KR20060015612A - 아실 캐리어 단백질을 기본으로 한 단백질 라벨링 방법 - Google Patents

아실 캐리어 단백질을 기본으로 한 단백질 라벨링 방법 Download PDF

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Abstract

다양한 상이한 라벨로 아실 캐리어 단백질(ACP) 융합 단백질을 라벨링하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소(ACPS) 또는 그의 상동체를 사용하여, 조효소 A형 기질로부터 ACP 융합 단백질로 라벨을 전달하는 것을 기초로 한다. 이 방법은 새로운 물리적 또는 화학적 특성을 융합 단백질에 도입하는 융합 단백질에 분자를 부착시키는 것에 의해 체외 및 체내 모두에서 융합 단백질을 검출 및 조작하는 것을 가능하게 한다. 이러한 라벨의 예는 그 중에서도 분광학적 프로브 또는 리포터 분자, 친화성 태그, 반응성 라디칼을 생성하는 분자, 가교제, 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 리간드 또는 융합 단백질의 고정화에 적합한 분자를 포함한다.
아실 캐리어 단백질(ACP), 조효소 A, 융합 단백질, 라벨링

Description

아실 캐리어 단백질을 기본으로 한 단백질 라벨링 방법{Methods for protein labeling based on acyl carrier protein}
본 발명은 기질로부터 목적하는 단백질 및 아실 캐리어 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질로 라벨을 전달하는 방법, 특히 라벨링된 융합 단백질을 검출 및/또는 조작하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
복잡한 생물학적 계를 이해하는데 있어서 진보는 생분자, 특히 단백질의 특징적인 상호작용에 좌우된다. 다수의 생물의 DNA 서열결정으로 그들의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 밝혀지는 한편, 체내 및 체외에서 상응하는 단백질을 특징화 하는 가능성은 제한되고 있다. 이러한 목적을 실현하기 위한 대부분의 전략은 체외 적용을 위한 융합물의 정제를 가능하게 하거나 체내에서 단백질을 추적을 가능하게하는 융합 단백질의 작성을 기본으로 하고 있다. 이러한 태그의 예는 6xHis 태그, 글루타치온 S 트랜스퍼라제, 말토오스 결합 단백질, 항원결정인자 태그, 효모-2 하이브리드 계, O6-알킬구아닌-DNA 알킬트랜스퍼라제, 스필트(spilt)-유비퀴틴, 및 녹색 형광 단백질(GFP) 융합 단백질을 포함한다. 그러나, 이들 수법 전부는 다양한 제한이나 결점을 갖는다.
게링 등(1997) 및 람바로트와 월쉬(1995)는 체외에서 보조인자 4'-포스포판테테인(P-pant)을 보존되는 세린 잔기에 부착시켜 홀로-ACP를 얻는 것에 의해 아포-아실 캐리어 단백질(apo-ACP)의 번역후 변형(modification)을 촉진하는 대장균 홀로 아실 캐리어 단백질 합성효소(ACPS)의 사용을 개시하고 있다. P-pant의 공급원은 조효소 A이다. 게링 등(1997)은 또한 P-pant 부위에서 변형되어 있지만 여전히 ACPS에 대한 기질로 작용할 수 있는 조효소 A 유사체(analog)를 사용하는 것에 의해 변형된 P-pant를 보조인자로 갖는 홀로-ACP를 얻는다고 개시하고 있다.
ACPS와 같은 분리된 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제는 국제특허출원 WO97/13845호에 기재되어 있다.
라벨을 O6-알킬구아닌-DNA 알킬트랜스퍼라제(AGT)에 전달하는 방법, 및 AGT 융합 단백질을 검출하기 위한 상기 방법의 용도는 국제 특허출원 WO 02/083937호에 기재되어 있다.
발명의 요약
본 발명은 목적하는 단백질 및 아실 캐리어 단백질(ACP) 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질을, 라벨링된 조효소 A(CoA)형 기질 및 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소(ACPS) 또는 그의 상동체와 접촉시켜 ACPS가 라벨을 융합 단백질에 전달하도록 하고, 또 경우에 따라, 상기 라벨을 인식하고 및/또는 취급하도록 고안된 계에서 상기 라벨을 사용하는 것에 의해 상기 라벨링된 융합 단백질을 검출 및/또는 조작하는 것을 포함하는, 목적하는 단백질의 검출 및/또는 조작방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 목적하는 단백질 및 ACP 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질의 상기 방법에서의 용도에도 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 목적하는 단백질을 정제하거나 고정화하기 위해서, 또는 본 발명의 방법에서 단백질에 부착된 라벨로 인하여 목적하는 단백질을 체외 또는 체내에서 연속적으로 모니터링하기 위해 사용된다.
본 발명의 융합 단백질에 혼입된 목적하는 단백질은 어떤 종류라도 좋으며, 임의 길이이고 2차, 3차 또는 4차 구조를 갖거나 갖지 않는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드를 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용된 특정 라벨링된 조효소 A(CoA)형 기질은, 라벨의 추가 부착을 위한 1 이상의 반응성 부위를 갖는 링커, 즉 검출가능한 마커의 부착에 의해 CoA 또는 변형된 CoA로부터 얻을 수 있다. 본 발명은 이러한 신규 라벨링된 조효소 A(CoA)형 기질, 그의 제조방법, 이러한 신규 CoA 형 기질의 합성에 유용한 중간체, 및 본 발명의 방법에서 이들의 용도에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 목적하는 단백질 및 아실 캐리어 단백질(ACP) 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질을, 라벨링된 조효소 A(CoA)형 기질 및 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소(ACPS) 또는 그의 상동체와 접촉시켜 ACPS가 라벨을 융합 단백질에 전달하도록 하고, 또 경우에 따라, 상기 라벨을 인식하고 및/또는 취급하도록 고안된 계에서 상기 라벨을 사용하는 것에 의해 상기 라벨링된 융합 단백질을 검출 및/또는 조작하는 것을 포함하는, 목적하는 단백질의 검출 및/또는 조작방법에 관한 것이다.
ACP 또는 ACP 도메인은 지방산, 폴리케티드의 생합성 및 비-리보솜 펩티드 합성에서 캐리어로 작용한다. ACP는 조효소 A로부터 ACP의 보존된 세린 잔기로 4-포스포판테테인 보조인자를 전달하는 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소(ACPS)에 의해 번역후 변형된다. ACPS는 또한 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제로도 불린다. ACPS는 CoA의 포스포판테테이닐 잔기의 티올 기에서 CoA의 변형에 관련된 비교적 낮은 기질 특이성을 갖고 있음이 밝혀졌다. 이를 이용하여, ACP 융합 단백질은 포스포판테테이닐 잔기를 통하여 라벨을 이동시키는 CoA 유도체 및 ACPS와의 배양에 의하여 특이적으로 라벨링될 수 있다. 상기 라벨은 포스포판테테이닐 잔기와 함께 ACP의 보존된 세린 잔기에 전달된다. 이 라벨링은 융합 단백질의 성질과는 독립적이다.
여기서 말하는 용어 ACP 및 ACPS는 2개중의 하나(ACP)가 CoA 유도체로부터 기인한 포스포판테테이닐 유도체에 대한 수용체이고 또 나머지 하나(ACPS)는 포스포판테테이닐 유도체를 상기 ACP에 전달하는 것을 촉진시키는 단백질 쌍을 의미한다.
용어 ACPS 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제는, 대장균(E.coli)로부터 얻은 ACPS와 상동인 다수의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제가 지방산 합성에 관여하지 않고 오히려 천연산물의 생합성에 관여하는 단백질을 변형하는 사실에도 불구하고 여기서는 상호교환하여 이용할 수 있다(Lambalot et al., 1996). 이러한 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제의 예는 다음과 같다: 엔테로박틴 합성에 관여하는 EntD; 서팍틴 생합성에 관여하는 Sfp 및 Psf-1; 그라미디신 S 생합성에 관여하는 Gsp; 리신 생합성에 관여하는 LYS5; 바시트라신 생합성에 관여하는 Bli; 이투린 A 생합성에 관여하는 Lpa-14; 및 노시헵티드 생합성에 관여하는 NshC. 본 발명은 대장균으로부터 얻은 ACPS와 상동인 라벨링 도식에서 모든 ACPS의 용도를 포함한다.
용어 ACP는 대장균으로부터 얻은 ACPS에 의해 번역후 포스포판테테이닐화될 수 있는 단백질 또는 람바로트 등(1996)에 의해 정의된 바와 같이 대장균으로부터 ACPS에 상동인 ACPS를 의미한다. 이것은 지방산 합성에 관여할 뿐만 아니라 폴리케티드 합성, 비-리보솜 펩티드 합성, 아미노산 합성 및 뎁시펩티드 합성에 관여하는 단백질을 포함한다. ACPS에 의해 번역후 변형 이외에, 이들 단백질은, 상이한 기질과 함께 아실-판테테이닐 티올에스테르를 형성하는 점 및 상기 포스포판테테이닐 잔기가 세린 잔기에 부착되는 점에서 공통점을 갖는다. 이들의 자연적 작용으로, ACP는 다작용성 효소의 도메인(타입 1 지방산 합성효소) 또는 별도의 단백질(타입 II 지방산 합성효소)일 수 있다.
"검출한다"는 것은 라벨을 관찰하도록 고안된 계에서 라벨의 특성을 기본으로 하여 라벨과 라벨에 부착된 목적하는 단백질을 관찰하는 것을 의미하는 것이며, 특정 라벨을 인식하고, 라벨의 특성으로 인하여 특정 환경에서 라벨을 찾고, 경우에 따라 라벨 및 그에 부착된 단백질의 양을 정량하고, 또 라벨의 미세환경의 특성을 결정하는 것을 포함한다.
