JP5731201B2

JP5731201B2 - 植物細胞プロトプラストにおける二本鎖アクセプタｄｎａ配列の標的化改変の方法

Info

Publication number: JP5731201B2
Application number: JP2010539319A
Authority: JP
Inventors: ブンドク，パウル; ボース，ミヒールテオドールヤンデ; ルイッシール，フランク
Original assignee: キージーンナムローゼフェンノートシャップ
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2027-12-21
Also published as: CA2710262A1; RU2010130453A; WO2009082190A1; US11008579B2; RU2515110C2; US20160201071A1; EP2562261B1; IL227942A0; US20210324393A1; NZ586846A; AU2007362895A1; ES2551256T3; IL227942A; KR20100106506A; HUE025914T2; EP2235187A1; EP2235187B1; EP2562261A1; US9365860B2; CN101883855B

Description

本発明は、細胞への一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド変異原性核酸塩基の導入により、標的細胞においてヌクレオチド配列をＤＮＡの特異的部位で特異的且つ選択的に改変する方法に関する。より詳細には、本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて変異原性核酸塩基を植物プロトプラストに導入することによる標的化突然変異誘発のプロセスに関する。本発明はさらに、変異原性核酸塩基及びＰＥＧを含有するキットに関する。本発明は、標的化突然変異誘発を向上させるためのＰＥＧの使用にも関する。

生細胞の遺伝物質において意図的に変化を作り出すプロセスは、この細胞、又はこの細胞が一部を形成するか、若しくはこの細胞から再生され得る生体の１つ又は複数の遺伝的にコードされた生物学的特性を変更することを目的とする。これらの変化は、遺伝物質の一部の欠失、外来性の遺伝物質の付加、又は遺伝物質の既存のヌクレオチド配列における変化の形態をとり得る。真核生物の遺伝物質を改変する方法は、２０年以上前から知られており、農業、ヒトの健康、食品品質、及び環境保護の分野における改良のために植物、ヒト、及び動物の細胞並びに微生物において広く利用されている。最も一般的な方法は、外来性のＤＮＡ断片を細胞のゲノムに付加させることから成り、これにより既存の遺伝子によってコードされる特性に勝る（over and above）新たな特性がこの細胞又はその生体に付与される（それにより既存の遺伝子の発現が抑制される用途を含む）。かかる例の多くは所望の特性を得るうえで効果的ではあるが、外来性のＤＮＡ断片が挿入されるゲノムの位置（したがって発現の最高レベル）が制御されず、所望の効果は元のバランスのとれたゲノムによってコードされる自然の特性を超えて現れる必要があるため、これらの方法はあまり正確でない。これに対し、規定のゲノム座においてヌクレオチドの付加、欠失、又は変換をもたらす標的化突然変異誘発法は、既存の遺伝子の正確な修飾を可能にする。また、標的化突然変異誘発の正確性によって、この方法により得られる新規の植物系統は、より容易に消費者に受け入れられることが期待される。

標的化突然変異誘発とは、合成変異原性核酸塩基（ワトソン・クリック塩基対合特性という点でＤＮＡに類似するが、ＤＮＡとは化学的に異なり得るヌクレオチド様部分の短いストレッチから成る分子）を真核細胞の核へと送達することに基づく部位特異的（site-directed）突然変異誘発法である（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。かかる変異原性核酸塩基は細胞に導入されると、標的遺伝子座の相補的配列と塩基対合する。核酸塩基においてミスマッチを意図的に設計することにより、そのミスマッチによって標的ゲノム配列中の対応する位置にヌクレオチド変換が生じる。この方法は、内因性遺伝子座において単一の又は多くとも数個のヌクレオチドしか変換しないが、既存の遺伝子座において終止コドンを作り出して、それらの機能を破壊するため、又はコドンの変化を作り出して、アミノ酸組成が変更されたタンパク質をコードする遺伝子をもたらすために適用することができる（タンパク質工学）。

植物細胞、動物細胞、及び酵母細胞における標的化突然変異誘発が記載されている。キメラＤＮＡ：ＲＮＡ核酸塩基又は一本鎖核酸塩基という２つの異なる種類の合成変異原性核酸塩基が、これらの研究において使用されている。

キメラＤＮＡ：ＲＮＡ核酸塩基（キメラ）は、２５ｂｐのＤＮＡのみの領域、及び５ｂｐのＤＮＡのコア領域（そのいずれかの側に、細胞内でのキメラの安定性を補助すると考えられる１０ｂｐの２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡが隣接する）から構成される２５ｂｐの相補的配列から成る自己相補的分子である。５ｂｐのコア領域はその中心に、ゲノムの標的ＤＮＡ配列において改変されるヌクレオチドとの操作されたミスマッチを含む。これらの領域は共に４ｂｐのチミジンヘアピンにより連結される。細胞内へ導入されると、キメラはその標的配列と二重Ｄループを形成すると考えられ、キメラと標的ヌクレオチドとの間にミスマッチが形成される。このミスマッチはその後、内因性の細胞ＤＮＡ修復タンパク質によるゲノムヌクレオチドの変換によって解消される。キメラを用いた標的化突然変異誘発の最初の例は、動物細胞において行なわれ（非特許文献４に掲載される）、その後、植物細胞においても標的化突然変異誘発を達成するために使用されている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。ヒト細胞とは異なり、標的化突然変異誘発事象が起こった植物細胞は、無傷植物へと再生することができ、突然変異は次の世代へと伝達されるため、キメラを用いた標的化突然変異誘発は重要な食用作物の研究及び商業的突然変異誘発の両方にとって理想的な手段（tool）とされる。しかしながら、多くの研究機関による広範な研究は、キメラを用いた標的化突然変異誘発頻度は、極めて低く、変動し易いか、又は検出可能でさえなく（非特許文献１０、非特許文献１１）、標的の転写状態、細胞周期における細胞の位置、標的の配列、及びキメラ（合成が困難である）の品質等の因子に依存することを示している。当該技術分野で既知の方法による標的化突然変異誘発の頻度は比較的低いため、かかる事象は、ゲノム標的の単一のヌクレオチド改変が優性選択可能な表現型を生じる場合にしか検出することができない。植物細胞において、特異的点突然変異が、分岐鎖アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、及びバリンの合成に共通する初期段階を触媒するアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ、トウモロコシではＡＨＡＳ）遺伝子のオープンリーディングフレームに導入された。タバコにおいては、コドン変換Ｐ１９４Ｑ又はＷ５７１Ｌを生じさせるには単一のヌクレオチド改変で十分である。これらのコドン変換のいずれかの後に産生されるＡＬＳタンパク質は、スルホニル尿素系除草剤による阻害に対して感度が低いため、染色体座での単一のヌクレオチド変換に関する選択法がもたらされる。

