BR122018070228B1

BR122018070228B1 - Método para produção de planta brassica resistente à herbicida

Info

Publication number: BR122018070228B1
Application number: BR122018070228-1A
Authority: BR
Inventors: Christian Schopke; Greg F. W. Gocal; Keith Walker; Peter R. Beetham
Original assignee: Cibus Europe B.V.
Priority date: 2007-10-05
Filing date: 2008-10-03
Publication date: 2023-01-10
Also published as: CN115044593A; WO2009046334A1; US20090205064A1; EP2700722A3; AU2008308530A1; CN108342376A; EA202092479A2; EA202092479A3; JP2019146587A; JP6833903B2; WO2009046334A4; CN108130336A; EP2700721B1; DK2700722T3; US20120178628A1; JP5745849B2; EA201691664A1; CN102405846A; EP2700721A2; PL2700722T3

Abstract

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE PLANTA RESISTENTE À HERBICIDA São providos ácidos nucléicos de aceto- hidroxiácido sintase (AHAS) com mutação e as proteínas codificadas pelos ácidos nucléicos com mutação. Também providos são plantas de canola, células e sementes compreendendo os genes com mutação.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos N° 60/977.944, depositado em 5 de outubro de 2007, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade incluindo relatório descritivo, figuras, e tabelas, e para todas as propostas. CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se ao campo de plantas e sementes resistente a herbicida e, mais especificamente, a mutações no gene e proteína de aceto-hidroxiácido sintase (AHAS).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A seguinte descrição é provida simplesmente como um auxílio na compreensão da invenção e não é admitida para descrever ou constituir técnica anterior da invenção.

[0004] Os benefícios de plantas tolerantes a herbicida são conhecidos. Por exemplo, plantas tolerantes a herbicida podem reduzir a necessidade da lavoura controlar ervas-daninhas reduzindo, desse modo, efetivamente, a erosão do solo.

[0005] A introdução de genes mutantes exógenos em plantas é bem documentada. Por exemplo, a Patente dos Estados Unidos N° 4.545.060 refere-se ao aumento de resistência de Planta a glifosato por introdução no genoma da planta de um gene que codifica uma variante de EPSPS tendo pelo menos uma mutação que torna a enzima mais resistente a seu inibidor competitivo, isto é, glifosato.

[0006] Exemplos de algumas das mutações em genes AHAS são conhecidos. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 7.094.606.

[0007] Através de mutagênese química, uma mutação foi encon- trada no gene AHAS I expresso inferior. Esta mutação é conhecida como PM-1 (uma mutação a em posição equivalente conhecida como 653 baseada na sequência de aminoácido de acetolactato sintase (ALS) de Arabidopsis, uma mudança de aminoácido se serina para asparagina, respectivamente codificada conforme segue - AGT para AAT). Outra mutação foi encontrada no gene AHAS III expresso mais alto, conhecido como PM-2 (uma mutação a uma posição equivalente conhecida como 574, uma mudança de aminoácido de triptofano para leucina, respectivamente codificada conforme segue - TGG para TTG). Estas duas mutações, PM-1 e PM-2, são combinadas em uma variedade comercial de Canola conhecida como Clearfield Canola (Tan et al, 2005).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] A invenção refere-se em parte a ácidos nucléicos de aceto- hidroxiácido sintase (AHAS) com mutação e as proteínas codificadas pelos ácido nucléicos com mutação. A invenção também refere-se em parte a células de Plantas de canola, e sementes compreendendo estes ácidos nucléicos e proteínas com mutação.

[0009] Em um aspecto, é provido um ácido nucléico isolado que codifica uma proteína Brassica aceto-hidroxiácido sintase tendo uma mutação em uma ou mais posições de aminoácido correspondentes a uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: A205, D376, W574, R577, e S653 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concreti- zações, ácido nucléico isolado codifica uma proteína tendo uma ou mais mutações selecionadas a partir do grupo consistindo em: uma substituição de alanina por valina em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de alanina por ácido aspártico em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de ácido aspártico por ácido glutâmico em uma posição correspondente a posição 376 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por cisteína em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por leucina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por metionina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por serina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de arginina por triptofano em uma posição correspondente a posição 577 de SEQ ID NO: 1, uma substi- tuição de serina por asparagina em uma posição correspondente a po- sição 653 de SEQ ID NO: 1, e uma substituição de serina por treonina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, a mutação é uma substituição de serina por asparagina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1 em que a mutação não é S653N em gene Brassica AHAS I. Em algumas concretizações, a mutação é uma substituição de serina por treonina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, a mutação é uma substituição de triptofano por leucina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, em que a mutação não é W574L gene Brassica AHAS III. Em algumas concretizações, a mutação é uma substituição de alanina por valina em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1. Em outras concretizações, a mutação é uma substi- tuição de alanina por ácido aspártico em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1. Em outras concretizações, ácido nu- cléico isolado codifica a proteína tendo a mutação selecionada a partir das mutações mostradas na Tabela 2. Em certas concretizações, áci- do nucléico isolado codifica uma proteína tendo duas ou mais muta- ções. Em algumas concretizações, as duas ou mais mutações são se- lecionadas da Tabela 2. Em algumas concretizações, ácido nucléico isolado codifica uma proteína tendo uma mutação em uma posição correspondente a S653 de SEQ ID NO: 1 e uma mutação em uma ou mais posições de aminoácido correspondentes a uma posição selecio- nada a partir do grupo consistindo em: A205, D376, W574, e R577 de SEQ ID NO: 1. Em outras concretizações, ácido nucléico isolado codi- fica uma proteína tendo uma mutação em uma posição corresponden- te a W574 de SEQ ID NO: 1 e uma mutação em uma posição corres- pondente a R577 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, áci- do nucléico isolado codifica uma proteína de aceto-hidroxiácido sintase (AHAS) que é resistente à inibição por um herbicida de inibição de AHAS. Em algumas concretizações, o herbicida de inibição de AHAS é selecionado a partir do grupo consistindo em herbicidas de: imidazoli- nona, sulfonilureia, triazolpirimidina, pirimidiniltiobenzoato, sulfonilami- no-carboniltriazolinona, e misturas destes. Em algumas concretiza- ções, o herbicida é um herbicida imidazolinona. Em algumas concreti- zações, o herbicida é um herbicida sulfonilureia. Em algumas concreti- zações, o ácido nucléico isolado codifica uma proteína de AHAS com- preendendo 70% ou mais de identidade para uma ou mais das se- quências de aminoácido na figura 2. Em algumas concretizações, áci- do nucléico isolado codifica uma proteína de Brassica napus AHAS. Em outras concretizações, ácido nucléico isolado codifica uma proteí- na de Brassica napus AHAS I. Em certas concretizações, ácido nucléi- co isolado codifica uma proteína de Brassica napus AHAS III.

[00010] Em outro aspecto, é provido um vetor de expressão contendo um ácido nucléico isolado que codifica uma proteína de Brassica aceto-hidroxiácido sintase tendo uma mutação em uma ou mais posições de aminoácido correspondentes a uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: A205, D376, W574, R577, e S653 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, o vetor de expressão contém um ácido nucléico isolado que codifica uma proteína tendo uma ou mais mutações selecionadas a partir do grupo consistindo em: uma substituição de alanina por valina em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de alanina por ácido aspártico em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de ácido aspártico por ácido glutâmico em uma posição correspondente a posição 376 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por cisteína em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por leucina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por metionina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por serina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de arginina por triptofano em uma posição correspondente a posição 577 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de serina por asparagina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1, e uma substituição de serina por treonina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, uma mutação é uma substituição de serina por asparagina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1 em que uma mutação não é S653N em gene Brassica AHAS I. Em algumas concretizações, uma mutação é uma substituição de serina por treonina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, uma mutação é uma substituição de triptofano por leucina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, em que uma mutação não é W574L em gene Brassica AHAS III. Em algumas concretizações, uma mutação é uma substituição de alanina por valina em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1. Em outras concretizações, uma mutação é uma substituição de alanina por ácido aspártico em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1.

[00011] Em outro aspecto, é provido uma planta tendo um gene de Brassica aceto-hidroxiácido sintase (AHAS), em que o gene codifica uma proteína tendo uma mutação em uma ou mais posições de aminoácido correspondentes a uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: A205, D376, W574, R577, e S653 de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, é provido planta tendo um gene de Brassica aceto- hidroxiácido sintase (AHAS), em que a planta é resistente a um herbicida de inibição de AHAS, em que o gene codifica uma proteína tendo uma mutação em uma ou mais posições de aminoácido correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em:

[00012] A205, D376, W574, R577, e S653 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações dos aspectos acima, a planta tem um gene de AHAS que codifica uma proteína tendo uma ou mais mutações seleci- onadas a partir do grupo consistindo em: uma substituição de alanina por valina em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de alanina por ácido aspártico em uma posi- ção correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de ácido aspártico por ácido glutâmico em uma posição corresponden- te a posição 376 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por cisteína em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por leucina em uma posição cor- respondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de trip- tofano por metionina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por serina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substi- tuição de arginina por triptofano em uma posição correspondente a posição 577 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de serina por aspara- gina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1, e uma substituição de serina por treonina em uma posição correspon- dente a posição 653 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, uma mutação é uma substituição de serina por asparagina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1 em que uma mutação não é S653N em gene Brassica AHAS I. Em algumas concre- tizações, uma mutação é uma substituição de serina por treonina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1. Em al- gumas concretizações, uma mutação é uma substituição de triptofano por leucina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, em que uma mutação não é W574L no gene Brassica AHAS III. Em algumas concretizações, uma mutação é uma substituição de ala- nina por valina em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1. Em outras concretizações, uma mutação é uma substi- tuição de alanina por ácido aspártico em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1. Em outras concretizações, uma mu- tação selecionada a partir das mutações mostradas na Tabela 2. Em certas concretizações, a planta tem um gene de AHAS que codifica uma proteína tendo duas ou mais mutações. Em algumas concretiza- ções, as duas ou mais mutações são selecionadas da Tabela 2. Em algumas concretizações, a planta tem um gene de AHAS que codifica uma proteína tendo uma mutação em uma posição correspondente a S653 de SEQ ID NO: 1, e uma mutação em uma ou mais posições de aminoácidos correspondentes a uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: A205, D376, W574, e R577 de SEQ ID NO: 1. Em outras concretizações, a planta tem um gene de AHAS que codifi- ca uma proteína tendo uma mutação em uma posição correspondente a W574 de SEQ ID NO: 1 e uma mutação em uma posição correspon- dente a R577 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, a planta tem um gene de AHAS que codifica uma proteína que é resistente à inibição por um herbicida de inibição de AHAS. Em algumas concreti- zações, a planta tem um gene de AHAS que codifica uma proteína compreendendo 70% ou mais de identidade para uma ou mais das sequências de aminoácido na figura 2. Em algumas concretizações, a planta é resistente a aplicação de pelo menos um herbicida de inibição de AHAS. Em algumas concretizações, o herbicida de inibição de AH- AS é selecionado a partir do grupo consistindo em herbicidas de: imi- dazolinona, sulfonilureia, triazolpirimidina, pirimidiniltiobenzoato, sulfo- nilamino-carboniltriazolinona, e misturas destes. Em algumas concreti- zações, o herbicida é um herbicida imidazolinona. Em algumas concre- tizações, o herbicida é um herbicida sulfonilureia. Em algumas concre- tizações, a planta é uma planta Brassica produzida pelo crescimento de uma semente de uma linha selecionada a partir das linhas listadas na Tabela 2. Em algumas concretizações, a planta é uma espécie Brassica. Em outras concretizações, a planta é Brassica napus. Em algumas concretizações, a planta é selecionada de Spring Oilseed Rape e Winter Oilseed Rape. Em algumas concretizações, a planta tem um gene de AHAS que codifica uma proteína de Brassica napus AHAS. Em outras concretizações, a planta tem um gene de AHAS que codifica uma proteína Brassica napus AHAS I. Em certas concretiza- ções, a planta tem um gene de AHAS que codifica uma proteína Bras- sica napus AHAS III. Em algumas concretizações, a planta é não- transgênica.

