JP4976651B2 - Ｏ６−アルキルグアニン−ｄｎａアルキルトランスフェラーゼのための基質 - Google Patents

Ｏ６−アルキルグアニン−ｄｎａアルキルトランスフェラーゼのための基質 Download PDF

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Description

本発明は、標識を新規基質からＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）及びＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ融合タンパク質に転移させる方法、並びに、そのような方法において適切な新規基質に関する。
発明の背景
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレアのような求電子試薬の突然変異誘発作用及び発癌作用は、主として、ＤＮＡ内のグアニンのＯ６−アルキル化に起因している。それらをＤＮＡ−アルキル化から保護するために、哺乳動物及び細菌類は、それらの損傷を修復するタンパク質Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を有している。ＡＧＴは、アルキル化されたグアニン及びグアニン誘導体のＯ−６位からそれが有している１つのシステインのメルカプト基にアルキル基を転移させ、不可逆的にアルキル化されたＡＧＴを生成する。その基礎的なメカニズムは、ＳＮ２型の求核反応であり、それにより、メチル基のみではなくベンジル基も容易に転移される理由が説明される。腫瘍細胞におけるＡＧＴの過剰発現は、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロマイド及びビス−２−クロロエチル−Ｎ−ニトロソウレアなどのアルキル化薬に対する抵抗性の主な原因であるので、化学療法における増感剤として使用するためのＡＧＴ阻害薬が求められてきた（Ｐｅｇｇら，Ｐｒｏｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５１：１６７−２２３，１９９５）。ＵＳ５，６９１，３０７には、ベンジル基に種々の置換基を有するＯ６−ベンジルグアニン類が記述されており、また、腫瘍細胞内のＡＧＴレベルを低下させ、それによりアルキル化抗腫瘍薬に対する反応性を増大させるためのＯ６−ベンジルグアニン類の使用についても記述されている。同様に、ＷＯ９７／２０８４３には、さらに、Ｏ６−ベンジル−ピリミジン誘導体及びＯ６−ヘテロアリールメチル−ピリミジン誘導体である、ＡＧＴを低減させる化合物が開示されている。
ＤＥ１９９０３８９５には、ＡＧＴのレベルを測定するためのアッセイが開示されており、ここで、該アッセイは、ビオチニル化Ｏ６−アルキルグアニン誘導体とＡＧＴを反応させてＡＧＴをビオチニル化することに依拠している。これにより、次に、ストレプトアビジンでコーティングしたプレート上でのＡＧＴの分離と検出（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）が可能となる。このアッセイは、腫瘍組織内のＡＧＴのレベルのモニタリング及びＡＧＴ阻害薬のスクリーニングにおける使用に示唆されるアッセイである。
ＷＯ０１／８５２２１では、ＡＧＴの検出及びＡＧＴレベルのモニタリングのために、放射能標識フルオロ置換Ｏ６−ベンジル−グアニン類又は放射能標識ヨード置換Ｏ６−ベンジル−グアニン類の使用が提案されている。
Ｄａｍｏｉｓｅａｕｘら（ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．４：２８５−２８７，２００１）は、研究及び化学療法において有用な、癌細胞内におけるこの酵素のレベルの検出を容易にする、ＡＧＴを標識するための化学プローブとして使用するためのオリゴデオキシリボヌクレオチドに組み入れた修飾されたＯ６−アルキル化グアニン誘導体を開示している。
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０１６３６（ＷＯ０２／０８３９３７）には、目的とするタンパク質を検出及び／又は操作する方法が開示されており、ここで、該方法では、タンパク質をＡＧＴに融合させ、得られたＡＧＴ融合タンパク質を標識を有しているＡＧＴ基質と接触させ、そして、該標識を用いて、該ＡＧＴ融合タンパク質を検出し、そして、場合により、該ＡＧＴ融合タンパク質をさらに操作する。使用する数種類のＡＧＴ融合タンパク質、ＡＧＴ基質の構造上の一般的な原則、並びに、該方法において有用な広範な種類の標識及び該標識の検出方法が開示されている。
発明の要旨
本発明は、目的とするタンパク質を検出及び／又操作する方法に関し、ここで、該方法では、目的とするタンパク質をＡＧＴ融合タンパク質に組み入れ、得られたＡＧＴ融合タンパク質を標識を有している特定のＡＧＴ基質と接触させ、そして、該標識を認識及び／又は処理するように設計されているシステム内で該標識を用いて、該ＡＧＴ融合タンパク質を検出し、及び、場合により、さらに操作する。
本発明の方法で使用する特定のＡＧＴ基質は、Ｏ６−置換グアニン誘導体又は関連する窒素含有ヒドロキシ−ヘテロ環及びそれらの硫黄類似体（ここで、該Ｏ６−置換基は、グアニン又は対応するヘテロ環からＡＧＴへ移動するのに適する活性化されたメチル誘導体である）であり、さらに、標識を有している。該標識は、同一であるか又は異なっている複数の標識からなるものであってよい。活性化されたメチル誘導体は、例えば、アリール環内で適切に置換されているアリールメチル誘導体、ヘテロアリール環内で適切に置換されているヘテロアリールメチル誘導体、及び、二重結合が適切に置換されているアリルタイプの誘導体などである。アリール環、ヘテロアリール環又はアリル二重結合の適切な置換基は、該アリール環、該ヘテロアリール環又は該アリル基に標識を連結するリンカーであり、好ましくは、さらに修飾され得るか又は切断され得るリンカー、及び、ＡＧＴ基質を二量体化又は環化するリンカーである。本発明は、さらに、そのような新規ＡＧＴ基質自体にも関し、また、そのような新規基質の製造方法及びそのような新規ＡＧＴ基質の合成において有用な中間体にも関する。