"조작한다"는 것은 라벨과 그에 부착된 목적하는 단백질의 취급을 의미하며, 또 라벨을 취급하도록 고안된 계에서 라벨의 특성을 기본으로 하여 그에 부착된 목적하는 단백질 및 라벨의 취급을 포함하며, 또 화학적 또는 생물학적 환경으로부터 분리하고, 다른 화학적 또는 생물학적 환경으로 도입하며, 정제하는, 즉 원하지 않는 부 생성물과 불순물을 분리하고, 라벨과 고체 캐리어의 반응에 의한 고정화, 화학적 또는 생물학적 시약과 접촉시켜 라벨 및/또는 목적하는 단백질의 특성을 변형시키는 등을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법은 다양한 용도에 적용될 수 있으며 일반적으로 (1) 라벨링된 융합 단백질의 환경에서 변화를 감지하고 유발할 수 있는 라벨, (2) 라벨에 의해 특이적으로 융합 단백질에 도입된 물리적 및/또는 화학적 특성에 의해 융합 단백질을 조작하는데 도움을 주는 라벨 및/또는 (3) 라벨에 의해 도입된 특성을 통하여 융합 단백질의 정제에 도움을 주는 라벨과 융합 단백질을 특이적으로 공유결합적으로 라벨링할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법은 체외 및 체내, 예컨대 세포에서 ACP 융합 단백질을 라벨링하기 위해 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 이러한 방법에서 목적하는 단백질 및 ACP 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질의 용도에도 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 목적하는 단백질을 정제하거나 고정화하기 위해, 또는 본 발명의 방법에서 단백질에 부착된 라벨로 인하여 체외 또는 체내에서 목적하는 단백질을 연속적으로 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
일례로서, 본 발명은 목적하는 단백질 및 아실 캐리어 단백질(ACP) 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질을, 라벨링된 조효소 A(CoA) 형 기질 및 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소(ACPS) 또는 그의 상동체와 접촉시켜 ACPS가 라벨을 융합 단백질에 전달하고 그 라벨은, 라벨을 인식하도록 고안된 계에서, 관찰되는 것을 특징으로하는, 체외 또는 체내에서 목적하는 단백질을 연속적으로 모니터링하기 위한 방법을 제공한다.
다른 요지로서, 본 발명은 목적하는 단백질 및 아실 캐리어 단백질(ACP) 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질을, 라벨링된 조효소 A(CoA)형 기질 및 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소(ACPS) 또는 그의 상동체와 접촉시켜서 ACPS가 라벨을 융합 단백질로 전달하고 또 융합 단백질이 라벨의 물리적 및/또는 화학적 특성을 기초로 하여 조작되는 것을 특징으로 하는, 체내 또는 체외에서 목적하는 단백질을 조작하는 방법을 제공한다.
특히 다른 요지로서, 라벨의 물리적 및/또는 화학적 특성은 라벨링된 융합 단백질의 효과적인 정제를 가능하게 하며, 또 본 발명은 정제하기 위해 라벨의 물리적 및/또는 화학적 특성을 이용하고 융합 단백질을 절단한 다음 목적하는 순수한 단백질을 제공하는 본 발명의 방법 단계를 실시함으로써 목적하는 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.
다른 요지로서, 본 발명은 목적하는 단백질 및 아실 캐리어 단백질(ACP) 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질을 고체 지지체상에 고정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 융합 단백질을 고체 지지체에 부착되어 있거나 부착될 수 있는 라벨링된 조효소 A(CoA)형 기질과 접촉시키는 것을 포함하며, 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소(ACPS)가 라벨을 전달하여 고체 지지체에 부착되어 있거나 부착될 수 있는 ACP 융합 단백질에 공유결합적으로 결합되게 한다. 라벨이 고체 지지체에 먼저 부착되지 않은 본 발명의 특별한 구체예로서, 이 방법은 라벨링된 ACP 융합 단백질을 고체 지지체와 접촉시켜서 고체 지지체상에 고정되도록 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 바람직한 구체예로서, 라벨이 전달되거나 뒤이은 반응에서 전달될 때, 라벨은 고체 지지체에 공유결합적으로 부착될 수 있거나, 또는 특정 결합쌍의 일원일 수 있고, 다른 구성원은 공유결합적으로 또는 다른 수단에 의해, 예컨대 비오틴과 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 특정 결합을 이용하여 고체 지지체에 부착되어 있거나 부착될 수 있다.
다른 요지로서, 본 발명은 체내 뿐만 아니라 체외에서 ACP 융합 단백질을 라벨링하기 위한 방법을 제공한다. 용어 ACP 융합 단백질의 체내 라벨링은 세포뿐만 아니라 세포외 공간에 해당되는 ACP 융합 단백질의 모든 구획에서 라벨링을 포함한다. ACP 융합 단백질의 라벨링이 체내에서 실시되고 ACP에 융합된 단백질이 플라즈마 막 단백질이면, 융합 단백질의 ACP 부분은 플라즈마 막의 세포질 또는 세포외측에 부착될 수 있다. 라벨링이 체외에서 실시되면, 융합 단백질의 라벨링은 세포 추출액에서 실시되거나 또는 ACP 융합 단백질의 정제 또는 농축 형태를 사용하여 실시될 수 있다.
본 발명은 라벨을 소망하는 단백질에 특정 부착하는 것은 목적하는 단백질 및 아실 캐리어 단백질(ACP) 또는 그의 단편 사이의 융합 단백질을 작성하는 것에 의해 실시할 수 있다는 자각을 기초로 한다.
바람직하게는, 상기 아실 캐리어 단백질 또는 "ACP"는, 라벨링된 4'-포스포판테테인이 적합한 조효소 A("CoA")로부터 ACP의 세린 잔기로 또는 융합 단백질의 일부를 형성하는 그의 단편으로 전달되는 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소 또는 "ACPS"에 의해 변형된다. 바람직한 구체예로서, ACP는 예컨대 로울링 및 크로난에 의해 1992년 기재된 대장균 아실 캐리어 단백질이며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 그러나, 다른 아실 캐리어 단백질(ACP)도 공지되어 있고 또 본 발명에 사용될 수 있으며, 예컨대 게링 등에 의해 1997년 기재된 스트렙토마이세스(Streptomyces)종으로부터 얻은 ACP, 또는 적합한 라벨링된 CoA의 존재하에서 상기와 같이 정의된 ACPS에 의해 특성이 변형된 다른 ACP를 들 수 있다. 본 발명에서, ACP는 1개 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가로 인하여 상이할 수 있지만, ACPS에 의해 촉진되는 반응에서, 라벨링된 4'-포스포판테테인에 대한 수용체로서 작용하는 특성을 그대로 유지하는 야생형 ACP의 변이체를 포함한다. ACP의 다른 변이체는 당업자에게 공지된 수법을 이용하여 화학적으로 변형될 수 있다. ACP 변이체는 당업자에게 공지된 단백질 유전공학 수법 및/또는 ACPS에 의해 촉진된 반응에서 라벨링된 4'-포스포판테테인에 대한 신규 수용체 서열을 생성하고 선택하기 위한 분자 발생학을 이용하여 제조할 수 있다. ACP 단편은 포스포판테테인 유도체가 부착되는 세린 잔기를 함유하는 것으로 이러한 포스포판테테인 유도체를 수용하는 작용을 유지한다.
바람직한 구체예로서, ACPS는 예컨대 람바로트 및 월쉬에 의해 1995년 기재된 대장균 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소이며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다. 그러나, 람바로트 등에 의해 1996년 기재된 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis(고초균))으로부터 얻은 ACPS, 또는 적합하게 라벨링된 CoA의 존재하에서 상기 기재된 바와 같은 ACP를 변형하는 특성을 갖도록 제공된 본 발명에서 적용될 수 있는 단백질 형태와 같이 다른 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소도 공지되어 있다. 이들 ACPs는 람바로트 등에 의해 1996년 기재된 바와 같이 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제로서 공지되어 있고 또 본 발명은 일반적 종류의 효소의 사용을 포함한다. 본 발명에서, 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소는 1 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 상이할 수 있지만, 라벨링된 4'-포스포판테테인을 특이적으로 ACP 융합 단백질에 전달하는 특성을 여전히 유지하는 야생형 ACPS의 변이체를 포함할 수 있다. ACPS의 다른 변이체는 당업자에게 잘 공지된 수법을 이용하여 화학적으로 변형될 수 있다. ACPS 변이체는 당업자에게 공지된 단백질 유전자조작 수법 및/또는 라벨링된 4'-포스포판테테인을 상이한 수용체 서열에 전달하기 위한 신규 특이성을 생성하여 선택하기 위한 분자 발생법을 이용하여 제조할 수 있다.
ACPS에 의해 ACP 융합 단백질을 라벨링하기 위해, 많은 사항을 고려해야한다. 가장 중요하게는, ACP 융합 단백질의 라벨링은 라벨링하기 전에 아포 형태의 ACP 융합 단백질의 ACP 일부의 존재에 좌우된다. ACP 융합 단백질이 번역후 변형용 기질로서 상기 ACP 융합 단백질을 수용하는 내생성 ACPS를 보유하는 숙주에서 발현되면, 상기 ACP 융합 단백질은 적어도 부분적으로 소망하는 변형에 대해 차단될 수 있다. 상기와 같은 ACP 융합 단백질의 원하지 않는 변형을 최소화하기 위해 상이한 용액이 제안된다. 첫째, 숙주의 ACPS에 의해는 효과적으로 변형되지 않는 ACP를 선택하고, 즉 ACP는 숙주의 생화학과 무관하다(orthogonal). 예컨대 대장균으로부터 얻은 ACP는 숙주세포에서 융합 단백질로 발현될 때 인간의 ACPS에 의해 상당한 정도로 변형되지 않는다(도 3 참조). 둘째, ACP 융합 단백질의 과발현은 ACP 융합 단백질에서 아포-ACP의 우세한 형성을 초래할 것이다. 예컨대 대장균으로부터 얻은 6xHis-ACP의 대장균에서의 과발현은, 내생성 ACPS가 이들 세포에 존재하긴 하지만 대부분 6xHis-ACP에서 apo-ACP의 형성을 초래한다.
라벨링 반응의 경우, ACP 융합 단백질은 상응하는 ACPS 및 CoA 유도체 모두와 접촉해야한다. 이것은 체내 적용의 경우 ACP 융합 단백질이 세포의 표면에 존재하거나 또는 ACPS 및 CoA 유도체는 이러한 미량주입법과 같은 수법을 이용하여 목적하는 세포에 도입한다는 것을 의미한다.
