JP7127942B2 - 二重鎖ｄｎａの標的化改変の方法 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、ゲノム又は遺伝子編集ツールの分野に関する。

（発明の背景）
生細胞の遺伝物質に改変を意図的に作出する過程は、生細胞、又は生細胞が部分を形成する若しくは再生できる生物の遺伝的にコードされている生物学的特性を１つ若しくは複数修飾するという目標を一般に有する。これらの変更は、遺伝物質の部分の欠失、外来性遺伝物質の付加又は遺伝物質の既存のヌクレオチド配列の変更という形をとり得る。

真核生物の遺伝物質を改変する方法は、２０年以上にわたって公知であり、農業、ヒトの健康、食物品質及び環境保護の分野における改善のために植物、ヒト及び動物細胞並びに微生物において幅広い用途を見出してきた。

最も一般的な方法は、細胞のゲノムに外来性ＤＮＡ断片を付加することからなり、その方法は、すでに存在する遺伝子にコードされている特性に加えて細胞又は生物に新たな特性を次いで付与することになる（既存の遺伝子の発現がそれによって抑制されることになる用途を含む）。これら例の多くは、所望の特性を得るのに有効であるが、にもかかわらずこれらの方法は、外来性ＤＮＡ断片が挿入され得るゲノム位置の制御（それ故、発現の最終的なレベルの制御）がなされず、所望の効果が、元の及びバランスのとれたゲノムにコードされる天然の特性を上回って所望の効果を現わさなければならなくなるので、あまり的確でない。

反対に、あらかじめ定義された、すなわち標的されたゲノム座においてヌクレオチドの付加、欠失又は変換をもたらすことになるゲノム編集の方法は、ゲノムの、例えば既存の遺伝子における的確な修飾を可能にする。

文献に記述されている、標的化ゲノム編集の大部分は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して実行されてきた。ＺＦＮを使用して、広範囲にわたる生物及び細胞型において内在性遺伝子が修飾されてきた。点突然変異、欠失、挿入、転移、複製及び転座を含めいくつかの型のゲノム改変がＺＦＮにより導入され得、したがって、遺伝子操作を実行するために先例のないツールを研究者に提供する。

より近年、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が、ＺＦＮに代わるものとしてゲノム編集及び標的化二本鎖切断（ＤＳＢ）導入、すなわちＤＮＡ二重鎖の両方の鎖が切断される、のために急速に出現してきた。ＴＡＬＥＮはＺＦＮと類似しており、カスタマイズ可能なＤＮＡ結合ドメインに融合された非特異的ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを含む。カスタマイズ可能なＤＮＡ結合ドメインは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌によって分泌されて宿主植物細胞中で遺伝子の転写を改変するタンパク質である転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）から得られる高度に保存された反復で構成されている。

より詳細には、ＴＡＬＥは、いくつかの反復するタンパク質ドメインからなり、ドメインのそれぞれは、４種のＤＮＡヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）のうち１つを特異的に認識し、そのヌクレオチドに結合することができる。各ヌクレオチドに特異的なドメインが同定されており、任意のＤＮＡ配列に高い結合親和性を有する特異的なドメインの列が作製され得る（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ、２０１０年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６：７５７～７６１頁；Ｃｅｒｍａｋら、２０１１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９：ｅ８２頁；Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ及びＶｏｙｔａｓ、２０１１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３：１８４３～１８４６頁；Ｂｏｃｈ、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１３５～１３６頁）。特異的なドメインの列を、ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインに次いで融合して、ＴＡＬＥＮを作出し、ＺＦＮと同様に２つのＴＡＬＥＮタンパク質を使用して標的ＤＮＡ二重鎖にＤＮＡ ＤＳＢを誘導する。いくつかの論文が、標的配列において突然変異を作出するためのＴＡＬＥＮの使用について記述している（Ｃｕｒｔｉｎ［２０１２年］Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ、５、４２～５０頁）。Ｊｏｕｎｇら（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．［２０１３年］１４［１］：４９～５５頁、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３４８６Ａ）は、標的化ゲノム編集においてＴＡＬＥＮを利用する様々な技術について概説し、比較した。

近年、標的化ゲノム編集の新規の別の方法が報告された。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な間隔のパリンドローム様短反復）（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）は、複数の短い直列反復を含有する座であり、配列決定された細菌の４０％及び配列決定された古細菌の９０％に見出される。

ＣＲＩＳＰＲ反復は、バクテリオファージ及びプラスミドなどの遺伝的病原体に対する後天性細菌免疫系を形成する。細菌が病原体に攻撃されると、病原体ゲノムの小片がＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）によってプロセッシングされ、ＣＲＩＳＰＲ反復間で細菌ゲノムに組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ座は次いで転写され、プロセッシングされて、病原体ゲノムと同一のおよそ３０ヌクレオチドの配列を含むいわゆるｃｒＲＮＡを形成する。これらＲＮＡ分子は、その後の感染に対する病原体の認識の基礎を形成し、ＲＮＡｉ様の過程又は病原体ゲノムの直接消化のいずれかにより病原体遺伝的エレメントのサイレンシングを導く。

細菌及び古細菌適応免疫のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、タンパク質組成物及びゲノム座構造の大きな多様性を示す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、５０種以上の遺伝子ファミリーを有し、座構造の速い進化及び大きな多様性を示す厳密に普遍的な遺伝子が存在しない。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣａｓタンパク質の一例であり、ｃｒＲＮＡ及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と称される第２のＲＮＡと組み合わさるとエンドヌクレアーゼを形成し、エンドヌクレアーゼは、侵入病原体ＤＮＡを標的して、ｃｒＲＮＡによって定義される病原体ゲノム中の位置でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することにより分解する。Ｊｉｎｅｋら（２０１２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２０頁）は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分を融合することにより作製される一本鎖キメラガイドＲＮＡ（本明細書において「ｓｇＲＮＡ」）が、Ｃａｓタンパク質と組み合わさって機能エンドヌクレアーゼを形成できることを実証した。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系の次に、新たなＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系である、プレボテラ及びフランシセラ１由来のクラスター化された規則的な間隔のパリンドローム様短反復又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１が、最近記述された。Ｃｐｆ１遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ座と関係しており、ｃｒＲＮＡを使用してＤＮＡを標的とするエンドヌクレアーゼをコードする。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９より小さく、より単純なエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の制約のいくつかを克服できる。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、Ｔに富んだプロトスペーサー隣接モチーフを活用する。Ｃｐｆ１は、突出したＤＮＡ二本鎖切断によりＤＮＡを開裂する（Ｚｅｔｓｃｈｅら［２０１５年］Ｃｅｌｌ １６３［３］：７５９～７７１頁）。

標的化ＤＮＡ改変の機序を理解する上でのこれら最近の進歩にもかかわらず、植物材料における標的化改変は、今なお必ずしも成功していない又は効果的でない。実際、利用可能な方法は、動物、特にヒト細胞材料用としてしばしば最適化されており、植物細胞に特別に適用した場合、必ずしも成功しない又は効果的でない。加えて、先行技術の方法は、遺伝的に操作された生物をもたらすが、一部の実施形態において、遺伝的に操作された生物は植物分野において好ましくない。したがって、植物細胞を提供する新たな方法であって、標的化改変が、植物細胞用として特別に設計された系及びプロトコールにより導入される方法が必要である。植物細胞におけるＤＮＡの標的化改変の方法は、好ましくは、当該技術分野で公知の方法と比較して様々な植物細胞において適当な効率で成功裏に適用され得る。

