JP7293441B2 - オリゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復を使用した標的遺伝子修飾の効率を高めるための方法および組成物 - Google Patents

オリゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復を使用した標的遺伝子修飾の効率を高めるための方法および組成物 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ、全ての表、図面および特許請求の範囲を含むその全体が参照によ
り本明細書に組み込まれている、２０１４年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６
１／９５３，３３３号；２０１４年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０５
１，５７９号；２０１４年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／０７５，８１
１号；２０１４年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／０７５，８１６号；お
よび２０１５年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１３３，１２９号の利益
を主張するものである。
本開示は、少なくとも部分的には、標的遺伝子突然変異および修飾に関し、そのような
突然変異および修飾を作製するための方法および組成物を含む。
以下の考察は、本開示を理解する際に読者を手助けするために単に提供するものであり
、本開示以前の従来技術を記載または構成することを認めるものではない。
米国特許第６，２７１，３６０号は、所定の変化をコードするオリゴデオキシヌクレオ
チドを導入することによる、生細胞の標的遺伝子中での所定の遺伝子変化の導入のための
方法および組成物を開示する。オリゴデオキシヌクレオチドは、哺乳動物、鳥類、植物お
よび細菌細胞中で有効である。
米国特許第８，７７１，９４５号は、その一部がＣＲＩＳＰＲ複合体の１つまたは複数
の構成要素をコードする、ベクターおよびベクター系、ならびにそのようなベクターの設
計および使用のための方法を開示する。
米国特許第８，４７０，９７３号は、ポリペプチドによりＤＮＡ配列中の塩基対を選択
的に認識するための方法、ＤＮＡ配列中の１つまたは複数の塩基対を特異的に認識する修
飾ポリペプチド、およびポリペプチドが特異的に認識できるように修飾されたＤＮＡおよ
び特異的ＤＮＡ標的化におけるポリペプチドおよびＤＮＡの使用、ならびに細胞中での標
的遺伝子の発現を調節する方法に言及する。
本明細書では、細胞においてＤＮＡの標的遺伝子変化を行うための方法および組成物が
提供される。特定の態様および実施形態は、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列中の特定
位置に対する、修飾の標的化の効率を改善することに関する。本明細書で記載するように
、ゲノムに対して特異的変化を誘導する核酸を様々な手法と組み合わせて、修飾の標的で
ある細胞中に存在する天然修復系の構成要素の利用性を高めることができる。
第１の態様において、植物細胞中の標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に遺伝子修復
オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）仲介型突然変異を導入するための方法が提供される。特定の
実施形態では、これらの方法は特に、植物細胞へのＧＲＯＮの送達、および／または１５
塩基長より大きく標的ＤＮＡに導入するための１つもしくは複数、または２つ以上の突然
変異部位を場合によっては含むＧＲＯＮの植物細胞への送達の前に、および／またはそれ
と同時に１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件下で植物細胞を培養
するステップを含む。
本明細書で使用する「遺伝子修復オリゴヌクレオチド」または「ＧＲＯＮ」は、特定の
条件下で、ＤＮＡ配列中で単一の、または幾つかの実施形態では、複数のヌクレオチド欠
失、挿入または置換を誘導することができるオリゴ核酸塩基（例えば、混合型二本鎖オリ
ゴヌクレオチド、非ヌクレオチド含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、二本鎖
オリゴデオキシヌクレオチドおよび他の遺伝子修復分子）を意味する。ゲノムのこのオリ
ゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復編集は、非相同性に基づく修復系（例えば、非相同末端
結合）と、相同性に基づく修復系（例えば、相同性特異的修復）の両方を含んでもよい。
ＧＲＯＮは、典型的には、指定のミスマッチを除いてゲノム標的と一致して整列するよう
に設計される。これらのミスマッチを、１つまたは複数の細胞の内因性ＤＮＡ修復系を利
用することにより認識および補正することができる。幾つかの実施形態では、ＧＲＯＮま
たはオリゴヌクレオチドを、生物標的配列と比較したときに複数の差異を含有するように
設計することができる。これらの差異は、前記標的配列から翻訳されるタンパク質配列に
全く影響しなくてもよく、１つまたは複数の事例では、サイレントな変化として知られる
。ＧＲＯＮの構造、化学および機能の多数の変異は、本明細書の他の場所に記載される。
様々な実施形態において、本明細書で使用するＧＲＯＮは、１つまたは複数の修飾を有し
てもよい。例えば、本明細書で使用するＧＲＯＮは、標的（ミスマッチ）部位にＤＮＡ修
復機構を誘引する、および／または標的ＤＮＡ配列のゲノムＤＮＡ中へのＧＲＯＮの一部
もしくは全部（所望の標的欠失、挿入、置換など以外）の組換えを防止する、および／ま
たはＧＲＯＮの安定性を増大させる１つまたは複数の修飾を有してもよい。
様々な実施形態において、ＧＲＯＮは、ＲＮＡとＤＮＡの両方のヌクレオチドおよび／
または他の型の核酸塩基を有してもよい。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のＤＮ
ＡまたはＲＮＡヌクレオチドは、修飾を含む。
一態様においては、植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、細胞をＤ
ＮＡ切断剤およびＧＲＯＮに、例えば、本明細書で企図されるように修飾されたＧＲＯＮ
に曝露するステップを含む方法が提供される。幾つかの実施形態においては、ＧＲＯＮは
、Ｃｙ３基、３ＰＳ基、２’Ｏ－メチル基または本明細書で企図される他の修飾などで修
飾することができる。別の態様では、ＤＮＡ切断剤と、例えば、Ｃｙ３基、３ＰＳ基、２
’Ｏ－メチル基または他の修飾などで修飾されたＧＲＯＮとを含む植物細胞が提供される
。幾つかの実施形態においては、ＤＮＡ切断剤は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフ
ィンガー、メガヌクレアーゼ、およびＤＮＡ切断性抗生物質から選択される１つまたは複
数のものである。幾つかの実施形態では、ＤＮＡ切断剤は、ＣＲＩＳＰＲである。幾つか
の実施形態では、ＤＮＡ切断剤は、ＴＡＬＥＮである。幾つかの実施形態では、ＧＲＯＮ
は、１５～６０核酸塩基長；または３０～４０核酸塩基長；または３５～４５核酸塩基長
；または２０～７０核酸塩基長；または２０～２００核酸塩基長；または３０～１８０核
酸塩基長；または５０～１６０核酸塩基長；または７０～１５０核酸塩基長；または７０
～２１０核酸塩基長；または８０～１２０核酸塩基長；または９０～１１０核酸塩基長；
または９５～１０５核酸塩基長；または８０～３００核酸塩基長；または９０～２５０核
酸塩基長；または１００～１５０核酸塩基長；または１００～２００核酸塩基長；または
１００～２１０核酸塩基長；または１００～３００核酸塩基長；または１５０～２００核
酸塩基長；または２００～３００核酸塩基長；または２５０～３５０核酸塩基長；または
５０～１１０核酸塩基長；または５０～２００核酸塩基長；または１５０～２１０核酸塩
基長；または２０～１０００核酸塩基長；または１００～１０００核酸塩基長；または２
００～１０００核酸塩基長；または３００～１０００核酸塩基長；または４００～１００
０核酸塩基長；または５００～１０００核酸塩基長；または６００～１０００核酸塩基長
；または７００～１０００核酸塩基長；または８００～１０００核酸塩基長；または９０
０～１０００核酸塩基長；または３００～８００核酸塩基長；または４００～６００核酸
塩基長；または５００～７００核酸塩基長；または６００～８００核酸塩基長；または３
０より長い核酸塩基長；または３５より長い核酸塩基長；または４０より長い核酸塩基長
；または５０より長い核酸塩基長；または６０より長い核酸塩基長；または６５より長い
核酸塩基長；または７０より長い核酸塩基長；または７５より長い核酸塩基長；または８
０より長い核酸塩基長；または８５より長い核酸塩基長；または９０より長い核酸塩基長
；または９５より長い核酸塩基長；または１００より長い核酸塩基長；または１１０より
長い核酸塩基長；または１２５より長い核酸塩基長；または１５０より長い核酸塩基長；
または１６５より長い核酸塩基長；または１７５より長い核酸塩基長；または２００より
長い核酸塩基長；または２５０より長い核酸塩基長；または３００より長い核酸塩基長；
または３５０より長い核酸塩基長；または４００より長い核酸塩基長；または４５０より
長い核酸塩基長；または５００より長い核酸塩基長；または５５０より長い核酸塩基長；
または６００より長い核酸塩基長；または７００より長い核酸塩基長；または８００より
長い核酸塩基長；または９００より長い核酸塩基長である。
ＧＲＯＮを、標的遺伝子の非コード（ＮＣ）領域とコード（Ｃ）領域の両方において標
的化することができる。例えば、図２７および図２８はそれぞれ、ＡＣＣａｓｅ遺伝子に
下記アミノ酸置換のうちの１つまたは複数を導入するためにイネゲノム中に突然変異を導
入するのに好適なＣ－ＧＲＯＮおよびＮＣ－ＧＲＯＮを記載する。慣例は、参照としてノ
スズメノテッポウ（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ；Ａｍ）に由来する
プラスチドＡＣＣａｓｅのためのアミノ酸番号付けシステムを使用することである。本明
細書で使用するＡＣＣａｓｅ番号付けは、ノスズメノテッポウ参照配列ＡＣＣａｓｅタン
パク質（配列番号１）に関する番号付けまたはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残
基（Ｖ＝ＣＹ３；Ｈ＝３’ＤＭＴ ｄＣ ＣＰＧ）に基づく。以下の表は、アロキシジム
、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、セトキシジム、テ
プラロキシジム、トラルコキシジム、クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、ジ
クロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ－Ｐ、フェンチアプロップ、フル
アジホップ、フルアジホップ－Ｐ、ハロキシホップ、ハロキシホップ－Ｐ、イソキサピリ
ホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ－Ｐ、トリホップ、ピノキサデ
ン、これらの除草剤のいずれかの農学的に許容される塩およびエステル、ならびにその組
合せの抵抗性表現型のうちの１つまたは複数をもたらすＡＣＣａｓｅ突然変異を列挙する
ものである。
Figure 0007293441000001
Figure 0007293441000002
同様に、図２９および図３０はそれぞれ、ＥＰＳＰＳ遺伝子に下記アミノ酸置換のうち
の１つまたは複数を導入するためにアマゲノム中に突然変異を導入するのに好適な（コー
ド）Ｃ－ＧＲＯＮおよび（非コード）ＮＣ－ＧＲＯＮを記載する（全ての番号付けは大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｒｏＡタンパク質（原核ＥＰＳＰＳ等価物）のアミノ酸配列と比較
したものである）（米国特許第８，２６８，６２２号に記載のものなど）。（Ｖ＝ＣＹ３
；Ｈ＝３’ＤＭＴ ｄＣ ＣＰＧ）。以下の表は、グリホサート、これらの除草剤のいず
れかの農学的に許容される塩およびエステル、ならびにその組合せの抵抗性表現型をもた
らすＥＰＳＰＳ突然変異を列挙するものである。
Figure 0007293441000003
本明細書で使用する用語「ＣＲＩＳＰＲ」とは、例えば、Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３３９ ｎｏ６１２１ ｐｐ．８１９－８２３（２０１３）
；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３３７：８１６－８２１（２０１
３）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．９０３－９１３（２００
８）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６１
，ｐｐ．２０－２７（２０１３），Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ
２０１３／０７４７４３号；およびＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ出願
第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２５８９号に記載されたものなどの、細胞中で効率的に存
在する、または発現される場合、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ細胞機構を介する標的ＤＮＡ配列
の切断を行うことができるエレメント、すなわち、ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子、
転写物（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペ
ーサー配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈ
ｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ、ＳＰＩＤＲ－ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔ
ｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔｓとしても知られる）を指す。幾つか
の実施形態においては、例えば、真核細胞中での使用のためのＣＲＩＳＰＲ、本明細書で
企図されるＣＲＩＳＰＲなどは、１つまたは複数の機能的な核局在化シグナルのための配
列を含むさらなるエレメントを含んでもよい。本明細書で企図されるＣＲＩＳＰＲを、任
意の多くの方法または発現で、細胞中で発現させる、細胞に投与する、および／または細
胞中に存在させることができる。例えば、本明細書で企図されるＣＲＩＳＰＲは、以下の
ような、プラスミド上の１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲ、プラスミド上のＣＲＩＳＰＲ
ニッカーゼ、プラスミド上のＣＲＩＳＰＲａ、またはプラスミド上のＣＲＩＳＰＲｉを含
んでもよい。
プラスミド上のＣＲＩＳＰＲ：
（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列で
あって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
ａ．標的ＤＮＡ中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント（
例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント（例えば、トラン
ス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）
を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ
遺伝子）であって、部位特異的ポリペプチドが、
ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；
および
ｂ．標的ＤＮＡ内の二本鎖切断の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、標的
ＤＮＡ内で二本鎖切断を引き起こす活性部分（例えば、ＮＵＣローブ）
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のＣＲＩＳＰＲニッカーゼ。
（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列で
あって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
ａ．標的ＤＮＡ中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント（
例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント（例えば、トラン
ス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）
を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ
遺伝子）であって、部位特異的ポリペプチドが、
ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；
および
ｂ．標的ＤＮＡ内の一本鎖切断の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、標的
ＤＮＡ内で一本鎖切断を引き起こす活性部分（例えば、ＮＵＣローブ）
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のＣＲＩＳＰＲａ。
（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列で
あって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
ａ．標的ＤＮＡ中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント（
例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント（例えば、トラン
ス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）
を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ
遺伝子）であって、部位特異的ポリペプチドが、
ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；
および
ｂ．標的ＤＮＡ内の転写調節部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、標的ＤＮ
Ａ内での転写を調節する活性部分（例えば、ＮＵＣローブ；特定の実施形態では、転写を
増大させる）
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のＣＲＩＳＰＲｉ。
（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列で
あって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
ａ．標的ＤＮＡ中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント（
例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント（例えば、トラン
ス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）
を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ
遺伝子）であって、部位特異的ポリペプチドが、
ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；
および
ｂ．標的ＤＮＡ内の転写／翻訳調節部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、標
的ＤＮＡ内での転写／翻訳を調節する活性部分（例えば、ＮＵＣローブ；幾つかの実施形
態では、転写／翻訳を減少させる）
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のＣＲＩＳＰＲ、プラスミド上のＣＲＩＳＰＲニッカーゼ、プラスミド上
のＣＲＩＳＰＲａ、およびプラスミド上のＣＲＩＳＰＲｉのそれぞれは、あるいは、幾つ
かの実施形態では、プラスミド上よりもむしろＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパ
ク質として細胞中に投与される、発現される、または存在する１つまたは複数の適切なエ
レメントを有してもよい。保護されたｍＲＮＡの送達は、Ｋａｒｉｋｏ，ｅｔ ａｌ．の
米国特許第８，２７８，０３６号に記載の通りであってもよい。
幾つかの実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａのそれぞれは、脱
活性化されたｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含んでもよい。脱活性化されたｃａｓ９は、標的
ＤＮＡに依然として結合するが、切断活性は有さない。ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９は、そ
の２つの触媒ドメインを不活化するＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ点突然変異から生じ得る。
幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲｉは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの立体障害を介し
て転写開始または伸長を阻害する。ＣＲＩＳＰＲｉは、場合により、ｄＣａｓ９タンパク
質のＣ末端への強力なリプレッサードメインの融合により増強することができる（ＣＲＩ
ＳＰＲｅｉ）。幾つかの実施形態では、リプレッサードメインは、クロマチン修飾因子を
動員および使用する。幾つかの実施形態では、リプレッサードメインは、Ｋａｇａｌｅ，
Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．６ ｎｏ２ ｐｐ１４１－１４６
（２０１１）に記載のドメイン：
１．ＬＤＬＮＲＰＰＰＶＥＮ－ＯｓＥＲＦ３リプレッサードメイン（ＬｘＬｘＰＰモチ
ーフ）
２．ＬＲＬＦＧＶＮＭ－ＡｔＢＲＤリプレッサードメイン（Ｒ／ＫＬＦＧＶモチーフ）
３．ＬＫＬＦＧＶＷＬ－ＡｔＨｓｆＢ１リプレッサードメイン（Ｒ／ＫＬＦＧＶモチー
フ）
４．ＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ－ＡｔＳＵＰリプレッサードメイン（ＥＡＲモチーフ）
５．ＥＲＳＮＳＩＥＬＲＮＳＦＹＧＲＡＲＴＳＰＷＳＹＧＤＹＤＮＣＱＱＤＨＤＹＬＬ
ＧＦＳＷＰＰＲＳＹＴＣＳＦＣＫＲＥＦＲＳＡＱＡＬＧＧＨＭＮＶＨＲＲＤＲＡＲＬＲＬ
ＱＱＳＰＳＳＳＳＴＰＳＰＰＹＰＮＰＮＹＳＹＳＴＭＡＮＳＰＰＰＨＨＳＰＬＴＬＦＰＴ
ＬＳＰＰＳＳＰＲＹＲＡＧＬＩＲＳＬＳＰＫＳＫＨＴＰＥＮＡＣＫＴＫＫＳＳＬＬＶＥＡ
ＧＥＡＴＲＦＴＳＫＤＡＣＫＩＬＲＮＤＥＩＩＳＬＥＬＥＩＧＬＩＮＥＳＥＱＤＬＤＬＥ
ＬＲＬＧＦＡ*－リプレッサードメインを含有する完全なＡｔＳＵＰ遺伝子（ＥＡＲモチ
ーフ）
だけに限られないが、これらを含む。
幾つかの実施形態では、転写のＣＲＩＳＰＲａ活性化は、融合したＣ末端転写アクチベ
ーターを含有するｄＣａｓ９タンパク質の使用により達成される。幾つかの実施形態では
、活性化は、Ｃｈｅｎｇ，ＡＷ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐｐ１－
９（２０１３）；Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１０ ｐｐ９１３－９７６（２０１３）；Ｍａｅｄｅｒ，ＭＬ．ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１０ ｐｐ９７７－９７９（２０１
３）およびＭａｌｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．
３１ ｐｐ８３３－８３８（２０１３）に記載のような、ＶＰ６４（４Ｘ ＶＰ１６）、
ＡｔＥＲＦ９８活性化ドメイン、またはＡｔＥＲＦ９８ｘ４コンカテマーだけに限られな
いが、これらを含んでもよい。
幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲは、ニッカーゼを含む。特定の実施形態では、２
つ以上のＣＲＩＳＰＲニッカーゼが使用される。幾つかの実施形態では、２つ以上のニッ
カーゼは、標的核酸の反対の鎖上を切断する。他の実施形態では、２つ以上のニッカーゼ
は、標的核酸の同じ鎖上を切断する。
本明細書で使用する「リプレッサータンパク質」または「リプレッサー」とは、それぞ
れ、転写または翻訳を防止するためにＤＮＡのオペレーターまたはＲＮＡに結合するタン
パク質を指す。
本明細書で使用する「抑制」とは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ上の特定部位へのリプレッサ
ータンパク質の結合による転写または翻訳の阻害を指す。幾つかの実施形態では、抑制は
、転写または翻訳レベルの少なくとも１．５倍、他の実施形態では、少なくとも２倍、他
の実施形態では、少なくとも５倍の有意な変化を含む。
遺伝子の転写および／または翻訳に関して本明細書で使用する「アクチベータータンパ
ク質」または「アクチベーター」は、ＤＮＡのオペレーターまたはＲＮＡに結合して、そ
れぞれ、転写または翻訳を増強または増大させるタンパク質を指す。
遺伝子転写および／または翻訳に関して本明細書で使用する、遺伝子転写および／また
は翻訳に関する「活性化」とは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ上の特定部位へのアクチベーター
タンパク質の結合により転写または翻訳を増強または増大させることを指す。幾つかの実
施形態では、活性化は、転写または翻訳レベルの少なくとも１．５倍、幾つかの実施形態
では、少なくとも２倍、幾つかの実施形態では、少なくとも５倍の有意な変化を含む。
特定の実施形態では、１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件は、
ＧＲＯＮまたは塩基除去修復の標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導
入、ＧＲＯＮまたは非相同末端結合の標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部
位の導入、ＧＲＯＮまたはマイクロホモロジー仲介型末端結合の標的である植物細胞ＤＮ
Ａへの１つまたは複数の部位の導入、ＧＲＯＮまたは相同組換えの標的である植物細胞Ｄ
ＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、およびＧＲＯＮまたは修復を行うための標的であ
る植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入の１つまたは複数を含み得る（例えば
、塩基除去修復（ＢＥＲ）；相同組換え修復（ＨＲ）；ミスマッチ修復（ＭＭＲ）；古典
的および代替的ＮＨＥＪを含む非相同末端結合修復（ＮＨＥＪ）；およびヌクレオチド除
去修復（ＮＥＲ））。
本明細書で記載するように、本明細書で使用するためのＧＲＯＮは、従来型ＲＮＡおよ
びＤＮＡヌクレオチドからの以下の改変：
１つまたは複数の無塩基部位ヌクレオチド、
１つまたは複数の８’オキソｄＡおよび／または８’オキソｄＧヌクレオチド、
その３’末端における逆向き塩基、
１つまたは複数の２’Ｏ－メチルヌクレオチド、
１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチド、
１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドをさらに修飾することができる、その５’末端に
おける１つまたは複数、および幾つかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９
、１０個、またはそれより多くのＲＮＡヌクレオチド、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオ
チドをさらに修飾することができる、その３’末端における１つまたは複数、および幾つ
かの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのＲ
ＮＡヌクレオチド、
その５’末端における１つまたは複数、および幾つかの実施形態では、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くの２’Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオチド、
挿入色素、
５’末端キャップ、
ホスホチオエート修飾、メチルホスホネート修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、Ｏ－
（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）修飾、ジＰＳ修飾、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）修
飾からなる群から選択される骨格修飾、
１つまたは複数の鎖間架橋、
それに、および幾つかの実施形態では、ＧＲＯＮの５’または３’末端に共有結合した
１つまたは複数の蛍光色素、ならびに
ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる１つまたは複数の塩基
のうちの１つまたは複数を含んでもよい。この一覧は限定的であることを意味しない。
本明細書で使用する用語「ゆらぎ塩基」とは、変化が参照配列と比較してヌクレオチド
によりコードされるアミノ酸の配列を変化させない、参照ヌクレオチド配列の１つまたは
複数のヌクレオチド塩基中の変化を指す。
本明細書で使用する用語「非ヌクレオチド」または「無塩基部位ヌクレオチド」とは、
糖および／またはリン酸置換のいずれかを含む、１つまたは複数のヌクレオチド単位の代
わりに核酸鎖中に組み込むことができ、残りの塩基にその酵素活性を示させる任意の基ま
たは化合物を指す。基または化合物は、それがアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシ
ルまたはチミンなどの、一般的に認識されるヌクレオチド塩基を含有しない点で無塩基性
である。それは、当業界で、および本明細書で記載されるような２’または３’Ｈまたは
ＯＨへの置換を有してもよい。
本明細書で記載するように、特定の実施形態において、ＧＲＯＮの質および変換効率は
、ヌクレオチド多量体、例えば、二量体、三量体、四量体などを使用してＧＲＯＮの全体
または一部分を合成することにより、その純度を改善することにより改善することができ
る。
特定の実施形態では、標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列は、植物細胞内に存在する
、例えば、標的ＤＮＡ配列は、植物細胞ゲノム内に存在する。植物細胞は非トランスジェ
ニックまたはトランスジェニックであってよく、標的ＤＮＡ配列は植物細胞の導入遺伝子
または内在性遺伝子であってよい。
特定の実施形態では、１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件は、
植物細胞へのＧＲＯＮの送達の前に、またはそれと同時に、またはその後に植物細胞への
一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する１つまたは複数の化合物の導入を含む。例示的
な化合物は本明細書に記載される。
本明細書で記載する方法および組成物は、一般に植物に適用可能である。例えば、キャ
ノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕ
ｍ種、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ、Ｔｒｉｔ
ｉｃｕｍ ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔｒｉ
ｔｉｃｕｍ ｓｐｅｌｔａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｚｈｕｋｏｖｓｋｙｉおよびＴｒｉｔｉ
ｃｕｍ ｕｒａｒｔｕならびにそのハイブリッドだけに限られないが、これらを含む）、
オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｃｏｍｏｓｕｍ、
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｄｅｐｒｅｓｓｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｉｎｔｅｒｃｅｄｅｎｓ、Ｈｏ
ｒｄｅｕｍ ｊｕｂａｔｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍａ
ｒｉｎｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｐａｒｏｄｉｉ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｐｕｓｉｌｌｕｍ、Ｈ
ｏｒｄｅｕｍ ｓｅｃａｌｉｎｕｍ、およびＨｏｒｄｅｕｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍだけ
に限られないが、これらを含む）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ亜種ｉｎｄｉｃａ、
Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ亜種ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ亜種ｊａｖ
ａｎｉｃａ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ亜種ｇｌｕｔｉｎｏｓａ（もち米）、Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ Ａｒｏｍａｔｉｃａ群（例えば、バスマティ）、およびＯｒｙｚａ ｓ
ａｔｉｖａ（浮稲群）だけに限られないが、これらを含む）、アルファルファ、オオムギ
、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッ
サバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ
科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、ソラマメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ
、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカ
リノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ
ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ、Ｓｅｃａｌｅ ｓｔｒｉｃｔｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ
、Ｓｅｃａｌｅ ｖａｖｉｌｏｖｉｉ、Ｓｅｃａｌｅ ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｓｅｃａｌ
ｅ ｃｉｌｉａｔｏｇｌｕｍｅ、Ｓｅｃａｌｅ ａｎｃｅｓｔｒａｌｅ、およびＳｅｃａ
ｌｅ ｍｏｎｔａｎｕｍだけに限られないが、これらを含む）、オートムギ、芝生（Ｚｏ
ｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ａｇｒｏｓｔｒｉｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｐｏａ ｐｒ
ａｔｅｎｓｉｓ、Ｐｏａ ａｎｎｕａ、Ｄｉｇｉｔａｒｉａ ｓａｎｇｕｉｎａｌｉｓ、
Ｃｙｐｅｒｕｓ ｒｏｔｕｎｄｕｓ、Ｋｙｌｌｉｎｇａ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ｃｙｐ
ｅｒｕｓ ａｍｕｒｉｃｕｓ、Ｅｒｉｇｅｒｏｎ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｙｄｒｏｃ
ｏｔｙｌｅ ｓｉｂｔｈｏｒｐｉｏｉｄｅｓ、Ｋｕｍｍｅｒｏｗｉａ ｓｔｒｉａｔａ、
Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｕｍｉｆｕｓａ、およびＶｉｏｌａ ａｒｖｅｎｓｉｓだけに限
られないが、これらを含む、芝草を含む）と飼草、アマ、ナタネ、ワタ、カラシナ、キュ
ウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デ
ージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、ユリ、既に特に記載されていない限
りにおいて、ナッツ生成植物からなる群から植物種を選択することができる。これらは、
細菌、酵母、真菌、藻類、および哺乳動物細胞およびさらにそれらのオルガネラ（例えば
、ミトコンドリアと葉緑体）だけには限られないが、それらを含めた他の全ての生物系に
全部または一部分を適用することもできる。幾つかの実施形態では、生物または細胞は、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ
、Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａ
ｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄａｍｏｎａｓ ｒｈｉｅｎｈａｒ
ｄｔｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群
から選択される種のものである。幾つかの実施形態においては、酵母は、Ｙａｒｒｏｗｉ
ａ ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａである。他の実施形態では、酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではない。幾つかの実施形態では、植物または植物細胞は、
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓ
ｏｌａｎｕｍ ｐｈｕｒｅｊａ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、
Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉ
ｍｕｍ、およびＺｅａ ｍａｙｓからなる群から選択される種のものである。植物種を、
イネ科の単子葉植物からなる群から選択することができる。イネ科植物を、２つの主要な
クレード、Ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅ、Ｅｈｒｈａｒｔｏｉｄｅａｅ、およびＰｏｏｉｄ
ｅａｅ亜科を含有するクレード（ＢＥＰクレード）と、Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ、Ａｒｕ
ｎｄｉｎｏｉｄｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｉｄｏｉｄｅａｅ、Ｃｅｎｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅａｅ
、Ｍｉｃｒａｉｒｏｉｄｅａｅ、Ａｒｉｓｔｉｄｏｉｄｅａｅ、およびＤａｎｔｈｏｎｉ
ｏｉｄｅａｅ亜科を含有するクレード（ＰＡＣＣＭＡＤクレード）とに分割することがで
きる。Ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅ亜科は、Ｏｒｙｚｅａｅ連を含む。植物種は、ＢＥＰク
レードの植物、特に、ＢａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅおよびＥｈｒｈａｒｔｏｉｄｅａｅ亜科
の植物と関連してもよい。ＢＥＴクレードは、Ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅ、Ｅｈｒｈａｒ
ｔｏｉｄｅａｅ、Ｔｒｉｔｉｃｏｄａｅ群を含み、他のＰｏｏｉｄｅａｅ亜科の群は含ま
ない。ＢＥＴ作物植物は、ＢＥＴサブクレードのメンバー、例えば、オオムギ、コーンな
どである、食物または飼料のために増殖させる植物である。
特定の実施形態では、方法は、植物細胞からＧＲＯＮによって導入された突然変異を有
する植物を再生するステップをさらに含み、植物から種子を回収するステップを含んでも
よい。
関連態様において、本開示は、本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入さ
れたゲノム修飾を含む植物細胞、本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入さ
れたゲノム修飾を含む植物、または本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入
されたゲノム修飾を含む種子、または本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導
入されたゲノム修飾を含む種子の子孫に関する。
本開示の他の実施形態は、以下に詳述する記載、例示的実施形態、および特許請求の範
囲から明らかとなる。
（ＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ部分を有する）ホスホチオエート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮおよび５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮによって仲介されるＢＦＰからＧＦＰへの変換を示す図である。 「２’－Ｏ－メチルＧＲＯＮ」と本明細書で呼ばれる、ＲＮＡ／ＤＮＡを含むＧＲＯＮを示す図である。 ＢＦＰ５ ＣＲＩＳＰＲが標的とするｂｆｐ遺伝子上の位置の略図である。 ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａモデル系における、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の割合に対する、様々な長さのＣｙ３または３ＰＳ ＧＲＯＮのいずれかを導入されたＣＲＩＳＰＲの効果の結果を示す図である。 ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａモデル系における、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の割合に対する、様々な長さの３ＰＳ ＧＲＯＮを導入されたＣＲＩＳＰＲの効果の結果を示す図である。 実施例９で使用されるＧＲＯＮ設計の略図である。 ７１量体ＧＲＯＮからのフローサイトメトリーにより決定されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＢＦＰトランスジェニックモデル系からのＧＦＰ陽性プロトプラストの平均割合の測定値を示す図である。 ２０１量体ＧＲＯＮからのフローサイトメトリーにより決定されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＢＦＰトランスジェニックモデル系からのＧＦＰ陽性プロトプラストの測定値を示す図である。 ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａモデル系におけるＧＦＰ陽性細胞の平均割合に対する、コードおよび非コードＧＲＯＮを導入されたＣＲＩＳＰＲの効果を示す図である。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体への一本鎖ＧＲＯＮまたは二本鎖ＤＮＡのテザリングの略図である。 異なる長さのスペーサーのＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を仲介する際のＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮの効果の結果を示す図である。 プラスミド（ｇＲＮＡプラスミド）上にコードされた、またはアンプリコン（ｇＲＮＡアンプリコン）として使用されたスペーサーのＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を仲介する際のＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮの効果の結果を示す図である。 非修飾対３ＰＳ修飾４１量体ＧＲＯＮのＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を仲介する際のＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮの効果の結果を示す図である。 Ｔ＝０でＣＲＩＳＰＲプラスミドでＰＥＧ処理された茎頂プロトプラストから誘導される３および６週齢のＬｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）微小カルスの次世代配列決定の結果を示す図である。 Ｔ＝０でＣＲＩＳＰＲプラスミドでＰＥＧ処理された茎頂プロトプラストから誘導される３および６週齢のＬｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ微小カルスの次世代配列決定の結果を示す図である。 Ａ．ｔｈａｌｉａｎａプロトプラストにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ活性および遺伝子編集を示す図である。図１６Ａ：送達の７２時間後に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプラスミド（ＢＣ－１）で処理されたプロトプラストにおけるディープシーケンシングにより決定された、サイズに基づくインデルの分布。インデルは総リードの０．７９％に相当した。図１６Ｂ：プラスミド（ＢＣ－１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ－６）の送達の７２時間後にフローサイトメトリーにより同定されたＧＦＰ蛍光プロトプラストの割合により測定されたＢＦＰからＧＦＰへの編集。示されたデータは、トランスフェクション効率について正規化されていない。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝９）である。 異なる長さおよび化学修飾のＧＲＯＮと組み合わせたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを用いたＡ．ｔｈａｌｉａｎａプロトプラストにおける遺伝子編集を示す図である。図１７ａ：プラスミド（ＢＣ－１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ－１）または（ＣＧ－２）の送達の７２時間後にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集における３ＰＳと非修飾ＧＲＯＮの比較。図１７ｂ：プラスミド（ＢＣ－２）およびＧＲＯＮ（ＣＧ－５）または（ＣＧ－８）の送達後７２時間でのフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集におけるＧＲＯＮの長さの比較。図１７ｃ：プラスミド（ＢＣ－１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ－６）、（ＣＧ－９）または（ＣＧ－１０）の送達の７２時間後にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集に関する３ＰＳと２’－Ｏ－Ｍｅ ＧＲＯＮとの比較。図１７ｄ：プラスミド（ＢＣ－３）およびＧＲＯＮ（ＣＧ－３）または（ＣＧ－４）の送達の７２時間後にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集に関する３ＰＳ－とＣｙ３ＧＲＯＮとの比較。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）である。（ＣＧ－１）：ＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ非修飾；（ＣＧ－２）：ＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ ３ＰＳ修飾；（ＣＧ－３）：ＢＦＰセンス４１ｎｂ ３ＰＳ修飾；（ＣＧ－４）：ＢＦＰセンス４１ｎｂ Ｃｙ３修飾；（ＣＧ－５）：ＢＦＰセンス６０ｎｂ ３ＰＳ修飾；（ＣＧ－６）：ＢＦＰアンチセンス２０１ｎｂ ３ＰＳ修飾；（ＣＧ－８）：ＢＦＰセンス２０１ｎｂ ３ＰＳ修飾；（ＣＧ－９）：最初の５’ＲＮＡ塩基上でのＢＦＰアンチセンス２０１ｎｂ ２’－Ｏ－Ｍｅ修飾；（ＣＧ－１０）：最初の９つの５’ＲＮＡ塩基上でのＢＦＰアンチセンス２０１ｎｂ ２’－Ｏ－Ｍｅ修飾。 Ａ．ｔｈａｌｉａｎａおよびＬ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍプロトプラスト中でのＴＡＬＥＮヌクレアーゼ活性および遺伝子編集を示す図である。図１８ａ：送達の７２時間後にＴＡＬＥＮプラスミド（ＢＴ－１）で処理されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロトプラスト中でのディープシーケンシングにより決定されたサイズに基づくインデルの分布。インデルは総リードの０．５１％を占めていた。図１８ｂ：プラスミド（ＢＴ－１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ－７）の送達の４８時間後にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集。図１８ｃ：送達の７ｄ後にＥＰＳＰＳ遺伝子を標的化するＴＡＬＥＮ（ＬｕＥＴ－１）で処理されたＬ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍプロトプラスト中でのｂｐ長に基づくインデルの代表的分布。インデルの総頻度は０．５０％である。図１８ｄ：プロトプラストへのプラスミド（ＬｕＥＴ－１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ－１１）の送達後７ｄでのディープシーケンシングにより測定されたＬ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍのＥＰＳＰＳ遺伝子編集。総リードの割合は、総リードの割合としてＴ９７ＩとＰ１０１Ａ編集の両方を含有するリードの数を表す。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）である。（ＣＧ－７）：ＢＦＰセンス２０１ｎｂ ３ＰＳ修飾；（ＣＧ－１１）：ＥＰＳＰＳセンス１４４ｎｂ Ｃｙ３修飾。 トランスジェニックＡ．ｔｈａｌｉａｎａプロトプラスト中でのＢＦＰからＧＦＰへの編集に対する、二本鎖切断を誘導する抗生物質ゼオシンおよびフレオマイシンの効果を示す図である。プロトプラストを、ゼオシンまたはフレオマイシンで９０分間処理した後、ＧＲＯＮをＰＥＧ導入した（ＣＧ２）。編集の成功はＧＦＰ蛍光をもたらした。緑色蛍光を発するプロトプラストを、Ａｔｔｕｎｅ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して定量した。 ＢＦＰからＧＦＰへの変換を標的化する、ＢＦＰトランスジェニックプロトプラストへのＧＲＯＮ送達の５日後の変換されたＢＦＰトランスジェニックＡ．ｔｈａｌｉａｎａ細胞を示す図である。緑色蛍光は、ＢＦＰ－ＧＦＰ編集を示す。明視野画像；Ｂ、青色光中での同じ視野。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）である；（ＣＧ２）：ＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ ３ＰＳ修飾；（ＣＧ１２）：ＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ ３ＰＳ修飾非標的化。画像を、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて獲得した。スケールバー＝２０μｍ。 ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓおよびＴＡＬＥＮ設計を示す図である。図２１Ａ：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプラスミドの略図である。マンノピンシンターゼ（Ｍａｓ）プロモーターは、高等植物のためにコドン最適化されたＣａｓ９遺伝子の転写を駆動している。Ｃａｓ９遺伝子は、遺伝子のいずれかの末端に２つのＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）と、２Ｘ ＦＬＡＧエピトープタグとを含有する。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ Ｕ６プロモーターは、ｇＲＮＡ足場の転写を駆動しており、転写はポリ（Ｔ）シグナルを使用して終結される。図２１Ｂ：ＴＡＬＥＮプラスミドの略図である。Ｍａｓプロモーターは、２Ａリボソームスキッピング配列と一緒に連結された右および左のテールアームの転写を駆動している。Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼは、それぞれのテールアームの３’末端に連結される。左のテールの５’末端は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）とＶ５エピトープタグとを含有する。ｒｂｃＴは、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍのＲＢＣＳＥ９遺伝子ターミネーターである。 ＢＦＰおよびＥＰＳＰＳヌクレアーゼ標的領域を示す図である。ａ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプロトスペーサー、ＢＣ－１、ＢＣ－２およびＢＣ－３ならびにＴＡＬＥＮ ＢＴ－１、左および右のテールアームに関するＢＦＰ遺伝子標的領域。ＰＡＭ配列を赤色で示す。ＴＡＬＥＮ結合部位は太字および下線付きである。ＢＦＰからＧＦＰへの編集ＣＡＣ→ＴＡＣ（Ｈ６６Ｙ）の部位は、緑色の太字である。ｂ、ＴＡＬＥＮ、ＬｕＥＴ－１、左および右のテールアームに関するＥＰＳＰＳ遺伝子標的領域。ＥＰＳＰＳ変換ＡＣＡ＞ＡＴＡおよびＣＣＧ＞ＧＣＧ（Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａ）の部位は緑色である。 Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ（ノスズメノテッポウ）ＡＣＣａｓｅ遺伝子産物のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＥＰＳＰＳ遺伝子産物のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。 例示的な類似ＥＰＳＰＳ位置を示す図である。 例示的なＡＣＣａｓｅ配列を示す図である。
