JPWO2020184403A1 - 培養細胞の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)a)複数の動物細胞又は植物細胞を培養容器において接着培養により又は半固形培地上で培養し、単一細胞に由来する複数のコロニーを形成させる工程、
b)前記複数のコロニーの一部について、核酸中の一以上の塩基配列を核酸又はタンパク質検出法により検出する工程であって、その間、前記複数のコロニーが培養容器において培養される工程、及び
c)前記検出法の結果に基づいて、前記一部のコロニーを選択して採取する工程、
を含む、培養細胞の生産方法。
(2)前記工程c)において採取された細胞をさらに培養する工程を含む、(1)に記載の方法。
(3)前記遺伝子又はタンパク質検出法が、一塩基ミスマッチ検出PCRである、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)前記工程a)において、細胞を接着培養により培養する、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)前記工程b)において、前記複数のコロニーが、4時間〜6日間培養される、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)前記工程a)において、動物細胞を培養する、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)前記動物細胞が哺乳動物細胞である、(6)に記載の方法。
(8)前記哺乳動物細胞が幹細胞である、(7)に記載の方法。
(9)前記培養容器が、容器上の各コロニーの位置を識別可能な識別子を有し、前記工程c)において、前記識別子に基づいて前記一部のコロニーを識別して選択を行う、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)前記識別子を有する培養容器が、グリッド付プレートである、(9)に記載の方法。
(11)前記工程c)の前又は後に、前記複数のコロニーの一部をさらに別の遺伝子又はタンパク質検出法に供する工程を含む、(1)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(12)前記工程a)の前に、前記動物細胞又は植物細胞に対してゲノム編集を行う工程をさらに含む、(1)〜(11)のいずれかに記載の方法。
(13)前記ゲノム編集により、ゲノムDNA中の変異型塩基配列を野生型塩基配列に置換するか、又は野生型塩基配列を変異型塩基配列に置換する、(12)に記載の方法。
(14)前記変異型塩基配列が疾患の原因となる、(13)に記載の方法。
(15)前記ゲノム編集においてマーカー塩基を導入せず、前記工程b)においてゲノム編集によって置換される前のヌクレオチドが存在しないことを検出する、(12)〜(14)のいずれかに記載の方法。
(16)前記ゲノム編集が、TALEN及びその改変体、SpCas9及びその改変体、SaCas9及びその改変体、ScCas9及びその改変体、AsCpf1及びその改変体、LbCpf1及びその改変体、FnCpf1及びその改変体、MbCpf1及びその改変体、CBE及びその改変体又は類似体、ABE及びその改変体又は類似体からなる群から選択されるタンパク質を用いて行われる、(12)〜(15)のいずれかに記載の方法。
(17)動物細胞又は植物細胞においてゲノム編集により、マーカー塩基を導入することなくゲノムDNA中の変異型塩基配列を野生型塩基配列に置換するか、又は野生型塩基配列を変異型塩基配列に置換する工程、
ゲノム編集後の細胞において、ゲノム編集によって置換される前のヌクレオチドが存在しないことを検出する工程、及び
置換される前のヌクレオチドが存在しないことが検出された細胞を選択して採取する工程、
を含む、培養細胞の生産方法。
(18)前記ゲノム編集によって置換される前のヌクレオチドが存在しないことを、一塩基ミスマッチ検出PCRにより検出する、(17)に記載の方法。
(19)前記ゲノム編集が、TALEN及びその改変体、SpCas9及びその改変体、SaCas9及びその改変体、ScCas9及びその改変体、AsCpf1及びその改変体、LbCpf1及びその改変体、FnCpf1及びその改変体、MbCpf1及びその改変体、CBE及びその改変体又は類似体、ABE及びその改変体又は類似体からなる群から選択されるタンパク質を用いて行われる、(17)又は(18)に記載の方法。
(20)(12)〜(19)のいずれかに記載の方法によって得られるゲノム編集がなされた細胞。