キメラを用いた作業は困難であるため、より信頼性の高い代替的なオリゴヌクレオチド設計が求められている。幾つかの研究機関では、標的化突然変異誘発を行なう一本鎖（ｓｓ）核酸塩基の能力を調査している。これらの核酸塩基はより再現性の高い結果をもたらし、より簡単に合成され、また、細胞における変異原性核酸塩基の性能を改善する修飾ヌクレオチドを含むことが見出されている（非特許文献１２、非特許文献１３（レビュー）、非特許文献１４、非特許文献１５）。

標的化突然変異誘発は、Kmiecの様々な特許出願、とりわけ特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６に記載されている。特許文献１では、未修飾の核酸塩基を用いて得られる遺伝子改変の効率の低さは、反応混合物又は標的細胞中に存在するヌクレアーゼによるそれらの分解によるところが大きいと考えられる。この問題点を改善するために、得られる核酸塩基をヌクレアーゼに対して抵抗性にする修飾ヌクレオチドを組み入れることが提案される。かかる修飾ヌクレオチドの典型的な例としては、ホスホロチオエート結合又は２’−Ｏ−メチル類縁体が挙げられる。これらの修飾は、標的塩基の周囲の中央の未修飾領域を残したまま、核酸塩基の末端に位置させるのが好ましい。この裏付けとして、特許出願の特許文献７は、核酸塩基の細胞内寿命を高める或る特定の修飾ヌクレオチドは、ｉｎｖｉｔｒｏ試験システム及び同様に哺乳類染色体標的において標的化突然変異誘発の効率を向上させることを示している。ヌクレアーゼ抵抗性だけでなく、ｓｓ変異原性核酸塩基のその相補的標的ＤＮＡとの結合親和性も、標的化突然変異誘発の頻度を劇的に向上させる可能性がある。その結合親和性を向上させる修飾ヌクレオチドを含有するｓｓ核酸塩基は、複雑なゲノムにおいてより効率的にその相補的標的を見つけるか、及び／又はより長い期間その標的との結合を維持することができ、ＤＮＡの転写及び複製を調節するタンパク質により除去される可能性が低い。突然変異誘発プロセスの効率を改善するために、多くの修飾ヌクレオチドがｉｎｖｉｔｒｏ標的化突然変異誘発アッセイを用いて試験されてきた。ロックト核酸（Locked nucleic acids）（ＬＮＡ）及びＣ５−プロピンピリミジンは、糖部分及び塩基のそれぞれに二本鎖形成を安定化させ、二本鎖の融解温度を上昇させる修飾を有する。これらの修飾ヌクレオチドをｓｓ核酸塩基に組み入れた場合、標的化突然変異誘発の効率が、配列の同じ未修飾の核酸塩基を用いて得られる効率よりも最大１３倍向上する。これに関しては、本出願人名義の国際公開第２００７０７３１６６号パンフレット及び国際公開第２００７０７３１７０号パンフレットを参照されたい。

本発明者らは、変異原性核酸塩基を植物細胞に導入するために使用される方法を最適化することにより、植物細胞における標的化突然変異誘発の頻度の改善に着手した。最も広く使用される植物細胞の形質転換法であるアグロバクテリウム介在形質転換では、その腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドの一部、いわゆるＴ−ＤＮＡを植物細胞に移入させ、そこで植物ゲノムのランダムな位置に効率的に組み込む。Ｔ−ＤＮＡの両末端には、標的配列と相同性を有しない、Ｔｉプラスミドに由来する最大で２２ｂｐの「境界」配列が隣接する。標的化突然変異誘発に使用されるｓｓ変異原性核酸塩基の短さを鑑みると、境界配列はプロセスを妨げる可能性がある。したがって、標的化突然変異誘発は、植物細胞においては化学的方法又は物理的方法を用いた直接ＤＮＡ移入によってのみ達成することができる。

かかる直接ＤＮＡ移入技法が文献において幾つか報告されており、エレクトロポレーション、プロトプラストのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理、植物カルス材料の遺伝子銃法、及びＤＮＡの個々のプロトプラスト又は組織へのマイクロインジェクションが挙げられる。この技術分野では、標的化突然変異誘発のためのｓｓ核酸塩基の移入、特に植物又は植物プロトプラストへのＤＮＡ移入にとって好適な方法は指摘されていない。

