JP2009523418A

JP2009523418A - Ｅｐｓｐｓ変異体

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Publication number: JP2009523418A
Application number: JP2008550371A
Authority: JP
Inventors: ゴカル，グレッグ，エフ．ダブリュ．
Original assignee: サイバス，エルエルシー
Priority date: 2006-01-12
Filing date: 2007-01-10
Publication date: 2009-06-25
Also published as: WO2007084294A3; NZ570009A; AU2007207813A8; EP2465341B1; US8268622B2; AU2007207813A1; WO2007084294A2; SI2465340T1; ES2532112T3; EP2923563A2; DK2465340T3; CA2636771A1; CA2923605A1; EP2465340B1; PL2465340T3; RU2008133046A; EP1978799A2; CA3077776A1; UA99594C2; US20090307802A1

Abstract

本発明は、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤、例えばグリホサートに対し抵抗性又は耐性の、ノントランスジェニック植物の製造に関する。本発明はまた、リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基の、植物のクロモソーム又はエピソームの配列における所望の変異を５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子内に作成するための使用にも関連する。野生型タンパク質の触媒活性を実質的に維持している変異タンパク質は、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対する、植物の増大された抵抗性又は耐性を可能にし、かつ、除草剤の存否にかかわらず、植物、その器官、組織、又は細胞の、野生型植物に比較して実質的に正常な成長又は発生を可能にする。さらに本発明は、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を含有する変異大腸菌細胞に関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、すべての図、表、又は図面を含め、２００６年１月１２日出願の米国仮出願番号６０／７５８，４３９の利益を享受し、その全体を参考として本明細書に含むものとする。

本発明は、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤、例えばグリホサートに対し抵抗性又は耐性の、ノントランスジェニック植物の製造に関する。本発明はまた、リコンビナジェニック（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｇｅｎｉｃ）オリゴ核酸塩基の、植物のクロモソーム又はエピソームの配列における所望の変異を５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子内に作成するための使用にも関連する。野生型タンパク質の触媒活性を実質的に維持している変異タンパク質は、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対する、植物の増大された抵抗性又は耐性を可能にし、かつ、除草剤の存否にかかわらず、植物、その器官、組織、又は細胞の、野生型植物に比較して実質的に正常な成長又は発生を可能にする。本発明はまた、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する大腸菌、そのＥＰＳＰＳ遺伝子が変異しているノントランスジェニック植物細胞、それらから再生されたノントランスジェニック植物、並びに、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する再生ノントランスジェニック植物を交雑の一方の親として用いた交雑から、結果として生じる植物にも関係する。本発明の変異ＥＰＳＰＳタンパク質は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＥＰＳＰＳタンパク質（ＮＭ１３００９３）のアミノ酸位置１５９、１７８、１８２、１９３、２４４、２７３、及び／又は４５４か、或いはＥＰＳＰＳパラログ内の類似アミノ酸残基において変化されている。

ホスホノメチルグリシン除草剤
除草剤耐性植物は、耕作地に雑草を制御する必要を低減し、それにより土壌侵食を効率的に低減しうる。これに関する多くの研究の対象である１つの除草剤は、Ｎ−ホスホノメチルグリシンであり、一般にはグリホサートと呼ばれる。グリホサートは、アミノ酸、ホルモン、及びビタミンを含む芳香族化合物の生合成をもたらすシキミ酸経路を阻害する。特に、グリホサートは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）と３−ホスホシキミ酸との５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸への転換を、酵素５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（以降、ＥＰＳＰ合成酵素又はＥＰＳＰＳと呼ばれる）を阻害することにより抑制する。本発明では、用語「グリホサート」は、任意の除草剤として有効な形状のＮ−ホスホノメチルグリシン（その任意の塩を含む）、植物においてグリホサートアニオンを産生する結果となる他の形状、及びホスホノメチルグリシンファミリーの任意の他の除草剤を包含する。

グリホサートに対する植物の耐性は、ＥＰＳＰＳアミノ酸コーディング配列中に改変をもつ変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を、植物のゲノム中に導入することにより増大可能である。グリホサート耐性を誘導するためのＥＰＳＰＳ遺伝子中の変異のいくつかの例は、以下の特許に記載されている：米国特許第５，３１０，６６７号；米国特許第５，８６６，７７５号；米国特許第５，３１２，９１０号；米国特許第５，１４５，７８３号。提案されたこれらの変異は、典型的には、グリホサートに対し、野生型ＥＰＳＰＳ酵素よりも高いＫ₁を有しており、このことはグリホサート耐性の表現形を与えるが、これらの変異体はまた、ＰＥＰに対する高いＫ_mによっても特徴づけられ、これが該酵素を動力学的に効率の低いものにする（キショア（Ｋｉｓｈｏｒｅ）ら著、「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」、１９９８年、第５７巻、ｐ．６２７−６６３；シュルツ（Ｓｃｈｕｌｚ）ら著、「アーカイブズ・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」、１９８４年、第１３７巻、ｐ．１２１−１２３；ソスト（Ｓｏｓｔ）ら著、「フェブス・レターズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．）」、１９８４年、第１７３巻、ｐ．２３８−２４１；キショア（Ｋｉｓｈｏｒｅ）ら著、「フェデレーション・プロシーディングズ（Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．）」、１９８６年、第４５巻、ｐ．１５０６；ソスト（Ｓｏｓｔ）及びアムルハイン（Ａｍｒｈｅｉｎ）著、「アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）」、１９９０年、第２８２巻、ｐ．４３３−４３６）。ＥＰＳＰＳ遺伝子の多くの変異は、除草剤に抵抗性のＥＰＳＰＳ酵素を産生するよう選択されているが、残念ながら、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子により産生されるＥＰＳＰＳ酵素は、野生型ＥＰＳＰＳに比較して有意に低い酵素活性を有している。例えば、大腸菌からの野生型ＥＰＳＰＳの、ＰＥＰに対する見かけのＫ_m及びグリホサートに対する見かけのＫ₁は、それぞれ１０μＭ及び０．５μＭであるのに対し、位置９６のグリシンに対しアラニンの単一アミノ酸置換を有するグリホサート耐性分離株では、これらの値はそれぞれ２２０μＭ及び４．０ｍＭである。数多くのグリホサート耐性ＥＰＳＰＳ遺伝子が、変異誘発により構築されてきた。再度、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳは、ＰＥＰに対するＫ_mの増大と、野生型植物酵素のＶ_maxのわずかな低減とによって示されるような、低い触媒効率（Ｖ_max／Ｋ_m）を有していた（キショア（Ｋｉｓｈｏｒｅ）ら著、「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー」、１９９８年、第５７巻、ｐ．６２７−６６３）。

変異酵素の反応動力学定数は、ＰＥＰについて低下していることから、グリホサートの存在下に植物において正常な触媒活性を維持するためには、４０−８０倍の高レベルの変異酵素の過剰産生が必要となることが提案されてきた（キショア（Ｋｉｓｈｏｒｅ）ら著、「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー」、１９８８年、第５７巻、ｐ．６２７−６６３）。グリホサート耐性植物は、細胞の葉緑体において高レベルのＥＰＳＰ合成酵素を産生する能力を、植物のゲノム内へ挿入することにより製造可能であることが示されており（シャー（Ｓｈａｈ）ら著、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８６年、第２３３巻、ｐ．４７８−４８１）、その酵素は、好ましくはグリホサート耐性である（キショア（Ｋｉｓｈｏｒｅ）ら著、「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー」、１９８８年、第５７巻、ｐ．６２７−６６３）。

外来変異ＥＰＳＰＳ遺伝子の、植物内への導入は、よく記載されている。例えば、米国特許第４，５４５，０６０号によれば、グリホサートに対する植物の抵抗性を増大するため、酵素をその競合阻害剤、すなわちグリホサートに対しより抵抗性にする、少なくとも１つの変異を有するＥＰＳＰＳ変異体をコードしている遺伝子が、該植物のゲノム内へ導入される。しかしながら、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を含有するこれらのトランスジェニック植物には、多くの厄介な事態及び問題が付随する。かかる変異の多くは、結果として変異ＥＰＳＰＳ遺伝子産物の低い発現を生じるか、又は野生型に比較して有意に低い酵素活性をもつＥＰＳＰＳ遺伝子産物を生じる結果となる。変異酵素の低い発現又は低い酵素活性は、結果として植物の異常に低い成長及び発生レベルを生じる。

ＥＰＳＰ合成酵素におけるかかる変異体が、グリホサートに耐性のトランスジェニック植物の取得において有用であることは立証済みであるが、高度にグリホサート耐性であって、しかしなお動力学的に効率のよい変異ＥＰＳＰＳ遺伝子産物を取得して、改良された耐性が野生型の発現レベルと共に得られるようにすることが、ますます有益となるであろう。

リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基
リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基、及び、真核細胞において遺伝的変化を生じさせるためのその使用は、クミーク（Ｋｍｉｅｃ）らの米国特許第５，５６５，３５０号（クミークＩ）に記載されている。クミークＩは、特定の遺伝的改変を標的遺伝子へ導入するための方法を教示している。クミークＩは、なかんずく、二本鎖を有するリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基を開示しており、但し、第１の鎖は、少なくとも８個のＲＮＡ様ヌクレオチドからなる２つのセグメントを含有し、それらは、「介在ＤＮＡセグメント」と呼ばれる４から約５０ＤＮＡ様ヌクレオチドからなる第３のセグメントにより分離されている。第１の鎖のヌクレオチドは、第２の鎖のＤＮＡ様ヌクレオチドと塩基対合される。第１及び第２の鎖は、一本鎖化されたヌクレオチドのセグメントにより付加的に連結され、第１及び第２の鎖が１つのオリゴヌクレオチド鎖の一部となるようにされている。クミークＩはさらに、特定の遺伝的改変を、標的遺伝子内へ導入するための方法を教示している。クミークＩによれば、ＲＮＡセグメントの配列は、標的遺伝子の第１及び第２のフラグメントの配列と相同、すなわち同一であるべく選択される。介在ＤＮＡセグメントの配列は、「非相同領域」と呼ばれる相違のある領域を除いて、第１及び第２のフラグメント間の標的遺伝子の配列と相同である。非相同領域は、挿入又は欠失をもたらすことが可能であり、或いは、標的遺伝子の配列とミス対合されて置換をもたらすようにする１以上の塩基を含有することが可能である。クミークＩによれば、標的遺伝子の配列は、非相同領域によって指示された通りに改変され、標的遺伝子がリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基の配列と相同となるようにする。クミークＩは特に、リボース及び２’−Ｏ−メチルリボース、すなわち２’−メトキシリボース含有ヌクレオチドが、リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基において使用可能であること、及び、天然産のデオキシリボース含有ヌクレオチドがＤＮＡ様ヌクレオチドとして使用可能であることを教示している。

