JP7182545B2 - 熱安定性ｃａｓ９ヌクレアーゼ - Google Patents

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Description

本発明は、遺伝子工学の分野に関し、さらに詳細には核酸編集およびゲノム改変に関する。本発明は、遺伝物質の配列依存部位特異的結合、ニッキング、切断および改変のために構成することができるヌクレアーゼ；その上、遺伝物質の配列特異的部位に活性、特にヌクレアーゼ活性を働かせるリボ核タンパク質、ならびにマーカーとして使用するための修飾ヌクレアーゼおよびリボ核タンパク質の形態での遺伝子工学ツールに関する。したがって、本発明は、細胞内でのヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの送達および発現のための関連発現構築物にも関する。さらに、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの核酸の配列特異的編集およびそれを達成するのに使用される方法に関する。本発明が関係する特定の分野は、好熱性生物、特に微生物の遺伝子操作である。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓが多くの細菌および大半の古細菌での適応免疫系であることは２００７年に初めて実証された（Barrangou et al., 2007, Science 315: 1709-1712）、Brouns et al., 2008, Science 321: 960-964）。機能的および構造的判断基準に基づいて、３種類のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系がこれまで特徴付けられており、その大半が相補的ＤＮＡ配列を標的にするためのガイドとして小型ＲＮＡ分子を使用している（Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbiol 9: 467-477；Van der Oost et al., 2014, Nat Rev Microbiol 12: 479-492）。
Ｄｏｕｄｎａ／Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ研究室による最近の研究では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（Ｃａｓ９）のエフェクター酵素の徹底的な特徴付けが実施され、設計されたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイド（特異的スペーサー配列を有する）の導入によりプラスミド上の相補的配列（プロトスペーサー）が標的にされ、このプラスミドの二本鎖切断が引き起こされることが実証された（Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821）。Jinek et al., 2012に続いて、Ｃａｓ９はゲノム編集のためのツールとして使用される。
Ｃａｓ９は様々な真核細胞（例えば、魚、植物、ヒト）のゲノムを操作するのに使用されてきた（Charpentier and Doudna, 2013, Nature 495: 50-51）。
さらに、Ｃａｓ９は、特定の組換え事象を選び出すことにより細菌での相同組換えの収率を改善するのに使用されてきた（Jiang et al., 2013, Nature Biotechnol 31: 233-239）。これを達成するためには、毒性断片（ターゲティング構築物）に所望の変化をもつレスキュー断片（編集構築物、点突然変異または欠失を有する）を共トランスフェクトする。ターゲティング構築物は、デザインＣＲＩＳＰＲと組み合わせたＣａｓ９および宿主染色体上で所望の組換え部位を規定する抗生物質耐性マーカーからなり、対応する抗生物質の存在下では宿主染色体でのターゲティング構築物の組込みが選択される。ＣＲＩＳＰＲ標的部位を有する編集構築物の追加の組換えが宿主染色体で起こる場合のみ、宿主は自己免疫問題から逃れることが可能である。したがって、抗生物質の存在下では、所望の（マーカーなし）突然変異体のみが生き延びて成長することができる。染色体から組み込まれたターゲティング構築物のその後の除去を選ぶ関連戦略も提起されており、本物のマーカーなし突然変異体を生み出している。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ媒介ゲノム編集は遺伝子工学のための有用なツールを成すことが近年確立された。原核生物ＣＲＩＳＰＲ系が適応免疫系としてその宿主に役立ち（Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821）、迅速で効果的な遺伝子工学のために使用することが可能であり（例えば、Mali et al., 2013, Nat Methods 10:957-963）、目的の配列を標的にするためにはガイド配列の改変のみが必要であることが確立されている。
しかし、遺伝子研究およびゲノム編集の分野での応用のために種々の実験条件下で改良された配列特異的核酸検出、切断および操作ができる作用因子の開発の必要性が続けて存在している。特に、Ｃａｓ９を含む現在利用可能な配列特異的ゲノム編集ツールは、あらゆる条件または生物での使用に適用可能なわけではなく、例えば、配列特異的ヌクレアーゼは相対的に熱感受性であり、したがって、厳密に好熱性の微生物（４１℃と１２２℃の間で成長することができ、最適には４５℃超から８０℃の温度範囲で成長し、超好熱菌は８０℃より上で最適成長できる）、例えば、工業用発酵においてまたは高温で行われるｉｎ ｖｉｔｒｏ実験工程のために使用される微生物での使用には適用可能ではない。
好熱菌において活性Ｃａｓ９タンパク質についての実験的証拠は現在まで存在しない。細菌におけるＣａｓ９の存在下でのChylinski et al. (2014; Nucleic Acids Research 42: 6091-6105)による比較ゲノムスクリーニングに基づいて、ＩＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系はすべての細菌ゲノムのおおよそ３．３％に存在するだけであることが見出された。好熱性細菌のなかで、ＩＩ型系は統計分析（Ｐ＝０．００１９）に基づいて過小に見積もられている。さらに、古細菌ではＩＩ型系は見出されていないが、これはおそらく古細菌にはリボヌクレアーゼＩＩＩタンパク質（ＩＩ型系に関与する）が存在しないせいであろう。Chylinski, et al., (2014; Nucleic Acids Research 42: 6091-6105)は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の分類および進化を過去に報告しており、特に、これらの系を示す２つの種が同定されているが、これらの種は最大５５℃で成長し、最適成長温度が６０～８０℃であり、超好熱菌では８０℃より上で最適に成長できる厳密に好熱性の成長を示してはいない。
細菌ゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の希少性、特に、Ｃａｓ９が最適成長温度が４５℃よりも低い細菌（古細菌ではない）でしか見つかっていないという事実にもかかわらず、本発明者らは、驚くべきことに、ゲノム編集を高温で実行するのを可能にするいくつかの熱安定性Ｃａｓ９変異体を発見した。発明者はまた、高温を含めた、幅広い範囲の温度にわたるゲノム編集の実施を可能にする、熱安定性Ｃａｓ９変異体と共に働く、最適化プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を発見した。関連ＰＡＭ配列の認識により設計された、これらのＣａｓ９ヌクレアーゼおよびＲＮＡ分子は、高温での遺伝子工学のための新規のツールとなり、好熱性生物、特に微生物の遺伝子操作に特に価値がある。
したがって、本発明は、
ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含む、単離されたＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質またはポリペプチドを提供する。
本開示は以下の［１］から［９１］を含む。
［１］標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変するための、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質の使用であって、
上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、上記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、
上記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有し、
上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子が、上記標的配列を認識し、
上記非標的核酸鎖が、上記プロトスペーサー核酸配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含む、使用。
［２］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［１］に記載の使用。
［３］上記標的核酸配列を含む上記ポリヌクレオチドが上記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは、上記切断がＤＮＡ切断である、上記［１］または上記［２］に記載の使用。
［４］上記標的配列を含む上記標的核酸鎖が二本鎖ＤＮＡであり、上記使用が、上記標的核酸配列を含む上記ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［１］から［３］のいずれかに記載の使用。
［５］上記標的核酸配列を含む上記ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記使用が上記ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、上記［１］または上記［２］に記載の使用。
［６］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＣＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＣＮ－３’、および／または５’－ＮＣＮＮＣＮＮ－３’を含む、上記［１］から［５］のいずれかに記載の使用。
［７］上記ＰＡＭ配列が５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］を含み、好ましくは上記ＰＡＭ配列が５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］を含む、上記［１］から［６］のいずれかに記載の使用。
［８］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［１］から［７］のいずれかに記載の使用。
［９］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［１］から［８］のいずれかに記載の使用。
［１０］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［１］から［９］のいずれかに記載の使用。
［１１］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［１］から［１０］のいずれかに記載の使用。
［１２］上記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の使用。
［１３］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［１］から［１２］のいずれかに記載の使用。
［１４］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［１］から［１３］のいずれかに記載の使用。
［１５］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［１３］または上記［１４］に記載の使用。
［１６］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［１３］から［１５］のいずれかに記載の使用。
［１７］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［１６］に記載の使用。
［１８］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［１６］または上記［１７］に記載の使用。
［１９］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［１６］から［１８］のいずれかに記載の使用。
［２０］二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する方法であって、上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸を含み、
上記方法が、
ａ．少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を設計するステップであって、上記ターゲティングＲＮＡ分子が、上記標的鎖の上記標的配列を認識し、上記非標的鎖が、上記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含む、ステップ、
ｂ．上記ターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体を形成するステップであって、上記単離Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、ステップ、および
ｃ．上記リボ核タンパク質複合体が、上記標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する、ステップ
を含む方法。
［２１］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［２０］に記載の方法。
［２２］上記標的核酸配列を含む上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが上記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは上記切断がＤＮＡ切断である、上記［２０］または上記［２１］に記載の方法。
［２３］上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記使用が、上記ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［２０］から［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］上記標的核酸配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が、上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記方法が、上記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、上記［２０］または上記［２１］に記載の方法。
［２５］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＣＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＣＮ－３’、および／または５’－ＮＣＮＮＣＮＮ－３’を含む、上記［２０］から［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］上記ＰＡＭ配列が５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］を含み、好ましくは上記ＰＡＭ配列が５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］を含む、上記［２０］から［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［２０］から［２６］のいずれかに記載の使用。
［２８］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［２０］から［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［２０］から［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［２０］から［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］上記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、上記［２０］から［３０］のいずれかに記載の方法。
［３２］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［２０］から［３１］のいずれかに記載の方法。
［３３］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［２０］から［３２］のいずれかに記載の方法。
［３４］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［３２］または上記［３３］に記載の方法。
［３５］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［３２］から［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［３５］に記載の方法。
［３７］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［３５］または上記［３６］に記載の方法。
［３８］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［３５］から［３７］のいずれかに記載の方法。
［３９］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、上記改変が、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断である、上記［１６］に記載の使用または上記［３５］に記載の方法。
［４０］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、上記結合、切断、標識または改変が、遺伝子発現の改変をもたらす、上記［１６］に記載の使用、または上記［３５］に記載の方法。
［４１］上記結合、切断、標識または改変が、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる、上記［１６］に記載の使用、または上記［３５］に記載の方法。
［４２］上記結合、切断、標識または改変が、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入をもたらし、かつ／または上記結合、切断、標識または改変が、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現をもたらす、上記［１］から［４］、［６］から［１９］、もしくは［３９］のいずれかに記載の使用、または上記［２０］から［２３］、［２５］から［３９］のいずれかに記載の方法。
［４３］標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドを有する形質転換細胞であって、上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、上記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、上記細胞が、
配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質、
上記標的核酸鎖中の上記標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子であって、上記非標的鎖が、上記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、上記ＰＡＭ配列が５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含む、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、および
少なくとも１つの上記Ｃａｓタンパク質および上記ターゲティングＲＮＡ分子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、形質転換細胞。
［４４］上記Ｃａｓタンパク質および上記ターゲティングＲＮＡ分子により、上記細胞中の上記標的ポリヌクレオチドの結合、切断、標識または改変が可能になり、上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［４３］に記載の形質転換細胞。
［４５］上記標的核酸配列を含む上記標的核酸鎖がＣａｓタンパク質により切断され、好ましくは上記切断がＤＮＡ切断である、上記［４３］または上記［４４］に記載の形質転換細胞。
［４６］上記標的配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記結合、切断、標識または改変が、上記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［４３］から［４５］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［４７］上記標的核酸配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が、上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記結合、切断、標識または改変が、上記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、上記［４３］または上記［４４］に記載の形質転換細胞。
［４８］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＣＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＣＮ－３’、および／または５’－ＮＣＮＮＣＮＮ－３’を含む、上記［４３］から［４７］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［４９］上記ＰＡＭ配列が５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］を含み、好ましくは上記ＰＡＭ配列が５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］を含む、上記［４３］から［４８］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５０］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［４３］から［４９］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５１］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［４３］から［５０］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５２］上記細胞が原核細胞である、上記［４３］から［５１］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５３］上記細胞が真核細胞である、上記［４３］から［５１］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５４］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［４３］から［５３］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５５］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［４３］から［５４］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５６］上記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、上記［４３］から［５５］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５７］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［４３］から［５６］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５８］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［４３］から［５７］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５９］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／またはＣ終端に、好ましくはＮ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［５７］または上記［５８］に記載の形質転換細胞。
［６０］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［５７］から［５９］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６１］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［６０］に記載の形質転換細胞。
［６２］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［５７］から［６１］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６３］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［５７］から［６１］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６４］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、上記改変が、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断である、上記［５７］から［６２］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６５］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、上記結合、切断、標識または改変が、遺伝子発現の改変をもたらす、上記［５７］から［６１］のいずれかに記載の形質転換細胞、または上記［３５］に記載の方法。
［６６］上記Ｃａｓタンパク質が、発現ベクターから発現される、上記［５７］から［６２］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６７］上記結合、切断、標識または改変が、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入をもたらし、かつ／または上記結合、切断、標識または改変が、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現をもたらす、上記［４３］から［６６］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６８］Ｃａｓタンパク質、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、および上記標的ポリヌクレオチドを含む、核タンパク質複合体であって、
上記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有し、
上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、上記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、ならびに上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列および上記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む非標的核酸鎖を含み、上記ＰＡＭ配列が５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含む、核タンパク質複合体。
［６９］２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で発生する、上記［６８］に記載の核タンパク質複合体。
［７０］上記標的核酸配列を含む上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが上記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは上記切断がＤＮＡ切断である、上記［６８］または上記［６９］に記載の核タンパク質複合体。