発明の詳細な説明
本発明では、目的とするタンパク質又はペプチドをＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に融合させる。目的とするタンパク質又はペプチドは、任意の長さを有するものであることができ、また、二次構造、三次構造若しくは四次構造を有していても又は有していなくてもよい。該タンパク質又はペプチドは、好ましくは、少なくとも１２個から２０００個以下のアミノ酸からなる。そのような目的とするタンパク質又はペプチドの例は以下で与えられており、例えば、酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核内受容体タンパク質、核局在化シグナルタンパク質、タンパク質補因子、小単量体ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、特定の細胞コンパートメントに対するタンパク質の標的に関与する配列を有するタンパク質、標識又はアフィニティータグとして一般に使用されるタンパク質、並びに、前記タンパク質のドメイン及びサブドメインなどがある。目的とするタンパク質又はペプチドは、好ましくは、酵素により切断され得るリンカー、例えば、ＤＮＡ段階で適切な制限酵素により切断され得るリンカー（例えば、ＢｇｌＩＩにより切断され得るＡＧＡＴＣＴ）、及び／又は、タンパク質段階で適切な酵素（例えば、タバコエッチウイルスＮｌａ（ＴＥＶ）プロテアーゼ）により切断され得るリンカーを介してＡＧＴに融合させる。融合タンパク質は、原核生物の宿主（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ）、又は、真核生物の宿主（例えば、酵母細胞、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞）で発現させることができる。
Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）は、基質上に存在している標識を融合タンパク質の中のＡＧＴを形成している部分に含まれているシステイン残基の１つに転移させる性質を有している。好ましい実施形態では、ＡＧＴは、公知ヒトＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）である。マウス形態又はラット形態の酵素も、それらがヒトＡＧＴのような基質と反応する上で同様の性質を有しているかぎり、同様に考慮される。本発明においては、１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加により異なり得るが、基質上に存在している標識を融合タンパク質内のＡＧＴ部分に転移させる性質は維持している野生型ＡＧＴの変異体も、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼに包含される。ＡＧＴ変異体は、当業者が周知している技術を用いて化学的に修飾することにより得ることができる。ＡＧＴ変異体は、好ましくは、当業者に公知のタンパク質工学技術を用いて製造することができるか、及び／又は、分子進化を用いて新しいＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼを生成及び選択することにより製造することができる。そのような技術は、例えば、飽和突然変異誘発、配列中の何れかに変異を導入する変異導入型ＰＣＲ、飽和突然変異誘発及び／又は変異導入型ＰＣＲの後で用いるＤＮＡシャフリング、又は、幾つかの種から得た遺伝子を用いるファミリーシャフリングなどである。
目的とするタンパク質及びＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキル−トランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含んでいる融合タンパク質を、標識を有している特定の基質と接触させる。反応条件は、ＡＧＴが基質と反応して、基質の標識を転移させるように選択する。一般的な条件は、約ｐＨ７で室温（約２５℃）の緩衝液である。しかしながら、ＡＧＴがさまざまな別の反応条件下でも反応すること、及び、本明細書において述べられている反応条件により本発明の範囲が限定されることはないことは理解される。
ＡＧＴは、その基質であるＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡからそのシステイン残基の内の１つに、アルキル基を不可逆的に転移させる。ｈＡＧＴと急速に反応する基質類似体は、Ｏ６−ベンジル−グアニンであり、二次反応速度定数は、約１０３秒−１Ｍ−１である。Ｏ６−ベンジルグアニンをベンジル環のＣ−４位で置換しても、Ｏ６−ベンジルグアニン誘導体に対するｈＡＧＴの反応性に対して有意な影響は与えない。これまで、この性質を利用して、ベンジル環のＣ−４位に結合させた標識をＡＧＴに転移させてきた。
当業者は、該融合タンパク質について意図している用途に応じて、基質の標識部分を選定することができる。ＡＧＴ含有融合タンパク質を基質と接触させた後、標識を共有結合的に融合タンパク質に結合させる。次いで、標識されたＡＧＴ融合タンパク質を、転移させた標識に基づいて、さらに操作するか、及び／又は、検出する。該標識は、複数の同一であるか又は異なっている標識から成ることができる。基質が２以上の標識を含んでいる場合、標識された対応するＡＧＴ融合タンパク質は、同様に、２以上の標識を含有し、これは、標識された融合タンパク質をさらに操作するか、及び／又は、検出するためのより多くの選択肢を与える。
特定のＡＧＴ基質は、式１：
Figure 0004976651