본 발명에서, ACP를 갖는 융합 단백질의 단백질 부분에 관해서는 단백질, 폴리펩티드 및 소정 길이의 펩티드를 포괄하여 의미하며 2차, 3차 또는 4차 구조를 갖거나 갖지 않으며, 바람직하게는 적어도 12개 아미노산에서 2000개 아미노산, 바람직하게는 50 내지 1000개 아미노산으로 구성된다. 본 발명에 따른 목적하는 단백질은 효소, DNA-결합 단백질, 전사 조절 단백질, 막 단백질, 핵 수용체 단백질, 핵 편재화 시그널 단백질, 단백질 보조인자, 항체, 막 펌프 단백질, 막 채널 단백질, 막 캐리어 단백질, 모터 단백질, 시그널 도입에 관련된 단백질, 핵 단백질, 리보솜 단백질, 작은 단량체성 GTPase, ATP-결합 카세트 단백질, 세포내 구조 단백질, 특정 세포 구획에 단백질을 표적화하는데 관련된 서열을 갖는 단백질, 라벨이나 친화성 태그로서 일반적으로 사용되는 단백질 및 상술한 단백질의 도메인 또는 서브도메인을 포함한다. ACP 융합 단백질은 1 이상, 예컨대 ACP의 N-, C- 또는 N- 및 C-말단에서 ACP에 융합된 목적하는 단백질 1개, 2개 또는 3개로 구성될 수 있다.
보다 특히, 본 발명에 따른 목적하는 단백질은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:
효소, 예컨대 트랜스퍼라제(EC 2), 보다 자세하게는 메틸기 이외의 알킬 또는 아릴기를 전달하는 트랜스퍼라제(EC 2.5), 특히 글루타치온 트랜스퍼라제(EC 2.5.1.18),
또는 키나제, 즉 인 함유 기를 전달하는 트랜스퍼라제(EC 2.7), 특히 세린 및 트레오닌을 기질 단백질에 있는 포스포릴화된 표적 부위로 갖는 단백질 키나제와 같은 알코올기를 억셉터로 갖는 키나제(EC 2.7.1), 예컨대 효모로 부터 얻은 카제인 키나제(EC 2.7.1.37), 또는 티로신 단백질 키나제(EC 2.7.1.112);
또는 예컨대 옥시도리덕타아제(EC 1), 보다 자세하게는 퍼옥시드상에서 수용체로 작용하는 옥시도리덕타아제(EC 1.11), 특히 효소 사이토크롬 C 퍼옥시다아제(EC 1.11.1.5);
또는 가수분해효소(EC 3), 보다 자세하게는 에스테르 결합에 작용하는 가수분해효소(EC 3.1), 특히 단백질 포스포르 모노에스테르 가수분해효소와 같은 포스포르 모노에스테르 가수분해효소(EC 3.1.3); 또는 펩티다제 또는 프로테아제(EC 3.4)로 공지된 펩티드 결합을 가수분해하는 가수분해효소, 특히 카스파제;
DNA-결합 단백질, 보다 자세하게는 mRNA 합성을 억제하는 단백질 인자인 전사 리프레서 단백질, 특히 대장균에서 mRNA 합성을 억제하는 단백질 인자, 특히 LexA 단백질의 DNA-결합 도메인;
전사 조절 단백질, 보다 자세하게는 전사 리프레서 단백질, 특히 트립토판/아스파테이트 반복 구조를 함유하는 전사 리프레서 단백질,
막 단백질, 예컨대 1 이상의 트랜스막 헬릭스를 나타내는 막 단백질, 보다 자세하게는 소포체(ER) 막으로 부터 얻은 막 단백질, 특히 ER 트랜스막 단백질 Sec62와 같은 ER로의 단백질 전위에 활성인 막 단백질;
또는 예컨대 7-트랜스막 헬릭스(7-TM) 단백질 패밀리(보다 자세하게는 7-TM 단백질은 G-단백질 결합된 수용체(GPCR)임), 특히 포유류, 예컨대 인간의 뉴로키닌-1-수용체(NK1)와 같은 1kDa 이상의 분자량을 갖는 고분자 리간드를 결합하는 단백질;
또는 예컨대 세포막으로 부터 얻은 트랜스막 이온 채널 단백질, 특히 리간드 게이트화된 이온 채널 단백질, 보다 자세하게는 세로토닌 수용체 5-HT3과 같은 세로토닌리간드에 대하여 민감한 게이트화된 이온 채널 단백질;
또는 예컨대 이온 채널 및 G-단백질 결합된 수용체 이외의 막 수용체;
또는 예컨대 특히 단백질 Pex15와 같은 효모로 부터 얻은 퍼옥시조말 막 단백질;
핵 수용체 단백질, 예컨대 전사 인자의 패밀리로 부터 얻은 핵 수용체 단백질, 보다 자세하게는 리간드 유도성 전사인자로 부터 얻은 핵 수용체 단백질, 인간 에스트로겐 수용체 hER과 같은 에스트로겐 수용체 등의 스테로이드 패밀리로 부터 얻은 핵 수용체;
시미안 바이러스(Simian Virus) 40 (SV40)으로 부터 얻은 핵 편재화 신호와 같은 핵 편재화 신호 단백질;
단백질 보조인자, 예컨대 자신의 유전자 구조에서 유비퀴틴 서열을 함유하는 단백질;
소형 단량체 GTPase, 보다 자세하게는 막-부착성 소형 단량체 GTPase, 예컨대 Ras 패밀리의 구성원;
ATP-결합 카세트(ABC) 단백질, 예컨대 다약제 내성 단백질;
세포내 구조 단백질, 보다 자세하게는 세포골격(cytoskeleton) 단백질, 보다 자세하게는 인간의 세포질 β-액틴;
특정 세포 부분(compartment), 예컨대 골지체, 소포체(ER), 미토콘드리아, 원형질막 또는 퍼옥시좀으로 단백질을 보내기 위한 서열을 갖는 단백질;
라벨 또는 치환성 태그로 일반적으로 사용되는 단백질, 예컨대 UV 또는 가시 방사선에 의해 여기되면 형광 신호를 나타내는 형광 단백질, 특히 향상된 시아노 형광 단백질(ECFP)로 공지된 형광 단백질과 같은 그린 형광 단백질(GFP);
및 상술한 단백질의 도메인 또는 서브도메인(subdomain).
또한 본 발명에 따른 단백질은 공급원에 따라 선택한다. 특히, 중요한 단백질은 세균 종, 예컨대 살모넬라, 보다 자세하게는 살모넬라 티피(salmonella typhi) 또는 살모넬라 티피무륨(salmonella typhimurium), 마이코박테리아(mycobacteria), 보다 자세하게는 마이코박테륨 튜버쿨렌시스(mycobacteria tuberculensis) 또는 스타필로커치(staphylococci), 보다 자세하게는 스타필로코커스 아우레우스(staphylococcus aureus)에 존재하는 단백질, 또는 바이러스 공급원, 예컨대 인간의 면역결핍 바이러스(HIV), 인간의 인플루엔자 바이러스, 간염 바이러스, 또는 코로나 바이러스로 부터 얻은 단백질이다.
또한 목적하는 단백질은 암, 심장혈관 질환, 정신병, 알츠하이머, 비만, 바이러스 감염 및 세균 감염과 같은 특정 질병에서 그의 역할에 따라 선택한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 융합 단백질은 한편은 대장균 ACP 또는 이러한 ACP DNA의 변이체 및 ACP DNA 서열의 N-말단(N) 또는 C-말단(C)측 또는 N- 및 C-말단측에 부착된 (상술한 바와 같은) 목적하는 단백질을 암호화하는 서열로 제조되어 본 발명의 융합 단백질을 생성한다. 융합 단백질은 또한 적합한 링커, 예컨대 적합한 조건하에서 효소 분해되기 쉬운 링커를 ACP와 목적하는 단백질 사이에 및/또는 융합 단백질중의 2개의 목적하는 단백질 사이에 함유할 수 있다. 이러한 링커의 예는 적합한 제한 효소에 의해 DNA 단계에서 분해될 수 있는 링커, 예컨대 Bgl II에 의해 분해될 수 있는 AGATCT 및/또는 단백질 단계에서 적합한 효소에 의해 분해될 수 있는 링커, 예컨대 담배 식각 바이러스 NIa(TEV) 프로테아제이다.
융합 단백질은 원핵생물 숙주, 바람직하게는 대장균, 또는 진핵생물 숙주, 예컨대 효모, 진균, 곤충 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다.
본 발명은 목적하는 단백질 및 ACP 또는 그의 단편을 포함하는 신규 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명에서, 라벨링된 CoA형 기질은 바람직하게는 하기 화학식(I) 또는 하기 화학식(II)로 표시되는 라벨링된 조효소 A 유도체이다:
Figure 112005066804508-PCT00001
Figure 112005066804508-PCT00002
식중에서,
R은 조효소 A 및 라벨을 연결하는 링커 기이고; 또 "라벨"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 검출, 정제 및/또는 조작하는데 적합한 라벨 분자임.
그러나, 본 발명은 라벨을 ACP 융합 단백질에 전달하는데에는 다양한 범위의 다른 기질이 사용될 수 있기 때문에 상기 화학식(I) 또는 (II)의 기질에 한정되지 않는다. 예컨대, 화학식(I)의 화합물의 퓨린 부분의 치환, 당 잔기의 변형 또는 판토테테이닐산 잔기의 변형을 고려할 수 있다.
화학식(I) 또는 (II)의 화합물중의 링커 기 R은 라벨을 조효소 A에 연결하는 유연성 링커이다. 링커 유닛은 생각한 용도, 즉 ACP를 포함하는 융합 단백질에 라벨을 전달하는 것을 고려하여 선택한다. 이들은 또한 적합한 용매에서 기질의 용해도를 증가시킨다. 사용된 링커는 실제 적용 조건하에서 화학적으로 안정하다. 링커 R은 ACP와의 반응을 방해하지도 않을 뿐만 아니라 라벨의 검출도 방해하지 않지만, ACP를 포함하는 융합 단백질을 사용하여 조효소 A형 기질을 반응시킨 후 소정 시점에서 분해되도록 작성될 수 있다.
