KR20210093890A - 유비퀴틴 결찰효소 작용제의 스크리닝 방법 - Google Patents

유비퀴틴 결찰효소 작용제의 스크리닝 방법 Download PDF

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토마스 알. 하인즈
헹 리
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Abstract

본 명세서에는 유비퀴틴 결찰효소 작용제를 식별하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 유비퀴틴 결찰효소를 후보 작용제 및 신생-기질과 접촉시키는 단계; 및 (b) 후보 작용제가 유비퀴틴 결찰효소를 신생-기질에 결합시키는데 효과적인지 여부를 결정하는 단계, 여기서 신생-기질에 대한 유비퀴틴 기질이 결합하면 후보 작용제를 유비퀴틴 결찰효소 작용제로서 식별한다.

Description

유비퀴틴 결찰효소 작용제의 스크리닝 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 17일자, 미국 가출원번호 제62/746,957호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
서열 목록에 관한 진술
본 명세서와 관련된 서열 목록이 종이 사본을 대신하여 텍스트 포맷으로 제공되며, 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 제목은 70157_Sequence_final_2019-10-16.txt이다. 텍스트 파일은 2 KB이며; 2019년 10월 16일에 생성되었고; 본 명세서의 제출과 함께 EFS-Web을 통해 제출된다.
유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (ubiquitin-proteasome system, UPS)은 진핵 세포에서 무수히 많은 단백질의 전환을 매개하여 다양한 세포 기능을 조절한다 (Hershko, A. and Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67, 425-479, doi:10.1146/annurev.biochem.67.1.425 (1998)). 분해를 위한 단백질에 태그하기 위해, 진핵 세포는 프로테아좀-표적화 신호로서 역할을 하는 폴리-유비퀴틴 사슬에 의해 단백질을 공유적으로 변형시킨다. 이러한 번역 이후 변형 (즉, 유비퀴틴화)는 세 가지 부류의 효소, E1, E2, 및 E3의 순차적인 작용에 의해 달성된다 (Pickart, C. M. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem 70, 503-533, doi:10.1146/annurev.biochem.70.1.503 (2001)). 이러한 효소 가운데, 유비퀴틴 E3 결찰효소(E3 ligase)가 단백질 기질을 인식하고 표적 단백질에 대한 유비퀴틴-컨쥬게이션 E2 효소로부터 유비퀴틴 전달을 촉진함으로써 효소 캐스케티드에서 중심적인 역할을 한다 (Zheng, N. & Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annu Rev Biochem 86, 129-157, doi:10.1146/annurev-biochem-060815-014922 (2017)). 따라서, 유비퀴틴화의 특이성은 E3-기질 인터페이스에 의해 결정된다. 인간은 수백 개의 상이한 E3를 가진다. 추가적인 어댑터 단백질(adaptor protein)의 도움으로, 이러한 E3 결찰효소는 높은 특이성으로, 수천 개는 아니더라도, 수백 개의 기질 단백질을 인식하고 유비퀴틴화할 수 있다. 그럼에도 불구하고, E3 결찰효소에 대한 기질이 아닌 단백질이 존재한다.
유비퀴틴 결찰효소를 재연결하여 E3에 의해 처리되지 않는 바람직한 기질을 유비퀴틴화하고 분해할 수 있는 분자 접착제(molecular glue) E3 작용제를 발견하고 개발하기 위한 효과적인 방법을 수립해야할 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고 추가적인 관련 이점을 제공하고자 한다.
하나의 양태에서, 유비퀴틴 결찰효소 작용제를 식별하는 방법이 개시된다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 (a) 유비퀴틴 결찰효소를 후보 작용제 및 신생-기질(neo-substrate)과 접촉시키는 단계; 및 (b) 후보 작용제가 유비퀴틴 결찰효소를 신생-기질에 결합시키는데 효과적인지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 신생-기질에 대한 유비퀴틴 기질의 결합은 후보 작용제를 유비퀴틴 결찰효소 작용제로서 식별한다. 특정 구현예에서, 신생-기질에 대한 유비퀴틴 기질의 결합은 유비퀴틴 결찰효소, 작용제, 및 신생-기질을 포함하는 복합체를 제공한다.
상기 방법의 특정 구현예에서, 후보 작용제가 유비퀴틴 결찰효소를 신생-기질에 결합시키는데 효과적인지 여부를 결정하는 단계는 결합에 의해 생성된 신호를 관찰하는 것을 포함한다.
상기 방법의 특정 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 제1 보고제(reporting agent)를 추가적으로 포함하고 기질은 제2 보고제를 추가적으로 포함하며, 여기서 유비퀴틴 결찰효소가 신생-기질에 결합할 때, 제1 보고제는 제2 보고제와 함께 작용하여 신호를 생성한다. 상기 특정 구현예에서, 제1 보고제를 포함하는 유비퀴틴 결찰효소는는 여기 상태일 때 반응성 산소 종을 생성하도록 구성된 공여체 비드(donor bead)이고, 제2 보고제를 포함하는 신생-기질은 유비퀴틴 기질이 신생-기질에 결합할 때 반응성 산소 종의 존재하에 빛을 생성하도록 구성된 수용체 비드(acceptor bead)이다. 상기 특정 구현예에서, 공여체 비드는 감작제(sensitizer)가 여기 상태일 때 반응성 산소 종을 생성하도록 구성된 감작제를 포함한다. 상기 특정 구현예에서, 감작제는 감작제에 자극 전자기파가 조사될 때 반응성 산소 종을 생성하도록 구성된 광감작제(photosensitizer)이다. 특정 구현예에서, 광감작제는 프탈로시아닌(phthalocyanine)이다. 특정 구현예에서, 수용체 비드는 발광 화합물이 반응성 산소 종에 근접할 때 발광 빛을 생성하도록 구성된 발광 화합물이다. 대표적인 발광 화합물로는 싸이옥센(thioxene), 안트라센(anthracene), 루브렌(rubrenein), 및 이의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 반응성 산소 종은 일중항(singlet) 산소이다.
상기 방법의 특정 구현예에서, 후보 작용제가 유비퀴틴 결찰효소를 신생-기질에 결합시키는데 효과적인지 여부를 결정하는 단계는 결합에 의한 신호의 획득을 관찰하는 것을 포함한다.
상기 방법의 특정 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 제1 보고제를 추가적으로 포함하고 신생-기질은 제2 보고제를 추가적으로 포함하며, 여기서 유비퀴틴 결찰효소가 신생-기질에 결합할 때, 제1 보고제는 제2 보고제와 함께 작용하여 신호를 획득한다.
상기 방법의 특정 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 다중-서브유닛(multi-subunit) E3 유비퀴틴 결찰효소의 컬린-RING 슈퍼패밀리(cullin-RING superfamily)의 구성원, 기질 결합 도메인을 가지는 RING-유형 E3 결찰효소의 구성원, 또는 기질 결합 도메인을 가지는 HECT-유형 E3 결찰효소의 구성원이다.
상기 방법의 특정 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 KEAP1이다.
상기 방법의 특정 구현예에서, 신생-기질은 KRAS 또는 KRAS 돌연변이체(mutant)이다.