(21)(20)に記載の細胞を含む、医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-042383号の開示内容を包含する。
一実施形態において、本発明は、培養細胞を生産する方法に関する。本発明の方法の対象となり得る細胞は、動物細胞又は植物細胞であれば限定しない。動物細胞の由来となる生物種は、例えば、哺乳動物(例えばヒト及びアカゲザル等の霊長類、ラット、マウス、及びドブネズミ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、並びにカンガルー、コアラ、ウォンバット等の有袋類及びカモノハシ、ハリモグラ等の単孔類が挙げられる)、鳥類(ニワトリ、アヒル、ハト、ダチョウ、エミュー、オウム、及びセキショクヤケイ等)、爬虫類(トカゲ、ワニ、ヘビ、カメ等)、両生類(アフリカツメガエル及びネッタイツメガエル、サンショウウオ、アホロートル等)、魚類(メダカ、ゼブラフィッシュ、キンギョ、フナ、コイ、サケ、マス、ウナギ、ナマズ、スズキ、タイ、ヒラメ、マグロ、ブリ、カツオ、サメ等)、軟体動物類(タコ、イカ、アワビ、サザエ、アコヤガイ、ハマグリ、アサリ、カタツムリなど)、棘皮動物類(ウニ、ナマコ、ヒトデ等)、甲殻類(カニ、エビ、シャコ、ザリガニ、ヤドカリ等)、昆虫類(カイコ、クワコ、オオミノガ、チャミノガ、ショウジョウバエ、ミツバチ、クマバチ、アリ、テントウムシ、コオロギ、バッタ、カブトムシ、クワガタムシ、カミキリムシ、ゴキブリ、シロアリ等)、刺胞動物(ヒドラ、クラゲ、サンゴ等)が挙げられ、好ましくはヒト等の哺乳動物である。植物細胞の由来となる生物種は限定されず、例えば、単子葉植物及び双子葉植物を含む被子植物、裸子植物、コケ植物、シダ植物、草本植物及び木本植物等いずれの植物細胞であってもよい。植物細胞の由来の具体例としては、例えば、イネ科(イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ソルガム、ハトムギ、サトウキビ、ヨシ及びマダケ等)、アブラナ科(シロイヌナズナ、アブラナ、ブロッコリー、ワサビ、及びキャベツ等)、ナス科(ナス、トマト、タバコ、トウガラシ、及びジャガイモ等)、ウリ科(キュウリ、メロン、スイカ、ヒョウタン等)、ヒガンバナ科(ネギ、タマネギ、ニンニク等)、マメ科(ダイズ、アズキ、レンゲ、カンゾウ、クズ、センナ、キバナオウギ、アラビアゴムノキ、シタン等)、キンポウゲ科(オウレン等)、アカネ科(クチナシ、コーヒーノキ等)、サトイモ科(サトイモ、コンニャク、ハンゲ、カラスビシャク等)、ヤマノイモ科(ヤマノイモ、ナガイモ等)、ヒルガオ科(サツマイモ、アサガオ等)、トウダイグサ科(キャッサバ、パラゴムノキ等)、セリ科(ニンジン、セロリ、トウキ、ミシマサイコ、センキュウ、ボウフウ等)、タデ科(イヌタデ、ソバ、ダイオウ等)、クワ科(クワ、カジノキ等)、ヒユ科(アマランサス、ケイトウ等)、スベリヒユ科(スベリヒユ、マツバボタン等)、アオイ科(オクラ、ハイビスカス等)、キク科(ヒマワリ、キクイモ、アーティチョーク、ホソバオケラ、オオバナオケラ等)、ミズキ科(サンシュユ等)、バラ科(バラ、モモ、ナシ、リンゴ、イチゴ等)、ミカン科(ミカン、ユズ、サンショウ、キハダ等)、ブドウ科(ブドウ、ヤマブドウ等)、ボタン科(ボタン、シャクヤク等)、ゴマノハグサ科(アカヤジオウ等)、シソ科(シソ、ハッカ、ローズマリー、コガネバナ等)、モクセイ科(レンギョウ等)、キキョウ科(キキョウ等)、マタタビ科(マタタビ、サルナシ、キウイフルーツ等)、オモダカ科(サジオモダカ等)、ジャノヒゲ(ジャノヒゲ等)、カキノキ科(カキノキ、コクタン等)、ラン科(シュンラン、バニラ等)、バショウ科(バショウ、バナナ等)、ウコギ科(タラノキ、オタネニンジン等)、クスノキ科(シナニッケイ、アボカド等)、クロウメモドキ科(ナツメ等)、ブナ科(ブナ、ナラ、クリ等)、ムクロジ科(ムクロジ、トチノキ等)、アサ科(麻(ヘンプ)等)、イラクサ科(苧麻(ラミー)等)、キジカクシ科(サイザルアサ、アガヴェ等)、ウルシ科(ヤマウルシ、ハゼノキ、マンゴー等)、カバノキ科(シラカンバ、ダケカンバ等)、ヤナギ科(ネコヤナギ、シダレヤナギ等)、コショウ科(コショウ等)、パイナップル科(パイナップル等)、パパイア科(パパイア等)、ニクズク科(ニクズク等)、ケシ科(ケシ等)、ヤシ科(ココヤシ、アブラヤシ等)、マツ科(アカマツ、エゾマツ等)、マオウ科(マオウ)、イチョウ科(イチョウ等)、シダ植物(ワラビ、スギナ、ヘゴ等)、コケ植物(ゼニゴケ、ツノゴケ、マゴケ、スギゴケ等)の植物が挙げられる。これら細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞、及び凍結細胞のいずれであってもよい。
