JP6777549B2

JP6777549B2 - オリゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復を使用した標的遺伝子修飾の効率を高めるための方法および組成物

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Publication number: JP6777549B2
Application number: JP2016575642A
Authority: JP
Inventors: アール．ビーサム，ピーター; エフ．ダブリュ．ゴカル，グレゴリー; ショープク，クリスティアン; サウアー，ノエル; ピアース，ジェイムズ; イー．セガミ，ローサ; モゾルク，ジェリー
Original assignee: サイバスユーエスエルエルシー; サイバスオイローペベスローテンヴェンノーツハップ
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2015-03-14
Publication date: 2020-10-28
Anticipated expiration: 2035-03-14
Also published as: CN117867008A; JP2017512494A; AU2025202366A1; AU2022202315A1; NZ762626A; KR102450868B1; KR20230127356A; EP4357452A2; JP7047014B2; EP4357452A3; JP2023113841A; JP2020188773A; CA2942407C; IL247679B1; PT3116305T; CN106455514A; KR20220137176A; CA3208184A1; EP3116305A4; IL304634A

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ、全ての表、図面および特許請求の範囲を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１４年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／９５３，３３３号；２０１４年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０５１，５７９号；２０１４年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／０７５，８１１号；２０１４年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／０７５，８１６号；および２０１５年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１３３，１２９号の利益を主張するものである。

本開示は、少なくとも部分的には、標的遺伝子突然変異および修飾に関し、そのような突然変異および修飾を作製するための方法および組成物を含む。

以下の考察は、本開示を理解する際に読者を手助けするために単に提供するものであり、本開示以前の従来技術を記載または構成することを認めるものではない。

米国特許第６，２７１，３６０号は、所定の変化をコードするオリゴデオキシヌクレオチドを導入することによる、生細胞の標的遺伝子中での所定の遺伝子変化の導入のための方法および組成物を開示する。オリゴデオキシヌクレオチドは、哺乳動物、鳥類、植物および細菌細胞中で有効である。

米国特許第８，７７１，９４５号は、その一部がＣＲＩＳＰＲ複合体の１つまたは複数の構成要素をコードする、ベクターおよびベクター系、ならびにそのようなベクターの設計および使用のための方法を開示する。

米国特許第８，４７０，９７３号は、ポリペプチドによりＤＮＡ配列中の塩基対を選択的に認識するための方法、ＤＮＡ配列中の１つまたは複数の塩基対を特異的に認識する修飾ポリペプチド、およびポリペプチドが特異的に認識できるように修飾されたＤＮＡおよび特異的ＤＮＡ標的化におけるポリペプチドおよびＤＮＡの使用、ならびに細胞中での標的遺伝子の発現を調節する方法に言及する。

本明細書では、細胞においてＤＮＡの標的遺伝子変化を行うための方法および組成物が提供される。特定の態様および実施形態は、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列中の特定位置に対する、修飾の標的化の効率を改善することに関する。本明細書で記載するように、ゲノムに対して特異的変化を誘導する核酸を様々な手法と組み合わせて、修飾の標的である細胞中に存在する天然修復系の構成要素の利用性を高めることができる。

第１の態様において、植物細胞中の標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）仲介型突然変異を導入するための方法が提供される。特定の実施形態では、これらの方法は特に、植物細胞へのＧＲＯＮの送達、および／または１５塩基長より大きく標的ＤＮＡに導入するための１つもしくは複数、または２つ以上の突然変異部位を場合によっては含むＧＲＯＮの植物細胞への送達の前に、および／またはそれと同時に１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件下で植物細胞を培養するステップを含む。

本明細書で使用する「遺伝子修復オリゴヌクレオチド」または「ＧＲＯＮ」は、特定の条件下で、ＤＮＡ配列中で単一の、または幾つかの実施形態では、複数のヌクレオチド欠失、挿入または置換を誘導することができるオリゴ核酸塩基（例えば、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド、非ヌクレオチド含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドおよび他の遺伝子修復分子）を意味する。ゲノムのこのオリゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復編集は、非相同性に基づく修復系（例えば、非相同末端結合）と、相同性に基づく修復系（例えば、相同性特異的修復）の両方を含んでもよい。ＧＲＯＮは、典型的には、指定のミスマッチを除いてゲノム標的と一致して整列するように設計される。これらのミスマッチを、１つまたは複数の細胞の内因性ＤＮＡ修復系を利用することにより認識および補正することができる。幾つかの実施形態では、ＧＲＯＮまたはオリゴヌクレオチドを、生物標的配列と比較したときに複数の差異を含有するように設計することができる。これらの差異は、前記標的配列から翻訳されるタンパク質配列に全く影響しなくてもよく、１つまたは複数の事例では、サイレントな変化として知られる。ＧＲＯＮの構造、化学および機能の多数の変異は、本明細書の他の場所に記載される。様々な実施形態において、本明細書で使用するＧＲＯＮは、１つまたは複数の修飾を有してもよい。例えば、本明細書で使用するＧＲＯＮは、標的（ミスマッチ）部位にＤＮＡ修復機構を誘引する、および／または標的ＤＮＡ配列のゲノムＤＮＡ中へのＧＲＯＮの一部もしくは全部（所望の標的欠失、挿入、置換など以外）の組換えを防止する、および／またはＧＲＯＮの安定性を増大させる１つまたは複数の修飾を有してもよい。

様々な実施形態において、ＧＲＯＮは、ＲＮＡとＤＮＡの両方のヌクレオチドおよび／または他の型の核酸塩基を有してもよい。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドは、修飾を含む。

一態様においては、植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、細胞をＤＮＡ切断剤およびＧＲＯＮに、例えば、本明細書で企図されるように修飾されたＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法が提供される。幾つかの実施形態においては、ＧＲＯＮは、Ｃｙ３基、３ＰＳ基、２’Ｏ−メチル基または本明細書で企図される他の修飾などで修飾することができる。別の態様では、ＤＮＡ切断剤と、例えば、Ｃｙ３基、３ＰＳ基、２’Ｏ−メチル基または他の修飾などで修飾されたＧＲＯＮとを含む植物細胞が提供される。幾つかの実施形態においては、ＤＮＡ切断剤は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、およびＤＮＡ切断性抗生物質から選択される１つまたは複数のものである。幾つかの実施形態では、ＤＮＡ切断剤は、ＣＲＩＳＰＲである。幾つかの実施形態では、ＤＮＡ切断剤は、ＴＡＬＥＮである。幾つかの実施形態では、ＧＲＯＮは、１５〜６０核酸塩基長；または３０〜４０核酸塩基長；または３５〜４５核酸塩基長；または２０〜７０核酸塩基長；または２０〜２００核酸塩基長；または３０〜１８０核酸塩基長；または５０〜１６０核酸塩基長；または７０〜１５０核酸塩基長；または７０〜２１０核酸塩基長；または８０〜１２０核酸塩基長；または９０〜１１０核酸塩基長；または９５〜１０５核酸塩基長；または８０〜３００核酸塩基長；または９０〜２５０核酸塩基長；または１００〜１５０核酸塩基長；または１００〜２００核酸塩基長；または１００〜２１０核酸塩基長；または１００〜３００核酸塩基長；または１５０〜２００核酸塩基長；または２００〜３００核酸塩基長；または２５０〜３５０核酸塩基長；または５０〜１１０核酸塩基長；または５０〜２００核酸塩基長；または１５０〜２１０核酸塩基長；または２０〜１０００核酸塩基長；または１００〜１０００核酸塩基長；または２００〜１０００核酸塩基長；または３００〜１０００核酸塩基長；または４００〜１０００核酸塩基長；または５００〜１０００核酸塩基長；または６００〜１０００核酸塩基長；または７００〜１０００核酸塩基長；または８００〜１０００核酸塩基長；または９００〜１０００核酸塩基長；または３００〜８００核酸塩基長；または４００〜６００核酸塩基長；または５００〜７００核酸塩基長；または６００〜８００核酸塩基長；または３０より長い核酸塩基長；または３５より長い核酸塩基長；または４０より長い核酸塩基長；または５０より長い核酸塩基長；または６０より長い核酸塩基長；または６５より長い核酸塩基長；または７０より長い核酸塩基長；または７５より長い核酸塩基長；または８０より長い核酸塩基長；または８５より長い核酸塩基長；または９０より長い核酸塩基長；または９５より長い核酸塩基長；または１００より長い核酸塩基長；または１１０より長い核酸塩基長；または１２５より長い核酸塩基長；または１５０より長い核酸塩基長；または１６５より長い核酸塩基長；または１７５より長い核酸塩基長；または２００より長い核酸塩基長；または２５０より長い核酸塩基長；または３００より長い核酸塩基長；または３５０より長い核酸塩基長；または４００より長い核酸塩基長；または４５０より長い核酸塩基長；または５００より長い核酸塩基長；または５５０より長い核酸塩基長；または６００より長い核酸塩基長；または７００より長い核酸塩基長；または８００より長い核酸塩基長；または９００より長い核酸塩基長である。

ＧＲＯＮを、標的遺伝子の非コード（ＮＣ）領域とコード（Ｃ）領域の両方において標的化することができる。例えば、図２７および図２８はそれぞれ、ＡＣＣａｓｅ遺伝子に下記アミノ酸置換のうちの１つまたは複数を導入するためにイネゲノム中に突然変異を導入するのに好適なＣ−ＧＲＯＮおよびＮＣ−ＧＲＯＮを記載する。慣例は、参照としてノスズメノテッポウ（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ；Ａｍ）に由来するプラスチドＡＣＣａｓｅのためのアミノ酸番号付けシステムを使用することである。本明細書で使用するＡＣＣａｓｅ番号付けは、ノスズメノテッポウ参照配列ＡＣＣａｓｅタンパク質（配列番号１）に関する番号付けまたはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基（Ｖ＝ＣＹ３；Ｈ＝３’ＤＭＴｄＣＣＰＧ）に基づく。以下の表は、アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−Ｐ、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップ−Ｐ、ハロキシホップ、ハロキシホップ−Ｐ、イソキサピリホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ−Ｐ、トリホップ、ピノキサデン、これらの除草剤のいずれかの農学的に許容される塩およびエステル、ならびにその組合せの抵抗性表現型のうちの１つまたは複数をもたらすＡＣＣａｓｅ突然変異を列挙するものである。

同様に、図２９および図３０はそれぞれ、ＥＰＳＰＳ遺伝子に下記アミノ酸置換のうちの１つまたは複数を導入するためにアマゲノム中に突然変異を導入するのに好適な（コード）Ｃ−ＧＲＯＮおよび（非コード）ＮＣ−ＧＲＯＮを記載する（全ての番号付けは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡｒｏＡタンパク質（原核ＥＰＳＰＳ等価物）のアミノ酸配列と比較したものである）（米国特許第８，２６８，６２２号に記載のものなど）。（Ｖ＝ＣＹ３；Ｈ＝３’ＤＭＴｄＣＣＰＧ）。以下の表は、グリホサート、これらの除草剤のいずれかの農学的に許容される塩およびエステル、ならびにその組合せの抵抗性表現型をもたらすＥＰＳＰＳ突然変異を列挙するものである。

本明細書で使用する用語「ＣＲＩＳＰＲ」とは、例えば、Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３３９ｎｏ６１２１ｐｐ．８１９−８２３（２０１３）；Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３３７：８１６−８２１（２０１３）；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＲＮＡ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．９０３−９１３（２００８）；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６１，ｐｐ．２０−２７（２０１３），Ｚｈａｎｇｅｔａｌ，ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３号；およびＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒｅｔａｌ．，ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２５８９号に記載されたものなどの、細胞中で効率的に存在する、または発現される場合、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ細胞機構を介する標的ＤＮＡ配列の切断を行うことができるエレメント、すなわち、ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子、転写物（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサー配列（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ、ＳＰＩＤＲ−ＳＰａｃｅｒＩｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄＤｉｒｅｃｔＲｅｐｅａｔｓとしても知られる）を指す。幾つかの実施形態においては、例えば、真核細胞中での使用のためのＣＲＩＳＰＲ、本明細書で企図されるＣＲＩＳＰＲなどは、１つまたは複数の機能的な核局在化シグナルのための配列を含むさらなるエレメントを含んでもよい。本明細書で企図されるＣＲＩＳＰＲを、任意の多くの方法または発現で、細胞中で発現させる、細胞に投与する、および／または細胞中に存在させることができる。例えば、本明細書で企図されるＣＲＩＳＰＲは、以下のような、プラスミド上の１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲ、プラスミド上のＣＲＩＳＰＲニッカーゼ、プラスミド上のＣＲＩＳＰＲａ、またはプラスミド上のＣＲＩＳＰＲｉを含んでもよい。

プラスミド上のＣＲＩＳＰＲ：
（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
ａ．標的ＤＮＡ中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント（例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント（例えば、トランス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）
を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ遺伝子）であって、部位特異的ポリペプチドが、
ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；および
ｂ．標的ＤＮＡ内の二本鎖切断の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、標的ＤＮＡ内で二本鎖切断を引き起こす活性部分（例えば、ＮＵＣローブ）
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。

プラスミド上のＣＲＩＳＰＲニッカーゼ。
（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
ａ．標的ＤＮＡ中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント（例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント（例えば、トランス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）
を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ遺伝子）であって、部位特異的ポリペプチドが、
ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；および
ｂ．標的ＤＮＡ内の一本鎖切断の部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を引き起こす活性部分（例えば、ＮＵＣローブ）
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。

プラスミド上のＣＲＩＳＰＲａ。
（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
ａ．標的ＤＮＡ中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント（例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント（例えば、トランス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）
を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ遺伝子）であって、部位特異的ポリペプチドが、
ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；および
ｂ．標的ＤＮＡ内の転写調節部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、標的ＤＮＡ内での転写を調節する活性部分（例えば、ＮＵＣローブ；特定の実施形態では、転写を増大させる）
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。

プラスミド上のＣＲＩＳＰＲｉ。
（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡが、
ａ．標的ＤＮＡ中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント（例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはｃｒＲＮＡ）；および
ｂ．部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメント（例えば、トランス活性化ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ）
を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃａｓ遺伝子）であって、部位特異的ポリペプチドが、
ａ．ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分（例えば、ＲＥＣローブ）；および
ｂ．標的ＤＮＡ内の転写／翻訳調節部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡにより決定される、標的ＤＮＡ内での転写／翻訳を調節する活性部分（例えば、ＮＵＣローブ；幾つかの実施形態では、転写／翻訳を減少させる）
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。

プラスミド上のＣＲＩＳＰＲ、プラスミド上のＣＲＩＳＰＲニッカーゼ、プラスミド上のＣＲＩＳＰＲａ、およびプラスミド上のＣＲＩＳＰＲｉのそれぞれは、あるいは、幾つかの実施形態では、プラスミド上よりもむしろＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質として細胞中に投与される、発現される、または存在する１つまたは複数の適切なエレメントを有してもよい。保護されたｍＲＮＡの送達は、Ｋａｒｉｋｏ，ｅｔａｌ．の米国特許第８，２７８，０３６号に記載の通りであってもよい。

幾つかの実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａのそれぞれは、脱活性化されたｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含んでもよい。脱活性化されたｃａｓ９は、標的ＤＮＡに依然として結合するが、切断活性は有さない。ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９は、その２つの触媒ドメインを不活化するＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ点突然変異から生じ得る。

幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲｉは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの立体障害を介して転写開始または伸長を阻害する。ＣＲＩＳＰＲｉは、場合により、ｄＣａｓ９タンパク質のＣ末端への強力なリプレッサードメインの融合により増強することができる（ＣＲＩＳＰＲｅｉ）。幾つかの実施形態では、リプレッサードメインは、クロマチン修飾因子を動員および使用する。幾つかの実施形態では、リプレッサードメインは、Ｋａｇａｌｅ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．６ｎｏ２ｐｐ１４１−１４６（２０１１）に記載のドメイン：
１．ＬＤＬＮＲＰＰＰＶＥＮ−ＯｓＥＲＦ３リプレッサードメイン（ＬｘＬｘＰＰモチーフ）
２．ＬＲＬＦＧＶＮＭ−ＡｔＢＲＤリプレッサードメイン（Ｒ／ＫＬＦＧＶモチーフ）
３．ＬＫＬＦＧＶＷＬ−ＡｔＨｓｆＢ１リプレッサードメイン（Ｒ／ＫＬＦＧＶモチーフ）
４．ＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ−ＡｔＳＵＰリプレッサードメイン（ＥＡＲモチーフ）
５．ＥＲＳＮＳＩＥＬＲＮＳＦＹＧＲＡＲＴＳＰＷＳＹＧＤＹＤＮＣＱＱＤＨＤＹＬＬＧＦＳＷＰＰＲＳＹＴＣＳＦＣＫＲＥＦＲＳＡＱＡＬＧＧＨＭＮＶＨＲＲＤＲＡＲＬＲＬＱＱＳＰＳＳＳＳＴＰＳＰＰＹＰＮＰＮＹＳＹＳＴＭＡＮＳＰＰＰＨＨＳＰＬＴＬＦＰＴＬＳＰＰＳＳＰＲＹＲＡＧＬＩＲＳＬＳＰＫＳＫＨＴＰＥＮＡＣＫＴＫＫＳＳＬＬＶＥＡＧＥＡＴＲＦＴＳＫＤＡＣＫＩＬＲＮＤＥＩＩＳＬＥＬＥＩＧＬＩＮＥＳＥＱＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ^*−リプレッサードメインを含有する完全なＡｔＳＵＰ遺伝子（ＥＡＲモチーフ）
だけに限られないが、これらを含む。

幾つかの実施形態では、転写のＣＲＩＳＰＲａ活性化は、融合したＣ末端転写アクチベーターを含有するｄＣａｓ９タンパク質の使用により達成される。幾つかの実施形態では、活性化は、Ｃｈｅｎｇ，ＡＷｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ，ｐｐ１−９（２０１３）；Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１０ｐｐ９１３−９７６（２０１３）；Ｍａｅｄｅｒ，ＭＬ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１０ｐｐ９７７−９７９（２０１３）およびＭａｌｉ，Ｐ．，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．３１ｐｐ８３３−８３８（２０１３）に記載のような、ＶＰ６４（４ＸＶＰ１６）、ＡｔＥＲＦ９８活性化ドメイン、またはＡｔＥＲＦ９８ｘ４コンカテマーだけに限られないが、これらを含んでもよい。

幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲは、ニッカーゼを含む。特定の実施形態では、２つ以上のＣＲＩＳＰＲニッカーゼが使用される。幾つかの実施形態では、２つ以上のニッカーゼは、標的核酸の反対の鎖上を切断する。他の実施形態では、２つ以上のニッカーゼは、標的核酸の同じ鎖上を切断する。

本明細書で使用する「リプレッサータンパク質」または「リプレッサー」とは、それぞれ、転写または翻訳を防止するためにＤＮＡのオペレーターまたはＲＮＡに結合するタンパク質を指す。

本明細書で使用する「抑制」とは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ上の特定部位へのリプレッサータンパク質の結合による転写または翻訳の阻害を指す。幾つかの実施形態では、抑制は、転写または翻訳レベルの少なくとも１．５倍、他の実施形態では、少なくとも２倍、他の実施形態では、少なくとも５倍の有意な変化を含む。

遺伝子の転写および／または翻訳に関して本明細書で使用する「アクチベータータンパク質」または「アクチベーター」は、ＤＮＡのオペレーターまたはＲＮＡに結合して、それぞれ、転写または翻訳を増強または増大させるタンパク質を指す。

遺伝子転写および／または翻訳に関して本明細書で使用する、遺伝子転写および／または翻訳に関する「活性化」とは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ上の特定部位へのアクチベータータンパク質の結合により転写または翻訳を増強または増大させることを指す。幾つかの実施形態では、活性化は、転写または翻訳レベルの少なくとも１．５倍、幾つかの実施形態では、少なくとも２倍、幾つかの実施形態では、少なくとも５倍の有意な変化を含む。

特定の実施形態では、１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件は、ＧＲＯＮまたは塩基除去修復の標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、ＧＲＯＮまたは非相同末端結合の標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、ＧＲＯＮまたはマイクロホモロジー仲介型末端結合の標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、ＧＲＯＮまたは相同組換えの標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、およびＧＲＯＮまたは修復を行うための標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入の１つまたは複数を含み得る（例えば、塩基除去修復（ＢＥＲ）；相同組換え修復（ＨＲ）；ミスマッチ修復（ＭＭＲ）；古典的および代替的ＮＨＥＪを含む非相同末端結合修復（ＮＨＥＪ）；およびヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ））。

本明細書で記載するように、本明細書で使用するためのＧＲＯＮは、従来型ＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチドからの以下の改変：
１つまたは複数の無塩基部位ヌクレオチド、
１つまたは複数の８’オキソｄＡおよび／または８’オキソｄＧヌクレオチド、
その３’末端における逆向き塩基、
１つまたは複数の２’Ｏ−メチルヌクレオチド、
１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチド、
１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドをさらに修飾することができる、その５’末端における１つまたは複数、および幾つかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのＲＮＡヌクレオチド、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドをさらに修飾することができる、その３’末端における１つまたは複数、および幾つかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのＲＮＡヌクレオチド、
その５’末端における１つまたは複数、および幾つかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くの２’Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、
挿入色素、
５’末端キャップ、
ホスホチオエート修飾、メチルホスホネート修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）修飾、ジＰＳ修飾、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾からなる群から選択される骨格修飾、
１つまたは複数の鎖間架橋、
それに、および幾つかの実施形態では、ＧＲＯＮの５’または３’末端に共有結合した１つまたは複数の蛍光色素、ならびに
ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる１つまたは複数の塩基
のうちの１つまたは複数を含んでもよい。この一覧は限定的であることを意味しない。

本明細書で使用する用語「ゆらぎ塩基」とは、変化が参照配列と比較してヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の配列を変化させない、参照ヌクレオチド配列の１つまたは複数のヌクレオチド塩基中の変化を指す。

本明細書で使用する用語「非ヌクレオチド」または「無塩基部位ヌクレオチド」とは、糖および／またはリン酸置換のいずれかを含む、１つまたは複数のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖中に組み込むことができ、残りの塩基にその酵素活性を示させる任意の基または化合物を指す。基または化合物は、それがアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなどの、一般的に認識されるヌクレオチド塩基を含有しない点で無塩基性である。それは、当業界で、および本明細書で記載されるような２’または３’ＨまたはＯＨへの置換を有してもよい。

本明細書で記載するように、特定の実施形態において、ＧＲＯＮの質および変換効率は、ヌクレオチド多量体、例えば、二量体、三量体、四量体などを使用してＧＲＯＮの全体または一部分を合成することにより、その純度を改善することにより改善することができる。

特定の実施形態では、標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列は、植物細胞内に存在する、例えば、標的ＤＮＡ配列は、植物細胞ゲノム内に存在する。植物細胞は非トランスジェニックまたはトランスジェニックであってよく、標的ＤＮＡ配列は植物細胞の導入遺伝子または内在性遺伝子であってよい。

特定の実施形態では、１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件は、植物細胞へのＧＲＯＮの送達の前に、またはそれと同時に、またはその後に植物細胞への一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する１つまたは複数の化合物の導入を含む。例示的な化合物は本明細書に記載される。

本明細書で記載する方法および組成物は、一般に植物に適用可能である。例えば、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ種、Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍｄｕｒｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍｓｐｅｌｔａ、ＴｒｉｔｉｃｕｍｚｈｕｋｏｖｓｋｙｉおよびＴｒｉｔｉｃｕｍｕｒａｒｔｕならびにそのハイブリッドだけに限られないが、これらを含む）、オオムギ（ＨｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇａｒｅＬ．、Ｈｏｒｄｅｕｍｃｏｍｏｓｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍｄｅｐｒｅｓｓｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍｉｎｔｅｒｃｅｄｅｎｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍｊｕｂａｔｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍｍａｒｉｎｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍｍａｒｉｎｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍｐａｒｏｄｉｉ、Ｈｏｒｄｅｕｍｐｕｓｉｌｌｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍｓｅｃａｌｉｎｕｍ、およびＨｏｒｄｅｕｍｓｐｏｎｔａｎｅｕｍだけに限られないが、これらを含む）、イネ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ亜種ｉｎｄｉｃａ、Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ亜種ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ亜種ｊａｖａｎｉｃａ、Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ亜種ｇｌｕｔｉｎｏｓａ（もち米）、ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＡｒｏｍａｔｉｃａ群（例えば、バスマティ）、およびＯｒｙｚａｓａｔｉｖａ（浮稲群）だけに限られないが、これらを含む）、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、ソラマメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅｓｙｌｖｅｓｔｒｅ、Ｓｅｃａｌｅｓｔｒｉｃｔｕｍ、Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ、Ｓｅｃａｌｅｖａｖｉｌｏｖｉｉ、Ｓｅｃａｌｅａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅｃｉｌｉａｔｏｇｌｕｍｅ、Ｓｅｃａｌｅａｎｃｅｓｔｒａｌｅ、およびＳｅｃａｌｅｍｏｎｔａｎｕｍだけに限られないが、これらを含む）、オートムギ、芝生（Ｚｏｙｓｉａｊａｐｏｎｉｃａ、Ａｇｒｏｓｔｒｉｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｐｏａｐｒａｔｅｎｓｉｓ、Ｐｏａａｎｎｕａ、Ｄｉｇｉｔａｒｉａｓａｎｇｕｉｎａｌｉｓ、Ｃｙｐｅｒｕｓｒｏｔｕｎｄｕｓ、Ｋｙｌｌｉｎｇａｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ｃｙｐｅｒｕｓａｍｕｒｉｃｕｓ、Ｅｒｉｇｅｒｏｎｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｙｄｒｏｃｏｔｙｌｅｓｉｂｔｈｏｒｐｉｏｉｄｅｓ、Ｋｕｍｍｅｒｏｗｉａｓｔｒｉａｔａ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｈｕｍｉｆｕｓａ、およびＶｉｏｌａａｒｖｅｎｓｉｓだけに限られないが、これらを含む、芝草を含む）と飼草、アマ、ナタネ、ワタ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、ユリ、既に特に記載されていない限りにおいて、ナッツ生成植物からなる群から植物種を選択することができる。これらは、細菌、酵母、真菌、藻類、および哺乳動物細胞およびさらにそれらのオルガネラ（例えば、ミトコンドリアと葉緑体）だけには限られないが、それらを含めた他の全ての生物系に全部または一部分を適用することもできる。幾つかの実施形態では、生物または細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｂａｃｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄａｍｏｎａｓｒｈｉｅｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａからなる群から選択される種のものである。幾つかの実施形態においては、酵母は、Ｙａｒｒｏｗｉａｌｙｐｏｌｉｔｉｃａである。他の実施形態では、酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではない。幾つかの実施形態では、植物または植物細胞は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍｐｈｕｒｅｊａ、Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ、Ｌｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ、およびＺｅａｍａｙｓからなる群から選択される種のものである。植物種を、イネ科の単子葉植物からなる群から選択することができる。イネ科植物を、２つの主要なクレード、Ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅ、Ｅｈｒｈａｒｔｏｉｄｅａｅ、およびＰｏｏｉｄｅａｅ亜科を含有するクレード（ＢＥＰクレード）と、Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ、Ａｒｕｎｄｉｎｏｉｄｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｉｄｏｉｄｅａｅ、Ｃｅｎｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅａｅ、Ｍｉｃｒａｉｒｏｉｄｅａｅ、Ａｒｉｓｔｉｄｏｉｄｅａｅ、およびＤａｎｔｈｏｎｉｏｉｄｅａｅ亜科を含有するクレード（ＰＡＣＣＭＡＤクレード）とに分割することができる。Ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅ亜科は、Ｏｒｙｚｅａｅ連を含む。植物種は、ＢＥＰクレードの植物、特に、ＢａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅおよびＥｈｒｈａｒｔｏｉｄｅａｅ亜科の植物と関連してもよい。ＢＥＴクレードは、Ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅ、Ｅｈｒｈａｒｔｏｉｄｅａｅ、Ｔｒｉｔｉｃｏｄａｅ群を含み、他のＰｏｏｉｄｅａｅ亜科の群は含まない。ＢＥＴ作物植物は、ＢＥＴサブクレードのメンバー、例えば、オオムギ、コーンなどである、食物または飼料のために増殖させる植物である。

特定の実施形態では、方法は、植物細胞からＧＲＯＮによって導入された突然変異を有する植物を再生するステップをさらに含み、植物から種子を回収するステップを含んでもよい。

関連態様において、本開示は、本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む植物細胞、本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む植物、または本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む種子、または本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む種子の子孫に関する。

本開示の他の実施形態は、以下に詳述する記載、例示的実施形態、および特許請求の範囲から明らかとなる。

（ＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ部分を有する）ホスホチオエート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮおよび５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮによって仲介されるＢＦＰからＧＦＰへの変換を示す図である。「２’−Ｏ−メチルＧＲＯＮ」と本明細書で呼ばれる、ＲＮＡ／ＤＮＡを含むＧＲＯＮを示す図である。ＢＦＰ５ＣＲＩＳＰＲが標的とするｂｆｐ遺伝子上の位置の略図である。ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａモデル系における、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の割合に対する、様々な長さのＣｙ３または３ＰＳＧＲＯＮのいずれかを導入されたＣＲＩＳＰＲの効果の結果を示す図である。ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａモデル系における、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の割合に対する、様々な長さの３ＰＳＧＲＯＮを導入されたＣＲＩＳＰＲの効果の結果を示す図である。実施例９で使用されるＧＲＯＮ設計の略図である。７１量体ＧＲＯＮからのフローサイトメトリーにより決定されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰトランスジェニックモデル系からのＧＦＰ陽性プロトプラストの平均割合の測定値を示す図である。２０１量体ＧＲＯＮからのフローサイトメトリーにより決定されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰトランスジェニックモデル系からのＧＦＰ陽性プロトプラストの測定値を示す図である。ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａモデル系におけるＧＦＰ陽性細胞の平均割合に対する、コードおよび非コードＧＲＯＮを導入されたＣＲＩＳＰＲの効果を示す図である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体への一本鎖ＧＲＯＮまたは二本鎖ＤＮＡのテザリングの略図である。異なる長さのスペーサーのＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を仲介する際のＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮの効果の結果を示す図である。プラスミド（ｇＲＮＡプラスミド）上にコードされた、またはアンプリコン（ｇＲＮＡアンプリコン）として使用されたスペーサーのＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を仲介する際のＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮの効果の結果を示す図である。非修飾対３ＰＳ修飾４１量体ＧＲＯＮのＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を仲介する際のＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮの効果の結果を示す図である。Ｔ＝０でＣＲＩＳＰＲプラスミドでＰＥＧ処理された茎頂プロトプラストから誘導される３および６週齢のＬｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）微小カルスの次世代配列決定の結果を示す図である。Ｔ＝０でＣＲＩＳＰＲプラスミドでＰＥＧ処理された茎頂プロトプラストから誘導される３および６週齢のＬｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ微小カルスの次世代配列決定の結果を示す図である。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａプロトプラストにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ活性および遺伝子編集を示す図である。図１６Ａ：送達の７２時間後に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミド（ＢＣ−１）で処理されたプロトプラストにおけるディープシーケンシングにより決定された、サイズに基づくインデルの分布。インデルは総リードの０．７９％に相当した。図１６Ｂ：プラスミド（ＢＣ−１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−６）の送達の７２時間後にフローサイトメトリーにより同定されたＧＦＰ蛍光プロトプラストの割合により測定されたＢＦＰからＧＦＰへの編集。示されたデータは、トランスフェクション効率について正規化されていない。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝９）である。異なる長さおよび化学修飾のＧＲＯＮと組み合わせたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを用いたＡ．ｔｈａｌｉａｎａプロトプラストにおける遺伝子編集を示す図である。図１７ａ：プラスミド（ＢＣ−１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−１）または（ＣＧ−２）の送達の７２時間後にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集における３ＰＳと非修飾ＧＲＯＮの比較。図１７ｂ：プラスミド（ＢＣ−２）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−５）または（ＣＧ−８）の送達後７２時間でのフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集におけるＧＲＯＮの長さの比較。図１７ｃ：プラスミド（ＢＣ−１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−６）、（ＣＧ−９）または（ＣＧ−１０）の送達の７２時間後にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集に関する３ＰＳと２’−Ｏ−ＭｅＧＲＯＮとの比較。図１７ｄ：プラスミド（ＢＣ−３）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−３）または（ＣＧ−４）の送達の７２時間後にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集に関する３ＰＳ−とＣｙ３ＧＲＯＮとの比較。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）である。（ＣＧ−１）：ＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ非修飾；（ＣＧ−２）：ＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ３ＰＳ修飾；（ＣＧ−３）：ＢＦＰセンス４１ｎｂ３ＰＳ修飾；（ＣＧ−４）：ＢＦＰセンス４１ｎｂＣｙ３修飾；（ＣＧ−５）：ＢＦＰセンス６０ｎｂ３ＰＳ修飾；（ＣＧ−６）：ＢＦＰアンチセンス２０１ｎｂ３ＰＳ修飾；（ＣＧ−８）：ＢＦＰセンス２０１ｎｂ３ＰＳ修飾；（ＣＧ−９）：最初の５’ＲＮＡ塩基上でのＢＦＰアンチセンス２０１ｎｂ２’−Ｏ−Ｍｅ修飾；（ＣＧ−１０）：最初の９つの５’ＲＮＡ塩基上でのＢＦＰアンチセンス２０１ｎｂ２’−Ｏ−Ｍｅ修飾。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａおよびＬ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍプロトプラスト中でのＴＡＬＥＮヌクレアーゼ活性および遺伝子編集を示す図である。図１８ａ：送達の７２時間後にＴＡＬＥＮプラスミド（ＢＴ−１）で処理されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロトプラスト中でのディープシーケンシングにより決定されたサイズに基づくインデルの分布。インデルは総リードの０．５１％を占めていた。図１８ｂ：プラスミド（ＢＴ−１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−７）の送達の４８時間後にフローサイトメトリーにより測定されたＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集。図１８ｃ：送達の７ｄ後にＥＰＳＰＳ遺伝子を標的化するＴＡＬＥＮ（ＬｕＥＴ−１）で処理されたＬ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍプロトプラスト中でのｂｐ長に基づくインデルの代表的分布。インデルの総頻度は０．５０％である。図１８ｄ：プロトプラストへのプラスミド（ＬｕＥＴ−１）およびＧＲＯＮ（ＣＧ−１１）の送達後７ｄでのディープシーケンシングにより測定されたＬ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍのＥＰＳＰＳ遺伝子編集。総リードの割合は、総リードの割合としてＴ９７ＩとＰ１０１Ａ編集の両方を含有するリードの数を表す。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）である。（ＣＧ−７）：ＢＦＰセンス２０１ｎｂ３ＰＳ修飾；（ＣＧ−１１）：ＥＰＳＰＳセンス１４４ｎｂＣｙ３修飾。トランスジェニックＡ．ｔｈａｌｉａｎａプロトプラスト中でのＢＦＰからＧＦＰへの編集に対する、二本鎖切断を誘導する抗生物質ゼオシンおよびフレオマイシンの効果を示す図である。プロトプラストを、ゼオシンまたはフレオマイシンで９０分間処理した後、ＧＲＯＮをＰＥＧ導入した（ＣＧ２）。編集の成功はＧＦＰ蛍光をもたらした。緑色蛍光を発するプロトプラストを、ＡｔｔｕｎｅＡｃｏｕｓｔｉｃＦｏｃｕｓｉｎｇＣｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して定量した。ＢＦＰからＧＦＰへの変換を標的化する、ＢＦＰトランスジェニックプロトプラストへのＧＲＯＮ送達の５日後の変換されたＢＦＰトランスジェニックＡ．ｔｈａｌｉａｎａ細胞を示す図である。緑色蛍光は、ＢＦＰ−ＧＦＰ編集を示す。明視野画像；Ｂ、青色光中での同じ視野。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）である；（ＣＧ２）：ＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ３ＰＳ修飾；（ＣＧ１２）：ＢＦＰアンチセンス４１ｎｂ３ＰＳ修飾非標的化。画像を、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓＭｉｃｒｏシステム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて獲得した。スケールバー＝２０μｍ。ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓおよびＴＡＬＥＮ設計を示す図である。図２１Ａ：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドの略図である。マンノピンシンターゼ（Ｍａｓ）プロモーターは、高等植物のためにコドン最適化されたＣａｓ９遺伝子の転写を駆動している。Ｃａｓ９遺伝子は、遺伝子のいずれかの末端に２つのＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）と、２ＸＦＬＡＧエピトープタグとを含有する。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＵ６プロモーターは、ｇＲＮＡ足場の転写を駆動しており、転写はポリ（Ｔ）シグナルを使用して終結される。図２１Ｂ：ＴＡＬＥＮプラスミドの略図である。Ｍａｓプロモーターは、２Ａリボソームスキッピング配列と一緒に連結された右および左のテールアームの転写を駆動している。Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼは、それぞれのテールアームの３’末端に連結される。左のテールの５’末端は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）とＶ５エピトープタグとを含有する。ｒｂｃＴは、ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍのＲＢＣＳＥ９遺伝子ターミネーターである。ＢＦＰおよびＥＰＳＰＳヌクレアーゼ標的領域を示す図である。ａ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプロトスペーサー、ＢＣ−１、ＢＣ−２およびＢＣ−３ならびにＴＡＬＥＮＢＴ−１、左および右のテールアームに関するＢＦＰ遺伝子標的領域。ＰＡＭ配列を赤色で示す。ＴＡＬＥＮ結合部位は太字および下線付きである。ＢＦＰからＧＦＰへの編集ＣＡＣ→ＴＡＣ（Ｈ６６Ｙ）の部位は、緑色の太字である。ｂ、ＴＡＬＥＮ、ＬｕＥＴ−１、左および右のテールアームに関するＥＰＳＰＳ遺伝子標的領域。ＥＰＳＰＳ変換ＡＣＡ＞ＡＴＡおよびＣＣＧ＞ＧＣＧ（Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａ）の部位は緑色である。Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ（ノスズメノテッポウ）ＡＣＣａｓｅ遺伝子産物のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉのＥＰＳＰＳ遺伝子産物のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。例示的な類似ＥＰＳＰＳ位置を示す図である。例示的なＡＣＣａｓｅ配列を示す図である。