植物において可能な限り高い標的化突然変異誘発の効率を達成するために、本発明者らは調査の過程で、最適化すべき４つの因子を同定した。第１に、変異原性核酸塩基は高い形質転換効率をもって、すなわち可能な限り多くの植物細胞に導入するのが好ましい。第２に、処理が大半の細胞に対して致死的でなく、形質転換される細胞の可能な限り多くが、形質転換手順にも確実に耐えることが好ましい（生存効率）。第３に、形質転換法が、形質転換植物細胞のミクロカルスを形成するその後の分裂に悪影響を与えないことが好ましく（再生／平板効率）、最後に、標的化突然変異誘発事象に由来する個々の再生された植物を、選択を適用することなく同定可能であることが好ましい（同定効率）。

個々の植物細胞に対するＤＮＡの形質転換法の多くは、葉に直接由来するプロトプラスト（葉肉細胞プロトプラスト）又は細胞懸濁液に由来するプロトプラストを使用する（非特許文献１６に掲載される）。プロトプラストは、一時的発現研究（この場合、遺伝子発現又はタンパク質局在化を形質転換の直後に評価することができる）、又は安定形質転換植物の作製（この場合、プロトプラストをカルス形成及び器官形成を促進する培地で成長させる）に使用することができる。

エレクトロポレーションを用いた植物プロトプラストの形質転換は、既に報告されている（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１）。一般に、最高の形質転換効率をもたらす電界強度（Ｖ／ｃｍ）では、プロトプラスト生存率は５０％未満である（非特許文献２１）。本発明者らは、タバコのエレクトロポレーション研究において、試料中の全タバコプロトプラストの約１０％しかＧＦＰを発現するプラスミドによって形質転換されないことを見出したが、この比較的低い形質転換効率は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）プロトプラストのエレクトロポレーションの後にも観察されている（非特許文献２２）。一般に、最適なエレクトロポレーション条件は、植物種の各々について実験的に決定する必要があり、これらの条件はエレクトロポレーション装置のタイプ、並びにプロトプラスト単離に使用される方法及びバッファーによっても変化し得る。エレクトロポレーションは、多くの植物種に首尾よく適用されてきたが、依然として特に再現性に関して幾つか重大な制限のある困難な技法のままである（非特許文献２３において論じられる）。したがって、エレクトロポレーションは、標的化突然変異誘発のＴＮＥに対する全体的効率を向上させるにはあまり望ましくない。

遺伝子銃送達を用いた直接遺伝子移入は、遺伝子組み換え作物の作製において大きな成功を収めており、導入遺伝子の安定した組み込みのために日常的に使用されている。細胞懸濁液をカルス誘導のために固体培地に移し、この材料に高圧ガス供給源により駆動される金粒子を衝突させる。その形質転換頻度は低く、形質転換される細胞は全細胞のうち約０．０１％であることが報告されている。この形質転換効率の低さのために、形質転換細胞の生存率を評価するのは困難である。対照的に、遺伝子銃法後の再生効率は、処理された材料が強く分裂することから高い可能性がある。しかしながら、ＴＮＥは単一のカルスの単一の細胞において起こるため、かかる事象はその細胞を選択しない限り、或いは再生される植物が標的化突然変異誘発事象に関してキメラでない限り、容易に失われる。このため、遺伝子銃法は選択不可能な遺伝子座において標的化突然変異誘発を行なうには実際的ではない。対照的に、各々のミクロカルスは単一のプロトプラストに由来するため、プロトプラストを用いて標的化突然変異誘発事象を回復させることが可能である。

キメラによるＡＬＳでの単一ヌクレオチド変換の誘導によって、タバコ、トウモロコシ、及びイネの細胞において標的化突然変異誘発が検出可能であることが実証されている。タバコ（非特許文献５、非特許文献８）、トウモロコシ（非特許文献６)、及びイネ（非特許文献９）に対して遺伝子銃法が使用されている。非特許文献５は、キメラを直接移入した後の除草剤抵抗性の頻度が、バックグラウンド突然変異率（１０^−７〜１０^−８であると推測される）と比較して２０倍増大することを報告している。非特許文献８は、タバコ葉肉細胞プロトプラストにおいて同様にエレクトロポレーションを使用して標的化突然変異誘発実験を行なっている。本発明者らは、除草剤抵抗性タバコカルスを、非特許文献５により得られた頻度に匹敵する０．０００１％という頻度で得ることができた。このことにより、この場合と同じ植物種及び同じ標的ヌクレオチドを扱う場合、直接ＤＮＡ送達法は標的化突然変異誘発効率に対して大きな影響を与えず、効率は望ましくない低いレベルのままであることが示唆される。しかしながら、非特許文献１０は、タバコ及びアブラナの両方において遺伝子銃法及びエレクトロポレーション実験の両方を行なったが、キメラの効果を全く検出することができなかった。

トウモロコシ及びイネの両方のカルスの遺伝子銃法においては、細胞が０．０１％という効率で形質転換されることが報告されている（非特許文献６、非特許文献９）。しかしながら、これは選択可能な遺伝子座でしか実行することができない。

ＰＥＧ介在プロトプラスト形質転換自体は、１９８５年から既に知られている。プロトプラスト形質転換の最初の方法は、ＰＥＧを利用するものであった（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６）。この技法は、多くの異なる植物に由来するプロトプラストに適用可能である（非特許文献２７）。ＰＥＧは二価陽イオンの存在下で、ＤＮＡをプロトプラストの表面（そこからＤＮＡが取り込まれる）に沈殿させることにより形質転換を刺激すると考えられる（非特許文献２８）。ＰＥＧ形質転換は、シロイヌナズナプロトプラストの形質転換に関する選択法であり（非特許文献２３、非特許文献２９）、効率的なＴＮＥのための形質転換法に関して規定される４つの要件によく適合する。タバコプロトプラストをＰＥＧで処理した場合、検査した全ての細胞においてビオチン標識ｓｓオリゴヌクレオチドを検出することができる。フルオレセイン二酢酸を用いた生体染色により評価される生存率は、ＰＥＧ処理後では９０％超である。全てのプロトプラストが分裂してミクロカルスを形成する能力を保持している訳ではない。未処理タバコプロトプラストの単離の典型例では、約２５％がミクロカルスを形成する。ＰＥＧ処理は再生効率に対し、わずかに影響するが（約１０％に低下する）、これは他の形質転換法と比較して劇的なものではない。上述の先行技術のいずれも、部位特異的突然変異誘発、特にＴＮＥにおけるＰＥＧ形質転換の使用を意図していない。

