PL193220B1 - Zmutowana transpozaza Tn5 zmieniona w stosunku do transpozazy Tn5 typu dzikiego, konstrukcje genetyczne, układ do transpozycji in vitro i sposób transpozycji in vitro - Google Patents
Zmutowana transpozaza Tn5 zmieniona w stosunku do transpozazy Tn5 typu dzikiego, konstrukcje genetyczne, układ do transpozycji in vitro i sposób transpozycji in vitroInfo
- Publication number
- PL193220B1 PL193220B1 PL332145A PL33214597A PL193220B1 PL 193220 B1 PL193220 B1 PL 193220B1 PL 332145 A PL332145 A PL 332145A PL 33214597 A PL33214597 A PL 33214597A PL 193220 B1 PL193220 B1 PL 193220B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- transposase
- sequence
- leu
- ala
- type
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
Abstract
1. Zmutowana transpozaza Tn5 zmieniona w stosunku do transpozazy Tn5 typu dzikiego, znamienna tym, ze zawiera mutacj e typu podstawienia w pozycji 54; i mutacj e typu podstawienia w pozycji 372, przy czym zmutowana transpozaza ma wi eksz a zdolno sc wi azania z powtarzalnymi sekwencjami poza zewn etrznymi ko ncami Tn5 donorowego DNA i mniejsz a zdolno sc do tworzenia multimerów ni z transpozaza Tn5 typu dzikiego. PL PL PL
Description
Przedmiotami wynalazku są zmutowana transpozaza Tn5 zmieniona w stosunku do transpozazy Tn5 typu dzikiego, konstrukcje genetyczne, układ do transpozycji in vitro i sposób transpozycji in vitro.
Niniejszy wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny transpozycyjnego kwasu nukleinowego, a bardziej szczegółowo wytwarzania i stosowania zmodyfikowanego enzymu transpozazy w układzie do wprowadzania zmian genetycznych do kwasu nukleinowego.
Transpozycyjne elementy genetyczne są sekwencjami DNA, występującymi w wielu różnych organizmach prokariotycznych i eukariotycznych, mogącymi przemieszczać się lub ulegać transpozycji z jednej pozycji w genomie do innej. In vivo znane są zarówno transpozycje wewnątrzchromosomalne, jak i transpozycje pomiędzy chromosomalnym i niechromosomalnym materiałem genetycznym. W przypadku kilku układów wiadomo, ż e transpozycja pozostaje pod kontrolą enzymu transpozazy, który zazwyczaj jest kodowany przez element transpozycyjny. Struktury genetyczne i mechanizmy transpozycji różnych elementów transpozycyjnych podsumowano, na przykład, w „Transposable Genetic Elements” w „The Encyclopedia of Molecular Biology”, Kendrew i Lawrence, red., Blackwell Science, Ltd., Oxford (1994), włączonej do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.
Systemy transpozycyjne in vitro, które wykorzystują określone elementy transpozycyjne bakteriofaga Mu i bakteryjnego transpozonu Tn10, zostały opisane odpowiednio przez grupy badawcze Kiyoshi Mizuuchi i Nancy Kleckner.
Układ bakteriofaga Mu po raz pierwszy opisano w Mizuuchi, K., „In vitro Transposition of Bacteria Phage Mu: A Biochemical Approach to a Novel Replication Reaction”, Cell: 78-794 (1983) oraz Craigie, R. i in., „A Defined System for the DNA Strand-Transfer Reaction at the Initiation of Bacteriophage Mu Transposition: Protein and DNA Substrate Requirements”, P.N.A.S. U.S.A. 82: 770-774 (1985). Substratowy DNA donora do reakcji Mu in vitro (mini-Mu) normalnie wymaga obecności sześciu miejsc wiążących transpozazę Mu (po trzy, o długości około 30 pz, na każdym końcu) i sekwencji wzmacniającej położonej około 1 kb od lewego końca. Plazmid donorowy musi być superzwinięty. Konieczna jest obecność białek A i B, kodowanych przez Mu oraz białek HU i IHF kodowanych przez gospodarza. Lavoie, B. D. i G. Chaconas, „Transposition of phage Mu DNA”, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 204: 83-99 (1995). Układ oparty na Mu jest niedogodny do zastosowań w układach transpozycji in vitro, ponieważ końce Mu są złożone i skomplikowane, a także ze względu na to, że do transpozycji, oprócz transpozazy, wymagane są dodatkowe białka.
Układ Tn10 opisano w Morisato, D. i N. Kleckner, „Tn10 Transposition and Circle Formation in vitro, Cell 51: 101-111 (1987) oraz Benjamin, H. W. i N. Kleckner, „Excision Of Tn10 from the Donor Site During Transposition Occurs By Flush Double-Strand Cleavages at the Transposon Termini”, P.N.A.S. U.S.A. 89: 4648-462 (1992). Układ Tn10 obejmuje superzwiniętą kolistą cząsteczkę DNA zawierającą element transpozycyjny (lub liniową cząsteczkę DNA plus białko IHF E. coli). Granice elementu transpozycyjnego stanowią złożone sekwencje terminalne o długości 42 pz z miejscem wiążącym IHF sąsiadującym z odwróconym powtórzeniem. W rzeczywistości, w opisanych doświadczeniach stosowano nawet dłuższe końce Tn10 (81 pz). Sakai, J. i in., „Identification and Characterization of Pre-Cleavage Synaptic Complex that is an Early Intermediate in Tn10 transposition”, E.M.B.O. J. 14: 4374-4383 (1995). W układzie Tn10 dla zachowania aktywnej transpozycji istotne jest chemiczne traktowanie białka transpozazy. Ponadto, końce elementu Tn10 ograniczają jego użyteczność w uniwersalnym układzie transpozycji in vitro.
Dalsze ograniczenie układów transpozycji in vitro opartych zarówno na Mu, jak i na Tn10 stanowi to, że są one aktywne tylko wobec cząsteczek docelowych, które są superzwiniętym DNA kowalencyjnie zamkniętym w postać kolistą. Pożądany jest układ transpozycji in vitro o szerszych możliwościach zastosowań, który wykorzystuje krótsze, lepiej zdefiniowane końce i który jest aktywny wobec docelowego DNA o dowolnej strukturze (liniowego, zrelaksowanego kolistego i superzwiniętego kolistego DNA).
Podsumowanie niniejszego wynalazku stanowi to, że układ do transpozycji in vitro według wynalazku obejmuje preparat odpowiednio zmodyfikowanej transpozazy bakteryjnego transpozonu Tn5, cząsteczkę donorowego DNA zawierającą element transpozycyjny i cząsteczkę docelowego DNA, do której może nastąpić transpozycja elementu transpozycyjnego, wszystko dostarczone w odpowiednim buforze reakcyjnym.
Elementem transpozycyjnym donorowej cząsteczki DNA określa się będącą przedmiotem zainteresowania transpozycyjną sekwencję DNA, przy czym końce 5' i 3' będącej przedmiotem zainterePL 193 220 B1 sowania sekwencji DNA flankują krótkie sekwencje powtarzalne, na które w układzie trans działa transpozaza Tn5.
Ponadto, odpowiednio zmodyfikowany enzym transpozaza według wynalazku zawiera dwie klasy różnic w stosunku do transpozazy Tn5 typu dzikiego, gdzie każda klasa wywiera odrębny mierzalny wpływ na ogólną aktywność transpozycyjną enzymu i gdzie wyższy wpływ obserwuje się, gdy obecne są obie modyfikacje. Odpowiednio zmodyfikowany enzym zarówno (1) wiąże się z powtarzalnymi sekwencjami donorowego DNA z większą silą niż transpozaza Tn5 typu dzikiego („mutacja klasy (1)”), jak i (2) mniej prawdopodobne jest, że białko typu dzikiego przyjmie nieaktywną postać multimeryczną („mutacja klasy (2)”). W testach w połączeniu z oznaczeniem koniugacji in vivo, opisanym w Weinreich, M. D., „Evidence that the cis Preference of the Tn5 Transposase is Caused by Nonproductive Multimerization”, Genes and Development 8: 2363-2374 (1994) (włączonym do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy), odpowiednio zmodyfikowana transpozaza Tn5 według niniejszego wynalazku, która zawiera zarówno modyfikację klasy (1), jak i klasy (2), indukuje około 100-krotnie (± 10%) wyższą transpozycję niż enzym typu dzikiego. W optymalnych warunkach transpozycja przy wykorzystaniu zmodyfikowanej transpozazy może być wyższa. Zmodyfikowana transpozaza zawierająca wyłącznie mutację klasy (1) ma wystarczająco większą zdolność wiązania z sekwencjami powtarzalnymi niż transpozaza Tn5 typu dzikiego, że przy pomiarach in vivo taka transpozaza Tn5 indukuje około 5- do 10-krotnie wyższą transpozycję, niż enzym typu dzikiego. Prawdopodobieństwo, że zmodyfikowana transpozaza zawierająca wyłącznie mutację klasy (2) przyjmie postać multimerycznej jest wystarczająco niższe niż dla transpozazy Tn5 typu dzikiego, że przy pomiarach in vivo taka transpozaza również indukuje około 5- do 10-krotnie wyższą transpozycję niż enzym typu dzikiego.
W innej postaci realizacji wynalazku sposób według wynalazku stanowi sposób transpozycji elementu transpozycyjnego z DNA donorowego do DNA docelowego in vitro, obejmujący etapy mieszania odpowiednio zmodyfikowanego białka transpozazy Tn5, DNA donorowego i DNA docelowego w odpowiednim buforze reakcyjnym, umożliwiania wiązania enzymu z flankującymi sekwencjami powtarzalnymi DNA donorowego w temperaturze wyższej niż 0°C, ale nie wyższej niż 28°C, a następnie podwyższania temperatury do temperatury fizjologicznej (około 37°C), po czym może występować cięcie i przenoszenie nici.
Celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie użytecznego układu transpozycji in vitro posiadającego niewielkie wymagania strukturalne i wysoką wydajność.
Innym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie sposobu, który może być szeroko stosowany w różny sposób, taki jak do tworzenia całkowicie defektywnych mutantów, do zapewniania markerów selekcyjnych w docelowym DNA, do zapewniania przenośnych regionów homologii w docelowym DNA, do ułatwienia insercji określonych sekwencji DNA do docelowego DNA, do zapewniania miejsc wiążących starter lub znaczników do sekwencjonowania DNA, do ułatwienia tworzenia fuzji genetycznych w badaniach ekspresji genów i mapowaniu domen białkowych, jak również do tworzenia innych pożądanych kombinacji sekwencji DNA (genetyka kombinatoryczna).
Zmodyfikowany enzym transpozaza wiąże się z DNA silniej niż transpozaza Tn5 typu dzikiego.
Zmodyfikowana transpozaza według wynalazku zwiększa szybkość reakcji transpozycji in vitro co najmniej 10-krotnie w stosunku do możliwej do uzyskania z zastosowaniem transpozazy typu dzikiego (według pomiarów in vivo). Należy zaznaczyć, że transpozaza Tn5 typu dzikiego nie wykazuje wykrywalnej aktywności in vitro w układzie według niniejszego wynalazku. A zatem, chociaż trudno obliczyć górną granicę wzrostu aktywności, jest jasne, że, gdy produkty transpozycji in vitro oznacza się in vivo, obserwuje się setki, jeśli nie tysiące kolonii.
W transpozycji in vitro z zastosowaniem układu według wynalazku można wykorzystywać DNA donorowy dawcy i DNA docelowy, który jest kolisty lub liniowy.
Transpozycja in vitro z zastosowaniem układu według wynalazku nie wymaga zewnętrznego źródła wysokiej energii, ani żadnego innego białka poza zmodyfikowaną transpozazą według wynalazku.
Opis figur
Figura 1 przedstawia plazmid testowy pRZTL1, stosowany tu do wykazywania transpozycji in vitro elementu transpozycyjnego położonego pomiędzy parą zewnętrznych końców Tn5. Plazmid pRZTL1 przedstawiono i opisano również w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3.
Figura 2 przedstawia analizę elektroforetyczną plazmidu 1 pRZTL1 przed i po transpozycji in vitro. Przedstawiono wyniki uzyskane przy użyciu substratu plazmidowego zarówno kolistego, jak i liniowego.
PL 193 220 B1
Figura 3 przedstawia analizę elektroforetyczną plazmidu pRZTL1 po transpozycji in vitro, obejmującą dalszą analizę rodzajów cząsteczek otrzymanych przy użyciu substratów plazmidowych kolistych i liniowych.
Figura 4 przedstawia plazmidy pRZ1496, pRZ5451 i pRZTL1, które omówiono dokładnie w opisie poniż ej.
Figura 5 przedstawia wykres liczby brodawek na kolonię w zależności od czasu dla różnych zmutowanych sekwencji OE testowanych in vivo wobec transpozazy EK54/MA56.
Figura 6 przedstawia wykres liczby brodawek na kolonię w zależności od czasu dla różnych zmutowanych sekwencji OE testowanych wobec transpozazy EK54/MA56, przy niższych wartościach na osi Y niż przedstawiono na fig. 5.
Figura 7 przedstawia wykres liczby brodawek na kolonię w zależności od czasu dla różnych zmutowanych sekwencji OE testowanych wobec transpozazy Tn5 MA56.
Figura 8 przedstawia transpozycję in vivo przy zastosowaniu dwóch najlepszych mutantów, testowaną wobec transpozaz MA56 i EK54/MA56.
Zrozumiałym będzie, że technika ta zapewnia prosty układ in vitro do wprowadzania dowolnego elementu transpozycyjnego z DNA donorowego do DNA docelowego.
Powszechnie przyjmuje się i rozumie, że transpozycja Tn5 wymaga jedynie pary końców OE, położonych na każdym z krańców elementu transpozycyjnego. Zazwyczaj uznaje się, że te końce OE mają długość 18 lub 19 zasad i w stosunku do siebie są odwróconymi powtórzeniami. Johnson, R. C.
i W. S. Reznikoff, Nature 304: 280 (1983), włączona do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Sekwencje odwróconych powtórzeń Tn5, które określa się jako „końce”, pomimo że nie muszą znajdować się na końcach cząsteczki DNA donorowego, są dobrze znane i zrozumiane.
Poza koniecznością flankowania pożądanego elementu transpozycyjnego przez standardowe końce zewnętrzne Tn5 („OE”), stwierdzono niewiele innych wymagań dotyczących DNA donorowego i DNA docelowego. Uważa się, że Tn5 wykazuje nieznaczne, jeśli w ogóle, preferencje co do miejsc insercji, tak że możliwe jest stosowanie układu do losowego wprowadzania pożądanych sekwencji do docelowego DNA. Dlatego też uważa się, że sposób według wynalazku, wykorzystujący opisaną w niniejszym opisie zmodyfikowaną transpozazę i prosty DNA donorowy, znajduje szerokie zastosowania do wprowadzania zmian w dowolnym DNA docelowym, bez względu na jego sekwencję nukleotydową. Będzie on zatem stosowany w wielu problemach będących przedmiotem zainteresowania specjalistów w dziedzinie biologii molekularnej.
W sposobie według wynalazku, zmodyfikowane białko transpozazy łączy się w odpowiednim buforze reakcyjnym z DNA donorowym i DNA docelowym. Odpowiedni bufor reakcyjny pozwala na zajście reakcji transpozycji. Zalecany choć niekoniecznie optymalny bufor zawiera spermidynę dla kondensacji DNA, glutaminian i magnez, jak również detergent, którym dogodnie jest sulfonian 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonowo]-1-propanowy („CHAPS”).
Mieszaninę można inkubować w temperaturze wyższej od 0°C i sięgającej do około 28°C, dla ułatwienia wiązania enzymu z końcami OE. W warunkach buforowych stosowanych przez twórców wynalazku w przykładach, preinkubacja w temperaturze 30°C nie była odpowiednia. Zalecany zakres temperatur wynosi od 16°C do 28°C. Najbardziej zalecana temperatura preinkubacji wynosi około 20°C. Jednakże w innych warunkach buforowych na etapie wiązania może być możliwe stosowanie innych temperatur niższych od fizjologicznej. Po krótkim okresie preinkubacji (którego długości nie optymalizowano, ale który może trwać zaledwie 30 minut albo aż 2 godziny, a zazwyczaj wynosi 1 godzinę), mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się 2 objętościami odpowiedniego buforu reakcyjnego i przeprowadza w warunki fizjologiczne na kilka dalszych godzin (powiedzmy 2-3 godziny) dla umożliwienia zajścia cięcia i przenoszenia nici. Odpowiednia jest temperatura 37°C lub zbliżona. Po około 3 godzinach szybkość transpozycji znacznie się obniża. Reakcję można zatrzymać przez ekstrakcję fenolem-chloroformem, a następnie można usunąć z roztworu sól poprzez wytrącanie etanolem.
Jeżeli DNA był oczyszczony z użyciem konwencjonalnych metod oczyszczania, w sposobie transpozycji in vitro można wykorzystywać prostsze warunki reakcji. DNA o wystarczająco wysokiej czystości można przygotować przepuszczając preparat DNA przez jedno ze złóż obecnie powszechnie stosowanych w laboratoriach biologii molekularnej, takich jak złoże Qiagen w zestawie Qiagen do oczyszczania plazmidów (numer katalogowy 12162). Gdy wykorzystuje się taki DNA o wyższej jakości, bufor reakcyjny może nie zawierać CHAPS. Gdy CHAPS wyeliminuje się z buforu reakcyjnego, nie trzeba rozcieńczać mieszaniny w opisany powyżej sposób. Można również pominąć wymieniony powyżej etap inkubacji w niższej temperaturze, zastępując go pojedynczą inkubacją w warunkach
PL 193 220 B1 fizjologicznych w celu cięcia i przenoszenia nici. Wystarczająca jest inkubacja w ciągu trzech godzin w temperaturze 37°C.
Po etapach reakcji i następującej po niej ekstrakcji, można oznaczać transpozycję przez wprowadzanie kwasu nukleinowego będącego produktem reakcji do komórek odpowiedniego szczepu gospodarza bakteryjnego (np. do komórek E. coli K-12 DH5a (recA-) dostępnych komercyjnie w Life Technologies (Gibco-BRL)),dogodnie przez elektroporację, jak opisano w Dower i in., Nuc. Acids Res. 16: 6127 (1988) i monitorując przejawy transpozycji jak opisano w innym miejscu niniejszego opisu.
Specjaliści w tej dziedzinie zauważą, że poza wymienionymi tu zmianami, reakcja transpozycji może przebiegać w warunkach bardzo zbliżonych do tych znanych dla reakcji in vivo. Jednakże, opisana tu zmodyfikowana transpozaza tak zwiększa poziom aktywności transpozycyjnej, że obecnie jest możliwe prowadzenie tej reakcji in vitro, co uprzednio nie było możliwe. Gdy połączy się zmodyfikowaną transpozazę z opisanymi tu zoptymalizowanym buforem i warunkami temperaturowymi, można uzyskać nawet wyższe szybkości reakcji.
W innej postaci realizacji preparat zmodyfikowanego enzymu transpozazy Tn5 różni się od transpozazy Tn5 typu dzikiego tym, że (1) ma większą zdolność wiązania się z powtarzalnymi sekwencjami DNA donorowego niż transpozaza Tn5 typu dzikiego i (2) z mniejszym prawdopodobieństwem przyjmuje nieaktywną postać multimeryczną niż białko typu dzikiego. Enzym spełniający te wymagania można otrzymać z komórek gospodarza bakteryjnego zawierających ulegający ekspresji gen zmodyfikowanego enzymu, który pozostaje pod kontrolą promotora aktywnego w komórce gospodarza. Materiał genetyczny, który koduje zmodyfikowaną transpozazę Tn5 można wprowadzić (np. poprzez elektroporację) do komórek odpowiedniego gospodarza bakteryjnego zdolnych do przeprowadzenia ekspresji materiału genetycznego. Wykorzystuje się odpowiednio znane metody nadprodukcji i oczyszczania innych mutantów transpozazy Tn5. Odpowiednią metodę podwyższonego wytwarzania transpozazy Tn5 opisano przykładowo w Weinreich, M. D. i in., supra. Drugą metodę oczyszczania transpozazy Tn5 opisano w de la Cruz, N. B. i in., „Characterization of the Tn5 Transposase and Inhibitor Proteins: A Model for the Inhibition of Transposition”, J. Bact. 17: 6932-6938 (1993), również włączoną do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Należy zauważyć, że indukcję można prowadzić w temperaturach poniżej 37°C, którą to temperaturę stosowano w de la Cruz i in. Odpowiednie są temperatury przynajmniej w zakresie od 33°C do 37°C. Twórcy wynalazku ustalili, że sposób wytwarzania zmodyfikowanej transpozazy według niniejszego wynalazku nie ma decydującego znaczenia dla powodzenia sposobu, ponieważ różne strategie przygotowywania stosowano z takim samym powodzeniem.
Ewentualnie, białko można zsyntetyzować chemicznie, w sposób znany w tej dziedzinie, jako wskazówkę stosując sekwencję aminokwasową dołączoną do niniejszego opisu jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2. Można również przygotować konstrukcję genetyczną, która koduje zmodyfikowane białko (i towarzyszące sygnały transkrypcji i translacji) przy wykorzystaniu standartowych metod rekombinacji DNA znanych biologom molekularnym. Materiał genetyczny użyteczny do przygotowania takich konstrukcji można uzyskać z istniejących konstrukcji Tn5 lub można przygotować stosując znane metody wprowadzania mutacji do materiału genetycznego (np. mutageneza losowa PCR lub mutageneza ukierunkowana) lub pewne kombinacje obu metod. Sekwencję genetyczną, która koduje białko przedstawione w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 podano w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1.
Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa transpozazy Tn5 typu dzikiego jest znana i została opublikowana; numer dostępu N. C. B. I. U00004 L19385, włączony do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.
W zalecanej postaci realizacji poprawioną zdolność wiązania zmodyfikowanej transpozazy z powtarzalnymi sekwencjami końców OE (mutacja klasy (1)) można uzyskać przez zapewnienie reszty lizyny w pozycji aminokwasowej 54, w której w transpozazie Tn5 typu dzikiego występuje kwas glutaminowy. Mutacja silnie zmienia preferencję transpozazy wobec końców OE, w przeciwieństwie do końców wewnętrznych („IE”). Wynikiem zwiększonego wiązania tego mutanta, znanego jako EK4, z końcami OE jest około 10-krotnie wyższa szybkość transpozycji w porównaniu z tą obserwowaną dla transpozazy typu dzikiego. Wynikiem podobnej zmiany w pozycji 54 na walinę (mutant EV4) również jest nieco zwiększone wiązanie/transpozycja dla końców OE, tak jak zmiana treoniny na prolinę w pozycji 47 (mutant TP47; około 10-krotny wzrost). Uważa się, że można również uzyskać inne porównywalne mutacje transpozazy (jednego lub więcej aminokwasów), które zwiększają zdolność wiązania z końcami OE i które powinny działać równie dobrze lub lepiej w opisanym tu oznaczeniu in vitro.
PL 193 220 B1
Specjalista stwierdzi również, że zmiany w sekwencjach nukleotydowych krótkich sekwencji powtarzalnych DNA donorowego mogą współdziałać z inną mutacją(ami) w regionie wiążącym enzymu transpozazy lub w jego pobliżu dla uzyskania takiego samego wpływu zwiększonego wiązania i w rezultacie 5- do 10-krotnym wzroście szybkości transpozycji. A zatem, chociaż przykładowo przedstawiono jeden przypadek mutacji, która poprawia wiązanie przykładowej transpozazy, jest zrozumiałe, że inne mutacje transpozazy lub krótkich sekwencji powtarzalnych, lub obu, również zapewnią transpozazę, która objęta jest zakresem i duchem niniejszego wynalazku. Odpowiednią metodę określania względnej siły wiązania z końcami OE Tn5 opisano w Jilk, R. A. i in., „The Organization of the Outside end of Transposon Tn5”, J. Bact. 178: 1671-79 (1996).
Transpozaza według niniejszego wynalazku wykazuje również mniejsze prawdopodobieństwo przyjmowania nieaktywnej postaci multimerycznej niż białko typu dzikiego. W zalecanej postaci realizacji, tę mutację klasy (2) z typu dzikiego można uzyskać przez modyfikację aminokwasu 372 (leucyna) transpozazy Tn5 typu dzikiego na prolinę (i, podobnie, przez modyfikację odpowiadającego DNA tak, by kodował prolinę). Tę mutację, oznaczoną jako LP372, scharakteryzowano uprzednio jako mutację w regionie dimeryzacji transpozazy. Weinreich i in., supra. W. Weinreich i in. zauważono, że ta mutacja w pozycji 372 mapuje się w regionie, który, jak wykazano wcześniej, ma krytyczne znaczenie dla oddziaływań z inhibitorem transpozycji Tn5. Inhibitorem jest białko kodowane przez ten sam gen, który koduje transpozazę, ale które jest skrócone na końcu N białka w porównaniu z transpozazą. Podejście Weinreicha i in. do określenia poziomu tworzenia multimerów jest odpowiednie do określenia, czy mutacja znajduje się w zakresie tego elementu.