링커 기 R은 1 내지 300개 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬렌 기이며, 경우에 따라
(a) 1 이상의 탄소원자가 산소에 의해 교체되며, 특히 매 3번째 탄소원자가 산소에 의해 교체되며, 예컨대 1 내지 100개 에틸렌옥시 단위를 갖는 폴리에틸렌옥시 기;
(b) 1 이상의 탄소원자가 수소원자를 갖는 질소에 의해 교체되며 인접 탄소원자는 옥소에 의해 치환되어 아미드 작용기 -NH-CO-를 나타내며;
(c) 1 이상의 탄소원자는 산소에 의해 교체되며, 또 인접한 탄소원자는 옥소에 의해 치환되어 에스테르 작용 -O-CO-을 나타내며;
(d) 2개의 인접한 탄소원자 사이의 결합은 이중결합 또는 삼중결합이어서, 작용 -CH=CH 또는 -C≡C- 를 나타내며;
(e) 1 이상의 탄소원자는 페닐렌, 포화 또는 불포화 시클로알킬렌, 포화 또는 불포화 비시클로알킬렌, 브릿징 헤테로방향족 또는 브릿징 포화 또는 불포화 헤테로시클릴 기에 의해 치환되며;
(f) 2개의 인접한 탄소원자는 디술피드 결합 -S-S-에 의해 교체되거나, 또는 상기 (a) 내지 (f)하에서 정의된 바와 같은, 경우에 따라 치환기를 함유하는, 2 이상, 특히 2 또는 3개의 알킬렌 및/또는 변형된 알킬렌 기의 조합물이다.
고려되는 치환기는 저급 알킬, 예컨대 메틸, 저급 알콕시, 예컨대 메톡시, 저급 아실옥시, 예컨대 아세톡시, 또는 할로게닐, 예컨대 클로로이다.
고려되는 추가의 치환기는 예컨대 α-아미노산 특히 천연산출 α-아미노산이 링커 R4에 혼입될 때 얻을 수 있는 치환기이며, 이때 탄소원자는 상기(b)하에서 정의된 바와 같은 아미드 작용 -NH-CO-에 의해 치환된다. 이러한 링커에서, 알킬렌 기 R4의 탄소사슬의 일부는 기-(NH-CHR-CO)n-에 의해 치환되며, 이때 n은 1 내지 100이고 또 R은 α-아미노산의 다양한 잔기를 나타낸다.
다른 치환기는 광분해성 링커 R을 유발하는 치환기, 예컨대 o-니트로페닐 기이다. 특히 치환기 o-니트로페닐은 아미드 결합에 인접한 탄소원자, 예컨대 -NH-CO-CH2-CH(o-니트로페닐)-NH-CO- 기에 존재한다.
상기 (e)하에서 정의된 바와 같이 탄소원자를 치환하는 페닐렌기는 예컨대 1,2-, 1,3- 또는 바람직하게는 1,4-페닐렌이다. 상기 (e)하에서 정의된 바와 같은 탄소원자를 치환하는 포화 또는 불포화 시클로알킬렌 기는 시클로펜틸 또는 시클로 헥실이거나, 또는 1- 또는 2-위치에서 불포화된 시클로헥실렌이다. 상기 (e)하에서 정의된 바와 같은 탄소원자를 치환하는 포화 또는 불포화 비시클로알킬렌 기는 경우에 따라 2-위치에서 불포화되거나 또는 2- 및 5-위치에서 이중 불포화된 비시클로[2.2.1]헵틸렌 또는 비시클로[2.2.2]옥틸렌이다. 상기 (e)하에서 정의된 바와 같은 탄소원자를 치환하는 브릿징 헤테로방향족 기는 예컨대 트리아졸리덴, 바람직하게는 1,4-트리아졸리덴 또는 이소옥사졸리덴, 바람직하게는 3,5-이소옥사졸리덴이다. 상기 (e)하에서 정의된 바와 같이 탄소원자를 치환하는 브릿징 포화 또는 불포화 헤테로시클릴 기는 예컨대 2,5-테트라히드로푸란디일 또는 2,5-디옥산디일이거나, 또는 이소옥사졸리디넨, 바람직하게는 3,5-이소옥사졸리디넨이다.
바람직한 링커 기 R는 경우에 따라 메틸, 메톡시 또는 아세톡시 기에 의해 치환된 1 내지 20개의 탄소원자의 알킬 사슬, 또는 1 내지 20개 에틸렌옥시 기로 구성된 폴리에틸렌 글리콜 사슬과 같은 유연성 링커이다.
기질의 라벨 부분은 융합 단백질의 적용 목적에 따라서 당업자들이 선택할 수 있다. 라벨의 예는 다음을 포함한다:
(1) 형광단, 발색단, 자성 프로브 또는 대조시약과 같은 분광학적 프로브, 또는 전자 현미경에서 유용한 프로브;
(2) 방사능 라벨링된 분자;
(3) 파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 결합 쌍의 한 부분인 분자. 이러한 특정 결합 쌍은 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 결합될 수 있는 비오틴을 포함한다;
(4) 다른 생분자와 상호작용할 것으로 보이는 분자;
(5) 다른 생분자와 상호작용할 것으로 보이는 분자의 라이브러리;
(6) 나데아우 등에 의해 2002년 기재된 바와 같은 당업자에게 공지된 다른 생분자와 가교될 수 있는 분자;
(7) 구속된(tethered) 금속-킬레이트와 같이 H2O2 및 아스코르베이트에 노출되면 히드록시 라디칼을 생성할 수 있는 분자;
(8) 제이 등에 의해 1999년 기재된 바와 같이, 말라카이트 그린처럼 광에 조사되면 반응성 라디칼을 생성할 수 있는 분자;
(9) 유리 슬라이드, 마이크로티터 플레이트 또는 당분야의 숙련자에게 공지된 임의의 중합체일 수 있는 고체 지지체에 공유 부착된 분자;
(10) 상보적 가닥과 염기쌍을 이룰 수 있는 핵산 또는 그의 유도체;
(11) 막-삽입 특성을 갖는 지질 또는 기타 소수성 분자;
(12) 소망하는 효소, 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 생분자;
(13) 상기 수록한 특성의 조합을 갖는 분자.
포스포판테테이닐 잔기가 형광단, 발색단, 자성 라벨, 방사성으로 라벨링된 분자 또는 기타 분광학적 프로브와 같은 ACP 융합 단백질에 전달될 수 있는 검출가능한 라벨을 갖는, 라벨링된 CoA 유도체의 사용은 체외 또는 세포내에서 또는 세포의 표면(체내에서)에서 본 발명을 특이적으로 이용하여 검출가능한 라벨을 ACP 융합 단백질에 공유결합적으로 부착시키게 한다. 이것은 체내 또는 체외에서 ACP 융 합 단백질의 검출과 특징화를 가능하게 한다. 용어 체내는 세포 뿐만 아니라 세포외 공간에 맞는 ACP 융합 단백질의 모든 구획에서 라벨링을 포함한다. 이 방법은 목적하는 단백질에 유전자적으로 융합된 그린 형광 단백질(GFP)과 비교될 수 있으며 살아있는 세포에서 그의 검사를 가능하게 한다. GFP 및 그의 돌연변이체의 결점은 이것이 GFP에 존재하는 천연 산출 형광단의 사용에 원칙적으로 한정되는 점이다. 세포내(체내)의 라벨링은 단백질의 기능적 구조에 대한 영향이 아주 적은 보통의 고정화 과정에 의해 세포를 고정한 후에 사용될 수 있으며 따라서 포스포판테테이닐 잔기에 의한 라벨링에 대하여 ACP 작용을 남긴다.
포스포판테테이닐 잔기가 ACP 융합 단백질에 전달될 수 있는 비오틴과 같은 친화성 태그를 갖는 경우 라벨링된 CoA 유도체의 사용은 본 발명이 이용되어 친화성 태그를 ACP 융합 단백질에 전달함으로써, 융합 단백질이 친화성 태그의 결합 파트너에 의해 결합되게 한다. 예로서, 비오틴과 같은 친화성 태그로 라벨링된 CoA 기질 및 ACPS를, ACP 융합 단백질을 발현하는 세포 추출물(세균 또는 진핵생물) 또는 정제된 ACP 융합 단백질에 부가하는 것은 융합 단백질을 친화성 태그에 의해 공유적 변형을 초래한다. 이것은 친화성 태그 및 그의 결합 파트너 사이의 상호작용, 예컨대 비오틴의 경우 고정화된 아비딘 또는 스트렙트아비딘과의 상호작용을 이용하여 융합 단백질의 분리를 가능하게 한다. 상기 라벨이 디술피드 브릿지와 같은 분해성 결합을 함유하는 링커 기 R을 통하여 ACP 융합 단백질에 결합되면, 또는 상기 링커가 광분해성이면, ACP 융합 단백질은 그의 분리 후 친화성 태그로부터 방출될 수 있다.
포스포판테테이닐 잔기가 ACP 융합 단백질에 전달될 수 있고 또 외부 자극에 노출되면 히드록실 라디칼과 같은 반응성 라디칼을 생성할 수 있는 라벨을 갖는 경우 라벨링된 CoA 유도체의 사용은 목적하는 단백질 및 인접하는 단백질의 구조 연구를 가능하게 한다. 생성한 라디칼은 ACP 융합 단백질 뿐만 아니라 ACP 융합 단백질과 인접하는 단백질을 불활성화하여 이들 단백질의 역할의 연구를 가능하게 한다. 이러한 라벨의 예는 H2O2 및 아스코르베이트에 노출되면 히드록시 라디칼을 생성하는 고착된 금속-킬레이트 복합체, 및 레이저 조사시 히드록시 라디칼을 생성하는 말라카이트 그린과 같은 발색단이다. 히드록실 라디칼을 생성하기 위한 발색단 및 레이저의 사용은 제이 등에 의해 1998년 기재된 바와 같이 발색단 보조 레이저 유도 불활성화(CALI)로 당업계에 공지되어 있다. CALI는 시간-제어되고 공간적 분석 방식으로 세포내에서 특정 단백질을 특이적으로 불활성화시키기 위해 사용되며 또 발색단 및 단백질이 공간적으로 인접할 때를 기초로 한 방법이다. 레이저 조사시 발색단은 히드록실 라디칼을 생성하며, 이것은 약 100 nm 발색단에서 모든 단백질을 불활성화시킨다. 지금까지, 발색단은 목적하는 단백질에 특이적인 발색단-라벨링된 항체를 미량주입하는 것에 의해 목적하는 단백질에 대하여 공간 특이적으로 인접하게 된다. 본 발명에서, ACP 융합 단백질을 말라카이트 그린과 같은 발색단으로 라벨링한 다음 레이저 조사하면 ACP 융합 단백질 뿐만 아니라 시간 제어되고 공간적 분석 방식으로 ACP 융합 단백질과 상호작용하는 단백질을 불활성화시킨다. 이 방법은 체내 또는 체외에서 모두 적용될 수 있다.