国際公開第０１／７３００２号パンフレット国際公開第０３／０２７２６５号パンフレット国際公開第０１／８７９１４号パンフレット国際公開第９９／５８７０２号パンフレット国際公開第９７／４８７１４号パンフレット国際公開第０２／１０３６４号パンフレット国際公開第０２／２６９６７号パンフレット国際公開第２００７／０７３１６６号パンフレット国際公開第２００７／０７３１７０号パンフレット

Alexeev and Yoon, Nature Biotechnol. 16: 1343, 1998 Rice, Nature Biotechnol. 19: 321, 2001 Kmiec, J. Clin. Invest. 112: 632, 2003 Igoucheva et al. 2001 Gene Therapy 8, 391-399 Beetham et al. 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8774-8778 Zhu et al. 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8768-8773 Zhu et al. 2000 Nature Biotech. 18, 555-558 Kochevenko et al. 2003 Plant Phys. 132: 174-184 Okuzaki et al. 2004 Plant Cell Rep. 22: 509-512 Ruiter et al. 2003 Plant Mol. Biol. 53, 715-729 Van der Steege et al. (2001) Nature Biotech. 19: 305-306 Liu et al. 2002 Nucl. Acids Res. 30: 2742-2750 Parekh-Olmedo et al. 2005 Gene Therapy 12: 639-646 Dong et al. 2006 Plant Cell Rep. 25: 457-65 De Piedoue et al. 2007 Oligonucleotides 27: 258-263 Sheen, J. (2001) Plant Phys. 127: 1466-1475 Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828 Nishiguchi et al. (1986) Plant Cell Rep. 5: 57-60 Ou-Lee et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6815-6819 Hauptmann et al. (1987) Plant Cell Rep. 6: 265-270 Jones et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 503-511 Miao et al. (2007) Nature Protocols 10: 2348-2353 http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/faq.html Krens et al. (1982) Nature 296: 72-74 Potyrykus et al. (1985) Plant Mol. Biol. Rep. 3: 117-128 Negrutiu et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363-373 Rasmussen et al. (1993) Plant Sci. 89: 199-207 Maas & Werr (1989) Plant Cell Rep. 8: 148-151 Mathur et al. Methods in molecular biology, vol. 82, 267-276

本発明者らは、植物細胞において効率的な標的化突然変異誘発を得るために、直接ＤＮＡ移入法の改善に着手した。本発明者らは、本明細書中で他に記載される形質転換技術のうち、ＰＥＧプロトプラスト形質転換が、エレクトロポレーション及び遺伝子銃法と比較して全体的標的化突然変異誘発効率を有意に向上させることを見出した。これは、植物におけるこれまでの標的化突然変異誘発の技術では、エレクトロポレーションがそれに付随する低い効率性とともに好まれているようであったため、驚くべきことである。さらに、この技術における最大の改善は、変異原性核酸塩基をゲノム標的ＤＮＡへと送達する送達システムではなく、変異原性核酸塩基の改善へと向けられた。

比較のために、本発明者らは、ＡＬＳ遺伝子座においてＰ１９４Ｑ変換を生じさせ、除草剤抵抗性をもたらすように設計したｓｓ変異原性核酸塩基を使用した。同一のｓｓ変異原性核酸塩基を、ＰＥＧ介在形質転換又はエレクトロポレーションのいずれかを用いてタバコ葉肉細胞プロトプラストに導入し、同一の選択条件を用いて除草剤抵抗性細胞を選択した。これにより本発明者らは、植物細胞のＰＥＧ介在形質転換が、植物細胞において標的化突然変異誘発を行なううえで、既知の形質転換法と比較して最も効率的な方法であることを見出した。

一態様において、本発明は、植物細胞プロトプラストにおける二本鎖アクセプタＤＮＡ配列の標的化改変の方法であって、二本鎖アクセプタＤＮＡ配列をｓｓ変異原性核酸塩基と合わせることを含み、二本鎖アクセプタＤＮＡ配列が、第１のＤＮＡ配列及び第１のＤＮＡ配列に相補的な第２のＤＮＡ配列を含有し、ドナーｓｓ変異原性核酸塩基が、改変される二本鎖アクセプタＤＮＡ配列、好ましくは第１のＤＮＡ配列に関して少なくとも１つのミスマッチを含み、且つ該方法がｓｓ変異原性核酸塩基を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在形質転換を用いて細胞プロトプラストに導入する工程をさらに含む、方法に関する。

ｓｓ変異原性核酸塩基を、ＰＥＧ形質転換に基づく技術を用いて形質転換される植物のプロトプラストと接触させる。ＰＥＧ介在形質転換技術自体は広く知られており、当業者は必要に応じて、本発明の要旨を逸脱することなく、特定のプロトコルに幾らか変更を加えることができる。