オリゴヌクレオチドによって仲介される標的遺伝子修飾は、欠失、短い挿入、および点
突然変異をもたらすためのＤＮＡの短いストレッチの特異的改変において使用するのに値
する技法である。これらの方法はＤＮＡ対形成／アニーリング、次にＤＮＡ修復／組換え
事象を含む。最初に核酸は、細胞タンパク質因子によって仲介されるプロセスにおいて、
二本鎖ＤＮＡ中のその相補鎖とアニーリングする。このアニーリングによって（点突然変
異の場合）中央に位置するミスマッチ塩基対を生成し、内在性タンパク質機構を刺激して
修復プロセス中に第２のステップ、染色体配列および／またはオルガネラ内の（例えば、
ミトコンドリアと葉緑体）の部位特異的修飾を開始させる可能性が最も高い構造不安定化
をもたらす。この新たに導入されたミスマッチはＤＮＡ修復機構を誘導し、標的部位の最
終修正をもたらす第２の修復事象を実施する。本明細書に開示される様々な態様および実
施形態における本発明の方法および組成物は、ＤＮＡ修復構成要素の利用性を高め、した
がって標的核酸に対する遺伝子修復仲介型修飾の効率と再現性を高める新規な手法を提供
することにより、前記方法を改良する。
部位特異的ゲノム修飾に有効な方法は、研究、臨床遺伝子療法、工業用微生物学および
農学にとって望ましい。一手法は、第３の鎖として二本鎖ＤＮＡに配列特異的に結合する
三本鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を利用して、定方向突然変異誘発を仲介する。
このようなＴＦＯは、ソラレンもしくはクロラムブシルなどの変異原性化学物質の送達（
Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９
０：７８７９－７８８３，１９９３；Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ６７：
７３２３－７３３１，１９９３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
１５：１７５９－１７６８，１９９５；Ｔａｋａｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６０２－５６０６，１９９１；Ｂｅ
ｌｏｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ２５：３４４０－３
４４４，１９９７）、または誤りがちの修復を誘発するのに十分なアフィニティーでの結
合（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：８０２－８０５，１９９６）のい
ずれかによって作用し得る。
ゲノム修飾に関する別の戦略は、外来ＤＮＡ断片と標的遺伝子の間の相同組換えの誘導
を含む。この手法は首尾よく使用され哺乳動物細胞中の選択遺伝子が標的化および妨害さ
れており、特異的遺伝子ノックアウトがあるトランスジェニックマウスの生成が可能にな
っている（Ｃａｐｅｅｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８－１２９
２，１９８９、Ｗａｇｎｅｒ，米国特許第４，８７３，１９１号）。この手法は、選択可
能マーカーの導入を含み所望の組換え体の単離を可能にするものである。選択がない場合
、典型的遺伝子導入実験におけるトランスフェクトＤＮＡの相同と非相同組み込みの比は
低く、通常は１：１０００以下の範囲内である（Ｓｅｄｉｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ
Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
１９９２）。相同組み込みのこの低い効率によって、実験用途または遺伝子療法に関する
遺伝子導入の利用が限定される。相同組換えの頻度は、ＵＶ照射および選択発癌性物質が
原因の標的部位への損傷（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ８：１
９６－２０２，１９８８）によって、ならびに部位特異的エンドヌクレアーゼ（Ｓｅｄｉ
ｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ
Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６０６４－６０６８，１９９４；Ｓｅｇａ
ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８０
６－８１０，１９９５）によって高まる可能性がある。さらに、三本鎖対象ソラレン光付
加物によって誘導されるＤＮＡ損傷は、染色体外ベクター内およびその間の組換えを刺激
する可能性がある（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃ
ｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８０６－８１０，１９９５；Ｆａｒｕｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ
ｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１６：６８２０－６８２８，１９９６、Ｇｌａｚｅｒ，米国特許
第５，９６２，４２６号）。
直鎖状ドナー断片は、それらの環状相当物より組換えの影響を受けやすい（Ｆｏｌｇｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２：１３７２－１３８７，１９８２）
。組換えは、特定の実施形態においては、ドナー部位と標的部位両方の間の連続した相同
性の長さによっても影響を受け、短い断片は組換えに関して無力な基質であると思われる
ことが多い（Ｒｕｂｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４：２２５
３－２２５８，１９８４）。それにもかかわらず、遺伝子補正用のＤＮＡまたはＤＮＡ／
ＲＮＡハイブリッドの短い断片の使用が、様々な戦略の焦点である（Ｋｕｎｚｅｌｍａｎ
ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３：８５９－８６７，１９９６）。
本明細書で使用する「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド配
列」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそれらの断片もしくは一部
分、および一本鎖もしくは二本鎖であってよくセンス鎖もしくはアンチセンス鎖を表すゲ
ノムもしくは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、少なくとも
約１０核酸塩基および最大約１０００核酸塩基の核酸塩基のポリマーを指す。
本明細書で使用する用語「ＤＮＡ修飾分子」および「ＤＮＡ修飾試薬」は、細胞のゲノ
ム中の核酸配列を認識しそれに特異的に結合することができ、ゲノム内の標的ヌクレオチ
ド配列を修飾することができ、認識およびＤＮＡ修飾分子と核酸配列の特異的結合がタン
パク質非依存的である分子を指す。ＤＮＡ修飾分子に関して本明細書で使用する用語「タ
ンパク質非依存的」は、ＤＮＡ修飾分子が核酸配列の認識、および／またはそれとの特異
的結合にタンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要としないことを
意味する。ＤＮＡ修飾分子は、遺伝子変換の助長を目的とする、三本鎖形成オリゴヌクレ
オチド、ペプチド核酸、ポリアミド、およびオリゴヌクレオチドだけには限られないが、
これらによって例示される。本開示のＤＮＡ修飾分子は、ある特定の実施形態では、相同
組換えに使用される従来技術の核酸配列がタンパク質依存的である点で、相同組換えに使
用される従来技術の核酸配列（Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２２９４－２２９５，１９８７）と区別される。分子に関して本明
細書で使用する用語「タンパク質依存的」は、分子が核酸配列の認識、および／またはそ
れとの特異的結合にタンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要とす
ることを意味する。ＤＮＡ修飾分子が核酸配列の認識、および／またはそれとの特異的結
合にタンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要するかどうか決定す
るための方法は、当技術分野の技術の範囲内にある（例えば、Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ
．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：４７３４－４７４２，１９９９を参照）。例え
ばＤＮＡ修飾分子は、任意のタンパク質および／または酵素の不在下で核酸配列と共にｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすることができる。ＤＮＡ修飾分子と核酸配列の間の特
異的結合の検出によって、ＤＮＡ修飾分子がタンパク質非依存的であることを実証する。
他方で、ＤＮＡ修飾分子と核酸配列の間の特異的結合の不在は、ＤＮＡ修飾分子がタンパ
ク質依存的であることおよび／または他の因子を必要とすることを実証する。
「三本鎖形成オリゴヌクレオチド」（ＴＦＯ）は、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡヘリック
スの主要溝に結合して三重ヘリックスを形成することができる、ＤＮＡまたはＲＮＡの配
列として定義する。ＴＦＯは任意の特定長に限定されないが、ＴＦＯの好ましい長さは２
５０ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、または１００ヌクレオチド以下、また
は５～５０ヌクレオチド、または１０～２５ヌクレオチド、または１５～２５ヌクレオチ
ドである。三重ヘリックスの形成のためＴＦＯと二本鎖ＤＮＡの間で一定の度合いの配列
特異性が必要であるが、三重ヘリックスが形成可能である限り、特定度合いの特異性が必
要とされるわけではない。同様に、三重ヘリックスが形成可能である限り、ＴＦＯと二本
鎖ヘリックスの間で特異的度合いのアビディティーまたはアフィニティーが必要とされる
わけではない。ＴＦＯが特異的に結合するヌクレオチド配列の長さを限定する目的ではな
いが、一実施形態において、ＴＦＯが特異的に結合するヌクレオチド配列は１～１００、
幾つかの実施形態では５～５０、さらに他の実施形態では１０～２５、および他の実施形
態では１５～２５ヌクレオチドである。さらに「三重ヘリックス」は、二重らせん核酸内
の標的配列と結合したオリゴヌクレオチドを含む二重らせん核酸として定義する。「二重
らせん」核酸は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、およびＤＮＡとＲＮＡの混合二本鎖を含
めた任意の二本鎖核酸であってよい。二本鎖核酸は任意の特定長に限定されない。しかし
ながら好ましい実施形態では、二本鎖核酸は５００ｂｐを超える、幾つかの実施形態では
１ｋｂを超える、および幾つかの実施形態では約５ｋｂを超える長さを有する。多くの適
用例において、二重らせん核酸は細胞、ゲノム核酸である。三本鎖形成オリゴヌクレオチ
ドは、パラレルまたはアンチパラレル形式で標的配列に結合することができる。
「ペプチド核酸」、「ポリアミド」または「ＰＮＡ」は、リン酸骨格がＮ－アミノエチ
ルグリシン系ポリアミド構造に置換された核酸である。ワトソン－クリックの塩基対形成
法則に従うと、ＰＮＡはそれら本来の相当物より相補核酸に対して高いアフィニティーを
有する。ＰＮＡは以下の化学量論比のＤＮＡとの非常に安定した三重ヘリックス構造を形
成し得る：（ＰＮＡ）２．ＤＮＡ。ペプチド核酸およびポリアミドは任意の特定長に限定
されないが、ペプチド核酸およびポリアミドの好ましい長さは２００ヌクレオチド以下、
幾つかの実施形態では１００ヌクレオチド以下、および幾つかの実施形態では５～５０ヌ
クレオチド長である。ペプチド核酸およびポリアミドが特異的に結合するヌクレオチド配
列の長さを限定する目的ではないが、一実施形態において、ペプチド核酸およびポリアミ
ドが特異的に結合するヌクレオチド配列は１～１００、幾つかの実施形態では５～５０、
さらに他の実施形態では５～２５、および他の実施形態では５～２０ヌクレオチドである
。
用語「細胞」は単細胞を指す。用語「細胞（複数）」は細胞の集団を指す。集団は１つ
の細胞型を含む純粋な集団であってよい。同様に、集団は２つ以上の細胞型を含み得る。
本開示では、一細胞集団が含み得る細胞型の数に制限はない。本明細書で使用する細胞は
、植物カルス細胞、細胞壁を含む、および含まない細胞、原核細胞ならびに真核細胞だけ
に限られないが、これらを含む。
細胞のサンプルを言及するときの用語「同調させる」または「同調した」、または「同
調細胞」もしくは「同調細胞集団」は、細胞周期の同じ時期に細胞集団が存在するように
処置した複数の細胞を指す。サンプル内の全ての細胞が同調状態である必要はない。わず
かな割合の細胞がサンプル内の大部分の細胞と同調していない可能性がある。同調状態で
ある細胞の好ましい範囲は１０～１００％である。より好ましい範囲は３０～１００％で
ある。さらに、細胞が一細胞型の純粋な集団である必要はない。２つ以上の細胞型がサン
プル内に含有される可能性がある。この点において、サンプル内の別の細胞型と比較して
、一細胞型のみが同調状態である、または細胞周期の異なる時期に存在する可能性がある
。
単細胞を言及するときの用語「同調細胞」は、操作前の細胞の細胞周期の時期と異なる
細胞周期の時期に細胞が存在するように、細胞を操作したことを意味する。あるいは「同
調細胞」は、対照細胞（例えば、操作がない状態の細胞）と比較して、操作前の細胞が存
在した細胞周期の時期の時間を改変（すなわち、延長または縮小）するよう操作した細胞
を指す。
用語「細胞周期」は、分裂（すなわち、増殖）時に細胞が経る生理的および形態的変化
の進行を指す。細胞周期は一般に、「分裂間期」、「前期」、「中期」、「後期」、およ
び「終期」と呼ばれる時期で構成されると認識されている。さらに、細胞周期の一部分は
「Ｍ（有糸分裂期）」、「Ｓ（合成期）」、「Ｇ０」、「Ｇ１（ギャップ１）」および「
Ｇ２（ギャップ２）」と呼ぶことができる。さらに細胞周期は、前述の名称の時期の間に
存在する進行期間を含む。
用語「細胞周期抑制」は、細胞または細胞集団における細胞周期進行の休止を指す。細
胞周期抑制は通常、細胞生理の態様に干渉する作用物質（化学物質、タンパク質またはそ
の他）への細胞の露出によって誘導され細胞周期の続行を妨げる。
「増殖」または「細胞増殖」は、２つの娘細胞に繰り返し分裂し、それによって集団に
おける全体的な細胞の増大をもたらす親細胞の能力を指す。細胞集団は生物中、または培
養装置中に存在してよい。
用語「ＤＮＡ修飾可能」または「ＤＮＡ修飾手段」は、標的ＤＮＡセグメントのヌクレ
オチド配列に対する変化を誘導する能力がある、またはその誘導を手助けすることができ
る手順、および内在もしくは外来作用物質もしくは試薬を指す。標的ＤＮＡセグメント上
の１つまたは複数の塩基の欠失、付加または置換によって、このような変化を施すことが
できる。ＤＮＡ配列の変化が、標的配列によってコードされる任意の遺伝子に対する機能
的変化をもたらすことは必要とされない。さらに、任意の特定部分または割合の細胞にＤ
ＮＡに対する変化を施すことは必要とされない。
用語「対象のヌクレオチド配列」は、当業者によるその操作が何らかの理由で望ましい
と思われる可能性のある、任意のヌクレオチド配列を指す。このようなヌクレオチド配列
には、構造遺伝子（例えば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、薬剤耐
性遺伝子、増殖因子など）のコード配列、およびｍＲＮＡまたはタンパク質産物をコード
していない非コード制御配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、ポリアデ
ニル化配列、終止配列、ｍｉＲＮＡなどの制御ＲＮＡ）があるが、これらだけには限られ
ない。
「アミノ酸配列」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド配列」および「ペプチド」は本
明細書中で交互に使用してアミノ酸の配列を指す。
本明細書で使用する「標的配列」は、８ヌクレオチド長を超えるが２０１ヌクレオチド
長未満の配列を含む二重らせん核酸を指す。幾つかの実施形態では、標的配列は８～３０
塩基である。一般に標的配列は、二重らせん核酸上の一鎖上のヌクレオチド配列によって
定義される。
本明細書で使用する「プリンリッチ配列」または「ポリプリン配列」は、二重らせん核
酸配列の一鎖上のヌクレオチド配列を言及するとき、標的配列の５０％を超えるヌクレオ
チドがプリン塩基を含有するヌクレオチドの隣接配列として定義する。しかしながら、プ
リンリッチ標的配列は、６０％を超えるプリンヌクレオチド、幾つかの実施形態では７５
％を超えるプリンヌクレオチド、他の実施形態では９０％を超えるプリンヌクレオチド、
およびさらに他の実施形態では１００％のプリンヌクレオチドを含有することが好ましい
。
本明細書で使用する「ピリミジンリッチ配列」または「ポリピリミジン配列」は、二重
らせん核酸配列の一鎖上のヌクレオチド配列を言及するとき、標的配列の５０％を超える
ヌクレオチドがピリミジン塩基を含有するヌクレオチドの隣接配列として定義する。しか
しながら、ピリミジンリッチ標的配列は、６０％を超えるピリミジンヌクレオチド、およ
び幾つかの実施形態では７５％を超えるピリミジンヌクレオチドを含有することが好まし
い。幾つかの実施形態では、配列は９０％を超えるピリミジンヌクレオチドを含有し、他
の実施形態では、１００％ピリミジンヌクレオチドである。
第１のヌクレオチド配列の「変異体」は、（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ
の使用またはＤＮＡ配列決定の使用によって検出可能である、１つまたは複数の欠失、挿
入、または置換を有することにより）第１のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列
として定義する。この定義内に含まれるのは、第１のヌクレオチド配列のゲノム配列に対
する改変または修飾の検出である。例えば、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して
、（１）ゲノム中に含まれるとき第１のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることがで
きる制限酵素断片のパターンの改変（すなわちＲＦＬＰ分析）、（２）第１のヌクレオチ
ド配列を含有するゲノムＤＮＡのサンプルに第１のヌクレオチド配列の選択部分がハイブ
リダイズできないこと（例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用）
、（３）第１のヌクレオチド配列に関する正常染色体遺伝子座以外の遺伝子座とのハイブ
リダイゼーションなどの、不適切または予想外なハイブリダイゼーションを検出すること
ができる（例えば、中期染色体分布に対する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
（ＦＩＳＨ）などを使用）。変異体の一例は突然変異野生型配列である。
本明細書で使用する用語「核酸」および「非修飾核酸」は、周知の４デオキシリボ核酸
塩基（すなわち、グアニン、アデニン、シトシン、およびチミン）のいずれか１つを指す
。用語「修飾核酸」は、非修飾核酸の構造に対してその構造が改変された核酸を指す。こ
のような修飾の例示は、塩基の置換、共有結合修飾、アミノおよび窒素環のアルキル化、
ならびに二重結合の飽和などであると思われる。
本明細書で使用する用語「突然変異」および「修飾」およびこれらと文法上同等な用語
は、核酸配列に関して使用するとき、交互に使用して欠失、挿入、置換、鎖切断、および
／または付加体の導入を指す。「欠失」は、１つまたは複数のヌクレオチドが無い核酸配
列の変化として定義する。「挿入」または「付加」は、１つまたは複数のヌクレオチドの
付加が起こった核酸配列の変化である。「置換」は、交換対象の１つまたは複数のヌクレ
オチドとは異なる分子である分子と、１つまたは複数のヌクレオチドの交換から生じる。
例えば、シトシン、アデニン、グアニン、またはウリジンとチミンの交換によって例示さ
れるように、一核酸は異なる核酸と交換することができる。ピリミジンからピリミジン（
例えば、ＣからＴまたはＴからＣのヌクレオチド置換）またはプリンからプリン（例えば
、ＧからＡまたはＡからＧのヌクレオチド置換）はトランジションと呼ばれ、一方ピリミ
ジンからプリンまたはプリンからピリミジン（例えば、ＧからＴまたはＧからＣまたはＡ
からＴまたはＡからＣ）はトランスバージョンと呼ばれる。あるいは、チミンとチミング
リコールの交換によって例示されるように、一核酸は修飾核酸と交換することができる。
突然変異はミスマッチをもたらす可能性がある。用語「ミスマッチ」は、それぞれの核酸
が異なるポリ核酸配列上に存在する２核酸間の非共有結合相互作用を指し、これは塩基対
形成の法則に従わない。例えば、部分的相補配列５’－ＡＧＴ－３’および５’－ＡＡＴ
－３’に関しては、Ｇ－Ａミスマッチ（トランジション）が存在する。用語「付加体の導
入」または「付加体形成」は、結合が（幾つかの実施形態では１０％～１００％、他の実
施形態では５０％～１００％、および幾つかの実施形態では７５％～１００％の）ＤＮＡ
複製および／または転写レベルの低下をもたらすような、ＤＮＡ配列中の１つまたは複数
のヌクレオチドと分子の共有結合または非共有結合を指す。
用語「ＤＮＡ切断剤」とは、鎖切断を行う部分を指す。非限定例は、メガヌクレアーゼ
、ＴＡＬＥ／ＴＡＬＥＮ、抗生物質、ジンクフィンガーおよびＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩ
ＳＰＲ／ｃａｓ系を含む。
用語「鎖切断」は、二本鎖核酸配列を言及するとき、一本鎖切断および／または二本鎖
切断を含む。一本鎖切断（ニック）は、二本鎖核酸配列の二本鎖の一本における妨害を指
す。これは、平滑末端または付着末端をもたらし得る、二本鎖核酸配列の両鎖における妨
害を指す二本鎖切断とは対照的である。鎖切断は、（例えば、電離放射線もしくは特定化
学物質を用いた処置により）直接的にまたは（例えば、核酸塩基における酵素での切断に
より）間接的に、二本鎖核酸配列に導入することができる。
用語「突然変異細胞」および「修飾細胞」は、細胞のゲノム配列中に少なくとも１つの
修飾を含有する細胞を指す。
用語「一部分」は、ヌクレオチド配列の言及において使用するとき、そのヌクレオチド
配列の断片を指す。断片は、５ヌクレオチド残基～ヌクレオチド配列全体マイナス１核酸
残基の大きさの範囲であり得る。
ＤＮＡ分子は「５’末端」および「３’末端」を有すると言える。１つのモノヌクレオ
チドペントース環の５’リン酸がホスホジエステル結合を介して一方向でその近隣の３’
酸素に結合するような形式で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを形成す
るからである。したがって、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素
と結合しない場合、オリゴヌクレオチドの末端は「５’末端」と呼ばれる。その３’酸素
が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と結合しない場合、オリゴヌクレオチ
ドの末端は「３’末端」と呼ばれる。本明細書で使用する核酸配列は、多量オリゴヌクレ
オチド内部の場合でさえ、５’末端および３’末端を有すると言うこともできる。直鎖状
または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、不連続なエレメントは「上流」または「下流
」の５’または３’エレメントであると言える。この述語は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５
’から３’方向に進行することを表す。関連遺伝子の転写を誘導するプロモーターおよび
エンハンサーエレメントは、一般にコード領域の５’または上流に位置する。しかしなが
ら、プロモーターエレメントおよびコード領域の３’に位置するときでさえ、エンハンサ
ーエレメントはその効果を発揮し得る。転写終結およびポリアデニル化シグナルはコード
領域の３’または下流に位置する。
本明細書で使用する用語「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学の技法により１つに接合
したＤＮＡのセグメントで構成されるＤＮＡ分子を指す。
本明細書で使用する用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、組換
えＤＮＡ分子を使用して発現されるタンパク質分子を指す。
本明細書で使用する用語「ベクター」と「運搬体」は、一細胞から別の細胞にＤＮＡセ
グメント（複数可）を移動させる核酸分子を言及する際に交互に使用する。
本明細書で使用する用語「作動可能な組合せで」、「作動可能な順序で」および「作動
可能に連結した」は、所与の遺伝子の転写の誘導および／または所望のタンパク質分子の
合成が可能な核酸分子を生成するような形式での核酸配列の結合を指す。これらの用語は
、機能的タンパク質を生成するような形式でのアミノ酸配列の結合も指す。
本明細書で使用する用語「トランスフェクション」は、細胞中への外来ＤＮＡの導入を
指す。リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン仲介トランスフェクショ
ン、ポリブレン仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェ
クション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感
染、バイオリスティック（すなわち、パーティクルボンバードメント）などを含めた当業
者に知られている様々な手段によって、トランスフェクションを実施することができる。
本明細書で使用する用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成の法則によって関
連付けられる（ヌクレオチドの配列を指す交換可能な用語である）「ポリヌクレオチド」
および「オリゴヌクレオチド」を言及する際に使用する。例えば、配列「５’－ＣＡＧＴ
－３’」は配列「５’－ＡＣＴＧ－３’」と相補的である。相補性は「部分的」または「
全体的」であってよい。「部分的」相補性は、塩基対形成の法則に従い１つまたは複数の
核酸塩基がマッチしない場合である。核酸間の「全体的」または「完全」相補性は、塩基
対形成の法則の下、それぞれ個々の核酸塩基が別の塩基とマッチする場合である。核酸鎖
間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に対して有意な影
響がある可能性がある。これは増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出法において
特に重要である可能性がある。便宜上、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレ
オチド」はヌクレオシドを含む分子を含む。
ヌクレオチド配列を言及する際に本明細書で使用する用語「相同性」および「相同的」
は、他のヌクレオチド配列との相補性の程度を指す。部分的相同性または完全相同性（す
なわち同一性）が存在し得る。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列を言
及する際に使用するとき、用語「実質的に相同的」は、前述の低ストリンジェンシーの条
件下で二本鎖核酸配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズすることができる、任意の
核酸配列（例えばプローブ）を指す。核酸配列と部分的に相補的、すなわち「実質的に相
同的」であるヌクレオチド配列は、標的核酸配列と完全相補配列がハイブリダイズするの
を少なくとも部分的に阻害するヌクレオチド配列である。標的配列と完全相補配列のハイ
ブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシーの条件下においてハイブリダイゼー
ションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を
使用して調べることができる。実質的に相同的な配列またはプローブは、低ストリンジェ
ンシーの条件下における完全相同配列と標的配列の結合（すなわち、ハイブリダイゼーシ
ョン）に関して競合しそれを阻害する。低ストリンジェンシーの条件は非特異的結合が許
容されるような条件であるとは言えず、低ストリンジェンシー条件は、２配列の互いの結
合が特異的（すなわち選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合の不在は
、部分的な割合の相補性さえ欠く（例えば、約３０％未満の同一性の）第２の標的配列の
使用によって試験することができ、非特異的結合の不在下では、プローブは第２の非相補
的標的とハイブリダイズしない。
低ストリンジェンシー条件は、約１００～約１０００ヌクレオチド長のプローブを利用
するとき、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ
2Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．１％のＳＤ
Ｓ、５×デンハルト試薬（５０×デンハルト試薬は５００ｍｌ当たり：５ｇのＦｉｃｏｌ
ｌ（Ｔｙｐｅ４００、Ｐｈｒｍａｃｉａ）、５ｇのＢＳＡ（ＦｒａｃｔｉｏｎＶ；Ｓｉｇ
ｍａ））および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での６８℃におけ
る結合またはハイブリダイゼーション、次に２．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶
液中での室温における洗浄と同等な条件を含む。
さらに、高ストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションを促進する条件（
例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ステップの温度の増大、ハイブリダ
イゼーション溶液におけるホルムアミドの使用など）は当技術分野でよく知られている。
高ストリンジェンシー条件は、核酸ハイブリダイゼーションを言及する際に使用するとき
、約１００～約１０００ヌクレオチド長のプローブを利用するとき、５×ＳＳＰＥ、１％
のＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶
液中での６８℃における結合またはハイブリダイゼーション、次に０．１％×ＳＳＰＥお
よび０．１％ＳＤＳを含む溶液中での６８℃における洗浄と同等な条件を含む。
低ストリンジェンシー条件、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）
、および標的の性質（溶液中または固定状態で存在するＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成など）
、ならびに塩および他の構成要素の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポ
リエチレングリコールの有無）、ならびに前述の条件とは異なるが同等である低ストリン
ジェンシーハイブリダイゼーション条件を得るため変更することができるハイブリダイゼ
ーション溶液の構成要素などの要因を含む、多くの同等な条件を利用することができるこ
とは当技術分野でよく知られている。
用語「同等」は、対象のハイブリダイゼーション条件と関連があるハイブリダイゼーシ
ョン条件を言及するとき、そのハイブリダイゼーション条件と対象のハイブリダイゼーシ
ョン条件が、同じ範囲の割合（％）の相同性を有する核酸配列のハイブリダイゼーション
をもたらすことを意味する。例えば、対象のハイブリダイゼーション条件が、第１の核酸
配列と５０％～７０％の相同性を有する他の核酸配列と第１の核酸配列のハイブリダイゼ
ーションをもたらす場合、したがって別のハイブリダイゼーション条件は、この他のハイ
ブリダイゼーション条件も、第１の核酸配列と５０％～７０％の相同性を有する他の核酸
配列と第１の核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらす場合、対象のハイブリダイゼ
ーション条件と同等であると言える。
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖を塩基対形成により
相補鎖と接合させハイブリダイゼーション複合体を形成する任意のプロセスを使用した、
相補核酸の対形成を言及する際に使用する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイ
ゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関連ス
トリンジェンシー条件、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの
要因によって影響を受ける。
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補Ｇ塩基とＣ塩基の
間および相補Ａ塩基とＴ塩基の間での水素結合の形成によって、２核酸配列間で形成され
る複合体を指し、これらの水素結合は塩基スタッキング相互作用によってさらに安定化さ
れ得る。２つの相補核酸にはアンチパラレル形状で水素結合が並ぶ。ハイブリダイゼーシ
ョン複合体は溶液中（例えば、ＣｏｔもしくはＲｏｔ分析）、または溶液中に存在する一
核酸配列と固形支持体（例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ドットブロッテ
ィングにおいて利用されるナイロン膜もしくはニトロセルロースフィルター、またはＦＩ
ＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）を含めたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダ
イゼーションにおいて利用されるスライドグラス）に固定された別の核酸配列の間で形成
され得る。
本明細書で使用する用語「Ｔｍ」は「融解温度」を言及する際に使用する。融解温度は
、二本鎖核酸分子の集団が半分になり一本鎖に解離する温度である。核酸のＴｍを計算す
るための等式は当技術分野でよく知られている。標準参照によって示されるように、核酸
が１ＭＮａＣｌで水溶液中に存在するとき、Ｔｍ値の単純推定値は等式：Ｔｍ＝８１．５
＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａ
ｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ，ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１９８５参照）
。他の参照は、Ｔｍ計算用に構造および配列特性を考慮に入れたさらに精巧な計算法を含
む。
本明細書で使用する用語「ストリンジェンシー」は、その下で核酸ハイブリダイゼーシ
ョンが実施される、温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在の条件を
言及する際に使用する。ストリンジェンシーは、典型的にはほぼＴｍ－５℃（プローブの
融点より５℃低い）からＴｍより約２０℃～２５℃低い範囲に存在する。当業者によって
理解されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを使用して同一ポリヌク
レオチド配列を同定もしくは検出することができ、または類似もしくは関連ポリヌクレオ
チド配列を同定もしくは検出することができる。
用語「特異的結合」、「結合特異性」、およびこれらと文法上同等な用語は、第１のヌ
クレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の結合を言及するとき、第２のヌクレオチド配
列と第３のヌクレオチド配列の間の相互作用と比較した、第１のヌクレオチド配列と第２
のヌクレオチド配列の間の優先的相互作用を指す。特異的結合は結合の絶対的特異性を必
要としない相対語である。言い換えると、用語「特異的結合」は、第２のヌクレオチド配
列と第３のヌクレオチド配列の間の相互作用の不在下で、第２のヌクレオチド配列が第１
のヌクレオチド配列と相互作用することを必要としない。そうではなくて、それは第１の
ヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の間の相互作用のレベルが、第２のヌクレオ
チド配列と第３のヌクレオチド配列の間の相互作用のレベルを超えることで十分である。
第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の「特異的結合」は、第１のヌクレオ
チド配列と第２のヌクレオチド配列の間の相互作用が、第１のヌクレオチド配列上または
内部の特定構造の存在に依存することも意味する。言い換えると、第２のヌクレオチド配
列は、一般に核酸またはヌクレオチド配列ではなく、第１のヌクレオチド配列上または内
部の特定構造を認識しそれに結合している。例えば、第２のヌクレオチド配列が第１のヌ
クレオチド配列上または内部に存在する構造「Ａ」に特異的である場合、構造Ａを含有す
る第３の核酸配列の存在によって第１のヌクレオチド配列と結合する第２のヌクレオチド
配列の量が減少する。
本明細書で使用する用語「増幅可能な核酸」は、任意の増幅法によって増幅することが
できる核酸を言及する際に使用する。「増幅可能な核酸」は「サンプル鋳型」を通常含む
と企図される。
用語「異種核酸配列」または「異種ＤＮＡ」を交互に使用して、それが本来連結してい
ない、またはそれが本来と異なる位置で連結した核酸配列と連結したヌクレオチド配列を
指す。異種ＤＮＡはそれが導入される細胞には内在せず、別の細胞から入手される。一般
に、必ずとは言えないが、このような異種ＤＮＡは、それが発現される細胞により通常生
成されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種ＤＮＡの例には、レポーター遺伝
子、転写および翻訳制御配列、選択可能マーカータンパク質（例えば、薬剤耐性をもたら
すタンパク質）などがある。
「増幅」は核酸配列の追加コピーの生成として定義し、当技術分野でよく知られている
ポリメラーゼ連鎖反応の技術を使用して一般に実施される（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ Ｃ
Ｗ ａｎｄ ＧＳ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ、ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐ
ｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）。本明細書で使用する用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「
ＰＣＲ」）は、クローニングまたは精製無しでゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列セグメ
ントの濃度を高めるための方法を記載する、参照により本明細書に組み込まれているＫ．
Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号、および同４，６８３，２０２号の
方法を指す。所望標的配列の増幅セグメントの長さは２オリゴヌクレオチドプライマーの
互いに対する相対的位置によって決定され、したがってこの長さは制御可能なパラメータ
ーである。プロセスの反復態様のため、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ
」）と呼ぶ。標的配列の所望増幅セグメントは（濃度の点で）混合物中の主要配列となる
ので、それらは「ＰＣＲ増幅された」と言える。
ＰＣＲによって、ゲノムＤＮＡにおける特異的標的配列の１コピーを、幾つかの異なる
方法（例えば、標識プローブとのハイブリダイゼーション、ビオチニル化プライマーの取
り込み、次にアビジン－酵素コンジュゲートの検出、増幅セグメントへのｄＣＴＰまたは
ｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の取り込み）により検出可能な
レベルまで増幅することができる。ゲノムＤＮＡ以外に、適切なセットのプライマー分子
で任意のオリゴヌクレオチド配列を増幅することができる。特に、ＰＣＲプロセス独力に
よって作製した増幅セグメントはそれら自体、後のＰＣＲ増幅に有効な鋳型である。
特に市販品用途の、１つのこのような好ましい方法は広く使用されているＴａｑＭａｎ
（登録商標）リアルタイムＰＣＲ技術に基づき、対立遺伝子特異的ＰＣＲとブロッキング
試薬（ＡＳＢ－ＰＣＲ）を組み合せて野生型対立遺伝子の増幅を抑制する。ホルマリン固
定パラフィン包埋腫瘍試料を含めた任意の組織型から抽出したＤＮＡもしくはＲＮＡのい
ずれか、生殖細胞系列または体細胞突然変異の検出にＡＳＢ－ＰＣＲを使用することがで
きる。１０００倍以上過剰に野生型対立遺伝子のバックグラウンドに対する一点置換、挿
入、または欠失の感受性および選択的検出を可能にする、一組の試薬設計法則が開発され
ている。（Ｍｏｒｌａｎ Ｊ，Ｂａｋｅｒ Ｊ，Ｓｉｎｉｃｒｏｐｉ Ｄ Ｍｕｔａｔｉ
ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ：Ａ Ｓｉｍｐｌｅ、Ｒｏ
ｂｕｓｔ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ．ＰＬｏＳ ＯＮ
Ｅ４（２）：ｅ４５８４，２００９）
用語「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」および「ＲＴ－ＰＣＲ」は、ＲＮＡ配列を逆転写
してｃＤＮＡ配列の混合物を生成させ、次にクローニングまたは精製無しで混合物中の転
写ｃＤＮＡ配列の所望セグメントの濃度を高めるための方法を指す。典型的には、２プラ
イマーを使用した転写ＤＮＡの所望セグメントのＰＣＲ増幅の前に、１つのプライマー（
例えばオリゴ－ｄＴプライマー）を使用してＲＮＡを逆転写する。
本明細書で使用する用語「プライマー」は、精製制限酵素消化産物に原型で存在しよう
と合成によって生じようと、核酸鎖と相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条
件下（すなわち、適切な温度およびｐＨでヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの
誘導剤の存在下）に置いたとき、合成の開始地点として作用することができるオリゴヌク
レオチドを指す。幾つかの実施形態では、プライマーは最大増幅効率のため一本鎖である
が、代替的に二本鎖であってよい。二本鎖の場合、延長産物の調製に使用する前に、プラ
イマーを最初に処理してその鎖を分離させる。幾つかの実施形態では、プライマーはオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で延長産物の合成を
引き起こすほど十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマ
ーの源および使用法を含めた多くの要因に依存する。
本明細書で使用する用語「プローブ」は、精製制限酵素消化産物に原型で存在しようと
、合成、組換えまたはＰＣＲ増幅によって生じようと、対象の別のオリゴヌクレオチドに
ハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列
）を指す。プローブは一本鎖または二本鎖であってよい。プローブは、特定遺伝子配列の
検出、同定および単離において有用である。本開示において使用する任意のプローブは任
意の「レポーター分子」で標識され、したがってそれは、酵素（例えばＥＬＩＳＡ、およ
び酵素系組織化学アッセイ）、蛍光、放射活性、および発光システムだけには限られない
が、これらを含めた任意の検出システムで検出可能であることが企図される。本開示が何
らかの特定検出システムまたは標識に限定されることを意図するものではない。
本明細書で使用する用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、その各々
が特定ヌクレオチド配列もしくはその近辺で二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡを切断するかま
たはそれに切れ目を入れる細菌酵素、例えばＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌ
クレアーゼドメイン（例えばＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６：１ １５６－６０によって教示されたように、ＦｏｋＩ
を使用することができる）を指す。
本明細書で使用する用語「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレ
オチド」は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、すなわち遺伝子産物をコードする核酸
配列を意味する。コード領域はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ型のいずれかで存在
し得る。ＤＮＡ型で存在するとき、オリゴヌクレオチドは一本鎖（すなわちセンス鎖）ま
たは二本鎖であり得る。さらに「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌ
クレオチド」は、転写の正確な開始および／または一次ＲＮＡ転写産物の正確なプロセシ
ングを可能にすることが必要な場合、エンハンサー、プロモーター、スプライスジャンク
ション、ポリアデニル化シグナルなどの適切な制御エレメントを含み得る。さらになお、
本開示のコード領域は内在エンハンサー、スプライスジャンクション、介在配列、ポリア
デニル化シグナルなどを含有し得る。
真核生物における転写制御シグナルは「エンハンサー」エレメントを含む。エンハンサ
ーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いＤＮＡ配列アレイから
なる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２３７，１９８
７）。エンハンサーエレメントは、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞ならびにウイル
スにおける遺伝子を含めた、様々な真核生物供給源から単離されている。個々のエンハン
サーの選択は、対象のタンパク質を発現させるのにどの細胞型を使用するかに依存する。
発現ベクターにおける「スプライシングシグナル」の存在は、組換え転写産物の高レベ
ルの発現をもたらすことが多い。スプライシングシグナルは一次ＲＮＡ転写産物からのイ
ントロンの除去を仲介し、スプライスドナーおよびアクセプタードナー部位からなる（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１６．７－１６．８，
１９８９）。一般に使用されるスプライスドナーおよびアクセプタードナー部位は、ＳＶ
４０の１６ＳＲＮＡ由来のスプライスジャンクションである。
真核生物細胞における組換えＤＮＡ配列の有効な発現は、有効な終結と生成転写産物の
ポリアデニル化を誘導するシグナルの発現を必要とする。転写終結シグナルは一般にポリ
アデニル化シグナルの下流で見られ、数百ヌクレオチド長である。本明細書で使用する用
語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、終結と発生期ＲＮＡ転写産物のポリアデニル
化の両方を誘導するＤＮＡ配列を示す。ポリＡ尾部を欠く転写産物は不安定であり急速に
分解されるので、組換え転写産物の有効なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターにお
いて利用されるポリＡシグナルは「異種」または「内在」であり得る。内在ポリＡシグナ
ルは、ゲノム中の所与遺伝子のコード領域の３’末端で本来見られるシグナルである。異
種ポリＡシグナルは、一遺伝子から単離され別の遺伝子の３’末端に配置されたシグナル
である。
本明細書で使用する用語「プロモーター」、「プロモーターエレメント」または「プロ
モーター配列」は、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に置かれる（すなわち上位に位置
する）とき、そのオリゴヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御することができるＤ
ＮＡ配列を指す。典型的にはプロモーターは、ｍＲＮＡへのその転写を制御するオリゴヌ
クレオチド配列の５’（すなわち上流）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼによる特異的結合
および転写開始に関する部位をもたらす。
用語「プロモーター活性」は、核酸配列を言及するとき、ｍＲＮＡへのオリゴヌクレオ
チド配列の転写を開始させる核酸配列の能力を指す。
用語「組織特異的」は、プロモーターに適用するとき、異型組織中での同じオリゴヌク
レオチドの発現の相対的不在下で、特異的型の組織に対するオリゴヌクレオチド配列の選
択的発現を誘導することができるプロモーターを指す。プロモーターの組織特異性は、例
えば、レポーター遺伝子とプロモーター配列を作動可能に連結させレポーター構築物を生
成させ、生成するトランスジェニック動物の各組織にレポーター構築物が組み込まれるよ
うに植物または動物のゲノムにレポーター構築物を導入し、トランスジェニック植物また
は動物の異なる組織におけるレポーター遺伝子の発現を検出する（例えば、ｍＲＮＡ、タ
ンパク質、またはレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を検出する）こ
とによって評価することができる。選択性は絶対的である必要はない。他の組織中でのレ
ポーター遺伝子の発現レベルに対する、１つまたは複数の組織中でのより高レベルのレポ
ーター遺伝子の発現の検出によって、より高レベルの発現が検出される組織にプロモータ
ーが特異的であることを示す。
用語「細胞型特異的」は、プロモーターに適用するとき、同じ組織内の異型細胞での同
じオリゴヌクレオチド配列の発現の相対的不在下で、特異的型の細胞におけるオリゴヌク
レオチド配列の選択的発現を誘導することができるプロモーターを指す。用語「細胞型特
異的」は、プロモーターに適用するとき、一組織内の領域におけるオリゴヌクレオチドの
選択的発現を促進することができるプロモーターも意味する。再度、選択性は絶対的であ
る必要はない。プロモーターの細胞型特異性は、当技術分野でよく知られている方法、例
えば本明細書に記載する免疫組織化学的染色法を使用して評価することができる。簡単に
言うと、組織切片をパラフィンに包埋し、パラフィン切片を、その発現がプロモーターに
よって制御されるオリゴヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド産物に特異的
な一次抗体と反応させる。パラフィン切片の代替として、サンプルを凍結切片化すること
ができる。例えば、切片化の前および最中に切片を凍結させ、残留パラフィンにより起こ
り得る干渉を回避することができる。一次抗体に特異的な標識（例えば、ペルオキシダー
ゼ結合）二次抗体は（例えば、アビジン／ビオチンを用いた）切片化組織との結合、およ
び顕微鏡検査による特異的結合の検出を可能にする。
用語「選択的発現」、「選択的に発現」、およびそれらの文法上同等な用語は、２箇所
以上の対象領域における発現の相対的レベルの比較を指す。例えば「選択的発現」は、組
織と関連付けて使用するとき、別組織中での同じ遺伝子の発現レベル、およびそれを発現
する細胞数とそれぞれ比較した、特定組織における対象遺伝子の実質的に高い発現レベル
、またはその組織内で遺伝子を発現する細胞の実質的に多い数を指す（すなわち、選択性
は絶対的である必要はない）。選択的発現は、特定組織における対象遺伝子の発現および
別組織中での同じ遺伝子の発現の完全不在を必要としないが、それらを含み得る。同様に
、本明細書で細胞型を言及する際に使用する「選択的発現」は、別細胞型中での遺伝子の
発現レベル、およびそれを発現する細胞数とそれぞれ比較したときの、特定細胞型におけ
る対象遺伝子の実質的に高い発現レベル、またはそれを発現する細胞の実質的に多い数を
指す。
用語「隣接」は、２つ以上のヌクレオチド配列を言及する際に使用するとき、１つまた
は複数の制御エレメントを含まない介在配列の不在下、またはそれらの存在下のいずれか
で、ヌクレオチド配列がタンデムに連結した状態であることを意味する。