[00013] Em um aspecto é provida uma semente tendo um gene de Brassica aceto-hidroxiácido sintase (AHAS) que codifica uma proteína tendo uma mutação em uma ou mais posições de aminoácido corres- pondentes a uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: A205, D376, W574, R577, e S653 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, a semente tem um gene de AHAS que codifica uma proteína tendo uma ou mais mutações selecionadas a partir do grupo consistindo em: uma substituição de alanina por valina em uma posi- ção correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de alanina por ácido aspártico em uma posição correspondente a po- sição 205 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de ácido aspártico por ácido glutâmico em uma posição correspondente a posição 376 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por cisteína em uma po- sição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substitui- ção de triptofano por leucina em uma posição correspondente a posi- ção 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por metioni- na em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de triptofano por serina em uma posição correspon- dente a posição 574 de SEQ ID NO: I, uma substituição de arginina por triptofano em uma posição correspondente a posição 577 de SEQ ID NO: 1, uma substituição de serina por asparagina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1, e uma substituição de serina por treonina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1, Em algumas concretizações, uma mutação é uma substituição de serina por asparagina em uma posição correspondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1 em que uma mutação não é S653N em gene de Brassica AHAS I. Em algumas concretizações, uma muta- ção é uma substituição de serina por treonina em uma posição corres- pondente a posição 653 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretiza- ções, uma mutação é uma substituição de triptofano por leucina em uma posição correspondente a posição 574 de SEQ ID NO: 1, em que uma mutação não é W574L em gene de Brassica AHAS III. Em algu- mas concretizações, uma mutação é uma substituição de alanina por valina em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1. Em outras concretizações uma mutação é uma substituição de ala- nina por ácido aspártico em uma posição correspondente a posição 205 de SEQ ID NO: 1. Em outras concretizações, uma mutação sele- cionada a partir das mutações mostradas na Tabela 2. Em certas con- cretizações, a semente tem um gene de AHAS que codifica uma prote- ína tendo duas ou mais mutações. Em algumas concretizações, as duas ou mais mutações são selecionadas da Tabela 2. Em algumas concretizações, a semente tem um gene de AHAS que codifica uma proteína tendo uma mutação em uma posição correspondente a S653 de SEQ ID NO: 1 e uma mutação em uma ou mais posições de ami- noácido correspondentes a uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: A205, D376, W574, e R577 de SEQ ID NO: 1. Em ou- tras concretizações, a semente tem um gene de AHAS que codifica uma proteína tendo uma mutação em uma posição correspondente a W574 de SEQ ID NO: 1 e uma mutação em uma posição correspon- dente a R577 de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, a se- mente tem um gene de AHAS que codifica uma proteína que é resis- tente à inibição por um herbicida de inibição de AHAS. Em algumas concretizações, a semente tem um gene de AHAS que codifica uma proteína compreendendo 70% ou mais de identidade a uma ou mais das sequências de aminoácido na figura 2. Em algumas concretiza- ções, a semente é resistente à aplicação de pelo menos um herbicida de inibição de AHAS. Em algumas concretizações, o herbicida de ini- bição de AHAS é selecionado a partir do grupo consistindo em herbici- das de: imidazolinona, sulfonilureia, triazolpirimidina, pirimidiniltioben- zoato, sulfonilamino-carboniltriazolinona, e misturas destes. Em algu- mas concretizações, o herbicida é um herbicida imidazolinona. Em al- gumas concretizações, o herbicida é um herbicida sulfonilureia. Em algumas concretizações, a semente é uma semente de Brassica. Em algumas concretizações, a semente tem um gene de AHAS que codifi- ca uma proteína de Brassica napus AHAS. Em outras concretizações, a semente tem um gene de AHAS que codifica uma proteína de Bras- sica napus AHAS I. Em certas concretizações, a semente tem um ge- ne de AHAS que codifica uma proteína de Brassica napus AHAS III. Em algumas concretizações, a semente é uma semente de um alinha de planta Brassica em que a linha é selecionada a partir das linhas lis- tadas na Tabela 2. Em algumas concretizações, a semente é não- transgênica. Em algumas concretizações, é provida uma semente pro- duzida por planta dos métodos aqui descritos. Em outras concretiza- ções, a semente é uma semente de canola.

[00014] Em outro aspecto, é provido um método para produção de planta resistente à herbicida por introdução na célula de planta de um oligonucleobase de reparo de gene (GRON) com uma mutação alvo em um gene de aceto-hidroxiácido sintase (AHAS) para produzir célula de planta com um gene de AHAS que expresses uma proteína de AHAS tendo uma mutação em uma ou mais posições de aminoácido correspondentes a uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: A205, D376, W574, e S653 de SEQ ID NO: 1; e identificando célula de planta tendo crescimento substancialmente normal e atividade catalítica conforme comparada a uma célula de planta tipo selvagem correspondente na presença de um herbicida de inibição de AHAS; e regeneração de uma planta resistente à herbicida não-transgênica tendo um gene de AHAS com mutação de referida célula de planta. Em outro aspecto, é provido um método para aumentar a planta resis-tente à herbicida por: (a) cruzamento de uma primeira planta de Brassica a uma segunda planta de Brassica, em que a primeira planta compreende um gene de Brassica aceto-hidroxiácido sintase (AHAS), em que o gene codifica uma proteína tendo uma mutação em uma ou mais posições de aminoácido correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: A205, D376, W574, R577, e S653 de SEQ ID NO: 1; (b) varredura de uma população resultante do cruzamento para resistência à herbicida de AHAS aumentada; (c) seleção de um membro resultante do cruzamento tendo resistência à herbicida de AHAS aumentada; e (d) produção de sementes resultantes do cruzamento. Em algumas concretizações, uma semente híbrida é produzida por qualquer dos métodos acima. Em algumas concretizações, plantas são crescidas de sementes produzidas por qualquer dos métodos acima. Em outro aspecto, é provido um método de controle de ervas-daninhas em um campo contendo plantas por aplicação de uma quantidade efetiva de pelo menos um herbicida de inibição de AHAS a um campo contendo referidas ervas-daninhas e plantas, a planta tendo um gene de Brassica aceto-hidroxiácido sintase (AHAS), em que o gene codifica uma proteína tendo uma mutação em uma ou mais posições de aminoácido correspondentes a uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: A205, D376, W574, R577, e S653 de SEQ ID NO: 1. 134. Em algumas concretizações, o herbicida de inibição de AHAS é selecionado a partir do grupo consistindo em herbicidas de: imidazolinona, sulfonilureia, triazolpirimidina, pirimidinil- tiobenzoato, sulfoniamino-carboniltriazolinona, e misturas destes. Em outras concretizações, o herbicida de inibição de AHAS é um herbicida imidazolinona. Em outras concretizações, o herbicida de inibição de AHAS é um herbicida sulfonilureia.

[00015] O termo "ácido nucléico" ou "sequência de ácido nucléico" refere-se a um oligonucleotídeo, nucleotídeo ou polinucleotídeo, e fragmentos ou porções destes, que podem ser de fita simples ou dupla, e representam a fita de sentido ou de antisentido. Um ácido nucléico pode incluir DNA ou RNA, e pode ser de origem natural ou sintética. Por exemplo, um ácido nucléico pode incluir mRNA ou cDNA. Ácido nucléico pode incluir ácido nucléico que foi amplificado (por exemplo, usando reação de cadeia de polimerase). A convenção "NTwt###NTmut" é usada para indicar uma mutação que resulta em nucleotídeo tipo selvagem NTwt na posição ### em ácido nucléico sendo substituído com mutante NTmut. O código de letra simples para nucleotídeos é conforme descrito no Manual do Escritório de Patente dos Estados Unidos do Procedimento de Exame de Patente, seção 2422, tabela 1. Neste particular, a designação de nucleotídeo "R" significa purina tal como guanina ou adenina, "Y" significa pirimidina tal como citosina ou timina (uracil se RNA); "M" significa adenina ou cito- sina; "K" significa guanina ou timina; e "W" significa adenina ou timina.

[00016] Um "gene" refere-se a uma sequência de DNA que compreende sequências de controle e de codificação necessárias para a produção de um RNA, que pode ter uma função de não-codificação (por exemplo, um RNA ribossomal ou de transferência) ou que pode incluir um polipeptídeo ou um precursor de polipeptídeo. O RNA ou polipeptídeo pode ser codificado por uma sequência de codificação de comprimento total ou por qualquer porção da sequência de codificação considerando-se que a atividade desejada ou função é retida. Conforme aqui usado, o termo "Gene de AHAS" refere-se a um gene que tem homologia a um gene de Brassica AHAS. Em certas concretizações, o gene de AHAS tem 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99%; ou 100% de identidade para um gene de Brassica AHAS específica, por exemplo, o gene de Brassica napus AHAS I ou o gene de Brassica napus AHAS III. Em certas concretizações, o gene de AHAS tem 60%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99%; ou 100% de identidade para uma sequência selecionada das sequências na figura 3. Em certas concretizações, o gene de AHAS é modificado com pelo menos uma mutação. Em outras concretizações, o gene de AHAS é modificado com pelo menos duas mutações. Em algumas concretizações, o gene de AHAS é modificado com pelo menos uma mutação selecionada das mutações mostradas na Tabela 2. Em certas concretizações, o gene de AHAS é modificado com pelo menos duas mutações mostradas na Tabela 2. Em certas concretizações, uma mutação é uma mutação conservada.

[00017] Por "sequência de codificação" é significativo uma sequência de um ácido nucléico ou seu complemento, ou uma parte destes, que pode ser transcrito e/ou transladado para produzir o mRNA para e/ou o polipeptídeo ou um fragmento deste. Sequências de codificação incluem exons em um DNA genômico ou transcrições de RNA primárias, que são unidas juntas pela maquinaria bioquímica da célula para proporcionar um mRNA maturo. A fita de antissentido é o complemento de tal ácido nucléico, e o que codifica sequência pode ser deduzido a partir deste.

[00018] Por "sequência de não-codificação" é significativo uma sequência de um ácido nucléico ou seu complemento, ou uma parte deste, que não é transcrita em aminoácido in vivo, ou onde tRNA não interage para colocar ou tentar colocar um aminoácido. Sequências de não-codificação incluem ambas sequências de intron em DNA genômico ou transcrições de RNA primárias imaturas, e sequências associadas de gene tais como promotores, intensificadores, silenciadores, etc.

[00019] Uma nucleobase é uma base, que em certas concretizações preferidas é uma purina, pirimidina, ou um derivado ou análogo destes. Nucleosídeos são nucleobases que contêm uma porção de pentosefuranosila, por exemplo, um ribosídeo opcionalmente substituído ou 2'-deoxirribosídeo. Nucleosídeos podem ser ligados por uma de várias porções de ligação, que podem ou não podem conter fósforo. Nucleosídeos que são ligados por ligações de fosfodiéster não- substituídas são denominados nucleotídeos. O termo "nucleobase", conforme aqui usado, inclui nucleobases de peptídeo, como as subu- nidades de ácidos nucléicos de peptídeo, e nucleobases de morfolina, bem como nucleosídeos e nucleotídeos.

[00020] Uma oligonucleobase é um polímero compreendendo nucleobases; preferivelmente pelo menos uma porção da qual pode hi- bridizar por emparelhamento de base de Watson-Crick para um DNA tendo a sequência complementar. Uma cadeia de oligonucleobase pode ter um terminal simples 5' e 3', que são as últimas nucleobases do polímero. Uma cadeia de oligonucleobase particular pode conter nu- cleobases de todos os tipos. Um composto de oligonucleobase é um composto compreendendo uma ou mais cadeias de oligonucleobase que pode ser complementar e hibridizada por emparelhamento de base de Watson-Crick. As nucleobases tipo Ribo incluem nucleobases contendo pentosefuranosil no qual o 2' carbono é um metileno substituído com uma hidroxila, alquilóxi ou halogênio. Nucleobases tipo deoxirribo são nucleobases outras do que nucleobases tipo ribo e incluem todas as nucleobases que não contêm uma porção de pentosefuranosila.