Uważa się, że gdy transpozaza Tn5 typu dzikiego multimeryzuje, obniżana jest jej aktywność w układzie trans. Przypuszczalnie mutacja w regionie dimeryzacji zmniejsza lub zapobiega multimeryzacji, zmniejszając w ten sposób aktywność hamującą i prowadząc do poziomów transpozycji od 5- do 10-krotnie wyższych niż obserwuje się dla transpozazy typu dzikiego. Mutacja LP372 powoduje około 10-krotny wzrost poziomu transpozycji w porównaniu z typem dzikim. Podobnie, inne mutacje (obejmujące mutacje jednego lub więcej aminokwasów), które zmniejszają zdolność transpozazy do multimeryzacji, powinny również działać w ten sam sposób, jak pojedyncza mutacja w pozycji 372 i byłyby również odpowiednie dla transpozazy według niniejszego wynalazku. Zmniejszenie zdolności transpozazy Tn5 do multimeryzacji może być również możliwe bez zmiany sekwencji typu dzikiego w tak zwanym regionie dimeryzacji, na przykład przez dodanie do układu innego białka lub czynnika niebiałkowego, który blokuje miejsce dimeryzacji. Ewentualnie, z białka transpozazy można całkowicie usunąć region dimeryzacji.
Jak wspomniano powyżej, białko hamujące, kodowane przez sekwencję częściowo pokrywającą się z transpozazą może zakłócać aktywność transpozazy. Z tego względu pożądane jest, aby ilość białka hamującego była obniżona w stosunku do ilości obserwowanej w typie dzikim in vivo. W niniejszym oznaczeniu używa się transpozazy w postaci oczyszczonej i przed użyciem może być możliwe oddzielenie transpozazy od inhibitora (na przykład dzięki różnicy w wielkości). Jednakże, możliwe jest również genetyczne wyeliminowanie możliwości występowania zanieczyszczającego białka hamującego przez usunięcie jego kodonu inicjacji z genu kodującego transpozazę.
Kodon AUG w genie transpozazy Tn5 typu dzikiego, który koduje aminokwas metioninę w pozycji 56 transpozazy, stanowi pierwszy kodon białka hamującego. Jednakże, wykazano już, że zastąpienie metioniny w pozycji 56 nie ma widocznego wpływu na aktywność transpozazy, a jednocześnie zapobiega translacji białka hamującego, powodując w ten sposób nieco wyższą szybkość transpozycji. Weigand, T. W. i W. S. Reznikoff, „Characterization of Two Hypertransposing Tn5 Mutants”, J. Bact. 174: 1229-1239 (1992), włączona do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. W szczególności, twórcy niniejszego wynalazku w zalecanej postaci realizacji zastąpili metioninę alaniną (i zastąpili kodujący metioninę kodon AUG na kodujący alaninę kodon GCC). Dlatego też, zalecana transpozaza według tego wynalazku zawiera w pozycji 56 aminokwas inny niż metionina, chociaż tą zmianę należy uważać jedynie za korzystną technicznie (ponieważ zapewnia nieobecność inhibitora w układzie in vitro), a nie za posiadającą zasadnicze znaczenie dla wynalazku (ponieważ do wyeliminowania białka hamującego z układu in vitro można użyć innych sposobów).
Najbardziej zalecana znana twórcom wynalazku sekwencja aminokwasowa transpozazy różni się od typu dzikiego w pozycjach aminokwasowych 54, 56 i 372. Mutacje w pozycjach 54 i 372 powodują oddzielnie około 10-krotny wzrost szybkości reakcji transpozycji in vivo. Gdy mutacje łączy się, stosując standardowe techniki rekombinacji, w jednej cząsteczce zawierającej obie klasy mutacji, podczas testowania in vivo produktów układu in vitro obserwuje się szybkości reakcji co najmniej
PL 193 220 B1
100-krotnie wyższe niż można uzyskać używając transpozazy typu dzikiego. Mutacja w pozycji 56 nie wpływa bezpośrednio na aktywność transpozazy.
Inne mutanty typu dzikiego, które uważa się za prawdopodobnie przyczyniające się do wysokiej aktywności transpozazy in vitro obejmują, ale nie ograniczają się do zastąpienia kwasu glutaminowego lizyną w pozycji 110 i kwasu glutaminowego lizyną w pozycji 345.
Jest oczywiście zrozumiałe, że w zmodyfikowanej transpozazie (lub konstrukcji kodującej zmodyfikowaną transpozazę) można dokonywać zmian innych niż te w wymienionych powyżej pozycjach bez ujemnego wpływu na aktywność transpozazy. Na przykład jest dobrze zrozumiałe, że konstrukcja kodująca taką transpozazę może obejmować w trzeciej pozycji kodonów takie zmiany, że kodowany aminokwas nie różni się od tu opisanego. Ponadto, niektóre zmiany kodonów mają niewielki lub żadnego wpływu funkcjonalnego na aktywność transpozycyjną kodowanego białka. Wreszcie można wprowadzić inne zmiany, które zapewnią jeszcze wyższą aktywność transpozycyjną kodowanego białka. W szczególności, dostrzega się możliwość łączenia kombinacji mutacji, tak by kodowały zmodyfikowaną transpozazę o aktywności transpozycyjnej jeszcze wyższej niż ta przykładowo podana w niniejszym opisie. Wszystkie te zmiany mieszczą się w zakresie niniejszego wynalazku. Należy jednakże zauważyć, że zmodyfikowana transpozaza zawierająca mutacje EK110 i EK345 (obie opisane w Weigand i Reznikoff, supra) ma niższą aktywność transpozycyjną niż transpozazy zawierające każdą z tych mutacji oddzielnie.
Po przygotowaniu i oczyszczeniu enzymu, jak opisano w powyżej, można go stosować w opisanej powyżej reakcji transpozycji in vitro do wprowadzenia jakiegokolwiek pożądanego elementu transpozycyjnego z DNA donorowego do DNA docelowego. DNA donorowy może być kolisty lub liniowy. Jeśli DNA donorowy jest liniowy, zaleca się, aby sekwencje powtarzalne flankujące element transpozycyjny nie znajdowały się na końcach liniowego fragmentu, ale powinny raczej obejmować pewien DNA przed i za regionem flankowanym sekwencjami powtarzalnymi.
Jak zauważono powyżej, transpozycja Tn5 wymaga pary końców o długości osiemnastu lub dziewiętnastu zasad. Opisano sekwencję końca zewnętrznego (OE) Tn5 typu dzikiego (5'-CTGACTCTTATACACAAGT-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7). Odkryto, że jeśli końce konstrukcji zawierają zasady ATA odpowiednio w pozycjach 10, 11 i 12, jak również nukleotydy wspólne dla OE i IE typu dzikiego (np. w pozycjach 1-3, 5-9, 13, 14, 16 i ewentualnie 19), to można uzyskać częstość transpozycji katalizowanej przez transpozazę in vitro co najmniej tak wysoką, jak ta dla OE typu dzikiego. Nukleotydy w pozycjach 4, 15, 17 i 18 mogą odpowiadać nukleotydom występującym w analogicznych pozycjach OE typu dzikiego lub IE typu dzikiego. Zauważono, że można zwiększyć częstość transpozycji w stosunku do OE typu dzikiego, jeśli nukleotydem w pozycji 4 jest T. Uprzednio nie stwierdzono ważności tych konkretnych zasad dla częstości transpozycji.
Należy zauważyć, że nie jest zamiarem, aby te zmiany obejmowały wszystkie pożądane modyfikacje OE. Jak opisano w innym miejscu niniejszego opisu, te cechy dopuszczalnych modyfikacji końców zidentyfikowano przez przeszukiwanie mutantów posiadających losowe różnice pomiędzy końcami IE i OE. Podczas gdy wykazano tu, że obecność pewnych nukleotydów w końcach jest zalecana, inne pożądane sekwencje terminalne mogą jeszcze zostać uzyskane dzięki przeszukiwaniu większego zestawu zdegenerowanych mutantów, zawierających zmiany w innych pozycjach niż te obecnie testowane, jak również mutantów zawierających nukleotydy nie testowane w opisanym przeszukiwaniu. Ponadto, dla specjalisty w tej dziedzinie jest oczywiste, że jeśli stosuje się inną transpozazę, może nadal okazać się możliwe wyselekcjonowanie innych wariantów końców, bardziej odpowiednich dla tej danej transpozazy.
Wśród mutantów, które są pożądane i które obejmuje zakres niniejszego wynalazku, znajdują się dwie bardzo aktywne zmutowane sekwencje OE, które zidentyfikowano in vivo. Chociaż przedstawiono je tu jako sekwencje jednoniciowe, w rzeczywistości sekwencje OE typu dzikiego i zmutowane zawierają komplementarne drugie nici. Pierwszy bardzo aktywny mutant, 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8) różni się od sekwencji OE typu dzikiego w pozycjach 4, 17 i 18, licząc od końca 5', ale zachowuje ATA w pozycjach 10-12. Drugi mutant, 5'-CTGTCTCTTATA-CAGATCT-3 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9), różni się od sekwencji OE typu dzikiego w pozycjach 4, 15, 17 i 18, ale również zachowuje ATA w pozycjach 10-12. Te dwie bardzo aktywne zmutowane sekwencje OE różnią się od siebie tylko w pozycji 15, w której występuje G lub C. Aktywność podobną do aktywności OE (lub wyższą) obserwuje się dla zmutowanej sekwencji, jeśli zawiera ona ATA w pozycjach 10, 11 i 12. Może być moż liwe zmniejszenie długości sekwencji OE z 19 do 18 par nukleotydów z nieznacznym lub bez żadnego wpływu.
PL 193 220 B1
Gdy jedna ze zidentyfikowanych bardzo aktywnych zmutowanych sekwencji OE flankuje substratowy DNA, częstość transpozycji in vivo dla transpozazy EK54/MA56 wzrasta około 46-60-krotnie w stosunku do częstości obserwowanej, gdy DNA ulegające transpozycji flankują końce OE typu dzikiego. Wiadomo już, że transpozaza EK54/MA56, wykorzystując końce OE typu dzikiego, wykazuje częstość transpozycji in vivo około 8-krotnie wyższą niż transpozaza typu dzikiego. Wiadomo, że transpozaza Tn5 posiadająca mutację EK54/MA56 wiąże się z większą siłą z OE, a z mniejszą siłą z końcami wewnętrznymi (IE) Tn5 niż transpozaza typu dzikiego.
Odpowiedni zmutowany koniec w konstrukcji do stosowania w oznaczeniach tu opisanych charakteryzowany jest biologicznie powodowaniem powstawania większej liczby brodawek na kolonię w porównywalnym czasie, powiedzmy 68 godzin, niż obserwowana w koloniach zawierających OE typu dzikiego w porównywalnym plazmidzie. OE typu dzikiego może indukować powstawanie około 100 brodawek na kolonię przy pomiarze po 68 godzinach od wysiania w oznaczeniu tworzenia brodawek przy zastosowaniu transpozazy EK54/MA56, jak opisano w innym miejscu niniejszego opisu. Zalecany mutant powinien powodować powstawanie pomiędzy 200 a 3000 brodawek na kolonię, a bardziej zalecany mutant pomiędzy 1000 a 3000 brodawek na kolonię, w przypadku pomiaru w tym samym oznaczeniu po takim samym czasie. Najbardziej zalecany mutant powinien powodować powstawanie pomiędzy 2000 a 3000 brodawek na kolonię podczas oznaczania w tych samych warunkach. Liczba brodawek może być nawet wyższa niż 3000 na kolonię, chociaż ilościowe określanie takich poziomów jest trudne.
Częstość transpozycji jest również zasadniczo zwiększana w oznaczeniu transpozycji in vitro według niniejszego wynalazku, gdy substratowy DNA jest flankowany przez dogodną zmutowaną sekwencją OE i stosuje się najkorzystniejszą zmutowaną transpozazę (zawierającą mutacje EK54/MA56/LP372). W tych warunkach zasadniczo cały substratowy DNA ulega przekształceniu w produkty transpozycji.
Szybkość transpozycji in vitro obserwowanej przy użyciu bardzo aktywnych końców jest według doświadczenia twórców wynalazku wystarczająco wysoka, aby nie zachodziła potrzeba selekcji pod względem zdarzeń transpozycji. Wszystkie kolonie losowo wybierane po transformacji do dalszych badań wykazywały dowody na zajście zdarzenia transpozycji.
Ten postęp może stanowić znaczące oszczędności czasu i pracy laboratoryjnej. Na przykład, szczególnie dogodna jest zdolność do poprawy częstości transpozycji in vitro raczej przez modyfikację DNA niż modyfikację transpozazy, ponieważ w miarę wzrostu aktywności transpozazy w komórkach gospodarza wzrasta prawdopodobieństwo, że komórki zawierające transpozazę zginą podczas wzrostu w wyniku zaburzających transpozycji DNA. W przeciwieństwie do tego, będący przedmiotem zainteresowania DNA zawierający zmodyfikowane końce OE można namnażać w źródłach całkowicie oddzielnych od transpozazy, a więc bez narażania na ryzyko komórek gospodarza.
Bez zamiaru ograniczania zakresu tego aspektu tego wynalazku jest oczywiste, że testowane bardzo aktywne końce nie mają większej zdolności wiązania z transpozazą niż końce OE typu dzikiego. A zatem, wyższa częstość transpozycji powodowana przez bardzo aktywne końce nie jest wynikiem wzmocnionego wiązania transpozazy.
Element transpozycyjny pomiędzy końcami może zawierać jakąkolwiek pożądaną sekwencję nukleotydową. Długość elementu transpozycyjnego pomiędzy końcami powinna wynosić co najmniej 50 par zasad, chociaż działać mogą mniejsze wstawki. Nie jest znana górna granica wielkości wstawki. Jednakże wiadomo, że część DNA donorowego o długości około 300 nukleotydów może dobrze funkcjonować. Dla nie ograniczającego przykładu, element transpozycyjny może obejmować region kodujący wykrywalne lub możliwe do wyselekcjonowania białko, z lub bez towarzyszących elementów regulacyjnych, takich jak promotor, terminator lub podobne.
Jeśli element zawiera taki wykrywalny lub możliwy do selekcji region kodujący bez promotora, będzie możliwe zidentyfikowanie i mapowanie promotorów w DNA docelowym, które zostaną wykryte dzięki transpozycji regionu kodującego do pozycji za promotorem, a następnie analizowanie sekwencji kwasu nukleinowego poprzedzającej miejsce transpozycji.
Podobnie, element może zawierać miejsce wiążące starter, które może ulec transpozycji do DNA docelowego, dla ułatwienia sekwencjonowania lub innych metod opartych na wykorzystaniu starterów rozmieszczonych w docelowym materiale genetycznym. Podobnie, sposób można stosować do wprowadzenia do sekwencji docelowej pożądanego miejsca dla enzymu restrykcyjnego lub poliłącznika, bądź miejsca odpowiedniego dla innego typu rekombinacji, takiego jak cre-lox.
PL 193 220 B1
Wynalazek można lepiej zrozumieć po zapoznaniu się z poniższymi przykładami, które w zamierzeniu są przykładowe i nie ograniczają wynalazku.
P r z y k ł a d y
W celu uzyskania transpozazy zmodyfikowanej w pozycji 54, pierwszą jedną trzecią część regionu kodującego z istniejącego klonu DNA, który koduje transpozazę Tn5, ale nie białko hamujące MA56 zmutagenizowano przy użyciu znanych metod, fragmenty DNA zawierające zmutagenizowaną część sklonowano z utworzeniem biblioteki klonów plazmidowych zawierających gen transpozazy o pełnej długości. Klonami tworzącymi bibliotekę stransformowano bakterie E. coli K-12 szczep MDW320, które wysiano i hodowano do uzyskania kolonii. Elementy transpozycyjne dostarczono do bakterii w oddzielnym plazmidzie, zawierającym defektywny gen lacZ. Oddzielny plazmid, pOXgen386, opisano w Weinreich, M. i in., „A functional analysis of the Tn5 Transposase: Identi-fication of
Domains Required for DNA Binding and Dimerization”, J. Mol. Biol. 241: 166-177 (1993), włączonej do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Kolonie posiadające podwyższoną aktywność transpozazy selekcjonowano poprzez przeszukiwanie pod względem obecności plamek o barwie niebieskiej (LacZ) na koloniach o barwie białej, rosnących w obecności X-gal. To oznaczanie tworzenia brodawek opisano w Weinreich i in. (1993), supra. W celu ustalenia, czy za wzrost aktywności transpozazy odpowiadała mutacja, zsekwencjonowano więcej niż jedną trzecią 5'-końcową część genów transpozazy Tn5 z takich kolonii. Ustalono, że mutacja w pozycji 54 na lizynę była dobrze skorelowana ze wzrostem aktywności transpozazy. Plazmid pRZ5412-EK54 zawiera lizynę w pozycji 54, jak również opisaną alaninę w pozycji 56.
Fragment zawierający mutację LP372 wyizolowano z pRZ4870 (Weinreich i in. (1994)) stosując enzymy restrykcyjne Nhel i BglII i zligowano z pRZ5412-EK54 strawionym Nhel-BgllI, aby utworzyć zrekombinowany gen zawierający mutacje w pozycjach 54, 56 i 372, jak opisano w niniejszym opisie i przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1. Gen przetestowano i wykazano, że wykazuje on co najmniej około stukrotny wzrost aktywności w porównaniu z transpozazą Tn5 typu dzikiego. Każdy z pojedynczych mutantów w pozycjach 54 i 372 wykazywał około10 -krotny wzrost aktywności transpozazy.
Zmodyfikowane białko transpozazy kodowane przez potrójnie zmutowany zrekombinowany gen przeniesiono do komercyjnego wektora ekspresyjnego z promotorem T7, pET-21D (dostępnego komercyjnie w Novagen, Madison, WL) przez wstawienie fragmentu BspHI/SalI do fragmentu NhoI/XhoI wektora pET21D. To klonowanie lokuje zmodyfikowany gen transpozazy raczej pod kontrolą promotora T7 niż naturalnego promotora genu transpozazy. Produkt genu ulegał wytwarzaniu na wysokim poziomie w komórkach gospodarza bakteryjnego BL21(DE3)pLysS, które nie zawierają miejsc wiążących enzym, dzięki specyficznej indukcji w procesie fermentacji po zakończeniu wzrostu komórek. (Patrz, Studier, F. W. i in., „Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes”, Methods Enzymol. 18: 60-89 (1990)). Transpozazę częściowo oczyszczano stosując przy użyciu metody de la Cruz, zmodyfikowanej przez indukcję wytwarzania na wysokim poziomie w temperaturze 33°C lub 37°C. Po oczyszczaniu preparat enzymu do chwili użycia przechowywano w temperaturze -70°C w buforze do przechowywania (10% glicerol, 0,7 M NaCl, mM Tris-Hcl, pH 7,5, 0,1% Triton-X100 i mM CHAPS). Ten bufor do przechowywania należy uważać za przykładowy, a nie optymalny.
Skonstruowano pojedynczy plazmid (pRZTL1, fig. 1), służący w tym przykładzie zarówno jako DNA donorowy, jak i docelowy. Pełną sekwencję DNA plazmidu pRZTL1 przedstawiono i opisano w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3. Plazmid pRZTL1 zawiera dwa końce OE Tn5 o długości 19 par zasad w odwróconej względem siebie orientacji. Do jednej z sekwencji OE przylega bezpośrednio gen, który powinien kodować oporność na tetracyklinę, gdyby nie brak poprzedzającego go promotora. Jednakże, gen ulega ekspresji, jeśli gen oporności na tetracyklinę zostanie umieszczony za regionem ulegającym transkrypcji (np. pod kontrolą promotora, który inicjuje transkrypcję genu oporności na chloramfenikol, również obecnego w pRZTL1). A zatem, dla potwierdzenia, że nastąpiła transpozycja, można po reakcji in vitro użyć plazmidu testowego pRZTL1 do oznaczeń in vivo. Plazmid pRZTL1 zawiera również w elemencie transpozycyjnym miejsce początku replikacji, które zapewnia, że wszystkie produkty transpozycji będą plazmidami zdolnymi do replikacji po wprowadzeniu do komórek gospodarza.
W typowych reakcjach transpozycji in vitro w objętości 20 μl stosowano następujące składniki:
Zmodyfikowana transpozaza: 2 μl (około 0,1 μg enzymu/μθ w buforze do przechowywania (10% glicerol, 0,7 M NaCl, mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% Triton-X100 i 10 mM CHAPS).
PL 193 220 B1
DNA donorowy/docelowy: 18 μl (około 1-2 μg) w buforze reakcyjnym (o końcowych stężeniach reakcyjnych: 0,1 M glutaminian potasowy, 2 mM Tris-octan, pH 7,5, 10 mM octan-Mg2+, 50 μg/ml BSA, 0,5 mM β-merkaptoetanol, 2 mM spermidyna, 100 μg/ml tRNA).
Transpozazę łączono z DNA pRZTL1 w temperaturze 20°C i pozostawiano w ciągu 60 minut. Następnie zwiększano objętość mieszaniny reakcyjnej poprzez dodanie dwóch objętości buforu reakcyjnego i temperaturę podwyższano do 37°C na 2-3 godziny, podczas których następowało cięcie i przenoszenie nici.
Wydajny przebieg transpozycji in vitro wykazano metodami in vivo i in vitro. In vivo obserwowano wiele kolonii opornych na tetracyklinę po wprowadzeniu kwasu nukleinowego, będącego produktem reakcji, do bakteryjnych komórek DH5a. Jak zaznaczono, oporność na tetracyklinę może w tym układzie powstać tylko wtedy, gdy element transpozycyjny ulegnie transpozycji za aktywny promotor gdziekolwiek w plazmidzie. Typowa częstość transpozycji wynosiła 0,1% komórek, które otrzymały plazmidowy DNA, jak określono przez liczenie kolonii opornych na chloramfenikol. Jednakże, ta wartość zaniża całkowitą częstość zdarzeń transpozycji, ponieważ układ detekcji ogranicza docelowy DNA do 1/16 całości.
Ponadto, analizy in vitro, elektroforetyczna (1% agaroza) i sekwencji DNA przeprowadzone wobec DNA izolowanego z kolonii, wykazały produkty rzeczywistych zdarzeń transpozycji, obejmujących zarówno procesy wewnątrzcząsteczkowe, jak i międzycząsteczkowe. Wyniki typowych reakcji z wykorzystaniem jako substratu kolistego plazmidu pRZTL1 przedstawiono na ścieżkach 4 i 5. Ścieżka 6 na fig. 2 przedstawia wyniki uzyskane przy użyciu jako substratów liniowego plazmidu pRZTL1.
Prążki w żelach 1% agarozy uwidoczniono przez barwienie SYBR Green (FMC BioProducts) i zeskanowano stosując Fluoroimager SI (Molecular Dynamics). Ścieżka 1 na figurze 2 przedstawia postacie zrelaksowaną kolistą, liniową i zamkniętą kolistą pRZTL1. Ścieżki 2 i 3 przedstawiają odpowiednio produkty wewnątrzcząsteczkowej i międzycząsteczkowej transpozycji in vitro w pRZTL1. Produkty oczyszczono z poddanych elektroporacji komórek DH5a i potwierdzono, że są rzeczywistymi produktami transpozycji poprzez analizę ich wielkości i sekwencji. Ścieżki 4 i 5 przedstawiają produkty dwóch niezależnych reakcji in vitro z wykorzystaniem mieszaniny testowych substratów plazmidowych w postaci zamkniętej i zrelaksowanej kolistej. Na ścieżce 6 substratem reakcji był liniowy pRZTL1 (cięty XhoI). Ścieżka 7 zawiera DNA faga lambda strawiony BstEII jako standard masy cząsteczkowej.
Figura 3 ponownie przedstawia ścieżki 4, 5 i 6 z fig. 2 i przedstawia analizę różnych produktów w oparciu o doświadczenia z kolejnymi trawieniami restrykcyjnymi oraz ponowną elektroporacją i sekwencjonowaniem DNA. Uwolniony DNA donorowy odpowiada fragmentowi pRZTL1 zawierającemu gen oporności na kanamycynę pomiędzy dwiema sekwencjami OE lub, w przypadku substratu liniowego, fragment OE-Xhol. Produkty transpozycji międzycząsteczkowej są widoczne jedynie jako zrelaksowany DNA kolisty. Produkty transpozycji wewnątrzcząsteczkowej widoczne są jako „drabinka”, która powstaje w wyniku przekształcenia początkowej superhelikalności substratu w węzły DNA. Reakcja jest wystarczająco wydajna, by spowodować podwójne zdarzenia transpozycji, które są kombinacją zdarzeń między- i wewnątrzcząsteczkowych.
