KR100524818B1 - 한세눌라 폴리모파의 시키메이트 경로 다기능 효소를코딩하는 유전자 및 이를 이용한 코리스메이트의 생합성방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한세눌라 폴리모파의 시키메이트 경로 다기능 효소를 코딩하는 유전자 및 이를 이용한 코리스메이트의 생합성방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 시키메이트 경로 중 다섯 단계의 효소반응을 수행할 수 있는 다기능 효소의 유전자를 메탄올 자화효모인 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)로부터 클로닝하고 이 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하며, 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시킨 형질전환 균주로부터 아로1을 발현시킴으로써 시키메이트 경로를 증폭시켜 세균, 효모, 곰팡이, 식물 등에서 방향족 화합물을 생합성하는데 사용되는 공통 전구체인 코리스메이트를 생합성하는 방법에 관한 것이다.

Description

한세눌라 폴리모파의 시키메이트 경로 다기능 효소를 코딩하는 유전자 및 이를 이용한 코리스메이트의 생합성방법{Hansenula polymorpha gene encoding a pentafunctional enzyme of shikimate pathaway and its use for biosynthesis of chorismate}

본 발명은 한세눌라 폴리모파의 시키메이트 경로 다기능 효소를 코딩하는 유전자 및 이를 이용한 코리스메이트의 생합성방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 시키메이트 경로 중 다섯 단계의 효소반응을 수행할 수 있는 다기능 효소인 아로1을 코딩하는 유전자를 메탄올 자화효모인 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)로부터 클로닝하고 이 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하며, 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시킨 형질전환 균주로부터 아로1을 발현시킴으로써 시키메이트 경로를 증폭시켜 세균, 효모, 곰팡이, 식물 등에서 방향족 화합물을 생합성하는데 사용되는 공통 전구체인 코리스메이트를 생합성하는 방법에 관한 것이다.

최근의 재조합 DNA 기술, 세포 생리학, 분자 유전학, 기능 유전체학, 및 발효공정 분야의 발전으로 대사공학 기술의 발전이 더욱 가속화되고 있으며 동시에 보다 많은 제품을 생물산업을 통해 생산하려는 방향으로 산업구조 자체도 변환되어 가고 있다. 따라서 기존의 제한적이고 단순한 형질조작수준의 대사공학은 다음과 같은 분야로까지 그 범위가 확대 적용되고 있다. 즉, 1) 반응속도제한, 전사조절, 혹은 자가억제 단계를 제거함으로써 최종산물 생산을 위한 대사경로의 최적화하고 완결시키며, 2) 원하는 대사경로와 경쟁하는 대사경로를 차단하고, 3) 중추 대사회로로부터 해당 대사경로로 탄소원의 흐름을 증대시키며, 4) 조작된 대사회로에 필요한 효소반응 보조인자들이나 에너지 공급을 증대시키기 위해 부가적인 대사회로 조작도 수행하고 있다. 나아가 최근 기하급수적으로 축적되고 있는 각종 생명체의 유전체 염기서열 정보를 활용하여 신규 유용유전자를 확보하고 분자진화 기법이나 게놈공학 기술 등을 통해 우수한 재조합 균주를 제작하는 사례가 점차 증가하고 있다. 예를 들어 각종 방향족 화합물을 생합성하는데 사용되는 공통 전구체인 코리스메이트(Chorismate)를 생합성하는 대사회로인 시키메이트 경로(Shikimate pathway)가 최적화된 숙주는 부가적인 대사회로 조작을 통해 여러 가지 일차 방향족 화합물을 생산하기 위한 초기 숙주로 사용될 수 있으며 새로운 유전자의 도입이나 생화학 전환공정의 도입을 통해 이차 방향족 화합물 생산에도 사용될 수 있는 고 부가가치의 방향족 화합물 양산용 균주가 될 것이다.

세균, 곰팡이, 그리고 식물은 해당과정의 중간체의 하나인 포스포에놀파이루베이트(phosphoenolpyruvate)와 펜토즈 포스페이트 경로(pentose phosphate pathway)에서 만들어지는 에리쓰로즈 4-포스페이트(erythrose 4-phosphate)를 전구체로 사용하여 일련의 효소반응에 의해 시키메이트(shikimate)를 거쳐 코리스메이트(chorismate)를 생성하는 대사경로인 일명 시키메이트 경로(shikimate pathway)를 지니고 있다. 미생물에 있어서 시키메이트 경로에 의해 생성되는 코리스메이트는 방향족 아미노산(트립토판, 페닐알라닌, 티로신), 철분동화체 시드로포어(siderophore)의 일종인 엔테로박틴(enterobactin), 유비퀴논(ubiquinone)이라 불리는 조효소 Q(coenzyme Q), 메나퀴논(menaquinone)으로도 알려진 비타민 K, 엽산 등 각종 방향족 화합물을 생합성하기 위한 대사경로들에 공통적인 전구체로 사용되는 물질이다. 식물의 경우에는 식물성장, 발달 혹은 방어 기전에 사용되는 수많은 일차 혹은 이차 방향족 화합물들이 시키메이트 경로로부터 유래하며 광합성에 의해 동화된 탄소원의 20% 가량이 시키메이트 경로에 사용되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 동물에는 시키메이트 경로가 존재하지 않는다. 따라서, 시키메이트 경로를 억제할 수 있는 제초제나 항생제 개발 가능성에 대해 많이 연구되어지고 있다. 한편, 시키메이트 경로에서 생산된 코리스메이트로부터 생합성되는 각종 방향족 화합물들은 부가적인 효소반응이나 화학반응에 의하여 인돌초산(indolacetic acid), 인디고(indigo), 아스파탐(aspartame), 멜라닌(melanin), 애디픽산(adipic acid) 등 다양한 형태의 산업적으로 고부가가치를 지니는 물질로 전환될 수 있으며 실제 여러 국가에서 활발히 연구되어지고 있다.