[00021] Em certas concretizações, uma fita de oligonucleobase pode incluir ambos cadeias de oligonucleobase e segmentos ou regiões de cadeias de oligonucleobase. Uma fita de oligonucleobase pode ter uma extremidade 3' e uma extremidade 5' e quando uma fita de oligonucleobase é coextensivo com uma cadeia, as extremidades 3' e 5' da fita são também terminais 3' e 5' da cadeia.

[00022] O termo "oligonucleobase de reparo de gene", conforme aqui usado, denota oligonucleobases, incluindo duplex oligonucleotí- deos duplex misturados, moléculas contendo não-nucleotídeo, oligo- deoxinucleotídeos de fita simples e outras moléculas de reparo de gene.

[00023] Por "isolado", quando refere-se a um ácido nucléico (por exemplo, um oligonucleotídeo tal como RNA, DNA, ou um polímero misturado) é significativo um ácido nucléico que é à parte de uma porção substancial do genoma em que ele ocorre naturalmente e/ou é substancialmente separado de outros componentes celulares que acompanham naturalmente tal ácido nucléico. Por exemplo, qualquer ácido nucléico que foi produzido sinteticamente (por exemplo, por condensação base em série) é considerado ser isolado. Do mesmo modo, ácidos nucléicos que são recombinantemente expressos, clonados, produzidos por uma reação de extensão de iniciador (por exemplo, PCR), ou, de outro modo, excisado de um genoma são também considerados serem isolados.

[00024] Uma "sequência de aminoácido" refere-se a uma sequência de polipeptídeo ou proteína. O "AAwt###AAmut" de convenção é usado para indicar uma mutação que resulta no aminoácido tipo selvagem AAwt na posição ### no polipeptídeo sendo substituído com mutante AAmut.

[00025] Por "complemento" é significativo a sequência complementar a um ácido nucléico de acordo com regras de emparelhamento de Watson/Crick padrões. Uma sequência de complemento pode também ser uma sequência de RNA complementar à sequência de DNA ou sua sequência de complemento, e pode também ser um cDNA.

[00026] Por "substancialmente complementar" é significativo que duas sequências hibridizam sob condições de hibridização estringen- tes. O versado na técnica compreenderá que sequências substancialmente complementares não necessitam hibridizar ao longo de seu comprimento total.

[00027] Conforme aqui usado, o termo "códon" refere-se a uma sequência de três nucleotídeos adjacentes (ou RNA ou DNA) que constituem o código genético que determina a inserção de um aminoácido específico em uma cadeia de polipeptídeo durante síntese de proteína ou o sinal para cessar síntese de proteína. O termo "códon" é também usado para se referir às sequências correspondentes (e complementares) de três nucleotídeos no RNA mensageiro em que o DNA original é transcrito.

[00028] Conforme aqui usado, o termo "Proteína de AHAS" refere- se a proteína que tem homologia a uma proteína de Brassica AHAS. Em certas concretizações, a proteína de AHAS tem 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 96%O; 97%; 98%; 99%; ou 100% de identidade para uma proteína de Brassica AHAS específica, tal como, por exemplo, a proteína de Brassica napus AHAS I ou a proteína de Brassica napus AHAS III. Em certas concretizações, a proteína de AHAS tem 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99%; ou 100% de identidade para uma sequência selecionada a partir das sequências na figura 2. Em certas concretizações, a proteína de AHAS é modificada com pelo menos uma mutação. Em outras concretizações, a proteína de AHAS é modificada com pelo menos duas mutações. Em algumas concretizações, a proteína de AHAS é modificada com pelo menos uma mutação selecionada a partir das mutações mostradas na Tabela 2. Em certas concretizações, a proteína de AHAS é modificada com pelo menos duas mutações mostradas na Tabela 2. Em certas concretizações, uma mutação é uma mutação conservada.

[00029] O termo "tipo selvagem" refere-se a um gene ou um produto de gene que tem as características de que gene ou produto de gene quando isolados de uma fonte que ocorre naturalmente. Um gene tipo selvagem é aquele que é mais frequentemente observado em uma população e é, desse modo, arbitrariamente designado a forma "normal" ou "tipo selvagem" do gene. "Tipo selvagem" pode também se referir à sequência em uma posição específica de nucleotídeo ou posições, ou a sequência em uma posição de códon particular ou posições, ou a sequência em uma posição de aminoácido particular ou po-sições.

[00030] Conforme aqui usado, "mutante," ou "modificado" refere-se a um ácido nucléico ou proteína que descreve modificações em sequência e ou propriedades funcionais (isto é, características alteradas) quando comparadas ao gene tipo selvagem ou produto de gene. "Mutante," ou "modificado" também refere-se à sequência em uma posição específica de nucleotídeo ou posições, ou a sequência em uma posição de códon particular ou posições, ou a sequência em uma posição de aminoácido particular ou posições que revelam modificações na sequência e ou propriedades funcionais (isto é, características alteradas) quando comparadas ao gene tipo selvagem ou produto de gene.

[00031] Uma "mutação" pretende abranger pelo menos uma variação de nucleotídeo simples em uma sequência de ácido nucléico ou uma variação de aminoácido simples em um polipeptídeo relativo à sequência normal ou sequência tipo selvagem. Uma mutação pode incluir uma substituição, uma anulação, uma inversão ou uma inserção.

[00032] Conforme aqui usado, o termo "homologia" refere-se a similaridade de sequência entre proteínas e DNA. O termo "homologia" ou "homólogo" refere-se a um grau de identidade. Ele pode ser homologia parcial ou homologia completa. Uma sequência parcialmente homóloga é uma que tem menos do que 100% de sequência de identidade quando comparada a outra sequência.

[00033] "Heterozigoto" refere-se a ter alelos diferentes em um ou mais locais genéticos em segmentos de cromossomo homólogos. Conforme aqui usado "heterozigoto" pode também se referir a uma amostra, uma célula, uma população de célula ou um organismo em que alelos diferentes em um ou mais locais genéticos podem ser detectados. Amostras heterozigotas podem também serem determinadas via métodos conhecidos na técnica tais como, por exemplo, sequenci- amento de ácido nucléico. Por exemplo, se um eletroferograma de se- quenciamento mostra dois picos em um local simples e ambos picos são severamente os mesmos, a amostra pode ser caracterizada como heterozigoto. Ou, se um pico é menor do que o outro, mas é pelo menos cerca de 25%, o tamanho da pica maior, a amostra pode ser caracterizada como heterozigoto. Em algumas concretizações, o pico menor é pelo menos cerca de 15% do pico maior. Em outras concretizações, o pico menor é pelo menos cerca de 10% do pico maior. Em outras concretizações, o pico menor é pelo menos cerca de 5% do pi- co maior. Em outras concretizações, uma quantidade mínima do pico menor é detectada.

[00034] Conforme aqui usado, "homozigoto" refere-se a ter alelos idênticos em um ou mais locais genéticos em segmentos de cromossomo homólogos. "Homozigoto" pode também se referir a uma amostra, uma célula, uma população de célula ou um organismo em que os mesmos alelos em um ou mais locais genéticos podem ser detectados. Amostras de homozigoto podem ser determinadas via métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, sequenciamento de ácido nucléico. Por exemplo, se um eletroferograma de sequenciamento mostra um pico simples em um local particular, a amostra pode ser denominada "homozigoto" com relação àquele local.

[00035] O termo "hemizigoto" refere-se a um gene ou segmento de gene estando presente somente uma vez no genótipo de uma célula ou um organismo porque o segundo alelo é anulado. Conforme aqui usado, "hemizigoto" pode também se referir a uma amostra, uma célula, uma população de célula ou um organismo em que um alelo em um ou mais locais genéticos pode ser detectado somente uma vez no genótipo.

[00036] O termo "estado de zigosidade", conforme aqui usado, refere-se a uma amostra, uma população de célula, ou um organismo como parecendo heterozigoto, homozigoto, ou hemizigoto conforme determinado por métodos de teste conhecidos na técnica e aqui descritos. O termo "estado de zigosidade de um ácido nucléico" significa determinar se a fonte de ácido nucléico parece heterozigoto, homozigoto, ou hemizigoto. O "estado de zigosidade" pode se referir a diferenças em um nucleotídeo simples em uma sequência. Em alguns métodos, o estado de zigosidade de uma amostra com relação a uma mutação simples pode ser categorizado como homozigoto tipo selvagem, heterozigoto (isto é, um alelo tipo selvagem e um alelo mutante), mutante homozigoto, ou hemizigoto (isto é, uma cópia simples de ou o alelo tipo selvagem ou alelo mutante).

[00037] Conforme aqui usado, o termo "RTDS" refere-se a Rapid Trait Development System® (RTDS) desenvolvido por Cibus. RTDS é um sistema de modificação de gene específico de local que é efetivo na produção de mudanças precisas em uma sequência de gene sem a incorporação de genes estranhos ou sequências de controle.

[00038] O termo "cerca de", conforme aqui usado, significa em termos quantitativos mais ou menos 10%. Por exemplo, "cerca de 3%" envolveria 2,7-3,3% e "cerca de 10%" envolveria 9-11%.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00039] A Figura 1 mostra um alinhamento de aminoácido de Arabi- dopsis aceto-hidroxiácido sintase AHAS (SEQ ID NO: 1), Brassica napus AHAS I (SEQ ID NO: 2), e Brassica napus AHAS III (SEQ ID NOs: 3 e 4). SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácido da Arabidopsis AHAS At3g48560 baseada na sequência de DNA genômico anotada de número de acesso no Banco de Gene NC003074. SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácido de Brassica napus AHAS I de linhas de elite Cibus BN-2 e BN-11. Esta sequência é idêntica ao produto transladado de acesso no Banco de Gene Zl 1524. SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácido de Brassica napus AHAS III de linha de elite Cibus BN-2. Esta sequência é idêntica ao produto transladado de acesso ao Banco de Gene Zl 1526, excetuando uma substituição de D325E em aminoácido 325. SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácido de Brassica napus AHAS III de linha de elite BN-11. Esta sequência é idêntica ao produto transladado de SEQ ID NO: 3, excetuando um E343 em aminoácido 343 como em SEQ ID NO: 1.

[00040] A Figura 2 mostra sequências de aminoácido de genes transladados referidos na Tabela 2. Os aminoácidos indicados em negrito representam uma mutação.

[00041] A Figura 3 mostra sequências de nucleotídeo referidas na Tabela 2. Os nucleotídeos indicados em negrito representam uma mutação.

[00042] A Figura 4 mostra os resultados do ensaio de pulverização descrito no Exemplo 4.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00043] São providos composições e métodos relacionados em parte ao alvo bem sucedido de genes de aceto-hidroxiácido sintase (AHAS) em Brassica usando, por exemplo, a tecnologia de Rapid Trait Development System (RTDS1) desenvolvida por Cibus. Em combinação ou sozinhas, as plantas contendo qualquer das mutações descritas aqui podem formar a base de novos produtos resistentes a herbicida. Também providas são sementes produzidas de plantas que sofreram mutação em que os genes de AHAS são ou homozigotos ou hete- rozigotos para as mutações. As mutações aqui descritas podem estar em combinação com qualquer outra mutação conhecida ou com mutações descobertas no futuro.

[00044] RTDS é baseada na alteração de um gene alvo por utilização de sistema de reparo de gene da própria célula para modificar especificamente a sequência de gene in situ e não inserir DNA estranho e sequências de controle de expressão de gene. Este procedimento afeta uma mudança precisa na sequência genética enquanto o restante do genoma é deixado inalterado. Em contraste a GMOs transgêni- cos convencionais, não existe integração de material genético estranho, nem é qualquer material genético estranho deixado na planta. As mudanças na sequência genética introduzida por RTDS não são aleatoriamente inseridas. Desde que os genes afetados permaneçam em sua localização nativa, nenhum modelo aleatório, não-controlado ou adverso de expressão ocorre.

