JP6777549B2 - オリゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復を使用した標的遺伝子修飾の効率を高めるための方法および組成物 - Google Patents

オリゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復を使用した標的遺伝子修飾の効率を高めるための方法および組成物 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ、全ての表、図面および特許請求の範囲を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれている、2014年3月14日に出願された米国仮特許出願第61/953,333号;2014年9月17日に出願された米国仮特許出願第62/051,579号;2014年11月5日に出願された米国仮特許出願第62/075,811号;2014年11月5日に出願された米国仮特許出願第62/075,816号;および2015年3月13日に出願された米国仮特許出願第62/133,129号の利益を主張するものである。
本開示は、少なくとも部分的には、標的遺伝子突然変異および修飾に関し、そのような突然変異および修飾を作製するための方法および組成物を含む。
以下の考察は、本開示を理解する際に読者を手助けするために単に提供するものであり、本開示以前の従来技術を記載または構成することを認めるものではない。
米国特許第6,271,360号は、所定の変化をコードするオリゴデオキシヌクレオチドを導入することによる、生細胞の標的遺伝子中での所定の遺伝子変化の導入のための方法および組成物を開示する。オリゴデオキシヌクレオチドは、哺乳動物、鳥類、植物および細菌細胞中で有効である。
米国特許第8,771,945号は、その一部がCRISPR複合体の1つまたは複数の構成要素をコードする、ベクターおよびベクター系、ならびにそのようなベクターの設計および使用のための方法を開示する。
米国特許第8,470,973号は、ポリペプチドによりDNA配列中の塩基対を選択的に認識するための方法、DNA配列中の1つまたは複数の塩基対を特異的に認識する修飾ポリペプチド、およびポリペプチドが特異的に認識できるように修飾されたDNAおよび特異的DNA標的化におけるポリペプチドおよびDNAの使用、ならびに細胞中での標的遺伝子の発現を調節する方法に言及する。
本明細書では、細胞においてDNAの標的遺伝子変化を行うための方法および組成物が提供される。特定の態様および実施形態は、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列中の特定位置に対する、修飾の標的化の効率を改善することに関する。本明細書で記載するように、ゲノムに対して特異的変化を誘導する核酸を様々な手法と組み合わせて、修飾の標的である細胞中に存在する天然修復系の構成要素の利用性を高めることができる。
第1の態様において、植物細胞中の標的デオキシリボ核酸(DNA)配列に遺伝子修復オリゴ核酸塩基(GRON)仲介型突然変異を導入するための方法が提供される。特定の実施形態では、これらの方法は特に、植物細胞へのGRONの送達、および/または15塩基長より大きく標的DNAに導入するための1つもしくは複数、または2つ以上の突然変異部位を場合によっては含むGRONの植物細胞への送達の前に、および/またはそれと同時に1つまたは複数の細胞DNA修復プロセスを増大させる条件下で植物細胞を培養するステップを含む。
本明細書で使用する「遺伝子修復オリゴヌクレオチド」または「GRON」は、特定の条件下で、DNA配列中で単一の、または幾つかの実施形態では、複数のヌクレオチド欠失、挿入または置換を誘導することができるオリゴ核酸塩基(例えば、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド、非ヌクレオチド含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドおよび他の遺伝子修復分子)を意味する。ゲノムのこのオリゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復編集は、非相同性に基づく修復系(例えば、非相同末端結合)と、相同性に基づく修復系(例えば、相同性特異的修復)の両方を含んでもよい。GRONは、典型的には、指定のミスマッチを除いてゲノム標的と一致して整列するように設計される。これらのミスマッチを、1つまたは複数の細胞の内因性DNA修復系を利用することにより認識および補正することができる。幾つかの実施形態では、GRONまたはオリゴヌクレオチドを、生物標的配列と比較したときに複数の差異を含有するように設計することができる。これらの差異は、前記標的配列から翻訳されるタンパク質配列に全く影響しなくてもよく、1つまたは複数の事例では、サイレントな変化として知られる。GRONの構造、化学および機能の多数の変異は、本明細書の他の場所に記載される。様々な実施形態において、本明細書で使用するGRONは、1つまたは複数の修飾を有してもよい。例えば、本明細書で使用するGRONは、標的(ミスマッチ)部位にDNA修復機構を誘引する、および/または標的DNA配列のゲノムDNA中へのGRONの一部もしくは全部(所望の標的欠失、挿入、置換など以外)の組換えを防止する、および/またはGRONの安定性を増大させる1つまたは複数の修飾を有してもよい。
様々な実施形態において、GRONは、RNAとDNAの両方のヌクレオチドおよび/または他の型の核酸塩基を有してもよい。幾つかの実施形態では、1つまたは複数のDNAまたはRNAヌクレオチドは、修飾を含む。
一態様においては、植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、細胞をDNA切断剤およびGRONに、例えば、本明細書で企図されるように修飾されたGRONに曝露するステップを含む方法が提供される。幾つかの実施形態においては、GRONは、Cy3基、3PS基、2’O−メチル基または本明細書で企図される他の修飾などで修飾することができる。別の態様では、DNA切断剤と、例えば、Cy3基、3PS基、2’O−メチル基または他の修飾などで修飾されたGRONとを含む植物細胞が提供される。幾つかの実施形態においては、DNA切断剤は、CRISPR、TALEN、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、およびDNA切断性抗生物質から選択される1つまたは複数のものである。幾つかの実施形態では、DNA切断剤は、CRISPRである。幾つかの実施形態では、DNA切断剤は、TALENである。幾つかの実施形態では、GRONは、15〜60核酸塩基長;または30〜40核酸塩基長;または35〜45核酸塩基長;または20〜70核酸塩基長;または20〜200核酸塩基長;または30〜180核酸塩基長;または50〜160核酸塩基長;または70〜150核酸塩基長;または70〜210核酸塩基長;または80〜120核酸塩基長;または90〜110核酸塩基長;または95〜105核酸塩基長;または80〜300核酸塩基長;または90〜250核酸塩基長;または100〜150核酸塩基長;または100〜200核酸塩基長;または100〜210核酸塩基長;または100〜300核酸塩基長;または150〜200核酸塩基長;または200〜300核酸塩基長;または250〜350核酸塩基長;または50〜110核酸塩基長;または50〜200核酸塩基長;または150〜210核酸塩基長;または20〜1000核酸塩基長;または100〜1000核酸塩基長;または200〜1000核酸塩基長;または300〜1000核酸塩基長;または400〜1000核酸塩基長;または500〜1000核酸塩基長;または600〜1000核酸塩基長;または700〜1000核酸塩基長;または800〜1000核酸塩基長;または900〜1000核酸塩基長;または300〜800核酸塩基長;または400〜600核酸塩基長;または500〜700核酸塩基長;または600〜800核酸塩基長;または30より長い核酸塩基長;または35より長い核酸塩基長;または40より長い核酸塩基長;または50より長い核酸塩基長;または60より長い核酸塩基長;または65より長い核酸塩基長;または70より長い核酸塩基長;または75より長い核酸塩基長;または80より長い核酸塩基長;または85より長い核酸塩基長;または90より長い核酸塩基長;または95より長い核酸塩基長;または100より長い核酸塩基長;または110より長い核酸塩基長;または125より長い核酸塩基長;または150より長い核酸塩基長;または165より長い核酸塩基長;または175より長い核酸塩基長;または200より長い核酸塩基長;または250より長い核酸塩基長;または300より長い核酸塩基長;または350より長い核酸塩基長;または400より長い核酸塩基長;または450より長い核酸塩基長;または500より長い核酸塩基長;または550より長い核酸塩基長;または600より長い核酸塩基長;または700より長い核酸塩基長;または800より長い核酸塩基長;または900より長い核酸塩基長である。
GRONを、標的遺伝子の非コード(NC)領域とコード(C)領域の両方において標的化することができる。例えば、図27および図28はそれぞれ、ACCase遺伝子に下記アミノ酸置換のうちの1つまたは複数を導入するためにイネゲノム中に突然変異を導入するのに好適なC−GRONおよびNC−GRONを記載する。慣例は、参照としてノスズメノテッポウ(Alopecurus myosuroides;Am)に由来するプラスチドACCaseのためのアミノ酸番号付けシステムを使用することである。本明細書で使用するACCase番号付けは、ノスズメノテッポウ参照配列ACCaseタンパク質(配列番号1)に関する番号付けまたはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基(V=CY3;H=3’DMT dC CPG)に基づく。以下の表は、アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−P、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップ−P、ハロキシホップ、ハロキシホップ−P、イソキサピリホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ−P、トリホップ、ピノキサデン、これらの除草剤のいずれかの農学的に許容される塩およびエステル、ならびにその組合せの抵抗性表現型のうちの1つまたは複数をもたらすACCase突然変異を列挙するものである。
同様に、図29および図30はそれぞれ、EPSPS遺伝子に下記アミノ酸置換のうちの1つまたは複数を導入するためにアマゲノム中に突然変異を導入するのに好適な(コード)C−GRONおよび(非コード)NC−GRONを記載する(全ての番号付けは大腸菌(E.coli)AroAタンパク質(原核EPSPS等価物)のアミノ酸配列と比較したものである)(米国特許第8,268,622号に記載のものなど)。(V=CY3;H=3’DMT dC CPG)。以下の表は、グリホサート、これらの除草剤のいずれかの農学的に許容される塩およびエステル、ならびにその組合せの抵抗性表現型をもたらすEPSPS突然変異を列挙するものである。
本明細書で使用する用語「CRISPR」とは、例えば、Cong,L.et al.,Science,vol.339 no6121 pp.819−823(2013);Jinek et al,Science,vol.337:816−821(2013);Wang et al.,RNA,vol.14,pp.903−913(2008);Zhang et al.,Plant Physiology,vol.161,pp.20−27(2013),Zhang et al,PCT出願第PCT/US2013/074743号;およびCharpentier et al.,PCT出願第PCT/US2013/032589号に記載されたものなどの、細胞中で効率的に存在する、または発現される場合、CRISPR/CAS細胞機構を介する標的DNA配列の切断を行うことができるエレメント、すなわち、cas(CRISPR関連)遺伝子、転写物(例えば、mRNA)またはタンパク質および少なくとも1つのCRISPRスペーサー配列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats、SPIDR−SPacer Interspersed Direct Repeatsとしても知られる)を指す。幾つかの実施形態においては、例えば、真核細胞中での使用のためのCRISPR、本明細書で企図されるCRISPRなどは、1つまたは複数の機能的な核局在化シグナルのための配列を含むさらなるエレメントを含んでもよい。本明細書で企図されるCRISPRを、任意の多くの方法または発現で、細胞中で発現させる、細胞に投与する、および/または細胞中に存在させることができる。例えば、本明細書で企図されるCRISPRは、以下のような、プラスミド上の1つもしくは複数のCRISPR、プラスミド上のCRISPRニッカーゼ、プラスミド上のCRISPRa、またはプラスミド上のCRISPRiを含んでもよい。
プラスミド上のCRISPR:
(i)DNA標的化RNA(例えば、ガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列であって、DNA標的化RNAが、
a.標的DNA中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第1のセグメント(例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはcrRNA);および
b.部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第2のセグメント(例えば、トランス活性化crRNAまたはtracrRNA)
を含む、ヌクレオチド配列;ならびに
(ii)部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、cas遺伝子)であって、部位特異的ポリペプチドが、
a.DNA標的化RNAと相互作用するRNA結合部分(例えば、RECローブ);および
b.標的DNA内の二本鎖切断の部位がDNA標的化RNAにより決定される、標的DNA内で二本鎖切断を引き起こす活性部分(例えば、NUCローブ)
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のCRISPRニッカーゼ。
(i)DNA標的化RNA(例えば、ガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列であって、DNA標的化RNAが、
a.標的DNA中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第1のセグメント(例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはcrRNA);および
b.部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第2のセグメント(例えば、トランス活性化crRNAまたはtracrRNA)
を含む、ヌクレオチド配列;ならびに
(ii)部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、cas遺伝子)であって、部位特異的ポリペプチドが、
a.DNA標的化RNAと相互作用するRNA結合部分(例えば、RECローブ);および
b.標的DNA内の一本鎖切断の部位がDNA標的化RNAにより決定される、標的DNA内で一本鎖切断を引き起こす活性部分(例えば、NUCローブ)
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のCRISPRa。
(i)DNA標的化RNA(例えば、ガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列であって、DNA標的化RNAが、
a.標的DNA中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第1のセグメント(例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはcrRNA);および
b.部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第2のセグメント(例えば、トランス活性化crRNAまたはtracrRNA)
を含む、ヌクレオチド配列;ならびに
(ii)部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、cas遺伝子)であって、部位特異的ポリペプチドが、
a.DNA標的化RNAと相互作用するRNA結合部分(例えば、RECローブ);および
b.標的DNA内の転写調節部位がDNA標的化RNAにより決定される、標的DNA内での転写を調節する活性部分(例えば、NUCローブ;特定の実施形態では、転写を増大させる)
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のCRISPRi。
(i)DNA標的化RNA(例えば、ガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列であって、DNA標的化RNAが、
a.標的DNA中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第1のセグメント(例えば、プロトスペーサー、スペーサー、またはcrRNA);および
b.部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第2のセグメント(例えば、トランス活性化crRNAまたはtracrRNA)
を含む、ヌクレオチド配列;ならびに
(ii)部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、cas遺伝子)であって、部位特異的ポリペプチドが、
a.DNA標的化RNAと相互作用するRNA結合部分(例えば、RECローブ);および
b.標的DNA内の転写/翻訳調節部位がDNA標的化RNAにより決定される、標的DNA内での転写/翻訳を調節する活性部分(例えば、NUCローブ;幾つかの実施形態では、転写/翻訳を減少させる)
を含む、ヌクレオチド配列
を含む組換え発現ベクター。
プラスミド上のCRISPR、プラスミド上のCRISPRニッカーゼ、プラスミド上のCRISPRa、およびプラスミド上のCRISPRiのそれぞれは、あるいは、幾つかの実施形態では、プラスミド上よりもむしろRNA(例えば、mRNA)またはタンパク質として細胞中に投与される、発現される、または存在する1つまたは複数の適切なエレメントを有してもよい。保護されたmRNAの送達は、Kariko,et al.の米国特許第8,278,036号に記載の通りであってもよい。
幾つかの実施形態においては、CRISPRiおよびCRISPRaのそれぞれは、脱活性化されたcas9(dCas9)を含んでもよい。脱活性化されたcas9は、標的DNAに依然として結合するが、切断活性は有さない。ヌクレアーゼ欠損Cas9は、その2つの触媒ドメインを不活化するD10AおよびH840A点突然変異から生じ得る。
幾つかの実施形態では、CRISPRiは、RNAポリメラーゼIIの立体障害を介して転写開始または伸長を阻害する。CRISPRiは、場合により、dCas9タンパク質のC末端への強力なリプレッサードメインの融合により増強することができる(CRISPRei)。幾つかの実施形態では、リプレッサードメインは、クロマチン修飾因子を動員および使用する。幾つかの実施形態では、リプレッサードメインは、Kagale,S.et al.,Epigenetics,vol.6 no2 pp141−146(2011)に記載のドメイン:
1.LDLNRPPPVEN−OsERF3リプレッサードメイン(LxLxPPモチーフ)
2.LRLFGVNM−AtBRDリプレッサードメイン(R/KLFGVモチーフ)
3.LKLFGVWL−AtHsfB1リプレッサードメイン(R/KLFGVモチーフ)
4.LDLELRLGFA−AtSUPリプレッサードメイン(EARモチーフ)
5.ERSNSIELRNSFYGRARTSPWSYGDYDNCQQDHDYLLGFSWPPRSYTCSFCKREFRSAQALGGHMNVHRRDRARLRLQQSPSSSSTPSPPYPNPNYSYSTMANSPPPHHSPLTLFPTLSPPSSPRYRAGLIRSLSPKSKHTPENACKTKKSSLLVEAGEATRFTSKDACKILRNDEIISLELEIGLINESEQDLDLELRLGFA*−リプレッサードメインを含有する完全なAtSUP遺伝子(EARモチーフ)
だけに限られないが、これらを含む。
幾つかの実施形態では、転写のCRISPRa活性化は、融合したC末端転写アクチベーターを含有するdCas9タンパク質の使用により達成される。幾つかの実施形態では、活性化は、Cheng,AW et al.,Cell Research,pp1−9(2013);Perez−Pinera,P.et al.,Nature Methods,vol.10 pp913−976(2013);Maeder,ML.et al.,Nature Methods,vol.10 pp977−979(2013)およびMali,P.,et al.,Nature Biotech.,vol.31 pp833−838(2013)に記載のような、VP64(4X VP16)、AtERF98活性化ドメイン、またはAtERF98x4コンカテマーだけに限られないが、これらを含んでもよい。
幾つかの実施形態では、CRISPRは、ニッカーゼを含む。特定の実施形態では、2つ以上のCRISPRニッカーゼが使用される。幾つかの実施形態では、2つ以上のニッカーゼは、標的核酸の反対の鎖上を切断する。他の実施形態では、2つ以上のニッカーゼは、標的核酸の同じ鎖上を切断する。
本明細書で使用する「リプレッサータンパク質」または「リプレッサー」とは、それぞれ、転写または翻訳を防止するためにDNAのオペレーターまたはRNAに結合するタンパク質を指す。
本明細書で使用する「抑制」とは、DNAまたはmRNA上の特定部位へのリプレッサータンパク質の結合による転写または翻訳の阻害を指す。幾つかの実施形態では、抑制は、転写または翻訳レベルの少なくとも1.5倍、他の実施形態では、少なくとも2倍、他の実施形態では、少なくとも5倍の有意な変化を含む。
遺伝子の転写および/または翻訳に関して本明細書で使用する「アクチベータータンパク質」または「アクチベーター」は、DNAのオペレーターまたはRNAに結合して、それぞれ、転写または翻訳を増強または増大させるタンパク質を指す。
遺伝子転写および/または翻訳に関して本明細書で使用する、遺伝子転写および/または翻訳に関する「活性化」とは、DNAまたはmRNA上の特定部位へのアクチベータータンパク質の結合により転写または翻訳を増強または増大させることを指す。幾つかの実施形態では、活性化は、転写または翻訳レベルの少なくとも1.5倍、幾つかの実施形態では、少なくとも2倍、幾つかの実施形態では、少なくとも5倍の有意な変化を含む。
特定の実施形態では、1つまたは複数の細胞DNA修復プロセスを増大させる条件は、GRONまたは塩基除去修復の標的である植物細胞DNAへの1つまたは複数の部位の導入、GRONまたは非相同末端結合の標的である植物細胞DNAへの1つまたは複数の部位の導入、GRONまたはマイクロホモロジー仲介型末端結合の標的である植物細胞DNAへの1つまたは複数の部位の導入、GRONまたは相同組換えの標的である植物細胞DNAへの1つまたは複数の部位の導入、およびGRONまたは修復を行うための標的である植物細胞DNAへの1つまたは複数の部位の導入の1つまたは複数を含み得る(例えば、塩基除去修復(BER);相同組換え修復(HR);ミスマッチ修復(MMR);古典的および代替的NHEJを含む非相同末端結合修復(NHEJ);およびヌクレオチド除去修復(NER))。
本明細書で記載するように、本明細書で使用するためのGRONは、従来型RNAおよびDNAヌクレオチドからの以下の改変:
1つまたは複数の無塩基部位ヌクレオチド、
1つまたは複数の8’オキソdAおよび/または8’オキソdGヌクレオチド、
その3’末端における逆向き塩基、
1つまたは複数の2’O−メチルヌクレオチド、
1つまたは複数のRNAヌクレオチド、
1つまたは複数のRNAヌクレオチドをさらに修飾することができる、その5’末端における1つまたは複数、および幾つかの実施形態では、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれより多くのRNAヌクレオチド、1つまたは複数のRNAヌクレオチドをさらに修飾することができる、その3’末端における1つまたは複数、および幾つかの実施形態では、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれより多くのRNAヌクレオチド、
その5’末端における1つまたは複数、および幾つかの実施形態では、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれより多くの2’O−メチルRNAヌクレオチド、
挿入色素、
5’末端キャップ、
ホスホチオエート修飾、メチルホスホネート修飾、ロックド核酸(LNA)修飾、O−(2−メトキシエチル)(MOE)修飾、ジPS修飾、およびペプチド核酸(PNA)修飾からなる群から選択される骨格修飾、
1つまたは複数の鎖間架橋、
それに、および幾つかの実施形態では、GRONの5’または3’末端に共有結合した1つまたは複数の蛍光色素、ならびに
ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる1つまたは複数の塩基
のうちの1つまたは複数を含んでもよい。この一覧は限定的であることを意味しない。
本明細書で使用する用語「ゆらぎ塩基」とは、変化が参照配列と比較してヌクレオチドによりコードされるアミノ酸の配列を変化させない、参照ヌクレオチド配列の1つまたは複数のヌクレオチド塩基中の変化を指す。
本明細書で使用する用語「非ヌクレオチド」または「無塩基部位ヌクレオチド」とは、糖および/またはリン酸置換のいずれかを含む、1つまたは複数のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖中に組み込むことができ、残りの塩基にその酵素活性を示させる任意の基または化合物を指す。基または化合物は、それがアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなどの、一般的に認識されるヌクレオチド塩基を含有しない点で無塩基性である。それは、当業界で、および本明細書で記載されるような2’または3’HまたはOHへの置換を有してもよい。
本明細書で記載するように、特定の実施形態において、GRONの質および変換効率は、ヌクレオチド多量体、例えば、二量体、三量体、四量体などを使用してGRONの全体または一部分を合成することにより、その純度を改善することにより改善することができる。
特定の実施形態では、標的デオキシリボ核酸(DNA)配列は、植物細胞内に存在する、例えば、標的DNA配列は、植物細胞ゲノム内に存在する。植物細胞は非トランスジェニックまたはトランスジェニックであってよく、標的DNA配列は植物細胞の導入遺伝子または内在性遺伝子であってよい。
特定の実施形態では、1つまたは複数の細胞DNA修復プロセスを増大させる条件は、植物細胞へのGRONの送達の前に、またはそれと同時に、またはその後に植物細胞への一本鎖または二本鎖DNA切断を誘導する1つまたは複数の化合物の導入を含む。例示的な化合物は本明細書に記載される。
本明細書で記載する方法および組成物は、一般に植物に適用可能である。例えば、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ(Triticum種、Triticum aestivum、Triticum durum、Triticum timopheevii、Triticum monococcum、Triticum spelta、Triticum zhukovskyiおよびTriticum urartuならびにそのハイブリッドだけに限られないが、これらを含む)、オオムギ(Hordeum vulgare L.、Hordeum comosum、Hordeum depressum、Hordeum intercedens、Hordeum jubatum、Hordeum marinum、Hordeum marinum、Hordeum parodii、Hordeum pusillum、Hordeum secalinum、およびHordeum spontaneumだけに限られないが、これらを含む)、イネ(Oryza sativa亜種indica、Oryza sativa亜種japonica、Oryza sativa亜種javanica、Oryza sativa亜種glutinosa(もち米)、Oryza sativa Aromatica群(例えば、バスマティ)、およびOryza sativa(浮稲群)だけに限られないが、これらを含む)、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、ソラマメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ(Secale sylvestre、Secale strictum、Secale cereale、Secale vavilovii、Secale africanum、Secale ciliatoglume、Secale ancestrale、およびSecale montanumだけに限られないが、これらを含む)、オートムギ、芝生(Zoysia japonica、Agrostris palustris、Poa pratensis、Poa annua、Digitaria sanguinalis、Cyperus rotundus、Kyllinga brevifolia、Cyperus amuricus、Erigeron canadensis、Hydrocotyle sibthorpioides、Kummerowia striata、Euphorbia humifusa、およびViola arvensisだけに限られないが、これらを含む、芝草を含む)と飼草、アマ、ナタネ、ワタ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、ユリ、既に特に記載されていない限りにおいて、ナッツ生成植物からなる群から植物種を選択することができる。これらは、細菌、酵母、真菌、藻類、および哺乳動物細胞およびさらにそれらのオルガネラ(例えば、ミトコンドリアと葉緑体)だけには限られないが、それらを含めた他の全ての生物系に全部または一部分を適用することもできる。幾つかの実施形態では、生物または細胞は、Escherichia coli、Mycobacterium smegmatis、Baccillus subtilis、Chlorella、Bacillus thuringiensis、Saccharomyces cerevisiae、Yarrowia lipolytica、Chlamydamonas rhienhardtii、Pichia pastoris、Corynebacterium、Aspergillus niger、およびNeurospora crassaからなる群から選択される種のものである。幾つかの実施形態においては、酵母は、Yarrowia lypoliticaである。他の実施形態では、酵母は、Saccharomyces cerevisiaeではない。幾つかの実施形態では、植物または植物細胞は、Arabidopsis thaliana、Solanum tuberosum、Solanum phureja、Oryza sativa、Glycine max、Amaranthus tuberculatus、Linum usitatissimum、およびZea maysからなる群から選択される種のものである。植物種を、イネ科の単子葉植物からなる群から選択することができる。イネ科植物を、2つの主要なクレード、Bambusoideae、Ehrhartoideae、およびPooideae亜科を含有するクレード(BEPクレード)と、Panicoideae、Arundinoideae、Chloridoideae、Centothecoideae、Micrairoideae、Aristidoideae、およびDanthonioideae亜科を含有するクレード(PACCMADクレード)とに分割することができる。Bambusoideae亜科は、Oryzeae連を含む。植物種は、BEPクレードの植物、特に、BambusoideaeおよびEhrhartoideae亜科の植物と関連してもよい。BETクレードは、Bambusoideae、Ehrhartoideae、Triticodae群を含み、他のPooideae亜科の群は含まない。BET作物植物は、BETサブクレードのメンバー、例えば、オオムギ、コーンなどである、食物または飼料のために増殖させる植物である。
特定の実施形態では、方法は、植物細胞からGRONによって導入された突然変異を有する植物を再生するステップをさらに含み、植物から種子を回収するステップを含んでもよい。
関連態様において、本開示は、本明細書で記載する方法に従いGRONによって導入されたゲノム修飾を含む植物細胞、本明細書で記載する方法に従いGRONによって導入されたゲノム修飾を含む植物、または本明細書で記載する方法に従いGRONによって導入されたゲノム修飾を含む種子、または本明細書で記載する方法に従いGRONによって導入されたゲノム修飾を含む種子の子孫に関する。
本開示の他の実施形態は、以下に詳述する記載、例示的実施形態、および特許請求の範囲から明らかとなる。
(GRONの各末端に3PS部分を有する)ホスホチオエート(PS)標識GRONおよび5’Cy3/3’idC標識GRONによって仲介されるBFPからGFPへの変換を示す図である。 「2’−O−メチルGRON」と本明細書で呼ばれる、RNA/DNAを含むGRONを示す図である。 BFP5 CRISPRが標的とするbfp遺伝子上の位置の略図である。 BFPトランスジェニックArabidopsis thalianaモデル系における、BFPからGFPへの変換の割合に対する、様々な長さのCy3または3PS GRONのいずれかを導入されたCRISPRの効果の結果を示す図である。 BFPトランスジェニックArabidopsis thalianaモデル系における、BFPからGFPへの変換の割合に対する、様々な長さの3PS GRONを導入されたCRISPRの効果の結果を示す図である。 実施例9で使用されるGRON設計の略図である。 71量体GRONからのフローサイトメトリーにより決定されたArabidopsis thaliana BFPトランスジェニックモデル系からのGFP陽性プロトプラストの平均割合の測定値を示す図である。 201量体GRONからのフローサイトメトリーにより決定されたArabidopsis thaliana BFPトランスジェニックモデル系からのGFP陽性プロトプラストの測定値を示す図である。 BFPトランスジェニックArabidopsis thalianaモデル系におけるGFP陽性細胞の平均割合に対する、コードおよび非コードGRONを導入されたCRISPRの効果を示す図である。 CRISPR/Cas複合体への一本鎖GRONまたは二本鎖DNAのテザリングの略図である。 異なる長さのスペーサーのBFPトランスジェニックArabidopsis thalianaモデル系におけるBFPからGFPへの変換を仲介する際のCRISPRおよびGRONの効果の結果を示す図である。 プラスミド(gRNAプラスミド)上にコードされた、またはアンプリコン(gRNAアンプリコン)として使用されたスペーサーのBFPトランスジェニックArabidopsis thalianaモデル系におけるBFPからGFPへの変換を仲介する際のCRISPRおよびGRONの効果の結果を示す図である。 非修飾対3PS修飾41量体GRONのBFPトランスジェニックArabidopsis thalianaモデル系におけるBFPからGFPへの変換を仲介する際のCRISPRおよびGRONの効果の結果を示す図である。 T=0でCRISPRプラスミドでPEG処理された茎頂プロトプラストから誘導される3および6週齢のLinum usitatissimum(アマ)微小カルスの次世代配列決定の結果を示す図である。 T=0でCRISPRプラスミドでPEG処理された茎頂プロトプラストから誘導される3および6週齢のLinum usitatissimum微小カルスの次世代配列決定の結果を示す図である。 A.thalianaプロトプラストにおけるCRISPR−Casヌクレアーゼ活性および遺伝子編集を示す図である。図16A:送達の72時間後に、CRISPR−Casプラスミド(BC−1)で処理されたプロトプラストにおけるディープシーケンシングにより決定された、サイズに基づくインデルの分布。インデルは総リードの0.79%に相当した。図16B:プラスミド(BC−1)およびGRON(CG−6)の送達の72時間後にフローサイトメトリーにより同定されたGFP蛍光プロトプラストの割合により測定されたBFPからGFPへの編集。示されたデータは、トランスフェクション効率について正規化されていない。エラーバーはs.e.m.(n=9)である。 異なる長さおよび化学修飾のGRONと組み合わせたCRISPR−Casを用いたA.thalianaプロトプラストにおける遺伝子編集を示す図である。図17a:プラスミド(BC−1)およびGRON(CG−1)または(CG−2)の送達の72時間後にフローサイトメトリーにより測定されたBFPからGFPへの遺伝子編集における3PSと非修飾GRONの比較。図17b:プラスミド(BC−2)およびGRON(CG−5)または(CG−8)の送達後72時間でのフローサイトメトリーにより測定されたBFPからGFPへの遺伝子編集におけるGRONの長さの比較。図17c:プラスミド(BC−1)およびGRON(CG−6)、(CG−9)または(CG−10)の送達の72時間後にフローサイトメトリーにより測定されたBFPからGFPへの遺伝子編集に関する3PSと2’−O−Me GRONとの比較。図17d:プラスミド(BC−3)およびGRON(CG−3)または(CG−4)の送達の72時間後にフローサイトメトリーにより測定されたBFPからGFPへの遺伝子編集に関する3PS−とCy3GRONとの比較。エラーバーはs.e.m.(n=3)である。(CG−1):BFPアンチセンス41nb非修飾;(CG−2):BFPアンチセンス41nb 3PS修飾;(CG−3):BFPセンス41nb 3PS修飾;(CG−4):BFPセンス41nb Cy3修飾;(CG−5):BFPセンス60nb 3PS修飾;(CG−6):BFPアンチセンス201nb 3PS修飾;(CG−8):BFPセンス201nb 3PS修飾;(CG−9):最初の5’RNA塩基上でのBFPアンチセンス201nb 2’−O−Me修飾;(CG−10):最初の9つの5’RNA塩基上でのBFPアンチセンス201nb 2’−O−Me修飾。 A.thalianaおよびL.usitatissimumプロトプラスト中でのTALENヌクレアーゼ活性および遺伝子編集を示す図である。図18a:送達の72時間後にTALENプラスミド(BT−1)で処理されたArabidopsisプロトプラスト中でのディープシーケンシングにより決定されたサイズに基づくインデルの分布。インデルは総リードの0.51%を占めていた。図18b:プラスミド(BT−1)およびGRON(CG−7)の送達の48時間後にフローサイトメトリーにより測定されたBFPからGFPへの遺伝子編集。図18c:送達の7d後にEPSPS遺伝子を標的化するTALEN(LuET−1)で処理されたL.usitatissimumプロトプラスト中でのbp長に基づくインデルの代表的分布。インデルの総頻度は0.50%である。図18d:プロトプラストへのプラスミド(LuET−1)およびGRON(CG−11)の送達後7dでのディープシーケンシングにより測定されたL.usitatissimumのEPSPS遺伝子編集。総リードの割合は、総リードの割合としてT97IとP101A編集の両方を含有するリードの数を表す。エラーバーはs.e.m.(n=3)である。(CG−7):BFPセンス201nb 3PS修飾;(CG−11):EPSPSセンス144nb Cy3修飾。 トランスジェニックA.thalianaプロトプラスト中でのBFPからGFPへの編集に対する、二本鎖切断を誘導する抗生物質ゼオシンおよびフレオマイシンの効果を示す図である。プロトプラストを、ゼオシンまたはフレオマイシンで90分間処理した後、GRONをPEG導入した(CG2)。編集の成功はGFP蛍光をもたらした。緑色蛍光を発するプロトプラストを、Attune Acoustic Focusing Cytometerを使用して定量した。 BFPからGFPへの変換を標的化する、BFPトランスジェニックプロトプラストへのGRON送達の5日後の変換されたBFPトランスジェニックA.thaliana細胞を示す図である。緑色蛍光は、BFP−GFP編集を示す。明視野画像;B、青色光中での同じ視野。エラーバーはs.e.m.(n=4)である;(CG2):BFPアンチセンス41nb 3PS修飾;(CG12):BFPアンチセンス41nb 3PS修飾非標的化。画像を、ImageXpress Microシステム(Molecular Devices、Sunnyvale、CA、USA)を用いて獲得した。スケールバー=20μm。 CRISPR−CasおよびTALEN設計を示す図である。図21A:CRISPR−Casプラスミドの略図である。マンノピンシンターゼ(Mas)プロモーターは、高等植物のためにコドン最適化されたCas9遺伝子の転写を駆動している。Cas9遺伝子は、遺伝子のいずれかの末端に2つのSV40核局在化シグナル(NLS)と、2X FLAGエピトープタグとを含有する。A.thaliana U6プロモーターは、gRNA足場の転写を駆動しており、転写はポリ(T)シグナルを使用して終結される。図21B:TALENプラスミドの略図である。Masプロモーターは、2Aリボソームスキッピング配列と一緒に連結された右および左のテールアームの転写を駆動している。Fok1エンドヌクレアーゼは、それぞれのテールアームの3’末端に連結される。左のテールの5’末端は、核局在化シグナル(NLS)とV5エピトープタグとを含有する。rbcTは、Pisum sativumのRBCSE9遺伝子ターミネーターである。 BFPおよびEPSPSヌクレアーゼ標的領域を示す図である。a、CRISPR−Casプロトスペーサー、BC−1、BC−2およびBC−3ならびにTALEN BT−1、左および右のテールアームに関するBFP遺伝子標的領域。PAM配列を赤色で示す。TALEN結合部位は太字および下線付きである。BFPからGFPへの編集CAC→TAC(H66Y)の部位は、緑色の太字である。b、TALEN、LuET−1、左および右のテールアームに関するEPSPS遺伝子標的領域。EPSPS変換ACA>ATAおよびCCG>GCG(T97IおよびP101A)の部位は緑色である。 Alopecurus myosuroides(ノスズメノテッポウ)ACCase遺伝子産物のアミノ酸配列(配列番号1)を示す図である。 Escherichia coliのEPSPS遺伝子産物のアミノ酸配列(配列番号2)を示す図である。 例示的な類似EPSPS位置を示す図である。 例示的なACCase配列を示す図である。