［Ｒ１−Ｒ２は、ＡＧＴにより基質として認識される基であり；
Ｘは、酸素又は硫黄であり；
Ｒ３は、芳香族基若しくはヘテロ芳香族基であるか、又は、ＣＨ２に結合した二重結合を有する、場合により置換されていてもよい不飽和のアルキル基、シクロアルキル基若しくはヘテロシクリル基であり；
Ｒ４は、リンカーであり；
そして、
Ｌは、１つの標識であるか、同一であるか若しくは異なっている複数の標識であるか、Ｒ４をＲ１に連結して環状基質を形成する結合であるか、又は、さらなる基−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である］
で表される化合物である。
基Ｒ１−Ｒ２において、残基Ｒ１は、好ましくは、ＡＧＴにより基質として認識されるヘテロ芳香族基（ここで、該ヘテロ芳香族基１〜５の窒素原子を含んでいる）である。
ヘテロ芳香族基Ｒ１は、単環式又は二環式であり、５〜１２個、好ましくは、６又は９又は１０個の環原子を有する。ヘテロ芳香族基Ｒ１は、置換基Ｒ２を有する他に、置換されていなくてもよいし、又は、以下のものからなる群から選択される１以上の置換基、特に、１、２若しくは３個の置換基で置換されていてもよい：低級アルキル、例えば、メチル、低級アルコキシ、例えば、メトキシ若しくはエトキシ、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、アシルアミノ、ハロゲン、例えば、塩素若しくは臭素、ハロゲン化低級アルキル、例えば、トリフルオロメチル、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、低級アルキルカルバモイル、又は、低級アルキルカルボニル。
低級アルキルは、好ましくは、１〜７個、好ましくは、１〜４個のＣ原子を有するアルキルであり、直鎖又は分枝鎖である。好ましくは、低級アルキルは、ブチル、例えば、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル若しくはｔ−ブチル、プロピル、例えば、ｎ−プロピル若しくはイソプロピル、エチル、又は、メチルである。好ましくは、低級アルキルは、メチルである。
低級アルコキシにおいて、低級アルキル基は、上記で定義されているとおりである。低級アルコキシは、好ましくは、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、イソプロポキシ、エトキシ、又は、メトキシを表し、特に、メトキシである。
好ましくは、単環式又は二環式のヘテロ芳香族基Ｒ１は、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピラゾリル、インダゾリル、プリニル、８−アザプリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリル、キナゾリニル、キノリニル、プテリジニル、インドリジニル、３Ｈ−インドリル、インドリル、イソインドリル、トリアゾリル、テトラゾリル、又は、ベンゾ［ｄ］ピラゾリルである。さらに好ましくは、単環式又は二環式のヘテロ芳香族基Ｒ１は、プリニル、８−アザプリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル及びピリダジニルからなる群から選択される。
例えば、基Ｒ１−Ｒ２は、式２：
Figure 0004976651
［式中、
Ｒ２は、水素、１〜１０個の炭素原子を有するアルキル、又は、糖部分であり；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、例えば、クロロ若しくはブロモ、トリフルオロメチル、又は、ヒドロキシであり；
そして、
Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、又は、置換されていないか若しくは置換されているアミノである］
で表されるプリンラジカルであることができる。
Ｒ５又はＲ６がヒドロキシである場合、上記プリンラジカルは、主として、その互変異性形態（ここで、Ｒ５又はＲ６を有している炭素原子に隣接している窒素は水素原子を有し、この窒素原子とＲ５又はＲ６を有している炭素原子の間の二重結合は単結合であり、及び、Ｒ５又はＲ６は、それぞれ、二重結合で結合してる酸素である）で存在している。
置換されているアミノ基Ｒ６は、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキルアミノ又はアシルアミノであり、その際、該アシル基は、１〜５個の炭素原子を有する低級アルキルカルボニル、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ−プロピルカルボニル若しくはイソプロピルカルボニル、ｎ−ブチルカルボニル、イソブチルカルボニル若しくはｔ−ブチルカルボニル、又は、アリールカルボニル、例えば、ベンゾイルである。
Ｒ６が置換されていないか又は置換されているアミノであり、且つ、残基Ｘがプリンラジカルの結合に連結している場合、式２で表されるラジカルは、グアニン誘導体である。
１〜１０個の炭素原子を有するアルキルとしてのＲ２は、直鎖又は分枝鎖であり、そのようなＲ２には、１〜４の炭素原子を有する低級アルキル、例えば、メチル、エチル、ブチル、例えば、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル又はｔ−ブチル、及び、プロピル、例えば、ｎ−プロピル又はイソプロピルなどがある。アルキルとしてのＲ２は、さらにまた、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、又は、デシル、例えば、ｎ−ヘキシルであってもよい。
糖部分Ｒ２は、可変的な長さのスペーサーでグアニン塩基の第Ｎ９位に結合している糖単量体又はオリゴマーである。これに関連して、スペーサーは、アルキル鎖（好ましくは、１〜１５個の炭素原子を有するアルキル鎖）、１〜２００個のエチレングリコール単位からなるポリエチレングリコールスペーサー、アミド基−ＣＯ−ＮＨ−、エステル基−ＣＯ−Ｏ−、若しくは、アルキレン基−ＣＨ＝ＣＨ−であるか、又は、アルキル鎖、ポリエチレングリコール基、アミド基、エステル基及び／若しくはアルキレン基の組合せである。
