JP2022166045A - 熱安定性ｃａｓ９ヌクレアーゼ - Google Patents

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Abstract

【課題】ゲノム編集を高温で実行するのを可能にする熱安定性Ｃａｓ９変異体およびＲＮＡ分子を提供する。【解決手段】Ｃａｓタンパク質、二本鎖標的ポリヌクレオチド中の標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、および標的ポリヌクレオチドを含む核タンパク質複合体であって、前記Ｃａｓタンパク質が、特定のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を有し、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドは、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、ならびに前記標的核酸配列に相補的なプロトスペーサー核酸配列および前記プロトスペーサー核酸配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む非標的核酸鎖を含み、前記ＰＡＭ配列が５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含み、前記核タンパク複合体はヒト細胞内にないものである、核タンパク質複合体を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝子工学の分野に関し、さらに詳細には核酸編集およびゲノム改変に関す
る。本発明は、遺伝物質の配列依存部位特異的結合、ニッキング、切断および改変のため
に構成することができるヌクレアーゼ；その上、遺伝物質の配列特異的部位に活性、特に
ヌクレアーゼ活性を働かせるリボ核タンパク質、ならびにマーカーとして使用するための
修飾ヌクレアーゼおよびリボ核タンパク質の形態での遺伝子工学ツールに関する。したが
って、本発明は、非ヒト細胞内でのヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの送達および発現の
ための関連発現構築物にも関する。さらに、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖ
ｉｖｏでの核酸の配列特異的編集およびそれを達成するのに使用される方法に関する。本
発明が関係する特定の分野は、好熱性生物、特に微生物の遺伝子操作である。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓが多くの細菌および大半の古細菌での適応免疫系であることは２
００７年に初めて実証された（Barrangou et al., 2007, Science 315: 1709-1712）、Br
ouns et al., 2008, Science 321: 960-964）。機能的および構造的判断基準に基づいて
、３つのタイプをそれぞれ含む２種類のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系がこれまで特徴付けられ
ており、その大半が相補的であるＤＮＡ配列を標的にするためのガイドとして小型ＲＮＡ
分子を使用している（Makarova et al., 2015, Nat Rev Microbiol 13: 722-736；Mahanr
aju et al., 2016, Science 353: aad5147）。
Ｄｏｕｄｎａ／Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ研究室による最近の研究では、クラス２／ＩＩ
型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（Ｃａｓ９）のエフェクター酵素の徹底的な特徴付けが実施さ
れ、設計されたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイド（特異的スペーサー配列を有する）の導入に
よりプラスミド上の相補的配列（プロトスペーサー）が標的にされ、このプラスミドの二
本鎖切断が引き起こされることが実証された（Jinek et al., 2012, Science 337: 816-8
21）。Jinek et al., 2012に続いて、Ｃａｓ９はゲノム編集のためのツールとして使用さ
れる。
Ｃａｓ９は様々な真核細胞（例えば、魚、植物、ヒト）のゲノムを操作するのに使用さ
れてきた（Charpentier and Doudna, 2013, Nature 495: 50-51）。
さらに、Ｃａｓ９は、特定の組換え事象を選び出すことにより細菌での相同組換えの収
率を改善するのに使用されてきた（Jiang et al., 2013, Nature Biotechnol 31: 233-23
9）。これを達成するためには、毒性断片（ターゲティング構築物）に所望の変化をもつ
レスキュー断片（編集構築物、点突然変異または欠失を有する）を共トランスフェクトす
る。ターゲティング構築物は、デザインＣＲＩＳＰＲと組み合わせたＣａｓ９および宿主
染色体上で所望の組換え部位を規定する抗生物質耐性マーカーからなり、対応する抗生物
質の存在下では宿主染色体でのターゲティング構築物の組込みが選択される。ＣＲＩＳＰ
Ｒ標的部位を有する編集構築物の追加の組換えが宿主染色体で起こる場合のみ、宿主は自
己免疫問題から逃れることが可能である。したがって、抗生物質の存在下では、所望の（
マーカーなし）突然変異体のみが生き延びて成長することができる。染色体から組み込ま
れたターゲティング構築物のその後の除去を選ぶ関連戦略も提起されており、本物のマー
カーなし突然変異体を生み出している。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ媒介ゲノム編集は遺伝子工学のための有用なツールを成すことが
近年確立された。原核生物ＣＲＩＳＰＲ系が適応免疫系としてその宿主に役立ち（Jinek
et al., 2012, Science 337: 816-821）、迅速で効果的な遺伝子工学のために使用するこ
とが可能であり（例えば、Mali et al., 2013, Nat Methods 10:957-963）、目的の配列
を標的にするためにはガイド配列の改変のみが必要であることが確立されている。
しかし、遺伝子研究およびゲノム編集の分野での応用のために種々の実験条件下で改良
された配列特異的核酸検出、切断および操作ができる作用因子の開発の必要性が続けて存
在している。特に、Ｃａｓ９を含む現在利用可能な配列特異的ゲノム編集ツールは、あら
ゆる条件または生物での使用に適用可能なわけではなく、例えば、配列特異的ヌクレアー
ゼは相対的に熱感受性であり、したがって、厳密に好熱性の微生物（４１℃と１２２℃の
間で成長することができ、最適には４５℃超から８０℃の温度範囲で成長し、超好熱菌は
８０℃より上で最適成長できる）、例えば、工業用発酵においてまたは高温で行われるｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ実験工程のために使用される微生物での使用には適用可能ではない。
好熱菌において活性Ｃａｓ９タンパク質についての実験的証拠は現在まで存在しない。
細菌におけるＣａｓ９の存在下でのChylinski et al. (2014; Nucleic Acids Research 4
2: 6091-6105)による比較ゲノムスクリーニングに基づいて、ＩＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－
Ｃａｓ系はすべての細菌ゲノムのおおよそ３．３％に存在するだけであることが見出され
た。好熱性細菌のなかで、ＩＩ型系は統計分析（Ｐ＝０．００１９）に基づいて過小に見
積もられている。さらに、古細菌ではＩＩ型系は見出されていないが、これはおそらく古
細菌にはリボヌクレアーゼＩＩＩタンパク質（ＩＩ型系に関与する）が存在しないせいで
あろう。Chylinski, et al., (2014; Nucleic Acids Research 42: 6091-6105)は、ＩＩ
型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の分類および進化を過去に報告しており、特に、これらの系を
示す２つの種が同定されているが、これらの種は最大５５℃で成長し、最適成長温度が６
０～８０℃であり、超好熱菌では８０℃より上で最適に成長できる厳密に好熱性の成長を
示してはいない。
細菌ゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の希少性、特に、Ｃａｓ９が最適成長温度
が４５℃よりも低い細菌（古細菌ではない）でしか見つかっていないという事実にもかか
わらず、本発明者らは、驚くべきことに、ゲノム編集を高温で実行するのを可能にするい
くつかの熱安定性Ｃａｓ９変異体を発見した。発明者はまた、高温を含めた、幅広い範囲
の温度にわたるゲノム編集の実施を可能にする、熱安定性Ｃａｓ９変異体と共に働く、最
適化プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を発見した。関連ＰＡＭ配列の認識に
より設計された、これらのＣａｓ９ヌクレアーゼおよびＲＮＡ分子は、高温での遺伝子工
学のための新規のツールとなり、好熱性生物、特に微生物の遺伝子操作に特に価値がある
。
好熱性ゲオバチルス（Geobacillus）属の系統発生学的再評価が、最近行われ、これに
より、新しい属、すなわちパラゲオバチルス（Parageobacillus）の創生をもたらした。
これにより、ゲオバチルス（Geobacillus）の以前の一部の属種は、パラゲオバチルス（P
arageobacillus）に系統的に、再度、帰属され、したがって、再命名された（Aliyu et a
l.,(2016) Systematic and Applied Microbiology 39:527-533）。
クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）および
ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は、侵入遺伝的エレメントに対して、原核生物に
おける、適応免疫および遺伝免疫をもたらす（Brouns et al. Science 321,(2008)；Barr
angou et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.
Science 315,(2007)；Wright et al. Cell 164, 29-44(2016)；Mohanraju et al. Scien
ce 353, aad5147(2016)）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、その複雑さおよびシグネチャタ
ンパク質に応じて、２つのクラス（１および２）および６つのタイプ（Ｉ～ＶＩ）に分類
される（Makarova et al. Nat. Rev. Microbiol. 13, 722-736(2015)）。ＩＩ型ＣＲＩＳ
ＰＲ－Ｃａｓ９およびＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ（以前には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐ
ｆ１と呼ばれていた）を含むクラス２系が、最近、真核生物（Komor et al. Cell 168, 2
0-36(2017)；Puchta, Curr. Opin. Plant Biol. 36, 1-8(2017)；Xu et al. J. Genet. G
enomics 42, 141-149(2015)；Tang et al. Nat. Plants 3, 17018(2017)；Zetsche et al
. Nat. Biotechnol. 35, 31-34(2016)）と原核生物（Mougiakos, et al. Trends Biotech
nol. 34,、575-587(2016)）の両方に対するゲノム工学ツールとして活用された。これら
の系は、単一ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＲＮＡガイドＲＮＡにより形成されるリボ
核タンパク質（ＲＮＰ）複合体に基づいた、標的二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を導入する
ので、それらの系は、最も簡単なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のなかで知られているものであ
る。
現在まで、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、
最もよく特徴付けられており、ゲノム工学のための最も広範に使用されているＣａｓ９で
ある。数種の他のＩＩ型系が特徴付けられているが、それらのどれも、好熱性生物から誘
導されたものではない（Nakade, et al. Bioengineered 1-9(2017). doi:10.1080/216559
79.2017.1282018）。このようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の特徴付けは、基礎的な考察、
および新規な用途にとって興味深いものとなろう。
いくつかの好熱菌の場合、基礎的な遺伝的ツールが利用可能であるが（Taylor et al.
Microb. Biotechnol. 4, 438-448(2011)；Olson, et al. Curr. Opin. Biotechnol. 33,
130-141(2015)；Zeldes, et al. Front. Microbiol. 6, 1209(2015)）、これらのツール
の効率は、依然として低すぎるため、この興味深い生物群の完全な探索および実施は可能
ではない。ＳｐＣａｓ９は、ｉｎ ｖｉｖｏでは、≧４２℃で活性ではないという本発明
者らの知見に基づくと、本発明者らは、高温での相同組換えと中温でのＳｐＣａｓ９に基
づく対向選択とを組み合わせた、条件的好熱菌に対するＳｐＣａｓ９に基づく工学ツール
を以前に開発した（Mougiakos et al. ACS Synth. Biol. 6, 849-861(2017)）。しかし、
ＳｐＣａｓ９は、４２℃以上では活性ではないので、偏性好熱菌に対するＣａｓ９に基づ
く編集およびサイレンシングツールは、依然として利用可能ではなく（Mougiakos et al.
ACS Synth. Biol. 6, 849-861(2017)）、これまで、好熱性Ｃａｓ９は特徴付けられてい
ない。
発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９：好熱性細菌であるゲオバチルス・サーモデニトリ
フィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＩＩ
Ｃ型系からＲＮＡ－ガイドＤＮＡ－エンドヌクレアーゼを発見して、特徴付けた。発明者
らは、驚くべきことに、幅広い温度範囲にわたる、そのｉｎ ｖｉｔｒｏで活性を示し、
熱安定性に対するｓｇＲＮＡ－構造の重要性を実証し、幅広い温度範囲にわたる、ｉｎ
ｖｉｖｏでのゲノム編集に、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を適用した。
したがって、本発明は、
ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシ
ン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラ
ギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独
立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）
；および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまた
はフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独
立して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸ま
たはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つであ
る）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（
式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであ
り、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンで
あり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含む、単離されたＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：クラス
ター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩ
ＳＰＲ関連）タンパク質またはポリペプチドを提供する。
疑義タンパク質を回避するため、本発明のＣａｓタンパク質をコードするポリペプチド
または核酸はまた、「ＧｔＣａｓ９」または「ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９」と称することがで
きる。「ＧｔＣａｓ９」および「ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９」は、本明細書全体にわたって互
換的に使用され、同じ意味を有する。
本発明の状況でのポリペプチドは、完全長Ｃａｓタンパク質の断片と見なしてもよい。
そのような断片は不活性であり、遺伝物質の結合、編集および／または切断と直接関連の
ない方法でおよび目的のために、例えば、アッセイでの標準または抗体を産生するなどの
ために使用してもよい。
しかし、好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも
１つのターゲティングＲＮＡ分子、およびターゲティングＲＮＡ分子により認識される標
的核酸配列を含むポリヌクレオチドと会合すると、２０℃から１００℃までの範囲の温度
で機能的であり、切断、結合、標識または改変することができる。好ましくは、Ｃａｓタ
ンパク質またはポリペプチドは、機能的であり、５０℃から７０℃までの範囲の温度、例
えば５５℃または６０℃で、前記切断、結合、標識または改変が可能である。
特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］を
含むＣａｓタンパク質またはポリペプチドを提供することができる。他の実施形態では、
Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドはアミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番
号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、
Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３は
グルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸または
アルギニンのうちの１つである）をさらに含んでいてもよい。
他の実施形態では、本明細書で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドはアミ
ノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニル
アラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択
される）を追加でさらに含んでいてもよい。
他の実施形態では、本明細書で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドはアミ
ノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロ
イシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）を追加
でさらに含んでいてもよい。
他の実施形態では、本明細書で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドはアミ
ノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９
はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１
はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１
３はリシンまたはセリンである）を追加でさらに含んでいてもよい。
本発明に従えば、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは配列番号２から６の
モチーフのうちのいずれでも、単独でまたは組み合わせて含むことができることが認識さ
れうる。以下は、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドを特徴付けることができ
るモチーフの組合せのそれぞれを要約している。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中
、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン
、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸
またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンの
うちの１つである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中
、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン
、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸
またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンの
うちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニン
またはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンか
ら独立して選択される）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中
、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン
、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸
またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンの
うちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニン
またはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンか
ら独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタ
ミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの
１つである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中
、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン
、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸
またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンの
うちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニン
またはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンか
ら独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタ
ミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの
１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式
中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり
、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであ
り、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中
、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン
、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸
またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンの
うちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニン
またはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンか
ら独立して選択される）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番
号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリ
シンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはア
ラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中
、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン
、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸
またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンの
うちの１つである）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン
酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つ
である）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、
Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ
１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、
Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ
５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたは
アスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中
、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたは
リシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配
列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまた
はリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまた
はアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ
５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたは
アスパラギンから独立して選択される）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ
７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシ
ンのうちの１つである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１
３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミ
ンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギ
ンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ
５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたは
アスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中
、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたは
リシンのうちの１つである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ
５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたは
アスパラギンから独立して選択される）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥ
Ｘ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグル
タミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパ
ラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ
７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシ
ンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番
号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリ
シンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはア
ラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたは
プロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシ
ンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４
はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６
ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択
され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたは
プロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシ
ンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４
はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６
ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択
され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹ
ＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８は
トリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたは
プロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシ
ンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４
はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６
ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択
され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹ
ＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８は
トリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１
１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸で
あり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであ
り、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたは
プロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシ
ンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４
はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ７ＶＹＳＸ
８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリ
プトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１Ｒ
ＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり
、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、
Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたは
プロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシ
ンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４
はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ７ＶＹＳＸ
８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリ
プトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたは
プロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシ
ンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４
はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１
０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミ
ン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニ
ンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンで
ある）。
Ｘ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンか
ら独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；
およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシン
であり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９
ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたは
グルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまた
はアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたは
セリンである）。
Ｘ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンか
ら独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；
およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシン
であり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
Ｘ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンか
ら独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；
およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラ
ニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアル
ギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリ
シンまたはセリンである）。
Ｘ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであ
り、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹ
Ｘ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグル
タミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはア
ラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリ
ンである）。
別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％
の同一性の配列を有する、単離Ｃａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片を提供し、
Ｃａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片は、以下のモチーフまたはアミノ酸：
ＩＧＬＤＩＧＩＴＳＩＧ［配列番号２３］、好ましくはＩＧＬＤＩＧＩＴＳＩＧＷＡＶＩ
ＮＬＤ［配列番号２４］を含む、ＲｕｖＣ－Ｉドメイン
ＲＳＡＲＲ［配列番号２５］、好ましくはＰＲＲＬＡＲＳＡＲＲＲＬＲＲＲＫＨＲＬＥＲ
ＩＲＲＬ［配列番号２６］を含む架橋ドメイン；および／または
ＷＱＬＲ［配列番号２７］を含む、α－ヘリカル／認識ローブドメイン；および／または
ＨＬＡＫＲＲＧ［配列番号２８］、好ましくはＬＡＲＩＬＬＨＬＡＫＲＲＧ［配列番号２
９］を含む、α－ヘリカル／認識ローブドメイン；および／または
ＩＦＡＫＱ［配列番号３０］、好ましくはＥＩＫＬＩＦＡＫＱ［配列番号３１］を含む、
α－ヘリカル／認識ローブドメイン；および／または
ＩＷＡＳＱＲ［配列番号３２］；および／または
ＫＶＧＦＣＴＦＥＰＫＥＫＲＡＰＫ［配列番号３３］；および／または
ＦＴＶＷＥＨＩＮＫＬＲＬ［配列番号３４］を含む、α－ヘリカル／認識ローブドメイン
；および／または
モチーフＩＡＮＰＶＶＭＲＡＬＴＱ［配列番号３５］、好ましくはＩＡＮＰＶＶＭＲＡＬ
ＴＱＡＲＫＶＶＮＡＩＩＫＫＹＧ［配列番号３６］を含む、ＲｕｖＣ－ＩＩドメイン；お
よび／または
モチーフＥＬＡＲ［配列番号３７］、好ましくはＩＨＩＥＬＡＲＥ［配列番号３８］を含
む、ＲｕｖＣ－ＩＩドメイン；および／または
モチーフＱＮＧＫＣＡＹ［配列番号３９］、好ましくはＩＶＫＦＫＬＷＳＥＱＮＧＫＣＡ
Ｙ［配列番号４０］を含む、ＨＮＨドメイン；および／または
モチーフＶＤＨＶＩＰ［配列番号４１］、好ましくはＶＤＨＶＩＰＹＳＲＳＬＤＤＳＹＴ
ＮＫＶＬ［配列番号４２］を含む、ＨＮＨドメイン；および／または
モチーフＤＴＲＹＩＳＲＦＬＡＮ［配列番号４３］を含む、ＲｕｖＣ－ＩＩＩドメイン；
および／または
モチーフＶＹＴＶＮＧＲＩＴＡＨＬＲＳＲＷ［配列番号４４］を含む、ＲｕｖＣ－ＩＩＩ
ドメイン；および／または
モチーフＨＨＡＶＤＡ［配列番号４５］、好ましくはＨＨＡＶＤＡＡＩＶＡ［配列番号４
６］を含む、ＲｕｖＣ－ＩＩＩドメイン
のいずれかを、単独または組合せのどちらかで含む。
好ましくは、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の
同一性の配列を有する、単離Ｃａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片を提供し、Ｃ
ａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片は、アミノ酸モチーフ［配列番号２３］～［
配列番号４６］の各々を組み合わせて含む。
別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７７％の
同一性の配列を有する単離されたＣａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片を提供す
る。好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、２０℃から１００℃までの範
囲の温度で、結合、切断、標識または改変が可能である。好ましくは、Ｃａｓタンパク質
またはポリペプチドは、２０℃と７０℃の間の範囲、例えば２５℃、５５℃、６０℃また
は６５℃で、前記切断、結合、標識または改変が可能である。好ましくは、Ｃａｓタンパ
ク質またはポリペプチドは、５０℃と７０℃の間の範囲の温度、例えば５５℃または６０
℃で、前記切断、結合、標識または改変が可能である。好ましくは、Ｃａｓタンパク質ま
たはポリペプチドは、３０℃と８０℃の間の範囲の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で
、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらによ
り好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で、前記切断、結合
、標識または改変が可能である。
本発明はまた、標的核酸配列を含む標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する
、標識するまたは改変するための、本明細書で提供されるターゲティングＲＮＡ分子およ
びＣａｓタンパク質またはポリペプチドの使用を提供する。ターゲティングＲＮＡ分子は
、ポリヌクレオチドの標的核酸鎖上の標的核酸配列を認識する。
標的核酸配列を含む標的ポリヌクレオチドは、二本鎖であってもよく、したがって、前
記標的核酸配列を含む標的核酸配列鎖、およびプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核
酸鎖を含む。プロトスペーサー核酸配列は、この標的核酸配列に実質的に相補的であり、
二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて、それと対合する。非標的核酸鎖は、プロトスペー
サー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさら
に含むことができる。このＰＡＭ配列は、長さが少なくとも６つ、７つまたは８つの核酸
とすることができる。好ましくは、ＰＡＭ配列は、５位にシトシンを有する。好ましくは
、ＰＡＭ配列は、配列５’－ＮＮＮＮＣ－３’を含み、したがって、ＰＡＭ配列は、５’
末端から、５’－ＮＮＮＮＣ－３’が始まる。さらにまたは代替的に、ＰＡＭ配列は、８
位にアデニンを有することができ、したがってＰＡＭ配列は、配列５’－ＮＮＮＮＮＮＮ
Ａ－３’を含み、ＰＡＭ配列は、５’末端から、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＡ－３’が始まる
。さらにまたは代替的に、ＰＡＭ配列は、１位、２位、３位、４位および６位のうちの１
つまたは複数にシトシンを有してもよく、こうして、ＰＡＭ配列は、５’末端から、５’
－ＣＮＮＮＮ－３’、５’－ＮＣＮＮＮ－３’、５’－ＮＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮ
ＣＮ－３’および／または５’－ＮＮＮＮＮＣ－３’が始まる。任意選択で、ＰＡＭ配列
は、ＰＡＭ配列が、５’末端から、５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］から
始まるように含み、さらに好ましくは、ＰＡＭ配列は、５’末端から、ＰＡＭ配列が５’
－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］で始まるように含む。他の好ましいＰＡＭ配
列は、５’－ＡＴＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号２１］および５’－ＡＣＧＧＣＣＡＡ－
３’［配列番号２２］を含む。
好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、４０℃から８０℃までの範囲、
好ましくは４５℃から８０℃までの範囲、さらに好ましくは５０℃から８０℃までの範囲
の温度で、結合、切断、標識または改変することができる。例えば、結合、切断、標識ま
たは改変は、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３
℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３
℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３
℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃または８０℃の温度で行われる。
より好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、５５から６５℃までの範囲の
温度で、結合、切断、標識または改変が可能である。好ましい態様では、本発明のＣａｓ
タンパク質またはポリペプチド断片は、配列番号１に対して少なくとも７５％の同一性；
好ましくは少なくとも８５％；より好ましくは少なくとも９０％；さらにより好ましくは
少なくとも９５％の同一性のアミノ酸配列を含むことができる。
Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、標的核酸鎖上の標的核酸配列を認識するター
ゲティングＲＮＡ分子と組み合わせて使用することができ、非標的核酸配列は、本明細書
に開示される通り、非標的鎖上のプロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するＰＡＭ
配列を有する。したがって、ＰＡＭ配列は、配列５’－ＮＮＮＮＣ－３’を含むことがで
き、Ｃａｓタンパク質は、２０℃から１００℃までの範囲、好ましくは３０℃から９０℃
までの範囲、３７℃から７８℃までの範囲、４０℃から８０℃までの範囲、５０℃から７
０℃までの範囲、または５５℃から６５℃までの範囲の温度で、標的鎖に結合する、これ
を切断する、標識するまたは改変することができる。好ましくは、５’末端から、ＰＡＭ
配列は、５’－ＮＮＮＮＣ－３’で始まり、Ｃａｓタンパク質は、２０℃から１００℃ま
での範囲、好ましくは３０℃から９０℃までの範囲、３７℃から７８℃までの範囲、４０
℃から８０℃までの範囲、５０℃から７０℃までの範囲、または５５℃から６５℃までの
範囲の温度で、標的鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変することができ
る。好ましくは、５’末端から、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＡ－３’で始まり
、Ｃａｓタンパク質は、２０℃から１００℃までの範囲、好ましくは３０℃から９０℃ま
での範囲、３７℃から７８℃までの範囲、４０℃から８０℃までの範囲、５０℃から７０
℃までの範囲、または５５℃から６５℃までの範囲の温度で、標的鎖に結合する、これを
切断する、標識するまたは改変することができる。さらに好ましくは、ＰＡＭ配列の５’
末端は、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］で始まり、Ｃａｓタンパク質は
、２０℃から１００℃までの範囲、好ましくは３０℃から９０℃までの範囲、３７℃から
７８℃までの範囲、４０℃から８０℃までの範囲、５０℃から７０℃までの範囲、または
５５℃から６５℃までの範囲の温度で、標的鎖に結合する、これを切断する、標識するま
たは改変することができる。
さらに詳細には、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、配列番号１と以下
の通り：少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、
少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくと
も６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％
、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なく
とも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１
％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少な
くとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９
０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少
なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも
９９％、少なくとも９９．５％または少なくとも９９．８％のパーセント同一性を有する
アミノ酸配列を含むことができる。パーセント同一性は、少なくとも８９％とすることが
できる。パーセント同一性は、少なくとも９０％とすることができる。好ましくは、パー
セント同一性は、少なくとも９５％、例えば９８％となろう。
配列番号１とのパーセントアミノ酸配列同一性は、２つの配列の最適整列のために導入
する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れて、選択され
た比較窓において配列により共有されている同一の位置の数の関数として決定可能である
。
本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片は、基準配列の配列番号１とパーセ
ント配列同一性により定義されるその任意の前述のパーセント変異体の両方の点から、単
独でまたは本質的特徴としての前述のアミノ酸モチーフ（すなわち、配列番号２および／
または３および／または４および／または５および／または６）のいずれかと組み合わせ
て、特徴付けることができる。
本発明は、標的核酸配列を含む標的核酸鎖に結合する、これを切断する、標識するまた
は改変するための、本明細書で提供されるターゲティングＲＮＡ分子、および本発明のＣ
ａｓタンパク質またはポリペプチドの使用を提供する。好ましくは、前記結合、切断、標
識または改変は、本明細書に開示される温度で、例えば２０と１００℃の間の温度で行わ
れる。本発明はまた、本明細書で提供されるターゲティングＲＮＡ分子の設計、ならびに
本発明のターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドを含むリ
ボ核タンパク質複合体の形成を含む標的核酸鎖中の標的核酸配列に結合する、これを切断
する、標識するまたは改変する方法を提供する。好ましくは、標的核酸配列のリボ核タン
パク質複合体結合、切断、標識または改変は、本明細書に開示される温度で、例えば３７
と１００℃の間の温度で行われる。
本発明の使用および方法を行うことができ、本発明の核タンパク質は、例えば細菌細胞
において、ｉｎ ｖｉｖｏで、形成して使用される。本発明の使用および方法を行うこと
ができ、本発明の核タンパク質は、ヒト細胞以外のｉｎ ｖｉｖｏで、形成および使用す
ることができる。代替として、本発明の使用および方法を行うことができ、本発明の核タ
ンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、形成して使用される。本発明のＣａｓタンパク質は、
例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する場合、またはトランスフェクションにより細胞に添
加する場合、単離形態で提供されてもよく、Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓタンパ
ク質をコードする核酸によって細胞の一過性または安定的な転換後に、非相同的に発現さ
れてもよく、ターゲティングＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードする核酸によって細胞の
一過性または安定的な転換後に、発現ベクターから転写されてもよく、かつ／またはＲＮ
Ａ分子は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用した場合、またはトランスフェクションによ
り細胞に添加する場合、単離形態で提供されてもよい。好ましい実施形態では、Ｃａｓタ
ンパク質またはポリペプチドが、宿主細胞のゲノムにおいて、Ｃａｓタンパク質またはポ
リペプチドをコードする核酸の安定な統合後に、宿主細胞のゲノムから発現される。した
がって、Ｃａｓタンパク質および／またはＲＮＡ分子は、そうでなければ存在しない、細
胞にタンパク質または核酸分子を加えるための人為的または意図的方法のいずれかを使用
して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの環境に加えることができる。
標的核酸配列を含むポリヌクレオチドは、Ｃａｓタンパク質によって切断することがで
き、任意選択で、切断は、ＤＮＡ切断とすることができる。標的配列を含む標的核酸鎖は
、二本鎖ＤＮＡとすることができ、本方法または使用は、標的核酸配列を含むポリヌクレ
オチドにおける二本鎖切断をもたらすことができる。標的核酸配列を含むポリヌクレオチ
ドは、二本鎖ＤＮＡとすることができ、Ｃａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡを切断する能
力を欠いてもよく、その使用または方法は、ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングを
もたらすことができる。
Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドを本方法、使用、および本発明の核タンパク質を
、２５０ｎＭ以下の濃度で、例えば２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、
５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎ
Ｍ以下の濃度で提供することができる。代替的に、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチド
は、少なくとも０．５ｎＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ
、少なくとも２５ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１５０
ｎＭ、少なくとも２００ｎＭまたは少なくとも２５０ｎＭの濃度で提供することができる
。本発明のＰＡＭ配列は、８位にアデニンを有することができ、したがって、ＰＡＭ配列
は、配列５’－ＮＮＮＮＮＮＮＡ－３’［配列番号４７］を含み、Ｃａｓタンパク質また
はポリペプチドの濃度は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下
、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．５ｎＭ以下とすることができる。ＰＡＭ配列は、配
列５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’を含むことができ、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチ
ドの濃度は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下
、１ｎＭ以下または０．５ｎＭ以下とすることができる。ＰＡＭ配列は、配列５’－ＣＣ
ＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０］を含むことができ、Ｃａｓタンパク質またはポリペ
プチドの濃度は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ
以下、１ｎＭ以下または０．５ｎＭ以下とすることができる。
その上、本発明は本発明の前述のタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードす
る核酸を提供する。核酸は単離されていても発現構築物の形態であってもよい。
本発明のすべての前述の態様では、アミノ酸残基は保存的にも非保存的にも置換されて
いてよい。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似する化学的特性（例えば、電荷
または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって、得られるポリペプチ
ドの機能的特性を変化させないアミノ酸置換のことである。
同様に、核酸配列がポリペプチドの機能に影響を与えずに保存的にも非保存的にも置換
されうることは当業者であれば認識している。保存的に改変された核酸とは、アミノ酸配
列の同一のまたは機能的に同一の変異体をコードする核酸で置換された核酸のことである
。核酸のそれぞれのコドン（ＡＵＧおよびＵＧＧを除く；典型的にはそれぞれメチオニン
またはトリプトファンの唯一のコドン）は改変して機能的に同一の分子を生じることが可
能であることは当業者であれば認識している。したがって、ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドのそれぞれのサイレント変異（すなわち、同義コドン）は、本発明のポリペプチ
ドをコードし、それぞれの記載されているポリペプチド配列に潜在的に含まれている。
本発明は、二本鎖標的ポリヌクレオチドに標的核酸配列を有する形質転換細胞を提供し
、前記細胞は、本明細書で提供されるＣａｓタンパク質またはポリペプチド、および本明
細書で提供される少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を含み、発現ベクターは、
前記Ｃａｓタンパク質および前記ターゲティングＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つをコ
ードする核酸を含む。Ｃａｓタンパク質およびターゲティングＲＮＡ分子により、高温で
、または、例えば本明細書に開示される３７と１００℃の間の温度の範囲の形質転換細胞
において、標的配列の結合、切断、標識または改変を行うことが可能となり得る、または
これらを許容することができる。本発明は、１）本発明のＣａｓタンパク質またはポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列、および本発明のターゲティングＲＮＡ分子をコー
ドするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを細胞に形質転換、トランスフェクトまたは
形質導入する、ステップ；または２）本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびさらには本発明のターゲティング
ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターを細胞に形質転換
、トランスフェクトまたは形質導入する、ステップ；または３）本発明のＣａｓタンパク
質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、および本発明において提供
されているターゲティングＲＮＡ分子を細胞にまたは細部内に送達する発現ベクターを細
胞に形質転換、トランスフェクトまたは形質導入する、ステップのいずれかを含む、細胞
中における標的核酸に結合する、それを切断する、標識するまたは改変する方法をさらに
提供する。Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、例えば、Ｃａｓタンパク質またはポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列のゲノムへの安定な統合後に、形質転換細胞の
ゲノムから発現することができる。
本発明はまた、本発明の使用および方法を行うため、または本発明の形質転換細胞もし
くは核タンパク質複合体を生成するための、１種または複数の試薬を含むキットであって
、本発明のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、または本発明のＣａｓタンパク質も
しくはポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクター；および／または本発明の
ターゲティングＲＮＡ分子、もしくは本発明のターゲティングＲＮＡ分子をコードする核
酸配列を含む発現ベクターを含む、キットを提供する。本キットは、本発明を行うための
指示書、例えば、本発明により、ターゲティングＲＮＡ分子を設計する方法に関する指示
書をさらに含むことができる。
ＲＮＡガイドおよび標的配列
本発明のＣａｓタンパク質は、高温での標的核酸の配列特異的結合、切断、タグ付け、
標識付けまたは改変を可能にする。標的核酸は、ＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）でもＲＮ
Ａでも合成核酸でもよい。本発明の特に有用な応用は、ゲノムＤＮＡの標的配列に相補的
に結合する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合した本発明の１つまたは複
数のＣａｓタンパク質によるゲノムＤＮＡの配列特異的ターゲティングおよび改変である
。したがって、標的核酸は好ましくは二本鎖ＤＮＡである。そのようなターゲティングは
ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも実施することができる。好ましくは、そのよう
なターゲティングはｉｎ ｖｉｖｏで実施される。この方法で、本発明のＣａｓタンパク