［７１］上記標的配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記結合、切断、標識または改変が、上記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［６８］から［７０］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［７２］上記標的核酸配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が、上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記核タンパク質複合体が存在することにより、上記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングがもたらされる、上記［６８］または上記［６９］に記載の核タンパク質複合体。
［７３］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＣＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＣＮ－３’、および／または５’－ＮＣＮＮＣＮＮ－３’を含む、上記［６８］から［７２］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［７４］上記ＰＡＭ配列が５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］を含み、好ましくは上記ＰＡＭ配列が５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］を含む、上記［６８］から［７３］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［７５］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［６８］から［７４］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［７６］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［６８］から［７５］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［７７］原核細胞中である、上記［６８］から［７６］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［７８］真核細胞中である、上記［６８］から［７６］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［７９］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［６８］から［７８］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８０］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［６８］から［７９］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８１］上記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、上記［６８］から［８０］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８２］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［６８］から［８１］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８３］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［６８］から［８２］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８４］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［８２］または上記［８３］に記載の核タンパク質複合体。
［８５］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［８２］から［８４］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８６］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［８５］に記載の核タンパク質複合体。
［８７］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［８２］から［８６］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８８］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［８２］から［８６］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８９］上記核酸がｄｓＤＮＡであり、上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、上記標的ポリヌクレオチドが、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断を有する、上記［８２］から［８７］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９０］上記核酸がｄｓＤＮＡであり、上記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、上記核タンパク質複合体形成により、遺伝子発現の改変がもたらされる、上記［８２］から［８６］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９１］上記核タンパク質形成により、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入がもたらされ、かつ／または上記核タンパク質複合体形成により、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現がもたらされる、上記［６８］から［９０］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
本発明の状況でのポリペプチドは、完全長Ｃａｓタンパク質の断片と見なしてもよい。そのような断片は不活性であり、遺伝物質の結合、編集および／または切断と直接関連のない方法でおよび目的のために、例えば、アッセイでの標準または抗体を産生するなどのために使用してもよい。
しかし、好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、およびターゲティングＲＮＡ分子により認識される標的核酸配列を含むポリヌクレオチドと会合すると、２０℃から１００℃までの範囲の温度で機能的であり、切断、結合、標識または改変することができる。好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、機能的であり、５０℃から７０℃までの範囲の温度、例えば５５℃または６０℃で、前記切断、結合、標識または改変が可能である。
特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］を含むＣａｓタンパク質またはポリペプチドを提供することができる。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドはアミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）をさらに含んでいてもよい。
他の実施形態では、本明細書で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドはアミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）を追加でさらに含んでいてもよい。
他の実施形態では、本明細書で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドはアミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）を追加でさらに含んでいてもよい。
他の実施形態では、本明細書で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドはアミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）を追加でさらに含んでいてもよい。
本発明に従えば、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは配列番号２から６のモチーフのうちのいずれでも、単独でまたは組み合わせて含むことができることが認識されうる。以下は、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドを特徴付けることができるモチーフの組合せのそれぞれを要約している。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
Ｘ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
Ｘ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
Ｘ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
Ｘ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する単離されたＣａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片を提供する。好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、２０℃から１００℃までの範囲の温度で、結合、切断、標識または改変が可能である。好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、５０℃と７０℃の間の範囲の温度、例えば５５℃または６０℃で、前記切断、結合、標識または改変が可能である。好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、３０℃と８０℃の間の範囲の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で、前記切断、結合、標識または改変が可能である。
本発明はまた、標的核酸配列を含む標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変するための、本明細書で提供されるターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドの使用を提供する。ターゲティングＲＮＡ分子は、ポリヌクレオチドの標的核酸鎖上の標的核酸配列を認識する。
標的核酸配列を含む標的ポリヌクレオチドは、二本鎖であってもよく、したがって、前記標的核酸配列を含む標的核酸配列鎖、およびプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含む。プロトスペーサー核酸配列は、この標的核酸配列に実質的に相補的であり、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて、それと対合する。非標的核酸鎖は、プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含むことができる。このＰＡＭ配列は、長さが少なくとも６つ、７つまたは８つの核酸とすることができる。好ましくは、ＰＡＭ配列は、５位にシトシンを有する。好ましくは、ＰＡＭ配列は、配列５’－ＮＮＮＮＣ－３’を含み、したがって、ＰＡＭ配列は、５’末端から、５’－ＮＮＮＮＣ－３’が始まる。さらにまたは代替的に、ＰＡＭ配列は、８位にアデニンを有することができ、したがってＰＡＭ配列は、配列５’－ＮＮＮＮＮＮＮＡ－３’を含み、ＰＡＭ配列は、５’末端から、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＡ－３’が始まる。さらにまたは代替的に、ＰＡＭ配列は、１位、２位、３位、４位および６位のうちの１つまたは複数にシトシンを有してもよく、こうして、ＰＡＭ配列は、５’末端から、５’－ＣＮＮＮＮ－３’、５’－ＮＣＮＮＮ－３’、５’－ＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＣＮ－３’および／または５’－ＮＮＮＮＮＣ－３’が始まる。好ましくは、ＰＡＭ配列は、ＰＡＭ配列が、５’末端から、５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］から始まるように含み、さらに好ましくは、ＰＡＭ配列は、５’末端から、ＰＡＭ配列が５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］で始まるように含む。他の好ましいＰＡＭ配列は、５’－ＡＴＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号２１］および５’－ＡＣＧＧＣＣＡＡ－３’［配列番号２２］を含む。
好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、４０℃から８０℃までの範囲、好ましくは４５℃から８０℃までの範囲、さらに好ましくは５０℃から８０℃までの範囲の温度で、結合、切断、標識または改変することができる。例えば、結合、切断、標識または改変は、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃または８０℃の温度で行われる。より好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、５５から６５℃までの範囲の温度で、結合、切断、標識または改変が可能である。好ましい態様では、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片は、配列番号１に対して少なくとも７５％の同一性；好ましくは少なくとも８５％；より好ましくは少なくとも９０％；さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性のアミノ酸配列を含むことができる。
Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、標的核酸鎖上の標的核酸配列を認識するターゲティングＲＮＡ分子と組み合わせて使用することができ、非標的核酸配列は、本明細書に開示される通り、非標的鎖上のプロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するＰＡＭ配列を有する。したがって、ＰＡＭ配列は、配列５’－ＮＮＮＮＣ－３’を含むことができ、Ｃａｓタンパク質は、２０℃から１００℃までの範囲、好ましくは３０℃から９０℃までの範囲、３７℃から７８℃までの範囲、４０℃から８０℃までの範囲、５０℃から７０℃までの範囲、または５５℃から６５℃までの範囲の温度で、標的鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変することができる。好ましくは、５’末端から、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＮＮＣ－３’で始まり、Ｃａｓタンパク質は、２０℃から１００℃までの範囲、好ましくは３０℃から９０℃までの範囲、３７℃から７８℃までの範囲、４０℃から８０℃までの範囲、５０℃から７０℃までの範囲、または５５℃から６５℃までの範囲の温度で、標的鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変することができる。好ましくは、５’末端から、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＡ－３’で始まり、Ｃａｓタンパク質は、２０℃から１００℃までの範囲、好ましくは３０℃から９０℃までの範囲、３７℃から７８℃までの範囲、４０℃から８０℃までの範囲、５０℃から７０℃までの範囲、または５５℃から６５℃までの範囲の温度で、標的鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変することができる。さらに好ましくは、ＰＡＭ配列の５’末端は、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’で始まり、Ｃａｓタンパク質は、２０℃から１００℃までの範囲、好ましくは３０℃から９０℃までの範囲、３７℃から７８℃までの範囲、４０℃から８０℃までの範囲、５０℃から７０℃までの範囲、または５５℃から６５℃までの範囲の温度で、標的鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変することができる。
さらに詳細には、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、配列番号１と以下の通り：少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または少なくとも９９．８％のパーセント同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。パーセント同一性は、少なくとも８９％とすることができる。パーセント同一性は、少なくとも９０％とすることができる。好ましくは、パーセント同一性は、少なくとも９５％、例えば９８％となろう。
配列番号１とのパーセントアミノ酸配列同一性は、２つの配列の最適整列のために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れて、選択された比較窓において配列により共有されている同一の位置の数の関数として決定可能である。
本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片は、基準配列の配列番号１とパーセント配列同一性により定義されるその任意の前述のパーセント変異体の両方の点から、単独でまたは本質的特徴としての前述のアミノ酸モチーフ（すなわち、配列番号２および／または３および／または４および／または５および／または６）のいずれかと組み合わせて、特徴付けることができる。
本発明は、標的核酸配列を含む標的核酸鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変するための、本明細書で提供されるターゲティングＲＮＡ分子、および本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドの使用を提供する。好ましくは、前記結合、切断、標識または改変は、本明細書に開示される温度で、例えば２０と１００℃の間の温度で行われる。本発明はまた、本明細書で提供されるターゲティングＲＮＡ分子の設計、ならびに本発明のターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドを含むリボ核タンパク質複合体の形成を含む標的核酸鎖中の標的核酸配列に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する方法を提供する。好ましくは、標的核酸配列のリボ核タンパク質複合体結合、切断、標識または改変は、本明細書に開示される温度で、例えば３７と１００℃の間の温度で行われる。
本発明の使用および方法を行うことができ、本発明の核タンパク質は、例えば細菌細胞において、ｉｎ ｖｉｖｏで、形成して使用される。代替として、本発明の使用および方法を行うことができ、本発明の核タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、形成して使用される。本発明のＣａｓタンパク質は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する場合、またはトランスフェクションにより細胞に添加する場合、単離形態で提供されてもよく、Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸によって細胞の一過性または安定的な転換後に、非相同的に発現されてもよく、ターゲティングＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードする核酸によって細胞の一過性または安定的な転換後に、発現ベクターから転写されてもよく、かつ／またはＲＮＡ分子は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用した場合、またはトランスフェクションにより細胞に添加する場合、単離形態で提供されてもよい。好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドが、宿主細胞のゲノムにおいて、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸の安定な統合後に、宿主細胞のゲノムから発現される。したがって、Ｃａｓタンパク質および／またはＲＮＡ分子は、そうでなければ存在しない、細胞にタンパク質または核酸分子を加えるための人為的または意図的方法のいずれかを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの環境に加えることができる。
標的核酸配列を含むポリヌクレオチドは、Ｃａｓタンパク質によって切断することができ、任意選択で、切断は、ＤＮＡ切断とすることができる。標的配列を含む標的核酸鎖は、二本鎖ＤＮＡとすることができ、本方法または使用は、標的核酸配列を含むポリヌクレオチドにおける二本鎖切断をもたらすことができる。標的核酸配列を含むポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡとすることができ、Ｃａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠いてもよく、その使用または方法は、ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらすことができる。
Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドを本方法、使用、および本発明の核タンパク質を、２５０ｎＭ以下の濃度で、例えば２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下の濃度で提供することができる。代替的に、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも０．５ｎＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２５ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１５０ｎＭ、少なくとも２００ｎＭまたは少なくとも２５０ｎＭの濃度で提供することができる。本発明のＰＡＭ配列は、８位にアデニンを有することができ、したがって、ＰＡＭ配列は、配列５’－ＮＮＮＮＮＮＮＡ－３’を含み、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドの濃度は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．５ｎＭ以下とすることができる。ＰＡＭ配列は、配列５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’を含むことができ、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドの濃度は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．５ｎＭ以下とすることができる。ＰＡＭ配列は、配列５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］を含むことができ、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドの濃度は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．５ｎＭ以下とすることができる。
その上、本発明は本発明の前述のタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸を提供する。核酸は単離されていても発現構築物の形態であってもよい。
本発明のすべての前述の態様では、アミノ酸残基は保存的にも非保存的にも置換されていてよい。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似する化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって、得られるポリペプチドの機能的特性を変化させないアミノ酸置換のことである。
同様に、核酸配列がポリペプチドの機能に影響を与えずに保存的にも非保存的にも置換されうることは当業者であれば認識している。保存的に改変された核酸とは、アミノ酸配列の同一のまたは機能的に同一の変異体をコードする核酸で置換された核酸のことである。核酸のそれぞれのコドン（ＡＵＧおよびＵＧＧを除く；典型的にはそれぞれメチオニンまたはトリプトファンの唯一のコドン）は改変して機能的に同一の分子を生じることが可能であることは当業者であれば認識している。したがって、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのそれぞれのサイレント変異（すなわち、同義コドン）は、本発明のポリペプチドをコードし、それぞれの記載されているポリペプチド配列に潜在的に含まれている。
本発明は、二本鎖標的ポリヌクレオチドに標的核酸配列を有する形質転換細胞を提供し、前記細胞は、本明細書で提供されるＣａｓタンパク質またはポリペプチド、および本明細書で提供される少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を含み、発現ベクターは、前記Ｃａｓタンパク質および前記ターゲティングＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つをコードする核酸を含む。Ｃａｓタンパク質およびターゲティングＲＮＡ分子により、高温で、または、例えば本明細書に開示される３７と１００℃の間の温度の範囲の形質転換細胞において、標的配列の結合、切断、標識または改変を行うことが可能となり得る、またはこれらを許容することができる。本発明は、１）本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および本発明のターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを細胞に形質転換、トランスフェクトまたは形質導入する、ステップ；または２）本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびさらには本発明のターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターを細胞に形質転換、トランスフェクトまたは形質導入する、ステップ；または３）本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、および本発明において提供されているターゲティングＲＮＡ分子を細胞にまたは細部内に送達する発現ベクターを細胞に形質転換、トランスフェクトまたは形質導入する、ステップのいずれかを含む、細胞中における標的核酸に結合する、それを切断する、標識するまたは改変する方法をさらに提供する。Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、例えば、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のゲノムへの安定な統合後に、形質転換細胞のゲノムから発現することができる。
本発明はまた、本発明の使用および方法を行うため、または本発明の形質転換細胞もしくは核タンパク質複合体を生成するための、１種または複数の試薬を含むキットであって、本発明のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、または本発明のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクター；および／または本発明のターゲティングＲＮＡ分子、もしくは本発明のターゲティングＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む、キットを提供する。本キットは、本発明を行うための指示書、例えば、本発明により、ターゲティングＲＮＡ分子を設計する方法に関する指示書をさらに含むことができる。
ＲＮＡガイドおよび標的配列
本発明のＣａｓタンパク質は、高温での標的核酸の配列特異的結合、切断、タグ付け、標識付けまたは改変を可能にする。標的核酸は、ＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）でもＲＮＡでも合成核酸でもよい。本発明の特に有用な応用は、ゲノムＤＮＡの標的配列に相補的に結合する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合した本発明の１つまたは複数のＣａｓタンパク質によるゲノムＤＮＡの配列特異的ターゲティングおよび改変である。したがって、標的核酸は好ましくは二本鎖ＤＮＡである。そのようなターゲティングはｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも実施することができる。好ましくは、そのようなターゲティングはｉｎ ｖｉｖｏで実施される。この方法で、本発明のＣａｓタンパク質を使用して細胞のゲノムＤＮＡに位置する特定のＤＮＡ配列を標的にして改変することができる。Ｃａｓ系を使用して、異なる生物の種々の細胞型でおよび／または異なる生物でゲノムを改変することができることが想定されている。
ターゲティングＲＮＡ分子とも呼ばれるｇＲＮＡは、ポリヌクレオチド標的鎖上の標的核酸配列を認識する。ＲＮＡ分子はまた、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおける標的配列を認識するよう設計され得、非標的鎖は、プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドを用いて、最適な方法で働くＰＡＭ配列が本明細書に開示される。これらのＰＡＭ配列の認識により、ｇＲＮＡは、本発明の温度範囲および高い温度にわたり、本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドとの使用のために設計することができる。