本発明との関連において、糖部分Ｒ２としては、さらに、β−Ｄ−２’−デオキシリボシル、又は、２〜９９個のヌクレオチドからなる長さを有する一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドに組み込まれているβ−Ｄ−２’−デオキシリボシルなどがあり、その際、グアニン誘導体Ｒ１は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置を占める。
特に好ましいのは、基Ｒ１−Ｒ２が式２で表されるプリンラジカルであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ５が水素であり、Ｒ６が置換されていないアミノであり、且つ、Ｘが酸素である化合物、即ち、置換されていないグアニン誘導体である。
本発明の好ましい別の実施形態では、基Ｒ１−Ｒ２は、式３：
Figure 0004976651
［式中、置換基Ｒ２及びＲ６は、式２におけるＲ２及びＲ６に関して定義されている意味を有する］
で表される８−アザプリンラジカルである。
本発明の好ましいさらに別の実施形態では、基Ｒ１−Ｒ２は、式４：
Figure 0004976651
［式中、
置換基Ｒ２は、式２において定義されている意味を有し、好ましくは、水素であり；
そして、
Ｒ７及びＲ８は、いずれも、互いに独立して、水素、ハロゲン、例えば、クロロ若しくはブロモ、１〜４の炭素原子を有する低級アルキル、例えば、メチル、アミノ、又は、ニトロである］
で表されるピリミジンラジカルである。
Ｘは、好ましくは、酸素である。
芳香族基若しくはヘテロ芳香族基としてのＲ３、又は、場合により置換されていてもよい不飽和アルキル基、シクロアルキル基若しくはヘテロシクリル基としてのＲ３は、ＡＧＴにより（その反応機構に従って）、立体的及び電子的に受容され、それにより、Ｒ３−Ｒ４−Ｌ単位が融合タンパク質へと共有結合的に転移するのを可能とする基である。Ｒ３−Ｒ４−Ｌ単位において、Ｒ４−Ｌは、さらにまた、同一であるか又は異なっている複数の標識Ｌを有している同一であるか又は異なっている複数のリンカーＲ４を意味し得る。
芳香族基としてのＲ３は、好ましくは、フェニル又はナフチル、特に、フェニル、例えば、パラ位又はメタ位がＲ４で置換されているフェニルである。
ヘテロ芳香族基Ｒ３は、０、１、２、３若しくは４個の環窒素原子と０若しくは１個の酸素原子と０若しくは１個の硫黄原子を含み、５〜１２個、好ましくは、５若しくは６個の環原子を有する単環式若しくは二環式のヘテロアリール基（但し、少なくとも１の環炭素原子は、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置き換えられている）であり、ここで、該ヘテロ芳香族基Ｒ３は、置換基Ｒ４を有している他に、置換されていなくてもよいし、又は、以下のものからなる群から選択される１つ以上の置換基、特に、１つのさらなる置換基で置換されていてもよい：低級アルキル、例えば、メチル、低級アルコキシ、例えば、メトキシ若しくはエトキシ、ハロゲン、例えば、塩素、臭素若しくはフッ素、ハロゲン化低級アルキル、例えば、トリフルオロメチル、又は、ヒドロキシ。
好ましくは、単環式又は二環式のヘテロアリール基Ｒ３は、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピラゾリル、インダゾリル、プリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリル、キナゾリニル、キノリニル、プテリジニル、インドリジニル、３Ｈ−インドリル、インドリル、イソインドリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、フラザニル、ベンゾ［ｄ］ピラゾリル、チエニル、及び、フラニルから選択される。さらに好ましくは、該単環式又は二環式のヘテロアリール基は、以下のものからなる群から選択される：ピロリル、イミダゾリル、例えば、１Ｈ−イミダゾール−１−イル、ベンゾイミダゾリル、例えば、１−ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、特に、５−インダゾリル、ピリジル、例えば、２−ピリジル、３−ピリジル若しくは４−ピリジル、ピリミジニル、特に、２−ピリミジニル、ピラジニル、イソキノリニル、特に、３−イソキノリニル、キノリニル、特に、４−キノリニル若しくは８−キノリニル、インドリル、特に、３−インドリル、チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｄ］ピラゾリル、チエニル、及び、フラニル。
本発明の特に好ましい実施形態では、該ヘテロアリール基Ｒ３は、トリアゾリル、特に、４位若しくは５位にさらなる置換基Ｒ４を有している１−トリアゾリル、テトラゾリル、特に、４位若しくは５位にさらなる置換基Ｒ４を有している１−テトラゾリル若しくは５位にさらなる置換基Ｒ４を有している２−テトラゾリル、イソオキサゾリル、特に、５位にさらなる置換基Ｒ４を有している３−イソオキサゾリル若しくは３位にさらなる置換基Ｒ４を有している５−イソオキサゾリル、又は、チエニル、特に、３位、４位若しくは５位（好ましくは、４位）にさらなる置換基Ｒ４を有している２−チエニル若しくは４位にさらなる置換基Ｒ４を有している３−チエニルである。
最も好ましいのは、４位又は５位に置換基Ｒ４を有しているトリアゾリルとしてのヘテロアリール基Ｒ３であり、また、同様に、４位又は５位に置換基Ｒ４を有している２−チエニルとしてのＲ３である。
