JP6529528B2 - アブラナ属の変異アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子 - Google Patents

Description

関連特許出願の相互参照
本出願は，米国特許仮出願６０／９７７，９４４（２００７年１０月５日出願）に基づく優先権を主張しており，この出願は，明細書，図面，表を含めその全体がすべての目的のために参照として本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は，除草剤耐性植物および種子の分野に関し，特に，アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子および蛋白質における変異に関する。

発明の背景
以下の説明は，単に本発明の理解を助けるために提供され，本発明に対する従来技術を記載するかまたは構成すると認めるものではない。

除草剤寛容性植物の有益性は知られている。例えば，除草剤寛容性植物は，雑草を防除するための耕うんの必要性を低減させ，このことにより土壌の浸食を有効に低減することができる。

外因性変異遺伝子を植物に導入することは，これまでに多く記述されている。例えば，米国特許４，５４５，０６０は，植物のゲノムに，酵素をその競合的阻害剤であるグリホセートに対してより耐性にする少なくとも１つの変異を有するＥＰＳＰＳ変種をコードする遺伝子を導入することにより，植物のグリホセートに対する耐性を増加することに関する。

ＡＨＡＳ遺伝子における変異のいくつかの例が知られている。例えば，米国特許７，０９４，６０６を参照。

化学的変異導入により，低発現しているＡＨＡＳ Ｉ遺伝子中に変異が見いだされた。この変異は，ＰＭ−１として知られる（シロイヌナズナのアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）アミノ酸配列に基づいて６５３として知られる同等の位置における変異，セリンからアスパラギンへのアミノ酸の変化，それぞれ次のようにコードされる-ＡＧＴからＡＡＴ）
。高発現している遺伝子ＡＨＡＳ ＩＩＩに別の変異が見いだされ，これはＰＭ−２として知られる（５７４として知られる同等の位置における変異，トリプトファンからロイシンへのアミノ酸の変化，それぞれ次のようにコードされる-ＴＧＧからＴＴＧ）。これら
の２つの変異，すなわちＰＭ−１およびＰＭ−２を組み合わせたものが，クリアフィールド（Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ）キャノーラとして知られるキャノーラの商業的亜種である（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

発明の概要
本発明は，部分的には，変異アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）核酸，および変異した核酸によりコードされる蛋白質に関する。本発明はまた，部分的には，これらの変異した核酸および蛋白質を含むキャノーラ植物，細胞，および種子に関する。

１つの観点においては，配列番号１のＡ２０５，Ｄ３７６，Ｗ５７４，Ｒ５７７，およ
びＳ６５３からなる群より選択される位置に対応する１またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有するアブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ蛋白質をコードする単離された核酸が提供される。ある態様においては，単離された核酸は，配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換，配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換，配列番号１の３７６位に対応する位置におけるアスパラギン酸からグルタミン酸への置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからシステインへの置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからメチオニンへの置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからセリンへの置換，配列番号１の５７７位に対応する位置におけるアルギニンからトリプトファンへの置換，配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換および配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換からなる群より選択される１またはそれ以上の変異を有する蛋白質をコードする。ある態様においては，変異は配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換であり，ここで，変異はアブラナ属ＡＨＡＳ Ｉ遺伝子のＳ６５３Ｎではない。ある態様においては，変異は配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換である。ある態様においては，変異は配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換であり，ここで，変異はアブラナ属ＡＨＡＳ ＩＩＩ遺伝子のＷ５７４Ｌではない。ある態様においては，変異は配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換である。別の態様においては，変異は，配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換である。別の態様においては，単離された核酸は，表２に示される変異から選択される変異を有する蛋白質をコードする。ある態様においては，単離された核酸は２またはそれ以上の変異を有する蛋白質をコードする。ある態様においては，２またはそれ以上の変異は表２から選択される。ある態様においては，単離された核酸は，配列番号１のＳ６５３に対応する位置に変異を有し，配列番号１のＡ２０５，Ｄ３７６，Ｗ５７４，およびＲ５７７からなる群より選択される位置に対応する１またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質をコードする。別の態様においては，単離された核酸は，配列番号１のＷ５７４に対応する位置において変異を有し，配列番号１のＲ５７７に対応する位置において変異を有する蛋白質をコードする。ある態様においては，単離された核酸は，ＡＨＡＳ阻害性除草剤による阻害に耐性であるアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）蛋白質をコードする。ある態様においては，ＡＨＡＳ阻害性除草剤は，イミダゾリノン，スルホニルウレア，トリアゾロピリミジン，ピリミジニルチオベンゾエート，スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン，およびこれらの混合物からなる群より選択される除草剤である。ある態様においては，除草剤はイミダゾリノン除草剤である。ある態様においては，除草剤はスルホニルウレア除草剤である。ある態様においては，単離された核酸は，図２のアミノ酸配列の１またはそれ以上と７０％またはそれ以上の同一性を含むＡＨＡＳ蛋白質をコードする。ある態様においては，単離された核酸はセイヨウアブラナＡＨＡＳ蛋白質をコードする。別の態様においては，単離された核酸はセイヨウアブラナＡＨＡＳ Ｉ蛋白質をコードする。ある態様においては，単離された核酸はセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩ蛋白質をコードする。

別の観点においては，配列番号１のＡ２０５，Ｄ３７６，Ｗ５７４，Ｒ５７７，およびＳ６５３からなる群より選択される位置に対応する１またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有するアブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ蛋白質をコードする単離された核酸を含む発現ベクターが提供される。ある態様においては，発現ベクターは，配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換，配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換，配列番号１の３７６位に対応する位置におけるアスパラギン酸からグルタミン酸への置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからシステインへの置換，配列番号１の５７
４位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからメチオニンへの置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからセリンへの置換，配列番号１の５７７位に対応する位置におけるアルギニンからトリプトファンへの置換，配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換および配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換からなる群より選択される１またはそれ以上の変異を有する蛋白質をコードする単離された核酸を含む。ある態様においては，変異は，配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換であり，ここで，変異はアブラナ属ＡＨＡＳ Ｉ遺伝子のＳ６５３Ｎではない。ある態様においては，変異は配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換である。ある態様においては，変異は配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換であり，ここで，変異はアブラナ属ＡＨＡＳ ＩＩＩ遺伝子のＷ５７４Ｌではない。ある態様においては，変異は配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換である。別の態様においては，変異は配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換である。

別の観点においては，アブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子を有する植物が提供され，ここで，該遺伝子は，配列番号１のＡ２０５，Ｄ３７６，Ｗ５７４，Ｒ５７７，およびＳ６５３からなる群より選択される位置に対応する１またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質をコードする。別の観点においては，アブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子を有する植物が提供され，ここで，該植物はＡＨＡＳ阻害性除草剤に耐性であり，該遺伝子は，配列番号１のＡ２０５，Ｄ３７６，Ｗ５７４，Ｒ５７７，およびＳ６５３からなる群より選択される位置に対応する１またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質をコードする。上述の観点のある態様においては，植物は，配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換，配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換，配列番号１の３７６位に対応する位置におけるアスパラギン酸からグルタミン酸への置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからシステインへの置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからメチオニンへの置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからセリンへの置換，配列番号１の５７７位に対応する位置におけるアルギニンからトリプトファンへの置換，配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換および配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換からなる群より選択される１またはそれ以上の変異を有する蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，変異は配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換であり，ここで，変異はアブラナ属ＡＨＡＳ Ｉ遺伝子のＳ６５３Ｎではない。ある態様においては，変異は配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換である。ある態様においては，変異は配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換であり，ここで，変異はアブラナ属ＡＨＡＳ ＩＩＩ遺伝子のＷ５７４Ｌではない。ある態様においては，変異は配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換である。別の態様においては，変は配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換である。別の態様においては，変異は表２に示される変異から選択される。ある態様においては，植物は，２またはそれ以上の変異を有する蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，２またはそれ以上の変異は表２から選択される。ある態様においては，植物は，配列番号１のＳ６５３に対応する位置において変異を有し，配列番号１のＡ２０５，Ｄ３７６，Ｗ５７４，およびＲ５７７からなる群より選択される位置に対応する１またはそれ以上のアミノ酸位置において
変異を有する蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。別の態様においては，植物は，配列番号１のＷ５７４に対応する位置において変異を有し，かつ配列番号１のＲ５７７に対応する位置において変異を有する蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，植物は，ＡＨＡＳ阻害性除草剤による阻害に耐性である蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，植物は，図２のアミノ酸配列の１またはそれ以上と７０％またはそれ以上の同一性を含む蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，植物は，少なくとも１つのＡＨＡＳ阻害性除草剤の適用に対して耐性である。ある態様においては，ＡＨＡＳ阻害性除草剤は，イミダゾリノン，スルホニルウレア，トリアゾロピリミジン，ピリミジニルチオベンゾエート，スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン，およびこれらの混合物からなる群より選択される除草剤である。ある態様においては，除草剤はイミダゾリノン除草剤である。ある態様においては，除草剤はスルホニルウレア除草剤である。ある態様においては，植物は，表２に挙げられる系統から選択される系統の種子を生長させることにより製造されるアブラナ属植物である。ある態様においては，植物はアブラナ属の種である。別の態様においては，植物はセイヨウアブラナである。ある態様においては，植物は，春菜種（Ｓｐｒｉｎｇ Ｏｉｌｓｅｅｄ Ｒａｐｅ）および冬菜種（Ｗｉｎｔｅｒ Ｏｉｌｓｅｅｄ Ｒａｐｅ）から選択される。ある態様においては，植物はセイヨウアブラナＡＨＡＳ蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。別の態様においては，植物はセイヨウアブラナＡＨＡＳ Ｉ蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，植物はセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩ蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，植物は非トランスジェニックである。

１つの観点においては，配列番号１のＡ２０５，Ｄ３７６，Ｗ５７４，Ｒ５７７，およびＳ６５３からなる群より選択される位置に対応する１またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質をコードするアブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子を有する種子提供される。ある態様においては，種子は，配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換，配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換，配列番号１の３７６位に対応する位置におけるアスパラギン酸からグルタミン酸への置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからシステインへの置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからメチオニンへの置換，配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからセリンへの置換，配列番号１の５７７位に対応する位置におけるアルギニンからトリプトファンへの置換，配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換，および配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換からなる群より選択される１またはそれ以上の変異を有する蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，変異は配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換であり，ここで，変異はアブラナ属ＡＨＡＳ Ｉ遺伝子のＳ６５３Ｎではない。ある態様においては，変異は配列番号１の６５３位に対応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換である。ある態様においては，変異は配列番号１の５７４位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換であり，ここで，変異はアブラナ属ＡＨＡＳ ＩＩＩ遺伝子のＷ５７４Ｌではない。ある態様においては，変異は配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換である。別の態様においては，変異は配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換である。別の態様においては，変異は表２に示される変異から選択される。ある態様においては，種子は２またはそれ以上の変異を有する蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，２またはそれ以上の変異は表２から選択される。ある態様においては，配列番号１のＳ６５３に対応する位置において変異を有し，かつ配列番号１のＡ２０５，Ｄ３７６，Ｗ５７４，およびＲ５７７からなる群より選択される位置に対応する１または
それ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。別の態様においては，種子は，配列番号１のＷ５７４に対応する位置において変異を有し，配列番号１のＲ５７７に対応する位置において変異を有する蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，種子は，ＡＨＡＳ阻害性除草剤による阻害に耐性である蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，種子は，図２のアミノ酸配列の１またはそれ以上と７０％またはそれ以上の同一性を含む蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，種子は，少なくとも１つのＡＨＡＳ阻害性除草剤の適用に耐性である。ある態様においては，ＡＨＡＳ阻害性除草剤は，イミダゾリノン，スルホニルウレア，トリアゾロピリミジン，ピリミジニルチオベンゾエート，スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン，およびこれらの混合物からなる群より選択される除草剤である。ある態様においては，除草剤はイミダゾリノン除草剤である。ある態様においては，除草剤はスルホニルウレア除草剤である。ある態様においては，種子はアブラナ属種子である。ある態様においては，種子はセイヨウアブラナＡＨＡＳ蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。別の態様においては，種子はセイヨウアブラナＡＨＡＳ Ｉ蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，種子はセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩ蛋白質をコードするＡＨＡＳ遺伝子を有する。ある態様においては，種子はアブラナ属植物系統の種子であり，この系統は，表２に挙げられる系統から選択される。ある態様においては，種子は非トランスジェニックである。ある態様においては，本明細書に記載される方法により得られる植物から生成される種子を提供する。別の態様においては，種子はキャノーラ種子である。