これを考慮すると、植物細胞におけるＤＮＡの標的化改変、並びに標的化改変が導入された植物細胞及び植物を提供する新たな方法が、非常に望ましくなる。特に、植物細胞のＤＮＡ分子の効果的な標的化改変を可能にする信頼性が高く、効果的で、再現性があり、特に標的化される方法が、当該技術分野において明白に必要である。したがって、本発明の根底にある技術的問題は、上述した必要性のいずれも満たす方法の提供に見ることができる。技術的問題は、請求項及び下記の開示において特徴付けられる実施形態により解決される。

（発明の概要）
第１の態様において、本開示は、植物における二重鎖ＤＮＡの標的化改変の方法であって、二重鎖ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖が標的配列を含み、二重鎖ＤＮＡの第２のＤＮＡ鎖が標的配列に相補的な配列を含み、
（ａ）前記二重鎖ＤＮＡを含む植物細胞又は植物プロトプラストを用意する工程と；
（ｂ）前記細胞又はプロトプラスト中の前記二重鎖ＤＮＡを：
Ｃｐｆ１タンパク質；及び
標的配列を含む二重鎖ＤＮＡの部位に前記Ｃｐｆ１タンパク質を標的とするためのガイド配列を含むｃｒＲＮＡ
に曝露する工程とを含む方法を提供する。

前記二重鎖ＤＮＡは、植物プロトプラストに前記Ｃｐｆ１の一過性発現のための核酸構築物を導入することによって前記Ｃｐｆ１に曝露されてもよい。

前記二重鎖ＤＮＡは、植物プロトプラストに前記ｃｒＲＮＡの一過性発現のための核酸構築物を導入することによって前記ｃｒＲＮＡに曝露されてもよい。

一実施形態において、前記二重鎖ＤＮＡは、植物プロトプラストに前記Ｃｐｆ１及び前記ｃｒＲＮＡの一過性発現のための核酸構築物を導入することによって前記Ｃｐｆ１及びｃｒＲＮＡに曝露される。

一実施形態において、前記ｃｒＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列は、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに作動可能に連結される。

一実施形態において、前記Ｃｐｆ１の一過性発現のための前記構築物は、構成的３５Ｓプロモーターに作動可能に連結されているＣｐｆ１をコードしているヌクレオチド配列を含む。

一実施形態において、工程（ｂ）において二重鎖ＤＮＡは、ポリエチレングリコール媒介トランスフォーメーションを使用して前記Ｃｐｆ１及びｃｒＲＮＡ又はこれらをコードしている核酸構築物を導入することにより前記Ｃｐｆ１及びｃｒＲＮＡに曝露される。

好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１をコードしているヌクレオチド配列は、植物細胞又は植物プロトプラストにおける発現のためにコドン最適化される。

一実施形態において、本明細書に教示される方法は、好ましくは工程（ｂ）を実行する前及び／又は実行する間に、細胞若しくはプロトプラストの細胞周期の期を同期させる工程をさらに含み、好ましくは同期が、細胞若しくはプロトプラストを同期薬剤と接触させることにより実行される。

一実施形態において、細胞期を同期させる工程は、細胞周期のＳ期、Ｍ期、Ｇ１及び／又はＧ２期においてプロトプラストを同期する。

一実施形態において、２つ以上のｃｒＲＮＡが使用される。

一実施形態において、少なくとも１つの標的化改変が二重鎖ＤＮＡに導入され、好ましくは、改変は少なくとも１つの塩基対の挿入、欠失又は修飾を含む。

一実施形態において、改変は、少なくとも１つの塩基対の欠失及び少なくとも１つの塩基対の挿入を含む。

一実施形態において、少なくとも１つの標的化改変は、二対立遺伝子（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ）である。

一実施形態において、本明細書に教示される方法は、植物プロトプラストから植物細胞又は植物を再生する工程をさらに含み、植物細胞、植物又はその植物の後代は、少なくとも１つの標的化改変を含む。

最終的に、本開示は、本明細書に教示される方法によって入手できる植物、植物部分、種子又は植物細胞を教示し、植物、植物部分、種子又は植物細胞は、対照植物、植物部分、種子又は植物細胞と比較して修飾されており、前記対照植物、植物部分、種子又は植物細胞は、少なくとも１つの標的化改変が本明細書に教示される方法によって導入される前の植物、植物部分、種子又は植物細胞である。

定義
本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関して様々な用語が、明細書及び請求項の全体を通じて使用される。そのような用語は、別段の指示がない限り、本発明が属する技術分野における通常の意味を与えられることになる。他の特別に定義された用語は、本明細書に提供される定義と整合した様式で解釈されるべきである。本明細書に記述される類似又は同等の任意の方法及び材料が、本発明の試験の実施に使用され得るが、好ましい材料及び方法については、本明細書に記述される。

単数用語、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な指図がない限り複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ以上の細胞、等の組合せを含む。

用語「及び／又は」とは、記載された事例のうちの１つ若しくは複数が、単独で又は記載された事例の少なくとも１つ、最高で記載された事例の全てと組み合わさって起こり得る状況のことを指す。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的であり、制約がなく、排他的でないものと解釈される。特に、本用語及びその変形は、指定された特徴、工程又は成分が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、工程又は成分の存在を除外すると解釈されるべきでない。

用語「キメラ遺伝子」とは、種において天然に通常見られない任意の遺伝子、特に核酸配列の１つ又は複数の部分が、天然において互いに関係していない遺伝子のことを指す。例えば、プロモーターは、転写される領域の一部若しくは全部又は別の調節性領域と天然において関係していない。用語「キメラ遺伝子」は、プロモーター又は転写調節配列が、１つ若しくは複数のコード配列に作動可能に連結されている発現構築物を含むと理解される。

「コドン最適化した」：この用語は、第１の生物（例えばバクテリア）の核酸のコドンの１つ又は複数を、第２の異なる生物（例えば植物）においてより高頻度に使用されるコドンで置きかえ（複数可）て、第２の生物における（遺伝子）発現に適応させ、最適化することを指す。

「構築物」又は「核酸構築物」又は「ベクター」：これは、組換えＤＮＡ技術を使用した結果得られる人工核酸分子のことを指し、しばしば構築物に含まれるＤＮＡ領域を宿主細胞中で発現させる目的で使用して、宿主細胞に外来性ＤＮＡを送達する。構築物のベクター骨格は、例えば、（キメラ）遺伝子が組み込まれるプラスミドであってもよく、又は適切な転写調節配列（例えば［誘導可能な］プロモーター）がすでに存在する場合、所望の核酸配列（例えばコード配列）だけが、転写調節配列の下流に組み込まれる。ベクターは、分子クローニングにおける使用を助けるために、例えば選択可能なマーカー、多重クローニング部位、等などさらなる遺伝的エレメントを含んでもよい。

「発現」：これは、適当な調節性領域、特にプロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡ領域が、タンパク質又はペプチドに翻訳される能力があるＲＮＡに転写される過程のことを指す。

「植物」：これは、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生され得る植物細胞組織培養、植物カルス、植物凝集塊、及び胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、仁、穂、トウモロコシ穂軸、殻、茎、根、根端、葯、穀物、等など植物又は植物の部分において完全である植物細胞を含む。植物の非限定的な例には、作物、並びにオオムギ、キャベツ、カノーラ、カッサバ、カリフラワー、チコリ、綿、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、アブラナ、ジャガイモ、カボチャ、米、ライ麦、モロコシ、スカッシュ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、アマトウガラシ、トマト（例えばソラヌムリコペルシクム［Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ］）、スイカ、小麦及びズッキーニなどの栽培植物がある。