質を使用して細胞のゲノムＤＮＡに位置する特定のＤＮＡ配列を標的にして改変すること
ができる。Ｃａｓ系を使用して、異なる生物の種々の細胞型でおよび／または異なる生物
でゲノムを改変することができることが想定されている。
ターゲティングＲＮＡ分子とも呼ばれるｇＲＮＡは、ポリヌクレオチド標的鎖上の標的
核酸配列を認識する。ＲＮＡ分子はまた、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおける標的配列
を認識するよう設計され得、非標的鎖は、プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接す
るプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。本発明のＣａｓタンパク質およ
びポリペプチドを用いて、最適な方法で働くＰＡＭ配列が本明細書に開示される。これら
のＰＡＭ配列の認識により、ｇＲＮＡは、本発明の温度範囲および高い温度にわたり、本
発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドとの使用のために設計することができる。
したがって、本発明は、上文に記載される本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチ
ドを含み、標的ポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列を認識するという点でター
ゲティング機能を有する少なくとも１つのＲＮＡ分子をさらに含むリボ核タンパク質複合
体を提供する。本発明はまた、標的核酸鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは
改変するための、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質ま
たはポリペプチドの使用、および本発明のリボ核タンパク質または核タンパク質、および
Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドおよびターゲティングＲＮＡ分子を有する形質転換
非ヒト細胞を使用する、標的核酸鎖の標的核酸配列に結合する、これを切断する、標識す
るまたは改変する方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるＰＡ
Ｍ配列により、プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接する、規定されたＰＡＭ配列
をさらに含むことができる。このＰＡＭ配列は、長さが６、７または８またはそれより長
い、好ましくは長さが８の核酸とすることができる。好ましくは、ＲＮＡ分子は、一本鎖
ＲＮＡ分子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり、例えば、ハイブリダ
イゼーションによりｔｒａｃｒＲＮＡと会合する。ターゲティングＲＮＡはｃｒＲＮＡと
ｔｒａｃｒＲＮＡのキメラでもよい。前述のＲＮＡ分子は、標的ヌクレオチド配列に対し
て少なくとも９０％の同一性、または相補性のリボヌクレオチド配列を有することができ
る。任意選択で、ＲＮＡ分子は、標的ヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、少な
くとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９
５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もし
くは１００％の同一性または相補性のリボヌクレオチド配列を有する。好ましい標的ヌク
レオチド配列はＤＮＡである。
好ましい態様では、本発明は、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子が標的ＤＮ
Ａ配列にその長さに沿って実質的に相補的である、上文に記載されるリボ核タンパク質複
合体を提供する。
ターゲティングＲＮＡ分子は、核タンパク質複合体内の標的配列に結合し得るまたはこ
れと会合することができ、その結果、非標的鎖上の標的配列およびＰＡＭ配列を含む標的
ポリヌクレオチドは、本発明の核タンパク質複合体と会合し、その結果、本発明の核タン
パク質複合体の一部を形成することができる。
したがって、本発明のＣａｓタンパク質と会合するＲＮＡガイドの配列を変化させると
、Ｃａｓタンパク質をガイドＲＮＡに相補的である部位で二本鎖ＤＮＡを標識または切断
するようプログラムすることが可能になる。
好ましくは、本発明のリボ核タンパク質複合体中の少なくとも１つのターゲティングＲ
ＮＡ分子の長さは、３５から１３５残基の範囲、任意選択で、３５から１３４残基、３５
から１３３残基、３５から１３２残基、３５から１３１残基、３５から１３０残基、３５
から１２９残基、３５から１２８残基、３５から１２７残基、３５から１２６残基、３５
から１２５残基、３５から１２４残基、３５から１２３残基、３５から１２２残基、３５
から１２１残基、３５から１２０残基、３５から１１９残基、３５から１１８残基、３５
から１１７残基、３５から１１６残基、３５から１１５残基、３５から１１４残基、３５
から１１３残基、３５から１１２残基、３５から１１１残基、３５から１００残基、３５
から１０９残基、３５から１０８残基、３５から１０７残基、３５から１０６残基、３５
から１０５残基、３５から１０４残基、３５から１０３残基、３５から１０２残基、３５
から１０１残基、３５から１００残基、３５から９９残基、３５から９８残基、３５から
９７残基、３５から９６残基、３５から９５残基、３５から９４残基、３５から９３残基
、３５から９２残基、３５から９１残基、３５から９０残基、３５から８９残基、３５か
ら８８残基、３５から８７残基、３５から８６残基、３５から８５残基、３５から８４残
基、３５から８３残基、３５から８２残基、３５から８１残基、３５から８０残基、３５
から７９残基、３５から７８残基、３５から７７残基、３５から７６残基、３５から７５
残基、３５から７４残基、３５から７３残基、３５から７２残基、３５から７１残基、３
５から７０残基、３５から６９残基、３５から６８残基、３５から６７残基、３５から６
６残基、３５から６５残基、３５から６４残基、３５から６３残基、３５から６２残基、
３５から６１残基、３５から６０残基、３５から５９残基、３５から５８残基、３５から
５７残基、３５から５６残基、３５から５５残基、３５から５４残基、３５から５３残基
、３５から５２残基、３５から５１残基、３５から５０残基、３５から４９残基、３５か
ら４８残基、３５から４７残基、３５から４６残基、３５から４５残基、３５から４４残
基、３５から４３残基、３５から４２残基、３５から４１残基、３５から４０残基、３５
から３９残基、３５から３８残基、３５から３７残基、３５から３６残基、または３５残
基の範囲である。好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡ分子の長さは、３６から１７４残
基、３７から１７３残基、３８から１７２残基、３９から１７１残基、４０から１７０残
基、４１から１６９残基、４２から１６８残基、４３から１６７残基、４４から１６６残
基、４５から１６５残基、４６から１６４残基、４７から１６３残基、４８から１６２残
基、４９から１６１残基、５０から１６０残基、５１から１５９残基、５２から１５８残
基、５３から１５７残基、５４から１５６残基、３６から７４残基、３７から７３残基、
３８から７２残基、３９から７１残基、４０から７０残基、４１から６９残基、４２から
６８残基、４３から６７残基、４４から６６残基、４５から６５残基、４６から６４残基
、４７から６３残基、４８から６２残基、４９から６１残基、５０から６０残基、５１か
ら５９残基、５２から５８残基、５３から５７残基、５４から５６残基の範囲である。
好ましい態様では、本発明は、少なくとも１つのＲＮＡ分子の相補的部分が少なくとも
３０残基長である、リボ核タンパク質複合体を提供する。代わりに、少なくとも１つのＲ
ＮＡ分子の相補的部分は、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４
０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３
、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、
６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５残基長でもよい。
ターゲティングＲＮＡ分子は、好ましくは、標的核酸配列に対する高い特異性および親
和性を必要とすることになる。未変性ゲル電気泳動、または代わりに等温滴定熱量測定、
表面プラズモン共鳴、もしくは蛍光ベースの滴定法により決定することができる場合、１
μＭから１ｐＭ、好ましくは１ｎＭから１ｐＭ、より好ましくは１～１００ｐＭの範囲の
解離定数（Ｋｄ）が望ましい。親和性は、ゲル遅延度アッセイとも呼ばれる電気泳動移動
度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して決定してもよい（Semenova et al. (2011) PNA
S 108: 10098-10103参照）。
ターゲティングＲＮＡ分子は、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子
として原核生物の性質から分かっていることに合わせて作られる。ｃｒＲＮＡ分子の構造
はすでに確立されており、Jore et al., 2011, Nature Structural & Molecular Biology
18: 529-537でさらに詳細に説明されている。手短に言えば、Ｉ－Ｅ型の成熟ｃｒＲＮＡ
は、多くの場合、６１ヌクレオチド長であり、８ヌクレオチドの５’「ハンドル」領域、
３２ヌクレオチドの「スペーサー」配列、およびテトラヌクレオチドループを有するヘア
ピンを形成する２１ヌクレオチドの３’配列からなる（図５）。Ｉ型系はＩＩ型（Ｃａｓ
９）とは異なり、異なる系の詳細はVan der Oost 2014 Nat Rev Micr 12: 479-492に記載
されている。ＩＩ型（Ｃａｓ９）系には異なるプロセシング機構が存在しており、第２の
ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）および２つのリボヌクレアーゼを利用している。ヘアピンよ
りはむしろ、ＩＩ型中の成熟ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡの断片に結合したままである
（図５）。しかし、本発明で使用されるＲＮＡは、長さであれ、領域であれまたは特定の
ＲＮＡ配列であれ、天然に存在するｃｒＲＮＡの設計に厳密に合わせて設計する必要はな
い。しかし、明白なのは、本発明で使用するためのＲＮＡ分子は、公開データベース中の
または新たに発見された遺伝子配列情報に基づいて設計され、次に、例えば、化学合成に
より全体をまたは部分を人工的に作ってもよいことである。本発明のＲＮＡ分子は、遺伝
的に改変された細胞または無細胞発現系での発現のために設計および作製されてもよく、
この選択肢にはＲＮＡ配列の一部または全部の合成が含まれてもよい。
ＩＩ型（Ｃａｓ９）中のｃｒＲＮＡの構造および必要条件もJinek et al., 2012 ibid
に記載されている。Ｉ型には、スペーサー配列の５’末端を形成し、そこの５’で８ヌク
レオチドの５’ハンドルと隣接しているいわゆる「シード（SEED）」部分が存在する。Se
menova et al. (2011, PNAS 108: 10098-10103)は、シード配列のすべての残基が標的配
列に相補的であるはずであるが、６位の残基ではミスマッチが許容されうることを見出し
た（図５）。ＩＩ型には、スペーサーの３’末端に位置している１０～１２ヌクレオチド
のシードが存在する（図５）（Van der Oost 2014 ibid.により概説されている）。同様
に、標的遺伝子座（すなわち、配列）に向けられている本発明のリボ核タンパク質複合体
のＲＮＡ成分を設計し作る場合、ＩＩ型シード配列についての必要なマッチおよびミスマ
ッチルールを適用することが可能である。
したがって、本発明は、標的核酸分子において単一塩基変化を検出するおよび／または
位置付ける方法であって、核酸試料を上文に記載される本発明のリボ核タンパク質複合体
と、または上文に記載される本発明のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチドおよび別の
ターゲティングＲＮＡ成分と接触させることを含み、ターゲティングＲＮＡの配列（リボ
核タンパク質複合体中にある場合を含めて）は、例えば、８ヌクレオチド残基の連続する
配列の６位での単一塩基変化に基づいて正常対立遺伝子と突然変異対立遺伝子を区別する
ようになっている、方法を含む。
特定の理論に縛られたくはないが、本発明のリボ核タンパク質複合体のターゲティング
ＲＮＡ成分の調製に使用してもよいデザインルールは、二本鎖標的ポリヌクレオチドにい
わゆる「ＰＡＭ」（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を含む。大腸菌（E. coli）の
Ｉ－Ｅ型系において、ＰＡＭ配列は、５’－ＣＴＴ－３’、５’－ＣＡＴ－３’、５’－
ＣＣＴ－３’、５’－ＣＡＣ－３’、５’－ＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴ－３’、および
５’－ＡＷＧ－３’などのヌクレオチド残基の保存されたトリプレットとすることができ
、ＷはＡ、ＴまたはＵである。Ｉ型では、標的鎖に位置しているＰＡＭ配列は、通常、シ
ードの５’に対応する位置にある。しかし、ＩＩ型では、ＰＡＭは、シードの３’に対応
する位置で、ｃｒＲＮＡスペーサーの３’末端に近い置換または非標的鎖上のもう一方の
末端に位置している（図５）（Jinek et al., 2012, op. cit.）。化膿性連鎖球菌（Stre
ptococcus pyogenes）Ｃａｓ９では、ＰＡＭ配列は保存された対のヌクレオチド残基、５
’－ＮＧＧ－３’を有する。最近、異なるＣａｓ９変異体（ＩＩＡ型およびＩＩＣ型）（
Ran et al., 2015 Nature 520:186-191）－図１Ａ）が特徴付けられ、ＰＡＭが明らかに
された（Ran et al., 2015, ibid.参照－図１Ｃ）。現在確立されているＣａｓ９ ＰＡ
Ｍは、ＩＩＡ型５’－ＮＧＧＮＮＮＮ－３’（化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes
））、５’－ＮＮＧＴＮＮＮ－３’（ストレプトコッカス・パスツリアヌス（Streptococ
cus pasteurianus））、５’－ＮＮＧＧＡＡＮ－３’（ストレプトコッカス・サーモフィ
ルス（Streptococcus thermophilus））、５’－ＮＮＧＧＧＮＮ－３’（黄色ブドウ球菌
（Staphylococcus aureus））、およびＩＩＣ型５’－ＮＧＧＮＮＮＮ－３’（ジフテリ
ア菌（Corynebacterium difteriae））、５’－ＮＮＧＧＧＴＮ－３’（カンピロバクタ
ー・ラリ（Campylobacter lari））、５’－ＮＮＮＣＡＴＮ－３’（パルビバクラム・ラ
バメンティボランス（Parvobaculum lavamentivorans））、５’－ＮＮＮＮＧＴＡ－３’
（ナイセリア・シネレア（Neiseria cinerea））を含む。ゲオバチルス・サーモデニトリ
フィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２のＣａｓ９（本発明）はＩＩＣ
型に属する（Ran et al., 2015, ibid.）。本発明者は、驚くべきことに、本発明により
使用するためのＰＡＭ配列の選択により、本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチド
が標的配列と相互作用する温度に、影響を及ぼすことができるということを見いだした。
特に、本発明者は、標的配列の３’末端の後の５位にシトシン、および／または８位にア
デニンを有する、８ｍｅｒのＰＡＭ配列が、幅広い温度範囲にわたり、活性を付与するの
に好ましいことを見いだした。プロトスペーサー配列の３’末端の後の、ＰＡＭ配列の１
位、２位、３位、４位および／または６位にシトシンが存在することがやはり好ましい。
特定の態様では、幅広い温度範囲、例えば２０℃から１００℃、２０℃から８０℃、３
０から８０℃、２０℃から７０℃または２５℃から６５℃の幅広い温度範囲内での、標的
配列との相互作用は、５’－ＮＮＮＮＣＶＡＡ－３’［配列番号４８］のＰＡＭ配列を利
用することにより実現することができる。最初の４つのＰＡＭ位が、特に好ましいわけで
はない。したがって、最初の４つのヌクレオチドは、任意のヌクレオチド（ＮＮＮＮ）で
あることが好都合とすることができる。好ましくは、このような幅広い温度範囲内での標
的配列との相互作用は、５’－ＮＮＮＮＣＳＡＡ－３’［配列番号４９］であるＰＡＭ配
列を利用することにより行うことができる。最適には、ＰＡＭは、配列５’－ＮＮＮＮＣ
ＧＡＡ－３’［配列番号５０］または５’－ＮＮＮＮＣＣＡＡ－３’［配列番号５１］と
することができる。
標的配列との相互作用が、≧３０℃、例えば、３０℃から１００℃で、好ましくは、３
０℃から７０℃、３０℃から６５℃、または４５℃から６５℃の範囲で必要となる場合、
ＰＡＭ配列は、最適には、配列５’－ＮＮＮＮＣＮＡＡ－３’［配列番号５２］または５
’－ＮＮＮＮＣＭＣＡ－３’［配列番号５３］とすることができる。最初の４つのＰＡＭ
位が、特に好ましいわけではない。したがって、最初の４つのヌクレオチドは、任意のヌ
クレオチド（ＮＮＮＮ）であるのが好都合とすることができる。任意選択で、例えば、Ｐ
ＡＭ配列は、５’－ＣＣＣＣＣＮＡＡ－３’または５’－ＣＣＣＣＣＭＣＡ－３’とする
ことができる。任意選択で、例えば、ＰＡＭ配列は、５’－ＣＣＣＣＣＡＡＡ－３’、５
’－ＣＣＣＣＣＡＴＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＡＧＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＡＣＡ
－３’、５’－ＣＣＣＣＣＴＡＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＣＣ
ＣＣＴＧＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＴＣＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＧＡＡ－３’、５
’－ＣＣＣＣＣＧＴＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＧＧＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＧＣＡ
－３’、５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］、５’－ＣＣＣＣＣＣＴＡ－３
’、５’－ＣＣＣＣＣＣＧＡ－３’、または５’－ＣＣＣＣＣＣＣＡ－３’から選択する
ことができる。
本発明の実施形態では、ターゲティングＲＮＡ分子は３５～２００残基の範囲の長さを
有していてもよい。好ましい実施形態では、ＲＮＡのうち所望の核酸配列に相補的であり
、これを標的にするために使用される部分は１５から３２残基長である。天然に存在する
ｃｒＲＮＡの文脈では、これは、例えば、Semenova et al. (2011 ibid.)の図１に示され
ているスペーサー部分と一致する。
本発明のリボ核タンパク質複合体は、ＤＮＡ標的配列に実質的な相補性を有するＲＮＡ
配列の５’にＣＲＩＳＰＲ繰り返しに由来する８残基を含むターゲティング成分を有して
いてもよい。ＤＮＡ標的配列に相補性を有するＲＮＡ配列は、スペーサー配列であるｃｒ
ＲＮＡの文脈で一致すると理解される。ＲＮＡの５’隣接配列は、例えば、Semenova et
al. (2011 ibid.)の図１に示されているように、ｃｒＲＮＡの５’ハンドルに一致すると
見なされるであろう。
本発明のリボ核タンパク質複合体は、ＤＮＡ標的配列に相補性を有するターゲティング
ＲＮＡ配列の３’に、すなわち、例えば、Semenova et al. (2011 ibid.)の図１に示され
ているように、ｃｒＲＮＡ中のスペーサー配列に隣接する３’ハンドルに一致するものの
３’にヘアピンおよびテトラヌクレオチドループ形成配列を有していてもよい。
特定の理論に縛られたくはないが、好ましいリボ核タンパク質複合体および二本鎖標的
ポリヌクレオチドにおいて、リボ核タンパク質複合体のターゲティングＲＮＡと対合しな
い非標的核酸鎖は、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］、５’－ＣＮＮＮＣ
ＮＮ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＣＮＣＮＮ－３’、５’－ＮＮＮ
ＮＣＣＮ－３’および５’－ＮＣＮＮＣＮＮ－３’のうちの１つまたは複数から選択され
る、直接３’隣接ＰＡＭ配列を含むことができる。任意選択で、例えば、ＰＡＭ配列は、
５’－ＮＮＮＮＣ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］、５’－ＣＮ
ＮＮＣ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＣＮＮＣ－３’、５’－ＮＣＮ
ＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＣＮＣ－３’、５’－ＮＮＣＮＣＮＮＡ－３’、５’－Ｎ
ＮＮＣＣ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＮＣＣ－３’、５’－Ｎ
ＮＮＮＣＣＮＡ－３’、５’－ＣＣＮＮＣ－３’、５’－ＣＣＮＮＣＮＮＡ－３’、５’
－ＣＮＣＮＣ－３’、５’－ＣＮＣＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＣＣＮ－３’、５’
－ＣＮＮＣＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＣ－３’、５’－ＣＮＮＮＣＣＮＡ－３’
、５’－ＣＣＣＮＣＮ－３’、５’－ＣＣＣＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＣＮＣＣＮ－３
’、５’－ＣＣＮＣＣＮＮＡ－３’、５’－ＣＣＮＮＣＣ－３’、５’－ＣＣＮＮＣＣＮ
Ａ－３’、５’－ＣＣＣＣＣ－３’［配列番号１２］、５’－ＣＣＣＣＣＮＮＡ－３’［
配列番号１３］、５’－ＣＣＣＣＣＣ－３’［配列番号１４］、５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ
－３’［配列番号１０］、５’－ＮＣＣＮＣ－３’、５’－ＮＣＣＮＣＮＮＡ－３’、５
’－ＮＣＣＣＣ－３’、５’－ＮＣＣＣＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＣＣＣＣＣ－３’［配
列番号１５］、５’－ＮＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１６］、５’－ＮＮＣＣＣ－３
’、５’－ＮＮＣＣＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＣＣＣＣ－３’、５’－ＮＮＣＣＣＣＮ
Ａ－３’、５’－ＮＮＮＣＣＣ－３’、および５’－ＮＮＮＣＣＣＮＡ－３’から選択す
ることができる。ＰＡＭ配列は、５’－ＣＮＣＣＣＣＡＣ－３’［配列番号１７］、５’
－ＣＣＣＣＣＣＡＧ－３’［配列番号１８］、５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号
１１］、５’－ＣＣＣＣＣＣＡＴ－３’［配列番号１９］、５’－ＣＣＣＣＣＣＡＣ－３
’［配列番号２０］、５’－ＡＴＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号２１］、または５’－Ａ
ＣＧＧＣＣＡＡ－３’［配列番号２２］とすることができる。好ましくは、ＰＡＭ配列は
、配列５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］となろう。しかし、ヌクレオチド
の他の組合せを所望の用途、および／またはＣａｓタンパク質もしくはポリペプチドの濃
度に応じて使用してもよいことは認識されている。特に、最初の４つのＰＡＭ位が、特に
好ましいわけではない。したがって、最初の４つのヌクレオチドは、任意のヌクレオチド
（ＮＮＮＮ）であることが好都合となり得る。これらの配列は、天然に存在するｃｒＲＮ
Ａの文脈で「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」と呼ばれているものと一
致している。ＩＩＣ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、これらのＰＡＭ配列は、天然系標的
でも、したがって好ましくは本発明に従ったＲＮＡでも、標的配列に対するｃｒＲＮＡの
高度な特異性を保証するために、そのｄｓＤＮＡ標的とのＣａｓｃａｄｅ／ｃｒＲＮＡ複
合体の安定な相互作用を促進する。好ましくは、プロトスペーサーに直接隣接する配列は
、５’－ＮＮＮＣＡＴＮ－３’ではないであろう。
さらに、ＰＡＭ配列は、配列５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］、例えば
５’－ＮＮＮＮＣＮＡＡ－３’［配列番号５２］、または５’－ＮＮＮＮＣＭＣＡ－３’
［配列番号５３］とすることができる。
中温性ＳｐＣａｓ９が限定される１つは、それが、２５と４４℃の間でしか活性を示さ
ないことである。これらの温度より高いと、ＳｐＣａｓ９活性は、非検出可能レベルまで
、急速に低下する（Mougiakos et al., 2017, ACS Synth Biol. 6: 849-861）。中温オル
ソログＳｐＣａｓ９が２５～４４℃の範囲であることと対照的に、本発明のＴｈｅｒｍｏ
Ｃａｓ９は、２０～７０℃とかなり幅広い温度範囲で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性である。
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性の延長および安定性により、２０～７０℃の温度においてＤ
ＮＡ操作を必要とする、分子生物学技法におけるその応用、および強固な酵素活性を必要
とする過酷な環境でのその実施が可能となる。したがって、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９はまた
、好熱性生物と中温生物の両方のためのゲノム編集ツールとして使用することができる。
幅広い機能温度活性範囲を有する、すなわち低温および高温の両方において、例えば、
２０℃と７０℃、または２０℃と６５℃、または２５℃と６５℃の両方で機能があること
に加え、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、ターゲティング切断または結合を可能にする温度範囲
、またはＴｈｅｒｍｏＣａｓ９もしくは関連エレメント（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｔｒ
ａｃＲＮＡなど）の構造的特徴を改変することにより、標的化切断または結合が効率的に
行われる温度範囲を操作する能力により、核酸配列操作にわたり一層高いレベルの制御を
行うことが可能となる。しかし、これまで、特定の温度において、Ｃａｓ９活性の分子決
定因子に関してほとんど知られていなかった。
発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の熱安定性を付与するために重要ないくつかの因子
を特定し、その１つは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のＰＡＭ優先性である。ＴｈｅｒｍｏＣａ
ｓ９のＰＡＭ優先性は、温度範囲（≦３０℃）の低い方の部分で活性に対して非常に厳密
である一方、ＰＡＭの多数の変化が、中温から最適温度（３７℃から６０℃）において、
活性となり得る。したがって、ＰＡＭ配列が改変されて、所与の温度において、標的物の
最も効率的な結合、切断、標識または改変を得ることができる。これは、特定の用途に応
じて、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の用途に、非常に大きな適応性をもたらす。例えば、一部の
用途では、標的結合、切断、標識または改変の非常に幅広い温度範囲、例えば、２０℃か
ら７０℃、好ましくは２０℃から６５℃または２５℃から６５℃が望ましいものとなり得
る。このような幅広い温度範囲内での標的配列の結合、切断、標識または改変は、５’－
ＮＮＮＮＣＶＡＡ－３’［配列番号４８］であるＰＡＭ配列を利用することにより行うこ
とができる。好ましくは、このような幅広い温度範囲内での標的配列の結合、切断、標識
または改変は、５’－ＮＮＮＮＣＳＡＡ－３’［配列番号４９］、例えば５’－ＮＮＮＮ
ＣＧＡＡ－３’［配列番号５０］または５’－ＮＮＮＮＣＣＡＡ－３’［配列番号５１］
であるＰＡＭ配列を利用することにより行うことができる。最初の４つのＰＡＭ位が、特
に好ましいわけではない。したがって、最初の４つのヌクレオチドは、任意のヌクレオチ
ド（ＮＮＮＮ）であることが好都合となり得る。任意選択で、例えば、５’－ＣＣＣＣＣ
ＧＡＡ－３’または５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］。
標的物の結合、切断、標識または改変は、≧３０℃、例えば、３０℃から１００℃で、
好ましくは、３０℃から７０℃、３０℃から６５℃、または４５℃から６５℃の範囲で必
要な場合、ＰＡＭ配列は、最適には、配列５’－ＮＮＮＮＣＮＡＡ－３’［配列番号５２
］または５’－ＮＮＮＮＣＭＣＡ－３’［配列番号５３］とすることができる。最初の４
つのＰＡＭ位が、特に好ましいわけではない。したがって、最初の４つのヌクレオチドは
、任意のヌクレオチド（ＮＮＮＮ）であることが好都合となり得る。任意選択で、例えば
、ＰＡＭ配列は、５’－ＣＣＣＣＣＮＡＡ－３’または５’－ＣＣＣＣＣＭＣＡ－３’と
することができる。任意選択で、例えば、ＰＡＭ配列は、５’－ＣＣＣＣＣＡＡＡ－３’
、５’－ＣＣＣＣＣＡＴＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＡＧＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＡ
ＣＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＴＡＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＴＴＡ－３’、５’－Ｃ
ＣＣＣＣＴＧＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＴＣＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＧＡＡ－３’
、５’－ＣＣＣＣＣＧＴＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＧＧＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＧ
ＣＡ－３’、５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］、５’－ＣＣＣＣＣＣＴＡ
－３’、５’－ＣＣＣＣＣＣＧＡ－３’、または５’－ＣＣＣＣＣＣＣＡ－３’から選択
することができる。
本明細書で提供される本発明のＰＡＭ配列は、例えば、６ｍｅｒ、７ｍｅｒまたは８ｍ
ｅｒの配列として、本明細書に開示される配列を含む。６ｍｅｒ、７ｍｅｒまたは８ｍｅ
ｒの配列は、非標的鎖上のプロトスペーサー配列の３’で直接、始まってもよく、標的Ｒ
ＮＡにより結合したプロトスペーサー配列に相補的なプロトスペーサー配列と、ＰＡＭ配
列の５’末端との間に間隔を置いた追加の核酸は存在しない。しかし、６ｍｅｒ、７ｍｅ
ｒまたは８ｍｅｒの配列の３’末端における、ＰＡＭ配列の部分を形成する追加の核酸が
存在してもよいことが認識されよう。さらにまたは代替的に、非標的鎖は、ＰＡＭ配列の
追加の核酸３’を含むことができる。
本発明の核タンパク質複合体は、本発明のリボ核タンパク質複合体、および該リボ核タ
ンパク質が会合する核酸の標的核酸鎖を含むことができる。
結合、切断、標識および改変の温度
活性、例えば本発明のＣａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性の最適温度範囲を含めた、
温度範囲は、既知のＣａｓ９タンパク質の温度範囲よりもかなり高い。同様に、活性を維
持する範囲の高い側の程度は、既知のＣａｓ９タンパク質のそれよりもかなり高い。最適
温度および機能範囲がより高いことにより、高温での遺伝子工学、したがって、例えば、
好熱性生物のゲノムの編集に大きな利点をもたらし、この多くは、高温で行われる工業的
、農業的および医薬品過程の範囲において利用性を有する。したがって、本発明の方法、
使用、核タンパク質および形質転換細胞は、工業的過程、例えば、代謝操作目的のための
ゲノム編集の実現に有用となり得る。非標的鎖のプロトスペーサー配列に直接隣接する本
発明のＰＡＭ配列が存在することにより、標的配列に対するＣａｓタンパク質およびポリ
ペプチドの特異性が改善され、より高い温度において、およびより大きな機能的温度範囲
にわたり、Ｃａｓタンパク質およびポリペプチドの使用を支持する。
かなり大きな熱安定性により、本発明のＣａｓタンパクは、既知のＣａｓ９タンパク質
の温度範囲よりもかなり大きな温度範囲にわたり、機能、例えばヌクレアーゼ活性を保持
する。同様に、活性を維持する、範囲の高い側の程度は、既知のＣａｓ９タンパク質のそ
れよりもかなり高い。最適温度および機能範囲がより高いことにより、高温での遺伝子工
学、したがって、例えば、好熱性生物および中温生物のゲノムの編集に大きな利点をもた
らし、この多くは、高温で行われる工業的、農業的および医薬品過程の範囲において利用
性を有する。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性および安定性の延長により、例えば、２０～７
０℃の幅広い温度範囲内でＤＮＡ操作を必要とする、分子生物学技法におけるその応用、
および強固な酵素活性を必要とする過酷な環境でのその実施が可能となる。したがって、
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９はまた、好熱性生物と中温生物の両方のためのゲノム編集ツールと
して使用することができる。
有利には、本発明者らはまた、本発明のＣａｓタンパク質は、標的配列に配列特異的に
結合することによって、標的配列の直接的な転写制御、例えば、サイレンシング転写に使
用することもできることを示す。したがって、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９はまた、好熱性生物
と中温生物の両方において、例えば、標的遺伝子のサイレンシングまたは活性転写におい
て、転写制御ツールとして使用することもできる。したがって、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は
また、好熱性生物と中温生物の両方における、遺伝子－サイレンシングツールとして使用
することもできる。
有利には、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、２０℃から１００℃まで
の温度で、核酸の結合、切断、標識または改変が可能であるが、高温で、例えば、４１℃
と１２２℃の間の温度、好ましくは５０℃と１００℃の間の温度で、特に有用である。本
発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび合成核酸に結合す
る、これを切断する、標識するまたは改変することが可能である。本発明のＣａｓタンパ
ク質またはポリペプチドは、例えば、２０℃から５０℃までの範囲の温度で、ヌクレアー
ゼ活性、遺伝子編集および核酸標識の用途に関する操作性をやはり実現することができる
。
温度範囲が、本明細書に含まれている場合、開示されている温度範囲に端点が含まれる
、すなわちこの範囲を「含む」ことが意図される。例えば、２０℃と１００℃の間の範囲
の温度で活性があると明記する場合、２０℃と１００℃の温度が、前記範囲に含まれる。
好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、結合される、切断され
る、標識されるまたは改変されるポリヌクレオチド分子の標的配列を認識する、好適なｇ
ＲＮＡ（ターゲティングＲＮＡ分子とも呼ばれる、ガイドＲＮＡ）と会合する場合、２０
℃から１００℃の範囲、任意選択で２０℃から７０℃、２０℃から６５℃、２５℃から７
０℃、２５℃から６５℃、５５℃から１００℃、５０℃から７０℃、５５℃から７０℃、
または５５℃から６５℃の範囲の温度において、上記のことを行う。
好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、結合される、切断され
る、標識されるまたは改変されるポリヌクレオチド分子の標的配列を認識する、好適なｇ
ＲＮＡ（ターゲティングＲＮＡ分子とも呼ばれる、ガイドＲＮＡ）と会合する場合、５０
℃から１００℃、任意選択で５５℃から１００℃、６０℃から１００℃、６５℃から１０
０℃、７０℃から１００℃、７５℃から１００℃、８０℃から１００℃、８５℃から１０
０℃、９０℃から１００℃、９５℃から１００℃の範囲の温度において、上記のことが行
われる。より好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、５１℃から９９℃、５２℃から
９８℃、５３℃から９７℃、５４℃から９６℃、５５℃から９５℃、５６℃から９４℃、
５７℃から９３℃、５８℃から９２℃、５９℃から９１℃、６０℃から９０℃、６１℃か
ら８９℃、６２℃から８８℃、６３℃から８７℃、６４℃から８６℃、６５℃から８５℃
、６６℃から８４℃、６７℃から８３℃、６８℃から８２℃、６９℃から８１℃、７０℃
から８０℃、７１℃から７９℃、７２℃から７８℃、７３℃から７７℃、７４℃から７６
℃の範囲の温度で、または７５℃の温度において、核酸を切断、標識または改変する。好
ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、６０℃から８０℃、６１℃から７９℃、６２℃
から７８℃、６３℃から７７℃、６４℃から７６℃、６０℃から７５℃、６０℃から７０
℃の範囲の温度で、核酸に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する。最適に
は、本発明のＣａｓタンパク質は、６０℃から６５℃の範囲の温度で、好ましくは６５℃
で核酸に結合する、核酸を切断する、標識するまたは改変する。
標的ＲＮＡ分子は、本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドと共に使用するよう
設計することができ、標的ＲＮＡ分子は、標的鎖における標的配列に結合し、非標的鎖は
、プロトスペーサー配列の直後の３’の本明細書に提供されるＰＡＭ配列をさらに含む。
ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＡ－３’、好ましくは５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３
’［配列番号４７］、任意選択で、例えば５’－ＣＣＣＣＣＣＮＡ－３’［配列番号１０
］または５’－ＣＣＣＣＣＣＡＡ－３’［配列番号１１］を含み、本発明の使用、方法、
形質転換細胞および核タンパク質は、５５℃から６５℃の温度範囲、好ましくは５０℃か
ら７０℃、４０℃から６５℃、４５℃から７５℃、３７℃から７８℃、および／または２
０℃から８０℃の温度範囲にわたる、標的鎖への結合、この切断、標識および／または改
変を実現することができる。
ＰＡＭ配列が改変されて、所与の温度において、標的物の最も効率的な切断を得ること
ができる。これは、特定の用途に応じて、本発明のＣａｓタンパク質の適用に、非常に大
きな適応性をもたらす。結合、切断、標識または改変活性、例えば切断活性が、２０℃か
ら１００℃、好ましくは２０℃から７０℃、または２０℃から６５℃、または２５℃から
６５℃の温度範囲において必要な場合、活性は、５’－ＮＮＮＮＣＶＡＡ－３’［配列番
号４８］となるＰＡＭ配列を利用することにより実現することができ、好ましくは、この
ような温度範囲内の活性は、５’－ＮＮＮＮＣＳＡＡ－３’［配列番号４９］、例えば５
’－ＮＮＮＮＣＧＡＡ－３’［配列番号５０］または５’－ＮＮＮＮＣＣＡＡ－３’［配
列番号５１］となるＰＡＭ配列を利用することにより実現することができる。任意選択で
、例えば、５’－ＣＣＣＣＣＧＡＡ－３’［配列番号５２］または５’－ＣＣＣＣＣＣＡ
Ａ－３’［配列番号１１］。
発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の熱安定性は、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の会合
と共に増大して、リボ核タンパク質複合体を形成することを見いだした。ガイドＲＮＡ（
ｓｇＲＮＡ）は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを好適に含むことができる。このよ
うな配置では、ガイドは、ヌクレオチドスペーサー断片および繰り返し断片を含むｃｒＲ
ＮＡを好適に含むことができる。ｃｒＲＮＡは、長さが１７～２０ｎｔであるのが好適と
なり得る。任意選択で、ｃｒＲＮＡは、長さが１７ｎｔとすることができる。代替的に、
ｃｒＲＮＡは、長さが１８ｎｔ、長さが１９ｎｔまたは長さが２０ｎｔとすることができ
る。ガイドはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ（抗繰り返し断片（ｃｒＲＮＡの繰り返し断片との
対合塩基））を含むことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、合成リンカー
によって分離され得る。以下のガイドが、好ましい配置：５’－［ｃｒＲＮＡ（１７～２
０ヌクレオチドスペーサー－断片および繰り返し断片）－（任意選択：２つのＲＮＡを連
結する合成ループ）－ｔｒａｃｒＲＮＡ（抗繰り返し断片（ｃｒＲＮＡの繰り返し断片と
の対合塩基）および一部の可変ステムループ構造（以下に示されているものに関する）、
これは、一部の系では、ある程度、トランケートされていてもよい）］－３’ を表す。
通常、ｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、キメ
ラ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の一部として提供されるであろう。ｔｒａｃｒＲＮＡ
は、抗繰り返し領域、その後の１つまたは複数のヘアピン構造、好ましくは２つ以上のヘ
アピン構造、またはより好ましくは３つ以上のヘアピン構造からなることができる。スペ
ーサー遠位終端において、（４－ヌクレオチドリンカー、例えば５’－ＧＡＡＡ－３’に
よって融合された合成ｓｇＲＮＡキメラにおける、相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ部分（
抗繰り返し）のｃｒＲＮＡ部分（繰り返し）の３’末端、およびその５’末端により形成
された）完全長繰り返し／抗繰り返しヘアピンの存在は、ヌクレアーゼへのアンカーとし
て機能するが、標的選択および切断活性に必須ではない。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分
の最大で５０ｎｔ長の欠失のスペーサー遠位末端における欠失は、ＤＮＡ切断効率に及ぼ
す効果はほとんどまたは全くなしに許容され得る。したがって、完全長繰り返し－抗繰り
返しヘアピンのスペーサー遠位終端の欠失は、標的ＤＮＡ切断効率に関して妥協点なしに
、最大で５０ｎｔ、最大で４５ｎｔ、最大で４０ｎｔ、最大で３５ｎｔ、最大で３０ｎｔ
、最大で２５ｎｔ、最大で２０ｎｔ、最大で１５ｎｔ、最大で１０ｎｔ、または最大で５
ｎｔまで作製することができる。
驚いたことに、発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡの構造が、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の熱安
定性、および活性、特に切断活性の効率に影響を及ぼすことも見いだした。具体的には、
所与の温度における、標的物の最も効率的な結合、切断、標識または改変を得るため、ｔ
ｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡにおけるヘアピン（または、ステムループ）構造の数を
修正することができる。これは、特定の用途に応じて、本発明のＣａｓタンパク質の適用
に、非常に大きな適応性をもたらす。任意選択で、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは
、１つまたは複数のステムループ構造、２つ以上のステムループ構造、または３つ以上の
ステムループ構造を形成することができる、核酸配列を含んで提供され得る。任意選択で
、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のステムループ構造、２つ以上
のステムループ構造、または３つ以上のステムループ構造を形成するよう配列された、核
酸配列を含んで提供され得る。好ましくは、ｓｇＲＮＡは、少なくとも３つのステムルー
プ構造を形成することができる、核酸配列を含んで提供されよう。
任意選択で、活性物に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する、例えば、
切断活性は、２０℃から６０℃、好ましくは３７℃から６０℃、または３７℃、４０℃、
４５℃、５０℃、５５℃または６０℃の温度範囲内で必要とされる場合、活性は、１つま
たは複数のステムループ構造を形成することが可能な、ｓｇＲＮＡ配列を利用することに
より実現することができる。
任意選択で、活性物に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する、例えば、
切断活性は、２０℃から６５℃、好ましくは３７℃から６５℃、より好ましくは４５℃か
ら５５℃、または３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃または６０℃の温度範囲内で
必要とされる場合、活性は、２つ以上のステムループ構造を形成することが可能な、ｓｇ
ＲＮＡ配列を利用することにより実現することができる。
任意選択で、活性物に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する、例えば、
切断活性は、２０℃から１００℃、好ましくは２０℃から７０℃、より好ましくは３７℃
から６５℃または３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃の温度
範囲内で必要とされる場合、活性は、３つ以上のステムループ構造を形成することが可能
な、ｓｇＲＮＡ配列を利用するにより実現することができる。
好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡの一部は、５’ヘアピンを例示す
る、配列；ＡＡＧＧＧＣＵＵＵＣＵＧＣＣＵＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＵＧＣＣＣ［配列番号
５４］を含むであろう。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡの部分は、
「ミドル」ヘアピンを例示する、配列；ＧＵＧＧＣＧＵＵＧＧＧＧＡＵＣＧＣＣＵＡＵＣ
ＧＣＣ［配列番号５５］をさらに含むであろう。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対応す
るｓｇＲＮＡの部分は、３’ヘアピンを例示する、配列；ＣＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＧＣ
ＡＵＵＣＣＣＣＡＣＵＣＵＵＡＧＧＣＧＵＵＵＵ［配列番号５６］をさらに含むであろう
。
好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡの部分は、配列；ＡＡＧＧＧＣＵ
ＵＵＣＵＧＣＣＵＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＵＧＣＣＣＧＵＧＧＣＧＵＵＧＧＧＧＡＵＣＧＣ
ＣＵＡＵＣＧＣＣ［配列番号５７］を含み、すなわち５’ヘアピンおよびミドルを含むで
あろう。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡの部分は、配列；
ＡＡＧＧＧＣＵＵＵＣＵＧＣＣＵＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＵＧＣＣＣＧＵＧＧＣＧＵＵＧＧ
ＧＧＡＵＣＧＣＣＵＡＵＣＧＣＣＣＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＧＣＡＵＵＣＣＣＣＡＣＵＣ
ＵＵＡＧＧＣＧＵＵＵＵ［配列番号５８］を含むことができ、すなわち、５’ヘアピン、
ミドルヘアピンおよび３’ヘアピンを含む。
発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の予測されたステムループの数が、特に高温におい
て、ＤＮＡ切断に重大な役割を果たすことを発見した。本発明者らは、３つのループすべ
てが存在する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の３つのステムループの存在は、切断活性に必
須ではないが、切断は、この範囲の温度すべてにおいて最も効率的であることを決定し、
完全長ｔｒａｃｒＲＮＡは、高温において、最適なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくＤＮＡ
切断に必要であることを示している。対照的に、３‘ヘアピンの除去により、切断効率の
低下がもたらされる。さらに、本発明者らは、ミドルヘアピンと３‘ヘアピンの両方を除
去すると、特に、機能的温度範囲の高い方の端と低い方の端において、ＴｈｅｒｍｏＣａ
ｓ９の切断効率の劇的な低下がもたらされることを見いだした。好ましくは、標的配列の
結合、切断、標識または改変は、高温、例えば４５℃から１００℃、５０℃から１００℃
、５０℃から７０℃、５０℃から６５℃、５５℃から６５℃、または２０℃から１００℃
、２０℃から７０℃、２０℃から６５℃などの幅広い温度範囲内が必要とされる。好まし
くは、３つのステムループ構造を有するｓｇＲＮＡと会合するＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、
２０℃から１００℃、２０℃から７０℃、２０℃から６５℃、４５℃から１００℃、５０
℃から１００℃、５０℃から７０℃、５０℃から６５℃、または５５℃から６５℃の範囲
の選択した温度で、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくと
も４分間または少なくとも５分間、好ましくは５分間、安定のままであり、かつ標的配列
の結合、切断、標識または改変を可能にするであろう。
さらに、発明者らはまた、ｓｇＲＮＡのスペーサー配列の長さが、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ
９活性、例えば、結合、切断、標識または改変活性の効率を操作するために、様々となり
得ることを発見した。通常、スペーサー配列は、長さが、１８ｎｔ～２５ｎｔの範囲にな
ろう。任意選択で、スペーサー配列は、長さが、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎ
ｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔまたは２５ｎｔになろう。好ましくは、１９ｎｔ、２
０ｎｔ、２１ｎｔまたは２３ｎｔのスペーサー長さが使用され、なぜなら、これらのスペ
ーサー長さを有するｓｇＲＮＡと会合した場合に、本発明のＣａｓ９タンパク質が、最も
高い効率で標的配列を切断するからである。１８ｎｔのスペーサーが使用される場合、切
断効率は、著しく低下する。好ましくは、スペーサーの長さは、２３ｎｔとなろう。
本発明のすべての態様において、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、細菌、古細
菌またはウイルスから得ることができるか、もしくはこれらに由来することができ、また
は代替として、ｄｅ ｎｏｖｏで合成されてもよい。好ましい実施形態では、本発明のＣ
ａｓタンパク質またはポリペプチドは、好熱性原核生物に由来し、これらの生物は、古細
菌または細菌として分類することができるが、好ましくは細菌である。より好ましくは、
本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、好熱性細菌に由来する。本明細書にお
いて、好熱性という用語は、比較的高い温度で、生存および成長することが可能である、
例えば、本発明の文脈では、４１と１２２℃（１０６と２５２°Ｆ）の間の温度で、核酸
の切断、結合または改変を行うことができるという意味として理解されるべきである。好
ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、１つまたは複数の好熱性細
菌から単離されてもよく、６０℃超で機能するであろう。好ましくは、本発明のＣａｓタ
ンパク質またはポリペプチドは、１つまたは複数の好熱性細菌から単離されてもよく、６
０℃から８０℃の範囲で、最適には６０℃と６５℃の間で機能するであろう。好ましい実
施形態では、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、ゲオバチルス（Geobacil
lus）属種に由来する。より好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、ゲオバチルス・
サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）に由来する。さらによ
り好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス
（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２に由来する。本発明のＣａｓタンパク質ま
たはポリペプチドは、ウイルスに由来することができる。
機能的部分
有利なことに、任意のポリヌクレオチド配列を配列特異的に標的にする本発明のＣａｓ
タンパク質、ポリペプチドおよびリボ核タンパク質複合体の能力は、何らかの方法で、例
えば、標的核酸を切断および／または標識および／または修飾することにより、標的核酸
を改変するために利用することができる。したがって、これを達成するためにはＣａｓタ
ンパク質またはポリペプチドと共に追加のタンパク質を提供してもよいことが認識されよ
う。したがって、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つの機
能的部分をさらに含んでもよく、かつ／または本発明のＣａｓタンパク質、ポリペプチド
またはリボ核タンパク質複合体は、少なくとも１つのさらなるタンパク質を含むタンパク
質複合体の一部として提供されてもよい。好ましい態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク
質または少なくとも１つのさらなるタンパク質が少なくとも１つの機能的部分をさらに含
む、Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体を提供する。少なく
とも１つの機能的部分は、Ｃａｓタンパク質に融合または連結していてもよい。好ましく
は、少なくとも１つの機能的部分は、天然のまたは人工的タンパク質発現系での発現を通
じてＣａｓタンパク質に翻訳によって融合してもよい。代わりに、少なくとも１つの機能
的部分は、化学合成ステップによりＣａｓタンパク質に共有結合によって連結してもよい
。好ましくは、少なくとも１つの機能的部分は、Ｃａｓタンパク質のＮ終端および／また
はＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している。
少なくとも１つの機能的部分はタンパク質であることが望ましい。タンパク質は、異種
タンパク質であってもよく、または代わりにＣａｓタンパク質が由来した細菌種に固有で
あってもよい。少なくとも１つの機能的部分はタンパク質であってもよく、任意選択で、
ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメ
チラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプ
レッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポー
タータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内
局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択されうる。
特に好ましい態様では、本発明は、少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質
、例えば、ＧＦＰである、Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合
体を提供する。
ヌクレアーゼ活性
本発明のＣａｓリボ核タンパク質は、本明細書にて開示される温度で、好ましくは高温
で、例えば、５０℃と１００℃の間の温度で、核酸結合、切断、標識または改変活性を有
する。本発明のリボ核タンパク質は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成核酸に結合する、これを
切断する、標識する、または改変することが可能となり得る。好ましい態様では、本発明
のＣａｓリボ核タンパク質は、ＤＮＡを、特に二本鎖ＤＮＡを配列特異的に切断すること
ができる。
本発明のＣａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質は、１つよりも多い
ヌクレアーゼドメインを有してもよい。部位特異的ヌクレアーゼは、ＤＮＡの鎖に沿って
選択された位置で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることができる。標的宿主細胞では、
これによりゲノム内の特定の前選択した位置でＤＳＢを作ることができる。部位特異的ヌ
クレアーゼによるそのような切断の作製に促されて、目的のゲノム内の所望の位置でＤＮ
Ａを挿入、欠失または改変するために内在性細胞修復機構が別の目的で利用される。
タンパク質またはポリペプチド分子の１つまたは複数のヌクレアーゼ活性部位は、例え
ば、タンパク質またはポリペプチドに連結または融合している別の機能的部分、例えば、
ＦｏｋIヌクレアーゼなどのヌクレアーゼドメインの活性を可能にするように不活化され
得る。
したがって、本発明のＣａｓタンパク質、ポリペプチドおよびリボ核タンパク質がある
特定の応用のために内在性ヌクレアーゼ活性を有する場合があるにもかかわらず、Ｃａｓ
タンパク質の天然のヌクレアーゼ活性を不活化し、天然のＣａｓ９ヌクレアーゼ活性が不
活化されＣａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結しているＣａｓタンパク
質またはリボ核タンパク質複合体を提供するのが望ましい場合がある。天然のＣａｓ９ヌ
クレアーゼ活性の相補性によるミスターゲティング事象の発生率を減らすことは１つのそ
のような応用である。これは、望ましくは、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複
合体の天然のＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活化させ、好ましくはＣａｓタンパク質に融
合している、異種ヌクレアーゼを提供することにより達成することもできる。したがって
、本発明は、少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩ
ヌクレアーゼドメインである、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体を提供す
る。特に好ましい態様では、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合している本発明のＣａ
ｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体は、好ましくは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメ
インに融合している本発明の別のＣａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体を含み
、２つの複合体が標的ゲノムＤＮＡの反対の鎖を標的にする、タンパク質複合体の一部と
して提供される。
いくつかの応用では、例えば、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体が核酸
中の特定の標的配列を認識し改変する、例えば、その標的配列を診断検査の一部として標
識するのに利用する応用では、Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質
のヌクレアーゼ活性を完全に減弱させるのが望ましい場合がある。そのような応用では、
Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性は不活化されてもよく、Ｃａｓタンパク質に融合し
ている機能的部分はタンパク質でもよく、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリ
カーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスフ
ァターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質
、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質
、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは
親和性精製タグから選択されうる。
好ましい態様では、触媒として不活性な、またはヌクレアーゼ活性を欠く「死滅した」
Ｃａｓタンパク質もしくはポリペプチド（ｄＣａｓ）は、標的核酸配列に結合することが
でき、それにより、その配列の活性を立体的に抑制する。例えば、遺伝子のプロモーター
またはエクソンの配列に相補的である標的ＲＮＡを設計することができ、その結果、遺伝
子へのｄＣａｓおよび標的ＲＮＡの結合は、遺伝子配列の転写開始または伸長を立体的に
抑制し、それにより、遺伝子の発現を抑制する。代替的に、本明細書に記載される方法お
よび使用は、ニッカーゼであるｇｔＣａｓ９の改変ヌクレアーゼ変異体を使用することが
できる。ニッカーゼは、ＨＮＨまたはｇｔＣａｓ９ヌクレアーゼのＲｕｖＣ触媒ドメイン
の一方において変異により作製することができる。これは、それぞれ、不活性なＲｕｖＣ
またはＨＮＨヌクレアーゼドメインを有する、ｓｐＣａｓ９－変異体Ｄ１０ＡおよびＨ８
４０Ａを含む化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ）の場合に示される
。これらの２つの変異を組み合わせることにより、触媒的に死滅したＣａｓ９変異体に至
る（Standage-Beier, K. et al., 2015, ACS Synth. Biol. 4, 1217-1225；Jinek, M. et
al., 2012, Science 337, 816-821；Xu, T. et al., 2015, Appl. Environ. Microbiol.