したがって、本発明は、上文に記載される本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドを含み、標的ポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列を認識するという点でターゲティング機能を有する少なくとも１つのＲＮＡ分子をさらに含むリボ核タンパク質複合体を提供する。本発明はまた、標的核酸鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変するための、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドの使用、および本発明のリボ核タンパク質または核タンパク質、およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドおよびターゲティングＲＮＡ分子を有する形質転換細胞を使用する、標的核酸鎖の標的核酸配列に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるＰＡＭ配列により、プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接する、規定されたＰＡＭ配列をさらに含むことができる。このＰＡＭ配列は、長さが６、７または８またはそれより長い、好ましくは長さが８の核酸とすることができる。好ましくは、ＲＮＡ分子は、一本鎖ＲＮＡ分子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり、例えば、ハイブリダイゼーションによりｔｒａｃｒＲＮＡと会合する。ターゲティングＲＮＡはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡのキメラでもよい。前述のＲＮＡ分子は、標的ヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性、または相補性のリボヌクレオチド配列を有することができる。任意選択で、ＲＮＡ分子は、標的ヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性または相補性のリボヌクレオチド配列を有する。好ましい標的ヌクレオチド配列はＤＮＡである。
好ましい態様では、本発明は、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子が標的ＤＮＡ配列にその長さに沿って実質的に相補的である、上文に記載されるリボ核タンパク質複合体を提供する。
ターゲティングＲＮＡ分子は、核タンパク質複合体内の標的配列に結合し得るまたはこれと会合することができ、その結果、非標的鎖上の標的配列およびＰＡＭ配列を含む標的ポリヌクレオチドは、本発明の核タンパク質複合体と会合し、その結果、本発明の核タンパク質複合体の一部を形成することができる。
したがって、本発明のＣａｓタンパク質と会合するＲＮＡガイドの配列を変化させると、Ｃａｓタンパク質をガイドＲＮＡに相補的である部位で二本鎖ＤＮＡを標識または切断するようプログラムすることが可能になる。
好ましくは、本発明のリボ核タンパク質複合体中の少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さは、３５から１３５残基の範囲、任意選択で、３５から１３４残基、３５から１３３残基、３５から１３２残基、３５から１３１残基、３５から１３０残基、３５から１２９残基、３５から１２８残基、３５から１２７残基、３５から１２６残基、３５から１２５残基、３５から１２４残基、３５から１２３残基、３５から１２２残基、３５から１２１残基、３５から１２０残基、３５から１１９残基、３５から１１８残基、３５から１１７残基、３５から１１６残基、３５から１１５残基、３５から１１４残基、３５から１１３残基、３５から１１２残基、３５から１１１残基、３５から１００残基、３５から１０９残基、３５から１０８残基、３５から１０７残基、３５から１０６残基、３５から１０５残基、３５から１０４残基、３５から１０３残基、３５から１０２残基、３５から１０１残基、３５から１００残基、３５から９９残基、３５から９８残基、３５から９７残基、３５から９６残基、３５から９５残基、３５から９４残基、３５から９３残基、３５から９２残基、３５から９１残基、３５から９０残基、３５から８９残基、３５から８８残基、３５から８７残基、３５から８６残基、３５から８５残基、３５から８４残基、３５から８３残基、３５から８２残基、３５から８１残基、３５から８０残基、３５から７９残基、３５から７８残基、３５から７７残基、３５から７６残基、３５から７５残基、３５から７４残基、３５から７３残基、３５から７２残基、３５から７１残基、３５から７０残基、３５から６９残基、３５から６８残基、３５から６７残基、３５から６６残基、３５から６５残基、３５から６４残基、３５から６３残基、３５から６２残基、３５から６１残基、３５から６０残基、３５から５９残基、３５から５８残基、３５から５７残基、３５から５６残基、３５から５５残基、３５から５４残基、３５から５３残基、３５から５２残基、３５から５１残基、３５から５０残基、３５から４９残基、３５から４８残基、３５から４７残基、３５から４６残基、３５から４５残基、３５から４４残基、３５から４３残基、３５から４２残基、３５から４１残基、３５から４０残基、３５から３９残基、３５から３８残基、３５から３７残基、３５から３６残基、または３５残基の範囲である。好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡ分子の長さは、３６から１７４残基、３７から１７３残基、３８から１７２残基、３９から１７１残基、４０から１７０残基、４１から１６９残基、４２から１６８残基、４３から１６７残基、４４から１６６残基、４５から１６５残基、４６から１６４残基、４７から１６３残基、４８から１６２残基、４９から１６１残基、５０から１６０残基、５１から１５９残基、５２から１５８残基、５３から１５７残基、５４から１５６残基、３６から７４残基、３７から７３残基、３８から７２残基、３９から７１残基、４０から７０残基、４１から６９残基、４２から６８残基、４３から６７残基、４４から６６残基、４５から６５残基、４６から６４残基、４７から６３残基、４８から６２残基、４９から６１残基、５０から６０残基、５１から５９残基、５２から５８残基、５３から５７残基、５４から５６残基の範囲である。
好ましい態様では、本発明は、少なくとも１つのＲＮＡ分子の相補的部分が少なくとも３０残基長である、リボ核タンパク質複合体を提供する。代わりに、少なくとも１つのＲＮＡ分子の相補的部分は、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５残基長でもよい。
ターゲティングＲＮＡ分子は、好ましくは、標的核酸配列に対する高い特異性および親和性を必要とすることになる。未変性ゲル電気泳動、または代わりに等温滴定熱量測定、表面プラズモン共鳴、もしくは蛍光ベースの滴定法により決定することができる場合、１μＭから１ｐＭ、好ましくは１ｎＭから１ｐＭ、より好ましくは１～１００ｐＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）が望ましい。親和性は、ゲル遅延度アッセイとも呼ばれる電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して決定してもよい（Semenova et al. (2011) PNAS 108: 10098-10103参照）。
ターゲティングＲＮＡ分子は、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子として原核生物の性質から分かっていることに合わせて作られる。ｃｒＲＮＡ分子の構造はすでに確立されており、Jore et al., 2011, Nature Structural & Molecular Biology 18: 529-537でさらに詳細に説明されている。手短に言えば、Ｉ－Ｅ型の成熟ｃｒＲＮＡは、多くの場合、６１ヌクレオチド長であり、８ヌクレオチドの５’「ハンドル」領域、３２ヌクレオチドの「スペーサー」配列、およびテトラヌクレオチドループを有するヘアピンを形成する２１ヌクレオチドの３’配列からなる（図５）。Ｉ型系はＩＩ型（Ｃａｓ９）とは異なり、異なる系の詳細はVan der Oost 2014 Nat Rev Micr 12: 479-492に記載されている。ＩＩ型（Ｃａｓ９）系には異なるプロセシング機構が存在しており、第２のＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）および２つのリボヌクレアーゼを利用している。ヘアピンよりはむしろ、ＩＩ型中の成熟ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡの断片に結合したままである（図５）。しかし、本発明で使用されるＲＮＡは、長さであれ、領域であれまたは特定のＲＮＡ配列であれ、天然に存在するｃｒＲＮＡの設計に厳密に合わせて設計する必要はない。しかし、明白なのは、本発明で使用するためのＲＮＡ分子は、公開データベース中のまたは新たに発見された遺伝子配列情報に基づいて設計され、次に、例えば、化学合成により全体をまたは部分を人工的に作ってもよいことである。本発明のＲＮＡ分子は、遺伝的に改変された細胞または無細胞発現系での発現のために設計および作製されてもよく、この選択肢にはＲＮＡ配列の一部または全部の合成が含まれてもよい。
ＩＩ型（Ｃａｓ９）中のｃｒＲＮＡの構造および必要条件もJinek et al., 2012 ibidに記載されている。Ｉ型には、スペーサー配列の５’末端を形成し、そこの５’で８ヌクレオチドの５’ハンドルと隣接しているいわゆる「シード（SEED）」部分が存在する。Semenova et al. (2011, PNAS 108: 10098-10103)は、シード配列のすべての残基が標的配列に相補的であるはずであるが、６位の残基ではミスマッチが許容されうることを見出した（図５）。ＩＩ型には、スペーサーの３’末端に位置している１０～１２ヌクレオチドのシードが存在する（図５）（Van der Oost 2014 ibid.により概説されている）。同様に、標的遺伝子座（すなわち、配列）に向けられている本発明のリボ核タンパク質複合体のＲＮＡ成分を設計し作る場合、ＩＩ型シード配列についての必要なマッチおよびミスマッチルールを適用することが可能である。
したがって、本発明は、標的核酸分子において単一塩基変化を検出するおよび／または位置付ける方法であって、核酸試料を上文に記載される本発明のリボ核タンパク質複合体と、または上文に記載される本発明のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチドおよび別のターゲティングＲＮＡ成分と接触させることを含み、ターゲティングＲＮＡの配列（リボ核タンパク質複合体中にある場合を含めて）は、例えば、８ヌクレオチド残基の連続する配列の６位での単一塩基変化に基づいて正常対立遺伝子と突然変異対立遺伝子を区別するようになっている、方法を含む。
特定の理論に縛られたくはないが、本発明のリボ核タンパク質複合体のターゲティングＲＮＡ成分の調製に使用してもよいデザインルールは、二本鎖標的ポリヌクレオチドにいわゆる「ＰＡＭ」（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を含む。大腸菌（E. coli）のＩ－Ｅ型系において、ＰＡＭ配列は、５’－ＣＴＴ－３’、５’－ＣＡＴ－３’、５’－ＣＣＴ－３’、５’－ＣＡＣ－３’、５’－ＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴ－３’、および５’－ＡＷＧ－３’などのヌクレオチド残基の保存されたトリプレットとすることができ、ＷはＡ、ＴまたはＵである。Ｉ型では、標的鎖に位置しているＰＡＭ配列は、通常、シードの５’に対応する位置にある。しかし、ＩＩ型では、ＰＡＭは、シードの３’に対応する位置で、ｃｒＲＮＡスペーサーの３’末端に近い置換または非標的鎖上のもう一方の末端に位置している（図５）（Jinek et al., 2012, op. cit.）。化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９では、ＰＡＭ配列は保存された対のヌクレオチド残基、５’－ＮＧＧ－３’を有する。最近、異なるＣａｓ９変異体（ＩＩＡ型およびＩＩＣ型）（Ran et al., 2015 Nature 520:186-191）－図１Ａ）が特徴付けられ、ＰＡＭが明らかにされた（Ran et al., 2015, ibid.参照－図１Ｃ）。現在確立されているＣａｓ９ ＰＡＭは、ＩＩＡ型５’－ＮＧＧＮＮＮＮ－３’（化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes））、５’－ＮＮＧＴＮＮＮ－３’（ストレプトコッカス・パスツリアヌス（Streptococcus pasteurianus））、５’－ＮＮＧＧＡＡＮ－３’（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus））、５’－ＮＮＧＧＧＮＮ－３’（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））、およびＩＩＣ型５’－ＮＧＧＮＮＮＮ－３’（ジフテリア菌（Corynebacterium difteriae））、５’－ＮＮＧＧＧＴＮ－３’（カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari））、５’－ＮＮＮＣＡＴＮ－３’（パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvobaculum lavamentivorans））、５’－ＮＮＮＮＧＴＡ－３’（ナイセリア・シネレア（Neiseria cinerea））を含む。ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２のＣａｓ９（本発明）はＩＩＣ型に属する（Ran et al., 2015, ibid.）。本発明者は、驚くべきことに、本発明により使用するためのＰＡＭ配列の選択により、本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドが標的配列と相互作用する温度に、影響を及ぼすことができるということを見いだした。特に、本発明者は、標的配列の３’末端の後の５位にシトシン、および／または８位にアデニンを有する、８ｍｅｒのＰＡＭ配列が、幅広い温度範囲にわたり、活性を付与するのに好ましいことを見いだした。プロトスペーサー配列の３’末端の後の、ＰＡＭ配列の１位、２位、３位、４位および／または６位にシトシンが存在することがやはり好ましい。
本発明の実施形態では、ターゲティングＲＮＡ分子は３５～２００残基の範囲の長さを有していてもよい。好ましい実施形態では、ＲＮＡのうち所望の核酸配列に相補的であり、これを標的にするために使用される部分は１５から３２残基長である。天然に存在するｃｒＲＮＡの文脈では、これは、例えば、Semenova et al. (2011 ibid.)の図１に示されているスペーサー部分と一致する。
本発明のリボ核タンパク質複合体は、ＤＮＡ標的配列に実質的な相補性を有するＲＮＡ配列の５’にＣＲＩＳＰＲ繰り返しに由来する８残基を含むターゲティング成分を有していてもよい。ＤＮＡ標的配列に相補性を有するＲＮＡ配列は、スペーサー配列であるｃｒＲＮＡの文脈で一致すると理解される。ＲＮＡの５’隣接配列は、例えば、Semenova et al. (2011 ibid.)の図１に示されているように、ｃｒＲＮＡの５’ハンドルに一致すると見なされるであろう。
本発明のリボ核タンパク質複合体は、ＤＮＡ標的配列に相補性を有するターゲティングＲＮＡ配列の３’に、すなわち、例えば、Semenova et al. (2011 ibid.)の図１に示されているように、ｃｒＲＮＡ中のスペーサー配列に隣接する３’ハンドルに一致するものの３’にヘアピンおよびテトラヌクレオチドループ形成配列を有していてもよい。
特定の理論に縛られたくはないが、好ましいリボ核タンパク質複合体および二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて、リボ核タンパク質複合体のターゲティングＲＮＡと対合しない非標的核酸鎖は、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＣＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＣＮ－３’および５’－ＮＣＮＮＣＮＮ－３’のうちの１つまたは複数から選択される、直接３’隣接ＰＡＭ配列を含むことができる。好ましくは、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＮＮＣ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＮＣ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＣＮＮＣ－３’、５’－ＮＣＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＣＮＣ－３’、５’－ＮＮＣＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＣＣ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＣ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＣＮＡ－３’、５’－ＣＣＮＮＣ－３’、５’－ＣＣＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＣＮＣ－３’、５’－ＣＮＣＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＣＣＮ－３’、５’－ＣＮＮＣＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＣ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＣＮＡ－３’、５’－ＣＣＣＮＣＮ－３’、５’－ＣＣＣＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＣＮＣＣＮ－３’、５’－ＣＣＮＣＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＣＮＮＣＣ－３’、５’－ＣＣＮＮＣＣＮＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣ－３’［配列番号１２］、５’－ＣＣＣＣＣＮＮＡ－３’［配列番号１３］、５’－ＣＣＣＣＣＣ－３’［配列番号１４］、５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］、５’－ＮＣＣＮＣ－３’、５’－ＮＣＣＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＣＣＣＣ－３’、５’－ＮＣＣＣＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＣＣＣＣＣ－３’［配列番号１５］、５’－ＮＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１６］、５’－ＮＮＣＣＣ－３’、５’－ＮＮＣＣＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＣＣＣＣ－３’、５’－ＮＮＣＣＣＣＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＣ－３’、および５’－ＮＮＮＣＣＣＮＡ－３’から選択することができる。ＰＡＭ配列は、５’－ＣＮＣＣＣＣＡＣ－３’［配列番号１７］、５’－ＣＣＣＣＣＣＡＧ－３’［配列番号１８］、５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］、５’－ＣＣＣＣＣＣＡＴ－３’［配列番号１９］、５’－ＣＣＣＣＣＣＡＣ－３’［配列番号２０］、５’－ＡＴＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号２１］、または５’－ＡＣＧＧＣＣＡＡ－３’［配列番号２２］とすることができる。好ましくは、ＰＡＭ配列は、配列５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’となろう。しかし、ヌクレオチドの他の組合せを所望の用途、および／またはＣａｓタンパク質もしくはポリペプチドの濃度に応じて使用してもよいことは認識されている。これらの配列は、天然に存在するｃｒＲＮＡの文脈で「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」と呼ばれているものと一致している。ＩＩＣ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、これらのＰＡＭ配列は、天然系標的でも、したがって好ましくは本発明に従ったＲＮＡでも、標的配列に対するｃｒＲＮＡの高度な特異性を保証するために、そのｄｓＤＮＡ標的とのＣａｓｃａｄｅ／ｃｒＲＮＡ複合体の安定な相互作用を促進する。好ましくは、プロトスペーサーに直接隣接する配列は、５’－ＮＮＮＣＡＴＮ－３’ではないであろう。
本明細書で提供される本発明のＰＡＭ配列は、例えば、６ｍｅｒ、７ｍｅｒまたは８ｍｅｒの配列として、本明細書に開示される配列を含む。６ｍｅｒ、７ｍｅｒまたは８ｍｅｒの配列は、非標的鎖上のプロトスペーサー配列の３’で直接、始まってもよく、標的ＲＮＡにより結合したプロトスペーサー配列に相補的なプロトスペーサー配列と、ＰＡＭ配列の５’末端との間に間隔を置いた追加の核酸は存在しない。しかし、６ｍｅｒ、７ｍｅｒまたは８ｍｅｒの配列の３’末端における、ＰＡＭ配列の部分を形成する追加の核酸が存在してもよいことが認識されよう。さらにまたは代替的に、非標的鎖は、ＰＡＭ配列の追加の核酸３’を含むことができる。
本発明の核タンパク質複合体は、本発明のリボ核タンパク質複合体、および該リボ核タンパク質が会合する核酸の標的核酸鎖を含むことができる。
結合、切断、標識および改変の温度
活性、例えば本発明のＣａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性の最適温度範囲を含めた、温度範囲は、既知のＣａｓ９タンパク質の温度範囲よりもかなり高い。同様に、活性を維持する範囲の高い側の程度は、既知のＣａｓ９タンパク質のそれよりもかなり高い。最適温度および機能範囲がより高いことにより、高温での遺伝子工学、したがって、例えば、好熱性生物のゲノムの編集に大きな利点をもたらし、この多くは、高温で行われる工業的、農業的および医薬品過程の範囲において利用性を有する。したがって、本発明の方法、使用、核タンパク質および形質転換細胞は、工業的過程、例えば、代謝操作目的のためのゲノム編集の実現に有用となり得る。非標的鎖のプロトスペーサー配列に直接隣接する本発明のＰＡＭ配列が存在することにより、標的配列に対するＣａｓタンパク質およびポリペプチドの特異性が改善され、より高い温度において、およびより大きな機能的温度範囲にわたり、Ｃａｓタンパク質およびポリペプチドの使用を支持する。
有利には、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、２０℃から１００℃までの温度で、核酸の結合、切断、標識または改変が可能であるが、高温で、例えば、４１℃と１２２℃の間の温度、好ましくは５０℃と１００℃の間の温度で、特に有用である。本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび合成核酸に結合する、これを切断する、標識するまたは改変することが可能である。本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、例えば、２０℃から５０℃までの範囲の温度で、ヌクレアーゼ活性、遺伝子編集および核酸標識の用途に関する操作性をやはり実現することができる。
温度範囲が、本明細書に含まれている場合、開示されている温度範囲に端点が含まれる、すなわちこの範囲を「含む」ことが意図される。例えば、２０℃と１００℃の間の範囲の温度で活性があると明記する場合、２０℃と１００℃の温度が、前記範囲に含まれる。
好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、結合される、切断される、標識されるまたは改変されるポリヌクレオチド分子の標的配列を認識する、好適なｇＲＮＡ（ターゲティングＲＮＡ分子とも呼ばれる、ガイドＲＮＡ）と会合する場合、５０℃から１００℃、任意選択で５５℃から１００℃、６０℃から１００℃、６５℃から１００℃、７０℃から１００℃、７５℃から１００℃、８０℃から１００℃、８５℃から１００℃、９０℃から１００℃、９５℃から１００℃の範囲の温度において、上記のことが行われる。より好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、５１℃から９９℃、５２℃から９８℃、５３℃から９７℃、５４℃から９６℃、５５℃から９５℃、５６℃から９４℃、５７℃から９３℃、５８℃から９２℃、５９℃から９１℃、６０℃から９０℃、６１℃から８９℃、６２℃から８８℃、６３℃から８７℃、６４℃から８６℃、６５℃から８５℃、６６℃から８４℃、６７℃から８３℃、６８℃から８２℃、６９℃から８１℃、７０℃から８０℃、７１℃から７９℃、７２℃から７８℃、７３℃から７７℃、７４℃から７６℃の範囲の温度で、または７５℃の温度において、核酸を切断、標識または改変する。好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、６０℃から８０℃、６１℃から７９℃、６２℃から７８℃、６３℃から７７℃、６４℃から７６℃、６０℃から７５℃、６０℃から７０℃の範囲の温度で、核酸に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する。最適には、本発明のＣａｓタンパク質は、６０℃から６５℃の範囲の温度で、好ましくは６５℃で核酸に結合する、核酸を切断する、標識するまたは改変する。
標的ＲＮＡ分子は、本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドと共に使用するよう設計することができ、標的ＲＮＡ分子は、標的鎖における標的配列に結合し、非標的鎖は、プロトスペーサー配列の直後の３’の本明細書に提供されるＰＡＭ配列をさらに含む。ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＡ－３’、好ましくは５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’、例えば５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］または５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］を含み、本発明の使用、方法、形質転換細胞および核タンパク質は、５５℃から６５℃の温度範囲、好ましくは５０℃から７０℃、４０℃から６５℃、４５℃から７５℃、３７℃から７８℃、および／または２０℃から８０℃の温度範囲にわたる、標的鎖への結合、この切断、標識および／または改変を実現することができる。
本発明のすべての態様において、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、細菌、古細菌またはウイルスから得ることができるか、もしくはこれらに由来することができ、または代替として、ｄｅ ｎｏｖｏで合成されてもよい。好ましい実施形態では、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、好熱性原核生物に由来し、これらの生物は、古細菌または細菌として分類することができるが、好ましくは細菌である。より好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、好熱性細菌に由来する。本明細書において、好熱性という用語は、比較的高い温度で、生存および成長することが可能である、例えば、本発明の文脈では、４１と１２２℃（１０６と２５２°Ｆ）の間の温度で、核酸の切断、結合または改変を行うことができるという意味として理解されるべきである。好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、１つまたは複数の好熱性細菌から単離されてもよく、６０℃超で機能するであろう。好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、１つまたは複数の好熱性細菌から単離されてもよく、６０℃から８０℃の範囲で、最適には６０℃と６５℃の間で機能するであろう。好ましい実施形態では、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、ゲオバチルス（Geobacillus）属種に由来する。より好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）に由来する。さらにより好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２に由来する。本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、ウイルスに由来することができる。
機能的部分