本明細書で使用する用語「核酸分子コード」、「ヌクレオチドコード」、「ＤＮＡ配列
コード」および「ＤＮＡコード」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレ
オチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序によって、ポ
リペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序が決まる。したがってＤＮＡ配列は
アミノ酸配列をコードする。
用語「単離」は、「単離オリゴヌクレオチド」など核酸に関して使用するとき、その元
の供給源と通常結合した少なくとも１つの汚染物質核酸から分離した核酸配列を指す。単
離核酸は、それが本来見られるのと異なる型または設定で存在する核酸である。対照的に
、非単離核酸は、それらが本来存在する状態において見られるＤＮＡおよびＲＮＡなどの
核酸である。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は隣接遺伝子付近の宿主細胞染
色体上に見られ、特異的タンパク質をコードする特異的ｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は
、多数のタンパク質をコードする多くの他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中に見られる
。しかしながら、対象のポリペプチドをコードする単離核酸は、例えば対象のポリペプチ
ドを通常発現する細胞中の核酸などを含み、この場合核酸は元の細胞のそれとは異なる染
色体内もしくは染色体外位置に存在し、または他の場合は本来見られるのと異なる核酸配
列に隣接する。単離核酸またはオリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖型で存在し得る
。単離核酸は、（望む場合）様々な技法（例えば、ハイブリダイゼーション、ドットブロ
ッティングなど）によって容易に確認することができる。単離核酸またはオリゴヌクレオ
チドを利用してタンパク質を発現させるとき、オリゴヌクレオチドはセンス鎖またはコー
ド鎖を少なくとも含有し得る（すなわち、オリゴヌクレオチドは一本鎖であり得る）。あ
るいはオリゴヌクレオチドはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含有し得る（すなわち、
オリゴヌクレオチドは二本鎖であり得る）。
本明細書で使用する用語「精製した」または「精製すること」は、サンプルからの１つ
または複数の（望ましくない）成分の除去を指す。例えば、細菌宿主細胞中で組換えポリ
ペプチドを発現させる場合、宿主細胞タンパク質を除去し、それによってサンプル中の組
換えポリペプチドの割合を高めることによりポリペプチドを精製する。
本明細書で使用する用語「実質的に精製された」は、それらの本来の環境から除去、単
離または分離し、それらが本来結合していた他の成分を少なくとも６０％含まない、幾つ
かの実施形態では７５％含まない、および他の実施形態では９０％含まない、核酸または
アミノ酸配列いずれかの分子を指す。したがって「単離ポリヌクレオチド」は実質的に精
製されたポリヌクレオチドである。
本明細書で使用する用語「コード領域」は、構造遺伝子を言及する際に使用するとき、
ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として発生期ポリペプチドにおいて見られるアミノ酸をコード
するヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物では、一般にイニシエーターメチ
オニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」により５’側、および停止コド
ンを指定する３トリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の１つにより３’側
に存在する。
「コード配列」によって、転写および／または翻訳してｍＲＮＡおよび／またはポリペ
プチドまたはその断片を生成することができる、核酸の配列またはその相補配列、または
その一部分を意味する。コード配列は、ゲノムＤＮＡまたは未熟一次ＲＮＡ転写産物中で
、細胞の生化学的機構により１つに接合して成熟ｍＲＮＡとなるエクソンを含む。アンチ
センス鎖はこのような核酸の相補鎖であり、コード配列はそこから推測することができる
。
「非コード配列」によって、ｉｎ ｖｉｖｏでアミノ酸に転写されない、またはｔＲＮ
Ａが相互作用してアミノ酸を置換しないもしくは置換しようとしない場合の、核酸の配列
またはその相補配列、またはその一部分を意味する。非コード配列は、ゲノムＤＮＡまた
は未熟一次ＲＮＡ転写産物中のイントロン配列と、例えばプロモーター、エンハンサー、
サイレンサーなどの遺伝子関連配列の両方を含む。
本明細書で使用する用語「構造遺伝子」または「構造ヌクレオチド配列」は、他の遺伝
子の発現を制御しないＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を指す。対照的に
、「制御遺伝子」または「制御配列」は、他の遺伝子の発現を制御する産物（例えば、転
写因子）をコードする構造遺伝子である。
本明細書で使用する用語「制御エレメント」は、核酸配列のある程度の発現態様を制御
する遺伝子エレメントを指す。例えばプロモーターは、作動可能に連結したコード領域の
転写の開始を容易にする制御エレメントである。他の制御エレメントには、スプライシン
グシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどがある。
本明細書で使用する用語「ペプチド転写因子結合部位」または「転写因子結合部位」は
、タンパク質転写因子と結合し、それによって核酸配列のある程度の発現態様を制御する
ヌクレオチド配列を指す。例えば、Ｓｐ－１およびＡＰ１（アクチベータータンパク質１
）結合部位はペプチド転写因子結合部位の例である。
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、構造遺伝子のコード領域を含むデオキシリボヌ
クレオチド配列を意味する。「遺伝子」は、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに相当するよ
うに、５’末端と３’末端の両方でコード領域に隣接して位置する非翻訳配列も含み得る
。コード領域の５’に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は５’非翻訳配列と呼ばれる。コ
ード領域の３’または下流に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は３’非翻訳配列と呼ばれ
る。用語「遺伝子」はｃＤＮＡとゲノム型両方の遺伝子を包含する。遺伝子のゲノム型ま
たはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コ
ード配列で妨害されるコード領域を含有する。イントロンは異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）
に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンはエンハンサーなどの制御エレメン
トを含有し得る。イントロンは核または一次転写産物から除去または「スプライシング除
去」され、したがってイントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存
在しない。ｍＲＮＡは翻訳中に働いて、発生期ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列また
は順序を指定する。遺伝子は一般に、単一の遺伝子座である。通常の２倍体生物では、遺
伝子は２個の対立遺伝子を有する。しかしながら、４倍体のジャガイモでは、それぞれの
遺伝子は４個の対立遺伝子を有する。１２倍体であるサトウキビでは、遺伝子あたり１２
個の対立遺伝子が存在し得る。特定の例は、それぞれ２個の対立遺伝子を有する２個のＥ
ＰＳＰＳ遺伝子座を有するアマおよび２個の対立遺伝子を有する単一の単量体プラスチド
ＡＣＣａｓｅを有するイネを含む。
イントロンを含有する以外に、ゲノム型の遺伝子は、ＲＮＡ転写産物上に存在する配列
の５’末端と３’末端の両方に位置する配列も含み得る。これらの配列は「隣接」配列ま
たは領域と呼ばれる（これらの隣接配列はｍＲＮＡ転写産物上に存在する非翻訳配列に対
して５’または３’に位置する）。５’隣接領域は、遺伝子の転写を制御するまたはそれ
に影響を与える、プロモーターおよびエンハンサーなどの制御配列を含有し得る。３’隣
接領域は、転写の終結、転写後の切断およびポリアデニル化を誘導する配列を含有し得る
。
「非ヒト動物」はヒトではない任意の動物を指し、例えばげっ歯動物、非ヒト霊長類、
ヒツジ、ウシ属、反芻動物、ウサギ目、ブタ、ヤギ、ウマ科、イヌ科、ネコ科、鳥類など
の脊椎動物を含む。好ましい非ヒト動物はげっ歯動物目から選択される。さらに「非ヒト
動物」は、両生類（例えばツメガエル属）、爬虫類、昆虫（例えばキイロショウジョウバ
エ属）、および他の非哺乳動物種を指す。
本明細書で使用する用語「トランスジェニック」は、植物または動物の体細胞および／
または生殖系列細胞のいずれかのゲノムに組み込まれた状態で挿入された、別の生物由来
のＤＮＡを有する生物または細胞を指す。「導入遺伝子」は、それが見られる植物または
動物と部分的もしくは完全に異種である（すなわち、本来存在しない）、または内在配列
（すなわち、動物中に本来見られる配列）と相同であり植物または動物ゲノム中の本来存
在する配列のそれと異なる位置に挿入されたＤＮＡ配列を意味する。１つまたは複数の導
入遺伝子を含むトランスジェニック植物または動物は本開示の範囲内にある。さらに、本
明細書で使用する「トランスジェニック」は、本開示の方法によって、相同組換え、ＴＦ
Ｏ突然変異によって、または類似の方法によって、１つまたは複数の遺伝子が修飾および
／または「ノックアウトされた」（非機能的状態になったまたは低レベルでの機能状態に
なった、すなわち「ノックアウト」突然変異）生物を指す。例えば幾つかの実施形態では
、トランスジェニック生物または細胞は、外来プロモーターおよび／またはコード領域を
含む挿入ＤＮＡを含む。
「形質転換細胞」は、多世代にわたり細胞培養中に増殖する能力、軟寒天中で増殖する
能力、および／または細胞間接触による細胞増殖を抑制しない能力を獲得した細胞または
細胞系である。この点で形質転換は、細胞または生物への外来遺伝子物質の導入を指す。
細胞中への核酸の首尾良い導入を可能にして導入核酸の発現をもたらす任意の周知の方法
によって、形質転換を実施することができる。「形質転換」は、トランスフェクション、
マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションおよびリポ
フェクション（リポソーム仲介遺伝子導入）などの方法だけには限られないが、これらを
含む。任意の発現ベクターを使用することにより、形質転換を実施することができる。例
えば、昆虫細胞に外来核酸を導入するためのバキュロウイルスの使用が企図される。用語
「形質転換」は、完全昆虫のＰエレメント仲介生殖細胞系列形質転換などの方法も含む。
さらに形質転換は、通常遺伝子突然変異により、自然に形質転換された細胞を指す。
本明細書で使用する「外因性」は、タンパク質をコードする遺伝子が通常細胞中で発現
されないことを意味する。さらに「外因性」は、その遺伝子の正常（すなわち本来）レベ
ルの発現を高めるために細胞にトランスフェクトされる遺伝子を指す。
ペプチド配列およびヌクレオチド配列は「内在」または「異種」（すなわち外来）であ
ってよい。用語「内在」は、それが本来存在する配列に対して何らかの修飾を含有しない
限り、それが導入される細胞中で本来見られる配列を指す。用語「異種」は、それが導入
される細胞に内在しない配列を指す。例えば異種ＤＮＡは、それが本来連結していない、
またはそれが本来と異なる位置で連結した核酸配列と連結した、または連結状態に操作し
たヌクレオチド配列を含む。異種ＤＮＡは、それが導入される細胞中で本来見られ本来存
在する配列に対して何らかの修飾を含有するヌクレオチド配列も含む。一般に、必ずとは
言えないが、異種ＤＮＡは、それが導入される細胞により通常生成されない異種ＲＮＡお
よび異種タンパク質をコードする。異種ＤＮＡの例には、レポーター遺伝子、転写および
翻訳制御配列、選択可能マーカータンパク質（例えば、薬剤耐性をもたらすタンパク質）
をコードするＤＮＡ配列などがある。
構築物
本明細書で開示している核酸分子（例えば、部位特異的ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳ
ＰＲのガイドＲＮＡ）は、組換え核酸構築物の生成において使用することができる。一実
施形態では、本開示の核酸分子を、核酸構築物、例えば、対象の植物、微生物、または動
物における発現のための発現カセットの調製において使用することができる。例えば構築
物が宿主ゲノム中に組み込まれない、またはそれが組み込まれた状態の場合はプロモータ
ーによってもたらされる制御下で宿主のゲノム内の構築物の位置に維持されるとき、この
発現は一過的である可能性がある。
発現カセットは、本明細書で開示している部位特異的ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡ
配列と作動可能に連結した制御配列を含み得る。カセットは、生物に同時形質転換される
少なくとも１つの別の遺伝子を別に含有し得る。あるいは、多数の発現カセットに別の遺
伝子（複数可）を提供することができる。
制御領域の転写制御下にある部位特異的ヌクレアーゼコード配列の挿入用の複数の制限
部位を有する、核酸構築物を提供することができる。核酸構築物は、選択可能マーカー遺
伝子をコードする核酸分子を別に含有し得る。
任意のプロモーターを、核酸構築物の生成において使用することができる。プロモータ
ーは、本明細書で開示している植物、微生物、または動物宿主核酸配列に固有もしくは類
似、または外来もしくは異種であってよい。さらに、プロモーターは天然配列、または代
替的に合成配列であってよい。プロモーターが「外来」または植物、微生物、または動物
宿主と「異種」である場合、プロモーターはそれが導入される元の植物、微生物、または
動物中で見られないと考えられる。本明細書で使用するキメラ遺伝子は、コード配列と異
種である転写開始領域と作動可能に連結したコード配列を含む。
本明細書で開示している部位特異的ヌクレアーゼ配列は、異種プロモーターを使用して
発現させることが可能である。
植物、微生物、または動物における発現のための構成的、組織優先的、誘導的発現をも
たらすプロモーター、または他のプロモーターなどの任意のプロモーターを、部位特異的
ヌクレアーゼ配列の発現を制御するための構築物の調製において使用することができる。
構成的プロモーターは、例えばＲｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターおよびＷＯ９
９／４３８３８と米国特許第６，０７２，０５０号中に開示された他の構成的プロモータ
ー、コアＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３１３：
８１０－８１２；１９８５）、イネアクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ
．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１６３－１７１，１９９０）、ユビキチンプロモーター（
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９
－６３２，１９８９およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．１８：６７５－６８９，１９９２）、ｐＥＭＵプロモーター（Ｌａｓｔ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１－５８８，１９９１）、
ＭＡＳプロモーター（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．３：２７２３－２７３
０，１９８４）、ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などを含む。
他の構成的プロモーターには、例えば米国特許第５，６０８，１４９号、同第５，６０８
，１４４号、同第５，６０４，１２１号、同第５，５６９，５９７号、同第５，４６６，
７８５号、同第５，３９９，６８０号、同第５，２６８，４６３号、同第５，６０８，１
４２号および同第６，１７７，６１１号のプロモーターを含む。
組織優先的プロモーターを利用して、特定植物組織内の部位特異的ヌクレアーゼの発現
を誘導することができる。このような組織優先的プロモーターには、葉優先的プロモータ
ー、根優先的プロモーター、種子優先的プロモーター、および茎優先的プロモーターがあ
るが、これらだけには限られない。組織優先的プロモーターには、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２（２）：２５５－２６５，１９９７；Ｋａｗａｍａｔ
ａｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２－
８０３，１９９７；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２５４
（３）：３３７－３４３，１９９７；Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎ
ｉｃ Ｒｅｓ．６（２）：１５７－１６８，１９９７；Ｒｉｎｅｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．
，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１－１３４１，１９９６；Ｖａｎ
Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５－５３
５，１９９６；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．
１１２（２）：５１３－５２４，１９９６；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３－７７８，１９９４；Ｌａｍ，Ｒｅ
ｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１－１９６，１９９４；
Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９－１
１３８，１９９３；Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（２０）：９５８６－９５９０，１９９３およびＧｕｅｖａｒａ－
Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（３）：４９５－５０５，１９９３の
プロモーターがある。
核酸構築物は転写終結領域も含み得る。転写終結領域を使用する場合、任意の終結領域
を核酸構築物の調製において使用することができる。例えば、終結領域は別の供給源（す
なわち、外来またはプロモーターと異種）に由来する可能性がある。本開示の構築物中で
の使用に利用することができる終結領域の例には、オクトピンシンターゼおよびノパリン
シンターゼ終結領域などの、エーツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ
ｉ－プラスミド由来の終結領域がある。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１－１４４，１９９１；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｃｅｌｌ
６４：６７１－６７４，１９９１；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅ
ｖ．５：１４１－１４９，１９９１；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
２：１２６１－１２７２，１９９０；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ９１：１５
１－１５８，１９９０；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１７：７８９１－７９０３，１９８９；およびＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９６２７－９６３９，１９８７も参照。
本明細書で開示している任意の態様、実施形態、方法および／または組成物に関して、
形質転換植物中での発現を高めるために核酸を最適化することができる。すなわち、部位
特異的ヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸を、発現改善用の植物優先的コドンを使
用して合成することができる。例えば、宿主優先的コドン使用頻度の考察に関する、Ｃａ
ｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ，（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１－１１，
１９９０）を参照。植物優先的遺伝子の合成に関する当技術分野の方法が利用可能である
。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号、および米国特許第５，４３６，３９１号、
およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７
７－４９８，１９８９を参照。例えば、Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：３３－４３，２０１４；Ｂｕｒｇｅｓｓ－Ｂｒｏｗｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．５９：９４－１０２，２００８；
Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３
４６－３５３，２００４も参照されたい。
さらに、他の配列修飾を本明細書で開示している核酸に施すことができる。例えば、細
胞宿主における遺伝子発現を高めるための、別の配列修飾が知られている。これらは、擬
似ポリアデニル化シグナル、エクソン／イントロンスプライス部位シグナル、トランスポ
ゾン様反復単位をコードする配列、および遺伝子発現に有害であり得る他のこのような十
分特徴付けられた配列の排除を含む。配列のＧ－Ｃ含有量は、宿主細胞中で発現される周
知の遺伝子を参照することにより計算した、標的細胞宿主の平均レベルに調節することも
できる。さらに、配列を修飾して予想ヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避することができる
。
他の核酸配列を本開示の構築物の調製において使用して、例えば部位特異的ヌクレアー
ゼコード配列の発現を高めることもできる。このような核酸配列には、メイズＡｄｈＩ、
イントロン１遺伝子のイントロン（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１：１１８３－１２００，１９８７）、ならびにタバコモザイク
ウイルス（ＴＭＶ）、メイズ萎黄病ウイルスおよびアルファルファモザイクウイルス由来
のリーダー配列（Ｗ－配列）がある（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：８６９３－８７１１，１９８７およびＳｋｕｚｅｓｋｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６５－７９，１９９０）。メイズの収
縮１型遺伝子座由来の第１のイントロンは、キメラ遺伝子構築物における遺伝子の発現を
高めることが示されている。米国特許第５，４２４，４１２号および米国特許第５，５９
３，８７４号は遺伝子発現構築物における特異的イントロンの使用を開示しており、Ｇａ
ｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：９２９－９３９，１９
９４）は、イントロンが組織特異的偏位で遺伝子発現を制御するのに有用であることも示
している。部位特異的ヌクレアーゼ遺伝子発現をさらに高めるまたは最適化するため、本
明細書で開示している植物用発現ベクターは、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）を含有す
るＤＮＡ配列も含有することができる。したがって、このような修飾発現系で形質転換し
た植物細胞は、本開示のヌクレオチド配列の過剰発現または構成的発現を示す可能性があ
る。
本明細書で開示している発現構築物は、葉緑体または原核生物と真核生物の両方におけ
る他のオルガネラおよび構造物に対する部位特異的ヌクレアーゼ配列の発現を誘導するこ
とができる核酸配列も含み得る。このような核酸配列には、植物細胞葉緑体に対象遺伝子
産物を誘導する葉緑体輸送ペプチドをコードする葉緑体標的配列がある。このような輸送
ペプチドは当技術分野で知られている。葉緑体標的配列に関して、「作動可能に連結した
」は、輸送ペプチドをコードする核酸配列（すなわち、葉緑体標的配列）が、２配列が隣
接し同じリーディングフレームに存在するように、本明細書で開示している部位特異的ヌ
クレアーゼ核酸分子と連結していることを意味する。例えば、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４－１２６，１９９１；
Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４－１７５５０
，１９８９；Ｄｅｌｌａ－Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．
８４：９６５－９６８，１９８７；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４－１４２１，１９９３およびＳｈａ
ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：４７８－４８１，１９８６を参照。
葉緑体標的配列は当技術分野でよく知られており、リブロース－１，５－ビスリン酸カ
ルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）（ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ Ｓｉｌｖａ Ｆｉｌｈｏ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：７６９－７８０，１９９６；Ｓｃｈ
ｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（５）：３３３５－３３４２
，１９９１）、５－（エノールピルビル）シキミ酸－３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ
）（Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２２（６）
：７８９－８１０，１９９０）、トリプトファンシンターゼ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１１）：６０８１－６０８７，１９９５）、プラスト
シアニン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３）
：２０３５７－２０３６３，１９９７）、コリスミ酸シンターゼ（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２７４４７－２７４５７，１９９
３）、および光吸収性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＬＨＢＰ）（Ｌａｍｐｐａ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４９９６－１４９９９，１９８８）
の葉緑体小サブユニットを含む。Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４－１２６，１９９１；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４－１７５５０，１９８９；Ｄｅｌｌａ－Ｃ
ｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｏｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５－９６８，１９
８７；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ．１９６：１４１４－１４２１，１９９３およびＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２３３：４７８－４８１，１９８６も参照。
本明細書で開示している任意の態様、実施形態、方法および／または組成物に関して、
核酸構築物を調製して、植物細胞葉緑体由来の突然変異部位特異的ヌクレアーゼコード配
列の発現を誘導することができる。葉緑体を形質転換するための方法は当技術分野で知ら
れている。例えば、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ８７：８５２６－８５３０，１９９０；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：９１３－９１７，１９９３；Ｓｖａ
ｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，ＥＭＢＯＪ．１２：６０１－６０６，１９９３を参照。この
方法は、選択可能マーカーを含有するＤＮＡのパーティクルガン送達法、および相同組換
えによるプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化を利用する。さらに、核コードおよびプラ
スチド対象ＲＮＡポリメラーゼの組織優先的発現によるサイレントプラスチド媒介導入遺
伝子のトランス作用によって、プラスチド形質転換を実施することができる。このような
システムはＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ９１：７３０１－７３０５，１９９４中で報告されている。
葉緑体を標的化する対象の核酸を、植物の核とこのオルガネラの間のコドン使用頻度の
違いを考慮して、葉緑体での発現用に最適化することができる。このようにして、葉緑体
優先的コドンを使用して対象の核酸を合成することができる。例えば、参照により本明細
書に組み込まれている米国特許第５，３８０，８３１号を参照。
核酸構築物を使用して植物細胞を形質転換し、部位特異的ヌクレアーゼコード配列を含
むトランスジェニック植物を再生することができる。植物形質転換用の多数の植物形質転
換ベクターおよび方法が利用可能である。例えば、米国特許第６，７５３，４５８号、Ａ
ｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８１：３０１－３０５，１９８
６；Ｆｒｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．６：３２１－３２５，
１９８７；Ｂｌｏｃｋ，Ｍ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．７６：７６７－７７
４，１９８８；Ｈｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｄｌｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｍｐ
．２０３２１２．２０３－２１２，１９９０；Ｃｏｕｓｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｓｔ
．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８：４８１－４９４，１９９１；Ｃｈｅｅ，Ｐ．
Ｐ．ａｎｄ Ｓｌｉｇｈｔｏｍ，Ｊ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ．１１８：２５５－２６０，１９９
２；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２
３９－２４６，１９９２；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
．１０：３０９－３１４，１９９２；Ｄｈｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．９９：８１－８８，１９９２；Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１２１２－１１２１６，１９９３；Ｃｈｒｉｓ
ｔｏｕ，Ｐ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．－Ｐｌａｎｔ２９Ｐ：
１１９－１２４，１９９３；Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅ
ｐ．１２：１８０－１８３，１９９３；Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｍｃ Ｈｕｇｈｅｎ
，Ａ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ９１：１３９－１４８，１９９３；Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｃ．
Ｉ．ａｎｄ Ｔｒｉｅｕ，Ｔ．Ｎ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１６７，１
９９３；Ｇｏｌｏｖｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９０：４１－５２，１
９９３；Ｇｕｏ Ｃｈｉｎ Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．３８：２０７２－２０７８；Ａｓａｎｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３，１９９４；Ａｙｅｒｅｓ Ｎ．
Ｍ．ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｄ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｓｃｉ．１３：２１
９－２３９，１９９４；Ｂａｒｃｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：５８３－
５９２，１９９４；Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：２９９－３０７
，１９９４；Ｂｏｒｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎ
ｔ。１６：２２５－２３０，１９９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．，Ａｇｒｏ．Ｆｏｏｄ．
Ｉｎｄ．Ｈｉ Ｔｅｃｈ．５：１７－２７，１９９４；Ｅａｐｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌ
ａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３：５８２－５８６，１９９４；Ｈａｒｔｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：９１９９２３，１９９４；Ｒｉｔａｌａ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３１７－３２５，１９９４および
Ｗａｎ，Ｙ．Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｍａｕｘ，Ｐ．Ｇ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０
４：３７４８，１９９４を参照。相同組換えを使用して、構築物を植物細胞に形質転換す
ることもできる。
用語「野生型」は、ペプチド配列およびヌクレオチド配列を言及するとき、本来存在す
る供給源から単離したときのペプチド配列およびヌクレオチド配列の特徴を有する、ペプ
チド配列およびヌクレオチド配列（遺伝子座／遺伝子／対立遺伝子）をそれぞれ指す。野
生型ペプチド配列およびヌクレオチド配列は集団内で最も頻繁に観察される配列であり、
したがって任意でそれぞれ「正常」または「野生型」形のペプチド配列およびヌクレオチ
ド配列と示される。「野生型」は、１つまたは複数の特異的ヌクレオチド位置における配
列、または１つまたは複数の特定コドン位置における配列、または１つまたは複数の特定
アミノ酸位置における配列を指すこともできる。
「コンセンサス配列」は、同一アミノ酸もしくはヌクレオチドまたは少なくとも２５％
の配列に関して機能上同等なアミノ酸もしくはヌクレオチドを含有する、アミノ酸または
ヌクレオチドの配列として定義する。同一または機能上同等なアミノ酸またはヌクレオチ
ドが隣接している必要はない。
本明細書で使用する用語「アブラナ」はアブラナ属の植物を指す。例示的なアブラナ種
には、ビーカリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）、ビーエロンゲート（Ｂ．ｅｌｏｎｇａｔ
ｅ）、ビーフルチクローサ（Ｂ．ｆｒｕｔｉｃｕｌｏｓａ）、ビージュンセア（Ｂ．ｊｕ
ｎｃｅａ）、ビーナプス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、ビーナリノーサ（Ｂ．ｎａｒｉｎｏｓａ）
、ビーニグラ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）、ビーオレラセア（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、ビーペリ
ビリディス（Ｂ．ｐｅｒｖｉｒｉｄｉｓ）、ビーレーパ（Ｂ．ｒａｐａ）（合成ビーカム
ペストリス（ｓｙｎＢ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、ビールペストリス（Ｂ．ｒｕｐｅｓ
ｔｒｉｓ）、ビーセプティセプス（Ｂ．ｓｅｐｔｉｃｅｐｓ）、およびビートウルネフォ
ルティ（Ｂ．ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉｉ）があるが、これらだけには限られない。
核酸塩基は、特定の好ましい実施形態においてプリン、ピリミジン、またはそれらの誘
導体もしくはアナログである塩基である。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル成分を
含有する核酸塩基、例えば場合によっては置換されたリボシドまたは２’－デオキシリボ
シドである。ヌクレオシドは数個の連結成分の１つによって連結することができ、それは
亜リン酸を含有し得るかまたは含有し得ない。非置換ホスホジエステル結合によって結合
したヌクレオシドはヌクレオチドと呼ばれる。本明細書で使用する用語「核酸塩基」は、
ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニット、およびモルホリン核酸塩基、ならびに
ヌクレオシドとヌクレオチドを含む。
オリゴ核酸塩基は核酸塩基を含むポリマーであり、幾つかの実施形態では、その少なく
とも一部分は相補配列を有するＤＮＡとワトソン－クリック塩基対形成によりハイブリダ
イズ可能である。オリゴ核酸塩基鎖は、ポリマーの末端核酸塩基である一本鎖５’末端と
３’末端を有し得る。特定オリゴ核酸塩基鎖は全タイプの核酸塩基を含有することができ
る。オリゴ核酸塩基化合物は、相補的でありワトソン－クリック塩基対形成によりハイブ
リダイズ可能である１つまたは複数のオリゴ核酸塩基鎖を含む化合物である。リボ型核酸
塩基は、２’炭素がヒドロキシ、アルキルオキシまたはハロゲンで置換されたメチレンで
あるペントースフラノシル含有核酸塩基を含む。デオキシリボ型核酸塩基はリボ型核酸塩
基以外の核酸塩基であり、ペントースフラノシル成分を含有しない全ての核酸塩基を含む
。
特定の実施形態では、オリゴ核酸塩基鎖部分は、オリゴ核酸塩基鎖とオリゴ核酸塩基鎖
のセグメントまたは領域の両方を含み得る。オリゴ核酸塩基鎖部分は３’末端と５’末端
を有することができ、オリゴ核酸塩基鎖部分が鎖と共に延長するとき、鎖部分の３’末端
と５’末端は鎖の３’末端と５’末端でもある。
本明細書で使用する用語「コドン」は、タンパク質合成中のポリペプチド鎖における指
定アミノ酸の挿入またはタンパク質合成を停止させるためのシグナルを決定する遺伝子コ
ードを構成する、３個の隣接ヌクレオチドの配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を指
す。用語「コドン」は、元のＤＮＡが転写されるメッセンジャーＲＮＡにおける３ヌクレ
オチドの対応（および相補）配列を指すためにも使用する。
本明細書で使用する用語「相同性」は、タンパク質とＤＮＡの間の配列類似性を指す。
用語「相同性」または「相同的」は同一性の程度を指す。部分的相同性または完全相同性
が存在し得る。部分的に相同的な配列は、別の配列と比較したとき１００％未満の配列同
一性を有する配列である。
「ヘテロ接合型」は、相同染色体セグメントにおける１つまたは複数の遺伝子座に異な
る対立遺伝子を有することを指す。本明細書で使用する「ヘテロ接合型」は、１つまたは
複数の遺伝子座に異なる対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞、細胞集団または生
物も指すことができる。ヘテロ接合型サンプルを、例えば核酸配列決定などの、当技術分
野で知られている方法によって決定することもできる。例えば、配列決定エレクトロフェ
ログラムが１つの遺伝子座で２つのピークを示し、２つのピークがほぼ同じサイズである
場合、サンプルはヘテロ接合型として特徴付けることができる。または、１つのピークが
他方より小さいが、大きなピークの少なくとも約２５％のサイズである場合、サンプルは
ヘテロ接合型として特徴付けることができる。幾つかの実施形態では、小さなピークは大
きなピークの少なくとも約１５％である。他の実施形態では、小さなピークは大きなピー
クの少なくとも約１０％である。他の実施形態では、小さなピークは大きなピークの少な
くとも約５％である。他の実施形態では、最小量の小さなピークが検出される。
本明細書で使用する「ホモ接合型」は、相同染色体セグメントにおける１つまたは複数
の遺伝子座に同一対立遺伝子を有することを指す。「ホモ接合型」は、１つまたは複数の
遺伝子座に同じ対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞、細胞集団または生物も指す
ことができる。ホモ接合型サンプルを、例えば核酸配列決定などの、当技術分野で知られ
ている方法によって決定することができる。例えば、配列決定エレクトロフェログラムが
特定遺伝子座で１つのピークを示す場合、サンプルはその遺伝子座に関して「ホモ接合型
」と呼ぶことができる。
用語「ヘミ接合型」は、第２の対立遺伝子が欠失しているか、または相同染色体セグメ
ント上に存在しないため、細胞または生物の遺伝子型に一回のみ存在する、遺伝子または
遺伝子セグメントを指す。本明細書で使用する「ヘミ接合型」は、遺伝子型に一回のみ存
在する、１つまたは複数の遺伝子座における対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞
、細胞集団または生物も指すことができる。
本明細書で使用する用語「接合状態」は、サンプル、細胞集団、または生物が、当技術
分野で知られており本明細書に記載する試験法により決定される、ヘテロ接合型、ホモ接
合型、またはヘミ接合型と考えられることを指す。用語「核酸の接合状態」は、核酸の供
給源がヘテロ接合型、ホモ接合型、またはヘミ接合型と考えられるかどうかの決定を意味
する。「接合状態」は配列中の１ヌクレオチド位置における違いを指すことができる。幾
つかの方法では、一突然変異に関するサンプルの接合状態を、ホモ接合野生型、ヘテロ接
合型（すなわち、１つの野生型対立遺伝子と１つの突然変異対立遺伝子）、ホモ接合突然
変異型、またはヘミ接合型（すなわち、野生型もしくは突然変異対立遺伝子いずれかの１
コピー）として分類することができる。
本明細書で使用する用語「ＲＴＤＳ」は、Ｃｉｂｕｓによって開発されたＴｈｅ Ｒａ
ｐｉｄ Ｔｒａｉｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＲＴＤＳ）を指
す。ＲＴＤＳは、外来遺伝子または対照配列の取り込み無しで遺伝子配列に正確な改変を
施す際に有効である、部位特異的遺伝子修飾システムである。
本明細書で使用する用語「約」は、プラスマイナス１０％の量を表す用語である。例え
ば「約３％」は２．７～３．３％を包含し、「約１０％」は９～１１％を包含する。さら
に、数量と共に「約」を本明細書で使用する場合、その値のプラスまたはマイナス１０％
だけでなく、その数量の正確な値も企図および記載されることが理解される。例えば、用
語「約３％」は、正確に３％を明示的に企図する、記載する、および含む。
ＲＴＤＳおよび修復オリゴヌクレオチド（ＧＲＯＮ）
本開示は一般に、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列中の特定位置に対する、修飾の標
的化の効率を改善するための新規な方法に関する。さらに本開示は、本明細書で開示して
いる手法により修飾、突然変異または顕在化された標的ＤＮＡに関する。本開示はさらに
、本開示の方法によって修飾された細胞、組織、および生物に関する。本開示は、成功し
た変換システム、ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｉｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（ＲＴＤＳ（商標）、Ｃｉｂｕｓ ＵＳ ＬＬＣ）と部分的に関連する組成物および
方法の開発に基づく。
ＲＴＤＳは、細胞独自の遺伝子修復システムを利用し、外来ＤＮＡおよび遺伝子発現制
御配列を挿入せずにｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子配列を特異的に修飾することによる、標的遺
伝子の改変に基づく。この手順は遺伝子配列の正確な改変に影響を与え、一方でゲノムの
残り部分は不変状態である。従来のトランスジェニックＧＭＯと対照的に、外来遺伝子物
質の組み込みがなく、如何なる外来遺伝子物質も植物中に残っていない。ＲＴＤＳによっ
て導入される遺伝子配列の改変はランダムに挿入されない。影響を受ける遺伝子はその元
の位置に留まるので、ランダム、制御不能または有害なパターンの発現は起こらない。
この改変に影響を与えるＲＴＤＳは、ＤＮＡと修飾ＲＮＡ塩基の両方、ならびに他の化
学成分で構成され得る、本明細書で記載されるような化学的に合成されたオリゴヌクレオ
チド（ＧＲＯＮ）であり、標的遺伝子位置でハイブリダイズしてミスマッチ塩基対（複数
可）を形成するよう設計されている。このミスマッチ塩基対は細胞独自の天然遺伝子修復
システムをその部位に向けるシグナルとして働き、遺伝子内の指定ヌクレオチド（複数可
）を補正する（置換、挿入または欠失）。補正プロセスが終了した後、ＲＴＤＳ分子は分
解され、現在修飾または修復中の遺伝子は、その遺伝子の通常の内在制御機構の下で発現
される。
本明細書で開示している方法および組成物は、本明細書および以下で詳細に記載する立
体配座および化学的性質を有する「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」（ＧＲＯＮ）を用いて実
施または作製することができる。本明細書で企図する「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」は、
「組換え可能オリゴ核酸塩基」、「ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド」、「キメ
ラオリゴヌクレオチド」、「混合型二本鎖オリゴヌクレオチド」（ＭＤＯＮ）、「ＲＮＡ
ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＤＯ）」、「遺伝子標的化オリゴヌクレオチド」、「ゲノ
プラスト」、「一本鎖修飾オリゴヌクレオチド」、「一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド
ミューテーターベクター」（ＳＳＯＭＶ）、「二本鎖突然変異ベクター」、および「ヘテ
ロ二本鎖突然変異ベクター」を含めた他の名称を使用して、刊行済みの科学誌および特許
文献中にも記載されている。遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、マイクロキャリア（バイオリ
スティックデリバリー）、マイクロファイバー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介
取り込み、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションだけには限られな
いが、これらを含めた、当技術分野で一般に使用される任意の方法を使用して植物細胞に
導入することができる。
一実施形態において、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、２’－ヒドロキシルとフルオロ、
クロロもしくはブロモ官能基の置換または２’－Ｏ上の置換基の配置によって混合型二本
鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ型ヌクレオチドがＲＮａｓｅ耐性になった、混合型二本鎖
オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）である。適切な置換基はＫｍｉｅｃＩＩによって教示さ
れた置換基を含む。別の置換基には、米国特許第５，３３４，７１１号（Ｓｐｒｏａｔ）
によって教示された置換基と特許公開ＥＰ６２９３８７およびＥＰ６７９６５７（まとめ
て、Ｍａｒｔｉｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）によって教示された置換基があり、これ
らは参照により本明細書に組み込まれている。本明細書で使用する、リボヌクレオチドの
２’－フルオロ、クロロもしくはブロモ誘導体、またはＭａｒｔｉｎ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓもしくはＳｐｒｏａｔ中に記載された置換基で置換されたＴ－ＯＨを有するリボ
ヌクレオチドは「Ｔ－置換リボヌクレオチド」と呼ばれる。本明細書で使用する用語「Ｒ
ＮＡ型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエステル結合またはＫｍｉｅｃＩもしくはＫｍ
ｉｅｃＩＩによって教示された任意の非天然結合によって混合型二本鎖オリゴヌクレオチ
ドの他のヌクレオチドと結合した、Ｔ－ヒドロキシルまたは２’－置換ヌクレオチドを意
味する。本明細書で使用する用語「デオキシリボ型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエ
ステル結合またはＫｍｉｅｃＩもしくはＫｍｉｅｃＩＩによって教示された任意の非天然
結合によって遺伝子修復オリゴ核酸塩基の他のヌクレオチドと結合することができる、Ｔ
－Ｈを有するヌクレオチドを意味する。
本開示の特定の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、非置換ホスホジエステル
結合によってのみ結合した混合型二本鎖オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）である。代替実
施形態では、結合は置換ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、およびＫｍｉｅｃ
ＩＩによって教示された非亜リン酸系結合による結合である。さらに別の実施形態では、
混合型二本鎖オリゴヌクレオチド中の各ＲＮＡ型ヌクレオチドは２’－置換ヌクレオチド
である。２’－置換リボヌクレオチドの特に好ましい実施形態は、２’－フルオロ、Ｔ－
メトキシ、２’－プロピルオキシ、２’－アリルオキシ、２’－ヒドロキシルエチルオキ
シ、２’－メトキシエチルオキシ、Ｔ－フルオロプロピルオキシおよび２’－トリフルオ
ロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドである。２’－置換リボヌクレオチドのより好ま
しい実施形態は、２’－フルオロ、２’－メトキシ、２’－メトキシエチルオキシ、およ
び２’－アリルオキシ置換ヌクレオチドである。別の実施形態では、混合型二本鎖オリゴ
ヌクレオチドは非置換ホスホジエステル結合によって結合している。
１型の２’－置換ＲＮＡ型ヌクレオチドのみを有する混合型二本鎖オリゴヌクレオチド
（ＭＤＯＮ）はより好都合に合成されるが、本開示の方法は、２型以上のＲＮＡ型ヌクレ
オチドを有する混合型二本鎖オリゴヌクレオチドで実施することができる。ＲＮＡセグメ
ントの機能が、２つのＲＮＡ型トリヌクレオチド間へのデオキシヌクレオチドの導入によ
り引き起こされる介入によって影響を受ける可能性はなく、したがって用語ＲＮＡセグメ
ントは「介入ＲＮＡセグメント」などの用語を包含する。非介入ＲＮＡセグメントは隣接
ＲＮＡセグメントと呼ばれる。代替実施形態では、ＲＮＡセグメントは改変ＲＮａｓｅ耐
性および非置換２’－ＯＨヌクレオチドを含有し得る。混合型二本鎖オリゴヌクレオチド
は、幾つかの実施形態では１００個より少ないヌクレオチド、および他の実施形態では８
５個より少ないヌクレオチド、ただし５０個を超えるヌクレオチドを有する。第１の鎖部
分と第２の鎖部分はワトソン－クリックの法則に従い塩基対形成する。一実施形態では、
混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの鎖部分は、第１の鎖部分と第２の鎖部分が１つの３’
末端と１つの５’末端を有する一本のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントであるように、
一本鎖ヘキサ、ペンタまたはテトラヌクレオチドなどのリンカーによって共有結合する。
３’末端と５’末端は「ヘアピンキャップ」の付加によって保護することができ、これに
より３’末端と５’末端ヌクレオチドはワトソン－クリックの法則に従い隣接ヌクレオチ