場合により置換されていてもよい不飽和アルキル基Ｒ３は、１位若しくは２位（好ましくは、２位）にさらなる置換基Ｒ４を有している１−アルケニルであるか、又は、１−アルキニルである。１−アルケニルにおいて考慮される置換基は、例えば、低級アルキル、例えば、メチル、低級アルコキシ、例えば、メトキシ、低級アシルオキシ、例えば、アセトキシ、又は、ハロゲニル、例えば、クロロである。本発明の特に好ましい実施形態では、Ｒ３は、１−アルキニルである。
場合により置換されていてもよい不飽和シクロアルキル基は、３〜７個の炭素原子を有し、１位が不飽和であるシクロアルキル基、例えば、任意の位置にさらなる置換基Ｒ４を有する１−シクロペンチル又は１−シクロヘキシルである。考慮される置換基は、例えば、低級アルキル、例えば、メチル、低級アルコキシ、例えば、メトキシ、低級アシルオキシ、例えば、アセトキシ、又は、ハロゲニル、例えば、クロロなどである。
場合により置換されていてもよい不飽和ヘテロシクリル基は、３〜１２個の原子、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子、並びに、該ヘテロシクリル基をメチレンＣＨ２に連結させている位置における二重結合を有する。考慮される置換基は、例えば、低級アルキル、例えば、メチル、低級アルコキシ、例えば、メトキシ、低級アシルオキシ、例えば、アセトキシ、又は、ハロゲニル、例えば、クロロなどである。
特に、場合により置換されていてもよい不飽和ヘテロシクリル基は、ヘテロ芳香族基Ｒ３に関して上記で定義されている部分的に飽和しているヘテロ芳香族基である。そのようなヘテロシクリル基の例は、イソオキサゾリジニル、特に、５位にさらなる置換基を有している３−イソオキサゾリジニル、又は、３位にさらなる置換基を有している５−イソオキサゾリジニルである。
リンカー基Ｒ４は、好ましくは、１つの標識Ｌ又は同一であるか若しくは異なっている複数の標識Ｌを基質に結合させる可変性リンカーである。リンカー単位は、想定される用途に照らして、即ち、ＡＧＴを含有している融合タンパク質への基質の転移に関連して選択される。それらは、さらに、適切な溶媒中における基質の溶解度も増大させる。使用されるリンカーは、実際に適用する条件下において化学的に安定である。そのようなリンカーは、ＡＧＴとの反応を妨害せず、また、標識Ｌの検出も妨害しないが、例えば、式１の化合物とＡＧＴ含有融合タンパク質の反応完了後のある時点で切断されるように構築し得る。
リンカーＲ４は、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキレン基であり、その際、場合により、
（ａ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられており、特に、２つおきの炭素原子が酸素で置き換えられており（例えば、１〜１００個のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基）；
（ｂ）１個以上の炭素原子が水素原子を有している窒素で置き換えられており、そして、それに隣接する炭素原子がオキソにより置換されていて、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を表し；
（ｃ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられており、そして、それに隣接する炭素原子がオキソにより置換されていて、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
（ｄ）隣接してる２つの炭素原子の間の結合が二重結合又は三重結合であって、官能基−ＣＨ＝ＣＨ−又は−Ｃ≡Ｃ−を表し；
（ｅ）１個以上の炭素原子が、フェニレン、飽和若しくは不飽和のシクロアルキレン、飽和若しくは不飽和のビシクロアルキレン、架橋ヘテロ芳香族、又は、飽和若しくは不飽和の架橋ヘテロシクリル基により置き換えられており；
（ｆ）隣接してる２個の炭素原子がジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−により置き換えられており；
又は、上記（ａ）〜（ｆ）で定義されている２以上（特に、２又は３）のアルキレン基及び／又は修飾されているアルキレン基の組合せは、場合により、置換基を含んでいてもよい。
考慮される置換基は、例えば、低級アルキル、例えば、メチル、低級アルコキシ、例えば、メトキシ、低級アシルオキシ、例えば、アセトキシ、又は、ハロゲニル、例えば、クロロなどである。
考慮されるさらなる置換基は、例えば、α−アミノ酸、特に、天然α−アミノ酸をリンカーＲ４に組み入れたときに得られる置換基（ここで、炭素原子は、（ｂ）で定義されているアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−により置き換えられている）などである。そのようなリンカーにおいては、アルキレン基Ｒ４の炭素鎖の一部は、基−（ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ）ｎ−（ここで、ｎは、１〜１００であり、Ｒは、α−アミノ酸の種々の残基を表す）で置き換えられている。
さらなる置換基は、光切断可能なリンカーＲ４、例えば、ｏ−ニトロフェニル基などをもたらす置換基である。特に、この置換基ｏ−ニトロフェニルは、アミド結合に隣接する炭素原子に位置するか（例えば、基−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−ＮＨ−ＣＯ−）、又は、ポリエチレングリコール鎖内の置換基として存在する（例えば、基−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−Ｏ−）。考慮される別の光切断可能なリンカーは、例えば、フェナシル、アルコキシベンゾイン、ベンジルチオエーテル及びピバロイルグリコール誘導体などである。