本発明において使用されるｓｓ変異原性核酸塩基は、標的化突然変異誘発において使用される他のｓｓ変異原性核酸塩基と同等に、典型的には１０ヌクレオチド長〜６０ヌクレオチド長、好ましくは２０ヌクレオチド長〜５５ヌクレオチド長、より好ましくは２５ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長である。本発明の或る特定の実施の形態では、本発明において使用されるｓｓ変異原性核酸塩基は、例えば、出願人の特許文献８及び特許文献９に記載されるように、ＬＮＡ修飾及び／又はプロピニル修飾により修飾されていてもよい。このため、或る特定の実施の形態では、ｓｓ変異原性核酸塩基は、標的ミスマッチから少なくとも１ヌクレオチド離間した位置に位置するＬＮＡ、好ましくはミスマッチ末端のいずれかの側から少なくとも１ヌクレオチド離間している位置の２つのＬＮＡを含有する。さらに、これらのＬＮＡは、ｓｓ変異原性核酸塩基の５’末端及び／又は３’末端から少なくとも３、４、又は５のヌクレオチド離間した位置にある。或る特定の実施の形態では、ｓｓ変異原性核酸塩基は、特許文献８及び特許文献９に実質的に記載されるように、１つ又は複数のプロピン置換を含み得る。或る特定の実施の形態では、ドナーｓｓ変異原性核酸塩基は、核局在シグナル等のタンパク質と共役していてもよい。この実施の形態では、本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、出願人の同時係属中の出願である国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２７９号明細書に実質的に記載されるように、従来の技術（リンカー）によって核局在シグナル、例えばＳＶ４０ラージＴ抗原、ＧＡＴＡ転写因子１１、ＤＮＡ修復ヘリカーゼＸＢＰ１、光介在（Light mediated）タンパク質ＤＥＴ１、ＥＲＦ転写因子、ＰＲ関連転写活性化因子ＰＴＩ６、及び核コイルドコイルタンパク質の既知の（ＮＬＳ）ペプチドに連結させる。オリゴヌクレオチド−核局在シグナル複合体を、本明細書中に記載されるＰＥＧに基づく形質転換手法において使用することができる。

本発明の方法により生じさせる変化は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換、又は挿入である。好ましくは変化は置換である。１つのオリゴヌクレオチド中で複数の（More）ヌクレオチドを改変してもよいが、効率の低下が予想されるため、１つのヌクレオチドを改変するのが好ましい。

標的ＤＮＡ（又は二本鎖アクセプタＤＮＡ）は任意の供給源に由来してもよいが、好ましくは標的ＤＮＡは植物に由来する。好ましくは、標的ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、線状ＤＮＡ、人工染色体、核染色体ＤＮＡ、オルガネラ染色体ＤＮＡ、エピソームＤＮＡに由来する。本発明による方法は、細胞を改変するため、野生型への回復により突然変異を修復するため、突然変異を誘発するため、コード領域の破壊により酵素を不活性化するため、コード領域の改変により酵素の生物活性を変更するため、コード領域の破壊によりタンパク質を修飾するために使用することができる。

一態様では、本発明は、植物プロトプラストにおける標的化突然変異誘発の効率を向上させるためのＰＥＧ介在形質転換の使用に関する。

理論に束縛されるものではないが、ＰＥＧ介在形質転換の使用は、ＤＮＡをプロトプラストの細胞膜上に沈殿させると考えられる。沈殿したＤＮＡは細胞膜により封入され、遮蔽された状態でプロトプラスト中に導入される。プロトプラストは、その正常な細胞周期の過程で、細胞壁の除去により形成された直後から、その正常細胞壁再生プロセスを開始する。細胞分裂は、典型的にはその後（数時間〜最大で数日）に開始する。標的化ヌクレオチド交換は通常、細胞の修復機構を用いて細胞分裂中に起こる。ドナーＤＮＡのプロトプラストへの導入から細胞分裂の開始までの期間中に、ドナーＤＮＡは、エクソヌクレアーゼ等の細胞の防御機構により、攻撃され易く、変性することにより、ＴＮＥに対して効果がなくなる可能性がある。ＰＥＧ介在形質転換技術を使用すると、ドナーＤＮＡは、エンドサイトーシスにより封入されることにより、エンドヌクレアーゼの変性作用から少なくとも一時的に遮蔽される。ＤＮＡがその封入形態から放出される時点（細胞分裂の瞬間又はその前後である可能性が高い）で、ＤＮＡ（すなわちｓｓ変異原性核酸塩基）を、アクセプタ細胞のＤＮＡからその相補体を見つけ出し、且つ一般的な標的化突然変異誘発機構のようにヌクレオチドを交換するために利用可能である。

