに適用されるものである。
１．ＧＲＯＮ（８０μＭ）６．２５μｌと５×１０６細胞／ｍｌのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰトランスジェニック根分裂組織由来プロトプラスト２５μｌを９６ウェルプレートの各ウェル内で混合する。
２．４０％ＰＥＧ溶液３１．２５μｌを加え、プロトプラストをかき混ぜた。
３．処理した細胞を氷上で３０分間インキュベートした。
４．各ウェルにＷ５溶液２００μｌを加え、細胞をかき混ぜた。
５．プレートを氷上で３０分間インキュベートしてプロトプラストを各ウェルの底に沈降させた。
６．沈降したプロトプラストの上にある培地２００μｌを除去した。
７．培地（ＭＳＡＰ、Ｍａｔｈｕｒら，１９９５を参照されたい）８５μｌを加えた。
８．プレートを室温、暗所にて４８時間インキュベートした。培地添加後のＧＲＯＮの最終濃度は８μＭである。
一般に、緑色および黄色の蛍光がＢＦＰ標的ＤＮＡを変化させない非標的化ＧＲＯＮで処理される対照プロトプラストのものと異なるプロトプラストを検出するため、ＧＲＯＮ送達から４８時間後に試料をフローサイトメトリーにより解析した。標的化ＧＲＯＮで処理した試料には、遺伝子編集によりＢＦＰ遺伝子に導入するとＧＦＰが合成される単一のＣ−Ｔ間のヌクレオチドの差（コード鎖）またはＧ−Ａ間のヌクレオチドの差（非コード鎖）がみられる。
青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）遺伝子から緑色蛍光への変換のために設計した例示的１０１量体および２０１量体ＢＦＰ４／ＮＣ ５’−３ＰＳ／３’−３ＰＳ ＧＲＯＮの配列を表１に示す。「３ＰＳ」は、５’および３’オリゴ末端それぞれの３ホスホチオアート結合を表す。
Figure 2019506170
 ＊＝ＰＳ結合（ホスホチオアート）
実施例２：５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮを用いた変換率
この一連の実験の目的は、ホスホチオアート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮ（ＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ部分を有する）と５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮの効率を比較することである。５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮは５’Ｃｙ３フルオロフォア（アミダイト）および３’ｉｄＣ逆塩基を有する。青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）から緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）への変換を用いて効率を評価した。
個々のＦａｌｃｏｎチューブ（「Ｔｕｂｅｓ」と標示）また９６ウェルプレート（「９６ウェルディッシュ」と標示）でプロトプラスト内へのＧＲＯＮのＰＥＧ送達により実施した全３種類の実験では全般的に、特に９６ウェルプレート法を用いた場合、サイトメトリーによる測定で、化学的性質の異なるＧＲＯＮ間にＢＦＰからＧＦＰへの変換効率の有意な差はみられなかった（図１）。
実施例３：４１量体ＢＦＰ４／ＮＣ ５’−３ＰＳ／３’−３ＰＳ ＧＲＯＮと２’−Ｏ−Ｍｅ ＧＲＯＮとの間の比較
この一連の実験の目的は、ＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ部分を有するホスホチオアート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮと２’−Ｏ−Ｍｅまたは「２ＯＭｅ」の変換効率を、ブレオマイシンファミリーのメンバーでありＤＮＡ切断を引き起こすＺｅｏｃｉｎ（商標）の存在下および不在下で比較することである。これらのＧＲＯＮの設計を図２に示す。ＰＥＧ処理によりＧＲＯＮをシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰプロトプラスト内に送達し、処理から２４時間後、ＢＦＰからＧＦＰへの変換をサイトメトリーにより求めた。Ｚｅｏｃｉｎ（１ｍｇ／ｍｌ）で処理する試料は、ＰＥＧ処理の前に氷上で９０分間、Ｚｅｏｃｉｎとインキュベートした。
全般的に、Ｚｅｏｃｉｎ（１ｍｇ／ｍｌ）の存在により、サイトメトリーにより求められるＢＦＰからＧＦＰへの変換が増大した（表３）。Ｚｅｏｃｉｎの存在下でも不在下でも、ＧＲＯＮの５’末端の１番目のＲＮＡ塩基に２’−ＯＭｅ基を１つ含むＮＣ ２ＯＭｅ ＧＲＯＮの方が、最初の９つの５’ＲＮＡ塩基にそれぞれ２’−ＯＭｅ基を１つ含むＮＣ ２ＯＭｅ ＧＲＯＮと比較して、ＢＦＰからＧＦＰに変換高する効果が高かった（図２および表３）。
いずれの実験でも、１ｍｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎの存在下、不在下ともに、４１量体ＢＦＰ４／ＮＣ ５’３ＰＳ／３’３ＰＳと、１番目の５’ＲＮＡ塩基に５’２’−ＯＭｅ基を１つ含む７１量体２ＯＭｅ ＢＦＰ４／ＮＣ ＧＲＯＮ（ＢＦＰ４ ７１量体（１）ＮＣと表される）との間に、サイトメトリーにより求められるＢＦＰからＧＦＰへの変換の有意な差はみられなかった（図２および表３）。Ｚｅｏｃｉｎ（ならびにブレオマイシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよびこの抗生物質ファミリーの他のメンバーで予想される）の存在下では、この変換が鎖依存性になる（つまり、上記の実験で試験した設計を有するコード（Ｃ）ＧＲＯＮと非コード（ＮＣ）ＧＲＯＮはともに活性がほぼ等しい）ことに留意することが重要である。
Figure 2019506170
実施例４：４１量体、１０１量体および２０１量体のＢＦＰ４／ＮＣ ５’−３ＰＳ／３’−３ＰＳ ＧＲＯＮの比較
この一連の実験の目的は、異なる長さの、つまり、表２に示す４１量体、１０１量体および２０１量体のＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ部分を有するホスホチオアート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮの変換効率を（Ｚｅｏｃｉｎの存在下および不在下で）比較することとした。ここでも、Ｚｅｏｃｉｎ（１ｍｇ／ｍｌ）の存在により、サイトメトリーにより求められるＢＦＰからＧＦＰへの変換率が増大した（表４）。全３種類の実験全体の傾向として、Ｚｅｏｃｉｎの存在下、不在下ともにＮＣ ＧＲＯＮの長さの増大との線形関係がみられた。Ｚｅｏｃｉｎ存在下でのＢＦＰ−４／ＮＣ／１０１およびＢＦＰ−４／Ｃ／１０１を除けば、これは、４１量体ＮＣ ＧＲＯＮとほぼ等しいがこれより低い変換率であった。
Figure 2019506170
実施例５：植物内へのＣａｓ９タンパク質の送達
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現プラスミドの送達に代わるものとして植物細胞への組換えＣａｓ９タンパク質の直接送達を利用する。この方法は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）などの担体、トランスフェクションリポソーム試薬、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、エレクトロポレーションを単独で、または組み合わせて用い、細胞への活性な組換えＣａｓ９タンパク質の送達を可能にするものである。
方法
誘導した根組織に由来するＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種する。次いで、蛍光タグで標識した組換えＣａｓ９タンパク質（１μｇ）を２０：１、１０：１または５：１のＣＰＰおよびその他のＣＰＰとカーゴの比（例えば、ＴＡＴ、ペネトラチン、Ｃｈａｒｉｏｔ（商標）、ＰＥＰ−１またはその他のもの）でプレコートしたもの、あるいは同タンパク質をリポソーム試薬で封入したものを播種したプロトプラストと混合し、２３℃で２〜６時間インキュベートして、Ｃａｓ９／担体複合体を細胞に浸透させる。別の一連の処理では、ＰＥＧまたはエレクターポレーション（ｅｌｅｃｔｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）法を用いて、蛍光タグで標識し上記のようにＣＰＰでプレコートした組換えＣａｓ９タンパク質（１μｇ）またはコートしなかった同タンパク質をプロトプラストに導入する。次いで、処理から２４〜７２時間後、所与の処理内でのＣａｓ９陽性プロトプラストの割合を求めるため、プロトプラストをフローサイトメトリーにより解析した。
実施例６：ＣＲＩＳＰＲと２０１量体±ゆらぎ塩基ＧＲＯＮ
この一連の実験の目的は、ｂｆｐ遺伝子に標的化二本鎖切断を生じさせるＣＲＩＳＰＲおよび変換を媒介する２０１量体ＧＲＯＮを用いて、本発明者らのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰトランスジェニックモデル系でのＢＦＰからＧＦＰへの変換を示すことである。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲはｂｆｐ遺伝子のコード鎖を標的とし、変換部位はＰＡＭ配列の２７ｂｐ上流である（図３）。ＧＲＯＮは、ＣＲＩＳＰＲにより生じたｂｆｐ遺伝子の二本鎖切断を修復するための鋳型として用いられ、標的遺伝子をＢＦＰからＧＦＰに変換するとともに、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列に対応するｂｆｐ遺伝子にゆらぎ塩基を導入する。変換が起こった後、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列内のゆらぎ塩基がＣＲＩＳＰＲによるｂｆｐ遺伝子の再切断を最小限に抑える。この一連の実験は、変換されたｂｆｐ遺伝子のＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列内にゆらぎ塩基を導入することにより変換効率が増大するかどうかという問題に取り組む一助となる。
方法
誘導した根組織に由来するＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種した。ＣＲＩＳＰＲがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するマンノピン合成酵素（ＭＡＳ）プロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、またｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナＵ６プロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ＣＲＩＳＰＲプラスミドおよびＧＲＯＮをそれぞれ最終濃度０．０５μｇ／μｌおよび０．１６μＭでＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入した。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を求めるため、それをフローサイトメータにより解析した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じプラスミドから発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている（図３）。ＢＦＰを標的とし、ゆらぎ塩基を有する、または有さない２０１量体ＧＲＯＮを用いて、それがＢＦＰからＧＦＰへの変換率に及ぼす効果を明らかにした。表５にＧＲＯＮおよびそれに対応する配列のリストを記載する。
Figure 2019506170
結果
ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを用いると、ゆらぎ塩基を有するＢＦＰ４／Ｃ ＧＲＯＮは、ゆらぎ塩基のないＢＦＰ４／Ｃ ＧＲＯＮと比較してＢＦＰからＧＦＰへの変換に対する効果が最大３．５倍になる（表６）。ゆらぎ塩基を有するＢＦＰ４／ＮＣ ＧＲＯＮの代わりにゆらぎ塩基を有するＢＦＰ４／Ｃ ＧＲＯＮを用いると、ＢＦＰからＧＦＰへの変換が最大５．９倍になる（表６）。したがって、ゆらぎ塩基を有するＢＦＰ４／Ｃ ＧＲＯＮは、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲとともに用いたときにＢＦＰからＧＦＰへの変換に対する効果が最大となる。
結論
変換された標的遺伝子のＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列を変化させるＧＲＯＮにゆらぎ塩基が含まれていると、ＢＦＰからＧＦＰへの変換が増大する。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲとゆらぎ塩基ＧＲＯＮによるＢＦＰからＧＦＰへの変換が次世代シーケンシングにより確認された（データ不掲載）。さらに、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲはＤＮＡを切断し、ｂｆｐ遺伝子にインデルを生じさせることが可能であることが、次世代シーケンシングにより確認された（データ不掲載）。
Figure 2019506170
実施例７：ＣＲＩＳＰＲとＣｙ３修飾ＧＲＯＮ
この一連の実験の目的は、ｂｆｐ遺伝子に標的化二本鎖切断を生じさせるＣＲＩＳＰＲおよび変換を媒介するＧＲＯＮを用いて、本発明者らのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰトランスジェニックモデル系でのＢＦＰからＧＦＰへの変換を示すことである。これらの実施例に用いたＢＦＰ６ ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲ：ＢＦＰ６）は、ｂｆｐ遺伝子を標的とし、ＤＮＡの変換部位付近に二本鎖切断を引き起こす。ＢＦＰ６ ＣＲＩＳＰＲとともに用いたＧＲＯＮは、変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列を含み、５’末端がＣｙ３で、また３’末端がｉｄＣ逆塩基で標識されており、本明細書ではＣｙ３ ＧＲＯＮと呼ばれる。これらのＧＲＯＮを４１量体、１０１量体および２０１量体の異なる長さで試験し、ＧＲＯＮの５’末端および３’末端の両方に３つのホスホチオアート結合を有する点でのみＣｙ３ ＧＲＯＮと異なる３ＰＳ ＧＲＯＮと直接比較する。これらのＧＲＯＮは本明細書では３ＰＳ ＧＲＯＮと呼ばれる。これらの実験に使用したＧＲＯＮのリストについては表７を参照されたい。
方法
誘導した根組織に由来するＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種した。ＣＲＩＳＰＲがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、またｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ＣＲＩＳＰＲプラスミドおよびＧＲＯＮを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌ、ＧＲＯＮについては４１量体が８．０μＭ、１０１量体が０．３２μＭ、２０１量体が０．１６μＭの最終濃度になるようＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入した。ＧＲＯＮ処理単独では、ＰＥＧ送達後の最終ＧＲＯＮ濃度を４１量体が８．０μＭ、１０１量体が５．０μＭ、２０１量体が２．５μＭになるようにした。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を求めるため、それをフローサイトメータにより解析した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じプラスミドから発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。この実験では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰ６ ＣＲＩＳＰＲ（５’ＧＧＴＧＣＣＧＣＡＣＧＴＣＡＣＧＡＡＧＴＣＧＧ３’）を用いた。ＧＲＯＮは変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列を含む。表７に、使用したＧＲＯＮのリストを記載する。
Figure 2019506170
結果
ＢＦＰ６ ＣＲＩＳＰＲを用いると、試験したいずれの長さのＣｙ３ ＧＲＯＮも、全般的に３ＰＳ ＧＲＯＮと同等の効率でＢＦＰからＧＦＰへの変換を媒介することができる（図４）。全体的にみると、ＢＦＰ６ ＣＲＩＳＰＲとＧＲＯＮを含有する試料は、ＢＦＰからＧＦＰへの変換のレベルがＧＲＯＮのみの試料と比較して高く（図４）、ＣＲＩＳＰＲが変換率の増大に正の効果を及ぼすことがわかる。
実施例８：ＣＲＩＳＰＲと様々な大きさのＧＲＯＮ
この一連の実験の目的は、ｂｆｐ遺伝子に標的化二本鎖切断を生じさせるＣＲＩＳＰＲおよび変換を媒介する様々な長さのＧＲＯＮを用いて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰトランスジェニックモデル系でのＢＦＰからＧＦＰへの変換を示すことである。これらの実施例に用いたＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲは、ｂｆｐ遺伝子を標的とし、ＤＮＡの変換部位付近に二本鎖切断を引き起こす。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲとともに用いたＧＲＯＮは、変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列を含み、５’末端および３’末端の両方が３つのホスホチオアート結合で標識されており、本明細書では３ＰＳ ＧＲＯＮと呼ばれる。これらのＧＲＯＮを６０量体、１０１量体および２０１量体の３つの異なる長さで試験し、ＧＲＯＮ単独処理と直接比較する。これらの実施例に使用したＧＲＯＮについては表８を参照されたい。
方法
誘導した根組織に由来するＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種した。ＣＲＩＳＰＲがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、またｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ＣＲＩＳＰＲプラスミドおよびＧＲＯＮを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌ、ＧＲＯＮについては６０量体が０．５４７μＭ、１０１量体が０．３２μＭ、２０１量体が０．１６μＭの最終濃度になるようＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入した。ＧＲＯＮ処理単独では、ＰＥＧ送達後の最終ＧＲＯＮ濃度を６０量体が７．５μＭ、１０１量体が５．０μＭ、２０１量体が２．５μＭになるようにした。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を求めるため、それをフローサイトメトリーにより解析した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じプラスミドから発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列は５’ＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＴ３’である。この実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを用いた。ＧＲＯＮは変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列を含む。表８に、使用したＧＲＯＮのリストを記載する。
Figure 2019506170
結果
ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを用いると、長さ１０１ｎｔ以上のＧＲＯＮは、長さ６０ｎｔのＧＲＯＮと直接比較した場合、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の仲介に優れている（図５）。全体的にみると、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲとＧＲＯＮを含有する試料は、ＢＦＰからＧＦＰへの変換のレベルがＧＲＯＮのみの試料と比較して高く（図５）、ＣＲＩＳＰＲが変換率の増大に正の効果を及ぼすことがわかる。このデータからさらに、ＣＲＩＳＰＲとともに用いる場合、ＢＦＰからＧＦＰへの変換を媒介する効果が最も高いＧＲＯＮの長さを１０１ｎｔ以上の長さにする必要があることがわかる。
実施例９：ＣＲＩＳＰＲと２’−Ｏ−Ｍｅ ＧＲＯＮ
これらの実験の目的は、ｂｆｐ遺伝子に標的化二本鎖切断を生じさせるＣＲＩＳＰＲおよび変換を媒介するＧＲＯＮを用いて、本発明者らのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰトランスジェニックモデル系でのＢＦＰからＧＦＰへの変換を示すことである。この実施例に用いたＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲは、ｂｆｐ遺伝子を標的とし、ＤＮＡの変換部位付近に二本鎖切断を引き起こす。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲとともに用いたＧＲＯＮは、変換部位のｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード配列を含み、ＧＲＯＮの最初の１０個の５’塩基がＤＮＡ塩基の代わりにＲＮＡ塩基になっている。これらのＲＮＡは、図６に示されるように、１番目の５’ＲＮＡ塩基または最初の９つの５’ＲＮＡ塩基が２’−Ｏ−Ｍｅ基（１つまたは複数）で標識されている。これらのＧＲＯＮは、本明細書では２’−Ｏ−Ｍｅ ＧＲＯＮと呼ばれ、これらを、ＤＮＡ塩基を含みＧＲＯＮの５’末端および３’末端の両方に３つのホスホチオアートを有するほぼ同じ長さの３ＰＳ ＧＲＯＮと直接比較する。これらのＧＲＯＮは、本明細書では３ＰＳ ＧＲＯＮと呼ばれる。これらの実施例に使用したＧＲＯＮのリストについては表９を参照されたい。
方法
誘導した根組織に由来するＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種した。ＣＲＩＳＰＲがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、またｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナＵ６プロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ＣＲＩＳＰＲプラスミドおよびＧＲＯＮを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌ、ＧＲＯＮについては７１量体が０．５μＭ、２０１量体が０．１６μＭの最終濃度になるようＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入した。ＧＲＯＮ処理単独では、ＰＥＧ送達後の最終ＧＲＯＮ濃度を７１量体が５．０μＭ、２０１量体が２．５μＭになるようにした。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を求めるため、それをフローサイトメータにより解析した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じプラスミドから発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列は５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’である。この実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを用いた。ＧＲＯＮは、変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード配列を含む。表９に、使用したＧＲＯＮのリストを示す。
Figure 2019506170
結果
７１量体および２０１量体の２’−Ｏ−Ｍｅ ＧＲＯＮは、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを用いて（０）、（１）または（９）の各種異なるタイプのＧＲＯＮ保護と比較したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの変換が同程度であった（図７および８）。２’−Ｏ−Ｍｅ ＧＲＯＮは、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを用いたＢＦＰからＧＦＰへの変換を媒介する効果が、その３ＰＳ ＧＲＯＮ対応物より高い（図７および８）。
実施例１０：ＣＲＩＳＰＲニッカーゼとＧＲＯＮ導入
この実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子に標的化一本鎖ニックを生じさせるＣＲＩＳＰＲおよび変換を媒介するＧＲＯＮを用いて、本発明者らのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰトランスジェニックモデル系でのＢＦＰからＧＦＰへの変換を示すことである。この実施例に用いるＢＦＰ１ ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲ：ＢＦＰ１）は、ｂｆｐ遺伝子を標的とし、ガイドＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖または非相補的なＤＮＡ鎖それぞれのｂｆｐ遺伝子の変換部位付近のＤＮＡに一本鎖ニックを引き起こす触媒残基の変異（ＲｕｖＣのＤ１０ＡおよびＨＮＨのＨ８４０Ａ）を含む。これらのＣＲＩＳＰＲは、本明細書ではＢＦＰ１ ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＤ１０ＡおよびＢＦＰ１ ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＨ８４０Ａと呼ばれ、別個のプラスミド上で単独で、またはＢＦＰ５ ｓｇＲＮＡとともに使用される。この実施例で複数のＣＲＩＳＰＲニッカーゼを一緒に用いると、それらは同じＤＮＡ鎖または反対側のＤＮＡ鎖にニックを入れ得る。ともにＤ１０ＡまたはＨ８４０Ａの同じ変異を含むＣａｓ９タンパク質を一緒に用いると、それらは同じ鎖のＤＮＡにニックを入れる。これとは逆に、２種類のＣａｓ９タンパク質を一緒に用い、そのうちの一方がＤ１０Ａ変異を含み、他方がＨ８４０Ａ変異を含む場合、それらはＤＮＡの反対側の鎖にニックを入れる。ニッカーゼＣＲＩＳＰＲとともに用いたＧＲＯＮは、変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード配列を含み、ＢＦＰ５ ＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列内にゆらぎ塩基が１つある。これらのＧＲＯＮは、５’末端および３’末端の両方に３つのホスホチオアート結合を有し、本明細書では３ＰＳ ＧＲＯＮと呼ばれる。これらの実験に使用するＧＲＯＮのリストについては表１０を参照されたい。ニッカーゼＣＲＩＳＰＲを、ｂｆｐ遺伝子のＤＮＡに標的化二本鎖切断を引き起こすことができるそのＣＲＩＳＰＲ対応物と直接比較する。
方法
誘導した根組織に由来するＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種する。ＣＲＩＳＰＲがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、またｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。Ｃａｓ９遺伝子は、触媒残基の変異であるＲｕｖＣのＤ１０ＡまたはＨＮＨのＨ８４０Ａのいずれかを含む。ＣＲＩＳＰＲプラスミドおよびＧＲＯＮを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌ、２０１量体については０．１６μＭの最終濃度になるようＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入する。ＧＲＯＮ処理単独では、２０１量体のＰＥＧ送達後の最終ＧＲＯＮ濃度が２．５μＭになるようにした。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を求めるため、それをフローサイトメータにより解析した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じプラスミドから発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。この実施例では、ｂｆｐ遺伝子の変換部位付近の異なる領域を標的とするＢＦＰ１ ｓｇＲＮＡおよびＢＦＰ５ ｓｇＲＮＡを用いた。ＢＦＰ１スペーサー（５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’）はｂｆｐ遺伝子のコード鎖を標的とし、ＢＦＰ５スペーサー（５’ＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＴ３’）はｂｆｐ遺伝子の非コード鎖を標的とする。ＧＲＯＮは変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード配列を含む。表１０に、使用したＧＲＯＮのリストを示す。
Figure 2019506170
結果
両ＣＲＩＳＰＲニッカーゼ（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）とも、個別に用いる代わりにＢＦＰ１ ＣＲＩＳＰＲおよびＢＦＰ５ ＣＲＩＳＰＲと一緒に用いた場合の方が、ＢＦＰからＧＦＰへの変換を媒介する効率が高い（図９）。さらに、ＢＦＰ１ Ｄ１０Ａ ＣＲＩＳＰＲニッカーゼおよびＢＦＰ５ Ｄ１０Ａ ＣＲＩＳＰＲニッカーゼをＣ／２０１ １Ｗ ＧＲＯＮと一緒に用いると、これらのＣＲＩＳＰＲニッカーゼをＮＣ／２０１ １Ｗ ＧＲＯＮとともに用いた処理と比較してＢＦＰからＧＦＰへの変換が有意に高くなる（図９）。ＢＦＰ１ Ｈ８４０Ａ ＣＲＩＳＰＲニッカーゼおよびＢＦＰ５ Ｈ８４０Ａ ＣＲＩＳＰＲニッカーゼを一緒に用いると、Ｃ／２０１ １Ｗ ＧＲＯＮまたはＮＣ／２０１ １Ｗ ＧＲＯＮとほぼ同じレベルのＢＦＰからＧＦＰへの変換が観察される（図９）。これらのＢＦＰからＧＦＰへの変換のレベルは、ＢＦＰ５ ＣＲＩＳＰＲを単独で用いた場合よりわずかに高く、ＢＦＰ１ ＣＲＩＳＰＲを単独で用いた場合よりわずかに低い（図９）。
実施例１１：ＣＲＩＳＰＲを用いた複数の遺伝子の標的化