クミークの米国特許第５，７３１，１８１号（クミークＩＩ）は、特に、植物細胞に遺伝的変化をもたらすためのリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基の使用を開示しており、特定の標的遺伝子に遺伝的変化をもたらすために使用可能な、ＲＮＡ様及びＤＮＡ様のヌクレオチドの、類似体及び誘導体のさらなる例を開示している。リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基の使用を議論している他の特許は；米国特許第５，７５６，３２５；５，８７１，９８４；５，７６０，０１２；５，８８８，９８３；５，７９５，９７２；５，７８０，２９６；５，９４５，３３９；６，００４，８０４；及び６，０１０，９０７号を包含し、また国際特許番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７において；及び、国際特許公開番号ＷＯ９８／４９３５０；ＷＯ９９／０７８６５；ＷＯ９９／５８７２３；ＷＯ９９／５８７０２；及びＷＯ９９／４０７８９において。リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基は、混合二重鎖オリゴヌクレオチド、クミークＩＩにより教示された分子を含有する非ヌクレオチド、及び上記の特許及び特許公報において教示された他の分子を包含する。

米国特許第６，８７０、０７５号（‘０７５特許）は、除草剤抵抗性又は耐性のノントランスジェニッ植物を製造するための方法であって、クミークＩ及びクミークＩＩに開示された方法に従ってリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基を用いる方法を開示している。‘０７５特許において開示されたＥＰＳＰＳ変異体は、ＥＰＳＰＳタンパク質の下記アミノ酸位置：シロイヌナズナＥＰＳＰＳタンパク質のＬｅｕ₁₇₃、Ｇｌｙ₁₇₇、Ｔｈｒ₁₇₈、Ａｌａ₁₇₉、Ｍｅｔ₁₈₀、Ａｒｇ₁₈₁、Ｐｒｏ₁₈₂、Ｓｅｒ₉₈、Ｓｅｒ₂₅₅、Ｌｅｕ₁₉₈、或いは、ＥＰＳＰＳパラログの類似アミノ酸残基において、作られた変化を包含する。

公開米国特許出願第２００３００８４４７３号もまた、ノントランスジェニック除草剤抵抗性植物を作成するための、リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基の使用を開示しており、但し、ＥＰＳＰＳタンパク質は、シロイヌナズナのＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸位置１２６、１７７、２０７、４３８、４７９、４８０、及び／又は５０５において、又はＥＰＳＰＳパラログの類似アミノ酸残基において変化されている。

本発明は、グリホサートに対し抵抗性をもつ遺伝子産物を製造するための、任意の種からの任意のＥＰＳＰＳ遺伝子中に作成可能な、付加的なアミノ酸変異に関する。

手短に言えば、本発明により、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１以上の変異を有するノントランスジェニック植物又は植物細胞が製造される。結果として得られる植物は、グリホサートのようなホスホノメチルグリシンファミリーのメンバーに対し増大された抵抗性又は耐性を有し、かつ、該植物、その器官、組織、又は細胞の、対応する野生型植物又は細胞に比較して実質的に正常な成長又は発生を示す。変異遺伝子産物は、シロイヌナズナＥＰＳＰＳタンパク質（ＡＦ３６０２２４）の１以上のアミノ酸位置、１６０、１７９、１８３、１９４、２４４、２７３、及び／又は４５４において、或いはＥＰＳＰＳパラログの類似アミノ酸残基において置換を有する。好ましくは、変異植物はグリホサートに対し抵抗性があり、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質に比較して実質的に同じ触媒活性を有する。

さらに、本発明は、大腸菌からの変異されたＥＰＳＰＳ遺伝子と、１以上のアミノ酸位置、８２、９７、１０１、１１４、１６４、１９３、及び３７４における置換を有する遺伝子産物を製造する変異大腸菌細胞とを包含する。変異された大腸菌ＥＰＳＰＳ遺伝子は、変異遺伝子産物のインビトロの試験に使用可能である。ひとたび活性のある大腸菌変異体が同定されれば、次には対応する変異体が、所望の作物のＥＰＳＰＳ遺伝子に対し、除草剤抵抗性を該作物に与えるべく作成されることが可能である。

本発明はまた、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤の存否にかかわらず、野生型タンパク質の触媒活性を実質的に維持している、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するノントランスジェニック植物を製造するための方法に関する。当該方法は、１以上の前記アミノ酸変化を有する遺伝子産物を産生する、ＥＰＳＰＳ遺伝子内に標的化された変異をもつリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基を、植物細胞内へ導入することを含んでなる。該方法はさらに、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する細胞、種子、又は植物を同定すること、及び培養すること、及び、種子を産生する植物、以降「稔性植物」、を取得するための再生法、及び、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を含有する子孫（プロジェニー）植物を含む、かかる稔性植物からの種子及び付加的な植物の製造を包含する。

本発明はさらに、田畑において雑草を選択的に制御する方法に向けられている。田畑は、開示されたＥＰＳＰＳ遺伝子改変をもつ植物と雑草とを含んでなる。方法は、前記植物がそれに対し抵抗性にされ、かつ雑草が制御される、ホスホノメチルグリシン除草剤の、田畑への適用を含んでなる。好ましい除草剤は、グリホサートである。

本発明はまた、ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバー、例えばグリホサート、に対する抵抗性又は耐性を植物に与えるか、或いはこれにおいて変異されたＥＰＳＰＳが、野生型ＥＰＳＰＳに比較して実質的に同じ酵素活性を有している、ＥＰＳＰＳ遺伝子の新規変異及び結果として得られる新規遺伝子産物に向けられている。加えて、本発明は、変異された大腸菌ＥＰＳＰＳ遺伝子産物（タンパク質）に向けてられており、これは、ＥＰＳＰＳ変異体を、植物における除草剤抵抗性変異としての使用についてスクリーンするために使用される。

定義
本発明は、以下の定義に従って理解されるものである。

オリゴ核酸塩基は、核酸塩基のポリマーであって、該ポリマーは、相補配列を有するＤＮＡに対しワトソン・クリック型塩基対合によりハイブリダイズすることが可能である。

核酸塩基は、塩基を含んでなり、それはプリン、ピリミジン、又は、それらの誘導体又は類似体である。核酸塩基は、ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニット、及び、モルホリンヌクレオチド、並びにヌクレオシド及びヌクレオチドを包含する。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル部分を含有する核酸塩基、例えば、任意に置換されたリボシド又は２’−デオキシリボシドである。ヌクレオシドは、リンを含有してもしなくてもよい、いくつかの連結成分の１つにより結合されることが可能である。未置換のホスホジエステル結合により連結されているヌクレオシドは、ヌクレオチドと呼ばれる。

オリゴ核酸塩基鎖は、１つの５’及び３’末端を有しており、それらはポリマーの最終の核酸塩基である。特定のオリゴ核酸塩基鎖は、全ての型の核酸塩基を含有することが可能である。オリゴ核酸塩基化合物は、１以上のオリゴ核酸塩基鎖を含んでなり、それらは相補的であって、ワトソン・クリック塩基対合によりハイブリダイズされる。核酸塩基は、デオキシリボ型か、又はリボ型のいずれかである。リボ型の核酸塩基は、ペントースフラノシル含有核酸塩基であり、これにおいて２’炭素は、ヒドロキシル、アルキルオキシ、又はハロゲンにより置換されたメチレンである。デオキシリボ型の核酸塩基は、リボ型核酸塩基以外の核酸塩基であって、ペントースフラノシル部分を含有しない全ての核酸塩基を包含する。

オリゴ核酸塩基鎖は、一般に、オリゴ核酸塩基鎖と、オリゴ核酸塩基鎖のセグメント又は領域との双方を包含する。１つのオリゴ核酸塩基鎖は、３’末端及び５’末端を有する。オリゴ核酸塩基鎖が１つの鎖と同一の広がりをもつ場合、該鎖の３’及び５’末端はまた、該鎖の３’及び５’末端である。

本発明によれば、植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞の実質的に正常な成長は、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質を発現している対応する植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞の成長速度又は細胞分裂速度の、少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７５％である、植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞の成長速度又は細胞分裂速度として定義される。

本発明によれば、植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞の実質的に正常な発生は、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質を発現している対応する植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞において起こっているものと実質的に同じである、植物、植物器官、植物組織、又は植物細胞における１以上の発生事象として定義される。

本発明によれば、植物器官は、制限されることなく、葉、茎、根、栄養芽、花芽、分裂組織、肺、子葉、内乳、がく片、花弁、雌しべ、心皮、雄しべ、葯、小胞子、花粉、花粉管、胚珠、子房、及び果実、或いは、それらから採取された切片、スライス、又はディスクを包含する。植物組織は、制限されることなく、カルス組織、基本組織、維管束組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、シュート組織、根組織、ゴール組織、植物腫瘍組織、及び生殖組織を包含する。植物細胞は、制限されることなく、細胞壁をもつ単離された細胞、様々なサイズのそれらの集合体、及びプロトプラストを包含する。

植物は、それらがグリホサートにさらされ、かつ、同様に処理された非耐性様植物により与えられるものと比較して右にシフトされている用量／反応曲線を与える場合、グリホサートに対し実質的に「耐性」である。かかる用量／反応曲線は、Ｘ軸上にプロットされた「用量」と、ｙ軸上にプロットされた「パーセント枯殺」、「除草効果」、その他とを有する。耐性植物は、所与の除草効果を得るために、非耐性様植物よりも多くの除草剤を必要とするであろう。グリホサートに対し実質的に「抵抗性」である植物は、田畑の雑草を枯殺すために農業用化学薬品界により典型的に使用される濃度及び速度においてグリホサートにさらされた場合、たとえあってもごく少ない壊死、溶解、白化、又は他の病変を示す。除草剤に対し抵抗性の植物はまた、除草剤の耐性でもある。用語「抵抗性」及び「耐性」は、本出願の文脈内では、「耐性及び／又は抵抗性」として解釈されるべきである。

用語「ＥＰＳＰＳホモログ」か、又は、その任意のバリエーションは、本明細書に開示されたＥＰＳＰＳ遺伝子と同じか又は実質的に同じ生物学的機能を行う、別の植物種において検出されるＥＰＳＰＳ遺伝子又はＥＰＳＰＳ遺伝子産物を指し、これにおいて、核酸配列又はポリペプチド配列（ＥＰＳＰＳ遺伝子産物の）は、以下に記載されるように、「同一」又は少なくとも５０％類似であると言われる（また「パーセント同一性」又は「実質的に同一」とも呼ばれる）。二つのポリヌクレオチド又はポリペプチドは、もし二つの配列中のヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列が、以下に記載されるように最大一致についてアラインメントされた場合にそれぞれ同じであれば、同一である。２以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈においては、用語「同一」又は「パーセント同一性」は、比較ウィンドウに対する最大一致について比較及びアラインメントされた場合、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるか、又はマニュアルアラインメント及び目視検査により測定されるような、同じであるか、又は、特定されたパーセントの同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドを有している、２以上の配列又はサブ配列を指す。保存的置換において配列が異なっているポリペプチドについては、パーセント配列同一性を、置換の保存的性質を補正するべく、上向きに調整してよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知のものである。このことは典型的には、保存的置換をフル（完全な）ミスマッチよりもパーシャル（部分的）であるとしてスコアリングし、それによりパーセント配列同一性を増大することを包含する。したがって、例えば、同一なアミノ酸がスコア１を与えられ、非保存的置換がスコアゼロを与えられる場合、保存的置換はゼロと１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えばマイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）及びミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム、「コンピューター・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサインエンセズ（ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．）」、１９８８年、第４巻、ｐ．１１−１７、に従って、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（インテリジェネティクス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）に実現されているように計算される。

句「実質的に同一」及び「パーセント同一性」は、２つの核酸又はポリペプチドの文脈において、比較ウィンドウに対する最大一致についてアラインメントされた場合、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又はマニュアルアラインメント及び目視検査により測定されるような、少なくとも５０％、さらに好都合には６０％、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、及び最も好ましくは９０−９５％の、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有している配列又はサブ配列を指す。この定義はまた、テスト配列がリファレンス配列に対し実質的に同一性を有する場合、実質的な配列又はサブ配列の相補性を有している、テスト配列の相補体にもあてはまる。

当業者は、もし２つのポリペプチドが免疫学的に類似していれば、２つのポリペプチドもまた「実質的に同一」であり得ることを認識するであろう。したがって、２つのポリペプチドの一次構造が有意な変動を示す一方で、全体のタンパク構造は類似してもよい。それ故、２つのポリペプチドが実質的に同一であるかどうかを測定する方法は、各ポリペプチドに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体の結合を測定することを包含する。もし、第１のポリペプチドに特異的な抗体が、第２のポリペプチドと、第１のポリペプチドに対する親和性の少なくとも三分の一の親和性をもって結合すれば、２つのポリペプチドは実質的に同一である。配列比較には、典型的には１つの配列はリファレンス配列の役目を果たし、これに対しテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テスト及びリファレンス配列はコンピューターにインプットされ、必要であればサブ配列コーディネイトが指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づき、リファレンス配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。

比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）及びウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）著、「０．４ｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．」１９８１年、第２巻、ｐ．４８２、の局所相同性アルゴリズムによるか、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）及びヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）著、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）」、１９７０年、第４８巻、ｐ．４４３、の相同性アラインメントアルゴリズムによるか、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）及びリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」、１９８８年、第５８５巻、ｐ．２４４４、の類似性検索法によるか、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ）、ジェネティクス・コンピューター・グループ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ）、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．ウイスコンシン州マディソン））のコンピューターによる実行によるか、インフォーマックス・インク（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．（米国メリーランド州））によるＶＥＣＴＯＲＮＴＩバージョン＃６のようなアラインメント用ソフトウェアによるか、クラスタルＷ（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．）、ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．）、及びギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．）著、「クラスタルＷ：配列加重、位置特異ギャップペナルティ、及びウェイトマトリックス選択による、累進的多重配列アラインメントの感受性の改善（ＣＬＵＳＴＡＬＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｔｈｒｏｕｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｇａｐｐｅｎａｌｔｉｅｓａｎｄｗｅｉｇｈｔｍａｔｒｉｘｃｈｏｉｃｅ）、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９４年、第２２巻、ｐ．４６７３−４６８０）に記載された手法によるか、或いは、目視検査（一般的には、アズベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、「プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、現在のプロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ・インク（ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）とジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）の間の合弁事業、（１９９５年付録）（アズベル））により実行可能である。

パーセント配列同一性及び配列類似性を測定するために好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ、及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらはアルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、１９９０年、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０、及びアルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、「ヌクレイック・アシズ・リサーチ」、１９７７年、第２５巻、ｐ．３３８９−３４０２においてそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、問題の配列中の、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされたときいくつかの正の値の閾値スコアＴと適合するか又は満たす、長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを包含する。Ｔは、近縁ワードスコア閾値と呼ばれる（アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、上記）。これらの最初の近縁ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための、検索を開始するための種子として機能する。ワードヒットは次に、各配列に沿って両方向に、累積アラインメントスコアが増大する限り伸長される。ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（適合残基の対に対する褒賞スコア；常に＞０）、及びＮ（不適合残基に対する罰則スコア；常に＜０）を用いて、累積スコアが計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの伸長は：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下したとき；蓄積スコアが、１以上の負のスコアリング残基のアラインメントの蓄積のため、ゼロ以下になるとき；又は、いずれかの配列の末端に到達したとき、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）に１１、期待値（Ｅ）に１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び双方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用には、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）に３、期待値（Ｅ）に１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）及びヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ」、１９８９年、第８９巻、ｐ．１０９１５参照）。パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も実行する（例えば、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）及びアルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ」、１９９３年、第９０巻、ｐ．５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であって、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間で、それによって偶然に適合が生じる確率の指標を与える。例えば、核酸は、リファレンス核酸に対するテスト核酸の比較において、もし最少合計確率が約０．１より小さく、さらに好ましくは約０．０１より小さく、最も好ましくは約０．００１より小さければ、リファレンス核酸と類似であるとみなされる。

本発明の実施においては、ＥＰＳＰＳ遺伝子内に１以上の変異を有している、ノントランスジェニック植物又は植物細胞が製される。結果として得られる植物は、グリホサートのようなホスホノメチルグリシンファミリーのメンバーに対し、増大された抵抗性又は耐性を有し、かつ、植物、その器官、組織、又は細胞の、対応する野生型植物又は細胞に比較して実質的に正常な成長又は発生を示す。変異された遺伝子は、シロイヌナズナＥＰＳＰＳ遺伝子ＡＦ３６０２２４産物の１以上のアミノ酸位置、１６０、１７９、１８３、１９４、２４４、２７３、及び４５４において、或いはＥＰＳＰＳホモログの類似アミノ酸位置において置換を有する遺伝子産物を産生する。好ましくは、変異植物は、グリホサートに対し抵抗性であり、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質に比較して実質的に同じ触媒活性を有する。

グリホサートに対する抵抗性を与える遺伝子産物を産生する変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を同定するため、インビトロスクリーニングを時間及び資源を節約するべく細菌の系において行うことが可能である。候補変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を発現している細菌コロニーの増殖曲線を作成して、グリホサート抵抗性表現形を有する変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を評価することができる。例えば、米国特許第第６，８７０，０７５号は、ＬａｃＺ−チフス菌（Ｓａｌｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）へ形質転換された、シロイヌナズナ変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を用いた、サルモネラ（Ｓａｌｌｍｏｎｅｌｌａ）のグリホサート抵抗性アッセイを開示している。本発明のもう１つの実施態様においては、ＡｒｏＡ遺伝子とも呼ばれる大腸菌ＥＰＳＰＳ遺伝子を、グリホサート抵抗性についてＥＰＳＰＳ変異体を評価のために使用可能である。増殖曲線アッセイ、及び候補変異体のＫ_i及びＫ_m値を測定する酵素アッセイは、周知の技術に従って行われる。いったん活性のあるグリホサート抵抗性の変異体が大腸菌のＥＰＳＰＳ遺伝子内に同定されれば、次に植物のＥＰＳＰＳ遺伝子内の類似アミノ酸を、本明細書に記載されたリコンビナジェニック核酸塩基を用いて変異させ、グリホサート抵抗性の植物を作成する。

大腸菌ＥＰＳＰＳ遺伝子（ＡｒｏＡ）産物における好ましいアミノ酸置換は、以下を包含する：
Ｌｅｕ₈₂Ｓｅｒ
Ｔｈｒ₉₇Ｉｌｅ又はＡｌａ
Ｐｒｏ₁₀₁Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ
Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ
Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ
Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及び
Ｘ₃₇₄Ｌｅｕ、
ここで、下付き数字の左のアミノ酸は天然のアミノ酸であり、下付き数字の右のアミノ酸は、変異アミノ酸である。アミノ酸位置３７４の文字「Ｘ」は、大腸菌ＥＰＳＰＳ遺伝子産物では天然のアミノ酸はＬｅｕであるという理由から示されている。しかしながら、多くの植物種において、位置３７４に存在するアミノ酸はＬｅｕではなく、この位置がＬｅｕに変化されると、植物はグリホサート抵抗性を示し、正常な植物の成長を支持するのに充分な酵素活性を保持しうることが見出されている。

ノントランスジェニック除草剤抵抗性植物を製造するため、植物種における対応するアミノ酸位置が、本発明に従って変化される。以下は、変化されるべきＥＰＳＰＳ遺伝子中のアミノ酸位置をリストしている、いくつかの好ましい作物のリストである。好ましいアミノ酸置換は、アミノ酸位置番号の右にリストされている。

トウモロコシでは、以下のアミノ酸変化が好ましい：
Ｌｅｕ₈₄Ｓｅｒ
Ｔｈｒ₁₀₂Ｉｌｅ又はＡｌａ
Ｐｒｏ₁₀₆Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ
Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ
Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ
Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及び
Ｘ₁₁₇Ｌｅｕ。

ワタでは、以下のアミノ酸変化が好ましい：
Ｌｅｕ₈₂Ｓｅｒ
Ｔｈｒ₉₇Ｉｌｅ又はＡｌａ
Ｐｒｏ₁₀₁Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ
Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ
Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ
Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及び
Ｘ₁₈₄Ｌｅｕ。

コメでは、以下のアミノ酸変化が好ましい：
Ｌｅｕ₁₅₀Ｓｅｒ
Ｔｈｒ₁₆₉Ｉｌｅ又はＡｌａ
Ｐｒｏ₁₇₃Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ
Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ
Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ

Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及び
Ｘ₁₈₄Ｌｅｕ。

セイヨウナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）（Ｘ５１４７５ｇＤＮＡからの２−２８）では、以下のアミノ酸変化が好ましい：
Ｌｅｕ₁₅₅Ｓｅｒ
Ｔｈｒ₁₇₄Ｉｌｅ又はＡｌａ
Ｐｒｏ₁₇₈Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ
Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ
Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ
Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及び
Ｘ₁₈₉Ｌｅｕ。

シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）（ＡＦ３６０２２４）では、下のアミノ酸変化が好ましい：
Ｌｅｕ₁₆₀Ｓｅｒ
Ｔｈｒ₁₇₉Ｉｌｅ又はＡｌａ
Ｐｒｏ₁₈₃Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ
Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ
Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ
Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及び
Ｘ₁₉₄Ｌｅｕ。

ペチュニア・ヒブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａ）では、下のアミノ酸変化が好ましい：
Ｌｅｕ₁₅₅Ｓｅｒ
Ｔｈｒ₁₇₄Ｉｌｅ又はＡｌａ
Ｐｒｏ₁₇₈Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ
Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ
Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ
Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及び
Ｘ₁₈₉Ｌｅｕ。

理解される通り、大腸菌は植物ではないが、大腸菌遺伝子は細菌細胞培養系において変異可能であり、さらに変異大腸菌遺伝子産物（酵素）は、グリホサートに対する抵抗性と、植物において不可欠である必要な酵素産物としての機能とを示しうる酵素活性（Ｋ_i及びＫ_m）についてアッセイ可能であるため、本発明において考察されている。ひとたび変異された大腸菌変異体が同定されれば、次に、その変異を、本明細書に記載のリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基を用いて植物細胞で生成させ、ノントランスジェニックな除草剤抵抗性植物を製造する。これらの理由から、変異された大腸菌、及び変異された領域（Ａｒｅａ）のタンパク質は、本発明の一部とみなされる。

以下の表は、好ましいアミノ酸置換位置を、様々な種についてアミノ番号によってリストしている。これらの１以上の位置においてアミノ酸置換を行うことにより、グリホサート抵抗性植物を製造できる。

上記の表及び図１−５から分かるように、ＥＰＳＰＳ遺伝子には、種間で、及び種内でいくつかのマイナーなバリエーションがある。このことは、予想されるべきである。これらのマイナーバリエーションは、本発明によって変異体を製する際に考慮されるべきである。異なる遺伝子間の類似の位置におけるアミノ酸が、グリホサート抵抗性植物を作成するべく変異される。例えば、シロイヌナズナＡＦ３６０２２４の位置１７９における変異（Ｔ＞Ａ）は、シロイヌナズナＮＭ１３００９３の位置１７８におけるＴ＞Ａ変異と等価とする。もう１つの例は、大腸菌ＥＰＳＰＳ遺伝子の位置Ｌ８２において見られる。殆どの植物は、この類似の位置にＬを有するが、シロイヌナズナは、上記表に示されるようにシロイヌナズナの遺伝子によって、類似の１５９又は１６０にＦを有する。

さらに、いくつかの種は１以上のＥＰＳＰＳ遺伝子を有する。かかる場合、１以上の遺伝子を、本発明に従って変異させ、グリホサート抵抗性変異体を作成する。もし種々のＥＰＳＰＳ遺伝子の発現レベルが知られており、かつ異なっているなら、より高発現性のＥＰＳＰＳ遺伝子を変異させることが好ましい。好ましい実施態様においては、作物中の全てのＥＰＳＰＳ遺伝子を変異させ、グリホサート表現形を作成する。例えば、ナタネ（ｃａｎｏｌａ）は，４つのＥＰＳＰＳ遺伝子を有することが知られている。２つの遺伝子が、図４及び５に示されている。比較は、２つの遺伝子間の軽微な差異を示すであろう。

本発明により変異された植物は、任意の種の双子葉植物、単子葉植物、又は裸子植物でよく、高木又は低木として成長する任意の木本種、任意の草本種、食用の果実、種子、又は野菜を産生する任意の種、或いは、カラフルな又は芳香性の花を産生する任意の種を含む。例えば、該植物は、ナタネ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、サツマイモ、ヤムイモ、ワタ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、サトウキビ、エンドウ、ラッカセイ、フィールドビーンズ、ポプラ、ブドウ、柑橘類、アルファルファ、ライムギ、エンバク、芝草及び牧草、アマ、セイヨウナタネ、キュウリ、アサガオ、バルサム、トウガラシ、ナス、マリーゴールド、ハス、キャベツ、デイジー、カーネーション、チューリップ、アヤメ、ユリ、及び、これまでに具体的に列挙されていない限りのナッツ生産植物からなる群より選択されてよい。

リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基は、制限されることなく、マイクロキャリア（バイオリスティックデリバリー）、マイクロファイバー（ウィスカー）、エレクトロポレーション、直接的ＤＮＡ取込み、及びマイクロインジェクションを含む、当該技術分野において一般に使用される任意の方法を用いて植物細胞内へ導入可能である。

リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基の例証となる例は、以下に記載される。

本発明は、参考として本明細書に含まれている、クミークＩ及びクミークＩＩの特許に記載された立体配座及び化学を有するリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基を用いて実行可能である。クミークＩは、特定の遺伝的改変を、標的遺伝子内へ導入するための方法を教示している。クミークＩ及び／又はクミークＩＩのリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基は、２つの相補的な鎖を含有しており、その１つは、他方の鎖のＤＮＡ型ヌクレオチドと塩基対合されている、少なくとも１つのＲＮＡ型ヌクレオチド（「ＲＮＡセグメント」）を含有する。

クミークＩＩは、プリン及びピリミジン塩基含有非ヌクレオチドが、ヌクレオチド用に置換可能であることを開示している。それぞれ参考としてその全てが本明細書に含まれている、米国特許第５，７５６，３２５；５，８７１，９８４；５，７６０，０１２；５，８８８，９８３；５，７９５，９７２；５，７８０，２９６；５，９４５，３３９；６，００４，８０４；及び６，０１０，９０７号、及び、国際特許番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７；及び、国際特許公開番号ＷＯ９８／４９３５０；ＷＯ９９／０７８６５；ＷＯ９９／５８７２３；ＷＯ９９／５８７０２；及びＷＯ９９／４０７８９；米国特許第６，８７０，０７５号において；及び米国特許出願公開第２００３００８４４７３号は、本発明に使用可能な付加的なリコンビナジェニック分子を開示している。用語「リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基」は、本明細書においては、本発明の方法において使用可能な分子を意味するべく使用され、かつ、混合二重鎖オリゴヌクレオチド、クミークＩＩにおいて教示された分子を含有する非ヌクレオチド、一本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド、及び、上記の特許及び特許公報において教示された他のリコンビナジェニック分子を包含する。

１つの実施態様においては、リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基は、混合二重鎖オリゴヌクレオチドであって、これにおいて該混合二重鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ型ヌクレオチドは、２’−ヒドロキシルをフルオロ、クロロ、又はブロモ官能基で置換することによるか、又は置換基を２’−Ｏに置くことにより、ＲＮアーゼ抵抗性にされる。好適な置換基は、クミークＩＩにより教示された置換基を包含する。別な置換基は、米国特許第５，３３４，７１１号（スプロート（Ｓｐｒｏａｔ））により教示された置換基、及び、特許公開第ＥＰ６２９３８７及びＥＰ６７９６５７号（まとめて、マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）出願）（これらは参考として本明細書に含まれる）により教示された置換基を包含する。本明細書で用いる場合、リボヌクレオチドの２’−フルオロ、クロロ、又はブロモ誘導体、又はマーチン出願又はスプロートに記載された置換基で置換された２’−ＯＨを有するリボヌクレオチドは、「２’−置換リボヌクレオチド」と呼ばれる。本明細書で用いる場合、用語「ＲＮＡ型ヌクレオチド」は、未置換のホスホジエステル結合によるか、或いは、クミークＩ又はクミークＩＩにより教示された任意の非天然の結合により、混合二重鎖オリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドへ結合されている、２’−ヒドロキシル又は２’−置換ヌクレオチドを意味する。本明細書で用いる場合、用語「デオキシリボ型ヌクレオチド」は、未置換のホスホジエステル結合によるか、或いは、クミークＩ又はクミークＩＩにより教示された任意の非天然の結合により、ＭＤＯＮの他のヌクレオチドへ結合可能な、２’−Ｈを有するヌクレオチドを意味する。

本発明の１つの実施態様においては、リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基は、未置換のホスホジエステル結合のみにより結合されている、混合二重鎖オリゴヌクレオチドである。別な実施態様においては、結合は、クミークＩＩにより教示された、置換ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、及び非リンベースの結合による。なおもう１つの実施態様においては、混合二重鎖オリゴヌクレオチドの各ＲＮＡ型ヌクレオチドは、２’−置換ヌクレオチドである。特に好ましい２’−置換リボヌクレオチドの実施態様は、２’−フルオロ、２’−メトキシ、２’−プロピルオキシ、２’−アリルオキシ、２’−ヒドロキシルエチルオキシ、２’−メトキシエチルオキシ、２’−フルオロプロピルオキシ、及び２’−トリフルオロプロピルオキシで置換されたリボヌクレオチドである。さらに好ましい２’−置換リボヌクレオチドの実施態様は、２’−フルオロ、２’−メトキシ、２’−メトキシエチルオキシ、及び２’−アリルオキシで置換されたヌクレオチドである。もう１つの実施態様においては、混合二重鎖オリゴヌクレオチドは、未置換のホスホジエステル結合により結合されている。

ただ１種の２’−置換ＲＮＡ型ヌクレオチドのみを有する混合二重鎖オリゴヌクレオチドは、より便利に合成されるが、本発明の方法は、２以上の型のＲＮＡ型ヌクレオチドを有する混合二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて実施可能である。ＲＮＡセグメントの機能は、２つのＲＮＡ型トリヌクレオチドの間にデオキシヌクレオチドを導入することで生じる中断により影響されなくてよく、それ故、用語ＲＮＡセグメントは、かかる「中断ＲＮＡセグメント」を含む。中断されていないＲＮＡセグメントは、連続ＲＮＡセグメントと呼ばれる。別な実施態様においては、ＲＮＡセグメントは、交互のＲＮアーゼ抵抗性及び未置換の２’−ＯＨヌクレオチドを含有することができる。混合二重鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは１００より少ないヌクレオチド、さらに好ましくは８５より少ないヌクレオチドであるが、しかし５０より多いヌクレオチドを有する。第１及び第２の鎖は、ワトソン・クリック型の塩基対合をする。１つの実施態様においては、混合二重鎖オリゴヌクレオチドの鎖は、一本鎖のヘキサ、ペンタ、又はテトラヌクレオチドといったリンカーにより共有結合され、第１及び第２の鎖が、１つの３’及び１つの５’末端を有する１本のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントであるようにする。３’及び５’末端は、「ヘアピンキャップ」の付加により保護可能であり、これにより３’及び５’末端ヌクレオチドは、隣接ヌクレオチドに対し、ワトソン・クリック型の対合をする。第２のヘアピンキャップは、付加的に、３’及び５’末端から遠くの、第１及び第２の鎖の間の結合部に置かれてよく、第１及び第２の鎖間のワトソン・クリック型の対合が安定化されるようにする。

第１及び第２の鎖は、標的ＥＰＳＰＳ遺伝子の２つのフラグメントと相同である、２つの領域を含有しており、すなわち標的遺伝子と同じ配列を有する。相同領域は、ＲＮＡセグメントのヌクレオチドを含有しており、ＤＮＡセグメントを連結している１以上のＤＮＡ型ヌクレオチドを含有してもよく、また介在ＤＮＡセグメント内ではないＤＮＡ型ヌクレオチドを含有してもよい。二つの相同領域は、「非相同領域」と呼ばれる、標的遺伝子の配列とは異なる配列を有する領域によって分離され、かつ各々がそれに隣接している。非相同領域は、１、２、又は３個のミス対合ヌクレオチドを含有することができる。ミス対合ヌクレオチドは、連続していることが可能であり、代わりに、標的遺伝子と相同な１又は２個のヌクレオチドにより分離されることが可能である。あるいは、非相同領域はまた、１、２、３個、又は５以下のヌクレオチドの挿入を含有することが可能である。別法として、混合二重鎖オリゴヌクレオチドの配列は、混合二重鎖オリゴヌクレオチドからの１、２、３個の、又は５以下のヌクレオチドの欠失のみによって、標的遺伝子の配列と異なってもよい。非相同領域の長さ及び位置は、この場合、たとえ非相同領域内に混合二重鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドがなくても、欠失の長さと考えられる。置換又は複数の置換が意図されている場合、２つの相同領域に相補的である、標的遺伝子のフラグメント間の距離は、非相同領域の長さと同一である。非相同領域が挿入を含有する場合、相同領域は、それにより混合二重鎖オリゴヌクレオチド内では、それらの相補的な相同領域が遺伝子内にあるよりもさらに遠く分離されており、非相同領域が欠失をコードしている場合には、その逆が適用可能である。

混合二重鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡセグメントは、それぞれが相同領域、すなわち標的遺伝子のフラグメントと配列において同一である領域、の一部であって、そのセグメントは共に、好ましくは少なくとも１３個のＲＮＡ型ヌクレオチド、及び好ましくは１６から２５個までのＲＮＡ型ヌクレオチド、又はなおさらに好ましくは１８−２２個のＲＮＡ型ヌクレオチドか、或いは最も好ましくは２０個のヌクレオチドを含有する。１つの実施態様においては、相同領域のＲＮＡセグメントは、介在ＤＮＡセグメントにより分離されかつそれに隣接しており、すなわち「それにより連結されている」。１つの実施態様においては、非相同領域の各ヌクレオチドは、介在ＤＮＡセグメントのヌクレオチドである。混合二重鎖オリゴヌクレオチドの非相同領域を含有している介在ＤＮＡセグメントは、「変異誘発セグメント」と呼ばれる。

標的ＥＰＳＰＳ遺伝子内へ導入されるべき変化は、非相同領域によりコードされている。ＥＰＳＰＳ遺伝子内へ導入されるべき変化は、ＥＰＳＰＳ遺伝子配列の１以上の塩基の変化であってよく、そのことが天然のアミノ酸を、その位置において所望のアミノ酸に変える。

本発明のもう１つの実施態様においては、リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基は、一本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド変異性ベクターか、又はＳＳＯＭＶであり、これは、その全てが参考として本明細書に含まれる、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７に開示されている。ＳＳＯＭＶの配列は、米国特許第５，７５６，３２５；５，８７１，９８４；５，７６０，０１２；５，８８８，９８３；５，７９５，９７２；５，７８０，２９６；５，９４５，３３９；６，００４，８０４；及び６，０１０，９０７号、及び国際特許公開番号ＷＯ９８／４９３５０；ＷＯ９９／０７８６５；ＷＯ９９／５８７２３；ＷＯ９９／５８７０２；及びＷＯ９９／４０７８９；米国特許第６，８７０，０７５号；及び米国特許出願公開第２００３００８４４７３号に記載された、変異性ベクターと同じ原理に基づいている。ＳＳＯＭＶの配列は、所望の遺伝的改変を含有する、変異誘発領域と呼ばれる領域により分離された、標的配列と相同である二つの領域を含有する。変異誘発領域は、標的配列内の相同領域を分離する配列と同じ長さの配列を有することができるが、異なる配列を有している。かかる変異誘発領域は、置換を引き起すことができる。

ＳＳＯＭＶのヌクレオチドは、３’末端及び／又は５’末端のヌクレオチド間結合か、又は代わりに２つの３’末端及び／又は５’末端のヌクレオチド間結合が、ホスホロチオアート又はホスホアミダートであり得ることを除いて、未修飾のホスホジエステル結合により連結されるデオキシリボヌクレオチドである。本明細書で用いる場合、ヌクレオチド間結合は、ＳＳＯＭＶのヌクレオチド間の結合であり、３’末端ヌクレオチド又は５’末端ヌクレオチドと、ブロッキング置換基、上記参照、との間の結合は包含しない。特別の実施態様においては、ＳＳＯＭＶの長さは２１と５５デオキシヌクレオチドの間であり、したがって相同領域の長さは、少なくとも２０デオキシヌクレオチドの全長であり、少なくとも２つの相同領域は、各々少なくとも８デオキシヌクレオチドの長さを有するはずである。

ＳＳＯＭＶは、標的遺伝子のコーディング又は非コーディング鎖のいずれかに対し相補的であるべくデザイン可能である。所望の変異が単一塩基の置換である場合、双方の変異誘発ヌクレオチドがピリミジンであることが好ましい。所望の機能上の結果を達成することに見合う程度に、変異誘発ヌクレオチドと、相補鎖内の標的ヌクレオチドとの双方がピリミジンであることが好ましい。特に好ましいのは、転換型変異をコードするＳＳＯＭＶであり、すなわち、Ｃ又はＴの変異誘発ヌクレオチドが、各々相補鎖内のＣ又はＴヌクレオチドとミス対合される。

オリゴデオキシヌクレオチドに加えて、ＳＳＯＭＶは、リンカーを介し５’末端炭素へ結合されている５’ブロッキング置換基を含有することができる。リンカーの化学は、その長さ以外は重要ではなく、好ましくは少なくとも６原子長であるべきであり、該リンカーはフレキシブルであるべきである。さまざまな非毒性の置換基、例えばビオチン、コレステロール又は他のステロイド、或いは非インターカレート型カチオン性蛍光色素が使用可能である。ＳＳＯＭＶを作成するための試薬として特に好ましいのは、Ｃｙ３^TM及びＣｙ５^TMとして、グレン・リサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）、バージニア州スターリング、により販売されている試薬であり、それらはブロックされたホスホロアミダイトであって、オリゴヌクレオチドへの取り込みに際し、３，３，３’，３’−テトラメチルＮ，Ｎ’−イソプロピル置換されたインドモノカルボシアニン及びインドジカルボシアニン色素をそれぞれ生じる。Ｃｙ３が最も好ましい。インドカルボシアニンがＮ−オキシアルキル置換されている場合、それは、５’末端ホスファートとのホスホジエステルとして、オリゴデオキシヌクレオチドの５’末端へ便利に結合可能である。色素とオリゴデオキシヌクレオチドとの間の色素リンカーの化学は重要ではなく、合成に都合がよいように選択される。市販のＣｙ３ホスホルアミダイトが指示通りに使用される場合、結果として生じる５’修飾は、ブロッキング置換基からなり、それと一緒のリンカーは、Ｎ−ヒドロキシプロピル、Ｎ’−ホスファチジルプロピル３，３，３’，３’−テトラメチルインドモノカルボシアニンである。

好ましい実施態様においては、インドカルボシアニン色素は、インドール環の３及び３’位置において四置換されている。理論に制限されることなく、これらの置換は、色素がインターカレート型色素であることを妨げる。これらの位置における置換基の正体は重要ではない。ＳＳＯＭＶはさらに、３’ブロッキング置換基を有することが可能である。再度、３’ブロッキング置換基の化学は重要ではない。

もう１つの実施態様においては、リコンビナジェニックオリゴヌクレオチドは、３’末端ヌクレオチド及び５’末端ヌクレオチドを有する一本鎖のオリゴデオキシヌクレオチドであって、少なくとも２５個のデオキシヌクレオチド、及び６５個以下のデオキシヌクレオチドを有しており、かつ、それぞれが標的染色体遺伝子の少なくとも２つの領域と同一である、各々少なくとも８デオキシヌクレオチドの少なくとも２つの領域を含んでなる配列を有しており、それらの領域は共に少なくとも２４ヌクレオチド長であって、その領域は、標的染色体遺伝子の配列中か、又はオリゴデオキシヌクレオチドの配列中か、又は双方の、少なくとも１つのヌクレオチドによって分離されており、オリゴデオキシヌクレオチドの配列が標的染色体遺伝子の配列と同一ではないようにする。参考として本明細書に含まれている、米国特許第６，２７１，３６０号参照。

マイクロキャリア及びマイクロファイバー
マイクロプロジェクタイル貫通により、セルロース細胞壁を有する植物細胞内へ大きいＤＮＡフラグメントを導入するための金属マイクロキャリア（ミクロスフェア）の使用は、関連技術分野（以降バイオリスティックデリバリー）における熟練者には周知である。米国特許第４，９４５，０５０；５，１００，７９２；及び５，２０４，２５３号は、それらを発射するためのマイクロキャリア及び装置を選択するための、一般的な技術を記載している。米国特許第５，４８４，９５６及び５，４８９，５２０号は、トウモロコシのカルス組織のマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントを用いた、稔性トランスジェニックトウモロコシの調製を記載している。バイオリスティック技術はまた、未熟なトウモロコシ胚の形質転換においても使用される。

本発明の方法においてマイクロキャリアを使用するための特別の条件は、国際特許公開番号ＷＯ９９／０７８６５に記載されている。代表的な技術においては、氷冷されたマイクロキャリア（６０ｍｇ／ｍｌ）、混合二重鎖オリゴヌクレオチド（６０ｍｇ／ｍｌ）、２．５ＭＣａＣｌ₂、及び０．１Ｍスペルミジンが、この順序で加えられ、混合物は穏やかに、例えばボルテックスにより１０分間攪拌され、室温で１０分間静置され、そこでマイクロキャリアは５体積のエタノールで希釈され、遠心分離され、１００％エタノール中に再懸濁される。良好な結果は、８−１０μｇ／μｌのマイクロキャリア、１４−１７μｇ／ｍｌの混合二重鎖オリゴヌクレオチド、１．１−１．４ＭのＣａＣｌ₂、及び１８−２２ｍＭのスペルミジンからなる粘着性溶液中の濃度において取得可能である。最適な結果は、８μｇ／μｌのマイクロキャリア、１６．５μｇ／ｍｌの混合二重鎖オリゴヌクレオチド、１．３ＭのＣａＣｌ₂、及び２１ｍＭのスペルミジンという条件下に観察された。

リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基はまた、本発明の実施のため、細胞壁及び細胞膜を貫通するためのマイクロファイバーを用いて、植物細胞内へ導入されることが可能である。コフィ（Ｃｏｆｆｅｅ）らに対する米国特許第５，３０２，５２３号は、ブラック・メキシカン・スイート（ＢｌａｃｋＭｅｘｉｃａｎＳｗｅｅｔ）のトウモロコシ懸濁培養物の形質転換を促進するための、３０回の０．５μｍ、及び１０回の０．３μｍの、シリコンカーバイドファイバーの使用を記載している。本発明のＥＰＳＰＳ変異の作成においては、リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基を送達するために、マイクロファイバーを用いた植物細胞の形質転換に向けてＤＮＡを導入するのに使用可能な任意の機械的技術を利用することができる。コフィ（Ｃｏｆｆｅｅ）らにより米国特許第５，３０２，５２３号に開示されたプロセスは、再生可能な植物細胞材料について、本発明のリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基を導入して、ＥＰＳＰＳ遺伝子の変異をもたらすべく使用可能であり、それによりグリホサート抵抗性の表現形を示す変異植物全体が回収可能である。

リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基のマイクロファイバーデリバリーのための例証となる技術は、以下の通りである：無菌のマイクロファイバー（２μｇ）は、約１０μｇの混合二重鎖オリゴヌクレオチドを含有する１５０μｌの植物培地中に懸濁される。懸濁培養が設定され、等量のパックされた細胞及び無菌のファイバー／ヌクレオチドの懸濁液は、１０分間ボルテックスされ、プレートされる。選択培地は直ちに適用されるか、或いは、特定の形質に適するよう、約１２０時間までの遅れをもって適用される。

エレクトロポレーション
別な実施態様においては、リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基は、当業者に周知の技術に従い、植物部分から誘導されたプロトプラストのエレクトロポレーションによって、植物細胞へ送達可能である。例えば、ガロイス（Ｇａｌｌｏｉｓ）ら著、「メソヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」、１９９６年、第５５巻、ｐ．８９−１０７（ヒューマナプレス（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ）、ニュージャージー州トトワ；キップ（Ｋｉｐｐ）ら著、「メソズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、１９９９年、第１３３巻、ｐ．２１３−２２１、ヒューマナプレス、ニュージャージー州トトワ参照。

リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基はまた、エレクトロポレーションにより、小胞子内へ導入可能である。四分子の放出に際し、小胞子は単核化され、薄壁化される。それは拡張し始め、外膜形成に先立ち、発芽孔を発生する。この段階の小胞子は潜在的に、他の植物細胞よりも外来ＤＮＡによる形質転換を受けやすい。さらに、小胞子の発生を、植物へ再生可能な、半数体胚又は胚形成カルスのいずれかを産生するために、インビトロにおいて改変可能である（コーマンス（Ｃｏｕｍａｎｓ）ら著、「プラント・セル・レポーツ（ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．）」、１９８９年、第７巻、ｐ．６１８−６２１；ダッタ（Ｄａｔｔａ）ら著、「プラント・サイエンス（ＰｌａｎｔＳｃｉ．）」、１９９０年、第６７巻、ｐ．８３−８８；マヘシュワリ（Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ）ら著、「アメリカン・ジャーナル・オブボタニー（Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔ．）」、１９８２年、第６９巻、ｐ．８６５−８７９；シャエファー（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）ら著、「アドバンセス・イン・セル・カルチャー（Ａｄｖ．ＩｎＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ）」、１９８９年、第７巻、ｐ．１６１−１８２；スワンソン（Ｓｗａｎｓｏｎ）ら著、「プラント・セル・レポーツ」、１９８７年、第６巻、ｐ．９４−９７）。したがって、形質転換された小胞子は、標準法による染色体倍加に際し、直接に半数体植物又は、稔性の二ゲノム性半数体植物へ再生可能である。参考として本明細書に含まれている、「植物の遺伝的修飾のための組成物及び方法」と題する米国同時係属出願第０９／６８０，８５８号も参照。

小胞子エレクトロポレーションは、その小胞子培養が可能な任意の植物種について実施可能であり、制限されることなく、イネ科（Ｇｒａｍｉｎａｅ）、マメ科、アブラナ科、ナス科、ウリ科、バラ科、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、ユリ科、ミカン科、ブドウ科の、トウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ），コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）、コメ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）、エンバク、オオムギ、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ（セイヨウナタネ、ブラシカ・ナプス）、Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ（ブラシカ・ラパ）、Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａ（ブラシカ・オレラセア）、及びＢｒａｓｓｉｃａｊｕｎｃｅａ（ブラシカユンケア））、ワタ（ＧｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｉｔｕｍＬ．）、種々のマメ科植物（例えば、ダイズ［Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ］、エンドウ［Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ］、その他）、ブドウ［Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ］といった種の植物、及び他の重要な作物植物の宿主を包含する。葯及び小胞子培養の双方からの小胞子胚発生は、双子葉植物及び単子葉植物の６８属及び２８科に属する、１７０を超える種において記載されてきた（ラガバン（Ｒａｇｈａｖａｎ）著、「被子植物における胚発生：発生及び実験的研究（ＥｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎＡｇｎｉｏｓｐｅｒｍｓ：ＡＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｙ）」、ケンブリッジ大学出版（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）、英国ケンブリッジ、１９８６年；ラガバン（Ｒｈａｇａｖａｎ）著、「セル・ディフェレンシエーション（ＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」、１９８７年、第２１巻、ｐ．２１３−２２６；ラーマーカズ（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ）ら著、「ユーフィティカ（Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ）」、１９９５年、第８１巻、ｐ．９３−１０７）。セイヨウナタネ（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）における、小胞子の単離、培養、及び、小胞子誘導胚［ＭＤＥ］からの倍加半数体植物の再生の詳細な議論には、ネーリン（Ｎｅｈｌｉｎ）著、「バイオテクノロジー応用のための道具としてのナタネ（プラシカ・ナプスＬ．）小胞子の使用（ＴｈｅＵｓｅｏｇＲａｐｅｓｅｅｄ（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）ＭｉｃｒｏｓｐｏｒｅｓａｓａｔｏｏｌｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、スウェーデン農業科学大学博士論文、スウェーデン、ウプサラ、１９９９年参照；またネーリン（Ｎｅｈｌｉｎ）ら著、「プラント・サイエンス（ＰｌａｎｔＳｃｉ．）」、１９９５年、第１１１巻、ｐ．２１９−２２７；ネーリン（Ｎｅｈｌｉｎ）ら著、「プラント・サイエンス」、１９９５年、第１１１巻、ｐ．２１９−２２７参照）。小胞子から、又は別の培養物からの染色体倍加は、いくつかの作物における倍加半数体（ｈｏｍｏｚｏｇｏｕｓ）植物の製造について、充分に確立されている（ハバール−ボース（Ｈｅｂｅｒｌｅ−Ｂｏｒｓ）ら著、「インビトロの花粉培養：進歩及び展望（Ｉｎｖｉｔｒｏｐｏｌｌｅｎｃｕｌｔｕｒｅｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ）、花粉バイオテクノロジー。遺伝子発現及びアレルゲンのキャラクタリゼーション（ＰｌｌｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｌｌｅｒｇｅｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」、モハパトラ（Ｍｏｈａｐａｔｒａ，Ｓ．Ｓ．）及びノクス（Ｋｎｏｘ，Ｒ．Ｂ．）編、チャプマン・アンド・ホール（ＣｈａｐｍａｎａｎｄＨａｌｌ）、ニューヨーク、１９９６年、ｖｏｌ．８５−１０９中）。

小胞子エレクトロポレーション法は、ジャーディナウド（Ｊａｒｄｉｎａｕｄ）ら著、「プラント・サイエンス」、１９９３年、第９３巻、ｐ．１７７−１８４、及び、フェンネル（Ｆｅｎｎｅｌｌ）及びハウプトマン（Ｈａｕｐｔｍａｎ）著、「プラント・セル・レポーツ」、１９９２年、第１１巻、ｐ．５６７−５７０に記載されている。植物プロトプラスト内へのＭＤＯＮのエレクトロポレーションのための方法もまた、小胞子エレクトロポレーションにおける使用に適合可能である。

ウィスカー及びマイクロインジェクション
なおもう１つの実施態様においては、リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基は、植物細胞のウィスカー又はマイクロインジェクションにより送達可能である。いわゆるウィスカー技術は、本質的に、フレイム（Ｆｒａｍｅ）ら著、「ザ・プラント・ジャーナル（ＰｌａｎｔＪ．）」、１９９４年、第６巻、ｐ．９４１−９４８に記載のように行われる。リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基は、ウィスカーへ添加され、植物細胞を形質転換するべく使用される。リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基は、植物細胞においてリコンビナーゼ複合体を形成することができるタンパク質をコードしている配列を含んでなるプラスミドと同時インキュベートされてよく、オリゴヌクレオチドとＥＰＳＰＳ遺伝子内の標的配列との間の組換えが触媒されるようにする。

グリホサート抵抗性植物の選択
植物又は植物細胞は、ホスホノメチルグリシン除草剤に対する抵抗性又は耐性について、当該技術分野において公知の方法を用いて、例えば、ホスホノメチルグリシン除草剤の存在下に植物又は植物細胞を成長させること、及び除草剤の不在下の対照植物の成長速度と比較して、成長の速度を測定することにより、試験することが可能である。グリホサートの場合には、約０．０１から約２０ｍＭまでの濃度が選択培地において使用される。

以下の実施例は、本発明の実施を例示するが、その範囲を制限するものとして理解されるべきではない。

セイヨウナタネ（ナタネ）におけるＰ１７８Ａ変異体
以下のゲノプラスト（リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基）が、ブラシカ・ナプス（ナタネ）生殖質においてＰ１７８Ａ変化を行うべく作成された：
配列番号１：ＶＡＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡＣＴＴＡＣＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＴＨ
これにおいて、Ｖは、蛍光色素（Ｖ＝Ｃｙ３）であり、Ｈは、逆向きのヌクレオチド又は逆向きの塩基（Ｈ＝３’ＤＭＴｄＣＣＰＧ）である。下線を付した核酸塩基は、非相同領域（コドン）を表し、これにおいて変異がナタネゲノム、すなわちＡ、に起こる。ゲノプラストは、周知の技術に従って作成され、該ゲノプラストは好ましくはマイクロパーティクル・ボンバードメント、すなわちバイオリスティックスにより、ナタネ植物細胞内へ送達される。Ｐ１７８Ａ変異を含有する再生されたナタネ植物は、商業用の比率で適用された場合、グリホサートに対し抵抗性である。

オリザ・サティバ（イネ）におけるＰ１７３Ａ変異体
以下のゲノプラスト（リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基）は、オリザ・サティバ（イネ）生殖質においてＰ１７３Ａ変化を行うべく作成された：
配列番号２：ＶＧＧＡＡＣＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＣＧＡＧＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＧＡＣＴＧＣＨ
これにおいて、Ｖは、蛍光色素（Ｖ＝Ｃｙ３）であり、Ｈは、逆向きのヌクレオチド又は逆向きの塩基（Ｈ＝３’ＤＭＴｄＣＣＰＧ）である。下線を付した核酸塩基は、非相同領域（コドン）を表し、これにおいて変異がイネゲノム、すなわちＡ、に起こる。ゲノプラストは、周知の技術に従って作成され、該ゲノプラストは好ましくはマイクロパーティクル・ボンバードメント、すなわちバイオリスティックスにより、イネ植物細胞内へ送達される。Ｐ１７３Ａ変異を含有する再生されたナタネ植物は、商業用の比率で適用された場合、グリホサートに対し抵抗性である。

大腸菌及びシロイヌナズナの変異体
以下の表は、グリホサート抵抗性の表現形を産生する、大腸菌（Ａｒｅａ）及びシロイヌナズナＮＭ１３００９３におけるＥＰＳＰＳ変異をリストしている。具体的なコドンの変化は、右のカラムに示されている。

^*大腸菌では真に相同のアミノ酸はない。大腸菌における最も近い相同アミノ酸はN111である。また、天然の大腸菌が位置82にLを有しており、シロイヌナズナの位置159における類似アミノ酸はFである。

以下にリストした（ａ−ｇ）は、本発明の変異をさらに詳細に示している。全ての「シロイヌナズナ」に対する言及は、シロイヌナズナ遺伝子ＮＭ１３００９３に対するものである。配列は、天然ＥＰＳＰＳ遺伝子（上）及び変異されたＥＰＳＰＳ遺伝子（下）の遺伝子配列である。変異されたコドンは、太字記載され、変化したヌクレオチドが小文字で表されている場所には下線が付されている。

大腸菌におけるＥＰＳＰＳ遺伝子（ＡｒｏＡ遺伝子）産物タンパク質配列を示す図であり、変異されたアミノ酸位置は、その周囲にボックスをつけて描かれている。これらの位置における置換アミノ酸は、配列の下に示されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３００９３（シロイヌナズナ）から翻訳された、ＡｔＥＰＳＰＳｃＤＮＡ−Ａｔ２ｇ４５３００のタンパク質配列を示す図である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３６０２２４Ｔ（シロイヌナズナ）から翻訳された、ＡｔＥＰＳＰＳｃＤＮＡ−Ａｔ１ｇ４８８６０のタンパク質配列を示す図である。ＢｎＥＰＳＰＳｃＤＮＡ−ＢＮ−２２−２３（ナタネ）のタンパク質配列を示す図である。Ｘ５１４７５ｇＤＮＡ翻訳（ナタネ）からの、ＢｎＥＰＳＰＳｃＤＮＡ−２−２８のタンパク質配列を示す図である。

Claims

除草剤抵抗性又は耐性のノントランスジェニック植物を製造するための方法であって：
ＥＰＳＰＳ遺伝子中に標的化された変異をもつリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基を植物細胞内へ導入して、１以上のアミノ酸位置において変異されているＥＰＳＰＳタンパク質を発現する、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子をもつ植物細胞を製造すること、但し、前記位置はシロイヌナズナのＥＰＳＰＳタンパク質（ＡＦ３６０２２４）のＬｅｕ₁₆₀、Ｔｈｒ₁₇₉、Ｐｒｏ₁₈₃、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₁₉₄からなる群より選択されるか、又はＥＰＳＰＳパラログの類似アミノ酸残基であり、ＸはＬｅｕではない；
対応する野生型植物細胞に比較して、グリホサートに対し改善された耐性を示す植物細胞を選択すること；及び
前記選択された植物細胞から、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する除草剤抵抗性又は耐性のノントランスジェニック植物を再生すること、
を含んでなる方法。
除草剤抵抗性又は耐性のノントランスジェニック植物を製造するための方法であって：
ＥＰＳＰＳ遺伝子中に標的化された変異をもつリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基を植物細胞内へ導入して、１以上のアミノ酸位置において変異されている変異ＥＰＳＰＳタンパク質を発現する、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子をもつ植物細胞を製造すること、但し、前記位置はシロイヌナズナのＥＰＳＰＳタンパク質（ＡＦ３６０２２４）のＬｅｕ₁₆₀、Ｔｈｒ₁₇₉、Ｐｒｏ₁₈₃、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₁₉₄からなる群より選択されるか、又はＥＰＳＰＳパラログの類似アミノ酸残基においてであり、ＸはＬｅｕではない；
野生型ＥＰＳＰＳタンパク質と実質的に同じ触媒活性を示し、かつグリホサートの存在下であってもその活性を示す、変異ＥＰＳＰＳタンパク質を有する植物細胞を同定すること；及び
（ｃ）前記植物細胞から、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する除草剤抵抗性又は耐性のノントランスジェニック植物を再生すること、
を含んでなる方法。
前記リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基が混合二重鎖ヌクレオチド又はＳＳＭＯＶである、請求項１又は２に記載の方法。
前記混合二重鎖ヌクレオチドが、標的ＥＰＳＰＳ遺伝子の第１のフラグメントの少なくとも６塩基対の配列と同一の配列を有する第１の相同領域と、標的ＥＰＳＰＳ遺伝子の第２のフラグメントの少なくとも６塩基対の配列と同一の配列を有する第２の相同領域と、かつ標的ＥＰＳＰＳ遺伝子に対し非相同な少なくとも１つの核酸塩基を含有する介在領域とを含有しており、前記介在領域が第１及び第２の相同領域を連結している、請求項３に記載の方法。
前記リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基が、エレクトロポレーションにより導入される、請求項１又は２に記載の方法。
前記アミノ酸位置が、トウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）パラログのＬｅｕ₈₄、Ｔｈｒ₁₀₂、Ｐｒｏ₁₀₆、Ｖａｌ₁₁₇、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₃₇₄からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記アミノ酸位置が、ブラシカ種（Ｂｒａｓｓｉｃａｓｐ）パラログ（Ｘ５１４７５．１）のＬｅｕ₁₅₅、Ｔｈｒ₁₇₄、Ｐｒｏ₁₇₈、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₁₈₉からなる群より選択される、請求項１の方法。
前記アミノ酸位置が、ペチュニア・ヒブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａ）パラログのＬｅｕ₁₅₅、Ｔｈｒ₁₇₄、Ｐｒｏ₁₇₈、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₁₈₉からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記植物細胞が、トウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、セイヨウナタネ、ナタネ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウ、レンズマメ、ブドウ、芝草、及びブラシカ種からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の植物。
前記アミノ酸位置が、トウモロコシパラログのＬｅｕ₈₄、Ｔｈｒ₁₀₂、Ｐｒｏ₁₀₆、Ｖａｌ₁₁₇、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₃₇₄からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
前記アミノ酸位置が、ブラシカ種パラログのＬｅｕ₁₅₅、Ｔｈｒ₁₇₄、Ｐｒｏ₁₇₈、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₁₈₉からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
前記アミノ酸位置が、ペチュニア・ヒブリダパラログのＬｅｕ₁₅₅、Ｔｈｒ₁₇₄、Ｐｒｏ₁₇₈、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₁₈₉からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
除草剤抵抗性又は耐性のノントランスジェニック植物を製造するための方法であって：
ＥＰＳＰＳ遺伝子中に標的化された変異をもつリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基を植物細胞内へ導入して、シロイヌナズナＥＰＳＰＳタンパク質（ＡＦ３６０２２４）のアミノ酸位置、Ｔｈｒ₁₇₉及びＰｒｏ₁₈₃において、又はＥＰＳＰＳパラログの類似アミノ酸残基において変異されているＥＰＳＰＳタンパク質を発現する、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子をもつ植物細胞を製造すること、但し、Ｔｈｒ₁₇₉はＩｌｅへ変化され、Ｐｒｏ₁₈₃はＴｈｒ又はＡｌａへ変化されている；
対応する野生型植物細胞に比較して、グリホサートに対し改善された耐性を示す植物細胞を選択すること；及び
前記選択された植物細胞から、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有する除草剤抵抗性又は耐性のノントランスジェニック植物を再生すること、
を含んでなる方法。
前記アミノ酸位置が、トウモロコシパラログのＴｈｒ₁₀₂及びＰｒｏ₁₀₆である、請求項１３に記載の方法。
前記アミノ酸位置が、ブラシカ種パラログのＴｈｒ₁₇₄及びＰｒｏ₁₇₈である、請求項１３に記載の方法。
前記アミノ酸位置が、ペチュニア・ヒブリダパラログのＴｈｒ₁₇₄及びＰｒｏ₁₇₈である、請求項１３に記載の方法。
変異ＥＰＳＰＳ遺伝子産物を発現する除草剤抵抗性の植物であって、但し、ＥＰＳＰＳ遺伝子は前記遺伝子産物中の１以上のアミノ酸位置を変えるべく、１つの位置において変異されており、前記アミノ酸位置がシロイヌナズナのＥＰＳＰＳタンパク質（ＡＦ３６０２２４）のＬｅｕ₁₆₀、Ｔｈｒ₁₇₉、Ｐｒｏ₁₈₃、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₁₉₄からなる群より選択されるか、又はＥＰＳＰＳホモログの類似アミノ酸位置においてであり、但し、ＸがＬｅｕではない植物。
前記植物がトウモロコシであり、前記アミノ酸位置がＬｅｕ₈₄、Ｔｈｒ₁₀₂、Ｐｒｏ₁₀₆、Ｖａｌ₁₁₇、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₃₇₄からなる群より選択される、請求項１７に記載の植物。
前記植物が、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）であり、前記アミノ酸位置がＬｅｕ₁₅₅、Ｔｈｒ₁₇₄、Ｐｒｏ₁₇₈、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₁₈₉からなる群より選択される、請求項１７に記載の植物。
前記植物が、ペチュニア・ヒブリダであり、前記アミノ酸位置がＬｅｕ₁₅₅、Ｔｈｒ₁₇₄、Ｐｒｏ₁₇₈、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₁₈₉からなる群より選択される、請求項１７に記載の植物。
前記植物が、トウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、ダイズ、ワタ、テンサイ、セイヨウナタネ、ナタネ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウ、レンズマメ、ブドウ、及び芝草、からなる群より選択される、請求項１７に記載の植物。
前記変異遺伝子が、結果として、ＥＰＳＰＳ遺伝子産物において、野生型配列に比較して１以上の下記アミノ酸置換：Ｌｅｕ₁₆₀Ｓｅｒ、Ｔｈｒ₁₇₉Ｉｌｅ又はＡｌａ、Ｐｒｏ₁₈₃Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ、Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ、Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ、Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及びＸ₁₉₄Ｌｅｕ、を生じ、但し、下付き数字の左のアミノ酸は天然のアミノ酸であり、下付き数字の右のアミノ酸は変異アミノ酸であり、かつＸはＬｅｕ以外の任意のアミノ酸である、請求項１７に記載の植物。
前記変異遺伝子が、結果として、トウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）ＥＰＳＰＳ遺伝子産物において、野生型配列に比較して１以上の下記アミノ酸置換：Ｌｅｕ₈₄Ｓｅｒ、Ｔｈｒ₁₀₂Ｉｌｅ又はＡｌａ、Ｐｒｏ₁₀₆Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ、Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ、Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ、Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及びＸ₃₇₄Ｌｅｕ、を生じ、但し、下付き数字の左のアミノ酸は天然のアミノ酸であり、下付き数字の右のアミノ酸は変異アミノ酸である、請求項１８に記載の植物。
前記変異遺伝子が、結果として、プラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）ＥＰＳＰＳ遺伝子産物において、野生型配列に比較して１以上の下記アミノ酸置換：Ｌｅｕ₁₅₅Ｓｅｒ、Ｔｈｒ₁₇₄Ｉｌｅ又はＡｌａ、Ｐｒｏ₁₇₈Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ、Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ、Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ、Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及びＸ₃₇₄Ｌｅｕ、を生じ、但し、下付き数字の左のアミノ酸は天然のアミノ酸であり、下付き数字の右のアミノ酸は変異アミノ酸である、請求項１９に記載の植物。
前記変異遺伝子が、結果として、ペチュニア・ヒブリダＥＰＳＰＳ遺伝子産物において、野生型配列に比較して１以上の下記アミノ酸置換：Ｌｅｕ₁₅₅Ｓｅｒ、Ｔｈｒ₁₇₄Ｉｌｅ又はＡｌａ、Ｐｒｏ₁₇₈Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ、Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ、Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ、Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及びＸ₃₇₄Ｌｅｕ、を生じ、但し、下付き数字の左のアミノ酸は天然のアミノ酸であり、下付き数字の右のアミノ酸は変異アミノ酸である、請求項２０に記載の植物。
図１に描かれた大腸菌ＥＰＳＰＳ遺伝子産物のアミノ酸配列を含んでなるか、又は、ＥＰＳＰＳホモログの類似アミノ酸位置において、Ｌｅｕ₈₂、Ｔｈｒ₉₇、Ｐｒｏ₁₀₁、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃、及びＸ₁₁₁、但しＸはＬｅｕ以外の任意のアミノ酸である、からなる群より選択される１以上のアミノ酸が別のアミノ酸へ変化されている、変異ＥＰＳＰＳタンパク質であって、ホスホノメチルグリシン除草剤に対し増大された抵抗性又は耐性を有する変異ＥＰＳＰＳタンパク質。
前記変異アミノ酸が、Ｌｅｕ₈₂Ｓｅｒ、Ｔｈｒ₉₇Ｉｌｅ又はＡｌａ、Ｐｒｏ₁₀₁Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ、Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ、Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ、Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及びＸ₃₇₄Ｌｅｕからなる群より選択され、但し、下付き数字の左のアミノ酸は天然のアミノ酸であり、下付き数字の右のアミノ酸は変異アミノ酸である、請求項２６に記載の変異ＥＰＳＰＳタンパク質。
２つのアミノ酸が変異されている、請求項２７に記載の変異ＥＰＳＰＳタンパク質。
下記アミノ酸位置が変異されている：（ａ）Ｔｈｒ₉₇Ｉｌｅ及びＰｒｏ₁₀₁Ｔｈｒ、又は（ｂ）Ｔｈｒ₉₇Ｉｌｅ及びＰｒｏ₁₀₁Ａｌａ、請求項２８に記載の変異ＥＰＳＰＳタンパク質。
２つのアミノ酸が変異されている、請求項２２に記載の植物。
下記アミノ酸位置が変異されている：（ａ）Ｔｈｒ₁₇₉Ｉｌｅ及びＰｒｏ₁₈₃Ｔｈｒ、又は（ｂ）Ｔｈｒ₁₇₉Ｉｌｅ及びＰｒｏ₁₈₃Ａｌａ、請求項３０に記載の植物。
前記変異された遺伝子が、結果として、ＥＰＳＰＳ遺伝子産物において、野生型配列に比較して、１以上の下記アミノ酸置換：Ｌｅｕ₁₆₀Ｓｅｒ、Ｔｈｒ₁₇₉Ｉｌｅ又はＡｌａ、Ｐｒｏ₁₈₃Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ、Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ、Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ、Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及びＸ₃₇₄Ｌｅｕ、を生じ、但し、下付き数字の左のアミノ酸は天然のアミノ酸であり、下付き数字の右のアミノ酸は変異アミノ酸であり、かつＸはＬｅｕ以外の任意のアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
２つのアミノ酸が変異されている、請求項３２に記載の方法。
下記アミノ酸位置が変異されている：（ａ）Ｔｈｒ₁₇₉Ｉｌｅ及びＰｒｏ₁₈₃Ｔｈｒ、又は（ｂ）Ｔｈｒ₁₇₉Ｉｌｅ及びＰｒｏ₁₈₃Ａｌａ、請求項３３に記載の方法。
前記変異された遺伝子が、結果として、ＥＰＳＰＳ遺伝子産物において、野生型配列に比較して、１以上の下記アミノ酸置換：Ｌｅｕ₁₆₀Ｓｅｒ、Ｔｈｒ₁₇₉Ｉｌｅ又はＡｌａ、Ｐｒｏ₁₈₃Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ、Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ、Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ、Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及びＸ₃₇₄Ｌｅｕ、を生じ、但し、下付き数字の左のアミノ酸は天然のアミノ酸であり、下付き数字の右のアミノ酸は変異アミノ酸であり、かつＸはＬｅｕ以外の任意のアミノ酸である、請求項２に記載の方法。
２つのアミノ酸が変異されている、請求項３２に記載の方法。
下記アミノ酸位置が変異されている：（ａ）Ｔｈｒ₁₇₉Ｉｌｅ及びＰｒｏ₁₈₃Ｔｈｒ、又は（ｂ）Ｔｈｒ₁₇₉Ｉｌｅ及びＰｒｏ₁₈₃Ａｌａ、請求項３３に記載の方法。
変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するノントランスジェニック大腸菌を製造するための方法であって：
ＥＰＳＰＳ遺伝子中に標的化された変異をもつリコンビナジェニックオリゴ核酸塩基を大腸菌細胞内へ導入して、１以上のアミノ酸位置において変異されているＥＰＳＰＳタンパク質を発現する、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子をもつ大腸菌細胞を製造すること、但し、前記位置はＬｅｕ₈₂、Ｔｈｒ₉₇、Ｐｒｏ₁₀₁、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、Ａｓｎ₁₉₃からなる群より選択される；
グリホサートの存在下に実質的に正常な成長を有する大腸菌細胞コロニーを同定すること；及び
ＥＰＳＰＳ変異遺伝子を含有する１以上の大腸菌細胞を単離すること、
を含んでなる方法。
前記リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基が、混合二重鎖ヌクレオチド又はＳＳＭＯＶである、請求項３８に記載の方法。
前記混合二重鎖ヌクレオチドが、大腸菌ＥＰＳＰＳ遺伝子の第１のフラグメントの少なくとも６塩基対の配列と同一の配列を有する第１の相同領域と、大腸菌ＥＰＳＰＳ遺伝子の第２のフラグメントの少なくとも６塩基対の配列と同一の配列を有する第２の相同領域と、かつ標的ＥＰＳＰＳ遺伝子に対し非相同な、少なくとも１つの核酸塩基を含有する介在領域とを含有しており、前記介在領域が第１及び第２の相同領域を連結している、請求項３９に記載の方法。
前記変異遺伝子が、結果として、ＥＰＳＰＳ遺伝子産物において、野生型配列に比較して、１以上の下記アミノ酸置換：Ｌｅｕ₈₂Ｓｅｒ、Ｔｈｒ₉₇Ｉｌｅ又はＡｌａ、Ｐｒｏ₁₀₁Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ、Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ、Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ、Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、を生じ、但し、下付き数字の左のアミノ酸は天然のアミノ酸であり、下付き数字の右のアミノ酸は変異アミノ酸である、請求項３８に記載の方法。
変異ＥＰＳＰＳ遺伝子産物を発現する変異大腸菌細胞であって、ＥＰＳＰＳ遺伝子が、前記遺伝子産物中の１以上のアミノ酸位置を変えるべく、１つの位置において変異されており、前記アミノ酸位置が、Ｌｅｕ₈₂、Ｔｈｒ₉₇、Ｐｒｏ₁₀₁、Ｖａｌ₁₁₄、Ａｓｐ₁₆₄、及びＡｓｎ₁₉₃からなる群より選択される、変異大腸菌細胞。
前記変異遺伝子が、結果として、ＥＰＳＰＳ遺伝子産物において、野生型配列に比較して、１以上の下記アミノ酸置換：Ｌｅｕ₈₂Ｓｅｒ、Ｔｈｒ₉₇Ｉｌｅ又はＡｌａ、Ｐｒｏ₁₀₁Ａｌａ又はＴｈｒ又はＬｅｕ又はＣｙｓ又はＧｌｙ、Ｖａｌ₁₁₄Ａｌａ、Ａｓｐ₁₆₄Ａｌａ、Ａｓｎ₁₉₃Ａｌａ、及びＸ₃₇₄Ｌｅｕを生じ、下付き数字の左のアミノ酸は天然のアミノ酸であり、下付き数字の右のアミノ酸は変異アミノ酸である、請求項４２に記載の変異大腸菌細胞。