以下、詳細に説明する。

ＰＥＧ介在形質転換又はエレクトロポレーションのいずれかを用いた標的化突然変異誘発頻度の比較
プロトプラスト単離
タバコ（Nicotiana tabacum）の栽培品種ＰｅｔｉｔＨａｖａｎａ株ＳＲ１のｉｎｖｉｔｒｏシュート培養を、背の高い（high）ガラスビン中の０．８％Ｄｉｆｃｏアガーを含むＭＳ２０培地において、２０００ルクスで１６時間／８時間の光周期、２５℃、６０％ＲＨ〜７０％ＲＨで維持する。ＭＳ２０培地は、２％（ｗ／ｖ）スクロース及び０．８％Ｄｉｆｃｏアガーを含有するホルモン無添加の基本的なムラシゲ−スクーグ培地（Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962）である。３週齢〜６週齢のシュート培養物の完全に展開した葉を採取する。葉を１ｍｍの細片にスライスし、これを次に、３０分間の前原形質分離（preplasmolysis）処理のために、４５ｍｌのＭＤＥ基本培地を含有する大きな（１００ｍｍ×１００ｍｍ）ペトリ皿に移す。ＭＤＥ基本培地は９００ｍｌの全容量中に、０．２５ｇのＫＣｌ、１．０ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１３６ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、２．５ｇのポリビニルピロリドン（分子量１００００）、６ｍｇのナフタレン酢酸、及び２ｍｇの６−ベンジルアミノプリンを含有するものであった。溶液のオスモル濃度を、ソルビトールを用いて６００ｍＯｓｍ／ｋｇに調節し、ｐＨを５．７とする。次いで５ｍＬの酵素原液ＳＲ１を添加する。酵素原液は、１００ｍｌ当たり７５０ｍｇのＣｅｌｌｕｌａｓｅＯｎｏｚｕｋａＲ１０、５００ｍｇのドリセラーゼ、及び２５０ｍｇのマセロザイムＲ１０から成り、ワットマン紙で濾過して濾過滅菌したものである。暗所、２５℃で一晩消化を進行させる。消化させた葉を５０μｍのナイロン篩を通して濾過し、滅菌ビーカーに入れる。等量の冷ＫＣｌ洗浄培地を使用して篩を洗浄し、プロトプラスト懸濁液と共にプールする。ＫＣｌ洗浄培地は、１Ｌ当たり２．０ｇのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、及びオスモル濃度を５４０ｍＯｓｍ／ｋｇとするのに十分な量のＫＣｌから成るものであった。懸濁液を１０ｍＬ容の試験管に移し、プロトプラストを４℃、８５×ｇで１０分間ペレット化する。上清を捨て、プロトプラストペレットを５ｍＬの冷ＭＬｍ洗浄培地中に慎重に再懸濁する。ＭＬｍ洗浄培地は、正常濃度の２分の１の量のＭＳ培地（Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962）の主要栄養素、１Ｌ当たり２．２ｇのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、及びオスモル濃度を５４０ｍＯｓｍ／ｋｇとする量のマンニトールを含むものである。２本の試験管の内容物を合わせ、４℃、８５×ｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、プロトプラストペレットを５ｍＬの冷ＭＬｓ洗浄培地中に慎重に再懸濁する。ＭＬｓ洗浄培地は、ＭＬｍ培地のマンニトールをスクロースに置き換えたものである。２本の試験管の内容物をプールし、１ｍＬのＫＣｌ洗浄培地を、下相を乱すことのないよう注意しながらスクロース溶液に添加する。プロトプラストを４℃、８５×ｇで１０分間遠心分離する。生プロトプラストを含有するスクロースとＫＣｌ溶液との間の中間相を慎重に回収する。等量のＫＣｌ洗浄培地を添加し、慎重に混合する。プロトプラスト密度を血球計算器を用いて測定する。

ＰＥＧ形質転換
プロトプラスト懸濁液を５℃、８５×ｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、プロトプラストペレットをＫＣｌ洗浄培地中に、最終濃度が１×１０^６個／ｍＬとなるよう再懸濁した。１０ｍＬ容の試験管中で、２５０μＬのプロトプラスト懸濁液、１．６ｎｍｏｌのｓｓ変異原性核酸塩基、及び２５０μｌのＰＥＧ溶液を穏やかに且つ十分に混合する。室温で２０分間のインキュベーション後、５ｍＬの０．２７５Ｍ冷Ｃａ（ＮＯ_３）_２を滴下する。プロトプラスト懸濁液を４℃、８５×ｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、プロトプラストペレットを、５０μｇ／ｍＬのセフォタキシム及び５０μｇ／ｍＬのバンコマイシンを添加した１．２５ｍＬのＴ_０培養培地中に慎重に再懸濁した。ｓｓ変異原性核酸塩基培養培地は、９５０ｍｇのＫＮＯ_３、８２５ｍｇのＮＨ_４ＮＯ_３、２２０ｍｇのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１８５ｍｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、８５ｍｇのＫＨ_２ＰＯ_４、２７．８５ｍｇのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３７．２５ｍｇのＮａ_２ＥＤＴＡ・２Ｈ_２Ｏ、へラー（Heller's）培地（Heller, R., Ann Sci Nat Bot Biol Veg 14: 1-223, 1953）による主要栄養素、モレル−ウェットモア（Morel and Wetmore's）培地（Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer. J. Bot. 38: 138-40, 1951）によるビタミン、２％（ｗ／ｖ）スクロース、３ｍｇのナフタレン酢酸、１ｍｇの６−ベンジルアミノプリン、及びオスモル濃度を５４０ｍＯｓｍ／ｋｇとする量のマンニトールを含有するものであった（１Ｌ当たり、ｐＨ５．７）。懸濁液を３５ｍｍペトリ皿に移す。等量のＴ_０アガロース培地を添加し、穏やかに混合する。試料を暗所、２５℃でインキュベートし、さらに下記に記載されるように培養する。

エレクトロポレーション
プロトプラストを５℃、８５×ｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを１０ｍＭＨＥＰＥＳ、８０ｍＭＮａＣｌ、０．０４ｍＭＣａＣｌ_２、０．４Ｍマンニトールから成る氷冷エレクトロポレーションバッファー（ｐＨ５．７、マンニトールを用いて５４０ｍＯｓｍ／Ｋｇに調節した）中に、最終濃度が１×１０^６個／ｍＬとなるよう再懸濁する。プロトプラストは手順の間中氷上に維持する。０．４ｃｍ幅のエレクトロポレーションキュベットに、４．５ｎｍｏｌのｓｓ変異原性核酸塩基及び７００μＬのプロトプラスト懸濁液を添加する。ＰＣモジュール及びＣＥモジュールを備えるBioradのＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸＣｅｌｌエレクトロポレーションシステムを用いて、以下のパラメータに従って細胞懸濁液に単一の減衰（exponential decay）パルスを送達する：
電界強度５００Ｖ／ｃｍ
静電容量９５０μＦ
これらの条件下で、試料の抵抗は約３０オームであり、得られる時定数は約３０ｍｓである。これらのパラメータを、エレクトロポレーションの２４時間後にタバコプロトプラストにおいて最高レベルのＧＦＰの一時的発現を与えるパラメータとして選択した。パルスを加えた後、プロトプラストをキュベットにおいて室温で３０分間回復させる。次いでプロトプラストを１ｍＬのＴ_０培養培地に回収し、１０ｍＬ容の試験管に移す。キュベットをさらに５ｍＬのＴ_０培養培地で洗浄し、プロトプラスト懸濁液と共にプールする。十分に且つ穏やかに混合した後、５０μｇ／ｍＬのセフォタキシム及び５０μｇ／ｍＬのバンコマイシンを添加し、１．２５ｍＬのプロトプラスト懸濁液を３５ｍｍペトリ皿に移す。等量のＴ_０アガロース培地を添加し、混合物を穏やかにホモジナイズする。試料を暗所、２５℃でインキュベートし、さらに下記に記載されるように培養する。

プロトプラスト培養
１０日間の培養の後、アガローススラブを６等分し、２０ｎＭクロルスルフロンを添加した２２．５ｍＬのＭＡＰ１ＡＯ培地を含有するペトリ皿に移す。この培地は、９５０ｍｇのＫＮＯ_３、８２５ｍｇのＮＨ_４ＮＯ_３、２２０ｍｇのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１８５ｍｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、８５ｍｇのＫＨ_２ＰＯ_４、２７．８５ｍｇのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３７．２５ｍｇのＮａ_２ＥＤＴＡ・２Ｈ_２Ｏ、元の濃度の１０分の１のムラシゲ−スクーグ培地（Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962）による主要栄養素、モレル−ウェットモア培地（Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer. J. Bot. 38: 138-40, 1951）によるビタミン、６ｍｇのピルビン酸塩、各１２ｍｇのリンゴ酸、フマル酸及びクエン酸、３％（ｗ／ｖ）スクロース、６％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０３ｍｇのナフタレン酢酸、並びに０．１ｍｇの６−ベンジルアミノプリンから成るものであった（１Ｌ当たり、ｐＨ５．７）。試料を微光下、２５℃で６週間〜８週間インキュベートする。次いで成長中のカルスをＭＡＰ１培地に移し、さらに２週間〜３週間発生させる。ＭＡＰ１培地はＭＡＰ１ＡＯ培地と同じ組成を有するが、６％ではなく３％（ｗ／ｖ）のマンニトール、及び４６．２ｍｇ／ｌのヒスチジンを含む（ｐＨ５．７）。ＭＡＰ１培地は０．８％（ｗ／ｖ）Ｄｉｆｃｏアガーを用いて凝固させた。カルスを次に滅菌鉗子を用いてＲＰ培地に移す。ＲＰ培地は、２７３ｍｇのＫＮＯ_３、４１６ｍｇのＣａ（ＮＯ_３）_２・４Ｈ_２Ｏ、３９２ｍｇのＭｇ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ、５７ｍｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２３３ｍｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２７１ｍｇのＫＨ_２ＰＯ_４、２７．８５ｍｇのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３７．２５ｍｇのＮａ_２ＥＤＴＡ・２Ｈ_２Ｏ、公開された濃度の５分の１のムラシゲ−スクーグ培地による主要栄養素、モレル−ウェットモア培地（Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer. J. Bot. 38: 138-40, 1951）によるビタミン、０．０５％（ｗ／ｖ）スクロース、１．８％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．２５ｍｇのゼアチン、及び４１ｎＭクロルスルフロンから成り（１Ｌ当たり、ｐＨ５．７）、０．８％（ｗ／ｖ）Ｄｉｆｃｏアガーを用いて凝固させてある。２週間〜３週間後、成熟した芽を発根培地に移す。

ｓｓ変異原性核酸塩基
全てのｓｓ変異原性核酸塩基は、Eurogentec（Seraing，Belgium）により合成されたものであり、逆相ＨＰＬＣにより精製し、滅菌ミリＱ水中に再懸濁した。使用の前に、ｓｓ変異原性核酸塩基を９５℃まで５分間加熱した。ｓｓ変異原性核酸塩基０６Ｑ２６２は、単一のミスマッチ（下線を引いたヌクレオチド）をタバコＡＬＳ遺伝子（アクセッション番号：Ｘ０７６４４）のコドン位置Ｐ１９４に導入するよう設計したものであり、ＣＣＡからＣＡＡ（Ｐ１９４Ｑ）への変換をもたらし得る。ｓｓ変異原性核酸塩基０６Ｑ２６１は、タバコＡＬＳ遺伝子配列と完全に一致し、陰性対照とされる。ｓｓ変異原性核酸塩基０６Ｑ２６３は、４０個のヌクレオチドのランダムな組み合わせから成り、陰性対照とされる。

０６Ｑ２６１５’−ＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧ［配列番号１］
０６Ｑ２６２５’−ＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧ［配列番号２］
０６Ｑ２６３５’−ＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧ［配列番号３］

各処理によるプロトプラスト生存率
ＰＥＧ形質転換及びエレクトロポレーションの両方の後のプロトプラスト生存率を、形質転換の２４時間後に、蛍光生体染色色素フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）を用いてエステラーゼ活性により評価する。アセトン中５ｍｇ／ｍＬの原液ＦＤＡ２μＬを、１ｍＬの形質転換プロトプラストに添加する。全集団のうち蛍光プロトプラストの割合を血球計算器を用いて計数する。ＧＦＰＬＰ（ＥＸ４８０／４０、ＤＭ５０５、ＢＡ５１０）フィルターセットを備える、NikonのＥｃｌｉｐｓｅＥ６００正立落射蛍光顕微鏡を用いて観察を行なう。１００Ｗの超高圧水銀ランプによって励起が行なわれる。NIS Elementの画像取得／分析ソフトウェアを実行するＰＣに取り付けたＤＳ−Ｕ１コントローラに接続されたＤＳ−２ＭＢＷｃＣＣＤカメラを用いて画像を取得する。

結果
ＰＥＧ形質転換及びエレクトロポレーションの両方を用いた形質転換の結果の概要を表１に示す。ＰＥＧ形質転換を用いた場合、プロトプラスト生存率はエレクトロポレーションと比較して有意に高い。エレクトロポレーション自体の性質は、ＰＥＧ形質転換よりもプロトプラスト生存率に対する悪影響が大きく、ＰＥＧ形質転換ははるかに高い回復／生存率と共により高い標的化突然変異誘発効率をもたらす。標的化突然変異誘発効率は、クロルスルフロン存在下でのプロトプラストのインキュベーションの後、スコア付けする。

^＊＊回収されたプロトプラスト集団のうち、ＦＤＡ染色後の蛍光プロトプラストの百分率として表す。

結果は３回の独立した反復試験の平均±ＳＤである。

ＡＬＳのＰＣＲ増幅及びシークエンシング：
クロルスルフロン抵抗性タバコ微小コロニーからＤＮＡをＤＮｅａｓｙキット（Qiagen）を用いて単離し、ＰＣＲ反応において鋳型として使用する。タバコＡＬＳ遺伝子における標的コドンの変換を、この遺伝子のコドン１９４を含む７７６ｂｐの断片を増幅するプライマー５’−ＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＧＴＡＧＧＡＴ［配列番号４］及び５’−ＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣ［配列番号５］を用いて検出する。除草剤抵抗性タバコカルスにおけるヌクレオチド変換を、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１：：ＴＯＰＯ（Invitrogen）にクローニングし、且つ個々のプラスミドをシークエンシングすることにより確認する。タバコは２つのＡＬＳの対立遺伝子（ＳｕｒＡ及びＳｕｒＢ）を含有する。これらの遺伝子座のいずれかのＰ１９４コドンでのヌクレオチド変換は、クロルスルフロンに対する抵抗性を付与するのに十分である。タバコは異質四倍体種であるため、タバコにおいてはＴＮＥが起こり得る潜在的標的は８つ存在する。これを踏まえると、ＣＣＡからＣＡＡへの変換を有する遺伝子を検出するためには、ＰＣＲ産物を含有するプラスミドクローンを１０個超シークエンシングすることが必要であった。このことから、各々の抵抗性カルスにおいて、８つのＡＬＳ対立遺伝子のうち１つしか標的化突然変異誘発介在ヌクレオチド変換を受けなかったことが示唆される。このＡＬＳのＰＣＲ増幅及びシークエンシングによる研究において作製した全てのカルスについては、期待されるＣＣＡからＣＡＡへのヌクレオチド変換が観察された。

Claims

植物細胞プロトプラストにおける二本鎖アクセプタＤＮＡ配列の標的化改変の方法であって、前記二本鎖アクセプタＤＮＡ配列をドナー一本鎖変異原性核酸塩基と合わせることを含み、前記二本鎖アクセプタＤＮＡ配列が、第１のＤＮＡ配列と前記第１のＤＮＡ配列に相補的な第２のＤＮＡ配列とを含有し、前記ドナー一本鎖変異原性核酸塩基が、改変される前記二本鎖アクセプタＤＮＡ配列に関して少なくとも１つのミスマッチを含み、且つ該方法が前記ドナー一本鎖変異原性核酸塩基を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在形質転換を用いて前記細胞プロトプラストに導入する工程をさらに含むことを特徴とする方法。
請求項１に記載の方法において、前記ドナー一本鎖変異原性核酸塩基は、１０−６０ヌクレオチド長の長さを有することを特徴とする方法。
請求項１又は２に記載の方法において、前記一本鎖変異原性核酸塩基が、前記標的ミスマッチから少なくとも１ヌクレオチド離間したＬＮＡを含むことを特徴とすることを方法。
請求項３に記載の方法において、前記ＬＮＡは、さらに、前記一本鎖変異原性核酸塩基の５’末端及び３’末端から少なくとも３ヌクレオチド離間していることを特徴とする方法。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法において、前記変異原性核酸塩基がプロピンを含むことを特徴とする方法。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法において、前記二本鎖アクセプタＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡ、線状ＤＮＡ、哺乳類人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体ＤＮＡ、オルガネラ染色体ＤＮＡ、及びエピソームＤＮＡのいずれかに由来することを特徴とする方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法において、前記方法は、細胞を改変すること、野生型への回復により突然変異を修復すること、突然変異を誘発すること、コード領域の破壊により酵素を不活性化すること、コード領域の改変により酵素の生物活性を変更すること、コード領域の破壊によりタンパク質を修飾することの内のいずれかを目的とすることを特徴とする方法。
植物、植物細胞、植物カルス、及び植物芽の内から選択されたいずれかの産物を生産する方法であって、
前記生産方法は、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を実行することで、二重鎖アクセプタＤＮＡ配列を標的化改変した植物細胞プロトプラストを得ることを含み、さらに、前記植物細胞プロトプラストから前記産物を再生することを含むことを特徴とする方法。