「配列」又は「核酸配列」：これは、核酸又は核酸中のヌクレオチドの順序のことを指す。換言すれば、核酸中のヌクレオチドの任意の順序は、核酸配列の配列と呼ばれてもよい。同様に、「標的配列」は、標的しようとする、すなわち改変を導入しようとする核酸中のヌクレオチドの順序を意味することになる。本発明の文脈の範囲において、第１の核酸配列は、さらなる核酸配列に含まれても又は重なってもよい。例えば、標的配列は、ＤＮＡ二重鎖の第１の鎖に含まれるヌクレオチドの順序である。

「ガイド配列」は、標的配列にガイドＲＮＡを標的とするためのガイドＲＮＡ（好ましくはｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡである）の区画として本明細書において理解されるべきである。

ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、用語「標的配列」とは、ガイド配列が標的し、例えば相補性を有するように設計される、配列のことを指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むｓｇＲＮＡ（例えばＣａｓ９の場合）又はｔｒａｃｒＲＮＡ配列を欠くｃｒＲＮＡ（例えばＣｐｆ１の場合）でもよい。標的配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドなど任意のポリヌクレオチドを含んでもよく、対象の標的座内に含まれる。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核又は細胞質に位置する。標的配列は、任意のＤＮＡ又はＲＮＡ配列であってもよい。一部の実施形態において、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡ前駆体、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）及び低分子量細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部のさらに好ましい実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ分子又はｍＲＮＡ前駆体分子内の配列であってもよい。

一部の実施形態において、ガイド配列は、長さ約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５若しくはより多い、又はより多いヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイド配列は、長さ約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２未満、又はより少ないヌクレオチドである。ガイド配列は、１０～３０又は１５～２５ヌクレオチド長であることが好ましい。

本明細書では「核酸－標的化複合体」又は「ＣＲＩＳＰＲ複合体」という用語は、標的配列とハイブリダイズし、１つ又は複数のＣｐｆ１タンパク質と複合体形成したガイドＲＮＡの複合体のことを指す。核酸－標的化複合体の形成により、標的配列中若しくは近く（標的配列から例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０個以内、又はより多くの塩基対）にあるＤＮＡ又はＲＮＡ鎖両方の開裂が生じる。本明細書では、用語「対象の標的座と関連する配列（複数可）」とは、標的配列周辺近くの配列のことを指す（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０個以内、又はより多くの塩基対であり、標的配列は、対象の標的座に含まれる）。

（発明の詳細な説明）
第１の態様において、本開示は、植物における二重鎖ＤＮＡの標的化、例えば対象の標的座における、改変方法であって、
二重鎖ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖が標的配列を含み、二重鎖ＤＮＡの第２のＤＮＡ鎖が標的配列に相補的な配列を含み、
（ａ）前記二重鎖ＤＮＡを含む植物細胞又は植物プロトプラストを用意する工程と；
（ｂ）前記プロトプラスト中の前記二重鎖ＤＮＡを
Ｃｐｆ１タンパク質；及び
二重鎖ＤＮＡの部位、例えば、標的配列を含む対象の標的座に前記Ｃｐｆ１を標的とするためのガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）
に曝露する工程とを含む、方法を提供する。

一実施形態において、標的化改変は、二本鎖切断などの鎖切断の導入を含む。

二重鎖ＤＮＡは、対象の標的座に存在してもよい。二重鎖ＤＮＡは、細胞内のＤＮＡ分子に含まれてもよい。細胞は、植物細胞又は植物プロトプラストであってもよい。植物細胞又は植物プロトプラストは、単子葉植物若しくは双子葉植物などの作物又はカッサバ、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、小麦、オート麦若しくは米などの作物若しくは穀物植物のものであってもよい。植物細胞は、藻、木若しくは生産植物、果実又は野菜（例えば、柑橘類の木、例えば、オレンジ、グレープフルーツ若しくはレモンの木などの木；桃若しくはネクタリンの木；リンゴ若しくは西洋ナシの木；アーモンド若しくはクルミ若しくはピスタチオの木などの堅果樹；ナス科の植物；アブラナ属の植物；アキノノゲシ属の植物；ホウレンソウ属の植物；トウガラシ属の植物；ナス属の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、キイチゴ、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココア、等）のものであってもよい。植物細胞は、ソラヌムリコペルシクム植物細胞であることが好ましい。

本発明は、対象の標的座を修飾する方法を提供し、本方法は、前記座にＣｐｆ１タンパク質及び１つ若しくは複数の核酸成分、例えばｃｒＲＮＡを含む天然に存在しない又は操作された組成物を送達する工程を含み、Ｃｐｆ１タンパク質は、１つ又は複数の核酸成分と複合体を形成し、対象の座に前記複合体が結合すると即座にＣｐｆ１タンパク質が対象の標的座の修飾を誘導する。好ましい実施形態において、修飾は二本鎖切断の導入である。

対象の標的座は、対象のゲノム又はエピゲノム座であってもよい。複合体は、多重化された使用のために複数のｃｒＲＮＡで送達されてもよい。複数のＣｐｆ１タンパク質（複数可）が使用されてもよい。異なるＰＡＭ配列を認識する相同分子種又は操作されたＣｐｆ１タンパク質を含めて、任意のＣｐｆ１タンパク質が使用されてもよい。

本発明によると、植物細胞が、部位特異的ヌクレアーゼ、一本鎖オリゴヌクレオチド、及び一部の実施形態においてガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へのＤＮＡ二重鎖の曝露を可能にしさえすれば、任意の型の植物細胞が、本方法に使用されてもよい。しかしながら、好ましい実施形態において、植物細胞は、植物プロトプラストである。当業者は、植物プロトプラストを調製し、増殖させる方法及びプロトコールを知っている、例えばＰｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＩＳＢＮ：９７８－０－１２－４１５９２０－４、Ｒｏｂｅｒｔａ Ｈ．Ｓｍｉｔｈ）を参照のこと。本発明の方法に使用する植物プロトプラストは、植物細胞プロトプラストの生成に使用される一般的な手順（例えばセルラーゼ及びペクチナーゼを使用する）を使用して用意することができる。

植物細胞プロトプラスト系については、例えばトマト、タバコ及びさらに多く（セイヨウアブラナ［Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ］、ダウカスカロタ［Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ］、ラクツカサティバ［Ｌａｃｔｕｃｃａ ｓａｔｉｖａ］、ゼアマイズ［Ｚｅａ ｍａｙｓ］、ニコチアナベンサミアナ［Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ］、ペチュニアハイブリダ［Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ］、ソラヌムツベロスム［Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ］、オリザサティバ［Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ］）について記述されている。本発明は、それだけには限らないが、以下の参照：Ｂａｒｓｂｙら、１９８６年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ５（２）：１０１～１０３頁；Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９２年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１１（１２）：６３２～６３６頁；Ｈｕら、１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ５９：１８９～１９６頁；Ｎｉｅｄｚら、１９８５年、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３９：１９９～２０４頁；Ｐｒｉｏｌｉ及びＳｏｎｄａｈｌ、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：５８９～５９４頁；Ｓ．Ｒｏｅｓｔ及びＧｉｌｉｓｓｅｎ １９８９年、Ａｃｔａ Ｂｏｔ．Ｎｅｅｒｌ．３８（１）：１～２３頁；Ｓｈｅｐａｒｄ及びＴｏｔｔｅｎ、１９７５年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５５：６８９～６９４頁；Ｓｈｅｐａｒｄ及びＴｏｔｔｅｎ、１９７７年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０：３１３～３１６頁のいずれか１つに記述される系を含めた任意のプロトプラスト系に一般に適用でき、上記文献を参照により本明細書に組み込む。