a)複数の動物細胞又は植物細胞を培養容器において接着培養により又は半固形培地上で培養し、単一細胞に由来する複数のコロニーを形成させる工程(以下、「コロニー形成工程」とも記載する)、
b)前記複数のコロニーの一部について、核酸中の一以上の塩基配列を核酸又はタンパク質検出法により検出する工程であって、その間、前記複数のコロニーが培養容器において培養される工程(以下、「検出工程」とも記載する)、及び
c)前記検出法の結果に基づいて、前記一部のコロニーを選択して採取する工程(以下、「選択工程」とも記載する)を含む。本実施形態における本発明の方法を構成する各工程を以下に詳細に記載する。
コロニー形成工程では、複数の動物細胞又は植物細胞を培養容器において接着培養により又は半固形培地上で培養し、単一細胞に由来する複数のコロニーを形成させる。
検出工程は、コロニー形成工程により形成された複数のコロニーの一部について、核酸中の一以上の塩基配列を核酸又はタンパク質検出法により検出する工程である。コロニーの「一部」とは、検出工程により目的の細胞を検出可能な程度であれば限定しないが、例えば形成された全コロニーの5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、又は20%以上であってよく、80%以下、60%以下、50%以下、40%以下、又は30%以下であってよく、例えば5%〜80%、8%〜40%、又は10%〜30%であってよい。
一塩基ミスマッチ検出PCRとは、一塩基ミスマッチを検出可能なPCRを意味する。一塩基ミスマッチ検出PCRは、特定のポリメラーゼを用いた場合に、プライマーの3'末端における1塩基が全一致しない場合(ミスマッチが存在する場合)は増幅効率が著しく低下することを利用する。一塩基ミスマッチ検出PCRは、対応する塩基を3'末端に設定した配列特異的プライマーを用いて行われる。一塩基ミスマッチは、例えばHiDi DNA polymerase(Drum, M. et al., 2014, PLoS One, 9, e96640)を用いて行うことができる。一塩基ミスマッチ検出PCRは、多型等を検出する場合等には、「amplification refractory mutation system(ARMS)」又は「アレル特異的増幅(ASA)、又は「アレル特異的PCR」とも呼ばれる。
酵素ミスマッチ切断法では、まず検出対象の核酸とハイブリダイズした際にミスマッチを含むか、或いは含まない核酸をハイブリダイズすることによってヘテロ二重鎖を形成せる。続いて、ミスマッチが存在する場合に生ずる二重鎖の一本鎖領域を切断する酵素で処置する。たとえば、RNA/DNA二重鎖では、RNaseで処置し、DNA/DNAハイブリッドでは、S1ヌクレアーゼ、CEL Iエンドヌクレアーゼ、T7 エンドヌクレアーゼI(T7E1)、T7 エンドヌクレアーゼIV(T7E4)、エンドヌクレアーゼV、Surveyorヌクレアーゼ等で処置して、ミスマッチ領域を酵素的に消化することができる。ミスマッチ領域の消化の後、次いで生じる産物を変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズによって分離して、SNP等の特定の塩基配列を検出することができる。詳細については、例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397等を参照されたい。
検出対象の塩基配列を含む核酸配列が制限酵素認識部位を含んでいる場合には、制限酵素断片長多型分析法(RFLP法:Botstein, D. R., et al., Am. J. Hum. Gen., 32, 314-331 (1980))によって検出を行うことができる。RFLP法では、まず、核酸中の検出される塩基配列を含む領域のDNA断片をPCR法等により増幅させてサンプルを得る。次いで、このサンプルを特定の制限酵素を用いて消化し、DNAの切断様式(切断の有無、切断フラグメントの塩基長等)を常法に従って確認し、これによりSNP等の特定の塩基配列を検出する。
TaqManPCR法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド(TaqManプローブ)とTaqDNAポリメラーゼによるPCRを利用した方法である(例えば、Genet. Anal., 14, 143-149 (1999))。TaqManプローブは、多型部位を含む約13〜20塩基のオリゴヌクレオチドであり、5'末端は蛍光レポーター色素によって標識されており、3'末端はクエンチャーによって標識されている。このアレル特異的プローブを用いることにより、SNP等の特定の塩基配列の検出が可能となる。