81, 4423-4431）。配列相同性に基づいて（図３）、これらの残基は、ｇｔＣａｓ９のＤ
８（図３におけるＤ１７）およびＤ５８１またはＨ５８２（図３）とすることができる。
好ましくは、ｇｔＣａｓ９（ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９）における変異Ｄ８ＡおよびＨ５８
２Ａを使用して、ヌクレアーゼ活性を欠いている、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９（ｄＣａｓ）の
触媒的に不活性な、または「死滅」Ｃａｓタンパク質もしくはポリペプチド変異体を作製
することができる。このようなｄＣａｓは、ｄｓＤＮＡ切断を導入することなく、ＤＮＡ
エレメントに安定してかつ特異的に結合することができる、例えば、効率的な熱活性転写
サイレンシングＣＲＩＳＰＲｉツールとしての用途を有用にも見いだすことができる。有
利には、このようなシステムは、とりわけ、好熱菌の代謝検討をかなり容易にすることが
できる。
特に好ましい態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性が不活化され
少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質、例えば、ＧＦＰである、Ｃａｓタン
パク質またはリボ核タンパク質複合体を提供する。この方法で、目的の核酸配列を特異的
に標的にし、光シグナルを発生させるマーカーを使用してその核酸配列を可視化すること
が可能になりうる。適切なマーカーは、例えば、蛍光レポータータンパク質、例えば、緑
色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Ｒ
ＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）またはｍＣｈｅｒｒｙを含んでいてもよい。そ
のタンパク質の発現は蛍光測定により簡単に直接的にアッセイすることが可能なので、そ
のような蛍光レポーター遺伝子はタンパク質発現の可視化に適したマーカーを提供する。
代わりに、レポーター核酸は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）など発
光タンパク質をコードしてもよい。代わりに、レポーター遺伝子は、光シグナルを発生さ
せるのに使用することが可能な発色酵素、例えば、発色酵素（ベータ－ガラクトシダーゼ
（ＬａｃＺ）またはベータ－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など）でもよい。発現の測定に
使用されるレポーターは、抗原ペプチドタグでもよい。他のレポーターまたはマーカーは
当技術分野では公知であり、必要に応じて使用してもよい。
マーカーは可視化することができるので、標的核酸がＲＮＡ、具体的にはｍＲＮＡであ
るある特定の実施形態では、特に、マーカーにより発生する光シグナルが発現産物の量に
正比例している場合、マーカーにより発生する光シグナルの検出および定量化により遺伝
子の転写活性を定量化することが可能でありうる。したがって、本発明の好ましい実施形
態では、本発明のＣａｓタンパク質またはリボ核タンパク質を使用して、目的の遺伝子の
発現産物をアッセイすることができる。
一態様では、本明細書に記載されるｇｔＣａｓ９は、微生物細胞における、相同組換え
（ＨＲ）媒介性ゲノム改変方法で使用されてもよい。このような方法は、ＨＲおよび部位
特異的ｇｔＣａｓ９活性を含み、これにより、対向選択は、ｇｔＣａｓ９活性が、ＨＲに
より導入された所望の改変を有していない微生物を除去することにより行われる。
したがって、本明細書で提供される方法および使用により、第１の工程の間に好都合と
なる相同組換え方法が可能になり、こうして、微生物ゲノムは、所望の変異、および非改
変細胞が、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によりターゲティングされて、非改変細
胞のゲノムにＤＳＤＢを導入することができる第２の工程により改変することができる。
大多数の微生物における効率的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の修復機構がないために、
ＤＳＤＢは、通常、細胞死に至る。したがって、これらの方法および使用は、いずれの非
改変微生物細胞を除去すると同時に、所望の変異を有する微生物細胞の集団全体を増大す
る。好ましくは、このような方法および使用は、実質的に、内因性ＮＨＥＪ修復機構を有
していない微生物において使用される。代替的に、本方法および使用は、内因性ＮＨＥＪ
修復機構を有する微生物に適用してもよい。本明細書に記載される方法および使用は、内
因性ＮＨＥＪ修復機構を有する微生物に適用することができるが、この場合、ＮＨＥＪ修
復機構は、条件付きで低下されるか、またはＮＨＥＪ活性がノックアウトされるかのどち
らかとなる。
本明細書で提供される方法および使用は、ガイドＲＮＡと少なくとも１つのミスマッチ
を有する、相同組換えポリヌクレオチドの配列を利用することができ、こうして、ガイド
ＲＮＡは、改変ゲノムをもはや認識することができない。これは、ｇｔＣａｓ９リボヌク
レアーゼ複合体が、改変ゲノムを認識しないことを意味する。したがって、ＤＳＤＢは、
ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によって導入することはできず、その結果、改変細
胞は、生存することになろう。しかし、非改変ゲノムを有する細胞は、ガイドＲＮＡに対
して実質的な相補性を依然として有しており、その結果、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ
複合体により部位特異的に切断され得る。
本発明の方法および使用の別の態様では、ｇｔＣａｓ９リボヌクレオアーゼ複合体が、
微生物ゲノムを切断させる作用を防止する方法は、ガイドによって標的とされる配列を改
変または除外することではなく、むしろ、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によって
必要とされるＰＡＭを改変または除外することである。ＰＡＭは、特定の切断部位に対し
てｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体を結合させるために、改変または除去のどちらか
一方が行われる。したがって、本発明の方法および使用は、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアー
ゼ複合体によって認識されるＰＡＭ配列を含まない、相同組換えポリヌクレオチドの配列
を使用するものを含むことができる。したがって、ＤＳＤＢは、ｇｔＣａｓ９リボヌクレ
アーゼ複合体によって導入することはできず、その結果、ＨＲ改変細胞は、生存すること
になろう。しかし、非修飾細胞は、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体およびそのガイ
ドにより依然として認識され、その結果、部位特異的に切断される。
したがって、微生物のゲノムを改変するために、ＨＲに頼る方法および使用が、明細書
において提供される。好ましくは、上流隣接部および下流隣接部は、長さが、それぞれ、
０．５キロ塩基（ｋｂ）から１．０ｋｂである。しかし、それより長い断片またはそれよ
り短い断片を使用する組換えが、同様に可能である。相同組換えポリヌクレオチドは、上
流と下流の隣接領域との間にポリヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。このポリヌク
レオチド配列は、例えば、微生物ゲノムに導入されることになる、改変を含むことができ
る。
相同組換えは、標的領域に対して実質的な相補性を有する、上流隣接部および下流領隣
接部に依存する一方、ミスマッチも同様に収容可能である。したがって、一部の実施形態
では、相同組換えは、上流隣接部および下流隣接部に対して広範な相同性を有する、ＤＮ
Ａセグメント間に行われることが知られている。代替実施形態では、上流および下流隣接
部は、標的領域に対して完全な相補性を有する。上流および下流隣接部は、サイズが同一
である必要がない。しかし、一部の例では、上流および下流隣接部は、サイズが同一であ
る。相同組換えの効率は、隣接部の最小断片長さの相同組換えの可能性に応じて様々とな
ろう。しかし、相同組換え法が、非効率である場合でさえも、有利には、本明細書に記載
される方法は、非改変微生物細胞よりも、所望の改変を有する任意の微生物細胞を選択す
ることになろう。相同組換えにより、やはり、完全遺伝子クラスターを包含する大きな欠
失（例えば、５０ｋｂ以上）を作製することが可能となる。相同組換えは組換えに使用さ
れ、これは、より小さな断片（４５～１００ｎｔ）に組換えを可能にする周知の方法であ
る。本明細書に記載される方法および使用は、微生物ゲノムにおいて、標的を含有する第
２の標的領域に実質的に相補的である配列を有する相同組換えポリヌクレオチドをコード
する配列を含む、少なくとも別の相同組換えポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを
さらに任意選択で含むことができる。
好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法および使用は、ＤＮＡである相同組
換えポリヌクレオチドを利用する。一部の実施形態では、ＤＮＡは一本鎖である。他の実
施形態では、ＤＮＡは二本鎖である。さらなる実施形態では、ＤＮＡは、二本鎖であり、
プラスミド媒介性である。
本明細書で提供される方法および使用にＨＲを使用して、微生物ゲノムからポリヌクレ
オチド配列を除去することができる。代替的に、本明細書で提供される方法および使用に
おけるＨＲを使用して、微生物ゲノムに１つまたは複数の遺伝子またはその断片を挿入す
ることができる。さらなる選択として、本明細書で提供される方法および使用においてＨ
Ｒを使用し、微生物ゲノムにおける少なくとも１つのヌクレオチドを改変、またはこれに
置き換えることができる。これにより、本明細書で提供される方法および使用は、任意の
所望の種類のゲノム改変に使用することができる。
代替的に、本明細書に記載されるｇｔＣａｓ９は、微生物細胞において、ＨＲ媒介性ゲ
ノム改変方法に使用してもよく、それにより、ｇｔＣａｓ９活性により、ＤＳＤＢが導入
され、ｓｐＣａｓ９に関して示されている通り、微生物細胞における細胞ＨＲを誘発する
ことができる（Jiang et al. (2013) Nature Biotech, 31, 233-239；Xu et al. (2015)
Appl Environ Microbiol, 81, 4423-4431；Huang et al. (2015) Acta Biochimica et Bi
ophysica Sinica, 47, 231-243）。
代替的に、相同組換えは、例えば、Ｍｏｕｇｉａｋｏｓらによって概説されている、Ｒ
ｅｃＴまたはベータプロテインをコードする遺伝子を発現する、微生物細胞にオリゴヌク
レオチドを導入することによる組換えによって促進することができる（(2016), Trends B
iotechnol. 34: 575-587）。さらなる実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｒｏｎｄａらにより例
示されている、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ（ＭＡＧＥ）と組み合わせることができる（(2016), Sci. Rep. 6: 19452.）
。
初めから終わりまで、本発明のＣａｓタンパク質の基準配列は、アミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列として定義することができる。例えば、配列番号２から６に定義さ
れるモチーフのアミノ酸配列は、そのアミノ酸配列をコードするすべての核酸配列も含む
。
したがって、本発明は、
ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシ
ン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラ
ギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独
立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）
；および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまた
はフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独
立して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸ま
たはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つであ
る）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（
式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであ
り、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンで
あり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含むＣａｓタンパク質であって、
少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、およびターゲティングＲＮＡ分子により認
識される標的核酸配列を含むポリヌクレオチドと会合すると５０℃と１００℃の間でＤＮ
Ａを結合、切断、標識または改変することができるＣａｓタンパク質をコードする単離さ
れた核酸分子も提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７７％の
同一性の配列を有するＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質をコードする単離された核酸分子も提供する。
別の態様では、本発明は、翻訳されるとＣａｓタンパク質に融合するペプチドをコード
する少なくとも１つの核酸配列をさらに含む、単離された核酸分子も提供する。
別の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸分子に融合する少なくと
も１つの核酸配列が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメ
チラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）
活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカ
ータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグ
ナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択されるタ
ンパク質をコードする、単離された核酸分子も提供する。
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ヌクレアーゼ活性：二価陽イオン
以前に特徴付けられた、中温性Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡにおいて、
二価陽イオンを使用して、ＤＳＢの生成を触媒する。発明者らは、以下の二価陽イオンＭ
ｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、およびＣｕ２＋のいずれかの存在下
で、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、ｄｓＤＮＡ切断を媒介することができることを示した。
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ヌクレアーゼ活性：基質
発明者らはまた、あるＩＩＣ型系は、効率的な一本鎖ＤＮＡカッターとなることが報告
されているにもかかわらず（Ma, et al., Mol. Cell 60, 398-407(2015)；Zhang, et al.
, Mol. Cell 60, 242-255(2015)）、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、ｓｓＤＮＡを直接切断す
ることができないことを驚くべきことに示した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のヌクレアーゼ活
性は、ｄｓＤＮＡ基質に限定される。
発現ベクター
本発明の核酸は単離されていてもよい。しかし、核酸感知構築物の発現が選ばれた細胞
で実行されうるように、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質をコードするポリヌク
レオチド配列は、好ましくは、発現構築物中に提供されている。いくつかの実施形態では
、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、適切な発
現ベクターの一部として提供されることになる。ある特定の実施形態では、本発明の発現
ベクター（発現するとＣａｓタンパク質に融合するアミノ酸残基をコードするヌクレオチ
ド配列ありまたはなしで）は、上文に定義されているターゲティングＲＮＡ分子をコード
するヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。したがって、そのような発現ベクター
を適切な宿主で使用して、所望のヌクレオチド配列を標的にすることが可能な本発明のリ
ボ核タンパク質複合体を産生することができる。代わりに、上文に定義されるターゲティ
ングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列は別の発現ベクターで提供してもよく、ま
たは代わりに他の手段によって標的細胞に送達してもよい。
適切な発現ベクターは受容細胞に応じて変化することになり、適宜、標的細胞での発現
を可能にし、好ましくは高レベルの発現を促進する調節エレメントを組み込んでもよい。
そのような調節配列は、例えば、開始、正確さ、速度、安定性、下流プロセシングおよび
可動性の点で遺伝子または遺伝子産物の転写または翻訳に影響を与えることができてもよ
い。
そのようなエレメントは、例えば、強力なおよび／または構成プロモーター、５’およ
び３’ＵＴＲ、転写および／または翻訳エンハンサー、転写因子またはタンパク質結合配
列、開始部位および終結配列、リボソーム結合部位、組換え部位、ポリアデニル化配列、
センスまたはアンチセンス配列、転写の正確な開始を確実にする配列ならびに任意選択で
、宿主細胞における転写の終結および転写物安定化を確実にするポリＡシグナルを含んで
いてもよい。調節配列は、植物、動物、細菌、真菌またはウイルス由来でもよく、好まし
くは、宿主細胞と同じ生物に由来してもよい。適切な調節エレメントが目的の宿主細胞に
応じて変化することになるのは明らかである。例えば、大腸菌（E.coli）などの原核宿主
細胞で高レベルの発現を促進する調節エレメントはｐＬａｃ、Ｔ７、Ｐ（Ｂｌａ）、Ｐ（
Ｃａｔ）、Ｐ（Ｋａｔ）、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターを含んでいてもよい。真核宿
主細胞で高レベルの発現を促進する調節エレメントは、酵母ではＡＯＸ１またはＧＡＬ１
プロモーターあるいは動物細胞ではＣＭＶもしくはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶエンハ
ンサー、ＳＶ４０エンハンサー、単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）ＶＩＰ
１６転写活性化因子またはグロビンイントロンの包含を含んでいてもよい。植物では、構
成的高レベルの発現は、例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターま
たはカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターを使用して得るこ
とができる。
適切な調節エレメントは構成的であってよく、この調節エレメントは大半の環境条件ま
たは発生段階、特異的もしくは誘導性の発生段階下で発現を指示する。好ましくは、プロ
モーターは誘導性であり、温度、光、化学物質、乾燥、および他の刺激などの環境的、化
学的または発生的合図に応答して発現を指示する。適宜、特定の発生段階であるいは細胞
外もしくは細胞内状態、シグナル、または外部から与えられる刺激に応答して目的のタン
パク質の発現を可能にするプロモーターを選んでもよい。例えば、大腸菌（E.coli）で使
用するための、特定の成長段階で（例えば、ｏｓｍＹ静止期プロモーター）または特定の
刺激に応答して（例えば、ＨｔｐＧ熱ショックプロモーター）高レベルの発現を与える様
々なプロモーターが存在する。
適切な発現ベクターは、適切な宿主細胞においておよび／または特定の条件下で前記ベ
クターの選択を可能にする選択可能マーカーをコードする追加の配列を含んでいてもよい
。
本発明は、細胞中で標的核酸を改変する方法であって、細胞を上文に記載される発現ベ
クターのうちのいずれかでトランスフェクト、形質転換または形質導入することを含む方
法も含む。トランスフェクション、形質転換または形質導入の方法は当業者には周知のタ
イプのものである。本発明のリボ核タンパク質複合体の発現を生み出すのに使用される１
つの発現ベクターが存在する場合、およびターゲティングＲＮＡが細胞に直接添加される
場合、トランスフェクション、形質転換または形質導入の同じまたは異なる方法を使用し
てもよい。同様に、本発明のリボ核タンパク質複合体の発現を生み出すのに使用される１
つの発現ベクターが存在する場合、および別の発現ベクターが発現を介してターゲティン
グＲＮＡをｉｎ ｓｉｔｕで生み出すのに使用されている場合、トランスフェクション、
形質転換または形質導入の同じまたは異なる方法を使用してもよい。
他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、細
胞中でＣａｓｃａｄｅ複合体が発現されるように細胞内に導入される。Ｃａｓタンパク質
複合体を所望の標的配列まで導くターゲティングＲＮＡも、ｍＲＮＡと同時でも、別々に
でもまたは逐次でも、必要なリボ核タンパク質複合体が細胞中で形成されるように、細胞
内に導入される。
したがって、本発明は、標的核酸を改変する、すなわち、切断、タグ付け、改変、標識
または結合する方法であって、核酸を上文で定義されるリボ核タンパク質複合体と接触さ
せることを含む方法も提供する。
さらに、本発明は標的核酸を改変する方法であって、核酸を、上文で定義されるターゲ
ティングＲＮＡ分子に加えて、上文で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドと
接触させることを含む方法も含む。
上記方法に従って、標的核酸の改変は、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでおよび無細胞
環境で実行することができる。無細胞環境では、標的核酸、Ｃａｓタンパク質およびター
ゲティングＲＮＡ分子のそれぞれの添加は、同時でも、逐次でも（希望通りのいかなる順
番でも）、または別々でもよい。したがって、標的核酸とターゲティングＲＮＡが反応混
合物に同時に添加され、次に、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドが後の段階
で別々に添加されることが可能である。
同様に、標的核酸の改変は、単離された細胞であれ多細胞組織、器官または生物の一部
としてであれ、ｉｎ ｖｉｖｏ、すなわち、細胞中ｉｎ ｓｉｔｕで行うことができる。
全組織および器官の文脈では、ならびに生物の文脈では、方法はｉｎ ｖｉｖｏで実行さ
れるのが望ましい場合があり、または代わりに、全組織、器官もしくは生物から細胞を単
離し、方法に従って細胞をリボ核タンパク質複合体で処理し、それに続いてリボ核タンパ
ク質複合体で処理された細胞を、同じ生物内であれ異なる生物内であれ、その前の位置に
、もしくは異なる位置に戻すことにより実行してもよい。
これらの実施形態では、リボ核タンパク質複合体またはＣａｓタンパク質もしくはポリ
ペプチドは、細胞内への適切な形態の送達を必要とする。そのような適切な送達系および
方法は当業者には周知であり、細胞質または核マイクロインジェクションを含むがこれら
に限定されない。好ましい送達様式では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が使用され、こ
の送達系はヒトでは病因性ではなく、欧州では臨床使用に承認されている。
したがって、本発明は標的核酸を改変する方法であって、核酸を、
ａ．上文で定義されるリボ核タンパク質複合体、または
ｂ．上文で定義されるタンパク質もしくはタンパク質複合体および上文で定義されるＲＮ
Ａ分子
と接触させることを含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は細胞中で標的核酸を改変する方法であって、細胞を上文で
定義されるリボ核タンパク質複合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで
形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入すること、または代わりに細胞を上文で定
義されるタンパク質もしくはタンパク質複合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現
ベクターおよび上文で定義されるターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配
列を含むさらなる発現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入すること
を含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は細胞中で標的核酸を改変する方法であって、細胞を上文で
定義されるタンパク質もしくはタンパク質複合体をコードするヌクレオチド配列を含む発
現ベクターで形質転換、トランスフェクトまたは形質導入し、次いで上文で定義されるタ
ーゲティングＲＮＡ分子を細胞内に送達することを含む方法を提供する。
ガイド（すなわち、ターゲティング）ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子およびＣａｓタンパク質
またはポリペプチドが、リボ核タンパク質複合体の一部としてというよりむしろ別々に提
供される実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体と同
時であれ、別々にであれ、逐次であれ、細胞内への適切な形態の送達を必要とする。ＲＮ
Ａを細胞内に導入するそのような形態は当業者には周知であり、従来のトランスフェクシ
ョン法を介したｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ送達を含んでもよい。マイクロイ
ンジェクションおよび電気穿孔法、ならびにカルシウム共沈、ならびに市販のカチオンポ
リマーおよび脂質、ならびに細胞透過性ペプチド、細胞透過性（微粒子銃）粒子などの物
理的方法をそれぞれ使用してもよい。例えば、ウイルス、特に好ましくはＡＡＶを、例え
ば、本発明のＣａｓタンパク質複合体または本発明のリボ核タンパク質複合体のウイルス
粒子への（可逆的）融合を介して、細胞質にであれおよび／または核にであれ送達媒体と
して使用してもよい。
別の態様では、本発明は標的核酸を改変する方法であって、少なくとも１つの機能的部
分がマーカータンパク質またはレポータータンパク質であり、マーカータンパク質または
レポータータンパク質が標的核酸と会合し、好ましくは、マーカーが蛍光タンパク質、例
えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、方法を提供する。
標的核酸を改変する上述の方法では、機能的部分はマーカーでもよく、マーカーは標的
核酸と会合し、好ましくは、マーカーはタンパク質であり、任意選択で、蛍光タンパク質
、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タ
ンパク質（ＲＦＰ）またはｍＣｈｅｒｒｙである。ｉｎ ｖｉｔｒｏであれ、ｅｘ ｖｉ
ｖｏであれ、またはｉｎ ｖｉｖｏであれ、本発明の方法を使用すれば、好ましくは、高
次コイルのプラスミドもしくは染色体などの高次構造、またはｍＲＮＡなどの一本鎖標的
核酸の形態で、核酸分子中の標的遺伝子座を直接可視化することが可能である。標的遺伝
子座の直接可視化は電子顕微鏡写真、または蛍光顕微鏡法を使用してもよい。しかし、本
発明の方法の文脈では、有機色素分子、放射性標識および小分子でもよいスピン標識を含
む、他の種類の標識をマーカーとして使用してもよいことは認識される。
標的核酸がｄｓＤＮＡである標的核酸を改変するための本発明の方法では、機能的部分
はヌクレアーゼでもヘリカーゼ－ヌクレアーゼでもよく、改変は好ましくは所望の遺伝子
座での一本鎖または二本鎖切断である。この方法で、ＤＮＡの独特な配列特異的切断は、
リボ核タンパク質複合体に融合している適切な機能的部分を使用することにより操作する
ことが可能である。最終的なリボ核タンパク質複合体のＲＮＡ成分の選ばれた配列は、機
能的部分の作用に対する所望の配列特異性を提供する。
したがって、本発明は、ｄｓＤＮＡ分子からヌクレオチド配列の少なくとも一部を取り
除くための、任意選択で遺伝子（単数または複数）の機能をノックアウトするための、細
胞中の所望の遺伝子座でのｄｓＤＮＡ分子の非相同末端結合の方法であって、上文に記載
される標的核酸を改変する方法のうちのいずれかを使用して二本鎖切断を作ることを含む
方法も提供する。
本発明は、既存のヌクレオチド配列を改変する、または所望のヌクレオチド配列を挿入
するために、細胞中の所望の遺伝子座でｄｓＤＮＡ分子内に核酸を相同組換えする方法で
あって、上文に記載される標的核酸を改変する方法のうちのいずれかを使用して所望の遺
伝子座で二本鎖切断を作ることを含む方法をさらに提供する。
したがって、本発明は、上文に記載される方法のうちのいずれかに従って標的核酸配列
を改変することを含む、生物中で遺伝子発現を改変する方法であって、核酸がｄｓＤＮＡ
であり、機能的部分がＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写
活性化因子または転写リプレッサーから選択される、方法も提供する。
本発明は、上文に記載される方法のうちのいずれかに従って標的核酸配列を改変するこ
とを含む、生物中で遺伝子発現を改変する方法であって、核酸がｍＲＮＡであり、機能的
部分はリボヌクレアーゼであり、任意選択でエンドヌクレオアーゼ、３’エキソヌクレア
ーゼまたは５’エキソヌクレアーゼから選択される、方法をさらに提供する。
標的核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成核酸でもよい。好ましくは、標的核酸はＤＮＡ、
好ましくはｄｓＤＮＡである。
しかし、標的核酸はＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡでも可能である。代わりに、したがっ
て、本発明は、標的核酸を改変する方法であって、標的核酸がＲＮＡである、方法も提供
する。
別の態様では、本発明は、標的核酸を改変する方法であって、核酸がｄｓＤＮＡであり
、少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、
改変が所望の遺伝子座での一本鎖または二本鎖切断である、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、細胞中で標的核酸を改変する方法であって、改変により所望
の遺伝子座で遺伝子発現のサイレンシングが生じ、
ａ．ｄｓＤＮＡ分子で二本鎖切断を作るステップと、
ｂ．非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により細胞中でｄｓＤＮＡ分子を修復するステップと
を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、細胞中で標的核酸を改変する方法であって、既存のヌクレオ
チド配列が改変もしくは欠失され、および／または所望の位置で所望のヌクレオチド配列
が挿入され、
ａ．所望の遺伝子座で二本鎖切断を作るステップと、
ｂ．相同組換えにより細胞中でｄｓＤＮＡ分子を修復するステップと
を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、上文に記載の標的核酸配列を改変することを含む、細胞中で
遺伝子発現を改変する方法であって、核酸がｄｓＤＮＡであり、機能的部分がＤＮＡ修飾
酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性化因子または転写リプレッサ
ーから選択される、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、上文に記載の標的核酸配列を改変することを含む、細胞中で
遺伝子発現を改変する方法であって、核酸がｍＲＮＡであり、機能的部分がリボヌクレア
ーゼであり、任意選択でエンドヌクレオアーゼ、３’エキソヌクレアーゼまたは５’エキ
ソヌクレアーゼから選択される、方法を提供する。
別の態様では、本発明は上文に記載の標的核酸を改変する方法であって、４５℃と１０
０℃の間の温度で実行される方法を提供する。好ましくは、方法は５０℃でまたはそれよ
りも高い温度で実行される。より好ましくは、方法は５５℃と８０℃の間の温度で実行さ
れる。最適には、方法は６０℃と６５℃の間の温度で実行される。代替的に、本方法は、
２０℃と４５℃の間の温度で行うことができる。より好ましくは、３０℃と４５℃の間の
温度である。さらにより好ましくは、３７℃と４５℃の間の温度である。
上文に記載される標的核酸を改変する方法のうちのいずれにおいても、細胞は原核細胞
でもよく、または代わりに真核細胞でもよい。
宿主細胞
有利なことに、本発明は広範な適用性があり、本発明の宿主細胞は、培養することが可
能であるいかなる遺伝的に扱いやすい生物に由来してもよい。したがって、本発明は上文
に記載される方法により形質転換される宿主細胞を提供する。本発明は、二本鎖標的ポリ
ヌクレオチドにおける標的核酸配列を有する形質転換細胞を提供し、前記細胞は、本明細
書で提供されるＣａｓタンパク質またはポリペプチド、および本明細書で提供される少な
くとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を含み、発現ベクターは、前記Ｃａｓタンパク質
および前記ターゲティングＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つをコードする核酸を含む。
適切な宿主細胞は原核生物でも真核生物でもよい。特に、遺伝的に利用しやすく、培養
することが可能である原核または真核細胞、例えば、原核細胞、真菌細胞、植物細胞およ
び動物細胞を含む、一般に使用されている宿主細胞を、本発明に従って使用するために選
択することができる。好ましくは、宿主細胞は原核細胞、真菌細胞、植物細胞、原生生物
細胞または動物細胞から選択されることになる。好ましくは、宿主細胞は、原核細胞、真
菌細胞、植物細胞、原生生物細胞、またはヒト細胞を除く動物細胞から選択されよう。好
ましくは、宿主細胞は、胚性幹細胞を含めた、ヒト細胞を含まないであろう。本発明に従
って使用するための好ましい宿主細胞は、典型的には高成長速度を示し、容易に培養され
および／もしくは形質転換され、短い世代時間を示す種、付随する確立した遺伝資源を有
する種または特定の条件下で異種タンパク質の最適発現のために選択され、改変されもし
くは合成された種に一般に由来している。目的のタンパク質が最終的には特定の工業的、
農業的、化学的または治療的状況で使用されることになる本発明の好ましい実施形態では
、適切な宿主細胞は、目的のタンパク質が配置されることになる所望の特定の条件または
細胞状況に基づいて選択してもよい。好ましくは、宿主細胞は原核細胞になる。好ましい
実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。宿主細胞は、例えば、大腸菌（Escherichia
coli（E. coli））細胞でもよい。好ましくは、宿主細胞は好熱性細菌の細胞になる。
本明細書に記載される本発明の方法および使用は、細菌細胞のゲノムを改変するために
使用することができる。特定の実施形態では、細菌は好熱性細菌であり、細菌は、好まし
くは、アシディチオバチルス（Acidithiobacillus）属種（アシディチオバチルス・カル
ドゥス（Acidithiobacillus caldus）を含む）；エアリバチルス（Aeribacillus）属種（
エアリバチルス・パリダス（Aeribacillus pallidus）を含む）；アリシクロバチルス（A
licyclobacillus）属種（アリシクロバチルス・アシドカラダリス（Alicyclobacillus ac
idocaldarius）、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidote
rrestris）、アリシクロバチルス・シクロヘプタニクス（Alicyclobacillus cycloheptan
icusl）、アリシクロバチルス・ヘスペリダム（Alicyclobacillus hesperidum）を含む）
；アノキシバチルス（Anoxybacillus）属種（アノキシバチルス・カルディプロテオリテ
ィクス（Anoxybacillus caldiproteolyticus）、アノキシバチルス・フラビサーマス（An
oxybacillus flavithermus）、アノキシバチルス・ルピエンシス（Anoxybacillus rupien
sis）、アノキシバチルス・テピダマンス（Anoxybacillus tepidamans）を含む）；バチ
ルス（Bacillus）属種（バチルス・カルドリティクス（Bacillus caldolyticus）、バチ
ルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）、バチルス・カルドベロクス（Bacillus
caldovelox）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・クラウシイ
（Bacillus clausii）、バチルス・ヒサシイ（Bacillus hisashii）、バチルス・リケニ
フォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メタノリクス（Bacillus methanoli
cus）、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）（バチルス・スミシイ（Bacillus smit
hii）ＥＴ１３８を含む）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・サ
ーモコプリアエ（Bacillus thermocopriae）、バチルス・サーモラクティス（Bacillus t
hermolactis）、バチルス・サーモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans）、バ
チルス・サーモレオボランス（Bacillus thermoleovorans）を含む）；カルディバチルス
（Caldibacillus）属種（カルディバチルス・デビリス（Caldibacillus debilis）を含む
）；カルディセルロシルプター（Caldicellulosiruptor）属種（カルディセルロシルプタ
ー・ベシイ（Caldicellulosiruptor bescii）、カルディセルロシルプター・ハイドロテ
ルマリス（Caldicellulosiruptor hydrothermalis）、カルディセルロシルプター・クリ
ストヤンソニイ（Caldicellulosiruptor kristjanssonii）、カルディセルロシルプター
・クロノトスキエンシス（Caldicellulosiruptor kronotskyensis）、カルディセルロシ
ルプター・ラクトアセチクス（Caldicellulosiruptor lactoaceticus）、カルディセルロ
シルプター・オブシディアンシス（Caldicellulosiruptor obsidiansis）、カルディセル
ロシルプター・オウエンセンシス（Caldicellulosiruptor owensensis）、カルディセル
ロシルプター・サッカロリティクス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）を含む）
；クロストリジウム（Clostridium）属種（クロストリジウム・クラリフラブン（Clostri
dium clariflavum）、クロストリジウム・ストラミニソルベンス（Clostridium stramini
solvens）、クロストリジウム・テピディプロフンディ（Clostridium tepidiprofundi）
、クロストリジウム・サーモブチリクム（Clostridium thermobutyricum）、クロストリ
ジウム・サーモセルム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・サーモサクシ
ノゲネス（Clostridium thermosuccinogenes）、クロストリジウム・サーモパルマリウム
（Clostridium thermopalmarium）を含む）；デイノコックス（Deinococcus）属種（デイ
ノコックス・セルロシリティクス（Deinococcus cellulosilyticus）、デイノコックス・
デセルティ（Deinococcus deserti）、デイノコックス・ゲオテルマリス（Deinococcus g
eothermalis）、デイノコックス・ムライイ（Deinococcus murrayi）、デイノコックス・
ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）を含む）；デフルビイタレア（Defluvi
italea）属種（デフルビイタレア・ファフィフィラ（Defluviitalea phaphyphila）を含
む）、デスルホトマクルム（Desulfotomaculum）属種（デスルホトマクルム・カルボキシ
ジボランス（Desulfotomaculum carboxydivorans）、デスルホトマクルム・ニグリフィカ
ンス（Desulfotomaculum nigrificans）、デスルホトマクルム・サリヌム（Desulfotomac
ulum salinum）、デスルホトマクルム・ソルファタリクム（Desulfotomaculum solfatari
cum）を含む）；デスルフレラ（Desulfurella）属種（デスルフレラ・アセチボランス（D
esulfurella acetivorans）を含む）；デスルフロバクテリウム（Desulfurobacterium）
属種（デスルフロバクテリウム・サーモリトトロフム（Desulfurobacterium thermolitho
trophum）を含む）；ゲオバチルス（Geobacillus）属種（ゲオバチルス・イシギアヌス（
Geobacillus icigianus）、ゲオバチルス・カルボキシロシリティクス（Geobacillus cal
doxylosilyticus）、ゲオバチルス・ユラシクス（Geobacillus jurassicus）、ゲオバチ
ルス・ガラクトシダシウス（Geobacillus galactosidasius）、ゲオバチルス・カウスト
フィルス（Geobacillus kaustophilus）、ゲオバチルス・リツアニクス（Geobacillus li
tuanicus）、ジェオバシラス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophil
us）、ゲオバチルス・スブテラネウス（Geobacillus subterraneus）、ゲオバチルス・テ
ルマンタルクティクス（Geobacillus thermantarcticus）、ゲオバチルス・サーモカネヌ
ラトゥス（Geobacillus thermocatenulatus）、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカン
ス（Geobacillus thermodenitrificans）、ゲオバチルス・サーモグルコシダンス（Geoba
cillus thermoglucosidans）、ゲオバチルス・サーモレオボランス（Geobacillus thermo
leovorans）、ゲオバチルス・トエビイ（Geobacillus toebii）、ゲオバチルス・ウゼネ
ンシス（Geobacillus uzenensis）、ゲオバチルス・ブルカニイ（Geobacillus vulcanii
）、ゲオバチルス・ザリハエ（Geobacillus zalihae）を含む）；ハイドロジェノバクタ
ー（Hydrogenobacter）属種（ハイドロジェノバクター・サーモフィレス（Hydrogenobact
er thermophiles）を含む）；ヒドロゲノバクルム（Hydrogenobaculum）属種（ヒドロゲ
ノバクルム・アシドフィルム（Hydrogenobaculum acidophilum）を含む）；イグナビバク
テリウム（Ignavibacterium）属種（イグナビバクテリウム・アルブム（Ignavibacterium
album）を含む）；ラクトバチルス（Lactobacillus）属種（ラクトバチルス・ブルガリ
クス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルエクキイ（Lactobacillu
s delbrueckii）、ラクトバチルス・イングルビエイ（Lactobacillus ingluviei）、ラク