この実施例の目的は、標的遺伝子に二本鎖切断を生じさせるＣＲＩＳＰＲおよび変換を媒介するＧＲＯＮを用いて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）モデル系に由来する所与のプロトプラスト集団で複数の遺伝子の変換を同時に示すことである。この実施例に用いたＣＲＩＳＰＲは、Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミド（１つまたは複数）および上記の２つの異なる遺伝子を標的とする複数のｓｇＲＮＡをプロトプラスト内に導入することにより、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ゲノムのＢＦＰおよびアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）の遺伝子をともに標的とする。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。これにより、ＢＦＰ遺伝子およびＡＨＡＳ遺伝子の両方の変換を媒介するＧＲＯＮの存在下で、Ｃａｓ９が両遺伝子に二本鎖切断を引き起こすことが可能になる。
方法
誘導した根組織に由来するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種する。ＣＲＩＳＰＲがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、また複数の異なるｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ＣＲＩＳＰＲプラスミドおよびＧＲＯＮを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌ、２０１量体については０．１６μＭの最終濃度になるようＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入する。ＧＲＯＮ処理単独では、２０１量体のＰＥＧ送達後の最終ＧＲＯＮ濃度が２．５μＭになるようにする。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内でＢＦＰからＧＦＰへの変換およびＡＨＡＳの変換の両方が起こったプロトプラストの割合を求めるため、それぞれフローサイトメータおよびアレル特異的ＰＣＲアッセイにより解析した。
アレル特異的ＰＣＲアッセイでは、ゲノムＤＮＡに相当する５，０００ゲノムの１０〜１６の複製物を一次ＰＣＲ反応に用いた。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じまたは複数のプラスミドから発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。この実施例では、異なるｓｇＲＮＡおよびＧＲＯＮを用いて複数の遺伝子の変換部位、すなわち、ＢＦＰスペーサー（５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’）およびＡＨＡＳスペーサー（５’ＴＧＧＴＴＡＴＧＣＡＡＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＧＣ３’）を標的とする。使用したＧＲＯＮを表１１に記載する。
Figure 2019506170
結果
ＢＦＰおよびＡＨＡＳ ＣＲＩＳＰＲプラスミドならびにＢＦＰ／Ｃ ２０１量体およびＡＨＡＳ（Ｗ）５７４／ＮＣ ２０１量体ＧＲＯＮをシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰトランスジェニック系列内にＰＥＧ送達してから１４４時間後、ＢＦＰからＧＦＰへの変換およびＡＨＡＳの変換を求めた。フローサイトメトリーのデータから，処理１により０．２０％のＢＦＰからＧＦＰへの変換が生じることがわかった（表１２）。アレル特異的ＰＣＲアッセイでは、処理１により０．０１％のＡＨＡＳ変換プロトプラストが得られることがわかった（表１２）。ＧＲＯＮ単独処理は、両アッセイを用いて最小の変換がみられた（表１２）。この実施例は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰモデル系に由来する所与のプロトプラスト集団内で、２つの独立した標的遺伝子（ＢＦＰおよびＡＨＡＳ）を同時に変換することに成功を収めたことを示している。
Figure 2019506170
実施例１２：植物細胞内へのＣａｓ９ ｍＲＮの送達
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現プラスミドの送達に代わるものとして植物細胞内への組換えＣａｓ９ ｍＲＮＡの直接送達を利用する。この方法は、（１）修飾ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成および（２）修飾ｍＲＮＡの植物細胞内への送達を含む。
方法
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６などのＲＮＡポリメラーゼを用いて、５’ＵＴＲ、タンパク質のコード配列（ＣＤＳ）および３’ＵＴＲの構成要素を含む直線化プラスミド鋳型から転写される。あるＲＮＡポリメラーゼは、別のＲＮＡポリメラーゼよりも特定の修飾ヌクレオシドの組込みに優れたものであり得る。５’ＵＴＲは、その安定性を向上させるエレメント、例えばＣ型肝炎ウイルスのＭｉＲ−１２２（Ｓｈｉｍａｋａｍｉら，２０１２）などを含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成では、保護機能があり標的植物細胞で良好に翻訳されるヌクレオシドが組み込まれる。組換えＣａｓ９ ｍＲＮＡはキャップがあり、ｐｏｌｙＡテールを含む。
誘導した根組織に由来するＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種する。組換えＣａｓ９ ｍＲＮＡを以下の手段（リストは包括的なものではない）：細胞内への活性な組換えＣａｓ９ ｍＲＮＡの送達を可能にする（単独の、または組み合わせた）細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、トランスフェクションリポソーム試薬、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーションのうちの１つを用いて植物細胞内に送達する。
実施例１３：ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を繋留するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ。
この実施例では修飾一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）カセットを利用し、ここでは、下に示される例（図１０）のように、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終止シグナルの５’末端にリンカー配列（繋留配列と呼ばれることもある）が含まれている。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。リンカーの配置はｔｒａｃｅｒＲＮＡの３’末端が好ましいが、これに限定されることはなく、ｓｇＲＮＡカセット内の複数の地点で検討される。リンカー配列は、様々なヌクレオチド長であってよく、あるいは、繋留を向上させるか三重鎖相互作用により繋留される分子数を増加させ得る二次構造を含んでよい。
リンカーにより、相補的配列を含むＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質とのワトソン・クリック型塩基対形成が可能になる（図１０）。さらに、複数のＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質分子を繋留し得るさらに複雑な多面的相互作用領域を与える高度な二次構造および三次構造を含むようｓｇＲＮＡカセット内のリンカー配列を設計する。
全体としての考え方は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が生体分子をヌクレアーゼ活性部位に繋留し、それにより遺伝子編集の可能性を増大させるというものである。これらの生体分子には、標的遺伝子（１つまたは複数）の変換を媒介するＧＲＯＮが含まれる。単に、例えばＧｅｎｅ Ｓｔｒｉｎｇｓまたはアニールしたオリゴヌクレオチドを用いることにより、ｓｇＲＮＡに繋留リンカーを付加することができる。
方法
誘導した根組織に由来するＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ繋留プラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、またｂｆｐを標的とする２０１量体編集ＧＲＯＮ上にある１５〜３０ｂｐのポリヌクレオチド地帯に相補的なリンカー配列を有するｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーターが含まれている（図１０に示される通り）。ｓｇＲＮＡ繋留カセットはポリ−Ｔ１０ターミネーターにより終止する。ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌ、２０１量体ＧＲＯＮについては０．１６μＭの最終濃度になるようＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入する。ＧＲＯＮ処理単独では、２０１量体のＰＥＧ送達後の最終ＧＲＯＮ濃度が２．５μＭになるようにした。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を求めるため、それをフローサイトメータにより解析した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じまたは異なるプラスミドから発現する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とリンカーの融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。この実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲを用いる。ＧＲＯＮは、変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード配列を含む。
実施例１４：ＣＲＩＳＰＲと短縮ｇＲＮＡ。
この実施例の目的は、標的遺伝子に二本鎖切断を生じさせるＣＲＩＳＰＲおよび変換を媒介するＧＲＯＮを用いて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰモデル系に由来するプロトプラストでのＢＦＰからＧＦＰへの変換を示すことである。この実施例に用いたＣＲＩＳＰＲは、Ｃａｓ９ 遺伝子をコードするプラスミド（１つまたは複数）および２つの異なる長さのｓｇＲＮＡ１つをプロトプラスト内に導入することにより、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ゲノムのｂｆｐ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。Ｃａｓ９を標的遺伝子に誘導するｃｒＲＮＡはスペーサーと呼ばれ、通常、２０ｎｔの長さである（ＣＲ：ＢＦＰ１ ２０−ｎｔ）が、これらの実施例では、これより短い１７ｎｔの長さのスペーサー（ＣＲ：ＢＦＰ１ １７−ｎｔ）をＢＦＰからＧＦＰへの変換の媒介に用いた場合の効果を試験した。
方法
誘導した根組織に由来するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種する。ＣＲＩＳＰＲがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、また複数の異なるｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ＣＲＩＳＰＲプラスミドおよびＧＲＯＮを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌ、２０１量体については０．１６μＭの最終濃度になるようＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入する。ＧＲＯＮ処理単独では、２０１量体のＰＥＧ送達後の最終ＧＲＯＮ濃度が２．５μＭになるようにする。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内でのＧＦＰに対するＢＦＰの割合を求めるため、それをフローサイトメータにより解析した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じまたは複数のプラスミドから発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。これらの実施例では、２０ｎｔ（５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’）と１７ｎｔ（５’ＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’）の２つの異なる長さのＢＦＰ１スペーサーを試験した。使用したＧＲＯＮを表１３に記載する。
Figure 2019506170
結果
ＢＦＰ１プロトスペーサーの長さを２０ｂｐから１７ｂｐに減じたところ、プラスミドおよびＧＲＯＮをシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰモデル系内にＰＥＧ送達してから７２時間後のＢＦＰからＧＦＰへの変換のレベルはそれぞれ０．１６３％および０．１７７％でほぼ同じであった（図１１）。
実施例１５：ＣＲＩＳＰＲとアンプリコンｇＲＮＡ。
この実施例の目的は、標的遺伝子に二本鎖切断を生じさせるＣＲＩＳＰＲおよび変換を媒介するＧＲＯＮを用いて、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰモデル系に由来するプロトプラストでのＢＦＰからＧＦＰへの変換を示すことである。この実施例に用いたＣＲＩＳＰＲは、Ｃａｓ９遺伝子をコードするプラスミド（１つまたは複数）およびプラスミド上でコードされるか、アンプリコンとしてプロトプラスト内に導入されるｓｇＲＮＡ１つをプロトプラスト内に導入することにより、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のｂｆｐ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡはＣａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこでＣａｓ９が二本鎖切断を生じさせ、ＧＲＯＮは、部位指向性にＢＦＰをＧＦＰに変換するための鋳型として用いられる。
方法
誘導した根組織に由来するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種する。ＣＲＩＳＰＲがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、また複数の異なるｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナＵ６プロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ＣＲＩＳＰＲプラスミドおよびＧＲＯＮを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌ、２０１量体については０．１６μＭの最終濃度になるようＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入する。ＧＲＯＮ処理単独では、２０１量体のＰＥＧ送達後の最終ＧＲＯＮ濃度が２．５μＭになるようにした。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内のＧＦＰに対するＢＦＰの割合を求めるため、それをフローサイトメータにより解析する。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じまたは複数のプラスミドから発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。これらの実施例では、同じＢＦＰ６ ｇＲＮＡ（５’ＧＧＴＧＣＣＧＣＡＣＧＴＣＡＣＧＡＡＧＴＣＧＧ３’）をアンプリコンとして、またはプラスミド上にコードさせる形でプロトプラスト内に導入した。使用したＧＲＯＮを表１４に記載する。
Figure 2019506170
結果
ＢＦＰ６ ｇＲＮＡをＣａｓ９のみが含まれるプラスミドとともにアンプリコン（ＣＲ：ＢＦＰ６（ｇＲＮＡアンプリコン））として送達すると、プラスミドおよびＧＲＯＮをシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰモデル系内に送達してから７２時間後、別個のプラスミド上にコードされるｇＲＮＡ（ｇＲＮＡプラスミド）およびＣａｓ９の両方で処理した場合と比較して同程度のＢＦＰからＧＦＰへの変換率が得られた（図１２）。
実施例１６：ＣＲＩＳＰＲと未修飾ＧＲＯＮ。
この実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子に標的化二本鎖切断を生じさせるＣＲＩＳＰＲおよび変換を媒介するＧＲＯＮを用いて、本発明者らのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＦＰトランスジェニックモデル系でのＢＦＰからＧＦＰへの変換を示すことである。この実施例に用いたＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲは、ｂｆｐ遺伝子を標的とし、ＤＮＡの変換部位付近に二本鎖切断を引き起こす。３ＰＳ ＧＲＯＮは、ＧＲＯＮの５’末端および３’末端の両方に３つのホスホチオアート結合を有するＤＮＡ塩基を含み、本明細書では３ＰＳ ＧＲＯＮと呼ばれる。本発明者らのＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）モデル系にＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを用い、媒介されるＢＦＰからＧＦＰへの変換において、３ＰＳ ＧＲＯＮをその未修飾ＧＲＯＮ対応物と直接比較した。これらの実施例に使用したＧＲＯＮのリストについては表１５を参照されたい。
Figure 2019506170
方法
誘導した根組織に由来するＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種した。ＣＲＩＳＰＲがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、またｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナＵ６プロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ＣＲＩＳＰＲプラスミドおよびＧＲＯＮを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌ、４１量体ＧＲＯＮについては０．１６μＭの最終濃度になるようＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入した。ＧＲＯＮ処理単独では、ＰＥＧ送達後の４１量体の最終ＧＲＯＮ濃度が０．８μＭになるようにした。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を求めるため、それをフローサイトメータにより解析した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じプラスミドから発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列は５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’である。この実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを用いた。ＧＲＯＮは変換部位付近にｂｆｐ遺伝子の非コード配列を含む。使用したＧＲＯＮのリストを表１６に示す。
Figure 2019506170
結果
４１量体３Ｐ ＧＲＯＮはその未修飾ＧＲＯＮ対応物よりも、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを用いたＢＦＰからＧＦＰへの変換を媒介する効果が高い（図１３）。
実施例１７：アマにおけるＴＡＬＥＮおよびＧＲＯＮ。
この実施例の目的は、アマにＴＡＬＥＮプラスミドおよびＧＲＯＮを送達してから２４時間後のプロトプラストおよび３週間後のマイクロカルスにおけるＥＰＳＰＳ変換を示すことである。この実施例に用いたＴＡＬＥＮは、二本鎖切断を生じさせるＴＡＬＥＮをコードするプラスミド（１つまたは複数）を茎頂由来プロトプラスト内に導入することによりアマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）ゲノムのｅｐｓｐｓ遺伝子を標的とし、ＧＲＯＮは、部位指向性にｅｐｓｐｓ遺伝子を変換するための鋳型として用いられる。
方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた実生から得た茎頂アマからプロトプラストを単離した。ＴＡＬＥＮプラスミドおよびＧＲＯＮを、それぞれ０．０５μｇ／μｌおよび０．５μＭの最終濃度になるようＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入した。プロトプラストを液体培地中で、またはアルギン酸ビーズに封入（５×１０５細胞／ｍｌ）して、２５℃、暗所にて最大４８時間インキュベートし、液体培地中で培養して細胞分裂およびマイクロカルス形成を誘導した。ＤＮＡ送達から２４時間後または３週間後に得たプロトプラストまたはマイクロカルスの試料をＮＧＳにより解析して、所与の処理内の標的変異を有する細胞の割合（ＤＮＡリード）を求めた。不完全ＮＨＥＪ媒介性ＤＮＡ修復によるインデル形成のパーセントも推定した。
ＴＡＬＥＮ構築物には２本のアーム（左および右）が含まれており、各腕は、ＦｏｋＩの触媒性ＤＮＡ切断ドメインと結合したＴＡＬエフェクター様ＤＮＡ結合ドメインからなる。ＴＡＬエフェクター様ＤＮＡ結合ドメインはＴＡＬＥＮアームをＤＮＡの特異的部位に誘導し、これにより各アームのＦｏｋＩエンドヌクレアーゼが一緒に二量体化し、二本鎖ＤＮＡを切断する。ＴＡＬＥＮがコードするプラスミドには、ＭａｓＰ：：ＬｕＥＰＳＰＳ＿（左アーム）−Ｔ２Ａ−ＬｕＥＰＳＰＳ＿（右アーム）がｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに含まれている。ＬｕＥＰＳＰＳ＿（左アーム）配列は５’ＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＣＧＴＣＣＧ３’であり、ＬｕＥＰＳＰＳ＿（右アーム）配列は５’ＴＧＡＧＴＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴ３’である。ＬｕＥＰＳＰＳを標的とし、ゆらぎ塩基を含む、または含まないＧＲＯＮ（１４４量体）を用いて、その変換率に対する効果を明らかにした。
結果
次世代シーケンシングにより求めた２４時間後のプロトプラストおよび３週齢のマイクロカルスのＥＰＳＰＳ変換率は、それぞれ０．０６７％および０．０５１％であった（図１４）。さらに、これらのデータから，ＴＡＬＥＮが活性であり、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）のｅｐｓｐｓ標的遺伝子を切断することが可能であり、プロトプラストでは２４時間後、マイクロカルスでは最大３週間でインデルをそれぞれ２．６０％および１．８４％形成することがわかる。さらに、ＥＰＳＰＳ変換およびインデルは、ＴＡＬＥＮプラスミドおよびＧＲＯＮを導入してから最大３週間維持される。
実施例１８：アマにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ。
この実施例の目的は、Ｃａｓ９プラスミドの送達から３週間後および６週間後のアママイクロカルスにおけるＣａｓ９の活性を示すことである。この実施例に用いたＣＲＩＳＰＲは、Ｃａｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡをコードするプラスミド（１つまたは複数）を茎頂由来プロトプラスト内に導入することによりアマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）ゲノムのｅｐｓｐｓ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡはＣａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこでＣａｓ９が部位指向性にｅｐｓｐｓ遺伝子に二本鎖切断を生じさせる。ｅｐｓｐｓ遺伝子内の二本鎖切断が遍在性のＮＨＥＪ経路により修復されると、切断部位付近にインデルが形成される。
方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた実生から得た茎頂からアマプロトプラストを単離した。ＣＲＩＳＰＲがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、またｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ＣＲＩＳＰＲプラスミドをＰＥＧ媒介送達により最終濃度０．０５μｇ／μｌでプロトプラスト内に導入した。プロトプラストをアルギン酸ビーズに封入し（５×１０５細胞／ｍｌ）、液体培地中で培養し、２５℃、暗所にて回転式振盪機（３０ｒｐｍ）でインキュベートした。ＣＲＩＳＰＲプラスミド送達から３週間後および６週間後、個々の細胞から発生したマイクロカルスをＮＧＳにより解析して、誤りがちなＮＨＥＪ媒介性ＤＮＡ修復経路により発生したインデルを有する細胞（ＤＮＡリード）の割合を求めた。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じプラスミドから発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列を含む。この実施例では、ＣＲＩＳＰＲはｅｐｓｐｓ遺伝子を標的とする。
結果
次世代シーケンシングにより求めた３週齢および６週齢のマイクロカルスのインデル形成は、それぞれ４６．５％および５４．７％である（図１５）。これらのデータから，Ｃａｓ９が活性であり、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）のＥＰＳＰＳ標的遺伝子を切断することが可能であり、インデルを形成することがわかる。さらに、これらのインデルは、ＣＲＩＳＰＲプラスミドを導入後してから最大６週間維持される。
実施例１９：操作されたヌクレアーゼの構築
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ
一過性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９発現プラスミドを構築するため、Ｎ末端およびＣ末端の両方にＳＶ４０ ＮＬＳと、Ｎ末端に２×ＦＬＡＧタグとを含む高等植物にコドン最適化されたＳｐＣａｓ９遺伝子を一連のＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カールスバド、カリフォルニア州）として合成し、次いで、ギブソン法によりマンノピン合成酵素（ＭＡＳ）プロモーターの下流、エンドウマメリブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ｒｂｃｓＥ９）ターミネーターの上流にクローン化した。次いで、シロイヌナズナＵ６プロモーターにより発現が駆動されるキメラｇＲＮＡからなるｓｇＲＮＡカセットをＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）として合成し、次いで、ギブソン法を用いてＣａｓ９含有構築物にシャトル化し、ｐＢＣＲＩＳＰＲを形成した。キメラｇＲＮＡをそれぞれの標的配列に対して指定するため、可変２０ｎｔ ｓｇＲＮＡ標的化配列をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドの対をアニールさせて、４ｂｐのオーバーハングを有する短い二本鎖フラグメントを作製した。このフラグメントをＢｂｓＩで消化したｐＢＣｒｉｓｐｒ内にライゲートし、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構築物ＢＣ−１、ＢＣ−２およびＢＣ−３を得た。
ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮ発現構築物ＢＴ−１およびＬｕＥＴ−１の設計および構築は、Ｃｅｒｍａｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９，ｅ８２（２０１１）に記載されている法則に基づくものとした。遺伝子編集部位ならびにＮＧ、ＨＤ、ＮＩおよびＮＮがそれぞれＴ、Ｃ、ＡおよびＧを認識するという法則に従う反復可変ｉ残基（ＲＶＤ）に基づき標的配列を選択した。市販のサービス（ＧｅｎｅＡｒｔ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により、ヘテロ二量体ＦｏｋＩドメインと結合したＴＡＬエフェクタードメインの組み立てを完了した。ギブソン法を用いて、ＭＡＳプロモーターの下流、ｒｂｃＥ９ターミネーターの上流にＴＡＬＥＮモノマーをクローン化し、２Ａ結合単位として発現させた。
細胞培養およびプロトプラスト単離