Przeprowadzono wstępne badania charakteru końców uczestniczących w reakcji transpozycji. Porównano sekwencje OE i IE Tn5 typu dzikiego i podjęto wysiłek losowego przetasowania nukleotydów w każdej z siedmiu pozycji, w których występują różnice. Utworzono populację oligonukleotydów zdegenerowanych w każdej pozycji, w której występują różnice. A zatem, poszczególne oligonukleotydy w populacji zawierały w przypadkowej kombinacji albo nukleotydy występujące w sekwencji OE typu dzikiego albo w sekwencji IE typu dzikiego. Według tego schematu, przy użyciu standardowych technik, zsyntetyzowano 27 (128) różnych oligonukleotydów. Te oligonukleotydy, zawierające sekwencje charakterystyczne zarówno dla OE, jak i dla IE, określa się w niniejszym opisie jako sekwencje OE/IE-podobne. Dla uniknięcia komplikacji nomenklaturowych wynikających z faktu, że oligonukleotydy są oligonukleotydami pośrednimi pomiędzy sekwencjami OE i IE typu dzikiego, twórcy zaznaczają, że, o ile nie stwierdzono inaczej, wybrane sekwencje oligonukleotydowe porównuje się raczej z OE typu dzikiego, a nie z IE typu dzikiego. Specjaliści w tej dziedzinie zauważą, że gdyby jako punkt odniesienia wybrano IE, różnice byłyby identyczne, ale inaczej by je określano.
Poniżej przedstawiono pozycje (x), które zmieniano w tym schemacie tworzenia mutantów. OE typu dzikiego (WT OE) przedstawiono również w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 7, a IE typu dzikiego (WT IE) w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 10.
5'-CTGACTCTTATACACAAGT-3' (WT OE) x xxx x xx (pozycje różnic)
PL 193 220 B1
5'-CTGTCTCTTGATCAGATCT-3' (WT LE)
Oprócz zdegenerowanych sekwencji OE/IE-podobnych, syntetyczne oligonukleotydy o długości 37 zasad zawierały również na końcach miejsca rozpoznawane i cięte przez enzymy restrykcyjne Sphl i KpnI dla dogodnego klonowania zdegenerowanych oligonukleotydów w wektorach plazmidowych. W ten sposób z populacji 27 (128) typów zdegenerowanych oligonukleotydów utworzono bibliotekę losowych końców.
Figura 4 przedstawia pRZ1496, którego pełną sekwencję przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11. W sekwencji odnotowano następujące cechy:
Cecha
WTOE sekwencja kodująca LacZ sekwencja kodująca LacY sekwencja kodująca LacA sekwencja kodująca tetr sekwencja kodująca transpozazę kasetka IE sekwencja colE1
Pozycja
94-112
135-3137
3199-4486
4553-6295
6669-9442
10683-12111 (nić komplementarna)
12184-12225
12732-19182
Kasetkę IE przedstawioną na fig. 4 wycięto przy użyciu Sphl i KpnI i zastąpiono, stosując standardowe metody cięcia i ligacji, kasetkami z syntetycznymi końcami zawierającymi części OE/IE-podobne. Pomiędzy stałą sekwencją OE typu dzikiego, a sklonowaną sekwencją OE/IE-podobną, plazmid pRZ1496 zawiera gen, którego aktywność można wykrywać, mianowicie LacZYA, jak również gen markera selekcyjnego, tetr. Gen LacZ jest defektywny pod tym względem, że pozbawiony jest odpowiednich sygnałów inicjacji transkrypcji i translacji. Gen LacZ ulega transkrypcji i translacji tylko wtedy, gdy ulegnie transpozycji w pozycję położoną za takimi sygnałami.
Otrzymanymi w wyniku klonami stransformowano, stosując elektroporację, bakteryjne komórki dam-, LacZ-, w tym przypadku komórki JCM101/pOXgen, które hodowano w temperaturze 37°C w podłożu LB w standardowych warunkach. Szczep dam- jest zalecany, ponieważ metylacja dam może hamować wykorzystywanie IE, a sekwencje IE typu dzikiego zawierają dwa miejsca metylacji dam. Szczep dam- wyklucza wpływ metylacji dam na wyniki pomiaru aktywności transpozycyjnej. Selekcjonowane komórki Tetr były LacZ-; aktywowana przez transpozycję ekspresja Lac była łatwo wykrywalna na negatywnym tle. pOXgen jest nie mającą zasadniczego znaczenia pochodną czynnika F, która nie musi być dostarczana do komórek gospodarza.
W niektórych doświadczeniach transpozazę EK54/MA56 kodował bezpośrednio transformujący plazmid pRZ1496. W innych doświadczeniach plazmid pRZ1496 modyfikowano poprzez delecję unikalnego fragmentu Hindlll/Eagl (nukleotydy 9112-12083) z plazmidu (patrz fig. 4) w celu zapobiegnięcia wytwarzaniu transpozazy. W doświadczeniach tego drugiego rodzaju, komórki gospodarza kotransformowano plazmidem z delecją Hindlll/EagI, nazwanym pRZ5451 (fig. 4) i kodującym transpozazę EK54/MA56 plazmidem nadającym oporność na chloramfenikol. W niektórych doświadczeniach dla porównania użyto porównywalnego plazmidu kodującego transpozazę Tn5 typu dzikiego.
Częstość transpozycji oceniano w oznaczeniu tworzenia brodawek, w którym mierzy się liczbę plamek o barwie niebieskiej (komórki wytwarzające Lac lub „brodawki”) na kolonii poza tym posiadającej białą barwę. Stransformowane komórki wysiewano (około 50 kolonii na szalkę) na glukozowe podłoże minimalne Millera (Miller, J., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972)) zawierające 0,3% hydrolizat kazeiny, 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-e-D-galaktozyd (40 μg/ml) i fenylo-e-D-galaktozyd (0,05%). Podłoże zawierało tetracyklinę (15 μg/ml) i tam, gdzie było to potrzebne, chloramfenikol (20 μg/ml). W koloniach, które przeżyły selekcję, oceniano częstość transpozycji in vivo. Chociaż można było gołym okiem odróżnić kolonie wykazujące większe brodawkowanie, liczbę plamek o barwie niebieskiej na kolonię określano w ciągu okresu kilku dni (przeciętnie 90 godzin po wysianiu).
W celu wykazania, że fenotyp wysokiego poziomu tworzenia brodawek był nadawany przez mutacje końców w plazmidzie, kolonie przesiewano, jeśli wykazywały wyższy poziom tworzenia brodawek niż obserwowany, gdy plazmid zawierał IE typu dzikiego. Następnie hodowano kolonie otrzymane z kolonii uzyskanych z takiego przesiania. Z wyhodowanych komórek izolowano i oczyszczano DNA stosując standardowe metody i transformowano nim ponownie „czyste” komórki JCM101/pOXgen. Po12
PL 193 220 B1 nownie porównywano poziom tworzenia brodawek w opisanym powyżej oznaczeniu z tym dla plazmidów zawierających IE typu dzikiego i zaobserwowano zgodne wyniki.
W celu uzyskania DNA do sekwencjonowania wstawionego oligonukleotydu, prowadzono hodowle zaszczepione materiałem z części o barwie białej 117 kolonii wykazujących wysokie poziomy tworzenia brodawek i z każdej z kolonii przygotowano DNA stosując standardowe metody minipreparatyk DNA.
Określono sekwencję DNA OE/IE-podobnej części ze 117 klonów (42 z transformacji z wykorzystaniem pRZ1496 jako wektora do klonowania; 7 z transformacji z wykorzystaniem pRZ5451 jako wektora do klonowania). Zaobserwowano tylko 29 odrębnych mutantów. Wiele z mutantów wyizolowano wielokrotnie.
Wszystkie mutanty wykazujące najwyższe częstości tworzenia brodawek zawierają zasady pochodzące z OE w pozycjach 10, 11 i 12. Gdy w tych pozycjach zachowane były zasady IE-podobne, nie było możliwe zmierzenie wpływu innych zmian na transpozycję, ponieważ poziom tworzenia brodawek był już skrajnie wysoki.
W opisany powyżej sposób przeszukano tysiąc pięćset siedemdziesiąt pięć kolonii. Prawdopodobieństwo, że sprawdzono wszystkie 128 możliwe zmutowane sekwencje było wyższe niż 95%. A zatem, nie jest prawdopodobne, by przy użyciu testowanej transpozazy uzyskano inny koniec, który zapewniałby wyższą częstość transformacji.
T a b e l a 1
Poziom tworzenia brodawek w układzie trans hybrydowych sekwencji końców dla Tnp EK4
Wymieniono wszystkie sekwencje hybrydowe końców izolowane w pRZ5451, które z większą częstością powodowały tworzenie brodawek, niż IE typu dzikiego, gdy ekspresję Tnp EK54 prowadzono z pFMA187.
a Poziomy tworzenia brodawek w układzie trans sekwencji końców IE typu dzikiego, OE typu dzikiego i hybrydowych sklasyfikowano następująco:
BN - bardzo niski,
N - niski,
Ś - średni,
W - wysoki.
b Choć w tym doświadczeniu nie stwierdzono mutantów 12 i 13, stwierdzono je w przeszukiwaniu tworzenia brodawek w układzie cis (tabela 2).
PL 193 220 B1
T a b e l a 2
Poziom tworzenia brodawek w układzie cis hybrydowych sekwencji końców dla Tnp EK4
Wymieniono wszystkie sekwencje hybrydowe końców izolowane w pRZ1496, które z większą częstością powodowały tworzenie brodawek, niż IE typu dzikiego, gdy ekspresje Tnp EK54 prowadzono z tego samego plazmidu.
a Poziomy tworzenia brodawek w układzie cis sekwencji koń ców IE typu dzikiego, OE typu dzikiego i hybrydowych sklasyfikowano następująco:
N - niski,
Ś - średni,
ŚW - średnio-wysoki,
W - wysoki.
b Choć w tym do ś wiadczeniu nie stwierdzono mutantów 2, 10 i 14, stwierdzono je w przeszukiwaniu tworzenia brodawek w układzie trans (tabela 1).
Tabele 1 i 2 podają jakościowy poziom tworzenia brodawek dla zmutowanych konstrukcji zawierających wskazane hybrydowe sekwencje końców albo sekwencje końców OE lub IE typu dzikiego. W tabelach, jeśli nie wskazano inaczej, sekwencja w każdej pozycji końca odpowiada IE typu dzikiego. Mimo, że sekwencje przedstawiono w notacji skróconej, zamiarem zgłaszających jest, aby specjalista mógł łatwo ustalić pełną sekwencję 19 par zasad każdego przedstawionego mutanta i ten opis należy odczytywać jako obejmujący wszystkie takie pełne sekwencje. Tabela 1 zawiera wyniki z prób, w których transpozazę EK54 zapewniono w ukł adzie trans, tabela 2 - tych testów, w których transpozazę EK54 zapewniono w układzie cis. Chociaż transpozaza zapewniona w cis jest bezwzględnie bardziej aktywna niż transpozaza zapewniona w układzie trans, źródło cis lub trans transpozazy nie zmienia względnych częstości transpozycji in vivo testowanych końców.
Tabele 1 i 2 wykazują, że każdy mutant, który zachowuje sekwencję ATA w pozycjach odpowiednio 10, 11 i 12, posiadał aktywność porównywalną lub wyższą niż OE typu dzikiego, niezależnie od tego, czy aktywność OE typu dzikiego była średnia (tabela 1, trans), czy wysoka (tabela 2, cis). Ponadto, kiedykolwiek ta trinukleotydowa sekwencja w mutancie była różna od ATA, mutant wykazywał niższą aktywność tworzenia brodawek niż OE typu dzikiego. Zauważono również, że gdy w pozycji 4 występuje T, tworzenie brodawek jest co najmniej porównywalne, a zazwyczaj znacząco wyższe niż dla OE typu dzikiego.
PL 193 220 B1
Ilościowa analiza tworzenia brodawek, dokładniejsza niż przedstawione poziomy porównawcze (bardzo niski, niski, średni, średnio-wysoki i wysoki) była trudna. Jednakże, specjalista w tej dziedzinie może łatwo określić poziom tworzenia brodawek OE i może rozpoznać te kolonie, które wykazują poziomy porównywalne lub wyższe. Pomocne jest obserwowanie brodawek w powiększeniu.
Liczba obserwowanych brodawek wzrastała w czasie, jak przedstawiono na fig. 5-7, co w przybliżeniu jest miarą tworzenia brodawek w komórkach transformowanych oddzielnie 9 klonami zawierającymi bądź odrębne kasetki z syntetycznymi końcami, bądź końce OE lub IE typu dzikiego. Na tych 3 figurach, każdy mutant jest identyfikowany przez różnice wykazywane w stosunku do sekwencji IE typu dzikiego. Należy zauważyć, że wśród testowanych mutantów tylko mutant 10A/11T/12A posiadał wyższy poziom transpozycyjnego tworzenia brodawek niż OE typu dzikiego. Ten mutant, który, gdyby punktem odniesienia była sekwencja OE, byłby nazwany 4/15/17/18, był jedynym mutantem z tych przedstawionych na fig. 5-7, który zachował nukleotydy ATA w pozycjach 10, 11 i 12. Fig. 5 (oś y: 0-1500 brodawek) i fig. 6 (oś y: 0-250 brodawek) przedstawiają tworzenie brodawek uzyskane przy użyciu różnych mutantów oraz IE i OE jako kontroli i enzymu EK54/MA56. Fig. 7 (oś y: 0-250 brodawek) przedstawia tworzenie brodawek, gdy te same zmutowane sekwencje testowano z transpozazą typu dzikiego (dokładniej MA56). Mutant 10A/11T/12A (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9) dawał z transpozazą ED54/MAC56 znacząco więcej brodawek (około 3000) w krótszym czasie (66 godzin) niż obserwowano nawet po 90 godzinach z WT OE (około 1500). Pojedynczy OE-podobny nukleotyd w pozycji 15 w IE-podobnym otoczeniu również zwiększał częstość brodawkowania.
Częstość transpozycji in vivo oceniano również ilościowo w oznaczeniu oporności na tetracyklinę przy użyciu dwóch sekwencji wykazujących wysokie poziomy tworzenia brodawek. Tymi sekwencjami były 5'-CTGTCTTATACACATCT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8), różniąca się od sekwencji OE typu dzikiego w pozycjach 4, 17 i 18 licząc od końca 5' oraz 5'-CTGTCTCTTATACAG -ATCT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9), różniąca się od OE typu dzikiego w pozycjach 4, 15, 17 i 18. Sekwencje te uznano za dogodnie zmutowane końce w oznaczeniu z wykorzystaniem transpozazy zawierającej ED54/MAC56 i transpozazy zawierającej MAC56. Każdą sekwencję wprowadzono oddzielnie do pRZTL1 w miejsce dwu sekwencji OE typu dzikiego plazmidu. Zamplifikowany w reakcji PCR fragment zawierający pożądane końce flankujące gen oporności na kanamycynę łatwo sklonowano w dużym fragmencie Hindlll pRZTL1. Powstałe plazmidy są identyczne z pRZTL1, z wyjątkiem wskazanych końców. Dla porównania testowano również pRZTL1 i pochodną pRZTL1 zawierającą dwie sekwencje IE typu dzikiego. W oznaczeniu komórki JCM101/p0Xgen poddawano kotransformacji plazmidem testowym (pRZTL1 lub pochodnym) i plazmidem ampr o wysokiej liczbie kopii, kodującym albo transpozazę ED54/MAC56 albo transpozazę typu dzikiego MAC56. Komórki gospodarza stawały się oporne na tetracyklinę tylko wówczas, gdy zdarzenie transpozycyjne umiejscawiało gen Tetr blisko za odpowiednim promotorem transkrypcji w innym miejscu plazmidu lub w chromosomie. Całkowitą liczbę komórek, które uzyskały plazmid testowy, określano licząc kolonie oporne na chloramfenikol i oporne na ampicylinę. Częstość transpozycji obliczano jako stosunek kolonii tetr/camrampr. Stosując każdy ze zmutowanych końców i transpozazę ED54/MAC56 obserwowano około 40-60-krotny wzrost transpozycji in vivo w stosunku do OE typu dzikiego. Spośród dwóch korzystnych zmutowanych końców, ten zawierający mutacje w trzech pozycjach względem sekwencji OE typu dzikiego powodował większy wzrost.
Jak pokazuje fig. 8, na której przedstawiono wykres częstości transpozycji (x 10-8) dla testowanych plazmidów, gdy plazmid testowy zawierał dwa końce IE, obserwowano nieznaczną transpozycję. Nieco wyższą transpozycję obserwowano, gdy plazmid testowy zawierał dwa końce OE, szczególnie gdy wykorzystywano transpozazę ED54/MAC56. W silnym przeciwieństwie, kombinacja transpozazy ED54/MAC56 z każdym z wybranych zalecanych końców (zawierających zasady OE-podobne wyłącznie w pozycjach 10, 11 i 12 lub w pozycjach 10, 11, 12 i 15) powodowała wielki wzrost transpozycji in vivo w porównaniu z końcami OE typu dzikiego.
Zalecany bardzo aktywny zmutowany koniec posiadający najbardziej zalecaną syntetyczną sekwencję końca, 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8) wprowadzono na miejsce obu końców WT OE w pRZTL1 (fig. 4) i testowano w oznaczeniu transpozycji in vitro tu opisanym, używając opisanego w niniejszym opisie potrójnego mutanta transpozazy. Ten zmutowany koniec wybrano do dalszej analizy in vitro, ponieważ częstość transpozycji była dla niego wyższa, niż dla drugiego korzystnego syntetycznego końca i ponieważ nie zawierał on żadnych miejsc metylacji dam, tak że metylacja dam nie wpływała już na częstość transpozycji. W przeciwieństwie do tego, mutant 4/15/17/18 zawiera miejsce metylacji dam.
PL 193 220 B1
We wstępnym doświadczeniu bufor reakcyjny nie zawierał CHAPS, ale zastosowano etap preinkubacji. Mieszaninę reakcyjną preinkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 20°C, następnie rozcieńczano dwukrotnie, a potem inkubowano w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C. Zastosowano
0,5 μg DNA i 0,4 μg transpozazy. Produkty transpozycji obserwowano w żelu. Dla zmutowanych końców obserwowano bardzo małe ilości wyjściowego DNA. Obserwowano liczne prążki odpowiadające pierwotnym i wtórnym produktom reakcji transpozycji. Mieszaninami reakcyjnymi stransformowano komórki DH5a i wysiano je na szalki zawierające chloramfenikol, tetracyklinę lub kanamycynę.
Zaobserwowano sześćset czterdzieści kolonii opornych na chloramfenikol. Chociaż mogły one reprezentować plazmid, który nie uległ reakcji, wszystkie testowane kolonie (n = 12) były oporne na kanamycynę, co wskazuje na utratę donorowego szkieletu DNA. Wszystkie dwanaście kolonii zawierało również plazmidy o zmienionej wielkości; 9 z 12 scharakteryzowano jako zawierające delecje-inwersje, pozostałe 3 posiadały proste delecje. Zaobserwowano 79 kolonii opornych na tetracyklinę, co wskazywało na aktywację genu tetr poprzez transpozycję.
Zaobserwowano jedenaście kolonii opornych na kanamycynę. Wskazywało to na niski procent pozostających plazmidów zawierających donorowy szkielet DNA.
W drugim podobnym teście użyto około 1 μg plazmidowego DNA i 0,2 μg transpozazy. W tym teście mieszaninę reakcyjną inkubowano bez CHAPS w temperaturze 37°C w ciągu 3 godzin bez preinkubacji lub rozcieńczania. Po 3 godzinach reakcji obserwowano w żelu nieco wyjściowego DNA. Po inkubacji przez noc obserwowano tylko produkty transpozycji.
Produktami 3-godzinnej reakcji stransformowano komórki DH5a i wysiano je w opisany sposób. Około 50% kolonii opornych na chloramfenikol było wrażliwych na kanamycynę i było przypuszczalnie produktami transpozycji.
Nie jest zamiarem, aby wynalazek był ograniczony do powyższych przykładów, ale aby obejmował wszystkie takie modyfikacje i odmiany, które mieszczą się w zakresie dołączonych zastrzeżeń. Przewiduje się, że poza szczegółowo tu podanymi zastosowaniami, dla specjalisty w dziedzinie biologii molekularnej oczywiste będą inne zastosowania. W szczególności, bardzo pożądane są sposoby wprowadzania pożądanych mutacji do DNA prokariotycznego lub eukariotycznego. Na przykład, obecnie trudno jest przeprowadzić usunięcie funkcjonalnego genu eukariotycznego poprzez rekombinację homologiczną z nieaktywną wersją genu znajdującą się w plazmidzie. Trudność wynika z konieczności flankowania genu w plazmidzie rozległymi sekwencjami leżącymi przed nim i za nim. Jednakże, przy zastosowaniu tego układu inaktywujący element transpozycyjny zawierający marker selekcyjny (np. neo) można wprowadzić in vitro do plazmidu zawierającego gen, którego inaktywacja jest pożądana. Po transpozycji produkty można wprowadzić do odpowiednich komórek gospodarza. Przy użyciu standardowych sposobów selekcji można uzyskać tylko te kolonie komórek, które zawierają plazmid z elementem transpozycyjnym. Takie plazmidy można przeszukiwać, na przykład przez analizę restrykcyjną, w celu odzyskania tych zawierających zniszczony gen. Takie klony można następnie wprowadzać bezpośrednio do komórek eukariotycznych w celu rekombinacji homologicznej i selekcjonować przy użyciu tego samego genu markerowego.
Można także stosować układ do łatwego wstawiania fragmentu DNA zamplifikowanego w reakcji PCR do wektora, unikając w ten sposób całkowicie tradycyjnych etapów klonowania. Można to przeprowadzić przez (1) zapewnienie odpowiedniej pary starterów reakcji PCR, zawierających końce OE sąsiadujące ze specyficznymi pod względem sekwencji częściami starterów, (2) przeprowadzenie standardowej amplifikacji pożądanego fragmentu kwasu nukleinowego w reakcji PCR, (3) przeprowadzenie reakcji transpozycji in vitro według niniejszego wynalazku, przy użyciu dwuniciowych produktów amplifikacji PCR jako DNA donorowego.