有利なことに、任意のポリヌクレオチド配列を配列特異的に標的にする本発明のＣａｓタンパク質、ポリペプチドおよびリボ核タンパク質複合体の能力は、何らかの方法で、例えば、標的核酸を切断および／または標識および／または修飾することにより、標的核酸を改変するために利用することができる。したがって、これを達成するためにはＣａｓタンパク質またはポリペプチドと共に追加のタンパク質を提供してもよいことが認識されよう。したがって、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つの機能的部分をさらに含んでもよく、かつ／または本発明のＣａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体は、少なくとも１つのさらなるタンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供されてもよい。好ましい態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質または少なくとも１つのさらなるタンパク質が少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体を提供する。少なくとも１つの機能的部分は、Ｃａｓタンパク質に融合または連結していてもよい。好ましくは、少なくとも１つの機能的部分は、天然のまたは人工的タンパク質発現系での発現を通じてＣａｓタンパク質に翻訳によって融合してもよい。代わりに、少なくとも１つの機能的部分は、化学合成ステップによりＣａｓタンパク質に共有結合によって連結してもよい。好ましくは、少なくとも１つの機能的部分は、Ｃａｓタンパク質のＮ終端および／またはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している。
少なくとも１つの機能的部分はタンパク質であることが望ましい。タンパク質は、異種タンパク質であってもよく、または代わりにＣａｓタンパク質が由来した細菌種に固有であってもよい。少なくとも１つの機能的部分はタンパク質であってもよく、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択されうる。
特に好ましい態様では、本発明は、少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質、例えば、ＧＦＰである、Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体を提供する。
ヌクレアーゼ活性
本発明のＣａｓリボ核タンパク質は、本明細書にて開示される温度で、好ましくは高温で、例えば、５０℃と１００℃の間の温度で、核酸結合、切断、標識または改変活性を有する。本発明のリボ核タンパク質は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成核酸に結合する、これを切断する、標識する、または改変することが可能となり得る。好ましい態様では、本発明のＣａｓリボ核タンパク質は、ＤＮＡを、特に二本鎖ＤＮＡを配列特異的に切断することができる。
本発明のＣａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質は、１つよりも多いヌクレアーゼドメインを有してもよい。部位特異的ヌクレアーゼは、ＤＮＡの鎖に沿って選択された位置で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることができる。標的宿主細胞では、これによりゲノム内の特定の前選択した位置でＤＳＢを作ることができる。部位特異的ヌクレアーゼによるそのような切断の作製に促されて、目的のゲノム内の所望の位置でＤＮＡを挿入、欠失または改変するために内在性細胞修復機構が別の目的で利用される。
タンパク質またはポリペプチド分子の１つまたは複数のヌクレアーゼ活性部位は、例えば、タンパク質またはポリペプチドに連結または融合している別の機能的部分、例えば、ＦｏｋIヌクレアーゼなどのヌクレアーゼドメインの活性を可能にするように不活化され得る。
したがって、本発明のＣａｓタンパク質、ポリペプチドおよびリボ核タンパク質がある特定の応用のために内在性ヌクレアーゼ活性を有する場合があるにもかかわらず、Ｃａｓタンパク質の天然のヌクレアーゼ活性を不活化し、天然のＣａｓ９ヌクレアーゼ活性が不活化されＣａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結しているＣａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体を提供するのが望ましい場合がある。天然のＣａｓ９ヌクレアーゼ活性の相補性によるミスターゲティング事象の発生率を減らすことは１つのそのような応用である。これは、望ましくは、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体の天然のＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活化させ、好ましくはＣａｓタンパク質に融合している、異種ヌクレアーゼを提供することにより達成することもできる。したがって、本発明は、少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体を提供する。特に好ましい態様では、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合している本発明のＣａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体は、好ましくは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合している本発明の別のＣａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体を含み、２つの複合体が標的ゲノムＤＮＡの反対の鎖を標的にする、タンパク質複合体の一部として提供される。
いくつかの応用では、例えば、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体が核酸中の特定の標的配列を認識し改変する、例えば、その標的配列を診断検査の一部として標識するのに利用する応用では、Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質のヌクレアーゼ活性を完全に減弱させるのが望ましい場合がある。そのような応用では、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性は不活化されてもよく、Ｃａｓタンパク質に融合している機能的部分はタンパク質でもよく、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択されうる。
好ましい態様では、触媒として不活性な、またはヌクレアーゼ活性を欠く「死滅した」Ｃａｓタンパク質もしくはポリペプチド（ｄＣａｓ）は、標的核酸配列に結合することができ、それにより、その配列の活性を立体的に抑制する。例えば、遺伝子のプロモーターまたはエクソンの配列に相補的である標的ＲＮＡを設計することができ、その結果、遺伝子へのｄＣａｓおよび標的ＲＮＡの結合は、遺伝子配列の転写開始または伸長を立体的に抑制し、それにより、遺伝子の発現を抑制する。代替的に、本明細書に記載される方法および使用は、ニッカーゼであるｇｔＣａｓ９の改変ヌクレアーゼ変異体を使用することができる。ニッカーゼは、ＨＮＨまたはｇｔＣａｓ９ヌクレアーゼのＲｕｖＣ触媒ドメインの一方において変異により作製することができる。これは、それぞれ、不活性なＲｕｖＣまたはＨＮＨヌクレアーゼドメインを有する、ｓｐＣａｓ９－変異体Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを含む化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ）の場合に示される。これらの２つの変異を組み合わせることにより、触媒的に死滅したＣａｓ９変異体に至る（Standage-Beier, K. et al., 2015, ACS Synth. Biol. 4, 1217-1225；Jinek, M. et al., 2012, Science 337, 816-821；Xu, T. et al., 2015, Appl. Environ. Microbiol. 81, 4423-4431）。配列相同性に基づいて（図３）、これらの残基は、ｇｔＣａｓ９のＤ８（図３におけるＤ１７）およびＤ５８１またはＨ５８２（図３）とすることができる。
特に好ましい態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性が不活化され少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質、例えば、ＧＦＰである、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体を提供する。この方法で、目的の核酸配列を特異的に標的にし、光シグナルを発生させるマーカーを使用してその核酸配列を可視化することが可能になりうる。適切なマーカーは、例えば、蛍光レポータータンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）またはｍＣｈｅｒｒｙを含んでいてもよい。そのタンパク質の発現は蛍光測定により簡単に直接的にアッセイすることが可能なので、そのような蛍光レポーター遺伝子はタンパク質発現の可視化に適したマーカーを提供する。代わりに、レポーター核酸は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）など発光タンパク質をコードしてもよい。代わりに、レポーター遺伝子は、光シグナルを発生させるのに使用することが可能な発色酵素、例えば、発色酵素（ベータ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）またはベータ－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など）でもよい。発現の測定に使用されるレポーターは、抗原ペプチドタグでもよい。他のレポーターまたはマーカーは当技術分野では公知であり、必要に応じて使用してもよい。
マーカーは可視化することができるので、標的核酸がＲＮＡ、具体的にはｍＲＮＡであるある特定の実施形態では、特に、マーカーにより発生する光シグナルが発現産物の量に正比例している場合、マーカーにより発生する光シグナルの検出および定量化により遺伝子の転写活性を定量化することが可能でありうる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明のＣａｓタンパク質またはリボ核タンパク質を使用して、目的の遺伝子の発現産物をアッセイすることができる。
一態様では、本明細書に記載されるｇｔＣａｓ９は、微生物細胞における、相同組換え（ＨＲ）媒介性ゲノム改変方法で使用されてもよい。このような方法は、ＨＲおよび部位特異的ｇｔＣａｓ９活性を含み、これにより、対向選択は、ｇｔＣａｓ９活性が、ＨＲにより導入された所望の改変を有していない微生物を除去することにより行われる。
したがって、本明細書で提供される方法および使用により、第１の工程の間に好都合となる相同組換え方法が可能になり、こうして、微生物ゲノムは、所望の変異、および非改変細胞が、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によりターゲティングされて、非改変細胞のゲノムにＤＳＤＢを導入することができる第２の工程により改変することができる。大多数の微生物における効率的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の修復機構がないために、ＤＳＤＢは、通常、細胞死に至る。したがって、これらの方法および使用は、いずれの非改変微生物細胞を除去すると同時に、所望の変異を有する微生物細胞の集団全体を増大する。好ましくは、このような方法および使用は、実質的に、内因性ＮＨＥＪ修復機構を有していない微生物において使用される。代替的に、本方法および使用は、内因性ＮＨＥＪ修復機構を有する微生物に適用してもよい。本明細書に記載される方法および使用は、内因性ＮＨＥＪ修復機構を有する微生物に適用することができるが、この場合、ＮＨＥＪ修復機構は、条件付きで低下されるか、またはＮＨＥＪ活性がノックアウトされるかのどちらかとなる。
本明細書で提供される方法および使用は、ガイドＲＮＡと少なくとも１つのミスマッチを有する、相同組換えポリヌクレオチドの配列を利用することができ、こうして、ガイドＲＮＡは、改変ゲノムをもはや認識することができない。これは、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体が、改変ゲノムを認識しないことを意味する。したがって、ＤＳＤＢは、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によって導入することはできず、その結果、改変細胞は、生存することになろう。しかし、非改変ゲノムを有する細胞は、ガイドＲＮＡに対して実質的な相補性を依然として有しており、その結果、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体により部位特異的に切断され得る。
本発明の方法および使用の別の態様では、ｇｔＣａｓ９リボヌクレオアーゼ複合体が、微生物ゲノムを切断させる作用を防止する方法は、ガイドによって標的とされる配列を改変または除外することではなく、むしろ、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によって必要とされるＰＡＭを改変または除外することである。ＰＡＭは、特定の切断部位に対してｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体を結合させるために、改変または除去のどちらか一方が行われる。したがって、本発明の方法および使用は、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によって認識されるＰＡＭ配列を含まない、相同組換えポリヌクレオチドの配列を使用するものを含むことができる。したがって、ＤＳＤＢは、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によって導入することはできず、その結果、ＨＲ改変細胞は、生存することになろう。しかし、非修飾細胞は、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体およびそのガイドにより依然として認識され、その結果、部位特異的に切断される。
したがって、微生物のゲノムを改変するために、ＨＲに頼る方法および使用が、明細書において提供される。好ましくは、上流隣接部および下流隣接部は、長さが、それぞれ、０．５キロ塩基（ｋｂ）から１．０ｋｂである。しかし、それより長い断片またはそれより短い断片を使用する組換えが、同様に可能である。相同組換えポリヌクレオチドは、上流と下流の隣接領域との間にポリヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。このポリヌクレオチド配列は、例えば、微生物ゲノムに導入されることになる、改変を含むことができる。
相同組換えは、標的領域に対して実質的な相補性を有する、上流隣接部および下流領隣接部に依存する一方、ミスマッチも同様に収容可能である。したがって、一部の実施形態では、相同組換えは、上流隣接部および下流隣接部に対して広範な相同性を有する、ＤＮＡセグメント間に行われることが知られている。代替実施形態では、上流および下流隣接部は、標的領域に対して完全な相補性を有する。上流および下流隣接部は、サイズが同一である必要がない。しかし、一部の例では、上流および下流隣接部は、サイズが同一である。相同組換えの効率は、隣接部の最小断片長さの相同組換えの可能性に応じて様々となろう。しかし、相同組換え法が、非効率である場合でさえも、有利には、本明細書に記載される方法は、非改変微生物細胞よりも、所望の改変を有する任意の微生物細胞を選択することになろう。相同組換えにより、やはり、完全遺伝子クラスターを包含する大きな欠失（例えば、５０ｋｂ以上）を作製することが可能となる。相同組換えは組換えに使用され、これは、より小さな断片（４５～１００ｎｔ）に組換えを可能にする周知の方法である。本明細書に記載される方法および使用は、微生物ゲノムにおいて、標的を含有する第２の標的領域に実質的に相補的である配列を有する相同組換えポリヌクレオチドをコードする配列を含む、少なくとも別の相同組換えポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをさらに任意選択で含むことができる。
好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法および使用は、ＤＮＡである相同組換えポリヌクレオチドを利用する。一部の実施形態では、ＤＮＡは一本鎖である。他の実施形態では、ＤＮＡは二本鎖である。さらなる実施形態では、ＤＮＡは、二本鎖であり、プラスミド媒介性である。
本明細書で提供される方法および使用にＨＲを使用して、微生物ゲノムからポリヌクレオチド配列を除去することができる。代替的に、本明細書で提供される方法および使用におけるＨＲを使用して、微生物ゲノムに１つまたは複数の遺伝子またはその断片を挿入することができる。さらなる選択として、本明細書で提供される方法および使用においてＨＲを使用し、微生物ゲノムにおける少なくとも１つのヌクレオチドを改変、またはこれに置き換えることができる。これにより、本明細書で提供される方法および使用は、任意の所望の種類のゲノム改変に使用することができる。
代替的に、本明細書に記載されるｇｔＣａｓ９は、微生物細胞において、ＨＲ媒介性ゲノム改変方法に使用してもよく、それにより、ｇｔＣａｓ９活性により、ＤＳＤＢが導入され、ｓｐＣａｓ９に関して示されている通り、微生物細胞における細胞ＨＲを誘発することができる（Jiang et al. (2013) Nature Biotech, 31, 233-239；Xu et al. (2015) Appl Environ Microbiol, 81, 4423-4431；Huang et al. (2015) Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 47, 231-243）。
代替的に、相同組換えは、例えば、Ｍｏｕｇｉａｋｏｓらによって概説されている、ＲｅｃＴまたはベータプロテインをコードする遺伝子を発現する、微生物細胞にオリゴヌクレオチドを導入することによる組換えによって促進することができる（(2016), Trends Biotechnol. 34: 575-587）。さらなる実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｒｏｎｄａらにより例示されている、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＭＡＧＥ）と組み合わせることができる（(2016), Sci. Rep. 6: 19452.）。
初めから終わりまで、本発明のＣａｓタンパク質の基準配列は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列として定義することができる。例えば、配列番号２から６に定義されるモチーフのアミノ酸配列は、そのアミノ酸配列をコードするすべての核酸配列も含む。
したがって、本発明は、
ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含むＣａｓタンパク質であって、
少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、およびターゲティングＲＮＡ分子により認識される標的核酸配列を含むポリヌクレオチドと会合すると５０℃と１００℃の間でＤＮＡを結合、切断、標識または改変することができるＣａｓタンパク質をコードする単離された核酸分子も提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有するＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質をコードする単離された核酸分子も提供する。
別の態様では、本発明は、翻訳されるとＣａｓタンパク質に融合するペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む、単離された核酸分子も提供する。
別の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸分子に融合する少なくとも１つの核酸配列が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択されるタンパク質をコードする、単離された核酸分子も提供する。
発現ベクター
本発明の核酸は単離されていてもよい。しかし、核酸感知構築物の発現が選ばれた細胞で実行されうるように、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、好ましくは、発現構築物中に提供されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターの一部として提供されることになる。ある特定の実施形態では、本発明の発現ベクター（発現するとＣａｓタンパク質に融合するアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列ありまたはなしで）は、上文に定義されているターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。したがって、そのような発現ベクターを適切な宿主で使用して、所望のヌクレオチド配列を標的にすることが可能な本発明のリボ核タンパク質複合体を産生することができる。代わりに、上文に定義されるターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列は別の発現ベクターで提供してもよく、または代わりに他の手段によって標的細胞に送達してもよい。
適切な発現ベクターは受容細胞に応じて変化することになり、適宜、標的細胞での発現を可能にし、好ましくは高レベルの発現を促進する調節エレメントを組み込んでもよい。そのような調節配列は、例えば、開始、正確さ、速度、安定性、下流プロセシングおよび可動性の点で遺伝子または遺伝子産物の転写または翻訳に影響を与えることができてもよい。
そのようなエレメントは、例えば、強力なおよび／または構成プロモーター、５’および３’ＵＴＲ、転写および／または翻訳エンハンサー、転写因子またはタンパク質結合配列、開始部位および終結配列、リボソーム結合部位、組換え部位、ポリアデニル化配列、センスまたはアンチセンス配列、転写の正確な開始を確実にする配列ならびに任意選択で、宿主細胞における転写の終結および転写物安定化を確実にするポリＡシグナルを含んでいてもよい。調節配列は、植物、動物、細菌、真菌またはウイルス由来でもよく、好ましくは、宿主細胞と同じ生物に由来してもよい。適切な調節エレメントが目的の宿主細胞に応じて変化することになるのは明らかである。例えば、大腸菌（E.coli）などの原核宿主細胞で高レベルの発現を促進する調節エレメントはｐＬａｃ、Ｔ７、Ｐ（Ｂｌａ）、Ｐ（Ｃａｔ）、Ｐ（Ｋａｔ）、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターを含んでいてもよい。真核宿主細胞で高レベルの発現を促進する調節エレメントは、酵母ではＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモーターあるいは動物細胞ではＣＭＶもしくはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）ＶＩＰ１６転写活性化因子またはグロビンイントロンの包含を含んでいてもよい。植物では、構成的高レベルの発現は、例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターまたはカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターを使用して得ることができる。
適切な調節エレメントは構成的であってよく、この調節エレメントは大半の環境条件または発生段階、特異的もしくは誘導性の発生段階下で発現を指示する。好ましくは、プロモーターは誘導性であり、温度、光、化学物質、乾燥、および他の刺激などの環境的、化学的または発生的合図に応答して発現を指示する。適宜、特定の発生段階であるいは細胞外もしくは細胞内状態、シグナル、または外部から与えられる刺激に応答して目的のタンパク質の発現を可能にするプロモーターを選んでもよい。例えば、大腸菌（E.coli）で使用するための、特定の成長段階で（例えば、ｏｓｍＹ静止期プロモーター）または特定の刺激に応答して（例えば、ＨｔｐＧ熱ショックプロモーター）高レベルの発現を与える様々なプロモーターが存在する。
適切な発現ベクターは、適切な宿主細胞においておよび／または特定の条件下で前記ベクターの選択を可能にする選択可能マーカーをコードする追加の配列を含んでいてもよい。
本発明は、細胞中で標的核酸を改変する方法であって、細胞を上文に記載される発現ベクターのうちのいずれかでトランスフェクト、形質転換または形質導入することを含む方法も含む。トランスフェクション、形質転換または形質導入の方法は当業者には周知のタイプのものである。本発明のリボ核タンパク質複合体の発現を生み出すのに使用される１つの発現ベクターが存在する場合、およびターゲティングＲＮＡが細胞に直接添加される場合、トランスフェクション、形質転換または形質導入の同じまたは異なる方法を使用してもよい。同様に、本発明のリボ核タンパク質複合体の発現を生み出すのに使用される１つの発現ベクターが存在する場合、および別の発現ベクターが発現を介してターゲティングＲＮＡをｉｎ ｓｉｔｕで生み出すのに使用されている場合、トランスフェクション、形質転換または形質導入の同じまたは異なる方法を使用してもよい。
他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、細胞中でＣａｓｃａｄｅ複合体が発現されるように細胞内に導入される。Ｃａｓタンパク質複合体を所望の標的配列まで導くターゲティングＲＮＡも、ｍＲＮＡと同時でも、別々にでもまたは逐次でも、必要なリボ核タンパク質複合体が細胞中で形成されるように、細胞内に導入される。
したがって、本発明は、標的核酸を改変する、すなわち、切断、タグ付け、改変、標識または結合する方法であって、核酸を上文で定義されるリボ核タンパク質複合体と接触させることを含む方法も提供する。
さらに、本発明は標的核酸を改変する方法であって、核酸を、上文で定義されるターゲティングＲＮＡ分子に加えて、上文で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドと接触させることを含む方法も含む。
上記方法に従って、標的核酸の改変は、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでおよび無細胞環境で実行することができる。無細胞環境では、標的核酸、Ｃａｓタンパク質およびターゲティングＲＮＡ分子のそれぞれの添加は、同時でも、逐次でも（希望通りのいかなる順番でも）、または別々でもよい。したがって、標的核酸とターゲティングＲＮＡが反応混合物に同時に添加され、次に、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドが後の段階で別々に添加されることが可能である。
同様に、標的核酸の改変は、単離された細胞であれ多細胞組織、器官または生物の一部としてであれ、ｉｎ ｖｉｖｏ、すなわち、細胞中ｉｎ ｓｉｔｕで行うことができる。全組織および器官の文脈では、ならびに生物の文脈では、方法はｉｎ ｖｉｖｏで実行されるのが望ましい場合があり、または代わりに、全組織、器官もしくは生物から細胞を単離し、方法に従って細胞をリボ核タンパク質複合体で処理し、それに続いてリボ核タンパク質複合体で処理された細胞を、同じ生物内であれ異なる生物内であれ、その前の位置に、もしくは異なる位置に戻すことにより実行してもよい。
これらの実施形態では、リボ核タンパク質複合体またはＣａｓタンパク質もしくはポリペプチドは、細胞内への適切な形態の送達を必要とする。そのような適切な送達系および方法は当業者には周知であり、細胞質または核マイクロインジェクションを含むがこれらに限定されない。好ましい送達様式では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が使用され、この送達系はヒトでは病因性ではなく、欧州では臨床使用に承認されている。
したがって、本発明は標的核酸を改変する方法であって、核酸を、
ａ．上文で定義されるリボ核タンパク質複合体、または
ｂ．上文で定義されるタンパク質もしくはタンパク質複合体および上文で定義されるＲＮＡ分子
と接触させることを含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は細胞中で標的核酸を改変する方法であって、細胞を上文で定義されるリボ核タンパク質複合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入すること、または代わりに細胞を上文で定義されるタンパク質もしくはタンパク質複合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターおよび上文で定義されるターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入することを含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は細胞中で標的核酸を改変する方法であって、細胞を上文で定義されるタンパク質もしくはタンパク質複合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換、トランスフェクトまたは形質導入し、次いで上文で定義されるターゲティングＲＮＡ分子を細胞内に送達することを含む方法を提供する。
ガイド（すなわち、ターゲティング）ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドが、リボ核タンパク質複合体の一部としてというよりむしろ別々に提供される実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体と同時であれ、別々にであれ、逐次であれ、細胞内への適切な形態の送達を必要とする。ＲＮＡを細胞内に導入するそのような形態は当業者には周知であり、従来のトランスフェクション法を介したｉｎ ｖｉｔｒｏ（インビトロ）またはｅｘ ｖｉｖｏ（エキソビボ）送達を含んでもよい。マイクロインジェクションおよび電気穿孔法、ならびにカルシウム共沈、ならびに市販のカチオンポリマーおよび脂質、ならびに細胞透過性ペプチド、細胞透過性（微粒子銃）粒子などの物理的方法をそれぞれ使用してもよい。例えば、ウイルス、特に好ましくはＡＡＶを、例えば、本発明のＣａｓタンパク質複合体または本発明のリボ核タンパク質複合体のウイルス粒子への（可逆的）融合を介して、細胞質にであれおよび／または核にであれ送達媒体として使用してもよい。