表面滅菌したシロイヌナズナ種子を１２時間の明暗サイクルの下、２５℃で固形１／２ＭＳ培地（半分の濃度のミネラルおよびビタミン；８７．７ｍＭスクロースを含有するＭＳ培地；ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ，１９６２）上で発芽させた。２〜３週齢の実生の根材料を採取し、低光条件下、１／２ＭＳ培地で２８℃にて維持した。プロトプラスト単離の３週間前、ＭＳＡＲ［０．２２％ １／２ＭＳ、８７．７ｍＭスクロース、１１．４μＭ ＩＡＡ、２．３μＭ ２，４−Ｄ、１．５μＭ ２ｉＰ、ｐＨ５．８］に根培養物を移し維持した。根を約６ｍｍのセグメントに切り、細胞壁消化酵素［１．２５％セルラーゼＲＳ、０．２５％マセロザイムＲ−１０、０．６Ｍマンニトール、５ｍＭ ＭＥＳ、０．１％ＢＳＡ］を含有するＭＳＡＰ溶液［０．２２％ １／２ＭＳ、８７．７ｍＭスクロース、１１．４μＭ ＩＡＡ、２．３μＭ ２，４−Ｄ、１．５μＭ ２ｉＰおよび４００ｍＭマンニトール、ｐＨ５．８］中、暗所で穏やかに振盪しながら３〜４時間インキュベートした。解離したプロトプラストを収集し、無菌の１００μｍフィルターおよび３５μｍフィルターに通した。プロトプラストろ液を０．８倍体積のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ社）と混合し、穏やかにかき混ぜた。ろ液／Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液上に６０％Ｗ５［１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＭＥＳ，（ｐＨ５．８）］／４０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液、次いで９０％Ｗ５／１０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液を穏やかに重層して勾配を作り、それを１９８ＲＣＦで１０分間遠心分離した。白色のプロトプラスト層を収集し、２倍体積のＷ５と混合した。プロトプラストを４４ＲＣＦで１０分間遠心分離し、１×１０７細胞／ｍｌの密度でＴＭ溶液［１４．８ｍＭ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、５ｍＭ ＭＥＳ、５７２ｍＭマンニトール、（ｐＨ５．８）］中に再懸濁させた。Ｚｅｏｃｉｎ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールスバド、カリフォルニア州）およびフレオマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いた実験には、トランスフェクションの前にプロトプラストをｐＨ７．０に調整したＴＭ中、氷上で９０分間保持した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた３週齢の実生から得た茎頂からアマプロトプラストを単離した。茎頂を解剖用メスで細切し、Ｂ培地［Ｂ５塩およびビタミン（Ｇａｍｂｏｒｇら，１９６８）、４ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１Ｍグルコース、０．３Ｍマンニトール、０．１Ｍグリシン、２５０ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物、１０ｍｇ／ｌ Ｌ−システイン−ＨＣＬ、０．５％ポリビニルピロリドン（ＭＷ１０，０００）、０．１％ＢＳＡ、１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、０．２ｍｇ／ｌ ＮＡＡおよび０．５ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ］中、室温で１時間、予め原形質分離させ、回転式振盪機（５０ｒｐｍ）上で０．６６％セルラーゼＹＣおよび０．１６％マクロザイムＲ−１０を添加したＢ培地を含有する細胞壁消化酵素溶液中、２５℃で５時間インキュベートした。解離したプロトプラストをふるいにかけ、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）層を用いた密度勾配遠心分離により精製し、血球計数器でカウントし、暗所にてＢ培地中０．５×１０６プロトプラスト／ｍｌの密度で一晩静置した。
プロトプラストのトランスフェクション
９６ウェル平底プレートでＰＥＧ［２７０ｍＭマンニトール、６７．５ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２、３８．４％ＰＥＧ１５００、（ｐＨ５．８）］を用いて、１ウェル当たり２．５×１０５個の細胞に１０ｐｍｏｌ ＧＲＯＮ、１０ｐｍｏｌ ＧＲＯＮと３．２５μｇ ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓもしくはＴＡＬＥＮ発現構築物またはモックをトランスフェクトした。細胞およびＤＮＡを氷上で３０分間、ＰＥＧとインキュベートし、次いで、Ｗ５溶液２００μｌで洗浄した。最後に、ＭＳＡＰ＋＋［５０ｎＭファイトスルフォカイン−αと２０μＭ ｎ−没食子酸プロピルとを含有するＭＳＡＰ］８５μｌを加え、細胞を低光条件下、２８℃で培養した。
約１８時間培養した後、ＰＥＧ媒介送達を用いてプロトプラストにＴＡＬＥＮプラスミドとＧＲＯＮ（２０μｇプラスミドと０．２ｎｍｏｌ ＧＲＯＮ／１０６プロトプラスト）をトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、処理済みプロトプラストをＢ培地中で、またはアルギン酸ビーズに封入して、２５℃、暗所にて最大４８時間インキュベートし、Ｖ−ＫＭ液体培地中で培養して、細胞分裂およびマイクロカルス形成を誘導した。抗生物質実験には、上記のＰＥＧ溶液を用いて１ウェル当たり１．２５×１０５個の細胞に８μＭ ＧＲＯＮ ＣＧ１３をトランスフェクトした。
サイトメトリー
トランスフェクションから７２時間後、Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇサイトメータ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を用いたサイトメトリーにより、必要に応じてＧＦＰ励起および発光検出を実施して、細胞を解析した。バックグラウンドレベルは、ＤＮＡ送達を実施していないＰＥＧ処理プロトプラストに基づくものとした。抗生物質実験には、トランスフェクション前にＺｅｏｃｉｎまたはフレオマイシンで処理したプロトプラストをトランスフェクションから４８時間後にサイトメトリーにより解析した。
シーケンシング解析
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｎｔ ＩＩキットを製造業者の推奨（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ社、ベツレヘム、パレスチナ）通りに用いて、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓまたはＴＡＬＥＮで処理したプロトプラストからゲノムＤＮＡを抽出した。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼを１００ｎｇのゲノムＤＮＡならびにシロイヌナズナＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥＮにプライマーＢＦＰＦ−１（５’−ＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣ−３’）／ＢＦＰＲ−１（５’−ＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣ−３’）；またはアマ（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）ＴＡＬＥＮにＬｕＥＰＦ−１（５’−ＧＣＡＴＡＧＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣ−３’）／ＬｕＥＰＲ−１ ５’−ＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧ−３’とともに用いて、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ標的領域に隣接するアンプリコンを作製した。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）を用いてアンプリコンを精製し濃縮した。２×２５０ｂｐのＭｉＳｅｑラン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて、ＧｅｎｅＷｉｚ（サウスプレーンフィールド、ニュージャージー州）によりアンプリコンのディープシーケンシングを実施した。データ解析には、リード１およびリード２のｆａｓｔｑファイルをＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ７．０．４（ＣＬＣＢｉｏ社、ボストン、マサチューセッツ州）にインポートした。ペアリードの配列がオーバーラップしている場合、それを単一配列にまとめた。アンプリコンの配列またはその逆配列および相補配列に順方向プライマー配列および逆方向プライマー配列がともに含まれている場合、それを特定した。試料中に固有の配列があれば、その存在量として記録した。編集またはインデルを有するリード数をシーケンシングされたリードの総数で除し、次いで１００を乗じることにより、インデルまたは遺伝子編集のパーセントを算出した。
Figure 2019506170
Figure 2019506170
ＴＡＬＥＮ結合ドメイン配列



Figure 2019506170
統計解析
両側分布のスチューデントｔ検定を用いて統計的有意性を決定した。ｐ値＜０．０５を有意であると見なした。データは平均およびＳＥＭで表す。
結果
シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ活性および遺伝子編集。
操作されたヌクレアーゼ、例えばＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）などは、二本鎖ＤＮＡを高い特異性で標的とし切断するようプログラムすることができる。ＴＡＬＥＮは２本のアームからなり、アームにはともに、ＦｏｋＩの触媒ＤＮＡヌクレアーゼドメインと結合したＴＡＬエフェクター様ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥ）を有する。ＴＡＬＥドメインはＴＡＬＥＮアームをＤＮＡの特異的部位に誘導し、これによりＦｏｋＩエンドヌクレアーゼが二量体化し、次いで二本鎖切断（ＤＳＢ）が起こる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は２つの構成要素、すなわち、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９）と、操作された一本鎖ガイド（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡ（ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ）のキメラ融合物とからなる。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９の最初の２０の５’塩基とＤＮＡ標的との塩基対形成を介するＣａｓ９の標的核酸特異性を補助し、それにより部位特異的ＤＳＢが生じる。
植物では、ＤＳＢは通常、誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路によって修復され、それにより修復部位にランダムな欠失および／または挿入（インデル）が生じる。これに対し、高精度のゲノム編集は、標的変化付近のヌクレアーゼ誘導性ＤＳＢが相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復されることに依存し、ＨＤＲは、相同な鋳型ＤＮＡ（多くの場合、姉妹染色分体）を必要とするためＮＨＥＪよりも精度の高い修復経路である。ＨＤＲ経路を利用することにより、ヌクレアーゼにより切断する場合はＤＮＡを特異的に編集する修復鋳型として、あるいは二本鎖切断を誘導する抗生物質とともに使用する場合はＤＮＡを非特異的に修復する修復鋳型として、操作されたオリゴヌクレオチドを用いることが可能となる。
図１６に、Ｈ６６をコードするコドンを編集（ＣＡＣ→ＴＡＣ Ｈ６６Ｙ）することにより、安定に組み込まれたＢＦＰ遺伝子をＧＦＰに変換することができるＢＦＰトランスジェニックモデル系に由来するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を示す。細胞をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ＢＣ−１）で処理した場合、ディープシーケンシングによりＢＦＰ遺伝子のＨ６６遺伝子座付近に０．７９％の頻度でＮＨＥＪ誘導性インデルがみられた（図１６ａ）。インデルの大部分は単一ｂｐであり、９ｂｐより長いものはみられなかった。これとは逆に、ＧＲＯＮ単独で処理した細胞にもモック処理した細胞にもインデルはみられなかった（データ不掲載）。以上の結果から，ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、このトランスジェニックモデル系においてＢＦＰ遺伝子を能動的に標的とし得ることがわかる。
ＧＲＯＮと組み合わせたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が本発明者らのトランスジェニックモデル系に由来するプロトプラストでＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集を媒介する効果に関しては、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９とホスホロチオアート（ＰＳ）修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ６）の両方を同時に導入した場合、ＧＲＯＮ単独またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９単独処理と比較して、ＢＦＰからＧＦＰへの編集が７．４倍改善された（図１６ｂ）。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をＰＳ修飾ＧＲＯＮとともにシロイヌナズナプロトプラスト内に導入すると、ＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集の頻度が有意に増大することを示している。
５’末端および３’末端の両方に３つの隣接するＰＳ修飾（本明細書では３ＰＳと呼ぶ）を含むＧＲＯＮは、未修飾ＧＲＯＮと比較してＢＦＰからＧＦＰへの編集に正の効果を及ぼす。３ＰＳ修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ２）をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ＢＣ−１）と組み合わせると、未修飾ＧＲＯＮ鋳型と比較してＢＦＰからＧＦＰへの編集の効果が高くなる（ＣＧ１；図１７ａ）。さらに、編集とＧＲＯＮの長さとの間に正の相関（図１７ｂ）が認められた。以上の結果を考え合わせると、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の存在下では、ＧＲＯＮ修飾と長さの両方がシロイヌナズナなどの植物における遺伝子編集の頻度を大幅に改善し得ることがわかる。
１番目のＲＮＡ塩基または最初の９つのＲＮＡ塩基が２’−Ｏ−メチルで修飾されたＲＮＡである最初の１０の５’塩基からなる２０１核酸塩基（ｎｂ）の３ＰＳ修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ６）または２０１ｎｂの２’−Ｏ−メチル修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ９）もしくは（ＣＧ１０）をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ＢＣ−１）とともにシロイヌナズナプロトプラスト内に導入しても、それらの間にＢＦＰからＧＦＰへの編集の統計学的差は認められなかった（図１７ｃ）。同様に、５’Ｃｙ３と３’ｉｄＣ逆塩基とを含む２０１ｎｂの３ＰＳ修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ３）または２０１ｎｂのＣｙ３修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ４）をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ＢＣ−３）とともにシロイヌナズナプロトプラスト内に導入しても、編集頻度に統計学的差は認められなかった（図１７ｄ）。以上のデータを全体的にみれば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の存在下では多様なＧＲＯＮ修飾が遺伝子編集の頻度を大幅に改善し得ることがわかる。
上記のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９および修飾ＧＲＯＮでの結果を踏まえ、ＢＦＰ遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮ対を組み合わせた修飾ＧＲＯＮにより、ＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集が改善されるかどうかを明らかにした。最初に、ＢＦＰ遺伝子座で効果的なヌクレアーゼ活性を明らかにするため、シロイヌナズナプロトプラストをＴＡＬＥＮ（ＢＴ−１）で処理したところ、ディープシーケンシングにより、予測切断部位またはその付近に０．５１％のインデルがみられ、このことは、ＴＡＬＥＮがこのモデル系でＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と同程度に活性であることを示している（図１８ａ）。欠失の大部分は１０ｂｐ超、５０ｂｐ未満であり、挿入は欠失よりはるかに少なく、３ｂｐ以下であった。次に、修飾ＧＲＯＮと組み合わせたＴＡＬＥＮがＢＦＰからＧＦＰに編集する効果を検討した。ＢＦＰ ＴＡＬＥＮ（ＢＴ−１）と３ＰＳ ＧＲＯＮ（ＣＧ７）の両方を導入した場合、３ＰＳ ＧＲＯＮ単独と比較して、ＢＦＰからＧＦＰへの編集の頻度に９．２倍の改善が認められた（図１８ｂ）。上記のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの実験と同じく、以上の結果は、ＴＡＬＥＮを３ＰＳ修飾ＧＲＯＮとともにシロイヌナズナプロトプラスト内に導入した場合にもＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集の頻度が有意に増大することを示している。
この系の標的としてアマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）のＥＰＳＰＳ（５’−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素）遺伝子座も用いた。ＥＰＳＰＳ遺伝子は、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの生合成に関与するシキミ酸経路の酵素をコードする。植物では、ＥＰＳＰＳは除草剤グリホサートの標的であり、この場合、グリホサートはホスホエノールピルビン酸に対する結合部位の競合阻害剤として作用する。
編集した場合にＥＰＳＰＳにグリホサート耐性を付与するアマ（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）の２つの遺伝子座（Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａ）の付近の部位を標的とするＴＡＬＥＮを選択した。Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａでの標的変化を含む１４４ｎｂの５’Ｃｙ３修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ１１）とともにＴＡＬＥＮ（ＬｕＥＴ−１）をプロトプラスト内に送達したところ、導入から７日後、両遺伝子座における０．１９％の遺伝子編集頻度および０．５％のインデル頻度が認められた（図１８ｃ、１８ｄ）。インデルの大部分は１０ｂｐ以下であった（図１８ｃ）。これらの結果は、ＴＡＬＥＮとＣｙ３修飾ＧＲＯＮとともにアマ（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）プロトプラスト内に導入することによりＥＰＳＰＳ遺伝子編集の頻度が有意に増大し、さらには、単一のＧＲＯＮにより複数のヌクレオチド編集が実現可能であることを示している。
実施例２０：抗生物質のブレオマイシンファミリーの２つのメンバーが変換に及ぼす効果。
この一連の実施例の目的は、変換効率に対する抗生物質の効果を評価することであった。
方法
複数コピーの青色蛍光タンパク質遺伝子を有するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）系列由来のプロトプラストを実施例１に記載した通りにＧＲＯＮで処理し、その際、以下のような修正を施した：ＧＲＯＮを添加する前に、プロトプラストを０μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌまたは１０００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（商標）またはフレオマイシンを添加したＴＭ（１４．８ｍＭ ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、５ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、５７２ｍＭマンニトール）の溶液中、氷上で９０分間保持した。溶液のｐＨを７．０に調整した。ＢＦＰからＧＦＰへの変換により得られた緑色蛍光を発する細胞の割合を実施例１に記載した通りにフローサイトメトリーにより評価した。
結果
用いた両濃度（２５０μｇ／ｍｌおよび１０００μｇ／ｍｌ）のＺｅｏｃｉｎおよびフレオマイシンにより、ＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集が増大した（図１９を参照されたい）。ＧＲＯＮ送達から５日後、ＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集により得られた緑色蛍光を発する細胞が観察された（図２０）。
参考文献
１．ＬｅＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ：ｖｏｌ．３３９ ｎｏ．６１２１ ｐｐ．８１９−８２３．
２．Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６−２１
３．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００８ ＲＮＡ １４：９０３−９１３
４．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１３．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６１：２０−２７
実施例２１：イネにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ。
この実験の目的は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮをプロトプラスト内にＰＥＧ送達してから１２０時間後のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）におけるＡＣＣアーゼ変換を示すことである。この実験に用いたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、Ｃａｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡをコードするプラスミド（１つまたは複数）をプロトプラスト内に導入することによりイネゲノムのａｃｃアーゼ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡはＣａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこでＣａｓ９がａｃｃアーゼ遺伝子に二本鎖切断を生じさせ、ＧＲＯＮは、部位指向性にａｃｃアーゼ遺伝子を変換するための鋳型として用いられる。
方法
イネプロトプラストをカルスから単離した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するトウモロコシ（ｃｏｒｎ）ユビキチンプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、またｓｇＲＮＡを駆動するイネＵ６プロモータープロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドを最終濃度０．０５μｇ／μｌでＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入した。以下の配列、すなわち、５’Ｖ Ｃ ＴＧＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＣＴＣ ＡＡＴ ＴＡＡ ＣＣＣ ＴＴＧ ＣＧＧ ＴＴＣ ＣＡＧ ＡＡＣ ＡＴＴ ＧＣＣ ＴＴＴ ＴＧＣ ＡＧＴ ＣＣＴ ＣＴＣ ＡＧＣ ＡＴＡ ＧＣＡ ＣＴＣ ＡＡＴ ＧＣＧ ＧＴＣ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＡＴ ＣＴＴ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＡＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＴＡＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＡＡＴ ＧＴＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＡＴＴ ＧＴＡ ＴＧＴ ＣＣＴ ＡＡＧ ＧＴＴ ＣＴＣ ＡＡＣ ＡＡＴ ＡＧＴ ＣＧＡ ＧＣＣ Ｈ３’を有するＧＲＯＮを最終濃度０．８μＭで用いた。プロトプラストをアガロースに封入し（２．５×１０６細胞／ｍｌ）、液体培地中で培養し、２８℃、暗所にて回転式振盪機（６０ｒｐｍ）でインキュベートした。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドおよび／またはＧＲＯＮの送達から１２０時間後、ａｃｃアーゼ遺伝子にＡＣＣアーゼ変換を有しインデルを有する細胞（ＤＮＡリード）の割合を求めるため、個々の試料をＮＧＳにより解析した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素とも同じプラスミドから発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列（５’−ＡＣＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧ−３）を含む。この実験では、ＣＲＩＳＰＲはａｃｃアーゼ遺伝子を標的とする。
結果
１２０時間後、イネプロトプラストは、次世代シーケンシングにより求めたＡＣＣアーゼ変換が０．０２６％であった。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを含まないＧＲＯＮ単独対照には１２０時間後に最小限のＡｃｃアーゼ変換０．００２％を示したものはなく、未処理対照に変換はみられなかった。さらに、これらのデータから，ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓが活性であり、ＡＣＣアーゼ標的遺伝子を切断し８．０％のインデルを形成することが可能であることがわかる。
実施例２２：イネにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ
概要：ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシング解析により１９週齢のカルスに標的化ＡＣＣアーゼ変異が確認された。
諸言
この実験の目的は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮをプロトプラスト内にＰＥＧ送達した後のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）カルスにおけるＡＣＣアーゼ変換を示すことである。この実験に用いたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、Ｃａｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡをコードするプラスミド（１つまたは複数）をプロトプラスト内に導入することによりイネゲノムのＡＣＣアーゼ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡはＣａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこでＣａｓ９がＡＣＣアーゼ遺伝子の標的位置に二本鎖切断またはニックを生じさせ、ＧＲＯＮは、部位指向性にＡＣＣアーゼ遺伝子を変換するための鋳型として用いられる。
結果
ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシング解析により１９週齢のカルスに下の表に記載する標的化ＯｓＡＣＣアーゼ変異が確認された。
方法
成熟種子由来胚発生カルスから開始した浮遊培養からイネプロトプラストを単離した。ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮをＰＥＧ媒介送達法により、それぞれ０．０５μｇ／μｌおよび０．８μＭの最終濃度でプロトプラスト内に導入した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドの最終濃度の例示的範囲としては、特に限定されないが、０．０１〜０．２μｇ／μｌが挙げられる。ＧＲＯＮの最終濃度の例示的範囲としては、特に限定されないが、０．０１〜４μＭが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するトウモロコシ（ｃｏｒｎ）ユビキチンプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、またｓｇＲＮＡを駆動するイネＵ６プロモータープロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ＧＲＯＮの配列に関する情報は表３に記載されている。ＰＥＧ処理の後、プロトプラストをアガロースに封入し（１．２５×１０６細胞／ｍｌ）、液体培地中で培養し、２８℃、暗所にて回転式振盪機（６０ｒｐｍ）でインキュベートした。アガロースに封入するプロトプラストの例示的範囲としては、特に限定されないが、０．６２５×１０６〜２．５×１０６細胞／ｍｌが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドおよび／またはＧＲＯＮ処理から４週間後、ＡＣＣアーゼ変換を有する細胞（ＤＮＡリード）の割合を求めるため、各処理で得た試料を次世代シーケンシングにより解析した。変換された処理で得られたマイクロカルスをクレトジム（０．２５〜０．５μＭ）またはセトキシジム（２．５μＭ）を含有する固形選択培地上に固形選択培地上に放出した。１９週間培養した後、標的化ＡＣＣアーゼ変換を含む個々のカルスを特定するため、この選択培地で増殖した個々のカルス系を自社スクリーニング法およびＤＮＡシーケンシングにより解析した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）などのＣａｓ９とｓｇＲＮＡとからなり、両要素ともプラスミド（１つまたは複数）から発現させた。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡは、それぞれｍＲＮＡ／ＲＮＡまたはタンパク質／ＲＮＡによって送達することもできる。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、表２に記載した配列を有するスペーサーを含み、これらを用いてＣａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導した。この実験では、ＣＲＩＳＰＲはイネＡＣＣアーゼ遺伝子を標的とする。
遺伝子内の２つの異なる位置、部位１および部位２におけるＯｓＡＣＣアーゼの変換のリスト。各部位について変換事象のあらゆる組合せが可能である。
Figure 2019506170
この実験に用いたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｇＲＮＡスペーサー配列のリスト。スペーサーの長さには±２０ｂｐまでの幅があり得る。スペーサー配列内のミスマッチは１０ｂｐまで許容され得る。
Figure 2019506170
Figure 2019506170