オリゴヌクレオチドによって仲介される標的遺伝子修飾は、欠失、短い挿入、および点突然変異をもたらすためのＤＮＡの短いストレッチの特異的改変において使用するのに値する技法である。これらの方法はＤＮＡ対形成／アニーリング、次にＤＮＡ修復／組換え事象を含む。最初に核酸は、細胞タンパク質因子によって仲介されるプロセスにおいて、二本鎖ＤＮＡ中のその相補鎖とアニーリングする。このアニーリングによって（点突然変異の場合）中央に位置するミスマッチ塩基対を生成し、内在性タンパク質機構を刺激して修復プロセス中に第２のステップ、染色体配列および／またはオルガネラ内の（例えば、ミトコンドリアと葉緑体）の部位特異的修飾を開始させる可能性が最も高い構造不安定化をもたらす。この新たに導入されたミスマッチはＤＮＡ修復機構を誘導し、標的部位の最終修正をもたらす第２の修復事象を実施する。本明細書に開示される様々な態様および実施形態における本発明の方法および組成物は、ＤＮＡ修復構成要素の利用性を高め、したがって標的核酸に対する遺伝子修復仲介型修飾の効率と再現性を高める新規な手法を提供することにより、前記方法を改良する。

部位特異的ゲノム修飾に有効な方法は、研究、臨床遺伝子療法、工業用微生物学および農学にとって望ましい。一手法は、第３の鎖として二本鎖ＤＮＡに配列特異的に結合する三本鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を利用して、定方向突然変異誘発を仲介する。このようなＴＦＯは、ソラレンもしくはクロラムブシルなどの変異原性化学物質の送達（Ｈａｖｒｅｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔ’ｌＡｃａｄＳｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７８７９−７８８３，１９９３；Ｈａｖｒｅｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ６７：７３２３−７３３１，１９９３；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１５：１７５９−１７６８，１９９５；Ｔａｋａｓｕｇｉｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔ’ｌＡｃａｄＳｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６０２−５６０６，１９９１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２５：３４４０−３４４４，１９９７）、または誤りがちの修復を誘発するのに十分なアフィニティーでの結合（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：８０２−８０５，１９９６）のいずれかによって作用し得る。

ゲノム修飾に関する別の戦略は、外来ＤＮＡ断片と標的遺伝子の間の相同組換えの誘導を含む。この手法は首尾よく使用され哺乳動物細胞中の選択遺伝子が標的化および妨害されており、特異的遺伝子ノックアウトがあるトランスジェニックマウスの生成が可能になっている（Ｃａｐｅｅｃｈｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８−１２９２，１９８９、Ｗａｇｎｅｒ，米国特許第４，８７３，１９１号）。この手法は、選択可能マーカーの導入を含み所望の組換え体の単離を可能にするものである。選択がない場合、典型的遺伝子導入実験におけるトランスフェクトＤＮＡの相同と非相同組み込みの比は低く、通常は１：１０００以下の範囲内である（Ｓｅｄｉｖｙｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２）。相同組み込みのこの低い効率によって、実験用途または遺伝子療法に関する遺伝子導入の利用が限定される。相同組換えの頻度は、ＵＶ照射および選択発癌性物質が原因の標的部位への損傷（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ８：１９６−２０２，１９８８）によって、ならびに部位特異的エンドヌクレアーゼ（Ｓｅｄｉｖｙｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２；Ｒｏｕｅｔｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔ’ｌＡｃａｄＳｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６０６４−６０６８，１９９４；Ｓｅｇａｌｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔ’ｌＡｃａｄＳｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８０６−８１０，１９９５）によって高まる可能性がある。さらに、三本鎖対象ソラレン光付加物によって誘導されるＤＮＡ損傷は、染色体外ベクター内およびその間の組換えを刺激する可能性がある（Ｓｅｇａｌｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔ’ｌＡｃａｄＳｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８０６−８１０，１９９５；Ｆａｒｕｑｉｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１６：６８２０−６８２８，１９９６、Ｇｌａｚｅｒ，米国特許第５，９６２，４２６号）。

直鎖状ドナー断片は、それらの環状相当物より組換えの影響を受けやすい（Ｆｏｌｇｅｒｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ２：１３７２−１３８７，１９８２）。組換えは、特定の実施形態においては、ドナー部位と標的部位両方の間の連続した相同性の長さによっても影響を受け、短い断片は組換えに関して無力な基質であると思われることが多い（Ｒｕｂｎｉｔｚｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ４：２２５３−２２５８，１９８４）。それにもかかわらず、遺伝子補正用のＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの短い断片の使用が、様々な戦略の焦点である（Ｋｕｎｚｅｌｍａｎｎｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ３：８５９−８６７，１９９６）。

本明細書で使用する「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそれらの断片もしくは一部分、および一本鎖もしくは二本鎖であってよくセンス鎖もしくはアンチセンス鎖を表すゲノムもしくは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指す。

本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、少なくとも約１０核酸塩基および最大約１０００核酸塩基の核酸塩基のポリマーを指す。

本明細書で使用する用語「ＤＮＡ修飾分子」および「ＤＮＡ修飾試薬」は、細胞のゲノム中の核酸配列を認識しそれに特異的に結合することができ、ゲノム内の標的ヌクレオチド配列を修飾することができ、認識およびＤＮＡ修飾分子と核酸配列の特異的結合がタンパク質非依存的である分子を指す。ＤＮＡ修飾分子に関して本明細書で使用する用語「タンパク質非依存的」は、ＤＮＡ修飾分子が核酸配列の認識、および／またはそれとの特異的結合にタンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要としないことを意味する。ＤＮＡ修飾分子は、遺伝子変換の助長を目的とする、三本鎖形成オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリアミド、およびオリゴヌクレオチドだけには限られないが、これらによって例示される。本開示のＤＮＡ修飾分子は、ある特定の実施形態では、相同組換えに使用される従来技術の核酸配列がタンパク質依存的である点で、相同組換えに使用される従来技術の核酸配列（ＷｏｎｇａｎｄＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２２９４−２２９５，１９８７）と区別される。分子に関して本明細書で使用する用語「タンパク質依存的」は、分子が核酸配列の認識、および／またはそれとの特異的結合にタンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要とすることを意味する。ＤＮＡ修飾分子が核酸配列の認識、および／またはそれとの特異的結合にタンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要するかどうか決定するための方法は、当技術分野の技術の範囲内にある（例えば、Ｄｅｎｎｉｓｅｔａｌ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２７：４７３４−４７４２，１９９９を参照）。例えばＤＮＡ修飾分子は、任意のタンパク質および／または酵素の不在下で核酸配列と共にｉｎｖｉｔｒｏでインキュベートすることができる。ＤＮＡ修飾分子と核酸配列の間の特異的結合の検出によって、ＤＮＡ修飾分子がタンパク質非依存的であることを実証する。他方で、ＤＮＡ修飾分子と核酸配列の間の特異的結合の不在は、ＤＮＡ修飾分子がタンパク質依存的であることおよび／または他の因子を必要とすることを実証する。

「三本鎖形成オリゴヌクレオチド」（ＴＦＯ）は、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡヘリックスの主要溝に結合して三重ヘリックスを形成することができる、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列として定義する。ＴＦＯは任意の特定長に限定されないが、ＴＦＯの好ましい長さは２５０ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、または１００ヌクレオチド以下、または５〜５０ヌクレオチド、または１０〜２５ヌクレオチド、または１５〜２５ヌクレオチドである。三重ヘリックスの形成のためＴＦＯと二本鎖ＤＮＡの間で一定の度合いの配列特異性が必要であるが、三重ヘリックスが形成可能である限り、特定度合いの特異性が必要とされるわけではない。同様に、三重ヘリックスが形成可能である限り、ＴＦＯと二本鎖ヘリックスの間で特異的度合いのアビディティーまたはアフィニティーが必要とされるわけではない。ＴＦＯが特異的に結合するヌクレオチド配列の長さを限定する目的ではないが、一実施形態において、ＴＦＯが特異的に結合するヌクレオチド配列は１〜１００、幾つかの実施形態では５〜５０、さらに他の実施形態では１０〜２５、および他の実施形態では１５〜２５ヌクレオチドである。さらに「三重ヘリックス」は、二重らせん核酸内の標的配列と結合したオリゴヌクレオチドを含む二重らせん核酸として定義する。「二重らせん」核酸は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、およびＤＮＡとＲＮＡの混合二本鎖を含めた任意の二本鎖核酸であってよい。二本鎖核酸は任意の特定長に限定されない。しかしながら好ましい実施形態では、二本鎖核酸は５００ｂｐを超える、幾つかの実施形態では１ｋｂを超える、および幾つかの実施形態では約５ｋｂを超える長さを有する。多くの適用例において、二重らせん核酸は細胞、ゲノム核酸である。三本鎖形成オリゴヌクレオチドは、パラレルまたはアンチパラレル形式で標的配列に結合することができる。

「ペプチド核酸」、「ポリアミド」または「ＰＮＡ」は、リン酸骨格がＮ−アミノエチルグリシン系ポリアミド構造に置換された核酸である。ワトソン−クリックの塩基対形成法則に従うと、ＰＮＡはそれら本来の相当物より相補核酸に対して高いアフィニティーを有する。ＰＮＡは以下の化学量論比のＤＮＡとの非常に安定した三重ヘリックス構造を形成し得る：（ＰＮＡ）２．ＤＮＡ。ペプチド核酸およびポリアミドは任意の特定長に限定されないが、ペプチド核酸およびポリアミドの好ましい長さは２００ヌクレオチド以下、幾つかの実施形態では１００ヌクレオチド以下、および幾つかの実施形態では５〜５０ヌクレオチド長である。ペプチド核酸およびポリアミドが特異的に結合するヌクレオチド配列の長さを限定する目的ではないが、一実施形態において、ペプチド核酸およびポリアミドが特異的に結合するヌクレオチド配列は１〜１００、幾つかの実施形態では５〜５０、さらに他の実施形態では５〜２５、および他の実施形態では５〜２０ヌクレオチドである。

用語「細胞」は単細胞を指す。用語「細胞（複数）」は細胞の集団を指す。集団は１つの細胞型を含む純粋な集団であってよい。同様に、集団は２つ以上の細胞型を含み得る。本開示では、一細胞集団が含み得る細胞型の数に制限はない。本明細書で使用する細胞は、植物カルス細胞、細胞壁を含む、および含まない細胞、原核細胞ならびに真核細胞だけに限られないが、これらを含む。

細胞のサンプルを言及するときの用語「同調させる」または「同調した」、または「同調細胞」もしくは「同調細胞集団」は、細胞周期の同じ時期に細胞集団が存在するように処置した複数の細胞を指す。サンプル内の全ての細胞が同調状態である必要はない。わずかな割合の細胞がサンプル内の大部分の細胞と同調していない可能性がある。同調状態である細胞の好ましい範囲は１０〜１００％である。より好ましい範囲は３０〜１００％である。さらに、細胞が一細胞型の純粋な集団である必要はない。２つ以上の細胞型がサンプル内に含有される可能性がある。この点において、サンプル内の別の細胞型と比較して、一細胞型のみが同調状態である、または細胞周期の異なる時期に存在する可能性がある。

単細胞を言及するときの用語「同調細胞」は、操作前の細胞の細胞周期の時期と異なる細胞周期の時期に細胞が存在するように、細胞を操作したことを意味する。あるいは「同調細胞」は、対照細胞（例えば、操作がない状態の細胞）と比較して、操作前の細胞が存在した細胞周期の時期の時間を改変（すなわち、延長または縮小）するよう操作した細胞を指す。

用語「細胞周期」は、分裂（すなわち、増殖）時に細胞が経る生理的および形態的変化の進行を指す。細胞周期は一般に、「分裂間期」、「前期」、「中期」、「後期」、および「終期」と呼ばれる時期で構成されると認識されている。さらに、細胞周期の一部分は「Ｍ（有糸分裂期）」、「Ｓ（合成期）」、「Ｇ０」、「Ｇ１（ギャップ１）」および「Ｇ２（ギャップ２）」と呼ぶことができる。さらに細胞周期は、前述の名称の時期の間に存在する進行期間を含む。

用語「細胞周期抑制」は、細胞または細胞集団における細胞周期進行の休止を指す。細胞周期抑制は通常、細胞生理の態様に干渉する作用物質（化学物質、タンパク質またはその他）への細胞の露出によって誘導され細胞周期の続行を妨げる。

「増殖」または「細胞増殖」は、２つの娘細胞に繰り返し分裂し、それによって集団における全体的な細胞の増大をもたらす親細胞の能力を指す。細胞集団は生物中、または培養装置中に存在してよい。

用語「ＤＮＡ修飾可能」または「ＤＮＡ修飾手段」は、標的ＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列に対する変化を誘導する能力がある、またはその誘導を手助けすることができる手順、および内在もしくは外来作用物質もしくは試薬を指す。標的ＤＮＡセグメント上の１つまたは複数の塩基の欠失、付加または置換によって、このような変化を施すことができる。ＤＮＡ配列の変化が、標的配列によってコードされる任意の遺伝子に対する機能的変化をもたらすことは必要とされない。さらに、任意の特定部分または割合の細胞にＤＮＡに対する変化を施すことは必要とされない。

用語「対象のヌクレオチド配列」は、当業者によるその操作が何らかの理由で望ましいと思われる可能性のある、任意のヌクレオチド配列を指す。このようなヌクレオチド配列には、構造遺伝子（例えば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、薬剤耐性遺伝子、増殖因子など）のコード配列、およびｍＲＮＡまたはタンパク質産物をコードしていない非コード制御配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、ポリアデニル化配列、終止配列、ｍｉＲＮＡなどの制御ＲＮＡ）があるが、これらだけには限られない。

「アミノ酸配列」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド配列」および「ペプチド」は本明細書中で交互に使用してアミノ酸の配列を指す。

本明細書で使用する「標的配列」は、８ヌクレオチド長を超えるが２０１ヌクレオチド長未満の配列を含む二重らせん核酸を指す。幾つかの実施形態では、標的配列は８〜３０塩基である。一般に標的配列は、二重らせん核酸上の一鎖上のヌクレオチド配列によって定義される。

本明細書で使用する「プリンリッチ配列」または「ポリプリン配列」は、二重らせん核酸配列の一鎖上のヌクレオチド配列を言及するとき、標的配列の５０％を超えるヌクレオチドがプリン塩基を含有するヌクレオチドの隣接配列として定義する。しかしながら、プリンリッチ標的配列は、６０％を超えるプリンヌクレオチド、幾つかの実施形態では７５％を超えるプリンヌクレオチド、他の実施形態では９０％を超えるプリンヌクレオチド、およびさらに他の実施形態では１００％のプリンヌクレオチドを含有することが好ましい。

本明細書で使用する「ピリミジンリッチ配列」または「ポリピリミジン配列」は、二重らせん核酸配列の一鎖上のヌクレオチド配列を言及するとき、標的配列の５０％を超えるヌクレオチドがピリミジン塩基を含有するヌクレオチドの隣接配列として定義する。しかしながら、ピリミジンリッチ標的配列は、６０％を超えるピリミジンヌクレオチド、および幾つかの実施形態では７５％を超えるピリミジンヌクレオチドを含有することが好ましい。幾つかの実施形態では、配列は９０％を超えるピリミジンヌクレオチドを含有し、他の実施形態では、１００％ピリミジンヌクレオチドである。

第１のヌクレオチド配列の「変異体」は、（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイの使用またはＤＮＡ配列決定の使用によって検出可能である、１つまたは複数の欠失、挿入、または置換を有することにより）第１のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列として定義する。この定義内に含まれるのは、第１のヌクレオチド配列のゲノム配列に対する改変または修飾の検出である。例えば、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して、（１）ゲノム中に含まれるとき第１のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる制限酵素断片のパターンの改変（すなわちＲＦＬＰ分析）、（２）第１のヌクレオチド配列を含有するゲノムＤＮＡのサンプルに第１のヌクレオチド配列の選択部分がハイブリダイズできないこと（例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用）、（３）第１のヌクレオチド配列に関する正常染色体遺伝子座以外の遺伝子座とのハイブリダイゼーションなどの、不適切または予想外なハイブリダイゼーションを検出することができる（例えば、中期染色体分布に対する蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などを使用）。変異体の一例は突然変異野生型配列である。

本明細書で使用する用語「核酸」および「非修飾核酸」は、周知の４デオキシリボ核酸塩基（すなわち、グアニン、アデニン、シトシン、およびチミン）のいずれか１つを指す。用語「修飾核酸」は、非修飾核酸の構造に対してその構造が改変された核酸を指す。このような修飾の例示は、塩基の置換、共有結合修飾、アミノおよび窒素環のアルキル化、ならびに二重結合の飽和などであると思われる。

本明細書で使用する用語「突然変異」および「修飾」およびこれらと文法上同等な用語は、核酸配列に関して使用するとき、交互に使用して欠失、挿入、置換、鎖切断、および／または付加体の導入を指す。「欠失」は、１つまたは複数のヌクレオチドが無い核酸配列の変化として定義する。「挿入」または「付加」は、１つまたは複数のヌクレオチドの付加が起こった核酸配列の変化である。「置換」は、交換対象の１つまたは複数のヌクレオチドとは異なる分子である分子と、１つまたは複数のヌクレオチドの交換から生じる。例えば、シトシン、アデニン、グアニン、またはウリジンとチミンの交換によって例示されるように、一核酸は異なる核酸と交換することができる。ピリミジンからピリミジン（例えば、ＣからＴまたはＴからＣのヌクレオチド置換）またはプリンからプリン（例えば、ＧからＡまたはＡからＧのヌクレオチド置換）はトランジションと呼ばれ、一方ピリミジンからプリンまたはプリンからピリミジン（例えば、ＧからＴまたはＧからＣまたはＡからＴまたはＡからＣ）はトランスバージョンと呼ばれる。あるいは、チミンとチミングリコールの交換によって例示されるように、一核酸は修飾核酸と交換することができる。突然変異はミスマッチをもたらす可能性がある。用語「ミスマッチ」は、それぞれの核酸が異なるポリ核酸配列上に存在する２核酸間の非共有結合相互作用を指し、これは塩基対形成の法則に従わない。例えば、部分的相補配列５’−ＡＧＴ−３’および５’−ＡＡＴ−３’に関しては、Ｇ−Ａミスマッチ（トランジション）が存在する。用語「付加体の導入」または「付加体形成」は、結合が（幾つかの実施形態では１０％〜１００％、他の実施形態では５０％〜１００％、および幾つかの実施形態では７５％〜１００％の）ＤＮＡ複製および／または転写レベルの低下をもたらすような、ＤＮＡ配列中の１つまたは複数のヌクレオチドと分子の共有結合または非共有結合を指す。

用語「ＤＮＡ切断剤」とは、鎖切断を行う部分を指す。非限定例は、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ／ＴＡＬＥＮ、抗生物質、ジンクフィンガーおよびＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を含む。

用語「鎖切断」は、二本鎖核酸配列を言及するとき、一本鎖切断および／または二本鎖切断を含む。一本鎖切断（ニック）は、二本鎖核酸配列の二本鎖の一本における妨害を指す。これは、平滑末端または付着末端をもたらし得る、二本鎖核酸配列の両鎖における妨害を指す二本鎖切断とは対照的である。鎖切断は、（例えば、電離放射線もしくは特定化学物質を用いた処置により）直接的にまたは（例えば、核酸塩基における酵素での切断により）間接的に、二本鎖核酸配列に導入することができる。

用語「突然変異細胞」および「修飾細胞」は、細胞のゲノム配列中に少なくとも１つの修飾を含有する細胞を指す。

用語「一部分」は、ヌクレオチド配列の言及において使用するとき、そのヌクレオチド配列の断片を指す。断片は、５ヌクレオチド残基〜ヌクレオチド配列全体マイナス１核酸残基の大きさの範囲であり得る。

ＤＮＡ分子は「５’末端」および「３’末端」を有すると言える。１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がホスホジエステル結合を介して一方向でその近隣の３’酸素に結合するような形式で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを形成するからである。したがって、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と結合しない場合、オリゴヌクレオチドの末端は「５’末端」と呼ばれる。その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と結合しない場合、オリゴヌクレオチドの末端は「３’末端」と呼ばれる。本明細書で使用する核酸配列は、多量オリゴヌクレオチド内部の場合でさえ、５’末端および３’末端を有すると言うこともできる。直鎖状または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、不連続なエレメントは「上流」または「下流」の５’または３’エレメントであると言える。この述語は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’方向に進行することを表す。関連遺伝子の転写を誘導するプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、一般にコード領域の５’または上流に位置する。しかしながら、プロモーターエレメントおよびコード領域の３’に位置するときでさえ、エンハンサーエレメントはその効果を発揮し得る。転写終結およびポリアデニル化シグナルはコード領域の３’または下流に位置する。

本明細書で使用する用語「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学の技法により１つに接合したＤＮＡのセグメントで構成されるＤＮＡ分子を指す。

本明細書で使用する用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ分子を使用して発現されるタンパク質分子を指す。

本明細書で使用する用語「ベクター」と「運搬体」は、一細胞から別の細胞にＤＮＡセグメント（複数可）を移動させる核酸分子を言及する際に交互に使用する。

本明細書で使用する用語「作動可能な組合せで」、「作動可能な順序で」および「作動可能に連結した」は、所与の遺伝子の転写の誘導および／または所望のタンパク質分子の合成が可能な核酸分子を生成するような形式での核酸配列の結合を指す。これらの用語は、機能的タンパク質を生成するような形式でのアミノ酸配列の結合も指す。

本明細書で使用する用語「トランスフェクション」は、細胞中への外来ＤＮＡの導入を指す。リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、バイオリスティック（すなわち、パーティクルボンバードメント）などを含めた当業者に知られている様々な手段によって、トランスフェクションを実施することができる。

本明細書で使用する用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成の法則によって関連付けられる（ヌクレオチドの配列を指す交換可能な用語である）「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」を言及する際に使用する。例えば、配列「５’−ＣＡＧＴ−３’」は配列「５’−ＡＣＴＧ−３’」と相補的である。相補性は「部分的」または「全体的」であってよい。「部分的」相補性は、塩基対形成の法則に従い１つまたは複数の核酸塩基がマッチしない場合である。核酸間の「全体的」または「完全」相補性は、塩基対形成の法則の下、それぞれ個々の核酸塩基が別の塩基とマッチする場合である。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に対して有意な影響がある可能性がある。これは増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出法において特に重要である可能性がある。便宜上、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」はヌクレオシドを含む分子を含む。

ヌクレオチド配列を言及する際に本明細書で使用する用語「相同性」および「相同的」は、他のヌクレオチド配列との相補性の程度を指す。部分的相同性または完全相同性（すなわち同一性）が存在し得る。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列を言及する際に使用するとき、用語「実質的に相同的」は、前述の低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズすることができる、任意の核酸配列（例えばプローブ）を指す。核酸配列と部分的に相補的、すなわち「実質的に相同的」であるヌクレオチド配列は、標的核酸配列と完全相補配列がハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するヌクレオチド配列である。標的配列と完全相補配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシーの条件下においてハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して調べることができる。実質的に相同的な配列またはプローブは、低ストリンジェンシーの条件下における完全相同配列と標的配列の結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）に関して競合しそれを阻害する。低ストリンジェンシーの条件は非特異的結合が許容されるような条件であるとは言えず、低ストリンジェンシー条件は、２配列の互いの結合が特異的（すなわち選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合の不在は、部分的な割合の相補性さえ欠く（例えば、約３０％未満の同一性の）第２の標的配列の使用によって試験することができ、非特異的結合の不在下では、プローブは第２の非相補的標的とハイブリダイズしない。

低ストリンジェンシー条件は、約１００〜約１０００ヌクレオチド長のプローブを利用するとき、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．１％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬（５０×デンハルト試薬は５００ｍｌ当たり：５ｇのＦｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ４００、Ｐｈｒｍａｃｉａ）、５ｇのＢＳＡ（ＦｒａｃｔｉｏｎＶ；Ｓｉｇｍａ））および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での６８℃における結合またはハイブリダイゼーション、次に２．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中での室温における洗浄と同等な条件を含む。

さらに、高ストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ステップの温度の増大、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドの使用など）は当技術分野でよく知られている。高ストリンジェンシー条件は、核酸ハイブリダイゼーションを言及する際に使用するとき、約１００〜約１０００ヌクレオチド長のプローブを利用するとき、５×ＳＳＰＥ、１％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での６８℃における結合またはハイブリダイゼーション、次に０．１％×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中での６８℃における洗浄と同等な条件を含む。

低ストリンジェンシー条件、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、および標的の性質（溶液中または固定状態で存在するＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成など）、ならびに塩および他の構成要素の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無）、ならびに前述の条件とは異なるが同等である低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を得るため変更することができるハイブリダイゼーション溶液の構成要素などの要因を含む、多くの同等な条件を利用することができることは当技術分野でよく知られている。

用語「同等」は、対象のハイブリダイゼーション条件と関連があるハイブリダイゼーション条件を言及するとき、そのハイブリダイゼーション条件と対象のハイブリダイゼーション条件が、同じ範囲の割合（％）の相同性を有する核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらすことを意味する。例えば、対象のハイブリダイゼーション条件が、第１の核酸配列と５０％〜７０％の相同性を有する他の核酸配列と第１の核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらす場合、したがって別のハイブリダイゼーション条件は、この他のハイブリダイゼーション条件も、第１の核酸配列と５０％〜７０％の相同性を有する他の核酸配列と第１の核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらす場合、対象のハイブリダイゼーション条件と同等であると言える。

本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖を塩基対形成により相補鎖と接合させハイブリダイゼーション複合体を形成する任意のプロセスを使用した、相補核酸の対形成を言及する際に使用する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関連ストリンジェンシー条件、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの要因によって影響を受ける。

本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補Ｇ塩基とＣ塩基の間および相補Ａ塩基とＴ塩基の間での水素結合の形成によって、２核酸配列間で形成される複合体を指し、これらの水素結合は塩基スタッキング相互作用によってさらに安定化され得る。２つの相補核酸にはアンチパラレル形状で水素結合が並ぶ。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、ＣｏｔもしくはＲｏｔ分析）、または溶液中に存在する一核酸配列と固形支持体（例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ドットブロッティングにおいて利用されるナイロン膜もしくはニトロセルロースフィルター、またはＦＩＳＨ（蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション）を含めたｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて利用されるスライドグラス）に固定された別の核酸配列の間で形成され得る。

本明細書で使用する用語「Ｔｍ」は「融解温度」を言及する際に使用する。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半分になり一本鎖に解離する温度である。核酸のＴｍを計算するための等式は当技術分野でよく知られている。標準参照によって示されるように、核酸が１ＭＮａＣｌで水溶液中に存在するとき、Ｔｍ値の単純推定値は等式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算することができる（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎａｎｄＹｏｕｎｇ，ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＦｉｌｔｅｒＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１９８５参照）。他の参照は、Ｔｍ計算用に構造および配列特性を考慮に入れたさらに精巧な計算法を含む。

本明細書で使用する用語「ストリンジェンシー」は、その下で核酸ハイブリダイゼーションが実施される、温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在の条件を言及する際に使用する。ストリンジェンシーは、典型的にはほぼＴｍ−５℃（プローブの融点より５℃低い）からＴｍより約２０℃〜２５℃低い範囲に存在する。当業者によって理解されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを使用して同一ポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出することができ、または類似もしくは関連ポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出することができる。

用語「特異的結合」、「結合特異性」、およびこれらと文法上同等な用語は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の結合を言及するとき、第２のヌクレオチド配列と第３のヌクレオチド配列の間の相互作用と比較した、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の間の優先的相互作用を指す。特異的結合は結合の絶対的特異性を必要としない相対語である。言い換えると、用語「特異的結合」は、第２のヌクレオチド配列と第３のヌクレオチド配列の間の相互作用の不在下で、第２のヌクレオチド配列が第１のヌクレオチド配列と相互作用することを必要としない。そうではなくて、それは第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の間の相互作用のレベルが、第２のヌクレオチド配列と第３のヌクレオチド配列の間の相互作用のレベルを超えることで十分である。第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の「特異的結合」は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の間の相互作用が、第１のヌクレオチド配列上または内部の特定構造の存在に依存することも意味する。言い換えると、第２のヌクレオチド配列は、一般に核酸またはヌクレオチド配列ではなく、第１のヌクレオチド配列上または内部の特定構造を認識しそれに結合している。例えば、第２のヌクレオチド配列が第１のヌクレオチド配列上または内部に存在する構造「Ａ」に特異的である場合、構造Ａを含有する第３の核酸配列の存在によって第１のヌクレオチド配列と結合する第２のヌクレオチド配列の量が減少する。

本明細書で使用する用語「増幅可能な核酸」は、任意の増幅法によって増幅することができる核酸を言及する際に使用する。「増幅可能な核酸」は「サンプル鋳型」を通常含むと企図される。