IDAAでは、標的部位に隣接する標的特異的プライマー(F/R)、及びFプライマーに付した5'オーバーハング配列に特異的な5'FAM標識プライマー(FamF)の3つのプライマーを用いて、標的部位の増幅を行う。増幅の結果、FAM標識された増幅産物が得られる。続いて、indelを含む蛍光標識された増幅産物を、断片分析により検出することによって、indelを検出することができる。詳細については、例えばYang Z. et al., 2015, Nucleic Acids Res., 43, e59;1-8を参照されたい。
質量分析法は、塩基配列の差によって生じる質量の差を検出する方法である。具体的には、検出したい塩基配列を含む領域をPCRにて増幅した後、SNP等の特定の塩基配列の位置直前に伸長用プライマーをハイブリダイズさせ、伸長反応を行う。伸長反応の結果、SNP等に応じて3'末端の異なる断片が生成される。この生成産物を精製し、MALDI-TOF等の質量分析計等によって分析することで、質量数と遺伝子型との対応を解析し、SNP等の特定の塩基配列を検出することができる(例えば、Pusch, W. et al., 2002, Pharmacogenomics, 3(4): 537-48を参照されたい)。
ダイレクトシークエンス法は、特定の塩基配列を含むDNA断片をPCR増幅した後、増幅されたDNAのヌクレオチド配列を直接ジデオキシ法等により配列決定する方法である(Biotechniques, 11, 246-249 (1991))。この方法で用いられるPCRプライマーは、約15〜30塩基程度のオリゴヌクレオチドであり、通常多型部位を含む約50bp〜2000bpのDNA断片を増幅する。また、シークエンスプライマーとしては、配列決定を行う部位から50〜300ヌクレオチド程度5'末端側の位置に相当する15〜30塩基程度のオリゴヌクレオチドを用いる。
核酸中の一以上の塩基配列によって指定されるアミノ酸を含むタンパク質を検出することによって、間接的に塩基配列を検出することもできる。タンパク質検出法の例としては、ウエスタンブロッティングが挙げられる。例えば、SNPによって、塩基配列により指定されるアミノ酸配列が異なる場合、例えば一アミノ酸置換を識別できる抗体を用いてウエスタンブロッティングを行うことにより、間接的にSNPを検出し得る。
選択工程では、検出工程における上記検出法の結果に基づいて、一部のコロニーのうち、上記一以上の塩基配列が検出されたコロニーを選択して採取する。
本態様の培養細胞を生産する方法は、上記コロニー形成工程、検出工程、及び選択工程に加えて、他の工程を含んでもよい。他の工程は限定しないが、例えば、以下で記載するゲノム編集工程、選抜工程、選択工程で選択された細胞を培養する工程、及び細胞のクローン性を確認する工程のいずれか一以上が挙げられる。本明細書に記載の培養細胞を生産する方法は、上記工程を含むか、又はからなってもよい。
一態様において、本発明は、(i)動物細胞又は植物細胞においてゲノム編集により、マーカー塩基を導入することなくゲノムDNA中の変異型塩基配列を野生型塩基配列に置換するか、又は野生型塩基配列を変異型塩基配列に置換する工程(以下、「ゲノム編集工程」とも記載する)、(ii)ゲノム編集後の細胞において、ゲノム編集によって置換される前のヌクレオチドが存在しないことを検出する工程(以下、「検出工程」とも記載する)、及び(iii)置換される前のヌクレオチドが存在しないことが検出された細胞を選択して採取しする工程(以下、「選択工程」とも記載する)を含む、培養細胞の生産方法に関する。
一態様において、「1.培養細胞を生産する方法」及び「2.マーカー塩基を用いない培養細胞を生産する方法」において記載された方法は、上記一以上の塩基配列が検出された細胞(又はコロニー)を選択する方法、又はゲノム編集がなされた細胞(又はコロニー)を選択する方法、又はこれらの細胞を生産する方法ということもできる。
実験フロー
実験フローの概要は以下の通りである。相同組換え(HDR)を実施するために、ゲノム編集ツール(ASCpf1-RR)、crRNA及びピューロマイシン耐性遺伝子を発現するall-in-one ベクター(pY211-puro)及びssODN鋳型を、ヒトiPSCにエレクトロポレーションにより導入した。ピューロマイシンによる選択及び回収の後に、グリッドを有する100mmプレート(マスタープレート)に単一の細胞をまばらに播種し、単一の細胞に由来するコロニーがプレート上で形成されるまで、7〜8日間培養した。図1に、実施例で用いたマスタープレートの模式図を示す。マスタープレートはグリッドにより複数の区画に分けられ、後述する一次又は二次スクリーニングに供する際、及びその後の採取の際のクローンの識別を可能にする(図中、スクリーニングに供した部位に○を付してあり、図1Aはマスタープレート、図1Bはそれをマップ化したものである)。