Figure 2019506170
この実験に用いるのに適したＧＲＯＮ配列のリストを下の表に記載する（Ｖ＝ＣＹ３；Ｈ＝３’ＤＭＴ ｄＣ ＣＰＧ）。
Figure 2019506170
Figure 2019506170
実施例２３：アマにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ
概要：ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシング解析により４週齢のカルスに標的化ＬｕＥＰＳＰＳ変異が確認された。
諸言
この実験の目的は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮのＰＥＧ媒介送達による茎頂由来プロトプラストのアマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）ゲノムにおけるＥＰＳＰＳ遺伝子の変換を示すことである。この実験に用いたＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓおよびＧＲＯＮはアマゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子を標的とする。ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）などのＣａｓ９とｓｇＲＮＡとからなり、両要素ともプラスミド（１つまたは複数）から発現させる。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡは、それぞれｍＲＮＡ／ＲＮＡまたはタンパク質／ＲＮＡによって送達することもできる。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡはＣａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこでＣａｓ９がＥＰＳＰＳ遺伝子に二本鎖切断またはニックを生じさせ、ＧＲＯＮは、部位指向性にＥＰＳＰＳ遺伝子を変換するための鋳型として用いられる。
結果
ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシング解析により４週齢のカルスに標的化ＬｕＥＰＳＰＳ（Ｔ９７Ｉおよび／またはＰ１０１Ａ、Ｐ１０１ＴもしくはＰ１０１Ｓおよび／またはＧ９６Ａ）変異が確認された。これらの変換されたカルスからシュートが再生した。
方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた実生から得た茎頂からアマプロトプラストを単離した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓがコードするプラスミドには、Ｃａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターがｒｂｃＳＥ９ターミネーターとともに、またｓｇＲＮＡを駆動するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーターがポリ−Ｔ１０ターミネーターとともに含まれている。ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドをＰＥＧ媒介送達により最終濃度０．０５μｇ／μｌでプロトプラスト内に導入した。２つのアマＬｕＥＰＳＰＳ遺伝子をそれぞれ標的とするＧＲＯＮ（表２）を最終濃度４．０μＭで用いた。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドの最終濃度の例示的範囲としては、特に限定されないが、０．０１〜０．２μｇ／μｌが挙げられる。ＧＲＯＮの最終濃度の例示的範囲としては、特に限定されないが、０．０１〜４μＭが挙げられる。プロトプラストをアルギン酸ビーズに封入し（５×１０５細胞／ｍｌ）、液体培地中で培養し、２５℃、暗所にて回転式振盪機（３０ｒｐｍ）でインキュベートした。アルギン酸ビーズに封入するプロトプラストの例示的範囲としては、特に限定されないが、３．０×１０５〜７．５×１０５細胞／ｍｌが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮの送達から３週間および７週間後、ＬｕＥＰＳＰＳ遺伝子に標的化変異を有する細胞（ＤＮＡリード）の割合を求めるため、個々の細胞から発生したマイクロカルスを次世代シーケンシングにより解析した。固形再生培地に播いた８週齢の変換マイクロカルスからさらに大きいカルスが成長し、約４〜８週間後、再生したカルスからシュートが分化し始めた。ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシング解析により標的化ＥＰＳＰＳ遺伝子変異を有する変換カルスおよびシュートが確認された。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素、すなわち、植物コドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素ともプラスミド（１つまたは複数）から発現させた。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、下の表に記載する配列を有するスペーサーを含み、これらを用いてＣａｓ９ヌクレアーゼをＥＰＳＰＳ標的遺伝子に誘導した。
この実験に用いたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｇＲＮＡスペーサー配列のリスト。スペーサーの長さには±２０ｂｐまでの幅があり得る。スペーサー配列内のミスマッチは１０ｂｐまで許容され得る。
Figure 2019506170
Figure 2019506170
この実験に用いるのに適したＧＲＯＮ配列のリストを下の表に記載する（Ｖ＝ＣＹ３；Ｈ＝３’ＤＭＴ ｄＣ ＣＰＧ）。
Figure 2019506170
Figure 2019506170
Figure 2019506170
実施例２４：非トランスジェニック作物育種のための高精度のゲノム編集手段
以下の実施例では、操作されたヌクレアーゼであるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ９とともにＧＲＯＮを外来性に導入したシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストにおける効率的で高精度の遺伝子編集を示す。このゲノム編集技術はアマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）などの農業上重要な作物にも応用され、その場合、高精度のＥＰＳＰＳ遺伝子編集によりプロトプラストにグリホサート耐性形質がもたらされ；のちに再生したシュートには、選択を必要とせずにそれらの高精度の編集およびそれに付随する形質がみられる。
方法
ＣＲＩＳＰＳ−Ｃａｓ９プラスミドの構築
一過性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９発現プラスミドを構築するため、Ｎ末端およびＣ末端の両方にＳＶ４０ ＮＬＳと、Ｎ末端に３×ＦＬＡＧタグとを含む高等植物にコドン最適化されたＳｐＣａｓ９遺伝子を一連のＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カールスバド、カリフォルニア州）として合成し、次いで、ギブソン法２３によりマンノピン合成酵素（ＭＡＳ）プロモーターの下流、エンドウマメリブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ｒｂｃｓＥ９）ターミネーターの上流にクローン化した（図２７ａ）。次いで、シロイヌナズナＵ６プロモーターにより発現が駆動されるキメラｇＲＮＡからなるｓｇＲＮＡカセットをＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）として合成し、次いで、ギブソン法を用いてＣａｓ９含有構築物にシャトル化し、ｐＢＣＲＩＳＰＲを形成した。キメラｓｇＲＮＡをそれぞれの標的配列に対して指定するため、以下の表に示すＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１およびＥＰＳＰＳ＿ｓｇＲＮＡ−２９に対するプロトスペーサーをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドの対をアニールさせて、４ｂｐのオーバーハングを有する短い二本鎖フラグメントを作製した。
Figure 2019506170
上記の配列の参照図は以下の通りである：Ｏｆｆ−１Ｆ〜ＢＦＰＲ−１−図２７ｄ；ＬｕＥＰＦ−１およびＬｕＥＰＲ−１−図２９ｄ；ＣＲ−ＬｕＥＰＳＰＳ２ａおよびＣＲ−ＬｕＥＰＳＰＳ２ｂ−図２９ａ；ＣＲ−ＢＦＰａ１およびＣＲ−ＢＦＰ１ｂ−図２７ａ。
フラグメントをＢｂｓＩで消化したｐＢＣｒｉｓｐｒ内にライゲートしてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物ｓｇＲＮＡ（ＢＦＰ）−１およびｓｇＲＮＡ（ＥＰＳＰＳ）−２を得た。使用したｓｇＲＮＡのプロトスペーサー配列を以下の表に示す：
Figure 2019506170
 ｓｇＲＮＡ配列中、赤文字のＧはＰｏｌＩＩＩプロモーターを適合させるために変化させたものである
遺伝子修復オリゴヌクレオ塩基（ＧＲＯＮ）
ＧＲＯＮはいずれもＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。使用したＧＲＯＮＳのリストは下表のとおりである：
Figure 2019506170
 ＊ＰＳ−ホスホロチオアート結合；ｉｄＣ−逆塩基；Ｃｙ３−シアニン染色
上記の配列の参照図は以下の通りである：ＢＦＰ／４１：図２７ｅ、２８ａ、２８ｂ；ＢＦＰ／４１／３ＰＳ：図２８ｂ；ＢＦＰ／１０１：図２８ｂ；ＢＦＰ／１０１／３ＰＦ：図２８ｂ；ＥＰＳＰＳ／１４４／Ｃｙ３：図２９。
細胞培養およびプロトプラスト単離
シロイヌナズナ
表面滅菌したシロイヌナズナ種子を１２時間の明暗サイクルの下、２５℃で固形１／２ＭＳ培地（ＭＳミネラルおよびビタミン２４；１／２濃度；８７．７ｍＭスクロース）上で発芽させた。２〜３週齢の実生の根を採取し、２５℃、低光量下にて１／２ＭＳ液体培地で維持した。プロトプラスト単離の３週間前、ＭＳＡＲ１．１２５（１／２×ＭＳ塩およびビタミン、スクロース８７．７ｍＭ、ＩＡＡ、１１．４μＭ、２，４−Ｄ ４．６μＭ）に培養物を移して維持し、根分裂組織（ＲＭＴ）を誘導した。ＲＭＴを小さいセグメントに切り、ＭＳＡＲ１．２酵素溶液（４００ｍＭマンニトール、１．２５％セルラーゼＲＳ、０．２５％マセロザイムＲ−１０、５ｍＭ ＭＥＳ、０．１％ＢＳＡを含有するＭＳＡＲ１．１）中、暗所で穏やかに振盪しながら１６時間インキュベートした。解離したプロトプラストを収集し、無菌の１００μｍフィルターおよび３５μｍフィルターに連続して通した。プロトプラストろ液を０．８倍体積のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ社）に加え、穏やかにかき混ぜた。ろ液／Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液上に６０％Ｗ５（１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．８）／４０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液、次いで９０％Ｗ５／１０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液を穏やかに重層して勾配を作り、それを１９８ＲＣＦで１０分間遠心分離した。白色のプロトプラスト層を収集し、２倍体積のＷ５と混合した。プロトプラストを４４ＲＣＦで１０分間遠心分離し、１ｘ１０７細胞／ｍｌの密度でＴＭ溶液（１４．８ｍＭ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、５ｍＭ ＭＥＳ、５７２ｍＭマンニトール、ｐＨ５．８）中に再懸濁させた。
アマ（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた３週齢の実生からアマプロトプラストを単離した。植物組織を解剖用メスで細切し、Ｂ培地［Ｂ５塩およびビタミン２６、４ｍＭ ＣａＣｌ２，０．１Ｍグルコース、０．３Ｍマンニトール、０．１Ｍグリシン、２５０ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物、１０ｍｇ／ｌ Ｌ−システイン−ＨＣＬ、０．５％ポリビニルピロリドン（ＭＷ１０，０００）、０．１％ＢＳＡ、１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、０．２ｍｇ／ｌ ＮＡＡおよび０．５ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ］中、室温で１時間、予め原形質分離させ、０．６６％セルラーゼＹＣおよび０．１６％マクロザイムＲ−１０を添加したＢ培地を含有する細胞壁消化酵素溶液中、２５℃で５時間、回転式振盪機（５０ｒｐｍ）でインキュベートした。解離したプロトプラストをふるいにかけ、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ層を用いた密度勾配遠心分離により精製し、血球計数器でカウントし、暗所にてＢ培地中０．５×１０６プロトプラスト／ｍｌの密度で一晩静置した。
プロトプラストのトランスフェクション
シロイヌナズナ
９６ウェル平底プレートでＰＥＧ媒介送達［２７０ｍＭマンニトール、６７．５ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２、３８．４％ＰＥＧ１５００］を用いて、１ウェル当たり２．５×１０５個のシロイヌナズナプロトプラストに２．５ｐｍｏｌ ＧＲＯＮ単独、２．５ｐｍｏｌ ＧＲＯＮと５μｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミド（ＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１）をトランスフェクトするか、またはモック処理を実施した。氷上で１０分間トランスフェクションを実施し、次いでＷ５溶液２００μｌで洗浄した。最後に、ＭＳＡＰ（０．４Ｍマンニトールを含有するＭＳＡＲ１．１）８５μｌを加え、細胞を低光条件下、２５℃で培養した。
アマ（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）
１８時間培養した後、ＰＥＧ媒介送達を用いて１×１０６個のアマプロトプラストに２００ｐｍｏｌのＧＲＯＮを２０μｇのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミド（ＥＰＳＰＳ＿ｓｇＲＮＡ−２）とともにトランスフェクトした。処理済みプロトプラストをアルギン酸ビーズに０．５×１０６プロトプラスト／ｍｌアルギン酸の密度で封入し２７、Ｂ培地中、２５℃、暗所にて最大２４時間インキュベートし、０．０２ｍｇ／ｌのチジアズロン（ＴＤＺ）および０．００２ｍｇ／ｌのＮＡＡを添加した基本Ｖ−ＫＭ液体培地２８で培養した。トランスフェクションから３週間および７週間後、プロトプラストから得た約１０，０００個の微小コロニーからなるプールから抽出したｇＤＮＡのＮＧＳにより、ＥＰＳＰＳ遺伝子を標的とする配列編集を評価した。次いで、５０ｍＭクエン酸緩衝液中、マイクロカルスをアルギン酸から３０分間解離させ、Ｖ−ＫＭ培地で２回洗浄し、沈殿細胞量０．５ｍｌ／プレートの密度で固化再生培地［ＭＳ塩２５、ＭｏｒｅｌおよびＷｅｔｍｏｒｅビタミン２９［０．００１ｍｇ／ｌビオチン、０．０１ｍｇ／ｌニコチン酸、１ｍｇ／ｌパントテン酸カルシウム、１ｍｇ／ｌピリドキシン、１ｍｇ／ｌチアミン、１００ｍｇ／ｌイノシトール）、３％スクロース、０．０２ｍｇ／ｌチジアズロン（ＴＤＺ）、０．００２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、ｐＨ５．８］に播いた。播種したマイクロカルスを１６時間の光周期（２７０ｍｏｌ．ｍ−２．ｓ−１）下、２５℃でインキュベートした。約３週間後、小さい個々のカルス（直径約０．５ｃｍ）を２つに分けた。一方を分子スクリーニングに用い、他方をシュート再生と同じ条件下、１ウェル当たり１カルスにて２４ウェルプレートで維持した。約６週間後、カルスからシュートが発生し始めた。伸長したシュートをマイクロプロパゲーションにより増殖させ、ＭＳ培地（４．３３ｇ／Ｌ ＭＳ塩混合物、３％スクロースおよび０．１％ＭｏｒｅｌおよびＷｅｔｍｏｒｅビタミン、０．３％Ｐｈｙｔａｇｅｌ）中で根付かせ、根付いた植物を土壌に移し、植物体が十分に確立されるまで生育用チャンバ（Ｃｏｎｖｉｒｏｎ社、ウィニペグ、マニトバ州）内で２〜４週間硬化させた。
シロイヌナズナのＢＦＰからＧＦＰへの編集の検出
トランスフェクションから７２時間後、Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇサイトメータ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を必要に応じてＧＦＰの励起および発光検出の設定で用いたサイトメトリーによりシロイヌナズナプロトプラストを解析した。バックグラウンドレベルは、ＤＮＡ送達を実施しないＰＥＧ処理プロトプラストに基づくものとした。
インデル解析
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｎｔ ＩＩキットを製造業者の推奨（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ社、ベツレヘム、パレスチナ）通りに用いて、処理済みプロトプラストからゲノムＤＮＡを抽出した。ＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１標的領域に隣接するプライマー（ＢＦＰＦ−１およびＢＦＰＲ−１）とともにＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼおよび１００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いてアンプリコンを作製した。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）を用いてアンプリコンを精製し濃縮した後、２×２５０ｂｐのＭｉＳｅｑラン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてディープシーケンシングを実施した。データ解析には、リード１およびリード２のｆａｓｔｑファイルをＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ７．０．４（ＣＬＣＢｉｏ社、ボストン、マサチューセッツ州）にインポートした。ペアリードの配列がオーバーラップしている場合、それを単一配列にまとめた。アンプリコンの配列またはその逆配列および相補配列に順方向プライマー配列および逆方向プライマー配列がともに含まれている場合、それを特定した。試料中に固有の配列があれば、その存在量として記録した。編集またはインデルを有するリード数を総配列数で除し、次いで１００を乗じることにより、インデルまたは標的化編集のパーセントを算出した。
アマ試料については、ＥｖｏＰＵＲＥ植物ＤＮＡキット（Ａｌｉｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ウォバーン、マサチューセッツ州）を用いて微小コロニーまたはカルス試料のゲノムＤＮＡを抽出し、ディープシーケンシングおよびアレル特異的ｑＰＣＲによりスクリーニングした。次いで、陽性スコアのＰＣＲフラグメントを製造業者のプロトコル通りにｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＴＯＰＯ−ＴＡクローン化した。次いで、通常１０〜１５個の形質転換細胞のＰＣＲフラグメントにＴｅｍｐｌｉＰｈｉシーケンシング（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を実施して、単一の単離カルス由来の各ＥＰＳＰＳアレルのＤＮＡ配列を確認した。これと同様のＰＣＲクローン化およびシーケンシング方法を再生シュートの葉試料のＤＮＡ配列の確認に用いた。
オフターゲット解析
Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒを用いて、シロイヌナズナゲノム内のＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１に対する潜在的オフターゲット遺伝子座を明らかにした。プロトスペーサー（シード配列）の塩基１〜１２との配列同一性に基づく５つのオフターゲット部位の変異をスクリーニングした。既に記載した通りにシロイヌナズナプロトプラストにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１をトランスフェクトした。７２時間後、ｇＤＮＡを抽出し、潜在的オフターゲット部位に隣接するプライマーをＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ社）とともに用いてアンプリコンを作製した（図２７ｄ）。次いで、２×２５０ｂｐのＭｉＳｅｑランを用いてアンプリコンにディープシーケンシングを実施した。編集またはインデルを有する配列数を総配列数で除し、次いで１００を乗じることにより、インデルの割合を算出した。
アマ（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）植物体材料の分子スクリーニング
ＥｖｏＰＵＲＥ植物ＤＮＡキット（Ａｌｉｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ウォバーン、マサチューセッツ州）を用いて微小コロニーまたはマイクロカルス試料のゲノムＤＮＡを抽出し、アレル特異的ｑＰＣＲを用いてスクリーニングした。次いで、陽性スコアのＰＣＲフラグメントを製造業者のプロトコル通りにｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＴＯＰＯ−ＴＡクローン化した。次いで、通常１０〜１５個の形質転換細胞のクローン化ＰＣＲフラグメントにＴｅｍｐｌｉＰｈｉシーケンシング（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を実施して、単一の単離カルス由来の各ＥＰＳＰＳアレルのＤＮＡ配列を確認した。これと同様のＰＣＲクローン化およびシーケンシング方法を、得られたシュートのＤＮＡ配列の確認に用いた。
除草剤耐性試験
カルスおよび再生植物体のグリホサート耐性をそれぞれｉｎ ｖｉｔｒｏおよび温室で評価した。個々のカルスを新鮮な再生培地で小片に切り分けて培養し、カルス塊を増大させることによりクローン化した。野生型葉プロトプラスト由来のカルスを陰性対照として用いた。次いで、個々のカルス系の継代培養から得られたカルスをプールし、液体ＭＳ培地（４．３３ｇ／Ｌ ＭＳ塩、３％スクロースおよび０．１％ＭｏｒｅｌおよびＷｅｔｍｏｒｅビタミン）中で混ぜ合わせることにより０．５〜１ｍｍの小片に分割し、沈殿したカルス片０．２５ｍｌを０ｍＭ、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは２．０ｍＭのグリホサートを含有する再生培地に接種した。３連で処理を実施し、実験を３回反復した。再生植物体には、噴霧試験の前に生育用チャンバ（Ｃｏｎｖｉｒｏｎ社、ウィニペグ、マニトバ州）内で１６時間の光周期下、日中および夜間の温度をそれぞれ２１℃および１８℃とする硬化期間を設けた。硬化した植物体を温室に移し、グリホサート処理を実施した。野生型対照およびＥＰＳＰＳ編集植物体に１０．５ｍＭまたは２１．０ｍＭのグリホサート（Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｐｒｏ、Ｍｏｎｓａｎｔｏ社）を噴霧した。畑での条件を再現するため、処理速度を７５．７ａｉ／Ａ（１エーカー当たりの有効成分）の噴霧体積に正規化した。界面活性剤単独のモック処理を対照として含めた。グリホサート処理から６日後、植物体の評価および写真撮影を実施して除草剤耐性を明らかにした。
統計解析
両側分布のスチューデントｔ検定を用いて統計的有意性を決定した。ｐ値＜０．０５を有意であると見なした。データを平均±ＳＥＭで表す。
考察
ＧＲＯＮ媒介性遺伝子編集を増強するため、この実施例にはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いた。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に関して例示したが、操作されたヌクレアーゼを二本鎖ＤＮＡを標的とし切断するようプログラムしてもよく、それによりＧＲＯＮ媒介性編集の増強に同等の機能を発揮することが予想される。このようなものとして、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのヌクレアーゼを挙げ得る。植物では、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）は通常、誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路によって修復され、それにより修復部位にランダムな欠失、挿入（インデル）および／または置換が生じる。高精度のゲノム編集は、標的遺伝子座付近のヌクレアーゼ誘導性ＤＳＢが相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復されることに依存し、ＨＤＲは、相同なＤＮＡ鋳型（多くの場合、姉妹染色分体）を必要とするためＮＨＥＪよりも精度の高い修復経路である。ＨＤＲ経路を利用することにより、ＧＲＯＮを操作されたヌクレアーゼとともに用いて、標的ＤＮＡに傷跡を残さない高精度のカスタム編集を施すことが可能となる。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は２つの構成要素、すなわち、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９）と、操作された一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）のキメラ融合物とからなる。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９の最初の２０の５’塩基とＤＮＡ標的との塩基対形成を介するＣａｓ９の標的核酸特異性を補助し、それにより部位特異的ＤＳＢが生じる。
ＢＦＰトランスジェニックモデルに由来するシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９編集系の効果を用いて、この系の効果を明らかにした。このモデルでは、Ｈ６６（ＣＡＣ）をコードするコドンをＹ６６（ＴＡＣ）に編集することにより、ａａが安定に組み込まれたＢＦＰ遺伝子をＧＦＰに変換することができる（図２７ａ、２７ｂ）。ＮＨＥＪ修復事象が残したインデルの傷跡を確認することにより、ＢＦＰ Ｈ６６遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドであるＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１の活性を明らかにした。プロトプラストをＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１で処理した場合、ディープシーケンシングによりインデルが１４．５％の頻度で検出され、標的化効率が高いことが示された（図２７ｃ）。注目すべきなのは、欠失の数が挿入の数を上回り、いずれのタイプもインデルの大部分が単一の塩基対であったことである（図２７ｃ）。Ｃａｓ９単独処理またはモック処理を実施したプロトプラストでは、Ｈ６６標的部位に近接するインデルは検出されなかった（データ不掲載）。
このモデル系由来のプロトプラストでＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１の活性が確立されたため、Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒを用いてシロイヌナズナゲノム内にＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１標的配列との類似性が高い候補オフターゲット配列を探索することにより、ＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１の潜在的オフターゲット活性を検討した１７。ディープシーケンシングを用いて、探索に基づきＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１標的配列と最も相同性の高い５つの部位を検討した１８，１９。５つの被験部位のうち１つの遺伝子座Ｏｆｆ−１にのみ、極めて低い頻度でインデル事象が検出された（図２７ｄ）。このレベルは検出可能なものではあるが、オンターゲット対照と比較して２４倍弱いものであった。Ｏｆｆ−１遺伝子座に認められた活性は、ミスマッチが１つのみ存在するＰＡＭ部位の近位にある配列との相同性に基づくものではないかと思われる。
次に、このモデル系を用いて、ＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１と組み合わせたＧＲＯＮがＢＦＰからＧＦＰへの高精度の遺伝子編集を促進する効果を検討した。ＧＲＯＮとＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１（ＢＦＰ／４１）の両方を同時に導入すると、フローサイトメトリーによる解析で、ＧＲＯＮ単独処理と比較してＢＦＰからＧＦＰへの編集の著明な改善が確認された（図２７ｅ）。以上の結果をまとめると、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドＢＦＰ ｓｇＲＮＡ−１は、ＢＦＰ遺伝子のＨ６６遺伝子座を能動的に破壊し、オフターゲットの痕跡をほとんど残さないことが可能であることがわかる。さらに、ＧＲＯＮをＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１とともに導入すると、高精度で傷跡のないＢＦＰからＧＦＰへの編集の頻度が有意に増大する。
３つの隣接するＰＳ修飾を含むＧＲＯＮ（ＢＦＰ／４１／３ＰＳ）をＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１と組み合わせて用いた場合、ＢＦＰからＧＦＰへの高精度で傷跡のない編集が未修飾ＧＲＯＮと比較して多く確認された（ＢＦＰ／４１；図２８ａ）。５’シアニン色素Ｃｙ３と３’ｉＤｃ逆塩基とを含む第二のＧＲＯＮ修飾を試験した場合にも同様の結果がみられた（データ不掲載）。長さが４１核酸塩基（ｎｂ）および１０１核酸塩基（ｎｂ）のＧＲＯＮで３ＰＳ修飾を有するもの、または有さないものもＢＦＰ＿ｓｇＲＮＡ−１とともに試験した。複数の実験で、１０１ｎｂのＧＲＯＮは、これより短い４１ｎｂのＧＲＯＮと比較して、３ＰＳ修飾とは無関係な編集効率の増大を一貫して示した（図２８ｂ）。注目すべきなのは、試験したいずれの長さのＧＲＯＮも、３ＰＳ修飾の方がＢＦＰからＧＦＰへの編集が未修飾のものより優れていた。長さ２０１ｎｂのＧＲＯＮは１０１ｎｂのＧＲＯＮと同程度の編集効率を示す（データ不掲載）。以上のデータをまとめると、操作されたヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と組み合わせた場合、３ＰＳ修飾およびＧＲＯＮの長さがシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストの遺伝子編集の頻度を大幅に改善し得ることがわかる。