ドと塩基対形成する。さらに第２のヘアピンキャップを、第１の鎖部分と第２の鎖部分の
間のワトソン－クリックの法則に従う塩基対形成が安定するように、３’末端と５’末端
から離れた第１の鎖部分と第２の鎖部分の間の接合部に置くことができる。
第１の鎖部分と第２の鎖部分は、標的遺伝子／対立遺伝子の２セグメントと相同的であ
る２領域を含有する、すなわち標的遺伝子／対立遺伝子と同じ配列を有する。相同領域は
ＲＮＡセグメントのヌクレオチドを含有し、結合ＤＮＡセグメントの１つまたは複数のＤ
ＮＡ型ヌクレオチドを含有する可能性があり、介在ＤＮＡセグメント内に存在しないＤＮ
Ａ型ヌクレオチドを含有する可能性もある。２つの相同領域は、「異種領域」と呼ばれる
標的遺伝子の配列と異なる配列を有する領域によって隔てられ、それぞれ隣接している。
異種領域は１、２または３個のミスマッチヌクレオチドを含有し得る。ミスマッチヌクレ
オチドは隣接する可能性があり、または代替的に、標的遺伝子／対立遺伝子と相同的であ
る１個または２個のヌクレオチドによって隔てられる可能性がある。あるいは異種領域は
、挿入物、または１、２、３もしくは５個以下のヌクレオチドも含有し得る。あるいは、
混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド由来の１、
２、３もしくは５個以下のヌクレオチドの欠失のみ標的遺伝子／対立遺伝子の配列と異な
る可能性がある。異種領域の長さと位置は、この場合、異種領域内に混合型二本鎖オリゴ
ヌクレオチドのヌクレオチドが存在しないが、欠失部分の長さであると考えられる。２つ
の相同領域と相補的である標的遺伝子の断片間の距離は、１つまたは複数の置換が考えら
れる異種領域の長さと同一である。異種領域が挿入物を含有する場合、相同領域は、遺伝
子／対立遺伝子中のそれらの相補相同断片より遠く混合型二本鎖オリゴヌクレオチド中で
それによって隔てられており、異種領域が欠失をコードするときは逆のことが当てはまる
。
混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡセグメントは、それぞれ相同領域、すなわち
標的遺伝子の断片と配列が同一である領域の一部分であり、これらのセグメントは、幾つ
かの実施形態では少なくとも１３のＲＮＡ型ヌクレオチド、および幾つかの実施形態では
１６～２５のＲＮＡ型ヌクレオチド、またはさらに他の実施形態では１８～２２のＲＮＡ
型ヌクレオチド、または幾つかの実施形態では２０のヌクレオチドを全体として含有する
。一実施形態では、相同領域のＲＮＡセグメントは隔てられ、介在ＤＮＡセグメントと隣
接、すなわち「結合」している。一実施形態では、異種領域のそれぞれのヌクレオチドは
介在ＤＮＡセグメントのヌクレオチドである。混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの異種領
域を含有する介在ＤＮＡセグメントは、「ミューテーターセグメント」と呼ばれる。
本開示の別の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）は、その全容が参
照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳＯＯ／２３４５７、米
国特許第６，２７１，３６０号、同第６，４７９，２９２号、および同第７，０６０，５
００号中に開示されているような、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドミューテーターベ
クター（ＳＳＯＭＶ）である。ＳＳＯＭＶの配列は、米国特許第５，７５６，３２５号、
同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，０１２号、同第５，８８８，９８３号、同
第５，７９５，９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第
６，００４，８０４号、および同第６，０１０，９０７号中、ならびに国際公開Ｎｏｓ．
ＷＯ９８／４９３５０、ＷＯ９９／０７８６５、ＷＯ９９／５８７２３、ＷＯ９９／５８
７０２、およびＷＯ９９／４０７８９中に記載されたミューテーターベクターと同じ原理
に基づく。ＳＳＯＭＶの配列は、ミューテーター領域と呼ばれる所望の遺伝子改変を含有
する領域によって隔てられた、標的配列と相同的である２領域を含有する。ミューテータ
ー領域は、標的配列中の相同領域を隔てる配列と同じ長さであるが、異なる配列を有する
配列を有し得る。このようなミューテーター領域は置換を引き起こす可能性がある。ある
いは、ＳＳＯＭＶ中の相同領域は互いに隣接している可能性があり、一方同じ配列を有す
る標的遺伝子中の領域は１個、２個以上のヌクレオチドにより隔てられている。このよう
なＳＳＯＭＶは、ＳＳＯＭＶが不在のヌクレオチドの標的遺伝子からの欠失を引き起こす
。最後に、相同領域と同一である標的遺伝子の配列は標的遺伝子中では隣接しているが、
ＳＳＯＭＶの配列中では１個、２個以上のヌクレオチドにより隔てられている可能性があ
る。このようなＳＳＯＭＶは標的遺伝子の配列における挿入を引き起こす。特定の実施形
態では、ＳＳＯＭＶはそれ自体にアニーリングしない。
ＳＳＯＭＶのヌクレオチドは、非修飾ホスホジエステル結合によって結合したデオキシ
リボヌクレオチドであるが、ただし１つの３’末端および／または５’末端ヌクレオチド
間結合、または代替的に２つの３’末端および／または５’末端ヌクレオチド間結合がホ
スホロチオエートまたはホスホアミデートであり得る。本明細書で使用するヌクレオチド
間結合は、ＳＳＯＭＶのヌクレオチドの間の結合であり、３’末端ヌクレオチドまたは５
’末端ヌクレオチドとブロッキング置換基の間の結合は含まない。具体的実施形態では、
ＳＳＯＭＶの長さは２１～５５デオキシヌクレオチドであり、したがって相同領域の長さ
は全長少なくとも２０デオキシヌクレオチドであり、少なくとも２つの相同領域は少なく
とも８デオキシヌクレオチドの長さをそれぞれ有するはずである。
標的遺伝子のコード鎖または非コード鎖のいずれかと相補的であるように、ＳＳＯＭＶ
を設計することができる。所望の突然変異が一塩基の置換であるとき、ミューテーターヌ
クレオチドと標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。所望の機能的
結果の獲得と一致する範囲で、相補鎖中のミューテーターヌクレオチドと標的ヌクレオチ
ドの両方がピリミジンであることが好ましい。特に好ましいのは、トランスバージョン突
然変異をコードする、すなわちそれぞれ相補鎖中のＣまたはＴヌクレオチドとＣまたはＴ
ミューテーターヌクレオチドがミスマッチである、ＳＳＯＭＶである。
岡崎フラグメント／２’－ＯＭＥ ＧＲＯＮの設計。様々な実施形態において、ＧＲＯ
ＮはＲＮＡとＤＮＡの両方のヌクレオチドならびに／または他の型の核酸塩基を有しても
よい。幾つかの実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドのうちの１つまたは複数
が修飾を含む。特定の実施形態では、最初の５’ヌクレオチドはＲＮＡヌクレオチドであ
り、残りのヌクレオチドはＤＮＡである。さらなる実施形態では、最初の５’ＲＮＡヌク
レオチドは２－Ｏ－Ｍｅで修飾される。他の実施形態では、最初の２、３、４、５、６、
７、８、９、１０個またはそれ以上の５’ヌクレオチドはＲＮＡヌクレオチドであり、残
りのヌクレオチドはＤＮＡである。さらなる実施形態では、最初の２、３、４、５、６、
７、８、９、１０個またはそれ以上の５’ＲＮＡヌクレオチドのうちの１つまたは複数は
、２－Ｏ－Ｍｅで修飾される。植物細胞においては、ＤＮＡ中での二本鎖切断は、典型的
には、ＮＨＥＪ ＤＮＡ修復経路によって修復される。この経路は、ＤＮＡを修復するた
めの鋳型を必要とせず、したがって誤りがちである。植物細胞に関してＤＮＡを修復する
ためにこの経路を使用する利点は、それが迅速であり、遍在的であり、最も重要なことに
は、細胞がＤＮＡ複製を受けていない時に起こり得るということである。植物細胞におけ
る複製フォークの外側の二本鎖切断を修復する際に機能する別のＤＮＡ修復経路は、相同
組換え（ＨＲ）と呼ばれる；しかしながら、ＮＨＥＪ経路と違って、この型の修復は正確
であり、ＤＮＡ鋳型（ＧＲＯＮ）の使用を必要とする。これらのＧＲＯＮは標的遺伝子の
ＤＮＡ複製フォークにおいて岡崎フラグメントを模倣するため、二本鎖ＤＮＡ切断剤と共
にそれらを使用することは、当業者には自明ではない。
効率の改善
本開示は、修復オリゴヌクレオチドを使用する、標的遺伝子の転換の有効性を高めるた
めの幾つかの手法を提供し、それらは単独でまたは互いに組み合せて使用することができ
る。これらは以下を含む：
１．標的（ミスマッチ）部位にＤＮＡ修復機構を向ける修復オリゴヌクレオチドに対す
る修飾の導入。
Ａ．オリゴヌクレオチド（例えば、１０塩基以内、および幾つかの実施形態では所望ミ
スマッチ部位の５塩基）における１つまたは複数の無塩基部位の導入により塩基切除修復
（ＢＥＲ）中の中間体である損傷が生じ、それによってＢＥＲ機構を修復オリゴヌクレオ
チドによる転換標的の部位近辺に向ける。ｄスペーサー（無塩基フラン）修飾オリゴヌク
レオチドは、例えばＴａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
６２：１０１７１－７９，１９８７中に記載されたように調製することができる。
Ｂ．オリゴヌクレオチド中へのまたはオリゴヌクレオチドと一緒のいずれかの、一本鎖
または二本鎖切断を誘導する化合物の封入によって、ＮＨＥＪ、マイクロホモロジー仲介
末端結合（ＭＭＥＪ）、および相同組換えにより修復される損傷が生じる。例えば、ブレ
オマイシンファミリーの抗生物質、ジンクフィンガー、ＦｏｋＩ（または任意のＩＩＳ型
クラスの制限酵素）および他のヌクレアーゼを修復オリゴヌクレオチドの３’末端または
５’末端に共有結合させて、修復オリゴヌクレオチドによる転換標的の部位近辺に二本鎖
切断を導入することが可能である。ブレオマイシンファミリーの抗生物質は、ブレオマイ
シン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよびその他を含
めたＤＮＡ切断糖ペプチドである。
Ｃ．オリゴヌクレオチド（例えば、１０塩基以内、および幾つかの実施形態では所望ミ
スマッチ部位の５塩基）に取り込まれる１つまたは複数の８’オキソｄＡまたはｄＧの導
入によって、反応性酸素種によって生成する損傷と類似した損傷が生じる。これらの損傷
はいわゆる「助長型修復」系を誘導する。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７：６５７－６２，２００４を参照。
２．修復オリゴヌクレオチドの安定性の増大：
修復オリゴヌクレオチド上に３’ブロッキング末端を作製するためのオリゴヌクレオチ
ドの３’末端における逆向き塩基（ｉｄＣ）の導入。
修復オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端における、ハイブリダイゼーシ
ョンエネルギーを増大させる１つまたは複数の２’Ｏ－メチルヌクレオチドまたは塩基の
導入（例えば、ＷＯ２００７／０７３１４９参照）。
修復オリゴヌクレオチドの５’末端における１つまたは複数の２’Ｏ－メチルＲＮＡヌ
クレオチドの導入、所望のミスマッチ部位をもたらすＤＮＡ塩基が生じ、それによって岡
崎フラグメント様核酸構造を生成する。
アクリジン、ソラレン、臭化エチジウムおよびサイバー染色液などの結合（５’または
３’）挿入色素。
Ｔ／Ａクランプ、コレステロール成分、ＳＩＭＡ（ＨＥＸ）、リボＣおよびアミダイト
などの５’末端キャップの導入。
ホスホチオエート、２’Ｏ－メチル、メチルホスホネート、ロックド核酸（ＬＮＡ）、
（ＭＯＥ）（メトキシエチル）、ジＰＳおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの骨格修飾。
例えばシスプラチンおよびマイトマイシンＣなどの鎖間架橋試薬物質による、修復オリ
ゴヌクレオチドの架橋。
Ｃｙ３、ＤＹ５４７、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５およびＤＹ６４７などの蛍光色素
との結合。
３．ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる塩基の取り込みによる、修復オリ
ゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションエネルギーの増大（例えば、ＷＯ２００７／０
７３１４９参照）。
４．合成用の構成単位としてヌクレオチドマルチマー（ジマー、トリマー、テトラマー
など）を使用することによる、修復オリゴヌクレオチド合成の質の向上。これによって、
より少ないカップリングステップ、および構成単位からの完全長産物の容易な分離をもた
らす。
５．長鎖修復オリゴヌクレオチド（すなわち、例えば、１個もしくは複数の突然変異ま
たは修復オリゴヌクレオチド中で標的化された２個以上の突然変異を有する、例えば、本
明細書に記載の長さなどの、５５ヌクレオチド長を超える）の使用。
前述の手法の例を表１に与える。
Figure 0007293441000004
Figure 0007293441000005
前述の修飾は、メチル化、５’挿入色素、５’と３’末端に対する修飾、骨格修飾、架
橋剤、環化、および「キャップ」、およびイノシンなどのアナログと１つまたは複数の天
然に存在するヌクレオチドの置換などの、周知のヌクレオチド修飾も含み得る。ヌクレオ
チドの修飾は、アクリジン、アミン、ビオチン、カスケードブルー、コレステロール、Ｃ
ｙ３＠、Ｃｙ５＠、Ｃｙ５．５＠、ダボイル、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、エダ
ンス、６－ＦＡＭ、フルオレセイン、３’－グリセリル、ＨＥＸ、ＩＲＤ－７００、ＩＲ
Ｄ－８００、ＪＯＥ、ホスフェートソラレン、ローダミン、ＲＯＸ、チオール（ＳＨ）、
スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＡＭＣＡ－Ｓ’’、ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ°、マリーナ
ブルー＠、パシフィックブルー＠、オレゴングリーン＠、ローダミングリーン＠、ローダ
ミンレッド＠、ロドールグリーン＠およびテキサスレッド＠の付加を含む。ポリヌクレオ
チド骨格修飾には、メチルホスホネート、２’－ＯＭｅメチルホスホネートＲＮＡ、ホス
ホロチオレート、ＲＮＡ、２’－ＯＭｅＲＮＡがある。塩基修飾には、２－アミノ－ｄＡ
、２－アミノプリン、３’－（ｄｄＡ）、３’ｄＡ（コルジセピン）、７－デアザ－ｄＡ
、８－Ｂｒ－ｄＡ、８－オキソ－ｄＡ、Ｎ６－Ｍｅ－ｄＡ、無塩基部位（ｄスペーサー）
、ビオチンｄＴ、２’－ＯＭｅ－５Ｍｅ－Ｃ、２’－ＯＭｅ－プロピニル－Ｃ、３’－（
５－Ｍｅ－ｄＣ）、３’－（ｄｄＣ）、５－Ｂｒ－ｄＣ、５－１－ｄｕｃ、５－Ｍｅ－ｄ
Ｃ、５－Ｆ－ｄＣ、カルボキシ－ｄＴ、転換可能ｄＡ、転換可能ｄＣ、転換可能ｄＧ、転
換可能ｄＴ、転換可能ｄＵ、７－デアザ－ｄＧ、８－Ｂｒ－ｄＧ、８－オキソ－ｄＧ、Ｏ
６－Ｍｅ－ｄＧ、Ｓ６－ＤＮＰ－ｄＧ、４－メチル－インドール、５－ニトロインドール
、２’－ＯＭｅ－イノシン、２’－ｄｌ、ｏ６－フェニル－ｄｌ、４－メチル－インドー
ル、２’－デオキシネブラリン、５－ニトロインドール、２－アミノプリン、ｄＰ（プリ
ンアナログ）、ｄＫ（ピリミジンアナログ）、３－ニトロピロール、２－チオ－ｄＴ、４
－チオ－ｄＴ、ビオチン－ｄＴ、カルボキシ－ｄＴ、０４－Ｍｅ－ｄＴ、０４－トリアゾ
ール－ｄＴ、２’－ＯＭｅ－プロピニル－Ｕ、５－Ｂｒ－ｄＵ、２’－ｄＵ、５－Ｆ－ｄ
Ｕ、５－ｌ－ｄＵ、０４－トリアゾール－ｄＵがある。前記用語は、ペプチド核酸（ＰＮ
Ａ）、その骨格が糖ではなくＮ－（２－アミノエチル）－グリシン単位からなる擬似ペプ
チドであるＤＮＡアナログも包含する。ＰＮＡはＤＮＡの挙動を模倣し、相補核酸鎖と結
合する。ＰＮＡの中性骨格は、通常得られるものより強い結合と高い特異性をもたらす。
さらに、強力な生体分子ツール、アンチセンスおよび抗原物質、分子プローブおよびバイ
オセンサーを生み出すため、ＰＮＡの独自の化学的、物理的および生物学的性質が利用さ
れている。
オリゴ核酸塩基は、ニック（複数可）、ギャップ（複数可）、修飾オリゴヌクレオチド
骨格、無塩基部位ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド、または他の化学成分を有する可
能性がある。さらなる実施形態では、オリゴ核酸塩基の少なくとも一本の鎖は、少なくと
も１つの他の修飾ヌクレオチド、例えばＭＯＥ（メトキシエチル）などの２’－Ｏ－メチ
ル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル
誘導体と結合した末端ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド
、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基部位ヌクレオチド
（核酸塩基は欠失状態であるかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）（例えば、
Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏ
ｍ／ＧｌｅｎＲｅｐｏｒｔｓ／ＧＲ２１－１４．ｈｔｍｌを参照）、２’－アミノ－修飾
ヌクレオチド、２’－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラ
ミダイト、および非天然塩基含有ヌクレオチドを含む。様々な塩、混合塩および遊離酸型
も含まれる。
好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオエート、キラルホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリ
エステル、メチルおよび３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート
およびキラルホスホネートを含めた他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－
アミノホスホラミダイトおよびアミノアルキルホスホラミダイト、チオノホスホラミダイ
トを含めたホスホラミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリ
エステル、正常３’－５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、
これらの２’－５’結合アナログ、ならびに反転極性を有し１つまたは複数のヌクレオチ
ド間結合が３’－３’、５’－５’または２’－２’結合である骨格がある。反転極性を
有する好ましいオリゴヌクレオチドは、３’の大部分のヌクレオチド間結合に１つの３’
－３’結合、すなわち無塩基であり得る（核酸塩基が欠失状態であるかまたはその代わり
にヒドロキシル基を有する）１つの反転ヌクレオシド残基を含む。結合反転の最も一般的
な用途は、ホスホロチオエート骨格を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの末端への
３’－３’結合の付加である。３’－３’結合は、２個の５’－ＯＨ末端と０個の３’－
ＯＨ末端を有するオリゴヌクレオチドを作製することによって、エクソヌクレアーゼ分解
に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに安定化させる。結合反転は、「逆ホス
ホラミダイト」を使用することによって、オリゴヌクレオチド合成中に特定位置に導入す
ることができる。これらの試薬は５’－ＯＨ位置にホスホラミダイト基、および３’－Ｏ
Ｈ位置にジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を有する。通常、ＤＭＴ保護基は５’－Ｏ
Ｈ位置に存在し、ホスホラミダイト基は３’－ＯＨ位置に存在する。
修飾塩基の例には、２－アミノプリン、２’－アミノ－ブチリルピレン－ウリジン、２
’－アミノウリジン、２’－デオキシウリジン、２’－フルオロ－シチジン、２’－フル
オロ－ウリジン、２，６－ジアミノプリン、４－チオ－ウリジン、５－ブロモ－ウリジン
、５－フルオロ－シチジン、５－フルオロウリジン、５－インド－ウリジン、５－メチル
－シチジン、イノシン、Ｎ３－メチル－ウリジン、７－デアザ－グアニン、８－アミノヘ
キシル－アミノ－アデニン、６－チオ－グアニン、４－チオ－チミン、２－チオ－チミン
、５－ヨード－ウリジン、５－ヨード－シチジン、８－ブロモ－グアニン、８－ブロモ－
アデニン、７－デアザ－アデニン、７－ジアザ－グアニン、８－オキソ－グアニン、５，
６－ジヒドロ－ウリジン、および５－ヒドロキシメチル－ウリジンがあるが、これらだけ
には限られない。これらの合成単位は市販されており（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙから購入可能）、化学合成によりＤＮＡに取り込むことができる。
糖成分の修飾の例は、３’－デオキシ化、２’－フルオロ化、およびアラビノシド化で
あるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。ＤＮＡ中へのこれらの取
り込みも化学合成によって可能である。
５’末端修飾の例は、５’－アミノ化、５’－ビオチニル化、５’－フルオレセイン化
、５’－テトラフルオロフルオレセイン化、５’－チオール化、および５’－ダブシル化
であるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。
３’末端修飾の例は、３’－アミノ化、３’－ビオチニル化、２，３－ジデオキシ化、
３’－チオール化、３’－ダブシル化、３’－カルボキシル化、および３’－コレステリ
ル化であるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。
好ましい一実施形態において、オリゴ核酸塩基は、リンカーを介して５’末端炭素に結
合した５’ブロッキング置換基を含有することができる。リンカーの化学的性質はその長
さ以外は重要ではなく、長さは幾つかの実施形態では少なくとも６原子長でなければなら
ず、リンカーは柔軟性でなければならない。ビオチン、コレステロールもしくは他のステ
ロイドなどの様々な非毒性置換基、または非挿入剤カチオン性蛍光色素を使用することが
できる。オリゴ核酸塩基を作製するのに特に好ましい試薬は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｖａ．（現在ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってＣｙ３（商
標）およびＣｙ５（商標）として販売されている試薬であり、これらは、オリゴヌクレオ
チドへの取り込みによって、３，３，３’，３’－テトラメチルＮ，Ｎ’－イソプロピル
置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニン色素をそれぞれ生成するブ
ロッキングホスホラミダイトである。Ｃｙ３が特に好ましい。インドカルボシアニンがＮ
－オキシアルキル置換状態であるとき、５’末端ホスフェートを有するホスホジエステル
としてオリゴデオキシヌクレオチドの５’末端とそれを好都合に結合させることが可能で
ある。市販のＣｙ３ホスホラミダイトを指示通り使用するとき、生じる５’修飾はブロッ
キング置換基とリンカーからなり、それらはまとめてＮ－ヒドロキシプロピル，Ｎ’－ホ
スファチジルプロピル３，３，３’，３’－テトラメチルインドモノカルボシアニンであ
る。企図される他の色素には、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、スルホローダ
ミン１０１、メロシアニン５４０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５５０２６、Ｃｙ３．５、
Ｄｙ５４７、Ｄｙ５４８、Ｄｙ５４９、Ｄｙ５５４、Ｄｙ５５５、Ｄｙ５５６、Ｄｙ５６
０、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙおよびｍＣｈｅｒｒｙがある。
好ましい実施形態では、インドカルボシアニン色素はインドール環の３および３’位置
でテトラ置換されている。理論について制限されずに、これらの置換基は色素が挿入色素
となるのを妨げる。これらの位置における置換基の同一性は重要ではない。
本明細書に記載するオリゴ設計は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｔｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（
ＴＡＬＥＮｓ）またはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅ
ｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲｓ）による部
位特異的相同組換えを使用する遺伝子標的化だけには限られないが、これらを含めた他の
ＤＮＡ編集または組換え技術と組み合せて、より有効なドナー鋳型としても有用であり得
る。
本開示は、特定の態様および実施形態においては、一般に、ゲノム細胞ＤＮＡの効率的
な修飾および／または細胞のゲノムＤＮＡへのＤＮＡの組換えのための方法に関する。任
意の特定の使用に限られないが、本明細書で提供する幾つかの方法は、特定の実施形態に
おいては、例えば、細胞に対する修飾の効果を決定する目的で細胞のゲノム中に修飾を導
入する際に有用であり得る。例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列に修飾を導入し
て、修飾が酵素の酵素活性を変えるかどうかを決定する、および／または酵素の触媒領域
の位置を決定することができる。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質のコード配列に修飾を
導入して、タンパク質のＤＮＡ結合活性が変わるかどうかを決定することができ、したが
ってタンパク質内の特定ＤＮＡ結合領域をたどることができる。さらに別の代替は、非コ
ード制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、制御ＲＮＡ配列（ｍｉＲＮＡ）な
ど）に修飾を導入して、非コード制御配列と作動可能に連結した第２の配列の発現レベル
に対する修飾の影響を決定することである。これは例えば、制御活性を有する特定配列を
画定するのに望ましい可能性がある。
ＤＮＡ切断剤
標的遺伝子破壊をもたらすための一戦略は、部位特異的エンドヌクレアーゼなどのＤＮ
Ａ切断剤を使用する一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断の発生によるものである。エンドヌク
レアーゼは、藻類、植物、およびヒトを含めた巨大動物モデルなどの、より従来型の遺伝
子標的法の影響を従来受けにくい生物における、標的遺伝子の妨害に最も頻繁に使用され
る。例えば、ＨＩＶ感染を治療および予防するための、ジンクフィンガーヌクレアーゼに
関する現在進行中のヒト臨床試験が存在する。さらに、エンドヌクレアーゼ操作は、穀物
中に望ましくない表現型をもたらす遺伝子を妨害する試みにおいて現在使用されている。
ジンクフィンガー
１クラスの人工エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼである。ジ
ンクフィンガーエンドヌクレアーゼは、非特異的切断ドメイン、典型的にはＦｏｋＩエン
ドヌクレアーゼのドメインと、特異的ＤＮＡ配列と結合するように操作したジンクフィン
ガータンパク質ドメインを組み合せる。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのモジュラ
ー構造によって、それらはゲノムに部位特異的二本鎖切断をもたらす用途の広い基盤とな
る。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼはジマーとして切断するので、オフターゲット切断事象
を予防するための一戦略は、隣接９塩基対部位で結合するジンクフィンガードメインの設
計となっている。それぞれ参照によりそれらの全容が本明細書に組み込まれている米国特
許第７，２８５，４１６号；第７，５２１，２４１号；第７，３６１，６３５号；第７，
２７３，９２３号；第７，２６２，０５４号；第７，２２０，７１９号；第７，０７０，
９３４号；第７，０１３，２１９号；第６，９７９，５３９号；第６，９３３，１１３号
；第６，８２４，９７８号も参照されたい。
ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮは、特異的ＤＮＡ部位への一本鎖および二本鎖切断の誘導に使用される標的
化可能ヌクレアーゼであり、次いでそれらは切断部位に配列変化を作製するのに利用可能
な機構により修復される。
ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合領域を操作するのに使用される基本構成単位は、キサントモナ
ス種プロテオバクテリアによってコードされる、天然に存在するＴＡＬＥ由来の高度に保
存された反復ドメインである。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ結合は、反復単位のアミノ末端と
カルボキシ末端で別のＴＡＬＥ由来ドメインと隣接した、高度に保存された３３～３５ア
ミノ酸反復単位のアレイによって仲介される。
これらのＴＡＬＥ反復単位はＤＮＡの一塩基と特異的に結合し、その同一性は、反復単
位の位置１２と１３に典型的に見られる２つの超可変残基、および所望標的核酸の長さに
相当するアレイ中の反復単位の数、標的核酸配列とマッチするよう選択した反復単位の同
一性によって決定される。幾つかの実施形態では、標的部位の選択性を最大にするため、
標的核酸は１５～２０塩基対である。標的核酸の切断は、典型的にＴＡＬＥＮ結合の５０
塩基対以内で起こる。ＴＡＬＥＮ認識部位設計に関するコンピュータプログラムは当技術
分野で記載されている。例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２０１１ Ｊｕｌｙ；３９（１２）：ｅ８２を参照。
所望標的配列とマッチするよう設計した後、ＴＡＬＥＮを組換えによって発現させ、外
来タンパク質としてプロトプラストに導入し、またはプロトプラスト内でプラスミドから
発現させ、またはｍＲＮＡとして投与することが可能である。
メガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼとしても知られるホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの大きな
（例えば１４ｂｐを超える）切断部位のため、高度の特異性でゲノムＤＮＡにおいて二本
鎖切断を発生させる配列特異的エンドヌクレアーゼである。それらの標的部位に対するホ
ーミングエンドヌクレアーゼの特異性によって誘導型ＤＮＡ切断の正確な標的化が可能に
なるが、ホーミングエンドヌクレアーゼの切断部位は希少であり、標的遺伝子中の本来存
在する切断部位を発見する確率は低い。
別のクラスの人工エンドヌクレアーゼは操作型メガヌクレアーゼである。操作型ホーミ
ングエンドヌクレアーゼは、既存のホーミングエンドヌクレアーゼの特異性を改変するこ
とにより生成する。一手法では、本来存在するホーミングエンドヌクレアーゼのアミノ酸
配列に変異を導入し、次いで生成した操作型ホーミングエンドヌクレアーゼをスクリーニ
ングして、標的結合部位を切断する機能性タンパク質を選択する。別の手法では、キメラ
ホーミングエンドヌクレアーゼを、２つの異なるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部
位を組み合せて各ホーミングエンドヌクレアーゼの半分の部位で構成される新たな認識部
位を作製することによって操作する。例えば、米国特許第８，３３８，１５７号を参照。
ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、３つの基本設計構成要素：１）Ｃａｓ遺伝子、転写物（例
えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質；２）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；ならびに３）外来
ＤＮＡ部位（例えば、内在性ＤＮＡ標的領域）およびＣＲＩＳＰＲ反復単位の一部と相補
的である「プロトスペーサー」領域を担持する、ＣＲＩＳＰＲ反復単位アレイをコードす
るＲＮＡ転写物からプロセッシングされるＲＮＡセグメントであるｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳ
ＰＲ ＲＮＡ）を含有する。例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ／２０１４／０９３６６１号およ
び第ＷＯ／２０１３／１７６７７２号を参照されたい。
Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子、転写物（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質
プラスミドベクターからの一過的Ｃａｓ発現は、Ｃａｓタンパク質の送達を誘導する、
および／または植物細胞へのＣａｓ ｍＲＮＡの送達を誘導する。Ｃａｓ遺伝子は、高等
植物、藻類または酵母における発現のためにコドン最適化され、適用可能な場合、構成的
、誘導性、組織特異的または種特異的プロモーターのいずれかによって駆動される。Ｃａ
ｓ転写物の終結およびポリアデニル化シグナルは、ＮｏｓＴ、ＲＢＣＴ、ＨＳＰ１８．２
Ｔまたは他の遺伝子特異的もしくは種特異的ターミネーターのいずれかである。Ｃａｓ遺
伝子カセットまたはｍＲＮＡは、天然の、または遺伝子特異的プロモーターおよび／もし
くは合成プロモーターと共に、イントロンを含有してもよい。Ｃａｓタンパク質は、１つ
または複数の核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）、突然変異、欠失、変異またはトランケー
ションを含有してもよい。一過的発現系では、Ｃａｓ遺伝子カセットを、同じ一過的発現
ベクター上のｇＲＮＡカセットなどのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の他の構成要素と組み合わ
せることができる。あるいは、Ｃａｓ遺伝子カセットを、ｇＲＮＡカセットとは無関係の
構築物から、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の他の構成要素から配置および発現させるこ
とができる。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子は、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼおよびポ
リメラーゼなどの様々な推定核酸操作活性を有するタンパク質をコードする。Ｃａｓ遺伝
子は、ｃａｓ９を含む。Ｃａｓ９は、推定ＲｕｖＣ様およびＨＮＨエンドヌクレアーゼド
メインを含有する大きいタンパク質をコードする遺伝子であり、ほとんどの古細菌および
多くの細菌に存在するＣＲＩＳＰＲ適応免疫系と関連する。Ｃａｓ９タンパク質は、２つ
のローブからなる：
１）認識（ＲＥＣ）ローブ－３つのドメイン：
ａ）ＢＨ（架橋ヘリックス）
ｂ）ＲＥＣ１－ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡ標的化を容易にする
ｃ）ＲＥＣ２－ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡ標的化を容易にする
からなる；
２）ヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブ－３つのドメイン：
ａ）ＲｕｖＣ－ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡ標的化を容易にする；エンドヌクレ
アーゼ活性
ｂ）ＨＮＨ－エンドヌクレアーゼ活性
ｃ）ＰＩ－ＰＡＭ相互作用
からなる。
他の実施形態では、ｃａｓ遺伝子は、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ、ＲＥＣおよびＢＨドメインが
高度に保存されたｃａｓ９の相同体であり得る。幾つかの実施形態では、ｃａｓ遺伝子は
、以下の種に由来するものである。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡと、トランス活性化Ｃ
ＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列の一部との融合物として操作され、プロト
スペーサー領域と相補的である特定の標的ＤＮＡ配列にＣａｓ９を誘導する。ガイドＲＮ
Ａは、長いトレーサーＲＮＡハイブリッド、短いｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドまたは天
然のＣＲＩＳＰＲアレイ＋ｔｒａｃｒＲＮＡコンフォメーションを有するキメラＲＮＡ設
計を含有する発現カセットを含んでもよい。キメラｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化特異
性と、単一の転写物へのｔｒａｃｒＲＮＡの足場化特性とを組み合わせたものである。ｇ
ＲＮＡの一過的発現は、Ｕ６またはＵ３ ｓｎＲＮＡ遺伝子ファミリー（Ｗａｎｇ ｅｔ
ａｌ ２００８）に由来するものなどの種特異的高等植物ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプ
ロモーターにより制御される。ｇＲＮＡ転写終結は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００８の
ようにポリｄＴの６～２０ヌクレオチドの経路によって制御される。ｇＲＮＡ発現カセッ
トは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の他の構成要素に由来する同じか、または異なる一過的発
現ベクター上に位置する。ｇＲＮＡ転写物をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、ｇＲＮＡ一過的
発現ベクターとは無関係に、またはそれと共に、植物細胞中に直接送達することができる
。
標的領域
ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的領域に対する特異性を定義する２つの構成要素である、プ
ロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含有する。典型的には
、２０ヌクレオチドであるが、ＤＮＡ標的に基づいて変化してもよいプロトスペーサー配
列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体に対するＤＮＡ配列特異性を提供する。ＤＮＡ標的は
また、Ｎがプロトスペーサーのすぐ３’側または下流の任意のヌクレオチドを示す、ＮＮ
ＧまたはＮＡＧトリヌクレオチド配列（ＰＡＭ）も含有する。
１構成要素手法
Ｌｅ Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）その他と同様、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝
子編集に対する単純化された「１構成要素手法」は、単一の一過的発現構築物がＣＲＩＳ
ＰＲ－Ｃａｓ複合体の全ての構成要素、すなわち、ｇＲＮＡとＣａｓ発現カセットの両方
を含有するものである。これにより、任意の所与の植物または作物において単一または複
数の遺伝子座を標的化するための容易なモジュラー設計が可能になる。複数の遺伝子座の
標的化を、単に標的特異的ｇＲＮＡカセット中でスワップすることによって達成すること
ができる。さらに、種特異的プロモーター、ターミネーターまたは他の発現増強エレメン
トを、「１構成要素手法」の一過的ベクター中に、およびそれから外に容易にシャトルし
て、種特異的様式でｇＲＮＡとＣａｓタンパク質の両方の最適な発現を可能にすることが
できる。
２構成要素手法
２構成要素手法においては、ＣａｓおよびｇＲＮＡ発現カセットは、異なる一過的発現
ベクター上に位置する。これにより、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集構成要素の別々の送達が
可能になり、同じ細胞内の異なる比率のｇＲＮＡ：Ｃａｓが可能になる。１構成要素手法
と同様、２構成要素手法もまた、プロモーター、ターミネーターまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃ
ａｓ構成要素の発現に影響する他のエレメントを容易に変化させ、種特異的様式でＤＮＡ
の標的化を可能にする。
抗生物質
別のクラスのエンドヌクレアーゼは、ブレオマイシンファミリーの抗生物質などのＤＮ
Ａ切断糖ペプチドである抗生物質であり、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、
タリソマイシン、ペプレオマイシンおよび本明細書にさらに記載する他のものを含むＤＮ
Ａ切断糖ペプチドである。
他のＤＮＡ修飾分子を標的遺伝子組換えにおいて使用することができる。例えば、ペプ
チド核酸を使用して、１つまたは複数の標的細胞のゲノムに対する修飾を誘導することが
できる（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｅｃｋｅｒ，米国特許第５，
９８６，０５３号を参照）。簡単に言うと、部分的ペプチド骨格を少なくとも含む合成ヌ
クレオチドを使用して、相同ゲノムヌクレオチド配列を標的化する。二重らせんＤＮＡと
の結合によって、またはペプチド核酸と連結した変異原性化学物質を介して、標的ＤＮＡ
配列の修飾および／または組換えが起こるよう誘導する。標的特異性は、標的配列とゲノ
ム配列の間の配列相同性の程度によって決定する。
さらに本開示は、ゲノム配列の修飾を実施するため本明細書で使用する個々の方法に限
られない。実際、幾つかの方法が企図される。例えば、三重ヘリックス形成オリゴヌクレ
オチド（ＴＦＯ）を使用して遺伝子を標的化することができる。ＴＦＯは合成により、例
えばＰＣＲにより、または遺伝子合成装置の使用により作製することができる。さらに、
適切な天然配列が見られる場合、ゲノムＤＮＡからＴＦＯを単離することができる。例え
ばソラレンまたはクロラムブシルだけには限られないがこれらなどの変異原性化学物質と
の結合を含めた、幾つかの方法においてＴＦＯを使用することができる（例えば、Ｈａｖ
ｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７
８７９－７８８３，１９９３；Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ６７：７３２
３－７３３１，１９９３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５
：１７５９－１７６８，１９９５；Ｔａｋａｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６０２－５６０６，１９９１；Ｂｅｌｏ
ｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ２５：３４４０－３４４
４，１９９７を参照）。さらに例えば、ＴＦＯはドナー二本鎖ＤＮＡと結合させることが
可能である（例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７２：１１５
４１－１１５４８，１９９９を参照）。ＴＦＯは誤りがちの修復を誘発するのに十分なア
フィニティーでの結合により作用することもできる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２７１：８０２－８０５，１９９６）。
本明細書に開示される方法は、使用するＤＮＡ修復試薬の性質または型に制約を受ける
必要はない。例えば、このようなＤＮＡ修復試薬はラジカルを放出し、これによってＤＮ
Ａ鎖切断をもたらす。あるいは、試薬はＤＮＡをアルキル化して、複製および転写を遮断
し得る付加体を形成する。別の代替では、試薬は細胞酵素を阻害する架橋または分子をも
たらし、鎖切断をもたらす。オリゴヌクレオチドに結合してＴＦＯを形成するＤＮＡ修復
試薬の例には、インドロカルバゾール、ナフタレンジイミド（ＮＤＩ）、トランスプラチ
ン、ブレオマイシン、シクロプロパピロールインドールのアナログ、およびフェナントジ
ヒドロジオキシンがあるが、これらだけには限られない。特に、インドロカルバゾールは
トポイソメラーゼＩ阻害剤である。これらの酵素の阻害は、鎖切断およびＤＮＡタンパク
質付加体形成をもたらす（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａ
ｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．８，７７７，２０００）。ＮＤＩはグアニンを酸
化することができる光酸化剤であり、これはグアニン残基の部位に突然変異を引き起こす
可能性がある（Ｎｕｎｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，６１９０
，２０００）。ＴＦＯが試薬と結合したとき、トランスプラチンが三本鎖標的中のＤＮＡ
と反応することが示されている。この反応は、突然変異誘発性であるＤＮＡ付加体の形成
を引き起こす（Ｃｏｌｕｍｂｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，２４：４５１９，１９９６）。ブレオマイシンは、放射性模倣体として広
く使用されているＤＮＡ切断物質である。それはオリゴヌクレオチドと結合し、その形式
で切断物質として活性があることが示されている（Ｓｅｒｇｅｙｅｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２３，４４００，１９９５；Ｋａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１６７１５，１９９５）。シクロプロパピロールインド
ールのアナログはＴＦＯと結合し、三本鎖標的配列中のＤＮＡをアルキル化することが示
されている。したがってアルキル化ＤＮＡは、突然変異誘発性である化学的付加体を含有
する（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，２５，５０７７，１９９７）。フェナントジヒドロジオキシンは、光活性化により
ラジカル種を放出する遮蔽キノンである。それらはＴＦＯと結合し、光活性化により二本
鎖ＤＮＡに切断をもたらすことが示されている（Ｂｅｎｄｉｎｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．９，５５５，１９９８）。
修飾および／または組換えを誘導する他の方法は本開示によって企図される。例えば別
の実施形態は、外来ＤＮＡ断片と標的遺伝子の間の、または標的部位に対するアフィニテ
ィーがあるペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用による相同組換えの誘導に関する（例えば、Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８－１２９２，１９８９
を参照）。さらに他の方法は、ポリアミドによる配列特異的ＤＮＡ認識および標的化（例
えば、Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ３：６８
８－６９３，１９９９；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８：２１４３－２１５１，１９９９
を参照）、および部位特異的活性を有するヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガータン
パク質、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲ）の使用を含む。
本開示は、任意の特定の修飾および／または組換え頻度に限られない。幾つかの実施形
態では、本明細書に開示される方法は、標的ヌクレオチド配列において０．２％～３％の
修飾頻度をもたらす。それでもなお、任意の（すなわち、０％と１００％の間の）修飾お
よび／または組換え頻度が本開示の範囲内にあると企図される。修飾および／または組換
え頻度は、修飾および／または組換えを誘導するために使用する方法、使用する細胞型、
特異的標的遺伝子、および存在する場合使用するＤＮＡ突然変異誘発試薬に依存する。さ
らに、修飾および／または組換えを検出するために使用する方法は、検出法における制約
のため、全ての修飾および／または組換えの発生を検出できるわけではない。その上、幾
つかの修飾および／または組換え事象はサイレント状態であり、修飾および／または組換
えが生じた検出可能な指標を与えない可能性がある。サイレント状態の修飾および／また
は組換え事象の検出不能は、修飾および／または組換えの人為的に低い推定値をもたらす
。これらの理由、および他の理由のため、本開示は任意の特定の修飾および／または組換
え頻度に限られる必要はない。一実施形態では、修飾および／または組換え頻度は０．０
１％と１００％の間である。別の実施形態では、修飾および／または組換え頻度は０．０
１％と５０％の間である。さらに別の実施形態では、修飾および／または組換え頻度は０
．１％と１０％の間である。他のさらに別の実施形態では、修飾および／または組換え頻
度は０．１％と５％の間である。
本明細書で使用する用語「突然変異の頻度」は、細胞のゲノム中の標的部位に突然変異
を導入することができるＤＮＡ修飾分子で処置した細胞の集団を言及する際には、ＤＮＡ
修飾分子で処置した細胞の合計数と比較した、標的部位に突然変異を含有する処置集団中
の細胞の数を指す。例えば、細胞のゲノム中の標的部位に突然変異を導入するよう設計し
たソラレン結合ＤＮＡ修飾分子ＴＦＯで処置した細胞の集団に関しては、５％の突然変異
の頻度は、ＴＦＯ－ソラレンで処置した合計１００細胞のうち、５細胞が標的部位に突然
変異を含有することを意味する。
本開示は細胞中のＤＮＡの任意の精度の修飾および／または組換えに限られる必要はな
く、本開示の幾つかの実施形態は、望む結果に応じてより高い精度を必要とすることが企
図される。例えば、遺伝子修復を必要とする特異的配列変化（例えば、特定塩基の変化）
は、遺伝子の妨害のみが必要である遺伝子ノックアウトの発生と比較して、より高い精度
を必要とする。本開示の方法を用いると、従来技術の方法を用いるより、高レベルの修飾
および／または相同組換え技法の精度を得る可能性が高くなる。
植物細胞への遺伝子修復オリゴ核酸塩基の送達
植物細胞を形質転換するのに使用される任意の一般に知られる方法を、遺伝子修復オリ
ゴ核酸塩基の送達に使用することができる。例示的な方法を以下に列挙する。本明細書の
方法および組成物は、１つまたは複数のＤＮＡ修飾試薬を細胞にトランスフェクトするた
めの任意の多くの方法を含んでもよい。１つまたは複数の細胞にＤＮＡ修飾試薬を導入す
るための方法は当技術分野でよく知られており、マイクロインジェクション、エレクトロ
ポレーション、受動吸着、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン仲
介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、リポソーム融合、リポ
フェクション、ヌクレオフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、バイ
オリスティクス（すなわち、パーティクルボンバードメント）などだけには限られないが
、これらを含む。
投射浸透によりセルロース細胞壁を有する植物細胞にＤＮＡの巨大断片を導入するため
の金属製マイクロキャリア（ミクロスフェア）の使用は、当業者にはよく知られている（
以後バイオリスティック送達）。米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，１００，７
９２号および同第５，２０４，２５３号は、それらの投射用マイクロキャリアおよびデバ
イスの選択に関する一般的な技法を記載する。
本明細書に開示される方法におけるマイクロキャリアの使用に関する具体的条件は、国
際公開ＷＯ９９／０７８６５中に記載の条件を含んでもよい。例示的一技法では、氷冷マ
イクロキャリア（６０ｍｇ／ｍＬ）、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド（６０ｍｇ／ｍＬ
）、２．５ＭのＣａＣｌ2および０．１Ｍのスペルミジンをこの順で加え、混合物を軽く
撹拌し、例えば１０分間撹拌し、次いで室温で１０分間放置し、この場合マイクロキャリ
アは５倍体積のエタノールに希釈し、遠心分離し１００％エタノールに再懸濁する。マイ
クロキャリア８～１０μｇ／μＬ、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド１４～１７μｇ／ｍ
Ｌ、ＣａＣｌ2１．１～１．４Ｍおよびスペルミジン１８～２２ｍＭの接着溶液中濃度で
良い結果を得ることができる。マイクロキャリア８μｇ／μＬ、混合型二本鎖オリゴヌク
レオチド１６．５μｇ／ｍＬ、ＣａＣｌ2１．３Ｍおよびスペルミジン２１ｍＭの条件下
で最適な結果を観察した。
細胞壁および細胞膜に浸透させるためのマイクロファイバーを使用して遺伝子修復オリ
ゴ核酸塩基を植物細胞に導入することもできる。Ｃｏｆｆｅｅ ｅｔ ａｌへの米国特許
第５，３０２，５２３号は、ブラックメキシカンスイートトウモロコシの懸濁培養物の形
質転換を容易にするための炭化珪素繊維の使用を記載する。マイクロファイバーを使用し
た植物細胞の形質転換のためのＤＮＡ導入に使用することができる任意の機械的技法を使
用して、トランスミューテーション用の遺伝子修復オリゴ核酸塩基を送達することができ
る。
遺伝子修復オリゴ核酸塩基のマイクロファイバー送達に関する例示的な技法は以下の通
りである。滅菌マイクロファイバー（２μｇ）を、約１０μｇの混合型二本鎖オリゴヌク
レオチドを含有する１５０μＬの植物培養培地に懸濁させる。懸濁培養物を沈殿させ、同
体積の充填細胞および滅菌ファイバー／ヌクレオチド懸濁液を１０分間撹拌し平板培養す
る。個々の形質に適したように、選択培地に直後に、または最大約１２０時間遅らせて施
用する。
代替実施形態では、植物の一部に由来するプロトプラストのエレクトロポレーションに
より、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を植物細胞に送達することができる。当業者によく知ら
れる技法に従い、プロトプラストは植物の一部、特に葉の酵素処置によって形成される。