オリゴヌクレオチドによって仲介される標的遺伝子修飾は、欠失、短い挿入、および点突然変異をもたらすためのDNAの短いストレッチの特異的改変において使用するのに値する技法である。これらの方法はDNA対形成/アニーリング、次にDNA修復/組換え事象を含む。最初に核酸は、細胞タンパク質因子によって仲介されるプロセスにおいて、二本鎖DNA中のその相補鎖とアニーリングする。このアニーリングによって(点突然変異の場合)中央に位置するミスマッチ塩基対を生成し、内在性タンパク質機構を刺激して修復プロセス中に第2のステップ、染色体配列および/またはオルガネラ内の(例えば、ミトコンドリアと葉緑体)の部位特異的修飾を開始させる可能性が最も高い構造不安定化をもたらす。この新たに導入されたミスマッチはDNA修復機構を誘導し、標的部位の最終修正をもたらす第2の修復事象を実施する。本明細書に開示される様々な態様および実施形態における本発明の方法および組成物は、DNA修復構成要素の利用性を高め、したがって標的核酸に対する遺伝子修復仲介型修飾の効率と再現性を高める新規な手法を提供することにより、前記方法を改良する。
部位特異的ゲノム修飾に有効な方法は、研究、臨床遺伝子療法、工業用微生物学および農学にとって望ましい。一手法は、第3の鎖として二本鎖DNAに配列特異的に結合する三本鎖形成オリゴヌクレオチド(TFO)を利用して、定方向突然変異誘発を仲介する。このようなTFOは、ソラレンもしくはクロラムブシルなどの変異原性化学物質の送達(Havre et al.,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.90:7879−7883,1993;Havre et al.,J Virol67:7323−7331,1993;Wang et al.,Mol Cell Biol15:1759−1768,1995;Takasugi et al.,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.88:5602−5606,1991;Belousov et al.,Nucleic Acids Res25:3440−3444,1997)、または誤りがちの修復を誘発するのに十分なアフィニティーでの結合(Wang et al.,Science271:802−805,1996)のいずれかによって作用し得る。
ゲノム修飾に関する別の戦略は、外来DNA断片と標的遺伝子の間の相同組換えの誘導を含む。この手法は首尾よく使用され哺乳動物細胞中の選択遺伝子が標的化および妨害されており、特異的遺伝子ノックアウトがあるトランスジェニックマウスの生成が可能になっている(Capeechi et al.,Science244:1288−1292,1989、Wagner,米国特許第4,873,191号)。この手法は、選択可能マーカーの導入を含み所望の組換え体の単離を可能にするものである。選択がない場合、典型的遺伝子導入実験におけるトランスフェクトDNAの相同と非相同組み込みの比は低く、通常は1:1000以下の範囲内である(Sedivy et al.,Gene Targeting,W.H.Freeman and Co.,New York,1992)。相同組み込みのこの低い効率によって、実験用途または遺伝子療法に関する遺伝子導入の利用が限定される。相同組換えの頻度は、UV照射および選択発癌性物質が原因の標的部位への損傷(Wang et al.,Mol Cell Biol8:196−202,1988)によって、ならびに部位特異的エンドヌクレアーゼ(Sedivy et al.,Gene Targeting,W.H.Freeman and Co.,New York,1992;Rouet et al.,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.91:6064−6068,1994;Segal et al.,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.92:806−810,1995)によって高まる可能性がある。さらに、三本鎖対象ソラレン光付加物によって誘導されるDNA損傷は、染色体外ベクター内およびその間の組換えを刺激する可能性がある(Segal et al.,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.92:806−810,1995;Faruqi et al.,Mol Cell Biol16:6820−6828,1996、Glazer,米国特許第5,962,426号)。
直鎖状ドナー断片は、それらの環状相当物より組換えの影響を受けやすい(Folger et al.,Mol Cell Biol 2:1372−1387,1982)。組換えは、特定の実施形態においては、ドナー部位と標的部位両方の間の連続した相同性の長さによっても影響を受け、短い断片は組換えに関して無力な基質であると思われることが多い(Rubnitz et al.,Mol Cell Biol 4:2253−2258,1984)。それにもかかわらず、遺伝子補正用のDNAまたはDNA/RNAハイブリッドの短い断片の使用が、様々な戦略の焦点である(Kunzelmann et al.,Gene Ther 3:859−867,1996)。
本明細書で使用する「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそれらの断片もしくは一部分、および一本鎖もしくは二本鎖であってよくセンス鎖もしくはアンチセンス鎖を表すゲノムもしくは合成起源のDNAまたはRNAを指す。
本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、少なくとも約10核酸塩基および最大約1000核酸塩基の核酸塩基のポリマーを指す。
本明細書で使用する用語「DNA修飾分子」および「DNA修飾試薬」は、細胞のゲノム中の核酸配列を認識しそれに特異的に結合することができ、ゲノム内の標的ヌクレオチド配列を修飾することができ、認識およびDNA修飾分子と核酸配列の特異的結合がタンパク質非依存的である分子を指す。DNA修飾分子に関して本明細書で使用する用語「タンパク質非依存的」は、DNA修飾分子が核酸配列の認識、および/またはそれとの特異的結合にタンパク質および/または酵素の存在および/または活性を必要としないことを意味する。DNA修飾分子は、遺伝子変換の助長を目的とする、三本鎖形成オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリアミド、およびオリゴヌクレオチドだけには限られないが、これらによって例示される。本開示のDNA修飾分子は、ある特定の実施形態では、相同組換えに使用される従来技術の核酸配列がタンパク質依存的である点で、相同組換えに使用される従来技術の核酸配列(Wong and Capecchi,Molec.Cell.Biol.7:2294−2295,1987)と区別される。分子に関して本明細書で使用する用語「タンパク質依存的」は、分子が核酸配列の認識、および/またはそれとの特異的結合にタンパク質および/または酵素の存在および/または活性を必要とすることを意味する。DNA修飾分子が核酸配列の認識、および/またはそれとの特異的結合にタンパク質および/または酵素の存在および/または活性を必要するかどうか決定するための方法は、当技術分野の技術の範囲内にある(例えば、Dennis et al.Nucl.Acids Res.27:4734−4742,1999を参照)。例えばDNA修飾分子は、任意のタンパク質および/または酵素の不在下で核酸配列と共にin vitroでインキュベートすることができる。DNA修飾分子と核酸配列の間の特異的結合の検出によって、DNA修飾分子がタンパク質非依存的であることを実証する。他方で、DNA修飾分子と核酸配列の間の特異的結合の不在は、DNA修飾分子がタンパク質依存的であることおよび/または他の因子を必要とすることを実証する。
「三本鎖形成オリゴヌクレオチド」(TFO)は、二本鎖DNAまたはRNAヘリックスの主要溝に結合して三重ヘリックスを形成することができる、DNAまたはRNAの配列として定義する。TFOは任意の特定長に限定されないが、TFOの好ましい長さは250ヌクレオチド以下、200ヌクレオチド以下、または100ヌクレオチド以下、または5〜50ヌクレオチド、または10〜25ヌクレオチド、または15〜25ヌクレオチドである。三重ヘリックスの形成のためTFOと二本鎖DNAの間で一定の度合いの配列特異性が必要であるが、三重ヘリックスが形成可能である限り、特定度合いの特異性が必要とされるわけではない。同様に、三重ヘリックスが形成可能である限り、TFOと二本鎖ヘリックスの間で特異的度合いのアビディティーまたはアフィニティーが必要とされるわけではない。TFOが特異的に結合するヌクレオチド配列の長さを限定する目的ではないが、一実施形態において、TFOが特異的に結合するヌクレオチド配列は1〜100、幾つかの実施形態では5〜50、さらに他の実施形態では10〜25、および他の実施形態では15〜25ヌクレオチドである。さらに「三重ヘリックス」は、二重らせん核酸内の標的配列と結合したオリゴヌクレオチドを含む二重らせん核酸として定義する。「二重らせん」核酸は、二本鎖DNA、二本鎖RNA、およびDNAとRNAの混合二本鎖を含めた任意の二本鎖核酸であってよい。二本鎖核酸は任意の特定長に限定されない。しかしながら好ましい実施形態では、二本鎖核酸は500bpを超える、幾つかの実施形態では1kbを超える、および幾つかの実施形態では約5kbを超える長さを有する。多くの適用例において、二重らせん核酸は細胞、ゲノム核酸である。三本鎖形成オリゴヌクレオチドは、パラレルまたはアンチパラレル形式で標的配列に結合することができる。
「ペプチド核酸」、「ポリアミド」または「PNA」は、リン酸骨格がN−アミノエチルグリシン系ポリアミド構造に置換された核酸である。ワトソン−クリックの塩基対形成法則に従うと、PNAはそれら本来の相当物より相補核酸に対して高いアフィニティーを有する。PNAは以下の化学量論比のDNAとの非常に安定した三重ヘリックス構造を形成し得る:(PNA)2.DNA。ペプチド核酸およびポリアミドは任意の特定長に限定されないが、ペプチド核酸およびポリアミドの好ましい長さは200ヌクレオチド以下、幾つかの実施形態では100ヌクレオチド以下、および幾つかの実施形態では5〜50ヌクレオチド長である。ペプチド核酸およびポリアミドが特異的に結合するヌクレオチド配列の長さを限定する目的ではないが、一実施形態において、ペプチド核酸およびポリアミドが特異的に結合するヌクレオチド配列は1〜100、幾つかの実施形態では5〜50、さらに他の実施形態では5〜25、および他の実施形態では5〜20ヌクレオチドである。
用語「細胞」は単細胞を指す。用語「細胞(複数)」は細胞の集団を指す。集団は1つの細胞型を含む純粋な集団であってよい。同様に、集団は2つ以上の細胞型を含み得る。本開示では、一細胞集団が含み得る細胞型の数に制限はない。本明細書で使用する細胞は、植物カルス細胞、細胞壁を含む、および含まない細胞、原核細胞ならびに真核細胞だけに限られないが、これらを含む。
細胞のサンプルを言及するときの用語「同調させる」または「同調した」、または「同調細胞」もしくは「同調細胞集団」は、細胞周期の同じ時期に細胞集団が存在するように処置した複数の細胞を指す。サンプル内の全ての細胞が同調状態である必要はない。わずかな割合の細胞がサンプル内の大部分の細胞と同調していない可能性がある。同調状態である細胞の好ましい範囲は10〜100%である。より好ましい範囲は30〜100%である。さらに、細胞が一細胞型の純粋な集団である必要はない。2つ以上の細胞型がサンプル内に含有される可能性がある。この点において、サンプル内の別の細胞型と比較して、一細胞型のみが同調状態である、または細胞周期の異なる時期に存在する可能性がある。
単細胞を言及するときの用語「同調細胞」は、操作前の細胞の細胞周期の時期と異なる細胞周期の時期に細胞が存在するように、細胞を操作したことを意味する。あるいは「同調細胞」は、対照細胞(例えば、操作がない状態の細胞)と比較して、操作前の細胞が存在した細胞周期の時期の時間を改変(すなわち、延長または縮小)するよう操作した細胞を指す。
用語「細胞周期」は、分裂(すなわち、増殖)時に細胞が経る生理的および形態的変化の進行を指す。細胞周期は一般に、「分裂間期」、「前期」、「中期」、「後期」、および「終期」と呼ばれる時期で構成されると認識されている。さらに、細胞周期の一部分は「M(有糸分裂期)」、「S(合成期)」、「G0」、「G1(ギャップ1)」および「G2(ギャップ2)」と呼ぶことができる。さらに細胞周期は、前述の名称の時期の間に存在する進行期間を含む。
用語「細胞周期抑制」は、細胞または細胞集団における細胞周期進行の休止を指す。細胞周期抑制は通常、細胞生理の態様に干渉する作用物質(化学物質、タンパク質またはその他)への細胞の露出によって誘導され細胞周期の続行を妨げる。
「増殖」または「細胞増殖」は、2つの娘細胞に繰り返し分裂し、それによって集団における全体的な細胞の増大をもたらす親細胞の能力を指す。細胞集団は生物中、または培養装置中に存在してよい。
用語「DNA修飾可能」または「DNA修飾手段」は、標的DNAセグメントのヌクレオチド配列に対する変化を誘導する能力がある、またはその誘導を手助けすることができる手順、および内在もしくは外来作用物質もしくは試薬を指す。標的DNAセグメント上の1つまたは複数の塩基の欠失、付加または置換によって、このような変化を施すことができる。DNA配列の変化が、標的配列によってコードされる任意の遺伝子に対する機能的変化をもたらすことは必要とされない。さらに、任意の特定部分または割合の細胞にDNAに対する変化を施すことは必要とされない。
用語「対象のヌクレオチド配列」は、当業者によるその操作が何らかの理由で望ましいと思われる可能性のある、任意のヌクレオチド配列を指す。このようなヌクレオチド配列には、構造遺伝子(例えば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、薬剤耐性遺伝子、増殖因子など)のコード配列、およびmRNAまたはタンパク質産物をコードしていない非コード制御配列(例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、ポリアデニル化配列、終止配列、miRNAなどの制御RNA)があるが、これらだけには限られない。
「アミノ酸配列」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド配列」および「ペプチド」は本明細書中で交互に使用してアミノ酸の配列を指す。
本明細書で使用する「標的配列」は、8ヌクレオチド長を超えるが201ヌクレオチド長未満の配列を含む二重らせん核酸を指す。幾つかの実施形態では、標的配列は8〜30塩基である。一般に標的配列は、二重らせん核酸上の一鎖上のヌクレオチド配列によって定義される。
本明細書で使用する「プリンリッチ配列」または「ポリプリン配列」は、二重らせん核酸配列の一鎖上のヌクレオチド配列を言及するとき、標的配列の50%を超えるヌクレオチドがプリン塩基を含有するヌクレオチドの隣接配列として定義する。しかしながら、プリンリッチ標的配列は、60%を超えるプリンヌクレオチド、幾つかの実施形態では75%を超えるプリンヌクレオチド、他の実施形態では90%を超えるプリンヌクレオチド、およびさらに他の実施形態では100%のプリンヌクレオチドを含有することが好ましい。
本明細書で使用する「ピリミジンリッチ配列」または「ポリピリミジン配列」は、二重らせん核酸配列の一鎖上のヌクレオチド配列を言及するとき、標的配列の50%を超えるヌクレオチドがピリミジン塩基を含有するヌクレオチドの隣接配列として定義する。しかしながら、ピリミジンリッチ標的配列は、60%を超えるピリミジンヌクレオチド、および幾つかの実施形態では75%を超えるピリミジンヌクレオチドを含有することが好ましい。幾つかの実施形態では、配列は90%を超えるピリミジンヌクレオチドを含有し、他の実施形態では、100%ピリミジンヌクレオチドである。
第1のヌクレオチド配列の「変異体」は、(例えば、ハイブリダイゼーションアッセイの使用またはDNA配列決定の使用によって検出可能である、1つまたは複数の欠失、挿入、または置換を有することにより)第1のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列として定義する。この定義内に含まれるのは、第1のヌクレオチド配列のゲノム配列に対する改変または修飾の検出である。例えば、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して、(1)ゲノム中に含まれるとき第1のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる制限酵素断片のパターンの改変(すなわちRFLP分析)、(2)第1のヌクレオチド配列を含有するゲノムDNAのサンプルに第1のヌクレオチド配列の選択部分がハイブリダイズできないこと(例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用)、(3)第1のヌクレオチド配列に関する正常染色体遺伝子座以外の遺伝子座とのハイブリダイゼーションなどの、不適切または予想外なハイブリダイゼーションを検出することができる(例えば、中期染色体分布に対する蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)などを使用)。変異体の一例は突然変異野生型配列である。
本明細書で使用する用語「核酸」および「非修飾核酸」は、周知の4デオキシリボ核酸塩基(すなわち、グアニン、アデニン、シトシン、およびチミン)のいずれか1つを指す。用語「修飾核酸」は、非修飾核酸の構造に対してその構造が改変された核酸を指す。このような修飾の例示は、塩基の置換、共有結合修飾、アミノおよび窒素環のアルキル化、ならびに二重結合の飽和などであると思われる。
本明細書で使用する用語「突然変異」および「修飾」およびこれらと文法上同等な用語は、核酸配列に関して使用するとき、交互に使用して欠失、挿入、置換、鎖切断、および/または付加体の導入を指す。「欠失」は、1つまたは複数のヌクレオチドが無い核酸配列の変化として定義する。「挿入」または「付加」は、1つまたは複数のヌクレオチドの付加が起こった核酸配列の変化である。「置換」は、交換対象の1つまたは複数のヌクレオチドとは異なる分子である分子と、1つまたは複数のヌクレオチドの交換から生じる。例えば、シトシン、アデニン、グアニン、またはウリジンとチミンの交換によって例示されるように、一核酸は異なる核酸と交換することができる。ピリミジンからピリミジン(例えば、CからTまたはTからCのヌクレオチド置換)またはプリンからプリン(例えば、GからAまたはAからGのヌクレオチド置換)はトランジションと呼ばれ、一方ピリミジンからプリンまたはプリンからピリミジン(例えば、GからTまたはGからCまたはAからTまたはAからC)はトランスバージョンと呼ばれる。あるいは、チミンとチミングリコールの交換によって例示されるように、一核酸は修飾核酸と交換することができる。突然変異はミスマッチをもたらす可能性がある。用語「ミスマッチ」は、それぞれの核酸が異なるポリ核酸配列上に存在する2核酸間の非共有結合相互作用を指し、これは塩基対形成の法則に従わない。例えば、部分的相補配列5’−AGT−3’および5’−AAT−3’に関しては、G−Aミスマッチ(トランジション)が存在する。用語「付加体の導入」または「付加体形成」は、結合が(幾つかの実施形態では10%〜100%、他の実施形態では50%〜100%、および幾つかの実施形態では75%〜100%の)DNA複製および/または転写レベルの低下をもたらすような、DNA配列中の1つまたは複数のヌクレオチドと分子の共有結合または非共有結合を指す。
用語「DNA切断剤」とは、鎖切断を行う部分を指す。非限定例は、メガヌクレアーゼ、TALE/TALEN、抗生物質、ジンクフィンガーおよびCRISPRまたはCRISPR/cas系を含む。
用語「鎖切断」は、二本鎖核酸配列を言及するとき、一本鎖切断および/または二本鎖切断を含む。一本鎖切断(ニック)は、二本鎖核酸配列の二本鎖の一本における妨害を指す。これは、平滑末端または付着末端をもたらし得る、二本鎖核酸配列の両鎖における妨害を指す二本鎖切断とは対照的である。鎖切断は、(例えば、電離放射線もしくは特定化学物質を用いた処置により)直接的にまたは(例えば、核酸塩基における酵素での切断により)間接的に、二本鎖核酸配列に導入することができる。
用語「突然変異細胞」および「修飾細胞」は、細胞のゲノム配列中に少なくとも1つの修飾を含有する細胞を指す。
用語「一部分」は、ヌクレオチド配列の言及において使用するとき、そのヌクレオチド配列の断片を指す。断片は、5ヌクレオチド残基〜ヌクレオチド配列全体マイナス1核酸残基の大きさの範囲であり得る。
DNA分子は「5’末端」および「3’末端」を有すると言える。1つのモノヌクレオチドペントース環の5’リン酸がホスホジエステル結合を介して一方向でその近隣の3’酸素に結合するような形式で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを形成するからである。したがって、その5’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の3’酸素と結合しない場合、オリゴヌクレオチドの末端は「5’末端」と呼ばれる。その3’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の5’リン酸と結合しない場合、オリゴヌクレオチドの末端は「3’末端」と呼ばれる。本明細書で使用する核酸配列は、多量オリゴヌクレオチド内部の場合でさえ、5’末端および3’末端を有すると言うこともできる。直鎖状または環状DNA分子のいずれかにおいて、不連続なエレメントは「上流」または「下流」の5’または3’エレメントであると言える。この述語は、転写がDNA鎖に沿って5’から3’方向に進行することを表す。関連遺伝子の転写を誘導するプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、一般にコード領域の5’または上流に位置する。しかしながら、プロモーターエレメントおよびコード領域の3’に位置するときでさえ、エンハンサーエレメントはその効果を発揮し得る。転写終結およびポリアデニル化シグナルはコード領域の3’または下流に位置する。
本明細書で使用する用語「組換えDNA分子」は、分子生物学の技法により1つに接合したDNAのセグメントで構成されるDNA分子を指す。
本明細書で使用する用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、組換えDNA分子を使用して発現されるタンパク質分子を指す。
本明細書で使用する用語「ベクター」と「運搬体」は、一細胞から別の細胞にDNAセグメント(複数可)を移動させる核酸分子を言及する際に交互に使用する。
本明細書で使用する用語「作動可能な組合せで」、「作動可能な順序で」および「作動可能に連結した」は、所与の遺伝子の転写の誘導および/または所望のタンパク質分子の合成が可能な核酸分子を生成するような形式での核酸配列の結合を指す。これらの用語は、機能的タンパク質を生成するような形式でのアミノ酸配列の結合も指す。
本明細書で使用する用語「トランスフェクション」は、細胞中への外来DNAの導入を指す。リン酸カルシウム−DNA共沈、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、バイオリスティック(すなわち、パーティクルボンバードメント)などを含めた当業者に知られている様々な手段によって、トランスフェクションを実施することができる。
本明細書で使用する用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成の法則によって関連付けられる(ヌクレオチドの配列を指す交換可能な用語である)「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」を言及する際に使用する。例えば、配列「5’−CAGT−3’」は配列「5’−ACTG−3’」と相補的である。相補性は「部分的」または「全体的」であってよい。「部分的」相補性は、塩基対形成の法則に従い1つまたは複数の核酸塩基がマッチしない場合である。核酸間の「全体的」または「完全」相補性は、塩基対形成の法則の下、それぞれ個々の核酸塩基が別の塩基とマッチする場合である。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に対して有意な影響がある可能性がある。これは増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出法において特に重要である可能性がある。便宜上、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」はヌクレオシドを含む分子を含む。
ヌクレオチド配列を言及する際に本明細書で使用する用語「相同性」および「相同的」は、他のヌクレオチド配列との相補性の程度を指す。部分的相同性または完全相同性(すなわち同一性)が存在し得る。cDNAまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列を言及する際に使用するとき、用語「実質的に相同的」は、前述の低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズすることができる、任意の核酸配列(例えばプローブ)を指す。核酸配列と部分的に相補的、すなわち「実質的に相同的」であるヌクレオチド配列は、標的核酸配列と完全相補配列がハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するヌクレオチド配列である。標的配列と完全相補配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシーの条件下においてハイブリダイゼーションアッセイ(サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど)を使用して調べることができる。実質的に相同的な配列またはプローブは、低ストリンジェンシーの条件下における完全相同配列と標的配列の結合(すなわち、ハイブリダイゼーション)に関して競合しそれを阻害する。低ストリンジェンシーの条件は非特異的結合が許容されるような条件であるとは言えず、低ストリンジェンシー条件は、2配列の互いの結合が特異的(すなわち選択的)相互作用であることを必要とする。非特異的結合の不在は、部分的な割合の相補性さえ欠く(例えば、約30%未満の同一性の)第2の標的配列の使用によって試験することができ、非特異的結合の不在下では、プローブは第2の非相補的標的とハイブリダイズしない。
低ストリンジェンシー条件は、約100〜約1000ヌクレオチド長のプローブを利用するとき、5×SSPE(43.8g/lのNaCl、6.9g/lのNaH2PO4・H2Oおよび1.85g/lのEDTA、NaOHでpH7.4に調節)、0.1%のSDS、5×デンハルト試薬(50×デンハルト試薬は500ml当たり:5gのFicoll(Type400、Phrmacia)、5gのBSA(FractionV;Sigma))および100μg/mlの変性サケ精子DNAからなる溶液中での68℃における結合またはハイブリダイゼーション、次に2.0×SSPE、0.1%SDSを含む溶液中での室温における洗浄と同等な条件を含む。
さらに、高ストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションを促進する条件(例えば、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄ステップの温度の増大、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドの使用など)は当技術分野でよく知られている。高ストリンジェンシー条件は、核酸ハイブリダイゼーションを言及する際に使用するとき、約100〜約1000ヌクレオチド長のプローブを利用するとき、5×SSPE、1%のSDS、5×デンハルト試薬および100μg/mlの変性サケ精子DNAからなる溶液中での68℃における結合またはハイブリダイゼーション、次に0.1%×SSPEおよび0.1%SDSを含む溶液中での68℃における洗浄と同等な条件を含む。
低ストリンジェンシー条件、プローブの長さおよび性質(DNA、RNA、塩基組成)、および標的の性質(溶液中または固定状態で存在するDNA、RNA、塩基組成など)、ならびに塩および他の構成要素の濃度(例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無)、ならびに前述の条件とは異なるが同等である低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を得るため変更することができるハイブリダイゼーション溶液の構成要素などの要因を含む、多くの同等な条件を利用することができることは当技術分野でよく知られている。
用語「同等」は、対象のハイブリダイゼーション条件と関連があるハイブリダイゼーション条件を言及するとき、そのハイブリダイゼーション条件と対象のハイブリダイゼーション条件が、同じ範囲の割合(%)の相同性を有する核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらすことを意味する。例えば、対象のハイブリダイゼーション条件が、第1の核酸配列と50%〜70%の相同性を有する他の核酸配列と第1の核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらす場合、したがって別のハイブリダイゼーション条件は、この他のハイブリダイゼーション条件も、第1の核酸配列と50%〜70%の相同性を有する他の核酸配列と第1の核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらす場合、対象のハイブリダイゼーション条件と同等であると言える。
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖を塩基対形成により相補鎖と接合させハイブリダイゼーション複合体を形成する任意のプロセスを使用した、相補核酸の対形成を言及する際に使用する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度(すなわち、核酸間の会合の強度)は、核酸間の相補性の程度、関連ストリンジェンシー条件、形成されるハイブリッドのTm、および核酸内のG:C比などの要因によって影響を受ける。
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補G塩基とC塩基の間および相補A塩基とT塩基の間での水素結合の形成によって、2核酸配列間で形成される複合体を指し、これらの水素結合は塩基スタッキング相互作用によってさらに安定化され得る。2つの相補核酸にはアンチパラレル形状で水素結合が並ぶ。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中(例えば、CotもしくはRot分析)、または溶液中に存在する一核酸配列と固形支持体(例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ドットブロッティングにおいて利用されるナイロン膜もしくはニトロセルロースフィルター、またはFISH(蛍光in situハイブリダイゼーション)を含めたin situハイブリダイゼーションにおいて利用されるスライドグラス)に固定された別の核酸配列の間で形成され得る。
本明細書で使用する用語「Tm」は「融解温度」を言及する際に使用する。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半分になり一本鎖に解離する温度である。核酸のTmを計算するための等式は当技術分野でよく知られている。標準参照によって示されるように、核酸が1MNaClで水溶液中に存在するとき、Tm値の単純推定値は等式:Tm=81.5+0.41(%G+C)によって計算することができる(例えば、Anderson and Young,Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic Acid Hybridization,1985参照)。他の参照は、Tm計算用に構造および配列特性を考慮に入れたさらに精巧な計算法を含む。
本明細書で使用する用語「ストリンジェンシー」は、その下で核酸ハイブリダイゼーションが実施される、温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在の条件を言及する際に使用する。ストリンジェンシーは、典型的にはほぼTm−5℃(プローブの融点より5℃低い)からTmより約20℃〜25℃低い範囲に存在する。当業者によって理解されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを使用して同一ポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出することができ、または類似もしくは関連ポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出することができる。
用語「特異的結合」、「結合特異性」、およびこれらと文法上同等な用語は、第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列の結合を言及するとき、第2のヌクレオチド配列と第3のヌクレオチド配列の間の相互作用と比較した、第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列の間の優先的相互作用を指す。特異的結合は結合の絶対的特異性を必要としない相対語である。言い換えると、用語「特異的結合」は、第2のヌクレオチド配列と第3のヌクレオチド配列の間の相互作用の不在下で、第2のヌクレオチド配列が第1のヌクレオチド配列と相互作用することを必要としない。そうではなくて、それは第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列の間の相互作用のレベルが、第2のヌクレオチド配列と第3のヌクレオチド配列の間の相互作用のレベルを超えることで十分である。第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列の「特異的結合」は、第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列の間の相互作用が、第1のヌクレオチド配列上または内部の特定構造の存在に依存することも意味する。言い換えると、第2のヌクレオチド配列は、一般に核酸またはヌクレオチド配列ではなく、第1のヌクレオチド配列上または内部の特定構造を認識しそれに結合している。例えば、第2のヌクレオチド配列が第1のヌクレオチド配列上または内部に存在する構造「A」に特異的である場合、構造Aを含有する第3の核酸配列の存在によって第1のヌクレオチド配列と結合する第2のヌクレオチド配列の量が減少する。
本明細書で使用する用語「増幅可能な核酸」は、任意の増幅法によって増幅することができる核酸を言及する際に使用する。「増幅可能な核酸」は「サンプル鋳型」を通常含むと企図される。
用語「異種核酸配列」または「異種DNA」を交互に使用して、それが本来連結していない、またはそれが本来と異なる位置で連結した核酸配列と連結したヌクレオチド配列を指す。異種DNAはそれが導入される細胞には内在せず、別の細胞から入手される。一般に、必ずとは言えないが、このような異種DNAは、それが発現される細胞により通常生成されないRNAおよびタンパク質をコードする。異種DNAの例には、レポーター遺伝子、転写および翻訳制御配列、選択可能マーカータンパク質(例えば、薬剤耐性をもたらすタンパク質)などがある。
「増幅」は核酸配列の追加コピーの生成として定義し、当技術分野でよく知られているポリメラーゼ連鎖反応の技術を使用して一般に実施される(Dieffenbach CW and GS Dveksler(1995)PCR Primer、a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.)。本明細書で使用する用語「ポリメラーゼ連鎖反応」(「PCR」)は、クローニングまたは精製無しでゲノムDNAの混合物中の標的配列セグメントの濃度を高めるための方法を記載する、参照により本明細書に組み込まれているK.B.Mullis、米国特許第4,683,195号、および同4,683,202号の方法を指す。所望標的配列の増幅セグメントの長さは2オリゴヌクレオチドプライマーの互いに対する相対的位置によって決定され、したがってこの長さは制御可能なパラメーターである。プロセスの反復態様のため、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」(「PCR」)と呼ぶ。標的配列の所望増幅セグメントは(濃度の点で)混合物中の主要配列となるので、それらは「PCR増幅された」と言える。
PCRによって、ゲノムDNAにおける特異的標的配列の1コピーを、幾つかの異なる方法(例えば、標識プローブとのハイブリダイゼーション、ビオチニル化プライマーの取り込み、次にアビジン−酵素コンジュゲートの検出、増幅セグメントへのdCTPまたはdATPなどの32P標識デオキシヌクレオチド三リン酸の取り込み)により検出可能なレベルまで増幅することができる。ゲノムDNA以外に、適切なセットのプライマー分子で任意のオリゴヌクレオチド配列を増幅することができる。特に、PCRプロセス独力によって作製した増幅セグメントはそれら自体、後のPCR増幅に有効な鋳型である。
特に市販品用途の、1つのこのような好ましい方法は広く使用されているTaqMan(登録商標)リアルタイムPCR技術に基づき、対立遺伝子特異的PCRとブロッキング試薬(ASB−PCR)を組み合せて野生型対立遺伝子の増幅を抑制する。ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料を含めた任意の組織型から抽出したDNAもしくはRNAのいずれか、生殖細胞系列または体細胞突然変異の検出にASB−PCRを使用することができる。1000倍以上過剰に野生型対立遺伝子のバックグラウンドに対する一点置換、挿入、または欠失の感受性および選択的検出を可能にする、一組の試薬設計法則が開発されている。(Morlan J,Baker J,Sinicropi D Mutation Detection by Real−TimePCR:A Simple、Robust and Highly Selective Method.PLoS ONE4(2):e4584,2009)
用語「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」および「RT−PCR」は、RNA配列を逆転写してcDNA配列の混合物を生成させ、次にクローニングまたは精製無しで混合物中の転写cDNA配列の所望セグメントの濃度を高めるための方法を指す。典型的には、2プライマーを使用した転写DNAの所望セグメントのPCR増幅の前に、1つのプライマー(例えばオリゴ−dTプライマー)を使用してRNAを逆転写する。
本明細書で使用する用語「プライマー」は、精製制限酵素消化産物に原型で存在しようと合成によって生じようと、核酸鎖と相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件下(すなわち、適切な温度およびpHでヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼなどの誘導剤の存在下)に置いたとき、合成の開始地点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。幾つかの実施形態では、プライマーは最大増幅効率のため一本鎖であるが、代替的に二本鎖であってよい。二本鎖の場合、延長産物の調製に使用する前に、プライマーを最初に処理してその鎖を分離させる。幾つかの実施形態では、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で延長産物の合成を引き起こすほど十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの源および使用法を含めた多くの要因に依存する。
本明細書で使用する用語「プローブ」は、精製制限酵素消化産物に原型で存在しようと、合成、組換えまたはPCR増幅によって生じようと、対象の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)を指す。プローブは一本鎖または二本鎖であってよい。プローブは、特定遺伝子配列の検出、同定および単離において有用である。本開示において使用する任意のプローブは任意の「レポーター分子」で標識され、したがってそれは、酵素(例えばELISA、および酵素系組織化学アッセイ)、蛍光、放射活性、および発光システムだけには限られないが、これらを含めた任意の検出システムで検出可能であることが企図される。本開示が何らかの特定検出システムまたは標識に限定されることを意図するものではない。