上記（ｅ）で定義されている炭素原子に置き換えられるフェニレン基は、例えば、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、又は、好ましくは、１，４−フェニレンである。。特定の実施形態において、該フェニレン基は、ニトロ基でさらに置換され、また、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）において述べられているような別の置き換えと組み合わされ、光切断可能な基を表し、例えば、４−ニトロ−１，３−フェニレン、例えば、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−４−ニトロ−１，３−フェニレン−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＯ−、又は、２−メトキシ−５−ニトロ−１，４−フェニレン、例えば、−ＣＨ２−Ｏ−２−メトキシ−５−ニトロ−１，４−フェニレン−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−などである。光切断可能なリンカーを表す特定の別の実施形態は、例えば、−１，４−フェニレン−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−（フェナシル基）、−１，４−フェニレン−ＣＨ（ＯＲ）−ＣＯ−１，４−フェニレン−（アルコキシベンゾイン）、又は、−３，５−ジメトキシ−１，４−フェニレン−ＣＨ２−Ｏ−（ジメトキシベンジル部分）などである。上記（ｅ）で定義されている炭素原子と置き換えられる飽和又は不飽和のシクロアルキレン基は、３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキルから、好ましくは、シクロペンチル又はシクロヘキシルから誘導され、例えば、１，２−シクロペンチレン、若しくは、１，３−シクロペンチレン、１，２−シクロヘキシレン、１，３−シクロヘキシレン、若しくは、好ましくは、１，４−シクロヘキシレンなどであるか、又は、さらに、例えば１位若しくは２位が不飽和である１，４−シクロヘキシレンである。上記（ｅ）で定義されている炭素原子と置き換えられる飽和又は不飽和のビシクロアルキレン基は、７又は８個の炭素原子を有するビシクロアルキルから誘導され、例えば、ビシクロ［２．２．１］へプチレン、又は、ビシクロ［２．２．２］オクチレン、好ましくは、場合により２位に不飽和を有するか若しくは２位と５位に二重に不飽和を有していてもよい１，４−ビシクロ［２．２．１］へプチレン、及び、場合により２位に不飽和を有するか若しくは２位と５位に二重に不飽和を有していてもよい１，４−ビシクロ［２．２．２］オクチレンなどである。上記（ｅ）で定義されている炭素原子と置き換えられる架橋ヘテロ芳香族基は、例えば、トリアゾリデン、好ましくは、１，４−トリアゾリデン、又は、イソオキサゾリデン、好ましくは、３，５−イソオキサゾリデンなどである。上記（ｅ）で定義されている炭素原子と置き換えられる飽和若しくは不飽和の架橋ヘテロシクリル基は、例えば、上記Ｒ３で定義されている不飽和ヘテロシクリル基から誘導され、例えば、イソオキサゾリジネン、好ましくは、３，５−イソオキサゾリジネンなどであるか、又は、３〜１２の原子（そのうちの１〜３は、窒素、酸素及び硫黄から選択されるヘテロ原子である）を有する完全に飽和しているヘテロシクリル基から誘導され、例えば、ピロリジンジイル、ピペリジンジイル、テトラヒドロフランジイル、ジオキサンジイル、モルホリンジイル、若しくは、テトラヒドロチオフェンジイル、好ましくは、２，５−テトラヒドロフランジイル、若しくは、２，５−ジオキサンジイルなどである。考慮される特定のヘテロシクリル基は、糖部分、例えば、α−フラノシル部分若しくはβ−フラノシル部分、又は、α−ピラノシル部分若しくはβ−ピラノシル部分などである。
リンカーＲ４内の環状下部構造は、Ｒ４内の回転可能な結合の数で評価した場合に、分子の柔軟性を低下させるが、これにより、良好な膜透過速度が得られる。これは、全てのインビボでの標識化用途にとって重要である。
好ましくは、リンカーＲ４は、場合により−ＣＨ＝ＣＨ−又は−Ｃ≡Ｃ−基で基Ｒ３に結合している、４〜１００のエチレンオキシ単位を有する直鎖ポリエチレングリコール基、又は、１〜２５個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である。さらに好ましいのは、１〜２５個の炭素原子（ここで、炭素原子は場合によりアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−で置き換えられていてもよい）を有し、光切断可能なサブユニット（例えば、ｏ−ニトロフェニル）を有している直鎖アルキレン基である。さらに好ましいのは、３〜６のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール基とアルキレン基（炭素原子はアミド結合で置き換えられている）を含み、さらに、置換されているアミノ官能基及びヒドロキシ官能基を有している分枝リンカーである。好ましい別の分枝鎖リンカーは、アルキレン基の炭素原子がアミン、カルボキサミド及び／又はエーテルで置き換えられている樹状構造（木のような構造）を有している。
特に好ましいリンカーＲ４は、３〜１２個の炭素原子が酸素で置き換えられており、１又は２の炭素原子がそれぞれ１又は２個の１，４−トリアゾリデン単位で置き換えられており、また、場合により１個の炭素原子が１，４−フェニレン単位で置き換えられている、１０〜４０個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である。
特に好ましい別のリンカーＲ４は、３〜１２個の炭素原子が酸素で置き換えられており、１又は２個の炭素原子が窒素で置き換えられている、場合によりオキソで置換されていてもよい１０〜４０個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である。