본 발명의 전술한 양태 및 수반되는 수많은 이점은 첨부하는 도면과 함께 다음의 상세한 설명을 참조하여 보다 잘 이해되는 것과 동일하게 더욱 용이하게 이해될 것이다.
도 1. E3　작용제로서 PROTAC와 분자 접착제의 비교. 도 2. KEAP1과 KRAS 사이에 상호작용을 촉진할 수 있는 분자 접착제 화합물의 개략도.
도 3. AlphaScreen-기반의 1차 스크리닝 및 반대-스크리닝 분석, 뿐만 아니라 원래 계획된 2차 스크리닝 분석의 설계. His-태그된 KRAS는 수용체 비드에 고정된 반면, 비오틴화 KEAP1이 공여체 비드에 결합된다. 소분자 화합물이 KEAP1-KRAS 상호작용을 촉진하는 경우, AlphaScreen에서 신호가 생성될 것이다. RBD-NRF2 데그론(degron) 융합 단백질이 양성 대조군으로서 사용될 것이다.
도 4. 2차 스크리닝으로서 Cisbio TR-FRET. 근접 기반 단백질-단백질 상호작용 분석인, TR-FRET 분석의 원리에 대한 개략도.
도 5. 저친화성 결합 (APTLAB) 분석을 추적하기 위한 조정 가능한 플랫폼의 설계. 상기 분석은 분자 접착 화합물에 의해 유도되는 두 단백질 사이의 약한 상호작용을 검출하기 위해 개발되었다. DNA 올리고 사이의 조정 가능한 약한 상호작용을 사용하여 화합물-유도된 약한 단백질-단백질 상호작용을 향상시킨다. 상기 시스템에서, 두 단백질은 개별적으로 단일 가닥 DNA와 컨쥬게이션되며, 상기 단일 가닥 DNA는 단백질-컨쥬게이션된 DNA 올리고에 상보적인 서열을 가지는 더 긴 단일 가닥 DNA에 의해 결합될 수 있다. DNA-단백질 컨쥬게이션은 박테리아 HUH 단백질에 의해 매개되는데, 이는 각각의 개별 단백질에 융합되며 티로신 잔기를 통해 특정 DNA 서열에 대한 컨쥬게이션을 촉매화할 수 있다.
도 6A 및 6B. APTLAB에 사용되는 DNA 올리고. HUH-특이적 DNA 서열 (ACCAG) 이외에도, DNA 올리고는 브릿지 올리고에 상보적인 서열을 가지는 상이한 길이를 특징으로 한다. 이러한 조정 가능한 특징은 DNA 올리고 사이에 단계별(graded) 친화성을 도입하도록 사용될 수 있다.
도 7A 및 7B. KEAP1 및 KRAS에 대한 단일 가닥 DNA 올리고의 컨쥬게이션. 상이한 길이의 두 DNA 올리고에 컨쥬게이션 전후의 KEAP-HUH 및 KRAS-HUH의 SDS-PAGE 분석.
도 8A-8C. 상이한 길이의 3 가지 ssDNA 브릿지 올리고의 설계. (A)　3 가지 올리고의 특이적 서열. (B) Octet BLI에 의해 검출되는 결합 신호 생성에 3 가지 올리고의 활성. (C) 두 가지 올리고의 존재하에 Octet BLI에 의해 검출되는 결합 신호에 미치는 하나의 적중 화합물의 영향.
도 9. APTLAB에 의해 검증된 19개의 적중 화합물의 활성 요약. 결합이 시작된 후 10분에 Octet BLI 결합 신호를 Y 축에 플로팅하였다.
도 10. 적중물 검증을 위한 분할 발광효소 분석의 설계. KEAP1과 KRAS 사이의 화합물-유도된 약한 상호작용은 결합 단백질 중 하나에 개별적으로 융합된 발광효소의 두 반쪽 사이의 상호작용을 촉진할 수 있다. 적중 화합물의 활성은 향상된 발광효소의 활성을 통해 검출될 수 있다.
도 11. 분할 발광효소 분석에 의해 검증된 적중 화합물 활성의 요약.
일부 구현예는, 종양 유전자 생성물에 결합하지 않는, 약물화가 불가능한(non-druggable) 종양 유전자 생성물과 인간 E3 결찰효소 사이의 상호 작용을 촉진하는 소분자 화합물 (예를 들어, 분자 접착제)의 발견 방법에 관한 것이다 (즉, 분자 접착제의 작용을 통해 결찰효소의 신생-기질이 된다).
일부 구현예는 유비퀴틴 결찰효소 작용제의 스크리닝 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: 유비퀴틴 결찰효소를 후보 작용제 및 신생-기질과 접촉시키는 단계; 및 후보 작용제의 존재하에 신생-기질에 대한 유비퀴틴 결찰효소의 결합 활성도를 측정하는 단계.
본 명세서에서 사용 시, 용어 "신생-기질"은 주어진 유비퀴틴 결찰효소에 대한 천연 기질이 아닌 단백질을 지칭한다. 용어 "신생-기질(neo-substrate)"은 분자 접착제로서 작용하는 작용제의 존재하에서만 주어진 유비퀴틴 결찰효소에 결합하는 단백질을 지칭하며, 이러한 분자 접착제는 결찰효소, 작용제, 및 신생-기질을 포함하는 복합체를 제공하는데 효과적이다. PROTAC 화합물 (단백질-표적화 키메라 분자(protein-targeting chimeric molecules))과는 대조적으로, 분자 접착제는 각각의 단백질에 대해 약간의 친화성을 갖거나 친화성을 전혀 가지지 않고, 오히려 삼원 상호작용을 촉진한다 (도 1). PROTAC 및 분자 접착제 모두 E3 작용제일 수 있고 표적 단백질 분해를 촉진할 수 있지만, 기계적으로 상이하다. PROTAC는 링커에 의해 연결되는 두 개의 개별 탄두(warhead)를 가지는 이작용성(bifunctioinal) 분자이다. 이러한 탄두는 E3와 기질을 동시에 모집하기에 매우 충분한 친화성을 가져야 한다. 이러한 요건은 PROTAC를 본질적으로 크게 만들어, 분자량이 500 Da를 쉽게 초과하게 한다. PROTAC의 기질은 탄두 화학적 모이어티에 대해 친화성을 나타내기 위해 배위 가능한(ligandable) 단백질이어야 한다. PROTAC 개발 접근법은 종래의 고처리량 스크리닝 방법을 사용하여 E3와 기질에 개별적으로 결합할 수 있는 화합물을 발견하고, 두 화합물을 링커 모이어티와 결합시키는 것을 포함한다. 규칙에 의해, 분자 접착제 화합물은 배위 불가능한 표적일 수 있는 기질에 대한 높은 친화성을 나타낼 필요는 없다. 분자 접착 화합물의 예상되는 분자량은 일반적인 소분자와 동일한 범위일 것이다.