トバチルス・サーモトレランス（Lactobacillus thermotolerans）を含む）；マリニテル
ムス（Marinithermus）属種（マリニテルムス・ヒドロテルマリス（Marinithermus hydro
thermalis）を含む）；モーレラ（Moorella）属種（モーレラ・サーモアセチカ（Moorell
a thermoacetica）を含む）；オセアニテルムス（Oceanithermus）属種（オセアニテルム
ス・デスルフランス（Oceanithermus desulfurans）、オセアニテルムス・プロフンドゥ
ス（Oceanithermus profundus）を含む）；パエニバシラス（Paenibacillus）属種（パエ
ニバシラ（Paenibacillus）属種Ｊ２、パエニバシラス・マリヌム（Paenibacillus marin
um）、パエニバシラ・サーモアエロフィルス（Paenibacillus thermoaerophilus）を含む
）；ペルセフォネラ（Persephonella）属種（ペルセフォネラ・グアイマセンシス（Perse
phonella guaymasensis）、ペルセフォネラ・ヒドロゲニフィラ（Persephonella hydroge
niphila）、ペルセフォネラ・マリナ（Persephonella marina）を含む）；ロドテルムス
（Rhodothermus）属種（ロドテルムス・マリヌス（Rhodothermus marinus）、ロドテルム
ス・オバメンシス（Rhodothermus obamensis）、ロドテルムス・プロフンディ（Rhodothe
rmus profundi）を含む）；スルホバチルス（Sulfobacillus）属種（スルホバチルス・ア
シドフィルス（Sulfobacillus acidophilus）を含む）；スルフリヒドロゲニビウム（Sul
furihydrogenibium）属種（スルフリヒドロゲニビウム・アゾレンセ（Sulfurihydrogenib
ium azorense）、スルフリヒドロゲニビウム・クリストヤンソニイ（Sulfurihydrogenibi
um kristjanssonii）、スルフリヒドロゲニビウム・ロドマニイ（Sulfurihydrogenibium
rodmanii）、スルフリヒドロゲニビウム・イロウストネンセ（Sulfurihydrogenibium yel
lowstonense）を含む）；シンビオバクテリウム（Symbiobacterium）属種（シンビオバク
テリウム・サーモフィルム（Symbiobacterium thermophilum）、シンビオバクテリウム・
トエビイ（Symbiobacterium toebii）を含む）；サーモアンアエロバクター（Thermoanae
robacter）属種（サーモアンアエロバクター・ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii
）、サーモアンアエロバクター・エタノリクス（Thermoanaerobacter ethanolicus）、サ
ーモアンアエロバクター・イタリクス（Thermoanaerobacter italicus）、サーモアンア
エロバクター・キブイ（Thermoanaerobacter kivui）、サーモアンアエロバクター・マリ
アネンシス（Thermoanaerobacter marianensis）、サーモアンアエロバクター・マトラニ
イ（Thermoanaerobacter mathranii）、サーモアンアエロバクター・シュードエタノリク
ス（Thermoanaerobacter pseudoethanolicus）、サーモアンアエロバクター・ウィエゲリ
イ（Thermoanaerobacter wiegelii）；サーモアンアエロバクテリウム（Thermoanaerobac
terium）属種（サーモアンアエロバクテリウム・アシジトレランス（Thermoanaerobacter
ium aciditolerans）、サーモアンアエロバクテリウム・アオテアロエンセ（Thermoanaer
obacterium aotearoense）、サーモアンアエロバクテリウム・エタノリクス（Thermoanae
robacterium ethanolicus）、サーモアンアエロバクテリウム・シュードエタノリクス（T
hermoanaerobacterium pseudoethanolicus）、サーモアンアエロバクテリウム・サッカロ
リティクム（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）、サーモアンアエロバクテリウ
ム・サーモサッカロリティクム（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）、サ
ーモアンアエロバクテリウム・キシラノリティクム（Thermoanaerobacterium xylanolyti
cum）を含む）；サーモバチルス（Thermobacillus）属種（サーモバチルス・コンポステ
ィ（Thermobacillus composti）、サーモバチルス・キシラニリティクス（Thermobacillu
s xylanilyticus）を含む）；サーモクリニス（Thermocrinis）属種（サーモクリニス・
アルブス（Thermocrinis albus）、サーモクリニス・ルベル（Thermocrinis ruber）を含
む）；サーモデュルファタトル（Thermodulfatator）属種、サーモデスルファタトル・ア
トランティクス（Thermodesulfatator atlanticus）、サーモデスルファタトル・アウト
トロフィクス（Thermodesulfatator autotrophicｕｓ）、サーモデスルファタトル・イン
ディクス（Thermodesulfatator indicus）を含む）；サーモデスルフォバクテリウム（Th
ermodesulfobacterium）属種（サーモデスルフォバクテリウム・コミュネ（Thermodesulf
obacterium commune）、サーモデスルフォバクテリウム・ヒドロゲニフィルム（Thermode
sulfobacterium hydrogeniphilum）を含む）；サーモデスルフォビウム（Thermodesulfob
ium）属種（サーモデスルフォビウム・ナルゲンセ（Thermodesulfobium narugense）を含
む）；サーモデスルフォビブリオ（Thermodesulfovibrio）属種（サーモデスルフォビブ
リオ・アグレガンス（Thermodesulfovibrio aggregans）、サーモデスルフォビブリオ・
チオフィルス（Thermodesulfovibrio thiophilus）、サーモデスルフォビブリオ・イエロ
ウストニイ（Thermodesulfovibrio yellowstonii）を含む）；サーモシフォ（Thermosiph
o）属種（サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、サーモシフォ・アト
ランティクス（Thermosipho atlantic




us）、サーモシフォ・メラネシエンシス（Thermosipho melanesiensis）を含む）；テル
モトガ（Thermotoga）属種（テルモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）、テルモト
ガ・ネオポリタナ（Thermotoga neopolitana）、テルモトガ（Thermotoga）属種ＲＱ７を
含む）；サーモビブリオ（Thermovibrio）属種（サーモビブリオ・アモニフィカンス（Th
ermovibrio ammonificans）、サーモビブリオ・ルベル（Thermovibrio ruber）を含む）
；サーモビルガ（Thermovirga）属種（サーモビルガ・リエニイ（Thermovirga lienii）
を含む）およびテルムス（Thermus）属種（テルムス・アクアティクス（Thermus aquatic
us）、テルムス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）、テルムス・フラブス（Therm
us flavus）、テルムス・スコトドゥクツス（Thermus scotoductus）、テルムス・サーモ
フィルス（Thermus thermophilus）を含む）；チオバチルス・ネアポリタヌス（Thiobaci
llus neapolitanus）から選択される。
別の態様では、本明細書に記載される方法または使用は、中温性細菌を改変するために
使用することができる。好ましい実施形態では、細菌は、アシディチオバシラス（Acidit
hiobacillus）属種（アシディチオバチルス・カルドゥス（Acidithiobacillus caldus）
を含む）；アクチノバチルス（Actinobacillus）属種（アクチノバチルス・サクシノゲネ
ス（Actinobacillus succinogenes）を含む）；アナエロビオスピリルム（Anaerobiospir
illum）属種（アナエロビオスピリルム・スクシニシプロドュセンス（Anaerobiospirillu
m succiniciproducens）を含む）；バチルス（Bacillus）属種（バチルス・アルカリフィ
ルス（Bacillus alcaliphilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyl
oliquefaciens）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）、バチルス・セレウ
ス（Bacillus cereus）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・フィ
ルムス（Bacillus firmus）、バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）、バチ
ルス・ヒサシイ（Bacillus hisashii）、バチルス・ラウツス（Bacillus lautus）、バチ
ルス・レンツス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus lichenif
ormis）、バチルス・メガトテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Ba
cillus pumilus）、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）、バチルス・スブチリス（
Bacillus subtilis）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含
む）；バスフィア（Basfia）属種（バスフィア・スクシニシプロドュセンス（Basfia suc
ciniciproducens）を含む）；ブレビバチルス（Brevibacillus）属種（ブレビバチルス・
ブレビス（Brevibacillus brevis）を含む）；ブレビバチルス・ラテロスポラス（Brevib
acillus laterosporus）；クロストリジウム（Clostridium）属種（クロストリジウム・
アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・アウトエタノゲ
ヌム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostri
dium beijerinkii）、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxid
ivorans）、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）、ク
ロストリジウム・ルジュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・
パステウリアヌム（Clostridium pasteurianum）、クロストリジウム・パーフリンジェン
ス（Clostridum perfringens）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsda
lei）、クロストリジウム・サッカロブチリクム（Clostridium saccharobutylicum）、ク
ロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニウム（Clostridium saccharoperbutylacet
onium）を含む）；コリネバクテリウム（Corynebacterium）属種（コリネバクテリウム・
グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）を含む）；デスルフィトバクテリウム（De
sulfitobacterium）属種（デスルフィトバクテリウム・デハロゲナンス（Desulfitobacte
rium dehalogenans）、デスルフィトバクテリウム・ハフニエンセ（Desulfitobacterium
hafniense）を含む）；デスルホトマクルム（Desulfotomaculum）属種（デスルホトマク
ルム・アセトキシダンス（Desulfotomaculum acetoxidans）、デスルホトマクルム・ギブ
ソニアエ（Desulfotomaculum gibsoniae）、デスルホトマクルム・レドュセンス（Desulf
otomaculum reducens）、デスルホトマクルム・ルミニス（Desulfotomaculum ruminis）
を含む）；エンテロバクター（Enterobacter）属種（エンテロバクター・アサブリアエ（
Enterobacter asburiae）を含む）；エンテロコッカス（Enterococcus）属種（エンテロ
コッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）を含む）；エシェリキア（Escherich
ia）属種（大腸菌（Escherichia coli）を含む）；ラクトバチルス（Lactobacillus）属
種（ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス
・アミロフィルス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチルス・アミロボルス（Lac
tobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・アニマリス（Lactobacillus animalis）、
ラクトバチルス・アリゾネンシス（Lactobacillus arizonensis）、ラクトバチルス・バ
バリクス（Lactobacillus bavaricus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus bre
vis）、ラクトバチルス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・ブル
ガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カセイ（Lactobacillus case
i）、ラクトバチルス・コリノフォルミス（Lactobacillus corynoformis）、ラクトバチ
ルス・クリスパツス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・クルバツス（Lacto
bacillus curvatus）、ラクトバチルス・デルブルエクキイ（Lactobacillus delbrueckii
）、ラクトバチルス・フェルメンツム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・
ガセリイ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus
helveticus）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバ
チルス・ペントスス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・プランタルム（Lact
obacillus plantarum）、ラクトバチルス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクト
バチルス・ラムノスス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・サケイ（Lactoba
cillus sakei）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクト
バチルス・サンフリスセンシス（Lactobacillus sanfriscensis）を含む）；ラクトコッ
カス属種（ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）を含む）；マンヘイミア
（Mannheimia）属種（マンヘイミア・スクシニシプロドュセンス（Mannheimia succinici
producens）を含む）；パエニバシラス（Paenibacillus）属種（パエニバチルス・アルベ
イ（Paenibacillus alvei）、パエニバチルス・ベイジンゲンシス（Paenibacillus beiji
ngensis）、パエニバチルス・ボレアリス（Paenibacillus borealis）、パエニバチルス
・ダウシ（Paenibacillus dauci）、パエニバチルス・ドュルス（Paenibacillus durus）
、パエニバチルス・グラミニス（Paenibacillus graminis）、パエニバチルス・ラルバエ
（Paenibacillus larvae）、パエニバチルス・レンチモルブス（Paenibacillus lentimor
bus）、パエニバチルス・マセランス（Paenibacillus macerans）、パエニバチルス・ム
シラギノスス（Paenibacillus mucilaginosus）、パエニバチルス・オドリフェル（Paeni
bacillus odorifer）、パエニバチルス・ポリミクサ（Paenibacillus polymyxa）、パエ
ニバチルス・ステリフェル（Paenibacillus stellifer）、パエニバチルス・テラエ（Pae
nibacillus terrae）、パエニバチルス・ブルムクイエンシス（Paenibacillus wulumuqie
nsis）を含む）；ペディオコッカス（Pediococcus）属種（ペディオコッカス・アシディ
ラクチシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・クラウセニイ（Pediococcu
s claussenii）、ペディオコッカス・エタノリドュランス（Pediococcus ethanolidurans
）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）を含む）；プロピ
オニバクテリウム（Propionibacterium）属種（Ｐ．アシジプロピオニシ（P. acidipropi
onici）、Ｐ．フレウデンレイチイ（P. freudenreichii）、Ｐ．イェンセニイ（P. jense
nii）を含む）；サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）；スポロラク
トバチルス（Sporolactobacillus）属種（スポロラクトバチルス・イヌリヌス（Sporolac
tobacillus inulinus）、スポロラクトバチルス・ラエボラクチクス（Sporolactobacillu
s laevolacticus）を含む）；スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus
）；ストレプトコッカス（Streptococcus）属種（ストレプトコッカス・アガラクティア
エ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis
）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプト
コッカス・フェアカリス（Streptococcus feacalis）、ストレプトコッカス・ムタンス（
Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、肺
炎レンサ球菌（Streptococcus pneumonia）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes
）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッ
カス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ソブリヌス菌（Streptococcus
sobrinus）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）を含む）；ストレ
プトマイセス（Streptomyces）属種（ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyc
es achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis
）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイ
セス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Strept
omyces lividans）、ストレプトマイセス・パルブルス（Streptomyces parvulus）、スト
レプトマイセス・ヴェネズエラエ（Streptomyces venezuelae）、ストレプトマイセス・
ビナセウス（Streptomyces vinaceus）を含む）；テトラジェノコッカス（Tetragenococc
us）属種（テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Tetragenococcus halophilus）を含む
）およびザイモモナス（Zymomonas）属種（ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis
）を含む）から選択される。シュードモナス（Pseudomonas）属種（シュードモナス・プ
チダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa
）、シュードモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）、シュードモナス・
アングイルリセプチカ（Pseudomonas anguilliseptica）、シュードモナス・アルゲンテ
ィネンシス（Pseudomonas argentinensis）、シュードモナス・ボルボリ（Pseudomonas b
orbori）、シュードモナス・シトロネロリス（Pseudomonas citronellolis）、シュード
モナス・フラベスセンス（Pseudomonas flavescens）、シュードモナス・メンドシナ（Ps
eudomonas mendocina）、シュードモナス・ニトロレドュセンス（Pseudomonas nitroredu
cens）、シュードモナス・オレオボオランス（Pseudomonas oleovorans）、シュードモナ
ス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、シュードモナス・レ
シノボランス（Pseudomonas resinovorans）、シュードモナス・ストラミネア（Pseudomo
nas straminea）、シュードモナス・アスプレニイ（Pseudomonas asplenii）、シュード
モナス・アウランティアカ（Pseudomonas aurantiaca）、シュードモナス・アウレオファ
シエンス（Pseudomonas aureofaciens）、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomona
s chlororaphis）、シュードモナス・コルガテ（Pseudomonas corrugate）、シュードモ
ナス・フラギ（Pseudomonas fragi）、シュードモナス・ルンデンシス（Pseudomonas lun
densis）、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）、シュードモナ
ス・アントラクチア（Pseudomonas antarctica）、シュードモナス・アゾトフォルマンス
（Pseudomonas azotoformans）、「シュードモナス・ブラトクフォルダエ（Pseudomonas
blatchfordae）」、シュードモナス・ブラッシカセアルム（Pseudomonas brassicacearum
）、シュードモナス・ブレンエリ（Pseudomonas brenneri）、シュードモナス・セドリナ
（Pseudomonas cedrina）、シュードモナス・コルガテ（Pseudomonas corrugate）、シュ
ードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・ゲッサル
ディイ（Pseudomonas gessardii）、シュードモナス・リバネンシス（Pseudomonas liban
ensis）、シュードモナス・マンデリイ（Pseudomonas mandelii）、シュードモナス・マ
ルギナリス（Pseudomonas marginalis）、シュードモナス・メディテルラネア（Pseudomo
nas mediterranea）、シュードモナス・メリディアナ（Pseudomonas meridiana）、シュ
ードモナス・ミグラエ（Pseudomonas migulae）、シュードモナス・ムシドレンス（Pseud
omonas mucidolens）、シュードモナス・オリエ




ンタリス（Pseudomonas orientalis）、シュードモナス・パナシス（Pseudomonas panaci
s）、シュードモナス・プロテゲンス（Pseudomonas protegens）、シュードモナス・プロ
テオリティカ（Pseudomonas proteolytica）、シュードモナス・ロデシアエ（Pseudomona
s rhodesiae）、シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）、シュードモ
ナス・ティベルバレンシス（Pseudomonas thivervalensis）、シュードモナス・トラアア
シイ（Pseudomonas tolaasii）、シュードモナス・ベロニイ（Pseudomonas veronii）、
シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）、シュードモナス
・ペルツシノゲナ（Pseudomonas pertucinogena）、シュードモナス・クレモリコロラタ
（Pseudomonas cremoricolorata）、シュードモナス・エントモフィラ（Pseudomonas ent
omophila）、シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）、シュードモナス・モンテ
イリイ（Pseudomonas monteilii）、シュードモナス・モッセリイ（Pseudomonas mosseli
i）、シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）、シュードモナ
ス・パラフルバ（Pseudomonas parafulva）、シュードモナス・プレコグロシッシダ（Pse
udomonas plecoglossicida）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュー
ドモナス・バレアリカ（Pseudomonas balearica）、シュードモナス・ルテオラ（Pseudom
onas luteola）、シュードモナス・スツツゼリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナ
ス・アミグダリ（Pseudomonas amygdali）、シュードモナス・アベルラナエ（Pseudomona
s avellanae）、シュードモナス・カリカパパイアエ（Pseudomonas caricapapayae）、シ
ュードモナス・シクホリイ（Pseudomonas cichorii）、シュードモナス・コロナファシエ
ンス（Pseudomonas coronafaciens）、シュードモナス・フィクセレクタエ（Pseudomonas
ficuserectae）、シュードモナス・ヘリアンティ（Pseudomonas helianthi）、シュード
モナス・メリアエ（Pseudomonas meliae）、シュードモナス・サバスタノイ（Pseudomona
s savastanoi）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、シュードモナ
ス・トマト（Pseudomonas tomato）、シュードモナス・ビリディフラバ（Pseudomonas vi
ridiflava）、シュードモナス・アビエタニフィヒラ（Pseudomonas abietaniphila）、シ
ュードモナス・アシドフィラ（Pseudomonas acidophila）、シュードモナス・アガリシ（
Pseudomonas agarici）、シュードモナス・アルカリフィラ（Pseudomonas alcaliphila）
、シュードモナス・アルカノリティカ（Pseudomonas alkanolytica）、シュードモナス・
アミロデラモサ（Pseudomonas amyloderamosa）、シュードモナス・アスプレニイ（Pseud
omonas asplenii）、シュードモナス・アゾチフィゲンス（Pseudomonas azotifigens）、
シュードモナス・カンナビナ（Pseudomonas cannabina）、シュードモナス・コエノビオ
ス（Pseudomonas coenobios）、シュードモナス・コンゲランス（Pseudomonas congelans
）、シュードモナス・コスタンチニイ（Pseudomonas costantinii）、シュードモナス・
クルシビアエ（Pseudomonas cruciviae）、シュードモナス・デルヒエンシス（Pseudomon
as delhiensis）、シュードモナス・エクシシビス（Pseudomonas excibis）、シュードモ
ナス・エクストレモリエンタリス（Pseudomonas extremorientalis）、シュードモナス・
フレデリクスベルゲンシス（Pseudomonas frederiksbergensis）、シュードモナス・フス
コバギナエ（Pseudomonas fuscovaginae）、シュードモナス・ゲリディコラ（Pseudomona
s gelidicola）、シュードモナス・グリモンティイ（Pseudomonas grimontii）、シュー
ドモナス・インディカ（Pseudomonas indica）、シュードモナス・ジェセンニイ（Pseudo
monas jessenii）、シュードモナス・ジンジュエンシス（Pseudomonas jinjuensis）、シ
ュードモナス・キロネンシス（Pseudomonas kilonensis）、シュードモナス・クナックム
ッシイ（Pseudomonas knackmussii）、シュードモナス・コレエンシス（Pseudomonas kor
eensis）、シュードモナス・リニ（Pseudomonas lini）、シュードモナス・ルテア（Pseu
domonas lutea）、シュードモナス・モラビエンシス（Pseudomonas moraviensis）、シュ
ードモナス・オティティディス（Pseudomonas otitidis）、シュードモナス・パカストレ
ルラエ（Pseudomonas pachastrellae）、シュードモナス・パルレロニアナ（Pseudomonas
palleroniana）、シュードモナス・パパベリス（Pseudomonas papaveris）、シュードモ
ナス・ペリ（Pseudomonas peli）、シュードモナス・ペロレンス（Pseudomonas perolens
）、シュードモナス・ポアエ（Pseudomonas poae）、シュードモナス・ポハンゲンシス（
Pseudomonas pohangensis）、シュードモナス・プロテゲンス（Pseudomonas protegens）
、シュードモナス・サイコロフィア（Pseudomonas psychrophila）、シュードモナス・サ
イコロトレランス（Pseudomonas psychrotolerans）、シュードモナス・ラトニス（Pseud
omonas rathonis）、シュードモナス・レプティリボラ（Pseudomonas reptilivora）、シ
ュードモナス・レシニフィラ（Pseudomonas resiniphila）、シュードモナス・リゾスフ
ァエラエ（Pseudomonas rhizosphaerae）、シュードモナス・ルベスセンス（Pseudomonas
rubescens）、シュードモナス・サロモニイ（Pseudomonas salomonii）、シュードモナ
ス・セギティス（Pseudomonas segitis）、シュードモナス・セプティカ（Pseudomonas s
eptica）、シュードモナス・シミアエ（Pseudomonas simiae）、シュードモナス・スイス
（Pseudomonas suis）、シュードモナス・サーモトレランス（Pseudomonas thermotolera
ns）、シュードモナス・トヨトミエンス（Pseudomonas toyotomiensis）、シュードモナ
ス・トレマエ（Pseudomonas tremae）、シュードモナス・トリビアリス（Pseudomonas tr
ivialis）、シュードモナス・チュービネルラエ（Pseudomonas turbinellae）、シュード
モナス・チューティコリネンシス（Pseudomonas tuticorinensis）、シュードモナス・ウ
ムソンゲンシス（Pseudomonas umsongensis）、シュードモナス・バンコウベレンシス（P
seudomonas vancouverensis）、シュードモナス・ブラノベンシス（Pseudomonas vranove
nsis）、シュードモナス・キサントマリナ（Pseudomonas xanthomarina）を含む）。好ま
しくは、中温菌は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）である。
さらなる態様では、本明細書で定義される方法または使用は、酵母または真菌のゲノム
を改変するために使用することができる。特定の実施形態では、真菌種は、中温性であり
、好ましくは、真菌は、以下に限定されないが、アスペルギルス・ニデュランス（Asperg
illus nidulans）、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、コウジカビ（Asper
gillus oryzae）およびアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）を含めたアス
ペルギルス（Aspergillus）属種から選択され、より好ましくは、アスペルギルス（Asper
gillus）属種は、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）またはアスペ
ルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）である。代替的に、中温真菌種は、カンジダ（C
andida）属種である。本明細書において定義されている方法または使用は、以下に限定さ
れないが、サッカロマイセス（Saccharomyces）属種（出芽酵母（Saccharomyces cerevis
iae）を含む）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）（分裂酵母（Schizosacc
haromyces pombe）を含む）、ピチア（Pichia）属種（以下に限定されないが、ピチア・
パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・スチピティス（Pichia stipitis）を含む）を
含めた、酵母種のゲノムを改変するために使用することができる。本明細書において定義
されている方法または使用は、以下に限定されないが、ハンセヌラ（Hansenula）属種（
ハンセヌラ・ポリマルファ（Hansenula polymorpha）を含む）、ペニシリウム（Penicill
ium）属種（以下に限定されないが、Ｐ．ブラシリアヌム（P. brasilianum）、Ｐ．クリ
ソゲヌム（P. chrysogenum）を含む）、ヤロウイア（Yarrowia）属種（ヤロウイア・リポ
リチカ（Yarrowia lipolytica）を含む）を含めた、真菌種のゲノムを改変するために使
用することができる。
本発明はさらに、好熱性酵母または真菌種を改変するための、本明細書で定義されてい
る方法の使用に関し、好ましくは、真菌または酵母は、アスペルギルス（Aspergillus）
属種（アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ニデ
ュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus
）、アスペルギルス・ベルシコロル（Aspergillus versicolor）を含む）；カナリオマイ
セス（Canariomyces）属種（カナリオマイセス・サーモフィル（Canariomyces thermophi
le）を含む）；カエトミウム（Chaetomium）属種（カエトミウム・メソポタミクム（Chae
tomium mesopotamicum）、カエトミウム・サーモフィルム（Chaetomium thermophilum）
を含む）；カンジダ（Candida）属種（カンジダ・ボビナ（Candida bovina）、カンジダ
・スロオフィイ（Candida sloofii）、カンジダ・サーモフィラ（Candida thermophila）
、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・クルセイ（Candida krus
ei）（＝イサトケンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis））を含む）；セ
ロフォラ（Cercophora）属種（セロフォラ・コロナテ（Cercophora coronate）、セロフ
ォラ・セプテントリオナリス（Cercophora septentrionalis）を含む）；コネメリア（Co
onemeria）属種（コネメリア・アエギプティアカ（Coonemeria aegyptiaca）を含む）；
コリナスカス（Corynascus）属種（コリナスカス・サーモフィルス（Corynascus thermop
hiles）を含む）；ゲオトリクム（Geotrichum）属種（ゲオトリクム・カンディドゥム（G
eotrichum candidum）を含む）；クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属種（クルイベ
ロマイセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロマイセス・マルキシア
ヌス（Kluyveromyces marxianus）を含む）；マルブランケア（Malbranchea）属種（マル
ブランケア・シンナモメア（Malbranchea cinnamomea）、マルブランケア・スルフレア（
Malbranchea sulfurea）を含む）；メラノカルプス（Melanocarpus）属種（メラノカルプ
ス・アルボマイセス（Melanocarpus albomyces）を含む）；ミセリオフトラ（Myceliopht
ora）属種（ミセリオフトラ・フェルグシイ（Myceliophthora fergusii）、ミセリオフト
ラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）を含む）；マイコテルムス（Mycother
mus）属種（マイコテルムス・サーモフィレス（Mycothermus thermophiles）（＝スキタ
リジウム・サーモフィルム（Scytalidium thermophilum）／トルラ・サーモフィラ（Toru
la thermophila））を含む）；マイリオコックム（Myriococcum）属種（マイリオコック
ム・サーモフィルム（Myriococcum thermophilum）を含む）；パエキロマイセス（Paecil
omyces）属種（パエキロマイセス・サーモフィラ（Paecilomyces thermophila）を含む）
；レメルソニア（Remersonia）属種（レメルソニア・サーモフィラ（Remersonia thermop
hila）を含む）；リゾムコル（Rhizomucor）属種（リゾムコル・プシルス（Rhizomucor p
usillus）、リゾムコル・タウリクス（Rhizomucor tauricus）を含む）；サッカロマイセ
ス（Saccharomyces）属種（出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）を含む）、シゾサッ
カロマイセス（Schizosaccharomyces）属種（分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）を
含む）、スキタリジウム（Scytalidium）属（スキタリジウム・サーモフィルム（Scytali
dium thermophilum）を含む）；ソルダリス（Sordaris）属（ソルダリア・サーモフィラ
（Sordaria thermophila）を含む）；サーモアスカス（Thermoascus）属種（サーモアス
カス・アウランティアクス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィ
レス（Thermoascus thermophiles）を含む）；テルモムコル（Thermomucor）属種（テル
モムコル・インディカエ－セウダティカエ（Thermomucor indicae-seudaticae）を含む）
、およびサーモマイセス（Thermomyces）属種（サーモマイセス・イバダネンシス（Therm
omyces ibadanensis）、サーモマイセス・ラヌギノスス（Thermomyces lanuginosus）
を含む）から選択される。
前述の一覧表示において、太字の活字で特定されている微生物は、本発明の使用に特に
好適／適用可能であることが見いだされた。
一部の好ましい本発明の実施形態には、好熱性細菌（アエリバチルス（Aeribacillus）
属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、アノキシバチルス（Anoxybacillus）
属、バチルス（Bacillus）属、ゲオバチルス（Geobacillus）属を含む）；パエニバシラ
ス（Paenibacillus）属種；サーモフィリック・クロストリジア（Thermophilic clostrid
ia）（アンアエロバクター（Anaerobacter）属、アンアエロバクテリウム（Anaerobacter
ium）属、カルディセルロシルプター（Caldicellulosiruptor）属、クロストリジウム（C
lostridium）属、モーレラ（Moorella）属、サーモアンアエロバクター（Thermoanaeroba
cter）属、サーモアンアエロバクテリウム（Thermoanaerobacterium）属、サーモブラキ
ウム（Thermobrachium）属、サーモハロバクター（Thermohalobacter）属種を含む）、ま
たは１つもしくは複数の好熱性ラクトバチルス（Lactobacillus）属種から選択される１
つもしくは複数の好熱性微生物、または１つもしくは複数の好熱性微生物、ならびにバチ
ルス（bacillus）属種、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス（Lactobacillus
）属種、ラクトコッカス（Lactococcus）属種、プロピオニバクトリウム（Propionibacte
rium）属種およびシュードモナス（Pseudomonas）属種から選択される中温細菌が含まれ
る。
本発明は、今や特定の実施形態に関連しておよび添付図に関連して詳細に説明されるこ
とになる。