特に好ましい別のリンカーＲ４は、２〜１２個の炭素原子が酸素で置き換えられており、２個の隣接する炭素原子の間の１又は２つの結合が二重結合であって、官能基−ＣＨ＝ＣＨ−を表している、６〜４０個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である。
リンカーＲ４は、１つ以上の同一であるか又は異なっている標識、例えば、１〜１００の同一であるか又は異なっている標識、特に、１〜５つ、好ましくは、１つ、２つ又は３つ、特に、１つ又は２つの同一であるか又は異なっている標識を有し得る。
基質の標識部分Ｌは、意図されている融合タンパク質についての用途に応じて、当業者が選択することができる。標識は、例えば、標識された融合タンパク質が、容易に検出されるか又はその環境から容易に分離されるようなものであり得る。考慮される別の標識は、該標識化融合タンパク質の周囲における変化を探知及び惹起することが可能な標識であるか、及び／又は、該標識によって融合タンパク質に特異的に導入された物理的及び／又は化学的性質により該融合タンパク質を操作するのを助ける標識である。
標識Ｌの例には、分光学的プローブ、例えば、発蛍光団、発色団、磁気プローブ又は造影剤；放射能で標識された分子；結合パートナーに特異的に結合することが可能な特異的結合対の一方である分子；別の生体分子と相互作用すると推測される分子；別の生体分子と相互作用すると推測される分子のライブラリー；別の分子と架橋することが可能な分子；Ｈ２Ｏ２及びアスコルベートと接触したときにヒドロキシルラジカルを生成することが可能な分子、例えば、テザー金属キレート（tethered metal-chelate）；光を照射されたときに反応性ラジカルを生成することが可能な分子、例えば、マラカイトグリーン；固体支持体に共有結合で結合している分子（ここで、支持体は、スライドガラス、マイクロタイタープレート又は当業者に知られている任意のポリマーであり得る）；その相補鎖と塩基対を成すことが可能な核酸若しくはその誘導体；膜挿入特性を有する脂質若しくは別の疎水性分子；酵素的、化学的若しくは物理的に望ましい特性を有している生体分子；又は、上記で挙げた特性のいずれかの組合せを有する分子などである。好ましいものは、放射能標識された分子を除く、上記で挙げた標識Ｌである。標識Ｌとして最も好ましいのは、分光学的プローブ、及び、結合パートナーに特異的に結合することが可能な特異的結合対の一方である分子（いわゆる、アフィニティー標識）である。
標識Ｌが、発蛍光団、発色団、磁気標識又は放射能標識などである場合、検出は、当該方法をインビトロ又はインビボで使用するかにより、該標識に適合させた標準的な方法による。該方法は、目的とするタンパク質に遺伝的に融合していて生細胞内でのタンパク質の研究を可能とするグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の適用と比較することができる。さらにまた、標識Ｌの特定の例は、非線形光学的性質を示すホウ素化合物、又は、標識された基質とＡＧＴ融合タンパク質が反応する際にその分光学的性質を変化させるＦＲＥＴ対のメンバーである。
標識Ｌの性質に応じて、目的とするタンパク質及びＡＧＴを含んでいる融合タンパク質を固体支持体に結合させ得る。ＡＧＴ含有融合タンパク質と反応する基質の標識は、ＡＧＴとの反応に入るときには既に固体支持体に結合させておいてもよいし、又は、その後で、即ち、ＡＧＴへ転移した後で、ＡＧＴ含有融合タンパク質と反応する基質の標識を用いてＡＧＴ融合タンパク質を固体支持体に結合させてもよい。該標識は、特異的結合対の一方のメンバーであってもよく、その際、該特異的結合対の他方のメンバーは、共有結合又は別の任意の手段により、固体支持体に結合しているか又は結合可能である。考慮される特異的結合対は、例えば、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンなどである。結合対のいずれのメンバーも基質の標識Ｌとすることが可能であり、その際、他方のメンバーは、固体支持体に結合されていてもよい。固体支持体に都合よく結合することを可能にする標識のさらなる例は、例えば、マルトース結合タンパク質、糖タンパク質、ＦＬＡＧタグ、又は、固体支持体の表面上に存在している相補的な官能基との間で化学選択的に反応することが可能な反応性置換基である。そのような反応性置換基と相補的な官能基の対の例は、例えば、アミドを形成するアミンと活性化カルボキシ基、１，３−双極子付加環化反応を受けるアジドとプロピオル酸誘導体、活性化ビス−ジカルボン酸誘導体のタイプの添加された二官能性リンカー試薬と反応して２つのアミド結合を生成させるアミンと別のアミン官能基、又は、当業界で知られている別の組合せなどである。
都合のよい固体支持体の例は、例えば、ガラス表面、例えば、スライドガラス、マイクロタイタープレート、及び、適切なセンサーエレメント、特に、官能化ポリマー（例えば、ビーズ形態にある官能化ポリマー）、化学的に修飾された酸化物表面、例えば、二酸化ケイ素、五酸化タンタル若しくは二酸化チタン、又は、化学的に修飾された金属表面、例えば、貴金属表面、例えば、金若しくは銀の表面などである。不可逆的に結合及び／又はスポットするＡＧＴ基質を用いて、ＡＧＴ融合タンパク質を、空間的に分離したやり方で、特に、スポットにより、固体支持体上に結合させることができ、これらは、タンパク質マイクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ又は小分子のアレイに相当する。