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:
(i) ZGŁ ASZAJĄ CY: WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Zmutowana transpozaza Tn5 zmieniona w stosunku do transpozazy Tn5 typu dzikiego, konstrukcje genetyczne, układ do transpozycji in vitro i sposób transpozycji in vitro (iii) LICZBA SEKWENCJI: 11 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: Quarles & Brady (B) ULICA: 1 South Pinckney Street (C) MIASTO: Madison
PL 193 220 B1 (D) STAN: WI (E) KRAJ: STANY ZJEDNOCZONE AMERYKI (F) KOD POCZTOWY: 53701 (v) ZAPIS KOMPUTEROWY:
(A) TYP NOŚ NIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: PC kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patent In wydanie # 1.0, wersja # 1.30 (vi) DANE DOTYCZĄ CE AKTUALNEGO ZGŁ OSZENIA:
(A) NUMER ZGŁ OSZENIA:
(B) DATA ZŁ O Ż ENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(viii) INFORMACJA O PE Ł NOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:
(A) NAZWISKO: Berson, Bennett J (B) NUMER REJESTRACYJNY: 37094 (C) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁYWAĆ/NUMER W REJESTRZE: 960296.94142 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:
(A) TELEFON: 608/251-5000 (B) TELEFAX: 608-251-9166 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁ UGOŚĆ: 1534 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS:/op = „Gen kodują cy zmodyfikowany enzym transpozazy Tn5” (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 93..1523 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 1:
CTGACTCTTA TACACAAGTA GCGTCCTGAA CGGAACCTTT CCCGTTTTCC AGGATCTGAT 60
CTTCCATGTG ACCTCCTAAC ATGGTAACGT TC ATG ATA ACT TCT GCT CTT CAT 113
| Met 1 | Ile | Thr | Ser | Ala 5 | Leu | His | |||||||||
| CGT | GCG | GCC | GAC | TGG | GCT | AAA | TCT | GTG | TTC | TCT | TCG | GCG | GCG | CTG | GGT |
| Arg | Ala | Ala 1C | Asp | Trp | Ala | Lys | Ser 15 | Val | Phe | Ser | Ser | Ala 20 | Ala | Leu | Gly |
| GAT | CCT | CGC | CGT | ACT | GCC | CGC | TTG | GTT | AAC | GTC | GCC | GCC | CAA | TTG | GCA |
| Asp | Pro 25 | Arg | Arg | Thr | Ala | Arg 30 | Leu | Val | Asn | Val | Ala 35 | Ala | Gin | Leu | Ala |
| AAA | TAT | TCT | GGT | AAA | TCA | ATA | ACC | ATC | TCA | TCA | GAG | GGT | AGT | AAA | GCC |
| Lys 40 | Tyr | Ser | Gly | Lye | Ser 45 | Ile | Thr | Ile | Ser | Ser 50 | Glu | Gly | Ser | Lys | Ala 55 |
| GCC | CAG | GAA | GGC | GCT | TAC | CGA | TTT | ATC | CGC | AAT | CCC | AAC | GTT | TCT | GCC |
| Ala | Gin | Glu | Gly | Ala 60 | Tyr | Arg | Phe | Ile | Arg 65 | Asn | Pro | Asn | Val | Ser 70 | Ala |
| GAG | GCG | ATC | AGA | AAG | GCT | GGC | GCC | ATG | CAA | ACA | GTC | AAG | TTG | GCT | CAG |
| Glu | Ala | Ile | Arg 75 | Lys | Ala | Gly | Ala | Met 80 | Gin | Thr | Val | Lys | Leu 85 | Ala | Gin |
| GAG | TTT | CCC | GAA | CTG | CTG | GCC | ATT | GAG | GAC | ACC | ACC | TCT | TTG | AGT | TAT |
| Glu | Phe | Pro 90 | GlU | Leu | Leu | Ala | Ile 95 | Glu | Asp | Thr | Thr | Ser 100 | Leu | Ser | Tyr |
PL 193 220 B1
| CGC | CAC | CAG | GTC | GCC | GAA | GAG | CTT | GGC | AAG | CTG | GGC | TCT | ATT | CAG | GAT | 449 |
| Arg | His 105 | Gin | Val | Ala | Glu | Glu 110 | Leu | Gly | Lys | Leu | Gly 115 | Ser | Ile | Gin | Asp | |
| AAA | TCC | CGC | GGA | TGG | TGG | GTT | CAC | TCC | GTT | CTC | TTG | CTC | GAG | GCC | ACC | 497 |
| Lys 120 | Ser | Arg | Gly | Trp | Trp 125 | Val | His | Ser | Val | Leu 130 | Leu | Leu | Glu | Ala | Thr 135 | |
| ACA | TTC | CGC | ACC | GTA | GGA | TTA | CTG | CAT | CAG | GAG | TGG | TGG | ATG | CGC | CCG | . 545 |
| Thr | Phe | Arg | Thr | Val 140 | Gly | Leu | Leu | His | Gin 145 | Glu | Trp | Trp | Met | Arg 150 | Pro | |
| GAT | GAC | CCT | GCC | GAT | GCG | GAT | GAA | AAG | GAG | AGT | GGC | AAA | TGG | CTG | GCA | 593 |
| Asp | Asp | Pro | Ala 155 | Asp | Ala | Asp | Glu | Lys 160 | Glu | Ser | Gly | Lys | Trp 165 | Leu | Ala | |
| GCG | GCC | GCA | ACT | AGC | CGG | TTA | CGC | ATG | GGC | AGC | ATG | ATG | AGC | AAC | GTG | 641 |
| Ala | Ala | Ala 170 | Thr | Ser | Arg | Leu | Arg 175 | Met | Gly | Ser | Met | Met 180 | Ser | Asn | Val | |
| ATT | GCG | GTC | TGT | GAC | CGC | GAA | GCC | GAT | ATT | CAT | GCT | TAT | CTG | CAG | GAC | 689 |
| Ile | Ala 18S | Val | Cys | Asp | Arg | Glu 190 | Ala | Asp | Ile | His | Ala 195 | Tyr | Leu | Gin | Asp | |
| AGG | CTG | GCG | CAT | AAC | GAG | CGC | TTC | GTG | GTG | CGC | TCC | AAG | CAC | CCA | CGC | 737 |
| Arg 200 | Leu | Ala | His | Asn | Glu 205 | Arg | Phe | Val | Val | Arg 210 | Ser | Lys | His | Pro | Arg 215 | |
| AAG | GAC | GTA | GAG | TCT | GGG | TTG | TAT | CTG | ATC | GAC | CAT | CTG | AAG | AAC | CAA | 785 |
| Lys | Asp | Val | Glu | Ser 220 | Gly | Leu | Tyr | Leu | Ile 225 | Asp | His | Leu | Lys | Asn 230 | Gin | |
| CCG | GAG | TTG | GGT | GGC | TAT | CAG | ATC | AGC | ATT | CCG | CAA | AAG | GGC | GTG | GTG | 833 |
| Pro | Glu | Leu | Gly 235 | Gly | Tyr | Gin | Ile | Ser 240 | Ile | Pro | Gin | Lys | Gly 245 | val | Val | |
| GAT | AAA | CGC | GGT | AAA | CGT | AAA | AAT | CGA | CCA | GCC | CGC | AAG | GCG | AGC | TTG | 881 |
| Asp | Lys | Arg 250 | Gly | Lys | Arg | Lys | Asn 255 | Arg | Pro | Ala | Arg | Lys 260 | Ala | Ser | Leu | |
| AGC | CTG | CGC | AGT | GGG | CGC | ATC | ACG | CTA | AAA | CAG | GGG | AAT | ATC | ACG | CTC | 929 |
| Ser | Leu 265 | Arg | Ser | Gly | Arg | Ile 270 | Thr | Leu | Lys | Gin | Gly 275 | Asn | Ile | Thr | Leu |
GCG GTC AGG CTG TTA CAG CTC AGA GAA
Ala Val Arg Leu Leu Gin Leu Arg Glu Ser Phe Thr Pro Pro Gin Ala
360
365
370
375
CTC AGG GCG CAA GGG CTG CTA AAG GAA GCG GAA CAC GTA GAA AGC CAG Leu Arg Ala Gin Gly Leu Leu Lya Glu Ala Glu His Val Glu Ser Gin
1265
380
385
390
TCC GCA GAA ACG GTG CTG ACC CCG GAT GAA TGT CAG CTA CTG GGC TAT Ser Ala Glu Thr Val Leu Thr Pro Asp Glu Cys Gin Leu Leu Gly Tyr
CTG GAC AAG GGA AAA CGC AAG CGC AAA GAG AAA GCA GGT AGC TTG CAG Leu Asp Lys Gly Lys Arg Lys Arg Lys Glu Lys Ala Gly Ser Leu Gin
415
420
TGG GCT TAC ATG GCG ATA GCT AGA CTG GGC GGT TTT ATG GAC AGC AAG Trn Ala Tyr Met Ala Ile Ala Arg Leu Gly Gly Phe Met Asp Ser Lys H 435
425
430
CGA ACC GGA ATT GCC AGC TGG GGC GCC CTC TGG GAA GGT TGG GAA GCC Arg Thr Gly Ile Ala Ser Trp Gly Ala Leu Trp Glu Gly Trp Glu Ala
CTG CAA AGT AAA CTG GAT GGC TTT CTT GCC GCC AAG GAT CTG ATG GCG Leu Gin Ser Lys Leu Asp Gly Phe Leu Ala Ala Lys Asp Leu Met Ala
460 465 470
CAG GGG ATC AAG ATC TGA TCAAGAGACA G
Gin Gly Ile Lys Ile *
475
1457
450
445
440
1505
1534
PL 193 220 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFLKACYJNYM: 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 477 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄ STECZKI: biał ko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 2:
Met Ile Thr Ser Ala Leu His Arg Ala Ala Asp Trp Ala Lys Ser Val 15 10 15
Phe Ser Ser Ala Ala Leu Gly Asp Pro Arg Arg Thr Ala Arg Leu Val 20 25
Asn Val Ala Ala Gin Leu Ala Lys Tyr Ser Gly Lys Ser Ile Thr Ile 35 «O 45
| Ser Ser Glu Gly Ser Lys Ala Ala Gin Glu | Gly | Ala Tyr Arg Phe 60 | Ile | ||
| 50 | ss | ||||
| Arg 65 | Asn | Pro Asn Val Ser Ala Glu Ala Ile 70 | Arg 75 | Lys Ala Gly Ala | Met 80 |
| Gin | Thr | Val Lys Leu Ala Gin Glu Phe Pro 85 30 | Glu | Leu Leu Ala Ile 95 | Glu |
| Asp | Thr | Thr Ser Leu Ser Tyr Arg His Gin 100 ' 105 | Val | Ala Glu Glu Leu 110 | Gly |
| Lys | Leu | Gly Ser Ile Gin Asp Lys Ser Arg 115 120 | Gly | Trp Trp Val His 125 | Ser |
| Val | Leu 130 | Leu Leu Glu Ala Thr Thr Phe Arg 135 | Thr | Val Gly Leu Leu 140 | His |
| Gin 145 | Glu | Trp Trp Met Arg Pro Asp Asp Pro 150 | Ala 155 | Asp Ala Asp Glu | Lys 16 0 |
| Glu | Ser | Gly Lys Trp Leu Ala Ala Ala Ala 16S 170 | Thr. | Ser Arg Leu Arg 175 | Met |
| Gly | Ser | Met Met Ser Asn Val Ile Ala Val 180 185 | Cys | Asp Arg Glu Ala 190 | Asp |
| Ile | His | Ala Tyr Leu Gin Asp Arg Leu Ala 195 200 | His | Asn Glu Arg Phe 205 | Val |
| Val | Arg 210 | Ser Lys His Pro Arg. Lys Asp Val 21S | Glu | Ser Gly Leu Tyr 220 | Leu |
| Ile 225 | Asp | His Leu Lys Asn Gin Pro Glu Leu 230 | Gly 235 | Gly Tyr Gin Ile | Ser 240 |
| Ile | Pro | Gin Lys Gly Val Val Asp Lys Arg 245 250 | Gly | Lys Arg Lys Asn 255 | Arg |
| Pro | Ala | Arg Lys Ala Ser Leu Ser Leu Arg 260 26S | Ser | Gly Arg Ile Thr 270 | Leu |
| Lys | Gin | Gly Asn Ile Thr Leu Asn Ala Val 275 280 | Leu | Ala Glu Glu Ile 285 | Asn |
| Pro | Pro 290 | Lys Gly Glu Thr Pro Leu Lys Trp 295 | Leu | Leu Leu Thr Gly 300 | Glu |
| Pro 305 | Val | Glu Ser Leu Ala Gin Ala Leu Arg 310 | Val 315 | Ile Asp Ile Tyr | Thr 320 |
| His | Arg | Trp Arg Ile Glu Glu Phe His Lys 325 330 | Ala | Trp Lys Thr Gly 335 | Ala |
| Gly | Ala | Glu Arg Gin Arg Met Glu Glu Pro 340 . 345 | Asp | Asn Leu Glu Arg 350 | Met |
| Val | Ser | Ile Leu Ser Phe Val Ala Val Arg 355 360 | Leu | Leu Gin Leu Arg 365 | Glu |
| Ser Phe Thr Pro Pro Gin Ala Leu. Arg Ala Gin Gly Leu Leu Lys 370 375 380 | ! Glu | ||||
| Ala 385 | i Glu | 1 His Val Glu Ser Gin Ser Ala Glu Thr Val Leu Thr Pro 390 395 | Asp 400 |
| Glu | Cys | Gin | Leu | Leu 405 | Gly | Tyr | Leu | Asp | Lys 410 | Gly | Lys | Arg | Lys | Arg 415 | Lys |
| Glu | Lys | Ala | Gly 420 | Ser | Leu | Gin | Trp | Ala 425 | Tyr | Met | Ala | Ile | Ala 430 | Arg | Leu. |
| Gly | Gly | Phe 435 | Met | Asp | Ser | Lys | Arg 440 | Thr | Gly | Ile | Ala | Ser 445 | Trp | Gly | Ala |
| Leu | Trp 450 | Glu | Gly | Trp | Glu | Ala 455 | Leu | Gin | Ser | Lys | Leu 460 | Asp | Gly | Phe | Leu |
| Ala 465 | Ala | Lys | Asp | Leu | Met 470 | Ala | Gin | Gly | Ile | Lys 475 | Ile | * |
PL 193 220 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁ UGO ŚĆ: 5838 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: kolista (ii) RODZAJ CZĄ STECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS:/op = „DNA plazmidowy” (vii) Ź RÓD Ł O BEZPOŚ REDNIE:
(B) KLON: pRZTL1 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: wstawka_sekw (B) LOKALIZACJA: 1..19 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 77..1267 (C) INNE INFORMACJE:/funkcja = „oporność na tetracyklinę” (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: komplementarna (2301..2960) (C) INNE INFORMACJE:/funkcja = „oporność na chloramfenikol” (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: wstawka_sekw (B) LOKALIZACJA: 4564..4582 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 4715..5530 (C) INNE INFORMACJE:/funkcja = „oporność na kanamycynę” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 3:
CTGACTCTTA TACACAAGTA AGCTTTAATG CGGTAGTTTA TCACAGTTAA ATTGCTAACG 6 0
CAGTCAGGCA CCGTGT ATG AAA TCT AAC AAT GCG CTC ATC GTC ATC CTC 109
Met Lys Ser Asn Asn Ala Leu Ile Val Ile Leu
| GGC Gly | ACC GTC | ACC CTG | 480 GAT GCT GTA | 485 | 157 | |||||||||||
| GGC Gly | ATA GGC He Gly | TTG Leu SOO | GTT ATG CCG GTA | |||||||||||||
| Thr 490 | Val | Thr | Leu | Asp | Ala 495 | Val | Val | Met | Pro | Val | ||||||
| CTG | CCG | GGC | CTC | TTG | CGG | GAT | ATC | GTC | CAT | TCC | GAC | AGC | ATC | GCC | AGT | 205 |
| Leu | Pro | Gly | Leu | Leu | Arg | Asp | Ile | Val | His | Ser | Asp | Ser | Ile | Ala | Ser | |
| 505 | 510 | 515 | 520 | |||||||||||||
| CAC | TAT | GGC | GTG | CTG | CTA | GCG | CTA | TAT | GCG | TTG | ATG | CAA | TTT | CTA | TGC | 253 |
| His | Tyr | Gly | Val | Leu | Leu | Ala | Leu | Tyr | Ala | Leu | Met | Gin | Phe | Leu | Cys | |
| 525 | 530 | 535 | ||||||||||||||
| GCA | CCC | GTT | CTC | GGA | GCA | CTG | TCC | GAC | CGC | TTT | GGC | CGC | CGC | CCA | GTC | 301 |
| Ala | Pro | Val | Leu | Gly | Ala | Leu | Ser | Asp | Arg | Phe | Gly | Arg | Arg | Pro | Val | |
| 540 | 545 | 550 | ||||||||||||||
| CTG | CTC | GCT | TCG | CTA | CTT | GGA | GCC | ACT | ATC | GAC | TAC | GCG | ATC | ATG | GCG | 349 |
| Leu | Leu | Ala | Ser | Leu | Leu | Gly | Ala | Thr | Ile | Asp | Tyr | Ala | Ile | Met | Ala | |
| 555 | 560 | 565 | ||||||||||||||
| ACC | ACA | CCC | GTC | CTG | TGG | ATC | CTC | TAC | GCC | GGA | CGC | ATC | GTG | GCC | GGC | 397 |
| Thr | Thr | Pro | Val | Leu | Trp | Ile | Leu | Tyr | Ala | Gly Arg | Ile | Val | Ala | Gly | ||
| 570 | 575 | 580 | ||||||||||||||
| ATC | ACC | GGC | GCC | ACA | GGT | GCG | GTT | GCT | GGC | GCC | TAT | ATC | GCC | GAC | ATC | 445 |
| Ile | Thr | Gly | Ala | Thr | Gly | Ala | Val | Ala | Gly | Ala | Tyr | Ile | Ala | Asp | Ile | |
| 585 | 590 | 595 | 600 | |||||||||||||
| ACC | GAT | GGG | GAA | GAT | CGG | GCT | CGC | CAC | TTC | GGG | CTC | ATG | AGC | GCT | TGT | 493 |
| Thr | Asp | Gly | Glu | Asp | Arg | Ala | Arg | His | Phe | Gly | Leu | Met | Ser | Ala | Cys | |
| 605 | 610 | 615 | ||||||||||||||
| TTC | GGC | GTG | GGT | ATG | GTG | GCA | GGC | CCC | GTG | GCC | GGG | GGA | CTG | TTG | GGC | . 541 |
| Phe | Gly | Val | Gly | Met | Val | Ala | Gly | Pro | Val | Ala | Gly | Gly | Leu | Leu | Gly | |
| 620 | 625 | 630 | ||||||||||||||
| GCC | ATC | TCC | TTG | CAT | GCA | CCA | TTC | CTT | GCG | GCG | GCG | GTG | CTC | AAC | GGC | 589 |
| Ala | Ile | Ser | Leu | His | Ala | Pro | Phe | Leu | Ala | Ala | Ala | Val | Leu | Asn | Gly |
635 640 645
PL 193 220 B1
| CTC AAC CTA CTA | CTG GGC TGC TTC CTA ATG CAG GAG TCG | CAT AAG GGA | 637 | |||||||||||||
| Leu Asn | Leu | Leu | Leu Gly | Cys 655 | Phe | Leu Met | Gin | Glu 660 | Ser | His | Lys | Gly | ||||
| 650 | ||||||||||||||||
| GAG | CGT | CGA | CCG | ATG | CCC | TTG | AGA | GCC | TTC | AAC | CCA | GTC | AGC | TCC | TTC | 685 |
| Glu | Arg | Arg | Pro | Met | Pro | Leu | Arg | Ala | Phe | Asn | Pro | Val | Ser | Ser | Phe | |
| 665 | 670 | 675 | 680 | |||||||||||||
| CGG | TGG | GCG | CGG | GGC | ATG | ACT | ATC | GTC | GCC | GCA | CTT | ATG | ACT | GTC | TTC | 733 |
| Arg | Trp | Ala | Arg | Gly | Met | Thr | Ile | Val | Ala | Alą | Leu | Met | Thr | val | Phe | |
| 685 | 650 | 695 | ||||||||||||||
| TTT | ATC | ATG | CAA | CTC | GTA | GGA | CAG | GTG | CCG | GCA | GCG | CTC | TGG | GTC | ATT | 781 |
| Phe | Ile | Met | Gin | Leu | Val | Gly | Gin | val | Pro | Ala | Ala | Leu | Trp | Val | Ile | |
| 700 | 705 | 710 | ||||||||||||||
| TTC | GGC | GAG | GAC | CGC | TTT | CGC | TGG | AGC | GCG | ACG | ATG | ATC | GGC | CTG | TCG | 829 |
| Phe | Gly | Glu | Asp | Arg | Phe | Arg | Trp | Ser | Ala | Thr | Met | Ile | Gly | Leu | Ser | |
| 715 | 720 | 725 | ||||||||||||||
| CTT | GCG | GTA | TTC | GGA | ATC | TTG | CAC | GCC | CTC | GCT | CAA | GCC | TTC | GTC | ACT | 877 |
| Leu | Ala | Val | Phe | Gly | Ile | Leu | Kie | Ala | Leu | Ala | Gin | Ala | Phe | Val | Thr | |
| 730 | 735 | 740 | ||||||||||||||
| GGT | CCC | GCC | ACC | AAA | CGT | TTC | GGC | GAG | AAG | CAG | GCC | ATT | ATC | GCC | GGC | 925 |
| Gly | Pro | Ala | Thr | Lys | Arg | Phe | Gly | Glu | Lys | Gin | Ala | ile | Ile | Ala | Gly | |
| 745 | 750 | 755 | 760 | |||||||||||||
| ATG | GCG | GCC | GAC | GCG | CTG | GGC | TAC | GTC | TTG | CTG | GCG | TTC | GCG | ACG | CGA | 973 |
| Met | Ala | Ala | Asp | Ala | Leu | Gly | Tyr | Val | Leu | Leu | Ala | Phe | Ala | Thr | Arg | |
| 765 | 770 | 775 | ||||||||||||||
| GGC | TGG | ATG | GCC | TTC | CCC | ATT | ATG | ATT | CTT | CTC | GCT | TCC | GGC | GGC | ATC | 1021 |
| Gly | Trp | Met | Ala | Phe | Pro | Ile | Met | Ile | Leu | Leu | Ala | Ser | Gly | Gly | Ile | |
| 780 | 785 | 790 | ||||||||||||||
| GGG | ATG | CCC | GCG | TTG | CAG | GCC | ATG | CTG | TCC | AGG | CAG | GTA | GAT | GAC | GAC | 1069 |
| Gly | Met | Pro | Ala | Leu | Gin | Ala | Met | Leu | Ser | Arg | Gin | Val | Asp | Asp | Asp | |