例えば、Ｇａｌｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９６，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ５５：８９－１０７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔ
ｏｗａ，Ｎ．Ｊ．；Ｋｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１３３：２１３－２２１，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪを参照。エレクトロポレーション前に、プロトプラストを増殖培
地中で培養する必要はない。エレクトロポレーションに関する例示的な条件は、０．３ｍ
Ｌの合計体積中に３００，０００プロトプラスト、および０．６～４μｇ／ｍＬの遺伝子
修復オリゴ核酸塩基濃度である。
代替実施形態では、当業者によく知られる技法に従い、膜修飾物質ポリエチレングリコ
ールの存在下で植物プロトプラストに核酸を取り込ませる。別の代替実施形態では、マイ
クロキャピラリーを用いて植物細胞またはプロトプラストにそれを注入することにより、
遺伝子修復オリゴ核酸塩基を送達することができる。
代替実施形態では、アルギン酸カルシウムで構成されるマイクロビーズ中に核酸を包埋
し、膜修飾物質ポリエチレングリコールの存在下で植物プロトプラストに取り込ませる（
例えば、Ｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００４を参照）
。
代替実施形態では、核酸を水中で凝固させ、マイクロ粒子の型でボンバードメントによ
り植物細胞に導入する（例えば、Ｇｉｌｍｏｒｅ，１９９１，米国特許第５，２１９，７
４６号；Ｂｒｉｎｅｇａｒ ｅｔ ａｌ．を参照）。
代替実施形態では、ナノ粒子と結合した核酸を、ナノ粒子を含有する懸濁液中での細胞
のインキュベーションによって（例えば、Ｐａｓｕｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，２００８
を参照）、またはパーティクルボンバードメントを介して完全細胞にそれらを送達するこ
とにより、または共インキュベーションによりプロトプラストに送達することにより（例
えば、Ｔｏｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００７を参照）、完全植物細胞中に導入する。
代替実施形態では、核酸は浸透ペプチドと複合体形成し、共インキュベーションにより
細胞に送達する（例えば、Ｃｈｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＷＯ２００８１４８２
２３ Ａ１；Ｅｕｄｅｓ ａｎｄ Ｃｈｕｇｈを参照）。
代替実施形態では、エレクトロポレーションを介して完全細胞に核酸を導入する（例え
ば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＵＳ２００３／０１１５６４１Ａｌ，Ｄｏｂｒｅｓ
ｅｔ ａｌ．を参照）。
代替実施形態では、核酸を含む溶液中にそれらを浸すことにより、乾燥胚の細胞に核酸
を送達する（例えば、Ｔｏｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｓｅｎａｒａｔｎａ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９１を参照）か、または他の実施形態では、Ｃｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅ（
ＳＱＺ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により導入する。
植物の選択
様々な実施形態において、本明細書で開示している植物は、高木もしくは低木として成
長する任意の樹木植物種、任意の草本植物種、または可食果実、種子もしくは野菜を生成
する任意の種、または有色もしくは芳香性品種の花を生成する任意の種を含めた、任意の
種の双子葉植物、単子葉植物または裸子植物であってよい。例えば植物は、それらが既に
具体的に言及されていない限り、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワ
タ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、
マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニ
ンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、
フィールドピー、マメ科マメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピ
ナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カ
ンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナ
タネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロー
タス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、ユリ、および
堅果産生植物からなる群の植物種から選択することができる。
植物および植物細胞は、当技術分野で一般的に知られている方法を使用して、例えば除
草剤の存在下で植物または植物細胞を成長させ、除草剤の不在下での成長速度と比較した
成長速度を測定することによって、除草剤に対する抵抗性または耐性に関して試験するこ
とができる。
本明細書で使用する、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な成長
は、対応する植物、植物器官、植物組織、または対象の野生型タンパク質を発現する植物
細胞における成長速度または細胞分裂速度の少なくとも３５％、少なくとも５０％、少な
くとも６０％、または少なくとも７５％である、植物、植物器官、植物組織または植物細
胞の成長速度または細胞分裂速度として定義する。
本明細書で使用する、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な発生
は、対応する植物、植物器官、植物組織、または野生型タンパク質を発現する植物細胞で
起こる事象と実質的に同じ、植物、植物器官、植物組織または植物細胞における１つまた
は複数の発生事象の出現として定義する。
特定の実施形態において、本明細書で提供する植物器官には、葉、茎、根、枝芽、花芽
、分裂組織、胚、子葉、内胚乳、がく片、花弁、めしべ、心皮、おしべ、やく、小胞子、
花粉、花粉管、胚珠、子房および果実、またはこれらから得る切片、薄片もしくは薄板が
あるが、これらだけには限られない。植物組織には、カルス組織、地下組織、脈管組織、
貯蔵組織、分裂組織、葉組織、苗条組織、根組織、菌こぶ組織、植物腫瘍組織、および生
殖組織があるが、これらだけには限られない。植物細胞には、細胞壁を有する単離細胞、
様々な大きさのそれらの凝集体、およびプロトプラストがあるが、これらだけには限られ
ない。
植物に除草剤を施用し、同様に施用した非耐性の同様の植物によって与えられる曲線と
の比較時に右に移動した用量／応答曲線を与えるとき、植物は関連除草剤に実質的に「耐
性がある」。このような用量／応答曲線はＸ軸にプロットされた「用量」、およびＹ軸に
プロットされた「殺傷率」、「除草剤効果」などを有する。耐性植物は、所与の除草剤効
果をもたらすのに、非耐性の同様の植物より多量の除草剤を必要とし得る。除草剤に実質
的に「抵抗性がある」植物は、原野の雑草を殺傷するため農薬散布地域により典型的に利
用される濃度と割合で除草剤を施用すると、示す場合でも、わずかな壊死、溶解、萎黄病
または他の損傷を示す。除草剤に抵抗性がある植物は除草剤耐性でもある。
植物の作製
植物種の様々な組織の組織培養、およびそこからの植物の再生は知られている。例えば
、組織培養によるキャノーラ品種の繁殖は、以下のいずれか、Ｃｈｕｏｎｇ ｅｔ ａｌ
．，「Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ」，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏ
ｒｔｓ４：４－６，１９８５；Ｂａｒｓｂｙ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｒａｐｉｄ
ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｈｙｐｏｃｏｔ
ｙｌ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ」，Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇ，１９９６）；Ｋａｒｔｈａ，Ｋ．，ｅｔ ａ
ｌ．，「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐｌａｎｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｓｔｅｍ Ｅ
ｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｒａｐｅ」，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，３１：２１７－２２
０，１９７４；Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ Ｓｈｏｏｔ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｃｏ
ｔｙｌｅｄｏｎａｒｙ Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａｓ」，Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇ１９８８）；Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｅ．，「Ｍｉｃ
ｒｏｓｐｏｒｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６，Ｃｈａｐｔｅｒ１７，ｐ．１５９，
１９９０だけには限られないが、これらのいずれかに記載されている。
変種のさらなる生殖を組織培養および再生によって行うことができる。ダイズの様々な
組織の組織培養およびそこからの植物の再生は、よく知られており広く公開されている。
例えば、Ｋｏｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｘ Ｓｕｃｒｏ
ｓｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉ
ｓ ｉｎ Ｓｏｙｂｅａｎ」，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３１：３３３－３３７，１９９１；Ｓ
ｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，「Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｅｖａｌｕａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｃｕｌｔｕｒｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｐｌａｎ
ｔｓ」，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８２：６３３－６３５，１９９１；Ｋｏｍ
ａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，「Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｒｍｉｎａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｓ ａｓ Ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｓｕ
ｃｒｏｓｅ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ Ｓｏｙ
ｂｅａｎｓ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｇｒａｃｉｌｉｓ Ｓｋｖｏｒｔｚ ａｎｄ Ｇｌｙｃｉ
ｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒ
ｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ，２８：１０３－１１３，１９９２；Ｄｈｉｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ
．，「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｔｉｌｅ Ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐ
ｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．Ｍｅｒｒ
．）；Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｓｐ
ｏｎｓｅ」、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ１１：２８５－２８９，１９９２；
Ｐａｎｄｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，「Ｐｌａｎｔ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ
Ｌｅａｆ ａｎｄ Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｉｎｅ
ｗｉｇｈｔｉｉ（Ｗ．ａｎｄ Ａ．）ＶＥＲＤＣ．ｖａｒ．ｌｏｎｇｉｃａｕｄａ」，Ｊ
ａｐａｎ Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．４２：１－５，１９９２；ａｎｄ Ｓｈｅｔｔｙ，Ｋ．，ｅ
ｔ ａｌ．，「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｈｏｏｔ Ｏｒｇ
ａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｍｅｒｒｉｌｌ．）ｂｙ Ａｌ
ｌａｎｔｏｉｎ ａｎｄ Ａｍｉｄｅｓ」，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ８１：２４５－
２５１，１９９２を参照することができる。１９９１年６月１８日に発行されたＣｏｌｌ
ｉｎｓ ｅｔ ａｌへの米国特許第５，０２４，９４４号および１９９１年４月１６日に
発行されたＲａｎｃｈ ｅｔ ａｌへの米国特許第５，００８，２００号の開示は、参照
によりそれらの全容が本明細書に組み込まれている。
例示的実施形態
本開示で記載され、本開示の他の場所に提供される態様および実施形態に加えて、特定
の実施形態の以下の非限定的一覧が具体的に企図される。
１．細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、細胞をＤＮＡ切断剤および修
飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
２．ＤＮＡ切断剤およびＧＲＯＮを含む細胞。
３．前記細胞が植物、細菌、酵母、真菌、藻類、および哺乳動物からなる群から選択さ
れる１つまたは複数の種の細胞である、実施形態１または２に記載の方法または細胞。
４．前記細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄａｍｏｎａｓ
ｒｈｉｅｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａ
ｓｓａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓ
ｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｈｕｒｅｊａ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ
ｍａｘ、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔ
ｉｓｓｉｍｕｍ、およびＺｅａ ｍａｙｓからなる群から選択される１つまたは複数の種
の細胞である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５．前記細胞がＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである、実施形態１～４のい
ずれか１つに記載の方法または細胞。
６．前記細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではない酵母細胞
である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７．植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＤＮＡ切断剤
および修飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
８．ＤＮＡ切断剤および修飾ＧＲＯＮを含む植物細胞。
９．植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＤＮＡ切断剤
ならびにＤＮＡおよびＲＮＡを含むＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
１０．ＤＮＡおよびＲＮＡを含むＤＮＡ切断剤を含む植物細胞。
１１．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子
の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号１のノスズメノテ
ッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９
、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置で
、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基で、アセチルコエンザイムＡカルボ
キシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が前記細胞を修飾
ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
１２．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子
の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号１のノスズメノテ
ッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９
、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置で
、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基で、アセチルコエンザイムＡカルボ
キシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が前記細胞をＤＮ
Ａ切断剤および修飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
１３．植物または植物細胞を生成するための方法であって、植物細胞中に、アセチルコ
エンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修
復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）を導入して、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の
番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および
２０８８からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数のアミノ酸位置、ま
たはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むＡＣＣａｓｅタンパク
質を発現するＡＣＣａｓｅ遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む方法。
１４．植物または植物細胞を生成するための方法であって、植物細胞中に、ＤＮＡ切断
剤と、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子に標的突然変異
を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）とを導入して、配列番号１のノスズメノ
テッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７
９、２０８０および２０８８からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数
のアミノ酸位置、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むＡ
ＣＣａｓｅタンパク質を発現するＡＣＣａｓｅ遺伝子を有する植物細胞を生成するステッ
プを含む方法。
１５．配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位に、ま
たはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードす
るアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含む、稔性植物。
１６．配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位に、ま
たはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードす
るアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含む、稔性イネ植
物。
１７．配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位に、ま
たはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードす
るアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含み、配列番号１
のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０
７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位
置、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコ
ードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子をさらに含む
、植物細胞。
１８．配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位に、ま
たはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードす
るアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含み、配列番号１
のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０
７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位
置、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコ
ードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子をさらに含む
、稔性植物。
１９．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子
の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号１のノスズメノテ
ッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似ア
ミノ酸残基でアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変
化を引き起こし、前記方法が前記細胞を修飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
２０．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子
の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号１のノスズメノテ
ッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似ア
ミノ酸残基でアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変
化を引き起こし、前記方法が前記細胞をＤＮＡ切断剤および修飾ＧＲＯＮに曝露するステ
ップを含む方法。
２１．アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の前記突然変
異または変化が、存在する場合、配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシン
からアラニン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからロイシン；配
列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからメチオニン；配列番号１の１７
８１位に対応する位置のイソロイシンからアスパラギン；配列番号１の１７８１位に対応
する位置のイソロイシンからセリン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイ
シンからトレオニン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからバリン
；配列番号１の１７８３位に対応する位置のグリシンからシステイン；配列番号１の１７
８６位に対応する位置のアラニンからプロリン；配列番号１の２０７８位に対応する位置
のアスパラギン酸からグリシン；配列番号１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン
酸からリシン；配列番号１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からトレオニン
；配列番号１の２０７９位に対応する位置のセリンからフェニルアラニン；配列番号１の
２０８０位に対応する位置のリシンからグルタミン酸；配列番号１の２０８８位に対応す
る位置のシステインからフェニルアラニン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシ
ステインからグリシン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからヒスチ
ジン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからリシン；配列番号１の２
０８８位に対応する位置のシステインからロイシン；配列番号１の２０８８位に対応する
位置のシステインからアスパラギン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステイ
ンからプロリン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからグルタミン；
配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからアルギニン；配列番号１の２０
８８位に対応する位置のシステインからセリン；配列番号１の２０８８位に対応する位置
のシステインからトレオニン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインから
バリン；および配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからトリプトファン
からなる群から選択される１つまたは複数を含むアセチルコエンザイムＡカルボキシラー
ゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質をもたらす、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方
法、植物または細胞。
２２．前記植物または細胞が、配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシン
からアラニン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからロイシン；配
列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからメチオニン；配列番号１の１７
８１位に対応する位置のイソロイシンからアスパラギン；配列番号１の１７８１位に対応
する位置のイソロイシンからセリン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイ
シンからトレオニン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからバリン
；配列番号１の１７８３位に対応する位置のグリシンからシステイン；配列番号１の１７
８６位に対応する位置のアラニンからプロリン；配列番号１の２０７８位に対応する位置
のアスパラギン酸からグリシン；配列番号１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン
酸からリシン；配列番号１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からトレオニン
；配列番号１の２０７９位に対応する位置のセリンからフェニルアラニン；配列番号１の
２０８０位に対応する位置のリシンからグルタミン酸；配列番号１の２０８８位に対応す
る位置のシステインからフェニルアラニン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシ
ステインからグリシン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからヒスチ
ジン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからリシン；配列番号１の２
０８８位に対応する位置のシステインからロイシン；配列番号１の２０８８位に対応する
位置のシステインからアスパラギン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステイ
ンからプロリン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからグルタミン；
配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからアルギニン；配列番号１の２０
８８位に対応する位置のシステインからセリン；配列番号１の２０８８位に対応する位置
のシステインからトレオニン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインから
バリン；および配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからトリプトファン
からなる群から選択される１つまたは複数を含むアセチルコエンザイムＡカルボキシラー
ゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質を含む、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の植物も
しくは細胞、または実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法により作製された植物
もしくは植物細胞。
２３．前記植物または植物細胞が、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付
けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８
８からなる群から選択される位置に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基
に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（Ａ
ＣＣａｓｅ）遺伝子を含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の植物もしくは細胞
、または実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法により作製された植物もしくは細
胞。
２４．前記植物または細胞が、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに
基づく２０７８位に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含
むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺
伝子を含み、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１
７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択さ
れる１つまたは複数のアミノ酸位置に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残
基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（
ＡＣＣａｓｅ）遺伝子をさらに含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の植物もし
くは細胞、または実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法により作製された植物も
しくは細胞。
前記ＡＣＣａｓｅの実施形態１１～２４のそれぞれにおいて、方法、植物、細胞、また
は別のものにしても、以下のものがその中での使用のための好適な突然変異である。
Figure 0007293441000006
Figure 0007293441000007
代替的な突然変異は、以下のものに限られないが、それらを含む。
Figure 0007293441000008
実施形態１１～２４に関して、ノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８
１ｍ、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、および２０８０に対応する位置は当業
界で周知であり、適切な配列データベースから容易に入手可能である。例えば、以下の表
は、イネＡＣＣａｓｅ配列中の対応する位置を示す。
Figure 0007293441000009
 ２５．突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物または植物細胞を生成する方法であって
、植物細胞中に、５－エノールピルビルシキメート－３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ
）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）とを導入して、
配列番号２のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ参照配列のアミノ酸配列の番号付けに基
づく９６、９７および１０１からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数
のアミノ酸位置に、またはＥＰＳＰＳ類似体中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むＥＰ
ＳＰＳタンパク質を発現するＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含
む方法。
２６．突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物または植物細胞を生成する方法であって
、植物細胞中に、ＤＮＡ切断剤と、５－エノールピルビルシキメート－３－リン酸シンタ
ーゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ
）とを導入して、配列番号２のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ参照配列のアミノ酸配
列の番号付けに基づく９６、９７および１０１からなる群から選択される位置に対応する
１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはＥＰＳＰＳ類似体中の類似アミノ酸残基に突
然変異を含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現するＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物細胞を生成
するステップを含む方法。
２７．突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物または細胞であって、植物細胞中に、Ｄ
ＮＡ切断剤と、５－エノールピルビルシキメート－３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）
遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）とを導入して、配
列番号２のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ参照配列のアミノ酸配列の番号付けに基づ
く９６、９７および１０１からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数の
アミノ酸位置に、またはＥＰＳＰＳ類似体中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むＥＰＳ
ＰＳタンパク質を発現するＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む
方法により作製される植物または細胞。
２８．植物または植物細胞が、配列番号２の９６位に対応する位置のグリシンからアラ
ニン；配列番号２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシン；配列番号２の
１０１位に対応する位置のプロリンからアラニン；配列番号２の１０１位に対応する位置
のプロリンからセリン；および配列番号２の１０１位に対応する位置のプロリンからトレ
オニンからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置の突然変異を含むＥＰＳ
ＰＳタンパク質を発現する、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の植物もしくは細胞
、または実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法により作製された植物もしくは細
胞。
２９．植物または植物細胞が、配列番号２の９７位に対応する位置のトレオニンからイ
ソロイシンと、配列番号２の１０１位に対応する位置のプロリンからアラニン；配列番号
２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、配列番号２の１０１位に対
応する位置のプロリンからアラニン；配列番号２の９７位に対応する位置のトレオニンか
らイソロイシンと、配列番号２の１０１位に対応する位置のプロリンからセリン；および
配列番号２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、配列番号２の１０
１位に対応する位置のプロリンからトレオニンからなる群から選択される突然変異の組合
せを含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現する、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の植
物もしくは細胞、または実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法により作製された
植物もしくは細胞。
実施形態２５～３０に関して、配列番号２のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ参照配
列の番号付けに基づく９６、９７および１０１に対応する位置は当業界で周知であり、適
切な配列データベースから容易に入手可能である。例えば、米国特許第８，２６８，６２
２号を参照されたい。例えば、以下の表は、アマＥＰＳＰＳ配列中の対応する位置を示す
。
Figure 0007293441000010
Ｅ．ｃｏｌｉのＥＰＳＰＳ配列は、配列：
MESLTLQPIARVDGTINLPGSKTVSNRALLLAALAHGKTVLTNLLDSDDVRHMLNALTALGVSYTLSADRTRCEIIGNGG
PLHAEGALELFLGNAGTAMRPLAAALCLGSNDIVLTGEPRMKERPIGHLVDALRLGGAKITYLEQENYPPLRLQGGFTGG
NVDVDGSVSSQFLTALLMTAPLAPEDTVIRIKGDLVSKPYIDITLNLMKTFGVEIENQHYQQFVVKGGQSYQSPGTYLVE
GDASSASYFLAAAAIKGGTVKVTGIGRNSMQGDIRFADVLEKMGATICWGDDYISCTRGELNAIDMDMNHIPDAAMTIAT
AALFAKGTTRLRNIYNWRVKETDRLFAMATELRKVGAEVEEGHDYIRITPPEKLNFAEIATYNDHRMAMCFSLVALSDTP
VTILDPKCTAKTFPDYFEQLARISQAA
を有するＡｒｏＡである。
アマ遺伝子１の配列は、配列：
MALVTKICGGANAVALPATFGTRRTKSISSSVSFRSSTSPPSLKQRRRSGNVAAAAAAPLRVSASLTTAAEKASTVPEEV
VLQPIKDISGIVTLPGSKSLSNRILLLAALSEGTTVVDNLLNSDDVHYMLGALKTLGLNVEHSSEQKRAIVEGCGGVFPV
GKLAKNDIELFLGNAGTAMRPLTAAVTAAGGNSSYILDGVPRMRERPIGDLVVGLKQLGADVTCSSTSCPPVHVNGQGGL
PGGKVKLSGSISSQYLTALLMAAPLALGDVEIEIVDKLISVPYVDMTLKLMERFGVAVEHSGSWDRFFVKGGQKYKSPGN
AYVEGDASSASYFLAGAAITGGTITVEGCGTSSLQGDVKFAEVLEKMGAKVIWTENSVTVTGPPRDASGRKHLRAVDVNM
NKMPDVAMTLAVVALYADGPTAIRDVASWRVKETERMIAICTELRKLGATVEEGPDYCIITPPEKLNIAEIDTYDDHRMA
MAFSLAACADVPVTIRDPGCTKKTFPDYFEVLERYTKH
を有するｌｃｌ－ｇ４１４５２＿１３３３である。
アマ遺伝子２の配列は、配列：
MAQVTKICGGANAVALPATFGTRRTKSISSSVSFRSSTSPPSLKQRRLLGNVAAAAAAAPLRISASLATAAEKASTVPEE
IVLQPIKDISGIVTLPGSKSLSNRILLLAALSEGKTVVDNLLNSDDVHYMLGALKTLGLNVEHSSEQKRAIVEGRGGVFP
VGKLGKNDIELFLGNAGTAMRPLTAAVTAAGGNSSYILDGVPRMRERPIGDLVVGLKQLGADVSCSSTSCPPVHVNAKGG
LPGGKVKLSGSISSQYLTALLMAAPLALGDVEIEIVDKLISVPYVDMTLKLMERFGVAVEHSGSWDRFFVKGGQKYKSPG
NAYVEGDASSASYFLAGAAITGGTITVEGCGTSSLQGDVKFAEVLEKMGAKVTWTETSVTVTGPPRDASGKKHLRAVDVN
MNKMPDVAMTLAVVALYADGPTAIRDVASWRVKETERMIAVCTELRKLGATVEEGPDYCIITPPEKLSIAEIDTYDDHRM
AMAFSLAACADVPVTIRDPGCTKKTFPDYFEVLERYTKH
を有するｌｃｌ－ｇ４０５４７＿１２７１である。
３０．前記ＤＮＡ切断剤が、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、メガヌク
レアーゼ、およびＤＮＡ切断性抗生物質から選択される１つまたは複数である、実施形態
１～２９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３１．前記ＤＮＡ切断剤がＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮである、実施形態１～３０の
いずれか１つに記載の方法または細胞。
３２．前記ＤＮＡ切断剤がＣＲＩＳＰＲである、実施形態１～３１のいずれか１つに記
載の方法または細胞。
３３．前記ＤＮＡ切断剤がＴＡＬＥＮである、実施形態１～３２のいずれか１つに記載
の方法または細胞。
３４．前記ＤＮＡ切断剤が、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイ
シンおよびペプレオマイシンからなる群から選択される１つまたは複数のＤＮＡ切断性抗
生物質である、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３５．前記ＤＮＡ切断剤がゼオシンである、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の
方法または細胞。
３６．前記ＧＲＯＮが一本鎖である、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法ま
たは細胞。
３７．ＧＲＯＮが、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドである、実施形態１～３６
のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３８．ＧＲＯＮが、５’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを
含む、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３９．ＧＲＯＮが、３’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを
含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４０．ＧＲＯＮが、５’および３’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌク
レオチドを含む、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４１．ＧＲＯＮが、Ｃｙ３基、３ＰＳ基、および２’－Ｏ－メチル基から選択される１
つまたは複数を含む、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４２．ＧＲＯＮがＣｙ３基を含む、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の方法また
は細胞。
４３．ＧＲＯＮが５’末端の第１の塩基にＣｙ３基を含む、実施形態１～４２のいずれ
か１つに記載の方法または細胞。
４４．ＧＲＯＮが３’末端の第１の塩基にＣｙ３基を含む、実施形態１～４３のいずれ
か１つに記載の方法または細胞。
４５．ＧＲＯＮが３ＰＳ基を含む、実施形態１～４４のいずれか１つに記載の方法また
は細胞。
４６．ＧＲＯＮが２個以上の３ＰＳ基を含む、実施形態１～４５のいずれか１つに記載
の方法または細胞。
４７．ＧＲＯＮが３個以上の３ＰＳ基を含む、実施形態１～４６のいずれか１つに記載
の方法または細胞。
４８．ＧＲＯＮが５’末端の第１の塩基に３ＰＳ基を含む、実施形態１～４７のいずれ
か１つに記載の方法または細胞。
４９．ＧＲＯＮが３’末端の第１の塩基に３ＰＳ基を含む、実施形態１～４８のいずれ
か１つに記載の方法または細胞。
５０．ＧＲＯＮが２’－Ｏ－メチル基を含む、実施形態１～４９のいずれか１つに記載
の方法または細胞。
５１．ＧＲＯＮが２つ以上の２’－Ｏ－メチル基を含む、実施形態１～５０のいずれか
１つに記載の方法または細胞。
５２．ＧＲＯＮが、５’末端の第１の塩基に２’－Ｏ－メチル基を含む、実施形態１～
５１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５３．ＧＲＯＮが、５’末端の第１の塩基に２’－Ｏ－メチル基を有し、他の２’－Ｏ
－メチル基を有さない、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５４．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の２個以上の塩基のそれぞれに２’－Ｏ－メチル基
を含む、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５５．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の３個以上の塩基のそれぞれに２’－Ｏ－メチル基
を含む、実施形態１～５４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５６．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の４個以上の塩基のそれぞれに２’－Ｏ－メチル基
を含む、実施形態１～５５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５７．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の５個以上の塩基のそれぞれに２’－Ｏ－メチル基
を含む、実施形態１～５６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５８．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の６個以上の塩基のそれぞれに２’－Ｏ－メチル基
を含む、実施形態１～５７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５９．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の７個以上の塩基のそれぞれに２’－Ｏ－メチル基
を含む、実施形態１～５８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６０．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の８個以上の塩基のそれぞれに２’－Ｏ－メチル基
を含む、実施形態１～５９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６１．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の９個以上の塩基のそれぞれに２’－Ｏ－メチル基
を含む、実施形態１～６０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６２．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の１０個以上の塩基のそれぞれに２’－Ｏ－メチル
基を含む、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６３．ＧＲＯＮが、５’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の
ＲＮＡ塩基を含む、実施形態１～６２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６４．前記ＧＲＯＮが、遺伝子変化のための標的配列に対してゆらぎ塩基対を有する、
実施形態１～６３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６５．前記ＧＲＯＮが１５～６０ヌクレオチド長である、実施形態１～６４のいずれか
１つに記載の方法または細胞。
６６．前記ＧＲＯＮが４１ヌクレオチド長である、実施形態１～６５のいずれか１つに
記載の方法または細胞。
６７．前記ＧＲＯＮが５０～１１０ヌクレオチド長である、実施形態１～６６のいずれ
か１つに記載の方法または細胞。
６８．前記ＧＲＯＮが１０１ヌクレオチド長である、実施形態１～６７のいずれか１つ
に記載の方法または細胞。
６９．前記ＧＲＯＮが１５０～２１０ヌクレオチド長である、実施形態１～６８のいず
れか１つに記載の方法または細胞。
７０．前記ＧＲＯＮが２０１ヌクレオチド長である、実施形態１～６９のいずれか１つ
に記載の方法または細胞。
７１．前記ＧＲＯＮが７０～２１０ヌクレオチド長である、実施形態１～７０のいずれ
か１つに記載の方法または細胞。
７２．前記ＧＲＯＮが７０ヌクレオチド長より長い、実施形態１～７１のいずれか１つ
に記載の方法または細胞。
７３．前記ＧＲＯＮが１００ヌクレオチド長より長い、実施形態１～７２のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