ＧＲＯＮと操作されたヌクレアーゼが媒介する遺伝子編集の用途を他の植物系にも拡大するため、アマ（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）の２つのＥＰＳＰＳ（５’−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素）遺伝子座も標的とした。ＥＰＳＰＳ遺伝子は、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの生合成に関与するシキミ酸経路の酵素をコードする。植物では、ＥＰＳＰＳは除草剤グリホサートの標的であり、この場合、グリホサートはホスホエノールピルビン酸に対する結合部位の競合阻害剤として作用する。
標的化効率を改善するため、編集によりＥＰＳＰＳ酵素にグリホサートに対する耐性が付与される２つの遺伝子座（Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａ）付近にある両ＥＰＳＰＳ遺伝子で保存された配列を標的とするよう１４４ｎｂのＣｙ３修飾ＧＲＯＮ（ＥＰＳＰＳ／１４４／Ｃｙ３）とＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミド（ＥＰＳＰＳ＿ｓｇＲＮＡ−２）を設計した（図２９）。標的とする変化を含む１４４ｎｂのＣｙ３修飾ＧＲＯＮをＥＰＳＰＳ＿ｓｇＲＮＡ−２とともにプロトプラスト内に送達し、次いで、処理済みプロトプラストから誘導された２１日齢の微小コロニーの遺伝子編集およびインデル形成をディープシーケンシングにより測定した。３つの独立した実験で、高精度で傷跡のない遺伝子編集の頻度の範囲が０．０９〜０．１９％、インデルの範囲が１９．２〜１９．８％であった（表１）。いずれの実験でも、ＥＰＳＰＳ遺伝子はともに、比例する数の編集およびインデルを示し（データ不掲載）、ＧＲＯＮとＥＰＳＰＳ＿ｓｇＲＮＡ−２が両遺伝子の編集に効果があることが示唆された。
Figure 2019506170
ａｇＤＮＡを約１０，０００個の微小コロニーからなるプールから単離し、次いでこれを鋳型に用いて標的領域を増幅した
ｂＴ９７Ｉ（ＡＣＡ＞ＡＴＡ）およびＰ１０１Ａ（ＣＣＧ＞ＧＣＧ）変化のみのシーケンシング；データは遺伝子１と遺伝子２の合計
ｃ個々のカルスを最初にアレル特異的ＰＣＲでスクリーニングし、次いでサンガーシーケンシングにより確認した
５１６７個のカルスのうち、８（０．１５％）個が少なくとも一方のＥＰＳＰＳ遺伝子にＴ９７Ｉ変化とＰ１０１Ａ変化の両方を保有することがわかった（表１）。この結果およびインデルの頻度は、２１日齢の微小コロニーから得た最初のディープシーケンシングデータとよく相関していた。陽性カルス材料から非選択的条件下でシュートを再生させ、ＤＮＡクローン化およびサンガーシーケンシングによりＴ９７ＩおよびＰ１０１Ａの編集の存在を連続的に確認した（図２９ｃ）。以上のデータから，アマ（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）プロトプラストに２つの内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子の高精度の標的化された編集およびインデルの傷跡を生じさせ、次いで、それをシュート再生の過程で確認し非選択的に維持することが可能であることがわかる。
高精度の編集のスクリーニングで陽性を示したカルスを用い、非選択的条件下で植物体全体を再生させたところ、その１００％が、ＤＮＡクローン化およびサンガーシーケンシングによるスクリーニングで少なくとも一方のＥＰＳＰＳ遺伝子のＴ９７Ｉ編集およびＰ１０１Ａ編集の存在が陽性であった（図２９ｂ−６）。ＥＰＳＰＳ＿ｇＲＮＡ−２処理により再生植物体（Ｙ２３）に生じる潜在的オフターゲット変異を確認するため、ＥＰＳＰＳ＿ｓｇＲＮＡ−２プロトスペーサーとの配列類似性を有する領域をＰＣＲで増幅し、ディープシーケンシングによりＮＨＥＪの傷跡を測定した。これらの潜在的オフターゲット部位のいずれにも変異は確認されなかった：
Figure 2019506170
 ａＰｈｙｔｏｚｙｍｅ １０．２から得た足場または遺伝子座ＩＤ
ｂ足場内でのプロトスペーサーの位置
ｃ赤い小文字の塩基はＥＰＳＰＳ＿ｓｇＲＮＡプロトスペーサーに対するミスマッチ数である
ｄシーケンシングにより明らかになった変異；オフターゲット変異はＴ９７ＩおよびＰ１０１Ａである
Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａの変異により与えられるグリホサート耐性を明らかにするため、ＥＰＳＰＳ遺伝子２のＴ９７ＩおよびＰ１０１Ａ編集に対してヘテロ接合性であることが確認されたカルス系（Ｙ２３）ならびにこのカルスから再生した植物体全体をグリホサートに曝露した。試験したいずれのグリホサート濃度でも、Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａ編集を保有するカルスの生重量の方が野生型カルスの生重量より有意（ｐ＜０．０１）に大きかった（図３０ａ、３０ｂ）。野生型植物体および編集を有する植物体を温室条件下で栽培し、１０．５ｍＭまたは２１．０ｍＭのグリホサートを含有する溶液を噴霧し、処理から６日後に評価した。野生型植物体にはいずれの塗布率でも、グリホサート中毒に典型的なしおれた壊死性の表現型がみられたのに対し、編集ＥＰＳＰＳ遺伝子を保有する植物体の表現型の変化は最小限のものであった（図３０ｃ）、この結果から、編集ＥＰＳＰＳ遺伝子が１つあれば、２つの比率のグリホサートで耐性レベルが対照植物体に観察されるレベルよりはるかに高くなることがわかる。以上のデータを考え合わせると、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と組み合わせたＲＴＤＳにより、高精度の標的化された編集が十分な頻度で得られるため、これらの編集およびインデルの傷跡を分子スクリーニングにより検出し、非選択的培養条件下で維持し、効率的に植物体に再生させることが可能であることがわかる。
この解析ののち、ＧＲＯＮをＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と組み合わせて用い、除草剤抵抗性を与える遺伝子に高精度の編集を有するイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）カルスも得られた。さらに、ＴＡＬＥＮと組み合わせたＧＲＯＮをシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）に用い、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と組み合わせたＧＲＯＮをセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）に用いて、ＢＦＰからＧＦＰへの導入遺伝子の再現可能な編集が得られた。
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実施例２４．アマにおける切断因子およびＧＲＯＮ
ＴＡＬＥＮ発現構築物ＢＴ−１およびＬｕＥＴ−１の設計および構築は、Ｃｅｒｍｅｋら（２０１１）に記載されている法則に基づくものとした。遺伝子編集部位ならびにＮＧ、ＨＤ、ＮＩおよびＮＮがそれぞれＴ、Ｃ、ＡおよびＧを認識するという法則に従う反復可変ｉ残基（ＲＶＤ）に基づき標的配列を選択した。市販のサービス（ＧｅｎｅＡｒｔ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により、ヘテロ二量体ＦｏｋＩドメインと結合したＴＡＬエフェクタードメインの組み立てを完了した。ギブソン法（Ｇｉｂｓｏｎら，２００９）を用いて、ＭＡＳプロモーターとｒｂｃＥ９ターミネーターの間にＴＡＬＥＮモノマーをクローン化し、結合単位として発現させた（図３３ａおよび３６ａ）。ＧＲＯＮはいずれもＴｒｉｌｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。
Figure 2019506170
 ＊ＥＰＳＰＳ／１４４は、それぞれがＥＰＳＰＳ遺伝子１および２のＳＮＰに特異的な配列を含む２つのオリゴヌクレオチドの等モル混合物からなる。ともにＴ９７Ｉ編集およびＰ１０１Ａ編集を含む。
上記の配列の参照図は以下の通りである：ＢＦＰ／４１：図３１ｂ、３２ａ、３５ｂ；ＢＦＰ／４１／ＮＴ：図３２ａ；ＢＦＰ／１０１：図３１ｂ、３５ｂ；ＢＦＰ／２０１：図３１ｂ、３５ｂ；ＥＰＳＰＳ／１４４：図３６ｂ。
ＴＡＬＥ結合ドメインの配列：
Figure 2019506170
上記の配列の参照図は以下の通りである：ＢＴ−１：図３３ａおよび３３ｂ；ＬｕＥＴ−１：図３６ａおよび３６ｂ。
この試験に使用したプライマー：
Figure 2019506170
上記の配列の参照図は以下の通りである：ＢＦＰＦ−１：図３３ｄ、３３ｅ、３４ａおよび３４ｂ；ＢＦＰＲ−１：図３３ｄ、３３ｅ、３４ａおよび３４ｂ；ＬｕＥＰＦ−１：図３７ａ、３７ｂ、３７ｃ、３７ｄ、３８ａ；ＬｕＥＰＲ−１：図３７ａ、３７ｂ、３７ｃ、３７ｄ、３８ｂ。
シロイヌナズナ：表面滅菌したシロイヌナズナ種子を１２時間の明暗サイクルの下、２５℃で固形１／２ＭＳ培地（半分の濃度のミネラルおよびビタミン；８７．７ｍＭスクロースを含有するＭＳ培地；ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ，１９６２）上で発芽させた。２〜３週齢の実生の根を採取し、１／２ＭＳ液体培地中、２５℃、暗所にて維持した。プロトプラスト単離の３週間前、培養物をＭＳＡＲ１．１（１１．４μＭ ＩＡＡ、４．６μＭ ２，４−Ｄを含むＭＳＡＲ；ＭａｔｈｕｒおよびＫｏｎｃｚ，１９９５）に移して維持し、根分裂組織（ＲＭＴ）を維持した。ＲＭＴを小さいセグメントに切り、ＭＳＡＲ１．２酵素溶液（０．４ Ｍマンニトール、１．２５％セルラーゼＲＳ、０．２５％マセロザイムＲ−１０、５ｍＭ ＭＥＳ、０．１％ＢＳＡを含有するＭＳＡＲ１．１）中、暗所で穏やかに振盪しながら１６時間インキュベートした。解離したプロトプラストを収集し、無菌の１００μｍフィルターおよび３５μｍフィルターに連続して通した。プロトプラストろ液を密度遠心分離により精製した。プロトプラスト層を収集し、２倍体積のＷ５（１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ ５．８；Ｍｅｎｃｚｅｌら，１９８１）と混合した。プロトプラストを４４ＲＣＦで１０分間遠心分離し、１×１０６細胞／ｍｌの密度でＴＭ溶液（１４．８ｍＭ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、５ｍＭ ＭＥＳ、５７２ｍＭマンニトール、ｐＨ５．８）中に再懸濁させた。フレオマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いた実験には、トランスフェクションの前にプロトプラストをｐＨ７．０に調整したＴＭ中、氷上で９０分間保持した。抗生物質の濃度については図３１ａを参照されたい。
９６ウェル平底プレートでＰＥＧ媒介送達［２７０ｍＭマンニトール、６７．５ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２、３８．４％ＰＥＧ１５００］を用いて、１ウェル当たり２．５×１０５個のシロイヌナズナプロトプラストに１．２ｎｍｏｌ ＧＲＯＮのみを、９３ｐｍｏｌ ＧＲＯＮと７．５μｇ ＢＦＰ ＴＡＬＥＮプラスミド（ＢＴ−１）を、またはＤＮＡなしでトランスフェクトした。トランスフェクションを氷上で１０分間実施し、次いでＷ５溶液２００μｌで洗浄した。最後に、ＭＳＡＰ（０．４Ｍマンニトールを含有するＭＳＡＲ１．１）８５μｌを加え、細胞を暗条件下、２５℃で培養した。
アマ（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）：ｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた３週齢の実生からアマプロトプラストを単離した。植物組織を解剖用メスで細切し、Ｂ培地［Ｂ５塩およびビタミン、４ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１Ｍグルコース、０．３Ｍマンニトール、０．１Ｍグリシン、２５０ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物、１０ｍｇ／ｌ Ｌ−システイン−ＨＣｌ、０．５％ポリビニルピロリドン（ＭＷ１０，０００）、０．１％ＢＳＡ、１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、０．２ｍｇ／ｌ ＮＡＡおよび０．５ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ；Ｇａｍｂｏｒｇら，１９６８］中、室温で１時間、予め原形質分離させ、回転式振盪機（５０ｒｐｍ）上で０．６６％セルラーゼＹＣおよび０．１６％マセロザイムＲ−１０を添加したＢ培地を含有する細胞壁消化酵素中、２５℃で５時間インキュベートした。解離したプロトプラストをふるいにかけ、密度勾配遠心分離により精製し、暗所にてＢ培地中０．５×１０６プロトプラスト／ｍｌの密度で一晩静置した。
１８時間培養した後、ＰＥＧ媒介性送達を用いて１×１０６個のアマプロトプラストに２００ｐｍｏｌのＧＲＯＮを２０μｇのＥＰＳＰＳ ＴＡＬＥＮプラスミド（ＬｕＥＴ−１）とともにトランスフェクトした。処理済みプロトプラストをＢアルギン酸ビーズ（Ｒｏｇｅｒら，１９９６）に０．５×１０６プロトプラスト／ｍｌアルギン酸の密度で封入し、培地中、２５℃、暗所にて最大２４時間インキュベートし、０．０２ｍｇ／ｌのチジアズロン（ＴＤＺ）および０．００２ｍｇ／ｌのＮＡＡを添加した基本Ｖ−ＫＭ液体培地（ＢｉｎｄｉｎｇおよびＮｅｈｌｓ、１９７７）で培養した。トランスフェクションから１週間後、約５０，０００個の細胞から抽出したｇＤＮＡのＮＧＳＥＰＳＰＳ遺伝子を標的とする配列編集を評価した。
シロイヌナズナのＢＦＰからＧＦＰへの編集の検出：トランスフェクションから７２時間後、Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇサイトメータ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールスバド、カリフォルニア州）を必要に応じてＧＦＰの励起および発光検出の設定で用いたサイトメトリーによりシロイヌナズナプロトプラストを解析した。バックグラウンドレベルは、ＤＮＡ送達を実施しないＰＥＧ処理プロトプラストに基づくものとした。抗生物質実験には、トランスフェクション前にフレオマイシンで処理したプロトプラストをトランスフェクションから２４時間後にサイトメトリーにより解析した。
インデル解析：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｎｔ ＩＩキットを製造業者の推奨（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ社、ベツレヘム、パレスチナ）通りに用いて、シロイヌナズナまたはアマの処理済みプロトプラストからゲノムＤＮＡを抽出した。ＢＴ−１またはＬｕＥＴ−１ ＴＡＬＥＮ標的領域に隣接するプライマーとともにＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼおよび１００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いてアンプリコンを作製した（図３８）。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）を用いてアンプリコンを精製し濃縮した後、２×２５０ｂｐのＭｉＳｅｑラン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてディープシーケンシングを実施した。データ解析には、リード１およびリード２のＦＡＳＴＱファイルをＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ７．０．４（ＣＬＣＢｉｏ社、ボストン、マサチューセッツ州）にインポートした。ペアリードの配列がオーバーラップしている場合、それを単一配列にまとめた。アンプリコンの配列またはその逆配列および相補配列に順方向プライマー配列および逆方向プライマー配列がともに含まれている場合、それを特定した。試料中に固有の配列があれば、その存在量として記録した。編集またはインデルを有する配列の数を総配列数で除し、次いで１００を乗じることにより、インデルまたは標的化編集のパーセントを算出した。
統計解析
両側分布のスチューデントｔ検定を用いて統計的有意性を決定した。ｐ値＜０．０５を有意であると見なした。データは平均およびＳＥＭで表す。
結果および考察
シロイヌナズナにおけるＢＦＰからＧＦＰへの変換へのＲＴＤＳ技術の応用
Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｉｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＤＳ（商標））は、天然または固有のＤＮＡ修復系を利用して標的特異的に遺伝子の編集を可能にする先進のオリゴヌクレオチド誘発突然変異導入（ＯＤＭ）技術である。真核細胞では、ＧＲＯＮが細胞膜を横断することにより細胞に侵入し、次いで核まで横断し、そこで標的配列に対して選択的かつ特異的に位置して結合し、その標的遺伝子に配列特異的変化１つまたは複数）を生じさせる。標的遺伝子が編集された後、細胞内のヌクレアーゼおよびその他の分解酵素がＧＲＯＮを分解する（図３１ａ）。シロイヌナズナにおけるＲＴＤＳの効果を明らかにするため、ＢＦＰトランスジェニック系列に由来するプロトプラスト（Ｈ６６（ＣＡＣ）をコードするコドンをＹ６６（ＴＡＣ）に編集することにより、安定に組み込まれたＢＦＰ遺伝子がＧＦＰに変換され得る（図３１ｂ））を用いた。この系を用いて、フローサイトメトリーにより細胞の緑色蛍光に基づき遺伝子編集を判定し得る。この系列由来のプロトプラストを０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬまたは１０００μｇ／ｍＬのグリコペプチド系抗生物質フレオマイシンで９０分間処理した。次いで、ｓｓＯＤＮ ＢＦＰ／４１またはＢＦＰ／４１／ＮＴ（ＢＦＰ／４１／ＮＴは陰性対照としての役割を果たし、ＢＦＰをＧＦＰに変換するＣ→Ｔ編集を含まない）を導入し、送達から２４時間後、サイトメトリーによりＧＦＰ蛍光をモニターした。ＢＦＰ／４１およびフレオマイシン前処理によりＧＦＰ陽性細胞の数が用量依存性に増加した（図３２）。以上の結果は、シロイヌナズナプロトプラストでは、ｓｓＯＤＮがフレオマイシンなどの非特異的ＤＳＢ試薬に基づくゲノム編集の頻度および精度を増大させ得ることを示す証拠となる。
シロイヌナズナにおいてＢＦＰをＧＦＰに変換するためのＲＴＤＳ技術とグリコペプチド系抗生物質の組合せ
低用量のグリコペプチド系抗生物質に曝露した哺乳動物細胞を所望の塩基変化を保有するオリゴヌクレオチドと組み合わせた場合、標的化遺伝子編集の増強がみられることが既に報告されている（Ｓｕｚｕｋｉら，２００３）。これらの試薬はＤＮＡと結合して相互作用し、二重らせんの完全性を破壊し、ＤＮＡ二本鎖切断を生じさせる。これらの抗生物質はＤＮＡ修復遺伝子の発現／活性を上昇さること、標的部位付近に二本鎖切断を引き起こすこと、または両者の組合せによりＯＤＭを増強するのではないかと考えられる。ＧＲＯＮと組み合わせた低用量グリコペプチド系抗生物質処理の効果を試験するため、シロイヌナズナプロトプラストを１０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬおよび１０００μｇ／ｍＬのグリコペプチド系抗生物質フレオマイシンと９０分間インキュベートし、次いで、ＧＲＯＮ ＢＦＰ／４１またはＣ＞Ｔ編集を含まない陰性対照ＧＲＯＮ ＢＦＰ／４１／ＮＴを導入し、２４時間後、サイトメトリーによりプロトプラストのＧＦＰ蛍光をモニターした。プロトプラストを最低濃度のフレオマイシン（１０μｇ／ｍＬ）で処理した場合、Ｓｕｚｕｋｉらが用いた濃度より大幅に高い濃度の抗生物質を用いたにもかかわらず、ＢＦＰ／４１／ＮＴ対照と比較してＧＦＰ陽性細胞数の改善はみられなかった（２００３；データ不掲載）。しかし、これより高い２５０μｇ／ｍＬおよび１０００μｇ／ｍＬの濃度では、フレオマイシン前処理によりＧＦＰ陽性細胞が用量依存性に増加し、１０００μｇ／ｍＬでは変換頻度が０．１４％に達した（図３２ａ）。図３２ｂに、ＧＲＯＮ送達およびグリコペプチド系抗生物質処理から５日後の編集されたシロイヌナズナプロトプラストを示す。
植物細胞膜は抗生物質の透過性が低いため、シロイヌナズナでは哺乳動物細胞と比較して上記のような高レベルのフレオマイシン処理が必要とされるものと考えられる。例えば、ＳｉｄｉｋおよびＳｍｅｒｄｏｎ（１９９０）は、ヒト線維芽細胞では、ブレオマイシンで処理する前に膜透過促進剤のリゾホスファチジルコリンで前処理すると、ＤＮＡ修復合成の量が透過促進剤で処理しない細胞と比較して有意に増大することを明らかにしている。同著者らは、この効果は細胞に侵入するブレオマイシンの量が少ないことに起因するものと考えた。シロイヌナズナの細胞膜がフレオマイシンに対する透過性が低いかどうかは明らかではないが、上記の結果は、高レベルのフレオマイシンで前処理することによりＧＲＯＮ媒介性遺伝子編集が有意に増大することを確かに示している。遺伝子編集に対するこのような正の効果が標的部位付近の二本鎖ＤＮＡ切断の増大に基づくものなのか、ＤＮＡ修復経路のアップレギュレーションに基づくものなのか、あるいは両者の組合せにもとづくものなのかは明らかではない。無差別的な性質により精度が低いＮＨＥＪ修復事象の結果としてフレオマイシンが他の非標的化変化を導入する可能性が考えられるが、そのようなランダムな変異があれば、後続する植物育種により排除されるものと思われる。このような変異は、従来の育種プログラムの一環として化学的突然変異誘発を用いて誘導される変異と同じようなものである。したがって、ＲＴＤＳに基づく高精度の遺伝子変種を改善する方法としてフレオマイシンを使用することは、注目に値するものであり、ＤＮＡ二本鎖切断の発生が植物での変換効率を改善するのに重要な因子となり得ることを示している。
シロイヌナズナにおいてＢＦＰをＧＦＰに変換するためのＲＴＤＳ技術とＴＡＬＥＮの組合せ
本発明者らのシロイヌナズナＢＦＰトランスジェニック系列においてＢＦＰをＧＦＰに変換するのに必要なＣ＞Ｔ編集のすぐ下流を標的とし切断するＴＡＬＥＮ（ＢＴ−１）（図３２ａおよび３２ｂ）を以下の実験に用いた。ＢＴ−１ ＴＡＬＥＮ対は、１２ｂｐのスペーサー領域により隔てられた２つの１７ｂｐ配列を認識し、Ｃｅｒｍｅｋら（２０１１）に概説されている構造仕様に従って設計されたものである。標的部位（Ｃ＞Ｔ）は左ＴＡＬＥＮアーム内にあり、したがって、予測切断部位の上流にあることになる。ウエスタンブロットを用いることにより、シロイヌナズナプロトプラストに一過性のＢＴ−１タンパク質発現が確認された（図３３ｃ）。次に、ＢＴ−１の切断効率を評価するため、ＴＡＬＥＮ導入から７２時間後、ＢＴ−１をトランスフェクトしたプロトプラストのゲノムＤＮＡを単離し、次いで、上に挙げたプライマーを用いて、ＴＡＬＥＮ結合部位付近の領域をＰＣＲで増幅した（図３８）。得られたアンプリコンをディープシーケンシングにより、ＴＡＬＥＮ切断部位付近の精度の低いＮＨＥＪ事象により生じたインデルの傷跡または置換について評価した。ＢＴ−１で処理したプロトプラストには、２．９％の頻度で挿入欠失変異がみられ、５．１％の頻度で置換がみられた（図３４ａ）。欠失は大部分が≦２０ｂｐ未満であり、挿入の数を大幅に上回っていた（図３４ｂ）。ｂｐの長さで２０ｂｐ以下のインデルの分布を図３４ｃおよび３４ｄに示す。
本発明者らのＢＦＰ導入遺伝子の標的化におけるＢＴ−１の活性を確認した後、ＢＴ−１ ＴＡＬＥＮと組み合わせたＧＲＯＮがＢＦＰからＧＦＰへの変換を媒介する際の組合せ効果を試験した。ＢＴ−１ ＴＡＬＥＮを、Ｈ６６Ｙアミノ酸置換をコードするヌクレオチド変化を含むＧＲＯＮ ＢＦＰ／４１、ＧＲＯＮ ＢＦＰ／１０１またはＧＲＯＮ ＢＦＰ／２０１とともにシロイヌナズナプロトプラスト内に導入した。ＢＦＰ／１０１およびＢＦＰ／２０１には、修正されたＧＦＰ遺伝子上での不必要なＴＡＬＥＮ活性を阻止する５つのサイレント変異が含まれている（図３５ａ）。ＧＲＯＮおよびＴＡＬＥＮの送達から７２時間後、フローサイトメトリーによりＧＦＰ蛍光を測定した。ＧＲＯＮとＴＡＬＥＮの両方で処理したプロトプラストでは、ＧＲＯＮ単独処理（図３１ｃ）またはモック処理（図３５ｂ）と比較して有意に多い（２５〜４５倍）ＧＦＰ蛍光細胞がみられた。この観察結果は、ＴＡＬＥＮと組み合わせた一本鎖オリゴにより哺乳動物細胞での遺伝子編集率が有意に増大したことを報告しているＳｔｒｏｕｓｅら（２０１４）らのものとほぼ同じである。ＧＲＯＮとＴＡＬＥＮを組み合わせた処理では、遺伝子編集に対してＧＲＯＮの長さに依存する同程度の正の効果が認められた（図３５ｂ）。以上の結果を考え合わせると、シロイヌナズナプロトプラストでは、ＲＴＤＳ媒介性遺伝子編集と標的化ＤＮＡ二本鎖切断因子（ＴＡＬＥＮ）とを組み合わせた方法を用いることにより、ＧＲＯＮの長さに依存するようにＢＦＰからＧＦＰへの編集の頻度が有意に改善されることがわかる。
次に、ｓｓＯＤＮが、より標的特異的な切断をもたらすＤＳＢ試薬が誘導するゲノム編集の結果にも正の影響を及ぼし得るかどうかを明らかにするため、本発明者らのシロイヌナズナトランスジェニック系列でのＢＦＰからＧＦＰへの変換に必要なＣ→Ｔ編集のすぐ下流を標的とし、そこにＤＳＢを生じさせるＴＡＬＥＮ発現構築物（ＢＴ−１）（図３３Ｃ）を用いた。ＢＴ−１ ＴＡＬＥＮ構築物は２つのアームからなり、両アームとも、ＦｏｋＩの触媒性ＤＮＡヌクレアーゼドメインと結合したＴＡＬエフェクター様ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥ）を有する。ＴＡＬＥドメインはＴＡＬＥＮアームをＤＮＡの特異的部位に誘導し、これによりＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの二量体化が起こり、次いで、２つの結合部位の間にあるスペーサー領域に標的化ＤＮＡ二本鎖切断が生じる（Ｃｅｒｍａｋら，２０１１）。各ＢＴ−１ ＴＡＬＥは、１４ｂｐのスペーサーにより隔てられた１９ｂｐ配列を認識し、短縮Ｎ１５２／Ｃ＋６３構造からなるものである（Ｍｉｌｌｅｒら，２０１１）。
スペーサー領域に起こる精度の低いＮＨＥＪ修復事象を測定することによるＢＦＰ導入遺伝子の標的部位におけるＢＴ−１活性を以下の通りに検討した。ＢＴ−１の導入から７２時間後に処理済みプロトプラストから全ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより標的領域を増幅した。次いで、ＰＣＲアンプリコンに５００，０００リード超の深度までディープシーケンシングを実施した（追加の図Ｓ１Ａおよび表Ｓ３）。解析から，欠失および挿入の頻度はそれぞれ平均２．６％および０．３％であることがわかった（図３７Ａ）。欠失は大部分が２０ｂｐ以下であり、大きさの分布は挿入の方が均等であった（図３７Ｂ）。ＢＦＰ導入遺伝子上でのＢＴ−１の標的化活性を確認した後、次に、ｓｓＯＤＮとＢＴ−１ ＴＡＬＥＮとを組み合わせてＢＦＰをＧＦＰに変換する効果を試験した。これらの実験では、３つの異なる長さのｓｓＯＤＮ（ＢＦＰ／４１、ＢＦＰ／１０１またはＢＦＰ／２０１）を検討し、それぞれ独立にＢＴ−１プラスミドとともに、またはＢＴ−１プラスミドなしでシロイヌナズナプロトプラスト内に送達した。次いで送達から７２時間後、生じたＢＦＰからＧＦＰへの編集をサイトメトリーにより定量化した。ｓｓＯＤＮとＢＴ−１ ＴＡＬＥＮの両方で処理したプロトプラストでは、緑色蛍光を発する細胞が、ｓｓＯＤＮ単独処理の２５〜４５倍みられ、ＴＡＬＥＮを単独で使用した場合の１２５倍みられた（図３７Ｃ）。注目すべきなのは、ＢＴ−１ ＴＡＬＥＮと組み合わせた場合、単独で使用した場合を問わず、ｓｓＯＤＮの長さがＢＦＰからＧＦＰへの編集の頻度に正の効果を及ぼしたことである。以上のデータを考え合わせると、ｓｓＯＤＮを標的特異的ＤＳＢ試薬と組み合わせた場合、高精度のゲノム編集の頻度が、非特異的ＤＳＢ試薬で観察される頻度の約１０倍になることがわかる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と組み合わせたｓｓＯＤＮ
ｓｓＯＤＮとＴＡＬＥＮと組み合わせることにより、ゲノム編集の頻度がＴＡＬＥＮまたはｓｓＯＤＮを単独で使用した場合より有意に改善された。しかし、新たなＤＮＡ標的ごとにＴＡＬＥＮタンパク質を再設計することの複雑さを考慮し、本発明者らは、さらに容易に設計および構築した操作されたヌクレアーゼＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９でも、ｓｓＯＤＮを補えばゲノム編集頻度の増大がみられるかどうかを問うた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、操作された一本鎖ガイド（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡ（ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ）のキメラ融合物とからなる。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９の最初の２０の５’塩基とＤＮＡ標的との塩基対形成を介するＣａｓ９の標的核酸特異性を補助し、それにより部位特異的ＤＳＢが生じる（Ｃｏｎｇら，２０１３）。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質複合体の標的特異性を変化させるには、大がかりなタンパク質工学は必要とせず、ｓｇＲＮＡの最小限の操作だけで済む。以下の表に示すように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現プラスミドであるＢＣ−１（図３４Ａ）を、本発明者らのトランスジェニックモデルのＢＦＰ遺伝子の遺伝子座Ｈ６６付近を標的とするよう設計した（図３４Ｂ）：
Figure 2019506170
 ｓｇＲＮＡ配列中、下線を施した文字のＧはＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを適合させるため変化させたものである
本発明者らのＴＡＬＥＮに関する研究と同様の実験方法論に従い、ＰＡＭ配列の上流にみられる精度の低いＮＨＥＪ修復事象の頻度を測定することにより、ＢＣ−１がＢＦＰ遺伝子を標的とし切断することが可能かどうかを判定した。本発明者らはディープアンプリコンシーケンシングを用いて、ＢＣ−１で処理したプロトプラストに欠失および挿入をそれぞれ３．７％および２．４％の頻度で検出した（図３５Ａ）。挿入または欠失の最も代表的なインデルは単一塩基対であった（データ不掲載）。注目すべきなのは、ＢＣ−１（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）のＢＦＰ導入遺伝子標的化効率が、ＢＴ−１（ＴＡＬＥＮ）を用いた同様の実験と比較してほぼ３倍高かったことである（図３５Ｂ）。ＢＣ−１のオンターゲット活性が確認されたため、Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ（Ｂａｅら，２０１４）を用いてシロイヌナズナゲノムにＢＣ−１標的配列と高い類似性を有する配列を検索することにより、潜在的オフターゲット切断を試験した。検索に基づき、ＢＣ−１標的配列と最も高い相同性を示した５つの潜在的オフターゲット部位（Ｈｓｕら，２０１３）を検討した。シロイヌナズナプロトプラストをＢＣ−１で７２時間処理し、そののち、５つの潜在的オフターゲット部位それぞれに隣接するプライマーを用いてアンプリコンを作製した：