別の観点においては，除草剤耐性植物を製造する方法が提供される。この方法は植物細胞にアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子に標的とする変異を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）を導入して，配列番号１のＡ２０５，Ｄ３７６，Ｗ５７４，およびＳ６５３からなる群より選択される位置に対応する１またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有するＡＨＡＳ蛋白質を発現するＡＨＡＳ遺伝子を有する植物細胞を生成し；ＡＨＡＳ阻害性除草剤の存在下で対応する野生型植物細胞と比較して実質的に正常な生長および触媒活性を有する植物細胞を同定し；そして，前記植物細胞から変異したＡＨＡＳ遺伝子を有する非トランスジェニック除草剤耐性植物を再生する，の各工程を含む。別の観点においては，植物の除草剤耐性を増加させる方法が提供され，この方法は，（ａ）第１のアブラナ属植物と第２のアブラナ属植物を交配させ，ここで，第１の植物はアブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子を含み，ここで，遺伝子は，配列番号１のＡ２０５，Ｄ３７６，Ｗ５７４，Ｒ５７７，およびＳ６５３からなる群より選択される位置に対応する１またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質をコードしており；（ｂ）交配から得られた集団を，増加したＡＨＡＳ除草剤耐性についてスクリーニングし；（ｃ）交配の結果生じた，ＡＨＡＳ除草剤耐性が増加したメンバーを選択し；そして（ｄ）交配から得られた種子を生成する，の各工程を含む。ある態様においては，ハイブリッド種子は上述のいずれかの方法により製造される。ある態様においては，植物は上述のいずれかの方法により製造された種子から生長させる。別の観点においては，植物を含む畑において雑草を防除する方法が提供され，この方法は，有効量の少なくとも１つのＡＨＡＳ阻害性除草剤を前記雑草および植物を含む畑に適用し，植物はアブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子を有しており，遺伝子は配列番号１のＡ２０５，Ｄ３７６，Ｗ５７４，Ｒ５７７，およびＳ６５３からなる群より選択される位置に対応する１またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質をコードする。ある態様においては，ＡＨＡＳ阻害性除草剤は，イミダゾリノン，スルホニルウレア，トリアゾロピリミジン，ピリミジニルチオベンゾエート，スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン，およびこれらの混合物からなる群より選択される除草剤である。別の態様においては，ＡＨＡＳ阻害性除草剤はイミダゾリノン除草剤である。別の態様においては，ＡＨＡＳ阻害性除草剤はスルホニルウレア除草剤である。

"核酸"または"核酸配列"との用語は，オリゴヌクレオチド，ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド，およびこれらのフラグメントまたは一部を表し，これは一本鎖であっても二本鎖であってもよく，センス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく，天然起源のものであっても合成のものであってもよい。例えば，核酸には，ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが含まれる。核酸には，増幅された（例えば，ポリメラーゼ連鎖反応を用いて）核酸が含まれる。"ＮＴｗｔ＃＃＃ＮＴｍｕｔ"との慣用表記法は，核酸中の位置＃＃＃において野生型ヌクレオチドＮＴｗｔが変異型ＮＴｍｕｔで置き換えられることにより生ずる変異を示すために用いられる。ヌクレオチドの１文字コードは"ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐ
ａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ"，第２４２２章，表１に示され
るとおりである。この点に関して，ヌクレオチドの表記では，"Ｒ"はプリン，例えばグアニンまたはアデニンを意味し，"Ｙ"はピリミジン，例えばシトシンまたはチミン（ＲＮＡの場合にはウラシル）を意味し，"Ｍ"はアデニンまたはシトシンを意味し，"Ｋ"はグアニンまたはチミンを意味し，"Ｗ"はアデニンまたはチミンを意味する。

"遺伝子"とは，ＲＮＡを生成するのに必要な制御配列およびコーディング配列を含むＤＮＡ配列を表し，これは，非コーディング機能（例えば，リボソームまたはトランスファーＲＮＡ）を有していてもよく，またはポリペプチドまたはポリペプチド前駆体を含んでいてもよい。ＲＮＡまたはポリペプチドは，全長コーディング配列によりコードされていてもよく，または，所望の活性または機能が維持される限り，コーディング配列の任意の一部によりコードされていてもよい。本明細書において用いる場合，"ＡＨＡＳ遺伝子"との用語は，アブラナ属ＡＨＡＳ遺伝子に対して相同性を有する遺伝子を表す。ある態様においては，ＡＨＡＳ遺伝子は，特定のアブラナ属ＡＨＡＳ遺伝子，例えば，セイヨウアブラナＡＨＡＳ遺伝子ＩまたはセイヨウアブラナＡＨＡＳ遺伝子ＩＩＩに対して，７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；９６％；９７％；９８％；９９％；または１００％の同一性を有する。ある態様においては，ＡＨＡＳ遺伝子は，図３の配列から選択される配列に対して，６０％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；９６％；９７％；９８％；９９％；または１００％の同一性を有する。ある態様においては，ＡＨＡＳ遺伝子は少なくとも１つの変異により改変されている。別の態様においては，ＡＨＡＳ遺伝子は，少なくとも２つの変異により改変されている。ある態様においては，ＡＨＡＳ遺伝子は，表２に示される変異から選択される少なくとも１つの変異により改変されている。ある態様においては，ＡＨＡＳ遺伝子は，表２に示される少なくとも２つの変異により改変されている。ある態様においては，変異は保存的変異である。

"コーディング配列"とは，転写されるか，および／または翻訳されて，ｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドまたはそのフラグメントを生成する核酸またはその相補体，またはその一部の配列を意味する。コーディング配列はゲノムＤＮＡまたは未成熟一次ＲＮＡ転写産物中にエクソンを含み，これは細胞の生化学的機構により一緒に連結されて，成熟ｍＲＮＡを与える。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり，コードされる配列はここから推定することができる。

"非コーディング配列"とは，インビボでアミノ酸に転写されない核酸またはその相補体の配列またはその一部，または，ｔＲＮＡがアミノ酸を配置するよう相互作用しないかまたは配置しようとしない配列を意味する。非コーディング配列には，ゲノムＤＮＡまたは未成熟一次ＲＮＡ転写産物中のイントロン配列，および遺伝子付随配列，例えばプロモーター，エンハンサー，サイレンサー等の両方が含まれる。

核酸塩基は塩基であり，ある好ましい態様においては，プリン，ピリミジン，またはこれらの誘導体または類似体である。ヌクレオシドは，ペントースフラノシル成分を含む核酸塩基，例えば，任意に置換されていてもよいリボシドまたは２’−デオキシリボシドで
ある。ヌクレオシドは，リンを含んでいても含んでいなくてもよいいくつかの連結成分の１つにより連結することができる。未置換ホスホジエステル結合により連結されているヌクレオシドは，ヌクレオチドと称される。本明細書において用いる場合，"核酸塩基"との用語には，ペプチド核酸塩基，ペプチド核酸のサブユニット，およびモルホリン核酸塩基，ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドが含まれる。

オリゴ核酸塩基は，核酸塩基を含むポリマーである。好ましくはその少なくとも一部は，相補的配列を有するＤＮＡに，ワトソンクリック塩基対形成によりハイブリダイズすることができる。オリゴ核酸塩基鎖は，単一の５’および３’末端を有することができ，これはポリマー中の最終の核酸塩基である。特定のオリゴ核酸塩基鎖は，すべてのタイプの核酸塩基を含むことができる。オリゴ核酸塩基化合物は，相補的であってワトソンクリック塩基対形成によりハイブリダイズすることができる１またはそれ以上のオリゴ核酸塩基鎖を含む化合物である。リボ型の核酸塩基には，２’炭素がヒドロキシル，アルキルオキシまたはハロゲンで置換されているメチレンであるペントースフラノシル含有核酸塩基が含まれる。デオキシリボ型の核酸塩基は，リボ型の核酸塩基以外の核酸塩基であり，これには，ペントースフラノシル成分を含まないすべての核酸塩基が含まれる。

ある態様においては，オリゴ核酸塩基鎖には，オリゴ核酸塩基鎖およびオリゴ核酸塩基鎖のセグメントまたは領域の両方が含まれる。オリゴ核酸塩基鎖は３’末端および５’末端を有することができ，オリゴ核酸塩基鎖が鎖と同一の広がりを持つ場合，鎖の３’および５’末端は鎖の３’および５’末端でもある。

本明細書において用いる場合，"遺伝子修復オリゴ核酸塩基"との用語は，混合デュープレックスオリゴヌクレオチド，非ヌクレオチド含有分子，一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドおよび他の遺伝子修復分子を含むオリゴ核酸塩基を表す。

核酸（例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡ，または混合ポリマー等のオリゴヌクレオチド）について"単離された"とは，これが天然に生ずるゲノムの実質的な部分から分離されているか，および／または，そのような核酸に天然に付随する他の細胞成分から実質的に分離されている核酸を意味する。例えば，合成により製造された（例えば，連続的な塩基縮合により）核酸は，単離されたものと考えられる。同様に，組換え的に発現された，クローニングされた，プライマー伸張反応（例えばＰＣＲ）により生成した，または他の方法によりゲノムから切り出された核酸もまた，単離されたものと考えられる。

"アミノ酸配列"とは，ポリペプチドまたは蛋白質の配列を表す。"ＡＡｗｔ＃＃＃ＡＡ
ｍｕｔ"との慣用表記法は，ポリペプチド中の位置＃＃＃において野生型アミノ酸ＡＡｗ
ｔが変異体ＡＡｍｕｔで置き換えられることにより生ずる変異を示すために用いられる。

"相補体"とは，核酸に対する標準的なワトソン−クリック塩基対規則にしたがう相補的配列を意味する。相補的配列はまた，ＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡの配列またはその相補的配列であってもよく，ｃＤＮＡであってもよい。

"実質的に相補的な"とは，ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で２つの配列がハイブリダイズすることを意味する。当業者は実質的に相補的な配列はその全長にわたってハイブリダイズする必要はないことを理解するであろう。

本明細書において用いる場合，"コドン"との用語は，蛋白質合成の間にポリペプチド鎖中への特定のアミノ酸の挿入を決定する遺伝的コードまたは蛋白質合成の停止のシグナルを構成する，３つの隣接するヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）の配列を表す。"コドン"との用語はまた，元のＤＮＡが転写されたメッセンジャーＲＮＡ中の３つの
ヌクレオチドの対応する（そして相補的な）配列を表すためにも用いられる。

本明細書において用いる場合，"ＡＨＡＳ蛋白質"との用語は，アブラナ属ＡＨＡＳ蛋白質に相同性を有する蛋白質を表す。ある態様においては，ＡＨＡＳ蛋白質は，特定のアブラナ属ＡＨＡＳ蛋白質，例えば，セイヨウアブラナＡＨＡＳ蛋白質ＩまたはセイヨウアブラナＡＨＡＳ蛋白質ＩＩＩと，７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；９６％；９７％；９８％；９９％；または１００％の同一性を有する。ある態様においては，ＡＨＡＳ蛋白質は，図２の配列から選択される配列と，７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；９６％；９７％；９８％；９９％；または１００％の同一性を有する。ある態様においては，ＡＨＡＳ蛋白質は少なくとも１つの変異により改変されている。別の態様においては，ＡＨＡＳ蛋白質は少なくとも２つの変異により改変されている。ある態様においては，ＡＨＡＳ蛋白質は，表２に示される変異から選択される少なくとも１つの変異により改変されている。ある態様においては，ＡＨＡＳ蛋白質は表２に示される少なくとも２つの変異により改変されている。ある態様においては，変異は保存的変異である。