유사한 방식으로, ACP 융합 단백질은 속박된 금속-킬레이트 및 ACP 융합 단백질에 의해 라벨링될 수 있고 또 ACP 융합 단백질과 상호작용하는 단백질은, H2O2 및 아스코르베이트에 노출될 때, 특이적 방식으로 불활성화될 수 있다. 이 방법은 ACP 융합 단백질 또는 ACP 융합 단백질과 아주 인접하는 단백질의 기능을 연구할 뿐만 아니라 ACP 융합 단백질과 아주 인접하는 단백질을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 여기서, ACP 융합 단백질과 아주 근접하는 단백질은 특정 항체에 의해 단백질의 단편을 검출하는 것에 의해, 고해상도 2D-전기영동 겔상에서 상기 단백질이 사라지는 것에 의해 또는 질량 분광계와 같은 분리 및 서열결정화 수법 또는 N-말단 분해에 의한 단백질 서열화를 통하여 분해 단백질 단편을 확인하는 것에 의해 확인될 수 있다.
포스포판테테이닐 잔기가 ACP 융합 단백질에 전달될 수 있는 리간드를 갖는 경우, 라벨링된 CoA 유도체의 사용은 본 발명이 리간드와 리간드의 결합 파트너, 예컨대 단백질을 ACP 융합 단백질에 특이적으로 부착시키도록 한다. 상기 리간드가 든 단백질 Y에 결합되고 또 단백질 Y와 라벨링된 ACP 융합 단백질의 이합체가 생물학적 작용 또는 측정가능한 시그널을 생성하면, 생물학적 작용 또는 측정된 시그널은 라벨링된 ACP 융합 단백질의 부가에 좌우된다. ACP가 세포 표면상에 나타난 단백질에 결합되면 리간드와의 상호작용이, 개별적으로 또는 다른 세포, 조직 및 리간드에 의해 변형된 완전 생물의 일부로서 생분자를 비롯한 리간드에 의해 변형된 다른 분자와의 접촉을 매개할 수 있다.
포스포판테테이닐 잔기가 캐리어의 표면에 공유결합적으로 부착된 경우, 또는 상기 라벨이 표면에 자체가 부착된 다른 분자에 의해 비공유결합적으로 결합될 수 있는 분자인 경우, 라벨링된 CoA 유도체의 사용은 본 발명이 고상 지지체 상의 단백질 어레이를 작성하는데 사용되도록 한다. 후자의 접근법의 예는 라벨이 비오틴이고 또 표면에 부착된 분자가 스트렙트아비딘 또는 아비딘인 경우이다. 캐리어로 적합한 예는 유리 슬라이드, 마이크로티터 플레이트 또는 작용화된 중합체이다. 기질로 사용된 CoA 유도체는 그의 라벨을 통하여 담체 상에 고정화되며 또 ACP 융합 단백질의 ACPS-촉진된 반응은 라벨을 융합 단백질로 전달하는 것에 의해 캐리어 상에 이러한 융합 단백질을 고정화시킨다. 상응하는 CoA 유도체를 사용하여 미리 처리된 캐리어상에서 공간적으로 해석되는 상식으로 ACPS와 함께 (상이한) ACP 융합 단백질을 스포팅하는 것은 단백질 어레이의 생성을 가능하게 한다.
포스포판테테이닐 잔기가 다른 단배질과 가교될 수 있는 분자인 라벨에 공유결합적으로 결합된 경우 라벨링된 CoA 유도체의 사용은 본 발명이 사용되어 적합한 환경에서 목적하는 단백질의 상호작용을 연구하도록 한다. 이러한 가교 링커의 예는 말레이미드, 활성 에스테르 또는 아지드와 같은 작용성 기를 함유하는 분자, 및 나데아우 등에 의해 2002년 기재된 바와 같은 당업자에게 공지된 다른 분자이다. 라벨링된 CoA 유도체를, ACPS 존재하에서, 다른 단백질과 상호작용하는 (체내 또는 체외에서) ACP 융합 단백질과 접촉시키는 것은 라벨을 통하여 상호작용성 단백질을 사용하여 ACP 융합 단백질의 공유결합적 가교를 초래할 수 있다. 이것은 ACP 융합 단백질과 상호작용하는 단백질의 확인도 허용한다.
포스포판테테이닐 잔기가, ACP 및 막 수용체로 구성된 ACP 융합 단백질로 전달될 수 있는 리간드를 갖는 경우, 라벨링된 CoA 유도체의 사용은 라벨링된 수용체의 검출을 허용한다. 이러한 세포 표면 수용체의 라벨링은 수용체 내재화의 관측을 가능하게한다. 특정 용도는 리간드의 결합 후 수용체 단백질의 내재화를 예컨대 약물, 약물 리드(lead) 또는 일시적 약물 리드에 의해 조사하는 것이다. 수용체 내재화는 다양한 방법에 의해, 예컨대 세포 막으로부터 세포 내부로 라벨이 전위되는 것을 현미경으로 검출하는 것에 의해 또는 세포내 환경으로 라벨을 전달할 때 라벨의 형광 특징의 변화를 관찰하는 것에 의해 검출할 수 있다. 이러한 변화는 현미경 기구없이도 검출될 수 있으며 세포외 배지에 켄처(quencher)를 부가하는 것에 의해 용이하게 될 수 있다.
포스포판테테이닐 잔기가, 전자현미경에 의해, 예컨대 전자 조밀 나노입자에 의해 직접 검출될 수 있는 리간드를 갖는 경우 라벨링된 CoA 유도체의 사용. 전자 현미경 검출에 포스포판테테이닐 잔기를 적용하는 것은 디아니시딘과 같은 방향족 아민을 조사하면 전자 조밀 침전물로 산화시키기 위한 에오신과 같은 증감제로 사용된 라벨을 기본으로 하며, 이것은 전자 현미경에 의해 검출될 수 있다.
도 1:
(A) 6xHis-ACP(1 μM), 6xHis-ACPS(0.2 μM) 및 CoA-Bt (5 μM)의 반응 분석. 지시된 시간(t)에서 반응 혼합물로부터 등분의 양(aliquot)을 제거하고 또 6xHis-ACP의 비오티닐화는 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 콘쥬게이트를 사용한 웨스턴 블러팅에 의해 확인하였다.
(B) 6xHis-ACP의 비오티닐화의 정량: 6xHis-ACP(3 μM), 6xHisACPS(5μM) 및 CoA-Bt (10 μM)를 30분간 배양하고, 투석시킨 다음 등량의 샘플을 스트렙트아비딘과 함께 배양한 다음 SDS-PAGE (레인 번호 2)에 적용하였다. 안정한 비오틴-스트렙트아비딘 복합체의 형성은 비오티닐화된 단백질의 겔 이동을 초래한다. 비오티닐화의 양은 레인번호 2에서 6xHis-ACP의 밴드 세기를, 동일 농도의 6xHis-ACP를 함유하지만 스트렙트아비딘을 함유하지 않는 샘플의 밴드세기(레인번호 1)와 비교하여 평가한다.
(C) CoA와 ACPS 기질로서 CoA-Bt 또는 CoA-Dg 사이의 경쟁 에세이: 6xHis-ACP(0.4 μM), 6xHisACPS(0.4 μM), CoA-Bt 또는 CoA-Dg (2 μM) 및 다양한 농도의 CoA(0-80 μM)를 30분간 배양한 다음 라벨링 정도를 웨스턴 블러팅으로 결정하였다. 웨스턴 블럿에서 상대적 신호 세기(I)를 [CoA]/[CoA-L](L=라벨)에 대해 플로팅하고 방정식 I = A/(1+Bx) (이때 x는 [CoA]/[CoA-L]을 나타내고, A는 비특정 상수이며 또 B는 비율 (kcat/KM)CoA/(kcat/KM)CoA -L 임)에 대입하였다. 이들 실험은 (kcat/KM)CoA/(kcat/KM)CoA-Bt의 경우 0.48 그리고 (kcat/KM)CoA/(kcat/KM)CoA - Dg 의 경우 0.35의 특이 상수비를 얻으며, 이것은 자유 및 유도된 CoA 사이에 아무런 차이가 없음을 보여준다.
도 2:
(A-F) 효모의 세포 표면상에서 ACP 융합 단백질의 라벨링. Cy3(A) 또는 비오 틴으로, 이어 스트렙트아비딘-피복된 퀀텀 도트(D)로 라벨링된 Aga2-ACP를 발현하는 효모 세포의 형광 현미경사진. 이어, AGA-ACP를 발현하지 않는 세포의 상기 (A)와 같은 것은 (B)에, (E)와 같은 것은 (D)에 표시. (C) 및 (F)는 (B) 및 (D)에서와 동일한 투과 현미경사진. 이들 실험은 Aga2p-ACP를 발현하는 효모 세포만이 라벨링된 것을 나타낸다.
예시적으로, 본 발명의 구체예를 첨부한 도면을 참조하여 더욱 자세하게 설명한다.
이하의 실시예 및 실험 과정은 본 발명을 실시하는 방법에 관한 완전한 기재와 설명을 당업자에게 제공하기 위해 기재한 것으로, 이것은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
CoA - Bt 의 합성
100 ㎕ DMF에 비오틴-말레이미드 1(1 mg, 0.0022 밀리몰)이 용해된 용액에, 90㎕ DMF 및 10 ㎕의 50 mM Tris·Cl pH 7.5에 조효소 A 이나트륨염(1.79 mg, 0.0022 밀리몰, 1당량)이 용해된 용액을 부가하였다. 이 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어 CH3CN/H2O 1:4를 사용하여 희석시킨 다음 500 ㎕씩의 동분량을 예비적 HPLC 칼럼: 구배 (A = H2O 99%, CH3CN 1%, 50mM NH4OAc/B = CH3CN), A/B 95:5 내지 A/B 80:20 으로 2분, A/B 68:32으로 7분, A/B 20:80으로 2분간 주입한 다음 A/B 95:5로 되돌렸다. CoA-비오틴의 체류 시간은 6.5분이었다. 소망하는 생성 물을 함유하는 분획을 진공에서 농축시키고, DMSO에 용해시키며 순도를 제어하도록 분석량을 주입한다. 순수 분획을 모았다. CoA-비오틴의 농도는 260 nm (ε (아데닌, 260 nm) = 15'300 [M-1cm-1)]에서 흡수에 의해 측정하였다. CoA-Bt의 수율은 0.895 mg (33%) 이었다.