Ｃａｓ９タンパク質配列の近隣結合樹を示す図である。ｐＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ－ＢＬＡＳＴに基づいて菌株Ｔ１２と４０％を超える配列類似性を有するすべての配列、ならびに現在十分に特徴付けられている配列（化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophiles）およびアクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii））、ならびに、これらの配列が４０％より低い同一性であった場合、現在同定されている好熱性配列も含まれた。すべての好熱性配列では、Ｔ１２に対するパーセント同一性は菌株名の後に示される。遺伝子識別子（ｇｉ）番号は種名の前に示される。説明文：閉環：好熱性（最適６０℃より高い）Ｃａｓ９配列、閉四角：熱耐性（最適＜５０℃）Ｃａｓ９配列、開三角：中温性起源由来のゲノム編集目的で現在最も使用されているＣａｓ９配列；符号なし：中温性Ｃａｓ９。結節点の値は１０００レプリケートブートストラップ値を表し；スケールバーは部位当たりの推定アミノ酸置換を表す。 Ｃａｓ９遺伝子配列の近隣結合樹を示す図である。遺伝子レベルでの同一性は極端に乏しかった；タンパク質整列のために使用された生物と同じ生物由来の配列を遺伝子整列のために使用した。遺伝子識別子（ｇｉ）番号は種名の前に示されている。説明文：閉環：好熱性（最適６０℃より高い）Ｃａｓ９配列、閉四角：熱耐性（最適＜５０℃）Ｃａｓ９配列、開三角：中温性起源由来のゲノム編集目的で現在最も使用されているＣａｓ９配列；符号なし：中温性Ｃａｓ９。結節点の値は１０００レプリケートブートストラップ値を表す。 ｇｔＣａｓ９（配列番号１）（ＩＩ－Ｃ型）と十分に特徴付けられているＩＩ－Ｃ型（アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）｜「ａｎａ」；配列番号８）およびＩＩ－Ａ型（化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）｜「ｐｙｏ」；配列番号９およびストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus））Ｃａｓ９配列とのタンパク質配列整列を示す図である。重要な活性部位残基はよく保存されており、黒色矢印で示されている。Ａｎａ－Ｃａｓ９およびＰｙｏ－Ｃａｓ９について記載されているタンパク質ドメイン（Jinek, et al., 2014, Science 343: 1247997）は斜線囲みおよび類似の色付き文字で示されている。ＰＡＭ認識ドメインは、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）ＩＩ－Ａ型系では決定されているが、いかなるＩＩ－Ｃ型系についても決定されておらず、したがって、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）配列でのみ示されている。 ｇｔＣａｓ９（配列番号１）（ＩＩ－Ｃ型）と十分に特徴付けられているＩＩ－Ｃ型（アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）｜「ａｎａ」；配列番号８）およびＩＩ－Ａ型（化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）｜「ｐｙｏ」；配列番号９およびストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus））Ｃａｓ９配列とのタンパク質配列整列を示す図である。重要な活性部位残基はよく保存されており、黒色矢印で示されている。Ａｎａ－Ｃａｓ９およびＰｙｏ－Ｃａｓ９について記載されているタンパク質ドメイン（Jinek, et al., 2014, Science 343: 1247997）は斜線囲みおよび類似の色付き文字で示されている。ＰＡＭ認識ドメインは、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）ＩＩ－Ａ型系では決定されているが、いかなるＩＩ－Ｃ型系についても決定されておらず、したがって、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）配列でのみ示されている。 アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－Ａｎａ）のタンパク質構成を示す図である（Jinek et al., 2014）。ｇｔＣａｓ９は同じＩＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ系に属し、活性部位残基を同定することができた。 相補的ｄｓＤＮＡのｃｒＲＮＡガイドターゲティングの比較を示す図である。塩基対合は破線で示されている。ＲＮＡは黒色で、ＤＮＡは灰色で描かれている。ｃｒＲＮＡスペーサーと標的プロトスペーサー間の塩基対合は太い黒色破線で示され、ＤＮＡ鎖間およびＲＮＡ鎖間の塩基対合は太い灰色破線で示されている。ｃｒＲＮＡの５’末端が示されている。Ｉ型中のＰＡＭ（小さい白色囲み）は標的鎖（プロトスペーサー）の下流に存在し、ＩＩ型ではＰＡＭは置き換えられた鎖のもう一方の末端に存在することに注目されたい。同様に、シード（標的ＤＮＡ鎖との塩基対合が始まり、ミスマッチが許されないガイドの予想配列）はＰＡＭの近くに位置しており、したがって、Ｉ型とＩＩ型で異なる（Van der Oost, 2014 ibid.）。パネルＡは大腸菌（E. coli）のＩ型Ｃａｓｃａｄｅ系の模式図を示している。ｃｒＲＮＡは、内部スペーサー（灰色囲み、標的認識を可能にする３１～３２ヌクレオチド）を有し、８ヌクレオチド５’ハンドルおよびステムループ構造（ヘアピン）からなる２９ヌクレオチド３’ハンドルで隣接している（Jore 2011 ibid.）。パネルＢは化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）のＩＩ型Ｃａｓ９系の模式図を示している。ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡと塩基対合し、リボヌクレアーゼＩＩＩによるプロセシングを可能にする（向かい合った黒色三角）。さらに、ｃｒＲＮＡの５’末端はリボヌクレアーゼにより刈り込まれ（黒色三角）、典型的には２０ヌクレオチドスペーサーを生じる。合成ループを導入してｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を生じてもよいことに注目されたい（Jinek et al., 2012 ibid.）。 Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２型ＩＩｃ ＣＲＩＳＰＲ系の配列のアライメントを示す図である。 ｇｔＣａｓ９のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの、ＰＡＭ予測をもたらすために得た６つの単一ヒットを示す図である。 ｇｔＣａｓ９のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの、ＰＡＭ予測をもたらすために得た６つの単一ヒットを示す図である。 図７に例示したアライメントの結果を組み合わせたｗｅｂｌｏｇｏを示す図である。このｗｅｂｌｏｇｏは、ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕを使用して生成した。 精製済みｇｔＣａｓ９による、プラスミドを標的とした、６０℃でのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイの結果を示すグラフである。このプラスミドは、ＰＡＭ配列の８ヌクレオチド長の特異的配列変異体を含んだ。 ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配列を含む標的プラスミドを使用する、ｇｔＣａｓ９濃度の効果を検討するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示すグラフである。 ある範囲の温度にわたる、ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配列を含む標的プラスミドを使用する、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示すグラフである。 実施例９に説明した通り、選択プレート上のバチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞のコロニーの成長または不在により、ｇｔＣａｓ９および８ｎｔ ＰＡＭ配列を使用するバチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞のｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集の結果を示すグラフである。コロニーは、図１２中に矢印で示している。 ｐｙｒＦ遺伝子を除外する、コロニーのＰＣＲスクリーニングの結果を示すグラフである。このコロニーは、構築物３（ネガティブ対照）による、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞の変換後に生成した。１５のコロニーをスクリーニングしたが、実施例９に説明されている通り、欠失遺伝子型－２．１ｋｂのバンドサイズを示すものはなく、代わりにすべてが、野生型－２．９ｋｂのバンドサイズを示した。 ｐｙｒＦ遺伝子が欠失された、コロニーのＰＣＲスクリーニングの結果を示すグラフである。このコロニーは、構築物１（ＰＡＭ配列ＡＴＣＣＣＣＡＡ［配列番号２１］）による、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞の変換後に生成した。２０のコロニーをスクリーニングし、実施例９に説明されている通り、１つが、欠失遺伝子型－２．１ｋｂのバンドサイズを示した一方、残りは、野生型－２．９ｋｂのバンドサイズと欠失遺伝子型－２．１ｋｂのバンドサイズの両方を示した。野生型のみの遺伝子型は観察されなかった。 ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２ ＩＩＣ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座は、熱安定性Ｃａｓ９ホモログであるＴｈｅｒｍｏＣａｓ９をコードする図である。 （Ａ）ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９をコードするゲノム遺伝子座の概略図。赤色で強調した予測活性部位残基を含む配列比較に基づく、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のドメインアーキテクチャ。Ｐｈｙｒｅ２を使用して生成した、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の相同性モデル（Kelley et al. Nat. Protoc. 10, 845-858(2015)）が、ドメインに対して様々な色を付けて示されている。 （Ｂ） ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９と高度に同一のＣａｓ９オルソログの進化系統樹。進化的解析は、ＭＥＧＡ７において行った（Kumar et al. Mol. Biol. Evol. 33, 1870-1874(2016)）。 （Ｃ） 金属－アフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過による精製後のＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。得られた単一バンドの移動は、アポ－ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の１２６ｋＤという理論分子量に一致する。 ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ ＰＡＭ解析を示す図である。 （Ａ） プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の位置および同一性（５’－ＮＮＮＮＮＮＮ－３’）を発見するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ 切断アッセイの例示概略図である。黒色三角は、切断位を示す。 （Ｂ）標的ライブラリーのＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づく切断の比較解析によって得られた、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のコンセンサス７ｎｔ長のＰＡＭの配列ロゴである。各位置の文字の高さは、情報内容により測定される。 （Ｃ） ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイにより８位とＰＡＭ同一性の伸長その各々が、個別の５’－ＣＣＣＣＣＣＡＮ－３’ＰＡＭを含有する、４つの線形プラスミド標的を、５５℃で１時間、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびｓｇＲＮＡと共にインキュベートし、次に、アガロースゲル電気泳動により解析した。 （Ｄ）３０℃および５５℃において、様々なＰＡＭを有するＤＮＡ標的に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイである。その各々が、１つの個別の５’－ＣＣＣＣＣＮＮＡ－３’［配列番号１３］ＰＡＭを含有する、１６の線形プラスミド標的を、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびｓｇＲＮＡと共にインキュベートし、次に、アガロースゲル電気泳動によって、切断効率を解析した。図２１も参照されたい。 ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ ＰＡＭ解析を示す図である。 （Ａ） プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の位置および同一性（５’－ＮＮＮＮＮＮＮ－３’）を発見するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ 切断アッセイの例示概略図である。黒色三角は、切断位を示す。 （Ｂ）標的ライブラリーのＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づく切断の比較解析によって得られた、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のコンセンサス７ｎｔ長のＰＡＭの配列ロゴである。各位置の文字の高さは、情報内容により測定される。 （Ｃ） ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイにより８位とＰＡＭ同一性の伸長その各々が、個別の５’－ＣＣＣＣＣＣＡＮ－３’ＰＡＭを含有する、４つの線形プラスミド標的を、５５℃で１時間、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびｓｇＲＮＡと共にインキュベートし、次に、アガロースゲル電気泳動により解析した。 （Ｄ）３０℃および５５℃において、様々なＰＡＭを有するＤＮＡ標的に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイである。その各々が、１つの個別の５’－ＣＣＣＣＣＮＮＡ－３’［配列番号１３］ＰＡＭを含有する、１６の線形プラスミド標的を、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびｓｇＲＮＡと共にインキュベートし、次に、アガロースゲル電気泳動によって、切断効率を解析した。図２１も参照されたい。 ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、幅広い温度範囲で活性であり、ｓｇＲＮＡに結合するとその熱安定性が増大することを示す図である。 （Ａ）ｓｇＲＮＡの概略図、および標的ＤＮＡのマッチング。標的ＤＮＡは、黒色輪郭により長方形として示されており、ＰＡＭは、黒色の輪郭により横方向の楕円で暗グレー色として示されている。ｃｒＲＮＡは、黒色輪郭で暗グレー色の長方形として示されており、ｃｒＲＮＡの３’末端がｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端と連結している部分は、黒色の縦方向の楕円として示されている。白色の文字による黒色の四角、および黒色文字による明グレーの四角は、それぞれ、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’側における３つおよび２つの予測ループを示している。ｃｒＲＮＡの相補的である３’末端およびｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端により形成された、繰り返し／抗繰り返し領域の４１ｎｔトランケートは、明グレー色の縦方向長点線で示されている。第１のｔｒａｃｒＲＮＡの予測３’位置は、黒色三角および黒色点線により印が付けられている。第２のｔｒａｃｒＲＮＡループの予測３’位置は、白色三角および黒色点線により印が付けられている。第３のｔｒａｃｒＲＮＡループの予測３’位置は、白色三角および白色点線により印が付けられている。 （Ｂ） ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の予測される３つのステムループの重要性は、ｓｇＲＮＡのトランケートした変異体を転写して、ガイドＲＮＡＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が様々な温度で標的ＤＮＡを切断する能力を評価することにより試験した。少なくとも２つの生物学的繰り返しの平均値が示されており、エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。 （Ｃ） 最大温度を特定するため、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を６０℃、６５℃および７０℃で５分間または１０分間、インキュベートした後にアッセイした。予め加熱したＤＮＡ基質を加え、この反応物を、対応する温度で１時間、インキュベートした。 （Ｄ）指示温度で５分間、インキュベートした後に行った活性アッセイにより、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の活性温度範囲の比較。予め加熱したＤＮＡ基質を加え、この反応物を、同一温度で１時間、インキュベートした。 ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、幅広い温度範囲で活性であり、ｓｇＲＮＡに結合するとその熱安定性が増大することを示す図である。 （Ａ）ｓｇＲＮＡの概略図、および標的ＤＮＡのマッチング。標的ＤＮＡは、黒色輪郭により長方形として示されており、ＰＡＭは、黒色の輪郭により横方向の楕円で暗グレー色として示されている。ｃｒＲＮＡは、黒色輪郭で暗グレー色の長方形として示されており、ｃｒＲＮＡの３’末端がｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端と連結している部分は、黒色の縦方向の楕円として示されている。白色の文字による黒色の四角、および黒色文字による明グレーの四角は、それぞれ、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’側における３つおよび２つの予測ループを示している。ｃｒＲＮＡの相補的である３’末端およびｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端により形成された、繰り返し／抗繰り返し領域の４１ｎｔトランケートは、明グレー色の縦方向長点線で示されている。第１のｔｒａｃｒＲＮＡの予測３’位置は、黒色三角および黒色点線により印が付けられている。第２のｔｒａｃｒＲＮＡループの予測３’位置は、白色三角および黒色点線により印が付けられている。第３のｔｒａｃｒＲＮＡループの予測３’位置は、白色三角および白色点線により印が付けられている。 （Ｂ） ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の予測される３つのステムループの重要性は、ｓｇＲＮＡのトランケートした変異体を転写して、ガイドＲＮＡＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が様々な温度で標的ＤＮＡを切断する能力を評価することにより試験した。少なくとも２つの生物学的繰り返しの平均値が示されており、エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。 （Ｃ） 最大温度を特定するため、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を６０℃、６５℃および７０℃で５分間または１０分間、インキュベートした後にアッセイした。予め加熱したＤＮＡ基質を加え、この反応物を、対応する温度で１時間、インキュベートした。 （Ｄ）指示温度で５分間、インキュベートした後に行った活性アッセイにより、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の活性温度範囲の比較。予め加熱したＤＮＡ基質を加え、この反応物を、同一温度で１時間、インキュベートした。 好熱菌における、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくゲノム工学を示す図である。 （Ａ） 基礎的な対象ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿Δｇｅｎｅ（ｇｏｉ）構築物の概略図である。ｐＮＷ３３ｎ（Ｂ．スミシイ（B. smithii））またはｐＥＭＧ（Ｐ．プチダ（P. putida））ベクターのどちらか一方に、ｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子を導入した。相同組換え隣接部を、標的ゲノムにおいて、上流でｔｈｅｒｍｏｃａｓ９に導入し、この隣接部は、上流領域に１ｋｂ（Ｂ．スミシイ（B. smithii））または０．５ｋｂ（Ｐ．プチダ（P. putida））を、および下流領域に１ｋｂまたは０．５ｋｂの目的の遺伝子（ｇｏｉ）を包含した。ｓｇＲＮＡ発現モジュールは、ｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子の下流に導入した。複製（ｏｒｉ）の起源、複製タンパク質（ｒｅｐ）、抗生物質耐性マーカー（ＡＢ）および可能な補助エレメント（ＡＥ）は、主鎖特異的であり、それらは、点線の輪郭で示されている。 （Ｂ）Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムに由来する、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくｐｙｒＦ欠失過程からの１０のコロニー上のゲノム特異的ＰＣＲから得られた生成物を示す、アガロースゲル電気泳動である。１０のコロニーはすべて、ΔｐｙｒＦ遺伝子型を含み、１つのコロニーは、野生型生成物を欠いた、クリーンなΔｐｙｒＦ変異体であった。 （Ｃ）基礎ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｇｏｉ構築物の概略図である。触媒的に不活性なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９（Ｔｈｅｒｍｏ－ｄＣａｓ９：Ｄ８Ａ、Ｈ５８２Ａ変異体）の発現を目的として、対応する変異を導入して、ｔｈｅｒｍｏ－ｄｃａｓ９遺伝子を作製した。ｔｈｅｒｍｏ－ｄｃａｓ９遺伝子は、ｐＮＷ３３ｎベクターに導入した。ｓｇＲＮＡ発現モジュールは、ｔｈｅｒｍｏ－ｄｃａｓ９の下流に導入した。 （Ｄ） Ｔｈｅｒｍｏ－ｄＣａｓ９を使用したｌｄｈＬサイレンシング実験からの生成、成長およびＲＴ－ｑＰＣＲ結果のグラフ表示である。このグラフは、対照培養物と比較した、抑制培養物における、ラクテート生成、６００ｎｍにおける光学密度およびｌｄｈＬ転写率を示すグラフである。少なくとも２つの生物学的繰り返しからの平均値が示されており、エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。 好熱菌における、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくゲノム工学を示す図である。 （Ａ） 基礎的な対象ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿Δｇｅｎｅ（ｇｏｉ）構築物の概略図である。ｐＮＷ３３ｎ（Ｂ．スミシイ（B. smithii））またはｐＥＭＧ（Ｐ．プチダ（P. putida））ベクターのどちらか一方に、ｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子を導入した。相同組換え隣接部を、標的ゲノムにおいて、上流でｔｈｅｒｍｏｃａｓ９に導入し、この隣接部は、上流領域に１ｋｂ（Ｂ．スミシイ（B. smithii））または０．５ｋｂ（Ｐ．プチダ（P. putida））を、および下流領域に１ｋｂまたは０．５ｋｂの目的の遺伝子（ｇｏｉ）を包含した。ｓｇＲＮＡ発現モジュールは、ｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子の下流に導入した。複製（ｏｒｉ）の起源、複製タンパク質（ｒｅｐ）、抗生物質耐性マーカー（ＡＢ）および可能な補助エレメント（ＡＥ）は、主鎖特異的であり、それらは、点線の輪郭で示されている。 （Ｂ）Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムに由来する、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくｐｙｒＦ欠失過程からの１０のコロニー上のゲノム特異的ＰＣＲから得られた生成物を示す、アガロースゲル電気泳動である。１０のコロニーはすべて、ΔｐｙｒＦ遺伝子型を含み、１つのコロニーは、野生型生成物を欠いた、クリーンなΔｐｙｒＦ変異体であった。 （Ｃ）基礎ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｇｏｉ構築物の概略図である。触媒的に不活性なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９（Ｔｈｅｒｍｏ－ｄＣａｓ９：Ｄ８Ａ、Ｈ５８２Ａ変異体）の発現を目的として、対応する変異を導入して、ｔｈｅｒｍｏ－ｄｃａｓ９遺伝子を作製した。ｔｈｅｒｍｏ－ｄｃａｓ９遺伝子は、ｐＮＷ３３ｎベクターに導入した。ｓｇＲＮＡ発現モジュールは、ｔｈｅｒｍｏ－ｄｃａｓ９の下流に導入した。 （Ｄ） Ｔｈｅｒｍｏ－ｄＣａｓ９を使用したｌｄｈＬサイレンシング実験からの生成、成長およびＲＴ－ｑＰＣＲ結果のグラフ表示である。このグラフは、対照培養物と比較した、抑制培養物における、ラクテート生成、６００ｎｍにおける光学密度およびｌｄｈＬ転写率を示すグラフである。少なくとも２つの生物学的繰り返しからの平均値が示されており、エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。 ＩＩ型Ａ、ＢおよびＣ Ｃａｓ９オルソログの多重配列整列を示す図である。化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（Ｓｐ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（Ｓｔ）、ウオリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）（Ｗｓ）、ネイッセリア・メニンギティデス（Neisseria meningitides）（Ｎｍ）、アクチノマイセス・ナエスルンディイ（Actinomyces naeslundii）（Ａｎ）、およびゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）（Ｔｈｅｒｍｏ）のＣａｓ９タンパク質配列を、デフォルト設定のＭＥＧＡ７ ２におけるＣｌｕｓｔａｌＷ１を使用して整列させた。ＥＳＰｒｉｐｔ３を使用して、可視化した。厳密に保存された残基は、グレーの背景上の白色の文字で示す。類似残基は、黒色輪郭により白色の縦方向の長方形に、黒色の文字で示す。ピラミッドは、すべての配列において、２つの保存されたヌクレアーゼドメインを示している。横方向の黒色矢印および渦は、それぞれ、ＳｐＣａｓ９二次構造における、β鎖およびα－ヘリックスを示している（タンパク質データベース ｎｒ ４ＣＭＰ４）。構造ドメインは、図１５Ａと同様に、同じ色のスキームを使用して、ＳｐＣａｓ９およびＴｈｅｒｍｏＣａｓ９について示している。 ＩＩ型Ａ、ＢおよびＣ Ｃａｓ９オルソログの多重配列整列を示す図である。化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（Ｓｐ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（Ｓｔ）、ウオリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）（Ｗｓ）、ネイッセリア・メニンギティデス（Neisseria meningitides）（Ｎｍ）、アクチノマイセス・ナエスルンディイ（Actinomyces naeslundii）（Ａｎ）、およびゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）（Ｔｈｅｒｍｏ）のＣａｓ９タンパク質配列を、デフォルト設定のＭＥＧＡ７ ２におけるＣｌｕｓｔａｌＷ１を使用して整列させた。ＥＳＰｒｉｐｔ３を使用して、可視化した。厳密に保存された残基は、グレーの背景上の白色の文字で示す。類似残基は、黒色輪郭により白色の縦方向の長方形に、黒色の文字で示す。ピラミッドは、すべての配列において、２つの保存されたヌクレアーゼドメインを示している。横方向の黒色矢印および渦は、それぞれ、ＳｐＣａｓ９二次構造における、β鎖およびα－ヘリックスを示している（タンパク質データベース ｎｒ ４ＣＭＰ４）。構造ドメインは、図１５Ａと同様に、同じ色のスキームを使用して、ＳｐＣａｓ９およびＴｈｅｒｍｏＣａｓ９について示している。 ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＰＡＭ決定結果を示す図である。パネル（Ａ）は、ＣＲＩＳＰＲｔａｒｇｅｔ６を使用して、ファージゲノムを用いて得られた２つのヒットを示している。パネル（Ｂ）は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＰＡＭ解析により得られた、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の７ｎｔ長のコンセンサスＰＡＭの配列ロゴを示している。各位置の文字の高さは、情報内容により測定される。 ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ ＰＡＭ発見を示す図である。２０℃、３７℃、４５℃および６０℃における、様々なＰＡＭを有するＤＮＡ標的のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイ。その各々が、１つの個別の５’－ＣＣＣＣＣＮＮＡ－３’［配列番号１３］ＰＡＭを含有する、７（２０℃）または１６（３７℃、４５℃、６０℃）の線形プラスミド標的を、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびｓｇＲＮＡと共にインキュベートし、次に、アガロースゲル電気泳動によって、解析した。 １つのループを含有する、ｓｇＲＮＡを使用する幅広い温度範囲のＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性を示している。ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の予測される３つのステムループの重要性は、ｓｇＲＮＡのトランケートした変異体を転写して、ガイドＲＮＡＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が様々な温度で標的ＤＮＡを切断する能力を評価することにより試験した。上には、様々な温度における、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性に及ぼす１つのループの影響を示す。少なくとも２つの生物学的繰り返しからの平均値が示されており、エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。 ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、触媒として二価陽イオンを使用して、ｄｓＤＮＡ標的化を媒介し、ｓｓＤＮＡを切断しないことを示す図である。パネル（Ａ）は、ＥＤＴＡおよび様々な金属イオンを含むＴｈｅｒｍｏＣａｓ９によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏプラスミドＤＮＡ切断を示す。Ｍ＝１ｋｂのＤＮＡラダー。パネル（Ｂ）は、ｓｓＤＮＡ基質に及ぼすＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性を示す。Ｍ＝１０ｂｐのＤＮＡラダー。 ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、触媒として二価陽イオンを使用して、ｄｓＤＮＡ標的化を媒介し、ｓｓＤＮＡを切断しないことを示す図である。パネル（Ａ）は、ＥＤＴＡおよび様々な金属イオンを含むＴｈｅｒｍｏＣａｓ９によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏプラスミドＤＮＡ切断を示す。Ｍ＝１ｋｂのＤＮＡラダー。パネル（Ｂ）は、ｓｓＤＮＡ基質に及ぼすＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性を示す。Ｍ＝１０ｂｐのＤＮＡラダー。 ｌｄｈＬサイレンシング実験に関するスペーサー選択を示す図である。ｌｄｈＬサイレンシング過程の間の、スペーサー（ｓｇＲＮＡ）－プロトスペーサーアニールの概略図である。選択したプロトスペーサーは、ｌｄｈＬ遺伝子の開始コドンの下流の非鋳型鎖および３９ｎｔに存在する。 ｐＥＭＧ主鎖、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ｐｙｒＦ隣接領域およびｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子、およびシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ｐｙｒＦターゲッティングｓｇＲＮＡからなる、プラスミドｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｐｐΔｐｙｒＦのマップを示す図である。 シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のゲノムに由来するＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくｐｙｒＦ欠失過程から得られたコロニーに関する、ゲノム特異的ＰＣＲから得られた生成物を示す、キャピラリーゲル電気泳動の結果を示す図である。１８５４ｂｐのバンドおよび１１１２ｂｐのバンドは、それぞれ、ｐｙｒＦおよびΔｐｙｒＦ遺伝子型に対応する。
以下は、本発明に従って使用されるＣａｓタンパク質のポリヌクレオチドおよびアミノ
酸配列である。
［配列番号１］ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitr
ificans）Ｔ１２ Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列
Figure 2022166045000001
［配列番号７］ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitr
ificans）Ｔ１２ Ｃａｓ９ ＤＮＡ配列
Figure 2022166045000002
Figure 2022166045000003
[実施例１]
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）の単離
驚くべきことに、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans
）は、嫌気性条件下でリグノセルロース基質を分解することができる好熱菌についての±
５００単離菌のライブラリーの探索中に発見された。当初、±５００単離菌のライブラリ
ーが確立され、これはセルロースおよびキシラン上での単離により数回の選択ラウンド後
に、１１０単離菌にまで削減された。１１０単離菌のこのライブラリーはゲオバチルス（
Geobacillus）単離菌のみからなり、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. ther
modenitrificans）がライブラリーの７９％を占めていた。
単離されたゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）菌株
は「Ｔ１２」と命名された。Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）
Ｔ１２に由来するＣａｓ９タンパク質は、「ｇｔＣａｓ９」と命名された。
[実施例２]
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）でのＣ
ａｓ９について必須のコンセンサス配列を定義する
以下のデータベース探索および整列が実施された。
ｐＢＬＡＳＴおよびｎＢＬＡＳＴは社内ＢＬＡＳＴサーバーで実施し、ゲオバチルス・
サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２のタンパク質または遺伝子
配列を問い合わせ配列として使用した。このデータベースは２０１４年５月に最後にアッ
プデートされ、したがって、最も最近に追加されたゲオバチルス（Geobacillus）ゲノム
を含有していないが、通常のオンラインＢＬＡＳＴはＴ１２配列の公開を防ぐために使用
されなかった。ＢＬＡＳＴ中の４０％を超えることが分かった配列同一性を図１に含む。
もっと最近の配列データを含めるために、ゲオバチルス（Geobacillus）ＭＡＳ１（ｇ
ｔＣａｓ９に最も密接に関係している）の配列を使用してＮＣＢＩウェブサイト上でＰＳ
Ｉ－ＢＬＡＳＴを実施した（Johnson et al., 2008 Nucleic Acids Res. 36(Web Server
issue): W5-9）。２連続ラウンドのＰＳＩ－ＢＬＡＳＴが実施され、そこでは以下の基準
：第１のラウンドでは最小配列包括度９６％、ならびに第２および第３のラウンドでは９
７％、最小同一性４０％、種当たり１つの菌株のみを満たした配列のみが次のラウンドで
使用された。
ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴから生じる配列、ならびに内部サーバーｐＢＬＡＳＴ由来のＴ１２
に対して４０％よりも大きな同一性を有し、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴには現われなかった配列
を、現在十分に特徴付けられている中温性配列と、および、これらの配列がもっと離れた
関係にある場合には、現在同定されているすべての好熱性配列とも整列させ、それから近
隣結合樹を構築した（図１参照）。整列はＣｌｕｓｔａｌＷを使用してＭｅｇａ６で実施
し、この後近隣結合法を使用して樹を構築し、ブートストラップ解析は１０００レプリケ
ートを使用して実施した。
問い合わせ配列としてゲオバチルス（Geobacillus）属種ＭＡＳ１を使用してＢＬＡＳ
Ｔｎを実施した場合、ゲオバチルス（Geobacillus）属種ＪＦ８ Ｃａｓ９のみが８８％
の同一性で同定され、遺伝子レベルでは相同性が極めて少ないことを示していた。図２は
Ｃｌｕｓｔａｌ整列Ｃａｓ９遺伝子配列の近隣結合樹である。
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２、アクチ
ノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）および化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）のタ
ンパク質配列は、デフォルト設定のＢＬＯＳＵＭ６２を使用してＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅ
ｒでその配列を整列させることによりタンパク質ドメイン相同性についてさらに解析した
（図３参照）。
[実施例３]
ＣＡＳ９の機能に不可欠であるコアアミノ酸モチーフおよび好熱性Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
の熱安定性を与えるコアアミノ酸モチーフを同定する
上記整列されたタンパク質配列のパーセント同一性は図１に与えられている。ｇｔＣａ
ｓ９はＩＩ－Ｃ型に属している。ＩＩ－Ｃ型系の最もよく研究され、最近結晶化された構
造はアクチノマイセス・ネスランディ（Actinomyces naeslundii）由来である（Jinek et
al., 2014, Science 343: 1247997）。このタンパク質配列はｇｔＣａｓ９に対して２０
％の同一性しか示していないが、高度に保存された残基を推定するのに使用することが可
能である。２つの十分に特徴付けられているＩＩ－Ａ型系（化膿性連鎖球菌（S. pyogene
s）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus））も分析に含まれた
（Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997；Nishimasu et al., 2014, Cell 156: 93
5-949）。これら４つのタンパク質配列の整列は図３に示されており、図４はアクチノマ
イセス・ネスランディ（A. naeslundii）について決定されたタンパク質構成（「Ａｎａ
－Ｃａｓ９」）を示している（Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997）。Ｔ１２（
ｇｔＣａｓ９）およびアクチノマイセス・ネスランディ（Actinomyces naeslundii）由来
のＣａｓ９の長さは極めて類似しており（アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslun
dii）１１０１アミノ酸、ｇｔＣａｓ９ １０８２アミノ酸）、ｇｔＣａｓ９は類似する
タンパク質構成を有すると予想されるが、Ｃａｓ９－Ａｎａに対する全体の配列同一性が
２０％にすぎないために、これはまだ確定されていない。Jinek et al.（Jinek et al.,
2014, Science 343: 1247997）により記載されているアクチノマイセス・ネスランディ（
A. naeslundii）および化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）由来のＣａｓ９中の活性部位残基
はすべてｇｔＣａｓ９において同定することができた（図３参照）。ＰＡＭ結合ドメイン
は化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）ＩＩ－Ａ型系については決定されているが、いかなる
ＩＩ－Ｃ型系についても決定されておらず、したがって、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes
）配列においてのみ示されている。さらに、ＰＡＭ認識部位は、ＣＲＩＳＰＲ系間だけで
なく、同じ系を含有する種間でも大きく変化する。ＰＡＭに関するさらなる情報について
は、問題点４および将来計画を参照されたい。
[実施例４]
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）ｇｔＣａｓ９のＰ
ＡＭ配列の決定
原核生物ＣＲＩＳＰＲ系が適応免疫系としてその宿主に役立ち（Jinek et al., 2012,
Science 337: 816-821）、迅速で効果的な遺伝子工学のために使用することが可能である
こと（Mali et al., 2013, Nat Methods 10: 957-963）は確立されている。
Ｃａｓ９タンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のための配列特異的ヌクレアーゼとして機
能する（Makarova et al., 2011, Nat Rev Micro 9: 467-477）。小型ｃｒＲＮＡ分子は
、繰り返し領域に連結している「スペーサー」（標的）からなり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座
の転写およびプロセシング産物である。「スペーサー」は天然にはバクテリオファージの
ゲノムおよび可動遺伝要素に起源をもつが、遺伝子工学工程中に特定のヌクレオチド配列
を標的にするように設計することも可能である（Bikard et al., 2013, Nucleic Acids R
esearch 41: 7429-7437）。ｃｒＲＮＡ分子はそのＤＮＡ標的の同定のためのガイドとし
てＣａｓ９により用いられる。スペーサー領域は、切断ＤＮＡ領域の標的物、「プロトス
ペーサー」と同一である（Brouns et al., 2012, Science 337: 808-809）。ＰＡＭ（プ
ロトスペーサー隣接モチーフ）は、プロトスペーサーの隣にあり、Ｃａｓ９による標的の
認識に必要である（Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821）。
ＩＩ型系に関する、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのＰＡＭ決定検討を行う
ために、ｔｒａｃｒＲＮＡ発現モジュールであるこの系のＣＲＩＳＰＲアレイをｉｎ ｓ
ｉｌｉｃｏで予測することが必要である。ＣＲＩＳＰＲアレイを、ｃｒＲＮＡモジュール
の特定に使用する。ｔｒａｃｒＲＮＡ発現配列は、５００ｂｐ窓隣接Ｃａｓ９内、または
Ｃａｓ遺伝子とＣＲＩＳＰＲ遺伝子座との間のどちらかに位置する（Chylinski, K., et
al. (2014） Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems. Nucleic
Acids Res. 42, 6091-6105）。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイの直接繰り返し
に対する相補性のレベルが高い、５’配列からなるはずであり、２つ以上のステムループ
構造の予測構造、およびＲｈｏ独立性転写停止シグナルが後に続く（Ran, F.A., et al.
(2015) In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186-
191）。次に、キメラｓｇＲＮＡモジュールを設計するために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａ
ｃｒＲＮＡ分子を使用することができる。ｓｇＲＮＡの５’末端は、トランケートされた
２０ｎｔ長のスペーサー、その後に、ＣＲＩＳＰＲアレイの１６～２０ｎｔ長のトランケ
ートされた繰り返しからなる。この繰り返しの後に、対応するトランケートされた抗繰り
返しおよびｔｒａｃｒＲＮＡモジュールのステムループが続く。ｓｇＲＮＡの繰り返しお
よび抗繰り返し部分は、ＧＡＡＡリンカーにより一般に接続されている（Karvelis, T.,
et al. (2015) Rapid characterization of CRISPR-Cas9 protospacer adjacent motif s
equence elements. Genome Biol. 16, 253）。
Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G.thermodenitrificans）Ｔ１２型ＩＩｃ ＣＲＩＳ
ＰＲ系のｃａｓ遺伝子（ｃａｓ９、次いでｃａｓ１およびｃａｓ２の遺伝子が続く）は、
Ｔ１２染色体のアンチセンス鎖を使用して転写される。ｃａｓ２遺伝子の後に、転写時に
、多重ループを有するＲＮＡ構造を形成する、１００ｂｐ長のＤＮＡ断片が続く。この構
造は、明らかに、転写ターミネータとして働く。
１１の繰り返しおよび１０のスペーサー配列を有するＣＲＩＳＰＲアレイは、転写終止
配列の上流に位置し、このアレイのリーダーは、このアレイの５’末端に位置する。ｔｒ
ａｃｒＲＮＡに転写されるＤＮＡ遺伝子座は、ｃａｓ９遺伝子の下流であることが予想さ
れる。ＣＲＩＳＰＲアレイから３６ｂｐ長の繰り返しを含むｃａｓ９遺伝子の右側下流の
３２５ｂｐ長の配列のアライメントにより、ｔｒａｃｒＲＮＡ遺伝子座における３６ｂｐ
長の配列が、この繰り返しにほとんど同一であることが明らかになった（図６に示されて
いる）。この結果により、本発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡ遺伝子座の転写の方向は、Ｃ
ＲＩＳＰＲアレイの転写の方向とは反対となるはずであるという結論に至った。したがっ
て、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端は、ｃｒＲＮＡの３’末端に相補的であり、Ｃａｓ９二
重ＲＮＡ分子により必要とされるものの形成に至る。
[実施例５]
無作為化されたＰＡＭを有する標的生成
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２菌株のＣ
ＲＩＳＰＲ ＩＩ遺伝子座由来の２つの異なるスペーサーを、鋳型としてゲオバチルス・
サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２ゲノムＤＮＡを使用してＰ
ＣＲにより増幅させた。２対の縮重プライマーをそれぞれのスペーサーの増幅のために使
用した。
第１に、「プロトスペーサー」断片の上流に６つの無作為ヌクレオチドの導入を引き起
こす対を使用し、無作為化されたＰＡＭ配列を有するプロトスペーサーのプールを作製し
た。
第２に、「プロトスペーサー」断片の下流に６つの無作為ヌクレオチドの導入を引き起
こす対を使用し、無作為化されたＰＡＭ配列を有するプロトスペーサーのプールを作製し
た。
作製された断片はｐＮＷ３３ｎベクターにライゲートされ、６ヌクレオチド長ＰＡＭそ
れぞれの考えられる４０９６の異なる組合せすべてを有する「プロトスペーサー」構築物
の４プールを作製した。構築されたＤＮＡはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（
G. thermodenitrificans）Ｔ１２細胞の形質転換のために使用された。細胞はクロラムフ
ェニコール選択上に蒔かれ、それぞれのプロトスペーサープールから２×１０６を超える
細胞がプールされることになる。プラスミドＤＮＡはプールから抽出され、標的領域はＰ
ＣＲ増幅されることになり、その産物はディープシークエンシングのために送られた。最
も少ないリードを有するＰＡＭは活性であると見なされ、その工程はこれらのＰＡＭを有
するスペーサーを含有するｐＮＷ３３ｎ構築物のみを用いて繰り返されることになる。ゲ
オバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２の形質転換効
率が減少していることはＰＡＭの活性を立証することになる。
[実施例６]
ｇｔＣａｓ９のＰＡＭ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ決定
ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔベクターの構築
ｃａｓ９ｇｔ遺伝子は、ＢＧ６９２７およびＢＧ６９２８プライマーを使用する、Ｇ・
サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２ゲノムからＰＣＲ増幅し、
１つの混合物中のｐＲｈａｍ Ｃ－Ｈｉｓ Ｋａｎベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ）と一緒に
した。この混合物を、提示されているプロトコルに従い、Ｅ．ｃｌｏｎｉサーモコンピテ
ント細胞を変換するために使用した。変換混合物からの１００μｌを、３７℃で一晩、成
長させるため、ＬＢ＋５０カナマイシンプレート上でプレート培養した。形成したＥ．ｃ
ｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔ単一コロニー３の中から、無作為に選択し、５０
μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１０ｍｌのＬＢ培地中に播種した。各培養物からの
１ｍｌに滅菌グリセロールを最大で２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加することにより
、グリセロール保存溶液を培養物から分離した。グリセロール保存溶液を－８０℃で保管
した。各培養物からの残りの９ｍｌを、「ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐ
ｒｅｐ Ｋｉｔ」（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プロトコルに従い、プラスミド
単離に使用した。このプラスミドをｃａｓ９ｇｔの配列確認のために送り、これらのプラ
スミドの１つを、右側配列を含む遺伝子を含有していることを確認した。対応する培養物
は、ｇｔＣａｓ９の非相同性の発現および精製のためにさらに使用した。
Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔベクターにおける、ｇｔＣａｓ９の非相同
性の発現
対応するグリセロール保存溶液を含む１０ｍｌのＬＢ＋５０カナマイシンを接種した後
に、Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔ事前培養物を調製した。３７℃および
１８０ｒｐｍで一晩、成長させた後、ＬＢ＋５０カナマイシン培地の２００ｍｌを接種す
るため、事前培養物から２ｍｌを使用した。Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇ
ｔ培養物を３７℃、１８０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．７になるまで、インキュベートし
た。次に、０．２％ｗ／ｖの最終濃度まで、Ｌ－ラムノースを加えることにより、ｇｔＣ
ａｓ９発現を誘発させた。この発現を８時間、進行させ、この後に、培養物を４７００ｒ
ｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離し、細胞を収穫した。培地を廃棄し、ペレット化した細
胞を、－２０℃で保管するか、または以下のプロトコルに従い、細胞不含抽出物（ＣＦＥ
）の調製に使用した。
１．２０ｍｌ音波照射緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．５）、
１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭのＤ
ＴＴ）中に上記のペレットを再懸濁させる。
２．超音波処理（３０秒のパルスを８回、その間、氷上で２０秒間、冷却）によって１
ｍｌの細胞を破壊する。
３．不溶部分を沈殿させるために、３５０００ｇ、４℃で１５分間、遠心分離する。
４．上澄み液を除き、４℃で、または氷上でこの上澄み液を保管する。
ｇｔＣａｓ９に対するｓｇＲＮＡモジュールを標的とするＰＡＭライブラリーの設計およ
び構築
Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２株（上の実施例４を
参照されたい）のゲノムにおいて、ｔｒａｃｒＲＮＡを発現するＤＮＡモジュールのｉｎ
ｓｉｌｉｃｏ決定の後に、単一分子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のｃｒＲＮＡお
よびｔｒａｃｒＲＮＡモジュールを組み合わせる、単一ガイド（ｓｇ）ＲＮＡ発現ＤＮＡ
モジュールを設計した。プラスミドライブラリーのプロトスペーサーに相補的であるよう
に、ｓｇＲＮＡの５’末端におけるスペーサーを設計し、モジュールを、Ｔ７プロモータ
ーの転写制御下で設定した。ｐＴ７＿ｓｇＲＮＡ ＤＮＡモジュールは、Ｂａｓｅｃｌｅ
ａｒにより合成して、ｐＵＣ５７ベクターに受け、ｐＵＣ５７：ｐＴ７＿ｓｇＲＮＡベク
ターを形成させた。ＤＨ５αの有能な大腸菌（E. coli）細胞（ＮＥＢ）をベクターで形
質転換し、この変換混合物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレー
ト上でプレート培養した。このプレートを３７℃で一晩、インキュベートした。形成した
単一コロニーのうちの３つを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１０ｍｌのＬ
Ｂ培地に播種した。各培養物からの１ｍｌに滅菌グリセロールを最大で２０％（ｖ／ｖ）
の最終濃度まで添加することにより、グリセロール保存溶液を培養物から分離した。グリ
セロール保存溶液を－８０℃で保管した。各培養物からの残りの９ｍｌを、「ＧｅｎｅＪ
ＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ」（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ）プロトコルに従い、プラスミド単離に使用した。単離したプラスミドを使用して、ｐ
Ｔ７＿ｓｇＲＮＡモジュールの増幅用のＰＣＲ鋳型として使用した。２１８ｂｐ長のｐＴ
７＿ｓｇＲＮＡ ＤＮＡモジュール（その中で、第１の１８ｂｐがｐＴ７に相当する）は
、プライマーＢＧ６５７４およびＢＧ６５７５を使用して得た。完全ＰＣＲ混合物を１．
５％アガロースゲル上で泳動させた。所望のサイズを有するバンドを切り取り、「Ｚｙｍ
ｏｃｌｅａｎ（商標）ゲルＤＮＡ回収キット」プロトコルに従い精製した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）は、「ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙ
ｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（ＮＥＢ）を使用して行った。精製済
みｐＴ７＿ｓｇＲＮＡ ＤＮＡモジュールを鋳型として使用した。ＩＶＴ混合物を等しい
体積のＲＮＡローディング色素（ＮＥＢ）と混合し、二次構造を破壊するため、７０℃で
１５分間、加熱した。熱処理したＩＶＴ混合物を、変性ウレア－ＰＡＧＥ上で泳動し、得
られたポリアクリルアミドゲルを、染色目的のため、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）を１０μｌ含有する１００ｍｌの０．５×ＴＢＥ緩衝液中で１０分間、エンバ
プティズ（embaptise）した。所望のサイズ（２００ｎｔ）のバンドを切り取り、以下の
ＲＮＡ精製プロトコルに従い、ｓｇＲＮＡを精製した：
１．外科用メスを用いてＲＮＡゲル剤断片を裁断し、１ｍｌのＲＮＡ溶出緩衝液を加え
、室温で一晩、放置した。
２．３３０μＬの一定分量分を、新しい１．５ｍｌの管に分割する。
３．事前冷却（－２０℃）した１００％ＥｔＯＨを３体積分（９９０μｌ）加える。
４．－２０℃で、６０分間、インキュベートする。
５．マイクロ遠心器中、室温で、２０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離する。
６．ＥｔＯＨを除去して、７０％ＥｔＯＨ１ｍｌによりペレットを洗浄する。
７．マイクロ遠心器中、室温で、５分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離する。
８．９９０μｌの上澄み液を除去する。
９．５５℃で１５～２０分間、サーモミキサー中の残りのＥｔＯＨを蒸発させる。
１０．２０μｌのＭＱ中にペレットを再懸濁し、－２０℃で保管する。
７ｎｔ長のＰＡＭライブラリーの設計および構築、ならびにライブラリーの線形化
ＰＡＭライブラリーの設計および構築は、ｐＮＷ３３ｎベクターに基づいた。２０ｂｐ
長のプロトスペーサーを、長さ７の縮重ヌクレオチド配列により、その３’側で隣接して
いるベクターに導入した。縮重配列は、ＰＡＭとして働き、プロトスペーサーが、右ＰＡ
Ｍにより隣接すると、ｓｇＲＮＡを搭載したＣａｓ９により標的として認識されて切断さ
れ得る。ＰＡＭライブラリーは、以下のプロトコルによって調製した：
１．一本鎖ＤＮＡオリゴ１（ＢＧ６４９４）および２（ＢＧ６４９５）をアニールする
ことによりＳｐＰＡＭ二本鎖ＤＮＡインサートを調製する。
Ｉ．１０μｌの１０×ＮＥ緩衝液２．１
ＩＩ．１μｌの５０μＭオリゴ１（約１．１２５μｇ）
ＩＩＩ．１μｌの５０μＭオリゴ２（約１．１２５μｇ）
ＩＶ．８５μｌのＭＱ
Ｖ．この混合物を９４℃で５分間、インキュベートし、０．０３℃／秒の速度で３７
℃まで冷却する。
２．１μｌのＫｌｅｎｏｗ ３’→５’エキソ－ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を加え、それ
ぞれアニールしたオリゴ混合物、次に、１０μＭのｄＮＴＰ２．５μｌを加える。３７℃
で１時間、次に、７５℃で２０分間、インキュベートする。
３．アニール混合物４６μｌに２μｌのＨＦ－ＢａｍＨＩおよび２μｌのＢｓｐＨＩ制
限酵素を加える。３７℃で１時間、インキュベートする。この過程により、粘着末端を有
するＳｐＰＡＭｂｂインサートとなる。Ｚｙｍｏ ＤＮＡクリーニングおよびコンセント
レータキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、作製したインサートを清浄す
る。
４．ＨＦ－ＢａｍＨＩおよびＢｓｐＨＩ（ＮＥＢ）によりｐＮＷ３３ｎを消化し、Ｚｙ
ｍｏ ＤＮＡクリーニングおよびコンセントレータキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
）を使用して、粘着端部を有する３．４００ｂｐ長の線形ｐＮＷ３３ｎｂｂ断片を精製す
る。
５．提示されているプロトコルに準拠し、ＮＥＢ Ｔ４リガーゼを使用して、１１ｎｇ
のＳＰＰＡＭｂｂインサートにより５０ｎｇのｐＮＷ３３ｎＢＢをライゲートする。Ｚｙ
ｍｏ ＤＮＡクリーニングおよび コンセントレータキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）を使用して、ライゲート混合物を精製する。
６．ＤＨ１０ｂエレクトロコンピテント細胞（５００ｎｇのＤＮＡを含む２００μｌの
細胞）を形質転換する。ＳＯＣ培地（８００μｌのＳＯＣ中に２００μｌの細胞）中に１
時間、細胞を回収し、次に、回収した細胞を５０ｍｌのＬＢ＋１２．５μｇ／ｍｌクロラ
ムフェニコールに接種する。３７℃および１８０ｒｐｍで、培養物を一晩、インキュベー
トする。
７．ＪｅｔＳｔａｒ ２．０ｍａｘｉｐｒｅｐキット（ＧＥＮＯＭＥＤ）を使用して、
この培養物からプラスミドＤＮＡを単離する。
８．単離したプラスミドを線形化するために提示されているプロトコルに準拠し、Ｓａ
ｐＩ（ＮＥＢ）制限液を使用する。
ＰＡＭ決定反応の設計および実施
標的したプロトスペーサーの３’末端の右側ＰＡＭ下流を含有する、ＰＡＭライブラリ
ーメンバーへのｄｓＤＮＡ切断のｇｔＣａｓ９誘発性導入を行うために、以下の切断反応
を設定した：
１．反応あたり、Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔ ＣＦＥを２．５μｇ
２．ｓｇＲＮＡを３０ｎＭの最終濃度まで
３．反応あたり、線形化ＰＡＭライブラリーを２００ｎｇ
４．切断緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．５）、５００ｍＭ
のＮａＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５％（ｖ／ｖ）グリセロール、５ｍＭのＤＴＴ）
を２μｌ
５．ＭＱ水を最大２０μｌの最終体積まで
この反応物を６０℃で１時間、インキュベートし、６×ゲル搭載色素（ＮＥＢ）４μｌ
を加えた後に停止した。この反応混合物を、１％のアガロースゲルにロードした。ゲルに
１００Ｖで１時間１５分の長さの電気泳動にかけ、次に、１０μｌのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ
色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有する０．５×ＴＡＥ緩衝液１００ｍｌ中で３
０分間、インキュベートした。青色光を用いてＤＮＡバンドを可視化した後、首尾よく切
断され、かつＰＡＭを含有するＤＮＡ断片に対応するバンドをゲルから切り出し、提示さ
れているプロトコルに準拠して、「Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）ゲルＤＮＡ回収キット」
を使用してゲルを精製した。
配列決定するための、ＰＡＭ含有ｇｔＣＡｓ９切断ＤＮＡ断片のタグ付け
Ｃａｓ９誘発性ＤＮＡ切断は、ＰＡＭ配列に対して近位の、プロトスペーサーの第３と
第４のヌクレオチドとの間に、通常、導入される。その結果、さらなるオンシークエンス
（on sequence）およびＰＡＭ配列を決定するため、切断したＤＮＡ断片のＰＡＭ含有部
分をＰＣＲ増幅することができる、一対のプライマーを設計することができない。この目
的の場合、５つの工程を使用した：
工程１：ＴａｑポリメラーゼによるＡテーリング
Ａテーリングは、Ｔａｑポリメラーゼを使用する、平滑二本鎖ＤｎＡ分子の３’末端に鋳
型化されていないアデニンを付加する過程である。
反応構成成分：
・ｇｔＣａｓ９切断およびＰＡＭ含有ＤＮＡ断片 － ２００ｎｇ
・１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標）緩衝液（ＮＥＢ） － ５μｌ
・１ｍＭ ｄＡＴＰ － １０μｌ
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ） － ０．２μｌ
・Ｈ２Ｏ－最大で５０μｌの最終反応体積
・インキュベート時間 － ２０分間
・インキュベート温度 － ７２℃
工程２：配列決定アダプターの構築
２つの短い相補的ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニールして、工程１
からのＤＮＡ断片のＰＡＭ近位部に対する配列決定アダプターを形成させた。オリゴヌク
レオチドのうちの１つは、Ａテールド断片に対するアダプターのライゲートを容易にする
ため、その３’末端におけるさらなるチミンを有した。
アダプターオリゴヌクレオチドリン酸化（各オリゴの個々のリン酸化反応）
・１００μＭオリゴヌクレオチド保存溶液 － ２μＬ
・１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ） － ２μＬ
・滅菌ＭＱ水 － １５μＬ
・Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ） － １μＬ
・インキュベート時間 － ６０分間
・インキュベート温度 － ３７℃
・Ｔ４ ＰＮＫ不活性化 － ６５℃で２０分間
リン酸化オリゴヌクレオチドのアニール
・オリゴヌクレオチド１ － 対応するリン酸化混合物から５μＬ
・オリゴヌクレオチド１ － 対応するリン酸化混合物から５μＬ
・滅菌ＭＱ水 － ９０μＬ
・リン酸化オリゴを、９５℃で３分間、インキュベートする。室温で約３０分間から１時
間、反応物をゆっくりと冷却する。
工程３：配列決定アダプターによる、ｇｔＣａｓ９切断した、Ａテールド断片のライゲー
ト
工程１および２の生成物は、以下のプロトコルに従い、ライゲートした。
・１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液 － ２μｌ
・生成物工程１ － ５０ｎｇ
・生成物工程２ － ４ｎｇ
・Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ － １μｌ
・滅菌ＭＱ水 － ２０μｌまで
・インキュベート時間 － １０分間
・インキュベート温度 － ２０～２５℃
・６５℃で１０分間、熱不活性化
工程４：１５０ヌクレオチド長のＰＡＭ含有断片のＰＣＲ増幅
工程４のライゲート混合物からの５μｌを、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使
用して、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。工程２からのチミン伸長によるオリゴヌクレ
オチドを、フォワードプライマーとして使用し、ＰＡＭ配列の下流の１５０ヌクレオチド
をアニールするようリバースプライマーを設計した。
非ｇｔＣａｓ９処理ＰＡＭライブラリーＤＮＡを鋳型として使用して、同一配列を増幅
した。両方のＰＣＲ生成物をゲル精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００ペアド
末端配列決定（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ）に送った。
候補ＰＡＭ配列の配列決定結果および決定の解析
配列決定の結果を解析後、以下の頻度マトリックスを構築した。このマトリックスは、
ｇｔＣａｓ９により消化した、および消化されなかったライブラリーの各ＰＡＭ位におけ
る、各ヌクレオチドの相対存在量を図示している。
Figure 2022166045000004
これらの結果は、ＰＡＭ５位におけるシトシンを標的とすることが明確に好ましいこと
、および最初の４つのＰＡＭ位におけるシトシンを標的とすることが好ましいことを示し
ている。
[実施例７]
ｇｔＣａｓ９のＩｎ ｓｉｌｉｃｏ ＰＡＭ予測
十分なプロトスペーサー配列が、ゲノムデータベースに利用可能である場合、ＰＡＭの
Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測が可能である。ｇｔＣａｓ９ ＰＡＭのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測
は、ＧｅｎＢａｎｋなどのゲノムデータベースにおける配列と比較することにより、Ｇ・
サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２株のゲノムにおける、ＣＲ
ＩＳＰＲアレイからのスペーサーのヒットを特定することから始まった。「ＣＲＩＳＰＲ
ファインダー」（http://crispr.u-psud.fr/Server/）ツールを使用して、Ｔ１２におけ
る候補ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を特定した。次に、特定したＣＲＩＳＰＲ遺伝子座出力値を
、選択データベースを検索し、プロトスペーサーとマッチする出力値をもたらす、「ＣＲ
ＩＳＰＲ標的」（http://bioanalysis.otago.ac.nz/CRISPRTarget/crispr_analysis.html
）ツールにロードした。次に、これらのプロトスペーサー配列を、特有のヒットに関して
、およびスペーサーに対する相補性に関してスクリーニングした。例えば、シード配列の
ミスマッチは、ポジティブヒットの不良である可能性が高いと見なし、さらなる解析から
除外した。プロファージ配列および（統合）プラスミドに対する同一性を伴うヒットによ
り、得られたヒットは真のポジティブとなることが実証された。全体として、この過程に
より、６つの単一ヒットが生じた（図７）。続いて、残りの特有のプロトスペーサーヒッ
トの隣接領域（ＩＩ型ｇｔＣａｓヌクレアーゼの場合、３’）をアラインし、ＷｅｂＬｏ
ｇｏ（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）を使用して、コンセンサス配列を比較し
た（Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE WebLogo: A sequence logo generato
r, Genome Research, 14:1188-1190, (2004)）ツール（図８）。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏの結果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＡＭの同定実験結果と比較し（
実施例６を参照されたい）、この場合、ＰＡＭ配列の第５の残基をシトシンと同一である
とバイアスをかけた。
[実施例８]
ｇｔＣａｓ９の８ヌクレオチド長のＰＡＭ配列の決定
実施例８からのｉｎ ｓｉｌｉｃｏデータは、ｇｔＣａｓ９が、８位にアデノシンが存
在することがある程度好ましいことが示唆され、したがって、さらなるＰＡＭ決定実験を
行い、この場合、ＰＡＭ配列の８位も同様に試験した。これは、プロトスペーサーの３’
末端における、５位と８位との間に伸長していることが見いだされた、中温ブレビバチル
ス・ラテロスポラス（Brevibacillus laterosporus）ＳＳＰ３６０Ｄ４（Ｋａｒｖｅｌｉ
ｓら、２０１５年）であるＣａｓ９ＰＡＭ配列の特徴と一致する。
ＰＡＭの特異的な長さ８のヌクレオチド配列変異体を、ｇｔＣａｓ９で予備試験した：
１）ＣＮＣＣＣＣＡＣ［配列番号１７］、
２）ＣＣＣＣＣＣＡＧ［配列番号１８］、
３）ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］、
４）ＣＣＣＣＣＣＡＴ［配列番号１９］、
５）ＣＣＣＣＣＣＡＣ［配列番号２０］、
６）ＮＮＮＮＴＮＮＣ（ネガティブ対照ＰＡＭ）
ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］配列をＰＡＭとして使用した場合、６０℃でｉｎ
ｖｉｔｒｏで切断アッセイを行った後、精製ｇｔＣａｓ９によるこれらのターゲティング
（非線形化）プラスミド、およびｇｔＣａｓ９切断活性の向上前と同じｓｇＲＮＡ（実施
例６を参照されたい）が観察された（図９）。しかし、切断活性は、ネガティブ対象のＰ
ＡＭ配列の場合、かすかな切断バンドが観察された場合でさえも、すべての試験ＰＡＭ配
列に対して、切断活性が明確に検出可能であった。特定の理論に縛られたくはないが、ネ
ガティブ対照の場合に観察される切断に寄与する高いｇｔＣａｓ９濃度の使用が可能であ
る。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＣａｓ９濃度が高いと、厳密なＰＡＭ要件なしに
、Ｃａｓ９誘発性ＤＮＡ切断に至ることが一般に観察されている。
Ｃａｓ９濃度は、一般に、Ｃａｓ９誘発性ＤＮＡ切断の効率に影響を及ぼすことが知ら
れている（Ｃａｓ９濃度が高いほど、Ｃａｓ９活性は高い）。このことは、ＣＣＣＣＣＣ
ＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配列を含む標的プラスミドおよび異なるｇｔＣａｓ９濃度を
使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行った場合にも観察された（図１０）。
上記のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合のＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配
列を含む標的プラスミドを、３８と７８℃の間の幅広い温度範囲で行った（図１１）。驚
くべきことに、ｇｔＣａｓ９は、すべての温度において活性であり、最高の活性は、４０
．１と６４．９℃の間にあった。
したがって、ゲオバチルス（Geobacillus）属種由来のＣａｓ９の最適温度範囲は今日
まで特徴付けられているＣａｓ９タンパク質よりもはるかに高い。同様に、ゲオバチルス
（Geobacillus）属種由来のＣａｓ９がヌクレアーゼ活性を保持する範囲の最上方は既知
のＣａｓ９タンパク質よりもはるかに高い。より高い最適温度および機能的範囲は高温で
の遺伝子工学に、したがって、好熱性生物のゲノムの編集に著しい利点を与え、これは高
温で実行される様々な工業、農業および製薬工程において有用性がある。
[実施例９]
ｇｔＣａｓ９および８ヌクレオチド長のＰＡＭ配列による、バチルス・スミシイ（Bacill
us smithii）ＥＴ１３８のｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集
８ヌクレオチドＰＡＭもやはり、ｉｎ ｖｉｖｏでｇｔＣａｓ９により認識されること
を確認するため、５５℃でバチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８のゲノム
におけるｐｙｒＦ遺伝子を欠失するよう設計を行った。
この方法は、相同組換え鋳型構築物の提供に依存し、ここでは、標的（ｐｙｒＦ）遺伝
子の上流および下流に相補的である領域が、Ｂ・スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８細胞
にもたらされる。鋳型の導入により、相同組換え法を使用して、相同組換え鋳型（ｐｙｒ
Ｆ遺伝子を含まない）をゲノムに導入し、こうして、細胞のゲノムにおけるＷＴ ｐｙｒ
Ｆ遺伝子を置き換える。
相同組換え構築物にｇｔＣａｓ９およびｓｇＲＮＡを含ませることを使用して、ＷＴ
ｐｙｒＦを含有する細菌ゲノムに二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＤＢ）を導入することができる
。細菌のゲノムにおけるＤＳＤＢは、通常、細胞死をもたらす。したがって、ＷＴ ｐｙ
ｒＦの配列を認識するｓｇＲＮＡは、ＤＳＤＢ、およびＷＴ ｐｙｒＦしか含有しない細
胞の死滅をもたらす。ＤＳＤＢの導入は、好適なＰＡＭ配列が、ｇｔＣａｓ９により認識
されるプロトスペーサーの３’末端において、下流に位置していることにやはり依存する
。
ｐＮＷ３３ｎプラスミドは、主鎖としてクローニングに使用した：
ｉ）自家開発グルコース抑制プロモーターの制御下でのｃａｓ９ｇｔ遺伝子、および
ｉｉ）Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムからのｐｙｒＦ遺伝子の欠失をも
たらす相同組換えの鋳型として、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムにおけ
る、ｐｙｒＦ遺伝子の１ｋｂ上流領域および１ｋｂ下流領域、および
ｉｉｉ）構成プロモーターの転写制御下での単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）発現モジュ
ール。
単一ガイドＲＮＡの配列が、ゲノムにおけるその特異的ＤＮＡ標的にｇｔＣａｓ９をガ
イドする配列に相当する最初の２０ヌクレオチドにおいて相違点がある、３種の個別の構
築物が生成された（スペーサーとしても知られている）。Ｂ・スミシイ（B. smithii）Ｅ
Ｔ１３８のｐｙｒＦ遺伝子におけるすべての３つの異なる候補プロトスペーサーを標的と
するよう、３つの異なるスペーサー配列を設計した。これらの構築物は、本明細書におい
て、それぞれ、構築物１、２および３と呼ばれる。
３つの異なる標的プロトスペーサーは、それらの３’末端において、以下の候補ＰＡＭ
配列を有した：
１．ＴＣＣＡＴＴＣＣ （ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果によるネガティブ対照；構築
物番号３にコードされるｓｇＲＮＡによりターゲティングされたプロトスペーサーの３’
末端）
２．ＡＴＣＣＣＣＡＡ（構築物番号１［配列番号２１］にコードされるｓｇＲＮＡにより
ターゲティングされたプロトスペーサーの３’末端）
３．ＡＣＧＧＣＣＡＡ（構築物番号２；［配列番号２２］にコードされるｓｇＲＮＡによ
りターゲティングされたプロトスペーサーの３’末端）
３つの構築物の１つおよび選択プレート上のプレート培養を、Ｂ・スミシイ（B. smith
ii）ＥＴ１３８細胞に形質転換した後、以下の結果が得られた：
１．細胞が、３’末端（構築物番号３）においてネガティブ対照であるＴＣＣＡＴＴＣＣ
ＰＡＭ配列を有するプロトスペーサーを標的とする構築物により形質転換しても、形質
転換効率は影響を受けなかった（図１２Ａ）。コロニー数は、ｐＮＷ３３ｎポジティブ対
照構築物による変換後のコロニー数と同じ範囲にあった（図１２Ｂ）。ｐｙｒＦ遺伝子が
欠失されたコロニーをスクリーニングするために、コロニーＰＣＲに施した１５のコロニ
ーの中で、欠失遺伝子型－２．１ｋｂ予期バンドサイズを示すものはなく、すべて、野生
型－２．９ｋｂ予期バンドサイズであった（図１３）。このことは、試験したＰＡＭは、
確かに、ｉｎ ｖｉｖｏでｇｔＣａｓ９により認識されなかったことを示している。
２．ポジティブ対照（ｐＮＷ３３ｎで形質転換した細胞）と比較すると、細胞が構築物番
号１により形質転換されると、わずか数個のコロニーしか得られなかった（図１２Ｃ）。
２０のコロニーに、ｐｙｒＦ遺伝子を欠失したコロニーをスクリーニングするためのコロ
ニーＰＣＲを施した。コロニーの大部分（１９）は、野生型およびｐｙｒＦ欠失遺伝子型
の両方を含有した一方、１つのコロニーは、ｐｙｒＦ欠失遺伝子型を有した（図１４）。
この結果により、ＷＴのみの遺伝子型が観察されなかったので、ＰＡＭ配列ＡＴＣＣＣＣ
ＡＡ［配列番号２１］は、ｇｔＣａｓ９によってｉｎ ｖｉｖｏで認識されることが示さ
れた。低下した形質転換効率はまた、細胞集団の割合が低下したことをやはり示し、この
ことは、ｇｔＣａｓ９によるターゲティングの成功によって、ＤＳＤＢによるＷＴのみの
遺伝子型細胞に引き起こされる細胞死に寄与し得る。
３．細胞が構築物番号２により形質転換されると、コロニーが得られなかった（図１２Ｄ
）。コロニーが欠如したことは、細胞集団のすべてがｇｔＣａｓ９により首尾よくターゲ
ティングされ、これにより、ＤＳＤＢにより引き起こされる細胞死に至ったことを示す。
これは、ＡＣＧＧＣＣＡＡ［配列番号２２］ＰＡＭ配列が、ｇｔＣａｓ９によって認識さ
れることを示唆する。
これらの結果は、ｇｔＣａｓ９が、５５℃で、ｉｎ ｖｉｖｏで、上記のＰＡＭ配列に
より活性となること、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＡＭ決定結果と一致する結果と
なることを示している。さらに、それは、プラスミド媒介性相同組換え鋳型と組み合わせ
て、同一温度においてゲノム編集ツールとして使用することができる。
[実施例１０]
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の同定および精製
本発明者らは、６５℃で、最適成長温度を有する中程度のグラム陽性好熱性細菌である
、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）株Ｔ
１２を単離して配列決定した（Daas et al. Biotechnol. Biofuels 9, 210(2016)）。Ｉ
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が好熱性細菌に存在しない以前の特許請求とは対照的に（Li
et al. Nucleic Acids Res. 44, e34-e34(2016)）、配列決定結果により、Ｇ．サーモデ
ニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２のゲノムにおいて、ＩＩＣ型ＣＲＩ
ＳＰＲ－Ｃａｓ系が存在することが明らかになった（図１５Ａ）。この系（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｃａｓ９）のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９（１３６８アミノ酸）などの
他のＣａｓ９オルソログと比べて、比較的小さな（１０８２アミノ酸）であると予測され
た。サイズ差異は大部分が、他の小さなＣａｓ９オルソログに関して実証された通り、ト
ランケートされたＲＥＣローブによるものである（図１９）（Ran et al. Nature 520, 1
86-191 (2015)）。さらに、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、少なくともＧ．サーモデニトリフ
ィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２の最適温度付近で、活性であることが予期さ
れた（Daas et al. Biotechnol. Biofuels 9, 210(2016)）。本発明者らは、クエリーと
してＴｈｅｒｍｏＣａｓ９配列を使用して、ＮＣＢＩ／非冗長タンパク質配列データセッ
トにおいて、ＢＬＡＳＴ－Ｐ検索を行い、大部分がゲオバチルス属（Geobacillus）内に
、いくつかの高度に同一性のＣａｓ９オルソログ（タンパク質レベルで８７～９９％の同
一性、表１）であることを見いだし、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、好熱性細菌の高度の保存
された防御系の部分となるという考えが支持された（図１５Ｂ）。これらの特徴により、
好熱性微生物の場合、およびタンパク質の頑健性の増強が必要な条件の場合の、ゲノム編
集およびサイレンシングツールとして実施するための候補可能性となり得ることが示唆さ
れる。
本発明者らは、既に記載した手法を使用して、Ｇ．サーモデニトリフィカンス（Ｇ.the
rmodenitrificans）Ｔ１２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮ
Ａモジュールのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測を最初に行った（Mougiakos et al. Trends Biot
echnol. 34, 575-587(2016)；Ran et al. Nature 520, 186-191(2015)）。この予測に基
づいて、予測した全サイズのｃｒＲＮＡ（３０ｎｔ長のスペーサー、その後に３６ｎｔ長
の繰り返し）とｔｒａｃｒＲＮＡ（３６ｎｔ長の抗繰り返し、その後に３つの予測ヘアピ
ン構造を有する８８ｎｔ配列が続く）とを連結することにより、１９０ｎｔのｓｇＲＮＡ
キメラを設計した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、大腸菌（E. coli）に異種発現させ、均一
に精製した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９にｓｇＲＮＡを搭載すると、タンパク質が安定化する
と仮定して、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｓｇＲＮＡを搭載した精製済
みアポＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を、６０℃および６５℃で、１
５分間および３０分間、インキュベートした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析により、精製したＴ
ｈｅｒｍｏＣａｓ９は６５℃において変性するが６０℃では変性しない一方、Ｔｈｅｒｍ
ｏＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体の変性温度は、６５℃を超えることが示された（図１５Ｃ
）。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の実証された熱安定性により、熱耐性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９
ゲノム編集ツールとして、その潜在性があることが示され、本発明者らに、一層詳細に、
一部の関連分子特徴の解析を促した。
Figure 2022166045000005
[実施例１１]
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ ＰＡＭ決定
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の特徴付けに対する第１の工程は、ＤＮＡ標的の切断の成功に対
するそのＰＡＭ優先性のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測であった。本発明者らは、Ｇ．サーモデ
ニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の１０のス
ペーサーを使用し、ＣＲＩＳＰＲｔａｒｇｅｔを使用する、ウイルス中の潜在的なプロト
スペーサーおよびプラスミド配列を探索した（Biswas et al. RNA Biol. 10, 817-827(20
13)）。ファージゲノムにより、わずか２つのヒットしか得られなかったので（図２０Ａ
）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＡＭ決定手法を用いて進めることに決めた。本発明者らは、
マッチングプロトスペーサーにより、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくターゲティング線形
ｄｓＤＮＡ基質に対するスペーサーを含有する、予測ｓｇＲＮＡ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏ
で転写した。プロトスペーサーは、無作為化した７塩基対（ｂｐ）配列により、３’末端
において隣接した。５５℃でＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づく切断アッセイを行った後、Ｔ
ｈｅｒｍｏＣａｓ９ ＰＡＭ優先性を特定するため、ライブラリーの切断されたメンバー
にディープ配列決定を行い（対照として非標的ライブラリー試料も一緒）、比較した（図
１６Ａ）。配列決定結果により、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、中温性Ｃａｓ９変異体と同様
に、３位と４位のＰＡＭ近位ヌクレオチドとの間に大部分位置する、二本鎖ＤＮＡ切断を
導入することが明らかとなった。さらに、切断された配列は、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、
５’－ＮＮＮＮＣＮＲ－３’ＰＡＭを認識し、ＰＡＭ１、３、４および６位において、わ
ずかにシトシン優先性がある（図１６Ｂ）。最近の検討により、ある種のＩＩＣ型Ｃａｓ
９オルソログの標的認識に対するＰＡＭ８位の重要性が明らかとなった（Karvelis et al
. Genome Biol. 16, 253(2015)；Kim et al. Genome Res. 24, 1012-9(2014)）。この目
的のために、およびｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ＰＡＭ予測からの結果
を考慮すると、本発明者らは、追加的なＰＡＭ決定アッセイを行った。これにより、ＰＡ
Ｍ８位におけるアデニンの存在下で、最適標的効率となることが明らかになった（図１６
Ｃ）。興味深いことに、ヒット数が限定されるにも関わらず、上述のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ
ＰＡＭ予測（図２０Ｂ）はまた、ＰＡＭ５位におけるシトシンおよびＰＡＭ８位におけ
るアデニンの重要性がやはり示唆された。
ＰＡＭ６位およびＰＡＭ７位におけるＰＡＭの不明確さをさらに明確にするため、本発
明者らは、マッチングプロトスペーサーが、５’－ＣＣＣＣＣＮＮＡ－３’［配列番号１
３］ＰＡＭにより隣接された、一式の１６の異なる標的ＤＮＡ断片を生成した。これらの
断片の切断アッセイ（各々は、第６および第７のヌクレオチドの特有の組合せを有する）
を行い、この場合、様々な構成成分（ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９、ｓｇＲＮＡガイドＲＮＡ、
ｄｓＤＮＡ標的）を、異なる温度（２０℃、３０℃、３７℃、４５℃、５５℃および６０
℃）で１０分間、個別に予め加熱した後、それらを一緒にして、対応するアッセイ温度で
１時間、インキュベートした。アッセイを３７℃と６０℃との間の温度で行った場合、異
なるＤＮＡ基質はすべて切断された（図１６Ｄ、図２１）。しかし、最も消化された標的
断片は、ＰＡＭ配列（ＰＡＭ５から８位）５’－ＣＮＡＡ－３’および５’－ＣＭＣＡ－
３’からなる一方、最も消化されなかった標的は、５’－ＣＡＫＡ－３’ＰＡＭを含有し
た。３０℃では、最適なＰＡＭ配列（ＰＡＭ５から８位）５’－ＣＮＡＡ－３’および５
’－ＣＭＣＡ－３’を有するＤＮＡ基質の切断しか、観察されなかった（図２Ｄ）。最後
に、２０℃では、（ＰＡＭ５から８位）５’－ＣＶＡＡ－３’および５’－ＣＣＣＡ Ｐ
ＡＭ配列を有するＤＮＡ基質しか標的とならず（図２１）、これらの配列が最も好ましい
ＰＡＭになった。これらの知見により、その温度下限値では、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、
好ましいＰＡＭを有する断片しか切断しないことが実証される。この特徴は、例えば、標
的外作用を回避するため、ｉｎ ｖｉｖｏでの編集過程の間に利用することができる。
[実施例１２]
熱安定性およびトランケート
予測したｔｒａｃｒＲＮＡは、抗繰り返し領域と、その後の３つのヘアピン構造からな
る（図１７Ａ）。ｃｒＲＮＡと共にｔｒａｃｒＲＮＡを使用して、ｓｇＲＮＡキメラを形
成させると、ＤＮＡ基質ＲＮＡの案内された切断が成功した。二重ガイド天然状態に良好
に類似する可能性が最も高い、完全長繰り返し－抗繰り返しヘアピンのスペーサー遠位末
端の４１－ｎｔ長の欠失（図１７Ａ）は、ＤＮＡ切断効率にほとんどまたは全く影響を及
ぼさなかったことが観察された。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の切断効率に及ぼす予測ヘアピン
（図１７Ａ）のさらなるトランケートの影響を、一連の時間で切断を行うことにより評価
し、この場合、すべての構成成分（ｓｇＲＮＡ、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９、基質ＤＮＡ）を
、様々な温度（３７～６５℃）で１分間、２分間および５分間、個別に事前加熱した後、
それらを一緒にして、様々なアッセイ温度（３７～６５℃）において１時間、インキュベ
ートした。ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の予測したステム－ループの数は、ＤＮＡ切断において
重要な役割を果たすように思われる。３つのループがすべて存在する場合、切断効率は、
すべての試験温度で最高であった一方、その効率は、３’ヘアピンの除去時に、低下した
（図１７Ｂ）。さらに、切断効率は、ミドルヘアピンと３’ヘアピンの両方を除去すると
、劇的に低下した（図２２）。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を６５℃で１分間または２分間、事
前加熱すると検出可能な切断がもたらされた一方、切断活性は、５分間のインキュベート
後、消失した。熱安定性アッセイにより、３’ステムループのないｓｇＲＮＡ変異体は、
６５℃において、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９タンパク質の安定性が低下し、完全長ｔｒａｃｒ
ＲＮＡは、高温において、最適なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくＤＮＡ切断にとって必要
であることを示している。さらに、本発明者らはまた、スペーサー配列の長さ（２５～１
８ｎｔ）を変えて、２３、２１、２０および１９のスペーサー長さは、最も高い効率で標
的を切断することを見いだした。切断効率は、１８ｎｔのスペーサーを使用した場合、著
しく低下する。
ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体は、恐らくは
、数分以内に形成される。上記の知見と一緒にすると、このことにより、本発明者らは、
ＲＮＰの活性および熱安定性を評価することが促された。事前に構築されたＲＮＰ複合体
を６０℃、６５℃および７０℃で５分間および１０分間、加熱した後、予め加熱したＤＮ
Ａを加え、次いで、６０℃、６５℃および７０℃で１時間、インキュベートした。顕著な
ことに、本発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ ＲＮＰは、７０℃で５分間、事前加熱し
たにもかかわらず、７０℃まで活性であることを観察した（図１７Ｃ）。この知見により
、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９安定性は、適切なｓｇＲＮＡガイドの会合と強く関連していると
いう本発明者らの仮説が確認された（Ma et al., Mol. Cell 60, 398-407(2015)）。
一部の用途では、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、幅広い温度活性範囲を有することが有利で
ある、すなわち、低温と高温の両方で機能的であると思われる。同様に、一部の状況では
、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性が、より狭い温度範囲に制限され得る場合、例えば、低温
または高温でしか活性でない場合に、有利になると思われる。したがって、Ｔｈｅｒｍｏ
Ｃａｓ９が、標的化切断もしくは結合を可能にする温度の範囲、または標的化切断または
結合が、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９または関連エレメント（ｓｇＲＮＡなど）の構造的特徴を
改変することによって効率的に行われる温度の範囲を操作する能力により、核酸配列の操
作全体にわたり、より高いレベルの制御を行い得ると思われる。したがって、本発明者ら
は、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の温度範囲と、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃ
ａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の温度範囲との比較に着手した。Ｃａｓ９ホモログのどちらにも
、２０と６５℃の間のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイを施した。どちらもタンパク質も、
ｓｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡ分子を添加する前に、対応するアッセイ温度で５分間、イン
キュベートした。以前の解析２６に一致して、中温性ＳｐＣａｓ９は、２５と４４℃の間
でしか活性でなかった（図１７Ｄ）。これらの温度より高い場合、ＳｐＣａｓ９は活性は
、非検出レベルまで急速に低下した。対照的に、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９切断活性は、２５
と６５℃の間で検知された（図１７Ｄ）。このことは、好熱性生物と中温生物の両方に対
するゲノム編集ツールとして、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を使用する可能性を示している。
以前に特徴付けられた中温性Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、二価陽イオンを使用して
、標的ＤＮＡにおけるＤＳＢの生成を触媒する（Jinek et al. Science 337, 816-821(20
12)；Chen et al. J. Biol. Chem. 289, 13284-13294(2014)）。陽イオンが、Ｔｈｅｒｍ
ｏＣａｓ９によってＤＮＡ切断に寄与することを評価するため、プラスミド切断アッセイ
は、以下の二価陽イオン：Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびＣ
ｕ２＋のうちの１つの存在下で行った。陽イオンキレート剤であるＥＤＴＡを用いるアッ
セイをネガティブ対照として含めた。予期される通り、標的ｄｓＤＮＡは、二価陽イオン
の存在下で切断され、ＥＤＴＡの存在下では不活性のままであった（図２３Ａ）。あるＩ
ＩＣ型系は、効率的な一本鎖ＤＮＡカッターであるという報告（Ma et al. Mol. Cell 60
, 398-407(2015)；Zhang et al. Mol. Cell 60, 242-255(2015)）に基づいて、本発明者
らは、ｓｓＤＮＡ基質に及ぼすＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性を試験した。しかし、切断は
観察されず、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、ｄｓＤＮＡヌクレアーゼであることが示される（
図２３Ｂ）。
[実施例１３]
好熱性Ｂ．スミシイ（B. smithii）における、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づく遺伝子欠失
本発明者らは、好熱性細菌に対するＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくゲノム編集ツールの
開発に着手した。ここで、本発明者らは、５５℃で培養した、バチルス・スミシイ（Baci
llus smithii）ＥＴ１３８を使用して、原理の証明を示す。最小限の遺伝部分を使用する
ため、本発明者らは、単一プラスミド手法に従った。本発明者らは、バチルス・コアグラ
ンス（Bacillus coagulans）に由来する構成的ｐｔａプロモーター（Ｐｐｔａ）の制御下
で、目的の遺伝子内のＣａｓ９誘発性二本鎖ＤＮＡ切断、およびｓｇＲＮＡ発現モジュー
ルを修復するための、相同組換え鋳型である、天然のｘｙｌＬプロモーター（ＰｘｙｌＬ
）の制御下で、ｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子を含有するｐＮＷ３３ｎをベースとする、一
連のｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９プラスミドを構築した。
第１の目的は、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムに由来する完全長ｐｙ
ｒＦ遺伝子の欠失であった。ｐｙｒＦ遺伝子の様々な部位を標的とするスペーサーを有す
る、様々なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ガイドの発現について、ｐＮＷ３３ｎに由来するプラス
ミドｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓΔｐｙｒＦ１およびｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓΔ
ｐｙｒＦ２を使用した一方、第３のプラスミド（ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌ）は
、ｓｇＲＮＡ発現モジュールにおいて、ランダム非標的スペーサーを含有した。対照プラ
スミドｐＮＷ３３ｎ（ガイドなし）およびｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ ｃｔｒｌによる、
５５℃でのＢ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８コンピテント細胞の形質転換により、
それぞれ、約２００のコロニーが形成した。スクリーニングした１０のｐＴｈｅｒｍｏＣ
ａｓ９＿ ｃｔｒｌコロニーの中から、ΔｐｙｒＦ遺伝子型を含有するものはなく、Ｂ．
スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８における相同組換えは、クリーンな変異体を得るには
不十分であるという以前の検討からの知見が確認された（Mougiakos et al. ACS Synth.
Biol. 6, 849-861(2017)；Bosma et al. Microb. Cell Fact. 14, 99(2015)）。対照的に
、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓΔｐｙｒＦ１およびｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓΔｐ
ｙｒＦ２プラスミドによる形質転換は、それぞれ、２０および０のコロニーとなり、５５
℃におけるＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のｉｎ ｖｉｖｏ活性を確認し、タンパク質の上記の幅
広いｉｎ ｖｉｔｒｏでの温度範囲が立証付けられた。１０のスクリーニングされたｐＴ
ｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ΔｐｙｒＦ１コロニーのなかで、１つが、クリーンなΔｐｙｒＦ変
異体となった一方、残りは、混合型の野生型／ΔｐｙｒＦ遺伝子型（図４Ｂ）を有し、標
的されたｐｙｒＦ遺伝子の設計された相同性特異的な修復が成功したので、この系の適応
性が証明された。それにもかかわらず、厳密に制御されたＳｐＣａｓ９に基づく対向選択
系では、本発明者らは、ｐｙｒＦ欠失効率が一層高くなることを以前に開発した（Olson
et al., Curr. Opin. Biotechnol. 33, 130-141(2015)）。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づ
くツールでは、得られた形質転換体およびクリーンな変異体の数が少ないことは、非常に
活性なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の構成的発現を組み合わされた、Ｂ．スミシイ（B. smithii
）では、低い相同組換え効率となることにより説明することができる（Olson et al., Cu
rr. Opin. Biotechnol. 33, 130-141(2015)）。厳密に制御可能なプロモーターの使用は
、効率が向上することが予測される。
[実施例１４]
中温性生物シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）におけるＴｈｅｒｍｏＣａｓ
９に基づく遺伝子欠失
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくゲノム編集ツールの適用性を広げるため、およびｉｎ
ｖｉｔｒｏの結果が、ｉｎ ｖｉｖｏで確認することができるかどうかを評価するため、
中温性グラム陰性菌であるＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０におけるその活性を、
相同組換えとＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づく対向選択とを組み合わせることにより評価し
た。この生物の場合、Ｃａｓ９をベースとするツールは、これまで、報告されてこなかっ
た。本発明者らは、もう一度、単一プラスミド手法に従った。本発明者らは、ｐｙｒＦ遺
伝子の欠失のための相同組換え鋳型である、３ーメチルベンゾエート誘発性Ｐｍ－プロモ
ーターの制御下でのｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子、および構成的Ｐ３プロモーターの制御
下でのｓｇＲＮＡ発現モジュールを含有するｐＥＭＧをベースとするｐＴｈｅｒｍｏＣａ
ｓ９＿ｐｐΔｐｙｒＦプラスミドを構築した。Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０細
胞の形質転換、およびプラスミド統合のＰＣＲ確認後、コロニーを３７℃で一晩の培養の
ために、選択的な液体培地中に接種した。一晩、培養物を選択的培地の接種に使用し、Ｔ
ｈｅｒｍｏＣａｓ９発現を３ーメチルベンゾエートにより誘発させた。続いて、希釈物を
３－メチルベンゾエートを補給した、非選択的培地上にプレート培養した。比較のため、
３－メチルベンゾエートによる誘発性ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９発現のない並行実験を行った
。その過程は、誘発性培養物の場合、７６のコロニーとなり、非誘発性対照培養物の場合
、５２のコロニーとなった。誘発性培養物の場合、３８のコロニー（５０％）は、クリー
ンな欠失遺伝子型を有し、６つのコロニーが混合型野生型／欠失遺伝子型を有した。それ
どころか、非誘発性培養物のわずか１つのコロニー（２％）しか、欠失遺伝子型を有して
おらず、混合型野生型／欠失遺伝子型を有するコロニーは回収されなかった（図２４）。
これらの結果は、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を使用して、３７℃で成長すると、中温性Ｐ．プ
チダ（P. putida）ＫＴ２４４０における効率的な対向選択ツールとして使用することが
できることを示している。
[実施例１５]
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づいた遺伝子サイレンシング
効率的な熱活性転写サイレンシングＣＲＩＳＰＲｉツールは、現在、利用可能ではない
。このような系は、いくつかの用途に有用となり得る。例えば、このような系は、好熱菌
の代謝検討をかなり容易にすると思われる。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の触媒的に死滅した変
異体は、ｄｓＤＮＡ切断を導入することなく、ＤＮＡエレメントに容易に結合することに
より、この目的を果たすことができる。この目的のため、本発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣ
ａｓ９のＲｕｖＣおよびＨＮＨ触媒ドメインを特定し、死滅（ｄ）ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９
を作製するための対応するＤ８ＡおよびＨ５８２Ａ変異を導入した。設計した配列の確認
後、Ｔｈｅｒｍｏ－ｄＣａｓ９は、異種生成して、精製し、上述のＴｈｅｒｍｏＣａｓ９
アッセイにおいて使用されものと同一のＤＮＡ標的によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断アッ
セイに使用した。切断は観察されず、ヌクレアーゼの触媒的不活性が確認された。
Ｔｈｅｒｍｏ－ｄＣａｓ９に基づくＣＲＩＳＰＲｉツールの開発に対して、本発明者ら
は、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムから、高度に発現したｌｄｈＬ遺伝
子の転写サイレンシングを目的とした。本発明者らは、ｐＮＷ３３ｎベースとするベクタ
ーｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬおよびｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｃｔｒｌを構
築した。どちらのベクターも、ＰｘｙｌＬプロモーターの制御下でのｔｈｅｒｍｏ－ｄＣ
ａｓ９遺伝子、および構成的Ｐｐｔａプロモーターの制御下でのｓｇＲＮＡ発現モジュー
ルを含有した（図４Ｃ）。ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬプラスミドは、Ｂ．スミ
シイ（B. smithii）ＥＴ１３８において、１３８ｌｄｈＬ遺伝子の５’末端における非鋳
型ＤＮＡ鎖を標的とするスペーサーを含有した（図Ｓ７）。位置および標的鎖選択は、こ
れまでの検討に基づき（Bikard et al. Nucleic Acids Res. 41. 7429-7437(2013)；Lars
on et al. Nat. Protoc. 8, 2180-2196(2013)）、ｌｄｈＬ遺伝子の有効な下方調節を目
的とした。ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｃｔｒｌプラスミドは、ｓｇＲＮＡ発現モジュー
ルにおける、無作為非標的スペーサーを含有した。構築物を使用して、５５℃でＢ．スミ
シイ（B. smithii）ＥＴ１３８コンピテント細胞を形質転換し、次いでＬＢ２寒天プレー
ト上に播種して、当量のコロニーが得られた。構築物あたり約７００のコロニーのうちの
２つを、既に示した通り、非好気性ラクテート生成条件下で、２４時間、培養するために
選択した。（Bosma et al. Appl. Environ. Microbiol. 81, 1874-1883(2015)）。ｐＴｈ
ｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬ培養物の成長は、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｃｔｒｌ培
養物の成長より５０％少なかった（図４Ｅ）。本発明者らは、ｌｄｈＬ遺伝子の欠失は、
微好気性条件下で、ＬｄｈをベースとするＮＡＤ＋再生成能力の欠如により、Ｂ．スミシ
イ（B. smithii）ＥＴ１３８において、深刻な成長遅延に至ることを以前に示している（
Bosma et al. Microb. Cell Fact. 14, 99 (2015)）。したがって、成長の観察された低
下は、ｌｄｈＬ遺伝子の転写阻害、およびＮＡＤ＋再生成能力の欠失による、その後の酸
化還元不均衡により引き起こされる可能性が高い。実際に、ＨＰＬＣ分析により、ｌｄｈ
Ｌサイレンシングした培養物のラクテート生成が４０％低下することが明らかになり、Ｒ
Ｔ－ｑＰＣＲ解析により、ｌｄｈＬ遺伝子の転写レベルは、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿
ｃｔｒｌ培養物と比べて、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬ培養物中で顕著に低下す
ることが示された（図４Ｅ）。
［実施例１６］
まとめ
大部分のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの用途は、Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ａなどのクラス２
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質によるＲＮＡにより案内されるＤＮＡ干渉に基づく（Ko
mor et al., Cell 168, 20-36(2017)；Puchta, Curr. Opin. Plant Biol. 36, 1-8(2017)
；Xu et al. J. Genet. Genomics 42, 141-149(2015)；Tang et al. Nat. Plants 3, 170
18(2017)；Zetsche et al. Nat. Biotechnol. 35, 31-34(2016)；Mougiakos et al., Tre
nds Biotechnol. 34, 575-587(2016)）。本検討の前に、その数種が好熱菌のゲノム編集
に使用されてきた、好熱性細菌および古細菌に存在する非常に多量のクラス１ ＣＲＩＳ
ＰＲ－Ｃａｓ系（Li et al. Nucleic Acids Res. 44, e34-e34(2016)）とは対照的に、ク
ラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ免疫系は、特定されておらず、好熱性微生物に特徴付けら
れていない（Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 13, 722-736(2015)；Weinberger
et al., MBio 3, e00456-12(2012)）。その結果、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ技術の応用は、
使用したＣａｓ－エンドヌクレアーゼの中温性性質のため、４２℃未満の温度に主に限定
された。したがって、これは、偏性好熱菌における、および高温を必要とし、かつ／また
はタンパク質安定性の改善された実験手法におけるこれらの技法の用途を除外する。
発明者らは、本発明者らが、以前にコンポストから単離した株である、好熱性細菌Ｇ・
サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２に由来する、Ｔｈｅｒｍｏ
Ｃａｓ９、Ｃａｓ９オルソログを特徴付けている（Daas et al. , Biotechnol. Biofuels
9, 210(2016)）。データマイニングにより、他の好熱菌のゲノムにおいて、Ｔｈｅｒｍ
ｏＣａｓ９とほぼ同一のさらなるＣａｓ９オルソログが存在することが明らかになり、バ
チルス属（Bacillus）およびゲオバチルス属（Geobacillus）の少なくとも一部の群では
、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＩＩ型系が好熱菌に存在することを最初に示した。本発明者らは
、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、２０～７０℃の幅広い温度範囲において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で、活性であり、この温度範囲は、その中温性オルソログＳｐＣａｓ９の２５～４４℃の
範囲よりもかなり幅広いことを示した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性および安定性の延長
により、２０～７０℃の温度においてＤＮＡ操作を必要とする、分子生物学技法における
その応用、および強固な酵素活性を必要とする過酷な環境でのその実施が可能となる。さ
らに、本発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の熱安定性を付与するのに重要な、いくつか
の因子を特定した。第１に、本発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のＰＡＭ優先性は、温
度範囲の低い方（≦３０℃）の部分で活性に対して非常に厳密である一方、ＰＡＭの多数
の種類が、中温から最適温度（３７～６０℃）において、活性となり得ることを実証した
。第２に、発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９活性および熱安定性は、適切なｓｇＲＮＡ
案内との会合に強く依存することを実証した。特定の理論に縛られたくはないが、本発明
者らは、多重ドメインＣａｓ９タンパク質のこのような安定化は、案内結合時に、ＳｐＣ
ａｓ９に関して記載されている通り、開放／従順状態からむしろ小さくまとまった状態へ
の主要な立体構造変化の結果である可能性が最も高い（Jinek et al. Science 343, 124
7997-1247997(2014)）。
新規なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のここで記載されている特徴付けに基づいて、発明者らは
、厳密な好熱性原核生物に対するゲノム工学ツールの開発に成功した。本発明者らは、５
５℃および３７℃において、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が活発であること
を示し、本発明者らは、好熱性Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８および中温性Ｐ．
プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０に関する現在のＣａｓ９に基づく工学技術を適用した
。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の幅広い温度範囲により、単純で有効かつ単一のプラスミドに基
づくＴｈｅｒｍｏＣａｓ９手法は、３７℃から７０℃までの温度で成長することができる
、好熱性および中温性微生物の幅広い範囲に好適となることが予期される。これは、既存
の中温技法を補完し、これらの効率的なツールは、これまで利用不能であった、大きな生
物群のための使用することが可能になる。
所望の形質を有する新規酵素に関する天然源のスクリーニングは、疑問の余地なく、価
値がある。これまでの検討により、指向性進化およびタンパク質工学を用いて、一層高い
温度まで中温性Ｃａｓ９オルソログを適用することは、好熱性Ｃａｓ９タンパク質の構築
２９に対して最良手法になると思われることが示唆される。代わりに、本発明者らは、あ
る好熱性細菌において、Ｃａｓ９の分岐群を特定し、好熱性生物と中温生物の両方に対す
る強力なゲノム工学ツールにこれらの熱安定性ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９変異体の１つを形質
転換した。この検討により、本発明者らは、Ｃａｓ９に基づくゲノム編集技術の可能性を
さらに拡大し、厳しい条件または幅広い温度範囲にわたり活性を必要とする条件下で新規
な用途におけるＣａｓ９技術を使用する新しい可能性を広げる。
[実施例１７]物質および方法：
ａ． 細菌株および成長条件
中等度の好熱菌Ｂ．スミシイ（B. Smithii）ＥＴ１３８ΔｓｉｇＦ ΔｈｓｄＲ（Moug
iakos, et al.,(2017) ACS Synth. Biol. 6, 849-861）を、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を使用
して遺伝子編集およびサイレンシング実験に使用した。これを、ＬＢ２培地中にて、５５
℃で成長させた（Bosma, et al. Microb. Cell Fact. 14, 99(2015)）。プレート培養の
場合、培地１リットルあたり３０ｇの寒天（Ｄｉｆｃｏ）をすべての実験に使用した。必
要な場合、クロラムフェニコールを７μｇ／ｍＬの濃度で加えた。タンパク質発現の場合
、大腸菌（E.coli）Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を、温度を１６℃に変更した後、０．５の
ＯＤ６００ｎｍに到達するまで、１２０ｒｐｍで震とう式インキュベータ中、３７℃のフ
ラスコ中、ＬＢ培地中で成長させた。３０分後、０．５ｍＭの最終濃度になるまで、イソ
プロピル－１－チオ－β－ｄ－ガル－アクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによ
り発現を誘発させて、この後、インキュベートを１６℃で継続した。ＰＡＭ６位および７
位および８位の構築物のクローニングに関すると、製造業者により提供されているマニュ
アルに従い、ＤＨ５－アルファコンピテント大腸菌（E. coli）（ＮＥＢ）を形質転換し
、ＬＢ寒天プレート上にて、３７℃で一晩、成長させた。縮重７－ｎｔ長のＰＡＭライブ
ラリーをクローニングするため、標準的手順に従い（Sambrook, Fritsch & Maniatis, T.
Molecular cloning: a laboratory manual.（Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）
、エレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ大腸菌（E. coli）細胞を形質転換し、３７℃で一
晩、ＬＢ寒天プレート上で成長させた。大腸菌（E. coli）ＤＨ５α λｐｉｒ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ａｕｓｕｂｅｌらにより記載されている形質転換手順を使用して、
Ｐ．プチダ（P. putida）プラスミド構築に使用した（Current Protocols in Molecular
Biology (John Wiley & Sons, Inc., 2001). doi:10.1002/0471142727）。すべての大腸
菌（E. coli）株に関すると、必要な場合、クロラムフェニコールを２５ｍｇ／Ｌの濃度
で、およびカナマイシンを５０ｍｇ／Ｌで使用した。特に明記しない場合、シュードモナ
ス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０（ＤＳＭ６１２５）株を、ＬＢ培地中、
３７℃で培養した。必要な場合、カナマイシンを５０ｍｇ／Ｌの濃度で、および３ーメチ
ルベンゾエートを３ｍＭの濃度で加えた。
ｂ． ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９発現および精製
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９をＧ．サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ
１２のゲノムからＰＣＲ増幅し、次に、クローニングし、大腸菌（E. coli）Ｒｏｓｅｔ
ｔａ（ＤＥ３）において異種発現させて、Ｎｉ２＋－親和性陰イオン交換とゲルろ過クロ
マトグラフィー工程とを組み合わせることによりＦＰＬＣを使用して精製した。遺伝子配
列を、オリゴヌクレオチド（表２）を使用して、ライゲート非依存性クローニングにより
、プラスミドｐＭＬ－１Ｂ（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ＭａｃｒｏＬａｂ、Ａｄｄｇｅｎ
ｅ ＃２９６５３から入手）に挿入し、ヘキサヒスチジン配列およびタバコエッチウイル
ス（ＴＥＶ）のプロテアーゼ切断部位を含むＮ末端タグと融合した、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ
９ポリペプチド配列（残基１～１０８２）をコードするタンパク質発現構築物を生成した
。触媒的に不活性なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９タンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ－ｄＣａｓ９）を発
現するため、ＰＣＲを使用してＤ８ＡおよびＨ５８２Ａポイント変異を挿入し、ＤＮＡ配
列決定により確認した。
Figure 2022166045000006
Figure 2022166045000007
Figure 2022166045000008
Figure 2022166045000009
Figure 2022166045000010
Figure 2022166045000011
Figure 2022166045000012
Figure 2022166045000013
Figure 2022166045000014
Figure 2022166045000015
タンパク質は、大腸菌（E. coli）Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株で発現した。培養物
を、０．５～０．６のＯＤ６００ｎｍまで成長させた。発現は、０．５ｍＭの最終濃度ま
でＩＰＴＧを添加することにより誘発させて、インキュベートを１６℃で一晩、継続した
。細胞を遠心分離により収穫し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ ｃＯｍｐｌｅｔｅ、
ＥＤＴＡ不含）およびリゾチームを補給した溶解緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、
ｐＨ８、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのイミダゾール）２０ｍＬに
、細胞ペレットを再懸濁した。一旦、超音波ＭＳ７２マイクロチッププローブ（Ｂａｎｄ
ｅｌｉｎ）を使用して、３０％振幅で２秒のパルスおよび２．５秒の休止からなる、５～
８分間の音波照射（Ｓｏｎｏｐｌｕｓ、Ｂａｎｄｅｌｉｎ）によりホモジナイズした細胞
を溶解し、次に、１６，０００×ｇで、４℃で１時間、遠心分離にかけ、不溶性物質を除
去した。透明になった溶解物を０．２２ミクロンのフィルター（Ｍｄｉ ｍｅｍｂｒａｎ
ｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりろ過して、ニッケルカラム（Ｈｉｓｔｒａｐ Ｈ
Ｐ、ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、次に、２５０ｍＭのイミダゾールによ
り溶出した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を含むフラクションをプールし、透析用緩衝液に一晩
、透析した（２５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨおよび１ｍＭのＤＴＴ
、ｐＨ７．５）。透析後、試料は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ８）に１：１で
希釈し、ＩＥＸ－Ａ緩衝液（１５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ
８）中で予め平衡したヘパリンＦＦカラムにロードした。カラムをＩＥＸ－Ａにより洗浄
し、次に、ＩＥＸ－Ｃ（２ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ８）のグラ
ジエントにより溶出した。ゲルろ過カラム（ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄ
ｅｘ ２００）にロードする前に、ＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ）により、試料を７０
０μＬまで濃縮した。ゲルろ過からのフラクションを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した
。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を含有するフラクションをプールし、２００μＬ（５０ｍＭのリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ８、２ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール、５００ｍＭのＮａＣｌ）
まで濃縮し、生化学的アッセイのために直接、使用するか、または保管のため、－８０℃
で凍結するかのどちらかとした。
ｃ． ｓｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成
ｓｇＲＮＡモジュールを、５’－ＧＡＡＡ－３’リンカーを含む予測ｃｒＲＮＡおよび
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を融合することにより設計した。ｓｇＲＮＡを発現するＤＮＡ配列
は、Ｔ７プロモーターの転写制御下に置いた。これを合成し（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ、Ｌｅ
ｉｄｅｎ、オランダ）、ｐＵＣ５７骨格に提供した。生化学反応に使用したｓｇＲＮＡを
すべて、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ合成キット（Ｎ
ＥＢ）を使用して合成した。５’末端にＴ７配列を有する、ｓｇＲＮＡをコードするＰＣ
Ｒ断片をｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写反応のための鋳型として、利用した。Ｔ７転写を４時
間、行った。ｓｇＲＮＡを電気泳動させて、ウレアＰＡＧＥゲルから切り離し、エタノー
ルによる沈殿を使用して精製した。
ｄ． ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを精製した組換えＴｈｅｒｍｏＣａｓ９で行った。Ｔｈ
ｅｒｍｏＣａｓ９タンパク質、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したｓｇＲＮＡおよびＤＮＡ基質
（表２に記載されているプライマーを使用したＰＣＲ増幅を使用して生成した）を、（他
に示さない限り）明記した温度で１０分間、個別にインキュベートし、次いで、構成要素
を一緒にして、切断用緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７）、５０
０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５（Ｖ／Ｖ％）グリセロール、５ｍＭのジ
チオトレイトール（ＤＴＴ））中、様々なアッセイ温度で１時間、インキュベートした。
各切断反応物は、１６０ｎＭのＴｈｅｒｍｏＣａｓ９タンパク質、４ｎＭの基質ＤＮＡお
よび１５０ｎＭの合成したｓｇＲＮＡを含んだ。反応物は、６ｘのロード用色素（ＮＥＢ
）を加えることにより停止し、１．５％アガロースゲル上で電気泳動した。ゲルをＳＹＢ
Ｒ ｓａｆｅ ＤＮＡ染色剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により染色し、ゲ
ルＤｏｃＴＭ ＥＺゲル画像化システム（Ｂｉｏ－ｒａｄ）で画像化した。
ｅ． ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＡＭスクリーニング用ライブラリー構築
ＰＡＭライブラリーの構築の場合、その３’末端にプロトスペーサーおよび７－ｂｐ長
の縮重配列を含有する１２２－ｂｐ長のＤＮＡ断片を、プライマーをアニールおよびＫｌ
ｅｎｏｗ断片（エキソ－）（ＮＥＢ）をベースとする伸長により構築した。ＰＡＭ－ライ
ブラリー断片およびｐＮＷ３３ｎベクターをＢｓｐＨＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）によ
り消化し、次に、ライゲートした（Ｔ４リガーゼ、ＮＥＢ）。ライゲート混合物をエレク
トロコンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換し、プラスミドを液体培
養物から単離した。７ｎｔ長のＰＡＭ決定法に関しては、プラスミドライブラリーをＳａ
ｐＩ（ＮＥＢ）により線形化し、標的として使用した。アッセイの残りに関すると、ＤＮ
Ａ基質をＰＣＲ増幅により線形化した。
ｆ． ＰＡＭスクリーニングアッセイ
ｔｈｅｒｍｏＣａｓ９のＰＡＭスクリーニングを、（反応当たり）１６０ｎＭのＴｈｅ
ｒｍｏＣａｓ９、１５０ｎＭのｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したｓｇＲＮＡ、４ｎＭのＤＮＡ
標的、４μｌの切断用緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５０
０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、２５％グリセロール）、およびＭＱ水を２０μｌま
での最終反応容積からなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを使用して行った。５５℃の
反応から切断断片を含有するＰＡＭをゲル精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプター
を用いてライゲートし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００配列決定（Ｂａｓｅｃｌ
ｅａｒ）に移送した。ＰＡＭライブラリーにより処理した等量の非ｔｈｅｒｍｏＣａｓ９
に、同じ過程を施し、参照として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００配列決定に移
送した。基準配列と完全に配列が一致したＨｉＳｅｑの読み取り値を、さらに解析するた
めに選択した。選択された読み取り値から、対照ライブラリーと比べて、ＴｈｅｒｍｏＣ
ａｓ９処置ライブラリーで１０００倍超で存在しているもの、およびＴｈｅｒｍｏＣａｓ
９処置ライブラリーで少なくとも１０倍超で存在しているものを、ＷｅｂＬｏｇｏ分析（
Crooks et al., Genome Res. 14, 1188-1190(2004)）に使用した。
ｇ． Ｂ．スミシイ（B. smithii）およびＰ．プチダ（P. putida）に関する編集および
サイレンシング構築物
プラスミド構築に使用したプライマーおよびプラスミドはすべて、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ
ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリ（ＮＥＢ）を行うことにより適切な突出部で設計し、それ
らをそれぞれ、表２および表３に列挙している。プラスミドを組み立てるための断片は、
Ｑ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）またはＰｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌ
ｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ）を用いてＰＣＲにより得て、ＰＣＲ生成物に１％アガロースゲル電気泳動を施し、
チモーゲンゲルＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。
化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（ＮＥＢ）に、またはＰ．プチダ（P
. putida）構築物では、大腸菌（E. coli）ＤＨ５α λｐｉｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）に、組み立てたプラスミドを形質転換した（後者は、直接的なベクター結合を容易にす
る）。単一コロニーをＬＢ培地に接種し、ＧｅｎｅＪｅｔプラスミドｍｉｎｉｐｒｅｐキ
ット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してプラスミド物質を
単離し、配列を確認して（ＧＡＴＣ－ｂｉｏｔｅｃｈ）、１μｇの各構築物を、既に記載
したプロトコルに従って調製した、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８エレクトロコ
ンピテント細胞から形質転換した（Bosma, et al. Microb. Cell Fact. 14, 99(2015)）
。Ｂ．スミシイ（B. smithii）およびＰ．プチダ（P. putida）液体培養物からゲノムＤ
ＮＡ単離するため、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）グラム陽性ＤｎＡ精製キット（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ）を使用した。
ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌの構築の場合、ΔｐｙｒＦ相同組換え隣接部と一緒
にしたｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓΔｐｙｒＦ１およびｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓ
ΔｐｙｒＦ２ベクター、ｐＮＷ３３ｎ主鎖を、ｐＷＵＲ＿Ｃａｓ９ｓｐ１＿ｈｒベクター
からＰＣＲ増幅した（Mougiakos, et al. ACS Synth. Biol. 6,849-861(2017)）（ＢＧ８
１９１およびＢＧ８１９２）。天然ＰｘｙｌＡプロモーターを、Ｂ．スミシイ（B. smith
ii）ＥＴ１３８（ＢＧ８１９４およびＢＧ８１９５）のゲノムからＰＣＲ増幅した。ｔｈ
ｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子は、Ｇ．サーモデニトリフィカン（G. thermodenitrificans）Ｔ
１２（ＢＧ８１９６およびＢＧ８１９７）のゲノムからＰＣＲ増幅した。Ｐｐｔａプロモ
ーターは、ｐＷＵＲ＿Ｃａｓ９ｓｐ１＿ｈｒベクターからＰＣＲ増幅した（Mougiakos, e
t al. ACS Synth. Biol. 6,849-861(2017)）（ＢＧ８１９８およびＢＧ８２６１＿２／Ｂ
Ｇ８２６３＿ｎｃ２／ＢＧ８３１７＿３）。ｓｇＲＮＡ足場の後のスペーサーは、ｐＵＣ
５７＿Ｔ７ｔ１２ｓｇＲＮＡベクターからＰＣＲ増幅した（ＢＧ８２６６＿２／ＢＧ８２
６８＿ｎｃ２／８３２０＿３およびＢＧ８２１０）。
４つの断片アセンブリを設計して、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬベクターの構
築を実施した。鋳型としてｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌを使用する２工程ＰＣＲ手
法により、最初に、標的ポイント変異をｔｈｅｒｍｏｃａｓ９触媒残基（変異Ｄ８Ａおよ
びＨ５８２Ａ）のコドンに導入した。第１のＰＣＲ工程（ＢＧ９０７５、ＢＧ９０７６）
の間に、所望の変異が、生成したＰＣＲ断片の終了時に導入され、第２の工程の間（ＢＧ
９０９１、ＢＧ９０９２）に、生成した断片を適切なアセンブリ－突出部の導入のための
ＰＣＲ鋳型として使用した。ｌｄｈＬサイレンシングスペーサーと共に第２の変異の下流
にｔｈｅｒｍｏｃａｓ９の一部を、鋳型として、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌを使
用してＰＣＲ増幅した（ＢＧ９０７７およびＢＧ９２６７）。ｐＮＷ３３ｎ主鎖を一緒に
したｓｇＲＮＡ足場を、鋳型としてｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌを使用してＰＣＲ
増幅した（ＢＧ９２６３およびＢＧ９０８８）。第１の変異の上流にｔｈｅｒｍｏｃａｓ
９の部分と一緒にしたプロモーターを鋳型としてｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌを使
用してＰＣＲ増幅した（ＢＧ９０８９、ＢＧ９０９０）。
２つの断片アセンブリを設計して、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｃｔｒｌベクターの構
築を実施した。ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬベクターにおけるスペーサー配列を
、両末端にＢａｅＩ制限部位を含有するランダム配列で置き換えた。ｐＮＷ３３ｎ主鎖を
一緒にしたｓｇＲＮＡ足場を、鋳型としてｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌを使用して
ＰＣＲ増幅した（ＢＧ９５４８、ＢＧ９６０１）。構築物の他の半分は、Ｔｈｅｒｍｏ－
ｄＣａｓ９からなり、プロモーターを鋳型としてｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬを
使用して増幅した（ＢＧ９６００、ＢＧ９５４９）。
５つの断片アセンブリを設計して、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０ベクターｐ
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｐｐΔｐｙｒＦの構築を実施した。自殺ベクターｐＥＭＧ由来の
レプリコンをＰＣＲ増幅した（ＢＧ２３６５、ＢＧ２３６６）。ｐｙｒＦの隣接領域を、
ＫＴ２４４０ゲノムＤＮＡから増幅した（５７６ｂｐ上流隣接部の場合、ＢＧ２３６７、
ＢＧ２３６８であり、５４０ｂｐ下流隣接部の場合、ＢＧ２３６９、ＢＧ２３７０）。隣
接部は、プライマーＢＧ２３６７およびＢＧ２３７０を使用して重複伸長ＰＣＲで融合し
、プライマーＢＧ２３６８およびＢＧ２３６９の重複を利用した。ｓｇＲＮＡは、ｐＴｈ
ｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌプラスミドから増幅した（ＢＧ２３７１、ＢＧ２３７２）。
構成的Ｐ３プロモーターは、ｐＳＷ＿Ｉ－ＳｃｅＩから増幅した（ＢＧ２３７３、ＢＧ２
３７４）。プロモーター断片は、プライマーＢＧ２３７２およびＢＧ２３７３を使用して
重複伸長ＰＣＲでｓｇＲＮＡ断片に融合し、プライマーＢＧ２３７１およびＢＧ２３７４
の重複を利用した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌプラス
ミドから増幅した（ＢＧ２３７５、ＢＧ２３７６）。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の３ーメチル
ベンゾエート誘発に使用されることになる、誘発性Ｐｍ－ＸｙｌＳ系は、ｐＳＷ＿Ｉ－Ｓ
ｃｅＩから増幅した（ＢＧ２３７７、ＢＧ２３７８）。
Figure 2022166045000016
Figure 2022166045000017
Figure 2022166045000018
ｈ． Ｐ．プチダ（P. putida）の編集プロトコル
Ｃｈｏｉら（Choi et al., J. Microbiol. Methods 64, 391-397(2006)）に従い、Ｐ．
プチダ（P. putida）へのプラスミドの形質転換を行った。統合体の形質転換および選択
後に、培養物を一晩、接種した。３ｍｌの新しい選択培地を接種するために、一晩の培養
物１０μｌを使用し、３７℃で２時間の成長後、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に３－メチルベン
ゾエートで誘発させた。さらに６時間後、３－メチルベンゾエートを補給した、非選択的
培地上に培養物の希釈物をプレート培養した。対照培養物の場合、３ーメチルベンゾエー
トの添加をすべての工程において省略した。Ｐ．プチダ（P. putida）染色体におけるプ
ラスミド統合の確認は、プライマーＢＧ２３８１およびＢＧ２１３５を用いるコロニーＰ
ＣＲにより行った。ｐｙｒＦ欠失の確認は、プライマーＢＧ２３８１およびＢＧ２３８２
を用いるコロニーＰＣＲにより行った。
ｉ． ＲＮＡ単離
ＲＮＡ単離は、既に記載したプロトコルに基づいて、フェノール抽出により行った（va
n Hijum et al. BMC Genomics 6, 77 (2005)）。１０ｍＬ培養物を４℃、４８１６×ｇで
１５分間、一晩、遠心分離にかけ、直ちにＲＮＡ単離に使用した。培地の除去後、細胞を
０．５ｍＬの氷冷ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中で懸濁させ、氷上で維持した。試料をすべ
て、０．５ｇのジルコニウムビーズ、３０μＬの１０％ＳＤＳ、３０μＬの３Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ５．２）および５００μＬのＲｏｔｉ－フェノール（ｐＨ４．５～５．０、
Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）を含有する２つの２ｍＬのスクリューキャップ付き管に
分割した。細胞を、５５００ｒｐｍで４５秒間、ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４装置（ＭＰ Ｂ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して破壊し、４℃および１００００ｒｐｍで５分間、遠心
分離にかけた。各管からの水相４００μＬを新しい管に移送し、ここに、４００μＬのク
ロロホルム－イソアミルアルコール（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）を加え、この後、
試料を４℃および１８４００×ｇで３分間、遠心分離にかけた。水相３００μＬを新しい
管に移送し、高純度のＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）からの溶解緩衝液３００μＬと混
合した。続いて、ＤＮアーゼインキュベート工程を除き（これは、４５分間、行った）、
このキットからの手順の残りを、製造業者のプロトコルに従って行った。ｃＤＮＡの濃度
および統合を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ－１０００ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙを使用して決定し、単
離したＲＮＡの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１００で確認した。
ｊ．ＲＴ－ｑＰＣＲによるｍＲＮＡの定量
製造業者のプロトコルに従いＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、単離ＲＮＡのための、第１の鎖ｃＤＮＡ合成を行った。
Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＰｅｒｆｅＣＴａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ ｉＱを使用して、ｑＰＣＲを行った。４０ｎｇのｃＤＮＡラ
イブラリーをそれぞれ、鋳型としてｑＰＣＲに使用した。２組のプライマー：ｌｄｈＬ遺
伝子の１５０ｎｔ長の領域を増幅するＢＧ９６６５：ＢＧ９６６６、およびｒｐｏＤ（Ｒ
ＮＡポリメラーゼシグマ因子）遺伝子の１５０ｎｔ長の配列を増幅するＢＧ９８８９：Ｂ
Ｇ９８９０を使用し、これは、ｑＰＣＲの対照として使用した。ｑＰＣＲは、Ｂｉｏ－Ｒ
ａｄ Ｃ１０００サーマルサイクラーで行った。
ｋ．ＨＰＬＣ
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムＩＣＳ－５０００をラクテート定量
に使用した。２１０ｎｍで作動するＵＶ１０００検出器およびＲＩ－１５０ ４０℃屈折
率検出器を装備した、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のＡｍｉｎｅｘ Ｈ
ＰＸ ８７Ｈカラムを用いて系を操作した。移動相は、０．１６Ｎ Ｈ２ＳＯ４からなり
、カラムを０．８ｍＬ／分で操作した。試料はすべて、０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４中の１０
ｍＭ ＤＭＳＯで４：１に希釈した。
説明の以下の項目は、本明細書に既に記載されている、本発明の記述を単に提示する番
号付けした段落からなる。この項目における番号付けした段落は、特許請求の範囲ではな
い。特許請求の範囲は、後の項目「特許請求の範囲」において以下に説明されている。
１．ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン
、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギ
ンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立
して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；
および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたは
フェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立
して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸また
はイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである
）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式
中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり
、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであ
り、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含む、単離されたＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ
ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：クラス
ター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩ
ＳＰＲ関連）タンパク質またはポリペプチドであって
少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子と会合すると、Ｃａｓタンパク質は、５０℃
と１００℃の間の核酸切断が可能であり、ポリヌクレオチドは、ターゲティングＲＮＡ分
子により認識される標的核酸配列を含む、上記タンパク質またはポリペプチド。
２．配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有す
る単離Ｃａｓタンパク質またはポリペプチド断片であって、標的配列を認識する少なくと
も１つのＲＮＡ分子と会合すると、Ｃａｓタンパク質は、５０℃と１００℃の間の温度で
、標的核酸配列を含むポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、改変するまたは標
識することができる、単離Ｃａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
３．Ｃａｓタンパク質またはポリペプチド断片が、５０℃と７５℃の間の温度、好まし
くは６０℃超の温度、より好ましくは６０℃と８０℃の間の温度、より好ましくは６０℃
と６５℃の間の温度で、核酸の結合、切断、標識または改変が可能である、段落番号１ま
たは段落番号２のＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
４．核酸の結合、切断、標識または改変が、ＤＮＡ切断である、段落番号１から３のい
ずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
５．アミノ酸配列が、配列番号１、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を含
む、前記段落番号のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
６．前記Ｃａｓタンパク質が細菌、古細菌またはウイルスから入手可能である、前記段
落番号のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
７．前記Ｃａｓタンパク質がゲオバチルス（Geobacillus）属種から、好ましくはゲオ
バチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から入手可
能である、前記段落番号のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
８．前記段落番号のいずれのＣａｓタンパク質を含み、標的ポリヌクレオチド中の配列
を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を含む、リボ核タンパク質複合体
。
９．前記ターゲティングＲＮＡ分子がｃｒＲＮＡおよび任意選択でｔｒａｃｒＲＮＡを
含む、段落番号８のリボ核タンパク質複合体。
１０．前記少なくとも１つのＲＮＡ分子の長さが３５～１３５ヌクレオチド残基の範囲
である、段落番号７から９のいずれかのリボ核タンパク質複合体。
１１．前記標的配列が３１または３２ヌクレオチド残基長である、段落番号８または９
のリボ核タンパク質複合体。
１２．タンパク質またはポリペプチドが、少なくとも１つのさらなる機能的または非機
能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供される、段落番号１から７のい
ずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド、または８から１１のいずれかのリボ核タ
ンパク質複合体。
１３．前記Ｃａｓタンパク質もしくはポリペプチドおよび／または前記少なくとも１つ
のさらなるタンパク質が少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、段落番号１２のＣａ
ｓタンパク質、ポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
１４．前記少なくとも１つの機能的部分が、前記Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまた
はリボ核タンパク質複合体のＮ終端および／またはＣ終端、好ましくはＮ終端に融合また
は連結している、段落番号１３のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核
タンパク質複合体。
１５．前記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ
、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、
アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、
ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパ
ク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、
抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択される、段落番号１３または１４のＣａｓ
タンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
１６．Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、Ｃａｓタンパク質が少
なくとも１つの機能的部分に連結している、段落番号１５のＣａｓタンパク質もしくはポ
リペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
１７．前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩ
ヌクレアーゼドメインである、段落番号１５または１６のＣａｓタンパク質もしくはポリ
ペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
１８．少なくとも１つの機能的部分が、マーカータンパク質、例えばＧＦＰである、段
落番号１５から１７のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチドまたはリボ核タン
パク質複合体。
１９．Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードする、単離核酸分子であって、
ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン
、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギ
ンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立
して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；
および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたは
フェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立
して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸また
はイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである
）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式
中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり
、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであ
り、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含み、
少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子と会合すると、Ｃａｓタンパク質またはポリ
ペプチドが、５０℃と１００℃の間で、ＤＮＡ結合、切断、標識または改変が可能であり
、ポリヌクレオチドが、ターゲティングＲＮＡ分子により認識される標的核酸配列を含む
、上記単離核酸分子。
２０．配列番号１のアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有
するＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐ
ａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的
に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タ
ンパク質、またはそのポリペプチド断片をコードする単離された核酸分子。
２１．翻訳されると前記Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドと融合するアミノ酸配列
をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む、段落番号１９または２０の単離さ
れた核酸分子。
２２．前記Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子に融合する前記
少なくとも１つの核酸配列が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、
ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転
写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質
、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク
質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択
されるタンパク質をコードする、段落番号２１の単離された核酸分子。
２３．段落番号１９から２２のいずれかの核酸分子を含む発現ベクター。
２４．少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列をさ
らに含む、段落番号２３の発現ベクター。
２５．標的核酸を改変する方法であって、核酸を
ａ． 段落番号６から１１のいずれかのリボ核タンパク質複合体；または
ｂ． 段落番号１２から１８のいずれかのタンパク質またはタンパク質複合体、および段
落番号６から１１のいずれかに記載の少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子
と接触させるステップを含み、ヒト細胞において使用されない方法。
２６．非ヒト細胞中で標的核酸を改変する方法であって、前記細胞を段落番号２４の発
現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入すること、または代わりに前
記細胞を段落番号２３の発現ベクターおよび段落番号６から１１のいずれかのターゲティ
ングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターで形質転換、
トランスフェクトもしくは形質導入することを含む方法。
２７．非ヒト細胞中で標的核酸を改変する方法であって、前記細胞を段落番号２３の発
現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入し、次いで、段落番号６から
１１のいずれかのターゲティングＲＮＡ分子を前記細胞に、または前記細胞内に送達する
ことを含む方法。
２８．段落番号２５から２８のいずれかの標的核酸を改変する方法であって、前記少な
くとも１つの機能的部分がマーカータンパク質またはレポータータンパク質であり、前記
マーカータンパク質またはレポータータンパク質が前記標的核酸と会合し、好ましくは前
記マーカーが蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、方法。
２９．前記標的核酸がＤＮＡ、好ましくはｄｓＤＮＡである、段落番号２５から２８の
いずれかの方法。
３０．前記標的核酸がＲＮＡである、段落番号２５から２８のいずれかの方法。
３１．段落番号２９の標的核酸を改変する方法であって、前記核酸がｄｓＤＮＡであり
、前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであ
り、前記改変が所望の遺伝子座での一本鎖または二本鎖切断である、方法。
３２．段落番号２６、２７、２９または３１方法のいずれかに従って所望の遺伝子座で
遺伝子発現をサイレンシングする方法。
３３．段落番号２６、２７、２９または３１の方法のいずれかに従って所望の位置で所
望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入する方法。
３４．段落番号２５から２９のいずれかの方法の標的核酸配列を改変することを含む、
非ヒト細胞中で遺伝子発現を改変する方法であって、前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記
機能的部分がＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性化因
子または転写リプレッサーから選択される、方法。
３５．段落番号３０の方法の標的核酸配列を改変することを含む、非ヒト細胞中で遺伝
子発現を改変する方法であって、前記核酸がｍＲＮＡであり、前記機能的部分がリボヌク
レアーゼであり、任意選択でエンドヌクレアーゼ、３’エキソヌクレアーゼまたは５’エ
キソヌクレアーゼから選択される、方法。
３６．５０℃と１００℃の間の温度で実行される、段落番号２５から３５のいずれかの
標的核酸を改変する方法。
３７．６０℃または６０℃より上、好ましくは６０℃と８０℃の間、より好ましくは６
０℃と６５℃の間の温度で実行される、段落番号３６の標的核酸を改変する方法。
３８．前記細胞が原核細胞である、段落番号２５から３７のいずれかの方法。
３９．前記細胞が真核細胞である、段落番号２５から３８のいずれかの方法。
４０．細胞がヒト細胞ではない、段落番号２２から３６のいずれかに記載の方法により
形質転換された、宿主細胞。
発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９：好熱性細菌であるゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＩＩＣ型系からＲＮＡ－ガイドＤＮＡ－エンドヌクレアーゼを発見して、特徴付けた。発明者らは、驚くべきことに、幅広い温度範囲にわたる、そのｉｎ ｖｉｔｒｏで活性を示し、熱安定性に対するｓｇＲＮＡ－構造の重要性を実証し、幅広い温度範囲にわたる、ｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム編集に、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を適用した。
本開示は、以下の［１］から［１０６］を含む。
［１］標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、切断する、標識するまたは改変するための、少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質の使用であって、
上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、上記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、
上記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有し、
上記少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子が、上記標的配列を認識し、
上記非標的核酸鎖が、上記プロトスペーサー核酸配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含み、上記使用が、ヒト細胞におけるものではない、使用。
［２］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［１］に記載の使用。
［３］上記標的核酸配列を含む上記ポリヌクレオチドが上記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは、上記切断がＤＮＡ切断である、上記［１］または上記［２］に記載の使用。
［４］上記標的配列を含む上記標的核酸鎖が二本鎖ＤＮＡであり、上記使用が、上記標的核酸配列を含む上記ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［１］から［３］のいずれかに記載の使用。
［５］上記標的核酸配列を含む上記ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記使用が上記ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、上記［１］または上記［２］に記載の使用。
［６］上記Ｃａｓタンパク質を含む上記ポリヌクレオチドが、変異Ｄ８ＡおよびＨ５８２Ａを含む、上記［５］に記載の使用。
［７］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］を含む、上記［１］から［６］のいずれかに記載の使用。
［８］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＳＡＡ－３’［配列番号４８］を含む、上記［１］から［７］のいずれかに記載の使用。
［９］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＣＡＡ－３’［配列番号５０］を含む、上記［８］に記載の使用。
［１０］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、上記［８］または上記［９］に記載の使用。