Figure 2019506170
次いで、アンプリコンディープシーケンシングにより上記のアンプリコンのＮＨＥＪ変異を解析した：
Figure 2019506170
試験した５つの部位のうち、予測切断部位付近に変異がみられたのはＯｆｆ−１のみであった（図３５Ｃ）。このレベルは検出可能なものではあるが、オンターゲット対照の約１３分の１である。Ｏｆｆ−１でのこの弱い活性は、ミスマッチが１つのみ存在するＰＡＭ部位の近位にある配列との相同性に基づくものである可能性がある（図３５Ｃ）（Ｈｓｕら，２０１３）。以上の結果をまとめると、ＢＣ−１は、ＢＦＰ導入遺伝子を能動的に標的として破壊し、オフターゲットの痕跡をほとんど残さないことが可能であることがわかる。さらに、ＢＣ−１により生じた高精度の切断をｓｓＯＤＮを用いて修正すると、シロイヌナズナプロトプラストの高精度で傷跡のないＢＦＰからＧＦＰへの編集の頻度が、ＢＣ−１またはｓｓＯＤＮを単独で使用した場合と比較して高くなる。
アマにおけるｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた高精度のＥＰＳＰＳ遺伝子編集の確立
ｓｓＯＤＮを操作されたヌクレアーゼと組み合わせて用いるゲノム編集の用途を商業的に重要な農作物に拡大するため、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）の相同性の高い２つのＥＰＳＰＳ（５’−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素）遺伝子座を標的とする一連の実験を実施した。ＥＰＳＰＳ遺伝子は、芳香族アミノ酸の生合成に関与するシキミ酸経路のタンパク質をコードする。植物では、ＥＰＳＰＳはグリホサートの標的であり、この除草剤はホスホエノールピルビン酸に対する結合部位の競合阻害剤として作用する（Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎら，２００１）。ｓｓＯＤＮをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素と組み合わせて用い、アマＥＰＳＰＳ遺伝子に高精度の編集を生じさせた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現プラスミド（ＥＣ−２）は、２つの遺伝子座Ｔ１７８およびＰ１８２の付近にある両ＥＰＳＰＳ遺伝子で保存された配列を標的とし、遺伝子座Ｔ１７８およびＰ１８２をＩ１７８およびＡ１８２に編集すると、ＥＰＳＰＳ酵素にグリホサートに対する耐性が付与される（Ｇｏｃａｌら，２００７）。一方がＰＡＭ配列を破壊する２つの標的化変化を含むｓｓＯＤＮ ＥＰＳＰＳ／１４４をＥＣ−２とともにアマプロトプラスト内に導入した。次いで、処理済みプロトプラストを２１日間、選択を用いずに分裂させて微小コロニーを形成させた（図７Ｂ）。
標的部位付近の領域をＰＣＲで増幅し、アンプリコンをディープシーケンシングに供することにより、両ＥＰＳＰＳ遺伝子座での高精度の編集およびインデルの傷跡を明らかにした。３つの独立した実験で、高精度のＥＰＳＰＳ編集の頻度は範囲が０．０９％〜０．２３％であり、インデルの頻度は範囲が１９．２％〜１９．８％であり、これらの編集およびインデルは２遺伝子座間で均等の分布していた：
Figure 2019506170
 ａｇＤＮＡを約１０，０００個の微小コロニーからなるプールから単離し、次いでこれを鋳型に用いて標的領域を増幅した
ｂＴ９７Ｉ（ＡＣＡ→ＡＴＡ）およびＰ１０１Ａ（ＣＣＧ→ＧＣＧ）を有する配列；データは遺伝子１と遺伝子２の合計
ｃ個々のカルスを最初にアレル特異的ＰＣＲでスクリーニングし、次いでサンガーシーケンシングにより確認した
ＮＳ−実験でスクリーニングを実施していない
微小コロニーにＴ１７８ＩおよびＰ１８２Ａの編集の存在を確認した後、ここでも同じく選択薬剤を一切用いずにカルスを再生させ、次いで、アレル特異的ＰＣＲを用いて標的化編集およびインデルの傷跡の分子スクリーニングを実施した（Ｍｏｒｌａｎら，２００９）。実験１でスクリーニングしたカルス５１６７個および実験２でスクリーニングしたカルス４６０１個のうち、それぞれ８個（０．１５％）および４個（０．０８％）に、少なくとも一方のＥＰＳＰＳ遺伝子座のＴ１７８Ｉ変化とＰ１８２Ａ変化の両方が含まれていた。この編集頻度は２１日齢の微小コロニーの最初のシーケンシングと相関していた。ここで得られた高精度の編集のスクリーニングで陽性を示したカルスを用いて、非選択的条件下で植物体全体を再生させたところ、その１００％が、ＤＮＡクローン化およびサンガーシーケンシングによるスクリーニングで少なくとも一方のＥＰＳＰＳ遺伝子のＴ１７８Ｉ編集およびＰ１８２Ａ編集の存在が陽性であった。土壌に移した再生植物体はいずれも稔性であり、遺伝子１または遺伝子２の遺伝子座におけるＴ１７８Ｉ編集およびＰ１８２Ａ編集に対してヘテロ接合性の遺伝子型であった。両方の遺伝子に対して両アレル性またはヘテロ接合性の植物体はなかった。次いで、単一カルス事象に由来する複数のＡ２３系植物体のＣ１（変換世代１）子孫を編集されたＥＰＳＰＳアレルの遺伝について評価した。配列解析から、編集されたＥＰＳＰＳアレルが、メンデルの法則から予想される分離比１：２：１で生殖伝達されることがわかった：
Figure 2019506170
ＥＣ−２処理により再生植物体Ａ２３に生じる潜在的オフターゲット変異を確認するため、ＥＣ−２プロトスペーサーとの配列類似性を有するアマゲノムの８つの異なる領域を増幅した。精度の低いＮＨＥＪ事象により生じたＮＨＥＪ変異がアンプリコンディープシーケンシングにより確認された。植物体Ａ２３について試験した８つの潜在的オフターゲット部位のいずれにもＥＣ−２活性を示す変異は検出されなかった：
Figure 2019506170
ａＰｈｙｔｏｚｙｍｅ １０．２から得た足場または遺伝子座ＩＤ
ｂ足場内でのプロトスペーサーの位置
ｃ小文字の塩基はＥＣ−２プロトスペーサーに対するミスマッチである
ｄシーケンシングにより明なった変異；オンターゲット変異はＴ１７８ＩおよびＰ１８２Ａである
編集されたカルスおよび植物体全体のグリホサート耐性
Ｔ１７８ＩおよびＰ１８２Ａの変異により与えられるグリホサート耐性を明らかにするため、ＥＰＳＰＳ遺伝子２のＴ１７８Ｉ編集およびＰ１８２Ａ編集に対してヘテロ接合性であることが確認された系列であるカルス系Ａ２３ならびにこのカルス系から再生したＣ０植物体全体をグリホサートに曝露した。Ａ２３カルスおよび対照野生型カルスを様々な濃度のグリホサートを含有する固形再生培地に播いた。２１日後、試験したいずれのグリホサート濃度でも、Ｔ１７８Ｉ編集およびＰ１８２Ａ編集を有するカルスの生重量の方が野生型カルスの生重量より有意（ｐ＜０．０１）に大きかった（図９Ａおよび９Ｂ）。再生した植物体全体については、野生型植物体およびＥＰＳＰＳ編集植物体をともに温室条件下、土壌で維持し、次いで、１０．５ｍＭまたは２１．０ｍＭのグリホサートを噴霧した。処理から６日後、野生型植物体にはいずれの塗布率でも、グリホサート中毒に典型的なしおれた壊死性の表現型がみられたのに対し、編集ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＡ２３植物体の表現型の変化は最小限のものであった（図９Ｃ）。この結果は、Ｔ１７８ＩおよびＰ１８２Ａが編集されたＥＰＳＰＳ遺伝子が１つあれば、耐性レベルが対照植物体に観察されるレベルよりはるかに高くなることを示していることから、注目すべきものである。
以上のデータを考え合わせると、アマでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と組み合わせたｓｓＯＤＮにより、選択的培養条件を必要とせずに、分子スクリーニングにより検出するのに十分な頻度で高精度のＥＰＳＰＳ編集が得られ、これらの編集は次の世代に適切に伝達されることがわかる。
アマにおいてＥＰＳＰＳ遺伝子を編集するためのＲＴＤＳ技術とＴＡＬＥＮの組合せ
ＲＴＤＳと操作されたヌクレアーゼが媒介する高精度の遺伝子編集の用途を他の植物系にも拡大するため、アマの２つのＥＰＳＰＳ（５’−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素）遺伝子座を標的とする同様の試験を実施した。ＥＰＳＰＳ遺伝子座は、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの生合成に寄与するシキミ酸経路の酵素をコードする。植物では、ＥＰＳＰＳは除草剤グリホサートの標的であり、この場合、グリホサートはホスホエノールピルビン酸に対する結合部位の競合阻害剤として作用する（Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎら，２００１）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＳＰＳホモログに関する変異の研究に基づけば、アマＥＰＳＰＳ遺伝子座のアミノ酸Ｔ９７位およびＰ１０１位をＩ９７位およびＡ１０１位に編集すれば、この酵素にグリホサートに対する耐性が付与されることが予想される（Ｇｏｃａｌら，２００７）。
これらのＥＰＳＰＳ遺伝子座に対するＧＲＯＮ媒介性標的化の効率を改善するため、ＢＴ−１に用いたのと同じ構築指針を用いて、Ｔ９７およびＰ１０１遺伝子座（図３８ｂ）の付近にある両ＥＰＳＰＳ遺伝子で保存された配列を標的とするＴＡＬＥＮ ＬｕＥＴ−１（図３８ａ）を設計した。ウエスタンブロットを用いて、アマプロトプラストでのＬｕＥＴ−１タンパク質の一過性発現を確認した。導入から２４時間後、ＴＡＬＥＮタンパク質が検出され、４８時間後まで同レベルで維持された（図３８ｃ）。ＲＴＤＳ技術をアマに応用するため、標的化変化Ｃ＞ＴおよびＣ＞Ｇ（ＡＣＡ＞ＡＴＡ Ｔ９７Ｉ；ＣＣＧ＞ＧＣＧ Ｐ１０１Ａ）を含むＴＡＬＥＮ ＬｕＥＴ−１と１４４ｎｂ ＧＲＯＮ（ＥＰＳＰＳ／１４４）の組合せを用いた。これらをアマプロトプラスト内にトランスフェクトした後、トランスフェクションから７日後の高精度の遺伝子編集およびＮＨＥＪ誘導性変異をディープシーケンシングにより解析した。ＮＨＥＪを利用した修復事象は合計１．４１％であり、欠失および置換が最も頻繁にみられ、数のうえで挿入を大幅に上回っていた（図３９ａ）。アマＥＰＳＰＳ遺伝子内の欠失の大部分が２０ｂｐ以下であった（図３９ｂ）。２つのＥＰＳＰＳ遺伝子座間のＳＮＰの差（図４０）を用いたところ、２つのＥＰＳＰＳ遺伝子座それぞれのＮＨＥＪ事象が同程度であることが明らかになり、このことは、ＬｕＥＴ−１ ＴＡＬＥＮが両遺伝子の切断に効果があることを示唆している。高精度の傷跡のない遺伝子編集を検討したところ、以下の表に示すように、０．１９％にＣ＞ＴおよびＣ＞Ｇに標的化された二重の変化が含まれていた。
Figure 2019506170
 導入から７日後に処理済み細胞由来のｇＤＮＡをＮＧＳにより解析した
†ＥＰＳＰＳ／１４４ＧＲＯＮ
＊同じリード内のＴ９７Ｉ変異およびＰ１０１Ａ変異の両方を表す
ＮＨＥＪ修復事象と同じように、これらの高精度の編集は各ＥＰＳＰＳ遺伝子座で同程度であり、ＧＲＯＮ依存性の修復事象に偏りがないことを示している。これらの結果は、本発明者らのシロイヌナズナのＢＦＰからＧＦＰへの編集のデータとよく相関しており、アマプロトプラストにおけるＧＲＯＮとＴＡＬＥＮとを組み合わせた方法が、ＥＰＳＰＳ遺伝子標的の傷跡のない編集の頻度を有意に増大させることを示している。単一のＧＲＯＮで複数のヌクレオチド編集を実現することが可能である。
ヒト、動物、酵母、植物を含めた様々な属を用いた多数の研究でオリゴ指向性遺伝子修復の有効性が示されており（ＡｌｅｘｅｅｖおよびＹｏｏｎ，１９９８；Ｂｅｅｔｈａｍら，１９９９；Ｋｒｅｎら，（１９９８）；Ｋｕｗａｙａｍａら，２００８；Ｌｉら，２００１；Ｒａｎｄｏら，１９９９；Ｒｉｃｅら，２００１；Ｘｉａｎｇら，１９９７）；Ｚｈｕら，１９９９）、多岐にわたる生物体の多数の遺伝子がＲＴＤＳに適していることが示唆される。
植物でのＲＴＤＳに基づく遺伝子編集は、ＤＮＡ二本鎖切断を生じさせる様々な試薬と組み合わせると増強され得る。これらのデータは、２つの異なる植物系、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）およびアマ（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）において、ＧＲＯＮをフレオマイシンまたはＴＡＬＥＮと組み合わせることにより、遺伝子編集の頻度がＧＲＯＮ単独と比較して著明に増大することを示している。この増強は、ＧＲＯＮの長さを変化させて、単一のＧＲＯＮで複数の遺伝子座を標的にするという柔軟性を付加すると同時に、編集全体の頻度を増大させることによりさらに増大し得る。ＴＡＬＥＮと、より長いＧＲＯＮとを組み合わせる方法を用いて、本発明者らはアマＥＰＳＰＳ遺伝子座に安定した高精度の遺伝子編集頻度をもたらし、グリホサート耐性形質を発現させることができた。
ＲＴＤＳを用いて、標的遺伝子およびそこから生じるタンパク質にごくわずかな変化を有する植物に新たな非トランスジェニック育種形質を発現させることができる。上に記載した結果は、シロイヌナズナのＢＦＰ導入遺伝子およびアマのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方におけるヌクレオチド置換を示している。さらに、この遺伝子編集技術は、あらゆる商業的に重要な作物の形質を改善するために迅速かつ正確に応用することができる。
実施例２５．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）におけるＣａｓ９タンパク質送達
この試験では、ｇＲＮＡ（ＢＦＰ１）と複合体を形成したＣａｓ９タンパク質をＧＲＯＮとともに送達することがＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）系列に由来するプロトプラストのＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集を媒介する効果を検討する。Ｃａｓ９ ＲＮＰとともに使用したＧＲＯＮは、変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列を含み、ＤＮＡ塩基の代わりにＲＮＡ塩基になっているＧＲＯＮの１番目の５’塩基が２’−Ｏ−Ｍｅ基で標識されている。このＧＲＯＮを本明細書では２ＯＭｅ ＧＲＯＮと呼ぶ。これらの実験に使用したＧＲＯＮの説明については表１を参照されたい。
誘導した根組織に由来するＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種した。ＰＥＧ媒介送達あるいはこれに代わる送達方法、例えばエレクトロポレーション、細胞透過性ペプチドおよび／または脂質に基づく送達技術などにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をＧＲＯＮとともにＲＮＰ複合体として送達した。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を求めるため、フローサイトメトリーにより解析した。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は２つの構成要素、すなわち、組換え化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質と、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されるｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。これらの実験では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰ１ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた。ＧＲＯＮは変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列を含む。表１にＧＲＯＮを記載し、表２に、これらの実験に使用したＢＦＰ ｇＲＮＡを記載する。
結果
ｇＲＮＡ（ＢＦＰ１）と複合体を形成したＣａｓ９タンパク質の送達をＧＲＯＮ（２ＯＭｅ；ＢＦＰ４／ＮＣ １０１量体）と組み合わせて用いることにより、３つの独立した実験から２．２０〜３．１０％のＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集が得られた。ＧＲＯＮを用いない対照処理では、ＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集は検出されなかった。以上のデータは、高精度の遺伝子編集にＧＲＯＮを用いることの利点を示している。
実施例２６．セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）におけるＣａｓ９タンパク質送達
この試験では、ｇＲＮＡ（ＢｎＥＰＳＰＳ ｇＲＮＡ−１）と複合体を形成したＣａｓ９タンパク質をＧＲＯＮとともに送達することがセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）葉材料に由来するプロトプラストのＥＰＳＰＳ遺伝子編集を媒介する効果を検討する。Ｃａｓ９ ＲＮＰとともに使用したＧＲＯＮは、変換部位付近に標的ｅｐｓｐｓ遺伝子のコード配列を含み、ＤＮＡ塩基の代わりにＲＮＡ塩基になっているＧＲＯＮの１番目の５’塩基が２’−Ｏ−Ｍｅ基で標識されている。このＧＲＯＮを本明細書では２ＯＭｅ ＧＲＯＮと呼ぶ。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで繁殖させた節の挿し木の葉に由来するセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）プロトプラストを５０ｍｌの遠心管に５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で１管当たり２，０００，０００個播種した。ＰＥＧ法を用いて、あるいはこれに代わる送達方法、例えばエレクトロポレーション、細胞透過性ペプチドおよび／または脂質に基づく送達技術により、ＥＰＳＰＳ２−２５遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をＧＲＯＮとともにリボ核タンパク質複合体として送達した。プロトプラストを２５℃、暗所にて３週間インキュベートし、次いで、所与の処理内の高精度のＥＰＳＰＳ編集の割合およびインデルの頻度を求めるため、ディープシーケンシングで解析した。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は２つの構成要素、すなわち、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とｓｇＲＮＡとからなり、両要素を混合するとＲＮＰ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体を形成する。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＥＰＳＰＳ標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。これらの実験では、ＥＰＳＰＳ２−２５遺伝子を標的とするＲＮＰ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた。ＧＲＯＮは、変換部位付近にＥＰＳＰＳ遺伝子のコード配列を含むほか、ＥＰＳＰＳ遺伝子に所望の変化を生じさせるヌクレオチド変化も含む。
Figure 2019506170
結果
ｇＲＮＡ（ＢｎＥＰＳＰＳ ｇＲＮＡ−１）と複合体を形成したＣａｓ９タンパク質の送達をＧＲＯＮ（２’ＯＭｅ；ＢｎＥＰＳＰＳ−２−２５／ＮＣ １０１量体）と組み合わせて用いることにより、３つの独立した実験から０．０７〜０．１２５％の遺伝子編集および２７．１〜３９．４％のインデル形成が得られた。ＧＲＯＮを用いない対照処理ではＥＰＳＰＳ遺伝子編集は検出されず、高精度の遺伝子編集にＧＲＯＮを用いることの利点が示された。
実施例２７．イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）におけるＣａｓ９タンパク質送達
この試験では、ｇＲＮＡ（ＣＲ−ＯｓＡＣＣアーゼ−４）と複合体を形成したＣａｓ９タンパク質の送達が、イネ細胞懸濁液に由来するプロトプラストのａｃｃアーゼ遺伝子のＣａｓ９ ＤＮＡ切断部位付近での標的化インデル形成を媒介する効果を検討する。コレラの実験に使用したｇＲＮＡの説明については表１を参照されたい。
細胞懸濁液に由来するイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）プロトプラストを０．４ｃｍのキュベット中、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で１キュベット当たり１ｘ１０６個処理した。Ｃａｓ９タンパク質とｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｇＲＮＡとからなるリボ核タンパク質複合体をＧＲＯＮとともにエレクトロポレーションによりプロトプラスト内に導入した。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質の活性に由来するインデルの割合を求めるためＴ７Ｅ１アッセイにより解析した。
Figure 2019506170
結果
ｇＲＮＡ（ＣＲ−ＯｓＡＣＣアーゼ−４）と複合体を形成したＣａｓ９タンパク質の送達により、３つの独立した実験からａｃｃアーゼ遺伝子のＣａｓ９切断部位付近にそれぞれ１５．９〜２３．３％のインデル形成が得られた。これらのデータは、Ｃａｓ９をタンパク質としてプロトプラスト内に送達すると標的化ＤＮＡ活性に機能することを示している。
実施例２８．キャッサバにおけるＣａｓ９タンパク質送達
この試験では、ｇＲＮＡ（ＢＦＰ１）と複合体を形成したＣａｓ９タンパク質をＧＲＯＮとともに送達することが、キャッサバ細胞浮遊培養物に由来するプロトプラストのＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集を媒介する効果を検討する。Ｃａｓ９ ＲＮＰとともに使用したＧＲＯＮは、変換部位付近に標的ｂｆｐ遺伝子のコード配列を含み、ＤＮＡ塩基の代わりにＲＮＡ塩基になっているＧＲＯＮの１番目の５’塩基が２’−Ｏ−Ｍｅ基で標識されている。このＧＲＯＮを本明細書では２’ＯＭｅ ＧＲＯＮと呼ぶ。これらの実験に使用したＧＲＯＮの説明については表１を参照されたい。
ＢＦＰトランスジェニックＦＥＣ（脆弱な胚発生カルス）浮遊培養物に由来するキャッサバプロトプラストを１４ｍｌの遠心管に５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で１管当たり４×１０６個播種した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＲＮＰを細胞１００万個当たり２５μｇで加えた。ＧＲＯＮを（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＲＮＰとともに）ＢＦＰ４／ＮＣ ２０１量体ＧＲＯＮ ０．５μＭのＰＥＧ媒介送達によりプロトプラスト内に導入した。プロトプラストを２５℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を求めるため、それをフローサイトメトリーにより解析した。
結果
ｇＲＮＡ（ＢＦＰ１）と複合体を形成したＣａｓ９タンパク質の送達をＧＲＯＮ（２’ＯＭｅ；ＢＦＰ４／ＮＣ ２０１量体）と組み合わせて用いたところ、０．００８〜０．００９％のＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集が得られた。ＧＲＯＮを用いない対照処理では、ＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集は検出されなかった。これらのデータは、高精度の遺伝子編集にＧＲＯＮを用いることの利点を示している。
実施例２９．ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）におけるＣａｓ９タンパク質送達
この試験では、ｇＲＮＡ（ＰＰＸ２またはＰＰＸ４）と複合体を形成したＣａｓ９タンパク質の送達が、ジャガイモ葉材料に由来するプロトプラストのｐｐｘ遺伝子のＣａｓ９ ＤＮＡ切断部位付近での標的化インデル形成を媒介する効果を検討する。これらの実験に使用したｇＲＮＡの説明については表１を参照されたい。
バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ＳＴ−０１植物体のプロトプラストを、ジャガイモプロトポルフィリノーゲン遺伝子の１４４（ＰＰＸ２）位または２２０（ＰＰＸ４）位に対して設計されたガイドＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９タンパク質と混合した。プロトプラストをＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体と氷上で１５分間インキュベートした後、トランスフェクション試薬であるポリエチレングリコールで処理した。全成分を混合してからチューブを氷上で３０分間インキュベートした後、プロトプラストの安定性を維持するため、浸透圧を調整した塩溶液で希釈した。プロトプラストを４４．１６×ｇで１０分間遠心分離し、培地１ｍｌに懸濁させ、２２℃でインキュベートした。トランスフェクションから２４時間後、試料からゲノムＤＮＡを単離し、ＮＧＳ（次世代シーケンシング）解析に供した。
Figure 2019506170
結果
ｇＲＮＡ（ＰＰＸ２またはＰＰＸ４）と複合体を形成したＣａｓ９タンパク質の送達により、それぞれｐｐｘ遺伝子のＣａｓ９切断部位付近に最大２４．４％および３５．７％のインデル形成が得られた。これらのデータは、Ｃａｓ９をタンパク質としてプロトプラスト内に送達すると標的化ＤＮＡ活性に機能することを示している。
実施例３０．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）におけるＣａｓ９ ｍＲＮＡ送達
この試験では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ（ＢＦＰ１）をＧＲＯＮとともに送達することが、ＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）系列に由来するプロトプラストのＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集を媒介する効果を検討する。Ｃａｓ９ ＲＮＰとともに使用したＧＲＯＮは、変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列を含み、ＤＮＡ塩基の代わりにＲＮＡ塩基になっているＧＲＯＮの１番目の５’塩基が２’−Ｏ−Ｍｅ基で標識されている。このＧＲＯＮを本明細書では２ＯＭｅ ＧＲＯＮと呼ぶ。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は２つの構成要素、すなわち、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ｍＲＮＡと、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されるｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の融合物である。ｃｒＲＮＡ領域には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するのに用いられるスペーサー配列が含まれている。これらの実験では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰ１ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた。ＧＲＯＮは変換部位付近にｂｆｐ遺伝子のコード配列を含む。
誘導した根組織に由来するＢＦＰトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロトプラストを平底９６ウェルプレートに１×１０７細胞／ｍｌの細胞密度で１ウェル当たり２５０，０００個播種した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をＲＮＡ種（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ）としてＧＲＯＮとともにＰＥＧ媒介送達により、あるいはこれに代わる送達方法、例えばエレクトロポレーション、細胞透過性ペプチドおよび／または脂質に基づく送達技術により送達した。プロトプラストを２３℃、暗所にて７２時間インキュベートし、次いで、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を求めるため、フローサイトメトリーにより解析した。
結果
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ（ＢＦＰ１）の送達をＧＲＯＮ（２ＯＭｅ；ＢＦＰ４／ＮＣ １０１量体）と組み合わせて用いることにより、３つの独立した実験から０．２４〜１．５１％のＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集が得られた。ＧＲＯＮを用いない対照処理では、ＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集は検出されなかった。これらのデータは、高精度の遺伝子編集にＧＲＯＮを用いることの利点を示している。
参考文献
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Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｄ．Ｆ．，Ｔａｎ，Ｗ．，Ｌｉｌｌｉｃｏ，Ｓ．Ｇ．，Ｓｔｖｅｒａｋｏｖａ，Ｄ．，Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｃ．，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｍ．，Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．，Ｌｏｎｇ，Ｃ．Ｒ．，Ｗｈｉｔｅｌａｗ，Ｃ．Ｂ．，ａｎｄ Ｆａｈｒｅｎｋｒｕｇ，Ｓ．Ｃ．（２０１２）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＴＡＬＥＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９，１７３８２−１７３８７．
Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．，Ｄｏｙｌｅ，Ｅ．Ｌ．，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．，Ｂａｌｌｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．，Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．（２０１１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３９，ｅ８２．
Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．，Ｃｈｕａｎｇ，Ｒ．Ｙ．，Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ ３ｒｄ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｏ．（２００９）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６ ３４３−３４５．
Ｇａｍｂｏｒｇ，Ｏ．Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ Ｏｈｙａｍａ，Ｋ．（１９６８）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｒｏｏｔ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，５０，１５１−８．
Ｇｉｌｏｎｉ，Ｌ．，Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｍ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．，Ｉｄｅｎ，Ｃ．，ａｎｄ Ｇｒｏｌｌｍａｎ，Ａ．Ｐ．（１９８１）Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｔｒａｎｄ−ｓｃｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６ ８６０８−８６１５．
Ｇｏｃａｌ，Ｆ．Ｗ．，Ｓｃｈｏｐｋｅ，Ｃ．，Ｂｅｅｔｈａｍ，Ｐ．Ｒ．（２０１５）Ｏｌｉｇｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｉｎ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｐｕｃｈｔａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．（Ｅｄｓ），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．Ｉｎ ｐｒｉｎｔ
Ｇｏｃａｌ，Ｇ．，Ｋｎｕｔｈ，Ｍ．，ａｎｄ Ｂｅｅｔｈａｍ，Ｐ．（２００７）Ｇｅｎｅｒｉｃ ＥＰＳＰＳ ｍｕｔａｎｔｓ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ ＵＳ８２６８６２２．Ｆｉｌｌｅｄ Ｊａｎ １０ ２００７，Ｉｓｓｕｅｄ Ｓｅｐ １８ ２０１２．
Ｋｒｅｎ，Ｂ．Ｔ．，Ｂａｎｄｙｐａｄｈｙａｙ，Ｐ．，ａｎｄ Ｓｔｅｅｒ，Ｃ．Ｊ．（１９９８）Ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｇｅｎｅ ｂｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４，２８５−２９０．
Ｋｕｗａｙａｍａ Ｈ．，Ｙａｎａｇｉｄａ Ｔ．，ａｎｄ Ｕｅｄａ，Ｍ．（２００８）ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３３，４１８−４２３．
Ｌｅｉ，Ｙ．，Ｇｕｏ，Ｘ．，Ｄｅｎｇ，Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｚｈａｏ，Ｈ．（２０１３）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮｓ）ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉ．，３，２１．
Ｌｉａｎｇ，Ｚ．，Ｚｈａｎｇ，Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｇａｏ，Ｃ．（２０１３）Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｚｅａ ｍａｙｓ ｕｓｉｎｇ ＴＡＬＥＮｓ ａｎｄ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４１，６３−６８．
Ｌｉ，Ｔ．，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，Ｚｈａｏ，Ｘ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ａ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｓ．，Ｓｐａｌｄｉｎｇ，Ｍ．Ｈ．，Ｗｅｅｋｓ，Ｄ．Ｐ．，ａｎｄ Ｙａｎｇ，Ｂ．（２０１１）Ｍｏｄｕｌａｒｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３９，６３１５−６３２５．
Ｌｉ，Ｔ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｓｐａｌｄｉｎｇ，Ｍ．Ｈ．，Ｗｅｅｋｓ，Ｄ．Ｐ．，ａｎｄ Ｙａｎｇ，Ｂ．（２０１２）Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＴＡＬＥＮ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｄｉｓｅａｓｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｒｉｃｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０，３９０ ｅ３９２．
Ｌｉ，Ｚ．Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｄ．Ｐ．，Ｙｉｎ，Ｗ．Ｘ．，Ｇｕｏ，Ｚ．Ｃ．，ａｎｄ Ｌｉａｎｇ，Ｃ．Ｃ．（２００１）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＨＰＦＨ ｂｙ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｂ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．，２７，５３０−５３８．
Ｌｉｅｂｅｒ，Ｍ．Ｒ．（２０１０）Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ＤＮＡ ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７９，１８１−１８３．
Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｃ．，Ｙｕ，Ｚ．，Ｈｕａｎｇ，Ｐ．，Ｗｕ，Ｈ．，Ｗｅｉ，Ｃ．，Ｚｈｕ，Ｎ．，Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｄｅｎｇ，Ｗ．Ｍ．ａｎｄ Ｊｉａｏ，Ｒ．（２０１２）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ａｎ ｅａｓｙ ＴＡＬＥＮ ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３９，２０９−２１５．
Ｌｏｒ，Ｖ．Ｓ．，Ｓｔａｒｋｅｒ，Ｃ．Ｇ．，Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．，Ｗｅｉｓｓ．Ｄ．，ａｎｄ Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ，Ｎ．Ｅ．（２０１４）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏ ＰＲＯＣＥＲＡ ｇｅｎｅ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６６，１２８８−９１．
Ｍａｔｈｕｒ，Ｊ．ａｎｄ Ｋｏｎｃｚ，Ｃ．Ａ（１９９５）Ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａＩｉａｎａ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，１０，２２１−２２６．
Ｍｅｎｃｚｅｌ Ｌ．，Ｎａｇｙ Ｆ．，Ｋｉｓｓ Ｚ．Ｒ．，ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ Ｐ．（１９８１）．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ＋Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ｐｌａｓｔｉｄｓ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５９，１９１−１９５．
Ｍｅｎｋｅ，Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｉ．Ｐ．，Ａｎｇｅｌｉｓ，Ｋ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ Ｉ．（２００１）ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｍｅｔ ａｓｓａｙ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｇｅｎｏｔｏｘｉｎｓ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，４９３，８７−９３．
Ｍｏｅｒｓｃｈｅｌｌ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｓｕｎａｓａｗａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ Ｆ．（１９８８）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｗｉｔｈ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５２４−５２８．
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．Ａ．（１９６２）Ａ ｒｅｖｉｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｉｏ−ａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ，１５，４７３−４９７．
Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ，Ｃ．，Ａｌｚｕｂｉ，Ｊ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ，Ｒ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，Ｔ．Ｊ．，Ｌａｈａｙｅ，Ｔ．，Ｂａｏ，Ｇ．ａｎｄ Ｃａｔｈｏｍｅｎ，Ｔ．（２０１４）ＴＡＬＥＮｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｌｏｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２，６７６２−６７７３．
Ｑｉｕ，Ｚ．，Ｌｉｕ，Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｚ．，Ｓｈａｏ，Ｙ．，Ｐａｎ，Ｈ．，（２０１３）Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４１，ｅ１２０．
Ｒａｎｄｏ，Ｔ．Ａ．，Ｄｉｓａｔｎｉｋ，Ｍ．Ｈ．ａｎｄ Ｚｈｏｕ，Ｌ．Ｚ．（２０００）Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｕｓｃｌｅ ｂｙ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９７，５３６３−５３６８．
Ｒｉｃｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｂｒｕｎｅｒ，Ｍ．，Ｃｚｙｍｍｅｋ，Ｃ．，ａｎｄ Ｋｍｉｅｃ，Ｅ．Ｂ．（２００１）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４０，８５７−８６８．
Ｒｉｖｅｒａ−Ｔｏｒｒｅｓ，Ｎ．，Ｓｔｒｏｕｓｅ，Ｂ．，Ｂｉａｌｋ，Ｐ．，Ｎｉａｍａｔ，Ｒ．Ａ．，Ｋｍｉｅｃ，Ｅ．Ｂ．（２０１４）Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＴＡＬＥＮｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，９，ｅ９６４８３
Ｒｏｇｅｒ，Ｄ．，Ｄａｖｉｄ．，Ａ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ，Ｈ．（１９９６）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｘ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｉｎ ａｇａｒｏｓｅ ａｎｄ ａｌｇｉｎａｔｅ Ｂｅａｄｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２，１１９１−１１９９．
Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎ，Ｅ．，Ｅｓｃｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓ．，Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈ，Ｗ．Ａ．，Ｓｃｈｌｏｓｓ，Ｊ．Ｖ．，Ａｍｒｈｅｉｎ，Ｎ．，ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，Ｊ．Ｎ．Ｓ．（２００１）Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｔａｒｇｅｔ ｅｎｚｙｍｅ ５−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ａｔｏｍｉｃ ｄｅｔａｉｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８，１３７６−８０．
Ｓｃｈｒｏｐｆｅｒ，Ｓ．，Ｋｎｏｌｌ，Ａ．，Ｔｒａｐｐ，Ｏ．，ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，Ｈ．（２０１４）ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，５１−９３．
Ｓｈａｎ，Ｑ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｋ．，Ｌｉａｎｇ，Ｚ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ａｎｄ Ｇａｏ，Ｃ．，（２０１３）Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ａｎｄ Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｕｓｉｎｇ ＴＡＬＥＮｓ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ，６，１３６５−１３６８．
Ｓｈａｎ，Ｑ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｋ．，Ｚｈａｎｇ，Ｋ．，ａｎｄ Ｇａｏ，Ｃ．（２０１５）Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒａｇｒａｎｔ ｒｉｃｅ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ＯｓＢＡＤＨ２ ｇｅｎｅ ｕｓｉｎｇ ＴＡＬＥＮ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２３１２．
Ｓｕｎｇ，Ｙ．Ｈ．，Ｂａｅｋ，Ｉ．−Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｄ．Ｈ．，Ｊｅｏｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｊ．（２０１３）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｃｒｅａｔｅｄ ｂｙ ＴＡＬＥＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１，２３−２４．
Ｓｔｒｏｕｓｅ，Ｂ．，Ｂｉａｌｋ，Ｐ．，Ｎｉａｍａｔ，Ｒ．，Ｒｉｖｅｒａ−Ｔｏｒｒｅｓ，Ｎ．，ａｎｄ Ｋｍｉｅｃ，Ｅ．Ｂ．（２０１４）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｓＯＤＮｓ ａｎｄ ＴＡＬＥＮｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３７９１．
Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｍｕｒａｉ，Ａ．，ａｎｄ Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．（２００３）Ｌｏｗ−ｄｏｓｅ ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｅｌａｎ−ｃ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１２，１０９−１１４．
Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ，Ｌ．Ｓ．ａｎｄ Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｊ．（２０１１）Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｅｎｄ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｐａｔｈｗａｙ ｃｈｏｉｃｅ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，４５，２４７−７１．
Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．（２０１３）Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，６４，３２７−５０．
Ｗｅｎｄｔ，Ｔ．，Ｈｏｌｍ，Ｐ．Ｂ．，Ｓｔａｒｋｅｒ，Ｃ．Ｇ．，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｍ．，Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．，Ｂｒｉｎｃｈ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｈ．，ａｎｄ Ｈｏｌｍｅ，Ｉ．Ｂ．（２０１３）ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ａ ｐｒｅ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｂａｒｌｅｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８３，２７９−２８５．
Ｘｉａｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓ，Ａ．，Ｙｏｏｎ，Ｋ．，Ｇｒｙｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｋｍｉｅｃ，Ｅ．Ｂ，（１９９７）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＣＤ３４＋−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７５，８２９−８３５．
Ｙｏｏｎ，Ｋ．，Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓ，Ａ．，ａｎｄ Ｋｍｉｅｃ，Ｅ．Ｂ．（１９９６）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡ．ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，２０７１−２０７６．
Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｇｏｕ，Ｆ．，Ｚｈａｎｇ．Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｑ．，Ｍａｏ，Ｙ．，Ｂｏｔｅｌｌａ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｚｈｕ，Ｊ．Ｋ．（２０１５）ＴＡＬＥＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａ ｌａｒｇｅ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｉｃｅ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．Ａｐｒ １３．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２３７２．
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｂａｌｌｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｑｉ，Ｙ．，Ｓｔａｒｋｅｒ，Ｃ．Ｇ．，Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．Ｆ．（２０１３）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６１，２０−２７．
Ｚｈｕ Ｔ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｄ．Ｊ．，Ｔａｇｌｉａｎｉ Ｌ．，Ｓｔ．Ｃｌａｉｒ Ｇ．，Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ Ｃ．Ｌ．，ａｎｄ Ｂｏｗｅｎ Ｂ．（１９９９）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，８７６８−８７７３．
当業者には、本開示が諸目的を遂行し、上記の目的および利点ならびに本明細書に固有の目的および利点を達成するのに十分適合していることが容易に理解される。本明細書に記載される実施例は、好ましい実施形態の代表的なものであり、また例示的なものであり、本開示の範囲を限定するものとして意図したものではない。
当業者には、本開示の範囲および趣旨を逸脱することなく、本明細書に開示される開示に様々な置換および修正を施し得ることが容易に理解されよう。
本明細書で適切に説明した本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定の不在下でも実施され得る。したがって例えば、本明細書の各場合において、「〜を含む」、「〜から実質的になる」および「〜からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかに置き換え得る。使用する用語および表現は、限定ではなく説明のために使用するのであって、図示および記載されている特徴またはその一部の均等物を除外するために使用する意図はなく、特許請求される開示の範囲内で様々な修正が可能であることが理解される。したがって、本開示は、好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修正形態および変形形態を当業者が用いてもよく、そのような修正形態および変形形態は、添付の特許請求の範囲により定められる本開示の範囲内にあるものと見なされることを理解するべきである。
したがって、本開示は、好ましい実施形態および任意選択の特徴により具体的に開示されているが、開示される本開示の修正、改善および変形を当業者が用いてもよく、そのような修飾、改善および変形は本開示の範囲内にあるものと見なされることを理解するべきである。本明細書に記載される材料、方法および実施例は、好ましい実施形態の代表的なものであり、また例示的なものであり、本開示の範囲を限定するものとして意図したものではない。
本開示は広範囲にわたって包括的に記載されている。包括的開示の範囲内に含まれるさらに狭い範囲の種および亜分類もそれぞれ本開示の一部を構成する。これには、削除された材料が本明細書に具体的に記載されているかどうかを問わず、属から任意の主題を排除する条件または消極的限定の付随する本開示の包括的記載が含まれる。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群の観点から記載される場合、本開示がそのマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも記載されることが当業者には理解されよう。
本明細書に記載される刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、それぞれが個別に参照により組み込まれた場合と同じく明示的に、その全体が参照により組み込まれる。不一致が生じた場合には、定義を含めた本明細書が統制する。
のちの請求項には他の実施形態も記載される。

Claims (149)

  1. 植物細胞に遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＤＮＡ切断剤および修飾ＧＲＯＮに曝露することを含む、方法。
  2. ＤＮＡ切断剤と修飾ＧＲＯＮとを含む、植物細胞。
  3. 植物細胞に遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＤＮＡ切断剤ならびにＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むＧＲＯＮに曝露することを含む、方法。
  4. ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはタンパク質を含むＤＮＡ切断剤を含む、植物細胞。
  5. 前記ＤＮＡ切断剤が、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガー、メガヌクレアーゼおよびＤＮＡ切断抗生物質から選択される１つまたは複数のものである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法または細胞。
  6. 前記ＤＮＡ切断剤がＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法または細胞。
  7. 前記ＤＮＡ切断剤がＣＲＩＳＰＲである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法または細胞。
  8. 前記ＤＮＡ切断剤がＴＡＬＥＮである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法または細胞。
  9. 前記ＤＮＡ切断剤が、ブレオマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ、フレオマイシン、タリソマイシンおよペプレオマイシンからなる群より選択される１つまたは複数のＤＮＡ切断抗生物質である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法または細胞。
  10. 前記ＤＮＡ切断剤がＺｅｏｃｉｎである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法または細胞。
  11. 前記ＧＲＯＮが一本鎖である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法または細胞。
  12. 前記ＧＲＯＮが、化学保護オリゴヌクレオチドである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法または細胞。
  13. 前記ＧＲＯＮが、５’末端で保護された化学保護オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法または細胞。
  14. 前記ＧＲＯＮが、３’末端で保護された化学保護オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法または細胞。
  15. 前記ＧＲＯＮが、５’末端および３’末端で保護された化学保護オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法または細胞。
  16. 前記ＧＲＯＮが、Ｃｙ３基、３ＰＳ基および２’−Ｏ−メチル基から選択される１つまたは複数のものを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法または細胞。
  17. 前記ＧＲＯＮがＣｙ３基を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法または細胞。
  18. 前記ＧＲＯＮが、２つ以上のＣｙ３基を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法または細胞。
  19. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の１番目（最後）の塩基にＣｙ３基を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法または細胞。
  20. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の１番目（最後）の塩基にｉｄＣ基を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法または細胞。
  21. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基にＣｙ３基を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法または細胞。
  22. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基にｉｄＣ基を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法または細胞。
  23. 前記ＧＲＯＮが３ＰＳ基を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法または細胞。
  24. 前記ＧＲＯＮが２つ以上の３ＰＳ基を含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法または細胞。
  25. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の１番目（最後）の塩基に３ＰＳ基を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法または細胞。