[00045] O RTDS que afeta esta mudança é um oligonucleotídeo quimicamente sintetizado que pode ser composto de ambos DNA e bases de RNA modificadas, bem como outras porções químicas, e é designado para hibridizar na localização de gene alvo para criar um par-base desequiparado. Este par-base desequiparado age como um sinal para atrair o sistema de reparo de gene natural da própria célula àquele local e corrigir (substituir, inserir ou anular) o(s) nucleotídeo(s) designado(s) dentro do gene. Uma vez que o processo de correção é complete, a molécula de RTDS é degradada e o gene agora modificado ou reparado é expresso sob os mecanismos de controle endógeno normal do gene.

[00046] As mutações objetos nos genes de AHAS I e III foram descritas usando os genes Brassica napus AHAS e proteínas (ver SEQ ID NOs: 2, 3 e 4). As composições e métodos também envolvem genes mutantes AHAS de outras espécies (paralogos). Contudo, devido a variações nos genes de AHAS de espécies diferentes, o número do resíduo de aminoácido a ser mudado em uma espécie pode ser diferente em outras espécies. Não obstante, a posição análoga é prontamente identificada por um versado na técnica por homologia de sequência. Por exemplo, a FIGURA 1 mostra as sequências de aminoácido alinhadas dos paralogos de Arabidopsis AHAS (SEQ ID NO.T) e Brassica napus AHAS I (SEQ ID NO:2) e AHAS III (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO: 4). Desse modo, posições análogas nestes e outros paralogos pode ser identificadas e mudadas.

[00047] As composições e métodos referem-se em parte a mutações em um gene de AHAS que tornam a planta resistente ou tolerante a um herbicida da família de inibição de AHAS ou de inibição de ALS de herbicidas. As composições e métodos também referem-se ao uso de uma oligonucleobase de reparo de gene para produzir uma mutação desejada nas sequências cromossomais ou epissomais de planta no gene que codifica uma proteína de AHAS. A proteína que sofreu mutação, que substancialmente mantém a atividade catalítica da proteína tipo selvagem, permite resistência ou tolerância aumentadas a um herbicida da família de inibição de AHAS, e permite o crescimento substancialmente normal ou desenvolvimento da planta, seus órgãos, tecidos, ou células, conforme comparado a planta tipo selvagem indiferente da presença ou ausência do herbicida. As composições e métodos também referem-se a uma célula de planta não-transgênica em que um gene de AHAS sofreu mutação, uma planta não-transgênica regenerada a partir desta, bem como planta resultante de um cruzamento usando uma planta não-transgênica regenerada em planta tendo uma mutação em um gene de AHAS diferente, ou a planta tendo um gene de EPSPS que sofreu mutação, por exemplo.

[00048] Imidazolinonas estão entre as cinco famílias químicas de herbicidas de inibição de AHAS. As outras quatro famílias são sulfoni- lureias, triazolpirimidinas, pirimidiniltiobenzoatos e sulfonilamino- carboniltriazolinonas (Tan et ai, 2005).

[00049] Também provida é uma planta transgênica ou não-transgênica ou célula de planta tendo uma ou mais mutações no gene de AHAS, por exemplo, tal como aqui descrito. Em certas concretizações, a planta ou célula de planta tendo uma ou mais mutações no gene de AHAS tem resistência ou tolerância aumentadas para um membro da inibição de AHAS. Em certas concretizações, a planta ou célula de planta tendo uma ou mais mutações no gene de AHAS pode exibir crescimento substancialmente normal ou desenvolvimento da planta, seu órgãos, tecidos ou células, conforme comparado a planta tipo sel-vagem correspondente ou célula. Em aspectos particulares e concretizações providas são plantas não-transgênicas tendo uma mutação em um gene de AHAS, por exemplo, tal como descrito aqui, que em certas concretizações tem resistência ou tolerância aumentadas para um membro de herbicida de inibição de família de AHAS e podem exibir crescimento substancialmente normal ou desenvolvimento da planta, seus órgãos, tecidos ou células, conforme comparado a planta tipo selvagem correspondente ou célula, isto é, na presença de um ou mais herbicidas tais como, por exemplo, uma imidazolinona e/ou sul- fonil ureia, a proteína de AHAS que sofreu mutação tem substancialmente a mesma atividade catalítica conforme comparada a proteína de AHAS tipo selvagem.

[00050] Adicionalmente providos são métodos para produção de planta tendo um gene de AHAS que sofreu mutação, por exemplo, tendo uma ou mais mutações conforme aqui descrito; preferivelmente a planta substancialmente mantém a atividade catalítica da proteína tipo selvagem indiferente da presença ou ausência de um herbicida relevante. Em certas concretizações, os métodos incluem introdução na célula de planta de uma oligonucleobase de reparo de gene com uma ou mais mutações alvos no gene de AHAS (por exemplo, tal como aqui descrito), e identificação de uma célula, semente, ou planta tendo um gene de AHAS que sofreu mutação.

[00051] Em várias concretizações, as plantas conforme aqui descrito podem ser de qualquer espécie de planta dicotiledônea, monoco- tiledônea ou gimnospermosa, incluindo qualquer espécie de planta lenhosa que cresce como uma árvore ou arbusto, qualquer espécie herbácea, ou qualquer espécie que produz frutos comestíveis, sementes ou vegetais, ou qualquer espécie que produz flores coloridas ou aromáticas. Por exemplo, a planta pode ser selecionada de uma espécie de planta a partir do grupo consistindo em canola, girassol, tabaco, beterraba, algodão, milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, tomate, manga, pêssego, maçã, pêra, morango, banana, melão, batata, cenoura, alface, cebola, sp. de soja, cana de açúcar, ervilha, feijões do campo, populus, uva, citrus, alfalfa, centeio, aveias, turfa e gramas de forragem, linho, colza de óleo de semente, pepino, glória da manhã, bálsamo, pimenta, berinjela, tegetes, flor de lótus, repolho, margarida, cravo, tulipa, íris, lírio, e plantas produtoras de noz na medida em que já não são especificamente mencionadas.

[00052] A oligonucleobase de reparo de gene pode ser introduzida na célula de planta usando qualquer método comumente usado na técnica, incluindo, mas não limitado a, microtransportadores (distribuição biolística), microfibras, entendimento mediado por polietileno glicol (PEG), eletroporação, e microinjeção.

[00053] Também providos são métodos e composições relacionados a cultura de células que sofreram mutação de acordo com os métodos conforme aqui descritos de modo obter planta que produz sementes, daqui por diante uma "planta fértil", e a produção de sementes e plantas adicionais de tal planta fértil.

[00054] Também providos são métodos de controlar seletivamente ervas-daninhas em um campo, o campo compreendendo plantas com as alterações de gene de AHAS descritas e ervas-daninhas, o método compreendendo aplicação ao campo de um herbicida ao qual as plantas foram tornadas resistentes.

[00055] Também providas são mutações no gene de AHAS que conferem resistência ou tolerância a um membro do herbicida relevante a planta, ou no qual os genes de AHAS que sofreram mutação tem substancialmente a mesma atividade enzimática conforme comparado ao AHAS tipo selvagem.

Oligonucleobases de Reparo de Gene

[00056] Os métodos e composições aqui descritos podem ser praticados ou produzidos com "oligonucleobases de reparo de gene" tendo as conformações e químicas conforme descrito em detalhe abaixo. As "oligonucleobases de reparo de gene" conforme contemplado aqui foram também descritas na literatura científica e de patente publicada usando-se outros nomes incluindo "oligonucleobases recombinogêni- cas;" "oligonucleotídeos quiméricos de RNA/DNA"; "oligonucleotídeos quiméricos;" "oligonucleotídeos duplex misturados" (MDONs); "oligo-nucleotídeos de RNA DNA (RDOs);" "oligonucleotídeos de alvejamento de gene;" "genoplastos;" "oligonucleotídeos modificados de fita simples;" "Vetores mutacionais de oligodeoxinucleotídeo de fita simples" (SSOMVs); "vetores mutacionais de duplex"; e "vetores mutacionais de heteroduplex".

[00057] Oligonucleobases tendo as conformações e químicas descritas na Patente dos Estados Unidos N° 5.565.350 por Kmiec (Kmiec I) e Patente dos Estados Unidos N° 5.731.181 por Kmiec (Kmiec II), desse modo incorporadas por referência, são adequadas para uso como "oligonucleobases de reparo de gene" da invenção. As oligonucleobases de reparo de gene em Kmiec I e/ou Kmiec II contêm duas fitas complementares, um do qual contém pelo menos um segmento de nucleotídeos tipo RNA (um "segmento de RNA") que são bases emparelhadas a nucleotídeos tipo DNA da outra fita.

[00058] Kmiec II descreve que não-nucleotídeos contendo base de purina e pirimidina podem ser substituídos por nucleotídeos. Moléculas de reparo de gene adicionais que podem ser usadas para a presente invenção são descritos nas Patentes dos Estados Unidos N°s 5.756.325; 5.871.984; 5.760.012; 5.888.983; 5.795.972; 5.780.296; 5.945.339; 6.004.804; e 6.010.907 e na Patente Internacional N° PCT/US00/23457; e nas Publicações de Patente Internacional N°s WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; e WO 99/40789, que são cada, desse modo, incorporada em sua totalidade.

[00059] Em uma concretização, a oligonucleobase de reparo de gene é um oligonucleotídeos duplex misturado (MDON) em que os nucleotídeos tipo RNA do oligonucleotídeo duplex misturado são feitos resistentes a RNase por substituição do 2'-hidroxil com uma funcionalidade de flúor, cloro ou bromo, ou por substituição de um substituinte no 2'-0. Substituintes adequados incluem os substituintes ensinados pelo Kmiec II. Substituintes alternativos incluem os substituintes ensinados pela Patente dos Estados Unidos N° 5.334.711 (Sproat) e os substituintes ensinados pelas publicações de patente EP 629 387 e EP 679 657 (coletivamente, a Martin Applications), que são, desse modo, incorporados por referência. Conforme aqui usado, um derivado de 2'- flúor, cloro ou bromo de um ribonucleotídeo ou um ribonucleotídeo tendo um 2'- OH substituído com um substituinte descrito no Martin Applications ou Sproat é denominado um "Ribonucleotídeo 2'-Substi- tuído." Conforme aqui usado, o termo "nucleotídeo tipo RNA" significa um 2'-hidroxil ou Nucleotídeo 2'-Substituído que é ligado a outros nucleotídeos de um oligonucleotídeo duplex misturado por uma ligação de fosfodiéster não-substituído ou quaisquer das ligações não-naturais ensinadas por Kmiec I ou Kmiec II. Conforme aqui usado, o termo "nucleotídeo tipo deoxirribo" significa um nucleotídeo tendo um 2'-H, que pode ser ligado a outros nucleotídeos de uma oligonucleobase de reparo de gene por uma ligação de fosfodiéster não-substituída ou qualquer das ligações não-naturais ensinadas por Kmiec I ou Kmiec II.

[00060] Em uma concretização particular da presente invenção, a oligonucleobase de reparo de gene é um oligonucleotídeo duplex misturado (MDON) que é ligado somente por ligações de fosfodiéster não- substituídas. Em concretizações alternativas, a ligação é por fosfodiés- teres substituídos, derivados de fosfodiéster e ligações baseadas em fósforo conforme ensinado por Kmiec II. Em ainda outra concretização, cada nucleotídeo tipo RNA no oligonucleotídeo duplex misturado é um Nucleotídeo 2'-Substituído. Concretizações preferidas particulares de Ribonucleotídeos 2'-Substituídos são ribonucleotídeos substituídos de 2'-flúor, 2'-metóxi, 2'-propilóxi, 2'-alilóxi, 2'-hidroxiletilóxi, 2'-metoxie- tilóxi, T-fluoropropilóxi e 2'-trifluoropropilóxi Concretizações mais preferidas de Ribonucleotídeos 2'-Substituídos são nucleotídeos substituí dos 2'-flúor, 2'-metóxi, 2'-metoxietilóxi, e 2'-alilóxi Em outra concretização, o oligonucleotídeo duplex misturado é ligado por ligações de fos- fodiéster não-substituídas.