Ｃｐｆ１タンパク質は、当該技術分野で公知の又はまだ発見されていない任意のＣｐｆ１タンパク質であってもよい。一実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、アシダミノコッカス属のＣｐｆ１タンパク質又はアシダミノコッカス属から得られるＣｐｆ１タンパク質であってもよい。前記アシダミノコッカス属Ｃｐｆ１タンパク質又はアシダミノコッカス属から得られる前記タンパク質は、植物における発現のためにコドン最適化されてもよい。当業者は、植物における外来タンパク質のコドン最適化発現の方法によく精通している。

一実施形態において、前記Ｃｐｆ１タンパク質は、図１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は図１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％など少なくとも７０％配列同一性を有するそのバリアントである。

本発明の方法の好ましい実施形態において、二重鎖ＤＮＡは、植物細胞においてＣｐｆ１タンパク質を発現させるための核酸構築物を植物細胞に導入することによりＣｐｆ１タンパク質に曝露される。

本発明の方法は、植物細胞にＣｐｆ１タンパク質を導入する特定の方法に左右されない。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、ポリペプチドとして植物細胞に提供され、ポリペプチドは、植物細胞内部に取り込まれる。

他の実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、植物細胞においてＣｐｆ１タンパク質を発現させるための核酸構築物、すなわちポリヌクレオチドを植物細胞に導入することにより用意される。そのような核酸構築物は、当該技術分野で公知の任意の適切な構築物であってもよく、宿主細胞中で構築物に含まれるＤＮＡ領域（ここではＣｐｆ１遺伝子）を発現させる目的で使用して、宿主細胞に外来性ＤＮＡを送達する。

Ｃｐｆ１タンパク質又は同一のものをコードしている核酸構築物の導入は、植物細胞へのタンパク質若しくは核酸構築物の良好な導入を可能にし、核酸構築物の場合に、導入された核酸の発現をもたらす任意の公知の方法により達成されてもよい。方法には、それだけには限らないが、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション及びリポフェクションなどの方法がある。

ｃｒＲＮＡは、また、任意の適切な方法により植物細胞に導入されてもよい。例えば、ｃｒＲＮＡは、植物細胞に、直接、又は好ましい実施形態において、植物細胞においてｃｒＲＮＡを発現させるための核酸構築物を植物細胞に導入することにより用意されてもよい。

そのような核酸構築物は、当該技術分野で公知の任意の適切な構築物であってもよく、宿主細胞中で構築物に含まれるＤＮＡ領域（ここではｃｒＲＮＡ）を発現させる目的で使用して、宿主細胞に外来性ＤＮＡを送達する。

ｃｒＲＮＡ又は同一のものをコードしている核酸構築物の導入は、植物細胞へのｃｒＲＮＡ若しくは核酸構築物の良好な導入を可能にし、核酸構築物の場合に、導入されたｃｒＲＮＡの発現をもたらす任意の公知の方法により達成されてもよい。方法には、それだけには限らないが、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション及びリポフェクションなどの方法がある。

Ｃｐｆ１タンパク質及びｃｒＲＮＡは、植物細胞においてＣｐｆ１タンパク質及びｃｒＲＮＡ両方を発現させるための核酸構築物を使用して植物細胞に導入されることが好ましい。これらの実施形態において、しかしながら、部位－Ｃｐｆ１タンパク質をコードしている核酸配列及びｃｒＲＮＡをコードしている核酸配列は、異なるプロモーターの制御下にあることが好ましい。

例えば、ｃｒＲＮＡは、好ましくは植物における発現の場合、好ましくはｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えばＵ６及びＨ１）の制御下にあり、すなわちそれに作動可能に連結されてもよく；Ｕ６及びＨ１などのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、これら小さいＲＮＡを発現するために一般的に使用される（例えばＭａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ［２０１４年］３［ｅ１６１］を参照のこと）。

例えば、好ましくは、Ｃｐｆ１タンパク質は、植物における発現の場合、好ましくは３５Ｓプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下であってもよい（例えば、カリフラワーモザイクウイルスから起用した３５Ｓ［ＣａＭＶ；Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０～８１２頁；１９８５年］）。他の適切な構成的プロモーターには、カッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーター及びサトウキビ稈菌状バドゥナウイルス（ＳｃＢＶ）プロモーター（例えば、Ｓａｍａｃら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２００４年８月；１３［４］：３４９～６１頁を参照のこと）があるが、これに限定されない。他の構成的プロモーターには、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター及び国際公開第９９／４３８３８号及び米国特許第６０７２０５０号に開示される他の構成的プロモーター；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９～６３２頁、１９８９年及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５～６８９頁、１９９２年）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１～５８８頁、１９９１年）；ＡＡ６プロモーター（国際公開第２００７／０６９８９４号）；等がある。

核酸構築物は、また、転写終結領域を含んでもよい。転写終結領域が使用される場合、任意の終結領域が、核酸構築物の調製物に使用されてもよい。

好ましい実施形態において、核酸構築物は、一過性発現用である。換言すれば、植物材料における発現は、核酸構築物の非永続的存在ゆえに一時的である。例えば、構築物が宿主ゲノムに組み込まれない場合、発現は一過性であり得る。例えば、Ｃｐｆ１タンパク質及びｃｒＲＮＡは、植物細胞に一過性に提供され、その後一方又は両方の成分の量が低下してもよい。その後、二重鎖ＤＮＡが改変された植物細胞、植物細胞の後代、及び植物細胞を含む若しくは植物プロトプラストから得られる植物は、本発明の方法で使用される成分の一方若しくは両方の減少した量を含み、又は成分の１つ若しくは複数をもはや含有しない。

本方法及び本明細書に開示される好ましい実施形態のいずれかと組み合わせて、核酸構築物は、形質転換された植物における発現を増大させるために最適化されてもよい。

本実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質をコードしている核酸配列が、植物細胞における発現のためにコドン最適化される本発明の方法が提供される。例えば、Ｃｐｆ１タンパク質をコードしている核酸配列は、トマトにおける発現のためにコドン最適化されてもよく、前記トマトは、好ましくはソラヌムリコペルシクムである。

すなわち、Ｃｐｆ１タンパク質をコードしている核酸構築物は、発現を改善するために植物に望ましいコドンを使用して合成され得る。宿主に望ましいコドン使用頻度の考察については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ及びＧｏｗｒｉ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１～１１頁（１９９０年）を参照のこと。植物に望ましい遺伝子を合成するための方法は、当該技術分野で利用可能である（例えばＭｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．［１９８９年］１７：４７７～４９８頁、又はＬａｎｚａら［２０１４年］ＢＭＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：３３～４３頁を参照のこと）。

植物細胞へのＣｐｆ１タンパク質、ｃｒＲＮＡ、並びに／又は該当する場合には、Ｃｐｆ１タンパク質及び／若しくはｃｒＲＮＡをコードしている核酸構築物の導入は、植物細胞へのそれらの良好な導入を可能にし、核酸構築物の場合に、導入されたＣｐｆ１タンパク質及び／若しくはｃｒＲＮＡの発現をもたらす任意の公知の方法により達成されてもよい。方法には、それだけには限らないが、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション及びリポフェクションなどの方法がある。