대장균의 시키메이트 경로는 총 7 단계의 효소반응으로 구성되어 있으며, 첫 단계는 펜토즈포스페이트 경로(pentose phosphate pathway)에서 생산된 에리쓰로즈포스페이트(erythrose-4-phosphate)와 해당과정 중간산물인 포스포에놀 파이루베이트(phosphoenolpyruvate)로부터 3-디옥시-D-아라비노-헵틀로소네이트 7-포스페이트 (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate)를 생합성하는 단계로 아로F(aroF), 아로G(aroG), 아로H(aroH) 유전자에 의해 코딩되는 3개 3-디옥시-D-아라비노-헵틀로소네이트 7-포스페이트 씬쎄이즈(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase) 효소들이 촉매할 수 있으며, 이들 3 유전자의 발현과 효소 활성은 세포 내 다양한 방향족 화합물의 필요성에 따라 복잡하게 조절된다. 두 번째 단계에서는 3-디옥시-D-아라비노-헵틀로소네이트 7-포스페이트가 아로B(aroB) 유전자에 의해 코딩되는 3-디하이드로퀴네이트 신쎄이즈(3-dehydroquinate synthase)에 의해 디하이드로퀴네이트(3-dehydroquinate)로 전환된다. 세 번째 단계에서는 디하이드로퀴네이트가 아로D(aroD) 유전자에 의해 코딩되는 디하이드로퀴네이트 디하이드라타제(3-dehydroquinate dehydratase)에 의해 3-디하이드로 시키메이트(3-dehydroshikimate)로 전환된다. 네 번째 단계에서는 디하이드로시키메이트가 아로E(aroE) 유전자에 의해 코딩되는 시키메이트 디하이드로제나아제(shikimate dehydrogenase)에 의해 시키메이트(shikimate)로 전환된다. 다섯 번째 단계에서는 시키메이트가 아로K(aroK) 혹은 아로L(aroL) 유전자에 의해 코딩되는 시키메이트카이나아제(shikimate kinase)에 의해 시키메이트-3-포스페이트(shikimate-3-phosphate)로 전환된다. 여섯 번째 단계에서는 시키메이트-3-포스페이트가 아로A(aroA) 유전자에 의해 코딩되는 3-에놀파이루빌-시키메이트-3-포스페이트 씬쎄이즈(3-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase)에 의해 3-에놀파이루빌-시키메이트-3-포스페이트 (3-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate)로 전환된다. 마지막 일곱 번째 단계에서는 3-에놀파이루빌-시키메이트-3-포스페이트가 아로C(aroC) 유전자에 의해 코딩되는 코리스메이트 신쎄이즈(chorismate synthase)에 의해 코리스메이트(chorismate)로 전환된다. 그러나, 생물의 종에 따라 시키메이트 경로의 구성, 유전자의 조절, 효소의 활성 조절 기전 등이 매우 다양한 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 효모나 곰팡이의 경우에는 대장균의 시키메이트 경로의 두 번째 단계부터 여섯 번째 단계에 해당하는 다섯 단계의 효소 반응이 아로1(aro1) 유전자에 의해 코딩되는 아로1(ARO1) 혹은 아롬(AROM) 다기능 효소에 의해 촉매되는 것으로 알려져 있다.

시키메이트 경로는 전기한 바와 같이 산업적으로 매우 중요한 생합성경로로써 좋은 대사공학 타겟으로 여겨지고 있다. 그러나, 그 복잡성 때문에 극히 제한 된 부분만이 연구되어졌고, 그 대표적인 예는 1) 대사회로의 첫 단계로서 포스포에놀파이루베이트와 에리쓰로즈-4-포스페이트부터 3-디옥시-D-아라비노-헵틀로소네이트 7-포스페이트를 합성하는 3-디옥시-D-아라비노-헵틀로소네이트 7-포스페이트 씬쎄이즈 효소의 피드백인히비션(feedback inhibition)을 제거하기 위한 돌연변이 유전자의 선별, 2) 전사조절기전을 회피하기 위한 새로운 프로모터를 사용하거나 벡터를 사용하여 복수의 유전자를 발현, 3) 타겟물질 생합성 경로 이외에 코리스메이트를 전구체로 사용하는 다른 대사경로가 차단된 돌연변이 사용, 4) 기질인 에리쓰로즈-4-포스페이트의 공급을 늘리기 위해 트랜스케토라아제(transketolase) 효소의 발현을 증대, 5) 기질인 포스포에놀파이루베이트의 농도를 높이기 위한 돌연변이의 선별 등이다. 또한, 이러한 연구들의 대부분은 외국대학의 연구진들에 의해 산발적으로 수행된 것들이며 산업화에 응용하기 위한 시도는 아직 미흡한 실정이다. 예를 들어 시키메이트 경로에서 시작되는 방향족 아미노산 생산을 증대시키기 위한 미생물발효도 아직은 기존의 전통적인 방법에 의해 선별된 돌연변이들을 활용하는 차원에 머물고 있으며 최근에서야 생산균주의 염기서열 분석 등이 이루어지고 있다. 따라서, 최근 기하급수적으로 축적되고 있는 다양한 생명체의 유전체 염기서열 정보를 바탕으로 산업적으로 잠재가치가 높은 시키메이트 경로를 최적화하기 위한 새로운 방법의 개발이 절실하다.

하지만 지금까지 효모나 곰팡이로부터 밝혀진 대부분의 7종의 아로1(aro1) 유전자는 대부분 그 기능에 대한 정보없이 단지 DNA 염기서열만이 알려져 있는 상태로서 효모 사카로마이세스 쎄레비지애(Saccharomyces cerevisiae)나 곰팡이 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 혹은 아스퍼질러스 니둘런스(Aspergillus nidulan) 유래의 아로1 단백질을 대상으로 한 부분적인 기능보완 실험만이 행해졌을 뿐이다[Hawkins et al. J. Gen. Microbiol. 139:2891, (1993), Duncan et al. Biochem. J. 246:375 91987)]. 한편, 기존의 시키메이트 경로를 증폭하는 방법으로는 주로 숙주 자체의 일부 혹은 다수의 시키메이트 관련 유전자들을 벡터에 클로닝하여 형질전환하는 수준에 머물러 있었다. 따라서, 다수의 유전자를 도입하여 동시에 발현시키기 위한 프로모터의 선택이 어려웠고 다수의 이종 유전자를 도입하기 위한 공존가능 벡터의 선별이나 항생제 내성유전자 등의 선별표지의 선택에 많은 제약이 따랐다. 하지만 아로1 유전자를 사용하여 시키메이트 경로를 증폭하기 위한 연구는 아직 시도된 바가 없었다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 기존의 시키메이트 경로 대사공학의 문제점을 해결하고 각종 고부가가치 방향족 화합물을 생산할 수 있는 기반을 구축하기 위하여 연구한 결과, 대장균이 아닌 다른 종으로부터 시키메이트 경로의 다섯 효소반응을 촉매할 수 있는 단일 효소인 아로1을 코딩하는 유전자를 확보하여 시키메이트 경로 재설계의 소재로 사용함으로써 기존의 방법보다 재조합 균주의 제작이나 유전자 발현 조절이 용이한 방법으로 대장균의 시키메이트 경로를 증폭시킴을 확인으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 메탄올 자화효모인 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)로부터 분리된 신규 아로1 유전자(HpARO1) 및 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체로부터 발현된 아로1(ARO1) 다기능 효소를 사용하여 시키메이트 경로를 증폭시킴으로써 코리스메이트를 생합성하는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 메탄올 자화효모인 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)로부터 분리된 신규 아로1 유전자(HpARO1)에 그 특징이 있다.

또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 형질전환시킨 형질전환체를 포함한다.

이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 시키메이트 경로 중 다섯 단계의 효소반응을 수행할 수 있는 다기능 효소의 유전자를 메탄올 자화효모인 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)로부터 클로닝하고 이 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하며, 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시킨 형질전환 균주로부터 아로1을 발현시킴으로써 시키메이트 경로를 증폭시켜 세균, 효모, 곰팡이, 식물 등에서 방향족 화합물을 생합성하는데 사용되는 공통 전구체인 코리스메이트를 생합성하는 방법에 관한 것이다.

아직 공개되지 않은 한세눌라 폴리모파의 유전체 염기서열을 분석하는 과정에서 효모 사카로마이세스 쎄레비지애 유래의 아로1과 상동성이 높은 폴리펩타이드를 코딩할 수 있을 것으로 추정되는 염색체 부위를 확인하였다. 이 추정 아로1 유전자의 기능을 확인하기 위하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 해당 DNA 절편을 증폭하여 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)로 발현유도가 가능한 pTac 프로모터를 갖고 있는 발현벡터 pEXT20에 클로닝하여 pEXT20-HpARO1을 제작하였다. 상기 벡터 pEXT20-HpARO1을 대장균 DH5α에 형질전환하였으며, 상기 형질전환체를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2003년 12월 20일에 기탁하였고, 수탁번호 KCTC 10569BP을 부여받았다.

한편, 본 발명은 한세눌라 폴리모파 HpARO1 유전자를 포함하고 있는 상기 벡터 pEXT20-HpARO1을 시키메이트 경로의 효소를 코딩하는 aroA, aroB, aroD, aroE 유전자가 결핍된 대장균이나 aroK와 aroL 유전자가 동시에 결핍된 대장균에 형질전환하여 성공적으로 시키메이트 경로 활성을 복원함으로써 HpARO1 유전자가 상기한 다섯가지 시키메이트 경로 관련 효소의 활성을 모두 갖고 있는 다기능 효소를 코딩하는 유전자임을 확인하는 방법을 포함한다,

또한, 본 발명은 pEXT20-HpARO1 벡터로 형질전환된 대장균 내에서 HpARO1 유전자의 발현을 유도하고 검증하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은 pEXT20-HpARO1 벡터로 형질전환된 균주에서 아로1을 발현시킴으로써 세균, 효모, 곰팡이, 식물 등에서 방향족 화합물을 생합성하는데 사용되는 공통 전구체인 코리스메이트를 생합성하는 시키메이트 경로를 증폭시키는 방법을 포함한다.

따라서, 본 발명은 한세눌라 폴리모파에서 클로닝한 시키메이트 경로 다기능 효소 유전자 HpARO1을 포함하고 있는 벡터를 대장균에 형질전환 할 경우 단일 벡터, 단일 프로모터를 사용하여 다섯 개의 효소활성을 동시에 증폭함으로써 효율적으로 시키메이트 경로가 증폭되어 각종 고부가가치 방향족 화합물을 생산하기 위한 기반구축에 매우 유용하게 사용될 것이다. 즉 부가적인 유전공학조작에 의해 시키메이트 경로 첫 단계를 촉매하는 효소와 마지막 단계를 촉매하는 효소의 발현을 증대시킬 경우 전체 시키메이트 경로의 발현을 쉽게 최적화 할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명은 다음 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1) 한세눌라 폴리모르파 A16으로부터 아로1 유전자 분리

한세눌라 폴리모파의 유전체 염기서열 분석을 통하여 기존에 알려진 사카로마이세스 쎄레비지애의 아로1과 유사한 단백질을 코딩할 수 있을 것으로 추정되는 부위가 확인되었다. 이 추정 아로1 유전자를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 클로닝하기 위하여 우선 PCR에 사용할 주형 DNA를 한세눌라 폴리모르파 A16 균주로부터 분리하였다. 확보된 DNA를 주형으로 사용하고 한 쌍의 올리고뉴클에오타이드(5'-CCCGAATTCATGACGACTCGCGTTGAAAAAGTG-3': 서열번호 3, 5'-CCCAAGCTTTTATCTAATCACCGCCTCATAGAC-3': 서열번호 4)를 프라이머로 이용하여 PCR 증폭을 시행하였다. PCR 산물로부터 아가로즈 젤 전기영동을 이용하여 4.7 kb DNA 절편을 분리하였으며 이를 제한효소 EcoRI과 HindIII로 처리하였다.