本明細書で使用する用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、その各々が特定ヌクレオチド配列もしくはその近辺で二本鎖もしくは一本鎖DNAを切断するかまたはそれに切れ目を入れる細菌酵素、例えばIIS型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメイン(例えばKim et al.,1996,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,6:1 156−60によって教示されたように、FokIを使用することができる)を指す。
本明細書で使用する用語「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、すなわち遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域はcDNA、ゲノムDNAまたはRNA型のいずれかで存在し得る。DNA型で存在するとき、オリゴヌクレオチドは一本鎖(すなわちセンス鎖)または二本鎖であり得る。さらに「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」は、転写の正確な開始および/または一次RNA転写産物の正確なプロセシングを可能にすることが必要な場合、エンハンサー、プロモーター、スプライスジャンクション、ポリアデニル化シグナルなどの適切な制御エレメントを含み得る。さらになお、本開示のコード領域は内在エンハンサー、スプライスジャンクション、介在配列、ポリアデニル化シグナルなどを含有し得る。
真核生物における転写制御シグナルは「エンハンサー」エレメントを含む。エンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いDNA配列アレイからなる(Maniatis,T.et al.,Science236:1237,1987)。エンハンサーエレメントは、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞ならびにウイルスにおける遺伝子を含めた、様々な真核生物供給源から単離されている。個々のエンハンサーの選択は、対象のタンパク質を発現させるのにどの細胞型を使用するかに依存する。
発現ベクターにおける「スプライシングシグナル」の存在は、組換え転写産物の高レベルの発現をもたらすことが多い。スプライシングシグナルは一次RNA転写産物からのイントロンの除去を仲介し、スプライスドナーおよびアクセプタードナー部位からなる(Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,pp.16.7−16.8,1989)。一般に使用されるスプライスドナーおよびアクセプタードナー部位は、SV40の16SRNA由来のスプライスジャンクションである。
真核生物細胞における組換えDNA配列の有効な発現は、有効な終結と生成転写産物のポリアデニル化を誘導するシグナルの発現を必要とする。転写終結シグナルは一般にポリアデニル化シグナルの下流で見られ、数百ヌクレオチド長である。本明細書で使用する用語「ポリA部位」または「ポリA配列」は、終結と発生期RNA転写産物のポリアデニル化の両方を誘導するDNA配列を示す。ポリA尾部を欠く転写産物は不安定であり急速に分解されるので、組換え転写産物の有効なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターにおいて利用されるポリAシグナルは「異種」または「内在」であり得る。内在ポリAシグナルは、ゲノム中の所与遺伝子のコード領域の3’末端で本来見られるシグナルである。異種ポリAシグナルは、一遺伝子から単離され別の遺伝子の3’末端に配置されたシグナルである。
本明細書で使用する用語「プロモーター」、「プロモーターエレメント」または「プロモーター配列」は、オリゴヌクレオチド配列の5’末端に置かれる(すなわち上位に位置する)とき、そのオリゴヌクレオチド配列のmRNAへの転写を制御することができるDNA配列を指す。典型的にはプロモーターは、mRNAへのその転写を制御するオリゴヌクレオチド配列の5’(すなわち上流)に位置し、RNAポリメラーゼによる特異的結合および転写開始に関する部位をもたらす。
用語「プロモーター活性」は、核酸配列を言及するとき、mRNAへのオリゴヌクレオチド配列の転写を開始させる核酸配列の能力を指す。
用語「組織特異的」は、プロモーターに適用するとき、異型組織中での同じオリゴヌクレオチドの発現の相対的不在下で、特異的型の組織に対するオリゴヌクレオチド配列の選択的発現を誘導することができるプロモーターを指す。プロモーターの組織特異性は、例えば、レポーター遺伝子とプロモーター配列を作動可能に連結させレポーター構築物を生成させ、生成するトランスジェニック動物の各組織にレポーター構築物が組み込まれるように植物または動物のゲノムにレポーター構築物を導入し、トランスジェニック植物または動物の異なる組織におけるレポーター遺伝子の発現を検出する(例えば、mRNA、タンパク質、またはレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を検出する)ことによって評価することができる。選択性は絶対的である必要はない。他の組織中でのレポーター遺伝子の発現レベルに対する、1つまたは複数の組織中でのより高レベルのレポーター遺伝子の発現の検出によって、より高レベルの発現が検出される組織にプロモーターが特異的であることを示す。
用語「細胞型特異的」は、プロモーターに適用するとき、同じ組織内の異型細胞での同じオリゴヌクレオチド配列の発現の相対的不在下で、特異的型の細胞におけるオリゴヌクレオチド配列の選択的発現を誘導することができるプロモーターを指す。用語「細胞型特異的」は、プロモーターに適用するとき、一組織内の領域におけるオリゴヌクレオチドの選択的発現を促進することができるプロモーターも意味する。再度、選択性は絶対的である必要はない。プロモーターの細胞型特異性は、当技術分野でよく知られている方法、例えば本明細書に記載する免疫組織化学的染色法を使用して評価することができる。簡単に言うと、組織切片をパラフィンに包埋し、パラフィン切片を、その発現がプロモーターによって制御されるオリゴヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド産物に特異的な一次抗体と反応させる。パラフィン切片の代替として、サンプルを凍結切片化することができる。例えば、切片化の前および最中に切片を凍結させ、残留パラフィンにより起こり得る干渉を回避することができる。一次抗体に特異的な標識(例えば、ペルオキシダーゼ結合)二次抗体は(例えば、アビジン/ビオチンを用いた)切片化組織との結合、および顕微鏡検査による特異的結合の検出を可能にする。
用語「選択的発現」、「選択的に発現」、およびそれらの文法上同等な用語は、2箇所以上の対象領域における発現の相対的レベルの比較を指す。例えば「選択的発現」は、組織と関連付けて使用するとき、別組織中での同じ遺伝子の発現レベル、およびそれを発現する細胞数とそれぞれ比較した、特定組織における対象遺伝子の実質的に高い発現レベル、またはその組織内で遺伝子を発現する細胞の実質的に多い数を指す(すなわち、選択性は絶対的である必要はない)。選択的発現は、特定組織における対象遺伝子の発現および別組織中での同じ遺伝子の発現の完全不在を必要としないが、それらを含み得る。同様に、本明細書で細胞型を言及する際に使用する「選択的発現」は、別細胞型中での遺伝子の発現レベル、およびそれを発現する細胞数とそれぞれ比較したときの、特定細胞型における対象遺伝子の実質的に高い発現レベル、またはそれを発現する細胞の実質的に多い数を指す。
用語「隣接」は、2つ以上のヌクレオチド配列を言及する際に使用するとき、1つまたは複数の制御エレメントを含まない介在配列の不在下、またはそれらの存在下のいずれかで、ヌクレオチド配列がタンデムに連結した状態であることを意味する。
本明細書で使用する用語「核酸分子コード」、「ヌクレオチドコード」、「DNA配列コード」および「DNAコード」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序によって、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順序が決まる。したがってDNA配列はアミノ酸配列をコードする。
用語「単離」は、「単離オリゴヌクレオチド」など核酸に関して使用するとき、その元の供給源と通常結合した少なくとも1つの汚染物質核酸から分離した核酸配列を指す。単離核酸は、それが本来見られるのと異なる型または設定で存在する核酸である。対照的に、非単離核酸は、それらが本来存在する状態において見られるDNAおよびRNAなどの核酸である。例えば、所与のDNA配列(例えば遺伝子)は隣接遺伝子付近の宿主細胞染色体上に見られ、特異的タンパク質をコードする特異的mRNA配列などのRNA配列は、多数のタンパク質をコードする多くの他のmRNAとの混合物として細胞中に見られる。しかしながら、対象のポリペプチドをコードする単離核酸は、例えば対象のポリペプチドを通常発現する細胞中の核酸などを含み、この場合核酸は元の細胞のそれとは異なる染色体内もしくは染色体外位置に存在し、または他の場合は本来見られるのと異なる核酸配列に隣接する。単離核酸またはオリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖型で存在し得る。単離核酸は、(望む場合)様々な技法(例えば、ハイブリダイゼーション、ドットブロッティングなど)によって容易に確認することができる。単離核酸またはオリゴヌクレオチドを利用してタンパク質を発現させるとき、オリゴヌクレオチドはセンス鎖またはコード鎖を少なくとも含有し得る(すなわち、オリゴヌクレオチドは一本鎖であり得る)。あるいはオリゴヌクレオチドはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含有し得る(すなわち、オリゴヌクレオチドは二本鎖であり得る)。
本明細書で使用する用語「精製した」または「精製すること」は、サンプルからの1つまたは複数の(望ましくない)成分の除去を指す。例えば、細菌宿主細胞中で組換えポリペプチドを発現させる場合、宿主細胞タンパク質を除去し、それによってサンプル中の組換えポリペプチドの割合を高めることによりポリペプチドを精製する。
本明細書で使用する用語「実質的に精製された」は、それらの本来の環境から除去、単離または分離し、それらが本来結合していた他の成分を少なくとも60%含まない、幾つかの実施形態では75%含まない、および他の実施形態では90%含まない、核酸またはアミノ酸配列いずれかの分子を指す。したがって「単離ポリヌクレオチド」は実質的に精製されたポリヌクレオチドである。
本明細書で使用する用語「コード領域」は、構造遺伝子を言及する際に使用するとき、mRNA分子の翻訳の結果として発生期ポリペプチドにおいて見られるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物では、一般にイニシエーターメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ATG」により5’側、および停止コドンを指定する3トリプレット(すなわち、TAA、TAG、TGA)の1つにより3’側に存在する。
「コード配列」によって、転写および/または翻訳してmRNAおよび/またはポリペプチドまたはその断片を生成することができる、核酸の配列またはその相補配列、またはその一部分を意味する。コード配列は、ゲノムDNAまたは未熟一次RNA転写産物中で、細胞の生化学的機構により1つに接合して成熟mRNAとなるエクソンを含む。アンチセンス鎖はこのような核酸の相補鎖であり、コード配列はそこから推測することができる。
「非コード配列」によって、in vivoでアミノ酸に転写されない、またはtRNAが相互作用してアミノ酸を置換しないもしくは置換しようとしない場合の、核酸の配列またはその相補配列、またはその一部分を意味する。非コード配列は、ゲノムDNAまたは未熟一次RNA転写産物中のイントロン配列と、例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子関連配列の両方を含む。
本明細書で使用する用語「構造遺伝子」または「構造ヌクレオチド配列」は、他の遺伝子の発現を制御しないRNAまたはタンパク質をコードするDNA配列を指す。対照的に、「制御遺伝子」または「制御配列」は、他の遺伝子の発現を制御する産物(例えば、転写因子)をコードする構造遺伝子である。
本明細書で使用する用語「制御エレメント」は、核酸配列のある程度の発現態様を制御する遺伝子エレメントを指す。例えばプロモーターは、作動可能に連結したコード領域の転写の開始を容易にする制御エレメントである。他の制御エレメントには、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどがある。
本明細書で使用する用語「ペプチド転写因子結合部位」または「転写因子結合部位」は、タンパク質転写因子と結合し、それによって核酸配列のある程度の発現態様を制御するヌクレオチド配列を指す。例えば、Sp−1およびAP1(アクチベータータンパク質1)結合部位はペプチド転写因子結合部位の例である。
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、構造遺伝子のコード領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」は、遺伝子が完全長mRNAの長さに相当するように、5’末端と3’末端の両方でコード領域に隣接して位置する非翻訳配列も含み得る。コード領域の5’に位置しmRNA上に存在する配列は5’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の3’または下流に位置しmRNA上に存在する配列は3’非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」はcDNAとゲノム型両方の遺伝子を包含する。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で妨害されるコード領域を含有する。イントロンは異種核RNA(hnRNA)に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンはエンハンサーなどの制御エレメントを含有し得る。イントロンは核または一次転写産物から除去または「スプライシング除去」され、したがってイントロンはメッセンジャーRNA(mRNA)転写産物中には存在しない。mRNAは翻訳中に働いて、発生期ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を指定する。遺伝子は一般に、単一の遺伝子座である。通常の2倍体生物では、遺伝子は2個の対立遺伝子を有する。しかしながら、4倍体のジャガイモでは、それぞれの遺伝子は4個の対立遺伝子を有する。12倍体であるサトウキビでは、遺伝子あたり12個の対立遺伝子が存在し得る。特定の例は、それぞれ2個の対立遺伝子を有する2個のEPSPS遺伝子座を有するアマおよび2個の対立遺伝子を有する単一の単量体プラスチドACCaseを有するイネを含む。
イントロンを含有する以外に、ゲノム型の遺伝子は、RNA転写産物上に存在する配列の5’末端と3’末端の両方に位置する配列も含み得る。これらの配列は「隣接」配列または領域と呼ばれる(これらの隣接配列はmRNA転写産物上に存在する非翻訳配列に対して5’または3’に位置する)。5’隣接領域は、遺伝子の転写を制御するまたはそれに影響を与える、プロモーターおよびエンハンサーなどの制御配列を含有し得る。3’隣接領域は、転写の終結、転写後の切断およびポリアデニル化を誘導する配列を含有し得る。
「非ヒト動物」はヒトではない任意の動物を指し、例えばげっ歯動物、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ属、反芻動物、ウサギ目、ブタ、ヤギ、ウマ科、イヌ科、ネコ科、鳥類などの脊椎動物を含む。好ましい非ヒト動物はげっ歯動物目から選択される。さらに「非ヒト動物」は、両生類(例えばツメガエル属)、爬虫類、昆虫(例えばキイロショウジョウバエ属)、および他の非哺乳動物種を指す。
本明細書で使用する用語「トランスジェニック」は、植物または動物の体細胞および/または生殖系列細胞のいずれかのゲノムに組み込まれた状態で挿入された、別の生物由来のDNAを有する生物または細胞を指す。「導入遺伝子」は、それが見られる植物または動物と部分的もしくは完全に異種である(すなわち、本来存在しない)、または内在配列(すなわち、動物中に本来見られる配列)と相同であり植物または動物ゲノム中の本来存在する配列のそれと異なる位置に挿入されたDNA配列を意味する。1つまたは複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物または動物は本開示の範囲内にある。さらに、本明細書で使用する「トランスジェニック」は、本開示の方法によって、相同組換え、TFO突然変異によって、または類似の方法によって、1つまたは複数の遺伝子が修飾および/または「ノックアウトされた」(非機能的状態になったまたは低レベルでの機能状態になった、すなわち「ノックアウト」突然変異)生物を指す。例えば幾つかの実施形態では、トランスジェニック生物または細胞は、外来プロモーターおよび/またはコード領域を含む挿入DNAを含む。
「形質転換細胞」は、多世代にわたり細胞培養中に増殖する能力、軟寒天中で増殖する能力、および/または細胞間接触による細胞増殖を抑制しない能力を獲得した細胞または細胞系である。この点で形質転換は、細胞または生物への外来遺伝子物質の導入を指す。細胞中への核酸の首尾良い導入を可能にして導入核酸の発現をもたらす任意の周知の方法によって、形質転換を実施することができる。「形質転換」は、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションおよびリポフェクション(リポソーム仲介遺伝子導入)などの方法だけには限られないが、これらを含む。任意の発現ベクターを使用することにより、形質転換を実施することができる。例えば、昆虫細胞に外来核酸を導入するためのバキュロウイルスの使用が企図される。用語「形質転換」は、完全昆虫のPエレメント仲介生殖細胞系列形質転換などの方法も含む。さらに形質転換は、通常遺伝子突然変異により、自然に形質転換された細胞を指す。
本明細書で使用する「外因性」は、タンパク質をコードする遺伝子が通常細胞中で発現されないことを意味する。さらに「外因性」は、その遺伝子の正常(すなわち本来)レベルの発現を高めるために細胞にトランスフェクトされる遺伝子を指す。
ペプチド配列およびヌクレオチド配列は「内在」または「異種」(すなわち外来)であってよい。用語「内在」は、それが本来存在する配列に対して何らかの修飾を含有しない限り、それが導入される細胞中で本来見られる配列を指す。用語「異種」は、それが導入される細胞に内在しない配列を指す。例えば異種DNAは、それが本来連結していない、またはそれが本来と異なる位置で連結した核酸配列と連結した、または連結状態に操作したヌクレオチド配列を含む。異種DNAは、それが導入される細胞中で本来見られ本来存在する配列に対して何らかの修飾を含有するヌクレオチド配列も含む。一般に、必ずとは言えないが、異種DNAは、それが導入される細胞により通常生成されない異種RNAおよび異種タンパク質をコードする。異種DNAの例には、レポーター遺伝子、転写および翻訳制御配列、選択可能マーカータンパク質(例えば、薬剤耐性をもたらすタンパク質)をコードするDNA配列などがある。
構築物
本明細書で開示している核酸分子(例えば、部位特異的ヌクレアーゼ、またはCRISPRのガイドRNA)は、組換え核酸構築物の生成において使用することができる。一実施形態では、本開示の核酸分子を、核酸構築物、例えば、対象の植物、微生物、または動物における発現のための発現カセットの調製において使用することができる。例えば構築物が宿主ゲノム中に組み込まれない、またはそれが組み込まれた状態の場合はプロモーターによってもたらされる制御下で宿主のゲノム内の構築物の位置に維持されるとき、この発現は一過的である可能性がある。
発現カセットは、本明細書で開示している部位特異的ヌクレアーゼまたはガイドRNA配列と作動可能に連結した制御配列を含み得る。カセットは、生物に同時形質転換される少なくとも1つの別の遺伝子を別に含有し得る。あるいは、多数の発現カセットに別の遺伝子(複数可)を提供することができる。
制御領域の転写制御下にある部位特異的ヌクレアーゼコード配列の挿入用の複数の制限部位を有する、核酸構築物を提供することができる。核酸構築物は、選択可能マーカー遺伝子をコードする核酸分子を別に含有し得る。
任意のプロモーターを、核酸構築物の生成において使用することができる。プロモーターは、本明細書で開示している植物、微生物、または動物宿主核酸配列に固有もしくは類似、または外来もしくは異種であってよい。さらに、プロモーターは天然配列、または代替的に合成配列であってよい。プロモーターが「外来」または植物、微生物、または動物宿主と「異種」である場合、プロモーターはそれが導入される元の植物、微生物、または動物中で見られないと考えられる。本明細書で使用するキメラ遺伝子は、コード配列と異種である転写開始領域と作動可能に連結したコード配列を含む。
本明細書で開示している部位特異的ヌクレアーゼ配列は、異種プロモーターを使用して発現させることが可能である。
植物、微生物、または動物における発現のための構成的、組織優先的、誘導的発現をもたらすプロモーター、または他のプロモーターなどの任意のプロモーターを、部位特異的ヌクレアーゼ配列の発現を制御するための構築物の調製において使用することができる。構成的プロモーターは、例えばRsyn7プロモーターのコアプロモーターおよびWO99/43838と米国特許第6,072,050号中に開示された他の構成的プロモーター、コアCaMV35Sプロモーター(Odell et al.Nature313:810−812;1985)、イネアクチンプロモーター(McElroy et al.,Plant Cell2:163−171,1990)、ユビキチンプロモーター(Christensen et al.,Plant Mol.Biol.12:619−632,1989およびChristensen et al.,Plant Mol.Biol.18:675−689,1992)、pEMUプロモーター(Last et al.,Theor.Appl.Genet.81:581−588,1991)、MASプロモーター(Velten et al.,EMBOJ.3:2723−2730,1984)、ALSプロモーター(米国特許第5,659,026号)などを含む。他の構成的プロモーターには、例えば米国特許第5,608,149号、同第5,608,144号、同第5,604,121号、同第5,569,597号、同第5,466,785号、同第5,399,680号、同第5,268,463号、同第5,608,142号および同第6,177,611号のプロモーターを含む。
組織優先的プロモーターを利用して、特定植物組織内の部位特異的ヌクレアーゼの発現を誘導することができる。このような組織優先的プロモーターには、葉優先的プロモーター、根優先的プロモーター、種子優先的プロモーター、および茎優先的プロモーターがあるが、これらだけには限られない。組織優先的プロモーターには、Yamamoto et al.,Plant J.12(2):255−265,1997;Kawamataet et al.,Plant Cell Physiol.38(7):792−803,1997;Hansen et al.,Mol.Gen Genet.254(3):337−343,1997;Russell et al.,Transgenic Res.6(2):157−168,1997;Rinehart et al.,Plant Physiol.112(3):1331−1341,1996;Van Camp et al.,Plant Physiol.112(2):525−535,1996;Canevascini et al.,Plant Physiol.112(2):513−524,1996;Yamamoto et al.,Plant Cell Physiol.35(5):773−778,1994;Lam,Results Probl.Cell Differ.20:181−196,1994;Orozco et al.Plant Mol Biol.23(6):1129−1138,1993;Matsuoka et al.,Proc Nat’l.Acad.Sci.USA90(20):9586−9590,1993およびGuevara−Garcia et al.,Plant J.4(3):495−505,1993のプロモーターがある。
核酸構築物は転写終結領域も含み得る。転写終結領域を使用する場合、任意の終結領域を核酸構築物の調製において使用することができる。例えば、終結領域は別の供給源(すなわち、外来またはプロモーターと異種)に由来する可能性がある。本開示の構築物中での使用に利用することができる終結領域の例には、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域などの、エーツメファシエンス(A.tumefaciens)のTi−プラスミド由来の終結領域がある。Guerineau et al.,Mol.Gen.Genet.262:141−144,1991;Proudfoot,Cell64:671−674,1991;Sanfacon et al.,Genes Dev.5:141−149,1991;Mogen et al.,Plant Cell2:1261−1272,1990;Munroe et al.,Gene91:151−158,1990;Ballas et al.,Nucleic Acids Res.17:7891−7903,1989;およびJoshi et al.,Nucleic Acids Res.15:9627−9639,1987も参照。
本明細書で開示している任意の態様、実施形態、方法および/または組成物に関して、形質転換植物中での発現を高めるために核酸を最適化することができる。すなわち、部位特異的ヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸を、発現改善用の植物優先的コドンを使用して合成することができる。例えば、宿主優先的コドン使用頻度の考察に関する、Campbell and Gowri,(Plant Physiol.92:1−11,1990)を参照。植物優先的遺伝子の合成に関する当技術分野の方法が利用可能である。例えば、米国特許第5,380,831号、および米国特許第5,436,391号、およびMurray et al.,Nucleic Acids Res.17:477−498,1989を参照。例えば、Lanza et al.,BMC Systems Biology 8:33−43,2014;Burgess−Brown et al.,Protein Expr. Purif.59:94−102,2008;Gustafsson et al.,Trends Biotechnol 22:346−353,2004も参照されたい。
さらに、他の配列修飾を本明細書で開示している核酸に施すことができる。例えば、細胞宿主における遺伝子発現を高めるための、別の配列修飾が知られている。これらは、擬似ポリアデニル化シグナル、エクソン/イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復単位をコードする配列、および遺伝子発現に有害であり得る他のこのような十分特徴付けられた配列の排除を含む。配列のG−C含有量は、宿主細胞中で発現される周知の遺伝子を参照することにより計算した、標的細胞宿主の平均レベルに調節することもできる。さらに、配列を修飾して予想ヘアピン二次mRNA構造を回避することができる。
他の核酸配列を本開示の構築物の調製において使用して、例えば部位特異的ヌクレアーゼコード配列の発現を高めることもできる。このような核酸配列には、メイズAdhI、イントロン1遺伝子のイントロン(Callis et al.,Genes and Development1:1183−1200,1987)、ならびにタバコモザイクウイルス(TMV)、メイズ萎黄病ウイルスおよびアルファルファモザイクウイルス由来のリーダー配列(W−配列)がある(Gallie et al.,Nucleic Acids Res.15:8693−8711,1987およびSkuzeski et al.,Plant Mol.Biol.15:65−79,1990)。メイズの収縮1型遺伝子座由来の第1のイントロンは、キメラ遺伝子構築物における遺伝子の発現を高めることが示されている。米国特許第5,424,412号および米国特許第5,593,874号は遺伝子発現構築物における特異的イントロンの使用を開示しており、Gallie et al.(Plant Physiol.106:929−939,1994)は、イントロンが組織特異的偏位で遺伝子発現を制御するのに有用であることも示している。部位特異的ヌクレアーゼ遺伝子発現をさらに高めるまたは最適化するため、本明細書で開示している植物用発現ベクターは、マトリックス結合領域(MAR)を含有するDNA配列も含有することができる。したがって、このような修飾発現系で形質転換した植物細胞は、本開示のヌクレオチド配列の過剰発現または構成的発現を示す可能性がある。
本明細書で開示している発現構築物は、葉緑体または原核生物と真核生物の両方における他のオルガネラおよび構造物に対する部位特異的ヌクレアーゼ配列の発現を誘導することができる核酸配列も含み得る。このような核酸配列には、植物細胞葉緑体に対象遺伝子産物を誘導する葉緑体輸送ペプチドをコードする葉緑体標的配列がある。このような輸送ペプチドは当技術分野で知られている。葉緑体標的配列に関して、「作動可能に連結した」は、輸送ペプチドをコードする核酸配列(すなわち、葉緑体標的配列)が、2配列が隣接し同じリーディングフレームに存在するように、本明細書で開示している部位特異的ヌクレアーゼ核酸分子と連結していることを意味する。例えば、Von Heijne et al.,Plant Mol.Biol.Rep.9:104−126,1991;Clark et al.,J.Biol.Chem.264:17544−17550,1989;Della−Cioppa et al.,Plant Physiol.84:965−968,1987;Romer et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414−1421,1993およびShah et al.,Science233:478−481,1986を参照。
葉緑体標的配列は当技術分野でよく知られており、リブロース−1,5−ビスリン酸カルボキシラーゼ(Rubisco)(de Castro Silva Filho et al.,Plant Mol.Biol.30:769−780,1996;Schnell et al.,J.Biol.Chem.266(5):3335−3342,1991)、5−(エノールピルビル)シキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)(Archer et al.,J.Bioenerg.Biomemb.22(6):789−810,1990)、トリプトファンシンターゼ(Zhao et al.,J.Biol.Chem.270(11):6081−6087,1995)、プラストシアニン(Lawrence et al.,J.Biol.Chem.272(33):20357−20363,1997)、コリスミ酸シンターゼ(Schmidt et al.,J.Biol.Chem.268(36):27447−27457,1993)、および光吸収性クロロフィルa/b結合タンパク質(LHBP)(Lamppa et al.,J.Biol.Chem.263:14996−14999,1988)の葉緑体小サブユニットを含む。Von Heijne et al.,Plant Mol.Biol.Rep.9:104−126,1991;Clark et al.,J.Biol.Chem.264:17544−17550,1989;Della−Cioppa et al.,Plant Ohysiol.84:965−968,1987;Romer et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414−1421,1993およびShah et al.,Science233:478−481,1986も参照。
本明細書で開示している任意の態様、実施形態、方法および/または組成物に関して、核酸構築物を調製して、植物細胞葉緑体由来の突然変異部位特異的ヌクレアーゼコード配列の発現を誘導することができる。葉緑体を形質転換するための方法は当技術分野で知られている。例えば、Svab et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA87:8526−8530,1990;Svab and Maliga,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90:913−917,1993;Svab and Maliga,EMBOJ.12:601−606,1993を参照。この方法は、選択可能マーカーを含有するDNAのパーティクルガン送達法、および相同組換えによるプラスチドゲノムへのDNAの標的化を利用する。さらに、核コードおよびプラスチド対象RNAポリメラーゼの組織優先的発現によるサイレントプラスチド媒介導入遺伝子のトランス作用によって、プラスチド形質転換を実施することができる。このようなシステムはMcBride et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA91:7301−7305,1994中で報告されている。
葉緑体を標的化する対象の核酸を、植物の核とこのオルガネラの間のコドン使用頻度の違いを考慮して、葉緑体での発現用に最適化することができる。このようにして、葉緑体優先的コドンを使用して対象の核酸を合成することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5,380,831号を参照。
核酸構築物を使用して植物細胞を形質転換し、部位特異的ヌクレアーゼコード配列を含むトランスジェニック植物を再生することができる。植物形質転換用の多数の植物形質転換ベクターおよび方法が利用可能である。例えば、米国特許第6,753,458号、An,G.et al.,Plant Physiol.,81:301−305,1986;Fry,J.et al.,Plant Cell Rep.6:321−325,1987;Block,M.,Theor.Appl Genet.76:767−774,1988;Hinchee et al.,Stadler.Genet.Symp.203212.203−212,1990;Cousins et al.,Aust.J.Plant Physiol.18:481−494,1991;Chee,P.P.and Slightom,J.L.,Gene.118:255−260,1992;Christou et al.,Trends.Biotechnol.10:239−246,1992;D’Halluin et al.,Bio/Technol.10:309−314,1992;Dhiret et al.,Plant Physiol.99:81−88,1992;Casas et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90:11212−11216,1993;Christou,P.,In Vitro Cell.Dev.Biol.−Plant29P:119−124,1993;Davies,et al.,Plant Cell Rep.12:180−183,1993;Dong,J.A.and Mc Hughen,A.,Plant Sci91:139−148,1993;Franklin,C.I.and Trieu,T.N.,Plant Physiol.102:167,1993;Golovkin et al.,Plant Sci.90:41−52,1993;Guo Chin Sci.Bull.38:2072−2078;Asano et al.,Plant Cell Rep.13,1994;Ayeres N.M.and Park,W.D.,Crit.Rev.Plant.Sci.13:219−239,1994;Barcelo et al.,Plant.J.5:583−592,1994;Becker et al.,Plant.J.5:299−307,1994;Borkowska et al.,Acta.Physiol Plant。16:225−230,1994;Christou,P.,Agro.Food.Ind.Hi Tech.5:17−27,1994;Eapen et al.,Plant Cell Rep.13:582−586,1994;Hartman et al.,Bio−Technology12:919923,1994;Ritala et al.,Plant.Mol.Biol.24:317−325,1994およびWan,Y.C.and Lemaux,P.G.,Plant Physiol.104:3748,1994を参照。相同組換えを使用して、構築物を植物細胞に形質転換することもできる。
用語「野生型」は、ペプチド配列およびヌクレオチド配列を言及するとき、本来存在する供給源から単離したときのペプチド配列およびヌクレオチド配列の特徴を有する、ペプチド配列およびヌクレオチド配列(遺伝子座/遺伝子/対立遺伝子)をそれぞれ指す。野生型ペプチド配列およびヌクレオチド配列は集団内で最も頻繁に観察される配列であり、したがって任意でそれぞれ「正常」または「野生型」形のペプチド配列およびヌクレオチド配列と示される。「野生型」は、1つまたは複数の特異的ヌクレオチド位置における配列、または1つまたは複数の特定コドン位置における配列、または1つまたは複数の特定アミノ酸位置における配列を指すこともできる。
「コンセンサス配列」は、同一アミノ酸もしくはヌクレオチドまたは少なくとも25%の配列に関して機能上同等なアミノ酸もしくはヌクレオチドを含有する、アミノ酸またはヌクレオチドの配列として定義する。同一または機能上同等なアミノ酸またはヌクレオチドが隣接している必要はない。
本明細書で使用する用語「アブラナ」はアブラナ属の植物を指す。例示的なアブラナ種には、ビーカリナタ(B.carinata)、ビーエロンゲート(B.elongate)、ビーフルチクローサ(B.fruticulosa)、ビージュンセア(B.juncea)、ビーナプス(B.napus)、ビーナリノーサ(B.narinosa)、ビーニグラ(B.nigra)、ビーオレラセア(B.oleracea)、ビーペリビリディス(B.perviridis)、ビーレーパ(B.rapa)(合成ビーカムペストリス(synB.campestris))、ビールペストリス(B.rupestris)、ビーセプティセプス(B.septiceps)、およびビートウルネフォルティ(B.tournefortii)があるが、これらだけには限られない。
核酸塩基は、特定の好ましい実施形態においてプリン、ピリミジン、またはそれらの誘導体もしくはアナログである塩基である。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル成分を含有する核酸塩基、例えば場合によっては置換されたリボシドまたは2’−デオキシリボシドである。ヌクレオシドは数個の連結成分の1つによって連結することができ、それは亜リン酸を含有し得るかまたは含有し得ない。非置換ホスホジエステル結合によって結合したヌクレオシドはヌクレオチドと呼ばれる。本明細書で使用する用語「核酸塩基」は、ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニット、およびモルホリン核酸塩基、ならびにヌクレオシドとヌクレオチドを含む。
オリゴ核酸塩基は核酸塩基を含むポリマーであり、幾つかの実施形態では、その少なくとも一部分は相補配列を有するDNAとワトソン−クリック塩基対形成によりハイブリダイズ可能である。オリゴ核酸塩基鎖は、ポリマーの末端核酸塩基である一本鎖5’末端と3’末端を有し得る。特定オリゴ核酸塩基鎖は全タイプの核酸塩基を含有することができる。オリゴ核酸塩基化合物は、相補的でありワトソン−クリック塩基対形成によりハイブリダイズ可能である1つまたは複数のオリゴ核酸塩基鎖を含む化合物である。リボ型核酸塩基は、2’炭素がヒドロキシ、アルキルオキシまたはハロゲンで置換されたメチレンであるペントースフラノシル含有核酸塩基を含む。デオキシリボ型核酸塩基はリボ型核酸塩基以外の核酸塩基であり、ペントースフラノシル成分を含有しない全ての核酸塩基を含む。
特定の実施形態では、オリゴ核酸塩基鎖部分は、オリゴ核酸塩基鎖とオリゴ核酸塩基鎖のセグメントまたは領域の両方を含み得る。オリゴ核酸塩基鎖部分は3’末端と5’末端を有することができ、オリゴ核酸塩基鎖部分が鎖と共に延長するとき、鎖部分の3’末端と5’末端は鎖の3’末端と5’末端でもある。
本明細書で使用する用語「コドン」は、タンパク質合成中のポリペプチド鎖における指定アミノ酸の挿入またはタンパク質合成を停止させるためのシグナルを決定する遺伝子コードを構成する、3個の隣接ヌクレオチドの配列(RNAまたはDNAのいずれか)を指す。用語「コドン」は、元のDNAが転写されるメッセンジャーRNAにおける3ヌクレオチドの対応(および相補)配列を指すためにも使用する。
本明細書で使用する用語「相同性」は、タンパク質とDNAの間の配列類似性を指す。用語「相同性」または「相同的」は同一性の程度を指す。部分的相同性または完全相同性が存在し得る。部分的に相同的な配列は、別の配列と比較したとき100%未満の配列同一性を有する配列である。
「ヘテロ接合型」は、相同染色体セグメントにおける1つまたは複数の遺伝子座に異なる対立遺伝子を有することを指す。本明細書で使用する「ヘテロ接合型」は、1つまたは複数の遺伝子座に異なる対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞、細胞集団または生物も指すことができる。ヘテロ接合型サンプルを、例えば核酸配列決定などの、当技術分野で知られている方法によって決定することもできる。例えば、配列決定エレクトロフェログラムが1つの遺伝子座で2つのピークを示し、2つのピークがほぼ同じサイズである場合、サンプルはヘテロ接合型として特徴付けることができる。または、1つのピークが他方より小さいが、大きなピークの少なくとも約25%のサイズである場合、サンプルはヘテロ接合型として特徴付けることができる。幾つかの実施形態では、小さなピークは大きなピークの少なくとも約15%である。他の実施形態では、小さなピークは大きなピークの少なくとも約10%である。他の実施形態では、小さなピークは大きなピークの少なくとも約5%である。他の実施形態では、最小量の小さなピークが検出される。