일부 구현예에서, 후보 작용제는 분자량이 500 Da 미만, 250 Da 미만, 200 Da 미만, 175 Da 미만, 125 Da, 또는 100 Da 미만이다. 일부 구현예에서, 후보 작용제는 신생-기질에 대한 친화성을 실질적으로 가지지 않는다. 일부 구현예에서, 후보 작용제는 신생-기질에 대한 친화성을 가지지 않는다. 일부 구현예에서, 후보 작용제는 유비퀴틴 결찰효소에 대한 친화성을 실질적으로 가지지 않는다. 일부 구현예에서, 후보 작용제는 유비퀴틴 결찰효소에 대한 친화성을 가지지 않는다. 일부 구현예에서, 후보 작용제는 신생-기질과 결합하는 모이어티와 유비퀴틴 결찰효소와 결합하는 모이어티 모두를 포함하지 않는다 (예를 들어, 이작용성이 아니다).
일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소 및 신생-기질의 존재하에 후보 작용제의 용량 반응은 후보 작용제의 농도를 증가시킬 때 결찰효소/신생-기질의 실질적인 감소를 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 결찰효소/신생-기질의 결합 정도는 최대 결찰효소/신생-기질 결합에서의 농도보다 높은 농도에서 최대 결합 정도의 5%, 10%, 15%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 감소하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상의 분석을 사용하여 결합 활성을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 스크리닝 방법은 1차 분석을 사용하여 결합 활성을 측정하고, 검증을 위해 하나 이상의 2차 분석을 사용하여 결합 활성을 측정하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 분석은 유비퀴틴 결찰효소 및 신생-기질을 포함한다.
일부 구현예에서, 1차 분석은 증폭 발광 근접 동종 분석(amplified luminescent proximity homogenous assay)이다. 일부 구현예에서, 2차 분석은 TR-FRET 결합 분석, Biacore 결합 분석, Octet BLI 결합 분석, 또는 시험관 내 활성 분석으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 신생-기질에 대한 유비퀴틴 기질의 결합은 유비퀴틴 결찰효소, 작용제, 및 신생-기질을 포함하는 복합체를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 후보 작용제가 유비퀴틴 결찰효소를 신생-기질에 결합시키는데 효과적인지 여부를 결정하기 위한 후보 작용제를 스크리닝하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 후보 작용제를 스크리닝하는 단계는 결합에 의해 생성된 신호를 관찰하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 제1 보고제를 추가적으로 포함하고 기질은 제2 보고제를 추가적으로 포함하며, 여기서 유비퀴틴 결찰효소가 신생-기질에 결합할 때, 제1 보고제는 제2 보고제와 함께 작용하여 신호를 생성한다.
일부 구현예에서, 제1 보고제를 포함하는 유비퀴틴 결찰효소는 여기 상태일 때 반응성 산소 종을 생성하도록 구성된 공여체 비드이고, 제2 보고제를 포함하는 신생-기질은 유비퀴틴 기질이 신생-기질에 결합할 때 반응성 산소 종의 존재하에 빛을 생성하도록 구성된 수용체 비드이다.
일부 구현예에서, 공여체 비드는 감작제가 여기 상태일 때 반응성 산소 종을 생성하도록 구성된 감작제를 포함한다.
일부 구현예에서, 감작제는 감작제에 자극 전자기파가 조사될 때 반응성 산소 종을 생성하도록 구성된 광감작제이다.
일부 구현예에서, 광감작제는 프탈로시아닌이다.
일부 구현예에서, 수용체 비드는 발광 화합물이 반응성 산소 종에 근접할 때 발광 빛을 생성하도록 구성된 발광 화합물이다.
일부 구현예에서, 발광 화합물은 싸이옥센, 안트라센, 루브렌, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 반응성 산소 종은 일중항 산소이다.
일부 구현예에서, 후보 작용제가 유비퀴틴 결찰효소를 신생-기질에 결합시키는데 효과적인지 여부를 결정하는 단계는 결합에 의한 신호의 획득을 관찰하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 제1 보고제를 추가적으로 포함하고 신생-기질은 제2 보고제를 추가적으로 포함하며, 여기서 유비퀴틴 결찰효소가 신생-기질에 결합할 때, 제1 보고제는 제2 보고제와 함께 작용하여 신호를 획득한다.
일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 다중-서브유닛 E3 유비퀴틴 결찰효소의 컬린-RING 슈퍼패밀리의 구성원, 기질 결합 도메인을 가지는 RING-유형 E3 결찰효소의 구성원, 또는 기질 결합 도메인을 가지는 HECT-유형 E3 결찰효소의 구성원이다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 기질 결합 도메인을 가지는 결찰효소의 HECT, RING-type, U-box, 및 PHD-핑거 유형의 구성원이다.
일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 KEAP1이다. 일부 구현예에서, 신생-기질은 KRAS 또는 KRAS 돌연변이체이다.
스크리닝 방법
다음은 (유비퀴틴화를 통해) 표적화된 신생-기질 분해를 위한 유비퀴틴 결찰효소의 소분자 작용제를 식별하기 위해 소분자를 스크리닝하는 대표적인 방법을 기재한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 분석은 유비퀴틴 결찰효소 결합 활성을 스크리닝하기 위해 설계된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 분석은 KEAP1 및 KRAS/KRAS 돌연변이체 결합을 스크리닝하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 스크리닝을 위해 둘 이상의 분석이 사용된다. 일부 구현예에서, 스크리닝 방법은 1차 분석으로 후보 작용제를 스크리닝하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 스크리닝 방법은 결합 활성을 검증하기 위한 2차 스크리닝 분석으로 후보 작용제를 스크리닝하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 스크리닝에 사용되는 분석은 증폭 발광 근접 동종 분석이며, 이러한 분석은 유비퀴틴 결찰효소 및 신생-기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 분석은 공여체 비드에 부착된 유비퀴틴 결찰효소 및 수용체 비드에 부착된 신생-기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 분석은 수용체 비드에 부착된 유비퀴틴 결찰효소 및 공여체 비드에 부착된 신생-기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소 작용제의 존재하에 유비퀴틴이 신생-기질에 결합할 때, 공여체 비드 및 수용체 비드는 상호작용하여 신호를 생성한다.
일부 구현예에서, 스크리닝에 사용되는 분석은 저친화성 결합 분석 (APTLAB)을 추적하기 위한 조정 가능한 플랫폼이다. 일부 구현예에서, 스크리닝에 사용되는 분석은 TR-FRET (시간 분해 형광 공명 에너지 전달(time resolved-fluorescence resonance energy transfer))이다. 일부 구현예에서, 스크리닝에 사용되는 분석은 분할 발광효소 분석이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상의 분석을 사용하여 결합 활성을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 스크리닝 방법은 1차 분석을 사용하여 결합 활성을 측정하고, 검증을 위해 하나 이상의 2차 분석을 사용하여 결합 활성을 측정하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 분석은 유비퀴틴 결찰효소 및 신생-기질을 포함한다.