  26. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の２番目（最後から２番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法または細胞。
  27. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の３番目（最後から３番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法または細胞。
  28. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基に３ＰＳ基を含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法または細胞。
  29. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の２番目（最後から２番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法または細胞。
  30. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の３番目（最後から３番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法または細胞。
  31. 前記ＧＲＯＮが、５’末端および３’末端の両方の１番目（最後）の塩基に３ＰＳ基を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法または細胞。
  32. 前記ＧＲＯＮが、５’末端および３’末端の両方の最初の２つ（最後および最後から２番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、実施形態１〜３１のいずれかに記載の方法または細胞。
  33. 前記ＧＲＯＮが、５’末端および３’末端の両方の最初の３つ（最後、最後から２番目および最後から３番目）の塩基に３ＰＳ基を含む、実施形態１〜３２のいずれかに記載の方法または細胞。
  34. 前記ＧＲＯＮが２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法または細胞。
  35. 前記ＧＲＯＮが２つ以上の２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法または細胞。
  36. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の１番目（最後）の塩基に２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法または細胞。
  37. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の１番目の塩基に２’−Ｏ−メチル基を有するが、他には２’−Ｏ−メチル基を有さない、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法または細胞。
  38. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の２つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法または細胞。
  39. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の３つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法または細胞。
  40. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の４つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法または細胞。
  41. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の５つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法または細胞。
  42. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の６つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜４１のいずれかに記載の方法または細胞。
  43. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の７つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜４２のいずれかに記載の方法または細胞。
  44. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の８つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜４３のいずれかに記載の方法または細胞。
  45. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の９つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜４４のいずれかに記載の方法または細胞。
  46. 前記ＧＲＯＮが、５’末端の最初の１０以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法または細胞。
  47. 前記ＧＲＯＮが、５’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＲＮＡ塩基を含む、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法または細胞。
  48. 前記ＧＲＯＮが、前記遺伝子変化の標的配列に対してゆらぎ塩基対を有する、請求項１〜４７のいずれかに記載の方法または細胞。
  49. 前記ＧＲＯＮが１５〜６０ヌクレオチド長である、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法または細胞。
  50. 前記ＧＲＯＮが４１ヌクレオチド長である、請求項１〜４９のいずれかに記載の方法または細胞。
  51. 前記ＧＲＯＮが５０〜１１０ヌクレオチド長である、請求項１〜５０のいずれかに記載の方法または細胞。
  52. 前記ＧＲＯＮが１０１ヌクレオチド長である、請求項１〜５１のいずれかに記載の方法または細胞。
  53. 前記ＧＲＯＮが１５０〜２１０ヌクレオチド長である、請求項１〜５２のいずれかに記載の方法または細胞。
  54. 前記ＧＲＯＮが２０１ヌクレオチド長である、請求項１〜５３のいずれかに記載の方法または細胞。
  55. 前記ＧＲＯＮが７０〜２１０ヌクレオチド長である、請求項１〜５４のいずれかに記載の方法または細胞。
  56. 前記ＧＲＯＮが７０ヌクレオチドより長い、請求項１〜５５のいずれかに記載の方法または細胞。
  57. 前記ＧＲＯＮが１６５ヌクレオチド長より長い、請求項１〜５６のいずれかに記載の方法または細胞。
  58. 前記ＧＲＯＮが１７５ヌクレオチド長より長い、請求項１〜５７のいずれかに記載の方法または細胞。
  59. 前記ＧＲＯＮが１８５ヌクレオチド長より長い、請求項１〜５８のいずれかに記載の方法または細胞。
  60. 前記ＧＲＯＮが１９５ヌクレオチド長より長い、請求項１〜５９のいずれかに記載の方法または細胞。
  61. 前記ＧＲＯＮが２００ヌクレオチド長より長い、請求項１〜６０のいずれかに記載の方法または細胞。
  62. 前記ＧＲＯＮが２１０ヌクレオチド長より長い、請求項１〜６１のいずれかに記載の方法または細胞。
  63. 前記ＧＲＯＮが２２０ヌクレオチド長より長い、請求項１〜６２のいずれかに記載の方法または細胞。
  64. 前記ＧＲＯＮが２３０ヌクレオチド長より長い、請求項１〜６３のいずれかに記載の方法または細胞。
  65. 前記ＧＲＯＮが２４０ヌクレオチド長より長い、請求項１〜６４のいずれかに記載の方法または細胞。
  66. 前記ＧＲＯＮが２５０ヌクレオチド長より長い、請求項１〜６５のいずれかに記載の方法または細胞。
  67. 前記ＧＲＯＮが２６０ヌクレオチド長より長い、請求項１〜６６のいずれかに記載の方法または細胞。
  68. 前記ＧＲＯＮが２７０ヌクレオチド長より長い、請求項１〜６７のいずれかに記載の方法または細胞。
  69. 前記ＧＲＯＮが２８０ヌクレオチド長より長い、請求項１〜６８のいずれかに記載の方法または細胞。
  70. 前記ＧＲＯＮが２９０ヌクレオチド長より長い、請求項１〜６９のいずれかに記載の方法または細胞。
  71. 前記ＧＲＯＮが３００ヌクレオチド長より長い、請求項１〜７０のいずれかに記載の方法または細胞。
  72. 前記ＧＲＯＮが４００ヌクレオチド長より長い、請求項１〜７１のいずれかに記載の方法または細胞。
  73. 前記ＧＲＯＮが５００ヌクレオチド長より長い、請求項１〜７２のいずれかに記載の方法または細胞。
  74. 前記ＧＲＯＮが６００ヌクレオチド長より長い、請求項１〜７３のいずれかに記載の方法または細胞。
  75. 前記ＧＲＯＮが７００ヌクレオチド長より長い、請求項１〜７４のいずれかに記載の方法または細胞。
  76. 前記ＧＲＯＮが８００ヌクレオチド長より長い、請求項１〜７５のいずれかに記載の方法または細胞。
  77. 前記ＧＲＯＮが９００ヌクレオチド長より長い、請求項１〜７６のいずれかに記載の方法または細胞。
  78. 前記ＧＲＯＮが１０００ヌクレオチド長より長い、請求項１〜７７のいずれかに記載の方法または細胞。
  79. 前記植物が、カノーラ、ヒマワリ、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、タバコ、サトウダイコン、ワタ、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、ソルガム、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ類、サトウキビ、エンドウマメ、ヒヨコマメ、フィールドピー、ソラマメ、レンズマメ、カブ、ルタバガ、メキャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、フィールドビーンズ、ポプラ、マツ、ユーカリ、ブドウ、カンキツ類、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、エンバク、芝草および飼料草、アマ、アブラナ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサムモミ、コショウ、ナス、マリーゴールド、ハス、キャベツ、デイジー、カーネーション、チューリップ、アヤメ、キャッサバならびにユリからなる群より選択される、請求項１〜７８のいずれかに記載の方法または細胞。
  80. 前記植物がカノーラである、請求項１〜７９のいずれかに記載の方法または細胞。
  81. 前記植物がトウモロコシ（ｃｏｒｎ）である、請求項１〜８０のいずれかに記載の方法または細胞。
  82. 前記植物がトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）である、請求項１〜８１のいずれかに記載の方法または細胞。
  83. 前記植物がイネである、請求項１〜８２のいずれかに記載の方法または細胞。
  84. 前記植物がソルガムである、請求項１〜８３のいずれかに記載の方法または細胞。
  85. 前記植物がジャガイモである、請求項１〜８４のいずれかに記載の方法または細胞。
  86. 前記植物がダイズである、請求項１〜８５のいずれかに記載の方法または細胞。
  87. 前記植物がアマである、請求項１〜８６のいずれかに記載の方法または細胞。
  88. 前記植物がアブラナである、請求項１〜８７のいずれかに記載の方法または細胞。
  89. 前記植物がキャッサバである、請求項１〜８８のいずれかに記載の方法または細胞。
  90. 前記植物がヒマワリである、請求項１〜８９のいずれかに記載の方法または細胞。
  91. 植物細胞に遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＣＲＩＳＰＲおよび修飾ＧＲＯＮに曝露することを含む、方法。
  92. 複数の遺伝子変化が生じる、請求項１〜９１のいずれかに記載の方法または細胞。
  93. ２つ以上のガイドＲＮを使用する、請求項１〜９２のいずれかに記載の方法または細胞。
  94. 前記２つ以上のガイドＲＮＡがそれぞれ、異なる遺伝子変化の標的に対して相補的である、請求項１〜９３のいずれかに記載の方法または細胞。
  95. 前記ＣＲＩＳＰＲがニッカーゼを含む、請求項１〜９４のいずれかに記載の方法または細胞。
  96. 前記ＤＮＡ切断剤が２つ以上のニッカーゼを含む、請求項１〜９５のいずれかに記載の方法または細胞。
  97. ２つ以上のニッカーゼが標的核酸配列の反対側の鎖を切断する、請求項１〜９６のいずれかに記載の方法または細胞。
  98. ２つ以上のニッカーゼが前記標的核酸配列の同じ鎖を切断する、請求項１〜９７のいずれかに記載の方法または細胞。
  99. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基に２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜９８のいずれかに記載の方法または細胞。
  100. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基に２’−Ｏ−メチル基を含み、他には２’−Ｏ−メチル基を有さない、請求項１〜９９のいずれかに記載の方法または細胞。
  101. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の２つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜１００のいずれかに記載の方法または細胞。
  102. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の３つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜１０１のいずれかに記載の方法または細胞。
  103. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の４つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜１０２のいずれかに記載の方法または細胞。
  104. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の５つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜１０３のいずれかに記載の方法または細胞。
  105. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の６つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜１０４のいずれかに記載の方法または細胞。
  106. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の７つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜１０５のいずれかに記載の方法または細胞。
  107. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の８つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜１０６のいずれかに記載の方法または細胞。
  108. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の９つ以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜１０７のいずれかに記載の方法または細胞。
  109. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の１０以上の塩基にそれぞれ２’−Ｏ−メチル基を含む、請求項１〜１０８のいずれかに記載の方法または細胞。
  110. 前記ＧＲＯＮが、３’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＲＮＡ塩基を含む、請求項１〜１０９のいずれかに記載の方法または細胞。
  111. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の１番目（最後）の塩基に２’−Ｏ−メチル基を含まない、請求項１〜９８のいずれかに記載の方法または細胞。
  112. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の２つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、請求項１〜９８および１１１のいずれかに記載の方法または細胞。
  113. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の３つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、請求項１〜９８および１１１〜１１２のいずれかに記載の方法または細胞。
  114. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の４つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、請求項１〜９８および１１１〜１１３のいずれかに記載の方法または細胞。
  115. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の５つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、請求項１〜９８および１１１〜１１４のいずれかに記載の方法または細胞。
  116. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の６つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、請求項１〜９８および１１１〜１１５のいずれかに記載の方法または細胞。
  117. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の７つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、請求項１〜９８および１１１〜１１６のいずれかに記載の方法または細胞。
  118. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の８つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、請求項１〜９８および１１１〜１１７のいずれかに記載の方法または細胞。
  119. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の９つ以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、請求項１〜９８および１１１〜１１８のいずれかに記載の方法または細胞。
  120. 前記ＧＲＯＮが、３’末端の最初の１０以上のいずれの塩基にも２’−Ｏ−メチル基を含まない、請求項１〜９８および１１１〜１１９のいずれかに記載の方法または細胞。
  121. 前記ＧＲＯＮが、３’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＲＮＡ塩基を含まない、請求項１〜９８および１１１〜１２０のいずれかに記載の方法または細胞。
  122. 請求項１〜１２１のいずれか１項に記載の方法により、または請求項１〜１２１のいずれか１項に記載の細胞から作製される、非トランスジェニック除草剤抵抗性または耐性植物。
  123. 前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）に遺伝子変化または変異を有し、オオムギ、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、キビ、エンバク、ライムギ、イネ、ソルガム、サトウキビ、芝草およびコムギからなる群より選択される、請求項１〜１２２のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  124. 前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）に遺伝子変化または変異を有し、１つまたは複数の除草剤に対して抵抗性または耐性である、請求項１〜１２３のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  125. 前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）に遺伝子変化または変異を有し、１つまたは複数のＡＣＣアーゼ阻害除草剤に対して抵抗性である、請求項１〜１２４のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  126. 前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）に遺伝子変化または変異を有し、アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップＰ、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップＰ、ハロキシホップ、ハロキシホップＰ、イソキサピリホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップＰ、トリホップ、ピノキサデン、上記のいずれかの除草剤の農学的に許容される塩およびエステルならびにそれらの組合せからなる群より選択される１つまたは複数の除草剤に対して抵抗性である、請求項１〜１２５のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  127. 前記植物細胞が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）に遺伝子変化または変異を有し、前記植物細胞が、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、コムギ、イネ、オオムギ、ソルガム、エンバク、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、アブラナ、カノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウマメ、レンズマメ、ブドウおよび芝草からなる群より選択される、請求項１〜１２６のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  128. 前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）に遺伝子変化または変異を有し、植物または植物細胞が、少なくとも１つの除草剤に対して抵抗性である、請求項１〜１２７のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  129. 前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）に遺伝子変化または変異を有し、植物または植物細胞が、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対して抵抗性である、請求項１〜１２８のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  130. 前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）に遺伝子変化または変異を有し、植物または植物細胞が、グリホサートに対して抵抗性である、請求項１〜１２９のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  131. 前記植物または植物細胞が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）に遺伝子変化または変異を有し、植物または植物細胞が、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、コムギ、イネ、オオムギ、ソルガム、エンバク、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、アブラナ、カノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウマメ、レンズマメ、ブドウおよび芝草からなる群より選択される、請求項１〜１３０のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  132. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１つのアレルに起こる、請求項１〜１３１のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  133. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の２つのアレルに起こる、請求項１〜１３２のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  134. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の３つのアレルに起こる、請求項１〜１３３のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  135. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の４つのアレルに起こる、請求項１〜１３４のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  136. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアレルに起こる、請求項１〜１３５のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  137. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１つのアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、請求項１〜１３６のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  138. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の２つのアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、請求項１〜１３７のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  139. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の３つのアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、請求項１〜１３８のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  140. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の４つのアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、請求項１〜１３９のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  141. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、請求項１〜１４０のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  142. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１つのアレルに起こり、前記遺伝子の第二のアレルが、前記第二のアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、請求項１〜１４１のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  143. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１つのアレルに起こり、前記遺伝子の第二のアレルおよび第三のアレルが、前記遺伝子の第二のアレルおよび第三のアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、請求項１〜１４２のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  144. 前記細胞の前記遺伝子変化または変異が、前記遺伝子の１つのアレルに起こり、前記遺伝子の第二のアレル、第三のアレルおよび第四のアレルが、前記遺伝子の第二のアレル、第三のアレルおよび第四のアレルのノックアウトを生じる欠失または挿入を含む、請求項１〜１４３のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  145. 前記細胞の前記遺伝子変化が、１つのアレルの少なくとも１つの変異と、別のアレルの少なくとも１つのノックアウトとを含む、請求項１〜１４４のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  146. 前記細胞の前記遺伝子変化が、１つのアレルの少なくとも１つの変異と、少なくとも１つの他のアレルの少なくとも１つのノックアウトとを含む、請求項１〜１４５のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  147. 前記細胞の前記遺伝子変化が、１つのアレルの少なくとも１つの変異と、少なくとも２つの他のアレルの少なくとも１つのノックアウトとを含む、請求項１〜１４６のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  148. 前記細胞の前記遺伝子変化が、１つのアレルの少なくとも１つの変異と、少なくとも３つの他のアレルの少なくとも１つのノックアウトとを含む、請求項１〜１４７のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
  149. 前記細胞の前記遺伝子変化が、１つのアレルの少なくとも１つの変異と、他のすべてのアレルのノックアウトとを含む、請求項１〜１４８のいずれかに記載の方法または細胞または植物。
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