本明細書で使用する「ホモ接合型」は、相同染色体セグメントにおける1つまたは複数の遺伝子座に同一対立遺伝子を有することを指す。「ホモ接合型」は、1つまたは複数の遺伝子座に同じ対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞、細胞集団または生物も指すことができる。ホモ接合型サンプルを、例えば核酸配列決定などの、当技術分野で知られている方法によって決定することができる。例えば、配列決定エレクトロフェログラムが特定遺伝子座で1つのピークを示す場合、サンプルはその遺伝子座に関して「ホモ接合型」と呼ぶことができる。
用語「ヘミ接合型」は、第2の対立遺伝子が欠失しているか、または相同染色体セグメント上に存在しないため、細胞または生物の遺伝子型に一回のみ存在する、遺伝子または遺伝子セグメントを指す。本明細書で使用する「ヘミ接合型」は、遺伝子型に一回のみ存在する、1つまたは複数の遺伝子座における対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞、細胞集団または生物も指すことができる。
本明細書で使用する用語「接合状態」は、サンプル、細胞集団、または生物が、当技術分野で知られており本明細書に記載する試験法により決定される、ヘテロ接合型、ホモ接合型、またはヘミ接合型と考えられることを指す。用語「核酸の接合状態」は、核酸の供給源がヘテロ接合型、ホモ接合型、またはヘミ接合型と考えられるかどうかの決定を意味する。「接合状態」は配列中の1ヌクレオチド位置における違いを指すことができる。幾つかの方法では、一突然変異に関するサンプルの接合状態を、ホモ接合野生型、ヘテロ接合型(すなわち、1つの野生型対立遺伝子と1つの突然変異対立遺伝子)、ホモ接合突然変異型、またはヘミ接合型(すなわち、野生型もしくは突然変異対立遺伝子いずれかの1コピー)として分類することができる。
本明細書で使用する用語「RTDS」は、Cibusによって開発されたThe Rapid Trait Development System(商標)(RTDS)を指す。RTDSは、外来遺伝子または対照配列の取り込み無しで遺伝子配列に正確な改変を施す際に有効である、部位特異的遺伝子修飾システムである。
本明細書で使用する用語「約」は、プラスマイナス10%の量を表す用語である。例えば「約3%」は2.7〜3.3%を包含し、「約10%」は9〜11%を包含する。さらに、数量と共に「約」を本明細書で使用する場合、その値のプラスまたはマイナス10%だけでなく、その数量の正確な値も企図および記載されることが理解される。例えば、用語「約3%」は、正確に3%を明示的に企図する、記載する、および含む。
RTDSおよび修復オリゴヌクレオチド(GRON)
本開示は一般に、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列中の特定位置に対する、修飾の標的化の効率を改善するための新規な方法に関する。さらに本開示は、本明細書で開示している手法により修飾、突然変異または顕在化された標的DNAに関する。本開示はさらに、本開示の方法によって修飾された細胞、組織、および生物に関する。本開示は、成功した変換システム、the Rapid Trait Development System(RTDS(商標)、Cibus US LLC)と部分的に関連する組成物および方法の開発に基づく。
RTDSは、細胞独自の遺伝子修復システムを利用し、外来DNAおよび遺伝子発現制御配列を挿入せずにin situで遺伝子配列を特異的に修飾することによる、標的遺伝子の改変に基づく。この手順は遺伝子配列の正確な改変に影響を与え、一方でゲノムの残り部分は不変状態である。従来のトランスジェニックGMOと対照的に、外来遺伝子物質の組み込みがなく、如何なる外来遺伝子物質も植物中に残っていない。RTDSによって導入される遺伝子配列の改変はランダムに挿入されない。影響を受ける遺伝子はその元の位置に留まるので、ランダム、制御不能または有害なパターンの発現は起こらない。
この改変に影響を与えるRTDSは、DNAと修飾RNA塩基の両方、ならびに他の化学成分で構成され得る、本明細書で記載されるような化学的に合成されたオリゴヌクレオチド(GRON)であり、標的遺伝子位置でハイブリダイズしてミスマッチ塩基対(複数可)を形成するよう設計されている。このミスマッチ塩基対は細胞独自の天然遺伝子修復システムをその部位に向けるシグナルとして働き、遺伝子内の指定ヌクレオチド(複数可)を補正する(置換、挿入または欠失)。補正プロセスが終了した後、RTDS分子は分解され、現在修飾または修復中の遺伝子は、その遺伝子の通常の内在制御機構の下で発現される。
本明細書で開示している方法および組成物は、本明細書および以下で詳細に記載する立体配座および化学的性質を有する「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」(GRON)を用いて実施または作製することができる。本明細書で企図する「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」は、「組換え可能オリゴ核酸塩基」、「RNA/DNAキメラオリゴヌクレオチド」、「キメラオリゴヌクレオチド」、「混合型二本鎖オリゴヌクレオチド」(MDON)、「RNADNAオリゴヌクレオチド(RDO)」、「遺伝子標的化オリゴヌクレオチド」、「ゲノプラスト」、「一本鎖修飾オリゴヌクレオチド」、「一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドミューテーターベクター」(SSOMV)、「二本鎖突然変異ベクター」、および「ヘテロ二本鎖突然変異ベクター」を含めた他の名称を使用して、刊行済みの科学誌および特許文献中にも記載されている。遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、マイクロキャリア(バイオリスティックデリバリー)、マイクロファイバー、ポリエチレングリコール(PEG)仲介取り込み、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションだけには限られないが、これらを含めた、当技術分野で一般に使用される任意の方法を使用して植物細胞に導入することができる。
一実施形態において、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、2’−ヒドロキシルとフルオロ、クロロもしくはブロモ官能基の置換または2’−O上の置換基の配置によって混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのRNA型ヌクレオチドがRNase耐性になった、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド(MDON)である。適切な置換基はKmiecIIによって教示された置換基を含む。別の置換基には、米国特許第5,334,711号(Sproat)によって教示された置換基と特許公開EP629387およびEP679657(まとめて、Martin Applications)によって教示された置換基があり、これらは参照により本明細書に組み込まれている。本明細書で使用する、リボヌクレオチドの2’−フルオロ、クロロもしくはブロモ誘導体、またはMartin ApplicationsもしくはSproat中に記載された置換基で置換されたT−OHを有するリボヌクレオチドは「T−置換リボヌクレオチド」と呼ばれる。本明細書で使用する用語「RNA型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエステル結合またはKmiecIもしくはKmiecIIによって教示された任意の非天然結合によって混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドと結合した、T−ヒドロキシルまたは2’−置換ヌクレオチドを意味する。本明細書で使用する用語「デオキシリボ型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエステル結合またはKmiecIもしくはKmiecIIによって教示された任意の非天然結合によって遺伝子修復オリゴ核酸塩基の他のヌクレオチドと結合することができる、T−Hを有するヌクレオチドを意味する。
本開示の特定の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、非置換ホスホジエステル結合によってのみ結合した混合型二本鎖オリゴヌクレオチド(MDON)である。代替実施形態では、結合は置換ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、およびKmiecIIによって教示された非亜リン酸系結合による結合である。さらに別の実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド中の各RNA型ヌクレオチドは2’−置換ヌクレオチドである。2’−置換リボヌクレオチドの特に好ましい実施形態は、2’−フルオロ、T−メトキシ、2’−プロピルオキシ、2’−アリルオキシ、2’−ヒドロキシルエチルオキシ、2’−メトキシエチルオキシ、T−フルオロプロピルオキシおよび2’−トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドである。2’−置換リボヌクレオチドのより好ましい実施形態は、2’−フルオロ、2’−メトキシ、2’−メトキシエチルオキシ、および2’−アリルオキシ置換ヌクレオチドである。別の実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドは非置換ホスホジエステル結合によって結合している。
1型の2’−置換RNA型ヌクレオチドのみを有する混合型二本鎖オリゴヌクレオチド(MDON)はより好都合に合成されるが、本開示の方法は、2型以上のRNA型ヌクレオチドを有する混合型二本鎖オリゴヌクレオチドで実施することができる。RNAセグメントの機能が、2つのRNA型トリヌクレオチド間へのデオキシヌクレオチドの導入により引き起こされる介入によって影響を受ける可能性はなく、したがって用語RNAセグメントは「介入RNAセグメント」などの用語を包含する。非介入RNAセグメントは隣接RNAセグメントと呼ばれる。代替実施形態では、RNAセグメントは改変RNase耐性および非置換2’−OHヌクレオチドを含有し得る。混合型二本鎖オリゴヌクレオチドは、幾つかの実施形態では100個より少ないヌクレオチド、および他の実施形態では85個より少ないヌクレオチド、ただし50個を超えるヌクレオチドを有する。第1の鎖部分と第2の鎖部分はワトソン−クリックの法則に従い塩基対形成する。一実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの鎖部分は、第1の鎖部分と第2の鎖部分が1つの3’末端と1つの5’末端を有する一本のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントであるように、一本鎖ヘキサ、ペンタまたはテトラヌクレオチドなどのリンカーによって共有結合する。3’末端と5’末端は「ヘアピンキャップ」の付加によって保護することができ、これにより3’末端と5’末端ヌクレオチドはワトソン−クリックの法則に従い隣接ヌクレオチドと塩基対形成する。さらに第2のヘアピンキャップを、第1の鎖部分と第2の鎖部分の間のワトソン−クリックの法則に従う塩基対形成が安定するように、3’末端と5’末端から離れた第1の鎖部分と第2の鎖部分の間の接合部に置くことができる。
第1の鎖部分と第2の鎖部分は、標的遺伝子/対立遺伝子の2セグメントと相同的である2領域を含有する、すなわち標的遺伝子/対立遺伝子と同じ配列を有する。相同領域はRNAセグメントのヌクレオチドを含有し、結合DNAセグメントの1つまたは複数のDNA型ヌクレオチドを含有する可能性があり、介在DNAセグメント内に存在しないDNA型ヌクレオチドを含有する可能性もある。2つの相同領域は、「異種領域」と呼ばれる標的遺伝子の配列と異なる配列を有する領域によって隔てられ、それぞれ隣接している。異種領域は1、2または3個のミスマッチヌクレオチドを含有し得る。ミスマッチヌクレオチドは隣接する可能性があり、または代替的に、標的遺伝子/対立遺伝子と相同的である1個または2個のヌクレオチドによって隔てられる可能性がある。あるいは異種領域は、挿入物、または1、2、3もしくは5個以下のヌクレオチドも含有し得る。あるいは、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド由来の1、2、3もしくは5個以下のヌクレオチドの欠失のみ標的遺伝子/対立遺伝子の配列と異なる可能性がある。異種領域の長さと位置は、この場合、異種領域内に混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが存在しないが、欠失部分の長さであると考えられる。2つの相同領域と相補的である標的遺伝子の断片間の距離は、1つまたは複数の置換が考えられる異種領域の長さと同一である。異種領域が挿入物を含有する場合、相同領域は、遺伝子/対立遺伝子中のそれらの相補相同断片より遠く混合型二本鎖オリゴヌクレオチド中でそれによって隔てられており、異種領域が欠失をコードするときは逆のことが当てはまる。
混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのRNAセグメントは、それぞれ相同領域、すなわち標的遺伝子の断片と配列が同一である領域の一部分であり、これらのセグメントは、幾つかの実施形態では少なくとも13のRNA型ヌクレオチド、および幾つかの実施形態では16〜25のRNA型ヌクレオチド、またはさらに他の実施形態では18〜22のRNA型ヌクレオチド、または幾つかの実施形態では20のヌクレオチドを全体として含有する。一実施形態では、相同領域のRNAセグメントは隔てられ、介在DNAセグメントと隣接、すなわち「結合」している。一実施形態では、異種領域のそれぞれのヌクレオチドは介在DNAセグメントのヌクレオチドである。混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの異種領域を含有する介在DNAセグメントは、「ミューテーターセグメント」と呼ばれる。
本開示の別の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基(GRON)は、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願PCT/USOO/23457、米国特許第6,271,360号、同第6,479,292号、および同第7,060,500号中に開示されているような、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドミューテーターベクター(SSOMV)である。SSOMVの配列は、米国特許第5,756,325号、同第5,871,984号、同第5,760,012号、同第5,888,983号、同第5,795,972号、同第5,780,296号、同第5,945,339号、同第6,004,804号、および同第6,010,907号中、ならびに国際公開Nos.WO98/49350、WO99/07865、WO99/58723、WO99/58702、およびWO99/40789中に記載されたミューテーターベクターと同じ原理に基づく。SSOMVの配列は、ミューテーター領域と呼ばれる所望の遺伝子改変を含有する領域によって隔てられた、標的配列と相同的である2領域を含有する。ミューテーター領域は、標的配列中の相同領域を隔てる配列と同じ長さであるが、異なる配列を有する配列を有し得る。このようなミューテーター領域は置換を引き起こす可能性がある。あるいは、SSOMV中の相同領域は互いに隣接している可能性があり、一方同じ配列を有する標的遺伝子中の領域は1個、2個以上のヌクレオチドにより隔てられている。このようなSSOMVは、SSOMVが不在のヌクレオチドの標的遺伝子からの欠失を引き起こす。最後に、相同領域と同一である標的遺伝子の配列は標的遺伝子中では隣接しているが、SSOMVの配列中では1個、2個以上のヌクレオチドにより隔てられている可能性がある。このようなSSOMVは標的遺伝子の配列における挿入を引き起こす。特定の実施形態では、SSOMVはそれ自体にアニーリングしない。
SSOMVのヌクレオチドは、非修飾ホスホジエステル結合によって結合したデオキシリボヌクレオチドであるが、ただし1つの3’末端および/または5’末端ヌクレオチド間結合、または代替的に2つの3’末端および/または5’末端ヌクレオチド間結合がホスホロチオエートまたはホスホアミデートであり得る。本明細書で使用するヌクレオチド間結合は、SSOMVのヌクレオチドの間の結合であり、3’末端ヌクレオチドまたは5’末端ヌクレオチドとブロッキング置換基の間の結合は含まない。具体的実施形態では、SSOMVの長さは21〜55デオキシヌクレオチドであり、したがって相同領域の長さは全長少なくとも20デオキシヌクレオチドであり、少なくとも2つの相同領域は少なくとも8デオキシヌクレオチドの長さをそれぞれ有するはずである。
標的遺伝子のコード鎖または非コード鎖のいずれかと相補的であるように、SSOMVを設計することができる。所望の突然変異が一塩基の置換であるとき、ミューテーターヌクレオチドと標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。所望の機能的結果の獲得と一致する範囲で、相補鎖中のミューテーターヌクレオチドと標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。特に好ましいのは、トランスバージョン突然変異をコードする、すなわちそれぞれ相補鎖中のCまたはTヌクレオチドとCまたはTミューテーターヌクレオチドがミスマッチである、SSOMVである。
岡崎フラグメント/2’−OME GRONの設計。様々な実施形態において、GRONはRNAとDNAの両方のヌクレオチドならびに/または他の型の核酸塩基を有してもよい。幾つかの実施形態では、DNAまたはRNAヌクレオチドのうちの1つまたは複数が修飾を含む。特定の実施形態では、最初の5’ヌクレオチドはRNAヌクレオチドであり、残りのヌクレオチドはDNAである。さらなる実施形態では、最初の5’RNAヌクレオチドは2−O−Meで修飾される。他の実施形態では、最初の2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の5’ヌクレオチドはRNAヌクレオチドであり、残りのヌクレオチドはDNAである。さらなる実施形態では、最初の2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の5’RNAヌクレオチドのうちの1つまたは複数は、2−O−Meで修飾される。植物細胞においては、DNA中での二本鎖切断は、典型的には、NHEJ DNA修復経路によって修復される。この経路は、DNAを修復するための鋳型を必要とせず、したがって誤りがちである。植物細胞に関してDNAを修復するためにこの経路を使用する利点は、それが迅速であり、遍在的であり、最も重要なことには、細胞がDNA複製を受けていない時に起こり得るということである。植物細胞における複製フォークの外側の二本鎖切断を修復する際に機能する別のDNA修復経路は、相同組換え(HR)と呼ばれる;しかしながら、NHEJ経路と違って、この型の修復は正確であり、DNA鋳型(GRON)の使用を必要とする。これらのGRONは標的遺伝子のDNA複製フォークにおいて岡崎フラグメントを模倣するため、二本鎖DNA切断剤と共にそれらを使用することは、当業者には自明ではない。
効率の改善
本開示は、修復オリゴヌクレオチドを使用する、標的遺伝子の転換の有効性を高めるための幾つかの手法を提供し、それらは単独でまたは互いに組み合せて使用することができる。これらは以下を含む:
1.標的(ミスマッチ)部位にDNA修復機構を向ける修復オリゴヌクレオチドに対する修飾の導入。
A.オリゴヌクレオチド(例えば、10塩基以内、および幾つかの実施形態では所望ミスマッチ部位の5塩基)における1つまたは複数の無塩基部位の導入により塩基切除修復(BER)中の中間体である損傷が生じ、それによってBER機構を修復オリゴヌクレオチドによる転換標的の部位近辺に向ける。dスペーサー(無塩基フラン)修飾オリゴヌクレオチドは、例えばTakeshita et al.,J.Biol.Chem.,262:10171−79,1987中に記載されたように調製することができる。
B.オリゴヌクレオチド中へのまたはオリゴヌクレオチドと一緒のいずれかの、一本鎖または二本鎖切断を誘導する化合物の封入によって、NHEJ、マイクロホモロジー仲介末端結合(MMEJ)、および相同組換えにより修復される損傷が生じる。例えば、ブレオマイシンファミリーの抗生物質、ジンクフィンガー、FokI(または任意のIIS型クラスの制限酵素)および他のヌクレアーゼを修復オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端に共有結合させて、修復オリゴヌクレオチドによる転換標的の部位近辺に二本鎖切断を導入することが可能である。ブレオマイシンファミリーの抗生物質は、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよびその他を含めたDNA切断糖ペプチドである。
C.オリゴヌクレオチド(例えば、10塩基以内、および幾つかの実施形態では所望ミスマッチ部位の5塩基)に取り込まれる1つまたは複数の8’オキソdAまたはdGの導入によって、反応性酸素種によって生成する損傷と類似した損傷が生じる。これらの損傷はいわゆる「助長型修復」系を誘導する。例えば、Kim et al.,J.Biochem.Mol.Biol.37:657−62,2004を参照。
2.修復オリゴヌクレオチドの安定性の増大:
修復オリゴヌクレオチド上に3’ブロッキング末端を作製するためのオリゴヌクレオチドの3’末端における逆向き塩基(idC)の導入。
修復オリゴヌクレオチドの5’および/または3’末端における、ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる1つまたは複数の2’O−メチルヌクレオチドまたは塩基の導入(例えば、WO2007/073149参照)。
修復オリゴヌクレオチドの5’末端における1つまたは複数の2’O−メチルRNAヌクレオチドの導入、所望のミスマッチ部位をもたらすDNA塩基が生じ、それによって岡崎フラグメント様核酸構造を生成する。
アクリジン、ソラレン、臭化エチジウムおよびサイバー染色液などの結合(5’または3’)挿入色素。
T/Aクランプ、コレステロール成分、SIMA(HEX)、リボCおよびアミダイトなどの5’末端キャップの導入。
ホスホチオエート、2’O−メチル、メチルホスホネート、ロックド核酸(LNA)、(MOE)(メトキシエチル)、ジPSおよびペプチド核酸(PNA)などの骨格修飾。
例えばシスプラチンおよびマイトマイシンCなどの鎖間架橋試薬物質による、修復オリゴヌクレオチドの架橋。
Cy3、DY547、Cy3.5、Cy3B、Cy5およびDY647などの蛍光色素との結合。
3.ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる塩基の取り込みによる、修復オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションエネルギーの増大(例えば、WO2007/073149参照)。
4.合成用の構成単位としてヌクレオチドマルチマー(ジマー、トリマー、テトラマーなど)を使用することによる、修復オリゴヌクレオチド合成の質の向上。これによって、より少ないカップリングステップ、および構成単位からの完全長産物の容易な分離をもたらす。
5.長鎖修復オリゴヌクレオチド(すなわち、例えば、1個もしくは複数の突然変異または修復オリゴヌクレオチド中で標的化された2個以上の突然変異を有する、例えば、本明細書に記載の長さなどの、55ヌクレオチド長を超える)の使用。
前述の手法の例を表1に与える。
前述の修飾は、メチル化、5’挿入色素、5’と3’末端に対する修飾、骨格修飾、架橋剤、環化、および「キャップ」、およびイノシンなどのアナログと1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの置換などの、周知のヌクレオチド修飾も含み得る。ヌクレオチドの修飾は、アクリジン、アミン、ビオチン、カスケードブルー、コレステロール、Cy3@、Cy5@、Cy5.5@、ダボイル、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、エダンス、6−FAM、フルオレセイン、3’−グリセリル、HEX、IRD−700、IRD−800、JOE、ホスフェートソラレン、ローダミン、ROX、チオール(SH)、スペーサー、TAMRA、TET、AMCA−S’’、SE、BODIPY°、マリーナブルー@、パシフィックブルー@、オレゴングリーン@、ローダミングリーン@、ローダミンレッド@、ロドールグリーン@およびテキサスレッド@の付加を含む。ポリヌクレオチド骨格修飾には、メチルホスホネート、2’−OMeメチルホスホネートRNA、ホスホロチオレート、RNA、2’−OMeRNAがある。塩基修飾には、2−アミノ−dA、2−アミノプリン、3’−(ddA)、3’dA(コルジセピン)、7−デアザ−dA、8−Br−dA、8−オキソ−dA、N6−Me−dA、無塩基部位(dスペーサー)、ビオチンdT、2’−OMe−5Me−C、2’−OMe−プロピニル−C、3’−(5−Me−dC)、3’−(ddC)、5−Br−dC、5−1−duc、5−Me−dC、5−F−dC、カルボキシ−dT、転換可能dA、転換可能dC、転換可能dG、転換可能dT、転換可能dU、7−デアザ−dG、8−Br−dG、8−オキソ−dG、O6−Me−dG、S6−DNP−dG、4−メチル−インドール、5−ニトロインドール、2’−OMe−イノシン、2’−dl、o6−フェニル−dl、4−メチル−インドール、2’−デオキシネブラリン、5−ニトロインドール、2−アミノプリン、dP(プリンアナログ)、dK(ピリミジンアナログ)、3−ニトロピロール、2−チオ−dT、4−チオ−dT、ビオチン−dT、カルボキシ−dT、04−Me−dT、04−トリアゾール−dT、2’−OMe−プロピニル−U、5−Br−dU、2’−dU、5−F−dU、5−l−dU、04−トリアゾール−dUがある。前記用語は、ペプチド核酸(PNA)、その骨格が糖ではなくN−(2−アミノエチル)−グリシン単位からなる擬似ペプチドであるDNAアナログも包含する。PNAはDNAの挙動を模倣し、相補核酸鎖と結合する。PNAの中性骨格は、通常得られるものより強い結合と高い特異性をもたらす。さらに、強力な生体分子ツール、アンチセンスおよび抗原物質、分子プローブおよびバイオセンサーを生み出すため、PNAの独自の化学的、物理的および生物学的性質が利用されている。
オリゴ核酸塩基は、ニック(複数可)、ギャップ(複数可)、修飾オリゴヌクレオチド骨格、無塩基部位ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド、または他の化学成分を有する可能性がある。さらなる実施形態では、オリゴ核酸塩基の少なくとも一本の鎖は、少なくとも1つの他の修飾ヌクレオチド、例えばMOE(メトキシエチル)などの2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体と結合した末端ヌクレオチド、2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基部位ヌクレオチド(核酸塩基は欠失状態であるかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する)(例えば、Glen Research、http://www.glenresearch.com/GlenReports/GR21−14.htmlを参照)、2’−アミノ−修飾ヌクレオチド、2’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミダイト、および非天然塩基含有ヌクレオチドを含む。様々な塩、混合塩および遊離酸型も含まれる。
好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび3’−アルキレンホスホネート、5’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めた他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’−アミノホスホラミダイトおよびアミノアルキルホスホラミダイト、チオノホスホラミダイトを含めたホスホラミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常3’−5’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの2’−5’結合アナログ、ならびに反転極性を有し1つまたは複数のヌクレオチド間結合が3’−3’、5’−5’または2’−2’結合である骨格がある。反転極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、3’の大部分のヌクレオチド間結合に1つの3’−3’結合、すなわち無塩基であり得る(核酸塩基が欠失状態であるかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する)1つの反転ヌクレオシド残基を含む。結合反転の最も一般的な用途は、ホスホロチオエート骨格を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの末端への3’−3’結合の付加である。3’−3’結合は、2個の5’−OH末端と0個の3’−OH末端を有するオリゴヌクレオチドを作製することによって、エクソヌクレアーゼ分解に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに安定化させる。結合反転は、「逆ホスホラミダイト」を使用することによって、オリゴヌクレオチド合成中に特定位置に導入することができる。これらの試薬は5’−OH位置にホスホラミダイト基、および3’−OH位置にジメトキシトリチル(DMT)保護基を有する。通常、DMT保護基は5’−OH位置に存在し、ホスホラミダイト基は3’−OH位置に存在する。
修飾塩基の例には、2−アミノプリン、2’−アミノ−ブチリルピレン−ウリジン、2’−アミノウリジン、2’−デオキシウリジン、2’−フルオロ−シチジン、2’−フルオロ−ウリジン、2,6−ジアミノプリン、4−チオ−ウリジン、5−ブロモ−ウリジン、5−フルオロ−シチジン、5−フルオロウリジン、5−インド−ウリジン、5−メチル−シチジン、イノシン、N3−メチル−ウリジン、7−デアザ−グアニン、8−アミノヘキシル−アミノ−アデニン、6−チオ−グアニン、4−チオ−チミン、2−チオ−チミン、5−ヨード−ウリジン、5−ヨード−シチジン、8−ブロモ−グアニン、8−ブロモ−アデニン、7−デアザ−アデニン、7−ジアザ−グアニン、8−オキソ−グアニン、5,6−ジヒドロ−ウリジン、および5−ヒドロキシメチル−ウリジンがあるが、これらだけには限られない。これらの合成単位は市販されており(例えば、Glen Research Companyから購入可能)、化学合成によりDNAに取り込むことができる。
糖成分の修飾の例は、3’−デオキシ化、2’−フルオロ化、およびアラビノシド化であるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。DNA中へのこれらの取り込みも化学合成によって可能である。
5’末端修飾の例は、5’−アミノ化、5’−ビオチニル化、5’−フルオレセイン化、5’−テトラフルオロフルオレセイン化、5’−チオール化、および5’−ダブシル化であるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。
3’末端修飾の例は、3’−アミノ化、3’−ビオチニル化、2,3−ジデオキシ化、3’−チオール化、3’−ダブシル化、3’−カルボキシル化、および3’−コレステリル化であるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。
好ましい一実施形態において、オリゴ核酸塩基は、リンカーを介して5’末端炭素に結合した5’ブロッキング置換基を含有することができる。リンカーの化学的性質はその長さ以外は重要ではなく、長さは幾つかの実施形態では少なくとも6原子長でなければならず、リンカーは柔軟性でなければならない。ビオチン、コレステロールもしくは他のステロイドなどの様々な非毒性置換基、または非挿入剤カチオン性蛍光色素を使用することができる。オリゴ核酸塩基を作製するのに特に好ましい試薬は、Glen Research,Sterling Va.(現在GE Healthcare)によってCy3(商標)およびCy5(商標)として販売されている試薬であり、これらは、オリゴヌクレオチドへの取り込みによって、3,3,3’,3’−テトラメチルN,N’−イソプロピル置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニン色素をそれぞれ生成するブロッキングホスホラミダイトである。Cy3が特に好ましい。インドカルボシアニンがN−オキシアルキル置換状態であるとき、5’末端ホスフェートを有するホスホジエステルとしてオリゴデオキシヌクレオチドの5’末端とそれを好都合に結合させることが可能である。市販のCy3ホスホラミダイトを指示通り使用するとき、生じる5’修飾はブロッキング置換基とリンカーからなり、それらはまとめてN−ヒドロキシプロピル,N’−ホスファチジルプロピル3,3,3’,3’−テトラメチルインドモノカルボシアニンである。企図される他の色素には、ローダミン6G、テトラメチルローダミン、スルホローダミン101、メロシアニン540、Atto565、Atto55026、Cy3.5、Dy547、Dy548、Dy549、Dy554、Dy555、Dy556、Dy560、mStrawberryおよびmCherryがある。
好ましい実施形態では、インドカルボシアニン色素はインドール環の3および3’位置でテトラ置換されている。理論について制限されずに、これらの置換基は色素が挿入色素となるのを妨げる。これらの位置における置換基の同一性は重要ではない。
本明細書に記載するオリゴ設計は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Transcription Activator−Like Effector Nucleases(TALENs)またはClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPRs)による部位特異的相同組換えを使用する遺伝子標的化だけには限られないが、これらを含めた他のDNA編集または組換え技術と組み合せて、より有効なドナー鋳型としても有用であり得る。
本開示は、特定の態様および実施形態においては、一般に、ゲノム細胞DNAの効率的な修飾および/または細胞のゲノムDNAへのDNAの組換えのための方法に関する。任意の特定の使用に限られないが、本明細書で提供する幾つかの方法は、特定の実施形態においては、例えば、細胞に対する修飾の効果を決定する目的で細胞のゲノム中に修飾を導入する際に有用であり得る。例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列に修飾を導入して、修飾が酵素の酵素活性を変えるかどうかを決定する、および/または酵素の触媒領域の位置を決定することができる。あるいは、DNA結合タンパク質のコード配列に修飾を導入して、タンパク質のDNA結合活性が変わるかどうかを決定することができ、したがってタンパク質内の特定DNA結合領域をたどることができる。さらに別の代替は、非コード制御配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、制御RNA配列(miRNA)など)に修飾を導入して、非コード制御配列と作動可能に連結した第2の配列の発現レベルに対する修飾の影響を決定することである。これは例えば、制御活性を有する特定配列を画定するのに望ましい可能性がある。
DNA切断剤
標的遺伝子破壊をもたらすための一戦略は、部位特異的エンドヌクレアーゼなどのDNA切断剤を使用する一本鎖または二本鎖DNA切断の発生によるものである。エンドヌクレアーゼは、藻類、植物、およびヒトを含めた巨大動物モデルなどの、より従来型の遺伝子標的法の影響を従来受けにくい生物における、標的遺伝子の妨害に最も頻繁に使用される。例えば、HIV感染を治療および予防するための、ジンクフィンガーヌクレアーゼに関する現在進行中のヒト臨床試験が存在する。さらに、エンドヌクレアーゼ操作は、穀物中に望ましくない表現型をもたらす遺伝子を妨害する試みにおいて現在使用されている。
ジンクフィンガー
1クラスの人工エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼである。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼは、非特異的切断ドメイン、典型的にはFokIエンドヌクレアーゼのドメインと、特異的DNA配列と結合するように操作したジンクフィンガータンパク質ドメインを組み合せる。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのモジュラー構造によって、それらはゲノムに部位特異的二本鎖切断をもたらす用途の広い基盤となる。FokIエンドヌクレアーゼはジマーとして切断するので、オフターゲット切断事象を予防するための一戦略は、隣接9塩基対部位で結合するジンクフィンガードメインの設計となっている。それぞれ参照によりそれらの全容が本明細書に組み込まれている米国特許第7,285,416号;第7,521,241号;第7,361,635号;第7,273,923号;第7,262,054号;第7,220,719号;第7,070,934号;第7,013,219号;第6,979,539号;第6,933,113号;第6,824,978号も参照されたい。
TALEN
TALENは、特異的DNA部位への一本鎖および二本鎖切断の誘導に使用される標的化可能ヌクレアーゼであり、次いでそれらは切断部位に配列変化を作製するのに利用可能な機構により修復される。
TALENのDNA結合領域を操作するのに使用される基本構成単位は、キサントモナス種プロテオバクテリアによってコードされる、天然に存在するTALE由来の高度に保存された反復ドメインである。TALENによるDNA結合は、反復単位のアミノ末端とカルボキシ末端で別のTALE由来ドメインと隣接した、高度に保存された33〜35アミノ酸反復単位のアレイによって仲介される。
これらのTALE反復単位はDNAの一塩基と特異的に結合し、その同一性は、反復単位の位置12と13に典型的に見られる2つの超可変残基、および所望標的核酸の長さに相当するアレイ中の反復単位の数、標的核酸配列とマッチするよう選択した反復単位の同一性によって決定される。幾つかの実施形態では、標的部位の選択性を最大にするため、標的核酸は15〜20塩基対である。標的核酸の切断は、典型的にTALEN結合の50塩基対以内で起こる。TALEN認識部位設計に関するコンピュータプログラムは当技術分野で記載されている。例えば、Cermak et al.,Nucleic Acids Res.2011 July;39(12):e82を参照。
所望標的配列とマッチするよう設計した後、TALENを組換えによって発現させ、外来タンパク質としてプロトプラストに導入し、またはプロトプラスト内でプラスミドから発現させ、またはmRNAとして投与することが可能である。
メガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼとしても知られるホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの大きな(例えば14bpを超える)切断部位のため、高度の特異性でゲノムDNAにおいて二本鎖切断を発生させる配列特異的エンドヌクレアーゼである。それらの標的部位に対するホーミングエンドヌクレアーゼの特異性によって誘導型DNA切断の正確な標的化が可能になるが、ホーミングエンドヌクレアーゼの切断部位は希少であり、標的遺伝子中の本来存在する切断部位を発見する確率は低い。
別のクラスの人工エンドヌクレアーゼは操作型メガヌクレアーゼである。操作型ホーミングエンドヌクレアーゼは、既存のホーミングエンドヌクレアーゼの特異性を改変することにより生成する。一手法では、本来存在するホーミングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列に変異を導入し、次いで生成した操作型ホーミングエンドヌクレアーゼをスクリーニングして、標的結合部位を切断する機能性タンパク質を選択する。別の手法では、キメラホーミングエンドヌクレアーゼを、2つの異なるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位を組み合せて各ホーミングエンドヌクレアーゼの半分の部位で構成される新たな認識部位を作製することによって操作する。例えば、米国特許第8,338,157号を参照。
CRISPRまたはCRISPR/cas系
CRISPR−Cas系は、3つの基本設計構成要素:1)Cas遺伝子、転写物(例えば、mRNA)またはタンパク質;2)ガイドRNA(gRNA);ならびに3)外来DNA部位(例えば、内在性DNA標的領域)およびCRISPR反復単位の一部と相補的である「プロトスペーサー」領域を担持する、CRISPR反復単位アレイをコードするRNA転写物からプロセッシングされるRNAセグメントであるcrRNA(CRISPR RNA)を含有する。例えば、PCT出願第WO/2014/093661号および第WO/2013/176772号を参照されたい。
Cas(CRISPR関連)遺伝子、転写物(例えば、mRNA)またはタンパク質