続いて、一部のコロニーに由来するサンプルから、ゲノムDNAを抽出し、一次スクリーニングを行った(一塩基ミスマッチ検出PCRによる候補となるコロニーの特定)。一次スクリーニングの間、抽出を行ったコロニーと、残りのコロニーの両方を含むマスタープレートをそのまま維持した。一次スクリーニングでは、ポジティブスクリーニングの場合、ssODNを用いて意図した置換(M)に加えて、一塩基(Single Nucleotide)マーカー(S)を導入し(MS鋳型)、マーカー塩基の存在を一塩基ミスマッチ検出PCRにより検出した。ネガティブスクリーニングの場合、ssODNを用いて意図した置換(M)のみを導入し(M鋳型)、置換前の塩基が存在しないことを一塩基ミスマッチ検出PCRによって確かめた。続いて、一次スクリーニングを通過したコロニーにつき、ダイレクトシークエンシングにより二次スクリーニングを行った。また、二次スクリーニングを通過したコロニーをマスタープレートから、顕微鏡下で、ピペットチップを用いて採取し、増殖させたクローンについて、意図した変異を導入する効率について、サンガーシークエンスにより試験した。実験の詳細について、以下に記載する。
ピューロマイシン耐性遺伝子を有するAsCpf1-RR変異体のall-in-oneベクターを作製するために、AsCpf1-RR及びcrRNA骨格を含むpY211哺乳動物発現ベクター(Gao, L. et al., 2017, Nat. Biotechnol., 35, 789-792)(Addgene plasmid ナンバー89352をDr. Feng Zhangから譲り受けた)を用いた。ここで、3×HAタグは、3×HAタグ、T2AペプチドcDNA、及びSGFP2 cDNAに置換した。手短には、3×HA及びT2AフラグメントをssODNのアニーリングにより構築し、SGFP2 cDNAをpSGFP2-C1(Addgene plasmid ナンバー22881をDr. Dorus Gadellaから譲り受けた)から増幅させた。pY211ベクターをBamHI/EcoRIにより切断した。最後に、全ての断片を、In-Fusion HD Cloning kit(Clontech/TAKARA-BIO)を用いて融合させた。得られたプラスミドを、pY211-T2Gと名付けた。その後、ピューロマイシン耐性遺伝子に対応するcDNAを、pSIH-H1-Puro vector(Addgene plasmid ナンバー26597をDr. Frank Sinicropeから譲り受けた)から増幅し、SpeI/EcoRI部位でpY211-T2Gベクターに融合させた。最終的なall-in-oneベクターは、pY211-puroと名付けた。
修復/改変のための99塩基長のssODN鋳型(PAGE精製済、Sigma-Aldrich)は、中心をCRISPR-AsCpf1の5’予測切断部位とし、5'隣接及び3'隣接49塩基長を含むものであった。本鋳型は、病原性SNP/SNV又はそれに対応する野生型ヌクレオチドを含み、場合によりマーカー塩基として用いるためのサイレント変異を含んでいた。サイレント変異は、コドン使用データベースに基づき選択した(https://www.kazusa.or.jp/codon/)。
iPSCsは、CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit(ThermoFisher Scientific, U.S.A.)を用いて、製造業者のプロトコルに従って、ヒトT細胞から作製した。手短には、ヒトT細胞を末梢血サンプルから単離し、1.5×106細胞/ウェルの密度で、抗CD3抗体(eBioscience)でコートした6ウェルプレートに播種した。1日後、3×105細胞に、感染多重度(MOI)10でリプログラミング因子を有する組換えセンダイウイルス(SeV)を感染させた。2日間培養後、感染細胞を回収し100mmディッシュあたり2×104細胞で、マイトマイシンC(MMC)処置マウス胚線維芽細胞(フィーダー細胞として作用する)上に再播種した。感染の20〜23日後、コロニーを採取し、ヒトiPSC培地(詳細は以下の通り)で再培養した。SeVを除くため、iPSCを38℃で3日間培養し、1回継代した。