［１１］結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［７］から［１０］のいずれかに記載の使用。
［１２］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の使用。
［１３］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［１］から［１２］のいずれかに記載の使用。
［１４］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［１］から［１３］のいずれかに記載の使用。
［１５］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［１］から［１４］のいずれかに記載の使用。
［１６］上記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、上記［１］から［１５］のいずれかに記載の使用。
［１７］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［１］から［１６］のいずれかに記載の使用。
［１８］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［１］から［１７］のいずれかに記載の使用。
［１９］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［１７］または上記［１８］に記載の使用。
［２０］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［１７］から［１９］のいずれかに記載の使用。
［２１］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［２０］に記載の使用。
［２２］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［２０］または上記［２１］に記載の使用。
［２３］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［２０］から［２２］のいずれかに記載の使用。
［２４］二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する方法であって、上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸を含み、上記方法が、
ａ．少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を設計するステップであって、上記ターゲティングＲＮＡ分子が、上記標的鎖の上記標的配列を認識し、上記非標的鎖が、上記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
配列をさらに含み、上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含む、ステップ、
ｂ．上記ターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体を形成するステップであって、上記単離Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、ステップ、および
ｃ．上記リボ核タンパク質複合体が、上記標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する、ステップ
を含み、ヒト細胞において使用されない方法。
［２５］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［２４］に記載の方法。
［２６］上記標的核酸配列を含む上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが上記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは上記切断がＤＮＡ切断である、上記［２４］または上記［２５］に記載の方法。
［２７］上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記使用が、上記ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［２４］から［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］上記標的核酸配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が、上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記方法が、上記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、上記［２４］または上記［２５］に記載の方法。
［２９］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］を含む、上記［２４］から［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＳＡＡ－３’［配列番号４８］を含む、上記［２９］に記載の方法。
［３１］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＣＡＡ－３’［配列番号５０］を含む、上記［３０］に記載の方法。
［３２］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、上記［３０］または上記［３１］に記載の方法。
［３３］結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［２９］から上記［３２］のいずれかに記載の方法。
［３４］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［２４］から［３３］のいずれかに記載の使用。
［３５］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［２４］から［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［２４］から［３５］のいずれかに記載の方法。
［３７］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［２４］から［３６］のいずれかに記載の方法。
［３８］上記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、上記［２４］から［３７］のいずれかに記載の方法。
［３９］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［２４］から［３９］のいずれかに記載の方法。
［４０］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［２４］から［４０］のいずれかに記載の方法。
［４１］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［３９］または上記［４０］に記載の方法。
［４２］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［３９］から［４１］のいずれかに記載の方法。
［４３］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［４２］に記載の方法。
［４４］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［４２］または上記［４３］に記載の方法。
［４５］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［４２］から［４４］のいずれかに記載の方法。
［４６］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、上記改変が、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断である、上記［２０］に記載の使用または上記［４２］に記載の方法。
［４７］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、上記結合、切断、標識または改変が、遺伝子発現の改変をもたらす、上記［２０］に記載の使用、または上記［４２］に記載の方法。
［４８］上記結合、切断、標識または改変が、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる、上記［２０］に記載の使用、または上記［４２］に記載の方法。
［４９］上記結合、切断、標識または改変が、好熱性生物において、好ましくは好熱性原核生物、より好ましくはゲオバチルス（Geobacillus）属種において起こる、上記［４８］に記載
の使用または方法。
［５０］上記結合、切断、標識または改変が、中温生物において、好ましくは中温性原核生物、より好ましくはシュードモナス（Pseudomonas）属種において起こる、上記［４８］に記載の使用または方法。
［５１］上記結合、切断、標識または改変が、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入をもたらし、かつ／または上記結合、切断、標識または改変が、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現をもたらす、上記［１］から［４］、［７］から［２３］、もしくは［４６］のいずれかに記載の使用、または上記［２４］から［２７］、［２９］から［４６］のいずれかに記載の方法。
［５２］標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドを有する形質転換非ヒト細胞であって、上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、上記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、上記細胞が、
配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質、
上記標的核酸鎖中の上記標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子であって、上記非標的鎖が、上記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、上記ＰＡＭ配列が５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含む、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、および
少なくとも１つの上記Ｃａｓタンパク質および上記ターゲティングＲＮＡ分子をコードする核酸を含む発現ベクター
を含む、形質転換非ヒト細胞。
［５３］上記Ｃａｓタンパク質および上記ターゲティングＲＮＡ分子により、上記細胞中の上記標的ポリヌクレオチドの結合、切断、標識または改変が可能になり、上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［５２］に記載の形質転換細胞。
［５４］上記標的核酸配列を含む上記標的核酸鎖がＣａｓタンパク質により切断され、好ましくは上記切断がＤＮＡ切断である、上記［５２］または上記［５３］に記載の形質転換細胞。
［５５］上記標的配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記結合、切断、標識または改変が、上記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［５２］から［５４］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５６］上記標的核酸配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が、上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記結合、切断、標識または改変が、上記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、上記［５２］または上記［５３］に記載の形質転換細胞。
［５７］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］を含む、上記［５２］から［５６］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５８］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＳＡＡ－３’［配列番号４８］を含む、上記［５７］に記載の形質転換細胞。
［５９］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＣＡＡ－３’［配列番号５０］を含む、上記［５８］に記載の形質転換細胞。
［６０］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、上記［５８］または上記［５９］に記載の形質転換細胞。
［６１］結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［５７］から［上記［６０］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６２］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［５２］から［６１］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６３］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［５２］から［６２］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６４］上記細胞が原核細胞である、上記［５２］から［６３］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６５］上記細胞が真核細胞である、上記［５２］から［６３］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６６］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［５２］から［６５］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６７］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［５２］から［６６］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６８］上記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、上記［５２］から［６７］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６９］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［５２］から［６８］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７０］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［５２］から［６９］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７１］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／またはＣ終端に、好ましくはＮ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［６９］または上記［７０］に記載の形質転換細胞。
［７２］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、
蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［６９］から［７１］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７３］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［７２］に記載の形質転換細胞。
［７４］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［６９］から［７３］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７５］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［６９］から［７３］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７６］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、上記改変が、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断である、上記［６９］から［７４］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７７］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、上記結合、切断、標識または改変が、遺伝子発現の改変をもたらす、上記［６９］から［７３］のいずれかに記載の形質転換細胞、または上記［４２］に記載の方法。
［７８］上記Ｃａｓタンパク質が、発現ベクターから発現される、上記［６９］から［７４］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７９］上記結合、切断、標識または改変が、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入をもたらし、かつ／または上記結合、切断、標識または改変が、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現をもたらす、上記［５２］から［７８］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［８０］Ｃａｓタンパク質、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子、および上記標的ポリヌクレオチドを含む、核タンパク質複合体であって、
上記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有し、
上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、上記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、ならびに上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列および上記プロトスペーサー配列の３‘末端に直接隣接したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む非標的核酸鎖を含み、上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含み、上記核タンパク質複合体がヒト細胞におけるものではない、核タンパク質複合体。
［８１］２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で発生する、上記［８０］に記載の核タンパク質複合体。
［８２］上記標的核酸配列を含む上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが上記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは上記切断がＤＮＡ切断である、上記［８０］または上記［８１］に記載の核タンパク質複合体。
［８３］上記標的配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記結合、切断、標識または改変が、上記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［８０］から［８２］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８４］上記標的核酸配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が、上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記核タンパク質複合体が存在することにより、上記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングがもたらされる、上記［８０］または上記［８１］に記載の核タンパク質複合体。
［８５］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］を含む、上記［８０］から［８４］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８６］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＳＡＡ－３’［配列番号４８］を含む、上記［８５］に記載の核タンパク質複合体。
［８７］上記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＣＡＡ－３’［配列番号５０］を含む、上記［８６］に記載の核タンパク質複合体。
［８８］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、上記［８６］または上記［８７］に記載の核タンパク質複合体。
［８９］結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［８５］から上記［８８］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９０］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［８０］から［８９］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９１］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［８０］から［９０］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９２］原核細胞中である、上記［８０］から［９１］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９３］真核細胞中である、上記［８０］から［９１］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９４］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［８０］から［９３］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９５］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［８０］から［９４］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９６］上記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、上記［８０］から［９５］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９７］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［８０］から［９６］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９８］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさら
なるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［８０］から［９７］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９９］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［９７］または上記［９８］に記載の核タンパク質複合体。
［１００］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［９７］から［９９］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［１０１］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［１００］に記載の核タンパク質複合体。
［１０２］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［９７］から［１０１］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［１０３］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［９７］から［１０１］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［１０４］上記核酸がｄｓＤＮＡであり、上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、上記標的ポリヌクレオチドが、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断を有する、上記［９７］から［１０２］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［１０５］上記核酸がｄｓＤＮＡであり、上記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、上記核タンパク質複合体形成により、遺伝子発現の改変がもたらされる、上記［９７］から［１０１］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［１０６］上記核タンパク質形成により、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入がもたらされ、かつ／または上記核タンパク質複合体形成により、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現がもたらされる、上記［８０］から［１０５］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。

Claims (106)

  1. 標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、切断する、標識するまた
    は改変するための、少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク
    質の使用であって、
    前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および前記
    標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、
    前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％
    の同一性の配列を有し、
    前記少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子が、前記標的配列を認識し、
    前記非標的核酸鎖が、前記プロトスペーサー核酸配列の３’末端に直接隣接するプロト
    スペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮ
    ＮＣＮＮ－３’を含み、前記使用が、ヒト細胞におけるものではない、使用。
  2. 前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃
    の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好まし
    くは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６
    ０℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項１に記載の使用。
  3. 前記標的核酸配列を含む前記ポリヌクレオチドが前記Ｃａｓタンパク質により切断され
    、好ましくは、前記切断がＤＮＡ切断である、請求項１または請求項２に記載の使用。
  4. 前記標的配列を含む前記標的核酸鎖が二本鎖ＤＮＡであり、前記使用が、前記標的核酸
    配列を含む前記ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、請求項１から３のいずれか
    に記載の使用。
  5. 前記標的核酸配列を含む前記ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記Ｃａｓタン
    パク質が前記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、前記使用が前記ポリヌクレオチドの遺
    伝子サイレンシングをもたらす、請求項１または請求項２に記載の使用。
  6. 前記Ｃａｓタンパク質を含む前記ポリヌクレオチドが、変異Ｄ８ＡおよびＨ５８２Ａを
    含む、請求項５に記載の使用。
  7. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］を含む、請求項１
    から６のいずれかに記載の使用。
  8. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＳＡＡ－３’［配列番号４８］を含む、請求項１
    から７のいずれかに記載の使用。
  9. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＣＡＡ－３’［配列番号５０］を含む、請求項８
    に記載の使用。
  10. 前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、請求項８ま
    たは請求項９に記載の使用。
  11. 結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項７から１
    ０のいずれかに記載の使用。
  12. 前記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌か
    ら得られる、請求項１から１１のいずれかに記載の使用。
  13. 前記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチル
    ス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることがで
    きる、請求項１から１２のいずれかに記載の使用。
  14. 前記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項
    １から１３のいずれかに記載の使用。
  15. 前記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド
    残基の範囲である、請求項１から１４のいずれかに記載の使用。
  16. 前記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、請求項１から１５のいず
    れかに記載の使用。
  17. 前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項１から１
    ６のいずれかに記載の使用。
  18. 前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質
    を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、前記少なくとも１つのさら
    なるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項１から１７のいず
    れかに記載の使用。
  19. 前記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質またはタン
    パク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結して
    いる、少なくとも１つの機能的部分を含む、請求項１７または請求項１８に記載の使用。
  20. 前記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌク
    レアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチ
    ラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ
    結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、
    蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エ
    ピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、
    請求項１７から１９のいずれかに記載の使用。
  21. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、前記Ｃａｓタンパク質が
    少なくとも１つの機能的部分に連結している、請求項２０に記載の使用。
  22. 前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレ
    アーゼドメインである、請求項２０または請求項２１に記載の使用。
  23. 前記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、請求項２０から２２の
    いずれかに記載の使用。
  24. 二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する方
    法であって、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、標的核酸配列を含む標的核酸鎖、およ
    び前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸を含み、
    前記方法が、
    ａ．少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を設計するステップであって、前記ター
    ゲティングＲＮＡ分子が、前記標的鎖の前記標的配列を認識し、前記非標的鎖が、前記プ
    ロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
    配列をさらに含み、前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含む、ステップ、
    ｂ．前記ターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質複合
    体を形成するステップであって、前記単離Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配
    列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、ステップ、および
    ｃ．前記リボ核タンパク質複合体が、前記標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断
    する、標識するまたは改変する、ステップ
    を含み、ヒト細胞において使用されない方法。
  25. 前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃
    の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好まし
    くは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６
    ０℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記標的核酸配列を含む前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが前記Ｃａｓタンパク質によ
    り切断され、好ましくは前記切断がＤＮＡ切断である、請求項２４または請求項２５に記
    載の方法。
  27. 前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記使用が、前記ポリヌクレオチド
    中の二本鎖切断をもたらす、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
  28. 前記標的核酸配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記Ｃａｓ
    タンパク質が、前記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、前記方法が、前記標的ポリヌク
    レオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、請求項２４または請求項２５に記載の方法
    。
  29. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］を含む、請求項２
    ４から２８のいずれかに記載の方法。
  30. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＳＡＡ－３’［配列番号４８］を含む、請求項２
    ９に記載の方法。
  31. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＣＡＡ－３’［配列番号５０］を含む、請求項３
    ０に記載の方法。
  32. 前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、請求項３０
    または請求項３１に記載の方法。
  33. 結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項２９から
    請求項３２のいずれかに記載の方法。
  34. 前記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌か
    ら得られる、請求項２４から３３のいずれかに記載の使用。
  35. 前記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチル
    ス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることがで
    きる、請求項２４から３４のいずれかに記載の方法。
  36. 前記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項
    ２４から３５のいずれかに記載の方法。
  37. 前記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド
    残基の範囲である、請求項２４から３６のいずれかに記載の方法。
  38. 前記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、請求項２４から３７のい
    ずれかに記載の方法。
  39. 前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項２４から
    ３９のいずれかに記載の方法。
  40. 前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質
    を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、前記少なくとも１つのさら
    なるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項２４から４０のい
    ずれかに記載の方法。
  41. 前記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質またはタン
    パク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結して
    いる、少なくとも１つの機能的部分を含む、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
  42. 前記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌク
    レアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチ
    ラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ
    結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、
    蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エ
    ピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、
    請求項３９から４１のいずれかに記載の方法。
  43. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、前記Ｃａｓタンパク質が
    少なくとも１つの機能的部分に連結している、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレ
    アーゼドメインである、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
  45. 前記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、請求項４２から４４の
    いずれかに記載の方法。
  46. 前記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、前記少なくとも１つの機能的部
    分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、前記改変が、所望の遺伝子座
    における一本鎖または二本鎖切断である、請求項２０に記載の使用または請求項４２に記
    載の方法。
  47. 前記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、前記機能的部分が、ＤＮＡ改変
    酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサー
    から選択され、前記結合、切断、標識または改変が、遺伝子発現の改変をもたらす、請求
    項２０に記載の使用、または請求項４２に記載の方法。
  48. 前記結合、切断、標識または改変が、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項２０に記載の
    使用、または請求項４２に記載の方法。
  49. 前記結合、切断、標識または改変が、好熱性生物において、好ましくは好熱性原核生物
    、より好ましくはゲオバチルス（Geobacillus）属種において起こる、請求項４８に記載
    の使用または方法。
  50. 前記結合、切断、標識または改変が、中温生物において、好ましくは中温性原核生物、
    より好ましくはシュードモナス（Pseudomonas）属種において起こる、請求項４８に記載
    の使用または方法。
  51. 前記結合、切断、標識または改変が、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変ま
    たは欠失および／もしくは挿入をもたらし、かつ／または前記結合、切断、標識または改
    変が、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現をもたらす、請求項１から４、７から
    ２３、もしくは４６のいずれかに記載の使用、または請求項２４から２７、２９から４６
    のいずれかに記載の方法。
  52. 標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドを有する形質転換非ヒト細胞であって
    、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および前記
    標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、前記
    細胞が、
    配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、
    Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃ
    ｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間
    隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパ
    ク質、
    前記標的核酸鎖中の前記標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮ
    Ａ分子であって、前記非標的鎖が、前記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接する
    プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、前記ＰＡＭ配列が５’－Ｎ
    ＮＮＮＣＮＮ－３’を含む、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、および
    少なくとも１つの前記Ｃａｓタンパク質および前記ターゲティングＲＮＡ分子をコード
    する核酸を含む発現ベクター
    を含む、形質転換非ヒト細胞。
  53. 前記Ｃａｓタンパク質および前記ターゲティングＲＮＡ分子により、前記細胞中の前記
    標的ポリヌクレオチドの結合、切断、標識または改変が可能になり、前記結合、切断、標
    識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃
    と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の
    間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温
    度で起こる、請求項５２に記載の形質転換細胞。
  54. 前記標的核酸配列を含む前記標的核酸鎖がＣａｓタンパク質により切断され、好ましく
    は前記切断がＤＮＡ切断である、請求項５２または請求項５３に記載の形質転換細胞。
  55. 前記標的配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記結合、切断
    、標識または改変が、前記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、請求項５２
    から５４のいずれかに記載の形質転換細胞。
  56. 前記標的核酸配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記Ｃａｓ
    タンパク質が、前記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、前記結合、切断、標識または改
    変が、前記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、請求項５２または
    請求項５３に記載の形質転換細胞。
  57. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］を含む、請求項５
    ２から５６のいずれかに記載の形質転換細胞。
  58. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＳＡＡ－３’［配列番号４８］を含む、請求項５
    ７に記載の形質転換細胞。
  59. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＣＡＡ－３’［配列番号５０］を含む、請求項５
    ８に記載の形質転換細胞。
  60. 前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、請求項５８
    または請求項５９に記載の形質転換細胞。
  61. 結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項５７から
    請求項６０のいずれかに記載の形質転換細胞。
  62. 前記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌か
    ら得られる、請求項５２から６１のいずれかに記載の形質転換細胞。
  63. 前記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチル
    ス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることがで
    きる、請求項５２から６２のいずれかに記載の形質転換細胞。
  64. 前記細胞が原核細胞である、請求項５２から６３のいずれかに記載の形質転換細胞。
  65. 前記細胞が真核細胞である、請求項５２から６３のいずれかに記載の形質転換細胞。
  66. 前記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項
    ５２から６５のいずれかに記載の形質転換細胞。
  67. 前記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド
    残基の範囲である、請求項５２から６６のいずれかに記載の形質転換細胞。
  68. 前記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、請求項５２から６７のい
    ずれかに記載の形質転換細胞。
  69. 前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項５２から
    ６８のいずれかに記載の形質転換細胞。
  70. 前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質
    を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、前記少なくとも１つのさら
    なるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項５２から６９のい
    ずれかに記載の形質転換細胞。
  71. 前記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質またはタン
    パク質複合体のＮ終端および／またはＣ終端に、好ましくはＮ終端に融合または連結して
    いる、少なくとも１つの機能的部分を含む、請求項６９または請求項７０に記載の形質転
    換細胞。
  72. 前記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌク
    レアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチ
    ラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ
    結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、
    蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エ
    ピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、
    請求項６９から７１のいずれかに記載の形質転換細胞。
  73. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、前記Ｃａｓタンパク質が
    少なくとも１つの機能的部分に連結している、請求項７２に記載の形質転換細胞。
  74. 前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレ
    アーゼドメインである、請求項６９から７３のいずれかに記載の形質転換細胞。
  75. 前記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、請求項６９から７３の
    いずれかに記載の形質転換細胞。
  76. 前記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、前記少なくとも１つの機能的部
    分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、前記改変が、所望の遺伝子座
    における一本鎖または二本鎖切断である、請求項６９から７４のいずれかに記載の形質転
    換細胞。
  77. 前記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、前記機能的部分が、ＤＮＡ改変
    酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサー
    から選択され、前記結合、切断、標識または改変が、遺伝子発現の改変をもたらす、請求
    項６９から７３のいずれかに記載の形質転換細胞、または請求項４２に記載の方法。
  78. 前記Ｃａｓタンパク質が、発現ベクターから発現される、請求項６９から７４のいずれ
    かに記載の形質転換細胞。
  79. 前記結合、切断、標識または改変が、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変ま
    たは欠失および／もしくは挿入をもたらし、かつ／または前記結合、切断、標識または改
    変が、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現をもたらす、請求項５２から７８のい
    ずれかに記載の形質転換細胞。
  80. Ｃａｓタンパク質、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて標的核酸配列を認識する少な
    くとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子、および前記標的ポリヌクレオチドを含む、核
    タンパク質複合体であって、
    前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％
    の同一性の配列を有し、
    前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、ならびに前
    記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列および前記プロトスペーサー配
    列の３‘末端に直接隣接したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む非標的
    核酸鎖を含み、前記ＰＡＭ配列が、５‘－ＮＮＮＮＣＮＮ－３’を含み、前記核タンパク
    質複合体がヒト細胞におけるものではない、核タンパク質複合体。
  81. ２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の
    温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さ
    らにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で発生する、
    請求項８０に記載の核タンパク質複合体。
  82. 前記標的核酸配列を含む前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが前記Ｃａｓタンパク質によ
    り切断され、好ましくは前記切断がＤＮＡ切断である、請求項８０または請求項８１に記
    載の核タンパク質複合体。
  83. 前記標的配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記結合、切断
    、標識または改変が、前記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、請求項８０
    から８２のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  84. 前記標的核酸配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記Ｃａｓ
    タンパク質が、前記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、前記核タンパク質複合体が存在
    することにより、前記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングがもたらされる、請
    求項８０または請求項８１に記載の核タンパク質複合体。
  85. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’［配列番号４７］を含む、請求項８
    ０から８４のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  86. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＳＡＡ－３’［配列番号４８］を含む、請求項８
    ５に記載の核タンパク質複合体。
  87. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＮＮＣＣＡＡ－３’［配列番号５０］を含む、請求項８
    ６に記載の核タンパク質複合体。
  88. 前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、請求項８６
    または請求項８７に記載の核タンパク質複合体。
  89. 結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項８５から
    請求項８８のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  90. 前記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌か
    ら得られる、請求項８０から８９のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  91. 前記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチル
    ス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることがで
    きる、請求項８０から９０のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  92. 原核細胞中である、請求項８０から９１のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  93. 真核細胞中である、請求項８０から９１のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  94. 前記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項
    ８０から９３のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  95. 前記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５～２００ヌクレオチド
    残基の範囲である、請求項８０から９４のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  96. 前記標的核酸配列が、１５～３２ヌクレオチド残基長である、請求項８０から９５のい
    ずれかに記載の核タンパク質複合体。
  97. 前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項８０から
    ９６のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  98. 前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質
    を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、前記少なくとも１つのさら
    なるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項８０から９７のい
    ずれかに記載の核タンパク質複合体。
  99. 前記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質またはタン
    パク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結して
    いる、少なくとも１つの機能的部分を含む、請求項９７または請求項９８に記載の核タン
    パク質複合体。
  100. 前記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌク
    レアーゼ、ヘリカーゼ－ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチ
    ラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ
    結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、
    蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エ
    ピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、
    請求項９７から９９のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  101. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、前記Ｃａｓタンパク質が
    少なくとも１つの機能的部分に連結している、請求項１００に記載の核タンパク質複合体
    。
  102. 前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレ
    アーゼドメインである、請求項９７から１０１のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  103. 前記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、請求項９７から１０１
    のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
  104. 前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたは
    ヘリカーゼ－ヌクレアーゼであり、前記標的ポリヌクレオチドが、所望の遺伝子座におけ
    る一本鎖または二本鎖切断を有する、請求項９７から１０２のいずれかに記載の核タンパ
    ク質複合体。
  105. 前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラー
    ゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、前記核タ
    ンパク質複合体形成により、遺伝子発現の改変がもたらされる、請求項９７から１０１の
    いずれかに記載の核タンパク質複合体。
  106. 前記核タンパク質形成により、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠
    失および／もしくは挿入がもたらされ、かつ／または前記核タンパク質複合体形成により
    、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現がもたらされる、請求項８０から１０５の
    いずれかに記載の核タンパク質複合体。
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