JP7127942B2 - 二重鎖dnaの標的化改変の方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ゲノム又は遺伝子編集ツールの分野に関する。
生細胞の遺伝物質に改変を意図的に作出する過程は、生細胞、又は生細胞が部分を形成する若しくは再生できる生物の遺伝的にコードされている生物学的特性を1つ若しくは複数修飾するという目標を一般に有する。これらの変更は、遺伝物質の部分の欠失、外来性遺伝物質の付加又は遺伝物質の既存のヌクレオチド配列の変更という形をとり得る。
第1の態様において、本開示は、植物における二重鎖DNAの標的化改変の方法であって、二重鎖DNAの第1のDNA鎖が標的配列を含み、二重鎖DNAの第2のDNA鎖が標的配列に相補的な配列を含み、
(a)前記二重鎖DNAを含む植物細胞又は植物プロトプラストを用意する工程と;
(b)前記細胞又はプロトプラスト中の前記二重鎖DNAを:
Cpf1タンパク質;及び
標的配列を含む二重鎖DNAの部位に前記Cpf1タンパク質を標的とするためのガイド配列を含むcrRNA
に曝露する工程とを含む方法を提供する。
本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関して様々な用語が、明細書及び請求項の全体を通じて使用される。そのような用語は、別段の指示がない限り、本発明が属する技術分野における通常の意味を与えられることになる。他の特別に定義された用語は、本明細書に提供される定義と整合した様式で解釈されるべきである。本明細書に記述される類似又は同等の任意の方法及び材料が、本発明の試験の実施に使用され得るが、好ましい材料及び方法については、本明細書に記述される。
第1の態様において、本開示は、植物における二重鎖DNAの標的化、例えば対象の標的座における、改変方法であって、
二重鎖DNAの第1のDNA鎖が標的配列を含み、二重鎖DNAの第2のDNA鎖が標的配列に相補的な配列を含み、
(a)前記二重鎖DNAを含む植物細胞又は植物プロトプラストを用意する工程と;
(b)前記プロトプラスト中の前記二重鎖DNAを
Cpf1タンパク質;及び
二重鎖DNAの部位、例えば、標的配列を含む対象の標的座に前記Cpf1を標的とするためのガイド配列を含むガイドRNA(crRNA)
に曝露する工程とを含む、方法を提供する。
構築物
バクテリアアシダミノコッカス種BV3L6由来Cpf1 ORFを、ソラヌムリコペルシクムにおける発現のためにコドン最適化し、NLS及び6×His配列をC末端に付加した(図1)。前記修飾されたCpf1 ORFを、GatewayエントリーベクターpDONR221中に次いで合成した(www.geneart.com)。Cpf1 ORFを、Gateway LR反応において植物発現ベクターK2GW7で次いで組み換え、Cpf1 ORFが構成的35Sプロモーターを使用して発現されるベクター(KG9858)を得た。
ソラヌムリコペルシクム品種モネイベルグ(Moneyberg)のin vitroシュート培養を、高いプラスチックジャー内の0.8%寒天を含むMS20培地上で、2000ルクスで16/8時間光周期、25℃及び相対湿度60~70%で維持した。若葉(1g)を、主脈に垂直に穏やかに切って、酵素混合物の浸透を容易にした。切った葉を、酵素混合物(CPW9M中の2%セルラーゼオノズカRS、0.4%マセロザイムオノズカR10)へ移し、細胞壁消化を、暗所で、25℃で終夜進行させておいた。プロトプラストを、50μmナイロンシーブを通して濾過し、遠心分離800rpm、5分間によって回収した。プロトプラストを、CPW9M(Frearson、1973年)培地に再懸濁し、CPW18S(Frearson、1973年)3mLを、長首ガラスパスツールピペットを使用して各管の底部に添加した。生プロトプラストを、スクロースとCPW9M培地との界面にある細胞画分として、遠心分離800rpm、10分間によって回収した。プロトプラストを計数し、最終密度1mL当たり106個でMaMg培地(Negrutiu、1987年)に再懸濁した。
Cas9/sgRNAプラスミド又はCpf1/crRNAプラスミドでトランスフェクトしたトマトプロトプラストを48時間培養し、アルギン酸溶解し、遠心分離によって採集した。全ゲノムDNA(gDNA)を、DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)を使用して各サンプルから次いで単離した。単離したgDNAをPCR反応に次いで使用して、標的部位を増幅した。以下のプライマーを使用して、異なる標的部位を増幅した:SlPDS1、5’-TGTGCAGAACCACTCCCT-3’及び5’-TTTAGTTGGGCGCGGAGA-3’;Solycl3g095310、5’-ATGGGAAGCGGTGAAAGAAAG-3’及び5’-AGGGTCACGATGAAGAGTTGG-3’;SlMET1、5’-GGACACAAAAAGAACAAACGCA-3’及び5’-TATGAACCCGCCCTGAGT-3’。これらを次いで使用して、固有の5bpタグを使用して同定される各サンプルで、MiSeq配列決定装置で次いで配列決定されるライブラリを生成した。配列決定後、各サンプルのリードを加工して、各サンプルに存在するindelの数及び型を同定した。
トマトプロトプラストにおいてCpf1タンパク質及びそのcrRNAを異所的に発現させることにより、Cpf1がゲノム植物細胞にINDEL突然変異を生成する能力を試験した。最初に、トマトにおけるコドン使用頻度に対して最適化したCpf1 ORFを、C末端に融合した核局在化シグナル(NLS)と共に構築した。これを、植物細胞内で発現させるために構成的CaMV35Sプロモーターの後に次いでクローニングした。クローニングしたベクターを、シロイヌナズナU6プロモーターによって駆動されるcrRNAを発現するプラスミドと一緒に、精製したトマト葉プロトプラストに次いで導入した。そのような系において、Cpf1 mRNA及びcrRNAは、短時間、24~48時間、高レベルで発現されることになり、発現の時点で導入されたプラスミドは、細胞のヌクレアーゼによって分解されることになり、Cpf1試薬は、細胞から消滅することになる。Cpf1 mRNA及びcrRNAが存在する間はずっと、Cpf1 mRNA及びcrRNAは、INDEL突然変異を作出するゲノム中の特異的標的部位を発見できる。導入したプラスミドは、まれにしかゲノムに組み込まれず、そのため、本手法によってトランスジェニック株は得られない。プロトプラストを、次いで48時間培養し、次いで破壊し、標的部位におけるINDELの存在について遺伝子型判定した。
Claims (17)
- 植物における二重鎖DNAの標的化改変の方法であって、前記二重鎖DNAの第1のDNA鎖が標的配列を含み、前記二重鎖DNAの第2のDNA鎖が前記標的配列に相補的な配列を含み、
(a)前記二重鎖DNAを含む植物プロトプラストを用意する工程と;
(b)前記プロトプラスト中の前記二重鎖DNAを
Cpf1タンパク質;及び
前記標的配列を含む前記二重鎖DNAの部位を前記Cpf1タンパク質が標的とするためのガイド配列を含むcrRNA
に曝露する工程であって、ポリエチレングリコール媒介トランスフォーメーションを使用して、前記植物プロトプラストに、前記Cpf1、前記crRNA、前記Cpf1をコードしている前記Cpf1の一過性発現のための核酸構築物、前記crRNAをコードしている前記crRNAの一過性発現のための核酸構築物、及び/又は、前記Cpf1及び前記crRNAをコードしている前記Cpf1及び前記crRNAの一過性発現のための核酸構築物を、導入することによって曝露する工程と、を含む方法。 - 前記二重鎖DNAが、前記植物プロトプラストに前記Cpf1の一過性発現のための核酸構築物を導入することによって前記Cpf1に曝露される、請求項1に記載の方法。
- 前記二重鎖DNAが、前記植物プロトプラストに前記crRNAの一過性発現のための核酸構築物を導入することによって前記crRNAに曝露される、請求項1に記載の方法。
- 前記二重鎖DNAが、前記植物プロトプラストに前記Cpf1及び前記crRNAの一過性発現のための核酸構築物を導入することによって前記Cpf1及びcrRNAに曝露される、請求項1に記載の方法。
- crRNAをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子が、pol IIIプロモーターに作動可能に連結される、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記Cpf1をコードしている一過性発現のための前記構築物が、構成的35Sプロモーターに作動可能に連結されているCpf1をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、請求項2又は4に記載の方法。
- Cpf1をコードしているヌクレオチド配列が、前記植物プロトプラストにおける発現のためにコドン最適化される、請求項2又は4に記載の方法。
- 前記プロトプラストの細胞周期を同期させる工程をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)を実行する前及び/又は実行する間に、前記プロトプラストの細胞周期が同期される、請求項8に記載の方法。
- 同期が、前記プロトプラストを同期薬剤と接触させることにより実行される、請求項8又は9に記載の方法。
- 細胞周期を同期させる前記工程が、前記細胞周期のS期、M期、G1及び/又はG2期において前記プロトプラストを同期させる工程である、請求項8~10のいずれか一項に記載の方法。
- 2つ以上のcrRNAが使用される、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの標的化改変が、前記二重鎖DNAに導入される、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変が少なくとも1つの塩基対の挿入、欠失又は修飾を含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変が、少なくとも1つの塩基対の欠失及び少なくとも1つの塩基対の挿入を含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの標的化改変が、二対立遺伝子である、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの標的化改変を含むプロトプラストから植物細胞又は植物を再生する工程をさらに含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
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