遺伝子編集(GE)実験1-4(GE1-4)では、疾患遺伝子座に常染色体優性変異を有するFB4-14細胞(MEN2B-特異的iPSC)を用いた。この遺伝子座は、エキソン16のコドン918においてRET遺伝子に単一アレル点突然変異(TからC)を有し、これがMet918Thr置換をもたらす。GE5では、疾患遺伝子座に常染色体劣性複合変異を有するB117-3 細胞(DEB-特異的iPSC)を用いた。この遺伝子座は、単一エキソン78のコドン2138において、COL7A1遺伝子に、ナンセンス変異(G2138X)をもたらす単一アレル点突然変異(GからT)を有し、またフレームシフトをもたらす単一アレルindel(n.3591 del.13, ins. GG)を有する。
細胞は、MMCで処置したMEFを播種した、0.1%ゼラチンでコートした細胞培養プレートで維持し、iPSC培地で37℃で5%CO2下で増殖させた。この培地は、20% KNOCKOUTTM血清代替物(KSR, Invitrogen)、2 mM L-グルタミン(Life technologies)、0.1 mM 非必須アミノ酸(NEAA, SIGMA)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(SIGMA)、0.5%ペニシリン及びストレプトマイシン(ナカライテスク)及び5 ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF、和光)を補充したDMEM/F12(SIGMA)からなる。トランスフェクションの前に、iPSCをMatrigel-GFR (Corning)でコートした細胞培養プレートに移し、10 μMのROCK阻害剤を含むMEFで調製したiPSC培地(MEF-CM)で2日間培養した。最後に、細胞をMatrigel-GFRでコートした細胞培養プレート上でmTeSR1培地(STEMCELL Technologies)において37℃で5%CO2下で増殖させた。
iPSCに、pY211-puroベクター(AsCpf1-RR cDNA、CRISPR RNA、及びピューロマイシン耐性遺伝子を含むall-in-one哺乳動物発現ベクター)、及びssODNをエレクトロポレーションした。手短には、1×106細胞を10 μg pY211-puro及び15 μg ssODN(99 nt, PAGE-purified; Sigma-Aldrich)を含む100 μlのOptiMEMに再懸濁した。続いて、Super Electroporator NEPA21 Type 2(NEPA GENE, Japan)を用いて、細胞を2 mmギャップキュベット内でエレクトロポレーションした(トランスファーパルス20 V、パルス長50 ms、パルス回数5回)。エレクトロポレーション後、細胞をMatrigel-GFRコート24ウェルプレートに移し、CloneR (STEMCELL Technologies)を含むmTeSR1培地で16時間増殖させ、CloneR及びピューロマイシン(0.5 μg/ml)を含むmTeSR1培地で48時間処置し、CloneRを含むmTeSR1培地で1〜2日増殖させた。その後、細胞をTrypLE(ThermoFisher Scientific, U.S.A.)で単一化し、CloneRを含むmTeSR1培地に低密度(100mmプレートに対し500〜1000細胞)で播種し、クローニングした。
単一細胞由来のクローンの遺伝子型決定を容易にするために、ポジティブスクリーニングでは、病原性SNP/変異に独立であり、一塩基ミスマッチ検出PCRに用いることができるサイレントな一塩基置換(SNS)をもたらすssODN鋳型を、HDRのために設計した。ゲノム編集を行った単一細胞に由来するiPSCクローンをマスタープレート(100個のスクエアグリッド(PetriSticker, Diversified Biotech Inc.)を有するMatrigel-GFRコート100 mmプレート)において、CloneRを含むmTeSR1培地で4日間、及びmTeSR1培地で3日間増殖させた。増殖したコロニーのおよそ25〜33%を双眼実体顕微鏡下でクリーンな10μLピペットチップを用いてマニュアルで採取し、10μlの溶解バッファーを含むPCRチューブに直接移した。残りのコロニーを含むマスタープレートは、同じ条件において2〜3日そのまま維持した。
遺伝子編集された疾患特異的iPSCにおいて、CHOPCHOP v2: Eivind Valenの研究室により作成されたウェブベースのCRISPRデザインツール(http://chopchop.cbu.uib.no)により、各ガイドRNAについて予測されるオフターゲット事象について試験した。各crRNAについて、上記デザインツールによって予測される7つの上位のオフターゲット部位を用いた。各オフターゲット部位の周囲のゲノムDNA領域を、PCRにより増幅し、UCSC ゲノムブラウザ上(http://genome.ucsc.edu/)の最も新しいHuman Dec. 2013 (GRCh38/hg38)アッセンブリのRefSeqと比較した。