2) 재조합 발현벡터 pEXT20-HpARO1 제작 및 형질전환

한편 상기 DNA 절편을 클로닝하기 위하여 대장균용 발현벡터의 일종인 pEXT20을 사용하였다. 이 벡터는 IPTG를 처리함으로써 클로닝된 유전자의 발현을 유도할 수 있는 pTac 프로모터를 함유하고 있으며 선별표지로서 항생제 앰피실린(Ampicillin) 내성 유전자를 갖고 있다[Dykxhoorn et al. Gene 177:133, (1996)]. 상기 벡터 pEXT20을 제한효소 EcoRI과 HindIII로 처리한 후 PCR에 의해 증폭하여 동일 제한효소로 처리한 상기 한세눌라 폴리모파 아로1 유전자를 삽입하여 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 이 형질전환체 중 한세눌라 폴리모파 아로1 유전자를 포함하고 있는 형질전환제를 선발하기 위하여 앰피실린 저항성을 보이는 형질전환체로부터 벡터를 분리하였다. 이들 벡터를 제한 효소 EcoRI과 HindII로 처리한 후 아가로즈 젤 전기영동에 의해 분리하였다. 이 아가로즈 젤 상에서 pEXT20에 해당하는 3.9 Kb DNA 절편과 한세눌라 폴리모파 아로1에 해당하는 4.7 Kb DNA 절편을 보이는 벡터를 분리하여 클로닝된 DNA절편에 대한 염기서열 분석을 수행하였으며 최종적으로 한세눌라 폴리모파 유래 aro1 유전자가 도입된 재조합 플라스미드 pEXT20-HpARO1을 확보하였다. 상기 벡터 pEXT20-HpARO1을 대장균 DH5α에 형질전환하였으며 상기 형질전환체를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2003년 12월 20일에 기탁하였고, 수탁번호 KCTC 10569BP을 부여받았다.

3) 형질전환체로 발현된 한세눌라 폴리모파 아로1과 기존의 아로1 비교

한세눌라 폴리모르파 아로1(서열번호 2)은 기존에 알려진 효모 혹은 사상성 진균류의 아로1과의 유사성을 다음 표 1에 나타내었다.

ARO1(출처)	HpARO1(Hansenula polymorpha)
ScARO1(Sccharomyces cerevisiae)	51%(67%)
NcARO1 (Neurospora crassa)	48%(63%)
SpARO1(Schizosaccharomyces pombe)	48%(62%)
AfARO1(Aspergillus fumigatus)	50%(67%)
EnARO1(Emericella nidulans)	43%(62%)
PcARO1(Pneumocystis carinii)	58%(74%)
* 유사성은 ( )안에 표시.

실시예 2 : 한세눌라 폴리모르파 HpARO1 유전자의 기능 분석

시키메이트 경로 관련 효소를 코딩하는 유전자가 결손된 대장균 변이주의 경우 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 조효소 Q, 메나퀴논 등 여러 종류의 방향족 화합물을 생합성할 수 없기 때문에 이들 화합물이 결여된 최소배지에서는 자라지 못하는 특성이 있다[Pittard and Wallace, J. Bacteriol. 91:1494, (1966)]. 본 발명자들이 한세눌라 폴리모파에서 클로닝한 HpARO1 유전자의 기능을 분석하기 위한 방법의 일환으로 HpARO1 유전자를 시키메이트 경로 유전자가 결핍된 대장균에 형질전환시켜 한세눌라 폴리모르파 HpARO1 유전자 발현이 대장균의 시키메이트 경로 유전자 변이주들의 최소배지 성장능을 회복시킬 수 있는 지를 살펴보는 기능보완(functional complementation) 실험을 수행하였다.

HpARO1 유전자를 대장균에서 발현시키기 위해 HpARO1 유전자가 포함된 4.7 kb DNA 절편을 대장균용 벡터 pEXT20[Dykxhoorn et al. Gene 177:133, (1996)]에 삽입하여 pEXT20-HpARO1을 제작하였다[도 1]. 상기한 pEXT20-HpARO1 벡터를 시키메이트 경로 상 일곱단계 효소반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자가 결손된 7종의 대장균 변이주와 야생형 대장균에 형질전환하였다[표 2]. 벡터 pEXT20 자체를 상기한 균주들에 형질전환하여 대조구로 사용하였다.

대장균 야생형과 시키메이트 경로 관련 유전자가 결손된 돌연변이주

대장균 균주	시키메이트 경로 유전형질
DH5α	야생형
AB2829	aroA
AB2834	aroE
AB2847	aroB
AB2848	aroD
AB2849	aroC
AB3257	aroF, aroG, aroH
ALO807	aroK, aroL

HpARO1 유전자에 의한 시키메이트 경로 결손 변이 대장균들의 기능보완여부를 확인하기 위하여 각 형질전환 균주들을 포도당(0.5%)과 싸이아민(Thiamine, 0.05%)이 첨가된 M9 최소배지(M9 mineral salt medium)에 접종하여 37 ℃에서 진탕 배양하였다. 성장여부를 측정하기 위하여 매 2시간마다 배양액 시료를 채취하여 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

HpARO1 유전자로 형질전환된 시키메이트 경로 결손 변이주들 중 aroA, aroB, aroD, aroE 유전자가 결핍된 균주와 aroK와 aroL 유전자가 동시에 결핍된 균주는 야생형 대장균과 같이 최소배지에서 성장할 수 있었다[도 3]. 그러나, 대조구로 사용된 pEXT20 벡터만으로 형질전환된 상기 변이주들은 최소배지에서 성장할 수 없었다. 하지만, HpARO1 유전자가 포함된 벡터인 pEXT20-HpARO1를 시키메이트 첫단계를 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자인 aroF, aroG, aroH가 모두 파쇄된 대장균 변이주나 시키메이트 경로의 마지막 단계를 촉매하는 효소를 코딩하는 aroC 유전자가 파쇄된 대장균 변이주에 형질전환한 경우에는 여전히 최소배지에서 성장할 수 없었다.

이는 한세눌라 폴리모파 아로1 유전자 HpARO1에 의해 코딩되는 단백질 ARO1은 대장균의 시키메이트 경로 중 두 번째 단계에서부터 여섯 번째 단계까지를 촉매하는 다섯 개 효소가 가지고 있는 활성을 모두 지니고 있는 다기능 효소임을 입증하는 결과이다.

실시예 3 : HpARO1 유전자의 발현 검증

상기 확보된 HpARO1 유전자는 1551개의 아미노산으로 구성된 171 kD 크기의 폴리펩타이드를 코딩할 수 있는 것으로 추정된다. 대장균에 형질전환된 HpARO1 유전자로부터 아로1 단백질의 발현여부를 확인하기 위하여 야생형 대장균 DH5α에 각기 벡터 pEXT20과 pEXT20-HpARO1으로 형질전환하였다. 상기 형질전환 균주를 복합배지 LB(1% tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl)에 접종한 후 호기상태에서 배양하며 성장을 측정하였다. 배양액 시료의 600 nm에서의 흡광도가 0.6인 시점에서부터 2시간 간격으로 배양 시료를 채취하여 12.5% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 사용하여 총 단백질의 전기영동 분석을 실시하였다. 전기영동 후 젤을 쿠마시 블루(comassie blue)로 염색하여 발현된 단백질을 확인하였다. pEXT20-HpARO1으로 형질전환된 균주의 시료에서는 예상되는 아로1의 크기인 170 kD에 해당하는 단백질이 발현되었음을 확인할 수 있었다[도 4].

실시예 4 : HpARO1 유전자의 유도발현 및 효소활성검증

상기한 재조합 벡터 pEXT20-HpARO1에서 HpARO1 유전자는 대장균에서의 유전자 유도발현 시스템으로 많이 사용되는 pTac 프로모터 하에 클로닝되어 있으므로 이 프로모터를 사용하여 HpARO1의 발현을 유도할 수 있는지 검증하였다. 이를 위해 우선 벡터 pEXT20과 pEXT20-HpARO1을 시키메이트 경로에 중 시키메이트 디하이드로나아제 효소를 코딩하는 aroE 유전자가 결손된 대장균 돌연변이주에 각기 형질전환하였다. 상기한 형질전환 균주들을 복합배지 LB(1% tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl)에 접종한 후 호기상태에서 배양하며 성장을 측정하였다. 배양액 시료의 600nm에서의 흡광도가 0.6인 시점에서 IPTG를 0.04 mg/ml 농도로 배양액에 첨가하였다. IPTG 첨가 후 계속 배양하면서 2시간 간격으로 배양 시료를 채취하여 시키메이트 디하이드로나아제 효소 활성을 측정하였다. 채취한 배양시료는 원심분리에 의해 균체만을 분리한 후 이를 PBS 버퍼[(pH 7.4), 100 mM EDTA(pH 8.0)]에 녹인 후 라이소자임을 1 mg/ml 농도로 첨가한 후 37 ℃에서 1시간 반응한 후 세포를 초음파 세포파쇄기(Ulsso Hitech Ultrasonic Cell disrupter: ULCD 4000)를 사용하여 파쇄하였다. 이 세포 파쇄액을 15000 g에서 50분간 원심 분리하여 상등액만을 분리하여 효소활성 분석에 사용하였다. 각 시료의 단백질 정량을 BSA를 스탠다드로 BioRad 단백질 분석 시료를 사용하여 시행하였다. 시키메이트 디하이드로나아제는 가역반응 효소로서 그 활성분석은 John R. Coggins 보고한 논문[Chaudhuri et al., Methods Enzymol 142:315, (1987)]을 바탕으로 역반응 중 흡광도 변화를 측정방법을 사용하였다. 즉, 효소 반응 중 NADP⁺가 환원되는 정도를 340 nm(ε340nm = 6.18 ×10³M^-1cm ^-1)에서 관찰함으로써 효소 활성을 측정하였다. 효소반응은 100 mM 트리스-HCl(pH 9.0), 4 mM 시킴산(shikimic acid), 2 mM NADP⁺를 포함하고 있는 반응액에 총 단백질 2.5 mg/㎖을 첨가하여 최종반응부피 1 ㎖로 반응시켜 2분 간격으로 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. IPTG 첨가 후 시간대별로 채취한 시료의 효소 활성을 측정한 결과 IPTG 첨가 후 효소활성이 급격히 증가함을 확인할 수 있었다[도 5]. 이는 pEXT20-HpARO1 벡터상에 클로닝된 HpARO1 유전자가 벡터상에 존재하는 pTac 프로모터에 의해 유도발현 될 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 5 : HpARO1 유전자에 의한 야생형 대장균의 시키메이트 경로 증폭

한세눌라 폴리모파의 유전체로부터 확보한 다기능 시키메이트 효소 코딩유전자인 HpARO1이 대장균의 결손된 시키메이트 경로 유전자의 기능을 보완하는 것 외에도 전체 시키메이트 경로의 활성을 증폭할 수 있는지 확인하기 위하여 pEXT20과 pEXT20-HpARO1으로 야생형 대장균 DH5a를 형질전환하여 각각의 형질전환주를 확보하였다. 이 형질전환주들을 복합배지 LB에 접종하여 호기상태에서 진탕 배양하여 상기한 바와 같이 IPTG 유도발현을 시행하였다. IPTG 첨가 후 6시간 경과 후 시료를 채취하여 원심분리에 의해 상등액과 균체를 분리하였다. 우선 균체는 상기한 방법에 따라 시키메이트 디하이드로나아제 효소 활성을 측정하였으며 대조구인 pEXT20 형질전환주보다 pEXT20-HpARO1 형질전환주에서의 활성이 현격하게 증가되어있음을 확인할 수 있었다[도 6].

상등액은 동결건조한 후 HPLC를 사용하여 코리스메이트 분석을 실시하였다. 동결건조한 시료 10 mg 3차 증류수 1 ㎖에 용해한 후 여과하여 HPLC 샘플을 준비하였다. HPLC 수행 조건은 모바일 상으로 0.05% 트리플루오로아세트산을 포함한 20% 아세토니트릴을 사용하였으며 10 ㎕ 시료를 주입한 후 1 ㎖/min의 유속으로 Hitachi YMC-Pack ODS-AM(250 ×4.6 s-5 m,120) 컬럼을 사용하여 다이오드 어래이 디텍터(diode array detector, 274 nm)로 Younlin 9600 HPLC로 분석하였다. 0.05% 트리플루오로아세트산을 포함한 20% 아세토니트릴을 10분간 흘려주고 0.05% 트리플루오로아세트산을 포함한 40% 아세토니트릴을 선형 그래디언트(linear gradient)로 30분간 걸어서 시그날을 관찰하였다. 코리스메이트 컨트롤은 상기한 조건에서 보류시간(retention time) 5.4분대에서 검출되었으며, 동일한 피크가 pEXT-HpARO1으로 형질전환된 균주에서 채취한 시료에서만 검출됨을 확인할 수 있었다[도 7]. 이것은 한세눌라 폴리모파의 HpARO1 유전자를 대장균에 형질전환하여 발현시킴으로써 전체 시키메이트 경로가 증폭될 수 있음을 보여주는 결과이다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 한세눌라 폴리모파에서 클로닝한 시키메이트 경로 다기능 효소 유전자 HpARO1을 사용하면 해당 시키메이트 경로 관련 다섯 단계를 코딩하는 유전자가 결손된 대장균 변이주의 기능을 보완할 수 있고 이 유전자로 대장균을 형질전환할 경우 시키메이트 경로가 증폭되어 각종 고부가가치 방향족 화합물을 생산하기 위한 기반구축에 매우 유용하게 사용될 것이다.

도 1은 한세물라 폴리모파 HpARO1에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열을 기존에 알려진 ARO1 단백질들과 비교한 결과이다.

도 2는 HpARO1을 대장균에서 발현하기 위해 제작한 발현벡터 pEXT20-HpARO1의 구조이다.

도 3은 HpARO1을 포함하고 있는 벡터로 형질전환한 시키메이트 경로 유전자 결손 대장균들의 기능 보완실험 결과이다.

도 4는 형질전환 대장균/pEXT20-HpARO1로부터 ARO1이 발현되는지 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.

도 5는 pEXT20-HpARO1를 형질전환시킨 시키메이트 디하이드로나아제 결손 대장균 변이주를 대상으로 HpARO1의 유도발현 여부를 효소활성 분석을 통해 검증한 결과이다[0: 유도발현개시 직전 시료, 2: 유도발현 개시 2시간 후 시료, 4:유도발현 개시 4시간 후 시료, 6:유도발현 개시 6시간 후 시료].

도 6은 pEXT20-HpARO1로 형질전환된 야생형 대장균의 시키메이트 디하이드로제나아제 활성이 증가된 것을 분석한 결과이다.

도 7은 pEXT20-HpARO1로 형질전환된 야생형 대장균의 시키메이트 경로의 증폭여부를 HPLC를 사용한 코리스메이트 분석을 통해 검증한 결과이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Hansenula polymorpha gene encoding a pentafunctional enzyme of shikimate pathaway and its use for biosynthesis of chorismate <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4668 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha A16 <400> 1 gaattcatga cgactcgcgt tgaaaaagtg gaaattctgg gtgcggaaac catccatgtc 60 gggtaccaga tgagagaaca cgtgtgtgag gagatcgttg caaacaaggc ctcctctaca 120 tatgtgctca tcactgactc gaatatcgtc agtgccggcc atctcgatgc ttacaagtct 180 agcatgctcg aggccataaa tagattgaga cctgaagcac gggtgctgac ttatgtggtg 240 tcgcctggcg agtccaacaa aaatcgtgcc accaaagccg cgatcgaaga ctacctgctt 300 tctcaaggat gcacccgaga cacctttata attgctattg gtggaggagt tattggcgac 360 atgattggat ttgtggcggc aactttcatg aggggcgttc ggtttgccca agtgccaacc 420 acacttctct ccatggtcga ctcctcgatt ggaggcaaga ctgccgtgga tactccgttg 480 ggcaagaact tcattggctc tttctggcag cctgactacg tttttgcaga tatctctttc 540 ttggagacgt taccggagcg cgagttcatc aacggtatgg ccgaggtgat caagactgct 600 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Glu His Val Cys Glu Glu Ile Val Ala 20 25 30 Asn Lys Ala Ser Ser Thr Tyr Val Leu Ile Thr Asp Ser Asn Ile Val 35 40 45 Ser Ala Gly His Leu Asp Ala Tyr Lys Ser Ser Met Leu Glu Ala Ile 50 55 60 Asn Arg Leu Arg Pro Glu Ala Arg Val Leu Thr Tyr Val Val Ser Pro 65 70 75 80 Gly Glu Ser Asn Lys Asn Arg Ala Thr Lys Ala Ala Ile Glu Asp Tyr 85 90 95 Leu Leu Ser Gln Gly Cys Thr Arg Asp Thr Phe Ile Ile Ala Ile Gly 100 105 110 Gly Gly Val Ile Gly Asp Met Ile Gly Phe Val Ala Ala Thr Phe Met 115 120 125 Arg Gly Val Arg Phe Ala Gln Val Pro Thr Thr Leu Leu Ser Met Val 130 135 140 Asp Ser Ser Ile Gly Gly Lys Thr Ala Val Asp Thr Pro Leu Gly Lys 145 150 155 160 Asn Phe Ile Gly Ser Phe Trp Gln Pro Asp Tyr Val Phe Ala Asp Ile 165 170 175 Ser Phe Leu Glu Thr Leu Pro Glu Arg Glu Phe Ile Asn Gly Met Ala 180 185 190 Glu Val Ile Lys Thr Ala Ala Ile Trp Asp Glu Ala Glu Phe Ala Arg 195 200 205 Leu Glu Lys His Thr Glu Val Phe Leu Glu Val Val Lys Asn Arg Lys 210 215 220 Pro Asp Asn Thr Val Asp Leu Thr Pro Ile Leu Asp His Ile Phe Lys 225 230 235 240 Leu Val Leu Gly Ser Ile Lys Val Lys Ala Glu Val Val Ser Leu Asp 245 250 255 Glu Arg Glu Gly Gly Leu Arg Asn Leu Leu Asn Phe Gly His Ser Ile 260 265 270 Gly His Ala Tyr Glu Ala Ile Leu Thr Pro Gln Ala Leu His Gly Glu 275 280 285 Cys Val Ala Ile Gly Ala Val Lys Glu Ala Glu Leu Ser Arg Tyr Leu 290 295 300 Gly Ile Leu Pro Pro Val Gly Val Ser Arg Leu Ala Lys Cys Leu Ser 305 310 315 320 Gly Tyr Gly Leu Pro Ile Ser Leu Asp Asp Lys Val Leu Gln Ser Arg 325 330 335 Ile Asn Gly Lys Lys Cys Pro Val Glu Val Leu Leu Lys Lys Met Ser 340 345 350 Val Asp Lys Lys Asn Asp Gly Ser Lys Lys Lys Val Val Leu Leu Lys 355 360 365 Ser Ile Gly Glu Cys Tyr Glu Pro Lys Ala Ser Tyr Val Asn Asp Glu 370 375 380 Asp Leu Arg Val Val Leu Thr Asp Glu Ile Leu Val Lys Pro Phe Glu 385 390 395 400 Asn Val Arg Gln Asp Val Val Val Thr Pro Pro Gly Ser Lys Ser Ile 405 410 415 Ser Asn Arg Ala Leu Val Met Ala Ala Leu Gly Lys Gly Val Cys Lys 420 425 430 Ile Lys Asn Leu Leu His Ser Asp Asp Thr Glu His Met Leu Thr Ala 435 440 445 Leu Thr Ala Leu Lys Ala Ala Thr Val Ser Trp Glu Asp Lys Gly Glu 450 455 460 Thr Leu Val Leu Asn Ala Asn Gly Gly Gln Leu Val Ala Cys Asp Glu 465 470 475 480 Glu Ile Tyr Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Ser Arg Phe Leu Thr Ser 485 490 495 Val Ala Ser Leu Val Gly Val Asn Gly Asp Leu Asp His Val Val Leu 500 505 510 Thr Gly Asn Lys Trp Met Gln Lys Arg Pro Ile Gly Pro Leu Val Asp 515 520 525 Ala Leu Arg Glu Asn Gly Ser Ser Ile Glu Tyr Gln Asn Arg Glu Gly 530 535 540 Ser Leu Pro Leu Lys Ile Arg Cys Gly Gln Gly Leu Lys Gly Gly Arg 545 550 555 560 Ile Glu Leu Glu Ala Thr Ile Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ser Ile Leu 565 570 575 Ile Cys Ala Pro Tyr Ala Glu Lys Pro Val Thr Leu Ala Leu Val Gly 580 585 590 Gly Lys Pro Ile Ser Gln Leu Tyr Ile Asp Met Thr Ile Arg Met Met 595 600 605 Ser Ala Phe Gly Ile His Val Thr Lys Ser Thr Thr Glu Glu His Thr 610 615 620 Tyr His Ile Pro Lys Gly Ser Tyr Val Asn Pro Pro Glu Tyr Val Ile 625 630 635 640 Glu Ser Asp Ala Ser Ser Ala Thr Tyr Pro Leu Ala Phe Ala Ala Met 645 650 655 Asn Gly Thr Lys Cys Thr Ile Pro Asn Ile Gly Ser Ser Ser Leu Gln 660 665 670 Gly Asp Ser Arg Phe Ala Val Glu Val Leu Lys Pro Met Gly Cys Ile 675 680 685 Val Thr Gln Thr Glu Thr Ser Thr Thr Val Gln Gly Pro Pro Val Gly 690 695 700 Gln Leu Lys Pro Leu Pro Leu Val Asp Met Glu Pro Met Thr Asp Ala 705 710 715 720 Phe Leu Thr Ala Ser Val Val Ala Ala Ile Ala Asn Asp Gln Thr Gln 725 730 735 Pro Thr Ser Ile Val Gly Ile Ala Asn Gln Arg Val Lys Glu Cys Asn 740 745 750 Arg Ile Ala Ala Met Arg Ile Gln Leu Ala Lys Phe Gly Val Lys Ala 755 760 765 Glu Glu Leu Glu Asp Gly Ile Lys Ile Tyr Gly Ile Asn Tyr Lys Asp 770 775 780 Leu Lys Thr Pro Glu Lys Pro Gly Ile Tyr Pro Tyr Asp Asp His Arg 785 790 795 800 Val Ala Met Ser Phe Ser Leu Leu Ala Gly Phe Cys Lys Asp Pro Val 805 810 815 Ile Ile Gln Glu Arg Arg Cys Thr Ala Lys Thr Trp Pro Gly Trp Trp 820 825 830 Asp Val Leu His Thr His Phe Gly Ala Gln Leu Asp Gly Tyr Glu Pro 835 840 845 Glu His Thr Lys Ser Val Val Ala Lys Gly Asn Gly Asp 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Ile Thr Thr Gly Cys Asp 1060 1065 1070 Ala Val Glu Leu Arg Val Asp Leu Leu Lys Ser Tyr Asp Leu Thr Tyr 1075 1080 1085 Val Ser Glu Gln Leu Gly Leu Leu Arg Asn His Thr Ser Leu Pro Ile 1090 1095 1100 Val Phe Thr Val Arg Ser Val Ser Gln Gly Gly Lys Phe Pro Asp Gly 1105 1110 1115 1120 Asp Tyr Ser Thr Leu Gln Glu Leu Cys Glu Leu Ala Phe Lys Phe Gly 1125 1130 1135 Val Gly Phe Leu Asp Leu Glu Leu Ser Leu Pro Glu Gly Leu Leu Asp 1140 1145 1150 Thr Leu Ser Ser Lys Arg Arg Phe Thr Lys Ile Ile Gly Ser His His 1155 1160 1165 Asp Phe Ala Gly Val Phe Lys Trp Asp Ser Ala Glu Trp Glu Ser Lys 1170 1175 1180 Tyr Leu Leu Ala Thr Arg Leu Asn Val Asp Val Val Lys Phe Val Gly 1185 1190 1195 1200 Met Ala Lys Glu Tyr Lys Asp Asn Tyr Leu Leu Glu Gln Phe Arg Glu 1205 1210 1215 Ser His Thr Gln Lys Pro Leu Ile Ala Ile Asn Met Gly Glu Tyr Gly 1220 1225 1230 Gln Tyr Ser Arg Val Val Asn Pro Val Leu Thr Pro Val Thr His Glu 1235 1240 1245 Arg Leu Pro Asn Ala Ser Ala Pro Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gln Ile 1250 1255 1260 Phe Gln Ala Arg Ser Leu Ile Gly Leu Glu Thr Pro Lys His Phe Cys 1265 1270 1275 1280 Ile Val Gly Glu Pro Ile Gly His Ser Arg Ser Pro Ala Leu His Gln 1285 1290 1295 Ala Ala Tyr Lys Val Phe Gly Leu Pro His Thr Phe Gly Lys Phe Glu 1300 1305 1310 Thr Ser Asp Ala Gln Leu Val Lys Glu Lys Val Leu Ser Asp Pro Asn 1315 1320 1325 Phe Gly Gly Cys Ala Ile Thr Ile Pro Leu Lys Val Asp Met Met Lys 1330 1335 1340 Tyr Ala Asp Glu Leu Ser Glu Ser Ala Lys Thr Ile Gly Ala Ile Asn 1345 1350 1355 1360 Thr Leu Ile Pro Leu Gly Asn Gly Arg Phe Arg Gly Asp Asn Thr Asp 1365 1370 1375 Trp Leu Gly Ile Thr Gln Ser Phe Thr Asn Asn Gly Cys Thr Ser Gln 1380 1385 1390 Ile Thr Gly Asn Gly Leu Val Ile Gly Ala Gly Gly Thr Ser Arg Ala 1395 1400 1405 Ala Val Phe Ala Leu His Gln Met Gly Cys Gln Lys Ile Tyr Val Leu 1410 1415 1420 Asn Arg Thr Ala Ser Lys Val Ala Asp Ile Lys Ala His Phe Pro Glu 1425 1430 1435 1440 Ser Tyr Asn Ile Glu Ile Leu Asp Ser Leu Glu Ser Val Lys Arg Ile 1445 1450 1455 Asp Gln Ile Leu Leu Val Val Ser Thr Val Pro Gly Tyr Asn Glu Ile 1460 1465 1470 Glu Leu Ala Phe Gln Glu Lys Ile Glu Thr Ala Leu Ser Lys Gly Gly 1475 1480 1485 Ser Pro Lys Met Leu Leu Glu Ala Ala Tyr Lys Pro His Glu Thr Pro 1490 1495 1500 Ile Met Lys Leu Ala Ser Thr Lys Tyr Gly Trp Lys Val Ile Pro Gly 1505 1510 1515 1520 Arg Glu Met Leu Val Asn Gln Gly Ile His Gln Phe Ala Arg Phe Asn 1525 1530 1535 Gly Leu Lys Pro Pro Phe Glu Pro Val Tyr Glu Ala Val Ile Arg 1540 1545 1550 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 cccgaattca tgacgactcg cgttgaaaaa gtg 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 cccaagcttt tatctaatca ccgcctcata gac 33

Claims (5)

1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 한세눌라 폴리모파 아로1 코딩(HpARO1) 유전자.
2. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 한세눌라 폴리모파 아로1 단백질.
3. 청구항 1의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터 pEXT20-HpARO1.
4. 청구항 3의 발현벡터를 대장균에 형질전환시킨 것을 특징으로 하는 형질전환 대장균DH5α/pEXT20-HpARO1[KCTC 10569BP].
5. 청구항 4의 형질전환 대장균DH5α/pEXT20-HpARO1[KCTC 10569BP]로부터 HpARO1 유전자를 발현시켜 대장균의 시키메이트 경로를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 코리스메이트를 생합성하는 방법.