[00061] Embora oligonucleotídeos duplex misturados (MDONs) tendo somente um tipo simples de nucleotídeo tipo RNA 2'-substituído são mais convenientemente sintetizados, os métodos da invenção pode ser praticados com oligonucleotídeos duplex misturados tendo dois ou mais tipos de nucleotídeos tipo RNA. A função de um segmento de RNA pode não ser afetada por uma interrupção causada pela introdução de um deoxinucleotídeo entre dois trinucleotídeos tipo RNA, consequentemente, o termo segmento de RNA envolve termos tais como "segmento de RNA interrompido". Um segmento de RNA não-interrom- pido é denominado um segmento de RNA contíguo. Em uma concretização alternativa, um segmento de RNA pode conter 2'-OH nucleotídeos resistentes a RNase alternantes e não-substituídos. Os oligonucleotídeos duplex misturados preferivelmente têm menos do que 100 nucleotídeos, e, mais preferivelmente, menos do que 85 nucleotídeos, mas mais do que 50 nucleotídeos. A primeira e segunda fitas são base emparelhada de Watson-Crick. Em uma concretização, as fitas do oli-gonucleotídeo duplex misturado são covalentemente ligadas por um ligador, tal como um hexa, penta ou tetranucleotídeo de fita simples de modo as primeira e segunda fitas são segmentos de uma cadeia de oligonucleotídeo simples tendo uma extremidade 3' simples e uma extremidade 5' simples. Aa extremidades 3' e 5' podem ser protegidas pela adição de uma "capa de grampo de cabelo", pelo que os nucleotídeos de 3' e 5' terminal são Watson-Crick emparelhados a nucleotídeos adjacentes. Uma segunda capa de grampo de cabelo pode, adicionalmente, ser colocada na junção entre a primeira e segunda fitas distantes das extremidades 3' e 5', de modo que o emparelhamento de Watson-Crick entre a primeira e segunda fitas é estabilizado.

[00062] A primeira e segunda fita contêm duas regiões que são homólogas com dois fragmentos do gene alvo, isto é, têm a mesma sequência conforme o gene alvo. Uma região homóloga contém os nucleotídeos de um segmento de RNA e pode conter um ou mais nucleotídeos tipo DNA de conexão de segmento de DNA e pode também conter nucleotídeos tipo DNA que não estão dentro do segmento de DNA de intervenção. As duas regiões de homologia são separadas por, e cada uma é adjacente a uma região tendo uma sequência que difere da sequência do gene alvo, denominada uma "região heterólo- ga". A região heteróloga pode conter um, dois ou três nucleotídeos desequiparados. Os nucleotídeos desequiparados podem ser contíguos ou alternativamente podem ser separados por um ou dois nucleotídeos que são homólogos com o gene alvo. Alternativamente, a região heteróloga pode também conter uma inserção ou um, dois, três ou de cinco ou menos nucleotídeos. Alternativamente, a sequência do oligonucleotídeo duplex misturado pode diferir da sequência do gene alvo somente pela anulação de um, dois, três, ou cinco ou menos nucleotídeos do oligonucleotídeo duplex misturado. O comprimento e posição da região heteróloga é, neste caso, de fato para ser o comprimento da anulação, mesmo embora nenhum nucleotídeo do oligonucleotídeo duplex misturado esteja dentro da região heteróloga. A distância entre os fragmentos do gene alvo que são complementares às duas regiões homólogas é idêntica ao comprimento da região heteróloga onde uma substituição ou substituições são pretendidas. Quando a região heteróloga contém uma inserção, as regiões heterólogas são, desse modo, separadas no oligonucleotídeo duplex misturado mais distante do que seus fragmentos homólogos complementares são no gene, e a conversão é aplicável quando a região heteróloga codifica uma anulação.

[00063] Os segmentos de RNA dos oligonucleotídeos duplex misturados são cada uma parte de uma região homóloga, isto é, uma região que é idêntica em sequência a um fragmento do gene alvo, cujos segmentos juntos preferivelmente contêm pelo menos 13 nucleotídeos tipo RNA e preferivelmente de 16 a 25 nucleotídeos tipo RNA, ou ainda mais preferivelmente 18-22 nucleotídeos tipo RNA, ou mais preferivelmente, 20 nucleotídeos. Em uma concretização, os segmentos de RNA das regiões de homologia são separados por e adjacentes a, isto é, "conectados por" um segmento de DNA de intervenção. Em uma concretização, cada nucleotídeo da região heteróloga é um nucleotídeo do segmento de DNA de intervenção. Um segmento de DNA de intervenção que contém a região heteróloga de um oligonucleotídeo duplex misturado é denominado um "segmento mutator".

[00064] Em outra concretização da presente invenção, a oligonucleobase de reparo de gene (GRON) é um vetor mutacional de oligo- deoxinucleotídeo de fita simples (SSOMV), que é descrito no Pedido de Patente Internacional PCT/US00/23457, Patentes dos Estados Unidos N°s 6.271.360, 6.479.292, e 7.060.500, que são incorporados por referência em sua totalidade. A sequência do SSOMV é baseada nos mesmos princípios como vetores mutacionais descritos nas Patentes dos Estados Unidos N°s 5.756.325; 5.871.984; 5.760.012; 5.888.983; 5.795.972; 5.780.296; 5.945.339; 6.004.804; e 6.010.907 e Publicações Internacionais N°s WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; e WO 99/40789. A sequência do SSOMV contém duas regiões que são homólogas com a sequência alvo separada por uma região que contém a alteração genética desejada denominada a região mutatora. A região mutatora pode ter uma sequência que é do mesmo comprimento como a sequência que separa as regiões homólogas na sequência alvo, mas tendo uma sequência diferente. Tal região mutatora pode causar uma substituição. Alternativamente, as regiões homólogas no SSOMV podem ser contíguas entre si, enquanto as regiões no gene alvo tendo a mesma sequência são separadas por um, dois ou mais nucleotídeos. Tal SSOMV causa uma anulação a partir do gene alvo dos nucleotídeos que são ausentes a partir do SSOMV. Por último, a sequência do gene alvo que é idêntica às regiões homólogas pode ser adjacente no gene alvo, mas separada por um, dois ou mais nucleotídeos na sequência do SSOMV. Tal SSOMV causa uma inserção na sequência do gene alvo.

[00065] Os nucleotídeos do SSOMV são deoxirribonucleotídeos que são ligados por ligações de fosfodiéster não-modificadas exceto que a ligação de internucleotídeo 3' terminal e/ou 5' terminal, ou, alternativamente, as duas ligações de internucleotídeo 3' terminal e/ou 5' terminal podem ser um fosforotioato ou fosfoamidato. Conforme aqui usado, uma ligação de internucleotídeo é a ligação entre nucleotídeos do SSOMV e não incluem a ligação entre o nucleotídeo terminal 3' ou nucleotídeo terminal 5' e um substituinte de bloqueio. Em uma concretização específica, o comprimento do SSOMV é entre 21 e 55 deoxinu- cleotídeos, e os comprimentos das regiões de homologia são, consequentemente, um comprimento total de pelo menos 20 deoxinucleotí- deos, e pelo menos duas regiões de homologia devem cada ter comprimentos de pelo menos 8 deoxinucleotídeos.

[00066] O SSOMV pode ser projetado para ser complementar à fita codificante ou não-codificante do gene alvo. Quando a mutação desejada é uma substituição de uma base simples, é preferido que ambos o nucleotídeo mutator e o nucleotídeo alvo sejam uma pirimidina. Para a extensão que é consistente com alcançar o resultado funcional desejado, é preferido que ambos os nucleotídeo mutator e o nucleotídeo alvo na fita complementar sejam pirimidinas. Particularmente preferidos são SSOMVs que codificam mutações de transversão, isto é, um nucleotídeo mutator C ou T é desequiparado, respectivamente, com um nucleotídeo C ou T na fita complementar.

[00067] Em adição ao oligodeoxinucleotídeo, o SSOMV pode conter um substituinte de bloqueio 5' que é fixado aos carbonos terminais 5' através de um ligador. A química do ligador não é crítica outra do que seu comprimento, que deve preferivelmente ser pelo menos 6 átomos de comprimento e que o ligador deve ser flexível. Uma variedade de substituintes não-tóxicos tais como biotin, colesterol ou outros esterói- des ou um corante fluorescente catiônico de não-intercalação podem ser usados. Reagentes particularmente preferidos para produzir SSOMVs são os reagentes vendidos como Cy3® e Cy5® por Glen Research, Sterling Va. (agora GE Healthcare), que são fosforoamiditas bloqueados que após incorporação em um oligonucleotídeo produzem corantes 3,3,3',3'-tetrametil N,N'-isopropil indomonocarbocianina substituída e indodicarbocianina, respectivamente. Cy3 é particularmente preferido. Quando a indocarbocianina é N-oxialquil substituída, ela pode ser convenientemente ligada ao 5' terminal do oligodeoxinucleotí- deo como um fosfodiéster com um 5' terminal fosfato. A química do ligador entre o corante e o oligodeoxinucleotídeo não é crítica e é escolhida para conveniência sintética. Quando a fosforamidita Cy3 comercialmente disponível é usada conforme direcionado, as modificações 5' resultantes consistem de um substituinte de bloqueio e ligador junto que são um N-hidroxipropila, N'-fosfatidilpropil 3,3,3',3'-tetrametil indomonocarbocianina.

[00068] Em uma concretização preferida, o corante de indocarbocianina é tetra substituído nas posições 3 e 3' dos anéis indoles. Sem limitações a teoria, estas substituições impedem o corante de ser um corante de intercalação. A identidade dos substituintes nestas posições não é crítica.

[00069] O SSOMV pode, em adição, ter um substituinte de bloqueio 3'. Novamente a química do substituinte de bloqueio 3' não é crítica.

[00070] As mutações aqui descritas pode também serem obtidas por mutagênese (aleatória, somática ou direcionada) e outras tecnolo- gias de edição ou recombinação de DNA incluindo, mas não limitadas a, gene alvo usando recombinação homóloga específica de local por nucleases de garra de zinco.

Distribuição de Oligonucleobases de Reparo de Gene em Células de planta

[00071] Qualquer método comumente conhecido usado para transformar célula de planta pode ser usado para distribuição das oligonucleobases de reparo de gene. Métodos ilustrativos são listados abaixo.

Microtransportadores e Microfibras

[00072] O uso de microtransportadores metálicos (microesferas) para introdução de fragmentos grandes de DNA em células de planta tendo paredes de célula de celulose por penetração de projétil é bem conhecido àqueles versados na técnica relevante (daqui por diante distribuição biolística). As Patentes dos Estados Unidos N°s 4.945.050; 5.100.792 e 5.204.253 descrevem técnicas gerais de seleção de microtransportadores e dispositivos para projetar os mesmos.

[00073] Condições específicas para uso de microtransportadores nos métodos da presente invenção são descritas na Publicação Internacional WO 99/07865. Em uma técnica ilustrativa, microtransportadores de gelo (60 mg/mL), oligonucleotídeo duplex misturado (60 mg/mL) 2,5 M de CaCl2 e 0,1 M espermidina são adicionados nesta ordem; a mistura brandamente agitada, por exemplo, por oscilação, por 10 minutos e, em seguida, deixada à temperatura ambiente por 10 minutos, onde após os microtransportadores são diluídos em 5 volumes de etanol, centrifugados e ressuspensos em 100% de etanol. Bons resultados podem ser obtidos com uma concentração na solução de aderência de 8-10 μg/μL de microtransportadores, 14-17 μg/mL de oligonucleotídeo duplex misturado, 1,1-1,4 M CaCl2 e 18-22 mM de espermidina. Resultados ótimos foram observados sob as condições de 8 μg/μL de microtransportadores, 16,5 μg/mL de oligonucleotídeo duplex misturado, 1,3 M CaCh e 21 mM de espermidina.