マーカー塩基を用いるアレル特異的単一ヌクレオチド置換
本実施例では、アレル特異的単一ヌクレオチド置換活性をヒトiPSCにおいて調べるために、FB4-14 MEN2B-iPSCにおいて野生型アレル中のRET_M918部位の野生型ヌクレオチドを変異ヌクレオチドに置換した(図2A)。まず、AsCpf1_RRとcrRNA1+、さらに、M918における変異塩基とI913にマーカー塩基の両方を有するssODN改変鋳型(ssODN_RET_M918T_I913_silentC (Mut))(図2A、第2行)を共にFB4-14細胞にエレクトロポレーションした(図2A、第1行)。一塩基ミスマッチ検出PCR分析により、384個のクローンのうち12個が陽性であることが認められた(図2A及びB、表1のGE1)。標的配列のダイレクトシークエンシングにより、12個のクローンのうち7個が、標的部位に野生型アレル特異的な変異ヌクレオチドの導入(Met918においてMetからThrへの置換をもたらすTからCへの置換、図2C、矢印)、及びマーカー塩基(Ile913におけるサイレント変異をもたらすTからCへの置換、図2C、矢頭)を有する意図された遺伝子編集クローンであることが明らかとなった。HDR効率は、1.8%であった(表1)。続いて、ウェブツールのCHOPCHOP v2を用いてオフターゲット標的について調べた。その結果、2つの予測されたオフターゲット部位において、indelは検出されなかった(表2)。さらに、意図しない遺伝子編集がなされたクローン間において標的部位周辺で配列が異なっていたことは、意図した遺伝子編集がなされたクローンのほとんどがクローン増殖していたことを示す(データ示さず)。これらの結果は、オフターゲット効果をもたらすことなく、MEN2B-iPSCにおいて野生型アレルについて示されたように、アレル特異的な方法で、単一の野生型ヌクレオチドを変異ヌクレオチドに置換することができることを示している。
FB4-14細胞において、AsCpf1_RR とcrRNA1m、さらにMet918に修復ヌクレオチド及びIle913にマーカー塩基を含むssODN修復鋳型(ssODN_RET_M918_I913_silentC(WT))を用いて、DSB/HDRを行った(図3A、第2行)。これについて、一塩基ミスマッチ検出PCRを行ったところ、344個のうち、17個の陽性クローンが見出された(図3B、表1のGE2)。また、ダイレクトシークエンシングにより確認したところ、この17個のクローンのうち、11個のクローンが意図した遺伝子編集がなされたクローンであった。すなわち、これらのクローンは、(Met918におけるThrからMetへのアミノ酸置換をもたらす)標的部位における変異型ヌクレオチドから野生型ヌクレオチドへのCからTへの置換(図3C、矢印)を有し、かつ、(Ile913にサイレント変異をもたらす)マーカー塩基(図3C、矢頭)が導入されていた。
続いて、マーカー塩基を用いずに、FB4-14細胞の変異アレル上のRET_M918部位における病原性SNPに対するネガティブスクリーニングを行った(図5A)。AsCpf1_RRとcrRNA1m及びMet918における正常なヌクレオチドのみを含むssODN修復鋳型(ssODN_RET_M918(WT))によるFB4-14細胞におけるDSB/HDRの後に、病原性SNPについて一塩基ミスマッチ検出PCRを行った。この実験系では、修復されたクローンでは変異アレルにおけるSNPが消失するため、修復されたクローンは病原性SNPに対する一塩基ミスマッチ検出PCRによってネガティブクローンとして検出される(図5A、5C)。結果、病原性SNPについて一塩基ミスマッチ検出PCRによって44のネガティブクローンが同定された。ダイレクトシークエンスにより確認したところ、この44個のクローンのうち、5個のクローンが意図した遺伝子編集がなされたクローン、すなわち、Met918における野生型ヌクレオチドのみを含むクローンであった(図5C、5D、及び表1におけるGE4)。全体のHDR効率は2%であり(表1)、また予測されたオフターゲット部位におけるindelは検出されなかった(表2、GE4)。また、標的部位周辺の次世代シークエンサーによるターゲットリシークエンシングによる分析により、遺伝子編集されたクローンにおける意図しない親細胞に由来するゲノムDNAの混入は発生しなかったことが明らかとなり(バックグラウンドレベル、データは示さず)、これは意図した遺伝子編集されたクローンが、クローン増殖したことを示している。
Claims (21)
- a)複数の動物細胞又は植物細胞を培養容器において接着培養により又は半固形培地上で培養し、単一細胞に由来する複数のコロニーを形成させる工程、