プラスミドベクターからの一過的Cas発現は、Casタンパク質の送達を誘導する、および/または植物細胞へのCas mRNAの送達を誘導する。Cas遺伝子は、高等植物、藻類または酵母における発現のためにコドン最適化され、適用可能な場合、構成的、誘導性、組織特異的または種特異的プロモーターのいずれかによって駆動される。Cas転写物の終結およびポリアデニル化シグナルは、NosT、RBCT、HSP18.2Tまたは他の遺伝子特異的もしくは種特異的ターミネーターのいずれかである。Cas遺伝子カセットまたはmRNAは、天然の、または遺伝子特異的プロモーターおよび/もしくは合成プロモーターと共に、イントロンを含有してもよい。Casタンパク質は、1つまたは複数の核局在化シグナル配列(NLS)、突然変異、欠失、変異またはトランケーションを含有してもよい。一過的発現系では、Cas遺伝子カセットを、同じ一過的発現ベクター上のgRNAカセットなどのCRISPR−Cas系の他の構成要素と組み合わせることができる。あるいは、Cas遺伝子カセットを、gRNAカセットとは無関係の構築物から、またはCRISPR−Cas系の他の構成要素から配置および発現させることができる。CRISPR関連(Cas)遺伝子は、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼおよびポリメラーゼなどの様々な推定核酸操作活性を有するタンパク質をコードする。Cas遺伝子は、cas9を含む。Cas9は、推定RuvC様およびHNHエンドヌクレアーゼドメインを含有する大きいタンパク質をコードする遺伝子であり、ほとんどの古細菌および多くの細菌に存在するCRISPR適応免疫系と関連する。Cas9タンパク質は、2つのローブからなる:
1)認識(REC)ローブ−3つのドメイン:
a)BH(架橋ヘリックス)
b)REC1−RNAによりガイドされるDNA標的化を容易にする
c)REC2−RNAによりガイドされるDNA標的化を容易にする
からなる;
2)ヌクレアーゼ(NUC)ローブ−3つのドメイン:
a)RuvC−RNAによりガイドされるDNA標的化を容易にする;エンドヌクレアーゼ活性
b)HNH−エンドヌクレアーゼ活性
c)PI−PAM相互作用
からなる。
他の実施形態では、cas遺伝子は、RuvC、HNH、RECおよびBHドメインが高度に保存されたcas9の相同体であり得る。幾つかの実施形態では、cas遺伝子は、以下の種に由来するものである。
ガイドRNA(gRNA)
gRNAまたはsgRNA(単一ガイドRNA)は、crRNAと、トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)配列の一部との融合物として操作され、プロトスペーサー領域と相補的である特定の標的DNA配列にCas9を誘導する。ガイドRNAは、長いトレーサーRNAハイブリッド、短いtracrRNAハイブリッドまたは天然のCRISPRアレイ+tracrRNAコンフォメーションを有するキメラRNA設計を含有する発現カセットを含んでもよい。キメラgRNAは、crRNAの標的化特異性と、単一の転写物へのtracrRNAの足場化特性とを組み合わせたものである。gRNAの一過的発現は、U6またはU3 snRNA遺伝子ファミリー(Wang et al 2008)に由来するものなどの種特異的高等植物RNAポリメラーゼIIIプロモーターにより制御される。gRNA転写終結は、Wang et al 2008のようにポリdTの6〜20ヌクレオチドの経路によって制御される。gRNA発現カセットは、CRISPR−Cas系の他の構成要素に由来する同じか、または異なる一過的発現ベクター上に位置する。gRNA転写物をin vitroで合成し、gRNA一過的発現ベクターとは無関係に、またはそれと共に、植物細胞中に直接送達することができる。
標的領域
ガイドRNAは、DNA標的領域に対する特異性を定義する2つの構成要素である、プロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を含有する。典型的には、20ヌクレオチドであるが、DNA標的に基づいて変化してもよいプロトスペーサー配列は、CRISPR−Cas複合体に対するDNA配列特異性を提供する。DNA標的はまた、Nがプロトスペーサーのすぐ3’側または下流の任意のヌクレオチドを示す、NNGまたはNAGトリヌクレオチド配列(PAM)も含有する。
1構成要素手法
Le Cong et al.(2013)その他と同様、CRISPR−Cas遺伝子編集に対する単純化された「1構成要素手法」は、単一の一過的発現構築物がCRISPR−Cas複合体の全ての構成要素、すなわち、gRNAとCas発現カセットの両方を含有するものである。これにより、任意の所与の植物または作物において単一または複数の遺伝子座を標的化するための容易なモジュラー設計が可能になる。複数の遺伝子座の標的化を、単に標的特異的gRNAカセット中でスワップすることによって達成することができる。さらに、種特異的プロモーター、ターミネーターまたは他の発現増強エレメントを、「1構成要素手法」の一過的ベクター中に、およびそれから外に容易にシャトルして、種特異的様式でgRNAとCasタンパク質の両方の最適な発現を可能にすることができる。
2構成要素手法
2構成要素手法においては、CasおよびgRNA発現カセットは、異なる一過的発現ベクター上に位置する。これにより、CRISPR−Cas編集構成要素の別々の送達が可能になり、同じ細胞内の異なる比率のgRNA:Casが可能になる。1構成要素手法と同様、2構成要素手法もまた、プロモーター、ターミネーターまたはCRISPR−Cas構成要素の発現に影響する他のエレメントを容易に変化させ、種特異的様式でDNAの標的化を可能にする。
抗生物質
別のクラスのエンドヌクレアーゼは、ブレオマイシンファミリーの抗生物質などのDNA切断糖ペプチドである抗生物質であり、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよび本明細書にさらに記載する他のものを含むDNA切断糖ペプチドである。
他のDNA修飾分子を標的遺伝子組換えにおいて使用することができる。例えば、ペプチド核酸を使用して、1つまたは複数の標的細胞のゲノムに対する修飾を誘導することができる(例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ecker,米国特許第5,986,053号を参照)。簡単に言うと、部分的ペプチド骨格を少なくとも含む合成ヌクレオチドを使用して、相同ゲノムヌクレオチド配列を標的化する。二重らせんDNAとの結合によって、またはペプチド核酸と連結した変異原性化学物質を介して、標的DNA配列の修飾および/または組換えが起こるよう誘導する。標的特異性は、標的配列とゲノム配列の間の配列相同性の程度によって決定する。
さらに本開示は、ゲノム配列の修飾を実施するため本明細書で使用する個々の方法に限られない。実際、幾つかの方法が企図される。例えば、三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド(TFO)を使用して遺伝子を標的化することができる。TFOは合成により、例えばPCRにより、または遺伝子合成装置の使用により作製することができる。さらに、適切な天然配列が見られる場合、ゲノムDNAからTFOを単離することができる。例えばソラレンまたはクロラムブシルだけには限られないがこれらなどの変異原性化学物質との結合を含めた、幾つかの方法においてTFOを使用することができる(例えば、Havre et al.,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.90:7879−7883,1993;Havre et al.,J Virol67:7323−7331,1993;Wang et al.,Mol Cell Biol 15:1759−1768,1995;Takasugi et al.,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.88:5602−5606,1991;Belousov et al.,Nucleic Acids Res25:3440−3444,1997を参照)。さらに例えば、TFOはドナー二本鎖DNAと結合させることが可能である(例えば、Chan et al.,J Biol Chem272:11541−11548,1999を参照)。TFOは誤りがちの修復を誘発するのに十分なアフィニティーでの結合により作用することもできる(Wang et al.,Science271:802−805,1996)。
本明細書に開示される方法は、使用するDNA修復試薬の性質または型に制約を受ける必要はない。例えば、このようなDNA修復試薬はラジカルを放出し、これによってDNA鎖切断をもたらす。あるいは、試薬はDNAをアルキル化して、複製および転写を遮断し得る付加体を形成する。別の代替では、試薬は細胞酵素を阻害する架橋または分子をもたらし、鎖切断をもたらす。オリゴヌクレオチドに結合してTFOを形成するDNA修復試薬の例には、インドロカルバゾール、ナフタレンジイミド(NDI)、トランスプラチン、ブレオマイシン、シクロプロパピロールインドールのアナログ、およびフェナントジヒドロジオキシンがあるが、これらだけには限られない。特に、インドロカルバゾールはトポイソメラーゼI阻害剤である。これらの酵素の阻害は、鎖切断およびDNAタンパク質付加体形成をもたらす(Arimondo et al.,Bioorganic and Medicinal Chem.8,777,2000)。NDIはグアニンを酸化することができる光酸化剤であり、これはグアニン残基の部位に突然変異を引き起こす可能性がある(Nunez,et al.,Biochemistry,39,6190,2000)。TFOが試薬と結合したとき、トランスプラチンが三本鎖標的中のDNAと反応することが示されている。この反応は、突然変異誘発性であるDNA付加体の形成を引き起こす(Columbier,et al.,Nucleic Acids Research,24:4519,1996)。ブレオマイシンは、放射性模倣体として広く使用されているDNA切断物質である。それはオリゴヌクレオチドと結合し、その形式で切断物質として活性があることが示されている(Sergeyev,Nucleic Acids Research23,4400,1995;Kane,et al.,Biochemistry,34,16715,1995)。シクロプロパピロールインドールのアナログはTFOと結合し、三本鎖標的配列中のDNAをアルキル化することが示されている。したがってアルキル化DNAは、突然変異誘発性である化学的付加体を含有する(Lukhtanov,et al.,Nucleic Acids Research,25,5077,1997)。フェナントジヒドロジオキシンは、光活性化によりラジカル種を放出する遮蔽キノンである。それらはTFOと結合し、光活性化により二本鎖DNAに切断をもたらすことが示されている(Bendinskas et al.,Bioconjugate Chem.9,555,1998)。
修飾および/または組換えを誘導する他の方法は本開示によって企図される。例えば別の実施形態は、外来DNA断片と標的遺伝子の間の、または標的部位に対するアフィニティーがあるペプチド核酸(PNA)の使用による相同組換えの誘導に関する(例えば、Capecchi et al.,Science244:1288−1292,1989を参照)。さらに他の方法は、ポリアミドによる配列特異的DNA認識および標的化(例えば、Dervan et al.,Curr Opin Chem Biol3:688−693,1999;Biochemistry38:2143−2151,1999を参照)、および部位特異的活性を有するヌクレアーゼ(例えば、ジンクフィンガータンパク質、TALEN、メガヌクレアーゼおよび/またはCRISPR)の使用を含む。
本開示は、任意の特定の修飾および/または組換え頻度に限られない。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、標的ヌクレオチド配列において0.2%〜3%の修飾頻度をもたらす。それでもなお、任意の(すなわち、0%と100%の間の)修飾および/または組換え頻度が本開示の範囲内にあると企図される。修飾および/または組換え頻度は、修飾および/または組換えを誘導するために使用する方法、使用する細胞型、特異的標的遺伝子、および存在する場合使用するDNA突然変異誘発試薬に依存する。さらに、修飾および/または組換えを検出するために使用する方法は、検出法における制約のため、全ての修飾および/または組換えの発生を検出できるわけではない。その上、幾つかの修飾および/または組換え事象はサイレント状態であり、修飾および/または組換えが生じた検出可能な指標を与えない可能性がある。サイレント状態の修飾および/または組換え事象の検出不能は、修飾および/または組換えの人為的に低い推定値をもたらす。これらの理由、および他の理由のため、本開示は任意の特定の修飾および/または組換え頻度に限られる必要はない。一実施形態では、修飾および/または組換え頻度は0.01%と100%の間である。別の実施形態では、修飾および/または組換え頻度は0.01%と50%の間である。さらに別の実施形態では、修飾および/または組換え頻度は0.1%と10%の間である。他のさらに別の実施形態では、修飾および/または組換え頻度は0.1%と5%の間である。
本明細書で使用する用語「突然変異の頻度」は、細胞のゲノム中の標的部位に突然変異を導入することができるDNA修飾分子で処置した細胞の集団を言及する際には、DNA修飾分子で処置した細胞の合計数と比較した、標的部位に突然変異を含有する処置集団中の細胞の数を指す。例えば、細胞のゲノム中の標的部位に突然変異を導入するよう設計したソラレン結合DNA修飾分子TFOで処置した細胞の集団に関しては、5%の突然変異の頻度は、TFO−ソラレンで処置した合計100細胞のうち、5細胞が標的部位に突然変異を含有することを意味する。
本開示は細胞中のDNAの任意の精度の修飾および/または組換えに限られる必要はなく、本開示の幾つかの実施形態は、望む結果に応じてより高い精度を必要とすることが企図される。例えば、遺伝子修復を必要とする特異的配列変化(例えば、特定塩基の変化)は、遺伝子の妨害のみが必要である遺伝子ノックアウトの発生と比較して、より高い精度を必要とする。本開示の方法を用いると、従来技術の方法を用いるより、高レベルの修飾および/または相同組換え技法の精度を得る可能性が高くなる。
植物細胞への遺伝子修復オリゴ核酸塩基の送達
植物細胞を形質転換するのに使用される任意の一般に知られる方法を、遺伝子修復オリゴ核酸塩基の送達に使用することができる。例示的な方法を以下に列挙する。本明細書の方法および組成物は、1つまたは複数のDNA修飾試薬を細胞にトランスフェクトするための任意の多くの方法を含んでもよい。1つまたは複数の細胞にDNA修飾試薬を導入するための方法は当技術分野でよく知られており、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、受動吸着、リン酸カルシウム−DNA共沈殿法、DEAEデキストラン仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、リポソーム融合、リポフェクション、ヌクレオフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、バイオリスティクス(すなわち、パーティクルボンバードメント)などだけには限られないが、これらを含む。
投射浸透によりセルロース細胞壁を有する植物細胞にDNAの巨大断片を導入するための金属製マイクロキャリア(ミクロスフェア)の使用は、当業者にはよく知られている(以後バイオリスティック送達)。米国特許第4,945,050号、同第5,100,792号および同第5,204,253号は、それらの投射用マイクロキャリアおよびデバイスの選択に関する一般的な技法を記載する。
本明細書に開示される方法におけるマイクロキャリアの使用に関する具体的条件は、国際公開WO99/07865中に記載の条件を含んでもよい。例示的一技法では、氷冷マイクロキャリア(60mg/mL)、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド(60mg/mL)、2.5MのCaCl2および0.1Mのスペルミジンをこの順で加え、混合物を軽く撹拌し、例えば10分間撹拌し、次いで室温で10分間放置し、この場合マイクロキャリアは5倍体積のエタノールに希釈し、遠心分離し100%エタノールに再懸濁する。マイクロキャリア8〜10μg/μL、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド14〜17μg/mL、CaCl21.1〜1.4Mおよびスペルミジン18〜22mMの接着溶液中濃度で良い結果を得ることができる。マイクロキャリア8μg/μL、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド16.5μg/mL、CaCl21.3Mおよびスペルミジン21mMの条件下で最適な結果を観察した。
細胞壁および細胞膜に浸透させるためのマイクロファイバーを使用して遺伝子修復オリゴ核酸塩基を植物細胞に導入することもできる。Coffee et alへの米国特許第5,302,523号は、ブラックメキシカンスイートトウモロコシの懸濁培養物の形質転換を容易にするための炭化珪素繊維の使用を記載する。マイクロファイバーを使用した植物細胞の形質転換のためのDNA導入に使用することができる任意の機械的技法を使用して、トランスミューテーション用の遺伝子修復オリゴ核酸塩基を送達することができる。
遺伝子修復オリゴ核酸塩基のマイクロファイバー送達に関する例示的な技法は以下の通りである。滅菌マイクロファイバー(2μg)を、約10μgの混合型二本鎖オリゴヌクレオチドを含有する150μLの植物培養培地に懸濁させる。懸濁培養物を沈殿させ、同体積の充填細胞および滅菌ファイバー/ヌクレオチド懸濁液を10分間撹拌し平板培養する。個々の形質に適したように、選択培地に直後に、または最大約120時間遅らせて施用する。
代替実施形態では、植物の一部に由来するプロトプラストのエレクトロポレーションにより、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を植物細胞に送達することができる。当業者によく知られる技法に従い、プロトプラストは植物の一部、特に葉の酵素処置によって形成される。例えば、Gallois et al,1996,in Methods in Molecular Biology55:89−107,Humana Press,Totowa,N.J.;Kipp et al.,1999,in Methods in Molecular Biology133:213−221,Humana Press,Totowa,NJを参照。エレクトロポレーション前に、プロトプラストを増殖培地中で培養する必要はない。エレクトロポレーションに関する例示的な条件は、0.3mLの合計体積中に300,000プロトプラスト、および0.6〜4μg/mLの遺伝子修復オリゴ核酸塩基濃度である。
代替実施形態では、当業者によく知られる技法に従い、膜修飾物質ポリエチレングリコールの存在下で植物プロトプラストに核酸を取り込ませる。別の代替実施形態では、マイクロキャピラリーを用いて植物細胞またはプロトプラストにそれを注入することにより、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を送達することができる。
代替実施形態では、アルギン酸カルシウムで構成されるマイクロビーズ中に核酸を包埋し、膜修飾物質ポリエチレングリコールの存在下で植物プロトプラストに取り込ませる(例えば、Sone et al.,2002,Liu et al.,2004を参照)。
代替実施形態では、核酸を水中で凝固させ、マイクロ粒子の型でボンバードメントにより植物細胞に導入する(例えば、Gilmore,1991,米国特許第5,219,746号;Brinegar et al.を参照)。
代替実施形態では、ナノ粒子と結合した核酸を、ナノ粒子を含有する懸濁液中での細胞のインキュベーションによって(例えば、Pasupathy et al.,2008を参照)、またはパーティクルボンバードメントを介して完全細胞にそれらを送達することにより、または共インキュベーションによりプロトプラストに送達することにより(例えば、Torney et al.,2007を参照)、完全植物細胞中に導入する。
代替実施形態では、核酸は浸透ペプチドと複合体形成し、共インキュベーションにより細胞に送達する(例えば、Chugh et al.,2008,WO2008148223 A1;Eudes and Chughを参照)。
代替実施形態では、エレクトロポレーションを介して完全細胞に核酸を導入する(例えば、He et al.,1998,US2003/0115641Al,Dobres et al.を参照)。
代替実施形態では、核酸を含む溶液中にそれらを浸すことにより、乾燥胚の細胞に核酸を送達する(例えば、Topfer et al.,1989、Senaratna et al.,1991を参照)か、または他の実施形態では、Cellsqueeze(SQZ Biotech)により導入する。
植物の選択
様々な実施形態において、本明細書で開示している植物は、高木もしくは低木として成長する任意の樹木植物種、任意の草本植物種、または可食果実、種子もしくは野菜を生成する任意の種、または有色もしくは芳香性品種の花を生成する任意の種を含めた、任意の種の双子葉植物、単子葉植物または裸子植物であってよい。例えば植物は、それらが既に具体的に言及されていない限り、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、マメ科マメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、ユリ、および堅果産生植物からなる群の植物種から選択することができる。
植物および植物細胞は、当技術分野で一般的に知られている方法を使用して、例えば除草剤の存在下で植物または植物細胞を成長させ、除草剤の不在下での成長速度と比較した成長速度を測定することによって、除草剤に対する抵抗性または耐性に関して試験することができる。
本明細書で使用する、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な成長は、対応する植物、植物器官、植物組織、または対象の野生型タンパク質を発現する植物細胞における成長速度または細胞分裂速度の少なくとも35%、少なくとも50%、少なくとも60%、または少なくとも75%である、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の成長速度または細胞分裂速度として定義する。
本明細書で使用する、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な発生は、対応する植物、植物器官、植物組織、または野生型タンパク質を発現する植物細胞で起こる事象と実質的に同じ、植物、植物器官、植物組織または植物細胞における1つまたは複数の発生事象の出現として定義する。
特定の実施形態において、本明細書で提供する植物器官には、葉、茎、根、枝芽、花芽、分裂組織、胚、子葉、内胚乳、がく片、花弁、めしべ、心皮、おしべ、やく、小胞子、花粉、花粉管、胚珠、子房および果実、またはこれらから得る切片、薄片もしくは薄板があるが、これらだけには限られない。植物組織には、カルス組織、地下組織、脈管組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、苗条組織、根組織、菌こぶ組織、植物腫瘍組織、および生殖組織があるが、これらだけには限られない。植物細胞には、細胞壁を有する単離細胞、様々な大きさのそれらの凝集体、およびプロトプラストがあるが、これらだけには限られない。
植物に除草剤を施用し、同様に施用した非耐性の同様の植物によって与えられる曲線との比較時に右に移動した用量/応答曲線を与えるとき、植物は関連除草剤に実質的に「耐性がある」。このような用量/応答曲線はX軸にプロットされた「用量」、およびY軸にプロットされた「殺傷率」、「除草剤効果」などを有する。耐性植物は、所与の除草剤効果をもたらすのに、非耐性の同様の植物より多量の除草剤を必要とし得る。除草剤に実質的に「抵抗性がある」植物は、原野の雑草を殺傷するため農薬散布地域により典型的に利用される濃度と割合で除草剤を施用すると、示す場合でも、わずかな壊死、溶解、萎黄病または他の損傷を示す。除草剤に抵抗性がある植物は除草剤耐性でもある。
植物の作製
植物種の様々な組織の組織培養、およびそこからの植物の再生は知られている。例えば、組織培養によるキャノーラ品種の繁殖は、以下のいずれか、Chuong et al.,「A Simple Culture Methods for Brassica hypocotyls Protoplasts」,Plant Cell Reports4:4−6,1985;Barsby,T.L.et al.,「A Rapid and Efficient Alternative Procedure for the Regeneration of Plants from Hypocotyl Protoplasts of Brassica napus」,Plant Cell Reports(Spring,1996);Kartha,K.,et al.,「In vitro Plant Formation from Stem Explants of Rape」,Physiol.Plant,31:217−220,1974;Narasimhulu,S.,et al.,「Species Specific Shoot Regeneration Response of Cotyledonary Explants of Brassicas」,Plant Cell Reports(Spring1988);Swanson,E.,「Microspore Culture in Brassica」,Methods in Molecular Biology,Vol.6,Chapter17,p.159,1990だけには限られないが、これらのいずれかに記載されている。
変種のさらなる生殖を組織培養および再生によって行うことができる。ダイズの様々な組織の組織培養およびそこからの植物の再生は、よく知られており広く公開されている。例えば、Komatsuda,T.et al.,「Genotype X Sucrose Interactions for Somatic Embryogenesis in Soybean」,Crop Sci.31:333−337,1991;Stephens,P.A.,et al.,「Agronomic Evaluation of Tissue−Culture−Derived Soybean Plants」,Theor.Appl.Genet.82:633−635,1991;Komatsuda,T.et al.,「Maturation and Germination of Somatic Embryos as Affected by Sucrose and Plant Growth Regulators in Soybeans Glycine gracilis Skvortz and Glycine max(L.)Merr.」Plant Cell,Tissue and Organ Culture,28:103−113,1992;Dhir,S.et al.,「Regeneration of Fertile Plants from Protoplasts of Soybean(Glycine max L.Merr.);Genotypic Differences in Culture Response」、Plant Cell Reports11:285−289,1992;Pandey,P.et al.,「Plant Regeneration from Leaf and Hypocotyl Explants of Glycine wightii(W.and A.)VERDC.var.longicauda」,Japan J.Breed.42:1−5,1992;and Shetty,K.,et al.,「Stimulation of In Vitro Shoot Organogenesis in Glycine max(Merrill.)by Allantoin and Amides」,Plant Science81:245−251,1992を参照することができる。1991年6月18日に発行されたCollins et alへの米国特許第5,024,944号および1991年4月16日に発行されたRanch et alへの米国特許第5,008,200号の開示は、参照によりそれらの全容が本明細書に組み込まれている。
例示的実施形態
本開示で記載され、本開示の他の場所に提供される態様および実施形態に加えて、特定の実施形態の以下の非限定的一覧が具体的に企図される。
1.細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、細胞をDNA切断剤および修飾GRONに曝露するステップを含む方法。
2.DNA切断剤およびGRONを含む細胞。
3.前記細胞が植物、細菌、酵母、真菌、藻類、および哺乳動物からなる群から選択される1つまたは複数の種の細胞である、実施形態1または2に記載の方法または細胞。
4.前記細胞がEscherichia coli、Mycobacterium smegmatis、Baccillus subtilis、Chlorella、Bacillus thuringiensis、Saccharomyces cerevisiae、Yarrowia lipolytica、Chlamydamonas rhienhardtii、Pichia pastoris、Corynebacterium、Aspergillus niger、およびNeurospora crassa、Arabidopsis thaliana、Solanum tuberosum、Solanum phureja、Oryza sativa、Glycine max、Amaranthus tuberculatus、Linum usitatissimum、およびZea maysからなる群から選択される1つまたは複数の種の細胞である、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の方法または細胞。
5.前記細胞がYarrowia lipolyticaである、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の方法または細胞。
6.前記細胞がSaccharomyces cerevisiaeではない酵母細胞である、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の方法または細胞。
7.植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をDNA切断剤および修飾GRONに曝露するステップを含む方法。
8.DNA切断剤および修飾GRONを含む植物細胞。
9.植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をDNA切断剤ならびにDNAおよびRNAを含むGRONに曝露するステップを含む方法。
10.DNAおよびRNAを含むDNA切断剤を含む植物細胞。
11.細胞においてアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく1781、1783、1786、2078、2079、2080および2088からなる群から選択される1つもしくは複数のアミノ酸位置で、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基で、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が前記細胞を修飾GRONに曝露するステップを含む方法。
12.細胞においてアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく1781、1783、1786、2078、2079、2080および2088からなる群から選択される1つもしくは複数のアミノ酸位置で、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基で、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が前記細胞をDNA切断剤および修飾GRONに曝露するステップを含む方法。
13.植物または植物細胞を生成するための方法であって、植物細胞中に、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基(GRON)を導入して、配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく1781、1783、1786、2078、2079、2080および2088からなる群から選択される位置に対応する1つもしくは複数のアミノ酸位置、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むACCaseタンパク質を発現するACCase遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む方法。
14.植物または植物細胞を生成するための方法であって、植物細胞中に、DNA切断剤と、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基(GRON)とを導入して、配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく1781、1783、1786、2078、2079、2080および2088からなる群から選択される位置に対応する1つもしくは複数のアミノ酸位置、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むACCaseタンパク質を発現するACCase遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む方法。
15.配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく2078位に、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子を含む、稔性植物。
16.配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく2078位に、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子を含む、稔性イネ植物。
17.配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく2078位に、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子を含み、配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく1781、1783、1786、2079、2080および2088からなる群から選択される1つもしくは複数のアミノ酸位置、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子をさらに含む、植物細胞。
18.配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく2078位に、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子を含み、配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく1781、1783、1786、2079、2080および2088からなる群から選択される1つもしくは複数のアミノ酸位置、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子をさらに含む、稔性植物。
19.細胞においてアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく2078位、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基でアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が前記細胞を修飾GRONに曝露するステップを含む方法。
20.細胞においてアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子の遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記遺伝子変化が、配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく2078位、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基でアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)タンパク質の変化を引き起こし、前記方法が前記細胞をDNA切断剤および修飾GRONに曝露するステップを含む方法。
21.アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子の前記突然変異または変化が、存在する場合、配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからアラニン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからロイシン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからメチオニン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからアスパラギン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからセリン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからトレオニン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからバリン;配列番号1の1783位に対応する位置のグリシンからシステイン;配列番号1の1786位に対応する位置のアラニンからプロリン;配列番号1の2078位に対応する位置のアスパラギン酸からグリシン;配列番号1の2078位に対応する位置のアスパラギン酸からリシン;配列番号1の2078位に対応する位置のアスパラギン酸からトレオニン;配列番号1の2079位に対応する位置のセリンからフェニルアラニン;配列番号1の2080位に対応する位置のリシンからグルタミン酸;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからフェニルアラニン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからグリシン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからヒスチジン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからリシン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからロイシン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからアスパラギン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからプロリン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからグルタミン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからアルギニン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからセリン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからトレオニン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからバリン;および配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからトリプトファンからなる群から選択される1つまたは複数を含むアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)タンパク質をもたらす、実施形態1〜20のいずれか1つに記載の方法、植物または細胞。
22.前記植物または細胞が、配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからアラニン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからロイシン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからメチオニン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからアスパラギン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからセリン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからトレオニン;配列番号1の1781位に対応する位置のイソロイシンからバリン;配列番号1の1783位に対応する位置のグリシンからシステイン;配列番号1の1786位に対応する位置のアラニンからプロリン;配列番号1の2078位に対応する位置のアスパラギン酸からグリシン;配列番号1の2078位に対応する位置のアスパラギン酸からリシン;配列番号1の2078位に対応する位置のアスパラギン酸からトレオニン;配列番号1の2079位に対応する位置のセリンからフェニルアラニン;配列番号1の2080位に対応する位置のリシンからグルタミン酸;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからフェニルアラニン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからグリシン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからヒスチジン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからリシン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからロイシン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからアスパラギン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからプロリン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからグルタミン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからアルギニン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからセリン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからトレオニン;配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからバリン;および配列番号1の2088位に対応する位置のシステインからトリプトファンからなる群から選択される1つまたは複数を含むアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)タンパク質を含む、実施形態1〜21のいずれか1つに記載の植物もしくは細胞、または実施形態1〜21のいずれか1つに記載の方法により作製された植物もしくは植物細胞。
23.前記植物または植物細胞が、配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく1781、1783、1786、2078、2079、2080および2088からなる群から選択される位置に、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子を含む、実施形態1〜22のいずれか1つに記載の植物もしくは細胞、または実施形態1〜22のいずれか1つに記載の方法により作製された植物もしくは細胞。
24.前記植物または細胞が、配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく2078位に、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子を含み、配列番号1のノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく1781、1783、1786、2078、2079、2080および2088からなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸位置に、またはACCaseパラログ中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むタンパク質をコードするアセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)遺伝子をさらに含む、実施形態1〜23のいずれか1つに記載の植物もしくは細胞、または実施形態1〜23のいずれか1つに記載の方法により作製された植物もしくは細胞。
前記ACCaseの実施形態11〜24のそれぞれにおいて、方法、植物、細胞、または別のものにしても、以下のものがその中での使用のための好適な突然変異である。
代替的な突然変異は、以下のものに限られないが、それらを含む。
実施形態11〜24に関して、ノスズメノテッポウ参照配列の番号付けに基づく1781m、1783、1786、2078、2079、および2080に対応する位置は当業界で周知であり、適切な配列データベースから容易に入手可能である。例えば、以下の表は、イネACCase配列中の対応する位置を示す。
25.突然変異EPSPS遺伝子を有する植物または植物細胞を生成する方法であって、植物細胞中に、5−エノールピルビルシキメート−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基(GRON)とを導入して、配列番号2のEscherichia coli参照配列のアミノ酸配列の番号付けに基づく96、97および101からなる群から選択される位置に対応する1つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはEPSPS類似体中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むEPSPSタンパク質を発現するEPSPS遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む方法。
26.突然変異EPSPS遺伝子を有する植物または植物細胞を生成する方法であって、植物細胞中に、DNA切断剤と、5−エノールピルビルシキメート−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基(GRON)とを導入して、配列番号2のEscherichia coli参照配列のアミノ酸配列の番号付けに基づく96、97および101からなる群から選択される位置に対応する1つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはEPSPS類似体中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むEPSPSタンパク質を発現するEPSPS遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む方法。
27.突然変異EPSPS遺伝子を有する植物または細胞であって、植物細胞中に、DNA切断剤と、5−エノールピルビルシキメート−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)遺伝子に標的突然変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基(GRON)とを導入して、配列番号2のEscherichia coli参照配列のアミノ酸配列の番号付けに基づく96、97および101からなる群から選択される位置に対応する1つもしくは複数のアミノ酸位置に、またはEPSPS類似体中の類似アミノ酸残基に突然変異を含むEPSPSタンパク質を発現するEPSPS遺伝子を有する植物細胞を生成するステップを含む方法により作製される植物または細胞。
28.植物または植物細胞が、配列番号2の96位に対応する位置のグリシンからアラニン;配列番号2の97位に対応する位置のトレオニンからイソロイシン;配列番号2の101位に対応する位置のプロリンからアラニン;配列番号2の101位に対応する位置のプロリンからセリン;および配列番号2の101位に対応する位置のプロリンからトレオニンからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸位置の突然変異を含むEPSPSタンパク質を発現する、実施形態1〜27のいずれか1つに記載の植物もしくは細胞、または実施形態1〜27のいずれか1つに記載の方法により作製された植物もしくは細胞。
29.植物または植物細胞が、配列番号2の97位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、配列番号2の101位に対応する位置のプロリンからアラニン;配列番号2の97位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、配列番号2の101位に対応する位置のプロリンからアラニン;配列番号2の97位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、配列番号2の101位に対応する位置のプロリンからセリン;および配列番号2の97位に対応する位置のトレオニンからイソロイシンと、配列番号2の101位に対応する位置のプロリンからトレオニンからなる群から選択される突然変異の組合せを含むEPSPSタンパク質を発現する、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の植物もしくは細胞、または実施形態1〜28のいずれか1つに記載の方法により作製された植物もしくは細胞。
実施形態25〜30に関して、配列番号2のEscherichia coli参照配列の番号付けに基づく96、97および101に対応する位置は当業界で周知であり、適切な配列データベースから容易に入手可能である。例えば、米国特許第8,268,622号を参照されたい。例えば、以下の表は、アマEPSPS配列中の対応する位置を示す。
E.coliのEPSPS配列は、配列:
MESLTLQPIARVDGTINLPGSKTVSNRALLLAALAHGKTVLTNLLDSDDVRHMLNALTALGVSYTLSADRTRCEIIGNGGPLHAEGALELFLGNAGTAMRPLAAALCLGSNDIVLTGEPRMKERPIGHLVDALRLGGAKITYLEQENYPPLRLQGGFTGGNVDVDGSVSSQFLTALLMTAPLAPEDTVIRIKGDLVSKPYIDITLNLMKTFGVEIENQHYQQFVVKGGQSYQSPGTYLVEGDASSASYFLAAAAIKGGTVKVTGIGRNSMQGDIRFADVLEKMGATICWGDDYISCTRGELNAIDMDMNHIPDAAMTIATAALFAKGTTRLRNIYNWRVKETDRLFAMATELRKVGAEVEEGHDYIRITPPEKLNFAEIATYNDHRMAMCFSLVALSDTPVTILDPKCTAKTFPDYFEQLARISQAA
を有するAroAである。
アマ遺伝子1の配列は、配列:
MALVTKICGGANAVALPATFGTRRTKSISSSVSFRSSTSPPSLKQRRRSGNVAAAAAAPLRVSASLTTAAEKASTVPEEVVLQPIKDISGIVTLPGSKSLSNRILLLAALSEGTTVVDNLLNSDDVHYMLGALKTLGLNVEHSSEQKRAIVEGCGGVFPVGKLAKNDIELFLGNAGTAMRPLTAAVTAAGGNSSYILDGVPRMRERPIGDLVVGLKQLGADVTCSSTSCPPVHVNGQGGLPGGKVKLSGSISSQYLTALLMAAPLALGDVEIEIVDKLISVPYVDMTLKLMERFGVAVEHSGSWDRFFVKGGQKYKSPGNAYVEGDASSASYFLAGAAITGGTITVEGCGTSSLQGDVKFAEVLEKMGAKVIWTENSVTVTGPPRDASGRKHLRAVDVNMNKMPDVAMTLAVVALYADGPTAIRDVASWRVKETERMIAICTELRKLGATVEEGPDYCIITPPEKLNIAEIDTYDDHRMAMAFSLAACADVPVTIRDPGCTKKTFPDYFEVLERYTKH
を有するlcl−g41452_1333である。
アマ遺伝子2の配列は、配列:
MAQVTKICGGANAVALPATFGTRRTKSISSSVSFRSSTSPPSLKQRRLLGNVAAAAAAAPLRISASLATAAEKASTVPEEIVLQPIKDISGIVTLPGSKSLSNRILLLAALSEGKTVVDNLLNSDDVHYMLGALKTLGLNVEHSSEQKRAIVEGRGGVFPVGKLGKNDIELFLGNAGTAMRPLTAAVTAAGGNSSYILDGVPRMRERPIGDLVVGLKQLGADVSCSSTSCPPVHVNAKGGLPGGKVKLSGSISSQYLTALLMAAPLALGDVEIEIVDKLISVPYVDMTLKLMERFGVAVEHSGSWDRFFVKGGQKYKSPGNAYVEGDASSASYFLAGAAITGGTITVEGCGTSSLQGDVKFAEVLEKMGAKVTWTETSVTVTGPPRDASGKKHLRAVDVNMNKMPDVAMTLAVVALYADGPTAIRDVASWRVKETERMIAVCTELRKLGATVEEGPDYCIITPPEKLSIAEIDTYDDHRMAMAFSLAACADVPVTIRDPGCTKKTFPDYFEVLERYTKH
を有するlcl−g40547_1271である。
30.前記DNA切断剤が、CRISPR、TALEN、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、およびDNA切断性抗生物質から選択される1つまたは複数である、実施形態1〜29のいずれか1つに記載の方法または細胞。
31.前記DNA切断剤がCRISPRまたはTALENである、実施形態1〜30のいずれか1つに記載の方法または細胞。
32.前記DNA切断剤がCRISPRである、実施形態1〜31のいずれか1つに記載の方法または細胞。
33.前記DNA切断剤がTALENである、実施形態1〜32のいずれか1つに記載の方法または細胞。
34.前記DNA切断剤が、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシンおよびペプレオマイシンからなる群から選択される1つまたは複数のDNA切断性抗生物質である、実施形態1〜33のいずれか1つに記載の方法または細胞。
35.前記DNA切断剤がゼオシンである、実施形態1〜34のいずれか1つに記載の方法または細胞。
36.前記GRONが一本鎖である、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の方法または細胞。
37.GRONが、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドである、実施形態1〜36のいずれか1つに記載の方法または細胞。
38.GRONが、5’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを含む、実施形態1〜37のいずれか1つに記載の方法または細胞。
39.GRONが、3’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを含む、実施形態1〜38のいずれか1つに記載の方法または細胞。
40.GRONが、5’および3’末端で保護された、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを含む、実施形態1〜39のいずれか1つに記載の方法または細胞。
41.GRONが、Cy3基、3PS基、および2’−O−メチル基から選択される1つまたは複数を含む、実施形態1〜40のいずれか1つに記載の方法または細胞。
42.GRONがCy3基を含む、実施形態1〜41のいずれか1つに記載の方法または細胞。
43.GRONが5’末端の第1の塩基にCy3基を含む、実施形態1〜42のいずれか1つに記載の方法または細胞。
44.GRONが3’末端の第1の塩基にCy3基を含む、実施形態1〜43のいずれか1つに記載の方法または細胞。
45.GRONが3PS基を含む、実施形態1〜44のいずれか1つに記載の方法または細胞。
46.GRONが2個以上の3PS基を含む、実施形態1〜45のいずれか1つに記載の方法または細胞。
47.GRONが3個以上の3PS基を含む、実施形態1〜46のいずれか1つに記載の方法または細胞。
48.GRONが5’末端の第1の塩基に3PS基を含む、実施形態1〜47のいずれか1つに記載の方法または細胞。
49.GRONが3’末端の第1の塩基に3PS基を含む、実施形態1〜48のいずれか1つに記載の方法または細胞。
50.GRONが2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜49のいずれか1つに記載の方法または細胞。
51.GRONが2つ以上の2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜50のいずれか1つに記載の方法または細胞。
52.GRONが、5’末端の第1の塩基に2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜51のいずれか1つに記載の方法または細胞。
53.GRONが、5’末端の第1の塩基に2’−O−メチル基を有し、他の2’−O−メチル基を有さない、実施形態1〜52のいずれか1つに記載の方法または細胞。
54.GRONが、5’末端の最初の2個以上の塩基のそれぞれに2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜53のいずれか1つに記載の方法または細胞。
55.GRONが、5’末端の最初の3個以上の塩基のそれぞれに2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜54のいずれか1つに記載の方法または細胞。
56.GRONが、5’末端の最初の4個以上の塩基のそれぞれに2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜55のいずれか1つに記載の方法または細胞。
57.GRONが、5’末端の最初の5個以上の塩基のそれぞれに2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜56のいずれか1つに記載の方法または細胞。
58.GRONが、5’末端の最初の6個以上の塩基のそれぞれに2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜57のいずれか1つに記載の方法または細胞。
59.GRONが、5’末端の最初の7個以上の塩基のそれぞれに2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜58のいずれか1つに記載の方法または細胞。
60.GRONが、5’末端の最初の8個以上の塩基のそれぞれに2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜59のいずれか1つに記載の方法または細胞。
61.GRONが、5’末端の最初の9個以上の塩基のそれぞれに2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜60のいずれか1つに記載の方法または細胞。
62.GRONが、5’末端の最初の10個以上の塩基のそれぞれに2’−O−メチル基を含む、実施形態1〜61のいずれか1つに記載の方法または細胞。
63.GRONが、5’末端に1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のRNA塩基を含む、実施形態1〜62のいずれか1つに記載の方法または細胞。
64.前記GRONが、遺伝子変化のための標的配列に対してゆらぎ塩基対を有する、実施形態1〜63のいずれか1つに記載の方法または細胞。
65.前記GRONが15〜60ヌクレオチド長である、実施形態1〜64のいずれか1つに記載の方法または細胞。
66.前記GRONが41ヌクレオチド長である、実施形態1〜65のいずれか1つに記載の方法または細胞。
67.前記GRONが50〜110ヌクレオチド長である、実施形態1〜66のいずれか1つに記載の方法または細胞。
68.前記GRONが101ヌクレオチド長である、実施形態1〜67のいずれか1つに記載の方法または細胞。
69.前記GRONが150〜210ヌクレオチド長である、実施形態1〜68のいずれか1つに記載の方法または細胞。
70.前記GRONが201ヌクレオチド長である、実施形態1〜69のいずれか1つに記載の方法または細胞。
71.前記GRONが70〜210ヌクレオチド長である、実施形態1〜70のいずれか1つに記載の方法または細胞。
72.前記GRONが70ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜71のいずれか1つに記載の方法または細胞。
73.前記GRONが100ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜72のいずれか1つに記載の方法または細胞。
74.前記GRONが165ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜73のいずれか1つに記載の方法または細胞。
75.前記GRONが175ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜74のいずれか1つに記載の方法または細胞。
76.前記GRONが185ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜75のいずれか1つに記載の方法または細胞。
77.前記GRONが195ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜76のいずれか1つに記載の方法または細胞。
78.前記GRONが200ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜77のいずれか1つに記載の方法または細胞。
79.前記GRONが210ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜78のいずれか1つに記載の方法または細胞。
80.前記GRONが220ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜79のいずれか1つに記載の方法または細胞。
81.前記GRONが230ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜80のいずれか1つに記載の方法または細胞。
82.前記GRONが240ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜81のいずれか1つに記載の方法または細胞。
83.前記GRONが250ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜82のいずれか1つに記載の方法または細胞。
84.前記GRONが260ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜83のいずれか1つに記載の方法または細胞。
85.前記GRONが270ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜84のいずれか1つに記載の方法または細胞。
86.前記GRONが280ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜85のいずれか1つに記載の方法または細胞。
87.前記GRONが290ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜86のいずれか1つに記載の方法または細胞。
88.前記GRONが300ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜87のいずれか1つに記載の方法または細胞。
89.前記GRONが400ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜88のいずれか1つに記載の方法または細胞。
90.前記GRONが500ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜89のいずれか1つに記載の方法または細胞。
91.前記GRONが600ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜90のいずれか1つに記載の方法または細胞。
92.前記GRONが700ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜91のいずれか1つに記載の方法または細胞。
93.前記GRONが800ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜92のいずれか1つに記載の方法または細胞。
94.前記GRONが900ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜93のいずれか1つに記載の方法または細胞。
95.前記GRONが1000ヌクレオチド長より長い、実施形態1〜94のいずれか1つに記載の方法または細胞。
96.前記植物が、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、ソラマメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、およびユリからなる群から選択される、実施形態1〜95のいずれか1つに記載の方法または細胞。
97.前記植物がキャノーラである、実施形態1〜96のいずれか1つに記載の方法または細胞。
98.前記植物がコーンである、実施形態1〜97のいずれか1つに記載の方法または細胞。
99.前記植物がメイズである、実施形態1〜98のいずれか1つに記載の方法または細胞。
100.前記植物がイネである、実施形態1〜99のいずれか1つに記載の方法または細胞。
101.前記植物がモロコシである、実施形態1〜100のいずれか1つに記載の方法または細胞。
102.前記植物がジャガイモである、実施形態1〜101のいずれか1つに記載の方法または細胞。
103.前記植物がダイズである、実施形態1〜102のいずれか1つに記載の方法または細胞。
104.前記植物がアマである、実施形態1〜103のいずれか1つに記載の方法または細胞。
105.前記植物がナタネである、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または細胞。
106.前記植物がキャッサバである、実施形態1〜105のいずれか1つに記載の方法または細胞。
107.前記植物がヒマワリである、実施形態1〜106のいずれか1つに記載の方法または細胞。
108.植物細胞において遺伝子変化を引き起こす方法であって、前記細胞をCRISPRおよび修飾GRONに曝露するステップを含む方法。
109.複数の遺伝子変化を生じる、実施形態1〜108のいずれか1つに記載の方法または細胞。
110.2つ以上のガイドRNAを使用する、実施形態1〜109のいずれか1つに記載の方法または細胞。
111.1より多いガイドRNAのそれぞれが遺伝子変化のための異なる標的と相補的である、実施形態1〜110のいずれか1つに記載の方法または細胞。
112.CRISPRがニッカーゼを含む、実施形態1〜111のいずれか1つに記載の方法または細胞。
113.DNA切断剤が2つ以上のニッカーゼを含む、実施形態1〜112のいずれか1つに記載の方法または細胞。
114.2つ以上のニッカーゼが標的核酸配列の反対の鎖上を切断する、実施形態1〜113のいずれか1つに記載の方法または細胞。
115.2つ以上のニッカーゼが標的核酸配列の同じ鎖上を切断する、実施形態1〜114のいずれか1つに記載の方法または細胞。
116.実施形態1〜115のいずれか1つに記載の方法により作製された、またはその細胞に由来する非トランスジェニック除草剤抵抗性または耐性植物。
117.前記植物細胞が、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)の遺伝子変化または突然変異を有し、オオムギ、メイズ、オートムギ、ライムギ、イネ、ソルガム、サトウキビ、芝草、およびコムギからなる群から選択される、実施形態1〜116のいずれか1つに記載の方法または細胞。
118.前記植物細胞が、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)の遺伝子変化または突然変異を有し、1つまたは複数の除草剤に対して抵抗性または耐性である、実施形態1〜117のいずれか1つに記載の方法または細胞。
119.前記植物細胞が、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)の遺伝子変化または突然変異を有し、1つまたは複数のACCase阻害性除草剤に対して抵抗性である、実施形態1〜118のいずれか1つに記載の方法または細胞。
120.前記植物細胞が、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ(ACCase)の遺伝子変化または突然変異を有し、アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−P、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジホップ−P、ハロキシホップ、ハロキシホップ−P、イソキサピリホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ−P、トリホップ、ピノキサデン、これらの除草剤のいずれかの農学的に許容される塩およびエステル、ならびにその組合せからなる群から選択される1つまたは複数の除草剤に対して抵抗性である、実施形態1〜119のいずれか1つに記載の方法または細胞。
121.前記植物細胞が5−エノールピルビルシキメート−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の遺伝子変化または突然変異を有し、前記植物細胞がコーン、コムギ、イネ、オオムギ、ソルガム、オートムギ、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、ナタネ、キャノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、リンゴ、レタス、マメ科植物、レンズマメ、ブドウおよび芝草からなる群から選択される、実施形態1〜120のいずれか1つに記載の方法または細胞。
122.前記植物または植物細胞が5−エノールピルビルシキメート−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞が少なくとも1つの除草剤に対して抵抗性である、実施形態1〜121のいずれか1つに記載の方法または細胞。
123.前記植物または植物細胞が5−エノールピルビルシキメート−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞がホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対して抵抗性である、実施形態1〜122のいずれか1つに記載の方法または細胞。
124.前記植物または植物細胞が5−エノールピルビルシキメート−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞がグリホサートに対して抵抗性である、実施形態1〜123のいずれか1つに記載の方法または細胞。
125.前記植物または植物細胞が5−エノールピルビルシキメート−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)の遺伝子変化または突然変異を有し、植物または植物細胞がコーン、コムギ、イネ、オオムギ、ソルガム、オートムギ、ライムギ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、サトウダイコン、ナタネ、キャノーラ、アマ、キャッサバ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、リンゴ、レタス、マメ科植物、レンズマメ、ブドウおよび芝草からなる群から選択される、実施形態1〜124のいずれか1つに記載の方法または細胞。
126.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の1個の対立遺伝子で起こる、実施形態1〜125のいずれか1つに記載の方法または細胞。
127.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の2個の対立遺伝子で起こる、実施形態1〜126のいずれか1つに記載の方法または細胞。
128.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の3個の対立遺伝子で起こる、実施形態1〜127のいずれか1つに記載の方法または細胞。
129.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の4個の対立遺伝子で起こる、実施形態1〜128のいずれか1つに記載の方法または細胞。
130.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個の対立遺伝子で起こる、実施形態1〜129のいずれか1つに記載の方法または細胞。
131.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の1個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態1〜130のいずれか1つに記載の方法または細胞。
132.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の2個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態1〜131のいずれか1つに記載の方法または細胞。
133.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の3個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態1〜132のいずれか1つに記載の方法または細胞。
134.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の4個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態1〜133のいずれか1つに記載の方法または細胞。
135.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態1〜134のいずれか1つに記載の方法または細胞。
136.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の1個の対立遺伝子で起こり、遺伝子の第2の対立遺伝子が、前記第2の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態1〜135のいずれか1つに記載の方法または細胞。
137.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の1個の対立遺伝子で起こり、遺伝子の第2の対立遺伝子および第3の対立遺伝子が、前記第2の対立遺伝子および前記第3の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態1〜136のいずれか1つに記載の方法または細胞。
138.細胞における遺伝子変化または突然変異が、遺伝子の1個の対立遺伝子で起こり、遺伝子の第2の対立遺伝子、第3の対立遺伝子、および第4の対立遺伝子が、前記第2の対立遺伝子、前記第3の対立遺伝子、および前記第4の対立遺伝子のノックアウトをもたらす欠失または挿入を含む、実施形態1〜137のいずれか1つに記載の方法または細胞。
139.細胞における遺伝子変化が、1個の対立遺伝子での少なくとも1個の突然変異および別の対立遺伝子中の少なくとも1個のノックアウトを含む、実施形態1〜138のいずれか1つに記載の方法または細胞。
140.細胞における遺伝子変化が、1個の対立遺伝子での少なくとも1個の突然変異および少なくとも1個の他の対立遺伝子中の少なくとも1個のノックアウトを含む、実施形態1〜139のいずれか1つに記載の方法または細胞。
141.細胞における遺伝子変化が、1個の対立遺伝子での少なくとも1個の突然変異および少なくとも2個の他の対立遺伝子中の少なくとも1個のノックアウトを含む、実施形態1〜140のいずれか1つに記載の方法または細胞。
142.細胞における遺伝子変化が、1個の対立遺伝子での少なくとも1個の突然変異および少なくとも3個の他の対立遺伝子中の少なくとも1個のノックアウトを含む、実施形態1〜141のいずれか1つに記載の方法または細胞。
143.細胞における遺伝子変化が、1個の対立遺伝子での少なくとも1個の突然変異および他の全ての対立遺伝子中のノックアウトを含む、実施形態1〜142のいずれか1つに記載の方法または細胞。
以下は実施例であり、本明細書に記載する方法および組成物を実施するための手順を例示するものである。これらの実施例は限定と解釈されるべきではない。
GRONの長さ
Sommer et al.,(Mol Biotechnol.33:115−22,2006)は、一ヌクレオチド変化を利用し緑色蛍光タンパク質(GFP)変異体において青色蛍光と緑色蛍光を転換する、in vivo遺伝子転換を検出するためのレポーターシステムを記載する。このレポーターシステムを、モデル種としてシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を使用しGRON長修飾後のGRON転換の効率を評価した、以下の実験中での使用に適合させた。
要約すると、この実施例および後の実施例用に、青色蛍光タンパク質遺伝子の多数のコピーを有するシロイヌナズナ系統を、当業者に知られる方法によって作製した(例えば、Clough and Brent,1998を参照)。根部由来分裂組織培養物をこの系統で樹立し、これをプロトプラスト単離および培養に使用した(例えば、Mathur et al.,1995を参照)。プロトプラストへのGRON送達は、プロトプラストへのポリエチレングリコール(PEG)仲介GRON取り込みによって実施した。Fujiwara and Kato(2007)によって記載された方法と類似した、96ウェル形式を使用する方法を使用した。以下に、そのプロトコールを簡潔に記載する。所与の体積は、96ウェルディッシュの個々のウェルに施用した体積である。
1.96ウェルプレートの各ウェルにおいて、5×106細胞/mlで6.25μlのGRON(80μM)と25μlのシロイヌナズナBFPトランスジェニック根部分裂組織由来プロトプラストを混合する。
2.31.25μlの40%PEG溶液を加えプロトプラストを混合した。
3.処置した細胞を氷上で30分間インキュベートした。
4.各ウェルに200μlのW5溶液を加え細胞を混合した。
5.プレートを氷上で30分間インキュベートし、各ウェルの底部にプロトプラストを沈殿させた。
6.沈殿したプロトプラスト上の培地200μlを除去した。
7.85μlの培養培地(MSAP,Mathur et al.,1995)を加えた。
8.プレートは48時間暗所において室温でインキュベートした。培養培地添加後のGRONの最終濃度は8μMである。
GRON送達後48時間で、サンプルをフローサイトメトリーによって分析し、その緑色蛍光と黄色蛍光が対照プロトプラストのそれと異なるプロトプラストを検出した(BFP0はBFP標的と比較して変化がない非標的GRONを示し、Cはコード鎖設計であり、NCは非コード鎖設計である)。BFP4分子の中心においてC→Tの1ヌクレオチド差(コード鎖)またはG→Aのヌクレオチド標的突然変異(非コード鎖)。緑色蛍光はBFP遺伝子における標的突然変異の導入によって引き起こされ、GFPの合成をもたらす。結果は図1中に示す。
表2は、青色蛍光タンパク質(BFP)遺伝子から緑色蛍光への転換用に設計した、例示的な101量体および201量体BFP4/NC5’−3PS/3’−3PSGRONの配列を示す。「3PS」は、5’と3’オリゴ末端それぞれにおける3個のホスホチオエート結合を示す。
5’Cy3/3’idC標識GRONを使用した転換率
この実施例系の目的は、(GRONの各末端に3PS成分を有する)ホスホチオエート(PS)標識GRONと、5’Cy3/3’idC標識GRONの効率を比較することである。5’Cy3/3’idC標識GRONは、5’Cy3フルオロフォア(アミダイト)および3’idC逆向き塩基を有する。青色蛍光タンパク質(BFP)から緑色蛍光への転換を使用して効率を評価した。
個々のファルコンチューブ中(「チューブ」で標識)または96ウェルプレート(「96ウェルディッシュ」で標識)のいずれかにおいてプロトプラストへのGRONのPEG送達により行った、3つ全ての実施例において、サイトメトリーにより測定して、BFPからGFPへの転換効率において異なるGRONの化学的性質の間に有意な差はなかった(図1)。
41量体BFP4/NC5’−3PS/3’−3PSGRONと2’−O−MeGRONの間の比較
この実施例系の目的は、DNA切断を誘導するブレオマイシンファミリーのメンバー、ゼオシン(商標)(1mg/ml)の有無の下で、GRONの各末端に3PS成分を有するホスホチオエート(PS)標識GRONと2’−O−Meまたは「岡崎フラグメントGRON」の転換効率を比較することである。これらのGRONの設計は図2中に示す。GRONはPEG処置によりシロイヌナズナBFPプロトプラストに送達し、BFPからGFPへの転換は処置後24時間でサイトメトリーにより測定した。ゼオシン(1mg/ml)で処置したサンプルは、PEG処置前に氷上で90分間ゼオシンとインキュベートした。
一般に、サイトメトリーにより測定して、ゼオシン(1mg/ml)の存在によってBFPからGFPへの転換は増大した(表3)。ゼオシンの存在下と不在下の両方で、GRONの5’末端における第1のRNA塩基上に1つの2’−OMe基を含有するNC岡崎フラグメントGRONは、第1の9個の5’RNA塩基のそれぞれに1つの2’−OMe基を含有するNC岡崎フラグメントGRONと比較したとき、BFPからGFPへの転換においてより有効であった(図2および表3)。
全ての実施例において、サイトメトリーにより測定して、1mg/mlのゼオシンの存在下と不在下の両方でBFPからGFPへの転換において、41量体BFP4/NC5’3PS/3’3PSと、第1の5’RNA塩基上に1つの5’2’−Ome基を含有する71量体岡崎フラグメントBFP4/NCGRON(BFP471量体(1)NCと示す)の間に有意な差はなかった(図2および表3)。ゼオシン(およびおそらくブレオマイシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよびこの抗生物質ファミリーの他のメンバー)の存在下において、転換は鎖非依存的になる(すなわち、これらの実施例中で試験した設計を有するコード(C)GRONと非コード(NC)GRONの両方がほぼ同じ活性を示す)ことを記すことは重要である。
41量体、101量体、および201量体BFP4/NC5’−3PS/3’−3PSGRONの間の比較