| 795 | 800 | 805 | ||||||||||||||
| CAT | CAG | GGA | CAG | CTT | CAA | GGA | TCG | CTC | GCG | GCT | CTT | ACC | AGC | CTA | ACT | 1117 |
| His | Gin | Gly | Gin | Leu | Gin | Gly | Ser | Leu | ’Ala | Ala | Leu | Thr | Ser | Leu | Thr | |
| 810 | 815 | 820 | ||||||||||||||
| TCG | ATC | ACT | GGA | CCG | CTG | ATC | GTC | ACG | GCG | ATT | TAT | GCC | GCC | TCG | GCG | 1165 |
| Ser | Ile | Thr | Gly | Pro | Leu | Ile | Val | Thr | Ala | Ile | Tyr | Ala | Ala | Ser | Ala | |
| 825 | 830 | 835 | 840 | |||||||||||||
| AGC | AGA | TGG | AAC | GGG | TTG | GCA | TGG | ATT | GTA | GGC | GCC | GCC | CTA | TAC | CTT | 1213 |
| Ser | Thr | Trp | Asn | Gly | Leu | Ala | Trp | Ile | Val | Gly | Ala | Ala | Leu | Tyr | Leu | |
| 845 | 850 | 855 | ||||||||||||||
| GTC | TGC | CTC | CCC | GCG | TTG | CGT | CGC | GGT | GCA | TGG | AGC | CGG | GCC | ACC | TCG | 1261 |
| Val | Cys | Leu | Pro | Ala | Leu | Arg | Arg | Gly | Ala | Trp | Ser | Arg | Ala | Thr | Ser |
860 865 870
ACC TGA ATGGAAGCCG GCGGCACCTC GCTAACGGAT TCACCACTCC AAGAATTGGA 1317
Thr *
| GCCAATCAAT | TCTTGCGGAG | AACTGTGAAT | GCGCAAACCA | ACCCTTGGCA | GAACATATCC | 1377 |
| ATCGCGTCCG | CCATCTCCAG | CAGCCGCACG | CGGCGCATCT | CGGGCAGCGT | TGGGTCCTGG | 1437 |
| CCACGGGTGC | GCATGATCGT | GCTCCTGTCG | TTGAGGACCC | GGCTAGGCTG | GCGGGGTTGC | 1497 |
| CTTACTGGTT | AGCAGAATGA | ATCACCGATA | CGCGAGCGAA | CGTGAAGCGA | CTGCTGCTGC | 1557 |
| AAAACGTCTG | CGACCTGAGC | AACAACATGA | ATGGTCTTCG | GTTTCCGTGT | TTCGTAAAGT | 1617 |
PL 193 220 B1
| CTGGAAACGC | GGAAGTCCCC | TACGTGCTGC | TGAAGTTGCC | CGCAACAGAG | AGTGGAACCA | 1577 |
| ACCGGTGATA | CCACGATACT | ATGACTGAGA | GTCAAOGCCA | TGAGCGGCCT | CATTTCTTAT | 1737 |
| TCTGAGTTAC | AACAGTCCGC | ACCGCTGTCC | GGTAGCTCCT | TCCGGTGGGC | GCGGGGCATG | 1797 |
| ACTATCGTCG | CCGCACTTAT | GACTGTCTTC | TTTATCATGC | AACTCGTAGG | ACAGGTGCCG | 1857 |
| GCAGCGCCCA | ACAGTCCCCC | GGCCACGGGG | CCTGCCACCA | TACCCACGCC | GAAACAAGCG | 1917 |
| CCCTGCACCA | TTATGTTCCG | GATCTGCATC | GCAGGATGCT | GCTGGCTACC | CTGTGGAACA | 1977 |
| CCTACATCTG | TATTAACGAA | GCGCTAACCG | TTTTTATCAG | GCTCTGGGAG | GCAGAATAAA | 2037 |
| TGATCATATC | GTCAATTATT | ACCTCCACGG | GGAGAGCCTG | AGCAAACTGG | CCTCAGGCAT | 2097 |
| TTGAGAAGCA | CACGGTCACA | CTGCTTCCGG | TAGTCAATAA | ACCGGTAAAC | CAGCAATAGA | 2157 |
| CATAAGCGGC | TATTTAACGA | CCCTGCCCTG | AACCGACGAC | CGGGTCGAAT | TTGCTTTCGA | 2217 |
| ATTTCTGCCA | TTCATCCGCT | TATTATCAAT | TATTCAGGCG | TAGCACCAGG | CGTTTAAGGG | 2277 |
| CACCAATAAC | TGCCTTAAAA | AAATTACGCC | CCGCCCTGCC | ACTCATCGCA | GTACTGTTGT | 2337 |
| AATTCATTAA | GCATTCTGCC | GACATGGAAG | CCATCACAGA | CGGCATGATG | AACCTGAATC | 2397 |
| GCCAGCGGCA | TCAGCACCTT | GTCGCCTTGC | GTATAATATT | TGCCCATGGT | GAAAACGGGG | 2457 |
| GCGAAGAAGT | TGTCCATATT | GGCCACGTTT | AAATCAAAAC | TGGTGAAACT | CACCCAGGGA | 2S17 |
| TTGGCTGAGA | CGAAAAACAT | ATTCTCAATA | AACCCTTTAG | GGAAATAGGC | CAGGTTTTCA | 2577 |
| CCGTAACACG | CCACATCTTG | CGAATATATG | TGTAGAAACT | GCCGGAAATC | GTCGTGGTAT | 2637 |
| TCACTCCAGA | GCGATGAAAA | CGTTTCAGTT | TGCTCATGGA | AAACGGTGTA | ACAAGGGTGA | 2697 |
| ACACTATCCC | ATATCACCAG | CTCACCGTCT | TTGATTGCCA | TACGGAATTC | CGGATGAGCA | 2757 |
| TTCATCAGGC | GGGCAAGAAT | GTGAATAAAG | GCCGGATAAA | ACTTGTGCTT | ATTTTTCTTT | 2817 |
| ACGGTCTTTA | AAAAGGCCGT | AATATCCAGC | TGAACGGTCT | GGTTATAGGT | ACATTGAGCA | 2877 |
| ACTGACTGAA | ATGCCTCAAA | ATGTTCTTTA | CGATGCCATT | GGGATATATC | AACGGTGGTA | 2937 |
| TATCCAGTGA | TTTTTTTCTC | cattttagct | TCCTTAGCTC | CTGAAAATCT | CGATAACTCA | 2997 |
| AAAAATACGC | CCGGTAGTGA | TCTTATTTCA | TTATGGTGAA | AGTTGGAACC | TCTTACGTGC | 3057 |
| CGATCAACGT | CTCATTTTCG | CCAAAAGTTG | GCCCAGGGCT | TCCCGGTATC | AACAGGGACA | 3117 |
| CCAGGATTTA | TTTATTCTGC | GAAGTGATCT | TCCGTCACAG | GTATTTATTC | GGCGCAAAGT | 3177 |
| GCGTCGGGTG | ATGCTGCCAA | CTTACTGATT | TAGTGTATGA | TGGTGTTTTT | GAGGTGCTCC | 3237 |
| AGTGGCTTCT | GTTTCTATCA | GCTGTCCCTC | CTGTTCAGCT | ACTGACGGGG | TGGTGCGTAA | 3297 |
| CGGCAAAAGC | ACCGCCGGAC | ATCAGCGCTA | GCGGAGTGTA | TACTGGCTTA | CTATGTTGGC | 3357 |
| ACTGATGAGG | GTGTCAGTGA | agtgcttcat | GTGGCAGGAG | AAAAAAGGCT | GCACCGGTGC | . 3417 |
| GTCAGCAGAA | TATGTGATAC | AGGATATATT | CCGCTTCCTC | GCTCACTGAC | TCGCTACGCT | 3477 |
| CGGTCGTTCG | ACTGCGGCGA | GCGGAAATGG | CTTACGAACG | GGGCGGAGAT | TTCCTGGAAG | 3537 |
| ATGCCAGGAA | GATACTTAAC | AGGGAAGTGA | GAGGGCCGCG | GCAAAGCCGT | TTTTCCATAG | 3597 |
| GCTCCGCCCC | CCTGACAAGC | ATCACGAAAT | CTGACGCTCA | AATCAGTGGT | GGCGAAACCC | 3657 |
PL 193 220 B1
| GACAGGACTA TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCTGGCGGCT CCCTCGTGCG CTCTCCTGTT | 3717 |
| CCTGCCTTTC GGTTTACCGG TGTCATTCCG CTGTTATGGC CGCGTTTGTC TCATTCCACG | 3777 |
| CCTGACACTC AGTTCCGGGT AGGCAGTTCG CTCCAAGCTG GACTGTATGC ACGAACCCCC | 3837 |
| CGTTCAGTCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGAAAG | 3897 |
| ACATGCAAAA GCACCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAATTGA TTTAGAGGAG TTAGTCTTGA | 3957 |
| AGTCATGCGC CGGTTAAGGC TAAACTGAAA GGACAAGTTT TGGTGACTGC GCTCCTCCAA | 4017 |
| GCCAGTTACC TCGGTTCAAA GAGTTGGTAG CTCAGAGAAC CTTCGAAAAA CCGCCCTGCA | 4077 |
| AGGCGGTTTT TTCGTTTTCA GAGCAAGAGA TTACGCGCAG ACCAAAACGA TCTCAAGAAG | 4137 |
| ATCATCTTAT TAATCAGATA AAATATTTCT AGAGGTGAAC CATCACCCTA ATCAAGTTTT | 4197 |
| TTGGGGTCGA GGTGCCGTAA AGCACTAAAT CGGAACCCTA AAGGGATGCC CCGATTTAGA | 4257 |
| GCTTGACGGG GAAAGCCGGC GAACGTGGCG AGAAAGGAAG GGAAGAAAGC GAAAGGAGCG | 4317 |
| GGCGCTAGGG CGCTGGCAAG TGTAGCGGTC ĄCGCTGCGCG TAACCACCAC ACCCGCCGCG | 4377 |
| CTTAATGCGC CGCTACAGCG CCATTCGCCA TTCAGGCTGC GCAACTGTTG GGAAGGGCGA | 4437 |
| TCGGTGCGGG CCTCTTCGCT ATTACGCCAG (CTGGCGAAAG GGGGATGTGC TGCAAGGCGA | 4497 |
| TTAAGTTGGG TAACGCCAGG GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTAAAACGAC GGCCAGTGCC | 4557 |
| AAGCTTACTT GTGTATAAGA GTCAGTCGAC CTGCAGGGGG GGGGGGGAAA GCCACGTTGT | 4617 |
| GTCTCAAAAT CTCTGATGTT ACATTGCACA AGATAAAAAT ATATCATCAT GAACAATAAA | 4677 |
| ACTGTCTGCT TACATAAACA GTAATACAAG GGGTGTT ATG AGC CAT ATT CAA CGG | 4732 |
Met Ser His Ile Gin Arg
| GAA Glu | ACG TCT | TGC Cys 10 | TCG AGG | CCG CGA | 1 TTA AAT TCC AAC ATG GAT Leu Asn Ser Asn Met Asp | 5 GCT GAT | 4780 | |||||||||
| Thr | Ser | Ser | Arg | Pro | Arg | Ala | Asp | |||||||||
| 15 | 20 | |||||||||||||||
| TTA | TAT | GGG | TAT | AAA | TGG | GCT | CGC | GAT | AAT | GTC | GGG | CAA | TCA | GGT | GCG | 4828 |
| Leu | Tyr | Gly | Tyr | Lys | Trp | Ala | Arg | Asp | Asn | Val | Gly | Gin | Ser | Gly | Ala | |
| 25 | 30 | 35 | ||||||||||||||
| ACA | ATC | TAT | CGA | TTG | TAT | GGG | AAG | CCC | GAT | GCG | CCA | GAG | TTG | TTT | CTG | 4876 |
| Thr | Ile | Tyr | Arg | Leu | Tyr | Gly | Lys | Pro | Asp | Ala | Pro | Glu | Leu | Phe | Leu | |
| 40 | 45 | 50 | ||||||||||||||
| AAA | CAT | GGC | AAA | GGT | AGC | GTT | GCC | AAT | GAT | GTT | ACA | GAT | GAG | ATG | GTC | 4924 |
| Lys | His | Gly | Lys | Gly | Ser | Val | Ala | Asn | Asp | Val | Thr | Asp | GlU | Met | Val | |
| 55 | 60 | 65 | 70 | |||||||||||||
| AGA | CTA | AAC | TGG | CTG | ACG | GAA | TTT | ATG | CCT | CTT | CCG | ACC | ATC | AAG | CAT | 4972 |
| Arg | Leu | Asn | Trp | Leu | Thr | Glu | Phe | Met | Pro | Leu | Pro | Thr | Ile | Lys | His | |
| 75 | 80 | 85 | ||||||||||||||
| TTT | ATC | CGT | ACT | CCT | GAT | GAT | GCA | TGG | TTA | CTC | ACC | ACT | GCG | ATC | CCC | 5020 |
| Phe | Ile | Arg | Thr | Pro | Asp | Asp | Ala | Trp | Leu | Leu | Thr | Thr | Ala | Ile | Pro | |
| 90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
| GGG | AAA | ACA | GCA | TTC | CAG | GTA | TTA | GAA | GAA. | TAT | CCT | GAT | TCA | GGT | GAA | 5068 |
| Gly | Lys | Thr | Ala | Phe | Gin | Val | Leu | Glu | Glu | Tyr | Pro | Asp | Ser | Gly | Glu | |
| 105 | 110 | 115 | ||||||||||||||
| AAT | ATT | GTT | GAT | GCG | CTG | GCA | GTG | TTC | CTG | CGC | CGG | TTG | CAT | TCG | ATT | 5116 |
| Asn | Ile | Val | Asp | Ala | Leu | Ala | Val | Phe | Leu | Arg | Arg | Leu | His | Ser | Ile |
120 125 130
PL 193 220 B1
| CCT | GTT | TGT | AAT | TGT | CCT | TTT | AAC | AGC | GAT | CGC | GTA | TTT | CGT | CTC | GCT |
| Pro 135 | Val | Cys | Asn | Cys | Pro 140 | Phe | Asn | Ser Asp | Arg 145 | Val | Phe | Arg | Leu | Ala 150 | |
| CAG | GCG | CAA | TCA | CGA | ATG | AAT | AAC | GGT' | TTG | GTT | GAT | GCG | AGT | GAT | TTT |
| Gin | Ala | Gin | Ser | Arg 155 | Met | Asn | Asn | Gly | Leu 160 | Val | Asp | Ala | Ser | Asp 165 | Phe |
| GAT | GAC | GAG | CGT | AAT | GGC | TGG | CCT | GTT | GAA | CAA | GTC | TGG | AAA | GAA | ATG |
| Asp | Asp | Glu | Arg 170 | Asn | Gly | Trp | Pro | Val 175 | Glu | Gin | Val | Trp | Lys ISO | Glu | Met |
| CAT | AAG | CTT | TTG | CCA | TTC | TCA | CCG | GAT | TCA | GTC | GTC | ACT | CAT | GGT | GAT |
| His | Lys | Leu 185 | Leu | Pro | Phe | Ser | Pro 190 | Asp | Ser | Val | Val | Thr 195 | His | Gly | Asp |
| TTC | TCA | CTT | GAT | AAC | CTT | ATT | TTT | GAC | GAG | GGG | AAA | TTA | ATA | GGT | TGT |
| Phe | Ser | Leu | Asp | Asn | Leu | Ile | Phe | Asp | Glu | Gly | Lys | Leu | Ile | Gly | Cys |
200 205 210
ATT GAT GTT GGA CGA GTC GGA ATC GCA GAC CGA TAC CAG GAT CTT GCC Ile Asp Val Gly Arg Val Gly Ile Ala Asp Arg Tyr Gin Asp Leu Ala 215 220 . 225 230
ATC CTA TGG AAC TGC CTC GGT GAG TTT TCT CCT TCA TTA CAG AAA CGG
Ile Leu Trp Asn Cys Leu Gly Glu Phe Ser Pro Ser Leu Gin Lys Arg
235 240 245
CTT TTT CAA AAA TAT GGT ATT GAT AAT CCT GAT ATG AAT AAA TTG CAG
Leu Phe Gin Lys Tyr Gly Ile Asp Asn Pro Asp Met Asn Lys Leu Gin
2S0 255 260
TTT CAT TTG ATG CTC GAT GAG TTT TTC TAA TCAGAATTGG TTAATTGGTT Phe His Leu Met Leu Asp Glu Phe Phe *
265 . 270
GTAACACTGG CAGAGCATTA CGCTGACTTG ACGGGACGGC GGCTTTGTTG AATAAATCGA ACTTTTGCTG AGTTGAAGGA TCAGATCACG CATCTTCCCG ACAACGCAGA CCGTTCCGTG GCAAAGCAAA AGTTCAAAAT CACCAACTGG TCCACCTACA ACAAAGCTCT CATCAACCGT GGCTCCCTCA CTTTCTGGCT GGATGA1GGG GCGATTCAGG CCTGGTATGA GTCAGCAACA CCTTCTTCAC GAGGCAGACC TCAGCGCCCC CCCCCCCCTG CAGGTCGA
5164
5212
5260 '
5308
5356
5404
5452
5500
5550
5610
5670
5730
5790
5838 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFLKACYJNYM: 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 397 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄ STECZKI: biał ko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 4:
PL 193 220 B1
| Met 1 | Lys | Ser | Asn | Asn 5 | Ala | Leu | Ile | Val | Ile 10 | Leu | Gly | Thr | Val | Thr 15 | Leu |
| Asp | Ala | Val | Gly 20 | Ile | Gly | Leu | Val | Met 25 | Pro | Val | Leu | Pro | Gly 30 | Leu | Leu |
| Arg | Asp | Ile 35 | val | His | Ser | Asp | Ser 40 | Ile | Ala | Ser | His | Tyr 45 | Gly | Val | Leu |
| Leu | Ala 50 | Leu | Tyr | Ala | Leu | Met 55 | Gin | Phe | Leu | Cys | Ala 60 | Pro | Val | Leu | Gly |
| Ala 65 | Leu | Ser | Asp | Arg | Phe 70 | Gly Arg | Arg | Pro | Val 75 | Leu | Leu | Ala | Ser | Leu 80 | |
| Leu | Gly | Ala | Thr | Ile 85 | Asp | Tyr | Ala | Ile | Met 90 | Ala | Thr | Thr | Pro | Val 95 | Leu |
| Trp | Ile | Leu | Tyr 100 | Ala | Gly | Arg | Ile | Val 105 | Ala | Gly | Ile | Thr | Gly 110 | Ala | Thr |
| Gly | Ala | Val 115 | Ala | Gly | Ala | Tyr | Ile 120 | Ala | Asp | Ile | Thr | Asp 125 | Gly | Glu | Asp |
| Arg | Ala 130 | Arg | His | Phe | Gly | Leu 135 | Met | Ser | Ala | Cys | Phe 140 | Gly | Val | Gly | Met |
| Val 145 | Ala | Gly | Pro | Val | Ala 150 | Gly | Gly | Leu | Leu | Gly 1SS | Ala | Ile | Ser | Leu | His 160 |
| Ala | Pro | Phe | Leu | Ala 165 | Ala | Ala | Val | Leu | Asn 170 | Gly | Leu | Asn | Leu | Leu 175 | Leu |
| Gly | Cys | Phe | Leu 180 | Met | Gin | Glu | Ser | His 185 | Lys | Gly | Glu | Arg | Arg 190 | Pro | Met |
| Pro | Leu | Arg 195 | Ala | Phe | Asn | Pro | Val 200 | Ser | Ser | Phe | Arg | Trp 205 | Ala | Arg | Gly |
| Met | Thr 210 | Ile | Val | Ala | Ala | Leu 215 | Met | Thr | Val | Phe | Phe 220 | Ile | Met | Gin | Leu |
| Val 225 | Gly | Gin | Val | Pro | Ala 230 | Ala | Leu | Trp | Val | Ile 235 | Phe | Gly | Glu | Asp | Arg 240 |
| Phe | Arg | Trp | Ser | Ala 245 | Thr | Met | Ile | Gly | Leu 250 | Ser | Leu | Ala | Val | Phe 255 | Gly |
| Ile | Leu | His | Ala 260 | Leu | Ala | Gin | Ala | Phe 265 | Val | Thr | Gly | Pro | Ala 270 | Thr | Lys |
| Arg | Phe | Gly 275 | Glu | Lys | Gin | Ala | Ile 280 | Ile | Ala | Gly | Met | Ala 285 | Ala | Asp | Ala |
| Leu | Gly 290 | Tyr | Val | Leu | Leu | Ala 295 | Phe | Ala | Thr | Arg | Gly 300 | Trp | Met | Ala | Phe |
| Pro 305 | Ile | Met | Ile | Leu | Leu 310 | Ala | Ser | Gly Gly | Ile 315 | Gly | Met | Pro | Ala | Leu 320 | |
| Gin | Ala | Met | Leu | Ser 325 | Arg | Gin | Val | Asp | Asp 330 | Asp | His | Gin | Gly | Gin 335 | Leu |
| Gin | Gly | Ser | Leu 340 | Ala | Ala | Leu | Thr | Ser 345 | Leu | Thr | Ser | Ile | Thr 350 | Gly | Pro |
| Leu | Ile | Val | Thr | Ala | Ile | Tyr | Ala | Ala | Ser | Ala | Ser | Thr | Trp | Asn | Gly |
355 360 365 Trp Ile Val G1y 1x5x1 Tyr Leu Val Cys Leu Pro Ala 370 375 380
Leu Arg Arg Gly Ala Trp Ser Arg Ala Thr Ser Thr *
385 39<J 39s
PL 193 220 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFLKACYJNYM: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 220 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄ STECZKI: biał ko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 5:
| Mec 1 | Glu | Lys | Lys | Ile S | Thr | Gly | Tyr | Thr | Thr· 10 | Val | Asp | Ile | Ser | Gin 1S | Trp |
| His | Arg | Lys | Glu 20 | His | Phe | Glu | Ala | Phe 25 | Gin | Ser | Val | Ala | Gin 30 | Cys | Thr |
| Tyr | Asn | Gin 35 | Thr | Val | Gin | Leu | ASP 40 | Ile | Thr | Ala | Phe | Leu 45 | Lys | Thr | Val |
| Lys | Lys 50 | Asn | Lys | His | Lys | Phe 55 | Tyr | Pro | Ala | Phe | Ile 60 | His | Ile | Leu | Ala |
| Arg €5 | Leu | Met | Asn | Ala | His 70 | Pro | Glu | Phe | Arg | Met 75 | Ala | Met | Lys | Asp | Gly 80 |
| Glu | Leu | val | Ile | Trp 85 | Asp | Ser | Val | His | Pro 90 | Cys | Tyr | Thr | Val | Phe 95 | His |
| Glu | Gin | Thr | Glu 100 | Thr | Phe | Ser | Ser | Leu 105 | Trp | Ser | Glu | Tyr | His 110 | Asp | Asp |
| Phe | Arg | Gin 115 | Phe | Leu | His | Ile | Tyr 120 | Ser | Gin | ASp | Val | Ala 125 | Cys | Tyr | Gly |
| Glu | Asn | Leu | Ala | Tyr | Phe | Pro | Lys | Gly | Phe | Ile | Glu | Asn | Met | Phe | Phe |
130 135 140
| Val 145 | Ser | Ala | Asn | Pro | Trp 150 | Val | Ser | Phe | Thr | Ser 155 | Phe | Asp | Leu | Asn | Val 160 |
| Ala | Asn | Met | Asp | Asn ies | Phe | Phe | Ala | Pro | Val 170 | Phe | Thr | Met | Gly | Lys 175 | Tyr |
| Tyr | Thr | Gin | Gly 180 | Asp | Lys | Val | Leu | Met 185 | Pro | Leu | Ala | Ile | Gin 190 | Val | His |
| His | Ala | Val 195 | Cys | Asp | Gly | Phe | His 200 | Val | Gly Arg | Met | Leu 205 | Asn | Glu | Leu | |
| Gin | Gin 210 | Tyr | Cys | Asp | Glu | Trp 215 | Gin | Gly Gly Ala | * 220 |
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFLKACYJNYM: 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 272 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄ STECZKI: biał ko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 6:
PL 193 220 B1
| Ket 1 | Ser | His | Ile | Gin 5 | Arg | Glu | Thr | Ser Cys 10 | Ser | Arg | Pro | Arg | Leu 15 | Asn | |
| Ser | Asn | Met | ASp 20 | Ala | Asp | Leu | Tyr | Gly Tyr 25 | Lys | Trp Ala | Arg 30 | Asp | Asn | ||
| Val | Gly | Gin 35 | Ser | Gly | Ala | Thr | Ile 40 | Tyr Arg | Leu | Tyr Gly 45 | Lys | Pro | Asp | ||