b)前記複数のコロニーの一部について、核酸中の一以上の塩基配列を核酸又はタンパク質検出法により検出する工程であって、その間、前記複数のコロニーが培養容器において培養される工程、及び
c)前記検出法の結果に基づいて、前記一部のコロニーを選択して採取する工程、
を含む、培養細胞の生産方法。 - 前記工程c)において採取された細胞をさらに培養する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子又はタンパク質検出法が、一塩基ミスマッチ検出PCRである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記工程a)において、細胞を接着培養により培養する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程b)において、前記複数のコロニーが、4時間〜6日間培養される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程a)において、動物細胞を培養する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項6に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が幹細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記培養容器が、容器上の各コロニーの位置を識別可能な識別子を有し、前記工程c)において、前記識別子に基づいて前記一部のコロニーを識別して選択を行う、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記識別子を有する培養容器が、グリッド付プレートである、請求項9に記載の方法。
- 前記工程c)の前又は後に、前記複数のコロニーの一部をさらに別の遺伝子又はタンパク質検出法に供する工程を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程a)の前に、前記動物細胞又は植物細胞に対してゲノム編集を行う工程をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム編集により、ゲノムDNA中の変異型塩基配列を野生型塩基配列に置換するか、又は野生型塩基配列を変異型塩基配列に置換する、請求項12に記載の方法。
- 前記変異型塩基配列が疾患の原因となる、請求項13に記載の方法。
- 前記ゲノム編集においてマーカー塩基を導入せず、前記工程b)においてゲノム編集によって置換される前のヌクレオチドが存在しないことを検出する、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム編集が、TALEN及びその改変体、SpCas9及びその改変体、SaCas9及びその改変体、ScCas9及びその改変体、AsCpf1及びその改変体、LbCpf1及びその改変体、FnCpf1及びその改変体、MbCpf1及びその改変体、CBE及びその改変体又は類似体、ABE及びその改変体又は類似体からなる群から選択されるタンパク質を用いて行われる、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 動物細胞又は植物細胞においてゲノム編集により、マーカー塩基を導入することなくゲノムDNA中の変異型塩基配列を野生型塩基配列に置換するか、又は野生型塩基配列を変異型塩基配列に置換する工程、
ゲノム編集後の細胞において、ゲノム編集によって置換される前のヌクレオチドが存在しないことを検出する工程、及び
置換される前のヌクレオチドが存在しないことが検出された細胞を選択して採取する工程、
を含む、培養細胞の生産方法。 - 前記ゲノム編集によって置換される前のヌクレオチドが存在しないことを、一塩基ミスマッチ検出PCRにより検出する、請求項17に記載の方法。
- 前記ゲノム編集が、TALEN及びその改変体、SpCas9及びその改変体、SaCas9及びその改変体、ScCas9及びその改変体、AsCpf1及びその改変体、LbCpf1及びその改変体、FnCpf1及びその改変体、MbCpf1及びその改変体、CBE及びその改変体又は類似体、ABE及びその改変体又は類似体からなる群から選択されるタンパク質を用いて行われる、請求項17又は18に記載の方法。
- 請求項12〜19のいずれか一項に記載の方法によって得られるゲノム編集がなされた細胞。
- 請求項20に記載の細胞を含む、医薬組成物。
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