７４．前記ＧＲＯＮが１６５ヌクレオチド長より長い、実施形態１～７３のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
７５．前記ＧＲＯＮが１７５ヌクレオチド長より長い、実施形態１～７４のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
７６．前記ＧＲＯＮが１８５ヌクレオチド長より長い、実施形態１～７５のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
７７．前記ＧＲＯＮが１９５ヌクレオチド長より長い、実施形態１～７６のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
７８．前記ＧＲＯＮが２００ヌクレオチド長より長い、実施形態１～７７のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
７９．前記ＧＲＯＮが２１０ヌクレオチド長より長い、実施形態１～７８のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
８０．前記ＧＲＯＮが２２０ヌクレオチド長より長い、実施形態１～７９のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
８１．前記ＧＲＯＮが２３０ヌクレオチド長より長い、実施形態１～８０のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
８２．前記ＧＲＯＮが２４０ヌクレオチド長より長い、実施形態１～８１のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
８３．前記ＧＲＯＮが２５０ヌクレオチド長より長い、実施形態１～８２のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
８４．前記ＧＲＯＮが２６０ヌクレオチド長より長い、実施形態１～８３のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
８５．前記ＧＲＯＮが２７０ヌクレオチド長より長い、実施形態１～８４のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
８６．前記ＧＲＯＮが２８０ヌクレオチド長より長い、実施形態１～８５のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
８７．前記ＧＲＯＮが２９０ヌクレオチド長より長い、実施形態１～８６のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
８８．前記ＧＲＯＮが３００ヌクレオチド長より長い、実施形態１～８７のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
８９．前記ＧＲＯＮが４００ヌクレオチド長より長い、実施形態１～８８のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
９０．前記ＧＲＯＮが５００ヌクレオチド長より長い、実施形態１～８９のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
９１．前記ＧＲＯＮが６００ヌクレオチド長より長い、実施形態１～９０のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
９２．前記ＧＲＯＮが７００ヌクレオチド長より長い、実施形態１～９１のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
９３．前記ＧＲＯＮが８００ヌクレオチド長より長い、実施形態１～９２のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
９４．前記ＧＲＯＮが９００ヌクレオチド長より長い、実施形態１～９３のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
９５．前記ＧＲＯＮが１０００ヌクレオチド長より長い、実施形態１～９４のいずれか
１つに記載の方法または細胞。
９６．前記植物が、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ
、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、
モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レ
タス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールド
ピー、ソラマメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフ
ラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ラ
イコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシ
ナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャ
ベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、およびユリからなる群から
選択される、実施形態１～９５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
９７．前記植物がキャノーラである、実施形態１～９６のいずれか１つに記載の方法ま
たは細胞。
９８．前記植物がコーンである、実施形態１～９７のいずれか１つに記載の方法または
細胞。
９９．前記植物がメイズである、実施形態１～９８のいずれか１つに記載の方法または
細胞。
１００．前記植物がイネである、実施形態１～９９のいずれか１つに記載の方法または
細胞。
１０１．前記植物がモロコシである、実施形態１～１００のいずれか１つに記載の方法
または細胞。
１０２．前記植物がジャガイモである、実施形態１～１０１のいずれか１つに記載の方
法または細胞。
１０３．前記植物がダイズである、実施形態１～１０２のいずれか１つに記載の方法ま
たは細胞。
１０４．前記植物がアマである、実施形態１～１０３のいずれか１つに記載の方法また
は細胞。
１０５．前記植物がナタネである、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法ま
たは細胞。
１０６．前記植物がキャッサバである、実施形態１～１０５のいずれか１つに記載の方
法または細胞。
１０７．前記植物がヒマワリである、実施形態１～１０６のいずれか１つに記載の方法
または細胞。
１０８．植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＣＲＩＳ
ＰＲおよび修飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
１０９．複数の遺伝子変化を生じる、実施形態１～１０８のいずれか１つに記載の方法
または細胞。
１１０．２つ以上のガイドＲＮＡを使用する、実施形態１～１０９のいずれか１つに記
載の方法または細胞。
１１１．１より多いガイドＲＮＡのそれぞれが遺伝子変化のための異なる標的と相補的
である、実施形態１～１１０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１２．ＣＲＩＳＰＲがニッカーゼを含む、実施形態１～１１１のいずれか１つに記載
の方法または細胞。
１１３．ＤＮＡ切断剤が２つ以上のニッカーゼを含む、実施形態１～１１２のいずれか
１つに記載の方法または細胞。
１１４．２つ以上のニッカーゼが標的核酸配列の反対の鎖上を切断する、実施形態１～
１１３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１５．２つ以上のニッカーゼが標的核酸配列の同じ鎖上を切断する、実施形態１～１
１４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１６．実施形態１～１１５のいずれか１つに記載の方法により作製された、またはそ
の細胞に由来する非トランスジェニック除草剤抵抗性または耐性植物。
１１７．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）
の遺伝子変化または突然変異を有し、オオムギ、メイズ、オートムギ、ライムギ、イネ、
ソルガム、サトウキビ、芝草、およびコムギからなる群から選択される、実施形態１～１
１６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１８．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）
の遺伝子変化または突然変異を有し、１つまたは複数の除草剤に対して抵抗性または耐性
である、実施形態１～１１７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１９．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）
の遺伝子変化または突然変異を有し、１つまたは複数のＡＣＣａｓｅ阻害性除草剤に対し
て抵抗性である、実施形態１～１１８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２０．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）
の遺伝子変化または突然変異を有し、アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロ
プロキシジム、シクロキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、
クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フ
ェノキサプロップ－Ｐ、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップ－Ｐ、ハ
ロキシホップ、ハロキシホップ－Ｐ、イソキサピリホップ、プロパキザホップ、キザロホ
ップ、キザロホップ－Ｐ、トリホップ、ピノキサデン、これらの除草剤のいずれかの農学
的に許容される塩およびエステル、ならびにその組合せからなる群から選択される１つま
たは複数の除草剤に対して抵抗性である、実施形態１～１１９のいずれか１つに記載の方
法または細胞。
１２１．前記植物細胞が５－エノールピルビルシキメート－３－リン酸シンターゼ（Ｅ
ＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、前記植物細胞がコーン、コムギ、イネ、
オオムギ、ソルガム、オートムギ、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、サトウダイコ
ン、ナタネ、キャノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、
アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、リンゴ、レタス、マメ科植物、レンズマ
メ、ブドウおよび芝草からなる群から選択される、実施形態１～１２０のいずれか１つに
記載の方法または細胞。
１２２．前記植物または植物細胞が５－エノールピルビルシキメート－３－リン酸シン
ターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞が少なく
とも１つの除草剤に対して抵抗性である、実施形態１～１２１のいずれか１つに記載の方
法または細胞。
１２３．前記植物または植物細胞が５－エノールピルビルシキメート－３－リン酸シン
ターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞がホスホ
ノメチルグリシンファミリーの除草剤に対して抵抗性である、実施形態１～１２２のいず
れか１つに記載の方法または細胞。
１２４．前記植物または植物細胞が５－エノールピルビルシキメート－３－リン酸シン
ターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞がグリホ
サートに対して抵抗性である、実施形態１～１２３のいずれか１つに記載の方法または細
胞。
１２５．前記植物または植物細胞が５－エノールピルビルシキメート－３－リン酸シン
ターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞がコーン
、コムギ、イネ、オオムギ、ソルガム、オートムギ、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワ
タ、サトウダイコン、ナタネ、キャノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、
タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、リンゴ、レタス、マメ
科植物、レンズマメ、ブドウおよび芝草からなる群から選択される、実施形態１～１２４
のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２６．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１個の対立遺伝子で起こ
る、実施形態１～１２５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２７．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の２個の対立遺伝子で起こ
る、実施形態１～１２６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２８．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の３個の対立遺伝子で起こ
る、実施形態１～１２７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２９．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の４個の対立遺伝子で起こ
る、実施形態１～１２８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３０．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１１、または１２個の対立遺伝子で起こる、実施形態１～１２９の
いずれか１つに記載の方法または細胞。
１３１．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１個の対立遺伝子のノッ
クアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１～１３０のいずれか１つに記載の
方法または細胞。
１３２．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の２個の対立遺伝子のノッ
クアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１～１３１のいずれか１つに記載の
方法または細胞。
１３３．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の３個の対立遺伝子のノッ
クアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１～１３２のいずれか１つに記載の
方法または細胞。
１３４．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の４個の対立遺伝子のノッ
クアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１～１３３のいずれか１つに記載の
方法または細胞。
１３５．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１１、または１２個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失ま
たは挿入を含む、実施形態１～１３４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３６．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１個の対立遺伝子で起こ
り、遺伝子の第２の対立遺伝子が、前記第２の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失
または挿入を含む、実施形態１～１３５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３７．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１個の対立遺伝子で起こ
り、遺伝子の第２の対立遺伝子および第３の対立遺伝子が、前記第２の対立遺伝子および
前記第３の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１～１
３６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３８．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１個の対立遺伝子で起こ
り、遺伝子の第２の対立遺伝子、第３の対立遺伝子、および第４の対立遺伝子が、前記第
２の対立遺伝子、前記第３の対立遺伝子、および前記第４の対立遺伝子のノックアウトを
もたらす欠失または挿入を含む、実施形態１～１３７のいずれか１つに記載の方法または
細胞。
１３９．細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異
および別の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、実施形態１～１３８の
いずれか１つに記載の方法または細胞。
１４０．細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異
および少なくとも１個の他の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、実施
形態１～１３９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１４１．細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異
および少なくとも２個の他の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、実施
形態１～１４０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１４２．細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異
および少なくとも３個の他の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、実施
形態１～１４１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１４３．細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異
および他の全ての対立遺伝子中のノックアウトを含む、実施形態１～１４２のいずれか１
つに記載の方法または細胞。
以下は実施例であり、本明細書に記載する方法および組成物を実施するための手順を例
示するものである。これらの実施例は限定と解釈されるべきではない。
ＧＲＯＮの長さ
Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：１１５－２２
，２００６）は、一ヌクレオチド変化を利用し緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）変異体にお
いて青色蛍光と緑色蛍光を転換する、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子転換を検出するためのレポー
ターシステムを記載する。このレポーターシステムを、モデル種としてシロイヌナズナ（
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）を使用しＧＲＯＮ長修飾後のＧＲＯＮ転換
の効率を評価した、以下の実験中での使用に適合させた。
要約すると、この実施例および後の実施例用に、青色蛍光タンパク質遺伝子の多数のコ
ピーを有するシロイヌナズナ系統を、当業者に知られる方法によって作製した（例えば、
Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ，１９９８を参照）。根部由来分裂組織培養物をこの
系統で樹立し、これをプロトプラスト単離および培養に使用した（例えば、Ｍａｔｈｕｒ
ｅｔ ａｌ．，１９９５を参照）。プロトプラストへのＧＲＯＮ送達は、プロトプラス
トへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介ＧＲＯＮ取り込みによって実施した。Ｆｕ
ｊｉｗａｒａ ａｎｄ Ｋａｔｏ（２００７）によって記載された方法と類似した、９６
ウェル形式を使用する方法を使用した。以下に、そのプロトコールを簡潔に記載する。所
与の体積は、９６ウェルディッシュの個々のウェルに施用した体積である。
１．９６ウェルプレートの各ウェルにおいて、５×１０6細胞／ｍｌで６．２５μｌの
ＧＲＯＮ（８０μＭ）と２５μｌのシロイヌナズナＢＦＰトランスジェニック根部分裂組
織由来プロトプラストを混合する。
２．３１．２５μｌの４０％ＰＥＧ溶液を加えプロトプラストを混合した。
３．処置した細胞を氷上で３０分間インキュベートした。
４．各ウェルに２００μｌのＷ５溶液を加え細胞を混合した。
５．プレートを氷上で３０分間インキュベートし、各ウェルの底部にプロトプラストを
沈殿させた。
６．沈殿したプロトプラスト上の培地２００μｌを除去した。
７．８５μｌの培養培地（ＭＳＡＰ，Ｍａｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を加え
た。
８．プレートは４８時間暗所において室温でインキュベートした。培養培地添加後のＧ
ＲＯＮの最終濃度は８μＭである。
ＧＲＯＮ送達後４８時間で、サンプルをフローサイトメトリーによって分析し、その緑
色蛍光と黄色蛍光が対照プロトプラストのそれと異なるプロトプラストを検出した（ＢＦ
Ｐ０はＢＦＰ標的と比較して変化がない非標的ＧＲＯＮを示し、Ｃはコード鎖設計であり
、ＮＣは非コード鎖設計である）。ＢＦＰ４分子の中心においてＣ→Ｔの１ヌクレオチド
差（コード鎖）またはＧ→Ａのヌクレオチド標的突然変異（非コード鎖）。緑色蛍光はＢ
ＦＰ遺伝子における標的突然変異の導入によって引き起こされ、ＧＦＰの合成をもたらす
。結果は図１中に示す。
表２は、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）遺伝子から緑色蛍光への転換用に設計した、例
示的な１０１量体および２０１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’－３ＰＳ／３’－３ＰＳＧＲＯＮ
の配列を示す。「３ＰＳ」は、５’と３’オリゴ末端それぞれにおける３個のホスホチオ
エート結合を示す。
Figure 0007293441000011
５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮを使用した転換率
この実施例系の目的は、（ＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ成分を有する）ホスホチオエート
（ＰＳ）標識ＧＲＯＮと、５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮの効率を比較することで
ある。５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮは、５’Ｃｙ３フルオロフォア（アミダイト
）および３’ｉｄＣ逆向き塩基を有する。青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）から緑色蛍光へ
の転換を使用して効率を評価した。
個々のファルコンチューブ中（「チューブ」で標識）または９６ウェルプレート（「９
６ウェルディッシュ」で標識）のいずれかにおいてプロトプラストへのＧＲＯＮのＰＥＧ
送達により行った、３つ全ての実施例において、サイトメトリーにより測定して、ＢＦＰ
からＧＦＰへの転換効率において異なるＧＲＯＮの化学的性質の間に有意な差はなかった
（図１）。
４１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’－３ＰＳ／３’－３ＰＳＧＲＯＮと２’－Ｏ－ＭｅＧＲＯ
Ｎの間の比較
この実施例系の目的は、ＤＮＡ切断を誘導するブレオマイシンファミリーのメンバー、
ゼオシン（商標）（１ｍｇ／ｍｌ）の有無の下で、ＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ成分を有す
るホスホチオエート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮと２’－Ｏ－Ｍｅまたは「岡崎フラグメントＧ
ＲＯＮ」の転換効率を比較することである。これらのＧＲＯＮの設計は図２中に示す。Ｇ
ＲＯＮはＰＥＧ処置によりシロイヌナズナＢＦＰプロトプラストに送達し、ＢＦＰからＧ
ＦＰへの転換は処置後２４時間でサイトメトリーにより測定した。ゼオシン（１ｍｇ／ｍ
ｌ）で処置したサンプルは、ＰＥＧ処置前に氷上で９０分間ゼオシンとインキュベートし
た。
一般に、サイトメトリーにより測定して、ゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在によってＢ
ＦＰからＧＦＰへの転換は増大した（表３）。ゼオシンの存在下と不在下の両方で、ＧＲ
ＯＮの５’末端における第１のＲＮＡ塩基上に１つの２’－ＯＭｅ基を含有するＮＣ岡崎
フラグメントＧＲＯＮは、第１の９個の５’ＲＮＡ塩基のそれぞれに１つの２’－ＯＭｅ
基を含有するＮＣ岡崎フラグメントＧＲＯＮと比較したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの転換
においてより有効であった（図２および表３）。
全ての実施例において、サイトメトリーにより測定して、１ｍｇ／ｍｌのゼオシンの存
在下と不在下の両方でＢＦＰからＧＦＰへの転換において、４１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’
３ＰＳ／３’３ＰＳと、第１の５’ＲＮＡ塩基上に１つの５’２’－Ｏｍｅ基を含有する
７１量体岡崎フラグメントＢＦＰ４／ＮＣＧＲＯＮ（ＢＦＰ４７１量体（１）ＮＣと示す
）の間に有意な差はなかった（図２および表３）。ゼオシン（およびおそらくブレオマイ
シン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよびこの抗生物質ファミリ
ーの他のメンバー）の存在下において、転換は鎖非依存的になる（すなわち、これらの実
施例中で試験した設計を有するコード（Ｃ）ＧＲＯＮと非コード（ＮＣ）ＧＲＯＮの両方
がほぼ同じ活性を示す）ことを記すことは重要である。
Figure 0007293441000012
Figure 0007293441000013
４１量体、１０１量体、および２０１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’－３ＰＳ／３’－３ＰＳ
ＧＲＯＮの間の比較
この実施例系の目的は、（ゼオシンの有無の下で）、異なる長さのＧＲＯＮの各末端に
３ＰＳ成分を有するホスホチオエート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮの転換効率を比較することで
あった。４１量体、１０１量体、および２０１量体を表２中に示す。再度、サイトメトリ
ーにより測定して、ゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在によってＢＦＰからＧＦＰへの転換
率は増大した（表４）。３つの実施例全てにおける大まかな傾向は、ゼオシンの存在下と
不在下の両方でＮＣＧＲＯＮ長の増大に比例した。ゼオシン存在下でのＢＦＰ－４／ＮＣ
／１０１とＢＦＰ－４／Ｃ／１０１以外、これは４１量体ＮＣＧＲＯＮとほぼ等しいがそ
れよりは低い転換率を有していた。これは、ＢＦＰ－４／４１コードおよび非コードＧＲ
ＯＮを使用した前の全ての実施例とは対照的であり、この場合非コードＧＲＯＮは常にコ
ードＧＲＯＮより優れていた。転換頻度のこの非対称性は、この実施例系で使用したＢＦ
Ｐ－４／２０１ＧＲＯＮにも当てはまった。
Figure 0007293441000014
Ｃａｓ９タンパク質の植物への送達
本実施例は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ発現プラスミドの送達の代替として、植物細胞への
組換えＣａｓ９タンパク質の直接送達を利用するものである。この方法は、細胞浸透ペプ
チド（ＣＰＰ）、トランスフェクションリポソーム試薬、ポリ（エチレングリコール）（
ＰＥＧ）などの担体を、単独で、または組み合わせて用いて、活性組換えＣａｓ９タンパ
ク質の細胞への送達を可能にする。
方法
誘導根部組織由来ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎ
ａプロトプラストを、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度でウェルあたり２５０，０００個
の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種する。次いで、２０：１、１０：または５：１
その他のＣＰＰとカーゴの比でＣＰＰ（例えば、ＴＡＴ、ペネトラチン、Ｃｈａｒｉｏｔ
（商標）、ＰＥＰ－１またはその他）で予め被覆された、またはリポソーム試薬と共に封
入された蛍光タグ付き組換えＣａｓ９タンパク質（１μｇ）を、播種されたプロトプラス
トと混合し、２３℃で２～６時間インキュベートして、Ｃａｓ９／担体複合体を細胞に浸
透させる。別の一連の処理において、上記のようにＣＰＰで予め被覆された、または被覆
されていない蛍光タグ付き組換えＣａｓ９タンパク質（１μｇ）を、ＰＥＧ法を使用して
プロトプラストに導入する。次いで、プロトプラストを、処理の２４時間後にフローサイ
トメトリーによって分析して、所与の処理内でのＣａｓ９陽性プロトプラストの割合を決
定した。
２０１量体±ゆらぎ塩基ＧＲＯＮを含むＣＲＩＳＰＲ
この一連の実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのＣＲＩ
ＳＰＲおよび変換を仲介するための２０１量体ＧＲＯＮを使用して本発明者らのＡｒａｂ
ｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＢＦＰトランスジェニックモデル系におけるＢＦＰ
からＧＦＰへの変換を証明することである。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲは、ｂｆｐ遺伝子のコ
ード鎖を標的とし、変換部位はＰＡＭ配列の２７ｂｐ上流にある（図３）。ＧＲＯＮを鋳
型として使用して、ＣＲＩＳＰＲにより作出されたｂｆｐ遺伝子中の二本鎖切断を修復し
、標的遺伝子をＢＦＰからＧＦＰへ変換することと共に、同様に、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲ
のＰＡＭ配列に対応するｂｆｐ遺伝子中にゆらぎ塩基を導入する。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲ
のＰＡＭ配列中のゆらぎ塩基は、一度、変換が起こったら、ＣＲＩＳＰＲによるｂｆｐ遺
伝子の再切断を最小化すると仮定される。この一連の実施例は、変換されたｂｆｐ遺伝子
中のＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列中へのゆらぎ塩基の導入が変換効率を高めるか、
またはそうでないかに対処するのに役立つ。
方法
誘導根部組織由来ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎ
ａプロトプラストを、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度でウェルあたり２５０，０００個
の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは
、ｒｂｃＳＥＣ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するマンノピンシンタ
ーゼ（ＭＡＳ）プロモーターおよびポリ－Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動
するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｕ６プロモーターを含有する。ＧＲＯＮと共にＣＲＩＳＰ
Ｒプラスミドを、それぞれ、０．０５μｇ／μｌおよび０．１６μＭの最終濃度でＰＥＧ
仲介性送達によりプロトプラスト中に導入した。プロトプラストを、２３℃で７２時間、
暗室中でインキュベートした後、それらをフローサイトメトリーによって分析して、所与
の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。
ＣＲＩＳＰＲは、２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コド
ン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ
９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と
、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は
、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列
を含有する。本実施例では、ＢＦＰはｂｇｐ遺伝子を標的とする（図３）。ゆらぎ塩基を
含む、または含まないＢＦＰを標的とする２０１量体ＧＲＯＮを用いて、ＢＦＰからＧＦ
Ｐへの変換の速度に対するそれらの効果を決定した。表５は、ＧＲＯＮとその対応する配
列の一覧を与える。
Figure 0007293441000015
結果
ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを使用した場合、ゆらぎ塩基を含むＢＦＰ４／Ｃ ＧＲＯＮは、
ゆらぎ塩基を含まないＢＦＰ４／Ｃ ＧＲＯＮと比較したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの変
換において最大で３．５倍効率的である（表６）。ゆらぎ塩基を含むＢＦＰ４／Ｃ ＧＲ
ＯＮを、ゆらぎ塩基を含むＢＦＰ４／ＮＣ ＧＲＯＮの代わりに使用する場合、ＢＦＰか
らＧＦＰへの変換の最大で５．９倍の増大が存在する（表６）。したがって、ゆらぎ塩基
を含むＢＦＰ４／Ｃ ＧＲＯＮは、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲと共に使用した場合、ＢＦＰか
らＧＦＰへの変換において最も効率的である。
結論
変換された標的遺伝子中のＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列を変化させるＧＲＯＮ中
にゆらぎ塩基を含有させることは、ＢＦＰからＧＦＰへの変換を増大させる。ゆらぎに基
づくＧＲＯＮと共にＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲによるＢＦＰからＧＦＰへの変換を、次世代配
列決定により確認した（データは示さない）。さらに、ＤＮＡを切断し、ｂｆｐ遺伝子中
にインデルを生成するＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲの能力を、次世代配列決定により確認した（
データは示さない）。
Figure 0007293441000016
Ｃｙ３修飾されたＧＲＯＮを含むＣＲＩＳＰＲ
この一連の実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためにＣＲＩ
ＳＰＲおよび変換を仲介するためにＧＲＯＮを使用して、本発明者らのＡｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＢＦＰトランスジェニックモデル系におけるＢＦＰからＧＦ
Ｐへの変換を証明することである。これらの実施例において使用されたＢＦＰ６ ＣＲＩ
ＳＰＲ（ＣＲ：ＢＦＰ６）は、ｂｆｐ遺伝子を標的とし、変換部位の近くでＤＮＡの二本
鎖切断を引き起こす。ＢＦＰ６ ＣＲＩＳＰＲと共に使用されるＧＲＯＮは、変換部位の
周囲にｂｆｐ遺伝子のコード配列を含有し、Ｃｙ３については５’末端で、およびｉｄＣ
逆向き塩基については３’末端で標識され、ここでは、Ｃｙ３ ＧＲＯＮと呼ばれる。こ
れらのＧＲＯＮを、４１量体、１０１量体および２０１量体の３つの異なる長さで試験し
、それらを、それらがＧＲＯＮの５’末端と３’末端の両方に３ホスホチオエート結合を
有する点でのみＣｙ３ ＧＲＯＮと異なる３ＰＳ ＧＲＯＮと直接比較する。これらのＧ
ＲＯＮを、本明細書では３ＰＳ ＧＲＯＮと呼ぶ。これらの実施例において使用されたＧ
ＲＯＮの一覧については表７を参照されたい。
方法
誘導根部組織由来ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎ
ａプロトプラストを、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度でウェルあたり２５０，０００個
の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは
、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーター
およびポリ－Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ Ｕ６プロモーターを含有する。ＧＲＯＮと共にＣＲＩＳＰＲプラス
ミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌならびに４１量体については８．０
μＭ、１０１量体については０．３２μＭおよび２０１量体ＧＲＯＮについては０．１６
μＭの最終濃度でＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。ＧＲＯＮ処理
は単独で、４１量体については８．０μＭ、１０１量体については５．０μＭおよび２０
１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラス
トを、２３℃で７２時間、暗室中でインキュベートした後、それらをフローサイトメトリ
ーによって分析して、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。
ＣＲＩＳＰＲは、２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コド
ン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ
９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と
、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は
、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列
を含有する。本実験では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰ６ ＣＲＩＳＰＲ（５’ＧＧ
ＴＧＣＣＧＣＡＣＧＴＣＡＣＧＡＡＧＴＣＧＧ３’）を使用した。ＧＲＯＮは、変換部位
の近くにｂｆｐ遺伝子のコード配列を含有する。表７は、使用したＧＲＯＮの一覧を与え
る。
Figure 0007293441000017
結果
ＢＦＰ６ ＣＲＩＳＰＲを用いた場合、試験した全ての長さにおいて、Ｃｙ３ ＧＲＯ
Ｎは３ＰＳ ＧＲＯＮと同程度に効率的にＢＦＰからＧＦＰへの変換を仲介することがで
きる（図４）。全体として、ＢＦＰ６ ＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮを含有するサンプル
は、ＧＲＯＮのみのサンプルと比較したとき、より高レベルのＢＦＰからＧＦＰへの変換
を有し（図４）、ＣＲＩＳＰＲが変換速度の増大に対して有する陽性の影響を証明してい
る。
様々なサイズのＧＲＯＮを含むＣＲＩＳＰＲ
この一連の実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのＣＲＩ
ＳＰＲおよび変換を仲介するための様々な長さのＧＲＯＮを使用して、本発明者らのＡｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＢＦＰトランスジェニックモデル系においてＢ
ＦＰからＧＦＰへの変換を証明することである。これらの実施例において使用されたＢＦ
Ｐ ＣＲＩＳＰＲはｂｆｐ遺伝子を標的とし、変換部位の近くでＤＮＡ中の二本鎖切断を
引き起こす。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲと共に使用したＧＲＯＮは、変換部位の周囲にｂｆｐ
遺伝子のコード配列を含有し、５’末端と３’末端の両方において３ホスホチオエート結
合で標識され、本明細書では３ＰＳ ＧＲＯＮと呼ばれる。これらのＧＲＯＮを６０量体
、１０１量体および２０１量体の３つの異なる長さにおいて試験し、それらを、ＧＲＯＮ
のみの処理と直接比較する。これらの実施例において使用されたＧＲＯＮの一覧について
は、表８を参照されたい。
方法
誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌ
ｉａｎａプロトプラストを、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，
０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラ
スミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロ
モーターおよびポリ－Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｕ６プロモーターを含有する。ＧＲＯＮと一緒にＣＲＩＳ
ＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌならびに６０量体につい
ては０．５４７μＭ、１０１量体については０．３２μＭおよび２０１量体ＧＲＯＮにつ
いては０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入し
た。ＧＲＯＮ処理は単独で、６０量体については７．５μＭ、１０１量体については５．
０μＭおよび２０１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受け
た。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、それらをフロー
サイトメトリーによって分析して、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決
定した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン
最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９
）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を
含有する。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列は、５’ＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡ
ＴＧＴＧＧＴ３’である。本実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰ ＣＲＩＳＰ
Ｒを使用した。ＧＲＯＮは、変換部位の近くにｂｆｐ遺伝子のコード配列を含有する。表
８は、使用したＧＲＯＮの一覧を与える。
Figure 0007293441000018
結果
ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを用いた場合、１０１ｎｔ以上の長さのＧＲＯＮは、６０ｎｔ長
のＧＲＯＮと直接比較したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の媒介において良好である（
図５）。全体として、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮを含有するサンプルは、ＧＲ
ＯＮのみのサンプルと比較したとき、より高レベルのＢＦＰからＧＦＰへの変換を有し（
図５）、ＣＲＩＳＰＲが変換速度の増大に対して有する陽性の影響を証明している。この
データはさらに、ＣＲＩＳＰＲと一緒に使用したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の媒介
において最も効率的であるＧＲＯＮの長さは、１０１ｎｔ以上の長さである必要があるこ
とを示している。
２’－Ｏ－Ｍｅ ＧＲＯＮを含むＣＲＩＳＰＲ
本実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲお
よび変換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、本発明者らのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ ＢＦＰトランスジェニックモデル系においてＢＦＰからＧＦＰへの変
換を証明することである。本実施例において使用されたＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲはｂｆｐ遺
伝子を標的とし、変換部位の近くでＤＮＡ中の二本鎖切断を引き起こす。ＢＦＰ ＣＲＩ
ＳＰＲと共に使用したＧＲＯＮは、変換部位の周囲にｂｆｐ遺伝子のコード配列または非
コード配列を含有し、ＧＲＯＮの最初の１０個の５’塩基はＤＮＡ塩基ではなくＲＮＡ塩
基である。これらのＲＮＡ塩基を、図６に記載されるように、最初の５’ＲＮＡ塩基また
は最初の９個の５’ＲＮＡ塩基のいずれかにおいて２’－Ｏ－Ｍｅ基で標識する。これら
のＧＲＯＮを本明細書では２’－Ｏ－Ｍｅ ＧＲＯＮと呼び、ＧＲＯＮの５’末端と３’
末端の両方に３ホスホチオエート結合を有するＤＮＡ塩基を含有する同様の長さの３ＰＳ
ＧＲＯＮと直接比較する。これらのＧＲＯＮは、本明細書では３ＰＳ ＧＲＯＮと呼ば
れる。本実施例において使用されたＧＲＯＮの一覧については、表９を参照されたい。
方法
誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌ
ｉａｎａプロトプラストを、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，
０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラ
スミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロ
モーターおよびポリ－Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｕ６プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰ
Ｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合
物である。ＧＲＯＮと一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０
５μｇ／μｌならびに７１量体については０．５μＭおよび２０１量体ＧＲＯＮについて
は０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。
ＧＲＯＮ処理は単独で、７１量体については５．０μＭおよび２０１量体については２．
５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で
７２時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与
の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン
最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９
）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を
含有する。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列は、５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴ
ＣＡＣＣＣＡ３’である。本実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰ ＣＲＩＳＰ
Ｒを使用した。ＧＲＯＮは、変換部位の近くにｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード
配列を含有する。表９は、使用したＧＲＯＮの一覧を示す。
Figure 0007293441000019
結果
ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを使用した場合、７１量体および２０１量体の２’－Ｏ－Ｍｅ
ＧＲＯＮは、（０）、（１）または（９）の様々な異なる型のＧＲＯＮ保護と比較したと
き、類似するＢＦＰからＧＦＰへの変換を有していた（図７および図８）。２’－Ｏ－Ｍ
ｅ ＧＲＯＮは、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを使用した場合、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の媒
介においてその３ＰＳ ＧＲＯＮ相当物よりも効率的である（図７および図８）。
ＧＲＯＮを導入したＣＲＩＳＰＲニッカーゼ
本実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖ニックを作出するためのＣＲＩＳＰＲ
および変換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、本発明者らのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ ＢＦＰトランスジェニックモデル系においてＢＦＰからＧＦＰへの
変換を証明することである。本実施例において使用されたＢＦＰ１ ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲ
：ＢＦＰ１）はｂｆｐ遺伝子を標的とし、それぞれ、ガイドＲＮＡと相補的または非相補
的なＤＮＡ鎖上の変換部位の近くでＤＮＡ中の一本鎖ニックを引き起こす触媒残基中に突
然変異（ＲｕｖＣ中ではＤ１０ＡおよびＨＮＨ中ではＨ８４０Ａ）を含有する。これらの
ＣＲＩＳＰＲを、本明細書ではＢＦＰ１ ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＤ１０ＡおよびＢＦＰ
１ ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＨ８４０Ａと呼び、別々のプラスミド上で単独で、またはＢ
ＦＰ５ ｓｇＲＮＡと一緒に使用する。本実施例において複数のＣＲＩＳＰＲニッカーゼ
を使用する場合、それらは同じＤＮＡ鎖または反対のＤＮＡ鎖をニックすることができる
。Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａのいずれかの同じ突然変異を含有する両方のＣａｓ９タンパ
ク質を一緒に使用する場合、それらはＤＮＡの同じ鎖をニックする。逆に、２つのＣａｓ
９タンパク質を一緒に使用し、それらの一方がＤ１０Ａ突然変異を含有し、他方の１つが
Ｈ８４０Ａ突然変異を含有する場合、それらはＤＮＡの反対の鎖をニックする。ニッカー
ゼＣＲＩＳＰＲと共に使用したＧＲＯＮは、ＢＦＰ５ ＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列中に位
置する１つのゆらぎ塩基と共に、変換部位の周囲にｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コ
ード配列のいずれかを含有する。これらのＧＲＯＮは、５’末端と３’末端の両方に３ホ
スホチオエート結合を有し、本明細書では３ＰＳ ＧＲＯＮと呼ばれる。これらの実施例
で使用されたＧＲＯＮの一覧については、表１０を参照されたい。ニッカーゼＣＲＩＳＰ
Ｒを、ｂｆｐ遺伝子のＤＮＡ中で標的二本鎖切断を引き起こすことができるそのＣＲＩＳ
ＰＲ相当物と直接比較する。
方法
誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌ
ｉａｎａプロトプラストを、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，
０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラ
スミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロ
モーターおよびポリ－Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｕ６プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰ
Ｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合
物である。Ｃａｓ９遺伝子は、触媒残基中に突然変異、ＲｕｖＣ中ではＤ１０ＡまたはＨ
ＮＨ中ではＨ８４０Ａを含有する。ＧＲＯＮと一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩ
ＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌおよび２０１量体については０．１６μＭの最終濃
度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。ＧＲＯＮ処理は単独で、
２０１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプ
ラストを暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、それらをフローサイトメータ
ーによって分析して、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン
最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９
）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を
含有する。本実施例では、変換部位の近くのｂｆｐ遺伝子の異なる領域を標的とするＢＦ
Ｐ１およびＢＦＰ５ ｓｇＲＮＡを使用した。ＢＦＰ１スペーサー（５’ＣＴＣＧＴＧＡ
ＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’）はｂｆｐ遺伝子のコード鎖を標的とするが、ＢＦＰ５
スペーサー（５’ＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＴ３’）は非コード鎖を標的
とする。ＧＲＯＮは、変換部位の近くにｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード配列を
含有する。表１０は、使用したＧＲＯＮの一覧を示す。
Figure 0007293441000020
結果
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは両方とも（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）、ＢＦＰ１ ＣＲＩ
ＳＰＲおよびＢＦＰ５ ＣＲＩＳＰＲを別々ではなく一緒に使用したとき、ＢＦＰからＧ
ＦＰへの変換を仲介するのにより効率的である（図９）。さらに、ＢＦＰ１およびＢＦＰ
５ Ｄ１０Ａ ＣＲＩＳＰＲニッカーゼをＣ／２０１ １Ｗ ＧＲＯＮと一緒に使用する
場合、ＢＦＰからＧＦＰへの変換は、これらのＣＲＩＳＰＲニッカーゼをＮＣ／２０１
１Ｗ ＧＲＯＮと共に使用する処理と比較したとき、有意により高い（図９）。ＢＦＰ１
およびＢＦＰ５ Ｈ８４０Ａ ＣＲＩＳＰＲニッカーゼを一緒に使用する場合、Ｃ／２０
１またはＮＣ／２０１ １Ｗ ＧＲＯＮのいずれかに関して、大まかに同レベルのＢＦＰ
からＧＦＰへの変換が観察される（図９）。ＢＦＰからＧＦＰへの変換のこれらのレベル
は、ＢＦＰ５ ＣＲＩＳＰＲを単独で使用するときよりもわずかに高く、ＢＦＰ１ ＣＲ
ＩＳＰＲを単独で使用するときよりもわずかに低い（図９）。
複数の遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲの使用
本実施例の目的は、標的遺伝子中の二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲおよび変
換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａモ
デル系に由来するプロトプラストの所与の集団において同時的に複数の遺伝子の変換を証
明することである。本実施例において使用されたＣＲＩＳＰＲは、プロトプラスト中に、
Ｃａｓ９遺伝子ならびにＢＦＰ遺伝子とアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝
子の両方を標的化する複数のｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを導入することによって
、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａゲノム中のこれらの２つの異なる遺伝子を
標的とする。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒ
ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。これにより、Ｃａｓ９は、その変換を仲
介するＧＲＯＮの存在下でＢＦＰ遺伝子とＡＨＡＳ遺伝子の両方における二本鎖切断を引
き起こすことができる。
方法
誘導根部組織に由来するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを
、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６
ウェルプレート上に播種する。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９タ
ーミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ－Ｔ１
０ターミネーターと共に複数の異なるｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔ
ｈａｌｉａｎａ Ｕ６プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（
ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。Ｇ
ＲＯＮと一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌ
および２０１量体については０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロ
トプラスト中に導入する。ＧＲＯＮ処理は単独で、２０１量体については２．５μＭのＰ
ＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間イ
ンキュベートした後、それらをフローサイトメーターおよび対立遺伝子特異的ＰＣＲアッ
セイによって分析して、所与の処理内のそれぞれＢＦＰからＧＦＰへ変換されたプロトプ
ラストおよびＡＨＡＳ変換されたプロトプラストの両方の割合を決定した。
対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイでは、ゲノムＤＮＡの５，０００個のゲノム等価物の
１０～１６個の複製物を、一次ＰＣＲ反応において使用した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じか、または複数のプラスミドから発現さ
れた、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ
９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（
ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃ
ｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペー
サー配列を含有する。本実施例では、異なるｓｇＲＮＡおよびＧＲＯＮを使用して、その
変換部位の近くの複数の遺伝子を標的化する；ＢＦＰスペーサー（５’ＣＴＣＧＴＧＡＣ
ＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’）およびＡＨＡＳスペーサー（５’ＴＧＧＴＴＡＴＧＣＡ
ＡＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＧＣ３’）。表１１は、使用したＧＲＯＮを記載する。
Figure 0007293441000021
結果
ＢＦＰからＧＦＰへの変換およびＡＨＡＳ変換を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌ
ｉａｎａ ＢＦＰトランスジェニック系統へのＢＦＰおよびＡＨＡＳ ＣＲＩＳＰＲプラ
スミドならびにＢＦＰ／Ｃ ２０１量体およびＡＨＡＳ（Ｗ）５７４／ＮＣ ２０１量体
ＧＲＯＮのＰＥＧ送達の１４４時間後に決定した。フローサイトメトリーデータは、処理
１が０．２０％のＢＦＰからＧＦＰへの変換をもたらすことを示していた（表１２）。対
立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイは、処理１が０．０１％のＡＨＡＳ変換されたプロトプラ
ストをもたらすことを示していた（表１２）。ＧＲＯＮのみの処理は、両アッセイを使用
した場合、最小の変換を示した（表１２）。本実施例は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈ
ａｌｉａｎａ ＢＦＰモデル系に由来するプロトプラストの所与の集団内の２つの独立し
た標的遺伝子（ＢＦＰおよびＡＨＡＳ）の同時的変換の成功を証明する。
Figure 0007293441000022
植物細胞へのＣａｓ９ ｍＲＮＡの送達
本実施例は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ発現プラスミドの送達に対する代替手段として植物
細胞への組換えＣａｓ９ ｍＲＮＡの直接送達を利用する。この方法は、（１）修飾ｍＲ
ＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの合成および（２）植物細胞へのこの修飾ｍＲＮＡの送達を含
む。
方法
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、５’ＵＴＲ、タンパク質のコード配列（ＣＤＳ）および３’Ｕ
ＴＲを含む線状化プラスミド鋳型に由来するＴ７、Ｔ３またはＳＰ６などのＲＮＡポリメ
ラーゼを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる。１つのＲＮＡポリメラーゼは、別の
ものよりも良好な特定の修飾ヌクレオシドを含有してもよい。５’ＵＴＲは、Ｃ型肝炎ウ
イルスのＭｉＲ－１２２などのその安定性を改善するエレメントを含有してもよい（Ｓｈ
ｉｍａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの合成は、保護的であ
り、標的植物細胞中での良好な翻訳を確保するヌクレオシドを含む。組換えＣａｓ９ ｍ
ＲＮＡは捕捉され、ポリＡ尾部を含有する。
誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌ
ｉａｎａプロトプラストを、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，
０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種する。組換えＣａｓ９ ｍＲＮＡを、
単独で、または組み合わせて、以下の手段の１つ（一覧は包括的ではない）：細胞浸透ペ
プチド（ＣＰＰ）、トランスフェクションリポソーム試薬、ポリ（エチレングリコール）
（ＰＥＧ）で植物細胞中に送達して、活性組換えＣａｓ９ ｍＲＮＡの細胞への送達を可
能にする。
ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質をテザリングするためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ
本実施例は、以下の実施例において示されるように、リンカー配列（テザリング配列と
呼ぶこともできる）がｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端であるが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ
終結シグナルの５’に含まれる修飾された単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）カセットを利
用する（図１０）。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性
化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。好ましいが、リンカーの配置はｔ
ｒａｃｒＲＮＡの３’末端に限られないが、ｓｇＲＮＡカセット内の幾つかの位置で調査
される。リンカー配列は、ヌクレオチド長において変化してもよく、またはテザリングを
改善するか、もしくは三本鎖相互作用を介して係留される分子数を増加させる二次構造を
含有してもよい。
リンカーは、相補的配列を含有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質とのワトソン－ク
リック塩基対形成を可能にする（図１０）。さらに、ｓｇＲＮＡ中のリンカー配列を、複
数のＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質分子をテザリングするより複雑な多面的相互作用領
域を可能にする進化した二次および三次構造を含有するように設計する。
全体の概念は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体がヌクレアーゼ活性の部位に生物学的分子
をテザリングすることによって、遺伝子編集の可能性を増大させるということである。こ
れらの生物学的分子は、標的遺伝子の変換を仲介するＧＲＯＮを含む。テザリングリンカ
ーを、単に、例えば、Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｉｎｇｓまたはアニーリングしたオリゴを使用す
ることによってｓｇＲＮＡに付加することができる。
方法
誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌ
ｉａｎａプロトプラストを、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，
０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓテザリン
グプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡ
Ｓプロモーターおよびｂｆｐを標的化するＧＲＯＮを編集する２０１量体上に位置する１
５～３０ｂｐのポリヌクレオチド経路と相補的であるリンカー配列と共にｓｇＲＮＡを駆
動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｕ６プロモーターを含有する（図１
０に示される）。ｓｇＲＮＡテザリングカセットはポリ－Ｔ１０ターミネーターによって
終結される。ＧＲＯＮと共にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについて
は０．０５μｇ／μｌおよび２０１量体ＧＲＯＮについては０．１６μＭの最終濃度でＰ
ＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。ＧＲＯＮ処理は単独で、２０１量
体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを
暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによっ
て分析して、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じか、または異なるプラスミドから発現さ
れた、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ
９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（
ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とリンカーとの融合物
である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために
用いられるスペーサー配列を含有する。本実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的化するＣＲＩ
ＳＰＲを使用する。ＧＲＯＮは、変換部位の近くにｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コ
ード配列を含有する。
トランケートされたｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ
本実施例の目的は、標的遺伝子中の二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲおよび変
換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
ＢＦＰモデル系に由来するプロトプラスト中でのＢＦＰからＧＦＰへの変換を証明するこ
とである。本実施例において使用されたＣＲＩＳＰＲは、２つの異なる長さであるＣａｓ
９遺伝子および１つのｓｇＲＮＡをコードするプラスミドをプロトプラスト中に導入する
ことによって、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａゲノム中のｂｆｐ遺伝子を標
的とする。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲ
ＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。Ｃａｓ９を標的遺伝子に誘導するｃｒＲＮ
Ａはスペーサーと呼ばれ、それは典型的には２０ｎｔ長（ＣＲ：ＢＦＰ１ ２０ｎｔ）で
あるが、これらの実施例では、本発明者らはＢＦＰからＧＦＰへの変換を仲介する際によ
り小さい長さの１７ｎｔ（ＣＲ：ＢＦＰ１ １７ｎｔ）のスペーサーを使用する有効性を
試験した。
方法
誘導根部組織に由来するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを
、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６
ウェルプレート上に播種する。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９タ
ーミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ－Ｔ１
０ターミネーターと共に複数の異なるｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔ
ｈａｌｉａｎａ Ｕ６プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（
ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。Ｇ
ＲＯＮと一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌ
および２０１量体については０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロ
トプラスト中に導入する。ＧＲＯＮ処理は単独で、２０１量体については２．５μＭのＰ
ＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間イ
ンキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内の
ＧＦＰに対するＢＦＰの割合を決定した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じか、または複数のプラスミドから発現さ
れた、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ
９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（
ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃ
ｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペー
サー配列を含有する。これらの実施例では、２０ｎｔ（５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴ
ＴＣＡＣＣＣＡ３’）対１７ｎｔ（５’ＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’）の２
つの異なる長さのＢＦＰ１スペーサーを試験した。表１３は、使用したＧＲＯＮを記載す
る。
Figure 0007293441000023
結果
２０ｂｐから１７ｂｐへのＢＦＰ１プロトプラストの長さの減少は、Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＢＦＰモデル系へのプラスミドおよびＧＲＯＮのＰＥＧ送達
の７２時間後に、それぞれ、０．１６３％対０．１７７％の同様のレベルのＢＦＰからＧ
ＦＰへの変換を有していた（図１１）。
アンプリコンｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ
本実施例の目的は、標的遺伝子中の二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲおよび変
換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
ＢＦＰモデル系に由来するプロトプラスト中でのＢＦＰからＧＦＰへの変換を証明するこ
とである。本実施例において使用されたＣＲＩＳＰＲは、プラスミド上にコードされるか
、またはアンプリコンとしてプロトプラスト中に導入されるＣａｓ９遺伝子および１つの
ｓｇＲＮＡをコードするプラスミドをプロトプラスト中に導入することによって、Ａｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａゲノム中のｂｆｐ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡ
は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮ
Ａ）との融合物である。ｃｒＲＮＡはＣａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこでＣａｓ９は
二本鎖切断を作出し、ＧＲＯＮは、部位特異的様式でＢＦＰをＧＦＰに変換するための鋳
型として使用される。
方法
誘導根部組織に由来するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを
、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６
ウェルプレート上に播種する。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９タ
ーミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ－Ｔ10
ターミネーターと共に複数の異なるｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｕ６
プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トラ
ンス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ＧＲＯＮと一緒にＣＲＩ
ＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌおよび２０１量体につ
いては０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入す
る。ＧＲＯＮ処理は単独で、２０１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲ
ＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、
それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のＧＦＰに対するＢＦＰ
の割合を決定した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じか、または複数のプラスミドから発現さ
れた、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ
９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（
ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃ
ｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペー
サー配列を含有する。これらの実施例では、同じＢＦＰ６ ｇＲＮＡ（５’ＧＧＴＧＣＣ
ＧＣＡＣＧＴＣＡＣＧＡＡＧＴＣＧＧ３’）を、アンプリコンとしてプロトプラスト中に
送達するか、またはプラスミド上にコードさせた。表１４は、使用したＧＲＯＮを記載す
る。
Figure 0007293441000024
結果
Ｃａｓ９のみを含有するプラスミドと一緒のアンプリコンとしてのＢＦＰ６ ｇＲＮＡ
（ＣＲ：ＢＦＰ６（ｇＲＮＡアンプリコン））の送達は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈ
ａｌｉａｎａ ＢＦＰモデル系へのプラスミドおよびＧＲＯＮのＰＥＧ送達の７２時間後
に別々のプラスミド上にコードされるｇＲＮＡ（ｇＲＮＡプラスミド）とＣａｓ９の両方
による処理と比較した場合、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の同様の速度を有していた（図１
２）。
非修飾ＧＲＯＮを含むＣＲＩＳＰＲ
本実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲお
よび変換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａ
ｎａ ＢＦＰトランスジェニックモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を証明する
ことである。本実施例において使用されたＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲは、ｂｆｐ遺伝子を標的
とし、変換部位の近くでＤＮＡ中の二本鎖切断を引き起こす。３ＰＳ ＧＲＯＮは、ＧＲ
ＯＮの５’末端と３’末端の両方に３ホスホチオエート結合を有するＤＮＡ塩基を含有し
、本明細書では３ＰＳ ＧＲＯＮと呼ばれる。３ＰＳ ＧＲＯＮを、本発明者らのＢＦＰ
トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａモデル系においてＢＦＰ
ＣＲＩＳＰＲを用いて仲介されたＢＦＰからＧＦＰへの変換におけるその非修飾ＧＲＯ
Ｎ相当物と直接比較した。これらの実施例で使用されたＧＲＯＮの一覧については、表１
５を参照されたい。
Figure 0007293441000025
方法
誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌ
ｉａｎａプロトプラストを、１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，
０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラ
スミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロ
モーターおよびポリ－Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ Ｕ６プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲ
ＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ＧＲＯＮ
と一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌおよび
４１量体ＧＲＯＮについては０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロ
トプラスト中に導入した。ＧＲＯＮ処理は単独で、４１量体については０．８μＭのＰＥ
Ｇ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間イン
キュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のＧ
ＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン
最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９
）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を
含有する。ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列は、５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴ
ＣＡＣＣＣＡ３’である。本実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰ ＣＲＩＳＰ
Ｒを使用した。ＧＲＯＮは、変換部位の近くにｂｆｐ遺伝子の非コード配列を含有する。
表１６は、使用したＧＲＯＮを記載する。
Figure 0007293441000026
結果
４１量体の３ＰＳ ＧＲＯＮは、ＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲを使用するＢＦＰからＧＦＰへ
の変換の仲介においてその非修飾ＧＲＯＮ相当物よりも効率的である（図１３）。
アマにおけるＴＡＬＥＮおよびＧＲＯＮ
本実施例の目的は、ＴＡＬＥＮプラスミドおよびＧＲＯＮの送達後、プロトプラスト中
では２４時間および微小パルス中では３週間の両方でのアマにおけるＥＰＳＰＳ変換を証
明することである。本実施例で使用されるＴＡＬＥＮは、茎頂由来プロトプラスト中に、
二本鎖切断を作出するＴＡＬＥＮおよび部位特異的様式でｅｐｓｐｓ遺伝子を変換するた
めの鋳型として使用されるＧＲＯＮをコードするプラスミドを導入することによってＬｉ
ｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍゲノム中のｅｐｓｐｓ遺伝子を標的とする。
方法
アマのプロトプラストを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた苗から得られた茎頂から単離
した。ＴＡＬＥＮプラスミドを、ＧＲＯＮと共に、それぞれ、０．０５μｇ／μｌおよび
０．５μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。プロ
トプラストを、暗室中、液体培地中、２５℃で最大４８時間インキュベートしたか、また
はアルギン酸ビーズ（５×１０5細胞／ｍｌ）中に埋め込み、液体培地中で培養して、細
胞分裂および微小カルスの形成を誘導した。ＤＮＡ送達の２４時間または３週間後に得ら
れたプロトプラストまたは微小カルスサンプルを、ＮＧＳによって分析して、所与の処理
内で標的突然変異を実行する細胞の割合（ＤＮＡリード）を決定した。不完全なＮＨＥＪ
仲介型ＤＮＡ修復により生成されたインデルのパーセントも見積もった。
ＴＡＬＥＮ構築物は、それぞれ、ＦｏｋＩの触媒的ＤＮＡ切断ドメインに連結されたＴ
ＡＬエフェクター様ＤＮＡ結合ドメインからなる２つのアーム（左および右）を含む。Ｔ
ＡＬエフェクター様ＤＮＡ結合ドメインは、各アームのＦｏｋＩエンドヌクレアーゼが一
緒に二量体化し、二本鎖ＤＮＡを切断することができるＤＮＡの特定部位にＴＡＬＥＮア
ームを誘導する。ＴＡＬＥＮをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと
共にＭａｓＰ：：ＬｕＥＰＳＰＳ＿（左アーム）－Ｔ２Ａ－ＬｕＥＰＳＰＳ＿（右アーム
）を含有する。ＬｕＥＰＳＰＳ＿（左アーム）配列は５’ＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＣ
ＧＴＣＣＧ３’であり、ＬｕＥＰＳＰＳ＿（右アーム）配列は５’ＴＧＡＧＴＴＧＣＣＴ
ＣＣＡＧＣＧＧＣＴ３’である。ゆらぎ塩基を含む、または含まないＬｕＥＰＳＰＳを標
的化するＧＲＯＮ（１４４量体）を用いて、変換速度に対するその効果を決定した。
結果
２４時間のプロトプラストおよび３週齢の微小カルスは、次世代配列決定により決定し
た場合、それぞれ、０．０６７％および０．０５１％ＥＰＳＰＳ変換を有する（図１４）
。さらに、これらのデータは、ＴＡＬＥＮが活性であり、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓ
ｓｉｍｕｍ中のｅｐｓｐｓ標的遺伝子を切断することができ、プロトプラスト中では２４
時間で、微小カルス中では最大３週間で、それぞれ２．６０％および１．８４％のインデ
ルを形成することを示す。さらに、ＥＰＳＰＳ変換およびインデルは、ＴＡＬＥＮプラス
ミドおよびＧＲＯＮが導入された後最大３週間維持される。
アマにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ
本実施例の目的は、Ｃａｓ９プラスミドの送達の３および６週間後のアマ微小カルスに
おけるＣａｓ９の活性を証明することである。本実施例で使用されたＣＲＩＳＰＲは、Ｃ
ａｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを茎頂由来プロトプラスト中に導
入することにより、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍゲノム中のｅｐｓｐｓ遺伝
子を標的とする。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とｔｒａｎｓ活性
化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を標的遺
伝子に誘導し、そこでＣａｓ９は部位特異的様式でｅｐｓｐｓ遺伝子中に二本鎖切断を作
出する。ｅｐｓｐｓ遺伝子中の二本鎖切断は、遍在的ＮＨＥＪ経路により修復された場合
、切断部位の周囲にインデルを形成させる。
方法
アマのプロトプラストを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた苗から得られた茎頂から単離
した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａ
ｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ－Ｔ10ターミネーターと共にｓ
ｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｕ６プロモーターを含
有する。ＣＲＩＳＰＲプラスミドを、０．０５μｇ／μｌの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送
達によってプロトプラスト中に導入した。プロトプラストを、アルギン酸ビーズ（５×１
０5細胞／ｍｌ）中に埋め込み、液体培地中で培養し、暗室中、２５℃で回転式振盪器（
３０ｒｐｍ）中でインキュベートした。個々の細胞から発生した微小カルスを、ＣＲＩＳ
ＰＲプラスミド送達の３および６週間後にＮＧＳによって分析して、誤りがちなＮＨＥＪ
仲介型ＤＮＡ修復経路により生成されたインデルを実行する細胞の割合（ＤＮＡリード）
を決定した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン
最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９
）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有す
る。本実施例では、ＣＲＩＳＰＲはｅｐｓｐｓ遺伝子を標的とする。
結果
３および６週齢の微小カルスは、次世代配列決定により決定された場合、それぞれ、４
６．５％および５４．７％のインデル形成を有する（図１５）。これらのデータは、Ｃａ
ｓ９がＬｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ中で活性であり、ＥＰＳＰＳ標的遺伝子
を切断することができ、インデルを形成することを示している。さらに、これらのインデ
ルは、ＣＲＩＳＰＲプラスミドが導入された後、最大６週間維持される。
操作されたヌクレアーゼの構築
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ
一過的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９発現プラスミドの構築のために、ＮおよびＣ末端の両方
にＳＶ４０ ＮＬＳならびにＮ末端に２ｘＦＬＡＧタグを含有する高等植物コドン最適化
されたＳｐＣａｓ９遺伝子を、一連のＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標
）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）として合成した後、Ｇ
ｉｂｓｏｎ法により、マンノピンシンターゼ（ＭＡＳ）プロモーターの下流およびエンド
ウマメリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ｒｂｃｓＥ９）ターミネーターの上流に
クローニングした。次に、発現がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｕ６プロモーターにより駆動
されるキメラｇＲＮＡからなるｓｇＲＮＡカセットを、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔ
ｒｉｎｇｓ（商標）として合成した後、Ｇｉｂｓｏｎ法を用いてＣａｓ９を含有する構築
物中にシャトルし、ｐＢＣＲＩＳＰＲを形成させた。対応する標的配列のためのキメラｇ
ＲＮＡを特定するために、可変性２０ｎｔ ｓｇＲＮＡ標的化配列をコードするＤＮＡオ
リゴヌクレオチドの対（拡張データ、表２）をアニーリングさせて、４ｂｐの突出部を有
する短い二本鎖断片を作製した。この断片をＢｂｓＩ消化されたｐＢＣｒｉｓｐｒ中にラ
イゲーションして、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構築物ＢＣ－１、ＢＣ－２およびＢＣ－３を得
た。
ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮ発現構築物ＢＴ－１およびＬｕＥＴ－１の設計および構築は、Ｃｅｒｍａｋ
ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９，ｅ８２（２０１１）に
記載された規則に基づくものであった。標的配列を、ＮＧ、ＨＤ、ＮＩおよびＮＮがそれ
ぞれＴ、Ｃ、ＡおよびＧを認識するという規則にしたがって、遺伝子編集部位および反復
可変ｉ残基（ＲＶＤ）に基づいて選択した。ヘテロ二量体ＦｏｋＩドメインに連結された
ＴＡＬエフェクタードメインの集合を、市販のサービス（ＧｅｎｅＡｒｔ；Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して完了させた。ＴＡＬＥＮ単量体を、Ｇｉｂｓｏｎ法を
用いてＭＡＳプロモーターの下流およびｒｂｃＥ９ターミネーターの上流にクローニング
し、２Ａ結合単位として発現させた。
細胞培養およびプロトプラストの単離
表面滅菌したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの種子を、１２時間の明／暗周期の下、２８℃で
固体１／２ＭＳ培地（ＸＸによるミネラルおよびビタミン；１／２濃縮；８７．７ｍＭス
クロース）上で発芽させた。２～３週齢の苗に由来する根材料を収集し、２８℃で低光量
条件下、１／２ＭＳ液体培地中で維持した。根培養物を、プロトプラストの単離の３週間
前にＭＳＡＲ［０．２２％ １／２ＭＳ、８７．７ｍＭスクロース、１１．４μＭ ＩＡ
Ａ、２．３μＭ ２，４－Ｄ、１．５μＭ ２ｉＰ、ｐＨ５．８］中に移し、維持した。
根を約６ｍｍのセグメントに切断し、細胞壁消化酵素［１．２５％セルラーゼＲＳ、０．
２５％マセロザイムＲ－１０、０．６Ｍマンニトール、５ｍＭ ＭＥＳ、０．１％ＢＳＡ
］を含有するＭＳＡＰ溶液［０．２２％ １／２ＭＳ、８７．７ｍＭスクロース、１１．
４μＭ ＩＡＡ、２．３μＭ ２，４－Ｄ、１．５μＭ ２ｉＰ、および４００ｍＭマン
ニトール、ｐＨ５．８］中で穏やかに振盪しながら暗室中で３～４時間インキュベートし
た。遊離したプロトプラストを収集し、滅菌１００μｍフィルターおよび３５μｍフィル
ターを通過させた。プロトプラストの濾液を０．８倍容量のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）Ｄ
ｅｎｓｉｔｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）と混合し、穏やかに混合
した。６０％のＷ５［１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ2
・２Ｈ2Ｏ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）］／４０％のＯｐｔｉ
ｐｒｅｐ溶液、次いで、９０％のＷ５／１０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ溶液を、濾液／Ｏｐｔ
ｉｐｒｅｐ溶液上にゆっくりと層化して勾配を作製し、１９８ＲＣＦで１０分間遠心分離
した。白色のプロトプラスト層を収集し、２倍容量のＷ５と混合した。プロトプラストを
４４ＲＣＦで１０分間遠心分離し、ＴＭ溶液［１４．８ｍＭ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、５ｍ
Ｍ ＭＥＳ、５７２ｍＭマンニトール（ｐＨ５．８）］中に１×１０7細胞／ｍｌの密度
で再懸濁した。Ｚｅｏｃｉｎ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌ
ｓｂａｄ、ＣＡ）およびフレオマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃ
Ａ）を用いる実験のために、プロトプラストを、トランスフェクション前に氷上で９０分
間、ｐＨ７．０に調整したＴＭ中で保持した。抗生物質濃度については、拡張データの図
１を参照されたい。
アマのプロトプラストを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた３週齢の苗から得られた茎頂
から単離した。茎頂を、外科用メスを用いて細かく切り刻み、Ｂ培地［Ｂ５塩およびビタ
ミン（Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９６８）、４ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１Ｍグル
コース、０．３Ｍマンニトール、０．１Ｍグリシン、２５０ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物
、１０ｍｇ／ｌ Ｌ－システイン－ＨＣＬ、０．５％ポリビニルピロリドン（ＭＷ１０，
０００）、０．１％ＢＳＡ、１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、０．２ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、および０．
５ｍｇ／ｌ ２，４－Ｄ］中、室温で１時間、予め原形質分離を起こさせ、回転式振盪器
（５０ｒｐｍ）上、２５℃で５時間、０．６６％セルラーゼＹＣおよび０．１６％マセロ
ザイムＲ－１０を添加したＢ培地を含有する細胞壁消化酵素溶液中でインキュベートした
。遊離したプロトプラストを篩にかけ、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）層を用いる密度
勾配遠心分離によって精製し、血球計を用いて計数し、Ｂ培地中、０．５×１０6個のプ
ロトプラスト／ｍｌの密度で暗室中で一晩、静置した。
プロトプラストのトランスフェクション
９６ウェル平底プレート中で、ＰＥＧ［２７０ｍＭマンニトール、６７．５ｍＭ Ｃａ
（ＮＯ3）2、３８．４％ＰＥＧ１５００（ｐＨ５．８）］を用いて、ウェルあたり２．５
×１０5個の細胞に、１０ｐｍｏｌのＧＲＯＮ、１０ｐｍｏｌのＧＲＯＮ＋３．２５μｇ
のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓもしくはＴＡＬＥＮ発現構築物またはモックをトランスフェクト
した。細胞およびＤＮＡを、氷上で３０分間、ＰＥＧと共にインキュベートした後、２０
０μｌのＷ５溶液で洗浄した。最後に、８５μｌのＭＳＡＰ＋＋［５０ｎＭフィトスルホ
キン－αおよび２０μＭ ｎ－プロピルガレートを含有するＭＳＡＰ］を添加し、細胞を
２８℃で低光量条件下で培養した。
培養の約１８時間後、プロトプラストに、ＰＥＧ仲介性送達を用いて、ＧＲＯＮと共に
ＴＡＬＥＮプラスミド（２０μｇのプラスミドおよび０．２ｎｍｏｌのＧＲＯＮ／１０6
個のプロトプラスト）をトランスフェクトした。処理されたプロトプラストを、Ｂ培地中
、暗室中で２５℃で最大４８時間インキュベートしたか、またはトランスフェクションの
２４時間後にアルギン酸ビーズ中に埋め込み、Ｖ－ＫＭ液体培地中で培養して、細胞分裂
および微小カルスの形成を誘導した。抗生物質実験のために、ウェルあたり１．２５×１
０5個の細胞に、上記のＰＥＧ溶液を用いて、８μＭのＧＲＯＮ ＣＧ１３をトランスフ
ェクトした。
サイトメトリー
トランスフェクションの７２時間後、細胞を、ＧＦＰについて必要に応じて放出を励起
および検出しながらＡｔｔｕｎｅ（登録商標）Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇサイ
トメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を用いるサイトメト
リーにより分析した。バックグラウンドレベルは、ＤＮＡ送達を用いないＰＥＧ処理され
たプロトプラストに基づいていた。抗生物質実験のために、トランスフェクションの前に
Ｚｅｏｃｉｎまたはフレオマイシンで処理されたプロトプラストを、トランスフェクショ
ンの４８時間後にサイトメトリーによって分析した。
配列決定分析
ゲノムＤＮＡを、製造業者の推奨（Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ
、ＰＡ）にしたがってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｎｔ ＩＩキットを用い
て、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓまたはＴＡＬＥＮ処理されたプロトプラストから抽出した。Ｔ
ＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ標的領域に隣接するアンプリコンを、１００ｎｇのゲノムＤ
ＮＡならびにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥＮについてはプライ
マーＢＦＰＦ－１（５’－ＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣ－３’）／Ｂ
ＦＰＲ－１（５’－ＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣ－３’）；またはＬ．ｕ
ｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍのＴＡＬＥＮについてはＬｕＥＰＦ－１（５’－ＧＣＡＴＡＧ
ＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣ－３’）／ＬｕＥＰＲ－１（５’－ＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡ
ＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧ－３’）と共にＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼを用いて
作製した。アンプリコンを精製し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（Ｑｉａ
ｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて濃縮した。アンプリコンのディープシーケン
シングを、２×２５０ｂｐのＭｉＳｅｑラン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、
ＣＡ）を用いるＧｅｎｅＷｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）により実施
した。データ分析のために、リード１およびリード２に関するｆａｓｔｑファイルを、Ｃ
ＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ７．０．４（ＣＬＣＢｉｏ、Ｂｏｓｔｏ
ｎ、ＭＡ）中にインポートした。リード対を、それらの配列が重複した場合、単一の配列
に融合させた。アンプリコンの配列を、それまたはその逆向きかつ相補的配列がフォワー
ドおよびリバースプライマー配列を含有する場合、同定した。サンプル中のユニークな配
列の出現を、その存在量として記録した。インデルまたは遺伝子編集のパーセントを、編
集またはインデルを有するリードの数を、配列決定されたリードの総数で除算した後、１
００を乗算することによって算出した。
Figure 0007293441000027
Figure 0007293441000028
Figure 0007293441000029
統計分析
統計的有意性を、両側分布を用いるＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて決定した。０．０
５未満のＰ値を、有意と考えた。データを平均およびＳＥＭとして示す。
結果
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａプロトプラスト中でのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ活性お
よび遺伝子編集
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびクラスター化された一定間隔の
短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９（ＣＲＩ
ＳＰＲ－Ｃａｓ９）などの操作されたヌクレアーゼをプログラムして、高い特異性で二本
鎖ＤＮＡを標的化および切断することができる。ＴＡＬＥＮは、両方ともＦｏｋＩの触媒
的ＤＮＡヌクレアーゼドメインに連結されたＴＡＬエフェクター様ＤＮＡ結合ドメイン（
ＴＡＬＥ）を有する２つのアームからなる。ＴＡＬＥドメインは、ＴＡＬＥＮアームをＤ
ＮＡの特定の部位に誘導し、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの二量体化およびその後の二本
鎖切断（ＤＳＢ）の生成を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、２つの構成要素；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９
）と、操作された単一のガイド（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよ
びｔｒａｃｒＲＮＡ）のキメラ融合物からなる。ｓｇＲＮＡは、その最初の２０個の５’
塩基と、ＤＮＡ標的との塩基対形成を介してＣａｓ９に対する標的核酸特異性を支援し、
続いて、部位特異的ＤＳＢをもたらす。
植物においては、ＤＳＢは、典型的には、誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮ
Ａ修復経路により修復され、修復部位において無作為な欠失および／または挿入（インデ
ル）をもたらす。対照的に、正確なゲノム編集は、多くの場合、姉妹染色分体における、
相同な鋳型ＤＮＡの要件のため、ＮＨＥＪよりも正確である修復経路である、相同性特異
的修復（ＨＤＲ）により修復される標的変化の近くでのヌクレアーゼ誘導ＤＳＢに依拠す
る。ＨＤＲ経路を利用することにより、ヌクレアーゼにより切断される場合、特異的に、
または二本鎖切断を誘導する抗生物質と組み合わせて使用される場合、非特異的に、ＤＮ
Ａを編集するための修復鋳型として操作されたオリゴヌクレオチドを使用することができ
る。
図１６は、Ｈ６６をコードするコドン（ＣＡＣ→ＴＡＣ Ｈ６６Ｙ）を編集することに
より、安定に組み込まれたＢＦＰ遺伝子をＧＦＰに変換することができる、ＢＦＰトラン
スジェニックモデル系に由来するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａプロトプラ
ストにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を記載する。細胞をＣＲＩＳＰＲ
－Ｃａｓ９（ＢＣ－１）で処理した場合、ＮＨＥＪにより誘導されるインデルは、ディー
プシーケンシングにより、ＢＦＰ遺伝子のＨ６６遺伝子座の近くで０．７９％の頻度で生
成された（図１６ａ）。大部分のインデルは１ｂｐであり、９ｂｐより長くなかった。逆
に、ＧＲＯＮのみで処理された、またはモック処理された細胞は、インデルを示さなかっ
た（データは示さない）。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、こ
のトランスジェニックモデル系において、ＢＦＰ遺伝子を能動的に標的化することができ
ることを示している。
本発明者らのトランスジェニックモデル系に由来するプロトプラスト中でＢＦＰからＧ
ＦＰへの遺伝子編集を仲介する、ＧＲＯＮと組み合わせたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の有効
性に関して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９と、ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾されたＧＲＯ
Ｎ（ＣＧ６）の両方を、ＧＲＯＮのみまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のみの処理と比較し