しかしながら、好ましい実施形態において工程（ｂ）において二重鎖ＤＮＡが、ポリエチレングリコール媒介トランスフォーメーションを使用して植物細胞若しくは植物プロトプラストにＣｐｆ１タンパク質及びｃｒＲＮＡ又はこれらをコードしている核酸構築物を導入することによりＣｐｆ１タンパク質及びｃｒＲＮＡに曝露される本発明の方法が提供される。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、工業生産から医学まで用途の多いポリエーテル化合物である。ＰＥＧは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）又はポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても公知である。ＰＥＧの化学構造は、一般的にＨ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨと表示される。本発明による方法に使用されるＰＥＧは、２００００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を持つオリゴマー及び／若しくはポリマー又はその混合物であることが好ましい。ＰＥＧ媒介遺伝子トランスフォーメーションは、１９８５年以降公知であった。植物プロトプラストトランスフォーメーションの最初の方法は、ＰＥＧを活用した（Ｋｒｅｎｓら［１９８２年］Ｎａｔｕｒｅ ２９６：７２～７４頁；Ｐｏｔｙｒｙｋｕｓら［１９８５年］Ｐｌａｎｔ ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３：１１７～１２８頁；Ｎｅｇｒｕｔｉｕら［１９８７年］Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３６３～３７３頁）。本技術は、多くの異なる植物由来のプロトプラストに適用できる（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら［１９９３年］Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８９：１９９～２０７頁）。ＰＥＧは、二価陽イオンの存在下で植物プロトプラストの表面上へＤＮＡを沈殿させることによりトランスフォーメーションを刺激し、次いでそこからＤＮＡが内部に取り込まれると考えられている（Ｍａａｓ及びＷｅｒｒ［１９８９年］Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．８：１４８～１５１頁）。好ましい実施形態において、４００ｇ／Ｌ ＰＥＧ４０００及び０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ_３）_２を含む溶液が、トランスフォーメーションに使用される。

しかしながら、これまで、植物細胞若しくは植物プロトプラストにＣｐｆ１タンパク質及び／若しくはｃｒＲＮＡ、又はＣｐｆ１タンパク質並びにｃｒＲＮＡの一方若しくは両方をコードしている核酸構築物を導入するための本発明の方法におけるＰＥＧトランスフォーメーションの使用は、提唱されてこなかった。

一実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質発現プラスミドのｃｒＲＮＡ発現プラスミドに対する質量比は、０．５～１０、又は０．７５：５など０．１：２０の範囲、より好ましくは１：３の範囲、さらにより好ましくは、約１：２など１．５：２．５の範囲である。

一実施形態において、少なくとも０．５μｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも５μｇ、又は少なくとも１０μｇなど少なくとも０．１μｇのＣｐｆ１発現プラスミドが、使用される。

一実施形態において、少なくとも０．５μｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも５μｇ、又は少なくとも１０μｇなど少なくとも０．１μｇの前記Ｃｐｆ１発現プラスミドが、明細書に教示される適当な質量範囲でｃｒＲＮＡ発現プラスミドと組み合わせられ、Ｃｐｆ１発現プラスミド及びｃｒＲＮａ発現プラスミドの前記組合せは、１００００～１０００００００個、好ましくは約５００００～５００００００個、より好ましくは約１０００００～１００００００個、例えば約５０００００個の植物細胞又は植物プロトプラストと組み合わせられる。

一実施形態において、植物細胞又は植物プロトプラストは、容積約５００μｌで存在してもよい。一実施形態において、植物細胞／植物プロトプラスト（Ｃｐｆ１タンパク質／ｃｒＲＮＡを含む）と好ましくは４００ｇ／Ｌ ＰＥＧ４０００及び０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ_３）_２を含む溶液であるＰＥＧ溶液の容積比は、１：０．５～１：１．５の範囲、好ましくは約１：１である。

一実施形態において、ＰＥＧトランスフェクションは、１５～４０分間など１０～６０分間の範囲内の期間、好ましくは約２０分間起こさせておいてもよい。

その後、０．２～０．４Ｍ、又は約０．２７５Ｍなど０．１～０．６Ｍ Ｃａ（ＮＯ_３）_２溶液が、上に教示されるトランスフェクション溶液に添加されてもよい。上に教示されるトランスフェクション溶液の約１０倍など約８～１２倍容積が、遠心分離によって回収される前に使用され得ることが好ましい。

別の実施形態によると、本発明に記載の方法が提供され、前記方法は、好ましくは工程（ｂ）を実行する前及び／又は実行する間に、植物細胞の細胞周期を同期させる工程を含み、好ましくは同期が、植物細胞を同期薬剤と接触させることにより実行される。

植物細胞の細胞周期を同期させるこのような方法は、欧州特許第２５１６６５２号に詳述されており、参照により本明細書に組み込む。より具体的には、植物細胞、例えば、植物プロトプラストを同期させる工程は、本発明のある特定の実施形態において二重鎖ＤＮＡにおける改変の導入の有効性をさらに増強するのに有利であり得る。したがって、ある特定の実施形態において、本方法は、植物細胞の細胞周期を同期させる工程を含む。

同期は、工程（ｂ）を実行する前及び／又は実行する間に実行されることが好ましい。同期が工程（ｂ）の前に実行される場合、二重鎖ＤＮＡが、例えば本明細書に定義されるＣｐｆ１タンパク質及び／又はｃｒＲＮＡに曝露されるときに大部分の植物細胞は、同じ期の細胞周期になる。このことは、有利であり、二重鎖ＤＮＡにおける改変の導入の率を増大させ得る。また、植物細胞が工程（ｂ）の間に同期される場合、これは、二重鎖ＤＮＡにおける改変の導入全体を増大させ得る。

植物細胞を同期させることは、任意の適切な手段により達成されてもよい。例えば、細胞周期の同期は、リン酸飢餓、硝酸塩飢餓、イオン飢餓、血清飢餓、スクロース飢餓、オーキシン飢餓などの栄養欠乏により達成されてもよい。同期は、植物細胞に同期薬剤を添加することによっても達成され得る。

アフィジコリン、水酸化尿素、チミジン、コルヒチン、コブトリン、ジニトロアニリン、ベネフィン、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンディメタリン、トリフルラリン、アミプロホスメチル、ブタミホスジチオピル、チアゾピルプロピザミド、テブタムＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、ミモシン、アニソマイシン、αアマニチン、ロバスタチン、ジャスモン酸、アブシジン酸、メナジオン、クリプトゲイン、過酸化水素、過マンガン酸ナトリウム、インドメタシン、エポキソマイシン、ラクタシスチン、ｉｃｒｆ１９３、オロモウシン、ロスコビチン、ボヘミン、スタウロスポリン、Ｋ２５２ａ、オカダ酸、エンドタール、カフェイン、ＭＧ１３２、サイクリン依存的キナーゼ及びサイクリン依存的キナーゼ阻害剤などの同期薬剤、及び同期薬剤の標的メカニズム、量及び濃度並びに同期薬剤と関連する細胞周期の期については、例えば、「Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ」Ｊ．Ｄｏｌｅｚｅｌ ｃ．ｓ．編、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ２００７年 ３２７ｆｆ頁に記述されている。アフィジコリン及び／又は水酸化尿素に優先傾向が存在する。

本発明の方法において、細胞周期を同期させることは、植物細胞を細胞周期のＳ期、Ｍ期、Ｇ１及び／又はＧ２期に同期させることが好ましい。

別の優先傾向によると、本発明の方法において、２つ以上のｃｒＲＮＡが使用される。２つ若しくは複数のｃｒＲＮＡが、ＤＮＡ二重鎖中の同じ部位又は異なる部位に（例えば複数の二本鎖切断を導入するために）Ｃｐｆ１タンパク質を仕向けてもよい。

別の優先傾向によると、本明細書において上ですでに述べた通り、Ｃｐｆ１タンパク質及びｃｒＲＮＡは、植物細胞内で一過性に発現される。

本明細書に教示される本方法により、植物プロトプラスト中の二重鎖ＤＮＡに改変を導入する。標的化改変は、少なくとも１つの塩基対の挿入、欠失又は修飾を含んでもよい。例えば、標的化改変は、少なくとも１つの塩基対の欠失及び少なくとも１つの塩基対の挿入を含んでもよい。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はより多くの塩基対が、本発明の方法により改変されてもよい。複数の修飾は、一回の実験で導入されてもよく、及び／又は実験を繰り返して植物細胞の二重鎖ＤＮＡにその後改変を導入してもよい。