別の態様では、本発明は標的核酸を改変する方法であって、少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質またはレポータータンパク質であり、マーカータンパク質またはレポータータンパク質が標的核酸と会合し、好ましくは、マーカーが蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、方法を提供する。
標的核酸を改変する上述の方法では、機能的部分はマーカーでもよく、マーカーは標的核酸と会合し、好ましくは、マーカーはタンパク質であり、任意選択で、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）またはｍＣｈｅｒｒｙである。ｉｎ ｖｉｔｒｏであれ、ｅｘ ｖｉｖｏであれ、またはｉｎ ｖｉｖｏであれ、本発明の方法を使用すれば、好ましくは、高次コイルのプラスミドもしくは染色体などの高次構造、またはｍＲＮＡなどの一本鎖標的核酸の形態で、核酸分子中の標的遺伝子座を直接可視化することが可能である。標的遺伝子座の直接可視化は電子顕微鏡写真、または蛍光顕微鏡法を使用してもよい。しかし、本発明の方法の文脈では、有機色素分子、放射性標識および小分子でもよいスピン標識を含む、他の種類の標識をマーカーとして使用してもよいことは認識される。
標的核酸がｄｓＤＮＡである標的核酸を改変するための本発明の方法では、機能的部分はヌクレアーゼでもヘリカーゼ－ヌクレアーゼでもよく、改変は好ましくは所望の遺伝子座での一本鎖または二本鎖切断である。この方法で、ＤＮＡの独特な配列特異的切断は、リボ核タンパク質複合体に融合している適切な機能的部分を使用することにより操作することが可能である。最終的なリボ核タンパク質複合体のＲＮＡ成分の選ばれた配列は、機能的部分の作用に対する所望の配列特異性を提供する。
したがって、本発明は、ｄｓＤＮＡ分子からヌクレオチド配列の少なくとも一部を取り除くための、任意選択で遺伝子（単数または複数）の機能をノックアウトするための、細胞中の所望の遺伝子座でのｄｓＤＮＡ分子の非相同末端結合の方法であって、上文に記載される標的核酸を改変する方法のうちのいずれかを使用して二本鎖切断を作ることを含む方法も提供する。
本発明は、既存のヌクレオチド配列を改変する、または所望のヌクレオチド配列を挿入するために、細胞中の所望の遺伝子座でｄｓＤＮＡ分子内に核酸を相同組換えする方法であって、上文に記載される標的核酸を改変する方法のうちのいずれかを使用して所望の遺伝子座で二本鎖切断を作ることを含む方法をさらに提供する。
したがって、本発明は、上文に記載される方法のうちのいずれかに従って標的核酸配列を改変することを含む、生物中で遺伝子発現を改変する方法であって、核酸がｄｓＤＮＡであり、機能的部分がＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性化因子または転写リプレッサーから選択される、方法も提供する。
本発明は、上文に記載される方法のうちのいずれかに従って標的核酸配列を改変することを含む、生物中で遺伝子発現を改変する方法であって、核酸がｍＲＮＡであり、機能的部分はリボヌクレアーゼであり、任意選択でエンドヌクレオアーゼ、３’エキソヌクレアーゼまたは５’エキソヌクレアーゼから選択される、方法をさらに提供する。
標的核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成核酸でもよい。好ましくは、標的核酸はＤＮＡ、好ましくはｄｓＤＮＡである。
しかし、標的核酸はＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡでも可能である。代わりに、したがって、本発明は、標的核酸を改変する方法であって、標的核酸がＲＮＡである、方法も提供する。
別の態様では、本発明は、標的核酸を改変する方法であって、核酸がｄｓＤＮＡであり、少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、改変が所望の遺伝子座での一本鎖または二本鎖切断である、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、細胞中で標的核酸を改変する方法であって、改変により所望の遺伝子座で遺伝子発現のサイレンシングが生じ、
ａ．ｄｓＤＮＡ分子で二本鎖切断を作るステップと、
ｂ．非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により細胞中でｄｓＤＮＡ分子を修復するステップと
を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、細胞中で標的核酸を改変する方法であって、既存のヌクレオチド配列が改変もしくは欠失され、および／または所望の位置で所望のヌクレオチド配列が挿入され、
ａ．所望の遺伝子座で二本鎖切断を作るステップと、
ｂ．相同組換えにより細胞中でｄｓＤＮＡ分子を修復するステップと
を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、上文に記載の標的核酸配列を改変することを含む、細胞中で遺伝子発現を改変する方法であって、核酸がｄｓＤＮＡであり、機能的部分がＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性化因子または転写リプレッサーから選択される、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、上文に記載の標的核酸配列を改変することを含む、細胞中で遺伝子発現を改変する方法であって、核酸がｍＲＮＡであり、機能的部分がリボヌクレアーゼであり、任意選択でエンドヌクレオアーゼ、３’エキソヌクレアーゼまたは５’エキソヌクレアーゼから選択される、方法を提供する。
別の態様では、本発明は上文に記載の標的核酸を改変する方法であって、４５℃と１００℃の間の温度で実行される方法を提供する。好ましくは、方法は５０℃でまたはそれよりも高い温度で実行される。より好ましくは、方法は５５℃と８０℃の間の温度で実行される。最適には、方法は６０℃と６５℃の間の温度で実行される。代替的に、本方法は、２０℃と４５℃の間の温度で行うことができる。より好ましくは、３０℃と４５℃の間の温度である。さらにより好ましくは、３７℃と４５℃の間の温度である。
上文に記載される標的核酸を改変する方法のうちのいずれにおいても、細胞は原核細胞でもよく、または代わりに真核細胞でもよい。
宿主細胞
有利なことに、本発明は広範な適用性があり、本発明の宿主細胞は、培養することが可能であるいかなる遺伝的に扱いやすい生物に由来してもよい。したがって、本発明は上文に記載される方法により形質転換される宿主細胞を提供する。本発明は、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおける標的核酸配列を有する形質転換細胞を提供し、前記細胞は、本明細書で提供されるＣａｓタンパク質またはポリペプチド、および本明細書で提供される少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を含み、発現ベクターは、前記Ｃａｓタンパク質および前記ターゲティングＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つをコードする核酸を含む。
適切な宿主細胞は原核生物でも真核生物でもよい。特に、遺伝的に利用しやすく、培養することが可能である原核または真核細胞、例えば、原核細胞、真菌細胞、植物細胞およびヒト細胞を含む（が胚性幹細胞は含まない）動物細胞を含む、一般に使用されている宿主細胞を、本発明に従って使用するために選択することができる。好ましくは、宿主細胞は原核細胞、真菌細胞、植物細胞、原生生物細胞または動物細胞から選択されることになる。本発明に従って使用するための好ましい宿主細胞は、典型的には高成長速度を示し、容易に培養されおよび／もしくは形質転換され、短い世代時間を示す種、付随する確立した遺伝資源を有する種または特定の条件下で異種タンパク質の最適発現のために選択され、改変されもしくは合成された種に一般に由来している。目的のタンパク質が最終的には特定の工業的、農業的、化学的または治療的状況で使用されることになる本発明の好ましい実施形態では、適切な宿主細胞は、目的のタンパク質が配置されることになる所望の特定の条件または細胞状況に基づいて選択してもよい。好ましくは、宿主細胞は原核細胞になる。好ましい実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。宿主細胞は、例えば、大腸菌（Escherichia coli（E. coli））細胞でもよい。好ましくは、宿主細胞は好熱性細菌の細胞になる。
本明細書に記載される本発明の方法および使用は、細菌細胞のゲノムを改変するために使用することができる。特定の実施形態では、細菌は好熱性細菌であり、細菌は、好ましくは、アシディチオバチルス（Acidithiobacillus）属種（アシディチオバチルス・カルドゥス（Acidithiobacillus caldus）を含む）；エアリバチルス（Aeribacillus）属種（エアリバチルス・パリダス（Aeribacillus pallidus）を含む）；アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属種（アリシクロバチルス・アシドカラダリス（Alicyclobacillus acidocaldarius）、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris）、アリシクロバチルス・シクロヘプタニクス（Alicyclobacillus cycloheptanicusl）、アリシクロバチルス・ヘスペリダム（Alicyclobacillus hesperidum）を含む）；アノキシバチルス（Anoxybacillus）属種（アノキシバチルス・カルディプロテオリティクス（Anoxybacillus caldiproteolyticus）、アノキシバチルス・フラビサーマス（Anoxybacillus flavithermus）、アノキシバチルス・ルピエンシス（Anoxybacillus rupiensis）、アノキシバチルス・テピダマンス（Anoxybacillus tepidamans）を含む）；バチルス（Bacillus）属種（バチルス・カルドリティクス（Bacillus caldolyticus）、バチルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）、バチルス・カルドベロクス（Bacillus caldovelox）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メタノリクス（Bacillus methanolicus）、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）（バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８を含む）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・サーモコプリアエ（Bacillus thermocopriae）、バチルス・サーモラクティス（Bacillus thermolactis）、バチルス・サーモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans）、バチルス・サーモレオボランス（Bacillus thermoleovorans）を含む）；カルディバチルス（Caldibacillus）属種（カルディバチルス・デビリス（Caldibacillus debilis）を含む）；カルディセルロシルプター（Caldicellulosiruptor）属種（カルディセルロシルプター・ベシイ（Caldicellulosiruptor bescii）、カルディセルロシルプター・ハイドロテルマリス（Caldicellulosiruptor hydrothermalis）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニイ（Caldicellulosiruptor kristjanssonii）、カルディセルロシルプター・クロノトスキエンシス（Caldicellulosiruptor kronotskyensis）、カルディセルロシルプター・ラクトアセチクス（Caldicellulosiruptor lactoaceticus）、カルディセルロシルプター・オブシディアンシス（Caldicellulosiruptor obsidiansis）、カルディセルロシルプター・オウエンセンシス（Caldicellulosiruptor owensensis）、カルディセルロシルプター・サッカロリティクス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）を含む）；クロストリジウム（Clostridium）属種（クロストリジウム・クラリフラブン（Clostridium clariflavum）、クロストリジウム・ストラミニソルベンス（Clostridium straminisolvens）、クロストリジウム・テピディプロフンディ（Clostridium tepidiprofundi）、クロストリジウム・サーモブチリクム（Clostridium thermobutyricum）、クロストリジウム・サーモセルム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・サーモサクシノゲネス（Clostridium thermosuccinogenes）、クロストリジウム・サーモパルマリウム（Clostridium thermopalmarium）を含む）；デイノコックス（Deinococcus）属種（デイノコックス・セルロシリティクス（Deinococcus cellulosilyticus）、デイノコックス・デセルティ（Deinococcus deserti）、デイノコックス・ゲオテルマリス（Deinococcus geothermalis）、デイノコックス・ムライイ（Deinococcus murrayi）、デイノコックス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）を含む）；デフルビイタレア（Defluviitalea）属種（デフルビイタレア・ファフィフィラ（Defluviitalea phaphyphila）を含む）、デスルホトマクルム（Desulfotomaculum）属種（デスルホトマクルム・カルボキシジボランス（Desulfotomaculum carboxydivorans）、デスルホトマクルム・ニグリフィカンス（Desulfotomaculum nigrificans）、デスルホトマクルム・サリヌム（Desulfotomaculum salinum）、デスルホトマクルム・ソルファタリクム（Desulfotomaculum solfataricum）を含む）；デスルフレラ（Desulfurella）属種（デスルフレラ・アセチボランス（Desulfurella acetivorans）を含む）；デスルフロバクテリウム（Desulfurobacterium）属種（デスルフロバクテリウム・サーモリトトロフム（Desulfurobacterium thermolithotrophum）を含む）；ゲオバチルス（Geobacillus）属種（ゲオバチルス・イシギアヌス（Geobacillus icigianus）、ゲオバチルス・カルボキシロシリティクス（Geobacillus caldoxylosilyticus）、ゲオバチルス・ユラシクス（Geobacillus jurassicus）、ゲオバチルス・ガラクトシダシウス（Geobacillus galactosidasius）、ゲオバチルス・カウストフィルス（Geobacillus kaustophilus）、ゲオバチルス・リツアニクス（Geobacillus lituanicus）、ジェオバシラス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、ゲオバチルス・スブテラネウス（Geobacillus subterraneus）、ゲオバチルス・テルマンタルクティクス（Geobacillus thermantarcticus）、ゲオバチルス・サーモカネヌラトゥス（Geobacillus thermocatenulatus）、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）、ゲオバチルス・サーモグルコシダンス（Geobacillus thermoglucosidans）、ゲオバチルス・サーモレオボランス（Geobacillus thermoleovorans）、ゲオバチルス・トエビイ（Geobacillus toebii）、ゲオバチルス・ウゼネンシス（Geobacillus uzenensis）、ゲオバチルス・ブルカニイ（Geobacillus vulcanii）、ゲオバチルス・ザリハエ（Geobacillus zalihae）を含む）；ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属種（ハイドロジェノバクター・サーモフィレス（Hydrogenobacter thermophiles）を含む）；ヒドロゲノバクルム（Hydrogenobaculum）属種（ヒドロゲノバクルム・アシドフィルム（Hydrogenobaculum acidophilum）を含む）；イグナビバクテリウム（Ignavibacterium）属種（イグナビバクテリウム・アルブム（Ignavibacterium album）を含む）；ラクトバチルス（Lactobacillus）属種（ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルエクキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・イングルビエイ（Lactobacillus ingluviei）、ラクトバチルス・サーモトレランス（Lactobacillus thermotolerans）を含む）；マリニテルムス（Marinithermus）属種（マリニテルムス・ヒドロテルマリス（Marinithermus hydrothermalis）を含む）；モーレラ（Moorella）属種（モーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）を含む）；オセアニテルムス（Oceanithermus）属種（オセアニテルムス・デスルフランス（Oceanithermus desulfurans）、オセアニテルムス・プロフンドゥス（Oceanithermus profundus）を含む）；パエニバシラス（Paenibacillus）属種（パエニバシラ（Paenibacillus）属種Ｊ２、パエニバシラス・マリヌム（Paenibacillus marinum）、パエニバシラ・サーモアエロフィルス（Paenibacillus thermoaerophilus）を含む）；ペルセフォネラ（Persephonella）属種（ペルセフォネラ・グアイマセンシス（Persephonella guaymasensis）、ペルセフォネラ・ヒドロゲニフィラ（Persephonella hydrogeniphila）、ペルセフォネラ・マリナ（Persephonella marina）を含む）；ロドテルムス（Rhodothermus）属種（ロドテルムス・マリヌス（Rhodothermus marinus）、ロドテルムス・オバメンシス（Rhodothermus obamensis）、ロドテルムス・プロフンディ（Rhodothermus profundi）を含む）；スルホバチルス（Sulfobacillus）属種（スルホバチルス・アシドフィルス（Sulfobacillus acidophilus）を含む）；スルフリヒドロゲニビウム（Sulfurihydrogenibium）属種（スルフリヒドロゲニビウム・アゾレンセ（Sulfurihydrogenibium azorense）、スルフリヒドロゲニビウム・クリストヤンソニイ（Sulfurihydrogenibium kristjanssonii）、スルフリヒドロゲニビウム・ロドマニイ（Sulfurihydrogenibium rodmanii）、スルフリヒドロゲニビウム・イロウストネンセ（Sulfurihydrogenibium yellowstonense）を含む）；シンビオバクテリウム（Symbiobacterium）属種（シンビオバクテリウム・サーモフィルム（Symbiobacterium thermophilum）、シンビオバクテリウム・トエビイ（Symbiobacterium toebii）を含む）；サーモアンアエロバクター（Thermoanaerobacter）属種（サーモアンアエロバクター・ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）、サーモアンアエロバクター・エタノリクス（Thermoanaerobacter ethanolicus）、サーモアンアエロバクター・イタリクス（Thermoanaerobacter italicus）、サーモアンアエロバクター・キブイ（Thermoanaerobacter kivui）、サーモアンアエロバクター・マリアネンシス（Thermoanaerobacter marianensis）、サーモアンアエロバクター・マトラニイ（Thermoanaerobacter mathranii）、サーモアンアエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudoethanolicus）、サーモアンアエロバクター・ウィエゲリイ（Thermoanaerobacter wiegelii）；サーモアンアエロバクテリウム（Thermoanaerobacterium）属種（サーモアンアエロバクテリウム・アシジトレランス（Thermoanaerobacterium aciditolerans）、サーモアンアエロバクテリウム・アオテアロエンセ（Thermoanaerobacterium aotearoense）、サーモアンアエロバクテリウム・エタノリクス（Thermoanaerobacterium ethanolicus）、サーモアンアエロバクテリウム・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacterium pseudoethanolicus）、サーモアンアエロバクテリウム・サッカロリティクム（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）、サーモアンアエロバクテリウム・サーモサッカロリティクム（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）、サーモアンアエロバクテリウム・キシラノリティクム（Thermoanaerobacterium xylanolyticum）を含む）；サーモバチルス（Thermobacillus）属種（サーモバチルス・コンポスティ（Thermobacillus composti）、サーモバチルス・キシラニリティクス（Thermobacillus xylanilyticus）を含む）；サーモクリニス（Thermocrinis）属種（サーモクリニス・アルブス（Thermocrinis albus）、サーモクリニス・ルベル（Thermocrinis ruber）を含む）；サーモデュルファタトル（Thermodulfatator）属種、サーモデスルファタトル・アトランティクス（Thermodesulfatator atlanticus）、サーモデスルファタトル・アウトトロフィクス（Thermodesulfatator autotrophicｕｓ）、サーモデスルファタトル・インディクス（Thermodesulfatator indicus）を含む）；サーモデスルフォバクテリウム（Thermodesulfobacterium）属種（サーモデスルフォバクテリウム・コミュネ（Thermodesulfobacterium commune）、サーモデスルフォバクテリウム・ヒドロゲニフィルム（Thermodesulfobacterium hydrogeniphilum）を含む）；サーモデスルフォビウム（Thermodesulfobium）属種（サーモデスルフォビウム・ナルゲンセ（Thermodesulfobium narugense）を含む）；サーモデスルフォビブリオ（Thermodesulfovibrio）属種（サーモデスルフォビブリオ・アグレガンス（Thermodesulfovibrio aggregans）、サーモデスルフォビブリオ・チオフィルス（Thermodesulfovibrio thiophilus）、サーモデスルフォビブリオ・イエロウストニイ（Thermodesulfovibrio yellowstonii）を含む）；サーモシフォ（Thermosipho）属種（サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、サーモシフォ・アトランティクス（Thermosipho atlanticus）、サーモシフォ・メラネシエンシス（The





rmosipho melanesiensis）を含む）；テルモトガ（Thermotoga）属種（テルモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）、テルモトガ・ネオポリタナ（Thermotoga neopolitana）、テルモトガ（Thermotoga）属種ＲＱ７を含む）；サーモビブリオ（Thermovibrio）属種（サーモビブリオ・アモニフィカンス（Thermovibrio ammonificans）、サーモビブリオ・ルベル（Thermovibrio ruber）を含む）；サーモビルガ（Thermovirga）属種（サーモビルガ・リエニイ（Thermovirga lienii）を含む）およびテルムス（Thermus）属種（テルムス・アクアティクス（Thermus aquaticus）、テルムス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）、テルムス・フラブス（Thermus flavus）、テルムス・スコトドゥクツス（Thermus scotoductus）、テルムス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）を含む）；チオバチルス・ネアポリタヌス（Thiobacillus neapolitanus）から選択される。