たとき、同時に導入する場合に、ＢＦＰからＧＦＰへの編集における７．４倍の改善が観
察された（図１６ｂ）。これらの結果は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロトプラスト中への
ＰＳ修飾ＧＲＯＮを有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の導入がＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子
編集の頻度を有意に増大させることを示している。
５’末端と３’末端の両方に３つの隣接するＰＳ修飾（本明細書では３ＰＳと呼ばれる
）を含有するＧＲＯＮは、非修飾ＧＲＯＮと比較した場合、ＢＦＰからＧＦＰへの編集に
正に影響する。３ＰＳ修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ２）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（ＢＣ－１）
と組み合わせた場合、非修飾ＧＲＯＮ鋳型（ＣＧ１；図１７ａ）と比較したとき、ＢＦＰ
からＧＦＰへの編集においてより効率的である。さらに、編集とＧＲＯＮの長さとの正の
相関（図１７ｂ）が観察された。総合すると、これらの結果は、ＧＲＯＮ修飾と長さの両
方が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の存在下でＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓなどの植物における遺
伝子編集の頻度を大きく改善することができることを示す。
２０１の核酸塩基（ｎｂ）の３ＰＳ修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ６）、または最初のＲＮＡ塩基
もしくは最初の９個のＲＮＡ塩基が２’－Ｏ－メチルで修飾されたＲＮＡとして最初の１
０個の５’塩基からなる２０１ｎｂの２’－Ｏ－メチル修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ９）もしくは
（ＣＧ１０）をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（ＢＣ－１）と一緒にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプ
ロトプラスト中に導入する場合、それらの間でＢＦＰからＧＦＰへの編集における統計的
差異が観察された（図１７ｃ）。同様に、２０１ｎｂの３ＰＳ修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ３）ま
たは５’Ｃｙ３および３’ｉｄＣ逆向き塩基からなる２０１ｎｂのＣｙ３修飾ＧＲＯＮ（
ＣＧ４）を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（ＢＣ－３）と一緒にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロ
トプラスト中に導入した場合、編集頻度における統計的差異は観察されなかった（図１７
ｄ）。全体として、これらのデータは、多様なＧＲＯＮ修飾は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９
の存在下でＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける遺伝子編集の頻度を大きく改善することがで
きることを示す。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９および修飾ＧＲＯＮに関するこれらの結果に基づいて、ＢＦＰ
遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮ対と結合した修飾ＧＲＯＮが、同様にＢＦＰからＧＦＰへ
の遺伝子編集の改善をもたらすかどうかを決定した。ＢＦＰ遺伝子座での有効なヌクレア
ーゼ活性を第１に示すために、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロトプラストをＴＡＬＥＮ（Ｂ
Ｔ－１）で処理したところ、ディープシーケンシングにより予想された切断部位に、また
はその近くに０．５１％のインデルが見られ、ＴＡＬＥＮがこのモデル系においてＣＲＩ
ＳＰＲ－Ｃａｓ９と同程度に活性であることを示している（図１８ａ）。欠失の大部分は
１０ｂｐを超えるものであったが、５０ｂｐ未満のものであり、一方、挿入は、欠失より
も有意に少なく、３ｂｐまたはそれ以下であった。次に、本発明者らは、ＢＦＰからＧＦ
Ｐに編集する、修飾ＧＲＯＮと結合したＴＡＬＥＮの有効性を検査した。ＢＦＰ ＴＡＬ
ＥＮ（ＢＴ－１）と３ＰＳ ＧＲＯＮ（ＣＧ７）の両方を導入する場合、３ＰＳ ＧＲＯ
Ｎのみと比較して、ＢＦＰからＧＦＰへの編集の頻度の９．２倍の改善が観察された（図
１８ｂ）。上記のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ実験と同様に、これらの結果は、３ＰＳ修飾ＧＲ
ＯＮを含むＴＡＬＥＮのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロトプラスト中への導入もまた、ＢＦ
ＰからＧＦＰへの遺伝子編集の頻度を有意に増大させることを示している。
Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）におけるＥＰＳＰＳ（５’－エノー
ルピルビルシキメート－３－リン酸シンターゼ）遺伝子座も、この系における標的として
使用した。ＥＰＳＰＳ遺伝子は、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシンおよ
びトリプトファンの生合成に参画するシキミ酸経路における酵素をコードする。植物にお
いては、ＥＰＳＰＳは除草剤グリホサートのための標的であり、ホスホエノールピルビン
酸のための結合部位の競合的阻害剤として作用する。
編集された場合、ＥＰＳＰＳをグリホサート耐性にする（拡張データの図１８ｂ）Ｌ．
ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍにおける２つの遺伝子座（Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａ）の近
くの部位を標的化するＴＡＬＥＮを選択した。Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａに標的変化を含
有する１４４ｎｂの５’Ｃｙ３修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ１１）と一緒にＴＡＬＥＮ（ＬｕＥＴ
－１）をプロトプラストに送達すると、導入の７日後に、両遺伝子座で０．１９％の遺伝
子編集頻度および０．５％のインデル頻度が観察された（図１８ｃ、図１８ｄ）。大部分
のインデルは１０ｂｐまたはそれ以下であった（図１８ｃ）。これらの結果は、Ｌ．ｕｓ
ｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍプロトプラスト中へのＣｙ３修飾ＧＲＯＮを含むＴＡＬＥＮの導
入は、ＥＰＳＰＳ遺伝子編集の頻度を有意に増大させ、さらに、複数のヌクレオチド編集
を単一のＧＲＯＮを用いて実現することができることを示している。
変換に対するブレオマイシンファミリーの抗生物質の２つのメンバーの効果
この一連の実施例の目的は、変換効率に対する抗生物質の効果を評価することであった
。
方法
複数コピーの青色蛍光タンパク質遺伝子を有するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉ
ａｎａ系統に由来するプロトプラストを、以下の修飾：ＧＲＯＮの付加の前に、プロトプ
ラストを、０．２５０、または１０００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｏｎ（商標）またはフレオ
マイシンを添加した、ＴＭ（１４．８ｍＭ ＭｇＣｌ2×６Ｈ2Ｏ、５ｍＭ ２－（Ｎ－モ
ルホリノ）エタンスルホン酸、５７２ｍＭマンニトール）の溶液中、氷上で９０分間保持
しながら、実施例１に記載のようにＧＲＯＮで処理した。溶液のｐＨを、７．０に調整し
た。ＢＦＰからＧＦＰへの変換をもたらす緑色蛍光を発する細胞の割合を、実施例１に記
載のフローサイトメトリーによって評価した。
結果
使用した両濃度（２５０および１０００μｇ／ｍｌ）で、Ｚｅｏｃｉｎおよびフレオマ
イシンは、ＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集の増加をもたらした（図１９を参照）。ＢＦ
ＰからＧＦＰへの遺伝子編集をもたらす緑色蛍光を発する細胞が、ＧＲＯＮ送達の５日後
に観察された（図２０）。
参考文献
１．ＬｅＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ：ｖｏｌ．３３９ ｎｏ．
６１２１ ｐｐ．８１９－８２３
２．Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－２１
３．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００８ ＲＮＡ １４：９０３－９１３
４．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６１：２０
－２７
イネにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ
この実験の目的は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮのプロトプラスト
中へのＰＥＧ送達後１２０時間でのＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａにおけるＡＣＣａｓｅ変換
を証明することである。この実験で使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、プロトプラスト中
に、Ｃａｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを導入することによって、
イネゲノム中のａｃｃａｓｅ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ
（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃ
ｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこで、Ｃａｓ９はａｃｃａｓｅ遺伝子中
に二本鎖切断を作出し、ＧＲＯＮは部位特異的様式でａｃｃａｓｅ遺伝子を変換するため
の鋳型として使用される。
方法
イネのプロトプラストを、カルスから単離した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓをコードしたプ
ラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するコーンユ
ビキチンプロモーターおよびポリ－Ｔ10ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するイネ
Ｕ６プロモーターを含有する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプラスミドを、０．０５μｇ／μｌ
の最終濃度でＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。以下の配列、５’
Ｖ Ｃ ＴＧＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＣＴＣ ＡＡＴ ＴＡＡ ＣＣＣ
ＴＴＧ ＣＧＧ ＴＴＣ ＣＡＧ ＡＡＣ ＡＴＴ ＧＣＣ ＴＴＴ ＴＧＣ ＡＧＴ
ＣＣＴ ＣＴＣ ＡＧＣ ＡＴＡ ＧＣＡ ＣＴＣ ＡＡＴ ＧＣＧ ＧＴＣ ＴＧＧ
ＧＴＴ ＴＡＴ ＣＴＴ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＡＣ ＣＣＡ ＡＧＣ
ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＴＡＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＡＡＴ
ＧＴＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＡＴＴ ＧＴＡ ＴＧＴ ＣＣＴ
ＡＡＧ ＧＴＴ ＣＴＣ ＡＡＣ ＡＡＴ ＡＧＴ ＣＧＡ ＧＣＣ Ｈ３’を有するＧ
ＲＯＮを、０．８μＭの最終濃度で使用した。プロトプラストをアガロース（２．５×１
０6細胞／ｍｌ）中に埋め込み、液体培地中で培養し、回転式振盪器（６０ｒｐｍ）中、
暗室中、２８℃でインキュベートした。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプラスミドおよび／または
ＧＲＯＮ送達の１２０時間後、個々のサンプルをＮＧＳによって分析して、ＡＣＣａｓｅ
変換を担持し、ａｃｃａｓｅ遺伝子中にインデルを有する細胞（ＤＮＡリード）の割合を
決定した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン
最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９
）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列（５’－
ＡＣＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧ－３）を含有する。本実験では、ＣＲ
ＩＳＰＲはａｃｃａｓｅ遺伝子を標的とする。
結果
１２０時間で、イネのプロトプラストは、次世代配列決定により決定された場合、０．
０２６％のＡＣＣａｓｅ変換を有する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを含まないＧＲＯＮのみの
対照は、１２０時間で０．００２％の最小Ａｃｃａｓｅ変換を示し、未処理の対照は変換
を示さなかった。さらに、これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓが活性であり、ＡＣ
Ｃａｓｅ標的遺伝子を切断し、８．０％のインデルを形成することができることを示す。
参考文献
５．ＬｅＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ：ｖｏｌ．３３９ ｎｏ．
６１２１ ｐｐ．８１９－８２３
６．Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－２１
７．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００８ ＲＮＡ １４：９０３－９１３
８．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６１：２０
－２７
イネにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ
概要：標的ＡＣＣａｓｅ突然変異を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定分析によって１９週
齢のカルスにおいて同定した。
はじめに
本実験の目的は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮのプロトプラスト中
へのＰＥＧ送達後のＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａカルスにおけるＡＣＣａｓｅ変換を証明す
ることである。この実験で使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、プロトプラスト中に、Ｃａ
ｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを導入することによって、イネゲノ
ム中のＡＣＣａｓｅ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲ
ＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ
は、Ｃａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこで、Ｃａｓ９はＡＣＣａｓｅ遺伝子中の標的位
置に二本鎖切断またはニックを作出し、ＧＲＯＮは部位特異的様式でＡＣＣａｓｅ遺伝子
を変換するための鋳型として使用される。
結果
以下の表に記載される標的ＯｓＡＣＣａｓｅ突然変異を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定
分析によって１９週齢のカルスにおいて同定した。
方法
イネのプロトプラストを、成熟種子由来胚発生カルスから開始された懸濁培養物から単
離した。それぞれ、０．０５μｇ／μｌおよび０．８μＭの最終濃度のＣＲＩＳＰＲ－Ｃ
ａｓプラスミドおよびＧＲＯＮを、ＰＥＧ仲介性送達法によってプロトプラスト中に導入
した。最終濃度のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプラスミドに関する例示的範囲は、０．０１～０
．２μｇ／μｌに限られないが、それを含む。最終濃度のＧＲＯＮに関する例示的範囲は
、０．０１～４μＭに限られないが、それを含む。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓをコードしたプ
ラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するコーンユ
ビキチンプロモーターおよびポリ－Ｔ10ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するイネ
Ｕ６プロモーターを含有する。ＧＲＯＮの配列情報は、表３に記載されている。ＰＥＧ処
理の後、プロトプラストをアガロース（１．２５×１０6細胞／ｍｌ）中に埋め込み、液
体培地中で培養し、回転式振盪器（６０ｒｐｍ）中、暗室中、２８℃でインキュベートし
た。アガロース中にプロトプラストを埋め込むための例示的範囲は、０．６２５×１０6
～２．５×１０6細胞／ｍｌに限られないが、それを含む。各処理からのサンプルを、Ｃ
ＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプラスミドおよび／またはＧＲＯＮ処理の４週間後に次世代配列決定
により分析して、ＡＣＣａｓｅ変換を担持する細胞（ＤＮＡリード）の割合を決定した。
変換された処理に由来する微小カルスを、クレトジム（０．２５～０．５μＭ）またはセ
トキシジム（２．５μＭ）を含有する固体選択培地上で遊離させた。培養の１９週間後に
この選択培地上で増殖する個々のカルス系統を、社内スクリーニング法ならびにＤＮＡ配
列決定によって分析して、標的ＡＣＣａｓｅ変換を含有する個々のカルスを同定した。
ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方ともプラスミドから発現された、植物コドン最適
化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）な
どのＣａｓ９と、ｓｇＲＮＡとからなる。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを、それぞれ、ｍＲ
ＮＡ／ＲＮＡまたはタンパク質／ＲＮＡによって送達することもできる。ｓｇＲＮＡは、
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ
）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導する
ために用いられる、表２に記載された配列を有するスペーサーを含有する。本実験では、
ＣＲＩＳＰＲはイネＡＣＣａｓｅ遺伝子を標的とする。
遺伝子内の２つの異なる位置、部位１および部位２でのＯｓＡＣＣａｓｅにおける変換
の一覧。それぞれの部位について、変換事象の全ての組合せが可能である。
Figure 0007293441000030
本実験で使用されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｇＲＮＡスペーサー配列の一覧。スペーサ
ーの長さは、最大で±２０ｂｐ変化してもよい。スペーサー配列内のミスマッチは、１０
ｂｐまで許容され得る。
Figure 0007293441000031
Figure 0007293441000032
本実験における使用にとって好適なＧＲＯＮ配列の一覧を、以下の表に提供する（Ｖ＝
ＣＹ３；Ｈ＝３’ＤＭＴ ｄＣ ＣＰＧ）。
Figure 0007293441000033
Figure 0007293441000034
アマにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ
概要：標的ＬｕＥＰＳＰＳ突然変異を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定分析によって４週
齢のカルスにおいて同定した。
はじめに
本実験の目的は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮのＰＥＧ仲介性送達
による茎頂由来プロトプラストにおけるＬｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍゲノム
中のＥＰＳＰＳ遺伝子の変換を証明することである。この実験で使用されたＣＲＩＳＰＲ
－ＣａｓおよびＧＲＯＮは、アマゲノム中のＥＰＳＰＳ遺伝子を標的とする。ＣＲＩＳＰ
Ｒは、２つの構成要素：両方ともプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）などのＣａｓ
９と、ｓｇＲＮＡとからなる。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを、それぞれ、ｍＲＮＡ／ＲＮ
Ａまたはタンパク質／ＲＮＡによって送達することもできる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰ
Ｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合
物である。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこで、Ｃａｓ９はＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子中に二本鎖切断またはニックを作出し、ＧＲＯＮは部位特異的様式でＥＰＳＰＳ
遺伝子を変換するための鋳型として使用される。
結果
標的ＬｕＥＰＳＰＳ（Ｔ９７Ｉおよび／またはＰ１０１Ａ、Ｐ１０１ＴもしくはＰ１０
１Ｓおよび／またはＧ９６Ａ）突然変異を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定分析によって４
週齢のカルスにおいて同定した。新芽を、これらの変換されたカルスから再生させた。
方法
アマのプロトプラストを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた苗から得られた茎頂から単離
した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと
共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ－Ｔ10ターミネーター
と共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｕ６プロモー
ターを含有する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプラスミドを、０．０５μｇ／μｌの最終濃度で
ＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。２つのアマＬｕＥＰＳＰＳ遺伝
子（表２）のそれぞれを標的とするＧＲＯＮを、４．０μＭの最終濃度で使用した。最終
濃度のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプラスミドの例示的範囲は、０．０１～０．２μｇ／μｌに
限られないが、これを含む。最終濃度のＧＲＯＮの例示的範囲は、０．０１～４μＭに限
られないが、これを含む。プロトプラストをアルギン酸ビーズ（５×１０5細胞／ｍｌ）
中に埋め込み、液体培地中で培養し、回転式振盪器（３０ｒｐｍ）中、暗室中、２５℃で
インキュベートした。アルギン酸ビーズ中にプロトプラストを埋め込むための例示的範囲
は、３．０×１０5～７．５×１０5細胞／ｍｌに限られないが、これを含む。個々の細胞
から発生した微小カルスを、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮ送達の３お
よび７週間後に、次世代配列決定により分析して、ＬｕＥＰＳＰＳ遺伝子中に標的突然変
異を担持する細胞（ＤＮＡリード）の割合を決定した。より大きいカルスを、固体再生培
地上に播種された８週齢の変換された微小カルスから増殖させたところ、新芽が約４～８
週間後に再生されたカルスから分化を開始した。標的ＥＰＳＰＳ遺伝子突然変異を有する
変換されたカルスおよび新芽を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定分析によって同定した。
ＣＲＩＳＰＲは、２つの構成要素：両方ともプラスミドから発現された、植物コドン最
適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）
と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、ト
ランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃ
ａｓ９ヌクレアーゼをＥＰＳＰＳ標的遺伝子に誘導するために使用された、以下の表に記
載される配列を有するスペーサーを含有する。
本実験で使用されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｇＲＮＡスペーサー配列の一覧。スペーサ
ーの長さは最大±２０ｂｐで変化してもよい。スペーサー配列内のミスマッチは、１０ｂ
ｐまで許容され得る。
Figure 0007293441000035
Figure 0007293441000036
本実験における使用にとって好適なＧＲＯＮ配列の一覧を、以下の表に提供する（Ｖ＝
ＣＹ３；Ｈ＝３’ＤＭＴ ｄＣ ＣＰＧ）。
Figure 0007293441000037
Figure 0007293441000038
当業者は、本開示が目的を実行し、言及する目的および利点、ならびに本開示に固有の
目的および利点を得るのに十分適応していることを容易に理解する。本明細書で提供する
例は好ましい実施形態の代表的なものであり、例示的であり、本開示の範囲を制限するも
のとして考えない。
本明細書で開示している本開示に対する様々な置換および修正を、本開示の範囲および
精神から逸脱せずに施すことができることは、当業者には容易に明らかとなる。
本明細書で適切に例示的に記載した本開示は、本明細書で具体的に開示していない如何
なる１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制約の不在下でも実施することができる。
したがって、例えば本明細書中でのそれぞれの場合において、用語「含む」、「から本質
的になる」および「からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれかと交換することが
できる。利用している用語および表現は、制約ではなく記載のための用語として使用し、
このような用語および表現の使用において、示し記載する特徴の任意の均等物、またはそ
れらの一部分の排除を意図するものではないが、特許請求する本開示の範囲内で様々な修
正が可能であることが認識される。したがって、好ましい実施形態および任意選択の特徴
によって本開示を具体的に開示してきたが、本明細書で開示している概念の修正および変
更は当業者に委ねることができ、このような修正および変更は、添付の特許請求の範囲に
よって定義する本開示の範囲内にあると考えられることが理解されるはずである。
したがって、好ましい実施形態および任意選択の特徴によって本開示を具体的に開示し
てきたが、開示された本開示の修正、改善、および変更は当業者に委ねることができ、こ
のような修正、改善および変更は、本開示の範囲内にあると考えられることが理解される
はずである。本明細書で提供する材料、方法、および例は、好ましい実施形態の代表であ
り、例示的なものであり、本開示の範囲に対する限定と意図されるものではない。
本開示を、本明細書に広く、一般的に説明してきた。一般的な開示の範囲内にあるより
狭い種および亜属群もそれぞれ、本開示の一部を形成する。これは、切り出された材料が
具体的に本明細書に記載されるか否かに関係なく、属に由来する任意の主題を除去すると
いう条件で、または負の限定で、本開示の一般的記載を含む。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群を単位として記載される場合、当業
者であれば、本開示もまたそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメ
ンバーの亜群を単位として記載されることを認識できる。
本明細書で記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、あたか
もそれぞれが個別に参照により組み込まれるのと同程度に、その全体が参照により明示的
に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御する。
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内で記載される。

Claims (12)

  1. 植物細胞において１つまたは複数の標的遺伝子変化を引き起こす方法であって、
    前記植物細胞から細胞壁を取り除いてプロトプラストを生成すること、
    植物細胞ゲノム中に一本鎖切断または二本鎖切断を導入するＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼと、植物細胞ゲノム中の内在性標的遺伝子内への前記１つまたは複数の標的遺伝子変化の導入を仲介するよう構成された遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）とを、前記プロトプラストへ送達することを含み、
    前記ＧＲＯＮが、
    ３’末端に、蛍光色素、逆向き塩基、３’－ジメトキシトリチルヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メチルヌクレオチドからなる群より選択される１つまたは複数、および、
    ５’末端に、蛍光色素、逆向き塩基、３’－ジメトキシトリチルヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メチルヌクレオチドからなる群より選択される１つまたは複数、を含み、
    前記プロトプラストが、前記標的遺伝子変化に関して非トランスジェニックである、
    方法。
  2. 前記１つまたは複数の標的遺伝子変化が、ＧＲＯＮを前記内在性標的遺伝子内に取り込ませることなく、植物細胞ゲノム中の前記内在性標的遺伝子内に導入される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記植物細胞が、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、ソラマメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、キャッサバ、およびユリからなる群から選択される植物由来である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 植物細胞ゲノム中に複数の標的遺伝子変化を生じる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ２つ以上のガイドＲＮＡを使用する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. １より多いガイドＲＮＡのそれぞれが、遺伝子変化のための異なる標的と相補的である、請求項５に記載の方法。
  7. ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがニッカーゼとして機能する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ニッカーゼであるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの２つ以上の使用を含み、
    前記２つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが標的核酸配列の反対の鎖上の切断を誘導するか、あるいは
    前記２つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが標的核酸配列の同じ鎖上の切断を誘導する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ)配列が、植物細胞ゲノム中に存在する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ)配列が、前記植物細胞の内在性遺伝子である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記プロトプラストから植物を再生するステップをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記植物から種子を回収するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
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Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012333134B2 (en) 2011-07-22 2017-05-25 John Paul Guilinger Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9957515B2 (en) 2013-03-15 2018-05-01 Cibus Us Llc Methods and compositions for targeted gene modification
RU2676708C2 (ru) 2013-04-16 2019-01-10 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Направленная модификация генома крысы
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
WO2015070083A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine,Inc. CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS
JP6174811B2 (ja) 2013-12-11 2017-08-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ゲノムの標的改変のための方法及び組成物
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
JP6727199B2 (ja) 2014-11-21 2020-07-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ガイドｒｎａのペアを使用したターゲティングによる遺伝子改変の方法及び組成物
WO2016094845A2 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 Woolf Tod M Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
WO2017070632A2 (en) 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
JP2019506170A (ja) * 2016-02-09 2019-03-07 キブス ユーエス エルエルシー オリゴヌクレオチド介在性遺伝子修復を利用した標的遺伝子修飾の効率を上昇させるための方法および組成物
JP6872560B2 (ja) * 2016-05-06 2021-05-19 エム． ウルフ、トッド プログラム可能ヌクレアーゼのあるゲノム編集及びプログラム可能ヌクレアーゼのないゲノム編集のための改善された方法
CA3032699A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
EP3526320A1 (en) 2016-10-14 2019-08-21 President and Fellows of Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
JP7182545B2 (ja) 2016-12-14 2022-12-02 ヴァーヘニンゲン ユニヴェルシテット 熱安定性ｃａｓ９ヌクレアーゼ
WO2018109101A1 (en) * 2016-12-14 2018-06-21 Wageningen Universiteit Thermostable cas9 nucleases
WO2018115389A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Keygene N.V. Methods of targeted genetic alteration in plant cells
JP7127942B2 (ja) * 2016-12-22 2022-08-30 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 二重鎖ｄｎａの標的化改変の方法
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
WO2018149915A1 (en) * 2017-02-15 2018-08-23 Keygene N.V. Methods of targeted genetic alteration in plant cells
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
KR102687373B1 (ko) 2017-03-23 2024-07-23 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
EP3658573A1 (en) 2017-07-28 2020-06-03 President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace)
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
CN108359646A (zh) * 2018-01-12 2018-08-03 江苏省农业科学院 使植物具有除草剂抗性的ACCase突变型蛋白及其应用
JP6614622B2 (ja) * 2018-04-17 2019-12-04 国立大学法人名古屋大学 植物ゲノム編集方法
US20210238612A1 (en) 2018-07-12 2021-08-05 Keygene N.V. Type v crispr/nuclease-system for genome editing in plant cells
CN109082416B (zh) * 2018-08-22 2021-10-26 江苏省农业科学院 具有除草剂抗性的ACCase突变型基因和蛋白及其应用
JP2022505440A (ja) 2018-11-01 2022-01-14 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 植物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集のためのデュアルガイドＲＮＡ
WO2020191249A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
MX2022014008A (es) 2020-05-08 2023-02-09 Broad Inst Inc Métodos y composiciones para la edición simultánea de ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos de doble cadena objetivo.
CN112375781B (zh) * 2020-11-08 2023-05-02 浙江大学 pC1300-MAS-Cas9基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用
CN115494031B (zh) * 2021-06-18 2024-06-18 北京大学 一种基于CRISPR/dCas9系统与寡核苷酸探针的活细胞DNA标记信号放大方法
CN115704040A (zh) * 2021-08-06 2023-02-17 华东理工大学 基于CRISPRi和CRISPRa的转录调控系统、其建立方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009542847A (ja) 2006-06-28 2009-12-03 サイバス，エルエルシー 脂肪酸ブレンド及びその使用
JP2012503488A (ja) 2008-09-26 2012-02-09 ビーエーエスエフ アグロケミカル プロダクツ ビー．ブイ． 除草剤抵抗性のａｈａｓ突然変異体及び使用の方法
JP2013545434A (ja) 2010-08-03 2013-12-26 キブス ユーエス エルエルシー 変異したプロトポルフィリノーゲンｉｘオキシダーゼ（ｐｐｘ）遺伝子

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5024944A (en) 1986-08-04 1991-06-18 Lubrizol Genetics, Inc. Transformation, somatic embryogenesis and whole plant regeneration method for Glycine species
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US5008200A (en) 1988-05-08 1991-04-16 United Agriseeds, Inc. Propagating multiple whole fertile plants from immature leguminous
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
ES2187497T3 (es) 1990-04-12 2003-06-16 Syngenta Participations Ag Promotores preferentemente en tejidos.
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5219746A (en) 1990-07-19 1993-06-15 Chris Brinegar Ice-mediated introduction of substances into biological material
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
US5641625A (en) 1992-05-22 1997-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
DE69230290T2 (de) 1991-08-27 2000-07-20 Novartis Ag, Basel Proteine mit insektiziden eigenschaften gegen homopteran insekten und ihre verwendung im pflanzenschutz
TW261517B (ja) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
IT230274Y1 (it) 1993-06-11 1999-06-02 Silc Spa Pannolone assorbente sagomato per incontinenza
US5962426A (en) 1993-06-25 1999-10-05 Yale University Triple-helix forming oligonucleotides for targeted mutagenesis
PT733059E (pt) 1993-12-09 2001-03-30 Univ Jefferson Compostos e metodos para mutacoes dirigidas ao local em celulas eucarioticas
PT679657E (pt) 1994-04-27 2003-11-28 Novartis Ag Nucleosidos e oligonucleotidos com grupos 2'-eter
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US7285416B2 (en) 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US5780296A (en) 1995-01-17 1998-07-14 Thomas Jefferson University Compositions and methods to promote homologous recombination in eukaryotic cells and organisms
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5888983A (en) 1996-05-01 1999-03-30 Thomas Jefferson University Method and oligonucleobase compounds for curing diseases caused by mutations
US5760012A (en) 1996-05-01 1998-06-02 Thomas Jefferson University Methods and compounds for curing diseases caused by mutations
US5731181A (en) 1996-06-17 1998-03-24 Thomas Jefferson University Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US6524613B1 (en) 1997-04-30 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Hepatocellular chimeraplasty
AU749410B2 (en) 1997-04-30 2002-06-27 Regents Of The University Of Minnesota In vivo use of recombinagenic oligonucleobases to correct genetic lesions in hepatocytes
CN100419083C (zh) 1997-08-05 2008-09-17 金默拉根有限公司 用混合双链寡核苷酸在植物中实现定点遗传改变的用途
BR9812540A (pt) * 1997-09-26 2001-12-26 Athersys Inc Expressão de genes endógenos por recombinaçãonão homóloga de uma construção de vetor comdna celular
WO1999018223A1 (en) 1997-10-07 1999-04-15 EMBRAPA-Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária A process for obtaining transgenic leguminous plants (leguminosae) containing exogenous dna
EP1056864B1 (en) 1998-02-26 2004-10-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Constitutive maize promoters
US6010907A (en) 1998-05-12 2000-01-04 Kimeragen, Inc. Eukaryotic use of non-chimeric mutational vectors
US6004804A (en) 1998-05-12 1999-12-21 Kimeragen, Inc. Non-chimeric mutational vectors
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6271360B1 (en) 1999-08-27 2001-08-07 Valigen (Us), Inc. Single-stranded oligodeoxynucleotide mutational vectors
ES2409080T3 (es) 2001-01-22 2013-06-24 Sangamo Biosciences Inc. Proteínas de unión con dedos de zinc modificadas
US20030115641A1 (en) 2001-07-24 2003-06-19 Dobres Michael S. Transformation of plants by electroporation of cultured explants
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
EP4332227A1 (en) 2005-08-23 2024-03-06 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
WO2007073149A1 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Keygene N.V. Alternative nucleotides for improved targeted nucleotide exchange
CA3077776C (en) 2006-01-12 2022-10-04 Cibus Europe B.V. Epsps mutants
CA2693525C (en) 2007-06-07 2020-09-29 Agriculture And Agri-Food Canada Nanocarrier based transfection and transduction of plant gametophytic cells
EP2700721B1 (en) 2007-10-05 2019-01-02 Cibus Europe B.V. Mutated acetohydroxyacid synthase genes in brassica
WO2009114321A2 (en) 2008-03-11 2009-09-17 Precision Biosciencs, Inc. Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
CA2788850C (en) * 2010-02-09 2019-06-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
EP2580331A4 (en) * 2010-06-14 2013-11-27 Univ Iowa State Res Found Inc NUCLEASE ACTIVITY OF THE TAL EFFECTOR AND FUSION PROTEIN FOKI
BR112013001685B1 (pt) * 2010-07-23 2021-10-13 Sigma-Aldrich Co. Llc Método para editar pelo menos uma sequência cromossômica endógena em uma célula pela inserção de uma sequência na sequência cromossômica
WO2013028188A1 (en) * 2011-08-24 2013-02-28 Cibus Us Llc Mutated protoporphyrinogen ix oxidase (ppx) genes
DK2800811T3 (en) 2012-05-25 2017-07-17 Univ Vienna METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DIRECTIVE TARGET DNA MODIFICATION AND FOR RNA DIRECTIVE MODULATION OF TRANSCRIPTION
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3527068B1 (en) * 2013-03-15 2022-06-01 Cibus US LLC Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009542847A (ja) 2006-06-28 2009-12-03 サイバス，エルエルシー 脂肪酸ブレンド及びその使用
JP2012503488A (ja) 2008-09-26 2012-02-09 ビーエーエスエフ アグロケミカル プロダクツ ビー．ブイ． 除草剤抵抗性のａｈａｓ突然変異体及び使用の方法
JP2013545434A (ja) 2010-08-03 2013-12-26 キブス ユーエス エルエルシー 変異したプロトポルフィリノーゲンｉｘオキシダーゼ（ｐｐｘ）遺伝子

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