| Ala | Pro SO | Glu | Leu | Phe | Leu | Lys 55 | His | Gly Lys | Gly | Ser 60 | Val | Ala | Asn | Asp | |
| Val 65 | Thr | Asp | Glu | Met | Val 70 | Arg | Leu | Asn | Trp | Leu 75 | Thr | Glu | Phe | Met | Pro 80 |
| Leu | Pro | Thr | Ile | Lys 85 | His | Phe | Ile | Arg | Thr 90 | Pro | Asp | Asp | Ala | Trp 95 | Leu |
| Leu | Thr | Thr | Ala 100 | Ile | Pro | Gly | Lys | Thr 105 | Ala | Phe | Gin | Val | Leu 110 | Glu | Glu |
| Tyr | Pro | Asp 115 | Ser | Gly | Glu | Asn | Ile 120 | Val | Asp | Ala | Leu | Ala 125 | val | Phe | Leu |
| Arg | Arg 130 | Leu | His | Ser | Ile | Pró 135 | Val | Cys | Asn | Cys | Pro 140 | Phe | Asn | Ser | Asp |
| Arg 145 | Val | Phe | Arg | Leu | Ala 150 | Gin | Ala | Gin | Ser | Arg 155 | Met | Asn | Asn | Gly | Leu 160 |
| Val | Asp | Ala | Ser | Asp 165 | Phe | Asp | Asp | Glu | Arg 170 | Asn | Gly | Trp | Pro | Val 175 | Glu |
| Gin | Val | Trp | Lys 180 | Glu | Met | His | Lys | Leu 185 | Leu | Pro | Phe | Ser | Pro 190 | Asp | Ser |
| Val | Val | Thr 195 | His | Gly | Asp | Phe | Ser 200 | Leu | Asp | Asn | Leu | Ile 205 | Phe | Asp | Glu |
| Gly | Lys 210 | Leu | Ile | Gly | Cys | Ile 215 | Asp | Val | Gly Arg | Val 220 | Gly | Ile | Ala | Asp | |
| Arg 225 | Tyr | Gin | Asp | Leu | Ala 230 | Ile | Leu | Trp | Asn | cys 235 | Leu | Gly | Glu | Phe | Ser 240 |
| Pro | Ser | Leu | Gin | Lys 245 | Arg | Leu | Phe | Gin | Lys 250 | Tyr | Gly | ile | Asp | Asn 255 | Pro |
| Asp | Met | Asn | Lys 260 | Leu | Gin | Phe | His | Leu 265 | Met | Leu | Asp | Glu | Phe 270 | Phe | * |
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁ UGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS:/op = „koniec zewnę trzny TN5 typu dzikiego”
PL 193 220 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 7:
CTGACTCTTA TACACAAGT 19 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁ UGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS:/op = „koniec zewnę trzny TN5 typu dzikiego” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 8:
CTGTCTCTTA TACATATCT 19 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁ UGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS:/op = „koniec zewnę trzny TN5 typu dzikiego” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 9:
CTGTCTCTTA TACAGATCT 19 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁ UGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS:/op = „koniec zewnę trzny TN5 typu dzikiego” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 10:
CTGTCTCTTG ATCAGATCT 19 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19182 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: kolista (ii) RODZAJ CZĄ STECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS:/op = „Plazmid pRZ4196” (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: jednostka_powtarzalna (B) LOKALIZACJA: 94..112 (C) INNE INFORMACJE:/uwaga = „sekwencja OE typu dzikiego” (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: jednostka_powtarzalna (B) LOKALIZACJA: 12184..12225 (C) INNE INFORMACJE:/uwaga = „kasetka IE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 11:
PL 193 220 B1
| TTCCTGTAAC | AATAGCAATA | CCCCAAATAC | CTAATGTAGT | TCCAGCAAGC | AAGCTAAAAA | 60 |
| GTAAAGCAAC | AACATAACTC | ACCCCTGCAT | CTGCTGACTC | TTATACACAA | GTAGCGTCCC | 120 |
| GGGATCGGGA | TCCCGTCGTT | TTACAACGTC | GTGACTGGGA | AAACCCTGGC | GTTACCCAAC | ieo |
| TTAATCGCCT | TGCAGCACAT | CCCCCTTTCG | CCAGCTGGCG | TAATAGCGAA | GAGGCCCGCA | 240 |
| CCGATCGCCC | TTCCCAACAiS | TTGCGCAGCC | TGAATGGĆGA | ATGGCGCTTT | GCCTGGTTTC | 300 |
| CGGCACCAGA | AGCGGTGCCG | GAAAGCTGGC | TGGAGTGCGA | TCTTCCTGAG | GCCGATACTG | 360 |
| TCGTCGTCCC | CTCAAACTGG | CAGATGCACG | GTTACGATGC | GCCCATCTAC | ACCAACGTAA | 420 |
| CCTATCCCAT | TACGGTCAAT | CCGCCGTTTG | TTCCęACGGA | GAATCCGACG | GGTTGTTACT | 480 |
| CGCTCACATT | TAATOTTGAT | GAAAGCTGGC | TACAGGAAGG | CCAGACGCGA | ATTATTTTTG | 540 |
| ATGGCGTTAA | CTCGGCGTTT | CATCTGTGGT | GCAACGGGCG | CTGGGTCGGT | TACGGCCAGG | 600 |
| ACAGTCGTTT | GCCGTCTGAA | TTTGACCTGA | GCGCATTTTT | ACGCGCCGGA | GAAAACCGCC | 660 |
| TCGCGGTGAT | GGTGCTGCGT | TGGAGTGACG | GCAGTTATCT | GGAAGATCAG | GATATGTGGC | 720 |
| GGATGAGCGG | CATTTTCCGT | GACGTCTCGT | TGCTGCATAA | ACCGACTACA | CAAATCAGCG | 780 |
| ATTTCCATGT | tgccactcgc | TTTAATGATG | ATTTCAGCCG | CGCTGTACTG | GAGGCTGAAG | 840 |
| TTCAGATGTG | CGGCGAGTTG | CGTGACTACC | TACGGGTAAC | AGTTTCTTTA | TGGCAGGGTG | 900 |
PL 193 220 B1
| AAACGCAGGT | CGCCAGCGGC | ACCGCGCCTT | TCGGCGGTGA | aattatcgat | GAGCGTGGTG | 960 |
| GTTATGCCGA | TCGCGTCACA | CTACGTCTGA | ACGTCGAAAA | CCCGAAACTG | TGGAGCGCCG | 1020 |
| AAATCCCGAA | TCTCTATCGT | GCGGTGGTTG | AACTGCACAC | CGCCGACGGC | ACGCTGATTG | 1080 |
| AAGCAGAAGC | CTGCGATGTC | GGTTTCCGCG | AGGTGCGGAT | TGAAAATGGT | CTGCTGCTGC | 1140 |
| TGAACGGCAA | GCCGTTGCTG | ATTCGAGGCG | TTAACCGTCA | CGAGCATCAT | CCTCTGCATG | 1200 |
| GTCAGGTCAT | GGATGAGCAG | ACGATGGTGC | AGGATATCCT | GCTGATGAAG | CAGAACAACT | 1260 |
| TTAACGCCGT | GCGCTGTTCG | CATTATCCGA | ACCATCCGCT | GTGGTACACG | CTGTGCGACC | 1320 |
| GCTACGGCCT | GTATGTGGTG | GATGAAGCCA | ATATTGAAAC | CCACGGCATG | GTGCCAATGA | 1380 |
| ATCGTCTGAC | CGATGATCCG | CGCTGGCTAC | CGGCGATGAG | CGAACGCGTA | ACGCGAATGG | 1440 |
| TGCAGCGCGA | TCGTAATCAC | CCGAGTGTGA | TCATCTGGTC | GCTGGGGAAT | GAATCAGGCC | 1500 |
| ACGGCGCTAA | TCACGACGCG | CTGTATCGCT | GGATCAAATC | TGTCGATCCT | TCCCGCCCGG: | 1560 |
| TGCAGTATGA | AGGCGGCGGA | GCCGACACCA | CGGCCACCGA | TATTATTTGC | CCGATGTACG | 1620 |
| CGCGCGTGGA | TGAAGACCAG | CCCTTCCCGG | CTGTGCCGAA | ATGGTCCATC | AAAAAATGGC | 1680 |
| TTTCGCTACC | TGGAGAGACG | CGCCCGCTGA | TCCTTTGCGA | ATACGCCCAC | GCGATGGGTA | 1740 |
| ACAGTCTTGG | CGGTTTCGCT | AAATACTGGC | AGGCGTTTCG | TCAGTATCCC | CGTTTACAGG | 1800 |
| GCGGCTTCGT | CTGGGACTGG | GTGGATCAGT | CGCTGATTAA | ATATGATGAA | AACGGGAACC | 1860 |
| CGTGGTCGGC | TTACGGCGGT | GATTTTGGCG | ATACGCCGAA | CGATCGCCAG | TTCTGTATGA | . 1920 |
| ACGGTCTGGT | CTTTGCCGAC | CGCACGCCGC | atccagcgct | GACGGAAGCA | AAACACCAGC | 1980 |
| AGCAGTTTTT | CCAGTTCCGT | TTATCCGGGC | AAACCATCGA | AGTGACCAGC | GAATACCTGT | 2040 |
| TCCGTCATAG | CGATAACGAG | CTCCTGCACT | GGATGGTGGC | GCTGGATGGT | AAGGCGCTGG | 2100 |
| CAAGCGGTGA | AGTGCCTCTG | GATGTCGCTC | CACAAGGTAA | ACAGTTGATT | GAACTGCCTG | 2160 |
| AACTACCGCA | gccggagagc | GCCGGGCAAC | TCTGGCTCAC | AGTACGCGTA | GTGCAACCGA | 2220 |
| ACGCGACCGC | ATGGTCAGAA | GCCGGGCACA | TCAGCGCCTG | GCAGCAGTGG | CGTCTGGCGG | 2280 |
| AAAACCTCAG | TGTGACGCTC | CCCGCCGCGT | CCCACGCCAT | CCCGCATCTG | ACCACCAGCG | 2340 |
| AAATGGATTT | TTGCATCGAG | CTGGGTAATA | AGCGTTGGCA | ATTTAACCGC | CAGTCAGGCT | 2400 |
| TTCTTTCACA | GATGTGGATT | GGCGATAAAA | AACAACTGCT | GACGCCGCTG | CGCGATCAGT | 2460 |
| TCACCCGTGC | ACCGCTGGAT | AACGACATTG | GCGTAAGTGA | AGCGACCCGC | ATTGACCCTA | 2520 |
| ACGCCTGGGT | CGAACGCTGG | AAGGCGGCGG | GCCATTACCA | GGCCGAAGCA | GCGTTGTTGC | 2580 |
| AGTGCACGGC | agatacactt | GCTGATGCGG | TGCTGATTAC | GACCGCTCAC | GCGTGGCAGC | 2640 |
| ATCAGGGGAA | AACCTTATTT | ATCAGCCGGA | AAACCTACCG | GATTGATGGT | AGTGGTCAAA | 2700 |
| TGGCGATTAC | CGTTGATGTT | GAAGTGGCGA | GCGATACACC | GCATCCGGCG | CGGATTGGCC | 2760 |
| TGAACTGCCA | GCTGGCGCAG | GTAGCAGAGC | GGGTAAACTG | GCTCGGATTA | GGGCCGCAAG | 2820 |
| AAAACTATCC | CGACCGCCTT | ACTGCCGCCT | GTTTTGACCG | ί CTGGGATCTG | CCATTGTCAG | 2880 |
| ACATGTATAC | CCCGTACGTC | TTCCCGAGCG | AAAACGGTCT | ' GCGCTGCGGG | i ACGCGCGAAT | 2940 |
PL 193 220 B1
| TGAATTATGG cccacaccag | tggcgcggcg acttccagtt caacatcagc | CGCTACAGTC | 3000 |
| AACAGCAACT GATGGAAACC | AGCCATCGCC ATCTGCTGCA CGCGGAAGAA | GGCACATGGC | 3oeo |
| TGAATATCGA CGGTTTCCAT | ATGGGGATTG GTGGCGACGA CTCCTGGAGC | CCGTCAGTAT | 3120 |
| CGGCGGATTC CAGCTGAGCG | CCGGTCGCTA CCATTACCAG TTGGTCTGGT | GTCAAAAATA | 3180 |
| ATAATAACCG GGCAGGCCAT | GTCTGCCCGT ATTTCGCGTA AGGAAATCCA | TTATGTACTA | 3240 |
| TTTAAAAAAC ACAAACTTTT | GGATGTTCGG TTTATTCTTT TTCTTTTACT | TTTTTATCAT | 3300 |
| GGGAGCCTAC TTCCCGTTTT | TCCCGATTTG GCTACATGAC ATCAACCATA | TCAGCAAAAG | 3360 |
| TGATACGGGT ATTATTTTTG | CCGCTATTTC TCTGTTCTCG CTATTATTCC | AACCGCTGTT | 3420 |
| TGGTCTGCTT TCTGACAAAC | TCGGGCTGCG CAAATACCTG CTGTGGATTA | TTACCGGCAT | 3480 |
| GTTAGTGATG TTTGCGCCGT | TCTTTATTTT TATCTTCGGG CCACTGTTAC | AATACAACAT | 3540 |
| TTTAGTAGGA TCGATTGTTG | GTGGTATTTA TCTAGGCTTT TGTTTTAACG | CCGGTGCGCC | 3600 |
| AGCAGTAGAG GCATTTATTG | AGAAAGTCAG CCGTCGCAGT AATTTCGAAT | TTGGTCGCGC | 3660 |
| GCGGATGTTT GGCTGTGTTG | gctgggcgct gtgtgcctcg attgtcggca | TCATGTTCAC | 3720 |
| CATCAATAAT CAGTTTGTTT | tctggctggg ctctggctgt gcactcatcc | TCGCCGTTTT | 3780 |
| actctttttc gccaaaacgg | ATGCGCCCTC TTCTGCCACG GTTGCCAATG | CGGTAGGTGC | 3840 |
| CAACCATTCG GCATTTAGCC | TTAAGCTGGC ACTGGAACTG TTCAGACAGC | caaaactgtg | 3900 |
| GTTTTTGTCA CTGTATGTTA | TTGGCGTTTC CTGCACCTAC GATGTTTTTG | ACCAACAGTT | . 3960 |
| TGCTAATTTC TTTACTTCGT | TCTTTGCTAC CGGTGAACAG GGTACGCGGG | TATTTGGCTA | 4020 |
| CGTAACGACA ATGGGCGAAT | TACTTAACGC CTCGATTATG TTCTTTGCGC | CACTGATCAT | 4080 |
| TAATCGCATC GGTGGGAAAA | ACGCCCTGCT GCTGGCTGGC ACTATTATGT | CTGTACGTAT | 4140 |
| TATTGGCTCA TCGTTCGCCA | CCTCAGCGCT GGAAGTGGTT ATTCTGAAAA | cgctgcatat | 4200 |
| GTTTGAAGTA CCGTTCCTGC | tggtgggctg CTTTAAATAT attaccagcc | AGTTTGAAGT | 4260 |
| GCGTTTTTCA GCGACGATTT | ATCTGGTCTG TTTCTGCTTC TTTAAGCAAC | TGGCGATGAT | 4320 |
| TTTTATGTCT GTACTGGCGG | GCAATATGTA TGAAAGCATC GGTTTCCAGG | GCGCTTATCT | 4380 |
| ggtgctgggt ctggtggcgc | TGGGCTTCAC CTTAATTTCC GTGTTCACGC | TTAGCGGCCC | 4440 |
| CGGCCCGCTT TCCCTGCTGC | gtcgtcaggt gaatgaagtc gcttaagcaa | , TCAATGTCGG | 4500 |
| ATGCGGCGCG acgcttatcc | : gaccaacata tcataacgga gtgatcgcai | ‘ TGAACATGCC | 4560 |
| AATGACCGAA AGAATAAGAG CAGGCAAGCT ATTTACCGAT ATGTGCGAAG GCTTACCGGA | 4620 | ||
| aaaaagactt cgtgggaaaa cgttaatgta tgagtttaat cactcgcatc catcagaagt | 4680 | ||
| TGAAAAAAGA GAAAGCCTGA TTAAAGAAAT GTTTGCCACG GTAGGGGAAA ACGCCTGGGT | 4740 | ||
| AGAACCGCCT GTCTATTTCT CTTACGGTTC CAACATCCAT ATAGGCCGCA ATTTTTATGC | 4800 | ||
| aaatttcaat ttaaccattg tcgatgacta cacggtaaca atcggtgata acgtactgat | 4 860 | ||
| TGCACCCAAC GTTACTCTTT CCGTTACGGG ACACCCTGTA CACCATGAAT TGAGAAAAAA | 4920 | ||
| CGGCGAGATG tactcttttc cgataacgat tggcaataac gtctggatcg gaagtcatgt | 4980 |
PL 193 220 B1
| GGTTATTAAT | CCAGGCGTCA | CCATCGGGGA | TAATTCTGTT | ATTGGCGCGG | GTAGTATCGT | 5040 |
| CACAAAAGAC | ATTCCACCAA | ACGTCGTGGC | GGCTGGCGTT | CCTTGTCGGG | TTATTCGCGA | 5100 |
| AATAAACGAC | CGGGATAAGC | ACTATTATTT | CAAAGATTAT | AAAGTTGAAT | CGTCAGTTTA | 5160 |
| AATTATAAAA | ATTGCCTGAT | ACGCTGCGCT | TATCAGGCCT | ACAAGTTCAG | CGATCTACAT | 522 0 |
| TAGCCGCATC | CGGCATGAAC | AAAGCGCAGG | AACAAGCGTC | GCATCATGCC | TCTTTGACCC | 5280 |
| ACAGCTGCGG | AAAACGTACT | GGTGCAAAAC | GCAGGGTTAT | GATCATCAGC | CCAACGACGC | 5340 |
| ACAGCGCATG | AAATGCCCAG | TCCATCAGGT | AATTGCCGCT | GATACTACGC | AGCACGCCAG | 5400 |
| AAAACCACGG | GGCAAGCCCG | GCGATGATAA | AACCGATTCC | CTGCATAAAC | GCCACCAGCT | 5460 |
| TGCCAGCAAT | AGCCGGTTGC | ACAGAGTGAT | CGAGCGCCAG | CAGCAAACAG | AGCGGAAACG | 5520 |
| CGCCGCCCAG | ACCTAACCCA | CACACCATCG | CCCACAATAC | CGGCAATTGC | ATCGGCAGCC | S580 |
| AGATAAAGCC | GCAGAACCCC | ACCAGTTGTA | ACACCAGCGC | CAGCATTAAC | AGTTTGCGCC | 5640 |
| GATCCTGATG | GCGAGCCATA | GCAGGCATCA | GCAAAGCTCC | TGCGGCTTGC | CCAAGCGTCA | 5700 |
| TCAATGCCAG | TAAGGAACCG | CTGTACTGCG | CGCTGGCACC | AATCTCAATA | TAGAAAGCGG | 5760 |
| GTAACCAGGC | AATCAGGCTG | GCGTAACCGC | CGTTAATCAG | ACCGAAGTAA | ACACCCAGCG | 5820 |
| TCCACGCGCG | GGGAGTGAAT | ACCACGCGAA | CCGGAGTGGT | TGTTGTCTTG | TGGGAAGAGG | 5880 |
| CGACCTCGCG | GGCGCTTTGC | CACCACCAGG | CAAAGAGCGC | AACAACGGCA | GGCAGCGCCA | 5940 |
| CCAGGCGAGT | GTTTGATACC | AGGTTTCGCT | ATGTTGAACT | AACCAGGGCG | TTATGGCGGC | . 6000 |
| ACCAAGCCCA | CCGCCGCCCA | TCAGAGCCGC | GGACCACAGC | CCCATCACCA | GTGGCGTGCG | 6060 |
| CTGCTGAAAC | CGCCGTTTAA | TCACCGAAGC | ATCACOGCCT | GAATGATGCC | GATCCCCACC | 6120 |
| CCACCAAGCA | GTGCGCTGCT | AAGCAGCAGC | GCACTTTGCG | GGTAAAGCTC | ACGCATCAAT | 6180 |
| GCACCGACGG | CAATCAGCAA | CAGACTGATG | GCGACACTGC | GACGTTCGCT | GACATGCTGA | 6240 |
| TGAAGCCAGC | TTCCGGCCAG | CGCCAGCCCG | CCCATGGTAA | CCACCGGCAG | AGCGGTCGAC | 6300 |
| CCGGACGGGA | CGCTCCTGCG | CCTGATACAG | aacgaattgc | TTGCAGGCAT | CTCATGAGTG | 6360 |
| TGTCTTCCCG | TTTTCCGCCT | GAGGTCACTG | CGTGGATGGA | GCGCTGGCGC | CTGCTGCGCG | 6420 |
| ACGGCGAGCT | GCTCACCACC | CACTCGAGCT | GGATACTTCC | CGTCCGCCAG | ggggacatgc | 64 8 0 |
| CGGCGATGCT | GAAGGTCGCG | CGCATTCCCG | ATGAAGAGGC | CGGTTACCGC | CTGTTGACCT | 6S40 |
| GGTGGGACGG | GCAGGGCGCC | GCCCGAGTCT | TCGCCTCGGC | GGCGGGCGCT | CTGCTCATGG | 6600 |
| AGCGCGCGTC | CGGGGCCGGG | GACCTTGCAC | AGATAGCGTG | GTCCGGCCAG | GACGACGAGG | 6660 |
| CTTGCAGGAT | CTATGATTCC | CTTTGTCAAC | AGCAATGGAT | CACTGAAAAT | GGTTCAATGA | 6720 |
| TCACATTAAG | TGGTATTCAA | TATTTTCATG | AAATGGGAAT | TGACGTTCCT | TCCAAACATT | 6780 |
| CACGTAAAAT | CTGTTGTGCG | TGTTTAGATT | GGAGTGAACG | CCGTTTCCAT | TTAGGTGGGT | 6840 |
| ACGTTGGAGC | CGCATTATTT | TCGCTTTATG | AATCTAAAGG | GTGGTTAACT | CGACATCTTG | 6900 |
| GTTACCGTGA | AGTTACCATC | ACGGAAAAAG | GTTATGCTGC | TTTTAAGACC | CACTTTCACA | 6960 |
| TTTAAGTTGT | TTTTCTAATC | CGCATATGAT | CAATTCAAGG | CCGAATAAGA | AGGCTGGCTC | 7020 |
PL 193 220 B1
TGCACCTTGG TGATCAAATA ATTCGATAGC TTGTCGTAAT AATGGCGGCA TACTATCAGT 7080
AGTAGGTGTT TCCCTTTCTT CTTTAGCGAC TTGATGCTCT TGATCTTCCA ATACGCAACC 7no
TAAAGTAAAA TGCCCCACAG CGCTGAGTGC ATATAATGCA TTCTCTAGTG AAAAACCTTG 7200
TTGGCATAAA AAGGCTAATT GATTTTCGAG AGTTTCATAC TGTTTTTCTG TAGGCCGTGT 7260
ACCTAAATGT ACTTTTGCTC CATCGCGATG ACTTAGTAAA GCACATCTAA AACTTTTAGC 7320
GTTATTACGT AAAAAATCTT GCCAGCTTTC CCCTTCTAAA GGGCAAAAGT GAGTATGGTG 7380
CCTATCTAAC ATCTCAATGG CTAAGGCGTC GAGCAAAGCC CGCTTATTTT TTACATGCCA 7440
ATACAATGTA GGCTGCTCTA CACCTAGCTT CTGGGCGAGT TTACGGGTTG TTAAACCTTC 7500
GATTCCGACC TCATTAAGCA GCTCTAATGC GCTOTTAATC ACTTTACTTT TATCTAATCT 7560
AGACATCATT AATTCCTAAT TTTTGTTGAC ACTCTATCAT TGATAGAGTT ATTTTACCAC 7620
TCCCTATCAG TGATAGAGAA AAGTGAAATG AATAGTTCGA CAAAGATCGC ATTGGTAATT 7680
ACGTTACTCG ATGCCATGGG GATTGGCCTT ATCATGCCAG TCTTGCCAAC GTTATTACGT 7740 gaatttattg cttcggaaga tatcgctaac cactttggcg TATTGCTTGC ACTTTATGCG 7800
TTAATGCAGG TTATCTTTGC TCCTTGGCTT GGAAAAATGT CTGACCGATT TGGTCGGCGC 7860
CCAGTGCTGT TGTTGTCATT AATAGGCGCA TCGCTGGATT ACTTATTGCT GGCTTTTTCA 7920
AGTGCGCTTT OGATGCTGTA.TTTAGGCCGT TTGCITTCAG GGATCACAGG AGCTACTGGG 7980 GCTGTCGCGG CATCGGTCAT TGCCGATACC ACCTCAGCTT CTCAACGCGT GAAGTGGTTC . 8040
GGTTGGTTAG GGGCAAGTTT TGGGCTTGGT TTAATAGCGG GGCCTATTAT TGGTGGTTTT 8100
GCAGGAGAGA TTTCACCGCA TAGTCCCTTT TTTATCGCTG CGTTGCTAAA TATTGTCACT 816 0
TTCCTTGTGG TTATGTTTTG GTTCCGTGAA ACCAAAAATA CACCTGATAA TACAGATACC 8220 gaagtagggg TTGAGACGCA ATCGAATTCG GTATACATCA CTTTATTTAA AACGATGCCC 8280
ATTTTGTTGA TTATTTATTT TTCAGCGCAA TTGATAGGCC AAATTCCCGC AACGGTGTGG 8 34 0 gtgctattta ccgaaaatcg ttttggatgg aatagcatga tggttggctt TTCATTAGCG 8400
GGTCTTGGTC TTTTACACTC AGTATTCCAA GCCTTTGTGG CAGGAAGAAT AGCCACTAAA 8460
TGGGGCGAAA AAACGGCAGT ACTGCTCGAA TTTATTGCAG ATAGTAGTGC ATTTGCCTTT 8520
TTAGCGTTTA TATCTGAAGG TTGGTTAGAT TTCCCTGTTT ΤΑΑΤΤΤΓΑΤΤ GGCTGGTGGT 8580
GGGATCGCTT TACCTGCATT ACAGGGAGTG atgtctatcc AAACAAAGAG TCATGAGCAA 8640
GGTGCTTTAC AGGGATTATT GGTGAGCCTT ACCAATGCAA CCGGTGTTAT TGGCCCATTA 8700
CTGTTTACTG TTATTTATAA TCATTCACTA CCAATTTGGG ATGGCTGGAT TTGGATTATT 8760