[00074] Oligonucleobases de reparo de gene podem também serem introduzidas em células de planta para a prática da presente invenção usando microfibras para penetrar a parede de célula e membrana de célula. A Patente dos Estados Unidos N° 5.302.523 para Coffee et al. descreve o uso de 30 vezes 0,5 μm e 10 vezes 0,3 μm de fibras de carbeto de silício para facilitar transformação de suspensão de culturas de milho de Black Mexican Sweet. Qualquer técnica mecânica que pode ser usada para introduzir DNA para transformação de célula de planta usando microfibras pode ser usada para distribuir oligonucleobases de reparo de gene para transmutação.

[00075] Uma técnica ilustrativa par distribuição de microfibra de um oligonucleobase de reparo de gene é conforme segue: Microfibras estéreis (2 μg) são suspensas em 150 μL de meio de cultura de planta contendo cerca de 10 μg de um oligonucleotídeo duplex misturado. Uma cultura de suspensão é permitida assentar e volumes iguais de células acondicionados e a fibra estéril/suspensão de nucleotídeo são centrifugadas por 10 minutos. Os meios seletivos são aplicados imediatamente ou com um retardo de até cerca de 120 horas conforme é apropriado para o traço particular.

Eletroporação de Protoplasto

[00076] Em uma concretização alternativa, as oligonucleobases de reparo de gene podem ser distribuídas para a célula de planta por eletroporação de um protoplasto derivado de parte de planta. Os proto- plastos são formados por tratamento enzimático de parte de planta, particularmente uma folha, de acordo com técnicas bem conhecidas àqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Gallois et al, 1996, em Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp et al, 1999, em Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, N.J. Os protoplastos não necessitam serem cul- tivados em meio de crescimento antes da eletroporação. Condições ilustrativas para eletroporação são 3 vezes 10.sup.5 protoplastos em um volume total de 0,3 mL com uma concentração de oligonucleobase de reparo de gene de entre 0,6-4 μg/mL.

Entendimento de DNA mediado por Protoplasto PEG

[00077] Em uma concretização alternativa, ácidos nucléicos são tomados por protoplastos de planta na presença do agente de modificação de membrana polietileno glicol, de acordo com técnicas bem conhecidas àqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Gharti- Chhetri et al, 1992; Datta et al, 1992).

Microinjeção

[00078] Em uma concretização alternativa, as oligonucleobases de reparo de gene podem ser distribuídas por injeção das mesmas com um micro capilar nas células de planta ou em protoplastos (ver, por exemplo, Miki et al., 1989; Schnorf et al., 1991).

Seleção de Plantas Resistentes à Herbicida e Aplicação de Herbicida

[00079] Plantas e células de planta podem ser testadas para resistência ou tolerância a um herbicida usando métodos comumente usados na técnica, por exemplo, por crescimento da planta ou célula de planta na presença de um herbicida e medição da taxa de crescimento conforme comparada a taxa de crescimento na ausência do herbicida.

[00080] Conforme aqui usado, crescimento substancialmente normal de planta, órgão de planta, tecido de planta ou célula de planta é definido como uma taxa de crescimento ou taxa de diviso de célula da planta, órgão de planta, tecido de planta, ou célula de planta que é pelo menos 35%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, ou pelo menos 75% da taxa de crescimento ou taxa de divisão de célula em uma planta correspondente, órgão de planta, tecido de planta ou célula de planta que expressa a proteína de AHAS tipo selvagem.

[00081] Conforme aqui usado, desenvolvimento substancialmente normal de planta, órgão de planta, tecido de planta ou célula de planta é definido como a ocorrência de um ou mais eventos de desenvolvimento na planta, órgão de planta, tecido de planta ou célula de planta que são substancialmente os mesmos conforme aqueles que ocorrem em uma planta correspondente, órgão de planta, tecido de planta ou célula de planta que expressa a proteína de AHAS tipo selvagem.

[00082] Em certas concretizações, os órgãos de planta aqui providos incluem, mas não estão limitados a, folhas, caules, raízes, botões de flor vegetativos, botões de flor florais, meristemas, embriões, cotile- dons, endosperma, sépalas, pétalas, pistilos, carpelos, estames, anteras, microesporos, pólen, tubos de pólen, óvulos, ovários e frutos, ou seções, fatias ou discos tomados dos mesmos. Os tecidos de planta incluem, mas não estão limitados a, tecido de calo, tecidos enterrados, tecidos vasculares, tecidos de armazenamento, tecidos meristemáti- cos, tecidos de folha, tecidos de broto, tecidos de raiz, tecidos de galha, tecidos de tumor de planta, e tecidos reprodutivos. As células de planta incluem, mas não estão limitadas a, células isoladas com paredes de célula, agregados variavelmente dimensionados destes, e pro- toplastos.

[00083] As plantas são substancialmente "tolerantes" a um herbicida relevante, e quando elas são submetidas ao mesmo e proporcionam uma curva de dose/resposta que é alterada para a direita quando comparada com aquela provida por planta similar não-tolerante similarmente submetida. Tais curvas de dose/resposta têm "dose" plotada no eixo X e "percentagem de morte", "efeito herbicida", etc., plotados no eixo y. As plantas tolerantes requererão mais herbicida do que plantas similares não-tolerantes de modo a produzir um dado efeito herbicida. As plantas que são substancialmente "resistentes" ao herbicida exibem poucas, se houverem, lesões necróticas, líticas, cloróticas ou outras lesões, quando submetidas a herbicida a concentrações e taxas que são tipicamente empregadas por comunidade agroquímica para matar ervas-daninhas no campo. As plantas que são resistentes a um herbicida são também tolerantes do herbicida.

EXEMPLOS

[00084] Em seguida estão exemplos que ilustram procedimentos para prática da invenção. Estes exemplos não devem ser construídos como limitantes. Todas as percentagens são por peso e todas as proporções de mistura de solvente são por volume, a menos que, de outro modo, notado.

Exemplo 1: Preparação de Amostras de Brassica Resistente à Herbicida

[00085] A menos que de outro modo especificado, conforme aqui usado, a numeração do(s) gene(s) é baseada na sequência de aminoácido da Arabidopsis acetolactato sintase (ALS) ou aceto-hidroxiácido sintase (AHAS) At3g48560 (SEQ ID NO: 1). Nas referências do livro de nota de laboratório antes de outubro de 2005, a posição S653 (baseada na sequência de Arabidopsis de aminoácido) é referida como S621 baseado nas sequências de aminoácido de milho ZmAHAS108 e ZmAHAS109 (Fang et ai, 1992),

[00086] Uma meta foi produzir a substituição de mino ácido resistente imazetapir (Imi) S653N em qualquer ou ambas BnAHAS I e III de spring Canola {Brassica napus, Spring Oilseed Rape -designada BN- 2) e Winter Oilseed Rape (WOSR, também Brassica napus - designada BN-11).

[00087] De modo a amplificar as regiões alvos de BnAHAS I e III de Brassica napus (inicialmente Canola de elite linha BN-2), o oligo par BnALSl e BnALS2 foi designado (SEQ ID NOs: 9 e 10). Desde que BnAHAS I e III não contêm introns, BnALSl e BnALS2 amplificam as regiões alvos de 284 bp de ambos DNA e cDNA genômicos que flanqueiam o local S653. Este par de iniciador foi também designado ca- pacitar amplificação da região alvo de ALS de Arabidopsis. Os príme- res foram recebidos e ressuspensos em água estéril.

[00088] Inicialmente o par de iniciador BnALS l/BnALS2 foi usado para PCR amplificar as regiões alvos BnAHAS I e III C-terminal de BN- 2. Mais tarde, as regiões alvos de ALS foram amplificadas de amostras adicionais de BN-2 e clonadas em pGEM-T fácil. Insertos clonados de 12 colônias de cada de 3 amostras de DNA e cDNA genômico cresceram em durante a noite e culturas eram plasmídeo preparado e se- quenciado, confirmando a sequência alvo. Estoques de glicerol foram preparados para BN-2 ALS 2c-21 como o BnAHAS I representativo e BN-2 ALS YB10-2g-14 as o BnAHAS III representativo para estas 284 bp de regiões alvos.

[00089] As sequências de região genômica e região alvo de cDNA de ALS da linha BN-2 foram analisadas e erros de PCR registrados. Baseado na sequência de BnAHAS I e III de BN-2, um GRON simples (Oligonucleotídeo de Reparo de Gene) BnALS 162l/C/41/5'Cy3/3'idC (SEQ ID NO: 5) foi designado para produzir uma serina em substituição de aminoácido asparagina (AGT -> AAT) na posição 653 (Ver Tabela 1). As sínteses iniciais foram ressuspensas e suas concentrações determinadas. Os oligos ressuspensos foram armazenados congelados a -70°C. A versão de não-codificação deste GRON foi denominada BnALSl621/NC/41/5'Cy3/3'idC (SEQ ID NO: 6). Em um ultimo caso, o BnALS1621/NC foi comparado com todas as sequências de Banco de Gene onde as únicas sequências com >16 nucleotídeos de 41 hibridi- zando foram BnAHAS I e III e onde o oligo tinha a desequiparação simples G->A designada para introduzir a substituição de aminoácido S653N. TABELA 1. SEQUENCIAS GRON

[00090] A base de conversão é mostrada em negrito. V=CY3; H=3'DMT dC CPG.

[00091] Regiões alvos de BnALS, de um Cibus elite Winter Oil Seed Rape (WOSR) linha BN-l 1, foram amplificadas de DNA genômico e cDNA de plantas simples conhecidas por representar linha BN-l 1. As sequências de BN-11 BnALS foram analisadas e erros de PCR registrados.

[00092] Em adição a caracterização das regiões alvos de BnALS de BN-2 e BN-l 1, as mesmas regiões alvos foram também caracterizadas na variedade comercial Clearfield Canola (BN-15). As sequências de Clearfield BnAHAS foram analisadas e erros de PCR registrados mostrando as mudanças de aminoácido esperada, S653N (AGT -> AAT) em BnAHAS I e W574L (TGG -> TTG) em BnAHAS III. Por último, sequências de codificação totais para BnAHAS I e III foram amplificadas usando-se BnALS3/BnALSOR2 (SEQ ID NOs: 11 e 12) e BnALS3/BnALSOR3 (SEQ ID NOs: 11 e 13) respectivamente, clona- das e sequenciadas de linhas BN-2, BN-l 1 e BN-15 para servir como sequências de referência para propostas comparativas.

[00093] Amostras de calo Imi resistente BN-2 (Canola) BnALS1621N-44 a 53, provenientes de vários tratamentos, foram extraídas usando-se o método de Edwards et al. (1991). O DNA genômi- co deste material foi classificado usando-se uma mistura de PCR específico de alelo (AS-PCR) (MM#23 composto de oligos BnALSOFl, BnALSOR2, BnALSOR3 e BnALSIRIA) (SEQ ID NOs: 14, 12, 13, e 15, respectivamente) para detectar especificamente a mudança de S653N e mistura de PCR específica de alelo (MM#29 composto dos oligos BnALSOF2, BnALSOR4 e BnALSIFIT) (SEQ ID NOs: 16, 17, e 18, respectivamente) para detectar especificamente a mudança de W574L in ou BnAHAS I ou III. Estes resultados de AS-PCR iniciais foram inconclusivos, portanto, amostras adicionais BnALS 1621N-54 a 58 para muitas das amostras BnALS 1621N-44 a 53 foram recebidas e extraídas usando-se o método de Edwards et al. (1991) com etapas de purificação adicionais para obter DNA genômico mais puro.

[00094] Neste ponto, amostras BnALS1621N-54 a 58 foram amplificadas com uma combinação de iniciador de BnALSOF2, BnALSOR2 e BnALSOR3, e uma pequena quantidade de produto amplificado foi obtida. Estes produtos foram clonados em pGEM-T fácil e 12 colônias brancas por composição de linha como culturas durante a noite, plas- mídeo preparados (usando-se o kit Qiagen plasmid miniprep), e se- quenciado usando-se química de sequenciamento BigDye 3.1.

[00095] A análise de sequência preliminar determinou que BnALS1621N-55~13 tenha uma mutação de S653N em BnAHAS III (AGT -> AAT) e dois outros clones a partir desta linha, BnALS1621N- 55-15 e 19, foram tipo selvagem em BnAHAS III. A análise de sequência total foi registrada. Para confirmar que este positive simples não resulta de um erro de PCR, um adicional de 38 colônias a partir desta linha foram classificados por AS-PCR. Os 8 positivos mais fortes desta varredura de AS-PCR BnALS1621N-55-l a 8 foram compostos como culturas durante a noite, e DNA de plasmídeo foi isolado e sequenciado. Sete das 8 colônias positivas, BnALS1621N-55-2 a 8 por AS-PCR foram positivas pelo sequenciamento para a mutação S653N em BnAHAS III; o outro BnALS1621N-55-l foi uma sequência de BnAHAS I tipo selvagem. Juntos estes resultados indicam que linha BnALS1621N-55 é he- terozigota para a mutação S653N em BnAHAS III.

[00096] Amostra BnALS1621N-55 foi uma amostra de calo paralela do mesmo calo resistente de Imi inicial como BnALS1621N-49. DNA genômico destas amostras foi amplificado com a combinação de iniciador BnALSOF2, BnALSOR2 e BnALSOR3, e os fragmentos clonados em pGEM-T fácil e transformados. MM#23 foi usado para classificar 38 colônias brancas para a mutação S653N, com 4 colônias positivas sendo identificadas (BnALS1621N-49-9 a 12). Estas colônias foram sequenciadas. Três das quatro colônias (BnALS1621N-49-9, 10 e 12) tinham a mutação S653N em BnAHAS III.

[00097] Um método similar de clonagem de região alvo, seguido por AS-PCR com confirmação de sequência foi usado para identificar outras linhas com o polimorfismo S653N. Entre estes estava a linha BnALS-97. BnALS-97 foi regenerada em planta e permitida virar semente. Desde que esta linha era um protótipo (como planta), as sequências de codificação totais de ambos BnAHAS I e III foram clona- das e sequenciadas. Nesta linha, o único polimorfismo comparado a sequência tipo selvagem BN-2 foi a mudança de códon AGT -> AAT que resulta na substituição de aminoácido S653N em BnAHAS III.

[00098] A análise de sequência preliminar de amplicons BnAL- SOF2/BnALSOR2 e BnALSOF2/BnALSOR3 clonados aleatórios de linha BnALS1621N-57 indicou que ambos clones BnALS1621N-57-43 e 46 tinham a mutação W574L (TGG -> TTG) em BnAHAS I. A análise de sequência total foi registrada, e indicou a linha 57 ser heterozigota, visto que clones 38 e 41 eram W574. Portanto, a combinação de iniciador BnALSOF2, BnALSOR2 e BnALSOR3 foi usada para amplificar este fragmento de BnALS1621N-57 e BnALS1621N-45, uma amostra de calo paralela do mesmo calo resistente a Imi inicial como BnALS1621N-57, ligado em pGEM-T fácil, transformado e colocado seleção azul/branca.

[00099] MM#29 foi usado para classificar 19 colônias brancas para o W574L de cada uma das placas para BnALS1621N-57 e BnALS1621N- 45, com 4 colônias positivas para cada (BnALS1621N-45-l, 2, 9 e 18, e BnALS1621N-57-l, 7, 13 e 16) sendo plasmídeo preparado e sequen- ciado. A análise de sequência mostrou que todas s 8 colônias tinham a mutação W574L em BnAHAS I. A temperatura de fortalecimento para MM#29 foi otimizada, e 19 colônias adicionais classificadas usando-se estas novas condições. Três colônias positivas (BnALS1621N-57-17, 18 e 19) eram plasmídeo preparado e sequenciado.

[000100] Amostras de Canola resistentes a Imi adicionais BnALS-68 a 91 foram recebidas e DNA genômico extraído usando-se o método de Edwards et al. (1991). De cada amostra, as combinações de iniciador BnALSOF2, BnALSOR2 e BnALSOR3 foram usadas para amplificar fragmentos de BnAHAS I e III e cloná-los em pGEM-T fácil.

[000101] Usando-se MM#23 em reações de AS-PCR para detectar a mutação S653N, 12 colônias por linha foram classificadas, e os resultados mostraram 2 positivos de linha BnALS-81 (BnALS-81-203 e 208) e 4 de BnALS-76 (BnALS-76-153, 154, 156 e 162) para conter a mutação S653N em BnAHAS III por sequenciamento. A análise de sequência total foi registrada. Por varredura de AS-PCR com MM#23, ambas regiões alvo amplificadas por PCR ou de colônias bacteriais com inser- tos clonados simples, linha BnALS-159 (amostra de biologia molecular 102; colônia 655) foi identificado como tendo a mutação S653N em BnAHAS I, evento S653N inicial de Cibus neste gene.

[000102] Finalmente, na linha BnALS-83 (amostra de biologia molecular 91), tipo selvagem (colônia 408) e mutante (colônias 403, 405 e 406) foram identificadas para indicar que esta linha foi heterozigota para a mutação S653T (AGT -> ACT) em BnAHAS I. Como plantas, a linha BnALS-83 foi confirmada ser heterozigota em BnAHAS I para a mutação S653T. Varredura adicional com MM#23 (S653N) e MM#29 (W574L) de novas linhas de BN-2 Canola resistente a Imi BnALS-76 e BnALS-123 foi realizada. Desde que as mutações esperadas antes mencionadas não foram encontradas nestas amostras, 12 BnAL- SOF2/OR2/3 foram clonados e sequenciados. Todos os 7 clones de BnAHAS III para BnALS-123 (Colônias 5, 17-19, 21,22, 26 e 28) foram positives para a mutação S653T. Contudo, semente a partir das plantas Rl foi genotipada como heterozigoto.

[000103] Adicionalmente, fragmentos de PCR N-terminal de cada de BnAHAS I e III foram clonados e sequenciados para BnALS-58, 68 e 69 usando-se BnALS3/BnALS8 (SEQ ID NOs: 11 e 19 respectivamente) e BnALS3/BnALS9 (SEQ ID NOs: 11 e 20, respectivamente) oligo combinações respectivamente. Um nova amostra de tecido para BnALS- 96 foi obtida e fragmentos de PCR N-terminal de BnAHAS I e III foram clonados e sequenciados para mostrar que linha BnALS-96 tinha uma mutação A205V (GCC -> GTC) em BnAHAS I. Todos os quatro clones da sequência de codificação de comprimento total de BnALS3/OR2 amplicon de material de planta derivada de linha de calo BnALS-68 tinham uma mudança A205V (GCG -> GTG) em BnAHAS III, idêntica à mudança em BnALS-69.

[000104] As linhas determinadas para ter uma mutação, o experimento elas foram derivadas de e o tratamento provido são resumidos na Tabela 2. A linha BnALS-159 morreu como uma linha de calo e não regenerou brotos. A Tabela 3 mostra oligos exemplares usados nos experimentos aqui descritos. TABELA 2. MUTAÇÕES EM AMOSTRAS DE TECIDO RESISTENTES À IMI DE BN CANOLA.

TABELA 3: OLIGOS EXEMPLARES

[000105] Conforme os brotos tornaram-se disponíveis, os cruzamentos estão sendo feitos em todas as permutações e combinações. A linha BnALS-97 é a referência S653N em BnAHAS III. A linha BnALS- 57 é a referência W574L em BnAHAS I. Ambos BnALS-68 e 69 estão sendo avançados como linhas de referência para A205V em BnAHAS III. A linha BnALS-83 é a primeira linha que foi heterozigota para S653T em BnAHAS I como calo para também ser heterozigota como planta.

Exemplo 2: Materiais e Métodos

[000106] Descrição da Operação de Cultura de Célula. Brotos derivados ambos de sementes e de embriões derivados de microesporo foram propagados sob condições estéreis in vitro. Cortes foram sub- cultivados de 2-4 semanas e cultivados em pratos petri (25 mm x 90 mm) em um volume de 40 - 45 mL de meio RS (Dovzhenko, 2001). Os pratos foram vedados com fita Micropore (3M Company). Folhas jovens foram usadas para isolamento de protoplasto.

[000107] Purificação e isolamento de protoplasto. Cerca de 600 mg de brotos de tecido de folha de 2 - 3 semanas de idade in vitro foram cortados em pequenas tiras com um escalpe em um prato petri com 5 mL de meio B (Pelletier et al, 1983), pH ajustado para 5,8. Após aproximadamente 1 hora, o meio B foi substituído com solução de enzima, consistindo em meio B em que 0,5% (p/v) Celulase YC e 0,75% (p/v) Macerozyme R10 (ambas de Karlan Research Products, Cottonwood, Arizona), 1 g/L de albumina de soro bovino, e 1 g/L de ácido 2- morfolinoetanosulfônico foram dissolvidos. A solução de enzima foi filtrada à vácuo no tecido de folha, e o prato com peças de folha em solução de enzima foi incubado a 25°C no escuro. A purificação do protoplasto foi realizada usando-se um gradiente de densidade de io- dixanol (adaptado de Optiprep Application Sheet Cl 8; Purification of Intact Plant Protoplasts; Axis-Shield USA, 10 Commerce Way, Norton, MA 02776). Após a centrifugação do gradiente de densidade, a faixa com protoplastos purificados foi removida junto com cerca de 5 mL de meio W5 (Frigerio et al, 1998). O protoplasto produzido foi determinado com um hemocitômetro, e os protoplastos foram armazenados por 2 horas a 4°C.

[000108] Introdução de GRON de Oligonucleotídeo de Reparo de Gene. A suspensão de protoplasto foi misturada com um volume igual de meio W5, transferida par um tubo centrífugo de 50 mL, e centrifugada por 5 minutos no assentamento mais baixo de uma centrífuga química (cerca de 50 x g). O sobrenadante foi removido e substituído com meio TM (Klaus, 2001), ajustando a densidade do protoplasto para 5 x 10 /mL. Alíquotas de 100 μL contendo 5x10 protoplastos cada foram distribuídas em tubos centrífugos de fundo redondo de 12 mL. GRONs alvejados em uma mutação em um ou ambos genes de AHAS foram então introduzidos nos protoplastos usando-se um tratamento de PEG. Para introduzir os GRONs nos protoplastos, 12,5 μg de GRON dissolvidos em 25 μL de água purificada e 125 μL de uma solução de polietileno glicol (5 g de PEG MW 1500, 638 mg de manitol, 207 mg de CaN0β x 4H20 e 8,75 mL de água purificada; pH ajustado a cerca de 9,0) foi adicionado. Após 30 minutos de incubação no gelo, a suspensão de protoplasto-PEG foi lavada com meio W5 e ressuspen- sa em meio B. A suspensão foi mantida durante a noite em um refrigerador a cerca de 4°C.

[000109] Embebimento de protoplastos em alginato de cálcio. Um dia após a introdução de GRON, os protoplastos foram embebidos em alginato de cálcio. O embebimento de protoplastos em substratos de gel (por exemplo, agarose, alginato) foi mostrado aumentar a sobrevivência do protoplasto e aumentar as frequências de divisão de células derivadas de protoplasto. O método aplicado foi baseado naquele descrito em Dovzhenko (2001).

[000110] Cultura de protoplasto e seleção de calo resistente a imaze- tapir. A seleção de calo resistente a imazetapir foi efetuada usando-se subculturas sequenciais dos alginatos no meio de acordo com Pelletier et al. (1983). A seleção foi iniciada uma semana após o tratamento de PEG/GRON a uma concentração de 0,5 μM de imazetapir. O herbicida não tem um efeito imediato. Inicialmente, todas as microcolônias que tinham se formado durante a fase de cultura anterior sem imazetapir continuaram a crescer, mas mais vagarosamente do que controles sem herbicida adicionado. Uma a duas semanas após o começo da seleção, as colônias diminuíram em crescimento ou cessaram o crescimento.