ESI-MS(m/z) 계산치 1217.296 [M(-1)], 실측치 1217.2657 [M(-1)]
CoA -Dg의 합성
50 ㎕ DMF에 N-(ε-말레이미도카프로산)히드라지드 2 (1 mg, 0.0044 밀리몰)이 용해된 용액에, DMF/완충액 혼합물(70㎕ DMF/30㎕ 50 mM Tris·Cl, pH 7.5)에 조효소 A 이나트륨염(3.6 mg, 0.0044 밀리몰, 1당량)이 용해된 용액을 부가하였다. 반응을 분석적 HPLC (260 nm에서 검출)에 의해 실시하여 반응의 완료를 확인하였다. 이어, 50 ㎕ DMF 및 10 ㎕ Et3N에 용해된 3-아미노-3-데옥시디옥시제닌 헤미숙신아미드 숙신이미딜 에스테르 (2.6 mg, 0.0044 밀리몰, 1당량) 용액을 부가하고, 그 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응을 예비적 HPLC 처리시키고 소망하는 생성물을 함유하는 분획을 진공에서 농축시키고, DMSO에 용해시키며 분석적 HPLC에 의해 분석하여 순도를 측정하였다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 모았다. CoA-Dg의 농도는 아데닌의 소광 계수(ε (아데닌, 260 nm) = 15'300 [M-1cm-1)]를 사용하여 측정하였다. CoA-Dg의 수율은 2.37 mg (37%) 이었다.
ESI-MS(m/z) 계산치 1462.3707 [M(-1)], 실측치 1462.481 [M(-1)]
Figure 112005066804508-PCT00004
CoA - Cy3 의 합성
100 ㎕ DMF에 Cy3-말레이미드 3(파마시아 제조, 1 mg, 0.00126 밀리몰)이 용해된 용액에, 90㎕ DMF 및 10 ㎕의 50 mM Tris·Cl pH 7.5에 조효소 A 이나트륨염(1.05 mg, 0.00126 밀리몰, 1당량)이 용해된 용액을 부가하였다. 이 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어 CH3CN/H2O 1:4를 사용하여 희석시킨 다음 500 ㎕씩의 동분량을 예비적 HPLC 칼럼: A/B 95:5 내지 A/B 80:20으로 2분, A/B 65:35으로 15분, A/B 20:80으로 2분간의 구배상에 주입한 다음 A/B 95:5로 되돌렸다(A 및 B는 앞의 실시예 참조). CoA-비오틴의 체류 시간은 10분이었다. 소망하는 생성물을 함유하는 분획을 진공에서 농축시키고, DMSO에 용해시키며 순도를 제어하도록 분석량을 주입한다. 순수 분획을 모았다. CoA-Cy3의 농도는 549 nm (ε (아데닌, 549 nm) = 150'000 [M-1cm-1)]에서 흡수에 의해 측정하였다. CoA-Cy3의 수율은 0.847 mg (44%) 이었다.
ESI-MS(m/z) 계산치 1519.370 [M(-1)], 실측치 1519.3071 [M(-1)]
Figure 112005066804508-PCT00005
CoA - Cy5 합성
Cy5-말레이미드 4(1 mg, 0.00122 밀리몰)을 출발물질로 하여 CoA-Cy3에 기재된 바와 같이 CoA-Cy5의 합성을 실시하였다. CoA-Cy5의 농도는 Cy5의 소광 계수 (ε (646 nm) = 250'000 [M-1cm-1)]에서 흡수에 의해 측정하였다. CoA-Cy5의 수율은 0.828 mg (44%) 이었다.
ESI-MS(m/z) 계산치 1545.386 [M(-1)] 및 772.189[M(-2)], 실측치 771.6524 [M(-2)]
Figure 112005066804508-PCT00006
6 xHis - ACPS 의 클로닝 , 발현 및 정제
XL1-블루 대장균 ACPS 유전자를 단일 콜로니 PCR에 의해 증폭시키고 또 NdeI 제한 부위(밑줄로 표시)를 갖는 정방향 프라이머 5'-TCT GGT CAT ATG GCA ATA TTA GGT TTA GGC ACG G-3' 및 XhoI 제한 부위(밑줄로 표시)를 갖는 역방향 프라이머 5'-TCA AGT CTC GAG TTA ACT TTC AAT AAT TAC CGT GGC A-3'를 사용하여 pET-15b 플라스미드 (Novagen 제조)에 클로닝하였다. 대장균 ACPS의 N-말단에 용합된 펩티드( 플라스미드 pET-15b로부터 유래)의 서열은 (단일자 코드로) ACPS의 첫 아미노산인 메티오닌에 이어 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH이다. 이 융합 단백질을 6XHis-ACPS라 칭한다.
6xHis-ACPS를 암호화하는 발현벡터를 기본한 pET-15b (Novagen제조)를 함유하는 BL21 대장균 세포의 액체 배양물을 광학밀도 OD600nm 0.6으로 생장시켰다. 6xHis-ACPS의 발현은 IPTG를 1 mM의 최종 농도로 부가하는 것에 의해 유도하였다. 220 rpm으로 24℃에서 3.5시간 동안 배양한 후, 배양액을 3000 g으로 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 펠릿을 10 ml의 추출 완충액(150 mM NaCl, 5 mM 이미다졸, 50 mM KH2PO4, pH 8.0)에 재현탁시키고, PMSF 및 아프로티민을 최종 농도 각각 1 mM 및 2 ㎍/ml으로 부가하였다. 리소자임을 1 mg/ml로 부가하고, 그 혼합물을 얼음상에서 15분간 배양한 다음 몇 회 뒤집었다. 이어 10분간 초음파처리(95% 파워, 50% 듀티)하였다. DNaseI을 최종 농도 0.01 mg/ml로 부가하였다. 4℃에서 30분 후, 혼합물을 18'000 rpm으로 10분간 원심분리시켰다.
단백질을 정제하기 위하여, 추출 완충액으로 미리 3회 세척된 350 ㎕의 Ni-NTA를 용균물에 부가하였다. 이 혼합물을 얼음상에서 20분간 배양하고 몇 회 혼합하였다. 추출 혼합물을 폴리프로필렌 칼럼에 부가한 다음 따라 내었다. 상기 칼럼을 5 x 400 ㎕ DNA 용출 완충액(10 mM Tris·Cl, pH 8.5)로 세척한 다음 2x5 ml 세척 완충액(300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 50 mM KH2PO4, pH 7.5)로 세척하였다. 단백질을 용출시키기 위하여, 용출 완충액(300 mM NaCl, 150 mM 이미다졸, pH 7.5)을 칼럼에 부가하고 10분간 배양한 다음 용출물(flow-through)을 수집하였다. 용출은 더 이상 단백질이 브라드포드 분석으로 검출되지 않을 때 까지 150 ㎕ 용출 완충액으로 점진적으로 계속하였다. 마지막으로 모아진 용출물을 투석 완충액(50 mM HEPES, 30% 글리세롤, pH 7.2)에서 철야로 투석하여 잔류하는 염을 제거하였다. 순수한 6xHis-ACPS(MW 16.215 kDa)를 등분량으로하여 -80℃에서 저장하였다. 브라드포드 분석으로 결정한 농도는 37.6 μM이었다. 수율: BL21 대장균 세포 배양액 리터당 0.912 mg.
6 xHis - ACP 의 클로닝 , 발현 및 정제
XL1-블루 대장균 ACP 유전자를 단일 콜로니 PCR에 의해 증폭시키고 또 NdeI 제한 부위(밑줄로 표시)를 갖는 정방향 프라이머 5'-GT CGG TAT CAT ATG AGC ACT ATC GAA GAA CG-3' 및 BamHI 제한 부위(밑줄로 표시)를 갖는 역방향 프라이머 5'-TCA TGC GGA TCC TTA CGC CTG GTG GCC GTT G-3'를 사용하여 pET-15b 플라스미드 (Novagen 제조)에 클로닝하였다. 대장균 ACP의 N-말단에 용합된 펩티드의 서열(6xHis-ACP 얻음)은 (단일자 코드로) ACP의 첫 아미노산인 메티오닌에 이어 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH 이다.
6xHis-ACP를 암호화하는 발현벡터를 기본한 pET-15b (Novagen제조)를 함유하는 BL21 대장균 세포의 액체 배양물을 광학밀도 OD600nm 0.6으로 생장시켰다. 6xHis-ACP의 발현은 IPTG를 1 mM의 최종 농도로 부가하는 것에 의해 유도하였다. 220 rpm 으로 37℃에서 3.5시간 동안 배양한 후, 배양액을 3000 g으로 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 6xHis-ACPS를 정제하기 위한 상기 실험에 기재된 바와 같이 펠릿을 처리하였다. 6xHis-ACP(MW 10.802 kDa)의 농도는 브라포드 에세이에 의해 측정하며 188 μM이었다. 수율: BL21 대장균 세포 배양액 리터당 3.1 mg.
아포- 및 홀로-6xHis-ACP의 비율을 결정하기 위하여, 정제 6xHis-ACP는 경우에 따라 Cap-LC (Waters 제조)에 결합된 Q-Tof-Ultima (Micromass/Waters 제조)를 이용한 ESI-MS(pos.mode), Xterra RP-C4 칼럼(Waters 제조, 5 ㎛, 0.32 x 50 mm; 유량 8 ㎕/분)상에서 크로마토그래피 및 MaxEnt1-소프트웨어에 의한 데콘볼루션(deconvolution)에 의해 분석하였다. 이 혼합물의 ESI-MS는 제제가 홀로- 및 아포-ACP의 혼합물을 함유함을 나타낸다. 첫째 메티오닌을 갖지 않는 정제 아포-6xHis-ACP의 중량은 10.6720 kDa(실측치 10.6716 kDa)인 것으로 밝혀졌고 홀로-6xHis ACP의 중량은 11.012 kDa (실측치 11.0119 kDa)인 것으로 밝혀졌다. LC-ESI-MS는 홀로- 및 아포-형태에 상응하는 피이크의 확인과 인테그레이션을 허용한다. 홀로-형태의 %는 16%(체류 시간 11.77분)인 것으로 결정되었고, 아포-형태의 %는 84%(체류 시간 14.16분)인 것으로 결정되었다.