GGTTTAGCGT TTTACTGTAT TATTATCCTG CTATCGATGA CCTTCATGTT AACCCCTCAA 8820
GCTCAGGGGA GTAAACAGGA GACAAGTGCT TAGTTATTTC GTCACCAAAT GATGTTATTC 8880
CGCGAAATAT AATGACCCTC TTGATAACCC AAGAGGGCAT TTTTTACGAT AAAGAAGATT 8940
TAGCTTCAAA TAAAACCTAT CTATTTTATT TATCTTTCAA GCTCAATAAA AAGCCGCGGT 9000
AAATAGCAAT AAATTGGCCT TTTTTATCGG CAAGCTCTTT TAGGTTTTTC gcatgtattg 9060
PL 193 220 B1
CGATATGCAT AAACCAGCCA TTGAGTAAGT TTTTAAGCAC ATCACTATCA TAAGCTTTAA 9120 GTTGGTTCTC TTGGATCAAT TTGCTGACAA TGGCGTTTAC CTTACCAGTA ATGTATTCAA 9130 GGCTAATTTT TTCAAGTTCA TTCCAACCAA TGATAGGCAT CACTTCTTGG ATAGGGATAA 9240 GGTTTTTATT ATTATCAATA ATATAATCAA GATAATGTTC AAATATACTT TCTAAGGCAG 9300 ACCAACCATT TGTTAAATCA GTTTTTGTTG TGATGTAGGC ATCAATCATA ATTAATTGCT 9360 GCTTATAACA GGCACTGAGT AATTGTTTTT ΤΑΤΓΓΤΤΑΑΑ GTGATGATAA AAGGCACCTT 942 0
| TGGTCACCAA | CGCTTTTCCC | GAGATCCTCT | GCGACACCGC | CGCTCGTCTG | CACGCGCCGC | 9480 |
| GGTCCGGACC | GCCGCCCGAT | CTCCATCCGC | TACAGGAATG | GTTCCAGCCG | CTTTTCCGGT | 9540 |
| TGGCCGCTGA | GCACGCGGCA | CTTGCGCCCG | CCGCCAGCGT | AGCGCGCCAA | CTTCTGGCGG | 9600 |
| CGCCGCGCGA | GGTGTGCCCG | CTCCACGGCG | ACCTGCACCA | CGAGAACGTG | CTCGACTTCG | 9660 |
| GCGACCGCGG | CTGGCTGGCC | atcgacccgc | ACGGACTGCT | CGGCGAGCGC | ACCTTCGACT | 9720 |
| ATGCCAACAT | CTTCACGAAT | CCCGATCTCA | GCGACCCCGG | TCGCCCGCTT | GCGATCCTGC | 9780 |
| CGGGCAGGCT | GGAGGCTCGA | CTCAGCATTG | TGGTCGCGAC | GACCGGGTTT | GAGCCCGAAC | 9840 |
| GGCTTCTTCG | CTGGATCATT | GCATGGACGG | GCTTGTCGGC | AGCCTGGTTC | ATCGGCGACG | 9900 |
| GCGACGGCGA | GGGCGAGGGC | GCTGCGATTG | ATCTOGCCGT | AAACGCCATG | GCACGCCGGT | 9960 |
| TGCTTGACTA | GCGCGGTCAC | CGATCTCACC | TGGTCGTCGA | GCTAGGTCAG | GCCGTGTCGG | 10020 |
| GCGTGATCCG | CTGGAAGTCG | TTGCGGGCCA | CACCCGCCGC | CTCGAAGCCC | TGCACCAGGC | ,10080 |
| CGGCATCGTG | GTGTGCGTGG | CCGAGGGACT | ATGGAAGGTG | CCGGACGATC | TGCCCGAGCA | 10140 |
| GGGCCGCCGC | TATGACGCCC | AGCGTCTTGG | TGGCOTGACG | GTGGAGCTGA | AATCGCACCT | 10200 |
| GCCCATCGAG | CGGCAGGCCC | GCGTGATCGG | TGCCACCTGG | CTTGACCAGC | AGTTGATCGA | 10260 |
| CGGTGGCTCG | GGCTTGGGCG | ACCTGGGCTT | TAGCAGTGAG | GCCAAGTAGG | CGATACAGCA | 10320 |
| GCGCGCGGAC | TTCCTGGCCG | AACAGGGACT | GGCCGAGCGG | CGCGGGCAGC | GCGTGATCCT | 10380 |
| CACCGGAATC | TGCTGGGCAG | CAGCGGGCTC | GGGAACTGGC | GCAGGCCGCG | AAGGACATTG | 10440 |
| CCGCCGATAC | CGGCCTGGAG | CATCGCCCCG | TGGCCGACGG | CCAGCGCGTT | GCCGGCGTCT | 10500 |
| ACCGGCGCCC | CGTCATGCTC | GCCAGCGGGC | GAAATGGGAT | GCTTGATGAC | GCCAAGGGGT | 10560 |
| CCAGCCTCGT | GCGGTGGAAG | CCCATCGAAC | AGCGGCTTGG | GGAGCAGCTC | GCCGCGACGG | 10620 |
| TGCGCGGTGG | CGGCGTGTCT | TGGGAGATTG | GACGACAGCG | TGGGCCGGCC | CCTGTCTCTT | 10680 |
| GATCAGATCT | TGATCCCCTG | CGCCATCAGA | TCCTTGGCGG | CAAGAAAGCC | ATCCAGTTTA | 10740 |
| CTTTGCAGGG | CTTCCCAACC | TTCCCAGAGG | GCGCCCCAGC | TGGCAATTCC | ggttcgcttg | 10800 |
| CTGTCCATAA | AACCGCCCAG | TCTAGCTATC | GCCATGTAAG | CCCACTGCAA | GCTACCTGCT | 10960 |
| TTCTCTTTGC | GCTTGCGTTT | TCCCTTGTCC | AGATAGCCCA | GTAGCTGACA | TTCATCCGGG | 10920 |
| GTCAGCACCG | TTTCTGCGGA | CTGGCTTTCT | ACGTGTTCCG | CTTCCTTTAG | cagcccttgc | 10960 |
| GCCCTGAGTG | CTTGCGGCAG | CGTGAAGCTT | TCTCTGAGCT | GTAACAGCCT | GACCGCAACA | 11040 |
| AACGAGAGGA | TCGAGACCAT | CCGCTCCAGA | TTATCCGGCT | CCTCCATGCG | TTGCCTCTCG | 11100 |
PL 193 220 B1
| GCTCCTGCTC | CGGTTTTCCA | TGCCTTATGG | aactcctcga | TCCGCCAGCG | ATGGGTATAA | 11160 |
| ATGTCGATGA | CGCGCAAGGC | TTGGGCTAGC | gactcgaccg | GTTCGCCGGT | CAGCAACAAC | 11220 |
| CATTTCAACG | GGGTCTCACC | CTTGGGCGGG | TTAATCTCCT | CGGCCAGCAC | CGCGTTGAGC | 11200 |
| GTGATATTCC | CCTGTTTTA.G | CGTGATGCGC | CCACTGCGCA | GGCTCAAGCT | CGCCTTGCGG | 11340 |
| GCTGGTCGAT | TTTTACGTTT | ACCGCGTTTA | TCCACCACGC | CCTTTTGCGG | AATGCTGATC | 11400 |
| TGATAGCCAC | CCAACTCCGG | TTGGTTCTTC | AGATGGTCGA | TCAGATACAA | CCCAGACTCT | 11460 |
| ACGTCCTTGC | GTGGGTGCTT | GGAGCGCACC | ACGAAGCGCT | CGTTATGCGC | CAGCCTGTCC | 11520 |
| TGCAGATAAG | CATGAATATC | GGCTTCGCGG | TCACAGACCG | CAATCACGTT | GCTCATCATG | 11530 |
| CTGCCCATGC | GTAACCGGCT | AGTTGCGGCC | GCTGCCAGCC | atttgccact | CTCCTTTTCA | 1X640 |
| TCCGCATCGG | CAGGGTCATC | CGGGCGCATC | CACCACTCCT | GATGCAGTAA | TCCTACGGTG | 11700 |
| CGGAATGTGG | TGGCCTCGAG | GAAGAGAACG | GAGTGAACCC | ACCATCCGCG | GGATTTATCC | 11760 |
| TGAATAGAGC | CCAGCTTGCC | AAGCTCTTCG | GCGACCTGGT | GGOGATAACT | CAAAGAGGTG | 11Θ20 |
| GTGTCCTCAA | TGGCCAGCAG | TTCGGGAAAC | TCCTGAGCCA | ACTTGACTGT | TTGCATGGCG | iieeo |
| CCAGCCTTTC | TGATCGCCTC | GGCAGAAACG | TTGGGATTGC | GGATAAATCG | GTAAGCGCCT | 11940 |
| TCCTGCATGG | CTTCACTACC | CTCTGATGAG | ATGGTTATTG | ATTTACCAGA | ATATTTTGCC | 12000 |
| AATTGGGCGG | CGACGTTAAC | CAAGCGGGCA | GTACGGCGAG | GATCACCCAG | CGCCGCCGAA | 12060 |
| GAGAACACAG | ATTTAGCCCA | GTCGGCCGCA | CGATGAAGAG | CAGAAGTTAT | CATGAACGTT | . 12120 |
| ACCATGTTAG | GAGGTCACAT | GGAAGATCAG | ATCCTGGAAA | ACGGGAAAGG | TTCCGTTCGA | 12180 |
| ATTGCATGCG | GATCCGGGAT | CAAGATCTGA | TCAAGAGACA | GGTACCAATT | GTTGAAGACG | 12240 |
| AAAGGGCCTC | GTGATACGCC | TATTTTTATA | GGTTAATGTC | ATGATAATAA | tggtttctta | 12300 |
| GACGTCAGGT | GGCACTTTTC | GGGGAAATGT | GCGCGGAACC | CCTATTTGTT | TATTTTTCTA | 12360 |
| AATACATTCA | AATATGTATC | CGCTCATGAG | ACAATAACCC | TGATAAATGC | TTCAATAATA | 12420 |
| TTGAAAAAGG | AAGAGTATGA | GTATTCAACA | TTTCCGTGTC | GCCCTTATTC | CCTTTTTTGC | 1248 0 |
| GGCATTTTGC | CTTCCTGTTT | TTGCTCACCC | AGAAACGCTG | GTGAAAGTAA | AAGATGCTGA | 12540 |
| AGATCAGTTG | GGTGCACGAG | TGGGTTACAT | COAACTGGAT | CTCAACAGCG | GTAAGATCCT | 12600 |
| TGAGAGTTTT | CGCCCCGAAG | AACGTTTTCC | AATGATGAGC | ACTTTTAAAG | TTCTGCTATG | 12660 |
| TGGCGCGGTA | TTATCCCGTG | TTGACGCCGG | GCAAGAGCAA | CTCGGTCGCC | GCATACACTA | 12720 |
| TTCTCAGAAT | GACTTGGTTG | AGTACTTGGC | AAACTGATCT | AAATGTTTAG | CCCAGTCATC | 12780 |
| ATACTTCACC | GATGCCAACG | CATTAAAAAT | AGCATCACGA | TCGGCTTTGC | TGAATTTCTT | 12840 |
| ATTTAAAACA | TCCTTGTATT | TTTCAAAAGC | AGCGAGAGCT | TCATTCACAT | TGCCGATTTT | 12900 |
| CTTACCTTTA | GACTTATCAG | CAAGTTCCTG | TGCCATTTTC | GAATATTTTT | CACCATATTT | 12960 |
| TTCAGTCAGC | GTTTGATAAA | AGCTAACTGT | TGCATCAACA | GCATCCTTAA | TCTGTGAATT | 13020 |
| AAGGAGATTA | TTCTGTGCTT | TTTTCAAATT | TTCTTCAGCT | TCATGAACAC | GAGCGATACC | 13080 |
| GGCATTACGA | TTATTACTGA | CCTGAGAAAT | AGCCTTCTGG | ATCTGAGTTA | TATCAGCATT | 13140 |
PL 193 220 B1
TATCCGGTTA ATACGTGTTT CTGATGCTGT TACCTGTTTT TGTTTTTCTT CTCTAATCTT 13200
ACCGGCCCCA ACCCGTCGTC TGGTTGCTTC AAAAAAAGGA CGGTTCTGAA GCGGATCATT 13260
GGCTCTTGGT GATAGTTTTT TGACCAGCTC ATCCAGTTCT TTATATTTAG CGGATGCCTG 13320
AGCCAGTTCA TTTCGTTTTC CAGCGAGCGT TTTCATTTCT GCATCACGGG CATGGATACT 133ΘΟ
GGAGCTTAAA CGAGAATTGA GAGTCTTAAT CTCTCCATCC ATTTTGACCA CTTCAGATTG 13440
TGCAGCAGAA AGTTTTTTTT GGGCGATCTC AACAGCTTTA GCTTCTTCAC TCAATGCAGC 13500
CAGTCGTTTC TCTTCAGCTT CAGCCAGTTT CAACTGGCGT TCTGTTTCAG CCTTCTCCCG 13560
TTCAATCTCT TTACGTCGTT GTTCTGCTTC CTGAAAAGCC TTTTCTGCTG CTTCCGCTTC 13620
TTTACGGGCT TTTTCTTCTG CTTTCGCAAG GCGCAAACGC TCTGCTTCCG CCTGCATAGC 13fi80
TGCATTATTA GCATGAGCAA GCTCTGTTGC TGAAGGCGTA CGTGAGGCAT TGTGACGAAG 13740
AGCCTCATTC ACGATATCCT TCAGGCGCTG AGTCAGCGCA TCCCTGTTTG CCTTIGCTTT 13800
CGCCTGTGCT TCCGCTGCAG CTTTTGCCCG GGCAGCCTGC TCTGCCTGTG TTTTCTTTAA 13860
TTGAGCAGTA GACCATTTAG CAGTTCCATG AATAGCTGCA GAACTTTCAC TTTTACTGCC 13920
TCCTTITCCA CCTCCGCCGC CAGAGCCACT CCCGTCAGGA GTACCA1TCA AAAGAGTAAT 13 98 0 aattacctgt cccttatcat CATAAGGAAC ACCATCTTTA TAGTACGCTA CCGCGGTTTC 14040
CATTATAAAA TCCTCTTTGA CTTTTAAAAC AATAAGTTAA AAATAAATAC TGTACATATA 14100
ACCACTGGTT TTATATACAG CATAAAAGCT ACGCCGCTGC ATTTTCCCTG TCAAGACTGT .14160 GGACTTCCAT TTTTGTGAAA ACGATCAAAA AAACAGTCTT TCACACCACG CGCTATTCTC 14220 gcccgatgcc acaaaaacca gcacaaacat taccgttctc agacctcatt ATGTTTTACT 14280 gaaactatga gatgagacat ctatgggaca ctgtcacttt ATGGCATGGG ACACACTCCG 14340 ggacgcacta aaaatgacag gcagatcgcg ttcacagttt taccgtgata TGCGCGGAGG 14400
CCTTGTCAGT TACCGTACCG GCAGGGACGG ACGACGGGAG TTTGAAACCA GTGAACTGAT 14460 CCGGGCATAC GGCGAATTAA AGCAGAATGA GACACCAGAA AGGCACAGTG AGGGACATGC 14520 AGAAAATCCA CATGATCAGC AGACAGAACG CATTCTCCGG GAACTGAATG AGCTGAAACA 14580 atgcctgacg CTGATGCTTG aggataaaca ggcacaggat atggatcgca GACGCCAGGA 14640 AGCAGAACGG GAACAGCTAC AAAATGAGAT AGCCCAGCTC AGGCAGGCAC TGGAACTGGA 14700 AAAGAAACGG GGATTCTGGT CCAGGTTGTT CGGTCGCTGA ACGCTGTCAG AGACTGATGA 14760 TAAAATAGTC TTCGGATAAT AACTCACCGA GAATAAATAC TTTAAGGTAG GGAGACACTC 14820 ATGAGACGTA CCGGAAACAA ACTTTGTCTT ATCGCCATGA TAACAGCAAC AGTAGCTCTC 14880 ACAGCCTGTA CCCCAAAGGG CAGCGTGGAA CAACATACCC GGCATTACGT ATATGCTTCT 14 94 0 gatgacggtt ttgatcccaa cttttccacc CAAAAAGCCG acacaacacg AATGATGGTG 15000
CCTTTTTTTC GGCAGTTCTG GGATATGGGA GCTAAAGACA AAGCGACAGG AAAATCACGG 15060
AGTGATGTGC AACAACGCAT TCAGCAGTTT CACAGCCAAG AATTTTTAAA CTCACTCCGG 15120
GGCACAACTC AATTTGCGGG TACTGATTAC CGCAGCAAAG ACCTTACCCC GAAAAAATCC 15180
PL 193 220 B1
| AGGCTGCTGG CTGACACGAT | TTCTGCGGTT TATCTCGATG GCTACGAGGG CAGACAGTAA | 15240 |
| GTGGATTTAC CATAATCCCT | TAATTGTACG CACCGCTAAA acgcgttcag cgcgatcacg | 15300 |
| GCAGCAGACA GGTAAAAATG | GCAACAAACC ACCCTAAAAA CTGCGCGATC GCGCCTGATA | 15360 |
| AATTTTAACC GTATGAATAC | CTATGCAACC AGAGGGTACA GGCCACATTA CCCCCACTTA | 15420 |
| ATCCACTGAA GCTGCCATTT | TTCATGGTTT CACCATCCCA GCGAAGGGCC ATCCAGCGTG | 15430 |
| CGTTCCTGTA TTTCCGGCTG | ACGCTCCCGT TCTAGGGATA ACACATGTTC GCGCTCCTGT | 15540 |
| ATCAGCCGTT CCTCTCTTAT | CTCCAGTTCT CGCTGTATAA CTGGCTCAAG CGTTCTGTCT | 15600 |
| GCTCGCTCAA GTGTTGCACC | TGCTGACTCA ACTGCATGAC CCGCTCGTTC AGCATCGCGT | 15660 |
| TGTCCCGTTG CGTAAGCGAA | AACATCTTCT GCAATTCCAC GAAGGCGCTC TCCCATTCGC | 1S720 |
| TCAGCCGCTG CATATAGTCC | TGTTGCAGCT GCTCTAAGGC GTTCAGCAAA TGTGTTTCCA | 15780 |
| GCTCTGTCAC TCTGTGTCAC | TCCTTCAGAT GTACCCACTC TTTCCCCTGA AAGGGAATCA | 15840 |
| CCTCCGCTGA TTTCCCGTAC | ggaaggacaa GGAATTTCCT GTTCCCGTCC TGCACAAACT | 15900 |
| CCACGCCCCA TGTCTTCGCG | TTCAGTTTCT GCAATGTCTC TTCCTGCTTC CTGATTTCTT | 15960 |
| CCAGGTTCGC CTGTATCCTC | CCTCCAAGAT ACCAGAGCGT CCCGCCACTC GCGGTAAACA | 16020 |
| ggagaaagac tatccccagt | AACATCATGC CCGTATTCCC TGCCAGCTTT AACACGTCCC | 16080 |
| TCCTGTGCTG CATCATCGCC | TCTTTCACCC CTTCCCGGTG TTTTTCCAGC GATTCCTCTG | 16140 |
| TCGAGGCTGT GAACAGGGCT | ATAGCGTCTC TGATTTTCGT CTCGTTTGAT GTCACAGCCT | .16200 |
| CGCTTACAGA TTCGCCGAGC | CTCCTGAACT CGTTGTTCAG CATTTTCTCT GTAGATTCGG | 16260 |
| CTCTCTCTTT CAGCTTTTTC GCTCCTTTCA GCCTGATATT | TCGAACTCCG CGCCCGTCTG CAAAAGATTG CTGATAAAAT CTTCCCGCCG TTCGGATCTG CAATGCTGAT ACTGCTTCGC | 16320 16380 |
| GTCACCCTGA CCACTTCCAG | CCCCGCCTCA GTGAGCGCCT GAATCACATC CTGACGGCCT | 1644C |
| TTTATCTCTC CGGCATGGTA | AAGTGCATCT ATACCTCGCG TGACGCCCTC AGCAAGCGCC | 16500 |
| TGTTTCGTTT CAGGCAGGTT | ATCAGGGAGT GTCAGCGTCC TGCGGTTCTC CGGGGCGTTC | 16560 |
| GGGTCATGCA GCCCGTAATG | GTGATTTAAC AGCGTCTGCC AAGCATCAAT TCTAGGCCTG | 16620 |
| TCTGCGCGGT CGTAGTACGG | CTGGAGGCGT TTTCCGGTCT GTAGCTCCAT GTTCGGAATG | 16680 |
| ACAAAATTCA GCTCAAGCCG | TCCCTTGTCC TGGTGCTCCA CCCACAGGAT GCTGTACTGA | 16740 |
| TTTTTTTCGA GACCGGGCAT CCCGGCGGCA GCTCCTTCTC | CAGTACACGC TCAAAGCTCG CCATCACTTT TTCACGTCCT CGCGAACGAC AGAACACCGG ACGTGTATTT CTTCGCAAAT | 16800 16860 |
| GGCGTGGCAT CGATGAGTTC | CCGGACTTCT TCCGGTATAC CCTGAAGCAC CGTTGCGCCT | 16920 |
| TCGCGGTTAC GCTCCCTCCC | CAGCAGGTAA TCAACCGGAC CACTGCCACC ACCTTTTCCC | 16980 |
| CTGGCATGAA ATTTAACTAT | ' CATCCCGCGC CCCCTGTTCC CTGACAGCCA GACGCAGCCG | 17040 |
| GCGCAGCTCA TCCCCGATGG | ! CCATCAGTGC GGCCACCACC TGAACCCGGT CACCGGAAGA | 17100 |
| CCACTGCCCG CTGTTCACCI | ' TACGGGCTGT CTGATTCAGG TTATTTCCGA TGGCGGCCAG | 17160 |
| CTGACGCAGT AACGGCGGTG CCAGTGTCGG CAGTTTTCCG GAACGGGCAA CCGGCTCCCC | 17220 |
PL 193 220 B1
| CAGGCAGACC | CGCCGCATCC | ATACCGCCAG | TTGTTTACCC | TCACAGCGTT | CAAGTAACCG | 17280 |
| GGCATGTTCA | TCATCAGTAA | CCCGTATTGT | GAGCATCCTC | TCGCGTTTCA | TCGGTATCAT | 17340 |
| TACCCCATGA | ACAGAAATCC | CCCTTACACG | GAGGCATCAG | TGACTAAACA | GGAAAAAACC | 17400 |
| GCCCTTAACA | TGGCCCGCTT | TATCAGAAGC | CAGACATTAA | CGCTGCTGGA | GAAGCTCAAC | 17460 |
| GAACTGGACG | CAGATGAACA | GGCCGATATT | TGTGAATCGC | TTCACGACCA | CGCCGATGAG | 17520 |
| CTTTACCGCA. | GCTGCCTCGC | ACGTTTCGGG | GATGACGGTG | AAAACCTCTG | ACACATGCAG | 17S80 |
| CTCCCGGAGA | CGGTCACAGC | TTGTCTGTGA | GCGGATGCCG | GGAGCTGACA | AGCCCGTCAG | 17640 |
| GGCGCGTCAG | CAGGTTTTAG | CGGGTGTCGG | GGCGCAGCCC | TGACCCAGTC | ACGTAGCGAT | 17700 |
| AGCGGAGTGT | ATACTGGCTT | AACCATGCGG | CATCAGTGCG | GATTGTATGA | AAAGTACGCC | 17760 |
| ATGCCGGGTG | TGAAATGCCG | CACAGATGCG | TAAGGAGAAA | ATGCAĆGTCC | AGGCGCTTTT | 17820 |
| CCGCTTCCTC | GCTCACTGAC | TCGCTACGCT | CGGTCGTTCG | ACTGCGGCGA | GCGGTACTGA | 17880 |
| CTCACACAAA | AACGGTAACA | CAGTTATCCA | CAGAATCAGG | GGATAAGGCC | GGAAAGAACA | 17940 |
| TGTGAGCAAA | AGACCAGGAA | CAGGAAGAAG | GCCACGTAGC | AGGCGTTTTT | CCATAGGCTC | 18000 |
| CGCCCCCCTG | ACGAGCATCA | CAAAAATĄGA | CGCTCAAGTC | AGAGGTGGCG | AAACCCGACA | 18060 |
| GGACTATAAA | GCTACCAGGC | GTTTCCCCCT | GGAAGCTCCC | TCGTGCGCTC | TCCTGTTCCG | 18120 |
| ACCCTGCCGC | TTACCGGATA | CCTGTCCGCC | TTTCTCCCTT | CGGGAAGCGT | GGCGCTTTCT | 18180 |
| CATAGCTCAC | GCTGTTGGTA | TCTCAGTTCG | GTGTAGGTCG | TTCGCTCCAA | GCTGGGCTGT | .18240 |
| GTGCACGAAC | CCCCCGTTCA | GCCCGACCGC | TGCGCCTTAT | CCGGTAACTA | TCGTCTTGAG | 18300 |
| TCCAACCCGG | TAAGGCACGC | CTTAACGCCA | CTGGCAGCAG | CCACTGGTAA | CCGGATTAGC | 18360 |
| AGAGCGATGA | TGGCACAAAC | GGTGCTACAG | AGTTCTTGAA | GTAGTGGCCC | GACTACGGCT | 18420 |
| ACACTAGAAG | GACAGTATTT | GGTATCTGCG | CTCTGCTGAA | GCCAGTTACC | TTCGGAAAAA | *18480 |
| GAGTTGGTAG | CTCTTGATCC | GGCAAACAAA | CCACCGTTGG | TAGCGGTGGT | TTTTTTGTTT | 18540 |
| GCAAGCAGCA | GATTACGCGC | AGAAAAAAAG | GATCTCAAGA | AGATCCTTTA | ATCTTTTCTA | 18600 |
| CTGAACCGCG | ATCCCCGTCA | GTTTAGAAGA | GGAGGATGGT | GCGATGGTCC | CTCCCTGAAC | 18660 |
| ATCAGGTATA | TAGTTAGCCT | GACATCCAAC | AAGGAGGTTT | ATCGCGAATA | TTCCCACAAA | 18720 |
| AAATCTTTTC | CTCATAACTC | GATCCTTATA | AAATGAAAAG | AATATATGGC | GAGGTTTAAT | 18780 |
| TTATGAGCTT | AAGATACTAC | ΑΤΑΑΑΑΑΑΤΑ | TTTTATTTGG | CCTGTACTGC | ACACTTATAT | 18840 |
| ATATATACCT | TATAACAAAA | AACAGCGAAG | GGTATTATTT | CCTTGTGTCA | GATAAGATGC | 18900 |
| TATATGCAAT | AGTGATAAGC | ACTATTCTAT | GTCCATATTC | AAAATATGCT | ATTGAATACA | 18 96 0 |
| TAGCTTTTAA | CTTCATAAAG | AAAGATTTTT | TCGAAAGAAG | AAAAAACCTA | AATAACGCCC | 19020 |
| CCGTAGCAAA | ATTAAACCTA | TTTATGCTAT | ATAATCTACT | TTGTTTGGTC | CTAGCAATCC | 19080 |
| CATTTGGATT | GCTAGGACTT | TTTATATCAA | TAAAGAATAA | TTAAATCCCT | AACACCTCAT | 19140 |
| TTATAGTATT | AAGTTTATTC | TTATCAATAT | AGGAGCATAG | AA | 19182 |
OB MAD11131190
Claims (38)
1. Zmutowana transpozaza Tn5 zmieniona w stosunku do transpozazy Tn5 typu dzikiego, znamienna tym, że zawiera mutację typu podstawienia w pozycji 54; i mutację typu podstawienia w pozycji 372, przy czym zmutowana transpozaza ma większą zdolność wiązania z powtarzalnymi sekwencjami poza zewnętrznymi końcami Tn5 donorowego DNA i mniejszą zdolność do tworzenia multimerów niż transpozaza Tn5 typu dzikiego.
2. Transpozaza Tn5 według zastrz. 1, znamienna tym, że w pozycji 54 znajduje się lizyna.
3. Transpozaza Tn5 według zastrz.1, znamienna tym, że w pozycji 372 znajduje się prolina.
4. Transpozaza Tn5 według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ponadto mutację typu podstawienia w pozycji 56, przy czym taka zmutowana transpozaza pozbawiona jest aktywności hamującej.