[000111] Antes do final da fase de seleção no meio líquido, as células e as colônias foram liberadas do alginato pelo tratamento das mesmas por 30 - 45 minutos com meio de cultura contendo 50 mM de citrato de ódio. No momento de transferência das colônias liberadas do líquido para o meio sólido, a maioria das colônias foram ou mortas, ou consistiam de um centro esverdeado, coberto com camadas externas de células mortas. No meio de seleção solidificado E, a maioria de microcalo que ainda continha células vivas cessou o crescimento e se tornou marrom. O crescimento limitado de calo individual continuou ocasionalmente, mas todo calo não-resistente eventualmente se tornou marrom e morreu. Duas a três semanas após a transferência para o meio de seleção solidificado (ocasionalmente anterior), o crescimento ativo do calo apareceu entre um antecedente de células marrons e microcalo.

[000112] A regeneração de plantas de calo tolerante à herbicida derivado de protoplasto com uma mutação se confirmou em um gene de AHAS. O calo tolerante a Imi que tinha se desenvolvido no meio de seleção solidificado e cujo DNA após análise tinha mostrado a presença de uma mutação foi transferido para o meio E livre de herbicida (Pelletier et al., 1983) para acelerar o desenvolvimento. Linhas de calo individuais variaram em suas taxas de crescimento e morfologias. Em geral, o desenvolvimento em direção a regeneração do broto seguiu estas etapas:

[000113] Calo verde não-diferenciado -> calo com áreas verdes escuras -> desenvolvimento de raízes -> desenvolvimento de brotos iniciais -> desenvolvimento de brotos retardados com folhas hiper- hídricas (vitrificadas).

[000114] O desenvolvimento de linha de calo individual foi variável, mas através de subcultura contínua e multiplicação no meio E ou modificações de meio E com concentrações inferiores de alfa-naftaleno ácido acético (NAA) eventualmente muitas linhas de calo produzem brotos.

[000115] Desde que brotos com três a quatro folhas tinham e forma- do no meio E, eles foram transferidos para o meio RS (Dovzhenko, 2001). Neste meio, com o tempo o broto e tecido de folha desenvolvidos eram morfologicamente 'normais' (isto é, não-hiperhídricas). Após as plantinhas in vitro tiverem produzido raízes, protocolos padrões foram usados para a adaptação às condições de estufa.

Exemplo 4: Dados de Pulverização de Herbicida

[000116] Plantas de B. napus no estágio de 5-6 folhas foram pulverizadas com vários herbicidas de inibição de AHAS. As plantas de B. napus pulverizadas incluíam a linha parental BN02 (ou BN11 conforme requerido), BN15 (Clearfield, uma verificação comercial de dois genes) e mutantes conforme detalhado abaixo. Os herbicidas foram pulverizados na presença de 0,25% de surfactante AU391 nas seguintes taxas:

[000117] Imazamox (Beyond®) 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 32 e 48 onças de ingrediente ativo/Acre (ai/A)

[000118] Tifensulfuron 0,028, 0,056, 0,112, 0,168 lb de ai/A

[000119] Tribenuron 0,015, 0,03, 0,06, 0,12, 0,18 lb de ai/A

[000120] Nicosulfuron 0,06, 0,120, 0,24, 0,36 lb de ai/A

[000121] Rimsulfuron 0,015, 0,03, 0,06, 0,12, 0,18 lb de ai/A

[000122] 2:1 peso-peso de Tifensulfuron/Tribenuron 0,056, 0,112, 0,224, 0,336 lb de ai/A

[000123] 2.22:1 Tifensulfuron/Nicosulfuron 0,058, 0,116, 0,232 lb de ai/A

[000124] Primisulfuron 0,035, 0,070, 0,140 lb de ai/A

[000125] Flumetsulam 0,040, 0,080, 0,16 lb de ai/A

[000126] Cloransulam 0,039, 0,078, 0,156 lb de ai/A

[000127] Os herbicidas foram aplicados por pulverização foliar com plantas de controle sendo deixadas não-pulverizadas. Esperando Imazamox, todos os traços de herbicida de inibição de AHAS foram avaliados 14 dias pós pulverização usando-se uma escala de dano de 1-10 com 1 estando morto, e 10 sendo os controles não-pulverizados não- danificado. AS linhas de planta individuais foram contadas em cada taxa de pulverização comparada ao desempenho dos controles naquela taxa particular. Os resultados do ensaio de pulverização são apresentados na figura 4.

[000128] Química testada: Genótipo (# de mudas para todas as taxas)

[000129] Tifensulfuron: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18)

[000130] Tribenuron: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18), 63 (9)

[000131] Nicosulfuron: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18)

[000132] THI/TRI: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18)

[000133] Rimsulfuron: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18), 63 (9)

[000134] THI/Nic: BN2 (18), 63 (9), BN15xBnALS-57 (36), BN15 (18)

[000135] Primisulfuron: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18)

[000136] Flumetsulam: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18)

[000137] Cloransulam: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18)

[000138] Os ensaios com Imazamox foram avaliados conforme segue:

[000139] Contagem 10d para: 8, 16, 32, e 48 onças/A de BnALS- 83xBnALS-123, BnALS-96xBnALS-123, BnALS-97xBnALS-57, BN15xBnALS- 57, BN2, BN15, BnALS-97xBN15

[000140] Contagem 17d para: 4 e 12 onças/A de BnALS-97xBnALS- 57, BN15xBnALS-97, BN2

[000141] Contagem 28d para: 2, 4, 6, 8 onças/A para todas as mutações de fator simples.

[000142] Imazamox:

[000143] (2 onças)/A: BN2 (18), BnALS-123 (9), BnALS-96 (9), BnALS-97 (18), BnALS-83 (6), BnALS-76 (18), BnALS-58 (9), BnALS- 57 (12)

[000144] (4 onças)/A: BN2 (18), BnALS-123 (9), BnALS-96 (9), BnALS-97 (18), BnALS-83 (9), BnALS-76 (18), BnALS-58 (9), BnALS- 57 (12), BnALS-97xBN15 (15), BnALS-97xBnALS-57 (14)

[000145] (6 onças)/A: BN2 (9), BnALS-123 (9), BnALS-96 (12), BnALS-97 (9), BnALS-83 (12), BnALS-76 (9), BnALS-57 (12)

[000146] (8 onças/)A: BnALS-123 (9), BnALS-96 (12), BnALS-83 (12), BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (18), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (15), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18)

[000147] (12 onças)/A: BnALS-97xBN15 (15), BnALS-97xBnALS-57 (14), BN2 (12)

[000148] (16 onças)/A: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS- 96xBnALS-123 (18), BN2 (15), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18)

[000149] (32 onças)/A: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS- 96xBnALS-123 (18), BN2 (13), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18)

[000150] (48 onças)/A: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS- 96xBnALS-123 (18), BN2 (6), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18) REFERÊNCIAS Datta SK, Datta K, Soltanifar N, Donn G, Potrykus 1 (1992) Herbicideresistant Indica rice plants from IRR1 breeding line 1R72 after PEG- mediated transformation of protoplasts. Plant Molec. Biol. 20:619-629 Dovzhenko A (2001) Towards plastid transformation in rapeseed (Brassica napus L.) e sugarbeet {Beta vulgaris L.). PhD Dissertation, LMU Munich, Faculty of Biology Edwards K, Johnstone C, Thompson C (1991) A simple e rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Acid nucle- ics Res. 19:1349. Frigerio L, Vitale A, Lord JM, Ceriotti A, Roberts LM (1998) Free ricin A chain, proricin, e native toxin have different celular fates when expressed in tobacco protoplasts. J Biol Chem 273:14194-14199 Fang LY, Gross PR, Chen CH, Lillis M (1992) Sequence of two aceto- hidroxiacid sintase genes from Zea mays. Plant Mol Biol. 18(6): 1185-7 Gharti-Chhetri GB, Cherdshewasart W, Dewulf J, Jacobs M, Negrutiu I (1992) Polyethylene glycol-mediated direct gene transfer in Nicotiana spp. Physiol. Plant. 85:345-351 Klaus S (2003) Markerfreie transplastome Tabakpflanzen (Marker-free transplastomic tobacco plants). PhD Dissertation, LMU Munich, Faculty of Biology Miki B, Huang B, Bird S, Kemble R, Simmonds D, Keller W (1989) A procedure for the microinjection of plant cells and protoplasts. Meth. Cell Science 12:139-144 Pelletier G, Primard C, Vedel F, Chetrit P, Remy R, Rouselle P, Renard M (1983) Intergeneric cytoplasm hybridization in Cruciferae by protoplast fusion. Mol. Gen. Genet. 191: 244-250 Schnorf M, Neuhaus-Url G, Galli A, Iida S, Potrykus I, Neuhaus G (1991) An improved approach for transformation of plant cells by microinjection: molecular e genetic analysis. Transgen. Res. 1:23- 30 Tan S, Evans RR, Dahmer ML, Singh BK, Shaner DL (2005) Imidazoli- none-tolerant crops: history, current status e future. Pest Manag Sci. 61(3):246-57.

[000151] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnico e científicos aqui usados têm o mesmo significado conforme co- mumente compreendido por um versado na técnica a qual esta invenção pertence.

[000152] As invenções ilustrativamente aqui descritas podem adequadamente serem praticadas na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente aqui descritas. Desse modo, por exemplo, os termos "compreendendo," "incluindo," "contendo," etc devem ser lidos expansivamente e sem limitação. Adicionalmente, os termos e expressões empregados aqui foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não existe intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções destes. É reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada.

[000153] Desse modo, deve ser compreendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita por concretizações preferidas e características opcionais, modificação, aperfeiçoamento, e variação das invenções descritas podem ser recorridos por aqueles versados na técnica, e que tais modificações, aperfeiçoamentos e variações são considerados estarem dentro do escopo desta invenção. Os materiais, métodos e exemplos providos aqui são representativos de concretizações preferidas, são exemplares, e não são pretendidos como limitações do escopo da invenção.

[000154] A invenção foi descrita amplamente e geneticamente aqui. Cada uma das espécies mais estreitas e grupamentos subgenéricos que caem dentro da revelação genérica também formam parte da invenção. Isto inclui a descrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa que remove qualquer matéria objeto do gênero, indiferente de se ou não o material excisado é especificamente citado aqui.

[000155] Em adição, onde características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos de Markush, aquele versado na técnica reconhecerá que a invenção é também desse modo descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.

[000156] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências aqui mencionadas são expressamente incorporados por referência em sua totalidade, para a mesma extensão como se cada fosse incorporado por referência individualmente. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, controlará.

[000157] Outras concretizações são colocadas dentro das reivindicações que se seguem.

Claims

1. Método para produção de planta Brassica resistente a herbicida, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introdução em uma célula de planta Brassica de uma primeira mutação direcionada em um gene de acetohidroxiácido sintase I (AHAS I) na célula de planta Brassica, em que a mutação direcionada é uma substituição de triptofano para leucina em uma posição correspondente à posição 559 de SEQ ID NO: 2, e uma segunda mutação direcionada em um gene de aceto-hidroxiácido sintase III (AHAS III) na célula de planta Brassica, em que a mutação direcionada é substituição de um triptofano para leucina em uma posição correspondente à posição 556 de SEQ ID NO: 3, e (b) identificação da célula de planta Brassica resistente a inibição por um herbicida de inibidor de AHAS, em que o herbicida de inibidor de AHAS é selecionado do grupo consistindo em imazamox, tifensulfuron, tribenuron, nicosulfuron, primisulfuron, flumetsulam e uma mistura 2:1 de tifensulfuron e tribenuron e uma mistura 2,22:1 de nicosulfuron e tifensulfuron; e (c) regeneração a partir da referida célula de planta Brassica identificada de uma planta Brassica não-transgênica tendo a primeira e a segunda mutações direcionadas no gene AHAS I e AHAS III.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta Brassica é uma planta Brassica napus.