本発明の別の実施形態によると、本方法は、植物又は標的化改変を含む子孫を再生させる工程をさらに含む。当業者は、植物プロトプラストから植物を再生する方法及びプロトコールを承知している。再生された植物の後代、子孫、バリアント及び変異体も、これらの部分が本明細書に教示される方法により導入された標的化改変を含むならば、本発明の範囲に含まれる。

最終的に、本発明の方法によって得られる植物、植物部分、種子又は植物細胞が提供され、対照植物、植物部分、種子又は植物細胞と比較した場合に、植物、植物部分、種子又は植物細胞が、標的化改変を含むことにより修飾されており、対照植物、植物部分、種子又は植物細胞は、標的化改変が本明細書に教示される方法によって導入される前の植物、植物部分、種子又は植物細胞である。

本発明について今、全般的に記述したが、同じことが図解として提供され、本発明を限定することを意図しない以下の例への言及によってより直ちに理解されることになる。

６×Ｈｉｓドメインに下線を引き、ＮＬＳ配列を太字体で示したＣｐｆ１－Ｈｉｓ－ＮＬＳのタンパク質配列、及びＣｐｆ１－Ｈｉｓ－ＮＬＳ ＯＲＦのヌクレオチド配列を示す図である。 実施例の節において使用したｃｒＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの配列を示す図である。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーターの配列に下線を引く。標的遺伝子から得られる配列を太字体で示し、ｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡの残りをイタリック体で示す。 Ｃｐｆ１又はＣａｓ９で処理したトマトプロトプラストに見出される挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）の定量化を示す図である。Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡ１及びＣａｓ９ ｓｇＲＮＡは、同じ標的配列でｉｎｄｅｌを生成し、一方Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡ２は、代わりの位置でｉｎｄｅｌを作出する。対照サンプルは、対応する標的化ＲＮＡを発現するプラスミドなしでＣｐｆ１又はＣａｓ９発現プラスミドだけでトランスフェクトしたプロトプラストから得た。 トマトＰＤＳ１遺伝子においてＣｐｆ１／ｃｒＲＮＡ１ ＰＤＳ１及びＣｐｆ１／ｃｒＲＮＡ２ ＰＤＳ１試薬で生成されたｉｎｄｅｌ突然変異を示す図である。 Ｃｐｆ１タンパク質及びｃｒＲＮＡで処理したプロトプラストから得られたカルスの遺伝子型判定を示す図である。パネルＡ：Ｃｐｆ１タンパク質及びｃｒＲＮＡ１ ＰＤＳ１で処理したプロトプラストから得られたカルスからのＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｈｏＩで次いで消化した。制限酵素ＸｈｏＩは、ＰＣＲ産物の中央で切断し、アガロースゲルで分離されない非常によく似たサイズの消化産物を２つ作製する。パネルＢ：Ｃｐｆ１タンパク質及びｃｒＲＮＡ２ ＰＤＳ１で処理したプロトプラストから得られたカルスからのＰＣＲ産物を、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで次いで消化した。制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ酵素は、ＰＣＲ産物から１００ｂｐの断片を除去する。

実施例１
構築物
バクテリアアシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６由来Ｃｐｆ１ ＯＲＦを、ソラヌムリコペルシクムにおける発現のためにコドン最適化し、ＮＬＳ及び６×Ｈｉｓ配列をＣ末端に付加した（図１）。前記修飾されたＣｐｆ１ ＯＲＦを、ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＤＯＮＲ２２１中に次いで合成した（ｗｗｗ．ｇｅｎｅａｒｔ．ｃｏｍ）。Ｃｐｆ１ ＯＲＦを、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ反応において植物発現ベクターＫ２ＧＷ７で次いで組み換え、Ｃｐｆ１ ＯＲＦが構成的３５Ｓプロモーターを使用して発現されるベクター（ＫＧ９８５８）を得た。

トマトゲノム中の３つの異なる遺伝子、ＰＤＳ１、Ｍｅｔ１及びＳｏｌｙｃ３ｇ０９５３１０へＣｐｆ１タンパク質を標的とすることになる４つのＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を設計した。Ｃｐｆ１及びＣａｓ９の突然変異誘発頻度を比較するために、同じ場所にＣａｓ９タンパク質を標的とすることになるＣａｓ９に対するガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）も設計した。ｃｒＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを、シロイヌナズナ由来Ｕ６ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを使用して発現させた。これらの実験に使用される発現カセットを、図２に示す。

トマトプロトプラスト単離及びトランスフェクション
ソラヌムリコペルシクム品種モネイベルグ（Ｍｏｎｅｙｂｅｒｇ）のｉｎ ｖｉｔｒｏシュート培養を、高いプラスチックジャー内の０．８％寒天を含むＭＳ２０培地上で、２０００ルクスで１６／８時間光周期、２５℃及び相対湿度６０～７０％で維持した。若葉（１ｇ）を、主脈に垂直に穏やかに切って、酵素混合物の浸透を容易にした。切った葉を、酵素混合物（ＣＰＷ９Ｍ中の２％セルラーゼオノズカＲＳ、０．４％マセロザイムオノズカＲ１０）へ移し、細胞壁消化を、暗所で、２５℃で終夜進行させておいた。プロトプラストを、５０μｍナイロンシーブを通して濾過し、遠心分離８００ｒｐｍ、５分間によって回収した。プロトプラストを、ＣＰＷ９Ｍ（Ｆｒｅａｒｓｏｎ、１９７３年）培地に再懸濁し、ＣＰＷ１８Ｓ（Ｆｒｅａｒｓｏｎ、１９７３年）３ｍＬを、長首ガラスパスツールピペットを使用して各管の底部に添加した。生プロトプラストを、スクロースとＣＰＷ９Ｍ培地との界面にある細胞画分として、遠心分離８００ｒｐｍ、１０分間によって回収した。プロトプラストを計数し、最終密度１ｍＬ当たり１０^６個でＭａＭｇ培地（Ｎｅｇｒｕｔｉｕ、１９８７年）に再懸濁した。

プロトプラストトランスフェクションのために、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１発現プラスミド１０μｇ及びｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ発現プラスミド２０μｇを、プロトプラスト懸濁液５００μＬ（プロトプラスト５０００００個）と混合し、ＰＥＧ溶液（４００ｇ／ｌポリ［エチレングリコール］４０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ＃８１２４０；０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ_３）_２）５００μＬを次いで添加し、トランスフェクションを室温で２０分間起こさせた。次いで、０．２７５Ｍ Ｃａ（ＮＯ_３）_２溶液１０ｍＬを添加し、完全に、しかし穏やかに混合した。プロトプラストを、遠心分離８００ｒｐｍ、５分間により回収し、１ｍｌ当たり０．５×１０^６個の密度で９Ｍ培養培地に再懸濁し、直径４ｃｍのペトリ皿へ移し、２％アルギン酸溶液（２０ｇ／ｌアルギン酸ナトリウム［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ０６８２］、０．１４ｇ／ｌ ＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、９０ｇ／ｌマンニトール）等容積を添加した。次いで、１ｍｌアリコート（トランスフェクトしたプロトプラスト１２５０００個）を、Ｃａ寒天プレート（７２．５ｇ／ｌマンニトール、７．３５ｇ／ｌ ＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、８ｇ／ｌ寒天、ｐＨ５．８）上に広げ、１時間重合させておいた。プロトプラスト培養のために、埋め込まれたプロトプラストを、Ｋ８ｐ（Ｋａｏ、１９７５年）培養培地４ｍｌを含有する４ｃｍ組織培養皿中で生長させた。トマトプロトプラスト中のｉｎｄｅｌを検出するために、４８時間後に、トランスフェクトしたプロトプラストの円板を皿から取り出し、（緩衝液に）アルギン酸を溶解し、プロトプラストを単離した。カルスを再生するために、プロトプラストを、Ｋ８ｐ培地中で、暗所で、２８℃で２１日間インキュベートした。２１日後に、トランスフェクトしたプロトプラストの円板を、１ｍｇ．ｌ^－１ゼアチン及び０．２ｍｇ．ｌ^－１ ＧＡ３で補充した固体ＧＭ培地（Ｔａｎ、１９８７年）へ移し、さらに３週間生長させ、生長させた時点でカルスは、サイズおよそ０．３ｍｍであった。アルギン酸を次いで溶解し、カルスをＧＭ培地の新しいプレート上に広げ、およそ１．５ｍｍになるまで生長させておき、生長させた時点でそれを新しい培地へ再び移し、さらなる１４日間後に次いで遺伝子型判定した。