この実施例系の目的は、(ゼオシンの有無の下で)、異なる長さのGRONの各末端に3PS成分を有するホスホチオエート(PS)標識GRONの転換効率を比較することであった。41量体、101量体、および201量体を表2中に示す。再度、サイトメトリーにより測定して、ゼオシン(1mg/ml)の存在によってBFPからGFPへの転換率は増大した(表4)。3つの実施例全てにおける大まかな傾向は、ゼオシンの存在下と不在下の両方でNCGRON長の増大に比例した。ゼオシン存在下でのBFP−4/NC/101とBFP−4/C/101以外、これは41量体NCGRONとほぼ等しいがそれよりは低い転換率を有していた。これは、BFP−4/41コードおよび非コードGRONを使用した前の全ての実施例とは対照的であり、この場合非コードGRONは常にコードGRONより優れていた。転換頻度のこの非対称性は、この実施例系で使用したBFP−4/201GRONにも当てはまった。
Cas9タンパク質の植物への送達
本実施例は、CRISPR−Cas発現プラスミドの送達の代替として、植物細胞への組換えCas9タンパク質の直接送達を利用するものである。この方法は、細胞浸透ペプチド(CPP)、トランスフェクションリポソーム試薬、ポリ(エチレングリコール)(PEG)などの担体を、単独で、または組み合わせて用いて、活性組換えCas9タンパク質の細胞への送達を可能にする。
方法
誘導根部組織由来BFPトランスジェニックArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度でウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種する。次いで、20:1、10:または5:1その他のCPPとカーゴの比でCPP(例えば、TAT、ペネトラチン、Chariot(商標)、PEP−1またはその他)で予め被覆された、またはリポソーム試薬と共に封入された蛍光タグ付き組換えCas9タンパク質(1μg)を、播種されたプロトプラストと混合し、23℃で2〜6時間インキュベートして、Cas9/担体複合体を細胞に浸透させる。別の一連の処理において、上記のようにCPPで予め被覆された、または被覆されていない蛍光タグ付き組換えCas9タンパク質(1μg)を、PEG法を使用してプロトプラストに導入する。次いで、プロトプラストを、処理の24時間後にフローサイトメトリーによって分析して、所与の処理内でのCas9陽性プロトプラストの割合を決定した。
201量体±ゆらぎ塩基GRONを含むCRISPR
この一連の実施例の目的は、bfp遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのCRISPRおよび変換を仲介するための201量体GRONを使用して本発明者らのArabidopsis thalianaのBFPトランスジェニックモデル系におけるBFPからGFPへの変換を証明することである。BFP CRISPRは、bfp遺伝子のコード鎖を標的とし、変換部位はPAM配列の27bp上流にある(図3)。GRONを鋳型として使用して、CRISPRにより作出されたbfp遺伝子中の二本鎖切断を修復し、標的遺伝子をBFPからGFPへ変換することと共に、同様に、BFP CRISPRのPAM配列に対応するbfp遺伝子中にゆらぎ塩基を導入する。BFP CRISPRのPAM配列中のゆらぎ塩基は、一度、変換が起こったら、CRISPRによるbfp遺伝子の再切断を最小化すると仮定される。この一連の実施例は、変換されたbfp遺伝子中のBFP CRISPRのPAM配列中へのゆらぎ塩基の導入が変換効率を高めるか、またはそうでないかに対処するのに役立つ。
方法
誘導根部組織由来BFPトランスジェニックArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度でウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種した。CRISPRをコードしたプラスミドは、rbcSEC9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するマンノピンシンターゼ(MAS)プロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共にsgRNAを駆動するArabidopsis U6プロモーターを含有する。GRONと共にCRISPRプラスミドを、それぞれ、0.05μg/μlおよび0.16μMの最終濃度でPEG仲介性送達によりプロトプラスト中に導入した。プロトプラストを、23℃で72時間、暗室中でインキュベートした後、それらをフローサイトメトリーによって分析して、所与の処理内のGFP陽性プロトプラストの割合を決定した。
CRISPRは、2つの構成要素:両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼをBFP標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実施例では、BFPはbgp遺伝子を標的とする(図3)。ゆらぎ塩基を含む、または含まないBFPを標的とする201量体GRONを用いて、BFPからGFPへの変換の速度に対するそれらの効果を決定した。表5は、GRONとその対応する配列の一覧を与える。
結果
BFP CRISPRを使用した場合、ゆらぎ塩基を含むBFP4/C GRONは、ゆらぎ塩基を含まないBFP4/C GRONと比較したとき、BFPからGFPへの変換において最大で3.5倍効率的である(表6)。ゆらぎ塩基を含むBFP4/C GRONを、ゆらぎ塩基を含むBFP4/NC GRONの代わりに使用する場合、BFPからGFPへの変換の最大で5.9倍の増大が存在する(表6)。したがって、ゆらぎ塩基を含むBFP4/C GRONは、BFP CRISPRと共に使用した場合、BFPからGFPへの変換において最も効率的である。
結論
変換された標的遺伝子中のBFP CRISPRのPAM配列を変化させるGRON中にゆらぎ塩基を含有させることは、BFPからGFPへの変換を増大させる。ゆらぎに基づくGRONと共にBFP CRISPRによるBFPからGFPへの変換を、次世代配列決定により確認した(データは示さない)。さらに、DNAを切断し、bfp遺伝子中にインデルを生成するBFP CRISPRの能力を、次世代配列決定により確認した(データは示さない)。
Cy3修飾されたGRONを含むCRISPR
この一連の実施例の目的は、bfp遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためにCRISPRおよび変換を仲介するためにGRONを使用して、本発明者らのArabidopsis thaliana BFPトランスジェニックモデル系におけるBFPからGFPへの変換を証明することである。これらの実施例において使用されたBFP6 CRISPR(CR:BFP6)は、bfp遺伝子を標的とし、変換部位の近くでDNAの二本鎖切断を引き起こす。BFP6 CRISPRと共に使用されるGRONは、変換部位の周囲にbfp遺伝子のコード配列を含有し、Cy3については5’末端で、およびidC逆向き塩基については3’末端で標識され、ここでは、Cy3 GRONと呼ばれる。これらのGRONを、41量体、101量体および201量体の3つの異なる長さで試験し、それらを、それらがGRONの5’末端と3’末端の両方に3ホスホチオエート結合を有する点でのみCy3 GRONと異なる3PS GRONと直接比較する。これらのGRONを、本明細書では3PS GRONと呼ぶ。これらの実施例において使用されたGRONの一覧については表7を参照されたい。
方法
誘導根部組織由来BFPトランスジェニックArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度でウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種した。CRISPRをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するMASプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共にsgRNAを駆動するArabidopsis thaliana U6プロモーターを含有する。GRONと共にCRISPRプラスミドを、CRISPRについては0.05μg/μlならびに41量体については8.0μM、101量体については0.32μMおよび201量体GRONについては0.16μMの最終濃度でPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。GRON処理は単独で、41量体については8.0μM、101量体については5.0μMおよび201量体については2.5μMのPEG送達後に最終GRON濃度を受けた。プロトプラストを、23℃で72時間、暗室中でインキュベートした後、それらをフローサイトメトリーによって分析して、所与の処理内のGFP陽性プロトプラストの割合を決定した。
CRISPRは、2つの構成要素:両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼをBFP標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実験では、bfp遺伝子を標的とするBFP6 CRISPR(5’GGTGCCGCACGTCACGAAGTCGG3’)を使用した。GRONは、変換部位の近くにbfp遺伝子のコード配列を含有する。表7は、使用したGRONの一覧を与える。
結果
BFP6 CRISPRを用いた場合、試験した全ての長さにおいて、Cy3 GRONは3PS GRONと同程度に効率的にBFPからGFPへの変換を仲介することができる(図4)。全体として、BFP6 CRISPRおよびGRONを含有するサンプルは、GRONのみのサンプルと比較したとき、より高レベルのBFPからGFPへの変換を有し(図4)、CRISPRが変換速度の増大に対して有する陽性の影響を証明している。
様々なサイズのGRONを含むCRISPR
この一連の実施例の目的は、bfp遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのCRISPRおよび変換を仲介するための様々な長さのGRONを使用して、本発明者らのArabidopsis thaliana BFPトランスジェニックモデル系においてBFPからGFPへの変換を証明することである。これらの実施例において使用されたBFP CRISPRはbfp遺伝子を標的とし、変換部位の近くでDNA中の二本鎖切断を引き起こす。BFP CRISPRと共に使用したGRONは、変換部位の周囲にbfp遺伝子のコード配列を含有し、5’末端と3’末端の両方において3ホスホチオエート結合で標識され、本明細書では3PS GRONと呼ばれる。これらのGRONを60量体、101量体および201量体の3つの異なる長さにおいて試験し、それらを、GRONのみの処理と直接比較する。これらの実施例において使用されたGRONの一覧については、表8を参照されたい。
方法
誘導根部組織に由来するBFPトランスジェニックArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度で、ウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種した。CRISPRをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するMASプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共にsgRNAを駆動するArabidopsis thaliana U6プロモーターを含有する。GRONと一緒にCRISPRプラスミドを、CRISPRについては0.05μg/μlならびに60量体については0.547μM、101量体については0.32μMおよび201量体GRONについては0.16μMの最終濃度でのPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。GRON処理は単独で、60量体については7.5μM、101量体については5.0μMおよび201量体については2.5μMのPEG送達後に最終GRON濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、23℃で72時間インキュベートした後、それらをフローサイトメトリーによって分析して、所与の処理内のGFP陽性プロトプラストの割合を決定した。
CRISPRは2つの構成要素:両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼをBFP標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。BFP CRISPRスペーサー配列は、5’GTCGTGCTGCTTCATGTGGT3’である。本実施例では、bfp遺伝子を標的とするBFP CRISPRを使用した。GRONは、変換部位の近くにbfp遺伝子のコード配列を含有する。表8は、使用したGRONの一覧を与える。
結果
BFP CRISPRを用いた場合、101nt以上の長さのGRONは、60nt長のGRONと直接比較したとき、BFPからGFPへの変換の媒介において良好である(図5)。全体として、BFP CRISPRおよびGRONを含有するサンプルは、GRONのみのサンプルと比較したとき、より高レベルのBFPからGFPへの変換を有し(図5)、CRISPRが変換速度の増大に対して有する陽性の影響を証明している。このデータはさらに、CRISPRと一緒に使用したとき、BFPからGFPへの変換の媒介において最も効率的であるGRONの長さは、101nt以上の長さである必要があることを示している。
2’−O−Me GRONを含むCRISPR
本実施例の目的は、bfp遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのCRISPRおよび変換を仲介するためのGRONを使用して、本発明者らのArabidopsis thaliana BFPトランスジェニックモデル系においてBFPからGFPへの変換を証明することである。本実施例において使用されたBFP CRISPRはbfp遺伝子を標的とし、変換部位の近くでDNA中の二本鎖切断を引き起こす。BFP CRISPRと共に使用したGRONは、変換部位の周囲にbfp遺伝子のコード配列または非コード配列を含有し、GRONの最初の10個の5’塩基はDNA塩基ではなくRNA塩基である。これらのRNA塩基を、図6に記載されるように、最初の5’RNA塩基または最初の9個の5’RNA塩基のいずれかにおいて2’−O−Me基で標識する。これらのGRONを本明細書では2’−O−Me GRONと呼び、GRONの5’末端と3’末端の両方に3ホスホチオエート結合を有するDNA塩基を含有する同様の長さの3PS GRONと直接比較する。これらのGRONは、本明細書では3PS GRONと呼ばれる。本実施例において使用されたGRONの一覧については、表9を参照されたい。
方法
誘導根部組織に由来するBFPトランスジェニックArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度で、ウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種した。CRISPRをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するMASプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共にsgRNAを駆動するArabidopsis thaliana U6プロモーターを含有する。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。GRONと一緒にCRISPRプラスミドを、CRISPRについては0.05μg/μlならびに71量体については0.5μMおよび201量体GRONについては0.16μMの最終濃度でのPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。GRON処理は単独で、71量体については5.0μMおよび201量体については2.5μMのPEG送達後に最終GRON濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、23℃で72時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のGFP陽性プロトプラストの割合を決定した。
CRISPRは2つの構成要素:両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼをBFP標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。BFP CRISPRスペーサー配列は、5’CTCGTGACCACCTTCACCCA3’である。本実施例では、bfp遺伝子を標的とするBFP CRISPRを使用した。GRONは、変換部位の近くにbfp遺伝子のコード配列または非コード配列を含有する。表9は、使用したGRONの一覧を示す。
結果
BFP CRISPRを使用した場合、71量体および201量体の2’−O−Me GRONは、(0)、(1)または(9)の様々な異なる型のGRON保護と比較したとき、類似するBFPからGFPへの変換を有していた(図7および図8)。2’−O−Me GRONは、BFP CRISPRを使用した場合、BFPからGFPへの変換の媒介においてその3PS GRON相当物よりも効率的である(図7および図8)。
GRONを導入したCRISPRニッカーゼ
本実施例の目的は、bfp遺伝子中の標的二本鎖ニックを作出するためのCRISPRおよび変換を仲介するためのGRONを使用して、本発明者らのArabidopsis thaliana BFPトランスジェニックモデル系においてBFPからGFPへの変換を証明することである。本実施例において使用されたBFP1 CRISPR(CR:BFP1)はbfp遺伝子を標的とし、それぞれ、ガイドRNAと相補的または非相補的なDNA鎖上の変換部位の近くでDNA中の一本鎖ニックを引き起こす触媒残基中に突然変異(RuvC中ではD10AおよびHNH中ではH840A)を含有する。これらのCRISPRを、本明細書ではBFP1 CRISPRニッカーゼD10AおよびBFP1 CRISPRニッカーゼH840Aと呼び、別々のプラスミド上で単独で、またはBFP5 sgRNAと一緒に使用する。本実施例において複数のCRISPRニッカーゼを使用する場合、それらは同じDNA鎖または反対のDNA鎖をニックすることができる。D10AまたはH840Aのいずれかの同じ突然変異を含有する両方のCas9タンパク質を一緒に使用する場合、それらはDNAの同じ鎖をニックする。逆に、2つのCas9タンパク質を一緒に使用し、それらの一方がD10A突然変異を含有し、他方の1つがH840A突然変異を含有する場合、それらはDNAの反対の鎖をニックする。ニッカーゼCRISPRと共に使用したGRONは、BFP5 CRISPRのPAM配列中に位置する1つのゆらぎ塩基と共に、変換部位の周囲にbfp遺伝子のコード配列または非コード配列のいずれかを含有する。これらのGRONは、5’末端と3’末端の両方に3ホスホチオエート結合を有し、本明細書では3PS GRONと呼ばれる。これらの実施例で使用されたGRONの一覧については、表10を参照されたい。ニッカーゼCRISPRを、bfp遺伝子のDNA中で標的二本鎖切断を引き起こすことができるそのCRISPR相当物と直接比較する。
方法
誘導根部組織に由来するBFPトランスジェニックArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度で、ウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種した。CRISPRをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するMASプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共にsgRNAを駆動するArabidopsis thaliana U6プロモーターを含有する。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。Cas9遺伝子は、触媒残基中に突然変異、RuvC中ではD10AまたはHNH中ではH840Aを含有する。GRONと一緒にCRISPRプラスミドを、CRISPRについては0.05μg/μlおよび201量体については0.16μMの最終濃度でのPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。GRON処理は単独で、201量体については2.5μMのPEG送達後に最終GRON濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、23℃で72時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のGFP陽性プロトプラストの割合を決定した。
CRISPRは2つの構成要素:両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼをBFP標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実施例では、変換部位の近くのbfp遺伝子の異なる領域を標的とするBFP1およびBFP5 sgRNAを使用した。BFP1スペーサー(5’CTCGTGACCACCTTCACCCA3’)はbfp遺伝子のコード鎖を標的とするが、BFP5スペーサー(5’GTCGTGCTGCTTCATGTGGT3’)は非コード鎖を標的とする。GRONは、変換部位の近くにbfp遺伝子のコード配列または非コード配列を含有する。表10は、使用したGRONの一覧を示す。
結果
CRISPRニッカーゼは両方とも(D10AおよびH840A)、BFP1 CRISPRおよびBFP5 CRISPRを別々ではなく一緒に使用したとき、BFPからGFPへの変換を仲介するのにより効率的である(図9)。さらに、BFP1およびBFP5 D10A CRISPRニッカーゼをC/201 1W GRONと一緒に使用する場合、BFPからGFPへの変換は、これらのCRISPRニッカーゼをNC/201 1W GRONと共に使用する処理と比較したとき、有意により高い(図9)。BFP1およびBFP5 H840A CRISPRニッカーゼを一緒に使用する場合、C/201またはNC/201 1W GRONのいずれかに関して、大まかに同レベルのBFPからGFPへの変換が観察される(図9)。BFPからGFPへの変換のこれらのレベルは、BFP5 CRISPRを単独で使用するときよりもわずかに高く、BFP1 CRISPRを単独で使用するときよりもわずかに低い(図9)。
複数の遺伝子を標的とするCRISPRの使用
本実施例の目的は、標的遺伝子中の二本鎖切断を作出するためのCRISPRおよび変換を仲介するためのGRONを使用して、Arabidopsis thalianaモデル系に由来するプロトプラストの所与の集団において同時的に複数の遺伝子の変換を証明することである。本実施例において使用されたCRISPRは、プロトプラスト中に、Cas9遺伝子ならびにBFP遺伝子とアセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)遺伝子の両方を標的化する複数のsgRNAをコードするプラスミドを導入することによって、Arabidopsis thalianaゲノム中のこれらの2つの異なる遺伝子を標的とする。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。これにより、Cas9は、その変換を仲介するGRONの存在下でBFP遺伝子とAHAS遺伝子の両方における二本鎖切断を引き起こすことができる。
方法
誘導根部組織に由来するArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度で、ウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種する。CRISPRをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するMASプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共に複数の異なるsgRNAを駆動するArabidopsis thaliana U6プロモーターを含有する。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。GRONと一緒にCRISPRプラスミドを、CRISPRについては0.05μg/μlおよび201量体については0.16μMの最終濃度でのPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。GRON処理は単独で、201量体については2.5μMのPEG送達後に最終GRON濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、23℃で72時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターおよび対立遺伝子特異的PCRアッセイによって分析して、所与の処理内のそれぞれBFPからGFPへ変換されたプロトプラストおよびAHAS変換されたプロトプラストの両方の割合を決定した。
対立遺伝子特異的PCRアッセイでは、ゲノムDNAの5,000個のゲノム等価物の10〜16個の複製物を、一次PCR反応において使用した。
CRISPRは2つの構成要素:両方とも同じか、または複数のプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実施例では、異なるsgRNAおよびGRONを使用して、その変換部位の近くの複数の遺伝子を標的化する;BFPスペーサー(5’CTCGTGACCACCTTCACCCA3’)およびAHASスペーサー(5’TGGTTATGCAATTGGAAGATCGC3’)。表11は、使用したGRONを記載する。
結果
BFPからGFPへの変換およびAHAS変換を、Arabidopsis thaliana BFPトランスジェニック系統へのBFPおよびAHAS CRISPRプラスミドならびにBFP/C 201量体およびAHAS(W)574/NC 201量体GRONのPEG送達の144時間後に決定した。フローサイトメトリーデータは、処理1が0.20%のBFPからGFPへの変換をもたらすことを示していた(表12)。対立遺伝子特異的PCRアッセイは、処理1が0.01%のAHAS変換されたプロトプラストをもたらすことを示していた(表12)。GRONのみの処理は、両アッセイを使用した場合、最小の変換を示した(表12)。本実施例は、Arabidopsis thaliana BFPモデル系に由来するプロトプラストの所与の集団内の2つの独立した標的遺伝子(BFPおよびAHAS)の同時的変換の成功を証明する。
植物細胞へのCas9 mRNAの送達
本実施例は、CRISPR Cas発現プラスミドの送達に対する代替手段として植物細胞への組換えCas9 mRNAの直接送達を利用する。この方法は、(1)修飾mRNAのin vitroでの合成および(2)植物細胞へのこの修飾mRNAの送達を含む。
方法
Cas9 mRNAを、5’UTR、タンパク質のコード配列(CDS)および3’UTRを含む線状化プラスミド鋳型に由来するT7、T3またはSP6などのRNAポリメラーゼを使用して、in vitroで転写させる。1つのRNAポリメラーゼは、別のものよりも良好な特定の修飾ヌクレオシドを含有してもよい。5’UTRは、C型肝炎ウイルスのMiR−122などのその安定性を改善するエレメントを含有してもよい(Shimakami et al.,2012)。in vitroでの合成は、保護的であり、標的植物細胞中での良好な翻訳を確保するヌクレオシドを含む。組換えCas9 mRNAは捕捉され、ポリA尾部を含有する。
誘導根部組織に由来するBFPトランスジェニックArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度で、ウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種する。組換えCas9 mRNAを、単独で、または組み合わせて、以下の手段の1つ(一覧は包括的ではない):細胞浸透ペプチド(CPP)、トランスフェクションリポソーム試薬、ポリ(エチレングリコール)(PEG)で植物細胞中に送達して、活性組換えCas9 mRNAの細胞への送達を可能にする。
DNA、RNAまたはタンパク質をテザリングするためのCRISPR−Cas
本実施例は、以下の実施例において示されるように、リンカー配列(テザリング配列と呼ぶこともできる)がtracrRNAの3’末端であるが、RNAポリメラーゼIII終結シグナルの5’に含まれる修飾された単一ガイドRNA(sgRNA)カセットを利用する(図10)。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。好ましいが、リンカーの配置はtracrRNAの3’末端に限られないが、sgRNAカセット内の幾つかの位置で調査される。リンカー配列は、ヌクレオチド長において変化してもよく、またはテザリングを改善するか、もしくは三本鎖相互作用を介して係留される分子数を増加させる二次構造を含有してもよい。
リンカーは、相補的配列を含有するDNA、RNAまたはタンパク質とのワトソン−クリック塩基対形成を可能にする(図10)。さらに、sgRNA中のリンカー配列を、複数のDNA、RNAまたはタンパク質分子をテザリングするより複雑な多面的相互作用領域を可能にする進化した二次および三次構造を含有するように設計する。
全体の概念は、CRISPR−Cas複合体がヌクレアーゼ活性の部位に生物学的分子をテザリングすることによって、遺伝子編集の可能性を増大させるということである。これらの生物学的分子は、標的遺伝子の変換を仲介するGRONを含む。テザリングリンカーを、単に、例えば、Gene Stringsまたはアニーリングしたオリゴを使用することによってsgRNAに付加することができる。
方法
誘導根部組織に由来するBFPトランスジェニックArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度で、ウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種する。CRISPR−Casテザリングプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するMASプロモーターおよびbfpを標的化するGRONを編集する201量体上に位置する15〜30bpのポリヌクレオチド経路と相補的であるリンカー配列と共にsgRNAを駆動するArabidopsis thaliana U6プロモーターを含有する(図10に示される)。sgRNAテザリングカセットはポリ−T10ターミネーターによって終結される。GRONと共にCRISPR−Casプラスミドを、CRISPRについては0.05μg/μlおよび201量体GRONについては0.16μMの最終濃度でPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。GRON処理は単独で、201量体については2.5μMのPEG送達後に最終GRON濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、23℃で72時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のGFP陽性プロトプラストの割合を決定した。
CRISPRは2つの構成要素:両方とも同じか、または異なるプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)とリンカーとの融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼをBFP標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実施例では、bfp遺伝子を標的化するCRISPRを使用する。GRONは、変換部位の近くにbfp遺伝子のコード配列または非コード配列を含有する。
トランケートされたgRNAを含むCRISPR
本実施例の目的は、標的遺伝子中の二本鎖切断を作出するためのCRISPRおよび変換を仲介するためのGRONを使用して、Arabidopsis thaliana BFPモデル系に由来するプロトプラスト中でのBFPからGFPへの変換を証明することである。本実施例において使用されたCRISPRは、2つの異なる長さであるCas9遺伝子および1つのsgRNAをコードするプラスミドをプロトプラスト中に導入することによって、Arabidopsis thalianaゲノム中のbfp遺伝子を標的とする。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。Cas9を標的遺伝子に誘導するcrRNAはスペーサーと呼ばれ、それは典型的には20nt長(CR:BFP1 20nt)であるが、これらの実施例では、本発明者らはBFPからGFPへの変換を仲介する際により小さい長さの17nt(CR:BFP1 17nt)のスペーサーを使用する有効性を試験した。
方法
誘導根部組織に由来するArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度で、ウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種する。CRISPRをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するMASプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共に複数の異なるsgRNAを駆動するArabidopsis thaliana U6プロモーターを含有する。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。GRONと一緒にCRISPRプラスミドを、CRISPRについては0.05μg/μlおよび201量体については0.16μMの最終濃度でのPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。GRON処理は単独で、201量体については2.5μMのPEG送達後に最終GRON濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、23℃で72時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のGFPに対するBFPの割合を決定した。
CRISPRは2つの構成要素:両方とも同じか、または複数のプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。これらの実施例では、20nt(5’CTCGTGACCACCTTCACCCA3’)対17nt(5’GTGACCACCTTCACCCA3’)の2つの異なる長さのBFP1スペーサーを試験した。表13は、使用したGRONを記載する。
結果
20bpから17bpへのBFP1プロトプラストの長さの減少は、Arabidopsis thaliana BFPモデル系へのプラスミドおよびGRONのPEG送達の72時間後に、それぞれ、0.163%対0.177%の同様のレベルのBFPからGFPへの変換を有していた(図11)。
アンプリコンgRNAを含むCRISPR
本実施例の目的は、標的遺伝子中の二本鎖切断を作出するためのCRISPRおよび変換を仲介するためのGRONを使用して、Arabidopsis thaliana BFPモデル系に由来するプロトプラスト中でのBFPからGFPへの変換を証明することである。本実施例において使用されたCRISPRは、プラスミド上にコードされるか、またはアンプリコンとしてプロトプラスト中に導入されるCas9遺伝子および1つのsgRNAをコードするプラスミドをプロトプラスト中に導入することによって、Arabidopsis thalianaゲノム中のbfp遺伝子を標的とする。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNAはCas9を標的遺伝子に誘導し、そこでCas9は二本鎖切断を作出し、GRONは、部位特異的様式でBFPをGFPに変換するための鋳型として使用される。
方法
誘導根部組織に由来するArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度で、ウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種する。CRISPRをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するMASプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共に複数の異なるsgRNAを駆動するArabidopsis U6プロモーターを含有する。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。GRONと一緒にCRISPRプラスミドを、CRISPRについては0.05μg/μlおよび201量体については0.16μMの最終濃度でのPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入する。GRON処理は単独で、201量体については2.5μMのPEG送達後に最終GRON濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、23℃で72時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のGFPに対するBFPの割合を決定した。
CRISPRは2つの構成要素:両方とも同じか、または複数のプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。これらの実施例では、同じBFP6 gRNA(5’GGTGCCGCACGTCACGAAGTCGG3’)を、アンプリコンとしてプロトプラスト中に送達するか、またはプラスミド上にコードさせた。表14は、使用したGRONを記載する。
結果
Cas9のみを含有するプラスミドと一緒のアンプリコンとしてのBFP6 gRNA(CR:BFP6(gRNAアンプリコン))の送達は、Arabidopsis thaliana BFPモデル系へのプラスミドおよびGRONのPEG送達の72時間後に別々のプラスミド上にコードされるgRNA(gRNAプラスミド)とCas9の両方による処理と比較した場合、BFPからGFPへの変換の同様の速度を有していた(図12)。
非修飾GRONを含むCRISPR
本実施例の目的は、bfp遺伝子中の標的二本鎖切断を作出するためのCRISPRおよび変換を仲介するためのGRONを使用して、Arabidopsis thaliana BFPトランスジェニックモデル系におけるBFPからGFPへの変換を証明することである。本実施例において使用されたBFP CRISPRは、bfp遺伝子を標的とし、変換部位の近くでDNA中の二本鎖切断を引き起こす。3PS GRONは、GRONの5’末端と3’末端の両方に3ホスホチオエート結合を有するDNA塩基を含有し、本明細書では3PS GRONと呼ばれる。3PS GRONを、本発明者らのBFPトランスジェニックArabidopsis thalianaモデル系においてBFP CRISPRを用いて仲介されたBFPからGFPへの変換におけるその非修飾GRON相当物と直接比較した。これらの実施例で使用されたGRONの一覧については、表15を参照されたい。
方法
誘導根部組織に由来するBFPトランスジェニックArabidopsis thalianaプロトプラストを、1×107細胞/mlの細胞密度で、ウェルあたり250,000個の細胞で平底96ウェルプレート上に播種した。CRISPRをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するMASプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共にsgRNAを駆動するArabidopsis U6プロモーターを含有する。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。GRONと一緒にCRISPRプラスミドを、CRISPRについては0.05μg/μlおよび41量体GRONについては0.16μMの最終濃度でのPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。GRON処理は単独で、41量体については0.8μMのPEG送達後に最終GRON濃度を受けた。プロトプラストを暗室中、23℃で72時間インキュベートした後、それらをフローサイトメーターによって分析して、所与の処理内のGFP陽性プロトプラストの割合を決定した。
CRISPRは2つの構成要素:両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼをBFP標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。BFP CRISPRスペーサー配列は、5’CTCGTGACCACCTTCACCCA3’である。本実施例では、bfp遺伝子を標的とするBFP CRISPRを使用した。GRONは、変換部位の近くにbfp遺伝子の非コード配列を含有する。表16は、使用したGRONを記載する。
結果
41量体の3PS GRONは、BFP CRISPRを使用するBFPからGFPへの変換の仲介においてその非修飾GRON相当物よりも効率的である(図13)。
アマにおけるTALENおよびGRON
本実施例の目的は、TALENプラスミドおよびGRONの送達後、プロトプラスト中では24時間および微小パルス中では3週間の両方でのアマにおけるEPSPS変換を証明することである。本実施例で使用されるTALENは、茎頂由来プロトプラスト中に、二本鎖切断を作出するTALENおよび部位特異的様式でepsps遺伝子を変換するための鋳型として使用されるGRONをコードするプラスミドを導入することによってLinum usitatissimumゲノム中のepsps遺伝子を標的とする。
方法
アマのプロトプラストを、in vitroで発芽させた苗から得られた茎頂から単離した。TALENプラスミドを、GRONと共に、それぞれ、0.05μg/μlおよび0.5μMの最終濃度でのPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。プロトプラストを、暗室中、液体培地中、25℃で最大48時間インキュベートしたか、またはアルギン酸ビーズ(5×105細胞/ml)中に埋め込み、液体培地中で培養して、細胞分裂および微小カルスの形成を誘導した。DNA送達の24時間または3週間後に得られたプロトプラストまたは微小カルスサンプルを、NGSによって分析して、所与の処理内で標的突然変異を実行する細胞の割合(DNAリード)を決定した。不完全なNHEJ仲介型DNA修復により生成されたインデルのパーセントも見積もった。
TALEN構築物は、それぞれ、FokIの触媒的DNA切断ドメインに連結されたTALエフェクター様DNA結合ドメインからなる2つのアーム(左および右)を含む。TALエフェクター様DNA結合ドメインは、各アームのFokIエンドヌクレアーゼが一緒に二量体化し、二本鎖DNAを切断することができるDNAの特定部位にTALENアームを誘導する。TALENをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にMasP::LuEPSPS_(左アーム)−T2A−LuEPSPS_(右アーム)を含有する。LuEPSPS_(左アーム)配列は5’TGGAACAGCTATGCGTCCG3’であり、LuEPSPS_(右アーム)配列は5’TGAGTTGCCTCCAGCGGCT3’である。ゆらぎ塩基を含む、または含まないLuEPSPSを標的化するGRON(144量体)を用いて、変換速度に対するその効果を決定した。
結果
24時間のプロトプラストおよび3週齢の微小カルスは、次世代配列決定により決定した場合、それぞれ、0.067%および0.051%EPSPS変換を有する(図14)。さらに、これらのデータは、TALENが活性であり、Linum usitatissimum中のepsps標的遺伝子を切断することができ、プロトプラスト中では24時間で、微小カルス中では最大3週間で、それぞれ2.60%および1.84%のインデルを形成することを示す。さらに、EPSPS変換およびインデルは、TALENプラスミドおよびGRONが導入された後最大3週間維持される。
アマにおけるCRISPRおよびGRON
本実施例の目的は、Cas9プラスミドの送達の3および6週間後のアマ微小カルスにおけるCas9の活性を証明することである。本実施例で使用されたCRISPRは、Cas9遺伝子およびsgRNAをコードするプラスミドを茎頂由来プロトプラスト中に導入することにより、Linum usitatissimumゲノム中のepsps遺伝子を標的とする。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)とtrans活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNAは、Cas9を標的遺伝子に誘導し、そこでCas9は部位特異的様式でepsps遺伝子中に二本鎖切断を作出する。epsps遺伝子中の二本鎖切断は、遍在的NHEJ経路により修復された場合、切断部位の周囲にインデルを形成させる。
方法
アマのプロトプラストを、in vitroで発芽させた苗から得られた茎頂から単離した。CRISPRをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するMASプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共にsgRNAを駆動するArabidopsis thaliana U6プロモーターを含有する。CRISPRプラスミドを、0.05μg/μlの最終濃度でのPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。プロトプラストを、アルギン酸ビーズ(5×105細胞/ml)中に埋め込み、液体培地中で培養し、暗室中、25℃で回転式振盪器(30rpm)中でインキュベートした。個々の細胞から発生した微小カルスを、CRISPRプラスミド送達の3および6週間後にNGSによって分析して、誤りがちなNHEJ仲介型DNA修復経路により生成されたインデルを実行する細胞の割合(DNAリード)を決定した。
CRISPRは2つの構成要素:両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列を含有する。本実施例では、CRISPRはepsps遺伝子を標的とする。
結果
3および6週齢の微小カルスは、次世代配列決定により決定された場合、それぞれ、46.5%および54.7%のインデル形成を有する(図15)。これらのデータは、Cas9がLinum usitatissimum中で活性であり、EPSPS標的遺伝子を切断することができ、インデルを形成することを示している。さらに、これらのインデルは、CRISPRプラスミドが導入された後、最大6週間維持される。
操作されたヌクレアーゼの構築
CRISPR−Cas
一過的CRISPR−Cas9発現プラスミドの構築のために、NおよびC末端の両方にSV40 NLSならびにN末端に2xFLAGタグを含有する高等植物コドン最適化されたSpCas9遺伝子を、一連のGeneArt(登録商標)Strings(商標)(Life Technology、Carlsbad、CA)として合成した後、Gibson法により、マンノピンシンターゼ(MAS)プロモーターの下流およびエンドウマメリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ(rbcsE9)ターミネーターの上流にクローニングした。次に、発現がArabidopsis U6プロモーターにより駆動されるキメラgRNAからなるsgRNAカセットを、GeneArt(登録商標)Strings(商標)として合成した後、Gibson法を用いてCas9を含有する構築物中にシャトルし、pBCRISPRを形成させた。対応する標的配列のためのキメラgRNAを特定するために、可変性20nt sgRNA標的化配列をコードするDNAオリゴヌクレオチドの対(拡張データ、表2)をアニーリングさせて、4bpの突出部を有する短い二本鎖断片を作製した。この断片をBbsI消化されたpBCrispr中にライゲーションして、CRISPR−Cas構築物BC−1、BC−2およびBC−3を得た。
TALEN
TALEN発現構築物BT−1およびLuET−1の設計および構築は、Cermak et al., Nucleic Acids Res.39,e82(2011)に記載された規則に基づくものであった。標的配列を、NG、HD、NIおよびNNがそれぞれT、C、AおよびGを認識するという規則にしたがって、遺伝子編集部位および反復可変i残基(RVD)に基づいて選択した。ヘテロ二量体FokIドメインに連結されたTALエフェクタードメインの集合を、市販のサービス(GeneArt;Life Technologies)を介して完了させた。TALEN単量体を、Gibson法を用いてMASプロモーターの下流およびrbcE9ターミネーターの上流にクローニングし、2A結合単位として発現させた。
細胞培養およびプロトプラストの単離
表面滅菌したArabidopsisの種子を、12時間の明/暗周期の下、28℃で固体1/2MS培地(XXによるミネラルおよびビタミン;1/2濃縮;87.7mMスクロース)上で発芽させた。2〜3週齢の苗に由来する根材料を収集し、28℃で低光量条件下、1/2MS液体培地中で維持した。根培養物を、プロトプラストの単離の3週間前にMSAR[0.22% 1/2MS、87.7mMスクロース、11.4μM IAA、2.3μM 2,4−D、1.5μM 2iP、pH5.8]中に移し、維持した。根を約6mmのセグメントに切断し、細胞壁消化酵素[1.25%セルラーゼRS、0.25%マセロザイムR−10、0.6Mマンニトール、5mM MES、0.1%BSA]を含有するMSAP溶液[0.22% 1/2MS、87.7mMスクロース、11.4μM IAA、2.3μM 2,4−D、1.5μM 2iP、および400mMマンニトール、pH5.8]中で穏やかに振盪しながら暗室中で3〜4時間インキュベートした。遊離したプロトプラストを収集し、滅菌100μmフィルターおよび35μmフィルターを通過させた。プロトプラストの濾液を0.8倍容量のOptiprep(商標)Density Gradient Medium(Sigma)と混合し、穏やかに混合した。60%のW5[154mM NaCl、5mM KCl、125mM CaCl2・2H2O、5mMグルコース、10mM MES(pH5.8)]/40%のOptiprep溶液、次いで、90%のW5/10%のOptiprep溶液を、濾液/Optiprep溶液上にゆっくりと層化して勾配を作製し、198RCFで10分間遠心分離した。白色のプロトプラスト層を収集し、2倍容量のW5と混合した。プロトプラストを44RCFで10分間遠心分離し、TM溶液[14.8mM MgCl2・6H2O、5mM MES、572mMマンニトール(pH5.8)]中に1×107細胞/mlの密度で再懸濁した。Zeocin(商標)(Life Technologies、Carlsbad、CA)およびフレオマイシン(InvivoGen、San Diego、CA)を用いる実験のために、プロトプラストを、トランスフェクション前に氷上で90分間、pH7.0に調整したTM中で保持した。抗生物質濃度については、拡張データの図1を参照されたい。
アマのプロトプラストを、in vitroで発芽させた3週齢の苗から得られた茎頂から単離した。茎頂を、外科用メスを用いて細かく切り刻み、B培地[B5塩およびビタミン(Gamborg et al.,1968)、4mM CaCl2、0.1Mグルコース、0.3Mマンニトール、0.1Mグリシン、250mg/lカゼイン加水分解物、10mg/l L−システイン−HCL、0.5%ポリビニルピロリドン(MW10,000)、0.1%BSA、1mg/l BAP、0.2mg/l NAA、および0.5mg/l 2,4−D]中、室温で1時間、予め原形質分離を起こさせ、回転式振盪器(50rpm)上、25℃で5時間、0.66%セルラーゼYCおよび0.16%マセロザイムR−10を添加したB培地を含有する細胞壁消化酵素溶液中でインキュベートした。遊離したプロトプラストを篩にかけ、Optiprep(Sigma)層を用いる密度勾配遠心分離によって精製し、血球計を用いて計数し、B培地中、0.5×106個のプロトプラスト/mlの密度で暗室中で一晩、静置した。
プロトプラストのトランスフェクション
96ウェル平底プレート中で、PEG[270mMマンニトール、67.5mM Ca(NO32、38.4%PEG1500(pH5.8)]を用いて、ウェルあたり2.5×105個の細胞に、10pmolのGRON、10pmolのGRON+3.25μgのCRISPR−CasもしくはTALEN発現構築物またはモックをトランスフェクトした。細胞およびDNAを、氷上で30分間、PEGと共にインキュベートした後、200μlのW5溶液で洗浄した。最後に、85μlのMSAP++[50nMフィトスルホキン−αおよび20μM n−プロピルガレートを含有するMSAP]を添加し、細胞を28℃で低光量条件下で培養した。
培養の約18時間後、プロトプラストに、PEG仲介性送達を用いて、GRONと共にTALENプラスミド(20μgのプラスミドおよび0.2nmolのGRON/106個のプロトプラスト)をトランスフェクトした。処理されたプロトプラストを、B培地中、暗室中で25℃で最大48時間インキュベートしたか、またはトランスフェクションの24時間後にアルギン酸ビーズ中に埋め込み、V−KM液体培地中で培養して、細胞分裂および微小カルスの形成を誘導した。抗生物質実験のために、ウェルあたり1.25×105個の細胞に、上記のPEG溶液を用いて、8μMのGRON CG13をトランスフェクトした。
サイトメトリー
トランスフェクションの72時間後、細胞を、GFPについて必要に応じて放出を励起および検出しながらAttune(登録商標)Acoustic Focusingサイトメーター(Applied Biosystems(登録商標))を用いるサイトメトリーにより分析した。バックグラウンドレベルは、DNA送達を用いないPEG処理されたプロトプラストに基づいていた。抗生物質実験のために、トランスフェクションの前にZeocinまたはフレオマイシンで処理されたプロトプラストを、トランスフェクションの48時間後にサイトメトリーによって分析した。
配列決定分析
ゲノムDNAを、製造業者の推奨(Machery−Nagel、Bethlehem、PA)にしたがってNucleoSpin(登録商標)Plant IIキットを用いて、CRISPR−CasまたはTALEN処理されたプロトプラストから抽出した。TALENまたはCRISPR標的領域に隣接するアンプリコンを、100ngのゲノムDNAならびにArabidopsisのCRISPRおよびTALENについてはプライマーBFPF−1(5’−GGACGACGGCAACTACAAGACC−3’)/BFPR−1(5’−TAAACGGCCACAAGTTCAGC−3’);またはL.usitatissimumのTALENについてはLuEPF−1(5’−GCATAGCAGTGAGCAGAAGC−3’)/LuEPR−1(5’−AGAAGCTGAAAGGCTGGAAG−3’)と共にPhusion(登録商標)ポリメラーゼを用いて作製した。アンプリコンを精製し、Qiaquick MinEluteカラム(Qiagen、Valencia、CA)を用いて濃縮した。アンプリコンのディープシーケンシングを、2×250bpのMiSeqラン(Illumina、San Diego、CA)を用いるGeneWiz(South Plainfield、NJ)により実施した。データ分析のために、リード1およびリード2に関するfastqファイルを、CLC Genomics Workbench 7.0.4(CLCBio、Boston、MA)中にインポートした。リード対を、それらの配列が重複した場合、単一の配列に融合させた。アンプリコンの配列を、それまたはその逆向きかつ相補的配列がフォワードおよびリバースプライマー配列を含有する場合、同定した。サンプル中のユニークな配列の出現を、その存在量として記録した。インデルまたは遺伝子編集のパーセントを、編集またはインデルを有するリードの数を、配列決定されたリードの総数で除算した後、100を乗算することによって算出した。
統計分析
統計的有意性を、両側分布を用いるStudentのt検定を用いて決定した。0.05未満のP値を、有意と考えた。データを平均およびSEMとして示す。
結果
A.thalianaプロトプラスト中でのCRISPR−Casヌクレアーゼ活性および遺伝子編集
TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)およびクラスター化された一定間隔の短いパリンドロームリピート(CRISPR)関連エンドヌクレアーゼCas9(CRISPR−Cas9)などの操作されたヌクレアーゼをプログラムして、高い特異性で二本鎖DNAを標的化および切断することができる。TALENは、両方ともFokIの触媒的DNAヌクレアーゼドメインに連結されたTALエフェクター様DNA結合ドメイン(TALE)を有する2つのアームからなる。TALEドメインは、TALENアームをDNAの特定の部位に誘導し、FokIエンドヌクレアーゼの二量体化およびその後の二本鎖切断(DSB)の生成を可能にする。CRISPR−Cas9系は、2つの構成要素;Streptococcus pyogenesのCas9ヌクレアーゼ(SpCas9)と、操作された単一のガイド(sgRNA)と呼ばれる2つのRNA(crRNAおよびtracrRNA)のキメラ融合物からなる。sgRNAは、その最初の20個の5’塩基と、DNA標的との塩基対形成を介してCas9に対する標的核酸特異性を支援し、続いて、部位特異的DSBをもたらす。
植物においては、DSBは、典型的には、誤りがちな非相同末端結合(NHEJ)DNA修復経路により修復され、修復部位において無作為な欠失および/または挿入(インデル)をもたらす。対照的に、正確なゲノム編集は、多くの場合、姉妹染色分体における、相同な鋳型DNAの要件のため、NHEJよりも正確である修復経路である、相同性特異的修復(HDR)により修復される標的変化の近くでのヌクレアーゼ誘導DSBに依拠する。HDR経路を利用することにより、ヌクレアーゼにより切断される場合、特異的に、または二本鎖切断を誘導する抗生物質と組み合わせて使用される場合、非特異的に、DNAを編集するための修復鋳型として操作されたオリゴヌクレオチドを使用することができる。
図16は、H66をコードするコドン(CAC→TAC H66Y)を編集することにより、安定に組み込まれたBFP遺伝子をGFPに変換することができる、BFPトランスジェニックモデル系に由来するArabidopsis thalianaプロトプラストにおけるCRISPR−Cas9ヌクレアーゼ活性を記載する。細胞をCRISPR−Cas9(BC−1)で処理した場合、NHEJにより誘導されるインデルは、ディープシーケンシングにより、BFP遺伝子のH66遺伝子座の近くで0.79%の頻度で生成された(図16a)。大部分のインデルは1bpであり、9bpより長くなかった。逆に、GRONのみで処理された、またはモック処理された細胞は、インデルを示さなかった(データは示さない)。これらの結果は、CRISPR−Cas9ヌクレアーゼが、このトランスジェニックモデル系において、BFP遺伝子を能動的に標的化することができることを示している。
本発明者らのトランスジェニックモデル系に由来するプロトプラスト中でBFPからGFPへの遺伝子編集を仲介する、GRONと組み合わせたCRISPR−Cas9の有効性に関して、CRISPR−Cas9と、ホスホロチオエート(PS)修飾されたGRON(CG6)の両方を、GRONのみまたはCRISPR−Cas9のみの処理と比較したとき、同時に導入する場合に、BFPからGFPへの編集における7.4倍の改善が観察された(図16b)。これらの結果は、Arabidopsisプロトプラスト中へのPS修飾GRONを有するCRISPR−Cas9の導入がBFPからGFPへの遺伝子編集の頻度を有意に増大させることを示している。
5’末端と3’末端の両方に3つの隣接するPS修飾(本明細書では3PSと呼ばれる)を含有するGRONは、非修飾GRONと比較した場合、BFPからGFPへの編集に正に影響する。3PS修飾GRON(CG2)は、CRISPR−Cas9(BC−1)と組み合わせた場合、非修飾GRON鋳型(CG1;図17a)と比較したとき、BFPからGFPへの編集においてより効率的である。さらに、編集とGRONの長さとの正の相関(図17b)が観察された。総合すると、これらの結果は、GRON修飾と長さの両方が、CRISPR−Cas9の存在下でArabidopsisなどの植物における遺伝子編集の頻度を大きく改善することができることを示す。
201の核酸塩基(nb)の3PS修飾GRON(CG6)、または最初のRNA塩基もしくは最初の9個のRNA塩基が2’−O−メチルで修飾されたRNAとして最初の10個の5’塩基からなる201nbの2’−O−メチル修飾GRON(CG9)もしくは(CG10)をCRISPR−Cas9(BC−1)と一緒にArabidopsisプロトプラスト中に導入する場合、それらの間でBFPからGFPへの編集における統計的差異が観察された(図17c)。同様に、201nbの3PS修飾GRON(CG3)または5’Cy3および3’idC逆向き塩基からなる201nbのCy3修飾GRON(CG4)を、CRISPR−Cas9(BC−3)と一緒にArabidopsisプロトプラスト中に導入した場合、編集頻度における統計的差異は観察されなかった(図17d)。全体として、これらのデータは、多様なGRON修飾は、CRISPR−Cas9の存在下でArabidopsisにおける遺伝子編集の頻度を大きく改善することができることを示す。
CRISPR−Cas9および修飾GRONに関するこれらの結果に基づいて、BFP遺伝子を標的とするTALEN対と結合した修飾GRONが、同様にBFPからGFPへの遺伝子編集の改善をもたらすかどうかを決定した。BFP遺伝子座での有効なヌクレアーゼ活性を第1に示すために、ArabidopsisプロトプラストをTALEN(BT−1)で処理したところ、ディープシーケンシングにより予想された切断部位に、またはその近くに0.51%のインデルが見られ、TALENがこのモデル系においてCRISPR−Cas9と同程度に活性であることを示している(図18a)。欠失の大部分は10bpを超えるものであったが、50bp未満のものであり、一方、挿入は、欠失よりも有意に少なく、3bpまたはそれ以下であった。次に、本発明者らは、BFPからGFPに編集する、修飾GRONと結合したTALENの有効性を検査した。BFP TALEN(BT−1)と3PS GRON(CG7)の両方を導入する場合、3PS GRONのみと比較して、BFPからGFPへの編集の頻度の9.2倍の改善が観察された(図18b)。上記のCRISPR−Cas実験と同様に、これらの結果は、3PS修飾GRONを含むTALENのArabidopsisプロトプラスト中への導入もまた、BFPからGFPへの遺伝子編集の頻度を有意に増大させることを示している。
Linum usitatissimum(アマ)におけるEPSPS(5’−エノールピルビルシキメート−3−リン酸シンターゼ)遺伝子座も、この系における標的として使用した。EPSPS遺伝子は、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの生合成に参画するシキミ酸経路における酵素をコードする。植物においては、EPSPSは除草剤グリホサートのための標的であり、ホスホエノールピルビン酸のための結合部位の競合的阻害剤として作用する。
編集された場合、EPSPSをグリホサート耐性にする(拡張データの図18b)L.usitatissimumにおける2つの遺伝子座(T97IおよびP101A)の近くの部位を標的化するTALENを選択した。T97IおよびP101Aに標的変化を含有する144nbの5’Cy3修飾GRON(CG11)と一緒にTALEN(LuET−1)をプロトプラストに送達すると、導入の7日後に、両遺伝子座で0.19%の遺伝子編集頻度および0.5%のインデル頻度が観察された(図18c、図18d)。大部分のインデルは10bpまたはそれ以下であった(図18c)。これらの結果は、L.usitatissimumプロトプラスト中へのCy3修飾GRONを含むTALENの導入は、EPSPS遺伝子編集の頻度を有意に増大させ、さらに、複数のヌクレオチド編集を単一のGRONを用いて実現することができることを示している。
変換に対するブレオマイシンファミリーの抗生物質の2つのメンバーの効果
この一連の実施例の目的は、変換効率に対する抗生物質の効果を評価することであった。
方法
複数コピーの青色蛍光タンパク質遺伝子を有するArabidopsis thaliana系統に由来するプロトプラストを、以下の修飾:GRONの付加の前に、プロトプラストを、0.250、または1000μg/mlのZeocon(商標)またはフレオマイシンを添加した、TM(14.8mM MgCl2×6H2O、5mM 2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸、572mMマンニトール)の溶液中、氷上で90分間保持しながら、実施例1に記載のようにGRONで処理した。溶液のpHを、7.0に調整した。BFPからGFPへの変換をもたらす緑色蛍光を発する細胞の割合を、実施例1に記載のフローサイトメトリーによって評価した。
結果
使用した両濃度(250および1000μg/ml)で、Zeocinおよびフレオマイシンは、BFPからGFPへの遺伝子編集の増加をもたらした(図19を参照)。BFPからGFPへの遺伝子編集をもたらす緑色蛍光を発する細胞が、GRON送達の5日後に観察された(図20)。
参考文献
1.LeCong et al 2013 Science:vol.339 no.6121 pp.819−823
2.Jinek et al 2012 Science.337:816−21
3.Wang et al 2008 RNA 14:903−913
4.Zhang et al 2013 Plant Physiol.161:20−27
イネにおけるCRISPRおよびGRON
この実験の目的は、CRISPR−CasプラスミドおよびGRONのプロトプラスト中へのPEG送達後120時間でのOryza sativaにおけるACCase変換を証明することである。この実験で使用したCRISPR−Casは、プロトプラスト中に、Cas9遺伝子およびsgRNAをコードするプラスミドを導入することによって、イネゲノム中のaccase遺伝子を標的とする。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNAは、Cas9を標的遺伝子に誘導し、そこで、Cas9はaccase遺伝子中に二本鎖切断を作出し、GRONは部位特異的様式でaccase遺伝子を変換するための鋳型として使用される。
方法
イネのプロトプラストを、カルスから単離した。CRISPR−Casをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するコーンユビキチンプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共にsgRNAを駆動するイネU6プロモーターを含有する。CRISPR−Casプラスミドを、0.05μg/μlの最終濃度でPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。以下の配列、5’V C TGA CCT GAA CTT GAT CTC AAT TAA CCC TTG CGG TTC CAG AAC ATT GCC TTT TGC AGT CCT CTC AGC ATA GCA CTC AAT GCG GTC TGG GTT TAT CTT GCT TCC AAC GAC AAC CCA AGC CCC TCC TCG TAG CTC TGC AGC CAT GGG AAT GTA GAC AAA GGC AGG CTG ATT GTA TGT CCT AAG GTT CTC AAC AAT AGT CGA GCC H3’を有するGRONを、0.8μMの最終濃度で使用した。プロトプラストをアガロース(2.5×106細胞/ml)中に埋め込み、液体培地中で培養し、回転式振盪器(60rpm)中、暗室中、28℃でインキュベートした。CRISPR−Casプラスミドおよび/またはGRON送達の120時間後、個々のサンプルをNGSによって分析して、ACCase変換を担持し、accase遺伝子中にインデルを有する細胞(DNAリード)の割合を決定した。
CRISPRは2つの構成要素:両方とも同じプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられるスペーサー配列(5’−ACGAGGAGGGGCTTGGGTTGTGG−3)を含有する。本実験では、CRISPRはaccase遺伝子を標的とする。
結果
120時間で、イネのプロトプラストは、次世代配列決定により決定された場合、0.026%のACCase変換を有する。CRISPR−Casを含まないGRONのみの対照は、120時間で0.002%の最小Accase変換を示し、未処理の対照は変換を示さなかった。さらに、これらのデータは、CRISPR−Casが活性であり、ACCase標的遺伝子を切断し、8.0%のインデルを形成することができることを示す。
参考文献
5.LeCong et al 2013 Science:vol.339 no.6121 pp.819−823
6.Jinek et al 2012 Science.337:816−21
7.Wang et al 2008 RNA 14:903−913
8.Zhang et al 2013 Plant Physiol.161:20−27
イネにおけるCRISPRおよびGRON
概要:標的ACCase突然変異を、PCRおよびDNA配列決定分析によって19週齢のカルスにおいて同定した。
はじめに
本実験の目的は、CRISPR−CasプラスミドおよびGRONのプロトプラスト中へのPEG送達後のOryza sativaカルスにおけるACCase変換を証明することである。この実験で使用したCRISPR−Casは、プロトプラスト中に、Cas9遺伝子およびsgRNAをコードするプラスミドを導入することによって、イネゲノム中のACCase遺伝子を標的とする。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNAは、Cas9を標的遺伝子に誘導し、そこで、Cas9はACCase遺伝子中の標的位置に二本鎖切断またはニックを作出し、GRONは部位特異的様式でACCase遺伝子を変換するための鋳型として使用される。
結果
以下の表に記載される標的OsACCase突然変異を、PCRおよびDNA配列決定分析によって19週齢のカルスにおいて同定した。
方法
イネのプロトプラストを、成熟種子由来胚発生カルスから開始された懸濁培養物から単離した。それぞれ、0.05μg/μlおよび0.8μMの最終濃度のCRISPR−CasプラスミドおよびGRONを、PEG仲介性送達法によってプロトプラスト中に導入した。最終濃度のCRISPR−Casプラスミドに関する例示的範囲は、0.01〜0.2μg/μlに限られないが、それを含む。最終濃度のGRONに関する例示的範囲は、0.01〜4μMに限られないが、それを含む。CRISPR−Casをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するコーンユビキチンプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共にsgRNAを駆動するイネU6プロモーターを含有する。GRONの配列情報は、表3に記載されている。PEG処理の後、プロトプラストをアガロース(1.25×106細胞/ml)中に埋め込み、液体培地中で培養し、回転式振盪器(60rpm)中、暗室中、28℃でインキュベートした。アガロース中にプロトプラストを埋め込むための例示的範囲は、0.625×106〜2.5×106細胞/mlに限られないが、それを含む。各処理からのサンプルを、CRISPR−Casプラスミドおよび/またはGRON処理の4週間後に次世代配列決定により分析して、ACCase変換を担持する細胞(DNAリード)の割合を決定した。変換された処理に由来する微小カルスを、クレトジム(0.25〜0.5μM)またはセトキシジム(2.5μM)を含有する固体選択培地上で遊離させた。培養の19週間後にこの選択培地上で増殖する個々のカルス系統を、社内スクリーニング法ならびにDNA配列決定によって分析して、標的ACCase変換を含有する個々のカルスを同定した。
CRISPRは2つの構成要素:両方ともプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)などのCas9と、sgRNAとからなる。Cas9およびsgRNAを、それぞれ、mRNA/RNAまたはタンパク質/RNAによって送達することもできる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼを標的遺伝子に誘導するために用いられる、表2に記載された配列を有するスペーサーを含有する。本実験では、CRISPRはイネACCase遺伝子を標的とする。
遺伝子内の2つの異なる位置、部位1および部位2でのOsACCaseにおける変換の一覧。それぞれの部位について、変換事象の全ての組合せが可能である。
本実験で使用されたCRISPR−Cas gRNAスペーサー配列の一覧。スペーサーの長さは、最大で±20bp変化してもよい。スペーサー配列内のミスマッチは、10bpまで許容され得る。
本実験における使用にとって好適なGRON配列の一覧を、以下の表に提供する(V=CY3;H=3’DMT dC CPG)。
アマにおけるCRISPRおよびGRON
概要:標的LuEPSPS突然変異を、PCRおよびDNA配列決定分析によって4週齢のカルスにおいて同定した。
はじめに
本実験の目的は、CRISPR−CasプラスミドおよびGRONのPEG仲介性送達による茎頂由来プロトプラストにおけるLinum usitatissimumゲノム中のEPSPS遺伝子の変換を証明することである。この実験で使用されたCRISPR−CasおよびGRONは、アマゲノム中のEPSPS遺伝子を標的とする。CRISPRは、2つの構成要素:両方ともプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)などのCas9と、sgRNAとからなる。Cas9およびsgRNAを、それぞれ、mRNA/RNAまたはタンパク質/RNAによって送達することもできる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNAは、Cas9を標的遺伝子に誘導し、そこで、Cas9はEPSPS遺伝子中に二本鎖切断またはニックを作出し、GRONは部位特異的様式でEPSPS遺伝子を変換するための鋳型として使用される。
結果
標的LuEPSPS(T97Iおよび/またはP101A、P101TもしくはP101Sおよび/またはG96A)突然変異を、PCRおよびDNA配列決定分析によって4週齢のカルスにおいて同定した。新芽を、これらの変換されたカルスから再生させた。
方法
アマのプロトプラストを、in vitroで発芽させた苗から得られた茎頂から単離した。CRISPR−Casをコードしたプラスミドは、rbcSE9ターミネーターと共にCas9コード配列を駆動するMASプロモーターおよびポリ−T10ターミネーターと共にsgRNAを駆動するArabidopsis thaliana U6プロモーターを含有する。CRISPR−Casプラスミドを、0.05μg/μlの最終濃度でPEG仲介性送達によってプロトプラスト中に導入した。2つのアマLuEPSPS遺伝子(表2)のそれぞれを標的とするGRONを、4.0μMの最終濃度で使用した。最終濃度のCRISPR−Casプラスミドの例示的範囲は、0.01〜0.2μg/μlに限られないが、これを含む。最終濃度のGRONの例示的範囲は、0.01〜4μMに限られないが、これを含む。プロトプラストをアルギン酸ビーズ(5×105細胞/ml)中に埋め込み、液体培地中で培養し、回転式振盪器(30rpm)中、暗室中、25℃でインキュベートした。アルギン酸ビーズ中にプロトプラストを埋め込むための例示的範囲は、3.0×105〜7.5×105細胞/mlに限られないが、これを含む。個々の細胞から発生した微小カルスを、CRISPR−CasプラスミドおよびGRON送達の3および7週間後に、次世代配列決定により分析して、LuEPSPS遺伝子中に標的突然変異を担持する細胞(DNAリード)の割合を決定した。より大きいカルスを、固体再生培地上に播種された8週齢の変換された微小カルスから増殖させたところ、新芽が約4〜8週間後に再生されたカルスから分化を開始した。標的EPSPS遺伝子突然変異を有する変換されたカルスおよび新芽を、PCRおよびDNA配列決定分析によって同定した。
CRISPRは、2つの構成要素:両方ともプラスミドから発現された、植物コドン最適化されたStreptococcus pyogenesのCas9(SpCas9)と、sgRNAとからなる。sgRNAは、CRISPR RNA(crRNA)と、トランス活性化crRNA(tracrRNA)との融合物である。crRNA領域は、Cas9ヌクレアーゼをEPSPS標的遺伝子に誘導するために使用された、以下の表に記載される配列を有するスペーサーを含有する。
本実験で使用されたCRISPR−Cas gRNAスペーサー配列の一覧。スペーサーの長さは最大±20bpで変化してもよい。スペーサー配列内のミスマッチは、10bpまで許容され得る。
本実験における使用にとって好適なGRON配列の一覧を、以下の表に提供する(V=CY3;H=3’DMT dC CPG)。
当業者は、本開示が目的を実行し、言及する目的および利点、ならびに本開示に固有の目的および利点を得るのに十分適応していることを容易に理解する。本明細書で提供する例は好ましい実施形態の代表的なものであり、例示的であり、本開示の範囲を制限するものとして考えない。
本明細書で開示している本開示に対する様々な置換および修正を、本開示の範囲および精神から逸脱せずに施すことができることは、当業者には容易に明らかとなる。
本明細書で適切に例示的に記載した本開示は、本明細書で具体的に開示していない如何なる1つまたは複数の要素、1つまたは複数の制約の不在下でも実施することができる。したがって、例えば本明細書中でのそれぞれの場合において、用語「含む」、「から本質的になる」および「からなる」のいずれも、他の2つの用語のいずれかと交換することができる。利用している用語および表現は、制約ではなく記載のための用語として使用し、このような用語および表現の使用において、示し記載する特徴の任意の均等物、またはそれらの一部分の排除を意図するものではないが、特許請求する本開示の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、好ましい実施形態および任意選択の特徴によって本開示を具体的に開示してきたが、本明細書で開示している概念の修正および変更は当業者に委ねることができ、このような修正および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義する本開示の範囲内にあると考えられることが理解されるはずである。
したがって、好ましい実施形態および任意選択の特徴によって本開示を具体的に開示してきたが、開示された本開示の修正、改善、および変更は当業者に委ねることができ、このような修正、改善および変更は、本開示の範囲内にあると考えられることが理解されるはずである。本明細書で提供する材料、方法、および例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的なものであり、本開示の範囲に対する限定と意図されるものではない。
本開示を、本明細書に広く、一般的に説明してきた。一般的な開示の範囲内にあるより狭い種および亜属群もそれぞれ、本開示の一部を形成する。これは、切り出された材料が具体的に本明細書に記載されるか否かに関係なく、属に由来する任意の主題を除去するという条件で、または負の限定で、本開示の一般的記載を含む。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群を単位として記載される場合、当業者であれば、本開示もまたそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群を単位として記載されることを認識できる。
本明細書で記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、あたかもそれぞれが個別に参照により組み込まれるのと同程度に、その全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御する。
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内で記載される。

Claims (12)

  1. 植物細胞において1つまたは複数の標的遺伝子変化を引き起こす方法であって、
    植物細胞ゲノム中に一本鎖切断または二本鎖切断を導入するClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(CRISPR)ヌクレアーゼと、植物細胞ゲノム中の内在性標的遺伝子内への前記1つまたは複数の標的遺伝子変化の導入を仲介するよう構成された遺伝子修復オリゴ核酸塩基(GRON)との前記植物細胞への送達を含み、
    前記GRONが、
    蛍光色素および逆向き塩基からなる群より選択される1つまたは複数の3’ブロッキング置換基、および、
    蛍光色素より選択される1つまたは複数の5’ブロッキング置換基、を含み、
    前記植物細胞が、前記標的遺伝子変化に関して非トランスジェニックである、
    方法。
  2. 前記1つまたは複数の標的遺伝子変化が、GRONを前記内在性標的遺伝子内に取り込ませることなく、植物細胞ゲノム中の前記内在性標的遺伝子内に導入される、請求項1記載の方法。
  3. 前記植物細胞が、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャッサバ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、ソラマメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、キャッサバ、およびユリからなる群から選択される植物由来である、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 植物細胞ゲノム中に複数の標的遺伝子変化を生じる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 2つ以上のガイドRNAを使用する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 1より多いガイドRNAのそれぞれが、遺伝子変化のための異なる標的と相補的である、請求項5記載の方法。
  7. CRISPRヌクレアーゼがニッカーゼとして機能する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. ニッカーゼであるCRISPRヌクレアーゼの2つ以上の使用を含み、
    前記2つ以上のCRISPRヌクレアーゼが標的核酸配列の反対の鎖上の切断を誘導するか、あるいは
    前記2つ以上のCRISPRヌクレアーゼが標的核酸配列の同じ鎖上の切断を誘導する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 標的デオキシリボ核酸(DNA)配列が、植物細胞ゲノム中に存在する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 標的デオキシリボ核酸(DNA)配列が、前記植物細胞の内在性遺伝子である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記植物細胞から植物を再生するステップをさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記植物から種子を回収するステップをさらに含む、請求項11記載の方法。
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