"野生型"との用語は，その遺伝子または遺伝子産物が天然に生ずる起源から単離されたときの特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を表す。野生型遺伝子とは，集団中で最も高い頻度で観察され，したがって，任意に遺伝子の"正常型"または"野生型"と呼ばれる遺伝子である。"野生型"とはまた，特定のヌクレオチド位置（単数または複数）における配列，または特定のコドン位置（単数または複数）における配列，または特定のアミノ酸位置（単数または複数）における配列を表してもよい。

本明細書において用いる場合，"変異体"または"改変された"とは，野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較したときに，配列および／または機能上の特性（すなわち，変更された特徴）に改変を示す核酸または蛋白質を表す。また，"変異体"または"改変された"とは，野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較したときに，配列および／または機能上の特性（すなわち，変更された特徴）に改変を示す，特定のヌクレオチド位置（単数または複数）における配列，または特定のコドン位置（単数または複数）における配列，または特定のアミノ酸位置（単数または複数）における配列を表す。

"変異"とは，正常な配列または野生型配列に対して，核酸配列における少なくとも単一のヌクレオチドの変動（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）またはポリペプチドにおける単一のアミノ酸の変動を包含することを意味する。変異には，置換，欠失，反転または挿入が含まれる。

本明細書において用いる場合，"相同性"との用語は，蛋白質およびＤＮＡの間での配列類似性を表す。"相同性"または"相同な"との用語は，同一性の程度を表す。部分的な相同性であっても完全な相同性であってもよい。部分的に相同な配列とは，別の配列と比較したときに１００％より低い配列同一性を有するものである。

"ヘテロ接合性"とは，相同な染色体セグメント中の１またはそれ以上の遺伝子座において異なるアレルを有することを表す。本明細書において用いる場合，"ヘテロ接合性"はまた，１またはそれ以上の遺伝子座において異なるアレルが検出されるサンプル，細胞，細胞集団または生物も表す。ヘテロ接合性のサンプルは，当該技術分野において知られる方法，例えば，核酸配列決定によって判定してもよい。例えば，配列決定の電気泳動像が単一の位置に２つのピークを示し，両方のピークがおおよそ同じサイズであれば，サンプルはヘテロ接合性であると特徴づけることができる。あるいは，一方のピークが他方のピークより小さいが，大きいほうのピークのサイズの少なくとも約２５％のサイズであれば，サンプルはヘテロ接合性であると特徴づけることができる。ある態様においては，小さい
ほうのピークは大きいほうのピークの少なくとも約１５％である。別の態様においては，小さいほうのピークは，大きいほうのピークの少なくとも約１０％である。別の態様においては，小さいほうのピークは，大きいほうのピークの少なくとも約５％である。別の態様においては，小さいほうのピークは最少量で検出される。

本明細書において用いる場合，"ホモ接合性"とは，相同な染色体セグメント中の１またはそれ以上の遺伝子座において同一のアレルを有することを表す。"ホモ接合性"はまた，１またはそれ以上の遺伝子座において同じアレルが欠失していてもよいサンプル，細胞，細胞集団または生物も表す。ホモ接合性のサンプルは，当該技術分野において知られる方法，例えば，核酸配列決定により判定することができる。例えば，配列決定電気泳動像が特定の位置において単一のピークを示す場合，サンプルはその位置に関して"ホモ接合性"であると称される。

"半接合性"との用語は，第２のアレルが欠失しているために細胞または生物のジェノタイプにおいて１回のみ存在する遺伝子または遺伝子セグメントを表す。本明細書において用いる場合，"半接合性"はまた，ジェノタイプにおいて１またはそれ以上の遺伝子座におけるアレルが１回のみ検出されるサンプル，細胞，細胞集団または生物も表す。

本明細書において用いる場合，"接合性状態"との用語は，当該技術分野において知られ，本明細書に記載される方法により試験することにより判定して，ヘテロ接合性，ホモ接合性，または半接合性と思われるサンプル，細胞集団，または生物を表す。"核酸の接合
性状態"との用語は，核酸の起源が，ヘテロ接合性，ホモ接合性，または半接合性と思わ
れるか否かを判定することを意味する。"接合性状態"は，配列中の単一のヌクレオチドの相違を表してもよい。ある方法においては，単一の変異に関するサンプルの接合性状態は，野生型のホモ接合性，ヘテロ接合性（すなわち，１つの野生型アレルおよび１つの変異型アレル），変異型のホモ接合性，または半接合性（すなわち，野生型または変位型のアレルのいずれかの単一コピー）として分類することができる。

本明細書において用いる場合，"ＲＴＤＳ"との用語は，サイバス（Ｃｉｂｕｓ）社により開発されたザ・ラピッド・トレイト・デベロップメント・システム（Ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｉｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（商標））（ＲＴＤＳ）を表す。ＲＴＤＳは，外来遺伝子または制御配列を取り込ませることなく遺伝子配列を精密に変更するのに有効な部位特異的遺伝子改変システムである。

本明細書において用いる場合，"約"との用語は，数量的にプラスまたはマイナス１０％を意味する。例えば，"約３％"は２．７−３．３％を包含し，"約１０％"は９−１１％を包含する。

図１は，シロイナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アセトヒドロキシ酸シンターゼＡＨＡＳ（配列番号１），セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳ Ｉ（配列番号２），およびセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩ（配列番号３および４）のアミノ酸のアラインメントを示す。配列番号１は，アノーテーションされたゲノムＤＮＡ配列，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ００３０７４に基づくシロイナズナＡＨＡＳ Ａｔ３ｇ４８５６０のアミノ酸配列である。配列番号２はサイバス社優良系統ＢＮ−２およびＢＮ−１１からのセイヨウアブラナＡＨＡＳ Ｉのアミノ酸配列である。この配列は，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ１１５２４の翻訳産物と同一である。配列番号３は，サイバス社優良系統ＢＮ−２からのセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩのアミノ酸配列である。この配列は，アミノ酸３２５のＤ３２５Ｅ置換を除き，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ１１５２６の翻訳産物と同一である。配列番号４は，サイバス社優良系統ＢＮ−１１からのセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩのアミノ酸配列である。この配列は，配列番号１におけるアミノ酸３４３のＥ３４３を除き，配列番号３の翻訳産物と同一である。 図１は，シロイナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アセトヒドロキシ酸シンターゼＡＨＡＳ（配列番号１），セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳ Ｉ（配列番号２），およびセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩ（配列番号３および４）のアミノ酸のアラインメントを示す。配列番号１は，アノーテーションされたゲノムＤＮＡ配列，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ００３０７４に基づくシロイナズナＡＨＡＳ Ａｔ３ｇ４８５６０のアミノ酸配列である。配列番号２はサイバス社優良系統ＢＮ−２およびＢＮ−１１からのセイヨウアブラナＡＨＡＳ Ｉのアミノ酸配列である。この配列は，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ１１５２４の翻訳産物と同一である。配列番号３は，サイバス社優良系統ＢＮ−２からのセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩのアミノ酸配列である。この配列は，アミノ酸３２５のＤ３２５Ｅ置換を除き，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ１１５２６の翻訳産物と同一である。配列番号４は，サイバス社優良系統ＢＮ−１１からのセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩのアミノ酸配列である。この配列は，配列番号１におけるアミノ酸３４３のＥ３４３を除き，配列番号３の翻訳産物と同一である。 図１は，シロイナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アセトヒドロキシ酸シンターゼＡＨＡＳ（配列番号１），セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳ Ｉ（配列番号２），およびセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩ（配列番号３および４）のアミノ酸のアラインメントを示す。配列番号１は，アノーテーションされたゲノムＤＮＡ配列，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ００３０７４に基づくシロイナズナＡＨＡＳ Ａｔ３ｇ４８５６０のアミノ酸配列である。配列番号２はサイバス社優良系統ＢＮ−２およびＢＮ−１１からのセイヨウアブラナＡＨＡＳ Ｉのアミノ酸配列である。この配列は，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ１１５２４の翻訳産物と同一である。配列番号３は，サイバス社優良系統ＢＮ−２からのセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩのアミノ酸配列である。この配列は，アミノ酸３２５のＤ３２５Ｅ置換を除き，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ１１５２６の翻訳産物と同一である。配列番号４は，サイバス社優良系統ＢＮ−１１からのセイヨウアブラナＡＨＡＳ ＩＩＩのアミノ酸配列である。この配列は，配列番号１におけるアミノ酸３４３のＥ３４３を除き，配列番号３の翻訳産物と同一である。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図２は，表２に示される遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列を示す。太字で示されるアミノ酸は変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図３は，表２に示されるヌクレオチド配列を示す。太字で示されるヌクレオチドは変異を表す。 図４は，実施例４に記載される散布試験の結果を示す。 図４は，実施例４に記載される散布試験の結果を示す。 図４は，実施例４に記載される散布試験の結果を示す。 図４は，実施例４に記載される散布試験の結果を示す。 図４は，実施例４に記載される散布試験の結果を示す。 図４は，実施例４に記載される散布試験の結果を示す。図中，＊ｎｔ−試験せず；†−散布率は除草剤の組み合わせの合計を示す チフェンスルフロン：トリベニュロン＝２：１ 合計ｌｂ ａｉ／Ａ（ポンド活性成分／エーカー）；‡−散布率は除除草剤の組み合わせの合計を示す ニコスルフロン：チフェンスルフロン＝２．２２：１ 合計ｌｂ ａｉ／Ａ

発明の詳細な説明
本発明は，部分的には，例えば，サイバス社により開発された"ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ
Ｔｒａｉｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＤＳ（登録商標）"技術を用
いて，アブラナ属のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子を首尾良く標的化することに関連する組成物および方法を提供する。本明細書に開示されるいすれかの変異を含む植物は，組み合わせでまたは単独で，新規な除草剤耐性製品の基礎を形成することができる。また，ＡＨＡＳ遺伝子の変異についてホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかである変異した植物から生成される種子も提供される。本明細書に開示される変異は，他の既知の任意の変異との，または将来発見される変異との組み合わせであってもよい。

ＲＴＤＳは，細胞それ自身の遺伝子修復系を利用して，遺伝子配列をインサイチューで特異的に改変し，外来ＤＮＡおよび遺伝子発現制御配列を挿入しないで，標的とする遺伝子を変化させることに基づく。この方法は，ゲノムの残部を変更せずに，遺伝的配列を精密に変化させることができる。慣用的なトランスジェニック遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）とは異なり，外来性の遺伝的物質のインテグレーションはなく，外来性の遺伝的物質は植物中に残らない。ＲＴＤＳにより導入される遺伝的配列の変化は，ランダムに挿入されるものではない。影響を受ける遺伝子はその天然の位置に維持されるため，ランダムな，制御されない，または有害な発現パターンは生じない。

この変化を生じさせるＲＴＤＳは，標的とする遺伝子の位置でハイブリダイズしてミスマッチした塩基対（単数または複数）を生成するよう設計された，ＤＮＡおよび修飾ＲＮＡ塩基の両方，ならびに他の化学成分から構成されることができる，化学的に合成したオリゴヌクレオチドである。このミスマッチした塩基対は，細胞それ自身の天然の遺伝子修復系をその部位に引きつけるシグナルとして作用し，遺伝子中の指定されたヌクレオチド（単数または複数）を修正（置き換え，挿入または欠失）する。修正プロセスが完了すると，ＲＴＤＳ分子は分解され，今回改変されたまたは修復された遺伝子は，その遺伝子の通常の内因性制御メカニズムの下で発現される。

ＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩ遺伝子中の本発明の変異は，セイヨウアブラナＡＨＡＳ遺伝子および蛋白質（配列番号２，３および４を参照）を用いて記述される。本発明の組成物および方法は，他の種の変異したＡＨＡＳ遺伝子（パラログ）も包含する。しかし，異なる種のＡＨＡＳ遺伝子における変動のため，１つの種において変更すべきアミノ酸残基の番号は別の種におけるものと異なるかもしれない。いずれにしても，当業者は配列相同性により類似の位置を容易に同定することができる。例えば，図１は，シロイナズナＡＨＡＳ（配列番号１）およびセイヨウアブラナＡＨＡＳ Ｉ（配列番号２）およびＡＨＡＳ ＩＩＩ（配列番号３および配列番号４）パラログのアライメントしたアミノ酸配列を示す。すなわち，これらのパラログおよび他のパラログにおける類似の位置を同定し，変異を導入することができる。

本発明の組成物および方法は，部分的には，植物をＡＨＡＳ阻害性またはＡＬＳ阻害性除草剤ファミリーの除草剤に対して耐性または寛容性にする，ＡＨＡＳ遺伝子中の変異に関連する。本発明の組成物および方法はまた，植物の染色体またはエピゾーム配列中のＡ
ＨＡＳ蛋白質をコードする遺伝子において所望の変異を作製するために，遺伝子修復オリゴ核酸塩基を使用することに関連する。野生型蛋白質の触媒活性を実質的に維持している変異蛋白質は，ＡＨＡＳ阻害性ファミリーの除草剤に対する植物の耐性または寛容性を増大させることができ，除草剤の存在または非存在にかかわらず，野生型植物と比較して，植物，その器官，組織，または細胞を実質的に正常な生長または発生させることができる。本発明の組成物および方法はまた，ＡＨＡＳ遺伝子が変異している非トランスジェニック植物細胞，これから再生された非トランスジェニック植物，ならびに再生された非トランスジェニック植物を用いて，異なるＡＨＡＳ遺伝子に変異を有する植物または例えば変異したＥＰＳＰＳ遺伝子を有する植物と交配させることにより得られる植物に関する。

イミダゾリノン類は，ＡＨＡＳ阻害性除草剤の５つの化学ファミリーの１つである。残りの４つのファミリーは，スルホニルウレア類，トリアゾロピリミジン類，ピリミジニルチオベンゾエート類およびスルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン類である（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

また，ＡＨＡＳ遺伝子中に１またはそれ以上の変異を有するトランスジェニックまたは非トランスジェニックの植物または植物細胞，例えば本明細書に開示されるものが提供される。ある態様においては，ＡＨＡＳ遺伝子中に１またはそれ以上の変異を有する植物または植物細胞は，ＡＨＡＳ阻害剤のメンバーに対して増加した耐性または寛容性を有する。ある態様においては，ＡＨＡＳ遺伝子中に１またはそれ以上の変異を有する植物または植物細胞は，対応する野生型の植物または細胞と比較して，植物，その器官，組織または細胞の実質的に正常な生長または発生を示すことができる。提供される特定の観点および態様は，ＡＨＡＳ遺伝子に変異を有する非トランスジェニック植物，例えば本明細書に開示されるものである。これは，ある態様においては，ＡＨＡＳ阻害性除草剤ファミリーのメンバーに対して増加した耐性または寛容性を有し，対応する野生型の植物または細胞と比較して，植物，その器官，組織または細胞の実質的に正常な生長または発生を示すことができる。すなわち，１またはそれ以上の除草剤，例えば，イミダゾリノンおよび／またはスルホニルウレアの存在下で，変異したＡＨＡＳ蛋白質は野生型ＡＨＡＳ蛋白質と比較して実質的に同じ触媒活性を有する。

さらに，変異したＡＨＡＳ遺伝子を有する，例えば，本明細書に記載される１またはそれ以上の変異を有する植物を製造する方法も提供される。好ましくは，植物は，関連する除草剤の存在または非存在にかかわらず，野生型蛋白質の触媒活性を実質的に維持している。ある態様においては，本発明の方法は，ＡＨＡＳ遺伝子中に１またはそれ以上の標的とする変異（例えば，本明細書に開示されるもの）を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基を植物細胞に導入し，そして変異したＡＨＡＳ遺伝子を有する細胞，種子，または植物を同定することを含む。

種々の態様においては，本明細書に開示される植物は，いかなる種の双子葉植物，単子葉植物または裸子植物であってもよく，例えば，木または潅木として生長する任意の木性植物種，任意の草本植物，または食用果実，種子または野菜を生成する任意の種，または色とりどりのまたは香りの良い花を生成する任意の種であることができる。例えば，植物は，上で特定的に記載されたもののほか，キャノーラ，ヒマワリ，タバコ，テンサイ，綿花，トウモロコシ，コムギ，オオムギ，イネ，ソルガム，トマト，マンゴー，モモ，リンゴ，洋ナシ，イチゴ，バナナ，メロン，ジャガイモ，ニンジン，レタス，タマネギ，大豆種，サトウキビ，エンドウ，ソラマメ，ポプラ，ブドウ，柑橘類，アルファルファ，ライ麦，オートムギ，芝草および飼料草，亜麻，菜種，キュウリ，アサガオ，ニガウリ（ｂａｌｓａｍ），ピーマン，ナス，マリーゴールド，ハス，キャベツ，デイジー，カーネーション，チューリップ，アヤメ，ユリ，および木の実を生成する植物からなる群の植物の種から選択することができる。

遺伝子修復オリゴ核酸塩基は，当該技術分野において一般に用いられている任意の方法，例えば，限定されないが，マイクロキャリア（遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）デリバリー），マイクロファイバー，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性取り込み，エレクトロポレーション，およびマイクロインジェクションを用いて，植物細胞中に導入することができる。

また，本明細書に開示される方法にしたがって変異した細胞を，種子を生成する植物（以下，"繁殖力のある植物"と称する）を得るために培養し，そのような繁殖力のある植物から種子およびさらなる植物を製造することに関連する方法および組成物が提供される。

畑において雑草を選択的に防除する方法も提供される。この畑は，開示されるようにＡＨＡＳ遺伝子が変更した植物および雑草を含み，この方法は，植物が耐性になっている畑に除草剤を適用することを含む。

また，関連する除草剤のメンバーに対する耐性または寛容性を植物に付与するか，または変異したＡＨＡＳ遺伝子が野生型ＡＨＡＳと比較して実質的に同じ酵素活性を有するような，ＡＨＡＳ遺伝子中の変異も提供される。

遺伝子修復オリゴ核酸塩基
本明細書に開示される方法および組成物は，下記に詳細に説明されるコンフォメーションおよび化学を有する"遺伝子修復オリゴ核酸塩基"を用いて実施または製造することができる。本明細書において企図される"遺伝子修復オリゴ核酸塩基"とは，公開された化学文献および特許文献において，例えば，"組換え誘導性（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｇｅｎｉｃ）
オリゴ核酸塩基"；"ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド"；"キメラオリゴヌクレオチド"；"混合デュープレックスオリゴヌクレオチド"（ＭＤＯＮｓ）；"ＲＮＡＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＤＯｓ）"；"遺伝子標的化オリゴヌクレオチド；""ジェノプラスト"
；"一本鎖修飾オリゴヌクレオチド"；"一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異用ベクタ
ー"（ＳＳＯＭＶｓ）；"デュープレックス変異用ベクター"；および"ヘテロデュープレックス変異用ベクター"等の他の名称を用いて記載されている。

Ｋｍｉｅｃの米国特許５，５６５，３５０（Ｋｍｉｅｃ Ｉ）およびＫｍｉｅｃの米国特許５，７３１，１８１（Ｋｍｉｅｃ ＩＩ）（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されるコンフォメーションおよび化学を有するオリゴ核酸塩基は，本発明の"遺伝子
修復オリゴ核酸塩基"として用いるのに適している。Ｋｍｉｅｃ Ｉおよび／またはＫｍ
ｉｅｃ ＩＩの遺伝子修復オリゴ核酸塩基は，２つの相補的鎖を含み，その一方は少なくとも１つのＲＮＡ型のヌクレオチドのセグメント（"ＲＮＡセグメント"）を含み，これは他方の鎖のＤＮＡ型のヌクレオチドと塩基対形成する。

Ｋｍｉｅｃ ＩＩは，ヌクレオチドの代わりにリンおよびピリミジン塩基含有非ヌクレオチドを用いてもよいことを開示する。本発明において用いることができる別の遺伝子修復分子は，米国特許５，７５６，３２５；５，８７１，９８４；５，７６０，０１２；５，８８８，９８３；５，７９５，９７２；５，７８０，２９６；５，９４５，３３９；６，００４，８０４；および６，０１０，９０７，および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７；および国際公開ＷＯ９８／４９３５０；ＷＯ９９／０７８６５；ＷＯ９９／５８７２３；ＷＯ９９／５８７０２；およびＷＯ９９／４０７８９（それぞれその全体が参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。

１つの態様においては，遺伝子修復オリゴ核酸塩基は混合デュープレックスオリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）であり，ここで，混合デュープレックスオリゴヌクレオチドのＲＮ
Ａ型のヌクレオチドは，２’−ヒドロキシルをフルオロ，クロロまたはブロモ官能基で置き換えることにより，または２’−Ｏ上に置換基を配置することにより，ＲＮａｓｅに耐性とされている。適当な置換基としては，Ｋｍｉｅｃ ＩＩにより教示される置換基が挙げられる。別の置換基としては，米国特許５，３３４，７１１（Ｓｐｒｏａｔ）により教示される置換基および特許公開ＥＰ６２９３８７およびＥＰ６７９６５７（併せてＭａｒｔｉｎ出願と称し，これらは参照として本明細書に組み込まれる）により教示される置換基が挙げられる。本明細書において用いる場合，リボヌクレオチドの２’−フルオロ，クロロまたはブロモ誘導体，またはＭａｒｔｉｎ出願またはＳｐｒｏａｔに記載される置換基で置換された２’−ＯＨを有するリボヌクレオチドは，"２’−置換リボヌクレオチド"と称される。本明細書において用いる場合，"ＲＮＡ型のヌクレオチド"との用語は，混合デュープレックスオリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドと，未置換ホスホジエステル結合またはＫｍｉｅｃ ＩまたはＫｍｉｅｃ ＩＩに教示されるいずれかの非天然型結合により連結している，２’−ヒドロキシルまたは２’−置換ヌクレオチドを意味する。本明細書において用いる場合，"デオキシリボ型のヌクレオチド"との用語は，２’−Ｈを有するヌクレオチドを意味し，これは，未置換ホスホジエステル結合またはＫｍｉｅｃ ＩまたはＫｍｉｅｃ ＩＩに教示されるいずれかの非天然型結合により，遺伝子修復オリゴ核酸塩基の他のヌクレオチドと連結されることができる。

本発明の特定の態様においては，遺伝子修復オリゴ核酸塩基は，もっぱら未置換ホスホジエステル結合により連結されている混合デュープレックスオリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）である。別の態様においては，結合は，置換されたホスホジエステル，ホスホジエステル誘導体およびＫｍｉｅｃ ＩＩに教示されるような非リン系結合によるものである。さらに別の態様においては，混合デュープレックスオリゴヌクレオチド中のそれぞれのＲＮＡ型のヌクレオチドは２’−置換ヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドの特に好ましい態様は，２’−フルオロ，２’−メトキシ，２’−プロピルオキシ，２’−アリルオキシ，２’−ヒドロキシルエチルオキシ，２’−メトキシエチルオキシ，２’−フルオロプロピルオキシおよび２’−トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドのより好ましい態様は，２’−フルオロ，２’−メトキシ，２’−メトキシエチルオキシ，および２’−アリルオキシ置換ヌクレオチドである。別の態様においては，混合デュープレックスオリゴヌクレオチドは，未置換ホスホジエステル結合により連結されている。

１つの型の２’−置換ＲＮＡ型のヌクレオチドのみを有する混合デュープレックスオリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）はより便利に合成することができるが，本発明の方法は，２またはそれ以上の型のＲＮＡ型のヌクレオチドを有する混合デュープレックスオリゴヌクレオチドを用いても実施することができる。ＲＮＡセグメントの機能は，２つのＲＮＡ型のトリヌクレオチドの間にデオキシヌクレオチドが導入されることにより引き起こされる中断によっては影響を受けない。したがって，ＲＮＡセグメントとの用語は，"中断され
たＲＮＡセグメント"等の用語を包含する。中断されていないＲＮＡセグメントは，連続
的ＲＮＡセグメントと称される。別の態様においては，ＲＮＡセグメントは，ＲＮａｓｅ耐性および未置換２’−ＯＨヌクレオチドを交互に含むことができる。混合デュープレックスオリゴヌクレオチドは，好ましくは１００ヌクレオチド未満，より好ましくは８５ヌクレオチド未満であり，５０より多いヌクレオチドを有する。第１および第２の鎖はワトソンクリック塩基対形成する。１つの態様においては，混合デュープレックスオリゴヌクレオチドの鎖は，リンカー，例えば，一本鎖ヘキサ，ペンタまたはテトラヌクレオチドにより共有結合されており，このため第１の鎖および第２の鎖は，単一の３’末端および単一の５’末端を有する単一のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントである。３’および５’末端は，"ヘアピンキャップ"を付加することにより保護することができ，このことにより３’および５’末端ヌクレオチドは隣接するヌクレオチドとワトソンクリック対を形成する。さらに，第２のヘアピンキャップを，３’および５’末端から離れた位置の第１の鎖
と第２の鎖との間の接合部に配置することができ，これにより第１の鎖と第２の鎖との間のワトソンクリック対が安定化される。

第１の鎖および第２の鎖は，標的遺伝子の２つのフラグメントと相同な２つの領域を含み，すなわち，標的遺伝子と同じ配列を有する。相同領域は，ＲＮＡセグメントのヌクレオチドを含み，連結ＤＮＡセグメントの１またはそれ以上のＤＮＡ型のヌクレオチドを含んでいてもよく，また，介在ＤＮＡセグメント中にはないＤＮＡ型のヌクレオチドを含んでいてもよい。相同性の２つの領域は，"非相同領域"と称される，標的遺伝子の配列とは異なる配列を有する領域により分離されており，かつそれぞれ隣接している。非相同領域は，１個，２個または３個のミスマッチしたヌクレオチドを含むことができる。ミスマッチしたヌクレオチドは，連続的であってもよく，あるいは標的遺伝子と相同な１または２個のヌクレオチドにより分離されていてもよい。あるいは，非相同領域はまた，１，２，３，または５またはそれ以下のヌクレオチドの挿入を含むことができる。あるいは，混合デュープレックスオリゴヌクレオチドの配列は，混合デュープレックスオリゴヌクレオチドからの１，２，３または５またはそれ以下のヌクレオチドの欠失によってのみ，標的遺伝子の配列と異なっていてもよい。この場合，非相同領域の長さおよび位置は，混合デュープレックスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドが非相同領域中にない場合であっても，欠失の長さであるとみなされる。置換（単数または複数）が意図される場合，２つの領域に相補的な標的遺伝子のフラグメント間の距離は，非相同領域の長さと同一である。非相同領域が挿入を含む場合，このことにより相同領域は，混合デュープレックスオリゴヌクレオチド中で，その相補的相同フラグメントが遺伝子中で離れているよりさらに遠くに離れており，非相同領域が欠失をコードする場合にはその逆があてはまる。

混合デュープレックスオリゴヌクレオチドのＲＮＡセグメントは，それぞれ相同領域，すなわち，標的遺伝子のフラグメントと配列が同一である領域の一部である。これらのセグメントは，一緒になって，好ましくは，少なくとも１３個のＲＮＡ型のヌクレオチドを含み，好ましくは１６から２５個のＲＮＡ型のヌクレオチドを含み，またはさらにより好ましくは１８から２２のＲＮＡ型のヌクレオチドを含み，または最も好ましくは２０ヌクレオチドを含む。１つの態様においては，相同性領域のＲＮＡセグメントは，介在ＤＮＡセグメントにより分離されかつ隣接しており，すなわち"接続"されている。１つの態様においては，非相同領域の各ヌクレオチドは介在ＤＮＡセグメントのヌクレオチドである。混合デュープレックスオリゴヌクレオチドの非相同領域を含む介在ＤＮＡセグメントは"
変異誘発セグメント"と称される。

本発明の別の態様においては，遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異誘発ベクター（ＳＳＯＭＶ）であり，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７，米国特許６，２７１，３６０，６，４７９，２９２，および７，０６０，５００（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＳＳＯＭＶの配列は，米国特許５，７５６，３２５；５，８７１，９８４；５，７６０，０１２；５，８８８，９８３；５，７９５，９７２；５，７８０，２９６；５，９４５，３３９；６，００４，８０４；および６，０１０，９０７および国際公開ＷＯ９８／４９３５０；ＷＯ９９／０７８６５；ＷＯ９９／５８７２３；ＷＯ９９／５８７０２；およびＷＯ９９／４０７８９に記載される変異誘発ベクターと同じ原理に基づく。ＳＳＯＭＶの配列は，所望の遺伝的変更を含む領域（変異誘発領域と称される）により隔てられている，標的配列と相同な２つの領域を含む。変異誘発領域は，標的配列中で相同領域を隔てている配列と同じ長さであるが配列が異なる配列を有することができる。そのような変異誘発領域は，置換を引き起こす。あるいは，ＳＳＯＭＶ中の相同領域は，互いに連続していてもよいが，標的遺伝子中の同じ配列を有する領域は，１，２またはそれ以上のヌクレオチドにより隔てられている。そのようなＳＳＯＭＶは，ＳＳＯＭＶに存在しないヌクレオチドの標的遺伝子からの欠失を引き起こす。最後に，標的遺伝子の相同領域と同一の配列は，標的遺
伝子中で隣接していてもよいが，ＳＳＯＭＶの配列中では１，２またはそれ以上のヌクレオチドにより隔てられている。そのようなＳＳＯＭＶは，標的遺伝子の配列中に挿入を引き起こす。

ＳＳＯＭＶのヌクレオチドは，３’末端および／または５’末端ヌクレオチド間結合を除き未修飾ホスホジエステル結合により連結されているデオキシリボヌクレオチドであるか，あるいは，２つの３’末端および／または５’末端ヌクレオチド間結合はホスホロチオエートまたはホスホルアミダイトであってもよい。本明細書において用いる場合，ヌクレオチド間結合はＳＳＯＭＶのヌクレオチドの間の連結であり，３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドとブロッキング置換基との間の連結を含まない。特定の態様においては，ＳＳＯＭＶの長さは２１から５５デオキシヌクレオチドであり，したがって相同性領域の長さは合計して少なくとも２０デオキシヌクレオチドであり，少なくとも２つの相同性領域はそれぞれ少なくとも８デオキシヌクレオチドの長さを有するべきである。

ＳＳＯＭＶは，標的遺伝子のコーディング鎖または非コーディング鎖のいずれかに相補的であるように設計することができる。所望の変異が単一塩基の置換である場合，変異誘発ヌクレオチドおよび標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。所望の機能上の結果を達成することと矛盾しないかぎり，相補鎖中の変異誘発ヌクレオチドおよび標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。特に好ましいものは，トランスバージョン変異をコードする，すなわち，ＣまたはＴ変異誘発ヌクレオチドがそれぞれ相補鎖中のＣまたはＴヌクレオチドとミスマッチするＳＳＯＭＶである。

オリゴデオキシヌクレオチドに加え，ＳＳＯＭＶは，５’末端炭素にリンカーを介して結合した５’ブロッキング置換基を含むことができる。リンカーの化学は長さを除き重要ではなく，長さは，好ましくは少なくとも６原子の長さであるべきであり，リンカーは柔軟性を有するものであるべきである。種々の非毒性置換基，例えば，ビオチン，コレステロールまたは他のステロイドまたは非インターカレート性のカチオン性蛍光染料を用いることができる。ＳＳＯＭＶを製造するのに特に好ましい試薬は，Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｖａ．（現在はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からＣｙ３（商標）およびＣｙ５（商標）として市販されている試薬であり，オリゴヌクレオチド中に取り込まれると，それぞれ３，３，３’，３’−テトラメチルＮ，Ｎ’−イソプロピル置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニン染料を生ずる，ブロックされたホスホルアミダイトである。Ｃｙ３が特に好ましい。インドカルボシアニンがＮ−オキシアルキル置換されている場合，これはオリゴデオキシヌクレオチド５’の末端に５’末端リン酸を有するホスホジエステルとして便利に連結することができる。染料とオリゴデオキシヌクレオチドとの間の染料リンカーの化学は重要ではなく，合成の便宜により選択される。市販のＣｙ３ホスホルアミダイトを指示どおりに用いる場合，得られる５’修飾は，ブロッキング置換基およびリンカーが一緒になって，Ｎ−ヒドロキシプロピル，Ｎ’−ホスファチジルプロピル３，３，３’，３’−テトラメチルインドモノカルボシアニンから構成される。

好ましい態様においては，インドカルボシアニン染料はインドール環の３および３’位においてテトラ置換されている。理論に限定されるものではないが，これらの置換のため，染料はインターカレート染料ではない。これらの位置における置換基の種類は重要ではない。ＳＳＯＭＶはさらに３’ブロッキング置換基を有することができる。この場合にも，３’ブロッキング置換基の化学は重要ではない。

本明細書に記載される変異はまた，変異導入（ランダム，体細胞的（ｓｏｍａｔｉｃ）または部位特異的），または他のＤＮＡ編集または組換え手法，例えば，限定されないが，ジンクフィンガーヌクレアーゼによる部位特異的相同組換えを用いる遺伝子標的化によ
っても得ることができる。

植物細胞への遺伝子修復オリゴ核酸塩基のデリバリー
植物細胞をトランスフォームするのに用いられる任意の既知の方法を用いて，遺伝子修復オリゴ核酸塩基をデリバリーすることができる。例示的な方法について以下に説明する。

マイクロキャリアおよびマイクロファイバー
セルロース細胞壁を有する植物細胞中に大きなフラグメントのＤＮＡを発射貫入により導入するための金属マイクロキャリア（微小球）の使用は，当業者によく知られている（以下，バイオリスティックデリバリーと称する）。米国特許４，９４５，０５０；５，１００，７９２および５，２０４，２５３は，マイクロキャリアおよびこれらを発射させるためのデバイスを選択する一般的手法を記載する。

本発明の方法においてマイクロキャリアを用いる特定の条件は，国際公開ＷＯ９９／０７８６５に記載されている。例示的手法においては，氷冷したマイクロキャリア（６０ｍｇ／ｍＬ），混合デュープレックスオリゴヌクレオチド（６０ｍｇ／ｍＬ），２．５ＭのＣａＣｌ_２および０．１Ｍのスペルミジンをこの順番で加え，混合物を例えば１０分間ボルテックスすることにより穏やかに撹拌し，次に室温で１０分間放置し，次いで，マイクロキャリアを５倍容量のエタノールで希釈し，遠心分離し，１００％エタノールに再懸濁する。良好な結果は，接着溶液中の濃度が，８−１０μｇ／μＬのマイクロキャリア，１４−１７μｇ／ｍＬの混合デュープレックスオリゴヌクレオチド，１．１−１．４ＭのＣａＣｌ_２および１８−２２ｍＭスペルミジンの場合に得ることができる。最適な結果は，８μｇ／μＬのマイクロキャリア，１６．５μｇ／ｍＬの混合デュープレックスオリゴヌクレオチド，１．３ＭのＣａＣｌ_２および２１ｍＭのスペルミジンの場合に認められた。

遺伝子修復オリゴ核酸塩基はまた，本発明の実施にあたり，細胞壁および細胞膜に侵入するためにマイクロファイバーを用いて植物細胞中に導入することができる。Ｃｏｆｆｅｅらの米国特許５，３０２，５２３は，３０ｘ０．５μｍおよび１０ｘ０．３μｍのシリコンカーバイド繊維を用いて，トウモロコシ（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ）の懸濁培養物のトランスフォーメーションを容易にすることを記載する。マイクロファイバーを用いる植物細胞のトランスフォーメーション用にＤＮＡを導入するために用いることができる任意の機械的手法を用いて，トランス変異用に遺伝子修復オリゴ核酸塩基をデリバリーすることができる。

遺伝子修復オリゴ核酸塩基のマイクロファイバーによるデリバリーの例示的手法は次のとおりである：滅菌したマイクロファイバー（２μｇ）を約１０μｇの混合デュープレックスオリゴヌクレオチドを含む１５０μＬの植物培養液に懸濁させる。懸濁した培養物を沈殿させ，集めた細胞と滅菌ファイバー／ヌクレオチド懸濁液とを等量で１０分間ボルテックスし，プレートに播種する。選択培地は，特定の特性に適するように，ただちに適用するか，または約１２０時間まで遅らせて適用する。

プロトプラストのエレクトロポレーション
別の態様においては，遺伝子修復オリゴ核酸塩基は，植物の一部に由来するプロトプラストのエレクトロポレーションにより植物細胞にデリバリーすることができる。プロトプラストは，当業者によく知られる手法にしたがって，植物の一部，特に葉を酵素で処理することにより形成される。例えば，Ｇａｌｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５５：８９−１０７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．；Ｋｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３３：２１３−２２１，Ｈｕ
ｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊを参照。プロトプラストは，エレクトロポレーション前に成長培地で培養する必要はない。エレクトロポレーションの条件の一例は，総容量０．３ｍＬ中に３ｘ１０^５個のプロトプラストであり，遺伝子修復オリゴ核酸塩基の濃度は０．６−４μｇ／ｍＬである。

プロトプラストＰＥＧ媒介性ＤＮＡ取り込み
別の態様においては，当業者によく知られる手法にしたがって膜改変剤であるポリエチレングリコールの存在下で，核酸を植物プロトプラストに取り込ませる（例えば，Ｇｈａｒｔｉ−Ｃｈｈｅｔｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９２を参照）。

マイクロインジェクション
別の態様においては，遺伝子修復オリゴ核酸塩基は，マイクロキャピラリーを用いて植物細胞またはプロトプラストに注入することによりデリバリーすることができる（例えば，Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓｃｈｎｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，１９９１を参照）。

除草剤耐性植物の選択および除草剤の適用
植物および植物細胞は，当該技術分野において一般に知られる方法を用いて，例えば，植物または植物細胞を除草剤の存在下で生長させ，除草剤の非存在下における生長速度と比較した生長の速度を測定することにより，除草剤に対する耐性または寛容性について試験することができる。

本明細書において用いる場合，植物，植物器官，植物組織または植物細胞の実質的に正常な生長とは，植物，植物器官，植物組織，または植物細胞の成長速度または細胞分裂の速度が，野生型ＡＨＡＳ蛋白質を発現する対応する植物，植物器官，植物組織または植物細胞における成長速度または細胞分裂の速度の少なくとも３５％，少なくとも５０％，少なくとも６０％，または少なくとも７５％であるものとして定義される。

本明細書において用いる場合，植物，植物器官，植物組織または植物細胞の実質的に正常な発生とは，植物，植物器官，植物組織または植物細胞において，野生型ＡＨＡＳ蛋白質を発現する対応する植物，植物器官，植物組織または植物細胞において生ずるものと実質的に同じ１またはそれ以上の発生事象が生ずることとして定義される。

ある態様においては，本明細書に記載される植物器官としては，限定されないが，葉，茎，根，枝芽，花芽，分裂組織，胚，子葉，内胚乳，萼片，花弁，雌しべ，心皮，雄蘂，葯，小胞子，花粉，花粉管，胚珠，子房および果実，またはこれらから取りだした切片，スライスまたはディスクが挙げられる。植物組織としては，限定されないが，カルス組織，基本組織，維管束組織，貯蔵組織，分裂組織，葉組織，芽組織，根組織，こぶ組織，植物腫瘍組織，および生殖組織が挙げられる。植物細胞としては，限定されないが，細胞壁を有する単離された細胞，その種々のサイズの凝集物およびプロトプラストが挙げられる。

植物は，除草剤をこれに適用して用量応答曲線を求めたときに，同じように適用した非寛容性の同様の植物から得られるものと比較して右にシフトしている場合，関連する除草剤に対して実質的に"寛容性"である。そのような用量応答曲線は，"用量"をＸ軸にプロットし，"殺生パーセント"，"除草効果"等をｙ軸にプロットしたものである。寛容性の植物は，所定の除草効果を得るために，非寛容性の同様の植物より多くの除草剤を必要とする。除草剤に対して実質的に"耐性"である植物は，畑の雑草を防除するために除草剤を農薬社会で典型的に用いられる濃度および速度で適用したときに，壊死，溶解，退緑またはそ
の他の病変がほとんどない。除草剤に対して耐性の植物は，除草剤に対して寛容性でもある。

以下の実施例は，本発明を実施するための方法を例示する。これらの実施例は，限定であると解釈してはならない。特に記載しないかぎり，すべてのパーセンテージは重量に基づき，すべての溶媒混合比は容量に基づく。

実施例１：除草剤耐性アブラナ属サンプルの調製
本明細書において用いる場合，特に記載しないかぎり，遺伝子の番号付けは，シロイナズナのアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）またはアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）Ａｔ３ｇ４８５６０（配列番号１）のアミノ酸配列に基づく。２００５年１０月より前の実験ノートでは，Ｓ６５３位（シロイナズナアミノ酸配列に基づく）は，トウモロコシのアミノ酸配列ＺｍＡＨＡＳ１０８およびＺｍＡＨＡＳ１０９（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）に基づいてＳ６２１として示されている。

１つの課題は，スプリングキャノーラ（セイヨウアブラナ，春菜種（Ｓｐｒｉｎｇ Ｏｉｌｓｅｅｄ Ｒａｐｅ−ＢＮ−２と称する）および冬菜種（ＷｉｎｔｅｒＯｉｌｓｅｅｄＲａｐｅ；ＷＯＳＲ，セイヨウアブラナ−ＢＮ−１１と称する）のＢｎＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩのいずれかまたは両方にイマゼタピル（Ｉｍｉ）耐性のアミノ酸置換Ｓ６５３Ｎを作製することであった。

セイヨウアブラナ（初期優良（ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｅｌｉｔｅ）キャノーラ系統ＢＮ−２）のＢｎＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩの標的領域を増幅するために，オリゴの対，すなわちＢｎＡＬＳ１およびＢｎＡＬＳ２を設計した（配列番号９および１０）。ＢｎＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩはイントロンを含まないため，ＢｎＡＬＳ１およびＢｎＡＬＳ２は，Ｓ６５３部位を挟むゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方から２８４ｂｐの標的領域を増幅する。また，このプライマー対は，シロイナズナからのＡＬＳ標的領域の増幅を可能とするよう設計した。プライマーを受領し，滅菌水に再懸濁した。

最初に，ＢｎＡＬＳ１／ＢｎＡＬＳ２プライマー対を用いてＢＮ−２からＢｎＡＨＡＳ
ＩおよびＩＩＩのＣ末端標的領域をＰＣＲ増幅した。その後，追加のＢＮ−２サンプルからＡＬＳ標的領域を増幅し，ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙにクローニングした。それぞれ３つのゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡサンプルからの１２個のコロニーを一晩培養してプラスミドを調製し，クローニングされた挿入物を配列決定して，標的配列を確認した。ＢｎＡＨＡＳ Ｉの２８４ｂｐ標的領域についての代表例としてＢＮ−２ＡＬＳ２ｃ−２１，ＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩの代表例としてＢＮ−２ＡＬＳＹＢ１０−２ｇ−１４について，グリセロールストックを調製した。

系統ＢＮ−２からの標的領域ＢｎＡＬＳ配列のゲノムおよびｃＤＮＡを分析し，ＰＣＲエラーを記録した。ＢＮ−２のＢｎＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩの配列に基づいて，単一のＧＲＯＮ（遺伝子修復オリゴヌクレオチド）ＢｎＡＬＳ１６２１／Ｃ／４１／５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ（配列番号５）を設計して，位置６５３においてセリンからアスパラギンへのアミノ酸置換（ＡＧＴ−＞ＡＡＴ）を作製した（表１を参照）。最初の合成物を再懸濁し，その濃度を決定した。再懸濁したオリゴを-７０℃で凍結保存した。このＧＲＯＮの
非コーディング版はＢｎＡＬＳ１６２１／ＮＣ／４１／５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣと称される（配列番号６）。後日，ＢｎＡＬＳ１６２１／ＮＣをすべてのＧｅｎｂａｎｋ配列と比較し，１６を越えるヌクレオチドを有しハイブリダイズする４１個のうち唯一の配列はＢｎＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩであり，オリゴはＳ６５３Ｎアミノ酸置換を導入するよう設計された単一のミスマッチＧ−＞Ａを有していた。

サイバス優良株冬菜種（Ｗｉｎｔｅｒ ＯｉｌＳｅｅｄ Ｒａｐｅ；ＷＯＳＲ）系統ＢＮ−１１からのＢｎＡＬＳ標的領域を，系統ＢＮ−１１を表すことが知られている単一の植物のゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡから増幅した。ＢＮ−１１ＢｎＡＬＳ配列を分析し，ＰＣＲエラーを記録した。

ＢＮ−２およびＢＮ−１１からのＢｎＡＬＳ標的領域の特性決定に加えて，同じ標的領域を市販の亜種であるクリアフィールドキャノーラ（ＢＮ−１５）においても特性決定した。クリアフィールドのＢｎＡＨＡＳ配列を分析し，ＰＣＲエラーを記録したところ，ＢｎＡＨＡＳ Ｉ中にＳ６５３Ｎ（ＡＧＴ−＞ＡＡＴ），およびＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩ中にＷ５７４Ｌ（ＴＧＧ−＞ＴＴＧ）の予測されたアミノ酸の変更が認められた。最後に，系統ＢＮ−２，ＢＮ−１１およびＢＮ−１５からのＢｎＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩの全コーディング配列を，それぞれＢｎＡＬＳ３／ＢｎＡＬＳＯＲ２（配列番号１１および１２）およびＢｎＡＬＳ３／ＢｎＡＬＳＯＲ３（配列番号１１および１３）を用いて増幅し，クローニングし，配列決定して，比較目的のための参照配列として用いた。

種々の処理から生じたＩｍｉ耐性ＢＮ−２（キャノーラ）のカルスサンプルであるＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−４４〜５３を，Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９１）の方法を用いて抽出した。この材料からのゲノムＤＮＡを，ＢｎＡＨＡＳ ＩまたはＩＩＩのいずれかにおいて，アレル特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）ミックス（ＭＭ＃２３，オリゴＢｎＡＬＳＯＦ１，ＢｎＡＬＳＯＲ２，ＢｎＡＬＳＯＲ３およびＢｎＡＬＳＩＲ１Ａから構成される）（それぞれ配列番号１４，１２，１３，および１５）を用いてスクリーニングして，Ｓ６５３Ｎの変化を特異的に検出し，アレル特異的ＰＣＲミックス（ＭＭ＃２９，オリゴＢｎＡＬＳＯＦ２，ＢｎＡＬＳＯＲ４およびＢｎＡＬＳＩＦ１Ｔから構成される）（それぞれ配列番号１６，１７，および１８）を用いて，Ｗ５７４Ｌの変化を特異的に検出した。これらの最初のＡＳ−ＰＣＲの結果は決定的ではなかったため，サンプルＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−４４〜５３の大部分について，追加のサンプルであるＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５４〜５８を受領し，Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９１）方法を用いて抽出し，さらなる精製工程を用いてより純度の高いゲノムＤＮＡを得た。

この時点で，サンプルＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５４〜５８をＢｎＡＬＳＯＦ２，ＢｎＡＬＳＯＲ２およびＢｎＡＬＳＯＲ３のプライマーの組み合わせを用いて増幅し，少量の増幅産物を得た。これらの産物をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙにクローニングし，１系統あたり１２個の白色コロニーを一晩培養し，プラスミドを調製し（Ｑｉａｇｅｎプラスミドミニプレップキットを用いた），ＢｉｇＤｙｅ３．１シークエンシング化学を用いて配列決定した。

予備的配列分析により，ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５５−１３はＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩ中にＳ６５３Ｎ変異（ＡＧＴ−＞ＡＡＴ）を有し，この系統からの別の２つのクローンであるＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５５−１５および１９はＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩについて野生型であることがわかった。全配列分析を記録した。この１個の陽性がＰＣＲエラーから生じたものではないことを確認するために，この系統からの追加の３８コロニーをＡＳ−ＰＣＲによりスクリーニングした。このＡＳ−ＰＣＲスクリーニングで最も強い８個の陽性ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５５−１〜８の一晩培養物を調製し，プラスミドＤＮＡを単離して配列決定した。８個の陽性コロニーのうちの７個，すなわち，ＡＳ−ＰＣＲによるＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５５−２〜８はＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩ中のＳ６５３Ｎ変異についての配列決定により陽性であり，残りのＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５５−１は野生型ＢｎＡＨＡＳ
Ｉ配列であった。これらの結果を合わせると，系統ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５５は，ＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩ中のＳ６５３Ｎ変異についてヘテロ接合性であることが示された。

サンプルＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５５は，ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−４９と同じ最初のＩｍｉ耐性カルスからの平行して得たカルスサンプルである。これらのサンプルからのゲノムＤＮＡをＢｎＡＬＳＯＦ２，ＢｎＡＬＳＯＲ２およびＢｎＡＬＳＯＲ３のプライマーの組み合わせで増幅し，フラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙにクローニングし，トランスフォーメーションした。ＭＭ＃２３を用いて３８個の白コロニーをＳ６５３Ｎ変異についてスクリーニングしたところ，４個の陽性コロニーが同定された（ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−４９−９〜１２）。これらのコロニーを配列決定した。４つのうち３つのコロニー（ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−４９−９，１０および１２）が，ＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩ中にＳ６５３Ｎ変異を有していた。

標的領域のクローニングおよび続くＡＳ−ＰＣＲおよび配列の確認の同様の方法を用いて，Ｓ６５３Ｎ多型を有する他の系統を同定した。これらの中に系統ＢｎＡＬＳ−９７があった。ＢｎＡＬＳ−９７は再生して植物となり，種子を形成させた。この系統はプロトタイプ（植物として）であるため，ＢｎＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩの両方の全コーディング配列をクローニングし，配列決定した。この系統においては，ＢＮ−２野生型配列と比較して唯一の多型はＡＧＴ−＞ＡＡＴのコドン変化であり，これはＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩ中のＳ６５３Ｎアミノ酸置換を生ずる。

系統ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５７からランダムクローニングしたＢｎＡＬＳＯＦ２／ＢｎＡＬＳＯＲ２およびＢｎＡＬＳＯＦ２／ＢｎＡＬＳＯＲ３アンプリコンの予備的配列分析により，ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５７−４３および４６の両方のクローンがＢｎＡＨＡＳ Ｉ中にＷ５７４Ｌ変異（ＴＧＧ−＞ＴＴＧ）を有していることが示された。全配列分析を記録し，クローン３８および４１はＷ５７４であったため，系統５７はヘテロ接合性であることが示された。したがって，ＢｎＡＬＳＯＦ２，ＢｎＡＬＳＯＲ２およびＢｎＡＬＳＯＲ３のプライマーの組み合わせを用いて，ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５７およびＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−４５（ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５７と同じ最初のＩｍｉ耐性カルスから平行して得たカルスサンプル）からこのフラグメントを増幅し，ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ中にライゲーションし，トランスフォーメーションし，プレートに播種して青／白選択を行った。

ＭＭ＃２９を用いて，それぞれＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５７およびＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−４５のプレートからの１９個の白色コロニーをＷ５７４Ｌについてスクリーニングし，それぞれ４つの陽性コロニー（ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−４５−１，２，９および１８，およびＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５７−１，７，１３および１６）について，プラスミドを調製し，配列決定した。配列分析により，８コロニーすべてがＢｎＡＨＡＳ ＩにＷ５７４Ｌ変異を有することが示された。ＭＭ＃２９についてアニーリング温度を最適化して，
この新たな条件でさらに１９コロニーをスクリーニングした。３つの陽性コロニー（ＢｎＡＬＳ１６２１Ｎ−５７−１７，１８および１９）について，プラスミドを調製し，配列決定した。

さらに別のＩｍｉ耐性キャノーラサンプルであるＢｎＡＬＳ−６８〜９１を受領し，Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９１）の方法を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。各サンプルから，ＢｎＡＬＳＯＦ２，ＢｎＡＬＳＯＲ２およびＢｎＡＬＳＯＲ３プライマーの組み合わせを用いて，ＢｎＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩのフラグメントを増幅し，これをｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ中にクローニングした。

ＡＳ−ＰＣＲ反応においてＭＭ＃２３を用いてＳ６５３Ｎ変異を検出し，１系統あたり１２コロニーをスクリーニングしたところ，系統ＢｎＡＬＳ−８１から２つ（ＢｎＡＬＳ−８１−２０３および２０８），ＢｎＡＬＳ−７６から４つ（ＢｎＡＬＳ−７６−１５３，１５４，１５６および１６２）の，ＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩ中にＳ６５３Ｎ変異を含む陽性コロニーが得られた。全配列分析を記録した。ＰＣＲ増幅した標的領域または単一のクローニングされた挿入物を有する細菌コロニーの両方を，ＭＭ＃２３を用いてＡＳ−ＰＣＲスクリーニングしたところ，系統ＢｎＡＬＳ−１５９（モレキュラー・バイオロジー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）のサンプル１０２；コロニー６５５）が，ＢｎＡＨＡＳ Ｉ中にＳ６５３Ｎ変異を有するものとして同定された。これはこの遺伝子中のサイバス社の最初のＳ６５３Ｎ事象である。

最後に，系統ＢｎＡＬＳ−８３（モレキュラー・バイオロジーのサンプル９１）において，野生型（コロニー４０８）および変異体（コロニー４０３，４０５および４０６）を同定したところ，この系統はＢｎＡＨＡＳ Ｉ中のＳ６５３Ｔ変異（ＡＧＴ−＞ＡＣＴ）についてヘテロ接合性であった。系統ＢｎＡＬＳ−８３は，植物として，ＢｎＡＨＡＳ Ｉ中のＳ６５３Ｔ変異についてヘテロ接合性であることが確認された。新たなＩｍｉ耐性ＢＮ−２キャノーラ系統ＢｎＡＬＳ−７６およびＢｎＡＬＳ−１２３について，ＭＭ＃２３（Ｓ６５３Ｎ）およびＭＭ＃２９（Ｗ５７４Ｌ）を用いてさらなるスクリーニングを行った。これらのサンプルでは上述した予測された変異が見いだされなかったため，１２個のＢｎＡＬＳＯＦ２／ＯＲ２／３をクローニングし配列決定した。ＢｎＡＬＳ−１２３についてのＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩの７個すべてのクローン（コロニー５，１７−１９，２１，２２，２６および２８）はＳ６５３Ｔ変異について陽性であった。しかし，Ｒ１植物からの種子のジェノタイプはヘテロ接合性であった。

さらに，ＢｎＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩのそれぞれのＮ末端ＰＣＲフラグメントをクローニングし，それぞれＢｎＡＬＳ３／ＢｎＡＬＳ８（それぞれ配列番号１１および１９）およびＢｎＡＬＳ３／ＢｎＡＬＳ９（それぞれ配列番号１１および２０）のオリゴの組み合わせを用いて，ＢｎＡＬＳ−５８，６８および６９について配列決定した。ＢｎＡＬＳ−９６の新たな組織サンプルを取得し，ＢｎＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩのＮ末端ＰＣＲフラグメントをクローニングし，配列決定したところ，系統ＢｎＡＬＳ−９６はＢｎＡＨＡＳ Ｉ中にＡ２０５Ｖ変異（ＧＣＣ−＞ＧＴＣ）を有することが示された。カルス系統ＢｎＡＬＳ−６８に由来する植物材料からの全長コーディング配列ＢｎＡＬＳ３／ＯＲ２アンプリコンの４つのクローンはすべて，ＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩ中にＡ２０５Ｖの変化（ＧＣＧ−＞ＧＴＧ）を有しており，これはＢｎＡＬＳ−６９における変化と同一であった。

変異を有すると判定された系統，これらが由来する実験，および与えられた処置を表２にまとめる。系統ＢｎＡＬＳ−１５９は，カルス系統として死滅し，新芽を再生しなかった。表３は，本明細書に開示される実験において用いた例示的オリゴを示す。

新芽が利用可能になった後，すべての順列および組み合わせで交配を行った。系統ＢｎＡＬＳ−９７はＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩ中の参照Ｓ６５３Ｎである。系統ＢｎＡＬＳ−５７はＢｎＡＨＡＳ Ｉ中の参照Ｗ５７４Ｌである。ＢｎＡＬＳ−６８および６９は両方ともＢｎＡＨＡＳ ＩＩＩ中のＡ２０５Ｖの参照系統として進歩したものである。系統ＢｎＡＬＳ−８３は，ＢｎＡＨＡＳ Ｉ中のＳ６５３Ｔについて，カルスとしてヘテロ接合性であり，植物としてもヘテロ接合性である最初の系統である。

実施例２：材料および方法
細胞培養の説明
種子から，および小胞子から誘導された胚からの両方の新芽をインビトロで無菌条件下で増殖させた。２−４週間ごとに切片を継代し，ペトリ皿（２５ｍｍｘ９０ｍｍ）で４０−４５ｍＬの容量のＲＳ培地（Ｄｏｖｚｈｅｎｋｏ，２００１）で培養した。皿をミクロポアテープ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅｔａｐｅ，３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ）で密封した。若葉をプロトプラスト単離に用いた。

プロトプラストの単離および精製
インビトロで発芽した２−３週齢の葉組織約６００ｍｇを，５ｍＬの培地Ｂ（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ｐＨを５．８に調節）を入れたペトリ皿中で，外科用メスを用いて小さいストリップに切断した。約１時間後，培地Ｂを，０．５％（ｗ／ｖ）のセルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）ＹＣおよび０．７５％（ｗ／ｖ）のマセロザイム（Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ）Ｒ１０（いずれもＫａｒｌａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｏｔｔｏｎｗｏｏｄ，Ａｒｉｚｏｎａより），１ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン，および１ｇ／Ｌの２−モルホリノエタンスルホン酸を溶解した培地Ｂからなる酵素溶液で置き換えた。酵素溶液を葉組織中に減圧浸潤させ，酵素溶液中の葉切片を入れた皿を暗所で２５℃でインキュベーションした。プロトプラスト精製は，イオジキサノール密度勾配（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｈｅｅｔ Ｃ１８；Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ；Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ ＵＳＡ，１０ Ｃｏｍｍｅｒｃｅ Ｗａｙ，Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ０２７７６を適用）を用いて行った。密度勾配遠心分離の後，精製されたプロトプラストを含むバンドを約５ｍＬのＷ５培地とともに取り出した（Ｆｒｉｇｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。プロトプラストの収率は血球計で測定し，プロトプラストは４℃で２時間保存した。

遺伝子修復オリゴヌクレオチドＧＲＯＮの導入
プロトプラスト懸濁液を等量のＷ５培地と混合し，５０ｍＬの遠心管に移し，臨床用遠心分離器で最低の設定（約５０ｘｇ）で５分間遠心分離した。上清を除去し，ＴＭ培地（Ｋｌａｕｓ，２００１）で置き換えて，プロトプラスト密度を５ｘ１０^６／ｍＬに調節した。それぞれ５ｘ１０^６個のプロトプラストを含む１００μＬのアリコートを１２ｍＬの丸底遠心管に入れた。次に，ＡＨＡＳ遺伝子中の一方または両方の変異を標的とするＧＲＯＮを，ＰＥＧ処理を用いてプロトプラストに導入した。ＧＲＯＮをプロトプラストに導入するためには，１２．５μｇのＧＲＯＮを２５μＬの純粋に溶解し，１２５μＬのポリエチレングリコール溶液（５ｇＰＥＧ，ＭＷ１５００，６３８ｍｇマンニトール，２０７ｍｇＣａＮＯ_３ｘ４Ｈ_２Ｏおよび８．７５ｍＬ純水；ｐＨを約９．０に調節）を加えた。氷上で３０分間インキュベーションした後，プロトプラスト−ＰＥＧ懸濁液をＷ５培地で洗浄し，培地Ｂに再懸濁した。懸濁液を冷蔵庫で約４℃で一晩保持した。

プロトプラストのアルギン酸カルシウムへの包埋
ＧＲＯＮを導入した１日後，プロトプラストをアルギン酸カルシウムに包埋した。プロトプラストをゲル基質（例えば，アガロース，アルギン酸）中に包埋すると，プロトプラストの生存が高まり，プロトプラストに由来する細胞の分裂頻度が増加することが示されている。適用した方法は，Ｄｏｖｚｈｅｎｋｏ（２００１）に記載されている方法に基づくものである。

プロトプラストの培養およびイマゼタピル耐性カルスの選択
イマゼタピル耐性カルスの選択は，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）にしたがって，培地中のアルギン酸の一連の継代培養により行った。０．５μＭイマゼタピルの濃度でＰＥＧ／ＧＲＯＮ処理した１週間後に選択を開始した。除草剤は即時効果は有していなかった。イマゼタピルなしで培養初期段階に形成されたすべてのマイクロコロニーは，最初は生長し続けたが，除草剤を加えていない対照より遅かった。選択開始の１から２週間後，コロニーの生長は鈍化するかまたは停止した。

液体培地での選択段階が終了する前に，細胞およびコロニーを５０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む培地で３０−４５分間処理することによりアルギン酸から放出させた。放出されたコロニーを液体培地から固体培地に移したとき，大部分のコロニーは死滅しているか，または，死亡した細胞の外層に覆われた緑色がかった中心から構成された。固化した選択培地Ｅ上では，生きた細胞をなお含んでいたマイクロカルスの大部分は生長を停止し，褐色がかった色に変化した。時々，個々のカルスの限定された成長が続いたが，すべての非耐性カルスは最終的に褐色に変化し，死亡した。固化した選択培地に移した２〜３週間後（場合によってはより早期に），褐色ががった細胞およびマイクロカルスの背景の中で，活発に生長するカルスが出現した。

プロトプラストから誘導された，ＡＨＡＳ遺伝子の変異が確認された除草剤寛容性のカルスからの植物の再生。
固化選択培地上に発生し，そのＤＮＡを分析すると変異の存在を示すＩｍｉ寛容性カルスを，除草剤を含まない培地Ｅ（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３）に移して，発生を加速させた。個々のカルス系統は，その生長速度および形態学は様々であった。一般に，新芽生成に向けた発生は以下の段階を経た：
未分化，緑色カルス−＞暗緑色の領域をもつカルス−＞発根−＞始原細胞発芽−＞過水状態の（ガラス化した）葉をもつ発育不良の発芽

個々のカルス系統の発生は様々であったが，培地Ｅまたは低濃度のアルファ−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）で改変した培地Ｅでの連続的な継代および増殖により，最終的に多くの
カルス系統が発芽した。

培地Ｅ上で３−４葉の新芽が形成されると，これをＲＳ培地（Ｄｏｖｚｈｅｎｋｏ，２００１）に移した。この培地上では，時間がたつと，形態学的に正常な（すなわち過水状態ではない）新芽および葉組織が発生した。インビトロで植物体が根を生成した後，標準的なプロトコルを用いて温室条件に適合させた。

実施例４：除草剤散布データ
５−６葉期のセイヨウアブラナ植物に種々のＡＨＡＳ阻害除草剤を散布した。散布したＢ．ｎａｐｕｓ植物には，親系統ＢＮ０２（または必要な場合にはＢＮ１１），ＢＮ１５（クリアフィールド（Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ），市販の２遺伝子チェック）および下記に示す変異体が含まれる。除草剤は，０．２５％のＡＵ３９１界面活性剤の存在下で下記の割合で散布した。
イマザモックス (Beyond（登録商標）) 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 32 および 48 オンスの活性成分/エーカー(ai/A)
チフェンスルフロン 0.028, 0.056, 0.112, 0.168 ポンドの ai/A
トリベヌロン 0.015, 0.03, 0.06, 0.12, 0.18 ポンドのai/A
ニコスルフロン 0.06, 0.120, 0.24, 0.36 ポンドのai/A
リムスルフロン 0.015, 0.03, 0.06, 0.12, 0.18 ポンドのai/A
2:1 重量:重量チフェンスルフロン/トリベヌロン 0.056, 0.112, 0.224, 0.336 ポンドのai/A
2.22:1 チフェンスルフロン/ニコスルフロン 0.058, 0.116, 0.232 ポンドのai/A
プリミスルフロン 0.035, 0.070, 0.140 ポンドのai/A
フルメツラム0.040, 0.080, 0.16 ポンドのai/A
クロランスラム0.039, 0.078, 0.156 ポンドのai/A

除草剤は葉面散布により適用し，対照植物には散布しなかった。イマザモックスを除き，すべてのＡＨＡＳ阻害除草剤の試験は，散布の１４日後に，枯死を１，未散布対照の損傷なしを１０とする１−１０の損傷評点を用いて評価した。個々の植物系統は，各散布率で，その特定の速度における対照の性能と比較して評点した。散布試験の結果を図４に示す。

試験した化学物質：ジェノタイプ（すべての割合についての苗の数）
チフェンスルフロン: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18)
トリベヌロン: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18), 63 (9)
ニコスルフロン: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18)
THI / TRI: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18)
リムスルフロン: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18), 63 (9)
THI / Nic: BN2 (18), 63 (9), BN15xBnALS-57 (36), BN15 (18)
プリミスルフロン: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18)
フルメツラム: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18)
クロランスラム: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18)

イマザモックスを用いる試験は，次のようにして評価した：
10回目の評点: 8, 16, 32, および 48 オンス／エーカー（oz/A）の BnALS-83xBnALS-123, BnALS-96xBnALS-123, BnALS-97xBnALS-57, BN15xBnALS-57, BN2, BN15, BnALS-97xBN1517回目の評点: 4 および 12 oz/A の BnALS-97xBnALS-57, BN15xBnALS-97, BN2
28回目の評点: すべての単一因子変異について2, 4, 6, 8 oz/A
イマザモックス:
2 oz/A: BN2 (18), BnALS-123 (9), BnALS-96 (9), BnALS-97 (18), BnALS-83 (6), BnA
LS-76 (18), BnALS-58 (9), BnALS-57 (12)
4 oz/A: BN2 (18), BnALS-123 (9), BnALS-96 (9), BnALS-97 (18), BnALS-83 (9), BnALS-76 (18), BnALS-58 (9), BnALS-57 (12), BnALS-97xBN15 (15), BnALS-97xBnALS-57 (14)
6 oz/A: BN2 (9), BnALS-123 (9), BnALS-96 (12), BnALS-97 (9), BnALS-83 (12), BnALS-76 (9), BnALS-57 (12)
8 oz/A: BnALS-123 (9), BnALS-96 (12), BnALS-83 (12), BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (18), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (15), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18)
12 oz/A: BnALS-97xBN15 (15), BnALS-97xBnALS-57 (14), BN2 (12)
16 oz/A: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (15), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18)
32 oz/A: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (13), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18)
48 oz/A: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (6), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18)

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特に記載しないかぎり，本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は，本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書に例示的に説明される本発明は，本明細書において特定的に開示されていない任意の要素および限定がない場合にも適切に実施することができる。すなわち，例えば，"含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）"，"含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）"，"含む（ｃｏｎｔａ
ｉｎｉｎｇ）"等の用語は，拡張的に限定なしに読むべきである。さらに，本明細書にお
いて用いられる用語および表現は，説明の用語として用いられており，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されるかまたは説明される特徴またはその一部の均等物を排除することを意図するものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内で種々の改変が可能であることが理解される。

すなわち，好ましい態様および任意の特徴により特定的に開示してきたが，当業者は開示される本発明の改変，改良および変更をなしうること，およびそのような改変，改良および変更は本発明の範囲内であると考えられることが理解される。本明細書に提供される物質，方法，および例は，好ましい態様の代表的なものであり，例示であって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

本発明を広く一般的に説明してきた。一般的開示に包含される，より狭い種および亜属のそれぞれも本願発明の一部を形成する。これには，属から任意の主題を除く，排除または負の限定を含む本発明の一般的説明が含まれ，除かれる物が本明細書に特定的記載されているか否かは問わない。

さらに，本発明の特徴または観点がマーカッシュグループにより記述されている場合には，当業者は，本発明はマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはサブグループについても記載されていることを理解するであろう。

本明細書に引用されるすべての刊行物，特許出願，特許および他の参考文献は，それぞれが個々に参照として本明細書に組み込まれる場合と同じ程度に，その全体が明示的に参照として本明細書に組み込まれる。不一致がある場合には，定義を含む本明細書の記載が優先する。

他の態様は下記の特許請求の範囲に包含される。

Claims (12)

1. 配列番号１の２０５位に対応する位置がアラニンであるアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）Ｉ遺伝子と、配列番号３の６３５位に対応する位置がセリンであるアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）ＩＩＩ遺伝子とを有する親系統に由来する非トランスジェニック除草剤耐性植物であって、
   アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）Ｉ遺伝子及びアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）ＩＩＩ遺伝子に人工的に導入された標的変異をゲノムに含み、人工的に導入された標的変異を含むＡＨＡＳＩ蛋白質及びＡＨＡＳＩＩＩ蛋白質を発現し、
   人工的に導入された標的変異が、
   配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換及び配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換のいずれか一つと、
   配列番号３の６３５位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換である、非トランスジェニック除草剤耐性植物。
2. 人工的に導入された標的変異が、配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換である、請求項１記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
3. 人工的に導入された標的変異が、配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換である、請求項１記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
4. ＡＨＡＳ阻害性除草剤による阻害に対して耐性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
5. 前記ＡＨＡＳ阻害性除草剤は、イミダゾリノン、スルホニルウレア、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルチオベンゾエート、スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン、およびこれらの混合物からなる群より選択される除草剤である、請求項４記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
6. 前記ＡＨＡＳ阻害性除草剤はイミダゾリノン除草剤である、請求項５に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
7. 前記ＡＨＡＳ阻害性除草剤はスルホニルウレア除草剤である、請求項５に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
8. 前記ＡＨＡＳＩ蛋白質は、配列番号２１〜６２のアミノ酸配列の１またはそれ以上と９０％またはそれ以上の同一性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
9. キャノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、綿花、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、洋ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、大豆種、サトウキビ、エンドウ、ソラマメ、ポプラ、ブドウ、柑橘類、アルファルファ、ライ麦、オートムギ、芝草および飼料草、亜麻、菜種、キュウリ、アサガオ、ニガウリ、ピーマン、ナス、マリーゴールド、ハス、キャベツ、デイジー、カーネーション、チューリップ、アヤメ、およびユリからなる群の植物の種から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
10. アブラナ属である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物の種子であって、
    人工的に導入された標的変異を含むアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）Ｉ蛋白質及びアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）ＩＩＩ蛋白質をコードする、人工的に標的変異が導入されたＡＨＡＳＩ遺伝子及びＡＨＡＳＩＩＩ遺伝子をゲノムに含み、
    人工的に導入された標的変異が、
    配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換及び配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換のいずれか一つと、
    配列番号３の６３５位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換である、種子。
12. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物の細胞であって、
    アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）Ｉ遺伝子及びアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）ＩＩＩ遺伝子に人工的に導入された標的変異をゲノムに含み、人工的に導入された標的変異を含むＡＨＡＳＩ蛋白質及びＡＨＡＳＩＩＩ蛋白質を発現し、
    人工的に導入された標的変異が、
    配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換及び配列番号１の２０５位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換のいずれか一つと、
    配列番号３の６３５位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換である、細胞。