일부 구현예에서, 1차 분석은 증폭 발광 근접 동종 분석(amplified luminescent proximity homogenous assay)이다. 일부 구현예에서, 분석은 유비퀴틴 결찰효소 작용제의 존재하에 유비퀴틴 결찰효소와 신생-기질 사이이 결합을 향상시키는데 사용될 수 있는 DNA 올리고(oligo) 사이의 조정 가능한 상호작용을 이용한다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 제1 단일 가닥 DNA에 컨쥬게이션되고, 신생-기질은 제2 단일 가닥 DNA과 컨쥬게이션되며, 여기서 제1 단일 가닥 DNA 및 제2 단일 가닥 DNA은 단백질-컨쥬게이션된 제1 및 제2 단일 가닥 DNA에 상보적인 서열을 가지는 더 긴 단일 가닥 DNA 조각에 의해 결합된다. DNA-단백질 컨쥬게이션은 박테리아 HUH 단백질에 의해 매개되는데, 이는 각각의 개별 단백질에 융합되며 티로신 잔기를 통해 특정 DNA 서열에 대한 컨쥬게이션을 촉매화할 수 있다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소 작용제의 존재하에 유비퀴틴 결찰효소와 신생-기질의 결합은 상보적 DNA 사이에 상호작용을 통해 향상될 수 있으며 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 2차 분석은 TR-FRET 결합 분석, Biacore 결합 분석, Octet BLI 결합 분석, 또는 시험관 내 활성 분석으로부터 선택된다.
표적 선별
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 먼저 신생-기질을 선별하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 기질 단백질을 선별하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질 단백질은 유비퀴틴화 및 분해될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 신생-기질 및 기질 단백질에 대해 결합할 때 기질 단백질을 유비퀴틴화할 수 있는 하나 이상의 E3 유비퀴틴 결찰효소를 선별하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질 단백질 및 E3　유비퀴틴 결찰효소는 신생-기질과 상호작용한 후 함께 결합할 수 있다. 종래의 신약 발견과 달리, E3　결찰효소를 화학적으로 재프로그램이하여 신생-기질을 유비퀴틴화하려는 노력은 두 가지 "표적", 유비퀴틴 E3 결찰효소 및 기질 단백질을 수반한다. 첫 번째 단계로서, 유비퀴틴화 및 분해되는 해당 단백질을 먼저 선별함으로써, "기질-중심" 접근법을 취했다. 이것은, 특정 E3에 초점을 맞추고 상이한 기질을 유비퀴틴화하는 잠재력을 연구하는 "결찰효소-중심" 접근법과 대조적이다. 기질이 식별되면, 하기 명시된 여러 기준에 따라 하나 이상의 적절한 E3를 선택하였다
일부 구현예에서, 신생-기질 단백질은 신생-기질의 부재하에 E3　유비퀴틴 결찰효소에 직접적으로 결합하지 않는다. 다수의 인간 질병은 돌연변이, 조절 장애, 또는 유해한 유전자 생성물에 의해 야기되며, 이를 하향-조절하면 질병 진행을 늦추고 즐병 증상을 완화시킬 수 있다. 분자 접착제 E3 작용제의 고유한 힘을 이용하기 위해, 약물화가 불가능하고 특히 배위 불가능한 표적을 고려하였다. 이러한 표적은 약물화가 불가능한 구형 도메인을 가졌을 수 있거나, 배위 가능한 부위를 가지지 않고 본질적으로 이상이 있을 수 있다. 특히 코돈 12 및 61에서의, KRAS의 돌연변이 및 기타 RAS 아형(isoform)은 GTPase를 발암성으로 만들 수 있고, 췌장암, 폐암 및 결장암에서 자주 발견된다. GTP-결합 포켓으로 인해, KRAS 돌연변이체는 높은 친화성 및 높은 세포 GTP 농도로 인해 약물화가 불가능할 수 있다. 뉴클레오타이드-결합 포켓 외부에, KRAS는 소분자에 의해 표적화될 수 있는 깊은 표면 공동을 거의 제공하지 않는다. 기존의 KRAS-결합 화합물에 대해 보고되어 있는 가장 높은 친화성은 ~ 100M이다 (Maurer, T. et al. Small-molecule ligands bind to a distinct pocket in Ras and inhibit SOS-mediated nucleotide exchange activity. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 5299-5304, doi:10.1073/pnas.1116510109 (2012)). 따라서, 종양 유전자 생성물은 분자 접착제 E3 작용제에 의해 하향 조절을 위한 표적이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 KRAS 또는 KRAS 돌연변이체에 결합 및 이를 유비퀴틴화할 수 있는 유비퀴틴 결찰효소를 선별하는 것을 포함한다. 적절한 E3를 선별하기 위해 다음의 몇 가지 기준이 사용될 수 있다: (1) 유비퀴틴 결찰효소는 세포기질(cytosol) 또는 원형질막(plasma membrane)에 국한되며, 여기서 KRAS가 합성 및 작용기화된다; (2) 유비퀴틴 결찰효소는 여러 조직에서 보편적으로 발현되어 작업 화합물이 상이한 암 징후에 대해 테스트될 수 있다; (3) 유비퀴틴 결찰효소는 상세히 특징 분석되어, 모노유비퀴틴화 또는 비-Lys48 연결부를 가지는 폴리유비퀴틴 사슬 어셈블리 대신에 기질 폴리유비퀴틴화 및 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다; (4) 유비퀴틴 결찰효소는 충분히 풍부하여, 이의 내인성 기능이 분자 접착제 화합물에 의해 손상될 가능성이 낮다; 및 (5) 유비퀴틴 결찰효소는 구조적으로 분석되어 있으며 대규모 정제를 위해 수정될 수 있다. E3 결찰효소 가운데, KEAP1가 상기 나열된 기준을, 모두는 아니더라도, 가장 만족시키는 후보로서 식별되었다 (도 2).
일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 세포기질 또는 원형질막에 국한된다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 신생-기질이 작용기화 및 합성되는 곳에 국한된다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 하나 이상의 조직에서 발현된다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 모노유비퀴틴화 또는 비-Lys48 연결부를 가지는 폴리유비퀴틴 사슬 어셈블리를 대신해 기질 폴리유비퀴틴화 및 분해를 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 소분자 길항제에 결합한 후 내인성 기능을 유지하는데 충분한 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 대규모 정제에 적합하다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 유비퀴틴 결찰효소에 직접적으로 또는 자연적으로 결합하지 않는 신생-기질을 식별하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 유비퀴틴 결찰효소와 신생-기질 상호작용을 촉진하는 화합물을 스크리닝하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 KEAP1과 KRAS 상호작용을 촉진하는 화합물을 스크리닝하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 변형된 단백질-단백질 상호작용 (PPI) 분석을 사용하여 후보 작용제를 스크리닝하는 것을 포함한다. KRAS-KEAP1 상호작용을 촉진할 수 있는 화합물을 식별하기 위해, 변형된 종래의 단백질-단백질 상호작용 (PPI) 분석을 사용하여 소분자 라이브러리를 스크리닝하였다. PPI-억제 소분자를 찾기 위한 일반적인 "하향" 스크리닝 대신에, 본 명세서에 기재된 분석은 비-상호작용 쌍으로서 KRAS 및 KEAP1으로 설정하였고, "상향" 스크리닝은 양성 PPI 신호를 생성하는 화합물을 찾도록 수행하였다. 목표는 KRAS-KEAP1 상호작용을 유도하는 검출 가능한 활성을 나타내는 임의의 소분자를 식별하는 것이었다 (도 2). 이러한 유형의 PPI 상향-스크리닝은 이전에 체계적으로 테스트된 적이 없다. 상향-스크리닝에서 신호의 획득과 관련된 위양성 적중은 하향 스크리닝에서의 적중보다 더 낮다. KRAS 및 KEAP1은 서로에게 무한한 방법으로 표면을 제공할 수 있었으며, 많은 수의 화학 물질이 이러한 불완전한 상호작용 중 하나를 보완하여 삼원 복합체 형성을 촉진시키는 기회를 가질 수 있었다.
고처리량 스크리닝 분석
1차 스크리닝 분석
AlphaScreen (Perkin Elmer, Inc., Waltham WA)는 비드 기반의, 비-방사성 증폭 발광 접근 균질 분석이다. 분석 시스템은 공여체 및 수용체 비드로 구성되며, 생물학적 상호작용에 의해 유도된 근접성은 일련의 화학 반응을 유발하여 크게 증폭된 신호를 생성한다. 사용된 공여체 비드는 스트렙타비딘 공여체 비드 (PE#6760002)이고, 사용된 수용체 비드는 Anti-6xHis 수용체 비드 (PE#AL128C)이었다. 레이저 여기(laser excitation)에서, 공여체 비드의 광감작제가 주변의 산소를 더욱 여기된 일중항 상태로 변환한다. 일중항 상태의 산소 분자는 확산되어 수용체 비드 내 싸이옥센 유도체와 반응하고, 370　nm에서 화학발광을 생성하며, 이는 동일한 비드 내에 포함된 형광단을 추가적으로 활성화한다. 형광단은 이후 520-620 nm에서 빛을 방출한다. 광범위한 친화성 (pM - mM)을 감지하는데 적합한 초고감도, 소형화에 대한 적응성, 및 다중화에 대한 가능성으로 AlphaScreen을 선택하였다. 상기 PPI 분석에서, 정제된 비오틴화 KEAP1 켈치(kelch) 반복 도메인이 스트렙타비딘 공여체 비드에 고정되었고, 8xHis-태그된 전장 SG12D 돌연변이체 단백질이 항-His 수용체 비드에 고정되었다 (도 3). 두 단백질은 일반적으로 서로 상호 작용하지 않기 때문에, 두 비드의 혼합물은 알파 신호를 생성하지 않았다.
실온의 384 웰 화이트 플레이트에서 분석을 수행하였다. 테스트 용액은 25 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, 0.05% BSA, 및 1mM TCEP을 포함하였다. KEAP1 및 KRAS 단백질 그리고 테스트 화합물 각각 10 μL를 각각의 웰에서 혼합하였다. 10 μL의 수용체 비드를 첨가하고 어둠속에서 혼합물을 인큐베이션하였다. 마지막으로, 10 μL의 공여체 비드를 혼합물에 첨가한 다음, 플레이트를 판독하였다. 분석은 최대 4%의 DMSO까지 쉽게 견딜 수 있었다. 적중 절단점(cut-off)으로서 평균 + 3x 표준 편차 (SD)를 사용하여, 두 플레이트 파일럿 테스트는 적중률이 1.52%에 도달한 것으로 나타났다. 분석이 검증된 후, 17,774 개의 화합물 라이브러리가 포함된 소규모 파일럿 스크리닝을 수행하였다. 평균 + 3x SD 절단점을 기준으로, 파일럿 스크리닝은 575 적중을 수득하였고 적중률은 3.2%이었다.
화합물 검증
2차 스크리닝 - Cisbio TR-FRET
AlphaScreen 분석의 초고감도로 인해, AlphaScreen에 직교하는 2차 스크리닝을 사용하여 적중 화합물을 추가적으로 검증하였다. Cisbio PPI 기술인, TR-FRET (시간 분해 형광 공명 에너지 전달)을 사용하여 용량 반응 연구에 기반하여 가장 높은 효능을 가지는 화합물을 확인하였다 (도 4).
AlphaScreen을 사용한 반복된 용량 반응 연구에서 살아남아 TR-FRET으로 테스트된 화합물로부터, KRASG12D-KEAP1 상호작용을 촉진하는 활성 (TR-FRET에 의한 검증으로 보다 높은 효능)으로 20개의 상위 적중을 식별하였다 (도 4).
2차 스크리닝 - APTLAB
TR-FRET은 적중 검증에 유익한 두 번째 스크리닝으로 사용할 수 있지만, 그 원리는 AlphaScreen과 유사하며 비드 기반 및 근접 유도 신호에 의존한다. 적중 화합물을 추가적으로 AlphaScreen 및 TR-FRET 방법과는 구별되는 추가적인 방법으로 검증하였다. Octet BioLayer 간섭기법 (BLI), 크기 배제 크로마토그래피, 및 친화성 풀 다운(affinity pull down)을 비롯한 PPI를 검출하기 위한 종래의 몇 가지 방법은 긍정적인 결과를 얻지 못했으며, 이는 적중물의 활성이 매우 낮을 수 있음을 시사한다. 즉, 이러한 화합물이 KRAS-KEAP1 상호작용을 촉진할 수 있지만, 생성된 삼원 복합체가 너무 불안정하여 기존 방법으로는 검출할 수 없다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 새로운 분석법이 설계되었고 (본 명세서에서 APTLAB, 저친화성 결합을 추적하기 위한 조정 가능한 플랫폼(adjustable platform for tracking low affinity binding)으로 지정) (도 5), 이러한 분석법에서 다양한 길이를 가지는 상보적 DNA 가닥 사이의 약한 상호작용은 KRAS와 KEAP1 사이의 화합물-유도된 낮은 친화성 결합을 향상시키고 종래의 방법에 의해 검출되도록 만드는데 사용되었다.
조정 가능한 DNA 올리고뉴클레오타이드 상호작용을 낮은 친화성 단백질-단백질 상호작용인 단백질 접힘과 결합시키기 위해, 특이적 단일 가닥 DNA (ssDNA) 올리고뉴클레오타이드와 반응할 수 있고 공유적으로 연결된 단백질-DNA 컨쥬게이트를 형성할 수 있는 HUH를 이용하였다 (Lovendahl, K. N., Hayward, A. N. & Gordon, W. R. Sequence-Directed Covalent Protein-DNA Linkages in a Single Step Using HUH-Tags. J Am Chem Soc　139, 7030-7035, doi:10.1021/jacs.7b02572 (2017)). HUH 단백질은 KEAP1 및 KRASG12D의 C-말단에 개별적으로 융합되어, 두 개의 키메라 단백질이 각각 HUH-반응성 서열을 포함하는 ssDNA와 공유 연결을 형성할 수 있다 (도 5 및 6). 정제된 HUH 융합 단백질은 20 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 1mM MgCl2 및 1mM MnCl2를 함유하는 완충액에서 100　μM로 조정되었다. ssDNA 올리고뉴클레오타이드를 120 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 반응 샘플을 음성 대조군과 나란히 SDS-PAGE 겔에서 실행하여 컨쥬게이션 효율을 확인하였다. DNA 컨쥬게이션된 HUH 융합 단백질은 SDS-PAGE 겔에서 느리게 이동한다.
HUH-반응성 서열 이외에도, 두 개의 키메라 단백질에 연결된두 개의 ssDNA 올리고뉴클레오타이드 또한, 각각 ssDNA 브릿지 올리고뉴클레오타이드의 절반에 상보적인 추가적인 서열을 포함한다 (도 6). 브릿지 ssDNA가 두 개의 단백질-연결된 올리고뉴클레오타이드와 어닐링하면, 물리적으로 KRAS와 KEAP1를 단일 복합체가 되도록 할 것이다. 브릿지 ssDNA의 길이를 변화시키면, DNA-DNA 상호작용의 친화성이 변할것이다. 브릿지 올리고뉴클레오타이드가 충분히 길면, 두 개의 키메라 단백질은 이의 DNA 부분을 통해 서로 안정하게 결합할 것이다. 생성된 복합체의 형성은 Octet BLI와 같은 종래의 방법에 의해 검출될 수 있다. 브릿지 ssDNA의 길이가 점차 짧아지면, DNA-DNA 상호작용의 친화성이 약해질 것이며, 검출할 수 없게 된다. 브릿지 올리고뉴클레오타이드의 길이를 적정함으로써, 특정 길이에서 변곡점이 관찰될 것이다. 상기 변곡점에서, 두 키메라 단백질 사이의 추가적인 약한 상호작용이 복합체의 안정성을 향상시키는 잠재력을 가지며 종래의 방법에 의해 검출 가능하게 만든다. 상기 접근법의 근거는 결합 에너지 변화와 결합 친화도 차이 사이의 비선형 관계에 달려 있다.
G= -RT ln(Kd1/Kd2) (1)
식 (1)에 따라, 소량의 추가적인 결합 에너지를 도입하면 상호작용하는 두 파트너의 친화력을 기하 급수적으로 향상시킬 수 있다. 전반적으로, APTLAB은 강력한 상호작용을 측정하는 데 적합한 기존 방법을 사용하여 또 다른 약한 상호작용에 의해 증가되는 약한 PPI를 검출하도록 설계된다.
APTLAB를 구현하기 위해, HUH-융합 비오틴화 KEAP1 및 His-KRASG12D를 준비하고 ssDNA 및 HUH 컨쥬게이션 분석을 수행하였으며, 여기서 두 ssDNA 올리고뉴클레오타이드는 개별적으로 HUH이 융합된 비오틴-KEAP1 (도 6A) 및 His-KRASG12D (도 6B)에 개별적으로 연결되었다. 다음의 APT-LAB 테스트를 위해 ssDNA Reco-C12 연결된 비오틴-KEAP1-HUH, 즉 KEAP1-ssDNA12, 및 ssDNA Reco-A18 연결된 His-KRASG12D-HUH (KRASG12D-ssDNA18)를 선택하였다.
ssDNA 브릿지 올리고뉴클레오타이드는 33, 28 및 23 개의 뉴클레오타이드 (nt)의 상이한 길이로 합성하였고 (도 8A), BLI에 의해 모니터링된 바와 같이 두 ssDNA-단백질 컨쥬게이션 사이에 복합체 형성을 촉진하는 능력을 테스트하였다. 가장 긴 ssDNA-브릿지33nt는 KEAP1-ssDNA12와 KRASG12D-ssDNA18 사이의 강력한 복합체 형성을 촉진하였고 높은 BLI 신호를 생성하였다 (도 8B). 대조적으로, ssDNA-브릿지28nt에 대한 결합 신호는 현저히 낮은 반면, 가장 짧은 브릿지 올리고뉴클레오타이드 ssDNA-브릿지23nt에 의해 매개되는 상호작용은 검출하기에 너무 약했다. 이에 따라, ssDNA-브릿지-28nt를 적중 화합물에 의해 유도된 KEAP1과 KRAS 사이 약한 결합을 테스트하기에 잠재적으로 적합한 변곡점 브릿지 올리고뉴클레오타이드로 결정하였다.
화합물을 DMSO에 용해시켰다. 상기 접근법에 사용되는 ssDNA가 Table1에 나열된다. ssDNA는 헤어핀(hairpin)을 피하기 위해 신중하게 설계되었다. For DNA-DNA 페어링 영역의 경우, Reco-C12는 33.3% A 및 66.7% C를 적용한 반면, Reco-A18는 33.3% C 및 66.7% A를 적용하였고, 이러한 차이로 인해 ssDNA-브릿지는 Reco-C12 및 Reco-A18가 바람직한 방향으로 결합하였다. ssDNA 및 HUH의 시험관 내 컨쥬게이션 방법이 이전에 보고되어 있다 (Lovendahl, K. N., Hayward, A. N. & Gordon, W. R. Sequence-Directed Covalent Protein-DNA Linkages in a Single Step Using HUH-Tags. J Am Chem Soc　139, 7030-7035, doi:10.1021/jacs.7b02572 (2017)). 컨쥬게이션 이후, ssDNA 표지 단백질을 추가적으로 정제하여 유리 ssDNA 및 미표지 단백질을 제거하였다. KEAP1-ssDNA12 (ssDNA Reco-C12 연결된 비오틴 -KEAP1-HUH) 및 KRASG12D-ssDNA18 (ssDNA Reco-A18 연결된 His-KRASG12D-HUH)를 Octet에 의해 검출되는 다음의 결합 분석에 사용하였따.
MG의 존재 여부와 관계없이 ssDNA-브릿지의 존재하에서 KEAP1-ssDNA12 (비오틴-태그) 및 KRASG12D-ssDNA18의 상호작용을 Octet Red 96 (ForteBio, Pall Life Sciences)를 사용하여 제조업체의 절차에 따라 측정하였다. 먼저, 스트렙타비딘이 코팅된광학 프로브를 완충액에서 수화시켰다. 두 번째로, 프로브는 광학 신호 ~ 1.6 nM에 대해 50 nM KEAP1-ssDNA12로 로딩하였다 (대부분의 스트렙타비딘은 KEAP1-ssDNA12에 결합). 세 번째로, 프로브에 남아있는 유리 스트렙타비딘을 차지하기 위해 500 nM 비오시틴에 프로브를 담지시켰다. 네 번째로, 베이스라인을 위해 프로브를 완충액에 넣었다. 다섯 번째로, KRASG12D-ssDNA18과 KEAP1-ssDNA12의 결합을 검출하기 위해 프로브를 샘플 웰 (화합물의 존재 여부와 관계없이 1uM KRASG12D-ssDNA18 및 82.5 nM ssDNA-브릿지의 혼합물)에 삽입하였고, 광학 신호 증가는 결합이 발생했음을 나타내며 결합 신호로서 처리되었다. 여섯 번째로, 결합된 KRASG12D-ssDNA18의 해리를 모니터링하기 위해 프로브를 완충액에 침지시켰다. 반응은 30 ℃로 유지되는 블랙 96 웰 플레이트에서 수행하였으며 반응 부피는 각 웰에서 200 μL이었다. 분석 완충액은 25 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.05% BSA를 가지는 0.1% Tween 20를 포함하며 1 mM TCEP를 새로 첨가하였다.
표 1. ssDNA
ssDNA 서열 (참고: 소문자 서열은 HUH에 의해 인식된다.)
Reco-C12 5'-aagtattaccagCCACCACACACC-3'
(서열 번호 2)
Reco-A18 5'-aagtattaccagCAAAACAACAACAACAAC-3'
(서열 번호 3)
ssDNA-브릿지33nt 5'-GTTGTTGTTGTTGTTTTGTATGGTGTGTGGTGG-3'
(서열 번호 4)
ssDNA-브릿지28nt 5'-GTTGTTGTTGTTTTGTATGGTGTGTGGT-3'
(서열 번호 5)
ssDNA-브릿지23nt 5'-GTTGTTGTTTTGTATGGTGTGTG-3'
(서열 번호 6)
상기 실험 설정에서, 1차 스크리닝 적중 화합물 중 하나를 테스트하였다. DMSO 단일 대조군과 비교하여, 적중 화합물의 첨가는 KEAP1-ssDNA12 및 KRASG12D-ssDNA18를 가지는 BLI 신호가 상당히 증가하였다 (도 8C). 이러한 영향은 용량 의존적이며 KEAP1-ssDNA12 및 KRASG12D-ssDNA18 모두의 존재에 의존한다. 이러한 결과는 적중 화합물이 KEAP1-ssDNA12 및 KRASG12D-ssDNA18 상호작용을 촉진하는 활성을 가지며, 두 단백질 사이의 인터페이스에서 결합할 가능성이 가장 높은 것을 강력하게 시사한다. 유사한 접근법을 사용하여, TR-FRET 2차 스크리닝에서 식별된 20 개의 적중 화합물 중 대부분의 활성을 검증하였다 (도 9).
2차 Screen - 분할 발광효소 분석
APTLAB의 개발과 병행하여, 추가적인 약한 상호작용에 의해 증가된 약한 상호 작용을 검출하는 동일한 원리를 사용하여 대안의 2 차 스크리닝 분석을 개발하였다. 작고 안정한 발광효소인 분석에 기초하여 (Dixon, A. S. et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chem Biol 11, 400-408, doi:10.1021/acschembio.5b00753 (2016)) 분할 발광효소 분석을 개발하였으며 (도 10), 이러한 분석법은 분자 산소의 존재하에 밝은 발광을 생성하는 퓨리마진을 사용할 수 있다. 효소 (PDB ID: 5IBO)는 큰 BiT (LBiT; 159 개의 아미노산, 17.6 kDa) 및 작은 BiT (SBiT; 11 개의 아미노산)의 두 부분으로 분할되며, 이는 해당 두 단백질에 융합될 수 있다. 두 융합 단백질을 근접하게 할 수 있는 단백질-단백질 상호작용이 존재하는 경우, LBiT 및 SBiT는 기능적인 Nanoluc 효소를 형성하여 밝은 광 신호를 생성할 수 있다. LBiT와 SBiT 사이의 본질적인 친화성이 매우 약하기 때문에 (Kd = 190 μM), 이러한 기술은 약한 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 분자 접착 화합물에 의해 유도되는 KEAP1과 KRASG12D 사이의 상호작용을 검출하는데 적합하다.
이러한 설계를 구현하기 위해, SBiT 및 LBiT를 각각 KRASG12D의 N-말단 및 KEAP1의 C-말단에 융합시켰다. KRASG12D와 KEAP1는 서로 자연적으로 상호작용하지 않기 때문에, 두 키메라 단백질과 루피세린의 혼합물은 produced very 매우 낮은 발광 신호를 생성하였다.
분할 발광효소 분석은 Promega에서 개발한 NanoLuc Binary Technology에 대해 기재된 일반 절차에 따라 수행하였다. SBiT-KRASG12D 및 KEAP1-LBiT 융합 단백질을 20 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 및 0.1%　BSA-FAF를 포함하는 50 L 완충액에서 2.5 nM의 최종 농도로 혼합하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 50 L의 동일한 반응 완충액을 2　L의 루시페린 저장 용액 (Promega으로부터 구매)과 혼합한 다음, 96-웰 화이트 플레이트의 단백질 혼합 용액에 첨가하였고, 2 분간 진탕하였다. 플라스틱 시트로 덮힌 플레이트를 사용하여, 루시페린 혼합 후 4 분에 Perkin Elmer Enspire 2300 멀티플레이트 판독기로 반응 시간 과정을 모니터링하였다. 상기 분석을 사용하여, TR-FRET 2차 스크리닝에서 식별된 20 개의 적중 화합물 중 대부분을 검증하였다 (도 11).
단백질 제조 방법
클로닝
상이한 분석을 위한 모든 작제물은 인간 KEAP1 켈치 도메인 (잔기 320-612, UniProtKB-Q14145, 이하 KEAP1로서 지칭, PDB ID: 2FLU) 및 부위 돌연변이 G12D (이하 KRASG12D로서 지칭, PDB ID: 4DSN)를 가지는 전장 인간 KRAS4B (UniProtKB-P01116-2)의 구조에 기초하여 설계하였다.
모든 단백질-코딩 DNA 서열은 PCR에 의해 증폭되고 pET15 및 pET41으로부터 변형된 결찰-독립 (LIC) 발현 벡터의 하나의 세트로 클로닝되었다. 8xHis-(GS)4-KRASG12D 및 8xHis-(GS)4- KRASG12D -(GS)8-HUH 모두를 pET41 LIC 벡터에 삽입하였다. 다른 작제물은 N-말단 6-히스티딘 태그를 보유하는 pET15 LIC 벡터로 클로닝되었다. N-말단 말토스 결합 단백질 (MBP) 융합 태그는 114-(GS)8-KRASG12D의 수율을 개선하도록 사용하였다.
단백질 발현 및 정제
플라스미드를 BL21 (DE3) E. coli 숙주로 형질전환하고, 37℃에서 세포를 600 nm에서 ∼ 0.5의 광학 밀도로 성장시킨 후 16℃로 옮겼다. 그 후, 흡수가 0.8에 도달했을 때 아이소프로필-β-d-1-싸이오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 0.2 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 16 ℃에서 IPTG 유도 16시간 후 세포를 수확하였다.
20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 0.5 mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP), 20 mM 이미다졸 및 1　mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF)를 포함하는 완충액에 세포 펠렛을 재현탁시켰다. 미세 유동기를 통과시켜 용해시킨 후, 세포 용해물을 20,000 g에서 1 시간 동안 원심 분리하고 상층액을 Ni-NTA 컬럼에 로딩하였다. 표적 단백질을 동일한 완충액에서 200 mM 이미다졸으로 용리시켰다.
KEAP1 작제물의 경우, N-말단 His-태그를 담배 식각 바이러스 (tobacco etch virus, TEV) 프로테아제에 의해 절단하였다. 비오틴화 후, KEAP1 단백질을 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가적으로 정제하였다. Ni-NTA 컬럼으로부터 용리된 후, KRASG12D를 HiTrap-SP 컬럼 (GE Healthcare)에서 추가적으로 정제하였다. 그 후, 뉴클레오타이드 교환 분석을 수행하여 균질 GTP-결합 KRASG12D을 수득한 다음, 크기 배제 크로마토 그래피를 수행하였다.
비오틴화 반응
KEAP1 작제물의 비오틴화에 AviTagTM 기술 (Avidity)을 사용하였다. AviTag (서열: GLNDIFEAQKIEWHE (서열 번호 1))은 E. coli 비오틴 결찰효소 (BirA) 효소의 기질이며, 비오틴 분자를 라이신 잔기에 컨쥬게이션하게 한다. 정제된 AviTag-fused KEAP1의 농도를 100 μM로 조정한 후, ATP, 염화 마그네슘, 정제된 비오틴 결찰효소 BirA 및 D-비오틴을 각각 최종 농도가 2 mM, 5 mM, 1 μM 및 200 μM으로 첨가하였다. 샘플을 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 다음의 스트렙타비딘 겔-시프트 분석으로 비오틴화 효율을 결정하였다: 두 개의 PCR 튜브에 각각 1 μL의 비오틴화된 KEAP1 샘플 및 10 μL의 1× SDS-PAGE 완충액을 포함하도록 제조; 두 샘플 모두 95 ℃에서 5 분간 가열; 샘플을 실온으로 냉각시킨 후, 샘플 중 하나에 1 μL의 100 μM 스트렙타비딘 (IBA-Lifesciences)을 첨가하고 실온에서 5 분간 인큐베이션; 두 샘플 모두 SDS-PAGE 겔에서 나란히 실행. 스트렙타비딘의 존재하에 KEAP1이 완전히 사라진 것은 비오틴화 반응이 종료된 것을 나타낸다.
뉴클레오타이드 교환
정제된 KRAS의 대부분은 고유한 GTPase 활성으로 인해 결국 비활성 GDP-결합 상태로 전환되었다. 활성화된 GTP-결합 형태로 단백질을 제조하기 위해, 결합된 GDP를 가수 분해가 불가능한 GTP 유사체, 예컨대 구아노신-5′βγ메틸레노] 트라이포스페이트 (GMP-PCP)으로 대체하였다. 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM (NH4)2SO4, 10 μM ZnCl2, 5 mM DTT 및 1 mM GMPPCP를 포함하는 완충액에서 KRASG12D의 농도를 100 μM으로 조정하였다. 세파로스 비드 (Sigma P-0762)에 컨쥬게이션된 알칼리성 포스파타제를 10　U/ml으로 첨가하였다. 실온에서 부드럽게 교반하면서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 반응에 10 mM MgCl2를 보충하고 짧은 원심 분리 스핀으로 알칼리성 포스파타제 비드를 제거하였다. GTP-결합된 KRASG12D를 크기 배제 크로마토그래피로 추가적으로 정제하여 20 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.5 mM TCEP를 포함하는 완충액에서 유리 뉴클레오타이드를 제거하였다.
상기 제공된 참조 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다.
예시적인 구체예가 예시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Washington Zheng, Ning Cao, Shiyun Hinds, Thomas R. Li, Heng Mao, Haibin <120> Methods for Screening Ubiquitin Ligase Agonists <130> UWOTL-1-70157 <150> US 62/746957 <151> 2018-10-17 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 aagtattacc agccaccaca cacc 24 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 aagtattacc agcaaaacaa caacaacaac 30 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 gttgttgttg ttgttttgta tggtgtgtgg tgg 33 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 gttgttgttg ttttgtatgg tgtgtggt 28 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 gttgttgttt tgtatggtgt gtg 23

Claims (16)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 유비퀴틴 결찰효소 작용제(ubiquitin ligase agonist)를 식별하는 방법:
    (a) 유비퀴틴 결찰효소를 후보 작용제 및 신생-기질(neo-substrate)과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 후보 작용제가 유비퀴틴 결찰효소를 신생-기질에 결합시키는데 효과적인지 여부를 결정하는 단계로서, 여기서 유비퀴틴 기질이 신생-기질에 결합하면 후보 작용제를 유비퀴틴 결찰효소 작용제로서 식별하는 것인 단계.
  2. 제1항에 있어서, 신생-기질에 대한 유비퀴틴 기질의 결합은 유비퀴틴 결찰효소, 작용제, 및 신생-기질을 포함하는 복합체를 제공하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 후보 작용제가 유비퀴틴 결찰효소를 신생-기질에 결합시키는데 효과적인지 여부를 결정하는 단계는 결합에 의해 생성된 신호를 관찰하는 것을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 유비퀴틴 결찰효소는 제1 보고제(reporting agent)를 추가적으로 포함하고 기질은 제2 보고제를 추가적으로 포함하며, 여기서 유비퀴틴 결찰효소가 신생-기질에 결합할 때, 제1 보고제는 제2 보고제와 함께 작용하여 신호를 생성하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제1 보고제를 포함하는 유비퀴틴 결찰효소는 여기 상태일 때 반응성 산소 종을 생성하도록 구성된 공여체 비드이고, 제2 보고제를 포함하는 신생-기질은 유비퀴틴 기질이 신생-기질에 결합할 때 반응성 산소 종의 존재하에 빛을 생성하도록 구성된 수용체 비드인 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 공여체 비드는 감작제(sensitizer)가 여기 상태일 때 반응성 산소 종을 생성하도록 구성된 감작제를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 감작제는 감작제에 자극 전자기파가 조사될 때 반응성 산소 종을 생성하도록 구성된 광감작제(photosensitizer)인 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 광감작제는 프탈로시아닌(phthalocyanine)인 것인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 수용체 비드는 발광 화합물이 반응성 산소 종에 근접할 때 발광 빛을 생성하도록 구성된 발광 화합물인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 발광 화합물은 싸이옥센(thioxene), 안트라센(anthracene), 루브렌(rubrenein), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제5항에 있어서, 반응성 산소 종은 일중항 산소(singlet oxygen)인 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 후보 작용제가 유비퀴틴 결찰효소를 신생-기질에 결합시키는데 효과적인지 여부를 결정하는 단계는 결합에 의해 생성된 신호의 수득을 관찰하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 제1 보고제를 추가적으로 포함하고 신생-기질은 제2 보고제를 추가적으로 포함하며, 여기서 유비퀴틴 결찰효소가 신생-기질에 결합할 때, 제1 보고제는 제2 보고제와 함께 작용하여 신호를 획득하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 일부 구현예에서, 유비퀴틴 결찰효소는 다중-서브유닛 E3 유비퀴틴 결찰효소의 컬린-RING 슈퍼패밀리의 구성원, 기질 결합 도메인을 가지는 RING-유형 E3 결찰효소의 구성원, 또는 기질 결합 도메인을 가지는 HECT-유형 E3 결찰효소의 구성원인 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 유비퀴틴 결찰효소는 KEAP1인 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 신생-기질은 KRAS 또는 KRAS 돌연변이체인 것인 방법.
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