用語「異種核酸配列」または「異種ＤＮＡ」を交互に使用して、それが本来連結していない、またはそれが本来と異なる位置で連結した核酸配列と連結したヌクレオチド配列を指す。異種ＤＮＡはそれが導入される細胞には内在せず、別の細胞から入手される。一般に、必ずとは言えないが、このような異種ＤＮＡは、それが発現される細胞により通常生成されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種ＤＮＡの例には、レポーター遺伝子、転写および翻訳制御配列、選択可能マーカータンパク質（例えば、薬剤耐性をもたらすタンパク質）などがある。

「増幅」は核酸配列の追加コピーの生成として定義し、当技術分野でよく知られているポリメラーゼ連鎖反応の技術を使用して一般に実施される（ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈＣＷａｎｄＧＳＤｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ、ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）。本明細書で使用する用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、クローニングまたは精製無しでゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列セグメントの濃度を高めるための方法を記載する、参照により本明細書に組み込まれているＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号、および同４，６８３，２０２号の方法を指す。所望標的配列の増幅セグメントの長さは２オリゴヌクレオチドプライマーの互いに対する相対的位置によって決定され、したがってこの長さは制御可能なパラメーターである。プロセスの反復態様のため、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）と呼ぶ。標的配列の所望増幅セグメントは（濃度の点で）混合物中の主要配列となるので、それらは「ＰＣＲ増幅された」と言える。

ＰＣＲによって、ゲノムＤＮＡにおける特異的標的配列の１コピーを、幾つかの異なる方法（例えば、標識プローブとのハイブリダイゼーション、ビオチニル化プライマーの取り込み、次にアビジン−酵素コンジュゲートの検出、増幅セグメントへのｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の取り込み）により検出可能なレベルまで増幅することができる。ゲノムＤＮＡ以外に、適切なセットのプライマー分子で任意のオリゴヌクレオチド配列を増幅することができる。特に、ＰＣＲプロセス独力によって作製した増幅セグメントはそれら自体、後のＰＣＲ増幅に有効な鋳型である。

特に市販品用途の、１つのこのような好ましい方法は広く使用されているＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ技術に基づき、対立遺伝子特異的ＰＣＲとブロッキング試薬（ＡＳＢ−ＰＣＲ）を組み合せて野生型対立遺伝子の増幅を抑制する。ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料を含めた任意の組織型から抽出したＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、生殖細胞系列または体細胞突然変異の検出にＡＳＢ−ＰＣＲを使用することができる。１０００倍以上過剰に野生型対立遺伝子のバックグラウンドに対する一点置換、挿入、または欠失の感受性および選択的検出を可能にする、一組の試薬設計法則が開発されている。（ＭｏｒｌａｎＪ，ＢａｋｅｒＪ，ＳｉｎｉｃｒｏｐｉＤＭｕｔａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲ：ＡＳｉｍｐｌｅ、ＲｏｂｕｓｔａｎｄＨｉｇｈｌｙＳｅｌｅｃｔｉｖｅＭｅｔｈｏｄ．ＰＬｏＳＯＮＥ４（２）：ｅ４５８４，２００９）

用語「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」および「ＲＴ−ＰＣＲ」は、ＲＮＡ配列を逆転写してｃＤＮＡ配列の混合物を生成させ、次にクローニングまたは精製無しで混合物中の転写ｃＤＮＡ配列の所望セグメントの濃度を高めるための方法を指す。典型的には、２プライマーを使用した転写ＤＮＡの所望セグメントのＰＣＲ増幅の前に、１つのプライマー（例えばオリゴ−ｄＴプライマー）を使用してＲＮＡを逆転写する。

本明細書で使用する用語「プライマー」は、精製制限酵素消化産物に原型で存在しようと合成によって生じようと、核酸鎖と相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、適切な温度およびｐＨでヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下）に置いたとき、合成の開始地点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。幾つかの実施形態では、プライマーは最大増幅効率のため一本鎖であるが、代替的に二本鎖であってよい。二本鎖の場合、延長産物の調製に使用する前に、プライマーを最初に処理してその鎖を分離させる。幾つかの実施形態では、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で延長産物の合成を引き起こすほど十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの源および使用法を含めた多くの要因に依存する。

本明細書で使用する用語「プローブ」は、精製制限酵素消化産物に原型で存在しようと、合成、組換えまたはＰＣＲ増幅によって生じようと、対象の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは一本鎖または二本鎖であってよい。プローブは、特定遺伝子配列の検出、同定および単離において有用である。本開示において使用する任意のプローブは任意の「レポーター分子」で標識され、したがってそれは、酵素（例えばＥＬＩＳＡ、および酵素系組織化学アッセイ）、蛍光、放射活性、および発光システムだけには限られないが、これらを含めた任意の検出システムで検出可能であることが企図される。本開示が何らかの特定検出システムまたは標識に限定されることを意図するものではない。

本明細書で使用する用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、その各々が特定ヌクレオチド配列もしくはその近辺で二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡを切断するかまたはそれに切れ目を入れる細菌酵素、例えばＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメイン（例えばＫｉｍｅｔａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６：１１５６−６０によって教示されたように、ＦｏｋＩを使用することができる）を指す。

本明細書で使用する用語「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、すなわち遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ型のいずれかで存在し得る。ＤＮＡ型で存在するとき、オリゴヌクレオチドは一本鎖（すなわちセンス鎖）または二本鎖であり得る。さらに「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」は、転写の正確な開始および／または一次ＲＮＡ転写産物の正確なプロセシングを可能にすることが必要な場合、エンハンサー、プロモーター、スプライスジャンクション、ポリアデニル化シグナルなどの適切な制御エレメントを含み得る。さらになお、本開示のコード領域は内在エンハンサー、スプライスジャンクション、介在配列、ポリアデニル化シグナルなどを含有し得る。

真核生物における転写制御シグナルは「エンハンサー」エレメントを含む。エンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いＤＮＡ配列アレイからなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２３７，１９８７）。エンハンサーエレメントは、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞ならびにウイルスにおける遺伝子を含めた、様々な真核生物供給源から単離されている。個々のエンハンサーの選択は、対象のタンパク質を発現させるのにどの細胞型を使用するかに依存する。

発現ベクターにおける「スプライシングシグナル」の存在は、組換え転写産物の高レベルの発現をもたらすことが多い。スプライシングシグナルは一次ＲＮＡ転写産物からのイントロンの除去を仲介し、スプライスドナーおよびアクセプタードナー部位からなる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．１６．７−１６．８，１９８９）。一般に使用されるスプライスドナーおよびアクセプタードナー部位は、ＳＶ４０の１６ＳＲＮＡ由来のスプライスジャンクションである。

真核生物細胞における組換えＤＮＡ配列の有効な発現は、有効な終結と生成転写産物のポリアデニル化を誘導するシグナルの発現を必要とする。転写終結シグナルは一般にポリアデニル化シグナルの下流で見られ、数百ヌクレオチド長である。本明細書で使用する用語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、終結と発生期ＲＮＡ転写産物のポリアデニル化の両方を誘導するＤＮＡ配列を示す。ポリＡ尾部を欠く転写産物は不安定であり急速に分解されるので、組換え転写産物の有効なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターにおいて利用されるポリＡシグナルは「異種」または「内在」であり得る。内在ポリＡシグナルは、ゲノム中の所与遺伝子のコード領域の３’末端で本来見られるシグナルである。異種ポリＡシグナルは、一遺伝子から単離され別の遺伝子の３’末端に配置されたシグナルである。

本明細書で使用する用語「プロモーター」、「プロモーターエレメント」または「プロモーター配列」は、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に置かれる（すなわち上位に位置する）とき、そのオリゴヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。典型的にはプロモーターは、ｍＲＮＡへのその転写を制御するオリゴヌクレオチド配列の５’（すなわち上流）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼによる特異的結合および転写開始に関する部位をもたらす。

用語「プロモーター活性」は、核酸配列を言及するとき、ｍＲＮＡへのオリゴヌクレオチド配列の転写を開始させる核酸配列の能力を指す。

用語「組織特異的」は、プロモーターに適用するとき、異型組織中での同じオリゴヌクレオチドの発現の相対的不在下で、特異的型の組織に対するオリゴヌクレオチド配列の選択的発現を誘導することができるプロモーターを指す。プロモーターの組織特異性は、例えば、レポーター遺伝子とプロモーター配列を作動可能に連結させレポーター構築物を生成させ、生成するトランスジェニック動物の各組織にレポーター構築物が組み込まれるように植物または動物のゲノムにレポーター構築物を導入し、トランスジェニック植物または動物の異なる組織におけるレポーター遺伝子の発現を検出する（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質、またはレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を検出する）ことによって評価することができる。選択性は絶対的である必要はない。他の組織中でのレポーター遺伝子の発現レベルに対する、１つまたは複数の組織中でのより高レベルのレポーター遺伝子の発現の検出によって、より高レベルの発現が検出される組織にプロモーターが特異的であることを示す。

用語「細胞型特異的」は、プロモーターに適用するとき、同じ組織内の異型細胞での同じオリゴヌクレオチド配列の発現の相対的不在下で、特異的型の細胞におけるオリゴヌクレオチド配列の選択的発現を誘導することができるプロモーターを指す。用語「細胞型特異的」は、プロモーターに適用するとき、一組織内の領域におけるオリゴヌクレオチドの選択的発現を促進することができるプロモーターも意味する。再度、選択性は絶対的である必要はない。プロモーターの細胞型特異性は、当技術分野でよく知られている方法、例えば本明細書に記載する免疫組織化学的染色法を使用して評価することができる。簡単に言うと、組織切片をパラフィンに包埋し、パラフィン切片を、その発現がプロモーターによって制御されるオリゴヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド産物に特異的な一次抗体と反応させる。パラフィン切片の代替として、サンプルを凍結切片化することができる。例えば、切片化の前および最中に切片を凍結させ、残留パラフィンにより起こり得る干渉を回避することができる。一次抗体に特異的な標識（例えば、ペルオキシダーゼ結合）二次抗体は（例えば、アビジン／ビオチンを用いた）切片化組織との結合、および顕微鏡検査による特異的結合の検出を可能にする。

用語「選択的発現」、「選択的に発現」、およびそれらの文法上同等な用語は、２箇所以上の対象領域における発現の相対的レベルの比較を指す。例えば「選択的発現」は、組織と関連付けて使用するとき、別組織中での同じ遺伝子の発現レベル、およびそれを発現する細胞数とそれぞれ比較した、特定組織における対象遺伝子の実質的に高い発現レベル、またはその組織内で遺伝子を発現する細胞の実質的に多い数を指す（すなわち、選択性は絶対的である必要はない）。選択的発現は、特定組織における対象遺伝子の発現および別組織中での同じ遺伝子の発現の完全不在を必要としないが、それらを含み得る。同様に、本明細書で細胞型を言及する際に使用する「選択的発現」は、別細胞型中での遺伝子の発現レベル、およびそれを発現する細胞数とそれぞれ比較したときの、特定細胞型における対象遺伝子の実質的に高い発現レベル、またはそれを発現する細胞の実質的に多い数を指す。

用語「隣接」は、２つ以上のヌクレオチド配列を言及する際に使用するとき、１つまたは複数の制御エレメントを含まない介在配列の不在下、またはそれらの存在下のいずれかで、ヌクレオチド配列がタンデムに連結した状態であることを意味する。

本明細書で使用する用語「核酸分子コード」、「ヌクレオチドコード」、「ＤＮＡ配列コード」および「ＤＮＡコード」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序によって、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序が決まる。したがってＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。

用語「単離」は、「単離オリゴヌクレオチド」など核酸に関して使用するとき、その元の供給源と通常結合した少なくとも１つの汚染物質核酸から分離した核酸配列を指す。単離核酸は、それが本来見られるのと異なる型または設定で存在する核酸である。対照的に、非単離核酸は、それらが本来存在する状態において見られるＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸である。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は隣接遺伝子付近の宿主細胞染色体上に見られ、特異的タンパク質をコードする特異的ｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする多くの他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中に見られる。しかしながら、対象のポリペプチドをコードする単離核酸は、例えば対象のポリペプチドを通常発現する細胞中の核酸などを含み、この場合核酸は元の細胞のそれとは異なる染色体内もしくは染色体外位置に存在し、または他の場合は本来見られるのと異なる核酸配列に隣接する。単離核酸またはオリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖型で存在し得る。単離核酸は、（望む場合）様々な技法（例えば、ハイブリダイゼーション、ドットブロッティングなど）によって容易に確認することができる。単離核酸またはオリゴヌクレオチドを利用してタンパク質を発現させるとき、オリゴヌクレオチドはセンス鎖またはコード鎖を少なくとも含有し得る（すなわち、オリゴヌクレオチドは一本鎖であり得る）。あるいはオリゴヌクレオチドはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含有し得る（すなわち、オリゴヌクレオチドは二本鎖であり得る）。

本明細書で使用する用語「精製した」または「精製すること」は、サンプルからの１つまたは複数の（望ましくない）成分の除去を指す。例えば、細菌宿主細胞中で組換えポリペプチドを発現させる場合、宿主細胞タンパク質を除去し、それによってサンプル中の組換えポリペプチドの割合を高めることによりポリペプチドを精製する。

本明細書で使用する用語「実質的に精製された」は、それらの本来の環境から除去、単離または分離し、それらが本来結合していた他の成分を少なくとも６０％含まない、幾つかの実施形態では７５％含まない、および他の実施形態では９０％含まない、核酸またはアミノ酸配列いずれかの分子を指す。したがって「単離ポリヌクレオチド」は実質的に精製されたポリヌクレオチドである。

本明細書で使用する用語「コード領域」は、構造遺伝子を言及する際に使用するとき、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として発生期ポリペプチドにおいて見られるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物では、一般にイニシエーターメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」により５’側、および停止コドンを指定する３トリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の１つにより３’側に存在する。

「コード配列」によって、転写および／または翻訳してｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドまたはその断片を生成することができる、核酸の配列またはその相補配列、またはその一部分を意味する。コード配列は、ゲノムＤＮＡまたは未熟一次ＲＮＡ転写産物中で、細胞の生化学的機構により１つに接合して成熟ｍＲＮＡとなるエクソンを含む。アンチセンス鎖はこのような核酸の相補鎖であり、コード配列はそこから推測することができる。

「非コード配列」によって、ｉｎｖｉｖｏでアミノ酸に転写されない、またはｔＲＮＡが相互作用してアミノ酸を置換しないもしくは置換しようとしない場合の、核酸の配列またはその相補配列、またはその一部分を意味する。非コード配列は、ゲノムＤＮＡまたは未熟一次ＲＮＡ転写産物中のイントロン配列と、例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子関連配列の両方を含む。

本明細書で使用する用語「構造遺伝子」または「構造ヌクレオチド配列」は、他の遺伝子の発現を制御しないＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を指す。対照的に、「制御遺伝子」または「制御配列」は、他の遺伝子の発現を制御する産物（例えば、転写因子）をコードする構造遺伝子である。

本明細書で使用する用語「制御エレメント」は、核酸配列のある程度の発現態様を制御する遺伝子エレメントを指す。例えばプロモーターは、作動可能に連結したコード領域の転写の開始を容易にする制御エレメントである。他の制御エレメントには、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどがある。

本明細書で使用する用語「ペプチド転写因子結合部位」または「転写因子結合部位」は、タンパク質転写因子と結合し、それによって核酸配列のある程度の発現態様を制御するヌクレオチド配列を指す。例えば、Ｓｐ−１およびＡＰ１（アクチベータータンパク質１）結合部位はペプチド転写因子結合部位の例である。

本明細書で使用する用語「遺伝子」は、構造遺伝子のコード領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」は、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに相当するように、５’末端と３’末端の両方でコード領域に隣接して位置する非翻訳配列も含み得る。コード領域の５’に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’または下流に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は３’非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」はｃＤＮＡとゲノム型両方の遺伝子を包含する。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で妨害されるコード領域を含有する。イントロンは異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンはエンハンサーなどの制御エレメントを含有し得る。イントロンは核または一次転写産物から除去または「スプライシング除去」され、したがってイントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。ｍＲＮＡは翻訳中に働いて、発生期ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を指定する。遺伝子は一般に、単一の遺伝子座である。通常の２倍体生物では、遺伝子は２個の対立遺伝子を有する。しかしながら、４倍体のジャガイモでは、それぞれの遺伝子は４個の対立遺伝子を有する。１２倍体であるサトウキビでは、遺伝子あたり１２個の対立遺伝子が存在し得る。特定の例は、それぞれ２個の対立遺伝子を有する２個のＥＰＳＰＳ遺伝子座を有するアマおよび２個の対立遺伝子を有する単一の単量体プラスチドＡＣＣａｓｅを有するイネを含む。

イントロンを含有する以外に、ゲノム型の遺伝子は、ＲＮＡ転写産物上に存在する配列の５’末端と３’末端の両方に位置する配列も含み得る。これらの配列は「隣接」配列または領域と呼ばれる（これらの隣接配列はｍＲＮＡ転写産物上に存在する非翻訳配列に対して５’または３’に位置する）。５’隣接領域は、遺伝子の転写を制御するまたはそれに影響を与える、プロモーターおよびエンハンサーなどの制御配列を含有し得る。３’隣接領域は、転写の終結、転写後の切断およびポリアデニル化を誘導する配列を含有し得る。

「非ヒト動物」はヒトではない任意の動物を指し、例えばげっ歯動物、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ属、反芻動物、ウサギ目、ブタ、ヤギ、ウマ科、イヌ科、ネコ科、鳥類などの脊椎動物を含む。好ましい非ヒト動物はげっ歯動物目から選択される。さらに「非ヒト動物」は、両生類（例えばツメガエル属）、爬虫類、昆虫（例えばキイロショウジョウバエ属）、および他の非哺乳動物種を指す。

本明細書で使用する用語「トランスジェニック」は、植物または動物の体細胞および／または生殖系列細胞のいずれかのゲノムに組み込まれた状態で挿入された、別の生物由来のＤＮＡを有する生物または細胞を指す。「導入遺伝子」は、それが見られる植物または動物と部分的もしくは完全に異種である（すなわち、本来存在しない）、または内在配列（すなわち、動物中に本来見られる配列）と相同であり植物または動物ゲノム中の本来存在する配列のそれと異なる位置に挿入されたＤＮＡ配列を意味する。１つまたは複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物または動物は本開示の範囲内にある。さらに、本明細書で使用する「トランスジェニック」は、本開示の方法によって、相同組換え、ＴＦＯ突然変異によって、または類似の方法によって、１つまたは複数の遺伝子が修飾および／または「ノックアウトされた」（非機能的状態になったまたは低レベルでの機能状態になった、すなわち「ノックアウト」突然変異）生物を指す。例えば幾つかの実施形態では、トランスジェニック生物または細胞は、外来プロモーターおよび／またはコード領域を含む挿入ＤＮＡを含む。

「形質転換細胞」は、多世代にわたり細胞培養中に増殖する能力、軟寒天中で増殖する能力、および／または細胞間接触による細胞増殖を抑制しない能力を獲得した細胞または細胞系である。この点で形質転換は、細胞または生物への外来遺伝子物質の導入を指す。細胞中への核酸の首尾良い導入を可能にして導入核酸の発現をもたらす任意の周知の方法によって、形質転換を実施することができる。「形質転換」は、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションおよびリポフェクション（リポソーム仲介遺伝子導入）などの方法だけには限られないが、これらを含む。任意の発現ベクターを使用することにより、形質転換を実施することができる。例えば、昆虫細胞に外来核酸を導入するためのバキュロウイルスの使用が企図される。用語「形質転換」は、完全昆虫のＰエレメント仲介生殖細胞系列形質転換などの方法も含む。さらに形質転換は、通常遺伝子突然変異により、自然に形質転換された細胞を指す。

本明細書で使用する「外因性」は、タンパク質をコードする遺伝子が通常細胞中で発現されないことを意味する。さらに「外因性」は、その遺伝子の正常（すなわち本来）レベルの発現を高めるために細胞にトランスフェクトされる遺伝子を指す。

ペプチド配列およびヌクレオチド配列は「内在」または「異種」（すなわち外来）であってよい。用語「内在」は、それが本来存在する配列に対して何らかの修飾を含有しない限り、それが導入される細胞中で本来見られる配列を指す。用語「異種」は、それが導入される細胞に内在しない配列を指す。例えば異種ＤＮＡは、それが本来連結していない、またはそれが本来と異なる位置で連結した核酸配列と連結した、または連結状態に操作したヌクレオチド配列を含む。異種ＤＮＡは、それが導入される細胞中で本来見られ本来存在する配列に対して何らかの修飾を含有するヌクレオチド配列も含む。一般に、必ずとは言えないが、異種ＤＮＡは、それが導入される細胞により通常生成されない異種ＲＮＡおよび異種タンパク質をコードする。異種ＤＮＡの例には、レポーター遺伝子、転写および翻訳制御配列、選択可能マーカータンパク質（例えば、薬剤耐性をもたらすタンパク質）をコードするＤＮＡ配列などがある。

構築物
本明細書で開示している核酸分子（例えば、部位特異的ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲのガイドＲＮＡ）は、組換え核酸構築物の生成において使用することができる。一実施形態では、本開示の核酸分子を、核酸構築物、例えば、対象の植物、微生物、または動物における発現のための発現カセットの調製において使用することができる。例えば構築物が宿主ゲノム中に組み込まれない、またはそれが組み込まれた状態の場合はプロモーターによってもたらされる制御下で宿主のゲノム内の構築物の位置に維持されるとき、この発現は一過的である可能性がある。

発現カセットは、本明細書で開示している部位特異的ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡ配列と作動可能に連結した制御配列を含み得る。カセットは、生物に同時形質転換される少なくとも１つの別の遺伝子を別に含有し得る。あるいは、多数の発現カセットに別の遺伝子（複数可）を提供することができる。

制御領域の転写制御下にある部位特異的ヌクレアーゼコード配列の挿入用の複数の制限部位を有する、核酸構築物を提供することができる。核酸構築物は、選択可能マーカー遺伝子をコードする核酸分子を別に含有し得る。

任意のプロモーターを、核酸構築物の生成において使用することができる。プロモーターは、本明細書で開示している植物、微生物、または動物宿主核酸配列に固有もしくは類似、または外来もしくは異種であってよい。さらに、プロモーターは天然配列、または代替的に合成配列であってよい。プロモーターが「外来」または植物、微生物、または動物宿主と「異種」である場合、プロモーターはそれが導入される元の植物、微生物、または動物中で見られないと考えられる。本明細書で使用するキメラ遺伝子は、コード配列と異種である転写開始領域と作動可能に連結したコード配列を含む。

本明細書で開示している部位特異的ヌクレアーゼ配列は、異種プロモーターを使用して発現させることが可能である。

植物、微生物、または動物における発現のための構成的、組織優先的、誘導的発現をもたらすプロモーター、または他のプロモーターなどの任意のプロモーターを、部位特異的ヌクレアーゼ配列の発現を制御するための構築物の調製において使用することができる。構成的プロモーターは、例えばＲｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターおよびＷＯ９９／４３８３８と米国特許第６，０７２，０５０号中に開示された他の構成的プロモーター、コアＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２；１９８５）、イネアクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：１６３−１７１，１９９０）、ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２，１９８９およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９，１９９２）、ｐＥＭＵプロモーター（Ｌａｓｔｅｔａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８，１９９１）、ＭＡＳプロモーター（Ｖｅｌｔｅｎｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．３：２７２３−２７３０，１９８４）、ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などを含む。他の構成的プロモーターには、例えば米国特許第５，６０８，１４９号、同第５，６０８，１４４号、同第５，６０４，１２１号、同第５，５６９，５９７号、同第５，４６６，７８５号、同第５，３９９，６８０号、同第５，２６８，４６３号、同第５，６０８，１４２号および同第６，１７７，６１１号のプロモーターを含む。

組織優先的プロモーターを利用して、特定植物組織内の部位特異的ヌクレアーゼの発現を誘導することができる。このような組織優先的プロモーターには、葉優先的プロモーター、根優先的プロモーター、種子優先的プロモーター、および茎優先的プロモーターがあるが、これらだけには限られない。組織優先的プロモーターには、Ｙａｍａｍｏｔｏｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＪ．１２（２）：２５５−２６５，１９９７；Ｋａｗａｍａｔａｅｔｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３，１９９７；Ｈａｎｓｅｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＧｅｎＧｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３，１９９７；Ｒｕｓｓｅｌｌｅｔａｌ．，ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓ．６（２）：１５７−１６８，１９９７；Ｒｉｎｅｈａｒｔｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１，１９９６；ＶａｎＣａｍｐｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５，１９９６；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４，１９９６；Ｙａｍａｍｏｔｏｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８，１９９４；Ｌａｍ，ＲｅｓｕｌｔｓＰｒｏｂｌ．ＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６，１９９４；Ｏｒｏｚｃｏｅｔａｌ．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８，１９９３；Ｍａｔｓｕｏｋａｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（２０）：９５８６−９５９０，１９９３およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＪ．４（３）：４９５−５０５，１９９３のプロモーターがある。

核酸構築物は転写終結領域も含み得る。転写終結領域を使用する場合、任意の終結領域を核酸構築物の調製において使用することができる。例えば、終結領域は別の供給源（すなわち、外来またはプロモーターと異種）に由来する可能性がある。本開示の構築物中での使用に利用することができる終結領域の例には、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域などの、エーツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ−プラスミド由来の終結領域がある。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４，１９９１；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｃｅｌｌ６４：６７１−６７４，１９９１；Ｓａｎｆａｃｏｎｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．５：１４１−１４９，１９９１；Ｍｏｇｅｎｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：１２６１−１２７２，１９９０；Ｍｕｎｒｏｅｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ９１：１５１−１５８，１９９０；Ｂａｌｌａｓｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：７８９１−７９０３，１９８９；およびＪｏｓｈｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：９６２７−９６３９，１９８７も参照。

本明細書で開示している任意の態様、実施形態、方法および／または組成物に関して、形質転換植物中での発現を高めるために核酸を最適化することができる。すなわち、部位特異的ヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸を、発現改善用の植物優先的コドンを使用して合成することができる。例えば、宿主優先的コドン使用頻度の考察に関する、ＣａｍｐｂｅｌｌａｎｄＧｏｗｒｉ，（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１，１９９０）を参照。植物優先的遺伝子の合成に関する当技術分野の方法が利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号、および米国特許第５，４３６，３９１号、およびＭｕｒｒａｙｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：４７７−４９８，１９８９を参照。例えば、Ｌａｎｚａｅｔａｌ．，ＢＭＣＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｌｏｇｙ８：３３−４３，２０１４；Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５９：９４−１０２，２００８；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２２：３４６−３５３，２００４も参照されたい。

さらに、他の配列修飾を本明細書で開示している核酸に施すことができる。例えば、細胞宿主における遺伝子発現を高めるための、別の配列修飾が知られている。これらは、擬似ポリアデニル化シグナル、エクソン／イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復単位をコードする配列、および遺伝子発現に有害であり得る他のこのような十分特徴付けられた配列の排除を含む。配列のＧ−Ｃ含有量は、宿主細胞中で発現される周知の遺伝子を参照することにより計算した、標的細胞宿主の平均レベルに調節することもできる。さらに、配列を修飾して予想ヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避することができる。

他の核酸配列を本開示の構築物の調製において使用して、例えば部位特異的ヌクレアーゼコード配列の発現を高めることもできる。このような核酸配列には、メイズＡｄｈＩ、イントロン１遺伝子のイントロン（Ｃａｌｌｉｓｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１：１１８３−１２００，１９８７）、ならびにタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、メイズ萎黄病ウイルスおよびアルファルファモザイクウイルス由来のリーダー配列（Ｗ−配列）がある（Ｇａｌｌｉｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：８６９３−８７１１，１９８７およびＳｋｕｚｅｓｋｉｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６５−７９，１９９０）。メイズの収縮１型遺伝子座由来の第１のイントロンは、キメラ遺伝子構築物における遺伝子の発現を高めることが示されている。米国特許第５，４２４，４１２号および米国特許第５，５９３，８７４号は遺伝子発現構築物における特異的イントロンの使用を開示しており、Ｇａｌｌｉｅｅｔａｌ．（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０６：９２９−９３９，１９９４）は、イントロンが組織特異的偏位で遺伝子発現を制御するのに有用であることも示している。部位特異的ヌクレアーゼ遺伝子発現をさらに高めるまたは最適化するため、本明細書で開示している植物用発現ベクターは、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）を含有するＤＮＡ配列も含有することができる。したがって、このような修飾発現系で形質転換した植物細胞は、本開示のヌクレオチド配列の過剰発現または構成的発現を示す可能性がある。

本明細書で開示している発現構築物は、葉緑体または原核生物と真核生物の両方における他のオルガネラおよび構造物に対する部位特異的ヌクレアーゼ配列の発現を誘導することができる核酸配列も含み得る。このような核酸配列には、植物細胞葉緑体に対象遺伝子産物を誘導する葉緑体輸送ペプチドをコードする葉緑体標的配列がある。このような輸送ペプチドは当技術分野で知られている。葉緑体標的配列に関して、「作動可能に連結した」は、輸送ペプチドをコードする核酸配列（すなわち、葉緑体標的配列）が、２配列が隣接し同じリーディングフレームに存在するように、本明細書で開示している部位特異的ヌクレアーゼ核酸分子と連結していることを意味する。例えば、ＶｏｎＨｅｉｊｎｅｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６，１９９１；Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０，１９８９；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８，１９８７；Ｒｏｍｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１，１９９３およびＳｈａｈｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：４７８−４８１，１９８６を参照。

葉緑体標的配列は当技術分野でよく知られており、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）（ｄｅＣａｓｔｒｏＳｉｌｖａＦｉｌｈｏｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：７６９−７８０，１９９６；Ｓｃｈｎｅｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（５）：３３３５−３３４２，１９９１）、５−（エノールピルビル）シキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）（Ａｒｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２２（６）：７８９−８１０，１９９０）、トリプトファンシンターゼ（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１１）：６０８１−６０８７，１９９５）、プラストシアニン（Ｌａｗｒｅｎｃｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３）：２０３５７−２０３６３，１９９７）、コリスミ酸シンターゼ（Ｓｃｈｍｉｄｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２７４４７−２７４５７，１９９３）、および光吸収性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＬＨＢＰ）（Ｌａｍｐｐａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４９９６−１４９９９，１９８８）の葉緑体小サブユニットを含む。ＶｏｎＨｅｉｊｎｅｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６，１９９１；Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０，１９８９；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＯｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８，１９８７；Ｒｏｍｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１，１９９３およびＳｈａｈｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：４７８−４８１，１９８６も参照。

本明細書で開示している任意の態様、実施形態、方法および／または組成物に関して、核酸構築物を調製して、植物細胞葉緑体由来の突然変異部位特異的ヌクレアーゼコード配列の発現を誘導することができる。葉緑体を形質転換するための方法は当技術分野で知られている。例えば、Ｓｖａｂｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：８５２６−８５３０，１９９０；ＳｖａｂａｎｄＭａｌｉｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：９１３−９１７，１９９３；ＳｖａｂａｎｄＭａｌｉｇａ，ＥＭＢＯＪ．１２：６０１−６０６，１９９３を参照。この方法は、選択可能マーカーを含有するＤＮＡのパーティクルガン送達法、および相同組換えによるプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化を利用する。さらに、核コードおよびプラスチド対象ＲＮＡポリメラーゼの組織優先的発現によるサイレントプラスチド媒介導入遺伝子のトランス作用によって、プラスチド形質転換を実施することができる。このようなシステムはＭｃＢｒｉｄｅｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：７３０１−７３０５，１９９４中で報告されている。

葉緑体を標的化する対象の核酸を、植物の核とこのオルガネラの間のコドン使用頻度の違いを考慮して、葉緑体での発現用に最適化することができる。このようにして、葉緑体優先的コドンを使用して対象の核酸を合成することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，３８０，８３１号を参照。

核酸構築物を使用して植物細胞を形質転換し、部位特異的ヌクレアーゼコード配列を含むトランスジェニック植物を再生することができる。植物形質転換用の多数の植物形質転換ベクターおよび方法が利用可能である。例えば、米国特許第６，７５３，４５８号、Ａｎ，Ｇ．ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，８１：３０１−３０５，１９８６；Ｆｒｙ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．６：３２１−３２５，１９８７；Ｂｌｏｃｋ，Ｍ．，Ｔｈｅｏｒ．ＡｐｐｌＧｅｎｅｔ．７６：７６７−７７４，１９８８；Ｈｉｎｃｈｅｅｅｔａｌ．，Ｓｔａｄｌｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｍｐ．２０３２１２．２０３−２１２，１９９０；Ｃｏｕｓｉｎｓｅｔａｌ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１８：４８１−４９４，１９９１；Ｃｈｅｅ，Ｐ．Ｐ．ａｎｄＳｌｉｇｈｔｏｍ，Ｊ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ．１１８：２５５−２６０，１９９２；Ｃｈｒｉｓｔｏｕｅｔａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９−２４６，１９９２；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：３０９−３１４，１９９２；Ｄｈｉｒｅｔｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９９：８１−８８，１９９２；Ｃａｓａｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１２１２−１１２１６，１９９３；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．，ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ２９Ｐ：１１９−１２４，１９９３；Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．１２：１８０−１８３，１９９３；Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ａ．ａｎｄＭｃＨｕｇｈｅｎ，Ａ．，ＰｌａｎｔＳｃｉ９１：１３９−１４８，１９９３；Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｃ．Ｉ．ａｎｄＴｒｉｅｕ，Ｔ．Ｎ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０２：１６７，１９９３；Ｇｏｌｏｖｋｉｎｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＳｃｉ．９０：４１−５２，１９９３；ＧｕｏＣｈｉｎＳｃｉ．Ｂｕｌｌ．３８：２０７２−２０７８；Ａｓａｎｏｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．１３，１９９４；ＡｙｅｒｅｓＮ．Ｍ．ａｎｄＰａｒｋ，Ｗ．Ｄ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｓｃｉ．１３：２１９−２３９，１９９４；Ｂａｒｃｅｌｏｅｔａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：５８３−５９２，１９９４；Ｂｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：２９９−３０７，１９９４；Ｂｏｒｋｏｗｓｋａｅｔａｌ．，Ａｃｔａ．ＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔ。１６：２２５−２３０，１９９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．，Ａｇｒｏ．Ｆｏｏｄ．Ｉｎｄ．ＨｉＴｅｃｈ．５：１７−２７，１９９４；Ｅａｐｅｎｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．１３：５８２−５８６，１９９４；Ｈａｒｔｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：９１９９２３，１９９４；Ｒｉｔａｌａｅｔａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３１７−３２５，１９９４およびＷａｎ，Ｙ．Ｃ．ａｎｄＬｅｍａｕｘ，Ｐ．Ｇ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７４８，１９９４を参照。相同組換えを使用して、構築物を植物細胞に形質転換することもできる。

用語「野生型」は、ペプチド配列およびヌクレオチド配列を言及するとき、本来存在する供給源から単離したときのペプチド配列およびヌクレオチド配列の特徴を有する、ペプチド配列およびヌクレオチド配列（遺伝子座／遺伝子／対立遺伝子）をそれぞれ指す。野生型ペプチド配列およびヌクレオチド配列は集団内で最も頻繁に観察される配列であり、したがって任意でそれぞれ「正常」または「野生型」形のペプチド配列およびヌクレオチド配列と示される。「野生型」は、１つまたは複数の特異的ヌクレオチド位置における配列、または１つまたは複数の特定コドン位置における配列、または１つまたは複数の特定アミノ酸位置における配列を指すこともできる。

「コンセンサス配列」は、同一アミノ酸もしくはヌクレオチドまたは少なくとも２５％の配列に関して機能上同等なアミノ酸もしくはヌクレオチドを含有する、アミノ酸またはヌクレオチドの配列として定義する。同一または機能上同等なアミノ酸またはヌクレオチドが隣接している必要はない。

本明細書で使用する用語「アブラナ」はアブラナ属の植物を指す。例示的なアブラナ種には、ビーカリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）、ビーエロンゲート（Ｂ．ｅｌｏｎｇａｔｅ）、ビーフルチクローサ（Ｂ．ｆｒｕｔｉｃｕｌｏｓａ）、ビージュンセア（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、ビーナプス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、ビーナリノーサ（Ｂ．ｎａｒｉｎｏｓａ）、ビーニグラ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）、ビーオレラセア（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、ビーペリビリディス（Ｂ．ｐｅｒｖｉｒｉｄｉｓ）、ビーレーパ（Ｂ．ｒａｐａ）（合成ビーカムペストリス（ｓｙｎＢ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、ビールペストリス（Ｂ．ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ）、ビーセプティセプス（Ｂ．ｓｅｐｔｉｃｅｐｓ）、およびビートウルネフォルティ（Ｂ．ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉｉ）があるが、これらだけには限られない。

核酸塩基は、特定の好ましい実施形態においてプリン、ピリミジン、またはそれらの誘導体もしくはアナログである塩基である。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル成分を含有する核酸塩基、例えば場合によっては置換されたリボシドまたは２’−デオキシリボシドである。ヌクレオシドは数個の連結成分の１つによって連結することができ、それは亜リン酸を含有し得るかまたは含有し得ない。非置換ホスホジエステル結合によって結合したヌクレオシドはヌクレオチドと呼ばれる。本明細書で使用する用語「核酸塩基」は、ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニット、およびモルホリン核酸塩基、ならびにヌクレオシドとヌクレオチドを含む。

オリゴ核酸塩基は核酸塩基を含むポリマーであり、幾つかの実施形態では、その少なくとも一部分は相補配列を有するＤＮＡとワトソン−クリック塩基対形成によりハイブリダイズ可能である。オリゴ核酸塩基鎖は、ポリマーの末端核酸塩基である一本鎖５’末端と３’末端を有し得る。特定オリゴ核酸塩基鎖は全タイプの核酸塩基を含有することができる。オリゴ核酸塩基化合物は、相補的でありワトソン−クリック塩基対形成によりハイブリダイズ可能である１つまたは複数のオリゴ核酸塩基鎖を含む化合物である。リボ型核酸塩基は、２’炭素がヒドロキシ、アルキルオキシまたはハロゲンで置換されたメチレンであるペントースフラノシル含有核酸塩基を含む。デオキシリボ型核酸塩基はリボ型核酸塩基以外の核酸塩基であり、ペントースフラノシル成分を含有しない全ての核酸塩基を含む。

特定の実施形態では、オリゴ核酸塩基鎖部分は、オリゴ核酸塩基鎖とオリゴ核酸塩基鎖のセグメントまたは領域の両方を含み得る。オリゴ核酸塩基鎖部分は３’末端と５’末端を有することができ、オリゴ核酸塩基鎖部分が鎖と共に延長するとき、鎖部分の３’末端と５’末端は鎖の３’末端と５’末端でもある。

本明細書で使用する用語「コドン」は、タンパク質合成中のポリペプチド鎖における指定アミノ酸の挿入またはタンパク質合成を停止させるためのシグナルを決定する遺伝子コードを構成する、３個の隣接ヌクレオチドの配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を指す。用語「コドン」は、元のＤＮＡが転写されるメッセンジャーＲＮＡにおける３ヌクレオチドの対応（および相補）配列を指すためにも使用する。

本明細書で使用する用語「相同性」は、タンパク質とＤＮＡの間の配列類似性を指す。用語「相同性」または「相同的」は同一性の程度を指す。部分的相同性または完全相同性が存在し得る。部分的に相同的な配列は、別の配列と比較したとき１００％未満の配列同一性を有する配列である。

「ヘテロ接合型」は、相同染色体セグメントにおける１つまたは複数の遺伝子座に異なる対立遺伝子を有することを指す。本明細書で使用する「ヘテロ接合型」は、１つまたは複数の遺伝子座に異なる対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞、細胞集団または生物も指すことができる。ヘテロ接合型サンプルを、例えば核酸配列決定などの、当技術分野で知られている方法によって決定することもできる。例えば、配列決定エレクトロフェログラムが１つの遺伝子座で２つのピークを示し、２つのピークがほぼ同じサイズである場合、サンプルはヘテロ接合型として特徴付けることができる。または、１つのピークが他方より小さいが、大きなピークの少なくとも約２５％のサイズである場合、サンプルはヘテロ接合型として特徴付けることができる。幾つかの実施形態では、小さなピークは大きなピークの少なくとも約１５％である。他の実施形態では、小さなピークは大きなピークの少なくとも約１０％である。他の実施形態では、小さなピークは大きなピークの少なくとも約５％である。他の実施形態では、最小量の小さなピークが検出される。

本明細書で使用する「ホモ接合型」は、相同染色体セグメントにおける１つまたは複数の遺伝子座に同一対立遺伝子を有することを指す。「ホモ接合型」は、１つまたは複数の遺伝子座に同じ対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞、細胞集団または生物も指すことができる。ホモ接合型サンプルを、例えば核酸配列決定などの、当技術分野で知られている方法によって決定することができる。例えば、配列決定エレクトロフェログラムが特定遺伝子座で１つのピークを示す場合、サンプルはその遺伝子座に関して「ホモ接合型」と呼ぶことができる。

用語「ヘミ接合型」は、第２の対立遺伝子が欠失しているか、または相同染色体セグメント上に存在しないため、細胞または生物の遺伝子型に一回のみ存在する、遺伝子または遺伝子セグメントを指す。本明細書で使用する「ヘミ接合型」は、遺伝子型に一回のみ存在する、１つまたは複数の遺伝子座における対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞、細胞集団または生物も指すことができる。

本明細書で使用する用語「接合状態」は、サンプル、細胞集団、または生物が、当技術分野で知られており本明細書に記載する試験法により決定される、ヘテロ接合型、ホモ接合型、またはヘミ接合型と考えられることを指す。用語「核酸の接合状態」は、核酸の供給源がヘテロ接合型、ホモ接合型、またはヘミ接合型と考えられるかどうかの決定を意味する。「接合状態」は配列中の１ヌクレオチド位置における違いを指すことができる。幾つかの方法では、一突然変異に関するサンプルの接合状態を、ホモ接合野生型、ヘテロ接合型（すなわち、１つの野生型対立遺伝子と１つの突然変異対立遺伝子）、ホモ接合突然変異型、またはヘミ接合型（すなわち、野生型もしくは突然変異対立遺伝子いずれかの１コピー）として分類することができる。

本明細書で使用する用語「ＲＴＤＳ」は、Ｃｉｂｕｓによって開発されたＴｈｅＲａｐｉｄＴｒａｉｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＳｙｓｔｅｍ（商標）（ＲＴＤＳ）を指す。ＲＴＤＳは、外来遺伝子または対照配列の取り込み無しで遺伝子配列に正確な改変を施す際に有効である、部位特異的遺伝子修飾システムである。

本明細書で使用する用語「約」は、プラスマイナス１０％の量を表す用語である。例えば「約３％」は２．７〜３．３％を包含し、「約１０％」は９〜１１％を包含する。さらに、数量と共に「約」を本明細書で使用する場合、その値のプラスまたはマイナス１０％だけでなく、その数量の正確な値も企図および記載されることが理解される。例えば、用語「約３％」は、正確に３％を明示的に企図する、記載する、および含む。

ＲＴＤＳおよび修復オリゴヌクレオチド（ＧＲＯＮ）
本開示は一般に、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列中の特定位置に対する、修飾の標的化の効率を改善するための新規な方法に関する。さらに本開示は、本明細書で開示している手法により修飾、突然変異または顕在化された標的ＤＮＡに関する。本開示はさらに、本開示の方法によって修飾された細胞、組織、および生物に関する。本開示は、成功した変換システム、ｔｈｅＲａｐｉｄＴｒａｉｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＳｙｓｔｅｍ（ＲＴＤＳ（商標）、ＣｉｂｕｓＵＳＬＬＣ）と部分的に関連する組成物および方法の開発に基づく。

ＲＴＤＳは、細胞独自の遺伝子修復システムを利用し、外来ＤＮＡおよび遺伝子発現制御配列を挿入せずにｉｎｓｉｔｕで遺伝子配列を特異的に修飾することによる、標的遺伝子の改変に基づく。この手順は遺伝子配列の正確な改変に影響を与え、一方でゲノムの残り部分は不変状態である。従来のトランスジェニックＧＭＯと対照的に、外来遺伝子物質の組み込みがなく、如何なる外来遺伝子物質も植物中に残っていない。ＲＴＤＳによって導入される遺伝子配列の改変はランダムに挿入されない。影響を受ける遺伝子はその元の位置に留まるので、ランダム、制御不能または有害なパターンの発現は起こらない。

この改変に影響を与えるＲＴＤＳは、ＤＮＡと修飾ＲＮＡ塩基の両方、ならびに他の化学成分で構成され得る、本明細書で記載されるような化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（ＧＲＯＮ）であり、標的遺伝子位置でハイブリダイズしてミスマッチ塩基対（複数可）を形成するよう設計されている。このミスマッチ塩基対は細胞独自の天然遺伝子修復システムをその部位に向けるシグナルとして働き、遺伝子内の指定ヌクレオチド（複数可）を補正する（置換、挿入または欠失）。補正プロセスが終了した後、ＲＴＤＳ分子は分解され、現在修飾または修復中の遺伝子は、その遺伝子の通常の内在制御機構の下で発現される。

本明細書で開示している方法および組成物は、本明細書および以下で詳細に記載する立体配座および化学的性質を有する「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」（ＧＲＯＮ）を用いて実施または作製することができる。本明細書で企図する「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」は、「組換え可能オリゴ核酸塩基」、「ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド」、「キメラオリゴヌクレオチド」、「混合型二本鎖オリゴヌクレオチド」（ＭＤＯＮ）、「ＲＮＡＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＤＯ）」、「遺伝子標的化オリゴヌクレオチド」、「ゲノプラスト」、「一本鎖修飾オリゴヌクレオチド」、「一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドミューテーターベクター」（ＳＳＯＭＶ）、「二本鎖突然変異ベクター」、および「ヘテロ二本鎖突然変異ベクター」を含めた他の名称を使用して、刊行済みの科学誌および特許文献中にも記載されている。遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、マイクロキャリア（バイオリスティックデリバリー）、マイクロファイバー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介取り込み、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションだけには限られないが、これらを含めた、当技術分野で一般に使用される任意の方法を使用して植物細胞に導入することができる。

一実施形態において、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、２’−ヒドロキシルとフルオロ、クロロもしくはブロモ官能基の置換または２’−Ｏ上の置換基の配置によって混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ型ヌクレオチドがＲＮａｓｅ耐性になった、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）である。適切な置換基はＫｍｉｅｃＩＩによって教示された置換基を含む。別の置換基には、米国特許第５，３３４，７１１号（Ｓｐｒｏａｔ）によって教示された置換基と特許公開ＥＰ６２９３８７およびＥＰ６７９６５７（まとめて、ＭａｒｔｉｎＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）によって教示された置換基があり、これらは参照により本明細書に組み込まれている。本明細書で使用する、リボヌクレオチドの２’−フルオロ、クロロもしくはブロモ誘導体、またはＭａｒｔｉｎＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓもしくはＳｐｒｏａｔ中に記載された置換基で置換されたＴ−ＯＨを有するリボヌクレオチドは「Ｔ−置換リボヌクレオチド」と呼ばれる。本明細書で使用する用語「ＲＮＡ型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエステル結合またはＫｍｉｅｃＩもしくはＫｍｉｅｃＩＩによって教示された任意の非天然結合によって混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドと結合した、Ｔ−ヒドロキシルまたは２’−置換ヌクレオチドを意味する。本明細書で使用する用語「デオキシリボ型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエステル結合またはＫｍｉｅｃＩもしくはＫｍｉｅｃＩＩによって教示された任意の非天然結合によって遺伝子修復オリゴ核酸塩基の他のヌクレオチドと結合することができる、Ｔ−Ｈを有するヌクレオチドを意味する。

本開示の特定の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、非置換ホスホジエステル結合によってのみ結合した混合型二本鎖オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）である。代替実施形態では、結合は置換ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、およびＫｍｉｅｃＩＩによって教示された非亜リン酸系結合による結合である。さらに別の実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド中の各ＲＮＡ型ヌクレオチドは２’−置換ヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドの特に好ましい実施形態は、２’−フルオロ、Ｔ−メトキシ、２’−プロピルオキシ、２’−アリルオキシ、２’−ヒドロキシルエチルオキシ、２’−メトキシエチルオキシ、Ｔ−フルオロプロピルオキシおよび２’−トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドのより好ましい実施形態は、２’−フルオロ、２’−メトキシ、２’−メトキシエチルオキシ、および２’−アリルオキシ置換ヌクレオチドである。別の実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドは非置換ホスホジエステル結合によって結合している。

１型の２’−置換ＲＮＡ型ヌクレオチドのみを有する混合型二本鎖オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）はより好都合に合成されるが、本開示の方法は、２型以上のＲＮＡ型ヌクレオチドを有する混合型二本鎖オリゴヌクレオチドで実施することができる。ＲＮＡセグメントの機能が、２つのＲＮＡ型トリヌクレオチド間へのデオキシヌクレオチドの導入により引き起こされる介入によって影響を受ける可能性はなく、したがって用語ＲＮＡセグメントは「介入ＲＮＡセグメント」などの用語を包含する。非介入ＲＮＡセグメントは隣接ＲＮＡセグメントと呼ばれる。代替実施形態では、ＲＮＡセグメントは改変ＲＮａｓｅ耐性および非置換２’−ＯＨヌクレオチドを含有し得る。混合型二本鎖オリゴヌクレオチドは、幾つかの実施形態では１００個より少ないヌクレオチド、および他の実施形態では８５個より少ないヌクレオチド、ただし５０個を超えるヌクレオチドを有する。第１の鎖部分と第２の鎖部分はワトソン−クリックの法則に従い塩基対形成する。一実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの鎖部分は、第１の鎖部分と第２の鎖部分が１つの３’末端と１つの５’末端を有する一本のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントであるように、一本鎖ヘキサ、ペンタまたはテトラヌクレオチドなどのリンカーによって共有結合する。３’末端と５’末端は「ヘアピンキャップ」の付加によって保護することができ、これにより３’末端と５’末端ヌクレオチドはワトソン−クリックの法則に従い隣接ヌクレオチドと塩基対形成する。さらに第２のヘアピンキャップを、第１の鎖部分と第２の鎖部分の間のワトソン−クリックの法則に従う塩基対形成が安定するように、３’末端と５’末端から離れた第１の鎖部分と第２の鎖部分の間の接合部に置くことができる。

第１の鎖部分と第２の鎖部分は、標的遺伝子／対立遺伝子の２セグメントと相同的である２領域を含有する、すなわち標的遺伝子／対立遺伝子と同じ配列を有する。相同領域はＲＮＡセグメントのヌクレオチドを含有し、結合ＤＮＡセグメントの１つまたは複数のＤＮＡ型ヌクレオチドを含有する可能性があり、介在ＤＮＡセグメント内に存在しないＤＮＡ型ヌクレオチドを含有する可能性もある。２つの相同領域は、「異種領域」と呼ばれる標的遺伝子の配列と異なる配列を有する領域によって隔てられ、それぞれ隣接している。異種領域は１、２または３個のミスマッチヌクレオチドを含有し得る。ミスマッチヌクレオチドは隣接する可能性があり、または代替的に、標的遺伝子／対立遺伝子と相同的である１個または２個のヌクレオチドによって隔てられる可能性がある。あるいは異種領域は、挿入物、または１、２、３もしくは５個以下のヌクレオチドも含有し得る。あるいは、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド由来の１、２、３もしくは５個以下のヌクレオチドの欠失のみ標的遺伝子／対立遺伝子の配列と異なる可能性がある。異種領域の長さと位置は、この場合、異種領域内に混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが存在しないが、欠失部分の長さであると考えられる。２つの相同領域と相補的である標的遺伝子の断片間の距離は、１つまたは複数の置換が考えられる異種領域の長さと同一である。異種領域が挿入物を含有する場合、相同領域は、遺伝子／対立遺伝子中のそれらの相補相同断片より遠く混合型二本鎖オリゴヌクレオチド中でそれによって隔てられており、異種領域が欠失をコードするときは逆のことが当てはまる。

混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡセグメントは、それぞれ相同領域、すなわち標的遺伝子の断片と配列が同一である領域の一部分であり、これらのセグメントは、幾つかの実施形態では少なくとも１３のＲＮＡ型ヌクレオチド、および幾つかの実施形態では１６〜２５のＲＮＡ型ヌクレオチド、またはさらに他の実施形態では１８〜２２のＲＮＡ型ヌクレオチド、または幾つかの実施形態では２０のヌクレオチドを全体として含有する。一実施形態では、相同領域のＲＮＡセグメントは隔てられ、介在ＤＮＡセグメントと隣接、すなわち「結合」している。一実施形態では、異種領域のそれぞれのヌクレオチドは介在ＤＮＡセグメントのヌクレオチドである。混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの異種領域を含有する介在ＤＮＡセグメントは、「ミューテーターセグメント」と呼ばれる。

本開示の別の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）は、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳＯＯ／２３４５７、米国特許第６，２７１，３６０号、同第６，４７９，２９２号、および同第７，０６０，５００号中に開示されているような、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドミューテーターベクター（ＳＳＯＭＶ）である。ＳＳＯＭＶの配列は、米国特許第５，７５６，３２５号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，０１２号、同第５，８８８，９８３号、同第５，７９５，９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第６，００４，８０４号、および同第６，０１０，９０７号中、ならびに国際公開Ｎｏｓ．ＷＯ９８／４９３５０、ＷＯ９９／０７８６５、ＷＯ９９／５８７２３、ＷＯ９９／５８７０２、およびＷＯ９９／４０７８９中に記載されたミューテーターベクターと同じ原理に基づく。ＳＳＯＭＶの配列は、ミューテーター領域と呼ばれる所望の遺伝子改変を含有する領域によって隔てられた、標的配列と相同的である２領域を含有する。ミューテーター領域は、標的配列中の相同領域を隔てる配列と同じ長さであるが、異なる配列を有する配列を有し得る。このようなミューテーター領域は置換を引き起こす可能性がある。あるいは、ＳＳＯＭＶ中の相同領域は互いに隣接している可能性があり、一方同じ配列を有する標的遺伝子中の領域は１個、２個以上のヌクレオチドにより隔てられている。このようなＳＳＯＭＶは、ＳＳＯＭＶが不在のヌクレオチドの標的遺伝子からの欠失を引き起こす。最後に、相同領域と同一である標的遺伝子の配列は標的遺伝子中では隣接しているが、ＳＳＯＭＶの配列中では１個、２個以上のヌクレオチドにより隔てられている可能性がある。このようなＳＳＯＭＶは標的遺伝子の配列における挿入を引き起こす。特定の実施形態では、ＳＳＯＭＶはそれ自体にアニーリングしない。

ＳＳＯＭＶのヌクレオチドは、非修飾ホスホジエステル結合によって結合したデオキシリボヌクレオチドであるが、ただし１つの３’末端および／または５’末端ヌクレオチド間結合、または代替的に２つの３’末端および／または５’末端ヌクレオチド間結合がホスホロチオエートまたはホスホアミデートであり得る。本明細書で使用するヌクレオチド間結合は、ＳＳＯＭＶのヌクレオチドの間の結合であり、３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドとブロッキング置換基の間の結合は含まない。具体的実施形態では、ＳＳＯＭＶの長さは２１〜５５デオキシヌクレオチドであり、したがって相同領域の長さは全長少なくとも２０デオキシヌクレオチドであり、少なくとも２つの相同領域は少なくとも８デオキシヌクレオチドの長さをそれぞれ有するはずである。

標的遺伝子のコード鎖または非コード鎖のいずれかと相補的であるように、ＳＳＯＭＶを設計することができる。所望の突然変異が一塩基の置換であるとき、ミューテーターヌクレオチドと標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。所望の機能的結果の獲得と一致する範囲で、相補鎖中のミューテーターヌクレオチドと標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。特に好ましいのは、トランスバージョン突然変異をコードする、すなわちそれぞれ相補鎖中のＣまたはＴヌクレオチドとＣまたはＴミューテーターヌクレオチドがミスマッチである、ＳＳＯＭＶである。

岡崎フラグメント／２’−ＯＭＥＧＲＯＮの設計。様々な実施形態において、ＧＲＯＮはＲＮＡとＤＮＡの両方のヌクレオチドならびに／または他の型の核酸塩基を有してもよい。幾つかの実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドのうちの１つまたは複数が修飾を含む。特定の実施形態では、最初の５’ヌクレオチドはＲＮＡヌクレオチドであり、残りのヌクレオチドはＤＮＡである。さらなる実施形態では、最初の５’ＲＮＡヌクレオチドは２−Ｏ−Ｍｅで修飾される。他の実施形態では、最初の２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の５’ヌクレオチドはＲＮＡヌクレオチドであり、残りのヌクレオチドはＤＮＡである。さらなる実施形態では、最初の２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の５’ＲＮＡヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、２−Ｏ−Ｍｅで修飾される。植物細胞においては、ＤＮＡ中での二本鎖切断は、典型的には、ＮＨＥＪＤＮＡ修復経路によって修復される。この経路は、ＤＮＡを修復するための鋳型を必要とせず、したがって誤りがちである。植物細胞に関してＤＮＡを修復するためにこの経路を使用する利点は、それが迅速であり、遍在的であり、最も重要なことには、細胞がＤＮＡ複製を受けていない時に起こり得るということである。植物細胞における複製フォークの外側の二本鎖切断を修復する際に機能する別のＤＮＡ修復経路は、相同組換え（ＨＲ）と呼ばれる；しかしながら、ＮＨＥＪ経路と違って、この型の修復は正確であり、ＤＮＡ鋳型（ＧＲＯＮ）の使用を必要とする。これらのＧＲＯＮは標的遺伝子のＤＮＡ複製フォークにおいて岡崎フラグメントを模倣するため、二本鎖ＤＮＡ切断剤と共にそれらを使用することは、当業者には自明ではない。

効率の改善
本開示は、修復オリゴヌクレオチドを使用する、標的遺伝子の転換の有効性を高めるための幾つかの手法を提供し、それらは単独でまたは互いに組み合せて使用することができる。これらは以下を含む：
１．標的（ミスマッチ）部位にＤＮＡ修復機構を向ける修復オリゴヌクレオチドに対する修飾の導入。
Ａ．オリゴヌクレオチド（例えば、１０塩基以内、および幾つかの実施形態では所望ミスマッチ部位の５塩基）における１つまたは複数の無塩基部位の導入により塩基切除修復（ＢＥＲ）中の中間体である損傷が生じ、それによってＢＥＲ機構を修復オリゴヌクレオチドによる転換標的の部位近辺に向ける。ｄスペーサー（無塩基フラン）修飾オリゴヌクレオチドは、例えばＴａｋｅｓｈｉｔａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１０１７１−７９，１９８７中に記載されたように調製することができる。
Ｂ．オリゴヌクレオチド中へのまたはオリゴヌクレオチドと一緒のいずれかの、一本鎖または二本鎖切断を誘導する化合物の封入によって、ＮＨＥＪ、マイクロホモロジー仲介末端結合（ＭＭＥＪ）、および相同組換えにより修復される損傷が生じる。例えば、ブレオマイシンファミリーの抗生物質、ジンクフィンガー、ＦｏｋＩ（または任意のＩＩＳ型クラスの制限酵素）および他のヌクレアーゼを修復オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に共有結合させて、修復オリゴヌクレオチドによる転換標的の部位近辺に二本鎖切断を導入することが可能である。ブレオマイシンファミリーの抗生物質は、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよびその他を含めたＤＮＡ切断糖ペプチドである。
Ｃ．オリゴヌクレオチド（例えば、１０塩基以内、および幾つかの実施形態では所望ミスマッチ部位の５塩基）に取り込まれる１つまたは複数の８’オキソｄＡまたはｄＧの導入によって、反応性酸素種によって生成する損傷と類似した損傷が生じる。これらの損傷はいわゆる「助長型修復」系を誘導する。例えば、Ｋｉｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７：６５７−６２，２００４を参照。
２．修復オリゴヌクレオチドの安定性の増大：
修復オリゴヌクレオチド上に３’ブロッキング末端を作製するためのオリゴヌクレオチドの３’末端における逆向き塩基（ｉｄＣ）の導入。
修復オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端における、ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる１つまたは複数の２’Ｏ−メチルヌクレオチドまたは塩基の導入（例えば、ＷＯ２００７／０７３１４９参照）。
修復オリゴヌクレオチドの５’末端における１つまたは複数の２’Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチドの導入、所望のミスマッチ部位をもたらすＤＮＡ塩基が生じ、それによって岡崎フラグメント様核酸構造を生成する。
アクリジン、ソラレン、臭化エチジウムおよびサイバー染色液などの結合（５’または３’）挿入色素。
Ｔ／Ａクランプ、コレステロール成分、ＳＩＭＡ（ＨＥＸ）、リボＣおよびアミダイトなどの５’末端キャップの導入。
ホスホチオエート、２’Ｏ−メチル、メチルホスホネート、ロックド核酸（ＬＮＡ）、（ＭＯＥ）（メトキシエチル）、ジＰＳおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの骨格修飾。
例えばシスプラチンおよびマイトマイシンＣなどの鎖間架橋試薬物質による、修復オリゴヌクレオチドの架橋。
Ｃｙ３、ＤＹ５４７、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５およびＤＹ６４７などの蛍光色素との結合。
３．ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる塩基の取り込みによる、修復オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションエネルギーの増大（例えば、ＷＯ２００７／０７３１４９参照）。
４．合成用の構成単位としてヌクレオチドマルチマー（ジマー、トリマー、テトラマーなど）を使用することによる、修復オリゴヌクレオチド合成の質の向上。これによって、より少ないカップリングステップ、および構成単位からの完全長産物の容易な分離をもたらす。
５．長鎖修復オリゴヌクレオチド（すなわち、例えば、１個もしくは複数の突然変異または修復オリゴヌクレオチド中で標的化された２個以上の突然変異を有する、例えば、本明細書に記載の長さなどの、５５ヌクレオチド長を超える）の使用。

前述の手法の例を表１に与える。

前述の修飾は、メチル化、５’挿入色素、５’と３’末端に対する修飾、骨格修飾、架橋剤、環化、および「キャップ」、およびイノシンなどのアナログと１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの置換などの、周知のヌクレオチド修飾も含み得る。ヌクレオチドの修飾は、アクリジン、アミン、ビオチン、カスケードブルー、コレステロール、Ｃｙ３＠、Ｃｙ５＠、Ｃｙ５．５＠、ダボイル、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、エダンス、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、３’−グリセリル、ＨＥＸ、ＩＲＤ−７００、ＩＲＤ−８００、ＪＯＥ、ホスフェートソラレン、ローダミン、ＲＯＸ、チオール（ＳＨ）、スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＡＭＣＡ−Ｓ’’、ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ°、マリーナブルー＠、パシフィックブルー＠、オレゴングリーン＠、ローダミングリーン＠、ローダミンレッド＠、ロドールグリーン＠およびテキサスレッド＠の付加を含む。ポリヌクレオチド骨格修飾には、メチルホスホネート、２’−ＯＭｅメチルホスホネートＲＮＡ、ホスホロチオレート、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅＲＮＡがある。塩基修飾には、２−アミノ−ｄＡ、２−アミノプリン、３’−（ｄｄＡ）、３’ｄＡ（コルジセピン）、７−デアザ−ｄＡ、８−Ｂｒ−ｄＡ、８−オキソ−ｄＡ、Ｎ６−Ｍｅ−ｄＡ、無塩基部位（ｄスペーサー）、ビオチンｄＴ、２’−ＯＭｅ−５Ｍｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｃ、３’−（５−Ｍｅ−ｄＣ）、３’−（ｄｄＣ）、５−Ｂｒ−ｄＣ、５−１−ｄｕｃ、５−Ｍｅ−ｄＣ、５−Ｆ−ｄＣ、カルボキシ−ｄＴ、転換可能ｄＡ、転換可能ｄＣ、転換可能ｄＧ、転換可能ｄＴ、転換可能ｄＵ、７−デアザ−ｄＧ、８−Ｂｒ−ｄＧ、８−オキソ−ｄＧ、Ｏ６−Ｍｅ−ｄＧ、Ｓ６−ＤＮＰ−ｄＧ、４−メチル−インドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−イノシン、２’−ｄｌ、ｏ６−フェニル−ｄｌ、４−メチル−インドール、２’−デオキシネブラリン、５−ニトロインドール、２−アミノプリン、ｄＰ（プリンアナログ）、ｄＫ（ピリミジンアナログ）、３−ニトロピロール、２−チオ−ｄＴ、４−チオ−ｄＴ、ビオチン−ｄＴ、カルボキシ−ｄＴ、０４−Ｍｅ−ｄＴ、０４−トリアゾール−ｄＴ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｕ、５−Ｂｒ−ｄＵ、２’−ｄＵ、５−Ｆ−ｄＵ、５−ｌ−ｄＵ、０４−トリアゾール−ｄＵがある。前記用語は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、その骨格が糖ではなくＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からなる擬似ペプチドであるＤＮＡアナログも包含する。ＰＮＡはＤＮＡの挙動を模倣し、相補核酸鎖と結合する。ＰＮＡの中性骨格は、通常得られるものより強い結合と高い特異性をもたらす。さらに、強力な生体分子ツール、アンチセンスおよび抗原物質、分子プローブおよびバイオセンサーを生み出すため、ＰＮＡの独自の化学的、物理的および生物学的性質が利用されている。

オリゴ核酸塩基は、ニック（複数可）、ギャップ（複数可）、修飾オリゴヌクレオチド骨格、無塩基部位ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド、または他の化学成分を有する可能性がある。さらなる実施形態では、オリゴ核酸塩基の少なくとも一本の鎖は、少なくとも１つの他の修飾ヌクレオチド、例えばＭＯＥ（メトキシエチル）などの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体と結合した末端ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基部位ヌクレオチド（核酸塩基は欠失状態であるかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）（例えば、ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ＧｌｅｎＲｅｐｏｒｔｓ／ＧＲ２１−１４．ｈｔｍｌを参照）、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミダイト、および非天然塩基含有ヌクレオチドを含む。様々な塩、混合塩および遊離酸型も含まれる。

好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めた他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミダイトおよびアミノアルキルホスホラミダイト、チオノホスホラミダイトを含めたホスホラミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、ならびに反転極性を有し１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’または２’−２’結合である骨格がある。反転極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、３’の大部分のヌクレオチド間結合に１つの３’−３’結合、すなわち無塩基であり得る（核酸塩基が欠失状態であるかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）１つの反転ヌクレオシド残基を含む。結合反転の最も一般的な用途は、ホスホロチオエート骨格を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの末端への３’−３’結合の付加である。３’−３’結合は、２個の５’−ＯＨ末端と０個の３’−ＯＨ末端を有するオリゴヌクレオチドを作製することによって、エクソヌクレアーゼ分解に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに安定化させる。結合反転は、「逆ホスホラミダイト」を使用することによって、オリゴヌクレオチド合成中に特定位置に導入することができる。これらの試薬は５’−ＯＨ位置にホスホラミダイト基、および３’−ＯＨ位置にジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を有する。通常、ＤＭＴ保護基は５’−ＯＨ位置に存在し、ホスホラミダイト基は３’−ＯＨ位置に存在する。

修飾塩基の例には、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリルピレン−ウリジン、２’−アミノウリジン、２’−デオキシウリジン、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２，６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジン、５−ブロモ−ウリジン、５−フルオロ−シチジン、５−フルオロウリジン、５−インド−ウリジン、５−メチル−シチジン、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、７−デアザ−グアニン、８−アミノヘキシル−アミノ−アデニン、６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン、２−チオ−チミン、５−ヨード−ウリジン、５−ヨード−シチジン、８−ブロモ−グアニン、８−ブロモ−アデニン、７−デアザ−アデニン、７−ジアザ−グアニン、８−オキソ−グアニン、５，６−ジヒドロ−ウリジン、および５−ヒドロキシメチル−ウリジンがあるが、これらだけには限られない。これらの合成単位は市販されており（例えば、ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｐａｎｙから購入可能）、化学合成によりＤＮＡに取り込むことができる。

糖成分の修飾の例は、３’−デオキシ化、２’−フルオロ化、およびアラビノシド化であるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。ＤＮＡ中へのこれらの取り込みも化学合成によって可能である。

５’末端修飾の例は、５’−アミノ化、５’−ビオチニル化、５’−フルオレセイン化、５’−テトラフルオロフルオレセイン化、５’−チオール化、および５’−ダブシル化であるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。

３’末端修飾の例は、３’−アミノ化、３’−ビオチニル化、２，３−ジデオキシ化、３’−チオール化、３’−ダブシル化、３’−カルボキシル化、および３’−コレステリル化であるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。

好ましい一実施形態において、オリゴ核酸塩基は、リンカーを介して５’末端炭素に結合した５’ブロッキング置換基を含有することができる。リンカーの化学的性質はその長さ以外は重要ではなく、長さは幾つかの実施形態では少なくとも６原子長でなければならず、リンカーは柔軟性でなければならない。ビオチン、コレステロールもしくは他のステロイドなどの様々な非毒性置換基、または非挿入剤カチオン性蛍光色素を使用することができる。オリゴ核酸塩基を作製するのに特に好ましい試薬は、ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ，ＳｔｅｒｌｉｎｇＶａ．（現在ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってＣｙ３（商標）およびＣｙ５（商標）として販売されている試薬であり、これらは、オリゴヌクレオチドへの取り込みによって、３，３，３’，３’−テトラメチルＮ，Ｎ’−イソプロピル置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニン色素をそれぞれ生成するブロッキングホスホラミダイトである。Ｃｙ３が特に好ましい。インドカルボシアニンがＮ−オキシアルキル置換状態であるとき、５’末端ホスフェートを有するホスホジエステルとしてオリゴデオキシヌクレオチドの５’末端とそれを好都合に結合させることが可能である。市販のＣｙ３ホスホラミダイトを指示通り使用するとき、生じる５’修飾はブロッキング置換基とリンカーからなり、それらはまとめてＮ−ヒドロキシプロピル，Ｎ’−ホスファチジルプロピル３，３，３’，３’−テトラメチルインドモノカルボシアニンである。企図される他の色素には、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、スルホローダミン１０１、メロシアニン５４０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５５０２６、Ｃｙ３．５、Ｄｙ５４７、Ｄｙ５４８、Ｄｙ５４９、Ｄｙ５５４、Ｄｙ５５５、Ｄｙ５５６、Ｄｙ５６０、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙおよびｍＣｈｅｒｒｙがある。

好ましい実施形態では、インドカルボシアニン色素はインドール環の３および３’位置でテトラ置換されている。理論について制限されずに、これらの置換基は色素が挿入色素となるのを妨げる。これらの位置における置換基の同一性は重要ではない。

本明細書に記載するオリゴ設計は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｃｔｉｖａｔｏｒ−ＬｉｋｅＥｆｆｅｃｔｏｒＮｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮｓ）またはＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲｓ）による部位特異的相同組換えを使用する遺伝子標的化だけには限られないが、これらを含めた他のＤＮＡ編集または組換え技術と組み合せて、より有効なドナー鋳型としても有用であり得る。

本開示は、特定の態様および実施形態においては、一般に、ゲノム細胞ＤＮＡの効率的な修飾および／または細胞のゲノムＤＮＡへのＤＮＡの組換えのための方法に関する。任意の特定の使用に限られないが、本明細書で提供する幾つかの方法は、特定の実施形態においては、例えば、細胞に対する修飾の効果を決定する目的で細胞のゲノム中に修飾を導入する際に有用であり得る。例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列に修飾を導入して、修飾が酵素の酵素活性を変えるかどうかを決定する、および／または酵素の触媒領域の位置を決定することができる。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質のコード配列に修飾を導入して、タンパク質のＤＮＡ結合活性が変わるかどうかを決定することができ、したがってタンパク質内の特定ＤＮＡ結合領域をたどることができる。さらに別の代替は、非コード制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、制御ＲＮＡ配列（ｍｉＲＮＡ）など）に修飾を導入して、非コード制御配列と作動可能に連結した第２の配列の発現レベルに対する修飾の影響を決定することである。これは例えば、制御活性を有する特定配列を画定するのに望ましい可能性がある。

ＤＮＡ切断剤
標的遺伝子破壊をもたらすための一戦略は、部位特異的エンドヌクレアーゼなどのＤＮＡ切断剤を使用する一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断の発生によるものである。エンドヌクレアーゼは、藻類、植物、およびヒトを含めた巨大動物モデルなどの、より従来型の遺伝子標的法の影響を従来受けにくい生物における、標的遺伝子の妨害に最も頻繁に使用される。例えば、ＨＩＶ感染を治療および予防するための、ジンクフィンガーヌクレアーゼに関する現在進行中のヒト臨床試験が存在する。さらに、エンドヌクレアーゼ操作は、穀物中に望ましくない表現型をもたらす遺伝子を妨害する試みにおいて現在使用されている。

ジンクフィンガー
１クラスの人工エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼである。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼは、非特異的切断ドメイン、典型的にはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのドメインと、特異的ＤＮＡ配列と結合するように操作したジンクフィンガータンパク質ドメインを組み合せる。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのモジュラー構造によって、それらはゲノムに部位特異的二本鎖切断をもたらす用途の広い基盤となる。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼはジマーとして切断するので、オフターゲット切断事象を予防するための一戦略は、隣接９塩基対部位で結合するジンクフィンガードメインの設計となっている。それぞれ参照によりそれらの全容が本明細書に組み込まれている米国特許第７，２８５，４１６号；第７，５２１，２４１号；第７，３６１，６３５号；第７，２７３，９２３号；第７，２６２，０５４号；第７，２２０，７１９号；第７，０７０，９３４号；第７，０１３，２１９号；第６，９７９，５３９号；第６，９３３，１１３号；第６，８２４，９７８号も参照されたい。

ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮは、特異的ＤＮＡ部位への一本鎖および二本鎖切断の誘導に使用される標的化可能ヌクレアーゼであり、次いでそれらは切断部位に配列変化を作製するのに利用可能な機構により修復される。

ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合領域を操作するのに使用される基本構成単位は、キサントモナス種プロテオバクテリアによってコードされる、天然に存在するＴＡＬＥ由来の高度に保存された反復ドメインである。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ結合は、反復単位のアミノ末端とカルボキシ末端で別のＴＡＬＥ由来ドメインと隣接した、高度に保存された３３〜３５アミノ酸反復単位のアレイによって仲介される。

これらのＴＡＬＥ反復単位はＤＮＡの一塩基と特異的に結合し、その同一性は、反復単位の位置１２と１３に典型的に見られる２つの超可変残基、および所望標的核酸の長さに相当するアレイ中の反復単位の数、標的核酸配列とマッチするよう選択した反復単位の同一性によって決定される。幾つかの実施形態では、標的部位の選択性を最大にするため、標的核酸は１５〜２０塩基対である。標的核酸の切断は、典型的にＴＡＬＥＮ結合の５０塩基対以内で起こる。ＴＡＬＥＮ認識部位設計に関するコンピュータプログラムは当技術分野で記載されている。例えば、Ｃｅｒｍａｋｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０１１Ｊｕｌｙ；３９（１２）：ｅ８２を参照。

所望標的配列とマッチするよう設計した後、ＴＡＬＥＮを組換えによって発現させ、外来タンパク質としてプロトプラストに導入し、またはプロトプラスト内でプラスミドから発現させ、またはｍＲＮＡとして投与することが可能である。

メガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼとしても知られるホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの大きな（例えば１４ｂｐを超える）切断部位のため、高度の特異性でゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断を発生させる配列特異的エンドヌクレアーゼである。それらの標的部位に対するホーミングエンドヌクレアーゼの特異性によって誘導型ＤＮＡ切断の正確な標的化が可能になるが、ホーミングエンドヌクレアーゼの切断部位は希少であり、標的遺伝子中の本来存在する切断部位を発見する確率は低い。

別のクラスの人工エンドヌクレアーゼは操作型メガヌクレアーゼである。操作型ホーミングエンドヌクレアーゼは、既存のホーミングエンドヌクレアーゼの特異性を改変することにより生成する。一手法では、本来存在するホーミングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列に変異を導入し、次いで生成した操作型ホーミングエンドヌクレアーゼをスクリーニングして、標的結合部位を切断する機能性タンパク質を選択する。別の手法では、キメラホーミングエンドヌクレアーゼを、２つの異なるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位を組み合せて各ホーミングエンドヌクレアーゼの半分の部位で構成される新たな認識部位を作製することによって操作する。例えば、米国特許第８，３３８，１５７号を参照。

ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、３つの基本設計構成要素：１）Ｃａｓ遺伝子、転写物（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質；２）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；ならびに３）外来ＤＮＡ部位（例えば、内在性ＤＮＡ標的領域）およびＣＲＩＳＰＲ反復単位の一部と相補的である「プロトスペーサー」領域を担持する、ＣＲＩＳＰＲ反復単位アレイをコードするＲＮＡ転写物からプロセッシングされるＲＮＡセグメントであるｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）を含有する。例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ／２０１４／０９３６６１号および第ＷＯ／２０１３／１７６７７２号を参照されたい。

Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子、転写物（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質
プラスミドベクターからの一過的Ｃａｓ発現は、Ｃａｓタンパク質の送達を誘導する、および／または植物細胞へのＣａｓｍＲＮＡの送達を誘導する。Ｃａｓ遺伝子は、高等植物、藻類または酵母における発現のためにコドン最適化され、適用可能な場合、構成的、誘導性、組織特異的または種特異的プロモーターのいずれかによって駆動される。Ｃａｓ転写物の終結およびポリアデニル化シグナルは、ＮｏｓＴ、ＲＢＣＴ、ＨＳＰ１８．２Ｔまたは他の遺伝子特異的もしくは種特異的ターミネーターのいずれかである。Ｃａｓ遺伝子カセットまたはｍＲＮＡは、天然の、または遺伝子特異的プロモーターおよび／もしくは合成プロモーターと共に、イントロンを含有してもよい。Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数の核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）、突然変異、欠失、変異またはトランケーションを含有してもよい。一過的発現系では、Ｃａｓ遺伝子カセットを、同じ一過的発現ベクター上のｇＲＮＡカセットなどのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の他の構成要素と組み合わせることができる。あるいは、Ｃａｓ遺伝子カセットを、ｇＲＮＡカセットとは無関係の構築物から、またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の他の構成要素から配置および発現させることができる。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子は、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼおよびポリメラーゼなどの様々な推定核酸操作活性を有するタンパク質をコードする。Ｃａｓ遺伝子は、ｃａｓ９を含む。Ｃａｓ９は、推定ＲｕｖＣ様およびＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを含有する大きいタンパク質をコードする遺伝子であり、ほとんどの古細菌および多くの細菌に存在するＣＲＩＳＰＲ適応免疫系と関連する。Ｃａｓ９タンパク質は、２つのローブからなる：
１）認識（ＲＥＣ）ローブ−３つのドメイン：
ａ）ＢＨ（架橋ヘリックス）
ｂ）ＲＥＣ１−ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡ標的化を容易にする
ｃ）ＲＥＣ２−ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡ標的化を容易にする
からなる；
２）ヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブ−３つのドメイン：
ａ）ＲｕｖＣ−ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡ標的化を容易にする；エンドヌクレアーゼ活性
ｂ）ＨＮＨ−エンドヌクレアーゼ活性
ｃ）ＰＩ−ＰＡＭ相互作用
からなる。

他の実施形態では、ｃａｓ遺伝子は、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ、ＲＥＣおよびＢＨドメインが高度に保存されたｃａｓ９の相同体であり得る。幾つかの実施形態では、ｃａｓ遺伝子は、以下の種に由来するものである。

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡと、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列の一部との融合物として操作され、プロトスペーサー領域と相補的である特定の標的ＤＮＡ配列にＣａｓ９を誘導する。ガイドＲＮＡは、長いトレーサーＲＮＡハイブリッド、短いｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドまたは天然のＣＲＩＳＰＲアレイ＋ｔｒａｃｒＲＮＡコンフォメーションを有するキメラＲＮＡ設計を含有する発現カセットを含んでもよい。キメラｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化特異性と、単一の転写物へのｔｒａｃｒＲＮＡの足場化特性とを組み合わせたものである。ｇＲＮＡの一過的発現は、Ｕ６またはＵ３ｓｎＲＮＡ遺伝子ファミリー（Ｗａｎｇｅｔａｌ２００８）に由来するものなどの種特異的高等植物ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより制御される。ｇＲＮＡ転写終結は、Ｗａｎｇｅｔａｌ２００８のようにポリｄＴの６〜２０ヌクレオチドの経路によって制御される。ｇＲＮＡ発現カセットは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の他の構成要素に由来する同じか、または異なる一過的発現ベクター上に位置する。ｇＲＮＡ転写物をｉｎｖｉｔｒｏで合成し、ｇＲＮＡ一過的発現ベクターとは無関係に、またはそれと共に、植物細胞中に直接送達することができる。

標的領域
ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的領域に対する特異性を定義する２つの構成要素である、プロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含有する。典型的には、２０ヌクレオチドであるが、ＤＮＡ標的に基づいて変化してもよいプロトスペーサー配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体に対するＤＮＡ配列特異性を提供する。ＤＮＡ標的はまた、Ｎがプロトスペーサーのすぐ３’側または下流の任意のヌクレオチドを示す、ＮＮＧまたはＮＡＧトリヌクレオチド配列（ＰＡＭ）も含有する。

１構成要素手法
ＬｅＣｏｎｇｅｔａｌ．（２０１３）その他と同様、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子編集に対する単純化された「１構成要素手法」は、単一の一過的発現構築物がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の全ての構成要素、すなわち、ｇＲＮＡとＣａｓ発現カセットの両方を含有するものである。これにより、任意の所与の植物または作物において単一または複数の遺伝子座を標的化するための容易なモジュラー設計が可能になる。複数の遺伝子座の標的化を、単に標的特異的ｇＲＮＡカセット中でスワップすることによって達成することができる。さらに、種特異的プロモーター、ターミネーターまたは他の発現増強エレメントを、「１構成要素手法」の一過的ベクター中に、およびそれから外に容易にシャトルして、種特異的様式でｇＲＮＡとＣａｓタンパク質の両方の最適な発現を可能にすることができる。

２構成要素手法
２構成要素手法においては、ＣａｓおよびｇＲＮＡ発現カセットは、異なる一過的発現ベクター上に位置する。これにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ編集構成要素の別々の送達が可能になり、同じ細胞内の異なる比率のｇＲＮＡ：Ｃａｓが可能になる。１構成要素手法と同様、２構成要素手法もまた、プロモーター、ターミネーターまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成要素の発現に影響する他のエレメントを容易に変化させ、種特異的様式でＤＮＡの標的化を可能にする。

抗生物質
別のクラスのエンドヌクレアーゼは、ブレオマイシンファミリーの抗生物質などのＤＮＡ切断糖ペプチドである抗生物質であり、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよび本明細書にさらに記載する他のものを含むＤＮＡ切断糖ペプチドである。

他のＤＮＡ修飾分子を標的遺伝子組換えにおいて使用することができる。例えば、ペプチド核酸を使用して、１つまたは複数の標的細胞のゲノムに対する修飾を誘導することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｅｃｋｅｒ，米国特許第５，９８６，０５３号を参照）。簡単に言うと、部分的ペプチド骨格を少なくとも含む合成ヌクレオチドを使用して、相同ゲノムヌクレオチド配列を標的化する。二重らせんＤＮＡとの結合によって、またはペプチド核酸と連結した変異原性化学物質を介して、標的ＤＮＡ配列の修飾および／または組換えが起こるよう誘導する。標的特異性は、標的配列とゲノム配列の間の配列相同性の程度によって決定する。

さらに本開示は、ゲノム配列の修飾を実施するため本明細書で使用する個々の方法に限られない。実際、幾つかの方法が企図される。例えば、三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を使用して遺伝子を標的化することができる。ＴＦＯは合成により、例えばＰＣＲにより、または遺伝子合成装置の使用により作製することができる。さらに、適切な天然配列が見られる場合、ゲノムＤＮＡからＴＦＯを単離することができる。例えばソラレンまたはクロラムブシルだけには限られないがこれらなどの変異原性化学物質との結合を含めた、幾つかの方法においてＴＦＯを使用することができる（例えば、Ｈａｖｒｅｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔ’ｌＡｃａｄＳｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７８７９−７８８３，１９９３；Ｈａｖｒｅｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ６７：７３２３−７３３１，１９９３；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１５：１７５９−１７６８，１９９５；Ｔａｋａｓｕｇｉｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔ’ｌＡｃａｄＳｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６０２−５６０６，１９９１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２５：３４４０−３４４４，１９９７を参照）。さらに例えば、ＴＦＯはドナー二本鎖ＤＮＡと結合させることが可能である（例えば、Ｃｈａｎｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７２：１１５４１−１１５４８，１９９９を参照）。ＴＦＯは誤りがちの修復を誘発するのに十分なアフィニティーでの結合により作用することもできる（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：８０２−８０５，１９９６）。

本明細書に開示される方法は、使用するＤＮＡ修復試薬の性質または型に制約を受ける必要はない。例えば、このようなＤＮＡ修復試薬はラジカルを放出し、これによってＤＮＡ鎖切断をもたらす。あるいは、試薬はＤＮＡをアルキル化して、複製および転写を遮断し得る付加体を形成する。別の代替では、試薬は細胞酵素を阻害する架橋または分子をもたらし、鎖切断をもたらす。オリゴヌクレオチドに結合してＴＦＯを形成するＤＮＡ修復試薬の例には、インドロカルバゾール、ナフタレンジイミド（ＮＤＩ）、トランスプラチン、ブレオマイシン、シクロプロパピロールインドールのアナログ、およびフェナントジヒドロジオキシンがあるが、これらだけには限られない。特に、インドロカルバゾールはトポイソメラーゼＩ阻害剤である。これらの酵素の阻害は、鎖切断およびＤＮＡタンパク質付加体形成をもたらす（Ａｒｉｍｏｎｄｏｅｔａｌ．，ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃａｎｄＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍ．８，７７７，２０００）。ＮＤＩはグアニンを酸化することができる光酸化剤であり、これはグアニン残基の部位に突然変異を引き起こす可能性がある（Ｎｕｎｅｚ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，６１９０，２０００）。ＴＦＯが試薬と結合したとき、トランスプラチンが三本鎖標的中のＤＮＡと反応することが示されている。この反応は、突然変異誘発性であるＤＮＡ付加体の形成を引き起こす（Ｃｏｌｕｍｂｉｅｒ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２４：４５１９，１９９６）。ブレオマイシンは、放射性模倣体として広く使用されているＤＮＡ切断物質である。それはオリゴヌクレオチドと結合し、その形式で切断物質として活性があることが示されている（Ｓｅｒｇｅｙｅｖ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２３，４４００，１９９５；Ｋａｎｅ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１６７１５，１９９５）。シクロプロパピロールインドールのアナログはＴＦＯと結合し、三本鎖標的配列中のＤＮＡをアルキル化することが示されている。したがってアルキル化ＤＮＡは、突然変異誘発性である化学的付加体を含有する（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２５，５０７７，１９９７）。フェナントジヒドロジオキシンは、光活性化によりラジカル種を放出する遮蔽キノンである。それらはＴＦＯと結合し、光活性化により二本鎖ＤＮＡに切断をもたらすことが示されている（Ｂｅｎｄｉｎｓｋａｓｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．９，５５５，１９９８）。

修飾および／または組換えを誘導する他の方法は本開示によって企図される。例えば別の実施形態は、外来ＤＮＡ断片と標的遺伝子の間の、または標的部位に対するアフィニティーがあるペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用による相同組換えの誘導に関する（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８−１２９２，１９８９を参照）。さらに他の方法は、ポリアミドによる配列特異的ＤＮＡ認識および標的化（例えば、Ｄｅｒｖａｎｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｈｅｍＢｉｏｌ３：６８８−６９３，１９９９；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８：２１４３−２１５１，１９９９を参照）、および部位特異的活性を有するヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲ）の使用を含む。

本開示は、任意の特定の修飾および／または組換え頻度に限られない。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、標的ヌクレオチド配列において０．２％〜３％の修飾頻度をもたらす。それでもなお、任意の（すなわち、０％と１００％の間の）修飾および／または組換え頻度が本開示の範囲内にあると企図される。修飾および／または組換え頻度は、修飾および／または組換えを誘導するために使用する方法、使用する細胞型、特異的標的遺伝子、および存在する場合使用するＤＮＡ突然変異誘発試薬に依存する。さらに、修飾および／または組換えを検出するために使用する方法は、検出法における制約のため、全ての修飾および／または組換えの発生を検出できるわけではない。その上、幾つかの修飾および／または組換え事象はサイレント状態であり、修飾および／または組換えが生じた検出可能な指標を与えない可能性がある。サイレント状態の修飾および／または組換え事象の検出不能は、修飾および／または組換えの人為的に低い推定値をもたらす。これらの理由、および他の理由のため、本開示は任意の特定の修飾および／または組換え頻度に限られる必要はない。一実施形態では、修飾および／または組換え頻度は０．０１％と１００％の間である。別の実施形態では、修飾および／または組換え頻度は０．０１％と５０％の間である。さらに別の実施形態では、修飾および／または組換え頻度は０．１％と１０％の間である。他のさらに別の実施形態では、修飾および／または組換え頻度は０．１％と５％の間である。

本明細書で使用する用語「突然変異の頻度」は、細胞のゲノム中の標的部位に突然変異を導入することができるＤＮＡ修飾分子で処置した細胞の集団を言及する際には、ＤＮＡ修飾分子で処置した細胞の合計数と比較した、標的部位に突然変異を含有する処置集団中の細胞の数を指す。例えば、細胞のゲノム中の標的部位に突然変異を導入するよう設計したソラレン結合ＤＮＡ修飾分子ＴＦＯで処置した細胞の集団に関しては、５％の突然変異の頻度は、ＴＦＯ−ソラレンで処置した合計１００細胞のうち、５細胞が標的部位に突然変異を含有することを意味する。

本開示は細胞中のＤＮＡの任意の精度の修飾および／または組換えに限られる必要はなく、本開示の幾つかの実施形態は、望む結果に応じてより高い精度を必要とすることが企図される。例えば、遺伝子修復を必要とする特異的配列変化（例えば、特定塩基の変化）は、遺伝子の妨害のみが必要である遺伝子ノックアウトの発生と比較して、より高い精度を必要とする。本開示の方法を用いると、従来技術の方法を用いるより、高レベルの修飾および／または相同組換え技法の精度を得る可能性が高くなる。

植物細胞への遺伝子修復オリゴ核酸塩基の送達
植物細胞を形質転換するのに使用される任意の一般に知られる方法を、遺伝子修復オリゴ核酸塩基の送達に使用することができる。例示的な方法を以下に列挙する。本明細書の方法および組成物は、１つまたは複数のＤＮＡ修飾試薬を細胞にトランスフェクトするための任意の多くの方法を含んでもよい。１つまたは複数の細胞にＤＮＡ修飾試薬を導入するための方法は当技術分野でよく知られており、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、受動吸着、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、リポソーム融合、リポフェクション、ヌクレオフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、バイオリスティクス（すなわち、パーティクルボンバードメント）などだけには限られないが、これらを含む。

投射浸透によりセルロース細胞壁を有する植物細胞にＤＮＡの巨大断片を導入するための金属製マイクロキャリア（ミクロスフェア）の使用は、当業者にはよく知られている（以後バイオリスティック送達）。米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，１００，７９２号および同第５，２０４，２５３号は、それらの投射用マイクロキャリアおよびデバイスの選択に関する一般的な技法を記載する。

本明細書に開示される方法におけるマイクロキャリアの使用に関する具体的条件は、国際公開ＷＯ９９／０７８６５中に記載の条件を含んでもよい。例示的一技法では、氷冷マイクロキャリア（６０ｍｇ／ｍＬ）、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド（６０ｍｇ／ｍＬ）、２．５ＭのＣａＣｌ₂および０．１Ｍのスペルミジンをこの順で加え、混合物を軽く撹拌し、例えば１０分間撹拌し、次いで室温で１０分間放置し、この場合マイクロキャリアは５倍体積のエタノールに希釈し、遠心分離し１００％エタノールに再懸濁する。マイクロキャリア８〜１０μｇ／μＬ、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド１４〜１７μｇ／ｍＬ、ＣａＣｌ₂１．１〜１．４Ｍおよびスペルミジン１８〜２２ｍＭの接着溶液中濃度で良い結果を得ることができる。マイクロキャリア８μｇ／μＬ、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド１６．５μｇ／ｍＬ、ＣａＣｌ₂１．３Ｍおよびスペルミジン２１ｍＭの条件下で最適な結果を観察した。

細胞壁および細胞膜に浸透させるためのマイクロファイバーを使用して遺伝子修復オリゴ核酸塩基を植物細胞に導入することもできる。Ｃｏｆｆｅｅｅｔａｌへの米国特許第５，３０２，５２３号は、ブラックメキシカンスイートトウモロコシの懸濁培養物の形質転換を容易にするための炭化珪素繊維の使用を記載する。マイクロファイバーを使用した植物細胞の形質転換のためのＤＮＡ導入に使用することができる任意の機械的技法を使用して、トランスミューテーション用の遺伝子修復オリゴ核酸塩基を送達することができる。

遺伝子修復オリゴ核酸塩基のマイクロファイバー送達に関する例示的な技法は以下の通りである。滅菌マイクロファイバー（２μｇ）を、約１０μｇの混合型二本鎖オリゴヌクレオチドを含有する１５０μＬの植物培養培地に懸濁させる。懸濁培養物を沈殿させ、同体積の充填細胞および滅菌ファイバー／ヌクレオチド懸濁液を１０分間撹拌し平板培養する。個々の形質に適したように、選択培地に直後に、または最大約１２０時間遅らせて施用する。

代替実施形態では、植物の一部に由来するプロトプラストのエレクトロポレーションにより、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を植物細胞に送達することができる。当業者によく知られる技法に従い、プロトプラストは植物の一部、特に葉の酵素処置によって形成される。例えば、Ｇａｌｌｏｉｓｅｔａｌ，１９９６，ｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ５５：８９−１０７，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．；Ｋｉｐｐｅｔａｌ．，１９９９，ｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１３３：２１３−２２１，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪを参照。エレクトロポレーション前に、プロトプラストを増殖培地中で培養する必要はない。エレクトロポレーションに関する例示的な条件は、０．３ｍＬの合計体積中に３００，０００プロトプラスト、および０．６〜４μｇ／ｍＬの遺伝子修復オリゴ核酸塩基濃度である。

代替実施形態では、当業者によく知られる技法に従い、膜修飾物質ポリエチレングリコールの存在下で植物プロトプラストに核酸を取り込ませる。別の代替実施形態では、マイクロキャピラリーを用いて植物細胞またはプロトプラストにそれを注入することにより、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を送達することができる。

代替実施形態では、アルギン酸カルシウムで構成されるマイクロビーズ中に核酸を包埋し、膜修飾物質ポリエチレングリコールの存在下で植物プロトプラストに取り込ませる（例えば、Ｓｏｎｅｅｔａｌ．，２００２，Ｌｉｕｅｔａｌ．，２００４を参照）。

代替実施形態では、核酸を水中で凝固させ、マイクロ粒子の型でボンバードメントにより植物細胞に導入する（例えば、Ｇｉｌｍｏｒｅ，１９９１，米国特許第５，２１９，７４６号；Ｂｒｉｎｅｇａｒｅｔａｌ．を参照）。

代替実施形態では、ナノ粒子と結合した核酸を、ナノ粒子を含有する懸濁液中での細胞のインキュベーションによって（例えば、Ｐａｓｕｐａｔｈｙｅｔａｌ．，２００８を参照）、またはパーティクルボンバードメントを介して完全細胞にそれらを送達することにより、または共インキュベーションによりプロトプラストに送達することにより（例えば、Ｔｏｒｎｅｙｅｔａｌ．，２００７を参照）、完全植物細胞中に導入する。

代替実施形態では、核酸は浸透ペプチドと複合体形成し、共インキュベーションにより細胞に送達する（例えば、Ｃｈｕｇｈｅｔａｌ．，２００８，ＷＯ２００８１４８２２３Ａ１；ＥｕｄｅｓａｎｄＣｈｕｇｈを参照）。

代替実施形態では、エレクトロポレーションを介して完全細胞に核酸を導入する（例えば、Ｈｅｅｔａｌ．，１９９８，ＵＳ２００３／０１１５６４１Ａｌ，Ｄｏｂｒｅｓｅｔａｌ．を参照）。

代替実施形態では、核酸を含む溶液中にそれらを浸すことにより、乾燥胚の細胞に核酸を送達する（例えば、Ｔｏｐｆｅｒｅｔａｌ．，１９８９、Ｓｅｎａｒａｔｎａｅｔａｌ．，１９９１を参照）か、または他の実施形態では、Ｃｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅ（ＳＱＺＢｉｏｔｅｃｈ）により導入する。

植物の選択
様々な実施形態において、本明細書で開示している植物は、高木もしくは低木として成長する任意の樹木植物種、任意の草本植物種、または可食果実、種子もしくは野菜を生成する任意の種、または有色もしくは芳香性品種の花を生成する任意の種を含めた、任意の種の双子葉植物、単子葉植物または裸子植物であってよい。例えば植物は、それらが既に具体的に言及されていない限り、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、マメ科マメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、ユリ、および堅果産生植物からなる群の植物種から選択することができる。

植物および植物細胞は、当技術分野で一般的に知られている方法を使用して、例えば除草剤の存在下で植物または植物細胞を成長させ、除草剤の不在下での成長速度と比較した成長速度を測定することによって、除草剤に対する抵抗性または耐性に関して試験することができる。

本明細書で使用する、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な成長は、対応する植物、植物器官、植物組織、または対象の野生型タンパク質を発現する植物細胞における成長速度または細胞分裂速度の少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７５％である、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の成長速度または細胞分裂速度として定義する。

本明細書で使用する、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な発生は、対応する植物、植物器官、植物組織、または野生型タンパク質を発現する植物細胞で起こる事象と実質的に同じ、植物、植物器官、植物組織または植物細胞における１つまたは複数の発生事象の出現として定義する。

特定の実施形態において、本明細書で提供する植物器官には、葉、茎、根、枝芽、花芽、分裂組織、胚、子葉、内胚乳、がく片、花弁、めしべ、心皮、おしべ、やく、小胞子、花粉、花粉管、胚珠、子房および果実、またはこれらから得る切片、薄片もしくは薄板があるが、これらだけには限られない。植物組織には、カルス組織、地下組織、脈管組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、苗条組織、根組織、菌こぶ組織、植物腫瘍組織、および生殖組織があるが、これらだけには限られない。植物細胞には、細胞壁を有する単離細胞、様々な大きさのそれらの凝集体、およびプロトプラストがあるが、これらだけには限られない。

植物に除草剤を施用し、同様に施用した非耐性の同様の植物によって与えられる曲線との比較時に右に移動した用量／応答曲線を与えるとき、植物は関連除草剤に実質的に「耐性がある」。このような用量／応答曲線はＸ軸にプロットされた「用量」、およびＹ軸にプロットされた「殺傷率」、「除草剤効果」などを有する。耐性植物は、所与の除草剤効果をもたらすのに、非耐性の同様の植物より多量の除草剤を必要とし得る。除草剤に実質的に「抵抗性がある」植物は、原野の雑草を殺傷するため農薬散布地域により典型的に利用される濃度と割合で除草剤を施用すると、示す場合でも、わずかな壊死、溶解、萎黄病または他の損傷を示す。除草剤に抵抗性がある植物は除草剤耐性でもある。

植物の作製
植物種の様々な組織の組織培養、およびそこからの植物の再生は知られている。例えば、組織培養によるキャノーラ品種の繁殖は、以下のいずれか、Ｃｈｕｏｎｇｅｔａｌ．，「ＡＳｉｍｐｌｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＢｒａｓｓｉｃａｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ」，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ４：４−６，１９８５；Ｂａｒｓｂｙ，Ｔ．Ｌ．ｅｔａｌ．，「ＡＲａｐｉｄａｎｄＥｆｆｉｃｉｅｎｔＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅＰｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｔｈｅＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔｓｆｒｏｍＨｙｐｏｃｏｔｙｌＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ」，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇ，１９９６）；Ｋａｒｔｈａ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，「ＩｎｖｉｔｒｏＰｌａｎｔＦｏｒｍａｔｉｏｎｆｒｏｍＳｔｅｍＥｘｐｌａｎｔｓｏｆＲａｐｅ」，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，３１：２１７−２２０，１９７４；Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，「ＳｐｅｃｉｅｓＳｐｅｃｉｆｉｃＳｈｏｏｔＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＲｅｓｐｏｎｓｅｏｆＣｏｔｙｌｅｄｏｎａｒｙＥｘｐｌａｎｔｓｏｆＢｒａｓｓｉｃａｓ」，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇ１９８８）；Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｅ．，「ＭｉｃｒｏｓｐｏｒｅＣｕｌｔｕｒｅｉｎＢｒａｓｓｉｃａ」，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６，Ｃｈａｐｔｅｒ１７，ｐ．１５９，１９９０だけには限られないが、これらのいずれかに記載されている。

変種のさらなる生殖を組織培養および再生によって行うことができる。ダイズの様々な組織の組織培養およびそこからの植物の再生は、よく知られており広く公開されている。例えば、Ｋｏｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔａｌ．，「ＧｅｎｏｔｙｐｅＸＳｕｃｒｏｓｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｆｏｒＳｏｍａｔｉｃＥｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎＳｏｙｂｅａｎ」，ＣｒｏｐＳｃｉ．３１：３３３−３３７，１９９１；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ａ．，ｅｔａｌ．，「ＡｇｒｏｎｏｍｉｃＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＴｉｓｓｕｅ−Ｃｕｌｔｕｒｅ−ＤｅｒｉｖｅｄＳｏｙｂｅａｎＰｌａｎｔｓ」，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８２：６３３−６３５，１９９１；Ｋｏｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔａｌ．，「ＭａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄＧｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＳｏｍａｔｉｃＥｍｂｒｙｏｓａｓＡｆｆｅｃｔｅｄｂｙＳｕｃｒｏｓｅａｎｄＰｌａｎｔＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｏｒｓｉｎＳｏｙｂｅａｎｓＧｌｙｃｉｎｅｇｒａｃｉｌｉｓＳｋｖｏｒｔｚａｎｄＧｌｙｃｉｎｅｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．」ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ，２８：１０３−１１３，１９９２；Ｄｈｉｒ，Ｓ．ｅｔａｌ．，「ＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＦｅｒｔｉｌｅＰｌａｎｔｓｆｒｏｍＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆＳｏｙｂｅａｎ（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．Ｍｅｒｒ．）；ＧｅｎｏｔｙｐｉｃＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎＣｕｌｔｕｒｅＲｅｓｐｏｎｓｅ」、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１１：２８５−２８９，１９９２；Ｐａｎｄｅｙ，Ｐ．ｅｔａｌ．，「ＰｌａｎｔＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍＬｅａｆａｎｄＨｙｐｏｃｏｔｙｌＥｘｐｌａｎｔｓｏｆＧｌｙｃｉｎｅｗｉｇｈｔｉｉ（Ｗ．ａｎｄＡ．）ＶＥＲＤＣ．ｖａｒ．ｌｏｎｇｉｃａｕｄａ」，ＪａｐａｎＪ．Ｂｒｅｅｄ．４２：１−５，１９９２；ａｎｄＳｈｅｔｔｙ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，「ＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＩｎＶｉｔｒｏＳｈｏｏｔＯｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎＧｌｙｃｉｎｅｍａｘ（Ｍｅｒｒｉｌｌ．）ｂｙＡｌｌａｎｔｏｉｎａｎｄＡｍｉｄｅｓ」，ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ８１：２４５−２５１，１９９２を参照することができる。１９９１年６月１８日に発行されたＣｏｌｌｉｎｓｅｔａｌへの米国特許第５，０２４，９４４号および１９９１年４月１６日に発行されたＲａｎｃｈｅｔａｌへの米国特許第５，００８，２００号の開示は、参照によりそれらの全容が本明細書に組み込まれている。

例示的実施形態
本開示で記載され、本開示の他の場所に提供される態様および実施形態に加えて、特定の実施形態の以下の非限定的一覧が具体的に企図される。
１．細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、細胞をＤＮＡ切断剤および修飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
２．ＤＮＡ切断剤およびＧＲＯＮを含む細胞。
３．前記細胞が植物、細菌、酵母、真菌、藻類、および哺乳動物からなる群から選択される１つまたは複数の種の細胞である、実施形態１または２に記載の方法または細胞。
４．前記細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｂａｃｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄａｍｏｎａｓｒｈｉｅｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍｐｈｕｒｅｊａ、Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ、Ｌｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ、およびＺｅａｍａｙｓからなる群から選択される１つまたは複数の種の細胞である、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５．前記細胞がＹａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６．前記細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではない酵母細胞である、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７．植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＤＮＡ切断剤および修飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
８．ＤＮＡ切断剤および修飾ＧＲＯＮを含む植物細胞。
９．植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＤＮＡ切断剤ならびにＤＮＡおよびＲＮＡを含むＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
１０．ＤＮＡおよびＲＮＡを含むＤＮＡ切断剤を含む植物細胞。
１１．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置で、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基で、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が前記細胞を修飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
１２．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置で、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基で、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が前記細胞をＤＮＡ切断剤および修飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
１３．植物または植物細胞を生成するための方法であって、植物細胞中に、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）を導入して、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数のアミノ酸位置、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むＡＣＣａｓｅタンパク質を発現するＡＣＣａｓｅ遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む方法。
１４．植物または植物細胞を生成するための方法であって、植物細胞中に、ＤＮＡ切断剤と、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）とを導入して、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数のアミノ酸位置、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むＡＣＣａｓｅタンパク質を発現するＡＣＣａｓｅ遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む方法。
１５．配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含む、稔性植物。
１６．配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含む、稔性イネ植物。
１７．配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含み、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子をさらに含む、植物細胞。
１８．配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含み、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子をさらに含む、稔性植物。
１９．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基でアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が前記細胞を修飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
２０．細胞においてアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基でアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が前記細胞をＤＮＡ切断剤および修飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
２１．アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の前記突然変異または変化が、存在する場合、配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからアラニン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからロイシン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからメチオニン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからアスパラギン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからセリン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからトレオニン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからバリン；配列番号１の１７８３位に対応する位置のグリシンからシステイン；配列番号１の１７８６位に対応する位置のアラニンからプロリン；配列番号１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からグリシン；配列番号１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からリシン；配列番号１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からトレオニン；配列番号１の２０７９位に対応する位置のセリンからフェニルアラニン；配列番号１の２０８０位に対応する位置のリシンからグルタミン酸；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからフェニルアラニン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからグリシン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからヒスチジン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからリシン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからロイシン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからアスパラギン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからプロリン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからグルタミン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからアルギニン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからセリン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからトレオニン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからバリン；および配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからトリプトファンからなる群から選択される１つまたは複数を含むアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質をもたらす、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法、植物または細胞。
２２．前記植物または細胞が、配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからアラニン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからロイシン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからメチオニン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからアスパラギン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからセリン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからトレオニン；配列番号１の１７８１位に対応する位置のイソロイシンからバリン；配列番号１の１７８３位に対応する位置のグリシンからシステイン；配列番号１の１７８６位に対応する位置のアラニンからプロリン；配列番号１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からグリシン；配列番号１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からリシン；配列番号１の２０７８位に対応する位置のアスパラギン酸からトレオニン；配列番号１の２０７９位に対応する位置のセリンからフェニルアラニン；配列番号１の２０８０位に対応する位置のリシンからグルタミン酸；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからフェニルアラニン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからグリシン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからヒスチジン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからリシン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからロイシン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからアスパラギン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからプロリン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからグルタミン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからアルギニン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからセリン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからトレオニン；配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからバリン；および配列番号１の２０８８位に対応する位置のシステインからトリプトファンからなる群から選択される１つまたは複数を含むアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）タンパク質を含む、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の植物もしくは細胞、または実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の方法により作製された植物もしくは植物細胞。
２３．前記植物または植物細胞が、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される位置に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の植物もしくは細胞、または実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法により作製された植物もしくは細胞。
２４．前記植物または細胞が、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく２０７８位に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子を含み、配列番号１のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、２０８０および２０８８からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に、またはＡＣＣａｓｅパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子をさらに含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の植物もしくは細胞、または実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の方法により作製された植物もしくは細胞。

前記ＡＣＣａｓｅの実施形態１１〜２４のそれぞれにおいて、方法、植物、細胞、または別のものにしても、以下のものがその中での使用のための好適な突然変異である。

代替的な突然変異は、以下のものに限られないが、それらを含む。

実施形態１１〜２４に関して、ノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく１７８１ｍ、１７８３、１７８６、２０７８、２０７９、および２０８０に対応する位置は当業界で周知であり、適切な配列データベースから容易に入手可能である。例えば、以下の表は、イネＡＣＣａｓｅ配列中の対応する位置を示す。

２５．突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物または植物細胞を生成する方法であって、植物細胞中に、５−エノールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）とを導入して、配列番号２のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ参照配列のアミノ酸配列の番号付けに基づく９６、９７および１０１からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはＥＰＳＰＳ類似体中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現するＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む方法。
２６．突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物または植物細胞を生成する方法であって、植物細胞中に、ＤＮＡ切断剤と、５−エノールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）とを導入して、配列番号２のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ参照配列のアミノ酸配列の番号付けに基づく９６、９７および１０１からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはＥＰＳＰＳ類似体中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現するＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む方法。
２７．突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物または細胞であって、植物細胞中に、ＤＮＡ切断剤と、５−エノールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）とを導入して、配列番号２のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ参照配列のアミノ酸配列の番号付けに基づく９６、９７および１０１からなる群から選択される位置に対応する１つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはＥＰＳＰＳ類似体中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現するＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む方法により作製される植物または細胞。
２８．植物または植物細胞が、配列番号２の９６位に対応する位置のグリシンからアラニン；配列番号２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシン；配列番号２の１０１位に対応する位置のプロリンからアラニン；配列番号２の１０１位に対応する位置のプロリンからセリン；および配列番号２の１０１位に対応する位置のプロリンからトレオニンからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸位置の突然変異を含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現する、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の植物もしくは細胞、または実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の方法により作製された植物もしくは細胞。
２９．植物または植物細胞が、配列番号２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、配列番号２の１０１位に対応する位置のプロリンからアラニン；配列番号２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、配列番号２の１０１位に対応する位置のプロリンからアラニン；配列番号２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、配列番号２の１０１位に対応する位置のプロリンからセリン；および配列番号２の９７位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、配列番号２の１０１位に対応する位置のプロリンからトレオニンからなる群から選択される突然変異の組合せを含むＥＰＳＰＳタンパク質を発現する、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の植物もしくは細胞、または実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の方法により作製された植物もしくは細胞。

実施形態２５〜３０に関して、配列番号２のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ参照配列の番号付けに基づく９６、９７および１０１に対応する位置は当業界で周知であり、適切な配列データベースから容易に入手可能である。例えば、米国特許第８，２６８，６２２号を参照されたい。例えば、以下の表は、アマＥＰＳＰＳ配列中の対応する位置を示す。

Ｅ．ｃｏｌｉのＥＰＳＰＳ配列は、配列：
MESLTLQPIARVDGTINLPGSKTVSNRALLLAALAHGKTVLTNLLDSDDVRHMLNALTALGVSYTLSADRTRCEIIGNGGPLHAEGALELFLGNAGTAMRPLAAALCLGSNDIVLTGEPRMKERPIGHLVDALRLGGAKITYLEQENYPPLRLQGGFTGGNVDVDGSVSSQFLTALLMTAPLAPEDTVIRIKGDLVSKPYIDITLNLMKTFGVEIENQHYQQFVVKGGQSYQSPGTYLVEGDASSASYFLAAAAIKGGTVKVTGIGRNSMQGDIRFADVLEKMGATICWGDDYISCTRGELNAIDMDMNHIPDAAMTIATAALFAKGTTRLRNIYNWRVKETDRLFAMATELRKVGAEVEEGHDYIRITPPEKLNFAEIATYNDHRMAMCFSLVALSDTPVTILDPKCTAKTFPDYFEQLARISQAA
を有するＡｒｏＡである。

アマ遺伝子１の配列は、配列：
MALVTKICGGANAVALPATFGTRRTKSISSSVSFRSSTSPPSLKQRRRSGNVAAAAAAPLRVSASLTTAAEKASTVPEEVVLQPIKDISGIVTLPGSKSLSNRILLLAALSEGTTVVDNLLNSDDVHYMLGALKTLGLNVEHSSEQKRAIVEGCGGVFPVGKLAKNDIELFLGNAGTAMRPLTAAVTAAGGNSSYILDGVPRMRERPIGDLVVGLKQLGADVTCSSTSCPPVHVNGQGGLPGGKVKLSGSISSQYLTALLMAAPLALGDVEIEIVDKLISVPYVDMTLKLMERFGVAVEHSGSWDRFFVKGGQKYKSPGNAYVEGDASSASYFLAGAAITGGTITVEGCGTSSLQGDVKFAEVLEKMGAKVIWTENSVTVTGPPRDASGRKHLRAVDVNMNKMPDVAMTLAVVALYADGPTAIRDVASWRVKETERMIAICTELRKLGATVEEGPDYCIITPPEKLNIAEIDTYDDHRMAMAFSLAACADVPVTIRDPGCTKKTFPDYFEVLERYTKH
を有するｌｃｌ−ｇ４１４５２＿１３３３である。

アマ遺伝子２の配列は、配列：
MAQVTKICGGANAVALPATFGTRRTKSISSSVSFRSSTSPPSLKQRRLLGNVAAAAAAAPLRISASLATAAEKASTVPEEIVLQPIKDISGIVTLPGSKSLSNRILLLAALSEGKTVVDNLLNSDDVHYMLGALKTLGLNVEHSSEQKRAIVEGRGGVFPVGKLGKNDIELFLGNAGTAMRPLTAAVTAAGGNSSYILDGVPRMRERPIGDLVVGLKQLGADVSCSSTSCPPVHVNAKGGLPGGKVKLSGSISSQYLTALLMAAPLALGDVEIEIVDKLISVPYVDMTLKLMERFGVAVEHSGSWDRFFVKGGQKYKSPGNAYVEGDASSASYFLAGAAITGGTITVEGCGTSSLQGDVKFAEVLEKMGAKVTWTETSVTVTGPPRDASGKKHLRAVDVNMNKMPDVAMTLAVVALYADGPTAIRDVASWRVKETERMIAVCTELRKLGATVEEGPDYCIITPPEKLSIAEIDTYDDHRMAMAFSLAACADVPVTIRDPGCTKKTFPDYFEVLERYTKH
を有するｌｃｌ−ｇ４０５４７＿１２７１である。
３０．前記ＤＮＡ切断剤が、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、およびＤＮＡ切断性抗生物質から選択される１つまたは複数である、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３１．前記ＤＮＡ切断剤がＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮである、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３２．前記ＤＮＡ切断剤がＣＲＩＳＰＲである、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３３．前記ＤＮＡ切断剤がＴＡＬＥＮである、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３４．前記ＤＮＡ切断剤が、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシンおよびペプレオマイシンからなる群から選択される１つまたは複数のＤＮＡ切断性抗生物質である、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３５．前記ＤＮＡ切断剤がゼオシンである、実施形態１〜３４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３６．前記ＧＲＯＮが一本鎖である、実施形態１〜３５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３７．ＧＲＯＮが、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３８．ＧＲＯＮが、５’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
３９．ＧＲＯＮが、３’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４０．ＧＲＯＮが、５’および３’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４１．ＧＲＯＮが、Ｃｙ３基、３ＰＳ基、および２’−Ｏ−メチル基から選択される１つまたは複数を含む、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４２．ＧＲＯＮがＣｙ３基を含む、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４３．ＧＲＯＮが５’末端の第１の塩基にＣｙ３基を含む、実施形態１〜４２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４４．ＧＲＯＮが３’末端の第１の塩基にＣｙ３基を含む、実施形態１〜４３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４５．ＧＲＯＮが３ＰＳ基を含む、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４６．ＧＲＯＮが２個以上の３ＰＳ基を含む、実施形態１〜４５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４７．ＧＲＯＮが３個以上の３ＰＳ基を含む、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４８．ＧＲＯＮが５’末端の第１の塩基に３ＰＳ基を含む、実施形態１〜４７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
４９．ＧＲＯＮが３’末端の第１の塩基に３ＰＳ基を含む、実施形態１〜４８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５０．ＧＲＯＮが２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜４９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５１．ＧＲＯＮが２つ以上の２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５２．ＧＲＯＮが、５’末端の第１の塩基に２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜５１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５３．ＧＲＯＮが、５’末端の第１の塩基に２’−Ｏ−メチル基を有し、他の２’−Ｏ−メチル基を有さない、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５４．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の２個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜５３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５５．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の３個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜５４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５６．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の４個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜５５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５７．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の５個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜５６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５８．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の６個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜５７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
５９．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の７個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜５８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６０．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の８個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜５９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６１．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の９個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜６０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６２．ＧＲＯＮが、５’末端の最初の１０個以上の塩基のそれぞれに２’−Ｏ−メチル基を含む、実施形態１〜６１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６３．ＧＲＯＮが、５’末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＲＮＡ塩基を含む、実施形態１〜６２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６４．前記ＧＲＯＮが、遺伝子変化のための標的配列に対してゆらぎ塩基対を有する、実施形態１〜６３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６５．前記ＧＲＯＮが１５〜６０ヌクレオチド長である、実施形態１〜６４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６６．前記ＧＲＯＮが４１ヌクレオチド長である、実施形態１〜６５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６７．前記ＧＲＯＮが５０〜１１０ヌクレオチド長である、実施形態１〜６６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６８．前記ＧＲＯＮが１０１ヌクレオチド長である、実施形態１〜６７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
６９．前記ＧＲＯＮが１５０〜２１０ヌクレオチド長である、実施形態１〜６８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７０．前記ＧＲＯＮが２０１ヌクレオチド長である、実施形態１〜６９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７１．前記ＧＲＯＮが７０〜２１０ヌクレオチド長である、実施形態１〜７０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７２．前記ＧＲＯＮが７０ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜７１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７３．前記ＧＲＯＮが１００ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜７２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７４．前記ＧＲＯＮが１６５ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜７３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７５．前記ＧＲＯＮが１７５ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜７４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７６．前記ＧＲＯＮが１８５ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜７５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７７．前記ＧＲＯＮが１９５ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜７６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７８．前記ＧＲＯＮが２００ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜７７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
７９．前記ＧＲＯＮが２１０ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜７８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
８０．前記ＧＲＯＮが２２０ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜７９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
８１．前記ＧＲＯＮが２３０ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜８０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
８２．前記ＧＲＯＮが２４０ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜８１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
８３．前記ＧＲＯＮが２５０ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜８２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
８４．前記ＧＲＯＮが２６０ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜８３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
８５．前記ＧＲＯＮが２７０ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜８４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
８６．前記ＧＲＯＮが２８０ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜８５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
８７．前記ＧＲＯＮが２９０ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜８６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
８８．前記ＧＲＯＮが３００ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜８７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
８９．前記ＧＲＯＮが４００ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
９０．前記ＧＲＯＮが５００ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜８９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
９１．前記ＧＲＯＮが６００ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜９０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
９２．前記ＧＲＯＮが７００ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜９１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
９３．前記ＧＲＯＮが８００ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜９２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
９４．前記ＧＲＯＮが９００ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜９３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
９５．前記ＧＲＯＮが１０００ヌクレオチド長より長い、実施形態１〜９４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
９６．前記植物が、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、ソラマメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、およびユリからなる群から選択される、実施形態１〜９５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
９７．前記植物がキャノーラである、実施形態１〜９６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
９８．前記植物がコーンである、実施形態１〜９７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
９９．前記植物がメイズである、実施形態１〜９８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１００．前記植物がイネである、実施形態１〜９９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１０１．前記植物がモロコシである、実施形態１〜１００のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１０２．前記植物がジャガイモである、実施形態１〜１０１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１０３．前記植物がダイズである、実施形態１〜１０２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１０４．前記植物がアマである、実施形態１〜１０３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１０５．前記植物がナタネである、実施形態１〜１０４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１０６．前記植物がキャッサバである、実施形態１〜１０５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１０７．前記植物がヒマワリである、実施形態１〜１０６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１０８．植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をＣＲＩＳＰＲおよび修飾ＧＲＯＮに曝露するステップを含む方法。
１０９．複数の遺伝子変化を生じる、実施形態１〜１０８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１０．２つ以上のガイドＲＮＡを使用する、実施形態１〜１０９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１１．１より多いガイドＲＮＡのそれぞれが遺伝子変化のための異なる標的と相補的である、実施形態１〜１１０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１２．ＣＲＩＳＰＲがニッカーゼを含む、実施形態１〜１１１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１３．ＤＮＡ切断剤が２つ以上のニッカーゼを含む、実施形態１〜１１２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１４．２つ以上のニッカーゼが標的核酸配列の反対の鎖上を切断する、実施形態１〜１１３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１５．２つ以上のニッカーゼが標的核酸配列の同じ鎖上を切断する、実施形態１〜１１４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１６．実施形態１〜１１５のいずれか１つに記載の方法により作製された、またはその細胞に由来する非トランスジェニック除草剤抵抗性または耐性植物。
１１７．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の遺伝子変化または突然変異を有し、オオムギ、メイズ、オートムギ、ライムギ、イネ、ソルガム、サトウキビ、芝草、およびコムギからなる群から選択される、実施形態１〜１１６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１８．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の遺伝子変化または突然変異を有し、１つまたは複数の除草剤に対して抵抗性または耐性である、実施形態１〜１１７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１１９．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の遺伝子変化または突然変異を有し、１つまたは複数のＡＣＣａｓｅ阻害性除草剤に対して抵抗性である、実施形態１〜１１８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２０．前記植物細胞が、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の遺伝子変化または突然変異を有し、アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−Ｐ、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップ−Ｐ、ハロキシホップ、ハロキシホップ−Ｐ、イソキサピリホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ−Ｐ、トリホップ、ピノキサデン、これらの除草剤のいずれかの農学的に許容される塩およびエステル、ならびにその組合せからなる群から選択される１つまたは複数の除草剤に対して抵抗性である、実施形態１〜１１９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２１．前記植物細胞が５−エノールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、前記植物細胞がコーン、コムギ、イネ、オオムギ、ソルガム、オートムギ、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、ナタネ、キャノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、リンゴ、レタス、マメ科植物、レンズマメ、ブドウおよび芝草からなる群から選択される、実施形態１〜１２０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２２．前記植物または植物細胞が５−エノールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞が少なくとも１つの除草剤に対して抵抗性である、実施形態１〜１２１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２３．前記植物または植物細胞が５−エノールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞がホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対して抵抗性である、実施形態１〜１２２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２４．前記植物または植物細胞が５−エノールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞がグリホサートに対して抵抗性である、実施形態１〜１２３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２５．前記植物または植物細胞が５−エノールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞がコーン、コムギ、イネ、オオムギ、ソルガム、オートムギ、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、ナタネ、キャノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、リンゴ、レタス、マメ科植物、レンズマメ、ブドウおよび芝草からなる群から選択される、実施形態１〜１２４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２６．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１個の対立遺伝子で起こる、実施形態１〜１２５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２７．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の２個の対立遺伝子で起こる、実施形態１〜１２６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２８．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の３個の対立遺伝子で起こる、実施形態１〜１２７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１２９．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の４個の対立遺伝子で起こる、実施形態１〜１２８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３０．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の対立遺伝子で起こる、実施形態１〜１２９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３１．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１〜１３０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３２．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の２個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１〜１３１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３３．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の３個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１〜１３２のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３４．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の４個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１〜１３３のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３５．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１〜１３４のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３６．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１個の対立遺伝子で起こり、遺伝子の第２の対立遺伝子が、前記第２の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１〜１３５のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３７．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１個の対立遺伝子で起こり、遺伝子の第２の対立遺伝子および第３の対立遺伝子が、前記第２の対立遺伝子および前記第３の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１〜１３６のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３８．細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の１個の対立遺伝子で起こり、遺伝子の第２の対立遺伝子、第３の対立遺伝子、および第４の対立遺伝子が、前記第２の対立遺伝子、前記第３の対立遺伝子、および前記第４の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態１〜１３７のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１３９．細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異および別の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、実施形態１〜１３８のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１４０．細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異および少なくとも１個の他の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、実施形態１〜１３９のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１４１．細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異および少なくとも２個の他の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、実施形態１〜１４０のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１４２．細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異および少なくとも３個の他の対立遺伝子中の少なくとも１個のノックアウトを含む、実施形態１〜１４１のいずれか１つに記載の方法または細胞。
１４３．細胞における遺伝子変化が、１個の対立遺伝子での少なくとも１個の突然変異および他の全ての対立遺伝子中のノックアウトを含む、実施形態１〜１４２のいずれか１つに記載の方法または細胞。

以下は実施例であり、本明細書に記載する方法および組成物を実施するための手順を例示するものである。これらの実施例は限定と解釈されるべきではない。

ＧＲＯＮの長さ
Ｓｏｍｍｅｒｅｔａｌ．，（ＭｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：１１５−２２，２００６）は、一ヌクレオチド変化を利用し緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）変異体において青色蛍光と緑色蛍光を転換する、ｉｎｖｉｖｏ遺伝子転換を検出するためのレポーターシステムを記載する。このレポーターシステムを、モデル種としてシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）を使用しＧＲＯＮ長修飾後のＧＲＯＮ転換の効率を評価した、以下の実験中での使用に適合させた。

要約すると、この実施例および後の実施例用に、青色蛍光タンパク質遺伝子の多数のコピーを有するシロイヌナズナ系統を、当業者に知られる方法によって作製した（例えば、ＣｌｏｕｇｈａｎｄＢｒｅｎｔ，１９９８を参照）。根部由来分裂組織培養物をこの系統で樹立し、これをプロトプラスト単離および培養に使用した（例えば、Ｍａｔｈｕｒｅｔａｌ．，１９９５を参照）。プロトプラストへのＧＲＯＮ送達は、プロトプラストへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介ＧＲＯＮ取り込みによって実施した。ＦｕｊｉｗａｒａａｎｄＫａｔｏ（２００７）によって記載された方法と類似した、９６ウェル形式を使用する方法を使用した。以下に、そのプロトコールを簡潔に記載する。所与の体積は、９６ウェルディッシュの個々のウェルに施用した体積である。
１．９６ウェルプレートの各ウェルにおいて、５×１０⁶細胞／ｍｌで６．２５μｌのＧＲＯＮ（８０μＭ）と２５μｌのシロイヌナズナＢＦＰトランスジェニック根部分裂組織由来プロトプラストを混合する。
２．３１．２５μｌの４０％ＰＥＧ溶液を加えプロトプラストを混合した。
３．処置した細胞を氷上で３０分間インキュベートした。
４．各ウェルに２００μｌのＷ５溶液を加え細胞を混合した。
５．プレートを氷上で３０分間インキュベートし、各ウェルの底部にプロトプラストを沈殿させた。
６．沈殿したプロトプラスト上の培地２００μｌを除去した。
７．８５μｌの培養培地（ＭＳＡＰ，Ｍａｔｈｕｒｅｔａｌ．，１９９５）を加えた。
８．プレートは４８時間暗所において室温でインキュベートした。培養培地添加後のＧＲＯＮの最終濃度は８μＭである。

ＧＲＯＮ送達後４８時間で、サンプルをフローサイトメトリーによって分析し、その緑色蛍光と黄色蛍光が対照プロトプラストのそれと異なるプロトプラストを検出した（ＢＦＰ０はＢＦＰ標的と比較して変化がない非標的ＧＲＯＮを示し、Ｃはコード鎖設計であり、ＮＣは非コード鎖設計である）。ＢＦＰ４分子の中心においてＣ→Ｔの１ヌクレオチド差（コード鎖）またはＧ→Ａのヌクレオチド標的突然変異（非コード鎖）。緑色蛍光はＢＦＰ遺伝子における標的突然変異の導入によって引き起こされ、ＧＦＰの合成をもたらす。結果は図１中に示す。

表２は、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）遺伝子から緑色蛍光への転換用に設計した、例示的な１０１量体および２０１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’−３ＰＳ／３’−３ＰＳＧＲＯＮの配列を示す。「３ＰＳ」は、５’と３’オリゴ末端それぞれにおける３個のホスホチオエート結合を示す。

５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮを使用した転換率
この実施例系の目的は、（ＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ成分を有する）ホスホチオエート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮと、５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮの効率を比較することである。５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮは、５’Ｃｙ３フルオロフォア（アミダイト）および３’ｉｄＣ逆向き塩基を有する。青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）から緑色蛍光への転換を使用して効率を評価した。

個々のファルコンチューブ中（「チューブ」で標識）または９６ウェルプレート（「９６ウェルディッシュ」で標識）のいずれかにおいてプロトプラストへのＧＲＯＮのＰＥＧ送達により行った、３つ全ての実施例において、サイトメトリーにより測定して、ＢＦＰからＧＦＰへの転換効率において異なるＧＲＯＮの化学的性質の間に有意な差はなかった（図１）。

４１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’−３ＰＳ／３’−３ＰＳＧＲＯＮと２’−Ｏ−ＭｅＧＲＯＮの間の比較
この実施例系の目的は、ＤＮＡ切断を誘導するブレオマイシンファミリーのメンバー、ゼオシン（商標）（１ｍｇ／ｍｌ）の有無の下で、ＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ成分を有するホスホチオエート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮと２’−Ｏ−Ｍｅまたは「岡崎フラグメントＧＲＯＮ」の転換効率を比較することである。これらのＧＲＯＮの設計は図２中に示す。ＧＲＯＮはＰＥＧ処置によりシロイヌナズナＢＦＰプロトプラストに送達し、ＢＦＰからＧＦＰへの転換は処置後２４時間でサイトメトリーにより測定した。ゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ）で処置したサンプルは、ＰＥＧ処置前に氷上で９０分間ゼオシンとインキュベートした。

一般に、サイトメトリーにより測定して、ゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在によってＢＦＰからＧＦＰへの転換は増大した（表３）。ゼオシンの存在下と不在下の両方で、ＧＲＯＮの５’末端における第１のＲＮＡ塩基上に１つの２’−ＯＭｅ基を含有するＮＣ岡崎フラグメントＧＲＯＮは、第１の９個の５’ＲＮＡ塩基のそれぞれに１つの２’−ＯＭｅ基を含有するＮＣ岡崎フラグメントＧＲＯＮと比較したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの転換においてより有効であった（図２および表３）。

全ての実施例において、サイトメトリーにより測定して、１ｍｇ／ｍｌのゼオシンの存在下と不在下の両方でＢＦＰからＧＦＰへの転換において、４１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’３ＰＳ／３’３ＰＳと、第１の５’ＲＮＡ塩基上に１つの５’２’−Ｏｍｅ基を含有する７１量体岡崎フラグメントＢＦＰ４／ＮＣＧＲＯＮ（ＢＦＰ４７１量体（１）ＮＣと示す）の間に有意な差はなかった（図２および表３）。ゼオシン（およびおそらくブレオマイシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよびこの抗生物質ファミリーの他のメンバー）の存在下において、転換は鎖非依存的になる（すなわち、これらの実施例中で試験した設計を有するコード（Ｃ）ＧＲＯＮと非コード（ＮＣ）ＧＲＯＮの両方がほぼ同じ活性を示す）ことを記すことは重要である。

４１量体、１０１量体、および２０１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’−３ＰＳ／３’−３ＰＳＧＲＯＮの間の比較
この実施例系の目的は、（ゼオシンの有無の下で）、異なる長さのＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ成分を有するホスホチオエート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮの転換効率を比較することであった。４１量体、１０１量体、および２０１量体を表２中に示す。再度、サイトメトリーにより測定して、ゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在によってＢＦＰからＧＦＰへの転換率は増大した（表４）。３つの実施例全てにおける大まかな傾向は、ゼオシンの存在下と不在下の両方でＮＣＧＲＯＮ長の増大に比例した。ゼオシン存在下でのＢＦＰ−４／ＮＣ／１０１とＢＦＰ−４／Ｃ／１０１以外、これは４１量体ＮＣＧＲＯＮとほぼ等しいがそれよりは低い転換率を有していた。これは、ＢＦＰ−４／４１コードおよび非コードＧＲＯＮを使用した前の全ての実施例とは対照的であり、この場合非コードＧＲＯＮは常にコードＧＲＯＮより優れていた。転換頻度のこの非対称性は、この実施例系で使用したＢＦＰ−４／２０１ＧＲＯＮにも当てはまった。

Ｃａｓ９タンパク質の植物への送達
本実施例は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現プラスミドの送達の代替として、植物細胞への組換えＣａｓ９タンパク質の直接送達を利用するものである。この方法は、細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）、トランスフェクションリポソーム試薬、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などの担体を、単独で、または組み合わせて用いて、活性組換えＣａｓ９タンパク質の細胞への送達を可能にする。

方法
誘導根部組織由来ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度でウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種する。次いで、２０：１、１０：または５：１その他のＣＰＰとカーゴの比でＣＰＰ（例えば、ＴＡＴ、ペネトラチン、Ｃｈａｒｉｏｔ（商標）、ＰＥＰ−１またはその他）で予め被覆された、またはリポソーム試薬と共に封入された蛍光タグ付き組換えＣａｓ９タンパク質（１μｇ）を、播種されたプロトプラストと混合し、２３℃で２〜６時間インキュベートして、Ｃａｓ９／担体複合体を細胞に浸透させる。別の一連の処理において、上記のようにＣＰＰで予め被覆された、または被覆されていない蛍光タグ付き組換えＣａｓ９タンパク質（１μｇ）を、ＰＥＧ法を使用してプロトプラストに導入する。次いで、プロトプラストを、処理の２４時間後にフローサイトメトリーによって分析して、所与の処理内でのＣａｓ９陽性プロトプラストの割合を決定した。

２０１量体±ゆらぎ塩基ＧＲＯＮを含むＣＲＩＳＰＲ
この一連の実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲおよび変換を仲介するための２０１量体ＧＲＯＮを使用して本発明者らのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａのＢＦＰトランスジェニックモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を証明することである。ＢＦＰＣＲＩＳＰＲは、ｂｆｐ遺伝子のコード鎖を標的とし、変換部位はＰＡＭ配列の２７ｂｐ上流にある（図３）。ＧＲＯＮを鋳型として使用して、ＣＲＩＳＰＲにより作出されたｂｆｐ遺伝子中の二本鎖切断を修復し、標的遺伝子をＢＦＰからＧＦＰへ変換することと共に、同様に、ＢＦＰＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列に対応するｂｆｐ遺伝子中にゆらぎ塩基を導入する。ＢＦＰＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列中のゆらぎ塩基は、一度、変換が起こったら、ＣＲＩＳＰＲによるｂｆｐ遺伝子の再切断を最小化すると仮定される。この一連の実施例は、変換されたｂｆｐ遺伝子中のＢＦＰＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列中へのゆらぎ塩基の導入が変換効率を高めるか、またはそうでないかに対処するのに役立つ。

方法
誘導根部組織由来ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度でウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥＣ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するマンノピンシンターゼ（ＭＡＳ）プロモーターおよびポリ−Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＵ６プロモーターを含有する。ＧＲＯＮと共にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、それぞれ、０．０５μｇ／μｌおよび０．１６μＭの最終濃度でＰＥＧ仲介性送達によりプロトプラスト中に導入した。プロトプラストを、２３℃で７２時間、暗室中でインキュベートした後、それらをフローサイトメトリーによって分析して、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。

ＣＲＩＳＰＲは、２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実施例では、ＢＦＰはｂｇｐ遺伝子を標的とする（図３）。ゆらぎ塩基を含む、または含まないＢＦＰを標的とする２０１量体ＧＲＯＮを用いて、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の速度に対するそれらの効果を決定した。表５は、ＧＲＯＮとその対応する配列の一覧を与える。

結果
ＢＦＰＣＲＩＳＰＲを使用した場合、ゆらぎ塩基を含むＢＦＰ４／ＣＧＲＯＮは、ゆらぎ塩基を含まないＢＦＰ４／ＣＧＲＯＮと比較したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの変換において最大で３．５倍効率的である（表６）。ゆらぎ塩基を含むＢＦＰ４／ＣＧＲＯＮを、ゆらぎ塩基を含むＢＦＰ４／ＮＣＧＲＯＮの代わりに使用する場合、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の最大で５．９倍の増大が存在する（表６）。したがって、ゆらぎ塩基を含むＢＦＰ４／ＣＧＲＯＮは、ＢＦＰＣＲＩＳＰＲと共に使用した場合、ＢＦＰからＧＦＰへの変換において最も効率的である。

結論
変換された標的遺伝子中のＢＦＰＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列を変化させるＧＲＯＮ中にゆらぎ塩基を含有させることは、ＢＦＰからＧＦＰへの変換を増大させる。ゆらぎに基づくＧＲＯＮと共にＢＦＰＣＲＩＳＰＲによるＢＦＰからＧＦＰへの変換を、次世代配列決定により確認した（データは示さない）。さらに、ＤＮＡを切断し、ｂｆｐ遺伝子中にインデルを生成するＢＦＰＣＲＩＳＰＲの能力を、次世代配列決定により確認した（データは示さない）。

Ｃｙ３修飾されたＧＲＯＮを含むＣＲＩＳＰＲ
この一連の実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためにＣＲＩＳＰＲおよび変換を仲介するためにＧＲＯＮを使用して、本発明者らのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰトランスジェニックモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を証明することである。これらの実施例において使用されたＢＦＰ６ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲ：ＢＦＰ６）は、ｂｆｐ遺伝子を標的とし、変換部位の近くでＤＮＡの二本鎖切断を引き起こす。ＢＦＰ６ＣＲＩＳＰＲと共に使用されるＧＲＯＮは、変換部位の周囲にｂｆｐ遺伝子のコード配列を含有し、Ｃｙ３については５’末端で、およびｉｄＣ逆向き塩基については３’末端で標識され、ここでは、Ｃｙ３ＧＲＯＮと呼ばれる。これらのＧＲＯＮを、４１量体、１０１量体および２０１量体の３つの異なる長さで試験し、それらを、それらがＧＲＯＮの５’末端と３’末端の両方に３ホスホチオエート結合を有する点でのみＣｙ３ＧＲＯＮと異なる３ＰＳＧＲＯＮと直接比較する。これらのＧＲＯＮを、本明細書では３ＰＳＧＲＯＮと呼ぶ。これらの実施例において使用されたＧＲＯＮの一覧については表７を参照されたい。

方法
誘導根部組織由来ＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度でウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ−Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＵ６プロモーターを含有する。ＧＲＯＮと共にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌならびに４１量体については８．０μＭ、１０１量体については０．３２μＭおよび２０１量体ＧＲＯＮについては０．１６μＭの最終濃度でＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。ＧＲＯＮ処理は単独で、４１量体については８．０μＭ、１０１量体については５．０μＭおよび２０１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを、２３℃で７２時間、暗室中でインキュベートした後、それらをフローサイトメトリーによって分析して、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。

ＣＲＩＳＰＲは、２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実験では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰ６ＣＲＩＳＰＲ（５’ＧＧＴＧＣＣＧＣＡＣＧＴＣＡＣＧＡＡＧＴＣＧＧ３’）を使用した。ＧＲＯＮは、変換部位の近くにｂｆｐ遺伝子のコード配列を含有する。表７は、使用したＧＲＯＮの一覧を与える。

結果
ＢＦＰ６ＣＲＩＳＰＲを用いた場合、試験した全ての長さにおいて、Ｃｙ３ＧＲＯＮは３ＰＳＧＲＯＮと同程度に効率的にＢＦＰからＧＦＰへの変換を仲介することができる（図４）。全体として、ＢＦＰ６ＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮを含有するサンプルは、ＧＲＯＮのみのサンプルと比較したとき、より高レベルのＢＦＰからＧＦＰへの変換を有し（図４）、ＣＲＩＳＰＲが変換速度の増大に対して有する陽性の影響を証明している。

様々なサイズのＧＲＯＮを含むＣＲＩＳＰＲ
この一連の実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲおよび変換を仲介するための様々な長さのＧＲＯＮを使用して、本発明者らのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰトランスジェニックモデル系においてＢＦＰからＧＦＰへの変換を証明することである。これらの実施例において使用されたＢＦＰＣＲＩＳＰＲはｂｆｐ遺伝子を標的とし、変換部位の近くでＤＮＡ中の二本鎖切断を引き起こす。ＢＦＰＣＲＩＳＰＲと共に使用したＧＲＯＮは、変換部位の周囲にｂｆｐ遺伝子のコード配列を含有し、５’末端と３’末端の両方において３ホスホチオエート結合で標識され、本明細書では３ＰＳＧＲＯＮと呼ばれる。これらのＧＲＯＮを６０量体、１０１量体および２０１量体の３つの異なる長さにおいて試験し、それらを、ＧＲＯＮのみの処理と直接比較する。これらの実施例において使用されたＧＲＯＮの一覧については、表８を参照されたい。

方法
誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ−Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＵ６プロモーターを含有する。ＧＲＯＮと一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌならびに６０量体については０．５４７μＭ、１０１量体については０．３２μＭおよび２０１量体ＧＲＯＮについては０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。ＧＲＯＮ処理は単独で、６０量体については７．５μＭ、１０１量体については５．０μＭおよび２０１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、それらをフローサイトメトリーによって分析して、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。

ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。ＢＦＰＣＲＩＳＰＲスペーサー配列は、５’ＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＴ３’である。本実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰＣＲＩＳＰＲを使用した。ＧＲＯＮは、変換部位の近くにｂｆｐ遺伝子のコード配列を含有する。表８は、使用したＧＲＯＮの一覧を与える。

結果
ＢＦＰＣＲＩＳＰＲを用いた場合、１０１ｎｔ以上の長さのＧＲＯＮは、６０ｎｔ長のＧＲＯＮと直接比較したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の媒介において良好である（図５）。全体として、ＢＦＰＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮを含有するサンプルは、ＧＲＯＮのみのサンプルと比較したとき、より高レベルのＢＦＰからＧＦＰへの変換を有し（図５）、ＣＲＩＳＰＲが変換速度の増大に対して有する陽性の影響を証明している。このデータはさらに、ＣＲＩＳＰＲと一緒に使用したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の媒介において最も効率的であるＧＲＯＮの長さは、１０１ｎｔ以上の長さである必要があることを示している。

２’−Ｏ−ＭｅＧＲＯＮを含むＣＲＩＳＰＲ
本実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲおよび変換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、本発明者らのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰトランスジェニックモデル系においてＢＦＰからＧＦＰへの変換を証明することである。本実施例において使用されたＢＦＰＣＲＩＳＰＲはｂｆｐ遺伝子を標的とし、変換部位の近くでＤＮＡ中の二本鎖切断を引き起こす。ＢＦＰＣＲＩＳＰＲと共に使用したＧＲＯＮは、変換部位の周囲にｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード配列を含有し、ＧＲＯＮの最初の１０個の５’塩基はＤＮＡ塩基ではなくＲＮＡ塩基である。これらのＲＮＡ塩基を、図６に記載されるように、最初の５’ＲＮＡ塩基または最初の９個の５’ＲＮＡ塩基のいずれかにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ基で標識する。これらのＧＲＯＮを本明細書では２’−Ｏ−ＭｅＧＲＯＮと呼び、ＧＲＯＮの５’末端と３’末端の両方に３ホスホチオエート結合を有するＤＮＡ塩基を含有する同様の長さの３ＰＳＧＲＯＮと直接比較する。これらのＧＲＯＮは、本明細書では３ＰＳＧＲＯＮと呼ばれる。本実施例において使用されたＧＲＯＮの一覧については、表９を参照されたい。

方法
誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ−Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＵ６プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ＧＲＯＮと一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌならびに７１量体については０．５μＭおよび２０１量体ＧＲＯＮについては０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。ＧＲＯＮ処理は単独で、７１量体については５．０μＭおよび２０１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。

ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。ＢＦＰＣＲＩＳＰＲスペーサー配列は、５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’である。本実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰＣＲＩＳＰＲを使用した。ＧＲＯＮは、変換部位の近くにｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード配列を含有する。表９は、使用したＧＲＯＮの一覧を示す。

結果
ＢＦＰＣＲＩＳＰＲを使用した場合、７１量体および２０１量体の２’−Ｏ−ＭｅＧＲＯＮは、（０）、（１）または（９）の様々な異なる型のＧＲＯＮ保護と比較したとき、類似するＢＦＰからＧＦＰへの変換を有していた（図７および図８）。２’−Ｏ−ＭｅＧＲＯＮは、ＢＦＰＣＲＩＳＰＲを使用した場合、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の媒介においてその３ＰＳＧＲＯＮ相当物よりも効率的である（図７および図８）。

ＧＲＯＮを導入したＣＲＩＳＰＲニッカーゼ
本実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖ニックを作出するためのＣＲＩＳＰＲおよび変換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、本発明者らのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰトランスジェニックモデル系においてＢＦＰからＧＦＰへの変換を証明することである。本実施例において使用されたＢＦＰ１ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲ：ＢＦＰ１）はｂｆｐ遺伝子を標的とし、それぞれ、ガイドＲＮＡと相補的または非相補的なＤＮＡ鎖上の変換部位の近くでＤＮＡ中の一本鎖ニックを引き起こす触媒残基中に突然変異（ＲｕｖＣ中ではＤ１０ＡおよびＨＮＨ中ではＨ８４０Ａ）を含有する。これらのＣＲＩＳＰＲを、本明細書ではＢＦＰ１ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＤ１０ＡおよびＢＦＰ１ＣＲＩＳＰＲニッカーゼＨ８４０Ａと呼び、別々のプラスミド上で単独で、またはＢＦＰ５ｓｇＲＮＡと一緒に使用する。本実施例において複数のＣＲＩＳＰＲニッカーゼを使用する場合、それらは同じＤＮＡ鎖または反対のＤＮＡ鎖をニックすることができる。Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａのいずれかの同じ突然変異を含有する両方のＣａｓ９タンパク質を一緒に使用する場合、それらはＤＮＡの同じ鎖をニックする。逆に、２つのＣａｓ９タンパク質を一緒に使用し、それらの一方がＤ１０Ａ突然変異を含有し、他方の１つがＨ８４０Ａ突然変異を含有する場合、それらはＤＮＡの反対の鎖をニックする。ニッカーゼＣＲＩＳＰＲと共に使用したＧＲＯＮは、ＢＦＰ５ＣＲＩＳＰＲのＰＡＭ配列中に位置する１つのゆらぎ塩基と共に、変換部位の周囲にｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード配列のいずれかを含有する。これらのＧＲＯＮは、５’末端と３’末端の両方に３ホスホチオエート結合を有し、本明細書では３ＰＳＧＲＯＮと呼ばれる。これらの実施例で使用されたＧＲＯＮの一覧については、表１０を参照されたい。ニッカーゼＣＲＩＳＰＲを、ｂｆｐ遺伝子のＤＮＡ中で標的二本鎖切断を引き起こすことができるそのＣＲＩＳＰＲ相当物と直接比較する。

方法
誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ−Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＵ６プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。Ｃａｓ９遺伝子は、触媒残基中に突然変異、ＲｕｖＣ中ではＤ１０ＡまたはＨＮＨ中ではＨ８４０Ａを含有する。ＧＲＯＮと一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌおよび２０１量体については０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。ＧＲＯＮ処理は単独で、２０１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。

ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実施例では、変換部位の近くのｂｆｐ遺伝子の異なる領域を標的とするＢＦＰ１およびＢＦＰ５ｓｇＲＮＡを使用した。ＢＦＰ１スペーサー（５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’）はｂｆｐ遺伝子のコード鎖を標的とするが、ＢＦＰ５スペーサー（５’ＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＴ３’）は非コード鎖を標的とする。ＧＲＯＮは、変換部位の近くにｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード配列を含有する。表１０は、使用したＧＲＯＮの一覧を示す。

結果
ＣＲＩＳＰＲニッカーゼは両方とも（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）、ＢＦＰ１ＣＲＩＳＰＲおよびＢＦＰ５ＣＲＩＳＰＲを別々ではなく一緒に使用したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの変換を仲介するのにより効率的である（図９）。さらに、ＢＦＰ１およびＢＦＰ５Ｄ１０ＡＣＲＩＳＰＲニッカーゼをＣ／２０１１ＷＧＲＯＮと一緒に使用する場合、ＢＦＰからＧＦＰへの変換は、これらのＣＲＩＳＰＲニッカーゼをＮＣ／２０１１ＷＧＲＯＮと共に使用する処理と比較したとき、有意により高い（図９）。ＢＦＰ１およびＢＦＰ５Ｈ８４０ＡＣＲＩＳＰＲニッカーゼを一緒に使用する場合、Ｃ／２０１またはＮＣ／２０１１ＷＧＲＯＮのいずれかに関して、大まかに同レベルのＢＦＰからＧＦＰへの変換が観察される（図９）。ＢＦＰからＧＦＰへの変換のこれらのレベルは、ＢＦＰ５ＣＲＩＳＰＲを単独で使用するときよりもわずかに高く、ＢＦＰ１ＣＲＩＳＰＲを単独で使用するときよりもわずかに低い（図９）。

複数の遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲの使用
本実施例の目的は、標的遺伝子中の二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲおよび変換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａモデル系に由来するプロトプラストの所与の集団において同時的に複数の遺伝子の変換を証明することである。本実施例において使用されたＣＲＩＳＰＲは、プロトプラスト中に、Ｃａｓ９遺伝子ならびにＢＦＰ遺伝子とアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子の両方を標的化する複数のｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを導入することによって、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａゲノム中のこれらの２つの異なる遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。これにより、Ｃａｓ９は、その変換を仲介するＧＲＯＮの存在下でＢＦＰ遺伝子とＡＨＡＳ遺伝子の両方における二本鎖切断を引き起こすことができる。

方法
誘導根部組織に由来するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種する。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ−Ｔ１０ターミネーターと共に複数の異なるｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＵ６プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ＧＲＯＮと一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌおよび２０１量体については０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。ＧＲＯＮ処理は単独で、２０１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターおよび対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイによって分析して、所与の処理内のそれぞれＢＦＰからＧＦＰへ変換されたプロトプラストおよびＡＨＡＳ変換されたプロトプラストの両方の割合を決定した。

対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイでは、ゲノムＤＮＡの５，０００個のゲノム等価物の１０〜１６個の複製物を、一次ＰＣＲ反応において使用した。

ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じか、または複数のプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実施例では、異なるｓｇＲＮＡおよびＧＲＯＮを使用して、その変換部位の近くの複数の遺伝子を標的化する；ＢＦＰスペーサー（５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’）およびＡＨＡＳスペーサー（５’ＴＧＧＴＴＡＴＧＣＡＡＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＧＣ３’）。表１１は、使用したＧＲＯＮを記載する。

結果
ＢＦＰからＧＦＰへの変換およびＡＨＡＳ変換を、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰトランスジェニック系統へのＢＦＰおよびＡＨＡＳＣＲＩＳＰＲプラスミドならびにＢＦＰ／Ｃ２０１量体およびＡＨＡＳ（Ｗ）５７４／ＮＣ２０１量体ＧＲＯＮのＰＥＧ送達の１４４時間後に決定した。フローサイトメトリーデータは、処理１が０．２０％のＢＦＰからＧＦＰへの変換をもたらすことを示していた（表１２）。対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイは、処理１が０．０１％のＡＨＡＳ変換されたプロトプラストをもたらすことを示していた（表１２）。ＧＲＯＮのみの処理は、両アッセイを使用した場合、最小の変換を示した（表１２）。本実施例は、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰモデル系に由来するプロトプラストの所与の集団内の２つの独立した標的遺伝子（ＢＦＰおよびＡＨＡＳ）の同時的変換の成功を証明する。

植物細胞へのＣａｓ９ｍＲＮＡの送達
本実施例は、ＣＲＩＳＰＲＣａｓ発現プラスミドの送達に対する代替手段として植物細胞への組換えＣａｓ９ｍＲＮＡの直接送達を利用する。この方法は、（１）修飾ｍＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏでの合成および（２）植物細胞へのこの修飾ｍＲＮＡの送達を含む。

方法
Ｃａｓ９ｍＲＮＡを、５’ＵＴＲ、タンパク質のコード配列（ＣＤＳ）および３’ＵＴＲを含む線状化プラスミド鋳型に由来するＴ７、Ｔ３またはＳＰ６などのＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎｖｉｔｒｏで転写させる。１つのＲＮＡポリメラーゼは、別のものよりも良好な特定の修飾ヌクレオシドを含有してもよい。５’ＵＴＲは、Ｃ型肝炎ウイルスのＭｉＲ−１２２などのその安定性を改善するエレメントを含有してもよい（Ｓｈｉｍａｋａｍｉｅｔａｌ．，２０１２）。ｉｎｖｉｔｒｏでの合成は、保護的であり、標的植物細胞中での良好な翻訳を確保するヌクレオシドを含む。組換えＣａｓ９ｍＲＮＡは捕捉され、ポリＡ尾部を含有する。

誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種する。組換えＣａｓ９ｍＲＮＡを、単独で、または組み合わせて、以下の手段の１つ（一覧は包括的ではない）：細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）、トランスフェクションリポソーム試薬、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で植物細胞中に送達して、活性組換えＣａｓ９ｍＲＮＡの細胞への送達を可能にする。

ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質をテザリングするためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ
本実施例は、以下の実施例において示されるように、リンカー配列（テザリング配列と呼ぶこともできる）がｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端であるが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結シグナルの５’に含まれる修飾された単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）カセットを利用する（図１０）。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。好ましいが、リンカーの配置はｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端に限られないが、ｓｇＲＮＡカセット内の幾つかの位置で調査される。リンカー配列は、ヌクレオチド長において変化してもよく、またはテザリングを改善するか、もしくは三本鎖相互作用を介して係留される分子数を増加させる二次構造を含有してもよい。

リンカーは、相補的配列を含有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質とのワトソン−クリック塩基対形成を可能にする（図１０）。さらに、ｓｇＲＮＡ中のリンカー配列を、複数のＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質分子をテザリングするより複雑な多面的相互作用領域を可能にする進化した二次および三次構造を含有するように設計する。

全体の概念は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体がヌクレアーゼ活性の部位に生物学的分子をテザリングすることによって、遺伝子編集の可能性を増大させるということである。これらの生物学的分子は、標的遺伝子の変換を仲介するＧＲＯＮを含む。テザリングリンカーを、単に、例えば、ＧｅｎｅＳｔｒｉｎｇｓまたはアニーリングしたオリゴを使用することによってｓｇＲＮＡに付加することができる。

方法
誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓテザリングプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびｂｆｐを標的化するＧＲＯＮを編集する２０１量体上に位置する１５〜３０ｂｐのポリヌクレオチド経路と相補的であるリンカー配列と共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＵ６プロモーターを含有する（図１０に示される）。ｓｇＲＮＡテザリングカセットはポリ−Ｔ１０ターミネーターによって終結される。ＧＲＯＮと共にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌおよび２０１量体ＧＲＯＮについては０．１６μＭの最終濃度でＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。ＧＲＯＮ処理は単独で、２０１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。

ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じか、または異なるプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とリンカーとの融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲを使用する。ＧＲＯＮは、変換部位の近くにｂｆｐ遺伝子のコード配列または非コード配列を含有する。

トランケートされたｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ
本実施例の目的は、標的遺伝子中の二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲおよび変換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰモデル系に由来するプロトプラスト中でのＢＦＰからＧＦＰへの変換を証明することである。本実施例において使用されたＣＲＩＳＰＲは、２つの異なる長さであるＣａｓ９遺伝子および１つのｓｇＲＮＡをコードするプラスミドをプロトプラスト中に導入することによって、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａゲノム中のｂｆｐ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。Ｃａｓ９を標的遺伝子に誘導するｃｒＲＮＡはスペーサーと呼ばれ、それは典型的には２０ｎｔ長（ＣＲ：ＢＦＰ１２０ｎｔ）であるが、これらの実施例では、本発明者らはＢＦＰからＧＦＰへの変換を仲介する際により小さい長さの１７ｎｔ（ＣＲ：ＢＦＰ１１７ｎｔ）のスペーサーを使用する有効性を試験した。

方法
誘導根部組織に由来するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種する。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ−Ｔ１０ターミネーターと共に複数の異なるｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＵ６プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ＧＲＯＮと一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌおよび２０１量体については０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。ＧＲＯＮ処理は単独で、２０１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のＧＦＰに対するＢＦＰの割合を決定した。

ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じか、または複数のプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。これらの実施例では、２０ｎｔ（５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’）対１７ｎｔ（５’ＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’）の２つの異なる長さのＢＦＰ１スペーサーを試験した。表１３は、使用したＧＲＯＮを記載する。

結果
２０ｂｐから１７ｂｐへのＢＦＰ１プロトプラストの長さの減少は、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰモデル系へのプラスミドおよびＧＲＯＮのＰＥＧ送達の７２時間後に、それぞれ、０．１６３％対０．１７７％の同様のレベルのＢＦＰからＧＦＰへの変換を有していた（図１１）。

アンプリコンｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ
本実施例の目的は、標的遺伝子中の二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲおよび変換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰモデル系に由来するプロトプラスト中でのＢＦＰからＧＦＰへの変換を証明することである。本実施例において使用されたＣＲＩＳＰＲは、プラスミド上にコードされるか、またはアンプリコンとしてプロトプラスト中に導入されるＣａｓ９遺伝子および１つのｓｇＲＮＡをコードするプラスミドをプロトプラスト中に導入することによって、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａゲノム中のｂｆｐ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡはＣａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこでＣａｓ９は二本鎖切断を作出し、ＧＲＯＮは、部位特異的様式でＢＦＰをＧＦＰに変換するための鋳型として使用される。

方法
誘導根部組織に由来するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種する。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ−Ｔ₁₀ターミネーターと共に複数の異なるｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＵ６プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ＧＲＯＮと一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌおよび２０１量体については０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。ＧＲＯＮ処理は単独で、２０１量体については２．５μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のＧＦＰに対するＢＦＰの割合を決定した。

ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じか、または複数のプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。これらの実施例では、同じＢＦＰ６ｇＲＮＡ（５’ＧＧＴＧＣＣＧＣＡＣＧＴＣＡＣＧＡＡＧＴＣＧＧ３’）を、アンプリコンとしてプロトプラスト中に送達するか、またはプラスミド上にコードさせた。表１４は、使用したＧＲＯＮを記載する。

結果
Ｃａｓ９のみを含有するプラスミドと一緒のアンプリコンとしてのＢＦＰ６ｇＲＮＡ（ＣＲ：ＢＦＰ６（ｇＲＮＡアンプリコン））の送達は、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰモデル系へのプラスミドおよびＧＲＯＮのＰＥＧ送達の７２時間後に別々のプラスミド上にコードされるｇＲＮＡ（ｇＲＮＡプラスミド）とＣａｓ９の両方による処理と比較した場合、ＢＦＰからＧＦＰへの変換の同様の速度を有していた（図１２）。

非修飾ＧＲＯＮを含むＣＲＩＳＰＲ
本実施例の目的は、ｂｆｐ遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのＣＲＩＳＰＲおよび変換を仲介するためのＧＲＯＮを使用して、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＢＦＰトランスジェニックモデル系におけるＢＦＰからＧＦＰへの変換を証明することである。本実施例において使用されたＢＦＰＣＲＩＳＰＲは、ｂｆｐ遺伝子を標的とし、変換部位の近くでＤＮＡ中の二本鎖切断を引き起こす。３ＰＳＧＲＯＮは、ＧＲＯＮの５’末端と３’末端の両方に３ホスホチオエート結合を有するＤＮＡ塩基を含有し、本明細書では３ＰＳＧＲＯＮと呼ばれる。３ＰＳＧＲＯＮを、本発明者らのＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａモデル系においてＢＦＰＣＲＩＳＰＲを用いて仲介されたＢＦＰからＧＦＰへの変換におけるその非修飾ＧＲＯＮ相当物と直接比較した。これらの実施例で使用されたＧＲＯＮの一覧については、表１５を参照されたい。

方法
誘導根部組織に由来するＢＦＰトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストを、１×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度で、ウェルあたり２５０，０００個の細胞で平底９６ウェルプレート上に播種した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ−Ｔ１０ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＵ６プロモーターを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ＧＲＯＮと一緒にＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＣＲＩＳＰＲについては０．０５μｇ／μｌおよび４１量体ＧＲＯＮについては０．１６μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。ＧＲＯＮ処理は単独で、４１量体については０．８μＭのＰＥＧ送達後に最終ＧＲＯＮ濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、２３℃で７２時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のＧＦＰ陽性プロトプラストの割合を決定した。

ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＢＦＰ標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。ＢＦＰＣＲＩＳＰＲスペーサー配列は、５’ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡ３’である。本実施例では、ｂｆｐ遺伝子を標的とするＢＦＰＣＲＩＳＰＲを使用した。ＧＲＯＮは、変換部位の近くにｂｆｐ遺伝子の非コード配列を含有する。表１６は、使用したＧＲＯＮを記載する。

結果
４１量体の３ＰＳＧＲＯＮは、ＢＦＰＣＲＩＳＰＲを使用するＢＦＰからＧＦＰへの変換の仲介においてその非修飾ＧＲＯＮ相当物よりも効率的である（図１３）。

アマにおけるＴＡＬＥＮおよびＧＲＯＮ
本実施例の目的は、ＴＡＬＥＮプラスミドおよびＧＲＯＮの送達後、プロトプラスト中では２４時間および微小パルス中では３週間の両方でのアマにおけるＥＰＳＰＳ変換を証明することである。本実施例で使用されるＴＡＬＥＮは、茎頂由来プロトプラスト中に、二本鎖切断を作出するＴＡＬＥＮおよび部位特異的様式でｅｐｓｐｓ遺伝子を変換するための鋳型として使用されるＧＲＯＮをコードするプラスミドを導入することによってＬｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍゲノム中のｅｐｓｐｓ遺伝子を標的とする。

方法
アマのプロトプラストを、ｉｎｖｉｔｒｏで発芽させた苗から得られた茎頂から単離した。ＴＡＬＥＮプラスミドを、ＧＲＯＮと共に、それぞれ、０．０５μｇ／μｌおよび０．５μＭの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。プロトプラストを、暗室中、液体培地中、２５℃で最大４８時間インキュベートしたか、またはアルギン酸ビーズ（５×１０⁵細胞／ｍｌ）中に埋め込み、液体培地中で培養して、細胞分裂および微小カルスの形成を誘導した。ＤＮＡ送達の２４時間または３週間後に得られたプロトプラストまたは微小カルスサンプルを、ＮＧＳによって分析して、所与の処理内で標的突然変異を実行する細胞の割合（ＤＮＡリード）を決定した。不完全なＮＨＥＪ仲介型ＤＮＡ修復により生成されたインデルのパーセントも見積もった。

ＴＡＬＥＮ構築物は、それぞれ、ＦｏｋＩの触媒的ＤＮＡ切断ドメインに連結されたＴＡＬエフェクター様ＤＮＡ結合ドメインからなる２つのアーム（左および右）を含む。ＴＡＬエフェクター様ＤＮＡ結合ドメインは、各アームのＦｏｋＩエンドヌクレアーゼが一緒に二量体化し、二本鎖ＤＮＡを切断することができるＤＮＡの特定部位にＴＡＬＥＮアームを誘導する。ＴＡＬＥＮをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＭａｓＰ：：ＬｕＥＰＳＰＳ＿（左アーム）−Ｔ２Ａ−ＬｕＥＰＳＰＳ＿（右アーム）を含有する。ＬｕＥＰＳＰＳ＿（左アーム）配列は５’ＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＣＧＴＣＣＧ３’であり、ＬｕＥＰＳＰＳ＿（右アーム）配列は５’ＴＧＡＧＴＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴ３’である。ゆらぎ塩基を含む、または含まないＬｕＥＰＳＰＳを標的化するＧＲＯＮ（１４４量体）を用いて、変換速度に対するその効果を決定した。

結果
２４時間のプロトプラストおよび３週齢の微小カルスは、次世代配列決定により決定した場合、それぞれ、０．０６７％および０．０５１％ＥＰＳＰＳ変換を有する（図１４）。さらに、これらのデータは、ＴＡＬＥＮが活性であり、Ｌｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ中のｅｐｓｐｓ標的遺伝子を切断することができ、プロトプラスト中では２４時間で、微小カルス中では最大３週間で、それぞれ２．６０％および１．８４％のインデルを形成することを示す。さらに、ＥＰＳＰＳ変換およびインデルは、ＴＡＬＥＮプラスミドおよびＧＲＯＮが導入された後最大３週間維持される。

アマにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ
本実施例の目的は、Ｃａｓ９プラスミドの送達の３および６週間後のアマ微小カルスにおけるＣａｓ９の活性を証明することである。本実施例で使用されたＣＲＩＳＰＲは、Ｃａｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを茎頂由来プロトプラスト中に導入することにより、Ｌｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍゲノム中のｅｐｓｐｓ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とｔｒａｎｓ活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこでＣａｓ９は部位特異的様式でｅｐｓｐｓ遺伝子中に二本鎖切断を作出する。ｅｐｓｐｓ遺伝子中の二本鎖切断は、遍在的ＮＨＥＪ経路により修復された場合、切断部位の周囲にインデルを形成させる。

方法
アマのプロトプラストを、ｉｎｖｉｔｒｏで発芽させた苗から得られた茎頂から単離した。ＣＲＩＳＰＲをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ−Ｔ₁₀ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＵ６プロモーターを含有する。ＣＲＩＳＰＲプラスミドを、０．０５μｇ／μｌの最終濃度でのＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。プロトプラストを、アルギン酸ビーズ（５×１０⁵細胞／ｍｌ）中に埋め込み、液体培地中で培養し、暗室中、２５℃で回転式振盪器（３０ｒｐｍ）中でインキュベートした。個々の細胞から発生した微小カルスを、ＣＲＩＳＰＲプラスミド送達の３および６週間後にＮＧＳによって分析して、誤りがちなＮＨＥＪ仲介型ＤＮＡ修復経路により生成されたインデルを実行する細胞の割合（ＤＮＡリード）を決定した。

ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実施例では、ＣＲＩＳＰＲはｅｐｓｐｓ遺伝子を標的とする。

結果
３および６週齢の微小カルスは、次世代配列決定により決定された場合、それぞれ、４６．５％および５４．７％のインデル形成を有する（図１５）。これらのデータは、Ｃａｓ９がＬｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ中で活性であり、ＥＰＳＰＳ標的遺伝子を切断することができ、インデルを形成することを示している。さらに、これらのインデルは、ＣＲＩＳＰＲプラスミドが導入された後、最大６週間維持される。

操作されたヌクレアーゼの構築
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ
一過的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９発現プラスミドの構築のために、ＮおよびＣ末端の両方にＳＶ４０ＮＬＳならびにＮ末端に２ｘＦＬＡＧタグを含有する高等植物コドン最適化されたＳｐＣａｓ９遺伝子を、一連のＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）として合成した後、Ｇｉｂｓｏｎ法により、マンノピンシンターゼ（ＭＡＳ）プロモーターの下流およびエンドウマメリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ｒｂｃｓＥ９）ターミネーターの上流にクローニングした。次に、発現がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＵ６プロモーターにより駆動されるキメラｇＲＮＡからなるｓｇＲＮＡカセットを、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）として合成した後、Ｇｉｂｓｏｎ法を用いてＣａｓ９を含有する構築物中にシャトルし、ｐＢＣＲＩＳＰＲを形成させた。対応する標的配列のためのキメラｇＲＮＡを特定するために、可変性２０ｎｔｓｇＲＮＡ標的化配列をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドの対（拡張データ、表２）をアニーリングさせて、４ｂｐの突出部を有する短い二本鎖断片を作製した。この断片をＢｂｓＩ消化されたｐＢＣｒｉｓｐｒ中にライゲーションして、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構築物ＢＣ−１、ＢＣ−２およびＢＣ−３を得た。

ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮ発現構築物ＢＴ−１およびＬｕＥＴ−１の設計および構築は、Ｃｅｒｍａｋｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３９，ｅ８２（２０１１）に記載された規則に基づくものであった。標的配列を、ＮＧ、ＨＤ、ＮＩおよびＮＮがそれぞれＴ、Ｃ、ＡおよびＧを認識するという規則にしたがって、遺伝子編集部位および反復可変ｉ残基（ＲＶＤ）に基づいて選択した。ヘテロ二量体ＦｏｋＩドメインに連結されたＴＡＬエフェクタードメインの集合を、市販のサービス（ＧｅｎｅＡｒｔ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して完了させた。ＴＡＬＥＮ単量体を、Ｇｉｂｓｏｎ法を用いてＭＡＳプロモーターの下流およびｒｂｃＥ９ターミネーターの上流にクローニングし、２Ａ結合単位として発現させた。

細胞培養およびプロトプラストの単離
表面滅菌したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの種子を、１２時間の明／暗周期の下、２８℃で固体１／２ＭＳ培地（ＸＸによるミネラルおよびビタミン；１／２濃縮；８７．７ｍＭスクロース）上で発芽させた。２〜３週齢の苗に由来する根材料を収集し、２８℃で低光量条件下、１／２ＭＳ液体培地中で維持した。根培養物を、プロトプラストの単離の３週間前にＭＳＡＲ［０．２２％１／２ＭＳ、８７．７ｍＭスクロース、１１．４μＭＩＡＡ、２．３μＭ２，４−Ｄ、１．５μＭ２ｉＰ、ｐＨ５．８］中に移し、維持した。根を約６ｍｍのセグメントに切断し、細胞壁消化酵素［１．２５％セルラーゼＲＳ、０．２５％マセロザイムＲ−１０、０．６Ｍマンニトール、５ｍＭＭＥＳ、０．１％ＢＳＡ］を含有するＭＳＡＰ溶液［０．２２％１／２ＭＳ、８７．７ｍＭスクロース、１１．４μＭＩＡＡ、２．３μＭ２，４−Ｄ、１．５μＭ２ｉＰ、および４００ｍＭマンニトール、ｐＨ５．８］中で穏やかに振盪しながら暗室中で３〜４時間インキュベートした。遊離したプロトプラストを収集し、滅菌１００μｍフィルターおよび３５μｍフィルターを通過させた。プロトプラストの濾液を０．８倍容量のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）ＤｅｎｓｉｔｙＧｒａｄｉｅｎｔＭｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）と混合し、穏やかに混合した。６０％のＷ５［１５４ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１２５ｍＭＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ５．８）］／４０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ溶液、次いで、９０％のＷ５／１０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ溶液を、濾液／Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液上にゆっくりと層化して勾配を作製し、１９８ＲＣＦで１０分間遠心分離した。白色のプロトプラスト層を収集し、２倍容量のＷ５と混合した。プロトプラストを４４ＲＣＦで１０分間遠心分離し、ＴＭ溶液［１４．８ｍＭＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、５ｍＭＭＥＳ、５７２ｍＭマンニトール（ｐＨ５．８）］中に１×１０⁷細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。Ｚｅｏｃｉｎ（商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびフレオマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いる実験のために、プロトプラストを、トランスフェクション前に氷上で９０分間、ｐＨ７．０に調整したＴＭ中で保持した。抗生物質濃度については、拡張データの図１を参照されたい。

アマのプロトプラストを、ｉｎｖｉｔｒｏで発芽させた３週齢の苗から得られた茎頂から単離した。茎頂を、外科用メスを用いて細かく切り刻み、Ｂ培地［Ｂ５塩およびビタミン（Ｇａｍｂｏｒｇｅｔａｌ．，１９６８）、４ｍＭＣａＣｌ₂、０．１Ｍグルコース、０．３Ｍマンニトール、０．１Ｍグリシン、２５０ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物、１０ｍｇ／ｌＬ−システイン−ＨＣＬ、０．５％ポリビニルピロリドン（ＭＷ１０，０００）、０．１％ＢＳＡ、１ｍｇ／ｌＢＡＰ、０．２ｍｇ／ｌＮＡＡ、および０．５ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ］中、室温で１時間、予め原形質分離を起こさせ、回転式振盪器（５０ｒｐｍ）上、２５℃で５時間、０．６６％セルラーゼＹＣおよび０．１６％マセロザイムＲ−１０を添加したＢ培地を含有する細胞壁消化酵素溶液中でインキュベートした。遊離したプロトプラストを篩にかけ、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）層を用いる密度勾配遠心分離によって精製し、血球計を用いて計数し、Ｂ培地中、０．５×１０⁶個のプロトプラスト／ｍｌの密度で暗室中で一晩、静置した。

プロトプラストのトランスフェクション
９６ウェル平底プレート中で、ＰＥＧ［２７０ｍＭマンニトール、６７．５ｍＭＣａ（ＮＯ₃）₂、３８．４％ＰＥＧ１５００（ｐＨ５．８）］を用いて、ウェルあたり２．５×１０⁵個の細胞に、１０ｐｍｏｌのＧＲＯＮ、１０ｐｍｏｌのＧＲＯＮ＋３．２５μｇのＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓもしくはＴＡＬＥＮ発現構築物またはモックをトランスフェクトした。細胞およびＤＮＡを、氷上で３０分間、ＰＥＧと共にインキュベートした後、２００μｌのＷ５溶液で洗浄した。最後に、８５μｌのＭＳＡＰ＋＋［５０ｎＭフィトスルホキン−αおよび２０μＭｎ−プロピルガレートを含有するＭＳＡＰ］を添加し、細胞を２８℃で低光量条件下で培養した。

培養の約１８時間後、プロトプラストに、ＰＥＧ仲介性送達を用いて、ＧＲＯＮと共にＴＡＬＥＮプラスミド（２０μｇのプラスミドおよび０．２ｎｍｏｌのＧＲＯＮ／１０⁶個のプロトプラスト）をトランスフェクトした。処理されたプロトプラストを、Ｂ培地中、暗室中で２５℃で最大４８時間インキュベートしたか、またはトランスフェクションの２４時間後にアルギン酸ビーズ中に埋め込み、Ｖ−ＫＭ液体培地中で培養して、細胞分裂および微小カルスの形成を誘導した。抗生物質実験のために、ウェルあたり１．２５×１０⁵個の細胞に、上記のＰＥＧ溶液を用いて、８μＭのＧＲＯＮＣＧ１３をトランスフェクトした。

サイトメトリー
トランスフェクションの７２時間後、細胞を、ＧＦＰについて必要に応じて放出を励起および検出しながらＡｔｔｕｎｅ（登録商標）ＡｃｏｕｓｔｉｃＦｏｃｕｓｉｎｇサイトメーター（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を用いるサイトメトリーにより分析した。バックグラウンドレベルは、ＤＮＡ送達を用いないＰＥＧ処理されたプロトプラストに基づいていた。抗生物質実験のために、トランスフェクションの前にＺｅｏｃｉｎまたはフレオマイシンで処理されたプロトプラストを、トランスフェクションの４８時間後にサイトメトリーによって分析した。

配列決定分析
ゲノムＤＮＡを、製造業者の推奨（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）にしたがってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＰｌａｎｔＩＩキットを用いて、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓまたはＴＡＬＥＮ処理されたプロトプラストから抽出した。ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ標的領域に隣接するアンプリコンを、１００ｎｇのゲノムＤＮＡならびにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥＮについてはプライマーＢＦＰＦ−１（５’−ＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣ−３’）／ＢＦＰＲ−１（５’−ＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣ−３’）；またはＬ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍのＴＡＬＥＮについてはＬｕＥＰＦ−１（５’−ＧＣＡＴＡＧＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣ−３’）／ＬｕＥＰＲ−１（５’−ＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧ−３’）と共にＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼを用いて作製した。アンプリコンを精製し、ＱｉａｑｕｉｃｋＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて濃縮した。アンプリコンのディープシーケンシングを、２×２５０ｂｐのＭｉＳｅｑラン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いるＧｅｎｅＷｉｚ（ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）により実施した。データ分析のために、リード１およびリード２に関するｆａｓｔｑファイルを、ＣＬＣＧｅｎｏｍｉｃｓＷｏｒｋｂｅｎｃｈ７．０．４（ＣＬＣＢｉｏ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）中にインポートした。リード対を、それらの配列が重複した場合、単一の配列に融合させた。アンプリコンの配列を、それまたはその逆向きかつ相補的配列がフォワードおよびリバースプライマー配列を含有する場合、同定した。サンプル中のユニークな配列の出現を、その存在量として記録した。インデルまたは遺伝子編集のパーセントを、編集またはインデルを有するリードの数を、配列決定されたリードの総数で除算した後、１００を乗算することによって算出した。

統計分析
統計的有意性を、両側分布を用いるＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて決定した。０．０５未満のＰ値を、有意と考えた。データを平均およびＳＥＭとして示す。

結果
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａプロトプラスト中でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ活性および遺伝子編集
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびクラスター化された一定間隔の短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）などの操作されたヌクレアーゼをプログラムして、高い特異性で二本鎖ＤＮＡを標的化および切断することができる。ＴＡＬＥＮは、両方ともＦｏｋＩの触媒的ＤＮＡヌクレアーゼドメインに連結されたＴＡＬエフェクター様ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥ）を有する２つのアームからなる。ＴＡＬＥドメインは、ＴＡＬＥＮアームをＤＮＡの特定の部位に誘導し、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの二量体化およびその後の二本鎖切断（ＤＳＢ）の生成を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、２つの構成要素；ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９）と、操作された単一のガイド（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）のキメラ融合物からなる。ｓｇＲＮＡは、その最初の２０個の５’塩基と、ＤＮＡ標的との塩基対形成を介してＣａｓ９に対する標的核酸特異性を支援し、続いて、部位特異的ＤＳＢをもたらす。

植物においては、ＤＳＢは、典型的には、誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路により修復され、修復部位において無作為な欠失および／または挿入（インデル）をもたらす。対照的に、正確なゲノム編集は、多くの場合、姉妹染色分体における、相同な鋳型ＤＮＡの要件のため、ＮＨＥＪよりも正確である修復経路である、相同性特異的修復（ＨＤＲ）により修復される標的変化の近くでのヌクレアーゼ誘導ＤＳＢに依拠する。ＨＤＲ経路を利用することにより、ヌクレアーゼにより切断される場合、特異的に、または二本鎖切断を誘導する抗生物質と組み合わせて使用される場合、非特異的に、ＤＮＡを編集するための修復鋳型として操作されたオリゴヌクレオチドを使用することができる。

図１６は、Ｈ６６をコードするコドン（ＣＡＣ→ＴＡＣＨ６６Ｙ）を編集することにより、安定に組み込まれたＢＦＰ遺伝子をＧＦＰに変換することができる、ＢＦＰトランスジェニックモデル系に由来するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａプロトプラストにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を記載する。細胞をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ＢＣ−１）で処理した場合、ＮＨＥＪにより誘導されるインデルは、ディープシーケンシングにより、ＢＦＰ遺伝子のＨ６６遺伝子座の近くで０．７９％の頻度で生成された（図１６ａ）。大部分のインデルは１ｂｐであり、９ｂｐより長くなかった。逆に、ＧＲＯＮのみで処理された、またはモック処理された細胞は、インデルを示さなかった（データは示さない）。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、このトランスジェニックモデル系において、ＢＦＰ遺伝子を能動的に標的化することができることを示している。

本発明者らのトランスジェニックモデル系に由来するプロトプラスト中でＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集を仲介する、ＧＲＯＮと組み合わせたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の有効性に関して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と、ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾されたＧＲＯＮ（ＣＧ６）の両方を、ＧＲＯＮのみまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のみの処理と比較したとき、同時に導入する場合に、ＢＦＰからＧＦＰへの編集における７．４倍の改善が観察された（図１６ｂ）。これらの結果は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロトプラスト中へのＰＳ修飾ＧＲＯＮを有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の導入がＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集の頻度を有意に増大させることを示している。

５’末端と３’末端の両方に３つの隣接するＰＳ修飾（本明細書では３ＰＳと呼ばれる）を含有するＧＲＯＮは、非修飾ＧＲＯＮと比較した場合、ＢＦＰからＧＦＰへの編集に正に影響する。３ＰＳ修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ２）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ＢＣ−１）と組み合わせた場合、非修飾ＧＲＯＮ鋳型（ＣＧ１；図１７ａ）と比較したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの編集においてより効率的である。さらに、編集とＧＲＯＮの長さとの正の相関（図１７ｂ）が観察された。総合すると、これらの結果は、ＧＲＯＮ修飾と長さの両方が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の存在下でＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓなどの植物における遺伝子編集の頻度を大きく改善することができることを示す。

２０１の核酸塩基（ｎｂ）の３ＰＳ修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ６）、または最初のＲＮＡ塩基もしくは最初の９個のＲＮＡ塩基が２’−Ｏ−メチルで修飾されたＲＮＡとして最初の１０個の５’塩基からなる２０１ｎｂの２’−Ｏ−メチル修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ９）もしくは（ＣＧ１０）をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ＢＣ−１）と一緒にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロトプラスト中に導入する場合、それらの間でＢＦＰからＧＦＰへの編集における統計的差異が観察された（図１７ｃ）。同様に、２０１ｎｂの３ＰＳ修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ３）または５’Ｃｙ３および３’ｉｄＣ逆向き塩基からなる２０１ｎｂのＣｙ３修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ４）を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ＢＣ−３）と一緒にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロトプラスト中に導入した場合、編集頻度における統計的差異は観察されなかった（図１７ｄ）。全体として、これらのデータは、多様なＧＲＯＮ修飾は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の存在下でＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける遺伝子編集の頻度を大きく改善することができることを示す。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９および修飾ＧＲＯＮに関するこれらの結果に基づいて、ＢＦＰ遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮ対と結合した修飾ＧＲＯＮが、同様にＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集の改善をもたらすかどうかを決定した。ＢＦＰ遺伝子座での有効なヌクレアーゼ活性を第１に示すために、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロトプラストをＴＡＬＥＮ（ＢＴ−１）で処理したところ、ディープシーケンシングにより予想された切断部位に、またはその近くに０．５１％のインデルが見られ、ＴＡＬＥＮがこのモデル系においてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と同程度に活性であることを示している（図１８ａ）。欠失の大部分は１０ｂｐを超えるものであったが、５０ｂｐ未満のものであり、一方、挿入は、欠失よりも有意に少なく、３ｂｐまたはそれ以下であった。次に、本発明者らは、ＢＦＰからＧＦＰに編集する、修飾ＧＲＯＮと結合したＴＡＬＥＮの有効性を検査した。ＢＦＰＴＡＬＥＮ（ＢＴ−１）と３ＰＳＧＲＯＮ（ＣＧ７）の両方を導入する場合、３ＰＳＧＲＯＮのみと比較して、ＢＦＰからＧＦＰへの編集の頻度の９．２倍の改善が観察された（図１８ｂ）。上記のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ実験と同様に、これらの結果は、３ＰＳ修飾ＧＲＯＮを含むＴＡＬＥＮのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロトプラスト中への導入もまた、ＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集の頻度を有意に増大させることを示している。

Ｌｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）におけるＥＰＳＰＳ（５’−エノールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ）遺伝子座も、この系における標的として使用した。ＥＰＳＰＳ遺伝子は、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの生合成に参画するシキミ酸経路における酵素をコードする。植物においては、ＥＰＳＰＳは除草剤グリホサートのための標的であり、ホスホエノールピルビン酸のための結合部位の競合的阻害剤として作用する。

編集された場合、ＥＰＳＰＳをグリホサート耐性にする（拡張データの図１８ｂ）Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍにおける２つの遺伝子座（Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａ）の近くの部位を標的化するＴＡＬＥＮを選択した。Ｔ９７ＩおよびＰ１０１Ａに標的変化を含有する１４４ｎｂの５’Ｃｙ３修飾ＧＲＯＮ（ＣＧ１１）と一緒にＴＡＬＥＮ（ＬｕＥＴ−１）をプロトプラストに送達すると、導入の７日後に、両遺伝子座で０．１９％の遺伝子編集頻度および０．５％のインデル頻度が観察された（図１８ｃ、図１８ｄ）。大部分のインデルは１０ｂｐまたはそれ以下であった（図１８ｃ）。これらの結果は、Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍプロトプラスト中へのＣｙ３修飾ＧＲＯＮを含むＴＡＬＥＮの導入は、ＥＰＳＰＳ遺伝子編集の頻度を有意に増大させ、さらに、複数のヌクレオチド編集を単一のＧＲＯＮを用いて実現することができることを示している。

変換に対するブレオマイシンファミリーの抗生物質の２つのメンバーの効果
この一連の実施例の目的は、変換効率に対する抗生物質の効果を評価することであった。

方法
複数コピーの青色蛍光タンパク質遺伝子を有するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ系統に由来するプロトプラストを、以下の修飾：ＧＲＯＮの付加の前に、プロトプラストを、０．２５０、または１０００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｏｎ（商標）またはフレオマイシンを添加した、ＴＭ（１４．８ｍＭＭｇＣｌ₂×６Ｈ₂Ｏ、５ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、５７２ｍＭマンニトール）の溶液中、氷上で９０分間保持しながら、実施例１に記載のようにＧＲＯＮで処理した。溶液のｐＨを、７．０に調整した。ＢＦＰからＧＦＰへの変換をもたらす緑色蛍光を発する細胞の割合を、実施例１に記載のフローサイトメトリーによって評価した。

結果
使用した両濃度（２５０および１０００μｇ／ｍｌ）で、Ｚｅｏｃｉｎおよびフレオマイシンは、ＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集の増加をもたらした（図１９を参照）。ＢＦＰからＧＦＰへの遺伝子編集をもたらす緑色蛍光を発する細胞が、ＧＲＯＮ送達の５日後に観察された（図２０）。

参考文献
１．ＬｅＣｏｎｇｅｔａｌ２０１３Ｓｃｉｅｎｃｅ：ｖｏｌ．３３９ｎｏ．６１２１ｐｐ．８１９−８２３
２．Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ２０１２Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６−２１
３．Ｗａｎｇｅｔａｌ２００８ＲＮＡ１４：９０３−９１３
４．Ｚｈａｎｇｅｔａｌ２０１３ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１６１：２０−２７

イネにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ
この実験の目的は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮのプロトプラスト中へのＰＥＧ送達後１２０時間でのＯｒｙｚａｓａｔｉｖａにおけるＡＣＣａｓｅ変換を証明することである。この実験で使用したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、プロトプラスト中に、Ｃａｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを導入することによって、イネゲノム中のａｃｃａｓｅ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこで、Ｃａｓ９はａｃｃａｓｅ遺伝子中に二本鎖切断を作出し、ＧＲＯＮは部位特異的様式でａｃｃａｓｅ遺伝子を変換するための鋳型として使用される。

方法
イネのプロトプラストを、カルスから単離した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するコーンユビキチンプロモーターおよびポリ−Ｔ₁₀ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するイネＵ６プロモーターを含有する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドを、０．０５μｇ／μｌの最終濃度でＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。以下の配列、５’ＶＣＴＧＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＣＴＣＡＡＴＧＣＧＧＴＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＣＴＴＧＣＴＴＣＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＧＴＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＴＣＣＴＡＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＴＡＧＴＣＧＡＧＣＣＨ３’を有するＧＲＯＮを、０．８μＭの最終濃度で使用した。プロトプラストをアガロース（２．５×１０⁶細胞／ｍｌ）中に埋め込み、液体培地中で培養し、回転式振盪器（６０ｒｐｍ）中、暗室中、２８℃でインキュベートした。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドおよび／またはＧＲＯＮ送達の１２０時間後、個々のサンプルをＮＧＳによって分析して、ＡＣＣａｓｅ変換を担持し、ａｃｃａｓｅ遺伝子中にインデルを有する細胞（ＤＮＡリード）の割合を決定した。

ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列（５’−ＡＣＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧ−３）を含有する。本実験では、ＣＲＩＳＰＲはａｃｃａｓｅ遺伝子を標的とする。

結果
１２０時間で、イネのプロトプラストは、次世代配列決定により決定された場合、０．０２６％のＡＣＣａｓｅ変換を有する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを含まないＧＲＯＮのみの対照は、１２０時間で０．００２％の最小Ａｃｃａｓｅ変換を示し、未処理の対照は変換を示さなかった。さらに、これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓが活性であり、ＡＣＣａｓｅ標的遺伝子を切断し、８．０％のインデルを形成することができることを示す。

参考文献
５．ＬｅＣｏｎｇｅｔａｌ２０１３Ｓｃｉｅｎｃｅ：ｖｏｌ．３３９ｎｏ．６１２１ｐｐ．８１９−８２３
６．Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ２０１２Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６−２１
７．Ｗａｎｇｅｔａｌ２００８ＲＮＡ１４：９０３−９１３
８．Ｚｈａｎｇｅｔａｌ２０１３ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１６１：２０−２７

イネにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ
概要：標的ＡＣＣａｓｅ突然変異を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定分析によって１９週齢のカルスにおいて同定した。

はじめに
本実験の目的は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮのプロトプラスト中へのＰＥＧ送達後のＯｒｙｚａｓａｔｉｖａカルスにおけるＡＣＣａｓｅ変換を証明することである。この実験で使用したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、プロトプラスト中に、Ｃａｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを導入することによって、イネゲノム中のＡＣＣａｓｅ遺伝子を標的とする。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこで、Ｃａｓ９はＡＣＣａｓｅ遺伝子中の標的位置に二本鎖切断またはニックを作出し、ＧＲＯＮは部位特異的様式でＡＣＣａｓｅ遺伝子を変換するための鋳型として使用される。

結果
以下の表に記載される標的ＯｓＡＣＣａｓｅ突然変異を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定分析によって１９週齢のカルスにおいて同定した。

方法
イネのプロトプラストを、成熟種子由来胚発生カルスから開始された懸濁培養物から単離した。それぞれ、０．０５μｇ／μｌおよび０．８μＭの最終濃度のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮを、ＰＥＧ仲介性送達法によってプロトプラスト中に導入した。最終濃度のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドに関する例示的範囲は、０．０１〜０．２μｇ／μｌに限られないが、それを含む。最終濃度のＧＲＯＮに関する例示的範囲は、０．０１〜４μＭに限られないが、それを含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するコーンユビキチンプロモーターおよびポリ−Ｔ₁₀ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するイネＵ６プロモーターを含有する。ＧＲＯＮの配列情報は、表３に記載されている。ＰＥＧ処理の後、プロトプラストをアガロース（１．２５×１０⁶細胞／ｍｌ）中に埋め込み、液体培地中で培養し、回転式振盪器（６０ｒｐｍ）中、暗室中、２８℃でインキュベートした。アガロース中にプロトプラストを埋め込むための例示的範囲は、０．６２５×１０⁶〜２．５×１０⁶細胞／ｍｌに限られないが、それを含む。各処理からのサンプルを、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドおよび／またはＧＲＯＮ処理の４週間後に次世代配列決定により分析して、ＡＣＣａｓｅ変換を担持する細胞（ＤＮＡリード）の割合を決定した。変換された処理に由来する微小カルスを、クレトジム（０．２５〜０．５μＭ）またはセトキシジム（２．５μＭ）を含有する固体選択培地上で遊離させた。培養の１９週間後にこの選択培地上で増殖する個々のカルス系統を、社内スクリーニング法ならびにＤＮＡ配列決定によって分析して、標的ＡＣＣａｓｅ変換を含有する個々のカルスを同定した。

ＣＲＩＳＰＲは２つの構成要素：両方ともプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）などのＣａｓ９と、ｓｇＲＮＡとからなる。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを、それぞれ、ｍＲＮＡ／ＲＮＡまたはタンパク質／ＲＮＡによって送達することもできる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられる、表２に記載された配列を有するスペーサーを含有する。本実験では、ＣＲＩＳＰＲはイネＡＣＣａｓｅ遺伝子を標的とする。

遺伝子内の２つの異なる位置、部位１および部位２でのＯｓＡＣＣａｓｅにおける変換の一覧。それぞれの部位について、変換事象の全ての組合せが可能である。

本実験で使用されたＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓｇＲＮＡスペーサー配列の一覧。スペーサーの長さは、最大で±２０ｂｐ変化してもよい。スペーサー配列内のミスマッチは、１０ｂｐまで許容され得る。

本実験における使用にとって好適なＧＲＯＮ配列の一覧を、以下の表に提供する（Ｖ＝ＣＹ３；Ｈ＝３’ＤＭＴｄＣＣＰＧ）。

アマにおけるＣＲＩＳＰＲおよびＧＲＯＮ
概要：標的ＬｕＥＰＳＰＳ突然変異を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定分析によって４週齢のカルスにおいて同定した。

はじめに
本実験の目的は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮのＰＥＧ仲介性送達による茎頂由来プロトプラストにおけるＬｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍゲノム中のＥＰＳＰＳ遺伝子の変換を証明することである。この実験で使用されたＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓおよびＧＲＯＮは、アマゲノム中のＥＰＳＰＳ遺伝子を標的とする。ＣＲＩＳＰＲは、２つの構成要素：両方ともプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）などのＣａｓ９と、ｓｇＲＮＡとからなる。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを、それぞれ、ｍＲＮＡ／ＲＮＡまたはタンパク質／ＲＮＡによって送達することもできる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を標的遺伝子に誘導し、そこで、Ｃａｓ９はＥＰＳＰＳ遺伝子中に二本鎖切断またはニックを作出し、ＧＲＯＮは部位特異的様式でＥＰＳＰＳ遺伝子を変換するための鋳型として使用される。

結果
標的ＬｕＥＰＳＰＳ（Ｔ９７Ｉおよび／またはＰ１０１Ａ、Ｐ１０１ＴもしくはＰ１０１Ｓおよび／またはＧ９６Ａ）突然変異を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定分析によって４週齢のカルスにおいて同定した。新芽を、これらの変換されたカルスから再生させた。

方法
アマのプロトプラストを、ｉｎｖｉｔｒｏで発芽させた苗から得られた茎頂から単離した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓをコードしたプラスミドは、ｒｂｃＳＥ９ターミネーターと共にＣａｓ９コード配列を駆動するＭＡＳプロモーターおよびポリ−Ｔ₁₀ターミネーターと共にｓｇＲＮＡを駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＵ６プロモーターを含有する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドを、０．０５μｇ／μｌの最終濃度でＰＥＧ仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。２つのアマＬｕＥＰＳＰＳ遺伝子（表２）のそれぞれを標的とするＧＲＯＮを、４．０μＭの最終濃度で使用した。最終濃度のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドの例示的範囲は、０．０１〜０．２μｇ／μｌに限られないが、これを含む。最終濃度のＧＲＯＮの例示的範囲は、０．０１〜４μＭに限られないが、これを含む。プロトプラストをアルギン酸ビーズ（５×１０⁵細胞／ｍｌ）中に埋め込み、液体培地中で培養し、回転式振盪器（３０ｒｐｍ）中、暗室中、２５℃でインキュベートした。アルギン酸ビーズ中にプロトプラストを埋め込むための例示的範囲は、３．０×１０⁵〜７．５×１０⁵細胞／ｍｌに限られないが、これを含む。個々の細胞から発生した微小カルスを、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓプラスミドおよびＧＲＯＮ送達の３および７週間後に、次世代配列決定により分析して、ＬｕＥＰＳＰＳ遺伝子中に標的突然変異を担持する細胞（ＤＮＡリード）の割合を決定した。より大きいカルスを、固体再生培地上に播種された８週齢の変換された微小カルスから増殖させたところ、新芽が約４〜８週間後に再生されたカルスから分化を開始した。標的ＥＰＳＰＳ遺伝子突然変異を有する変換されたカルスおよび新芽を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定分析によって同定した。

ＣＲＩＳＰＲは、２つの構成要素：両方ともプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）と、ｓｇＲＮＡとからなる。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との融合物である。ｃｒＲＮＡ領域は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＥＰＳＰＳ標的遺伝子に誘導するために使用された、以下の表に記載される配列を有するスペーサーを含有する。

本実験で使用されたＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓｇＲＮＡスペーサー配列の一覧。スペーサーの長さは最大±２０ｂｐで変化してもよい。スペーサー配列内のミスマッチは、１０ｂｐまで許容され得る。

当業者は、本開示が目的を実行し、言及する目的および利点、ならびに本開示に固有の目的および利点を得るのに十分適応していることを容易に理解する。本明細書で提供する例は好ましい実施形態の代表的なものであり、例示的であり、本開示の範囲を制限するものとして考えない。

本明細書で開示している本開示に対する様々な置換および修正を、本開示の範囲および精神から逸脱せずに施すことができることは、当業者には容易に明らかとなる。

本明細書で適切に例示的に記載した本開示は、本明細書で具体的に開示していない如何なる１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制約の不在下でも実施することができる。したがって、例えば本明細書中でのそれぞれの場合において、用語「含む」、「から本質的になる」および「からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれかと交換することができる。利用している用語および表現は、制約ではなく記載のための用語として使用し、このような用語および表現の使用において、示し記載する特徴の任意の均等物、またはそれらの一部分の排除を意図するものではないが、特許請求する本開示の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、好ましい実施形態および任意選択の特徴によって本開示を具体的に開示してきたが、本明細書で開示している概念の修正および変更は当業者に委ねることができ、このような修正および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義する本開示の範囲内にあると考えられることが理解されるはずである。

したがって、好ましい実施形態および任意選択の特徴によって本開示を具体的に開示してきたが、開示された本開示の修正、改善、および変更は当業者に委ねることができ、このような修正、改善および変更は、本開示の範囲内にあると考えられることが理解されるはずである。本明細書で提供する材料、方法、および例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的なものであり、本開示の範囲に対する限定と意図されるものではない。

本開示を、本明細書に広く、一般的に説明してきた。一般的な開示の範囲内にあるより狭い種および亜属群もそれぞれ、本開示の一部を形成する。これは、切り出された材料が具体的に本明細書に記載されるか否かに関係なく、属に由来する任意の主題を除去するという条件で、または負の限定で、本開示の一般的記載を含む。

さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群を単位として記載される場合、当業者であれば、本開示もまたそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群を単位として記載されることを認識できる。

本明細書で記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、あたかもそれぞれが個別に参照により組み込まれるのと同程度に、その全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御する。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内で記載される。

Claims

植物細胞において１つまたは複数の標的遺伝子変化を引き起こす方法であって、
植物細胞ゲノム中に一本鎖切断または二本鎖切断を導入するＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼと、植物細胞ゲノム中の内在性標的遺伝子内への前記１つまたは複数の標的遺伝子変化の導入を仲介するよう構成された遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）との前記植物細胞への送達を含み、
前記ＧＲＯＮが、
蛍光色素および逆向き塩基からなる群より選択される１つまたは複数の３’ブロッキング置換基、および、
蛍光色素より選択される１つまたは複数の５’ブロッキング置換基、を含み、
前記植物細胞が、前記標的遺伝子変化に関して非トランスジェニックである、
方法。
前記１つまたは複数の標的遺伝子変化が、ＧＲＯＮを前記内在性標的遺伝子内に取り込ませることなく、植物細胞ゲノム中の前記内在性標的遺伝子内に導入される、請求項１記載の方法。
前記植物細胞が、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、ソラマメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、キャッサバ、およびユリからなる群から選択される植物由来である、請求項１又は２に記載の方法。
植物細胞ゲノム中に複数の標的遺伝子変化を生じる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
２つ以上のガイドＲＮＡを使用する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
１より多いガイドＲＮＡのそれぞれが、遺伝子変化のための異なる標的と相補的である、請求項５記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがニッカーゼとして機能する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
ニッカーゼであるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの２つ以上の使用を含み、
前記２つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが標的核酸配列の反対の鎖上の切断を誘導するか、あるいは
前記２つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが標的核酸配列の同じ鎖上の切断を誘導する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ)配列が、植物細胞ゲノム中に存在する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ)配列が、前記植物細胞の内在性遺伝子である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
前記植物細胞から植物を再生するステップをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
前記植物から種子を回収するステップをさらに含む、請求項１１記載の方法。