プロトプラスト及びカルスを遺伝子型判定する
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミド又はＣｐｆ１／ｃｒＲＮＡプラスミドでトランスフェクトしたトマトプロトプラストを４８時間培養し、アルギン酸溶解し、遠心分離によって採集した。全ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して各サンプルから次いで単離した。単離したｇＤＮＡをＰＣＲ反応に次いで使用して、標的部位を増幅した。以下のプライマーを使用して、異なる標的部位を増幅した：ＳｌＰＤＳ１、５’－ＴＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴ－３’及び５’－ＴＴＴＡＧＴＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＧＡ－３’；Ｓｏｌｙｃｌ３ｇ０９５３１０、５’－ＡＴＧＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＧＡＡＡＧ－３’及び５’－ＡＧＧＧＴＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＧＧ－３’；ＳｌＭＥＴ１、５’－ＧＧＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＣＧＣＡ－３’及び５’－ＴＡＴＧＡＡＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＴ－３’。これらを次いで使用して、固有の５ｂｐタグを使用して同定される各サンプルで、ＭｉＳｅｑ配列決定装置で次いで配列決定されるライブラリを生成した。配列決定後、各サンプルのリードを加工して、各サンプルに存在するｉｎｄｅｌの数及び型を同定した。

カルスを、ダイレクトＰＣＲキット（Ｐｈｉｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び上記の遺伝子特異的プライマーを使用して直接遺伝子型判定した。得られたＰＣＲ産物を次いで配列決定して、どのカルスが意図した標的部位にＩＮＤＥＬ突然変異を含有するか同定した。これらを、２ｍｇ．ｌ^－１ゼアチン及び０．１ｍｇ．ｌ^－１ ＩＡＡ培地で補充したＭＳ培地へ次いで移し、その後再生したトマト苗木を、温室へ移動させる前に０．５ｍｇ．ｌ^－１ ＩＢＡで補充したＭＳ培地上で根付かせた。

結果
トマトプロトプラストにおいてＣｐｆ１タンパク質及びそのｃｒＲＮＡを異所的に発現させることにより、Ｃｐｆ１がゲノム植物細胞にＩＮＤＥＬ突然変異を生成する能力を試験した。最初に、トマトにおけるコドン使用頻度に対して最適化したＣｐｆ１ ＯＲＦを、Ｃ末端に融合した核局在化シグナル（ＮＬＳ）と共に構築した。これを、植物細胞内で発現させるために構成的ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの後に次いでクローニングした。クローニングしたベクターを、シロイヌナズナＵ６プロモーターによって駆動されるｃｒＲＮＡを発現するプラスミドと一緒に、精製したトマト葉プロトプラストに次いで導入した。そのような系において、Ｃｐｆ１ ｍＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは、短時間、２４～４８時間、高レベルで発現されることになり、発現の時点で導入されたプラスミドは、細胞のヌクレアーゼによって分解されることになり、Ｃｐｆ１試薬は、細胞から消滅することになる。Ｃｐｆ１ ｍＲＮＡ及びｃｒＲＮＡが存在する間はずっと、Ｃｐｆ１ ｍＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは、ＩＮＤＥＬ突然変異を作出するゲノム中の特異的標的部位を発見できる。導入したプラスミドは、まれにしかゲノムに組み込まれず、そのため、本手法によってトランスジェニック株は得られない。プロトプラストを、次いで４８時間培養し、次いで破壊し、標的部位におけるＩＮＤＥＬの存在について遺伝子型判定した。

Ｃｐｆ１タンパク質は、ＳｌＰＤＳ１遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡのいずれかと一緒に発現させると、トマトプロトプラストにおいて高効率でＩＮＤＥＬ突然変異を作製できることを見出した（図３）。各トランスフェクションを３つ組で実行し、サンプルを別々に配列決定して、異なる生体サンプルにおけるＣｐｆ１の効果を試験した。ｃｒＲＮＡ２ ＰＤＳ１を使用した場合、リードの３０．７％が標的部位にＩＮＤＥＬを含有した。それに対し、ｃｒＲＮＡ１ ＰＤＳ１の場合、配列リードのおよそ６．５％が、ＩＮＤＥＬを含有した。この結果は、Ｃｐｆ１タンパク質が、植物細胞においてＩＮＤＥＬを生成するのに非常に効果的であり、生成効率が、標的配列によって変動することを実証するものである。ｓｇＲＮＡ ＰＤＳ１は、ｃｒＲＮＡ ＰＤＳ１と同じ配列を標的とするので、これにより、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１タンパク質のいずれかを使用する場合に得られる突然変異効率の間で直接比較を行うことが可能になり、その結果植物細胞においてどちらがよりよく作用するか判断することができる。ＳｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＰＤＳ１サンプルから生成される配列リードにおいて、１０％がＩＮＤＥＬを含有した。これは、ｃｒＲＮＡ１ ＰＤＳ１を使用して得られる効率と有意差がなく、そのためトランスフェクション４８時間後に両方のＣＲＩＳＰＲタンパク質が、同程度の頻度で突然変異を生成したと結論できる。

Ｃｐｆ１を使用して生長及び収量特質が改善された新規の植物を作製する場合、標的配列にＩＮＤＥＬを保有する植物を変異したプロトプラストから再生できることを実証することが重要である。したがって、上記のトマトプロトプラストトランスフェクションを繰り返したが、この場合、生長培地中に細胞を維持して、プロトプラストがサンプル採取し、遺伝子型判定できるほど十分に大きなカルスを形成するまで細胞分裂を促進させた。ＰＤＳ１遺伝子中の標的部位を増幅するように設計されたプライマーと共に直接ＰＣＲ反応の鋳型として使用される少量の組織を取り出すことにより、個々のカルスのそれぞれをサンプル採取した。Ｃｐｆ１標的部位は両方とも、ＩＮＤＥＬが作出されたときに失われる制限部位（ｃｒＲＮＡ１ ＰＤＳ１に対してＸｈｏＩ及びｃｒＲＮＡ２ ＰＤＳ１に対してＳａｕ３ＡＩ）を含有する（図３及び図４）。したがって、適当な制限酵素でＰＤＳ１ ＰＣＲ産物を消化し、アガロースゲル上でこれらを分析することにより、ＩＮＤＥＬを含有するカルスを容易に同定することができる。ＩＮＤＥＬ突然変異を含有するカルスは、制限酵素消化に耐性のあるＰＣＲ産物を生じ、このようにして変異体を容易に定量化することができた。ｃｒＲＮＡ１ ＰＤＳ１標的において、３２％のカルスがＩＮＤＥＬを含有し（図５）、配列決定手法を使用して推定されるよりおよそ５倍高いことを見出した。また、ｃｒＲＮＡ２ ＰＤＳ１標的を分析した場合、予想されるより多くの変異体カルスを見出した（図５）。この場合、５７％のカルスが標的にＩＮＤＥＬを含有した。したがって、Ｃｐｆ１タンパク質及びそのｃｒＲＮＡの一過性発現はプロトプラストの生長に負の影響を及ぼさず、変異体プロトプラストは再生して変異体カルスを形成できると結論することができた。カルスにおける突然変異誘発効率が、配列決定結果に基づいて予想した効率より２～５倍高かった点に注意することは非常に興味深い。ＳｐＣａｓ９をトマトプロトプラストにおける突然変異誘発に使用する場合、このことは観察されず、プロトプラストとカルスの効率の間に有意差は全く見られない。このことに対する１つの説明は、Ｃｐｆ１タンパク質及び／又はそのｃＲＮＡが、ＳｐＣａｓ９及び／又はそのｓｇＲＮＡと比較して植物プロトプラスト中でより安定であるということであり得る。この結果、Ｃｐｆ１タンパク質及びｃｒＲＮＡは、植物細胞中でより長期間活性があることになり、したがって突然変異を誘導する可能性がより高いことになる。