6 xHis - ACP -ha의 발현 및 정제
대장균 ACP의 N-말단에 용합된 펩티드의 서열은 ACP의 첫 아미노산인 메티오닌에 이어 (단일자 코드로) MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH 이고, 또 대장균 ACP의 C-말단에 용합된 펩티드의 서열은 (단일자 코드로) TSRSYPYDVPDYARW (6xHis-ACP-ha 수득)이 다.
6xHis-ACP-ha를 암호화하는 발현벡터를 기본한 pET-15b를 함유하는 BL21(DE3) 대장균 세포의 액체 배양물을 광학밀도 OD600nm 0.6으로 생장시켰다. 6xHis-ACP-ha의 발현은 IPTG를 1 mM의 최종 농도로 부가하는 것에 의해 유도하였다. 220 rpm으로 24℃에서 3시간 동안 배양한 후, 배양액을 3000 g으로 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 6xHis-ACPS의 정제에 기재된 것과 동일하게 6xHis-ACP를 정제하였다. 6xHis-ACP-ha(MW 12.65 kDa)의 농도는 브라포드 에세이에 의해 측정하며 400 μM이었고 단백질의 총 수율은 쉐이크-플라스크 배양액 리터당 10 mg이었다.
CoA - Bt 및 6 xHis - ACPS 를 사용한 6 xHis - ACP 의 체외 비오티닐화
정제된 6xHis-ACP(1μM)을 반응 완충액(43 ㎕, 50 mM Tris·Cl, pH 8.8)중의 6xHis-ACPS(0.2 μM) 및 MgCl2 (10 mM)과 실온에서 배양하였다. 7.5 ㎕의 등분량을 취하여 분석에 사용하였다. CoA-Bt를 최종 농도 5 μM으로 부가하였다. 7.5 ㎕의 등분량을 소정 시간에 취하였다. 이 등분량을 조효소 A(1 mM 최종 농도)를 사용하여 30초간 켄칭하고, 8.2 ㎕ SDS-완충액 2x를 부가하였다. 이 샘플을 95℃에서 2분간 가열하였다. 스트렙트아비딘-꽃양배추 퍼옥시다제 콘쥬게이트(NEN) 및 화학발광성 퍼옥시다제 기질(Renaissance reagent plus, NEN)을 사용한 웨스턴-블러팅에 의해 비오티닐화된 6xHis-ACP를 검출하였다. 이미지 스테이션(Kodak 440)을 이용하여 웨스턴 블럿을 분석하였다. 대조용으로서, 각 단백질만을 함유하는 샘플 및 2개의 단백질 및 CoA-Bt중의 하나만을 함유하는 샘플을 제조하고 상기와 같이 비오티닐화에 대해 분석하여 바탕값 및 반응의 특이성을 확인하였다. 비오티닐화는 3개 성분 전부의 존재 여부에 의해 좌우된다.
겔 시프트 에세이를 통한 6 xHis - ACP 의 비오티닐화의 정량
정제된 6xHis-ACP (3 μM)를 실온에서 CoA-Bt (10 μM) 및 정제 6xHis-ACPS (5μM)와 함께 최종 부피 50㎕의 반응 완충액(50 mM Tris·Cl, pH 8.8, 10 mM MgCl2)에서 배양하였다. 30분간 배양한 후, 그 혼합물을 TBS (10 mM Tris·Cl, 150 mM NaCl, pH 7.9)에 대하여 철야로 투석시켜 과량의 CoA-Bt를 제거하였다. 반응의 등분량을 최종 농도 0.6 ㎍/㎕에서 스트렙트아비딘과 1시간 동안 배양하였다. 2% SDS만을 함유하는 2xSDS 샘플 완충액을 상기 샘플에 부가하고, 샘플을 가열하지 않고 직접 SDS-PAGE를 실시하였다. 쿠마씨 염색에 의해 단백질을 검출하고, 비오티닐화도는 동량의 6xHis-ACP를 함유하지만 비오티닐화되지 않고 스트렙트아비딘과 배양되지 않는 샘플과 밴드 세기를 대조함으로써 평가하였다.
CoA 및 CoA -라벨 사이의 경쟁 에세이
정제된 6xHis-AcpS (0.4 μM)를 실온에서 CoA-Bt 또는 CoA-Dg (2 μM), 다양한 양의 CoA (0, 2, 4, 8, 12, 20, 40, 80 μM) 및 정제 6xHis-ACP-ha (0.4μM)와 함께 20 ㎕의 반응 완충액 (50 mM Tris·Cl, pH 7.5, 10 mM MgCl2)에서 배양하였다. 25분 후, 20㎕의 2xSDS 샘플 완충액을 부가하여 샘플을 c칭시키고 95℃에서 2분간 가열하였다. 라벨링된 6xHis-ACP-ha는 스트렙트아비딘-꽃양배추 퍼옥시다제 콘쥬게이트 (희석 1:12500) 또는 항-디곡시게닌 항체-꽃양배추 퍼옥시다제 콘쥬게이트 (희석 1:500) 및 화학발광성 퍼옥시다제 기질을 사용한 웨스턴 블러팅에 의해 검출하였다. 0μM CoA에서 시그널 세기는 각 시험에 대하여 임의로 1로 설정하였다.
효모 세포의 표면상에 Aga2 - ACP 의 라벨링
AGA2의 서열을 효모 게놈 DNA로부터 증폭시키고 또 PCR 단편의 말단에 도입된 EcoRI 및 SalI 제한부위를 사용하여 PCUP1-프로모터 서열 뒤에 효모 발현 벡터 pRS314에 삽입하였다. ACP는 ACP 서열의 PCR 증폭에 의해 도입된 SalI 및 Acc651 제한 부위를 사용하여 AGA2 뒤의 프레임에 클로닝하였다. ACP는 HA-항원결정기를 암호화하는 서열에 의해 연장된다. Aga2p 및 ACP를 연결하는 서열은 다음과 같다: FVDEMLYFQGM. Aga2p의 마지막 잔기 및 ACP의 첫번째 잔기는 밑줄쳐 있다. HA-항원결정기를 포함하는 ACP의 C-말단 서열은 다음과 같다: QAYPYDVPDYAG. ACP의 마지막 잔기는 밑줄쳐 있다. PGAL1-프로모터로부터 Aga1p 및 PCUP1-프로모터로부터 Aga2-ACP를 발현하는 효모 균주 EBY100 (MATa ura3-52 trp1 leu2△1 his3△200 pep4::HIS3 can1 GAL plU211:URA3)(인비트로겐 제조, 캐나다 칼리스배드 소재)를 2% 갈락토오스 및 0.1 mM 구리를 함유하는 10 ml 선택 배지에서 OD600 1.4 까지 생장시키고 세포를 2 ml 물로 세척한 다음 0.2 ml 라벨링 완충액(50mM Tris·Cl pH 8.8, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2)에 재현탁시켰다. CoA 기질 및 6xHis-ACPS를 최종 농도 10 및 1 μM로 부가하였다. 실온에서 20분 지난 후 2 ml PBS를 사용하여 반응을 희석시키는 것에 의해 라벨링을 중지시켰다. 2 ml PBS를 사용하여 세포를 4회 세척하고 20 nM QdotTM 605 스트렙트아비딘 콘쥬게이트(Milan Analytica AG, 스위스)를 함유하는 QdotTM 배양 완충액 0.2 ml에서 배양한 다음 세포를 2 ml PBS를 사용하여 4회 세척하였다. 세포를 63 x oil (1.4 개구수) 대물렌즈를 갖는 Zeiss Axiovert 135 형광 현미경 (Carl Zeiss, Gottingen, 독일)으로 관찰하였다.
HEK293 세포상에 나타난 ACP - NK1 융합 단백질의 라벨링
ACP-NK1의 일시적 발현을 위해, 짧은 DYV 링커를 통하여 5-HT3-수용체의 시그널 서열(SigtHT3)을 ACP의 N 말단에 융합시키고, 또 짧은 TS 링커를 통하여 NK1을 ACP의 C 말단에 융합시켰다. 생성한 구조물에서, FLAG 태그 및 6xHis 태그를 NK1의 C 말단에 부착시켰다. 융합 단백질의 상응하는 유전자를 벡터 pCEP4 (인비트로겐 제조)의 NheI 및 BamHI 부위에 삽입하였다. HEK293 세포를, 2.2% 송아지 태아 혈청(GIBCO, BRL 제조)가 보충된 DMEM/F12 (둘베코 변형 이글 배지; GIBCO BRL 제조)에서 생장시켰다. 일시적 감염은 기재된 바와 같이 실시하였고(Nat Biotechnol 21, 86-89 (2003)) 또 HEK293 세포는 ACP-NK1을 발현하는 벡터 및 핵 표적 EGFP (EGFP-NLS3)으로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 실온에서 MgCl2 (10 mM), 6xHis-AcpS (1μM) 및 CoA-Cy3, CoA-Cy5 또는 CoA-Bt (각각 5 μM)을 함유하는 500 ㎕ PBS 완충액과 함께 실온에서 10분간 배양하였다. 이들 세포를 PBS를 사용하여 3회 세척하여 과량의 기질을 제거하고 Cy3 또는 Cy5로 라벨링된 경우 레이저 주사 공초점 형광 현미경으로 직접 분석하였다. 비오티닐화된 세포는 PBS를 사용하여 3회 세척하기 전에 PBS중의 1 ㎍/ml 농도의 FluoroLinkTM Cy5-라벨링된 스트렙트아비딘(애머샴 바이오사이언스 제조)과 배양하였다. 63x 물 (1.2 개구수) 대물렌즈를 갖는 Zeiss LSM 510 현미경 (Carl Zeiss AG 제조, 독일 게팅겐 소재) 상에서 488 nm 아르곤/크립톤 레이저 라인, 543 nm HeNe 레이저 라인 또는 633 nm HeNe 레이저 라인을 사용하여 레이저 주사 공초점 현미경 그래프를 기록하였다. 주사 속도 및 레이저 세기는 형광 프로브의 광표백 및 세포의 손상 또는 형태적 변화를 피하도록 조정하였다. 투명 핵 시험된 각 세포 샘플의 경우 라벨링은 GFP 채널에서 발견되었고, 투명 막 라벨링은 CoA-Cy3과 라벨링한 후, CoA-Cy5과 라벨링한 후, 및 CoA-Bt와 라벨링한 후 스트렙트아비딘-Cy5로 염색한 경우에 세포 막 영역에서 관찰되었다. GFP의 핵 발현을 나타내지 않는 비-형질감염 세포에서는 막 염색이 관찰되지 않았으며, 이는 Cy3, Cy5 및 비오틴을 사용한 ACP-NK1의 특정 라벨링을 나타낸다. HEK293 세포에서 일시적으로 발현된 ACP-NK1 수용체는 CoA-Cy5 및 NK1의 천연 리간드인 테트라메틸로다민-라벨링된 물질 P (SP-rho)을 사용하여 공동염색하였다. 양쪽 물질은 막 영역만을 염색하므로 동일 염색 영역을 보인다. 과량의 라벨링되지 않은 물질 P에 의해 SP-rho 염색의 1분 내의 반전은 리간드 결합에 관한 ACP-NK1의 라벨링과 작용기의 특이성을 증명해 준다.
참고문헌
Figure 112005066804508-PCT00007
SEQUENCE LISTING <110> EPFL - Ecole Polytechnique Federale de Lausanne Johnsson, Kai George, Nathalie <120> Methods for Protein Labeling based on Acyl Carrier Protein <130> P311A <150> EP03405364.5 <151> 2003-05-23 <160> 8 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foward primer for cloning ACPS into pET-15b <400> 1 tctggtcata tggcaatatt aggtttaggc acgg 34 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for cloning ACPS into pET-15b <400> 2 tcaagtctcg agttaacttt caataattac cgtggca 37 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6xHis extension for ACPS and ACP <400> 3 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His 20 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for cloning ACP into pEt-15b <400> 4 gtcggtatca tatgagcact atcgaagaac g 31 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for cloning ACP into pEt-15b <400> 5 tcatgcggat ccttacgcct ggtggccgtt g 31 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HA epitope extension for ACP <400> 6 Thr Ser Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Arg Trp 1 5 10 15 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence connecting Aga2p and ACP <400> 7 Phe Val Asp Glu Met Leu Tyr Phe Gln Gly Met 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA Epitope extension for Aga2p ACP fusion protein <400> 8 Gln Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly 1 5 10

Claims (26)

  1. 목적하는 단백질 및 아실 캐리어 단백질(ACP) 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질을, 라벨링된 조효소 A(CoA)형 기질 및 홀로-아실 캐리어 단백질 합성효소(ACPS) 또는 그의 상동체와 접촉시킴으로써 상기 ACPS가 라벨을 융합 단백질에 전달하도록 하고 또 얻어진 라벨링된 융합 단백질을 검출 및/또는 조작하는 것을 포함하는, 목적하는 단백질의 검출 및/또는 조작 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 라벨링된 융합 단백질은 체외 또는 체내에서 라벨을 연속적으로 모니터링하도록 고안된 계에서 연속적으로 모니터링될 수 있는, 목적하는 단백질의 검출 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 체외에서의 목적하는 단백질의 검출 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 체내, 세포내에서의 목적하는 단백질의 검출 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 라벨링된 융합 단백질은 라벨을 정제하기 위해 고안된 계에서 정제되며, 또 추가의 단계로서, 상기 목적하는 단백질은 라벨링된 융합 단백질로부터 분해되는, 목적하는 단백질의 조작 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 라벨링된 융합 단백질은 라벨을 고정화하도록 고안된 계에서 고체 지지체에 고정화된, 목적하는 단백질의 조작 방법.
  7. 제 1항에 있어서, ACPS는 대장균으로부터 얻은 ACPS인, 목적하는 단백질의 조작 방법.
  8. 제 1항에 있어서, ACPS 상동체는 EntD, Sfp, Psf-1, Gsp, LYS5, Bli, Lpa-14 및 노시헵티드 생합성에 관여하는 NshC로 구성된 군으로부터 선택되는, 목적하는 단백질의 조작 방법.
  9. 제 1항에 있어서, ACP는 대장균 아실 캐리어 단백질인 목적하는 단백질의 조작 방법.
  10. 제 1항에 있어서, ACP는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종으로부터 얻은 것인 목적하는 단백질의 조작 방법.
  11. 제 1항에 있어서, ACP는 1 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 상이하지만, ACPS에 의해 촉진된 반응에서 라벨링된 4'-포스포판테테인에 대한 수용체로서 작용하는 특성은 그대로 유지하는 야생형 ACP의 ACP 변이체인 목적하는 단백질의 조작 방법.
  12. 제 1항에 있어서, ACP는, 포스포판테테인 유도체가 부착된 세린 잔기를 함유하고 포스포판테테인 유도체를 수용하는 작용을 유지하는 ACP 단편인, 목적하는 단백질의 조작 방법.
  13. 목적하는 단백질이 12 내지 5000개 아미노산으로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는, 목적하는 단백질 및 아실 캐리어 단백질(ACP) 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질.
  14. 제 13항에 있어서, 목적하는 단백질이 50 내지 1000개 아미노산으로 구성되는 융합 단백질.
  15. 제 13항에 있어서, 목적하는 단백질이 효소, DNA-결합 단백질, 전사 조절 단백질, 막 단백질, 핵 수용체 단백질, 핵 편재화 시그널 단백질, 단백질 보조인자, 항체, 막 펌프 단백질, 막 채널 단백질, 막 캐리어 단백질, 모터 단백질, 시그널 도입에 관련된 단백질, 핵 단백질, 리보솜 단백질, 작은 단량체성 GTPase, ATP-결합 카세트 단백질, 세포내 구조 단백질, 특정 세포 구획에 단백질을 표적화하는데 관련된 서열을 갖는 단백질, 라벨이나 친화성 태그로서 일반적으로 사용되는 단백질 및 상술한 단백질의 도메인 또는 서브도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
  16. 제 13항에 있어서, 목적하는 단백질이 인간, 고등 포유동물, 진핵생물, 세균종 또는 바이러스원으로부터 유도되는 융합 단백질.
  17. 제 13항에 있어서, 목적하는 단백질이 살모넬라(salmonella), 마이코박테리아(mycobacteria), 스타필로커치(staphylococci), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간의 인플루엔자 바이러스, 간염 바이러스 또는 코로나 바이러스로부터 유도되는 융합 단백질.
  18. 제 13항에 있어서, 목적하는 단백질이 암, 심장혈관질환, 정신병, 알츠하이머, 비만, 바이러스 감염 또는 세균 감염에 역할을 하는 융합 단백질.
  19. 제 13항에 있어서, 적합한 조건하에서 효소 분해되기 쉬운 링커를 통하여 연결된 목적하는 단백질 및 ACP를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  20. 제 13항에 있어서, ACP 및 뉴로키닌-1 수용체를 포함하는 융합 단백질.
  21. 제 1항에 따른 방법에서 제 13항에 따른 융합 단백질의 용도.
  22. 하기 화학식(I) 또는 (II)의 라벨링된 CoA형 기질:
    Figure 112005066804508-PCT00008
    (I)
    Figure 112005066804508-PCT00009
    (II)
    식중에서,
    R은 조효소 A 및 라벨을 연결하는 링커 기이고; 또 "라벨"은 라벨을 검출 및/또는 조작하도록 고안된 계에서 융합 단백질을 검출 및/또는 조작하는데 적합한 라벨 분자임.
  23. 제 22항에 있어서, R은 1 내지 300개 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬렌 기이며, 경우에 따라
    (a) 1 이상의 탄소원자가 산소에 의해 교체되며;
    (b) 1 이상의 탄소원자가 수소원자를 갖는 질소에 의해 교체되며 인접 탄소원자는 옥소에 의해 치환되어 아미드 작용기 -NH-CO-를 나타내며;
    (c) 1 이상의 탄소원자는 산소에 의해 교체되며, 또 인접한 탄소원자는 옥소에 의해 치환되어 에스테르 작용 -O-CO-을 나타내며;
    (d) 2개의 인접한 탄소원자 사이의 결합은 이중결합 또는 삼중결합이어서, 작용 -CH=CH 또는 -C≡C- 를 나타내며;
    (e) 1 이상의 탄소원자는 페닐렌, 포화 또는 불포화 시클로알킬렌, 포화 또는 불포화 비시클로알킬렌, 브릿징 헤테로방향족 또는 브릿징 포화 또는 불포화 헤테로시클릴 기에 의해 치환되며;
    (f) 2개의 인접한 탄소원자는 디술피드 결합 -S-S-에 의해 교체되거나, 또는 상기 (a) 내지 (f)하에서 정의된 바와 같은, 경우에 따라 치환기를 함유하는, 2 이상, 특히 2 또는 3개의 알킬렌 및/또는 변형된 알킬렌 기의 조합물인,
    라벨링된 CoA형 기질.
  24. 제 22항에 있어서, "라벨"이 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 라벨링된 CoA형 기질:
    (1) 분광학적 프로브, 또는 전자 현미경에서 유용한 프로브;
    (2) 방사능 라벨링된 분자;
    (3) 파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 결합 쌍의 한 부분인 분자; (4) 다른 생분자와 상호작용할 것으로 보이는 분자;
    (5) 다른 생분자와 상호작용할 것으로 보이는 분자의 라이브러리;
    (6) 다른 생분자와 가교될 수 있는 분자;
    (7) H2O2 및 아스코르베이트에 노출되면 히드록시 라디칼을 생성할 수 있는 분자;
    (8) 광에 조사되면 반응성 라디칼을 생성할 수 있는 분자;
    (9) 고체 지지체에 공유 부착된 분자;
    (10) 상보적 가닥과 염기쌍을 이룰 수 있는 핵산 또는 그의 유도체;
    (11) 막-삽입 특성을 갖는 지질 또는 기타 소수성 분자;
    (12) 소망하는 효소, 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 생분자; 및
    (13) 상기 (1) 내지 (12)에 수록된 특성의 조합을 갖는 분자.
  25. 제 22항에 있어서, "라벨"이 비오틴, 디곡시게닌, Cy-3 및 Cy-5로부터 선택되는 라벨링된 CoA형 기질.
  26. 제 1항에 따른 방법에서 제 22항에 따른 라벨링된 CoA형 기질의 용도.
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