別の態様では、本明細書に記載される方法または使用は、中温性細菌を改変するために使用することができる。好ましい実施形態では、細菌は、アシディチオバシラス（Acidithiobacillus）属種（アシディチオバチルス・カルドゥス（Acidithiobacillus caldus）を含む）；アクチノバチルス（Actinobacillus）属種（アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）を含む）；アナエロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）属種（アナエロビオスピリルム・スクシニシプロドュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）を含む）；バチルス（Bacillus）属種（バチルス・アルカリフィルス（Bacillus alcaliphilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）、バチルス・ラウツス（Bacillus lautus）、バチルス・レンツス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガトテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含む）；バスフィア（Basfia）属種（バスフィア・スクシニシプロドュセンス（Basfia succiniciproducens）を含む）；ブレビバチルス（Brevibacillus）属種（ブレビバチルス・ブレビス（Brevibacillus brevis）を含む）；ブレビバチルス・ラテロスポラス（Brevibacillus laterosporus）；クロストリジウム（Clostridium）属種（クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・アウトエタノゲヌム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinkii）、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxidivorans）、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）、クロストリジウム・ルジュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・パステウリアヌム（Clostridium pasteurianum）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridum perfringens）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、クロストリジウム・サッカロブチリクム（Clostridium saccharobutylicum）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニウム（Clostridium saccharoperbutylacetonium）を含む）；コリネバクテリウム（Corynebacterium）属種（コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）を含む）；デスルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）属種（デスルフィトバクテリウム・デハロゲナンス（Desulfitobacterium dehalogenans）、デスルフィトバクテリウム・ハフニエンセ（Desulfitobacterium hafniense）を含む）；デスルホトマクルム（Desulfotomaculum）属種（デスルホトマクルム・アセトキシダンス（Desulfotomaculum acetoxidans）、デスルホトマクルム・ギブソニアエ（Desulfotomaculum gibsoniae）、デスルホトマクルム・レドュセンス（Desulfotomaculum reducens）、デスルホトマクルム・ルミニス（Desulfotomaculum ruminis）を含む）；エンテロバクター（Enterobacter）属種（エンテロバクター・アサブリアエ（Enterobacter asburiae）を含む）；エンテロコッカス（Enterococcus）属種（エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）を含む）；エシェリキア（Escherichia）属種（大腸菌（Escherichia coli）を含む）；ラクトバチルス（Lactobacillus）属種（ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・アミロフィルス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチルス・アミロボルス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・アニマリス（Lactobacillus animalis）、ラクトバチルス・アリゾネンシス（Lactobacillus arizonensis）、ラクトバチルス・ババリクス（Lactobacillus bavaricus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カセイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・コリノフォルミス（Lactobacillus corynoformis）、ラクトバチルス・クリスパツス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・クルバツス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・デルブルエクキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・フェルメンツム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ガセリイ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・ペントスス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラムノスス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サンフリスセンシス（Lactobacillus sanfriscensis）を含む）；マンヘイミア（Mannheimia）属種（マンヘイミア・スクシニシプロドュセンス（Mannheimia succiniciproducens）を含む）；パエニバシラス（Paenibacillus）属種（パエニバチルス・アルベイ（Paenibacillus alvei）、パエニバチルス・ベイジンゲンシス（Paenibacillus beijingensis）、パエニバチルス・ボレアリス（Paenibacillus borealis）、パエニバチルス・ダウシ（Paenibacillus dauci）、パエニバチルス・ドュルス（Paenibacillus durus）、パエニバチルス・グラミニス（Paenibacillus graminis）、パエニバチルス・ラルバエ（Paenibacillus larvae）、パエニバチルス・レンチモルブス（Paenibacillus lentimorbus）、パエニバチルス・マセランス（Paenibacillus macerans）、パエニバチルス・ムシラギノスス（Paenibacillus mucilaginosus）、パエニバチルス・オドリフェル（Paenibacillus odorifer）、パエニバチルス・ポリミクサ（Paenibacillus polymyxa）、パエニバチルス・ステリフェル（Paenibacillus stellifer）、パエニバチルス・テラエ（Paenibacillus terrae）、パエニバチルス・ブルムクイエンシス（Paenibacillus wulumuqiensis）を含む）；ペディオコッカス（Pediococcus）属種（ペディオコッカス・アシディラクチシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・クラウセニイ（Pediococcus claussenii）、ペディオコッカス・エタノリドュランス（Pediococcus ethanolidurans）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）を含む）；サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）；スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）属種（スポロラクトバチルス・イヌリヌス（Sporolactobacillus inulinus）、スポロラクトバチルス・ラエボラクチクス（Sporolactobacillus laevolacticus）を含む）；スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）；ストレプトコッカス（Streptococcus）属種（ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・フェアカリス（Streptococcus feacalis）、ストレプトコッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumonia）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ソブリヌス菌（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を含む）；ストレプトマイセス（Streptomyces）属種（ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・パルブルス（Streptomyces parvulus）、ストレプトマイセス・ヴェネズエラエ（Streptomyces venezuelae）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）を含む）；テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属種（テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Tetragenococcus halophilus）を含む）およびザイモモナス（Zymomonas）属種（ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）を含む）から選択される。
さらなる態様では、本明細書で定義される方法または使用は、酵母または真菌のゲノムを改変するために使用することができる。特定の実施形態では、真菌種は、中温性であり、好ましくは、真菌は、以下に限定されないが、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、コウジカビ（Aspergillus oryzae）およびアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）を含めたアスペルギルス（Aspergillus）属種から選択され、より好ましくは、アスペルギルス（Aspergillus）属種は、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）またはアスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）である。中温真菌種は、カンジダ（Candida）属種である。
本発明はさらに、好熱性酵母または真菌種を改変するための、本明細書で定義されている方法の使用に関し、好ましくは、真菌または酵母は、アスペルギルス（Aspergillus）属種（アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・ベルシコロル（Aspergillus versicolor）を含む）；カナリオマイセス（Canariomyces）属種（カナリオマイセス・サーモフィル（Canariomyces thermophile）を含む）；カエトミウム（Chaetomium）属種（カエトミウム・メソポタミクム（Chaetomium mesopotamicum）、カエトミウム・サーモフィルム（Chaetomium thermophilum）を含む）；カンジダ（Candida）属種（カンジダ・ボビナ（Candida bovina）、カンジダ・スロオフィイ（Candida sloofii）、カンジダ・サーモフィラ（Candida thermophila）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）（＝イサトケンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis））を含む）；セロフォラ（Cercophora）属種（セロフォラ・コロナテ（Cercophora coronate）、セロフォラ・セプテントリオナリス（Cercophora septentrionalis）を含む）；コネメリア（Coonemeria）属種（コネメリア・アエギプティアカ（Coonemeria aegyptiaca）を含む）；コリナスカス（Corynascus）属種（コリナスカス・サーモフィルス（Corynascus thermophiles）を含む）；ゲオトリクム（Geotrichum）属種（ゲオトリクム・カンディドゥム（Geotrichum candidum）を含む）；クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属種（クルイベロマイセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）を含む）；マルブランケア（Malbranchea）属種（マルブランケア・シンナモメア（Malbranchea cinnamomea）、マルブランケア・スルフレア（Malbranchea sulfurea）を含む）；メラノカルプス（Melanocarpus）属種（メラノカルプス・アルボマイセス（Melanocarpus albomyces）を含む）；ミセリオフトラ（Myceliophtora）属種（ミセリオフトラ・フェルグシイ（Myceliophthora fergusii）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）を含む）；マイコテルムス（Mycothermus）属種（マイコテルムス・サーモフィレス（Mycothermus thermophiles）（＝スキタリジウム・サーモフィルム（Scytalidium thermophilum）／トルラ・サーモフィラ（Torula thermophila））を含む）；マイリオコックム（Myriococcum）属種（マイリオコックム・サーモフィルム（Myriococcum thermophilum）を含む）；パエキロマイセス（Paecilomyces）属種（パエキロマイセス・サーモフィラ（Paecilomyces thermophila）を含む）；レメルソニア（Remersonia）属種（レメルソニア・サーモフィラ（Remersonia thermophila）を含む）；リゾムコル（Rhizomucor）属種（リゾムコル・プシルス（Rhizomucor pusillus）、リゾムコル・タウリクス（Rhizomucor tauricus）を含む）；サッカロマイセス（Saccharomyces）属種（出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）を含む）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属種（分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）を含む）、スキタリジウム（Scytalidium）属（スキタリジウム・サーモフィルム（Scytalidium thermophilum）を含む）；ソルダリス（Sordaris）属（ソルダリア・サーモフィラ（Sordaria thermophila）を含む）；サーモアスカス（Thermoascus）属種（サーモアスカス・アウランティアクス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィレス（Thermoascus thermophiles）を含む）；テルモムコル（Thermomucor）属種（テルモムコル・インディカエ－セウダティカエ（Thermomucor indicae-seudaticae）を含む）、およびサーモマイセス（Thermomyces）属種（サーモマイセス・イバダネンシス（Thermomyces ibadanensis）、サーモマイセス・ラヌギノスス（Thermomyces lanuginosus）
を含む）から選択される。
前述の一覧表示において、太字の活字で特定されている微生物は、本発明の使用に特に好適／適用可能であることが見いだされた。
一部の好ましい本発明の実施形態には、好熱性細菌（アエリバチルス（Aeribacillus）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、アノキシバチルス（Anoxybacillus）属、バチルス（Bacillus）属、ゲオバチルス（Geobacillus）属を含む）；パエニバシラス（Paenibacillus）属種；サーモフィリック・クロストリジア（Thermophilic clostridia）（アンアエロバクター（Anaerobacter）属、アンアエロバクテリウム（Anaerobacterium）属、カルディセルロシルプター（Caldicellulosiruptor）属、クロストリジウム（Clostridium）属、モーレラ（Moorella）属、サーモアンアエロバクター（Thermoanaerobacter）属、サーモアンアエロバクテリウム（Thermoanaerobacterium）属、サーモブラキウム（Thermobrachium）属、サーモハロバクター（Thermohalobacter）属種を含む）、または１つもしくは複数の好熱性ラクトバチルス（Lactobacillus）属種から選択される１つもしくは複数の好熱性微生物、または１つもしくは複数の好熱性微生物、ならびにバチルス（bacillus）属種、大腸菌（Escherichia coli）およびラクトバチルス（Lactobacillus）属種から選択される中温細菌が含まれる。
本発明は、今や特定の実施形態に関連しておよび添付図に関連して詳細に説明されることになる。
Ｃａｓ９タンパク質配列の近隣結合樹を示す図である。ｐＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ－ＢＬＡＳＴに基づいて菌株Ｔ１２と４０％を超える配列類似性を有するすべての配列、ならびに現在十分に特徴付けられている配列（化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophiles）およびアクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii））、ならびに、これらの配列が４０％より低い同一性であった場合、現在同定されている好熱性配列も含まれた。すべての好熱性配列では、Ｔ１２に対するパーセント同一性は菌株名の後に示される。遺伝子識別子（ｇｉ）番号は種名の前に示される。説明文：閉環：好熱性（最適６０℃より高い）Ｃａｓ９配列、閉四角：熱耐性（最適＜５０℃）Ｃａｓ９配列、開三角：中温性起源由来のゲノム編集目的で現在最も使用されているＣａｓ９配列；符号なし：中温性Ｃａｓ９。結節点の値は１０００レプリケートブートストラップ値を表し；スケールバーは部位当たりの推定アミノ酸置換を表す。 Ｃａｓ９遺伝子配列の近隣結合樹を示す図である。遺伝子レベルでの同一性は極端に乏しかった；タンパク質整列のために使用された生物と同じ生物由来の配列を遺伝子整列のために使用した。遺伝子識別子（ｇｉ）番号は種名の前に示されている。説明文：閉環：好熱性（最適６０℃より高い）Ｃａｓ９配列、閉四角：熱耐性（最適＜５０℃）Ｃａｓ９配列、開三角：中温性起源由来のゲノム編集目的で現在最も使用されているＣａｓ９配列；符号なし：中温性Ｃａｓ９。結節点の値は１０００レプリケートブートストラップ値を表す。 ｇｔＣａｓ９（配列番号１）（ＩＩ－Ｃ型）と十分に特徴付けられているＩＩ－Ｃ型（アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）｜「ａｎａ」；配列番号８）およびＩＩ－Ａ型（化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）｜「ｐｙｏ」；配列番号９およびストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus））Ｃａｓ９配列とのタンパク質配列整列を示す図である。重要な活性部位残基はよく保存されており、黒色矢印で示されている。Ａｎａ－Ｃａｓ９およびＰｙｏ－Ｃａｓ９について記載されているタンパク質ドメイン（Jinek, et al., 2014, Science 343: 1247997）は斜線囲みおよび類似の色付き文字で示されている。ＰＡＭ認識ドメインは、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）ＩＩ－Ａ型系では決定されているが、いかなるＩＩ－Ｃ型系についても決定されておらず、したがって、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）配列でのみ示されている。 ｇｔＣａｓ９（配列番号１）（ＩＩ－Ｃ型）と十分に特徴付けられているＩＩ－Ｃ型（アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）｜「ａｎａ」；配列番号８）およびＩＩ－Ａ型（化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）｜「ｐｙｏ」；配列番号９およびストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus））Ｃａｓ９配列とのタンパク質配列整列を示す図である。重要な活性部位残基はよく保存されており、黒色矢印で示されている。Ａｎａ－Ｃａｓ９およびＰｙｏ－Ｃａｓ９について記載されているタンパク質ドメイン（Jinek, et al., 2014, Science 343: 1247997）は斜線囲みおよび類似の色付き文字で示されている。ＰＡＭ認識ドメインは、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）ＩＩ－Ａ型系では決定されているが、いかなるＩＩ－Ｃ型系についても決定されておらず、したがって、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）配列でのみ示されている。 アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－Ａｎａ）のタンパク質構成を示す図である（Jinek et al., 2014）。ｇｔＣａｓ９は同じＩＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ系に属し、活性部位残基を同定することができた。 相補的ｄｓＤＮＡのｃｒＲＮＡガイドターゲティングの比較を示す図である。塩基対合は破線で示されている。ＲＮＡは黒色で、ＤＮＡは灰色で描かれている。ｃｒＲＮＡスペーサーと標的プロトスペーサー間の塩基対合は太い黒色破線で示され、ＤＮＡ鎖間およびＲＮＡ鎖間の塩基対合は太い灰色破線で示されている。ｃｒＲＮＡの５’末端が示されている。Ｉ型中のＰＡＭ（小さい白色囲み）は標的鎖（プロトスペーサー）の下流に存在し、ＩＩ型ではＰＡＭは置き換えられた鎖のもう一方の末端に存在することに注目されたい。同様に、シード（標的ＤＮＡ鎖との塩基対合が始まり、ミスマッチが許されないガイドの予想配列）はＰＡＭの近くに位置しており、したがって、Ｉ型とＩＩ型で異なる（Van der Oost, 2014 ibid.）。パネルＡは大腸菌（E. coli）のＩ型Ｃａｓｃａｄｅ系の模式図を示している。ｃｒＲＮＡは、内部スペーサー（灰色囲み、標的認識を可能にする３１～３２ヌクレオチド）を有し、８ヌクレオチド５’ハンドルおよびステムループ構造（ヘアピン）からなる２９ヌクレオチド３’ハンドルで隣接している（Jore 2011 ibid.）。パネルＢは化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）のＩＩ型Ｃａｓ９系の模式図を示している。ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡと塩基対合し、リボヌクレアーゼＩＩＩによるプロセシングを可能にする（向かい合った黒色三角）。さらに、ｃｒＲＮＡの５’末端はリボヌクレアーゼにより刈り込まれ（黒色三角）、典型的には２０ヌクレオチドスペーサーを生じる。合成ループを導入してｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を生じてもよいことに注目されたい（Jinek et al., 2012 ibid.）。 Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２型ＩＩｃ ＣＲＩＳＰＲ系の配列のアライメントを示す図である。 ｇｔＣａｓ９のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの、ＰＡＭ予測をもたらすために得た６つの単一ヒットを示す図である。 ｇｔＣａｓ９のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの、ＰＡＭ予測をもたらすために得た６つの単一ヒットを示す図である。 図７に例示したアライメントの結果を組み合わせたｗｅｂｌｏｇｏを示す図である。このｗｅｂｌｏｇｏは、ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕを使用して生成した。 精製済みｇｔＣａｓ９による、プラスミドを標的とした、６０℃でのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイの結果を示すグラフである。このプラスミドは、ＰＡＭ配列の８ヌクレオチド長の特異的配列変異体を含んだ。 ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配列を含む標的プラスミドを使用する、ｇｔＣａｓ９濃度の効果を検討するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示すグラフである。 ある範囲の温度にわたる、ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配列を含む標的プラスミドを使用する、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示すグラフである。 実施例９に説明した通り、選択プレート上のバチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞のコロニーの成長または不在により、ｇｔＣａｓ９および８ｎｔ ＰＡＭ配列を使用するバチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞のｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集の結果を示すグラフである。コロニーは、図１２中に矢印で示している。 ｐｙｒＦ遺伝子を除外する、コロニーのＰＣＲスクリーニングの結果を示すグラフである。このコロニーは、構築物３（ネガティブ対照）による、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞の変換後に生成した。１５のコロニーをスクリーニングしたが、実施例９に説明されている通り、欠失遺伝子型－２．１ｋｂのバンドサイズを示すものはなく、代わりにすべてが、野生型－２．９ｋｂのバンドサイズを示した。 ｐｙｒＦ遺伝子が欠失された、コロニーのＰＣＲスクリーニングの結果を示すグラフである。このコロニーは、構築物１（ＰＡＭ配列ＡＴＣＣＣＣＡＡ［配列番号２１］）による、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞の変換後に生成した。２０のコロニーをスクリーニングし、実施例９に説明されている通り、１つが、欠失遺伝子型－２．１ｋｂのバンドサイズを示した一方、残りは、野生型－２．９ｋｂのバンドサイズと欠失遺伝子型－２．１ｋｂのバンドサイズの両方を示した。野生型のみの遺伝子型は観察されなかった。
以下は、本発明に従って使用されるＣａｓタンパク質のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。
［配列番号１］ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２ Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列
Figure 0007182545000001
［配列番号７］ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２ Ｃａｓ９ ＤＮＡ配列
Figure 0007182545000002
Figure 0007182545000003
Figure 0007182545000004
[実施例１]
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）の単離
驚くべきことに、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）は、嫌気性条件下でリグノセルロース基質を分解することができる好熱菌についての±５００単離菌のライブラリーの探索中に発見された。当初、±５００単離菌のライブラリーが確立され、これはセルロースおよびキシラン上での単離により数回の選択ラウンド後に、１１０単離菌にまで削減された。１１０単離菌のこのライブラリーはゲオバチルス（Geobacillus）単離菌のみからなり、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）がライブラリーの７９％を占めていた。
単離されたゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）菌株は「Ｔ１２」と命名された。Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２に由来するＣａｓ９タンパク質は、「ｇｔＣａｓ９」と命名された。
[実施例２]
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）でのＣａｓ９について必須のコンセンサス配列を定義する
以下のデータベース探索および整列が実施された。
ｐＢＬＡＳＴおよびｎＢＬＡＳＴは社内ＢＬＡＳＴサーバーで実施し、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２のタンパク質または遺伝子配列を問い合わせ配列として使用した。このデータベースは２０１４年５月に最後にアップデートされ、したがって、最も最近に追加されたゲオバチルス（Geobacillus）ゲノムを含有していないが、通常のオンラインＢＬＡＳＴはＴ１２配列の公開を防ぐために使用されなかった。ＢＬＡＳＴ中の４０％を超えることが分かった配列同一性を図１に含む。
もっと最近の配列データを含めるために、ゲオバチルス（Geobacillus）ＭＡＳ１（ｇｔＣａｓ９に最も密接に関係している）の配列を使用してＮＣＢＩウェブサイト上でＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを実施した（Johnson et al., 2008 Nucleic Acids Res. 36(Web Server issue): W5-9）。２連続ラウンドのＰＳＩ－ＢＬＡＳＴが実施され、そこでは以下の基準：第１のラウンドでは最小配列包括度９６％、ならびに第２および第３のラウンドでは９７％、最小同一性４０％、種当たり１つの菌株のみを満たした配列のみが次のラウンドで使用された。
ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴから生じる配列、ならびに内部サーバーｐＢＬＡＳＴ由来のＴ１２に対して４０％よりも大きな同一性を有し、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴには現われなかった配列を、現在十分に特徴付けられている中温性配列と、および、これらの配列がもっと離れた関係にある場合には、現在同定されているすべての好熱性配列とも整列させ、それから近隣結合樹を構築した（図１参照）。整列はＣｌｕｓｔａｌＷを使用してＭｅｇａ６で実施し、この後近隣結合法を使用して樹を構築し、ブートストラップ解析は１０００レプリケートを使用して実施した。
問い合わせ配列としてゲオバチルス（Geobacillus）属種ＭＡＳ１を使用してＢＬＡＳＴｎを実施した場合、ゲオバチルス（Geobacillus）属種ＪＦ８ Ｃａｓ９のみが８８％の同一性で同定され、遺伝子レベルでは相同性が極めて少ないことを示していた。図２はＣｌｕｓｔａｌ整列Ｃａｓ９遺伝子配列の近隣結合樹である。
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２、アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）および化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）のタンパク質配列は、デフォルト設定のＢＬＯＳＵＭ６２を使用してＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒでその配列を整列させることによりタンパク質ドメイン相同性についてさらに解析した（図３参照）。
[実施例３]
ＣＡＳ９の機能に不可欠であるコアアミノ酸モチーフおよび好熱性Ｃａｓ９ヌクレアーゼの熱安定性を与えるコアアミノ酸モチーフを同定する
上記整列されたタンパク質配列のパーセント同一性は図１に与えられている。ｇｔＣａｓ９はＩＩ－Ｃ型に属している。ＩＩ－Ｃ型系の最もよく研究され、最近結晶化された構造はアクチノマイセス・ネスランディ（Actinomyces naeslundii）由来である（Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997）。このタンパク質配列はｇｔＣａｓ９に対して２０％の同一性しか示していないが、高度に保存された残基を推定するのに使用することが可能である。２つの十分に特徴付けられているＩＩ－Ａ型系（化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus））も分析に含まれた（Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997；Nishimasu et al., 2014, Cell 156: 935-949）。これら４つのタンパク質配列の整列は図３に示されており、図４はアクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）について決定されたタンパク質構成（「Ａｎａ－Ｃａｓ９」）を示している（Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997）。Ｔ１２（ｇｔＣａｓ９）およびアクチノマイセス・ネスランディ（Actinomyces naeslundii）由来のＣａｓ９の長さは極めて類似しており（アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）１１０１アミノ酸、ｇｔＣａｓ９ １０８２アミノ酸）、ｇｔＣａｓ９は類似するタンパク質構成を有すると予想されるが、Ｃａｓ９－Ａｎａに対する全体の配列同一性が２０％にすぎないために、これはまだ確定されていない。Jinek et al.（Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997）により記載されているアクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）および化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）由来のＣａｓ９中の活性部位残基はすべてｇｔＣａｓ９において同定することができた（図３参照）。ＰＡＭ結合ドメインは化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）ＩＩ－Ａ型系については決定されているが、いかなるＩＩ－Ｃ型系についても決定されておらず、したがって、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）配列においてのみ示されている。さらに、ＰＡＭ認識部位は、ＣＲＩＳＰＲ系間だけでなく、同じ系を含有する種間でも大きく変化する。ＰＡＭに関するさらなる情報については、問題点４および将来計画を参照されたい。
[実施例４]
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）ｇｔＣａｓ９のＰＡＭ配列の決定
原核生物ＣＲＩＳＰＲ系が適応免疫系としてその宿主に役立ち（Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821）、迅速で効果的な遺伝子工学のために使用することが可能であること（Mali et al., 2013, Nat Methods 10: 957-963）は確立されている。
Ｃａｓ９タンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のための配列特異的ヌクレアーゼとして機能する（Makarova et al., 2011, Nat Rev Micro 9: 467-477）。小型ｃｒＲＮＡ分子は、繰り返し領域に連結している「スペーサー」（標的）からなり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写およびプロセシング産物である。「スペーサー」は天然にはバクテリオファージのゲノムおよび可動遺伝要素に起源をもつが、遺伝子工学工程中に特定のヌクレオチド配列を標的にするように設計することも可能である（Bikard et al., 2013, Nucleic Acids Research 41: 7429-7437）。ｃｒＲＮＡ分子はそのＤＮＡ標的の同定のためのガイドとしてＣａｓ９により用いられる。スペーサー領域は、切断ＤＮＡ領域の標的物、「プロトスペーサー」と同一である（Brouns et al., 2012, Science 337: 808-809）。ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）は、プロトスペーサーの隣にあり、Ｃａｓ９による標的の認識に必要である（Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821）。
ＩＩ型系に関する、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのＰＡＭ決定検討を行うために、ｔｒａｃｒＲＮＡ発現モジュールであるこの系のＣＲＩＳＰＲアレイをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで予測することが必要である。ＣＲＩＳＰＲアレイを、ｃｒＲＮＡモジュールの特定に使用する。ｔｒａｃｒＲＮＡ発現配列は、５００ｂｐ窓隣接Ｃａｓ９内、またはＣａｓ遺伝子とＣＲＩＳＰＲ遺伝子座との間のどちらかに位置する（Chylinski, K., et al. (2014） Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 42, 6091-6105）。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイの直接繰り返しに対する相補性のレベルが高い、５’配列からなるはずであり、２つ以上のステムループ構造の予測構造、およびＲｈｏ独立性転写停止シグナルが後に続く（Ran, F.A., et al. (2015) In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186-191）。次に、キメラｓｇＲＮＡモジュールを設計するために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子を使用することができる。ｓｇＲＮＡの５’末端は、トランケートされた２０ｎｔ長のスペーサー、その後に、ＣＲＩＳＰＲアレイの１６～２０ｎｔ長のトランケートされた繰り返しからなる。この繰り返しの後に、対応するトランケートされた抗繰り返しおよびｔｒａｃｒＲＮＡモジュールのステムループが続く。ｓｇＲＮＡの繰り返しおよび抗繰り返し部分は、ＧＡＡＡリンカーにより一般に接続されている（Karvelis, T., et al. (2015) Rapid characterization of CRISPR-Cas9 protospacer adjacent motif sequence elements. Genome Biol. 16, 253）。
Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G.thermodenitrificans）Ｔ１２型ＩＩｃ ＣＲＩＳＰＲ系のｃａｓ遺伝子（ｃａｓ９、次いでｃａｓ１およびｃａｓ２の遺伝子が続く）は、Ｔ１２染色体のアンチセンス鎖を使用して転写される。ｃａｓ２遺伝子の後に、転写時に、多重ループを有するＲＮＡ構造を形成する、１００ｂｐ長のＤＮＡ断片が続く。この構造は、明らかに、転写ターミネータとして働く。
１１の繰り返しおよび１０のスペーサー配列を有するＣＲＩＳＰＲアレイは、転写終止配列の上流に位置し、このアレイのリーダーは、このアレイの５’末端に位置する。ｔｒａｃｒＲＮＡに転写されるＤＮＡ遺伝子座は、ｃａｓ９遺伝子の下流であることが予想される。ＣＲＩＳＰＲアレイから３６ｂｐ長の繰り返しを含むｃａｓ９遺伝子の右側下流の３２５ｂｐ長の配列のアライメントにより、ｔｒａｃｒＲＮＡ遺伝子座における３６ｂｐ長の配列が、この繰り返しにほとんど同一であることが明らかになった（図６に示されている）。この結果により、本発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡ遺伝子座の転写の方向は、ＣＲＩＳＰＲアレイの転写の方向とは反対となるはずであるという結論に至った。したがって、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端は、ｃｒＲＮＡの３’末端に相補的であり、Ｃａｓ９二重ＲＮＡ分子により必要とされるものの形成に至る。
[実施例５]
無作為化されたＰＡＭを有する標的生成
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２菌株のＣＲＩＳＰＲ ＩＩ遺伝子座由来の２つの異なるスペーサーを、鋳型としてゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２ゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲにより増幅させた。２対の縮重プライマーをそれぞれのスペーサーの増幅のために使用した。
第１に、「プロトスペーサー」断片の上流に６つの無作為ヌクレオチドの導入を引き起こす対を使用し、無作為化されたＰＡＭ配列を有するプロトスペーサーのプールを作製した。
第２に、「プロトスペーサー」断片の下流に６つの無作為ヌクレオチドの導入を引き起こす対を使用し、無作為化されたＰＡＭ配列を有するプロトスペーサーのプールを作製した。
作製された断片はｐＮＷ３３ｎベクターにライゲートされ、６ヌクレオチド長ＰＡＭそれぞれの考えられる４０９６の異なる組合せすべてを有する「プロトスペーサー」構築物の４プールを作製した。構築されたＤＮＡはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２細胞の形質転換のために使用された。細胞はクロラムフェニコール選択上に蒔かれ、それぞれのプロトスペーサープールから２×１０６を超える細胞がプールされることになる。プラスミドＤＮＡはプールから抽出され、標的領域はＰＣＲ増幅されることになり、その産物はディープシークエンシングのために送られた。最も少ないリードを有するＰＡＭは活性であると見なされ、その工程はこれらのＰＡＭを有するスペーサーを含有するｐＮＷ３３ｎ構築物のみを用いて繰り返されることになる。ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２の形質転換効率が減少していることはＰＡＭの活性を立証することになる。
[実施例６]
ｇｔＣａｓ９のＰＡＭ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ決定
ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔベクターの構築
ｃａｓ９ｇｔ遺伝子は、ＢＧ６９２７およびＢＧ６９２８プライマーを使用する、Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２ゲノムからＰＣＲ増幅し、１つの混合物中のｐＲｈａｍ Ｃ－Ｈｉｓ Ｋａｎベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ）と一緒にした。この混合物を、提示されているプロトコルに従い、Ｅ．ｃｌｏｎｉサーモコンピテント細胞を変換するために使用した。変換混合物からの１００μｌを、３７℃で一晩、成長させるため、ＬＢ＋５０カナマイシンプレート上でプレート培養した。形成したＥ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔ単一コロニー３の中から、無作為に選択し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１０ｍｌのＬＢ培地中に播種した。各培養物からの１ｍｌに滅菌グリセロールを最大で２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加することにより、グリセロール保存溶液を培養物から分離した。グリセロール保存溶液を－８０℃で保管した。各培養物からの残りの９ｍｌを、「ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ」（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プロトコルに従い、プラスミド単離に使用した。このプラスミドをｃａｓ９ｇｔの配列確認のために送り、これらのプラスミドの１つを、右側配列を含む遺伝子を含有していることを確認した。対応する培養物は、ｇｔＣａｓ９の非相同性の発現および精製のためにさらに使用した。
Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔベクターにおける、ｇｔＣａｓ９の非相同性の発現
対応するグリセロール保存溶液を含む１０ｍｌのＬＢ＋５０カナマイシンを接種した後に、Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔ事前培養物を調製した。３７℃および１８０ｒｐｍで一晩、成長させた後、ＬＢ＋５０カナマイシン培地の２００ｍｌを接種するため、事前培養物から２ｍｌを使用した。Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔ培養物を３７℃、１８０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．７になるまで、インキュベートした。次に、０．２％ｗ／ｖの最終濃度まで、Ｌ－ラムノースを加えることにより、ｇｔＣａｓ９発現を誘発させた。この発現を８時間、進行させ、この後に、培養物を４７００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離し、細胞を収穫した。培地を廃棄し、ペレット化した細胞を、－２０℃で保管するか、または以下のプロトコルに従い、細胞不含抽出物（ＣＦＥ）の調製に使用した。
１．２０ｍｌ音波照射緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）中に上記のペレットを再懸濁させる。
２．超音波処理（３０秒のパルスを８回、その間、氷上で２０秒間、冷却）によって１ｍｌの細胞を破壊する。
３．不溶部分を沈殿させるために、３５０００ｇ、４℃で１５分間、遠心分離する。
４．上澄み液を除き、４℃で、または氷上でこの上澄み液を保管する。
ｇｔＣａｓ９に対するｓｇＲＮＡモジュールを標的とするＰＡＭライブラリーの設計および構築
Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２株（上の実施例４を参照されたい）のゲノムにおいて、ｔｒａｃｒＲＮＡを発現するＤＮＡモジュールのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ決定の後に、単一分子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡモジュールを組み合わせる、単一ガイド（ｓｇ）ＲＮＡ発現ＤＮＡモジュールを設計した。プラスミドライブラリーのプロトスペーサーに相補的であるように、ｓｇＲＮＡの５’末端におけるスペーサーを設計し、モジュールを、Ｔ７プロモーターの転写制御下で設定した。ｐＴ７＿ｓｇＲＮＡ ＤＮＡモジュールは、Ｂａｓｅｃｌｅａｒにより合成して、ｐＵＣ５７ベクターに受け、ｐＵＣ５７：ｐＴ７＿ｓｇＲＮＡベクターを形成させた。ＤＨ５αの有能な大腸菌（E. coli）細胞（ＮＥＢ）をベクターで形質転換し、この変換混合物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上でプレート培養した。このプレートを３７℃で一晩、インキュベートした。形成した単一コロニーのうちの３つを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１０ｍｌのＬＢ培地に播種した。各培養物からの１ｍｌに滅菌グリセロールを最大で２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加することにより、グリセロール保存溶液を培養物から分離した。グリセロール保存溶液を－８０℃で保管した。各培養物からの残りの９ｍｌを、「ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ」（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プロトコルに従い、プラスミド単離に使用した。単離したプラスミドを使用して、ｐＴ７＿ｓｇＲＮＡモジュールの増幅用のＰＣＲ鋳型として使用した。２１８ｂｐ長のｐＴ７＿ｓｇＲＮＡ ＤＮＡモジュール（その中で、第１の１８ｂｐがｐＴ７に相当する）は、プライマーＢＧ６５７４およびＢＧ６５７５を使用して得た。完全ＰＣＲ混合物を１．５％アガロースゲル上で泳動させた。所望のサイズを有するバンドを切り取り、「Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）ゲルＤＮＡ回収キット」プロトコルに従い精製した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）は、「ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（ＮＥＢ）を使用して行った。精製済みｐＴ７＿ｓｇＲＮＡ ＤＮＡモジュールを鋳型として使用した。ＩＶＴ混合物を等しい体積のＲＮＡローディング色素（ＮＥＢ）と混合し、二次構造を破壊するため、７０℃で１５分間、加熱した。熱処理したＩＶＴ混合物を、変性ウレア－ＰＡＧＥ上で泳動し、得られたポリアクリルアミドゲルを、染色目的のため、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０μｌ含有する１００ｍｌの０．５×ＴＢＥ緩衝液中で１０分間、エンバプティズ（embaptise）した。所望のサイズ（２００ｎｔ）のバンドを切り取り、以下のＲＮＡ精製プロトコルに従い、ｓｇＲＮＡを精製した：
１．外科用メスを用いてＲＮＡゲル剤断片を裁断し、１ｍｌのＲＮＡ溶出緩衝液を加え、室温で一晩、放置した。
２．３３０μＬの一定分量分を、新しい１．５ｍｌの管に分割する。
３．事前冷却（－２０℃）した１００％ＥｔＯＨを３体積分（９９０μｌ）加える。
４．－２０℃で、６０分間、インキュベートする。
５．マイクロ遠心器中、室温で、２０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離する。
６．ＥｔＯＨを除去して、７０％ＥｔＯＨ１ｍｌによりペレットを洗浄する。
７．マイクロ遠心器中、室温で、５分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離する。
８．９９０μｌの上澄み液を除去する。
９．５５℃で１５～２０分間、サーモミキサー中の残りのＥｔＯＨを蒸発させる。
１０．２０μｌのＭＱ中にペレットを再懸濁し、－２０℃で保管する。
７ｎｔ長のＰＡＭライブラリーの設計および構築、ならびにライブラリーの線形化
ＰＡＭライブラリーの設計および構築は、ｐＮＷ３３ｎベクターに基づいた。２０ｂｐ長のプロトスペーサーを、長さ７の縮重ヌクレオチド配列により、その３’側で隣接しているベクターに導入した。縮重配列は、ＰＡＭとして働き、プロトスペーサーが、右ＰＡＭにより隣接すると、ｓｇＲＮＡを搭載したＣａｓ９により標的として認識されて切断され得る。ＰＡＭライブラリーは、以下のプロトコルによって調製した：
１．一本鎖ＤＮＡオリゴ１（ＢＧ６４９４）および２（ＢＧ６４９５）をアニールすることによりＳｐＰＡＭ二本鎖ＤＮＡインサートを調製する。
Ｉ．１０μｌの１０×ＮＥ緩衝液２．１
ＩＩ．１μｌの５０μＭオリゴ１（約１．１２５μｇ）
ＩＩＩ．１μｌの５０μＭオリゴ２（約１．１２５μｇ）
ＩＶ．８５μｌのＭＱ
Ｖ．この混合物を９４℃で５分間、インキュベートし、０．０３℃／秒の速度で３７℃まで冷却する。
２．１μｌのＫｌｅｎｏｗ ３’→５’エキソ－ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を加え、それぞれアニールしたオリゴ混合物、次に、１０μＭのｄＮＴＰ２．５μｌを加える。３７℃で１時間、次に、７５℃で２０分間、インキュベートする。
３．アニール混合物４６μｌに２μｌのＨＦ－ＢａｍＨＩおよび２μｌのＢｓｐＨＩ制限酵素を加える。３７℃で１時間、インキュベートする。この過程により、粘着末端を有するＳｐＰＡＭｂｂインサートとなる。Ｚｙｍｏ ＤＮＡクリーニングおよびコンセントレータキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、作製したインサートを清浄する。
４．ＨＦ－ＢａｍＨＩおよびＢｓｐＨＩ（ＮＥＢ）によりｐＮＷ３３ｎを消化し、Ｚｙｍｏ ＤＮＡクリーニングおよびコンセントレータキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、粘着端部を有する３．４００ｂｐ長の線形ｐＮＷ３３ｎｂｂ断片を精製する。
５．提示されているプロトコルに準拠し、ＮＥＢ Ｔ４リガーゼを使用して、１１ｎｇのＳＰＰＡＭｂｂインサートにより５０ｎｇのｐＮＷ３３ｎＢＢをライゲートする。Ｚｙｍｏ ＤＮＡクリーニングおよび コンセントレータキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ライゲート混合物を精製する。
６．ＤＨ１０ｂエレクトロコンピテント細胞（５００ｎｇのＤＮＡを含む２００μｌの細胞）を形質転換する。ＳＯＣ培地（８００μｌのＳＯＣ中に２００μｌの細胞）中に１時間、細胞を回収し、次に、回収した細胞を５０ｍｌのＬＢ＋１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールに接種する。３７℃および１８０ｒｐｍで、培養物を一晩、インキュベートする。
７．ＪｅｔＳｔａｒ ２．０ｍａｘｉｐｒｅｐキット（ＧＥＮＯＭＥＤ）を使用して、この培養物からプラスミドＤＮＡを単離する。
８．単離したプラスミドを線形化するために提示されているプロトコルに準拠し、ＳａｐＩ（ＮＥＢ）制限液を使用する。
ＰＡＭ決定反応の設計および実施
標的したプロトスペーサーの３’末端の右側ＰＡＭ下流を含有する、ＰＡＭライブラリーメンバーへのｄｓＤＮＡ切断のｇｔＣａｓ９誘発性導入を行うために、以下の切断反応を設定した：
１．反応あたり、Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔ ＣＦＥを２．５μｇ
２．ｓｇＲＮＡを３０ｎＭの最終濃度まで
３．反応あたり、線形化ＰＡＭライブラリーを２００ｎｇ
４．切断緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５％（ｖ／ｖ）グリセロール、５ｍＭのＤＴＴ）を２μｌ
５．ＭＱ水を最大２０μｌの最終体積まで
この反応物を６０℃で１時間、インキュベートし、６×ゲル搭載色素（ＮＥＢ）４μｌを加えた後に停止した。この反応混合物を、１％のアガロースゲルにロードした。ゲルに１００Ｖで１時間１５分の長さの電気泳動にかけ、次に、１０μｌのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ 色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有する０．５×ＴＡＥ緩衝液１００ｍｌ中で３０分間、インキュベートした。青色光を用いてＤＮＡバンドを可視化した後、首尾よく切断され、かつＰＡＭを含有するＤＮＡ断片に対応するバンドをゲルから切り出し、提示されているプロトコルに準拠して、「Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）ゲルＤＮＡ回収キット」を使用してゲルを精製した。
配列決定するための、ＰＡＭ含有ｇｔＣＡｓ９切断ＤＮＡ断片のタグ付け
Ｃａｓ９誘発性ＤＮＡ切断は、ＰＡＭ配列に対して近位の、プロトスペーサーの第３と第４のヌクレオチドとの間に、通常、導入される。その結果、さらなるオンシークエンス（on sequence）およびＰＡＭ配列を決定するため、切断したＤＮＡ断片のＰＡＭ含有部分をＰＣＲ増幅することができる、一対のプライマーを設計することができない。この目的の場合、５つの工程を使用した：
工程１：ＴａｑポリメラーゼによるＡテーリング
Ａテーリングは、Ｔａｑポリメラーゼを使用する、平滑二本鎖ＤｎＡ分子の３’末端に鋳型化されていないアデニンを付加する過程である。
反応構成成分：
・ｇｔＣａｓ９切断およびＰＡＭ含有ＤＮＡ断片 － ２００ｎｇ
・１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標）緩衝液（ＮＥＢ） － ５μｌ
・１ｍＭ ｄＡＴＰ － １０μｌ
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ） － ０．２μｌ
・Ｈ２Ｏ－最大で５０μｌの最終反応体積
・インキュベート時間 － ２０分間
・インキュベート温度 － ７２℃
工程２：配列決定アダプターの構築
２つの短い相補的ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニールして、工程１からのＤＮＡ断片のＰＡＭ近位部に対する配列決定アダプターを形成させた。オリゴヌクレオチドのうちの１つは、Ａテールド断片に対するアダプターのライゲートを容易にするため、その３’末端におけるさらなるチミンを有した。
アダプターオリゴヌクレオチドリン酸化（各オリゴの個々のリン酸化反応）
・１００μＭオリゴヌクレオチド保存溶液 － ２μＬ
・１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ） － ２μＬ
・滅菌ＭＱ水 － １５μＬ
・Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ） － １μＬ
・インキュベート時間 － ６０分間
・インキュベート温度 － ３７℃
・Ｔ４ ＰＮＫ不活性化 － ６５℃で２０分間
リン酸化オリゴヌクレオチドのアニール
・オリゴヌクレオチド１ － 対応するリン酸化混合物から５μＬ
・オリゴヌクレオチド１ － 対応するリン酸化混合物から５μＬ
・滅菌ＭＱ水 － ９０μＬ
・リン酸化オリゴを、９５℃で３分間、インキュベートする。室温で約３０分間から１時間、反応物をゆっくりと冷却する。
工程３：配列決定アダプターによる、ｇｔＣａｓ９切断した、Ａテールド断片のライゲート
工程１および２の生成物は、以下のプロトコルに従い、ライゲートした。
・１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液 － ２μｌ
・生成物工程１ － ５０ｎｇ
・生成物工程２ － ４ｎｇ
・Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ － １μｌ
・滅菌ＭＱ水 － ２０μｌまで
・インキュベート時間 － １０分間
・インキュベート温度 － ２０～２５℃
・６５℃で１０分間、熱不活性化
工程４：１５０ヌクレオチド長のＰＡＭ含有断片のＰＣＲ増幅
工程４のライゲート混合物からの５μｌを、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。工程２からのチミン伸長によるオリゴヌクレオチドを、フォワードプライマーとして使用し、ＰＡＭ配列の下流の１５０ヌクレオチドをアニールするようリバースプライマーを設計した。
非ｇｔＣａｓ９処理ＰＡＭライブラリーＤＮＡを鋳型として使用して、同一配列を増幅した。両方のＰＣＲ生成物をゲル精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００ペアド末端配列決定（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ）に送った。
候補ＰＡＭ配列の配列決定結果および決定の解析
配列決定の結果を解析後、以下の頻度マトリックスを構築した。このマトリックスは、ｇｔＣａｓ９により消化した、および消化されなかったライブラリーの各ＰＡＭ位における、各ヌクレオチドの相対存在量を図示している。
Figure 0007182545000005
これらの結果は、ＰＡＭ５位におけるシトシンを標的とすることが明確に好ましいこと、および最初の４つのＰＡＭ位におけるシトシンを標的とすることが好ましいことを示している。
[実施例７]
ｇｔＣａｓ９のＩｎ ｓｉｌｉｃｏ ＰＡＭ予測
十分なプロトスペーサー配列が、ゲノムデータベースに利用可能である場合、ＰＡＭのＩｎ ｓｉｌｉｃｏ予測が可能である。ｇｔＣａｓ９ ＰＡＭのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測は、ＧｅｎＢａｎｋなどのゲノムデータベースにおける配列と比較することにより、Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２株のゲノムにおける、ＣＲＩＳＰＲアレイからのスペーサーのヒットを特定することから始まった。「ＣＲＩＳＰＲファインダー」（http://crispr.u-psud.fr/Server/）ツールを使用して、Ｔ１２における候補ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を特定した。次に、特定したＣＲＩＳＰＲ遺伝子座出力値を、選択データベースを検索し、プロトスペーサーとマッチする出力値をもたらす、「ＣＲＩＳＰＲ標的」（http://bioanalysis.otago.ac.nz/CRISPRTarget/crispr_analysis.html）ツールにロードした。次に、これらのプロトスペーサー配列を、特有のヒットに関して、およびスペーサーに対する相補性に関してスクリーニングした。例えば、シード配列のミスマッチは、ポジティブヒットの不良である可能性が高いと見なし、さらなる解析から除外した。プロファージ配列および（統合）プラスミドに対する同一性を伴うヒットにより、得られたヒットは真のポジティブとなることが実証された。全体として、この過程により、６つの単一ヒットが生じた（図７）。続いて、残りの特有のプロトスペーサーヒットの隣接領域（ＩＩ型ｇｔＣａｓヌクレアーゼの場合、３’）をアラインし、ＷｅｂＬｏｇｏ（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）を使用して、コンセンサス配列を比較した（Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE WebLogo: A sequence logo generator, Genome Research, 14:1188-1190, (2004)）ツール（図８）。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏの結果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＡＭの同定実験結果と比較し（実施例６を参照されたい）、この場合、ＰＡＭ配列の第５の残基をシトシンと同一であるとバイアスをかけた。
[実施例８]
ｇｔＣａｓ９の８ヌクレオチド長のＰＡＭ配列の決定
実施例８からのｉｎ ｓｉｌｉｃｏデータは、ｇｔＣａｓ９が、８位にアデノシンが存在することがある程度好ましいことが示唆され、したがって、さらなるＰＡＭ決定実験を行い、この場合、ＰＡＭ配列の８位も同様に試験した。これは、プロトスペーサーの３’末端における、５位と８位との間に伸長していることが見いだされた、中温ブレビバチルス・ラテロスポラス（Brevibacillus laterosporus）ＳＳＰ３６０Ｄ４（Ｋａｒｖｅｌｉｓら、２０１５年）であるＣａｓ９ＰＡＭ配列の特徴と一致する。
ＰＡＭの特異的な長さ８のヌクレオチド配列変異体を、ｇｔＣａｓ９で予備試験した：
１）ＣＮＣＣＣＣＡＣ［配列番号１７］、
２）ＣＣＣＣＣＣＡＧ［配列番号１８］、
３）ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］、
４）ＣＣＣＣＣＣＡＴ［配列番号１９］、
５）ＣＣＣＣＣＣＡＣ［配列番号２０］、
６）ＮＮＮＮＴＮＮＣ（ネガティブ対照ＰＡＭ）
ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］配列をＰＡＭとして使用した場合、６０℃でｉｎ ｖｉｔｒｏで切断アッセイを行った後、精製ｇｔＣａｓ９によるこれらのターゲティング（非線形化）プラスミド、およびｇｔＣａｓ９切断活性の向上前と同じｓｇＲＮＡ（実施例６を参照されたい）が観察された（図９）。しかし、切断活性は、ネガティブ対象のＰＡＭ配列の場合、かすかな切断バンドが観察された場合でさえも、すべての試験ＰＡＭ配列に対して、切断活性が明確に検出可能であった。特定の理論に縛られたくはないが、ネガティブ対照の場合に観察される切断に寄与する高いｇｔＣａｓ９濃度の使用が可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＣａｓ９濃度が高いと、厳密なＰＡＭ要件なしに、Ｃａｓ９誘発性ＤＮＡ切断に至ることが一般に観察されている。
Ｃａｓ９濃度は、一般に、Ｃａｓ９誘発性ＤＮＡ切断の効率に影響を及ぼすことが知られている（Ｃａｓ９濃度が高いほど、Ｃａｓ９活性は高い）。このことは、ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配列を含む標的プラスミドおよび異なるｇｔＣａｓ９濃度を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行った場合にも観察された（図１０）。
上記のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合のＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配列を含む標的プラスミドを、３８と７８℃の間の幅広い温度範囲で行った（図１１）。驚くべきことに、ｇｔＣａｓ９は、すべての温度において活性であり、最高の活性は、４０．１と６４．９℃の間にあった。
したがって、ゲオバチルス（Geobacillus）属種由来のＣａｓ９の最適温度範囲は今日まで特徴付けられているＣａｓ９タンパク質よりもはるかに高い。同様に、ゲオバチルス（Geobacillus）属種由来のＣａｓ９がヌクレアーゼ活性を保持する範囲の最上方は既知のＣａｓ９タンパク質よりもはるかに高い。より高い最適温度および機能的範囲は高温での遺伝子工学に、したがって、好熱性生物のゲノムの編集に著しい利点を与え、これは高温で実行される様々な工業、農業および製薬工程において有用性がある。
[実施例９]
ｇｔＣａｓ９および８ヌクレオチド長のＰＡＭ配列による、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８のｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集
８ヌクレオチドＰＡＭもやはり、ｉｎ ｖｉｖｏでｇｔＣａｓ９により認識されることを確認するため、５５℃でバチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８のゲノムにおけるｐｙｒＦ遺伝子を欠失するよう設計を行った。
この方法は、相同組換え鋳型構築物の提供に依存し、ここでは、標的（ｐｙｒＦ）遺伝子の上流および下流に相補的である領域が、Ｂ・スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８細胞にもたらされる。鋳型の導入により、相同組換え法を使用して、相同組換え鋳型（ｐｙｒＦ遺伝子を含まない）をゲノムに導入し、こうして、細胞のゲノムにおけるＷＴ ｐｙｒＦ遺伝子を置き換える。
相同組換え構築物にｇｔＣａｓ９およびｓｇＲＮＡを含ませることを使用して、ＷＴ ｐｙｒＦを含有する細菌ゲノムに二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＤＢ）を導入することができる。細菌のゲノムにおけるＤＳＤＢは、通常、細胞死をもたらす。したがって、ＷＴ ｐｙｒＦの配列を認識するｓｇＲＮＡは、ＤＳＤＢ、およびＷＴ ｐｙｒＦしか含有しない細胞の死滅をもたらす。ＤＳＤＢの導入は、好適なＰＡＭ配列が、ｇｔＣａｓ９により認識されるプロトスペーサーの３’末端において、下流に位置していることにやはり依存する。
ｐＮＷ３３ｎプラスミドは、主鎖としてクローニングに使用した：
ｉ）自家開発グルコース抑制プロモーターの制御下でのｃａｓ９ｇｔ遺伝子、および
ｉｉ）Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムからのｐｙｒＦ遺伝子の欠失をもたらす相同組換えの鋳型として、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムにおける、ｐｙｒＦ遺伝子の１ｋｂ上流領域および１ｋｂ下流領域、および
ｉｉｉ）構成プロモーターの転写制御下での単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）発現モジュール。
単一ガイドＲＮＡの配列が、ゲノムにおけるその特異的ＤＮＡ標的にｇｔＣａｓ９をガイドする配列に相当する最初の２０ヌクレオチドにおいて相違点がある、３種の個別の構築物が生成された（スペーサーとしても知られている）。Ｂ・スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のｐｙｒＦ遺伝子におけるすべての３つの異なる候補プロトスペーサーを標的とするよう、３つの異なるスペーサー配列を設計した。これらの構築物は、本明細書において、それぞれ、構築物１、２および３と呼ばれる。
３つの異なる標的プロトスペーサーは、それらの３’末端において、以下の候補ＰＡＭ配列を有した：
１．ＴＣＣＡＴＴＣＣ （ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果によるネガティブ対照；構築物番号３にコードされるｓｇＲＮＡによりターゲティングされたプロトスペーサーの３’末端）
２．ＡＴＣＣＣＣＡＡ（構築物番号１［配列番号２１］にコードされるｓｇＲＮＡによりターゲティングされたプロトスペーサーの３’末端）
３．ＡＣＧＧＣＣＡＡ（構築物番号２；［配列番号２２］にコードされるｓｇＲＮＡによりターゲティングされたプロトスペーサーの３’末端）
３つの構築物の１つおよび選択プレート上のプレート培養を、Ｂ・スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８細胞に形質転換した後、以下の結果が得られた：
１．細胞が、３’末端（構築物番号３）においてネガティブ対照であるＴＣＣＡＴＴＣＣ ＰＡＭ配列を有するプロトスペーサーを標的とする構築物により形質転換しても、形質転換効率は影響を受けなかった（図１２Ａ）。コロニー数は、ｐＮＷ３３ｎポジティブ対照構築物による変換後のコロニー数と同じ範囲にあった（図１２Ｂ）。ｐｙｒＦ遺伝子が欠失されたコロニーをスクリーニングするために、コロニーＰＣＲに施した１５のコロニーの中で、欠失遺伝子型－２．１ｋｂ予期バンドサイズを示すものはなく、すべて、野生型－２．９ｋｂ予期バンドサイズであった（図１３）。このことは、試験したＰＡＭは、確かに、ｉｎ ｖｉｖｏでｇｔＣａｓ９により認識されなかったことを示している。
２．ポジティブ対照（ｐＮＷ３３ｎで形質転換した細胞）と比較すると、細胞が構築物番号１により形質転換されると、わずか数個のコロニーしか得られなかった（図１２Ｃ）。２０のコロニーに、ｐｙｒＦ遺伝子を欠失したコロニーをスクリーニングするためのコロニーＰＣＲを施した。コロニーの大部分（１９）は、野生型およびｐｙｒＦ欠失遺伝子型の両方を含有した一方、１つのコロニーは、ｐｙｒＦ欠失遺伝子型を有した（図１４）。この結果により、ＷＴのみの遺伝子型が観察されなかったので、ＰＡＭ配列ＡＴＣＣＣＣＡＡ［配列番号２１］は、ｇｔＣａｓ９によってｉｎ ｖｉｖｏで認識されることが示された。低下した形質転換効率はまた、細胞集団の割合が低下したことをやはり示し、このことは、ｇｔＣａｓ９によるターゲティングの成功によって、ＤＳＤＢによるＷＴのみの遺伝子型細胞に引き起こされる細胞死に寄与し得る。
３．細胞が構築物番号２により形質転換されると、コロニーが得られなかった（図１２Ｄ）。コロニーが欠如したことは、細胞集団のすべてがｇｔＣａｓ９により首尾よくターゲティングされ、これにより、ＤＳＤＢにより引き起こされる細胞死に至ったことを示す。これは、ＡＣＧＧＣＣＡＡ［配列番号２２］ＰＡＭ配列が、ｇｔＣａｓ９によって認識されることを示唆する。
これらの結果は、ｇｔＣａｓ９が、５５℃で、ｉｎ ｖｉｖｏで、上記のＰＡＭ配列により活性となること、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＡＭ決定結果と一致する結果となることを示している。さらに、それは、プラスミド媒介性相同組換え鋳型と組み合わせて、同一温度においてゲノム編集ツールとして使用することができる。
説明の以下の項目は、本明細書に既に記載されている、本発明の記述を単に提示する番号付けした段落からなる。この項目における番号付けした段落は、特許請求の範囲ではない。特許請求の範囲は、後の項目「特許請求の範囲」において以下に説明されている。
１．ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含む、単離されたＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質またはポリペプチドであって
少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子と会合すると、Ｃａｓタンパク質は、５０℃と１００℃の間の核酸切断が可能であり、ポリヌクレオチドは、ターゲティングＲＮＡ分子により認識される標的核酸配列を含む、上記タンパク質またはポリペプチド。
２．配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する単離Ｃａｓタンパク質またはポリペプチド断片であって、標的配列を認識する少なくとも１つのＲＮＡ分子と会合すると、Ｃａｓタンパク質は、５０℃と１００℃の間の温度で、標的核酸配列を含むポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、改変するまたは標識することができる、単離Ｃａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
３．Ｃａｓタンパク質またはポリペプチド断片が、５０℃と７５℃の間の温度、好ましくは６０℃超の温度、より好ましくは６０℃と８０℃の間の温度、より好ましくは６０℃と６５℃の間の温度で、核酸の結合、切断、標識または改変が可能である、段落番号１または段落番号２のＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
４．核酸の結合、切断、標識または改変が、ＤＮＡ切断である、段落番号１から３のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
５．アミノ酸配列が、配列番号１、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を含む、前記段落番号のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
６．前記Ｃａｓタンパク質が細菌、古細菌またはウイルスから入手可能である、前記段落番号のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
７．前記Ｃａｓタンパク質がゲオバチルス（Geobacillus）属種から、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から入手可能である、前記段落番号のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
８．前記段落番号のいずれのＣａｓタンパク質を含み、標的ポリヌクレオチド中の配列を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を含む、リボ核タンパク質複合体。
９．前記ターゲティングＲＮＡ分子がｃｒＲＮＡおよび任意選択でｔｒａｃｒＲＮＡを含む、段落番号８のリボ核タンパク質複合体。
１０．前記少なくとも１つのＲＮＡ分子の長さが３５～１３５ヌクレオチド残基の範囲である、段落番号７から９のいずれかのリボ核タンパク質複合体。
１１．前記標的配列が３１または３２ヌクレオチド残基長である、段落番号８または９のリボ核タンパク質複合体。
１２．タンパク質またはポリペプチドが、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供される、段落番号１から７のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド、または８から１１のいずれかのリボ核タンパク質複合体。
１３．前記Ｃａｓタンパク質もしくはポリペプチドおよび／または前記少なくとも１つのさらなるタンパク質が少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、段落番号１２のＣａｓタンパク質、ポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
１４．前記少なくとも１つの機能的部分が、前記Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体のＮ終端および／またはＣ終端、好ましくはＮ終端に融合または連結している、段落番号１３のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
１５．前記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択される、段落番号１３または１４のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
１６．Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、段落番号１５のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
１７．前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、段落番号１５または１６のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
１８．少なくとも１つの機能的部分が、マーカータンパク質、例えばＧＦＰである、段落番号１５から１７のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体。
１９．Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードする、単離核酸分子であって、
ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含み、
少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子と会合すると、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドが、５０℃と１００℃の間で、ＤＮＡ結合、切断、標識または改変が可能であり、ポリヌクレオチドが、ターゲティングＲＮＡ分子により認識される標的核酸配列を含む、上記単離核酸分子。
２０．配列番号１のアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有するＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質、またはそのポリペプチド断片をコードする単離された核酸分子。
２１．翻訳されると前記Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドと融合するアミノ酸配列をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む、段落番号１９または２０の単離された核酸分子。
２２．前記Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子に融合する前記少なくとも１つの核酸配列が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択されるタンパク質をコードする、段落番号２１の単離された核酸分子。
２３．段落番号１９から２２のいずれかの核酸分子を含む発現ベクター。
２４．少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、段落番号２３の発現ベクター。
２５．標的核酸を改変する方法であって、前記核酸を、
ａ．段落番号６から１１のいずれかのリボ核タンパク質複合体、または
ｂ．段落番号１２から１８のいずれかのタンパク質またはタンパク質複合体および段落番号６から１１のいずれかの少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子
と接触させることを含む方法。
２６．細胞中で標的核酸を改変する方法であって、前記細胞を段落番号２４の発現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入すること、または代わりに前記細胞を段落番号２３の発現ベクターおよび段落番号６から１１のいずれかのターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入することを含む方法。
２７．細胞中で標的核酸を改変する方法であって、前記細胞を段落番号２３の発現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入し、次いで、段落番号６から１１のいずれかのターゲティングＲＮＡ分子を前記細胞に、または前記細胞内に送達することを含む方法。
２８．段落番号２５から２８のいずれかの標的核酸を改変する方法であって、前記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質またはレポータータンパク質であり、前記マーカータンパク質またはレポータータンパク質が前記標的核酸と会合し、好ましくは前記マーカーが蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、方法。
２９．前記標的核酸がＤＮＡ、好ましくはｄｓＤＮＡである、段落番号２５から２８のいずれかの方法。
３０．前記標的核酸がＲＮＡである、段落番号２５から２８のいずれかの方法。
３１．段落番号２９の標的核酸を改変する方法であって、前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、前記改変が所望の遺伝子座での一本鎖または二本鎖切断である、方法。
３２．段落番号２６、２７、２９または３１方法のいずれかに従って所望の遺伝子座で遺伝子発現をサイレンシングする方法。
３３．段落番号２６、２７、２９または３１の方法のいずれかに従って所望の位置で所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入する方法。
３４．段落番号２５から２９のいずれかの方法の標的核酸配列を改変することを含む、細胞中で遺伝子発現を改変する方法であって、前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記機能的部分がＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性化因子または転写リプレッサーから選択される、方法。
３５．段落番号３０の方法の標的核酸配列を改変することを含む、細胞中で遺伝子発現を改変する方法であって、前記核酸がｍＲＮＡであり、前記機能的部分がリボヌクレアーゼであり、任意選択でエンドヌクレアーゼ、３’エキソヌクレアーゼまたは５’エキソヌクレアーゼから選択される、方法。
３６．５０℃と１００℃の間の温度で実行される、段落番号２５から３５のいずれかの標的核酸を改変する方法。
３７．６０℃または６０℃より上、好ましくは６０℃と８０℃の間、より好ましくは６０℃と６５℃の間の温度で実行される、段落番号３６の標的核酸を改変する方法。
３８．前記細胞が原核細胞である、段落番号２５から３７のいずれかの方法。
３９．前記細胞が真核細胞である、段落番号２５から３８のいずれかの方法。
４０．段落番号２２から３６のいずれかの方法により形質転換される宿主細胞。

Claims (13)

  1. Ｃａｓタンパク質、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、および前記標的ポリヌクレオチドを含む、核タンパク質複合体であって、
    前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有し、３０℃から８０℃までの範囲の温度で前記二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合し、核酸を切断し、標識し、または改変することが可能であり、
    前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、ならびに前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列および前記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む非標的核酸鎖を含み、前記ＰＡＭ配列が５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含む、核タンパク質複合体。
  2. 前記結合、切断、標識、もしくは改変、または核タンパク質複合体が、５５℃から６５℃までの範囲の温度で形成される、請求項１に記載の核タンパク質複合体。
  3. 前記標的核酸配列を含む前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが前記Ｃａｓタンパク質により切断される、請求項１または２に記載の核タンパク質複合体。
  4. 前記標的核酸配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記結合、切断、標識または改変が、前記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、請求項１から３のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  5. 前記Ｃａｓタンパク質が、前記二本鎖ＤＮＡを切断するヌクレアーゼ活性を欠き、それでもなお前記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングがもたらされる、請求項４に記載の核タンパク質複合体。
  6. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＣＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＣＮ－３’、５’－ＮＣＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］、または５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］を含む、請求項１から５のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  7. 前記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１から６のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  8. 前記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド残基の範囲である、または
    前記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、請求項１から７のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  9. 前記Ｃａｓタンパク質が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープ、親和性精製タグ、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  10. 二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変するインビトロまたはエキソビボの方法であって、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸を含み、前記方法が、
    ａ．少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を設計するステップであって、前記ターゲティングＲＮＡ分子が、前記標的核酸鎖の前記標的核酸配列を認識し、前記非標的核酸鎖が、前記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含む、ステップ、
    ｂ．前記ターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体を形成するステップであって、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有し、３０℃から８０℃までの範囲の温度で標的ポリヌクレオチドに結合し、標的ポリヌクレオチドを切断し、標識し、または改変することが可能である、ステップ、および
    ｃ．前記リボ核タンパク質複合体が、前記標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する、ステップ
    を含む方法。
  11. 請求項１０に記載の、二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変するインビトロまたはエキソビボの方法であって、
    前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＣＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＣＮ－３’、５’－ＮＣＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］、または５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］を含む、方法。
  12. 標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変するための、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質のインビトロまたはエキソビボでの使用であって、
    前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、
    前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有し、３０℃から８０℃までの範囲の温度で二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合し、二本鎖標的ポリヌクレオチドを切断し、標識し、または改変することが可能であり、
    前記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子が、前記標的核酸配列を認識し、
    前記非標的核酸鎖が、前記プロトスペーサー核酸配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含む、使用。
  13. 請求項１２に記載のインビトロまたはエキソビボの使用であって、
    前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＣＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＣＮ－３’、５’－ＮＣＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］、または５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］を含む、使用。

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