標的部位に二対立遺伝子突然変異を含有するカルスの数を定量化することもできた。再生植物は、ヌル対立遺伝子の場合通常直ちにホモ接合性であり、分析され得る前に自家受粉の世代を経る必要がないので、二対立遺伝子変異体を得ることは有利であり得る。突然変異をホモ接合性にできない場合、このことは、栄養生長的に再生される作物種において特別に有益なものである。３５Ｓ：：Ｃｐｆ１及びｃｒＲＮＡ１ ＰＤＳ１ベクターでトランスフェクトしたプロトプラストから得られるカルスは、ＳｐＣａｓ９を使用してこれまでに見られた二対立遺伝子突然変異と同程度の頻度で二対立遺伝子突然変異を示した（４／３１個の変異体カルスが、二対立遺伝子突然変異を含有した、１２％）。しかしながら、３５Ｓ：：Ｃｐｆ１及びｃｒＲＮＡ２ ＰＤＳ１ベクターでトランスフェクトしたプロトプラストから得られるカルスにおいては非常に高いパーセンテージの二対立遺伝子突然変異が見られた（５８／１１１個の変異体カルスが、二対立遺伝子突然変異を含有した、５２％）。これらの結果は、Ｃｐｆ１が、植物細胞における突然変異誘発についてＳｐＣａｓ９より有意に優れていることを実証するものである。そのような高レベルの二対立遺伝子突然変異形成は、植物細胞においてこれまで報告されておらず、また倍数性作物種の突然変異誘発の著しい進展を表す。変異体カルスを、シュートを再生するまで生長培地上で維持した。これらを次いで遺伝子型判定して、カルスに存在する突然変異が再生されたシュートにも存在することを確認した。カルスに元々存在した突然変異と同じ突然変異がシュートに常に見られた。したがって、Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、変異体植物を作製し得ることを示すことができた。

Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ系が、トマトゲノム内の他の座で突然変異を生成できるかどうか試験するために、ＳｌＭＥＴ１及びＳｏｌｙｃ３ｇ０９５３１０座の標的部位で追加の類似の実験を実行した。ＳｌＭＥＴ１及びＳｏｌｙｃ３ｇ０９５３１０座の両方について、Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ系が、ＳｐＣａｓ９より有意に高い突然変異誘発頻度を与えることを発見した。Ｃｐｆ１を使用する突然変異誘発頻度は、ＳｐＣａｓ９が使用される場合より少なくとも２倍高かった。したがって、Ｃｐｆ１タンパク質は、より高い突然変異誘発効率のため、より多くの遺伝子コピーにＩＮＤＥＬを導入できることになり、結果的に、倍数種のプロトプラストにおいて収量及び栄養価を改善した植物を作製する際にＳｐＣａｓ９より適当になると結論される。

Claims (17)

1. 植物における二重鎖ＤＮＡの標的化改変の方法であって、前記二重鎖ＤＮＡの第１のＤＮＡ鎖が標的配列を含み、前記二重鎖ＤＮＡの第２のＤＮＡ鎖が前記標的配列に相補的な配列を含み、
   （ａ）前記二重鎖ＤＮＡを含む植物プロトプラストを用意する工程と；
   （ｂ）前記プロトプラスト中の前記二重鎖ＤＮＡを
   Ｃｐｆ１タンパク質；及び
   前記標的配列を含む前記二重鎖ＤＮＡの部位を前記Ｃｐｆ１タンパク質が標的とするためのガイド配列を含むｃｒＲＮＡ
   に曝露する工程であって、ポリエチレングリコール媒介トランスフォーメーションを使用して、前記植物プロトプラストに、前記Ｃｐｆ１、前記ｃｒＲＮＡ、前記Ｃｐｆ１をコードしている前記Ｃｐｆ１の一過性発現のための核酸構築物、前記ｃｒＲＮＡをコードしている前記ｃｒＲＮＡの一過性発現のための核酸構築物、及び／又は、前記Ｃｐｆ１及び前記ｃｒＲＮＡをコードしている前記Ｃｐｆ１及び前記ｃｒＲＮＡの一過性発現のための核酸構築物を、導入することによって曝露する工程と、を含む方法。
2. 前記二重鎖ＤＮＡが、前記植物プロトプラストに前記Ｃｐｆ１の一過性発現のための核酸構築物を導入することによって前記Ｃｐｆ１に曝露される、請求項１に記載の方法。
3. 前記二重鎖ＤＮＡが、前記植物プロトプラストに前記ｃｒＲＮＡの一過性発現のための核酸構築物を導入することによって前記ｃｒＲＮＡに曝露される、請求項１に記載の方法。
4. 前記二重鎖ＤＮＡが、前記植物プロトプラストに前記Ｃｐｆ１及び前記ｃｒＲＮＡの一過性発現のための核酸構築物を導入することによって前記Ｃｐｆ１及びｃｒＲＮＡに曝露される、請求項１に記載の方法。
5. ｃｒＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子が、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに作動可能に連結される、請求項３又は４に記載の方法。
6. 前記Ｃｐｆ１をコードしている一過性発現のための前記構築物が、構成的３５Ｓプロモーターに作動可能に連結されているＣｐｆ１をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、請求項２又は４に記載の方法。
7. Ｃｐｆ１をコードしているヌクレオチド配列が、前記植物プロトプラストにおける発現のためにコドン最適化される、請求項２又は４に記載の方法。
8. 前記プロトプラストの細胞周期を同期させる工程をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 工程（ｂ）を実行する前及び／又は実行する間に、前記プロトプラストの細胞周期が同期される、請求項８に記載の方法。
10. 同期が、前記プロトプラストを同期薬剤と接触させることにより実行される、請求項８又は９に記載の方法。
11. 細胞周期を同期させる前記工程が、前記細胞周期のＳ期、Ｍ期、Ｇ１及び／又はＧ２期において前記プロトプラストを同期させる工程である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ２つ以上のｃｒＲＮＡが使用される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 少なくとも１つの標的化改変が、前記二重鎖ＤＮＡに導入される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記改変が少なくとも１つの塩基対の挿入、欠失又は修飾を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記改変が、少なくとも１つの塩基対の欠失及び少なくとも１つの塩基対の挿入を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 少なくとも１つの標的化改変が、二対立遺伝子である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 少なくとも１つの標的化改変を含むプロトプラストから植物細胞又は植物を再生する工程をさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
    

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