5. Transpozaza Tn5 według zastrz. 4, znamienna tym, że w pozycji 56 znajduje się alanina.
6. Konstrukcja genetyczna, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową, która koduje zmodyfikowaną transpozazę Tn5 zmienioną w stosunku do transpozazy Tn5 typu dzikiego, zawierającą mutację typu podstawienia w pozycji 54; i mutację typu podstawienia w pozycji 372, przy czym zmutowana transpozaza ma większą zdolność wiązania z powtarzalnymi sekwencjami poza zewnętrznymi końcami Tn5 donorowego DNA i mniejszą zdolność do tworzenia multimerów niż transpozaza Tn5 typu dzikiego.
7. Konstrukcja genetyczna według zastrz. 6, znamienna tym, że w pozycji 54 znajduje się lizyna.
8. Konstrukcja genetyczna według zastrz. 6, znamienna tym, że pozycji 372 znajduje się prolina.
9. Konstrukcja genetyczna według zastrz. 6, znamienna tym, że sekwencja kodująca zmodyfikowaną transpozazę Tn5, zawiera ponadto mutację typu podstawienia w pozycji 56, przy czym taka zmutowana transpozaza pozbawiona jest aktywności hamującej.
10. Konstrukcja genetyczna według zastrz. 9, znamienna tym, że w pozycji 56 znajduje się alanina.
11. Konstrukcja genetyczna według zastrz. 6, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową, która koduje resztę lizyny w pozycji aminokwasowej 54 transpozazy oraz resztę proliny w pozycji aminokwasowej 372 transpozazy.
12. Konstrukcja genetyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową oznaczoną jako sekwencja nukleotydową o numerze identyfikacyjnym 1.
13. Układ do transpozycji in vitro sekwencji transpozycyjnego DNA, znamienny tym, że zawiera: zmutowaną transpozazę Tn5 zmodyfikowaną w stosunku do transpozazy Tn5 typu dzikiego, przy czym zmutowana transpozaza zawiera mutację typu podstawienia w pozycji 54 i mutację typu podstawienia w pozycji 372 i przy czym zmutowana transpozaza ma większą zdolność wiązania z powtarzalnymi sekwencjami poza zewnętrznymi końcami Tn5 donorowego DNA i mniejszą zdolność do tworzenia multimerów niż transpozaza Tn5 typu dzikiego; cząsteczkę donorowego DNA zawierającą transpozycyjną sekwencję DNA, przy czym sekwencja DNA jest flankowana na jej końcach 3' i 5' przez powtarzalne sekwencje poza zewnętrznymi końcami Tn5; i cząsteczkę docelowego DNA, do której można przenieść transpozycyjną sekwencję DNA.
14. Układ według zastrz. 13, znamienny tym, że w pozycji 54 znajduje się lizyna.
15. Układ według zastrz. 13, znamienny tym, że w pozycji 372 znajduje się prolina.
16. Układ według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera ponadto mutację typu podstawienia w pozycji 56, przy czym zmutowana transpozaza pozbawiona jest aktywności hamującej.
17. Układ według zastrz. 16, znamienny tym, że w pozycji 56 znajduje się alanina.
18. Układ według zastrz. 13, znamienny tym, że cząsteczka donorowego DNA jest flankowana przy jej końcach 3' i 5' przez flankującą sekwencję DNA o długości 18 lub 19 par zasad zawierającą w pozycji 10 nukleotyd A, w pozycji 11 nukleotyd T i w pozycji 12 nukleotyd A.
19. Układ według zastrz. 18, znamienny tym, że sekwencja flankująca zawiera ponadto w pozycji 4 nukleotyd wybrany z grupy składającej się z A lub T.
20. Układ według zastrz. 18, znamienny tym, że sekwencja flankująca zawiera ponadto w pozycji 15 nukleotyd wybrany z grupy składającej się z G lub C.
21. Układ według zastrz. 18, znamienny tym, że sekwencja flankująca zawiera ponadto w pozycji 17 nukleotyd wybrany z grupy składającej się z A lub T.
22. Układ według zastrz. 18, znamienny tym, że sekwencja flankująca zawiera ponadto w pozycji 18 nukleotyd wybrany z grupy składającej się z G lub C.
PL 193 220 B1
23. Układ według zastrz. 13, znamienny tym, że sekwencja flankująca ma sekwencję 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8) lub 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 9).
24. Sposób transpozycji in vitro, znamienny tym, że łączy się cząsteczkę donorowego DNA, która obejmuje transpozycyjną sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania, przy czym będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA jest flankowana przy jej końcach 3' i '5 przez sekwencje powtarzalne zewnętrznego końca Tn5; z cząsteczką docelowego DNA i zmutowaną transpozazą Tn5 zmodyfikowaną w stosunku do transpozazy Tn5 typu dzikiego w odpowiednim buforze reakcyjnym przez okres czasu wystarczający do katalizowania reakcji transpozycji in vitro; przy czym zmutowana transpozaza zawiera mutację typu podstawienia w pozycji 54 oraz mutację typu podstawienia w pozycji 372 i przy czym zmutowana transpozaza ma większą zdolność wiązania z sekwencjami powtarzalnymi poza zewnętrznymi końcami Tn5 niż transpozaza Tn5 typu dzikiego.
25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że w pozycji 54 znajduje się lizyna.
26. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że w pozycji 372 znajduje się prolina.
27. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że transpozaza zawiera ponadto mutację typu podstawienia w pozycji 56, przy czym zmutowana transpozaza pozbawiona jest aktywności hamującej.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że w pozycji 56 znajduje się alanina.
29. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA jest flankowana przy jej końcach 3' i 5' przez flankująca sekwencję DNA o długości 18 lub 19 par zasad zawierającą w pozycji nukleotyd A, w pozycji 11 nukleotyd T i w pozycji 12 nukleotyd A.
30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że sekwencja flankująca zawiera ponadto w pozycji 4 nukleotyd wybrany z grupy składającej się z A lub T.
31. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że sekwencja flankująca zawiera ponadto w pozycji 15 nukleotyd wybrany z grupy składającej się z G lub C.
32. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że sekwencja flankującą zawiera ponadto w pozycji 17 nukleotyd wybrany z grupy składającej się z A lub T.
33. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że sekwencja flankująca zawiera ponadto w pozycji 18 nukleotyd wybrany z grupy składającej się z G lub C.
34. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że sekwencja flankująca ma sekwencję 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8) lub 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 9).
35. Konstrukcja genetyczna, znamienna tym, że zawiera transpozycyjną sekwencję DNA flankowaną przy jej końcach 3' i 5' przez sekwencję DNA obejmującą 18 lub 19 par zasad zawierającą w pozycji 10 nukleotyd A, w pozycji 11 nukleotyd T i w pozycji 12 nukleotyd A, przy czym flankująca sekwencja DNA różni się w pozycji 4 od powtarzanej sekwencji poza zewnętrznymi końcami Tn5 typu dzikiego (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 7) i zawiera w tej pozycji nukleotyd T, G lub C i przy czym transpozycyjna sekwencja DNA tej konstrukcji ulega transpozycji przez transpozazę Tn5, jak określono w zastrzeżeniu 1.
36. Konstrukcja według zastrz. 3, znamienna tym, że w pozycji 4 znajduje się T lub A.
37. Konstrukcja według zastrz. 3, znamienna tym, że sekwencja flankująca ma sekwencję 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8).
38. Konstrukcja według zastrz. 3, znamienna tym, że sekwencja flankująca ma sekwencję 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 9).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/814,877 US5965443A (en) | 1996-09-09 | 1996-09-09 | System for in vitro transposition |
| US08/850,880 US5925545A (en) | 1996-09-09 | 1997-05-02 | System for in vitro transposition |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL332145A1 PL332145A1 (en) | 1999-08-30 |
| PL193220B1 true PL193220B1 (pl) | 2007-01-31 |
Family
ID=27123892
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL332145A PL193220B1 (pl) | 1996-09-09 | 1997-09-09 | Zmutowana transpozaza Tn5 zmieniona w stosunku do transpozazy Tn5 typu dzikiego, konstrukcje genetyczne, układ do transpozycji in vitro i sposób transpozycji in vitro |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5925545A (pl) |
| EP (1) | EP0927258B1 (pl) |
| JP (1) | JP4361971B2 (pl) |
| CN (1) | CN1163605C (pl) |
| AT (1) | ATE238422T1 (pl) |
| AU (1) | AU732130B2 (pl) |
| CA (1) | CA2265477C (pl) |
| DE (1) | DE69721282T2 (pl) |
| ES (1) | ES2195171T3 (pl) |
| PL (1) | PL193220B1 (pl) |
| RU (1) | RU2218406C2 (pl) |
| WO (1) | WO1998010077A1 (pl) |
Families Citing this family (106)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5925545A (en) * | 1996-09-09 | 1999-07-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation | System for in vitro transposition |
| US6022716A (en) | 1998-04-10 | 2000-02-08 | Genset Sa | High throughput DNA sequencing vector |
| US6159736A (en) * | 1998-09-23 | 2000-12-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for making insertional mutations using a Tn5 synaptic complex |
| US6299850B1 (en) | 1999-03-16 | 2001-10-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Energy | Carbon activation process for increased surface accessibility in electrochemical capacitors |
| US6562624B2 (en) | 1999-03-17 | 2003-05-13 | Paradigm Genetics, Inc. | Methods and materials for the rapid and high volume production of a gene knock-out library in an organism |
| JP2003502015A (ja) * | 1999-03-17 | 2003-01-21 | パラダイム ジェネティックス、 インコーポレイテッド | 生物中における遺伝子ノックアウトライブラリの迅速かつ大量産生のための方法類および素材類 |
| US6818441B1 (en) * | 1999-06-18 | 2004-11-16 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Vectors for improving cloning and expression in low copy number plasmids |
| US6406896B1 (en) * | 1999-08-02 | 2002-06-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Transposase enzyme and method for use |
| US7029842B2 (en) * | 2000-04-07 | 2006-04-18 | Novozymes A/S | Signal sequence trapping |
| WO2002004629A2 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-17 | Maxygen, Inc. | Molecular breeding of transposable elements |
| CA2431246A1 (en) * | 2000-12-05 | 2002-06-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Double transposition methods for manipulating nucleic acids |
| US7138267B1 (en) * | 2001-04-04 | 2006-11-21 | Epicentre Technologies Corporation | Methods and compositions for amplifying DNA clone copy number |
| US7262056B2 (en) * | 2001-11-08 | 2007-08-28 | Mirus Bio Corporation | Enhancing intermolecular integration of nucleic acids using integrator complexes |
| KR100459870B1 (ko) * | 2002-02-22 | 2004-12-04 | 한국과학기술원 | 트랜스포존과 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 방법을 이용하는 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주 제조방법 |
| FI20020746A (fi) * | 2002-04-18 | 2003-10-19 | Finnzymes Oy | Menetelmä ja materiaalit polypeptidien deleetiojohdannaisten tuottamiseksi |
| US20040235011A1 (en) * | 2002-06-26 | 2004-11-25 | Cooper Richard K. | Production of multimeric proteins |
| US20040172667A1 (en) * | 2002-06-26 | 2004-09-02 | Cooper Richard K. | Administration of transposon-based vectors to reproductive organs |
| US7527966B2 (en) * | 2002-06-26 | 2009-05-05 | Transgenrx, Inc. | Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector |
| US7316903B2 (en) * | 2003-03-28 | 2008-01-08 | United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Detection of nucleic acid sequence variations using phase Mu transposase |
| WO2004093645A2 (en) * | 2003-04-17 | 2004-11-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Tn5 transposase mutants and the use thereof |
| US8071364B2 (en) * | 2003-12-24 | 2011-12-06 | Transgenrx, Inc. | Gene therapy using transposon-based vectors |
| US20050214838A1 (en) * | 2004-03-10 | 2005-09-29 | Waclaw Szybalski | Methods for mapping and sequencing nucleic acids |
| WO2005100585A2 (en) | 2004-03-30 | 2005-10-27 | Epicentre | Methods for obtaining directionally truncated polypeptides |
| US20060294606A1 (en) * | 2004-05-18 | 2006-12-28 | Istefo Moisyadi | Tn5 transposase-mediated transgenesis |
| US7608434B2 (en) * | 2004-08-04 | 2009-10-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Mutated Tn5 transposase proteins and the use thereof |
| US8383345B2 (en) | 2008-09-12 | 2013-02-26 | University Of Washington | Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads |
| WO2010036979A2 (en) * | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Transgenrx, Inc. | Novel vectors for production of interferon |
| WO2010036976A2 (en) * | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Transgenrx, Inc. | Novel vectors for production of antibodies |
| US9157097B2 (en) * | 2008-09-25 | 2015-10-13 | Proteovec Holding, L.L.C. | Vectors for production of growth hormone |
| US9080211B2 (en) | 2008-10-24 | 2015-07-14 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
| EP2376517B1 (en) * | 2008-10-24 | 2013-01-16 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
| WO2010118360A1 (en) * | 2009-04-09 | 2010-10-14 | The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Production of proteins using transposon-based vectors |
| PT2556171E (pt) | 2010-04-05 | 2015-12-21 | Prognosys Biosciences Inc | Ensaios biológicos codificados espacialmente |
| US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
| US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| WO2011159942A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Illumina, Inc. | Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids |
| US8829171B2 (en) | 2011-02-10 | 2014-09-09 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| US9074251B2 (en) | 2011-02-10 | 2015-07-07 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| DK3037536T3 (da) | 2011-01-28 | 2020-01-13 | Illumina Inc | Oligonukleotiderstatning for di-taggede og retnings biblioteker |
| WO2012106546A2 (en) | 2011-02-02 | 2012-08-09 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Massively parallel continguity mapping |
| GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| US20150284768A1 (en) * | 2012-05-29 | 2015-10-08 | The Johns Hopkins University | Eukaryotic transposase mutants and transposon end compositions for modifying nucleic acids and methods for production and use in the generation of sequencing libraries |
| US9683230B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
| CA3094792A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-09-18 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| US9879313B2 (en) | 2013-06-25 | 2018-01-30 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
| US10287622B2 (en) | 2013-11-07 | 2019-05-14 | Agilent Technologies, Inc. | Plurality of transposase adapters for DNA manipulations |
| CN106414765A (zh) | 2013-12-20 | 2017-02-15 | Illumina公司 | 在片段化的基因组dna样品中保留基因组连接信息 |
| ES2819277T3 (es) | 2014-02-11 | 2021-04-15 | Hoffmann La Roche | Secuenciación dirigida y filtrado de UID |
| JP6490710B2 (ja) | 2014-04-15 | 2019-03-27 | イラミーナ インコーポレーテッド | 改善された挿入配列バイアスおよび拡大されたｄｎａインプット許容差のための修正トランスポザーゼ |
| WO2015189636A1 (en) | 2014-06-13 | 2015-12-17 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for preparing sequencing libraries |
| CN112430641A (zh) | 2014-06-30 | 2021-03-02 | 亿明达股份有限公司 | 使用单侧转座的方法和组合物 |
| BR112017007912A2 (pt) | 2014-10-17 | 2018-01-23 | Illumina Cambridge Limited | transposon de preservação de contiguidade |
| EP3222717B1 (en) * | 2014-11-18 | 2020-04-22 | OriCiro Genomics, Inc. | Method of amplifying circular dna |
| EP3259355B1 (en) | 2015-02-20 | 2020-11-25 | The Regents of the University of California | Methods related to dna sequencing |
| RU2020127887A (ru) | 2015-03-11 | 2020-10-02 | Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем | Полипептиды транспозазы и их применение |
| CN113186256A (zh) | 2015-04-10 | 2021-07-30 | 空间转录公司 | 生物样本的空间区别、多重核酸分析 |
| US10156025B2 (en) | 2015-05-04 | 2018-12-18 | University Of South Carolina | Monolithic heterogeneous single crystals with multiple regimes for solid state laser applications |
| US11453875B2 (en) | 2015-05-28 | 2022-09-27 | Illumina Cambridge Limited | Surface-based tagmentation |
| WO2016196358A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-12-08 | Epicentre Technologies Corporation | Methods of analyzing nucleic acids |
| CN108026575B (zh) | 2015-07-17 | 2022-08-19 | 哈佛学院董事及会员团体 | 扩增核酸序列的方法 |
| PT3334841T (pt) | 2015-08-12 | 2020-01-30 | Cemm Forschungszentrum Fuer Molekulare Medizin Gmbh | Métodos para estudar ácidos nucleicos |
| EP3485038B1 (en) | 2016-07-12 | 2020-12-23 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Primer extension target enrichment |
| WO2018027048A1 (en) | 2016-08-05 | 2018-02-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Second strand direct |
| US11021738B2 (en) | 2016-12-19 | 2021-06-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet tagging contiguity preserved tagmented DNA |
| CN106754811B (zh) * | 2016-12-21 | 2019-05-14 | 南京诺唯赞生物科技有限公司 | 一种突变型Tn5转座酶及其制备方法和应用 |
| CN108265101A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-10 | 天津强微特生物科技有限公司 | 一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法 |
| AU2018225503A1 (en) | 2017-02-21 | 2018-12-13 | Illumina Cambridge Limited | Tagmentation using immobilized transposomes with linkers |
| EP4060041B1 (en) | 2017-09-25 | 2023-12-27 | Fred Hutchinson Cancer Center | High efficiency targeted in situ genome-wide profiling |
| WO2019084055A1 (en) | 2017-10-23 | 2019-05-02 | Massachusetts Institute Of Technology | CLASSIFICATION OF GENETIC VARIATION FROM UNICELLULAR TRANSCRIPTOMS |
| EP3704247B1 (en) | 2017-11-02 | 2023-01-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Transposase-based genomic analysis |
| EP3841202B1 (en) | 2018-08-20 | 2023-10-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions |
| CN113286893A (zh) | 2018-08-28 | 2021-08-20 | 10X基因组学股份有限公司 | 生成阵列的方法 |
| US11519033B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-12-06 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
| JP2022513561A (ja) | 2018-11-30 | 2022-02-09 | イルミナ インコーポレイテッド | 単一アッセイを使用した複数の分析物の分析 |
| EP3894590A2 (en) | 2018-12-10 | 2021-10-20 | 10X Genomics, Inc. | Methods of using master / copy arrays for spatial detection |
| US20220195507A1 (en) | 2018-12-17 | 2022-06-23 | Illumina, Inc. | Methods and means for preparing a library for sequencing |
| US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| WO2020243579A1 (en) | 2019-05-30 | 2020-12-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
| KR20220031539A (ko) | 2019-07-12 | 2022-03-11 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 전기영동을 이용한 핵산 라이브러리 제조 |
| EP4025708A1 (en) | 2019-09-06 | 2022-07-13 | CeMM - Forschungszentrum für Molekulare Medizin GmbH | Method for sequencing rna oligonucleotides |
| EP4025711A2 (en) | 2019-11-08 | 2022-07-13 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
| FI3891300T3 (fi) | 2019-12-23 | 2023-05-10 | 10X Genomics Inc | Menetelmät spatiaalista analyysiä varten rna-templatoitua ligaatiota käyttäen |
| US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
| US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
| US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
| US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
| US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
| ES2965354T3 (es) | 2020-04-22 | 2024-04-12 | 10X Genomics Inc | Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana |
| WO2021236929A1 (en) | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
| AU2021275906A1 (en) | 2020-05-22 | 2022-12-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
| WO2021242834A1 (en) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | 10X Genomics, Inc. | Method for resetting an array |
| WO2021252499A1 (en) | 2020-06-08 | 2021-12-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
| EP4165207A1 (en) | 2020-06-10 | 2023-04-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for determining a location of an analyte in a biological sample |
| AU2021294334A1 (en) | 2020-06-25 | 2023-02-02 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of DNA methylation |
| US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
| US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
| WO2022140028A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
| AU2022212231A1 (en) | 2021-01-29 | 2023-08-03 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample |
| WO2023034489A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-03-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
| WO2023172514A1 (en) | 2022-03-07 | 2023-09-14 | Catamaran Bio, Inc. | Engineered immune cell therapeutics targeted to her2 and methods of use thereof |
| WO2023225519A1 (en) | 2022-05-17 | 2023-11-23 | 10X Genomics, Inc. | Modified transposons, compositions and uses thereof |
| WO2023225095A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Illumina Cambridge Limited | Preparation of size-controlled nucleic acid fragments |
| CN114774411B (zh) * | 2022-06-16 | 2022-10-21 | 序康医疗科技（苏州）有限公司 | 大片段dna环化连接方法 |
| WO2024003332A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Controlling for tagmentation sequencing library insert size using archaeal histone-like proteins |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5316946A (en) * | 1987-10-05 | 1994-05-31 | Washington University | DNA transposon TN5SUPF in plasmid pBRG1310 |
| US5925545A (en) * | 1996-09-09 | 1999-07-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation | System for in vitro transposition |
-
1997
- 1997-05-02 US US08/850,880 patent/US5925545A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 AU AU42620/97A patent/AU732130B2/en not_active Expired
- 1997-09-09 DE DE69721282T patent/DE69721282T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 CA CA002265477A patent/CA2265477C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 JP JP51299798A patent/JP4361971B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 ES ES97940955T patent/ES2195171T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 WO PCT/US1997/015941 patent/WO1998010077A1/en active IP Right Grant
- 1997-09-09 PL PL332145A patent/PL193220B1/pl unknown
- 1997-09-09 RU RU99107555/13A patent/RU2218406C2/ru active
- 1997-09-09 AT AT97940955T patent/ATE238422T1/de active
- 1997-09-09 EP EP97940955A patent/EP0927258B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-09 CN CNB971977518A patent/CN1163605C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-06 US US08/944,916 patent/US5948622A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-03-19 US US09/272,432 patent/US6437109B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5948622A (en) | 1999-09-07 |
| EP0927258A1 (en) | 1999-07-07 |
| US6437109B1 (en) | 2002-08-20 |
| ES2195171T3 (es) | 2003-12-01 |
| AU732130B2 (en) | 2001-04-12 |
| US5925545A (en) | 1999-07-20 |
| RU2218406C2 (ru) | 2003-12-10 |
| JP4361971B2 (ja) | 2009-11-11 |
| ATE238422T1 (de) | 2003-05-15 |
| CA2265477C (en) | 2007-03-20 |
| DE69721282T2 (de) | 2003-12-18 |
| CN1163605C (zh) | 2004-08-25 |
| CA2265477A1 (en) | 1998-03-12 |
| CN1251135A (zh) | 2000-04-19 |
| EP0927258B1 (en) | 2003-04-23 |
| AU4262097A (en) | 1998-03-26 |
| JP2001507565A (ja) | 2001-06-12 |
| WO1998010077A1 (en) | 1998-03-12 |
| PL332145A1 (en) | 1999-08-30 |
| DE69721282D1 (de) | 2003-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU732130B2 (en) | System for in vitro transposition using modified Tn5 transposase | |
| KR102127418B1 (ko) | 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환을 통해 글리포세이트-내성 벼를 수득하는 방법 | |
| KR102417127B1 (ko) | 대형 유전자 절제 및 삽입 | |
| JP2021166513A (ja) | 配列操作のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ成分系、方法および組成物 | |
| Sauer et al. | Cre-stimulated recombination at loxP-containing DNA sequences placed into the mammalian genome | |
| CA2940217C (en) | Compositions and methods for site directed genomic modification | |
| JP6665088B2 (ja) | 配列操作のための最適化されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ二重ニッカーゼ系、方法および組成物 | |
| JP5902631B2 (ja) | 標的化ゲノム変更 | |
| RU2701662C9 (ru) | Компоненты системы crispr-cas, способы и композиции для манипуляции с последовательностями | |
| KR20210149686A (ko) | 유전자 편집에 유용한 폴리펩티드 및 사용 방법 | |
| Thomson et al. | PhiC31 recombination system demonstrates heritable germinal transmission of site-specific excision from the Arabidopsis genome | |
| US20080241915A1 (en) | Dna cloning vector plasmids and methods for their use | |
| KR20200119239A (ko) | 코리네박테리움에서 crispr을 사용하는 게놈 편집 | |
| Xiao et al. | Intrachromosomal homologous recombination in Arabidopsis induced by a maize transposon | |
| US20030175968A1 (en) | Gene targeting method | |
| EP1259600A2 (en) | Gene targeting method | |
| Nishizawa-Yokoi et al. | A universal system of CRISPR/Cas9-mediated gene targeting using all-in-one vector in plants | |
| Goguel et al. | Connections between RNA splicing and DNA intron mobility in yeast mitochondria: RNA maturase and DNA endonuclease switching experiments | |
| US20230147287A1 (en) | Genome engineering method and genome engineering kit | |
| EP4243608A1 (en) | Fusion protein for editing endogenous dna of a eukaryotic cell | |
| Urawa et al. | Enhanced homologous recombination caused by the non-transcribed spacer of the rDNA in Arabidopsis | |
| JP2021164447A (ja) | ゲノム改変方法及びゲノム改変キット | |
| Yamauchi et al. | Gene targeting in crop species with effective selection systems | |
| Kumar et al. | Gene targeting: development of novel systems for genome engineering in plants | |
| Kuang | Studies of site-specific DNA double strand break repair in plants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |