BRPI0722219A2 - "um método de mutagênese melhorando utilizando a introdução de nucleobases mutagênicas mediada por polietileno glicol em protoplastos vegetais" - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “Um método de mutagênese melhorado utilizando a introdução de nucleobases mutagênicas mediada por polietileno glico! em protoplastos vegetais”

5 CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um método para a alteração específica e seletiva de uma seqüência de nucleotídeos em um sítio específico do DNA em uma célula alvo pela introdução na célula de uma nucleobase mutagênica de oligonucleotídeo de DNA de fita simples. Mais especificamente, a invenção se 10 refere a um processo de mutagênese direcionada pela introdução de uma nucleobase mutagênica em protoplastos vegetais utilizando o polietilenoglicol (PEG). A invenção se refere ainda a kits contendo uma nucleobase mutagênica e PEG. A invenção também se refere ao uso de PEG para intensificar a mutagênese direcionada.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

O processo de deliberadamente criar mudanças no material genético das células vivas tem o objetivo de modificar uma ou mais propriedades biológicas geneticamente codificadas da célula, ou do organismo do qual a célula faz parte, ou no qual pode se regenerar. Estas mudanças podem assumir a forma de 20 supressão de parte do material genético, adição de material genético exógeno, ou alterações na seqüência de nucleotídeos existente no material genético. Os métodos de alteração do material genético dos organismos eucariotas são conhecidos há mais de 20 anos, e têm ampla aplicação em células vegetais,

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humanas e animais, e em microrganismos, para melhorias nas áreas de 25 agricultura, saúde humana, qualidade dos alimentos e proteção ambiental. Os métodos mais comuns consistem na adição de fragmentos de DNA exógeno ao genoma de uma célula, que irá, então, conferir uma nova propriedade para a célula ou seu organismo, além das propriedades codificadas por genes já existentes (incluindo aplicações nas quais a expressão de genes existentes será, assim, suprimida). Embora muitos exemplos sejam eficazes na obtenção das propriedades desejadas, esses métodos são, no entanto, não muito precisos, porque não há nenhum controle sobre as posições genômicas nas quais os fragmentos de DNA exógeno são inseridos (e, consequentemente, sobre os níveis 5 finais de expressão), e porque o efeito desejado terá de se manifestar sobre as propriedades naturais, codificadas pelo genoma original e bem equilibrado. Ao contrário, os métodos de mutagênese direcionada, que irão resultar na adição, suDressão ou conversão de nucleotídeos em locais genômicos pré-definidos, permitirão a modificação precisa de genes já existentes. Além disso, dévidò a 10 natureza precisa da mutagênese direcionada, espera-se que as novas linhas vegetais obtidas desta forma sejam mais facilmente aceitas pelos consumidores.

A mutagênese direcionada é um método de mutagênese direcionado ao sítio que se baseia no envio, direto ao núcleo da célula eucariótica, de nucleobases mutagênicas sintéticas (moléculas formadas por trechos curtos de frações 15 semelhantes ao nucleotídeo que lembram o DNA em suas propriedades de emparelhamento de bases de Watson-Crick, mas que podem ser quimicamente diferentes do DNA) (Alexeev and Yoon, 5 Nature Biotechnol. 16: 1343, 1998; Rice, Nature Biotechnol. 19: 321, 2001; Kmiec, J. Clin. Invest. H2: 632, 2003). Uma vez introduzidas na célula, tais nucleobases mutagênicas se emparelham com a 20 seqüência complementar no Iocus de destino. Ao projetar deliberadamente um desalinhamento na nucleobase, o desalinhamento pode causar uma conversão de nucleotídeo na posição correspondente na seqüência genômica de alvo. Este método permite a conversão de um ou, no máximo, poucos nucleotídeos em locais endógenos, mas pode ser aplicado para criar códon de parada em locais 25 existentes, resultando em uma ruptura de sua função, ou para criar mudanças de códons, resultando em genes que codificam proteínas com composição de aminoácidos alterada (manipulação de proteínas).

A mutagênese direcionada foi descrita em células vegetais, animais e de leveduras. Duas classes diferentes de nucleobases mutagênicas sintéticas foram utilizadas nesses estudos, as nucleobases DNA:RNA quiméricas ou nucleobases de fita simples.

As nucleobases DNA:RNA quiméricas (quimeras) são moléculas auto-complementares que consistem de apenas uma região de DNA de 25 pb e 5 uma seqüência complementar de 25bp composta de 5bp da região principal do DNA flanqueado de ambos os lados por 10bp de RNA 2-O-metilado que acredita-se que ajude na estabilidade da quimera na célula. A região principal de 5bp inclui em seu centro um desalinhamento manipulado com o nucleotídeo a ser alterado na seqüência de DNA alvo genômico. Ambas as regiões são ligadas por 10 timidinas em forma de gancho de 4 pb. Após a introdução na célula, acredita-se que a quimera forme um D-Ioop (laço de deslocamento) duplo com sua seqüência alvo e que um desalinhamento seja formado entre a quimera e o nucleotídeo alvo. Esse desalinhamento é, então, resolvido pelas proteínas endógenas de reparo do DNA celular pela conversão dos nucleotídeos genômicos. Os primeiros exemplos 15 de mutagênese direcionada usando quimeras vieram de células animais (revistos em Igoucheva et al. 2001 Gene Therapy 8, 391-399) e foram, então, utilizados posteriormente para alcançar a mutagênese direcionada em células vegetais (Beetham et al. 1999 Proc.Natl.Acad.Sci.USA96: 8774-8778; Zhu et al. 1999 Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 96, 8768-8773; Zhu et al. 2000 Nature Biotech. 18, 20 555-558; Kochevenko et al. 2003 Plant Phys. 132: 174-184; Okuzaki et al. 2004 Plant Cell Rep. 22: 509-512). Ao contrário das células humanas, uma célula vegetal na qual um evento de mutagênese direcionado tenha ocorrido pode ser regenerada em uma planta intacta, e a mutação transferida para a próxima geração, fazendo com que isso seja uma ferramenta ideal para mutagênese de 25 pesquisa e comercial de culturas alimentares importantes. No entanto, uma extensa pesquisa de muitos laboratórios mostrou que a freqüência de mutagênese direcionada usando quimeras é bastante baixa e variável, ou nem mesmo detectável (Ruiter et al. 2003 Mol Plant. Biol. 53, 715-729, Van der Steege et al. (2001) Nature Biotech. 19: 305-306), e depende de fatores como o estado de transcrição do alvo, a posição da célula no ciclo celular, a seqüência do alvo e a qualidade das quimeras, que são difíceis de serem sintetizadas. Devido à freqüência relativamente baixa de mutagênese direcionada com os métodos conhecidos na técnica, tais eventos só podem ser detectados quando a alteração 5 de um único nucleotídeo do alvo genômico resulta em um fenótipo dominante selecionável. Em células vegetais as mutações de pontos específicos foram introduzidas no quadro aberto de leitura do gene de acetolactato sintase (ALS, em AHAS de milho), que catalisa a etapa inicial comum à síntese da cadeia ramificada dos aminoácidos leucina, isoleucina e valina. Em tabaco, as alterações 10 de um único nucleotídeo são suficientes para produzir as conversões do códon P194Q ou W571L. A proteína ALS produzida após uma dessas conversões de códon é insensível à inibição pela classe sulfoniluréia de herbicidas, proporcionando assim um método de seleção para a conversão de um único nucleotídeo em um local cromossômico. Devido às dificuldades de trabalhar com 15 quimeras, projetos de oligonucleotídeos alternativos mais confiáveis têm sido procurados. Vários laboratórios têm investigado a capacidade de nucleobases (ss) de fita simples de executar mutagênese direcionada. Foi descoberto que elas dão resultados mais reprodutíveis, são mais simples de serem sintetizadas, e também podem incluir nucleotídeos modificados para melhorar o desempenho da 20 nucleobase mutagênica na célula (Liu et al. 2002 Nucl. Acids Res. 30: 2742-2750; review, Parekh-Olmedo et al. 2005 Gene Therapy 12: 639-646; Dong et a/.2006 Plant Cell Rep. 25: 457-65; De Piedoue et al. 2007 Oligonucleotides 27: 258-263). A mutagênese direcionada foi descrita em uma variedade de pedidos de patente de Kmiec, nomeadamente em W00173002, W003/027265, W001/87914, 25 W099/58702, W097/48714, W002/10364. Em WO 01/73002, é contemplado que a baixa eficiência de alteração genética obtida utilizando nucleobases inalteradas é amplamente considerada como sendo o resultado da sua degradação por nucleases presentes na mistura de reação ou na célula-alvo. Para solucionar este problema, é proposta a incorporação de nucleotídeos modificados que tomam as nucleobases resultantes resistentes a nucleases. Os exemplos típicos deste tipo de nucleotídeos modificados incluem ligações fosforotioato ou 2'-0-metil-análogos. Essas modificações são preferencialmente localizadas nas terminações da nucleobase, deixando um domínio central não modificado em tomo da base de alvo. Em apoio a isso, o pedido de patente WO 02/26967 mostra que certos nucleotídeos alterados que aumentam o tempo de vida intracelular da nucleobase aumentam a eficiência da mutagênese direcionada de um sistema de teste in vitro, e também de um alvo cromossômico de mamífero. Não só a resistência à nuclease, mas também á afinidade ^Je ligaçao dé^jmariucleõbasé mutagênica ss ao seu DNA alvo complementar, tem o potencial de aumentar dramaticamente a freqüência de mutagênese direcionada. Uma nucleobase ss que contém nucleotídeos modificados que aumentam sua afinidade de ligação pode encontrar de forma mais eficiente seu alvo complementar em um genoma complexo, e/ou permanecer ligada ao seu alvo por mais tempo, e ter menos probabilidade de ser removida por proteínas reguladoras da transcrição e replicação de DNA. Um ensaio de mutagênese direcionada in vitro foi utilizado para testar vários nucleotídeos modificados, para melhorar a eficiência do processo de mutagênese. Os ácidos nucléicos bloqueados (LNA) e as pirimidinas C5-propino têm modificações da fração de açúcar e da base, respectivamente, que estabilizam a formação de dúplex e elevam a temperatura de fusão do dúplex. Quando esses nucleotídeos modificados são incorporadas em uma nucleobase ss, eles intensificam a eficiência da mutagênese direcionada em até 13 vezes mais que a obtida através de uma nucleobase não modificada de mesma seqüência. Veja em relação a isso os pedidos W02007073166 e W02007073170 em nome dos presentes reclamantes.

Os presentes inventores se propuseram a melhorar a freqüência de mutagênese direcionada em células vegetais através da otimização do método utilizado para introduzir nucleobases mutagênicas em células vegetais.

O método mais amplamente utilizado para a transformação de células vegetais, a transformação mediada por Agrobacterium, transfere uma parte de seu plasmídeo de indução a tumor (Ti), o chamado T-DNA, para células vegetais, onde se integra de forma eficiente ao genoma vegetal em uma posição aleatória.

O T-DNA é flanqueado em ambas as terminações por seqüências de “fronteiras”

de até 22 bps derivados do plasmídeo Ti que não compartilha nenhuma homologia com a seqüência alvo. Dado o curto tamanho das nucleobases mutagênicas ss usadas para a mutagênese direcionada, as seqüências de fronteira poderiam interferir no processo. Assim, a mutagênese direcionada só

pode ser alcançada nas células vegetaisatravés da transferência direta de DNA_____

através de métodos químicos ou físicos. Na literatura, várias dessas técnicas de transferência direta de DNA têm sido relatadas, e incluem eletroporação, tratamento de protoplastos com polietileno glicol (PEG), bombardeio biobalístico de material de calos vegetais e microinjeção de DNA em protoplastos ou tecidos individuais. A técnica não fornece nenhuma indicação sobre o método preferencial 15 para a transferência de nucleobases ss para mutagênese direcionada, em particular para transferência de DNA para plantas ou protoplastos vegetais.

A fim de alcançar uma eficiência de mutagênese direcionada em plantas tão alta quanto possível, os presentes inventores, no decurso de suas investigações, identificaram quatro fatores que devem ser otimizados. Primeiro, a 20 nucleobase mutagênica é introduzida preferencialmente com uma alta eficiência de transformação, ou seja, é introduzida em tantas células vegetais quanto possível. Em segundo lugar, o tratamento é de preferência não letal para a maioria das células, garantindo que tantas células quanto possível que se transformam também sobreviveram ao processo de transformação (eficiência de 25 sobrevivência). Em terceiro lugar, o método de transformação é de preferência não prejudicial às divisões subsequentes das células vegetais transformadas para formar microcalos (eficiência de regeneração / plaqueamento) e, finalmente, é possível identificar, de preferência plantas regeneradas individuais derivadas de eventos de mutagênese direcionada sem a aplicação de uma seleção (eficiência de identificação).

A maioria dos métodos para a transformação do DNA em células vegetais individuais utiliza protoplastos derivados diretamente das folhas (protoplastos mesófilos) ou de células em suspensão (revisto em Sheen, J. (2001) Plant Phys.

5 127: 1466-1475). Os protoplastos podem ser usados para estudos de expressão transiente, em que a expressão genética ou a localização protéica pode ser avaliada logo após a transformação, ou para a produção de plantas estavelmente transformadas, quando os protoplastos são cultivados em meio para promover a formação de calos e organogenese.

A transformação de protoplastos vegetais utilizando eletroporação já foi

relatada previamente (Fromm et al. (1985) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82: 5824-5828; Nishiguchi et al. (1986) Plant Cell Rep. 5: 57-60; Ou-Lee et al. (1986) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 6815-6819; Hauptmann et al. (1987) Plant Cell Rep. 6: 265-270; Jones et al. (1989) Plant Mol.Biol. 13: 503-511). Geralmente, a 15 intensidade do campo (V/cm) dando a mais elevada eficiência na transformação resulta em <50% de sobrevivência de protoplastos (Jones et al. (1989) Plant Mol.Biol. 13: 503-511). Em estudos de eletroporação em tabaco, descobrimos que apenas cerca de 10% do total de protoplastos de tabaco na amostra são transformados com um plasmídeo que expressa GFP, e esta eficiência de 20 transformação relativamente baixa também foi observada após eletroporação de protoplastos de Arabidopsis (Miao et al. (2007) Nature Protocols 10: 2348-2353). Em geral, as condições de eletroporação ideal devem ser determinadas empiricamente para cada espécie vegetal, e estas também podem variar de acordo com o tipo de máquina de eletroporação, o método e os tampões 25 utilizados para o isolamento de protoplastos. Apesar da eletroporação vem sendo utilizada com sucesso em muitas espécies vegetais, ela continua a ser uma técnica difícil, com várias limitações sérias (como discutido em: http://qenetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/faq.html). Em particular, em termos de reprodutibilidade. Consequentemente, a eletroporação é menos desejável para • intensificar a eficiência global para TNE de mutagênese direcionada.

A transferência direta de genes utilizando a entrega biobalística foi muito bem sucedida na geração de plantas transgênicas e é usada rotineiramente para a integração estável de transgenes. As suspensões celulares são transferidas 5 para meio sólido para a indução de calos, e este material é bombardeado por partículas de ouro levadas por uma fonte de gás de alta pressão. Foi relatado que as frequências de transformação são baixas, -0,01% do total de células são transformadas. Devido à baixa eficiência de transformação, a sobrevivência das células transformadas é difícil de ser avaliada. Em contraste; a eficiência de 10 regeneração após o bombardeio tem probabilidade de ser elevada, devido ao material fortemente dividido que é tratado. No entanto, como TNE ocorrerá em uma única célula de um único calo, um evento como esse vai ser facilmente perdido se não for selecionado ou, alternativamente, as plantas regeneradas serão quiméricas para o evento da mutagênese direcionada. Assim, o bombardeio 15 não é prático para a realização de mutagênese direcionada em locais não-selecionáveis. Em contrapartida, é possível recuperar os eventos de mutagênese direcionada utilizando protoplastos, uma vez que cada microcalo é derivado de um único protoplasto.

As conversões induzidas de um único nucleotídeo por quimeras em ALS 20 demonstraram que a mutagênese direcionada pode ser detectada em células de tabaco, milho e arroz. O bombardeio foi usado para o tabaco (Beetham et al. 1999 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96: 8774-8778; Kochevenko et al. 2003 Plant Phys. 132: 174-184), milho (Zhu et al. 1999 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 8768-8773) e arroz (Okuzaki et al. 2004 Plant Cell Rep. 22: 509-512). Beetham et al. (1999) e 25 mostrou que a freqüência de resistência a herbicidas, após a transferência direta de quimeras, aumentou 20 vezes em comparação com a taxa de mutação de fundo (assumido como sendo entre 10-7 e 10-8). Kochevenko et al. também usaram eletroporação para realizar experimentos de mutagênese direcionada em protoplastos de tabaco mesófilo. Os presentes inventores foram capazes de obter calos de tabaco resistente a herbicida em uma freqüência de 0,0001%, comparável à freqüência obtida por Beetham et al. Isto sugere que quando se lida com a mesma espécie vegetal e os mesmos nucleotídeos alvo, neste caso o método de entrega direta de DNA não tem um grande impacto sobre a eficiência 5 da mutagênese direcionada, que permanece em um nível baixo indesejável. No entanto, Ruiter et al. (2003 Plant Mol. Biol. 53, 715-729) realizaram experimentos de bombardeio e de eletroporação em tabaco e colza, e não conseguiram detectar qualquer efeito das quimeras.

O bombardeio de calos de milho e arrõz fõi relatado com uma eficiência de 0,01% das células que são transformadas (Zhu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 8768-8773; Okuzaki et al. (2004( Plant Cell Rep. 22: 509-512). No entanto, isso só é viável em locais selecionáveis.

A transformação de protoplastos mediada por PEG por si só já é conhecida desde 1985. O primeiro método de transformação de protoplastos 15 utilizou polietileno glicol (PEG) (Krens et al. (1982) Nature 296: 72-74; Potyrykus et al. (1985) Plant Mol.Biol.Rep. 3:117-128; Negrutiu et al. (1987) Plant Mol.Biol. 8: 363-373). A técnica é aplicável a protoplastos de muitas plantas diferentes (Rasmussen et al. (1993) Plant Sei. 89: 199-207). Acredita-se que o PEG estimule a transformação pela precipitação do DNA, na presença de cátions divalentes, na 20 superfície dos protoplastos de onde se toma então internalizado (Maas & Werr (1989) Plant Cell Rep. 8: 148-151). A transformação por PEG é o método de escolha para a transformação de protoplastos de Arabidopsis (http://genetics.mqh.harvard.edu/sheenweb/faq.html) (Mathur et al. Methods in molecular biology, vol. 82, 267-276), e é bem adequada para os quatro requisitos 25 definidos para um método de transformação para TNE eficiente. Quando os protoplastos de tabaco são tratados com PEG, um oligonucleotídeo ss marcado com biotina pode ser detectado em todas as células examinadas. A sobrevivência, avaliada pela coloração vital com diacetato de fluoresceína, é > 90% após o tratamento com PEG. Nem todos os protoplastos mantêm a capacidade de dividir e de formar microcalos. Em um isolamento típico de protoplastos de tabaco não-tratados, cerca de 25% formam microcalos. O tratamento com PEG tem um impacto pequeno sobre a eficiência de regeneração, o que cai para cerca de 10%, mas isso não é dramático em comparação com outros métodos de transformação.

5 Nenhuma das práticas correntes descritas acima contemplou a utilização de transformação com PEG para mutagênese direcionada ao sítio, em particular a TNE. Os presentes inventores se propuseram a melhorar o método de transferência direta de DNA para obter mutagênese direcionada eficiente nas células vegetais. Os presentes inventores descobriram que, dèntré ás tecnologias10 de transformação, conforme descrito aqui em outro momento, a transformação de protoplastos com PEG intensifica a eficiência global da mutagênese direcionada significativamente, em comparação com a eletroporação a e biobalística. Isto é surpreendente, uma vez que as tecnologias de mutagênese direcionada em vegetais, até a data corrente, pareciam favorecer a eletroporação com as baixas 15 eficiências associadas. Além disso, a maioria das melhorias na tecnologia foi dirigida para melhorar as nucleobases mutagênicas, e não o sistema de entrega para a entrega das nucleobases mutagênicas ao DNA genômico alvo.

Para efeito de comparação, os presentes inventores utilizaram nucleobase mutagênicas ss projetada para produzir uma conversão P194Q no 20 local ALS, levando à resistência a herbicidas. As nucleobases mutagênicas ss idênticas foram introduzidas em protoplastos mesófilos de tabaco utilizando a transformação mediada por PEG ou a eletroporação, e as células resistentes a herbicida foram selecionadas a partir de condições de seleção idênticas. Assim, os presentes inventores descobriram que a transformação mediada por PEG de 25 células vegetais é o método mais eficiente para realizar a mutagênese direcionada em células vegetais, em comparação com os métodos conhecidos de transformação.

Em um aspecto, a invenção pertence a um método para alteração direcionada de uma seqüência de DNA aceptora duplex em um protoplastos de células vegetais, compreendendo combinar a seqüência de DNA aceptora duplex com uma nucleobase mutagênica ss, em que a seqüência de DNA aceptora duplex contém uma primeira seqüência de DNA e uma segunda seqüência de DNA que é complementar à primeira seqüência de DNA e em que a nucleobase 5 mutagênica ss doadora compreende pelo menos um desalinhamento em relação à seqüência de DNA aceptora duplex a ser alterada, de preferência com relação à primeira seqüência de DNA, em que o método compreende ainda uma etapa de introdução da nucleobase mutagênica ss no protoplasto celular utilizando transformação mediada por polietilenoglicol (PEG).

A nucleobase mutagênica ss é posta em contato com protoplastos da

planta a ser transformada utilizando-se uma transformação por PEG com base em biotecnologia. A tecnologia de transformação mediada por PEG, por si só, é amplamente conhecida e necessária, e pequenas alterações a protocolos específicos podem ser feitas por qualquer técnico no assunto, sem se afastar da essência da presente invenção.

A nucleobase mutagênica ss usada na presente invenção tem um comprimento que está em consonância com outras nucleobases mutagênicas ss (quiméricas) usadas na mutagênese direcionada, isto é, tipicamente entre 10-60 nucleotídeos, de preferência entre 20-55 nucleotídeos, e mais preferivelmente 20 entre 25-50 nucleotídeos. Em certas modalidades da invenção, a nucleobase mutagênica usada na presente invenção pode ser modificada, por exemplo, por LNA e/ou modificações de propinilo, conforme descrito nos pedidos W02007073166 e W02007073170. Assim, em certas modalidades, a nucleobase mutagênica ss contém pelo menos um LNA localizado em uma posição que é a 25 partir do desalinhamento direcionado e, de preferência, dois LNAs localizados a pelo menos um nucleotídeo removido de qualquer um dos lados do desalinhamento e, além disso, estes LNAs têm pelo menos 3, 4 ou 5 nucleotídeos retirados das terminações 5’ e/ou 3’ da nucleobase mutagênica ss. Em certas modalidades, a nucleobase mutagênica ss pode compreender uma ou mais substituições de propino, essencialmente como descrito em W02007073166 e W02007073170. Em certas modalidades, a nucleobase mutagênica ss doadora pode ser conjugada com uma proteína como um sinal de localização nuclear.

Nesta modalidade, o oligonucleotídeo utilizado na presente invenção é acoplado,

5 através de tecnologia convencional (linker), a um sinal de localização nuclear, como o conhecido peptídeo (NLS) do T-antígeno SV40 grande, o fator de transcrição GATA 11, a helicase de reparo do DNA XBP1, a proteína DET1 mediada por luz, o fator de transcrição ERF, ativador de transcirção relacionado a PR PTI6 e a proteína nuclear helicoidal, essencialmente como déscritõ^^no pedido — 10 co-pendente PCT/NL2007/000279. O conjugado de sinal de localização oligonucleotídeo-nuclear pode ser utilizado na metodologia de transformação com base em PEG descrita aqui.

A alteração produzida pelo método da presente invenção é uma supressão, uma substituição ou uma inserção de pelo menos um nucleotídeo.

Preferencialmente a alteração é uma substituição. Mais nucleotídeos podem ser alterados em um oligonucleotídeo, mas espera-se que a eficiência vai diminuir; portanto, há uma preferência para alterar um nucleotídeo.

O DNA-alvo (ou DNA aceptor duplex) pode, ser de qualquer fonte, mas de preferência o DNA-alvo é de um vegetal. De preferência, o DNA-alvo é o DNA 20 genômico, DNA linear, cromossomos artificiais, DNA cromossômico nuclear, DNA cromossômico de organelas, DNA epissomal. O método, de acordo com a invenção, pode ser usado para alterar uma célula, corrigir uma mutação por restauração para o tipo selvagem, induzir uma mutação, inativar uma enzima pela ruptura da região codificadora, modificar a bioatividade de uma enzima pela 25 alteração de uma região de codificação, modificar uma proteína pela ruptura da região de codificação.

Em um aspecto, a invenção se refere à utilização de transformação mediada por PEG para melhorar a eficiência da mutagênese direcionada em protoplastos vegetais. Sem vinculação à teoria, acredita-se que o uso de transformação mediada por PEG precipita o DNA na membrana celular dos protoplastos. O DNA precipitado é encapsulado pela membrana celular e introduzido no protoplasto de uma forma protegida. Os protoplastos iniciarão seu processo normal de regeneração da parede celular no decurso do ciclo celular 5 normal, logo após sua formação pela remoção da parede celular. A divisão celular geralmente começa mais tarde (entre várias horas até alguns dias). A troca direcionada de nucleotídeos geralmente ocorre durante a divisão celular, utilizando o mecanismo de reparação celular. No período de tempo entre a iniroauçao ao uina aoaaor no protoplasto e o início dã divisão "celular, o DNA' — 10 doador é propenso ao ataque das células do mecanismo de defesa, tais como as exonucleases, e é susceptível de ser degenerado e, portanto, torna-se ineficaz para TNE. Com o uso da tecnologia de transformação mediada por PEG, o DNA doador é encapsulado através de endocitose e, desta forma, é pelo menos temporariamente protegido contra a ação degenerativa das endonucleases.

Quando o DNA é liberado de sua forma encapsulada, tem uma maior chance de estar presente ou em torno do momento da divisão celular, durante o qual o DNA (por exemplo, a nucleobase mutagênica ss) está disponível para encontrar o seu complemento no DNA da célula aceptora e trocar o nucleotídeo como nos mecanismos de mutagênese direcionada comuns.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Comparação das freqüências de mutagênese direcionada usando transformação mediada por PEG ou eletroporação Isolamento de protoplastos

As culturas in vitro de Nicotiana tabacum cv Petit Havana linha SR1 são mantidas em meio MS20 com 0,8% de ágar Difco em frascos de vidro altos por fotoperíodos de 16/8 h de 2.000 Iux a 25°C e 60-70% RH. O meio MS20 é o meio básico de Murashige e Skoog's (Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum,

15: 473-497,1962), contendo 2% (p/v) de sacarose, nenhum hormônio adicionado e de 0,8% agar Difco. As culturas de folhas completamente expandidas de 3-6 semanas de idade são colhidas. As folhas são cortadas em tiras finas de 1 milímetro, que são então transferidas para placas de Petri grandes (100 mm x 100 mm) contendo 45 ml de meio basal MDE para um tratamento pré-plasmólise de min. O meio basal MDE continha 0,25 g de KCI, 1,0 g de MgSO4-TH2O, 0,136 g de KH2PO4, 2,5 g de polivinilpirrolidona (10.000 MW), 6 mg de ácido naftaleno acético e 2 mg de 6-benzilaminopurina em um volume total de 900 ml. A osmolaridade da solução é ajustada para 600 mOsm.kg'1 com sorbitol, e o pH 5,7. 5 mL de solução padrão de enzimas SR1 são então adicionados. A solução padrão de enzimas consiste de 750 mg de Cellulase Onozuka R10, 500 mg de driselase e 250 mg de macerozimas R10 por 100 ml, filtrada através de papel Whatman e filtro esterilizado. A digestão é deixada para prosseguir durante a noite, no escuro, a 25°C. As folhas digeridas são filtradas através de peneiras de nylon de 50 μιτι para um beaker esieril. um voiume igual de meio de lavagem a τηο ae KCl é usado para lavar a peneira e se combinar com a suspensão de protoplastos. O meio de lavagem de KCL consistia de 2,0 g de CaCI2^H2O por litro, e de quantidade de KCL suficiente para trazer a osmolaridade para 540 mOsm.kg'1. A suspensão é transferida para tudos de 10 ml, e os protoplastos são precipitados por 10 minutos a 85x g a 4°C. O sobrenadante é descartado e os pellets de protoplastos cuidadosamente resuspensos em 5 ml de meio de lavagem a frio de MLm, que são os macro-nutrientes do meio MS (Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Piantarum, 15: 473-497, 1962)^ em metade da concentração normal, 2,2 g de CaCI2.2H20 por litro e umã quantidade de manitol para levar a osmolalidade para 540 mOsm.kg'1. O conteúdo dos 2 tubos são combinados e centrifugados por 10 min a 85x g a 4°C. O sobrenadante é descartado e os pellets de protoplastos cuidadosamente resuspensos em 5 ml de meio de lavagem a frio de MLm, que é um meio MLM com manitol substituído por sacarose.O conteúdo dos 2 tubos é puxado e 1 mL de meio de lavagem de KCI é adicionado sobre a solução de sacarose, tomando-se cuidado para não perturbar a fase mais baixa. Os protoplastos são centrifugados por 10 minutos a 85x g a 4°C. A interfase entre a sacarose e as soluções de KCI contendo os protoplastos vivos é cuidadosamente coletada. Um volume igual de meio de lavagem de KCI é adicionado e cuidadosamente misturado. A densidade dos protoplastos é medida com um hemocitômetro.

Transformação por PEG

A suspensão de protoplastos é centrifugada em 85x g por 10 minutos a 5°C. O sobrenadante é descartado e o pellet de protoplastos ressuspenso em uma concentração final de 106.mL'1 em meio de lavagem deKCI. Em um tubo de 10 mL, 250 μί da suspensão de protoplastos, 1,6 nmoles de nucleobase mutagênicas ss e 250 μΙ de solução PEG são bem misturados, porém suavemente. Depois de 20

I minutos de incubação à temperatura ambiente, 5 mL de Ca(NO3)2 a 0,275 M frio são adicionados gota a gota. A suspensão de protoplastos é centrifugada por 10 minutos em 85x g a 4°C. O sobrenadante é descartado e o pellet de protoplastos cuidadosamente ressuspenso em 1,25 mL de meio de cultura T0 suplementado com 5 50 pg.mL'1 de cefotaxima e 50 pg.mL'1 de vancomicina. O meio de cultura de nucleobase mutagênica ss continha (por litro, pH 5,7) 950 mg de KNO3, 825 mg de NH4NO3, 220 mg de CaCI2.2H20, 185 mg de MgS04.7H20, 85 mg de KH2PO4, 27.85 mg de FeS04.7H20,37.25 mg de Na2EDTA.2H20, os micro-nutrientes de acordo com o meio de Heller (Heller, R., Ann Sci Nat Bot Biol Veg 14: 1-223, 1953), as vitaminas .10. _ de acordo com o meio de Morel e Wetmore (Morei, G. and R.H. Wetmore Amer. J. Bot. 38: 138-40, 1951), 2% (p/v) de sacarose, 3 mg de ãcídõ"riaftaleno acético, 1 mg de 6-benzilaminopurina e uma quantidade de manitol para trazer a osmolaridade para 540 mOsm.kg'1. A suspensão é transferida para uma placa de Petri de 35 mm. Um volume equivalente de meio de agarose T0 é adicionado e suavemente 15 misturado. As amostras são incubadas a 25°C no escuro e ainda cultivadas como descrito abaixo.

Eletroporação

Os protoplastos são centrifugados por 10 minutos a 85x g a 5°C. O sobrenadante é descartado e o pellet ressuspenso em tampão de eletroporação 20 gelado composto por 10 mM de HEPES, 80 mM de NaCI, 0,04 mM CaCI2, 0,4 M de manitol, pH 5,7 ajustado para 540 mOsm.Kg "1 com manitol a uma concentração final de 106 mL'1. Os protoplastos são mantidos em gelo durante todo o processo. Para uma cubeta de eletroporação de 0,4 centímetros de largura, 4,5 nmoles de nucleobase mutagênica ss e 700 μί da suspensão de protoplastos são adicionados. 25 Um pulso de decaimento exponencial simples é aplicado à suspensão celular usando um sistema de eletroporação Biorad GenePuIser XCeII equipado com um PC e um módulo CE, de acordo com os seguintes parâmetros:

Campo de força 500 V.cm-1

Capacitância 950 pF

Nestas condições, a resistência da amostra é de aproximadamente 30

ohms, e o tempo resultante constante de aproximadamente 30 ms. Estes parâmetros foram selecionados como os parâmetros que dão o maior nível de expressão transiente de GFP em protoplastos de tabaco, 24 horas após a eletroporação. Após a pulsação, os protoplastos são deixados para recuperação 35 na cuvette a temperatura ambiente por 30 minutos. Os protoplastos são então recuperados em 1 mL de meio de cultura T0 e transferidos para um tubo de 10 mL. A célula é lavada com 5 mL adicionais de meio de cultura T0, que é combinado com a suspensão de protoplastos. Após uma misturação vigorosa, porém gentil, 50 pg.mL'1 de cefotaxima e 50 pg.mL'1 de vancomicina são adicionados, e 1,25 mL da suspensão de protoplastos é transferida para uma placa de Petri 35 mm. Um 5 volume equivalente de meio de agarose T0 é adicionado e a mistura é suavemente homogenizada. As amostras são incubadas a 25°C no escuro e airida cultivadas como descrito abaixo.

Cultivo de Protoplastos

Após 10 dias de cultivo, a agarose é cortada em 6 partes iguais e . transferida para uma placa de Petri contendo 22,5 mL de meio MAPI AO suplementado com 20 nM de clorosulfurônio. Esse meicTconsistède (por litro. pH

5.7) 950 mg de KNO3, 825 mg de NH4NO3, 220 mg de CaCI2.2H20, 185 mg de MgSO4JH2O, 85 mg de KH2PO4, 27.85 mg de FeSO4TH2O, 37.25 mg de Na2EDTA.2H20, os micro-nutrientes de acordo com o meio de Murashige e Skoog

(Murashige, T. e Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962) em um décimo da concentração original, vitaminas de acordo com o meio de Morel e Wetmore (Morei, G. e R.H. Wetmore Amer. J. Bot. 38: 138-40, 1951), 6 mg de piruvato, 12 mg cada de ácido málico, ácido fumárico e ácido cítrico, 3% (p/v) de sacarose, 6% (p/v) de manitol, 0,03 mg de ácido naftaleno acético e 0,1 mg de 20 6-benzilaminopurina. As amostras são incubadas a 25°C em Iuz baixa por 6-8 semanas. Os calos cultivados são então transferidos para meio e deixados para desenvolver por outras 2-3 semanas. O meio tem a mesma composição do meio AO, porém com 3% (p/v) de manitol, ao invés de 6%, e 46,2 mg.l'1 de histidina (pH

5.7). Ele foi solidificado com 0,8% (p/v) de agar Difco. Os calos foram então transferidos para meio RP com o uso de fórceps estéreis. O meio RP consiste de

(por litro, pH 5,7) 273 mg de KN03, 416 mg de Ca(NO3)2.4H20, 392 mg de Mg(NO3)2.6H20, 57 mg de MgSO4.7H20, 233 mg de (NH4)2SO4, 271 mg de KH2PO4, 27.85 mg de FeS04.7H20, 37.25 mg de Na2EDTA.2H20, os micro-nutrientes de acordo com o meio de Murashige e Skoog em um quinto da concentração 30 publicada, vitaminas de acordo com o meio de Morel e Wetmore (Morei, G. e R.H. Wetmore Amer. J. Bot. 38: 138-40, 1951), 0,05% (p/v) de sacarose, 1,8% (p/v) de manitol, 0,25 mg de zeatina e 41 nM de clorsulfurônio, e é solidificado com 0,8% (p/v) de agar Difco.

Os brotos maduros são transferidos para meio de enraizamento após 2-3 semanas.

Nucleobases mutagênicas ss Todas as nucleobases mutagênicas ss foram sintetizadas por Eurogentec (Seraing, Bélgica), purificadas por HPLC de fase reversa e ressuspensas em água deionizada estéril purificada pelo sistema MilliQ. Antes do uso, as nucleobases mutagênicas ss foram aquecidas até 95°C por 5 min. A nucleobase mutagênica ss 5 06Q262 foi projetada para introduzir um único desalinhamento (nucleotídeo sublinhado) no gene de tabaco ALS (número de acesso X07644) na posição de códon P194, o que resultaria em uma conversão de CCA em CAA (P194Q). A nucleobase mutagênica ss 06Q261 é o emparelhamento exato da seqüência de gene de tabaco ALS1 e serve como controle negativo. A nucleobase 10 mutagênica ss 06Q263 consiste de uma combinação aleatória de 40 nucleotídeos, e serve como controle negativo.

06Q261 5' TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCTGTTATAG [SEQ ID 1] 06Q262 5’ TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCTGTTATAG [SEQ ID 2] 06Q263 5' ATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCG [SEQ ID 3]

Sobrevivência dos protoplastos por tratamento

A sobrevivência de protoplastos após tanto a transformação por PEG como a eletroporação é avaliada pela atividade de esterases, utilizando o corante vital fluorescente de diacetato de fluoresceína (FDA) 24 horas após a transformação. 2 pL de uma solução padrão de FDA a 5 mg.mL'1 em acetona foram adicionados a 1 mL 20 de protoplastos transformados. A proporção de protoplastos fluorescentes em toda a população é contada com um hemocitômetro. As observações são feitas com um microscópio Nikon Eclipse E600 de epifluorescência vertical equipado com um conjunto de filtros GFP LP (EX480/40, DM505, BA510).

A excitação é fornecida por uma lâmpada de mercúrio de 100W de pressão super alta. As imagens são adquiridas usando uma câmera DS-2MBWc CCD conectada a um controlador DS-U1 ligado a um PC executando o software de análise / aquisição de imagem NIS Element.

Resultados

Um resumo dos resultados da transformação por meio tanto da 30 transformação por PEG como da eletroporação é apresentado na Tabela 1. Usando a transformação por PEG a taxa de sobrevivência de protoplastos é significativamente maior, em comparação com a eletroporação. A natureza da eletroporação em si é mais prejudicial para a sobrevivência de protoplastos do que a transformação por PEG, resultando em uma taxa de recuperação / sobrevivência muito superior, bem 35 como uma maior eficiência na mutagênese direcionada. A eficiência da mutagênese direcionada é medida após a incubação dos protoplastos na presença de clorosulfurônio.

Nucleobase mutagênica Tratamento por PEG Eletroporação Sobreviência (%) Sobreviência (%) 06Q261 83.5±1.8 65.9±2.2 060262 82.6±2.1 66.3±2.6 060263 83.8±2.6 64.7±3.1 Tabela 1: Comparação de transformação por PEG e eletroporação em relação à sobrevida de protoplastos, expressa em porcentagem de protoplastos fluorescentes após a coloração com FDA na população de protoplastos 5 - recuperados. Os resultados são uma média de 3 replicações independentes + SD.

Amplificação por PCR de ALS e sequenciamento

O DNA é isolado de microcolônias de tabaco resistentes a clorosulfurônio usando o kit DNeasy (Qiagen), e usado como um molde em uma reação de PCR. As conversões dos códons direcionados no gene ALS de tabaco são detectadas 10 utilizando os primers 5'GGTCAAGTGCCACGTAGGAT [SEQ ID 4] & 5'GGGTGCTTCAC I I ICTGCTC [SEQ ID 5], que amplificam um fragmento de 776 pb do gene, incluindo o códon 194. A conversão de nucleotídeos no calo de tabaco resistente a herbicidas é confirmada por clonagem dos produtos de PCR em pCR2.1: TOPO (Invitrogen) e sequenciamento de plasmídeos individuais. O 15 tabaco contém 2 alelos de ALS (SurA and SurB).

A conversão de nucleotídeos no códon P194 de qualquer um desses locais é suficiente para conferir resistência a clorosulfurônio. Como o tabaco é uma espécie alotetraplóide, existem oito possíveis alvos no tabaco nos quais a TNE pode ter ocorrido. Em consonância com isso, foi necessário sequenciar >10 clones 20 de plasmídeos contendo o produto de PCR para detectar um com uma conversão de CCA para CAA. Isto sugere que, em cada calo resistente apenas 1 dos 8 alelos ALS tenha sofrido uma conversão de nucleotídeos mediada por mutagênese direcionada. Para todos os calos produzidos neste estudo, observou-se a conversão de nucleotídeos CCA em CAA esperada.

Claims (12)

1.Método para alteração direcionada de uma seqüência de DNA aceptora duplex em um protoplasto de célula vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende combinar a seqüência de DNA aceptora duplex com uma nucleobase mutagênica doadora, onde a seqüência de DNA aceptora duplex contém uma primeira seqüência de DNA e uma segunda seqüência de DNA que é o complemento da primeira seqüência de DNA, e em que a nucleobase mutagênica doadora compreende pelo menos um desalinhamento em relação à seqüência de DNA aceptora duplex a ser alterada, dè preferência em relação à primeira seqüência de DNA, em que o método compreende ainda uma etapa de introdução de uma nucleobase mutagênica nos protoplastos das células utilizando transformação mediada por polietileno glicol (PEG).

2.Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nucleobase mutagênica é uma nucleobase mutagênica ss.

3.Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a nucleobase mutagênica compreende substituições de LNA que são pelo menos um nucleotídeo removido do desalinhamento direcionado e, opcionalmente, pelo menos 3, 4 ou 5 nucleotídeos removidos das terminações 5’ e 3’ de uma nucleobase mutagênica.

4.Método, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a nucleobase mutagênica compreende substituições de propino.

5.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o DNA aceptor é de DNA genômico, DNA linear, cromossomos artificiais de mamíferos, cromossomos artificiais de bactérias, cromossomos artificiais de leveduras, cromossomos artificiais de vegetais, DNA cromossômico nuclear, DNA cromossômico de organelas, DNA epissomal.

6.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser para alterar uma célula, corrigir uma mutação por restauração ao tipo selvagem, induzir uma mutação, inativar uma enzima por ruptura de região codificadora, modificar a bioatividade de uma enzima por alteração da região codificadora, modificar uma proteína por ruptura de região codificadora.

7.Uso de transformação mediada por PEG para intensificar a eficiência da mutagênese direcionada em protoplastos vegetais pelo menos 10 vezes em comparação com a transformação com base em eletroporação.

8.Uso, de acordo com a reivindicação 7, carácté rizado peIo fato de que a nucleobase mutagênica é uma nucleobase mutagênica ss.

9.Uso, de acordo com as reivindicações 7 a 8, caracterizado pelo fato de que a nucleobase mutagênica compreende substituições de LNA que são pelo menos um nucleotídeo removido do desalinhamento direcionado e, opcionalmente, pelo menos 3, 4 ou 5 nucleotídeos removidos das terminações5’ e 3’ do oligonucleotídeo.

10.Uso, de acordo com as reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a nucleobase mutagênica compreende substituições de propino.

11.Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o DNA aceptor é de DNA genômico, DNA linear, cromossomos artificiais de mamíferos, cromossomos artificiais de bactérias, cromossomos artificiais de leveduras, cromossomos artificiais de vegetais, DNA cromossômico nuclear, DNA cromossômico de organelas, DNA epissomal.

12.Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser para alterar uma célula, corrigir uma mutação por restauração ao tipo selvagem, induzir uma mutação, inativar uma enzima por ruptura de região codificadora, modificar a bioatividade de uma enzima por alteração da região codificadora, modificar uma proteína por ruptura de região codificadora.