標識Ｌが、外部刺激に晒されたときに反応性ラジカル（例えば、ヒドロキシルラジカル）を生成し得る場合、生成されたラジカルは、ＡＧＴ融合タンパク質及びＡＧＴ融合タンパク質に近接しているタンパク質を不活性化することができ、これは、これらのタンパク質の役割についての研究を可能にする。そのような標識の例は、Ｈ２Ｏ２及びアスコルベートと接触したときにヒドロキシルラジカルを生成するテザー金属キレート錯体（tethered metal-chelate complex）、及び、レーザーを照射されたときにヒドロキシルラジカルを生成する発色団、例えば、マラカイトグリーンなどである。ヒドロキシルラジカルを生成させるために発色団とレーザーを使用することは、当技術分野では、発色団アシストレーザー分子機能不活化（chromophore assisted laser induced inactivation）（ＣＡＬＩ）として知られている。本発明では、発色団（例えば、マラカイトグリーン）を用いてＡＧＴ融合タンパク質を標識した後、レーザーを照射して、時間を制御し且つ空間的に分離したやり方で、ＡＧＴ融合タンパク質を不活性化すると共にＡＧＴ融合タンパク質と相互作用するタンパク質を不活性化する。この方法は、インビボ又はインビトロの両方に適用可能である。さらに、ＡＧＴ融合タンパク質に近接しているタンパク質は、該タンパク質のフラグメントを特異的抗体により検出することにより、又は、高分解２Ｄ−電気泳動ゲル上における該タンパク質の消失により、又は、分離及び配列決定法（例えば、質量分析法又はＮ−末端分解によるタンパク質配列決定法など）による切断されたタンパク質フラグメントを同定することにより、同定することができる。
標識Ｌが、別のタンパク質と架橋可能な分子、例えば、官能基（例えば、マレイミド、活性エステル又はアジド及び当業者に知られている別のものなど）を含んでいる分子である場合、そのような標識されたＡＧＴ基質を別のタンパク質と相互作用するＡＧＴ融合タンパク質と接触させる（インビボ又はインビトロ）ことにより、ＡＧＴ融合タンパク質をそれが相互作用するタンパク質と該標識を介して共有結合的に架橋することができる。これにより、ＡＧＴ融合タンパク質と相互作用するタンパク質を同定することが可能となる。光活性化架橋のための標識Ｌは、例えば、ベンゾフェノン類である。架橋の特定の態様において、標識Ｌは、それ自体がＡＧＴ基質である分子であり、それにより、ＡＧＴ融合タンパク質が二量体化される。そのような二量体の化学的構造は、対称（ホモ二量体）又は非対照（ヘテロ二量体）であり得る。
考慮される別の標識Ｌは、例えば、フラーレン類、中性子捕獲処理のためのボラン類、例えばセルフアドレッシングチップ（self-addressing chip）用のヌクレオチド類若しくはオリゴヌクレオチド類、ペプチド核酸類、及び、金属キレート類、例えば、ＤＮＡに特異的に結合する白金キレートなどである。
望ましい酵素的性質、化学的性質又は物理的性質を有している特定の生体分子は、メトトレキサートである。メトトレキサートは、酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の強結合阻害剤である。式中のＬがメトトレキサートである式１の化合物は、いわゆる「二量体化誘発物質（chemical inducers of dimerization）」（ＣＩＤ）と称されるよく知られている種類に属する。ｈＡＧＴとＤＮＡ結合ドメインＬｅｘＡの融合タンパク質を使用し、式１（式中、Ｌはメトトレキサートである）の化合物によるｈＡＧＴ融合タンパク質のインビボ標識化に、転写活性化ドメインＢ４２を有するＤＨＦＲを添加することにより、ｈＡＧＴ−ＬｅｘＡ融合タンパク質とＤＨＦＲ−Ｂ４２融合タンパク質のカップリング（「二量体化」）が誘発され、その結果、図４に示されているように、ＬｅｘＡとＢ４２が空間的に近接し、その後、転写が刺激される。
基質が２つ以上の標識を有している場合、これら標識は、同一でもよく、又は、異なっていてもよい。特に好ましい組合せは、２つの異なったアフィニティー標識、又は、１つのアフィニティー標識と１つの発色団標識、特に、１つのアフィニティー標識と１つの発蛍光団標識である。
本発明は、さらに、インビボ及びインビトロの両方において、ＡＧＴ融合タンパク質を標識する方法を提供する。ＡＧＴ融合タンパク質のインビボ標識化という用語には、細胞の全てのコンパートメントにおける標識化、及び、細胞外空間に面しているＡＧＴ融合タンパク質の標識化が包含される。ＡＧＴ融合タンパク質の標識化がインビボで行われ且つＡＧＴに融合しているタンパク質が膜タンパク質（より特定的には、細胞膜タンパク質）である場合、該融合タンパク質内のＡＧＴ部分は、該膜のいずれの面にも結合させることが可能であり、例えば、細胞質面又は細胞膜の細胞外の面に結合させることが可能である。
標識化をインビトロで行う場合、融合タンパク質の標識化は、細胞抽出物中で、又は、ＡＧＴ融合タンパク質の精製された形態若しくは濃縮された形態で行うことができる。
標識化をインビボ又は細胞抽出物中で行う場合、宿主の内因性ＡＧＴの標識化を考慮に入れるのが有利である。宿主の内因性ＡＧＴが、Ｏ６−アルキルグアニン誘導体又はその関連する化合物を基質として受容しない場合、該融合タンパク質の標識化は、特異的である。哺乳類細胞、例えば、ヒト、マウス又はラットの細胞においては、内因性ＡＧＴの標識化が可能である。内因性ＡＧＴとＡＧＴ融合タンパク質を同時に標識化すると問題が生じるような実験においては、公知のＡＧＴ欠失細胞系を使用することができる。
特定の態様において、本発明は、候補化合物又は候補化合物のライブラリーと標的タンパク質又は標的タンパク質のライブラリーの相互作用を測定する方法を提供する。候補化合物と標的タンパク質の例には、リガンドとタンパク質、薬物と該薬物の標的、又は、小分子とタンパク質などがある。本発明のこの特定の方法において、ＡＧＴに融合させる目的とするタンパク質は、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子の活性化ドメインを含んでいる。物質又はタンパク質のライブラリーの推定されるタンパク質標的を、機能的転写因子が形成され得るような方法で、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は活性化ドメインのいずれかに結合させ、本発明によるＡＧＴ基質の標識Ｌは、１種又は複数の標的物質と相互作用すると推定される候補化合物又は候補化合物のライブラリーである。基質の一部分である候補化合物又は候補化合物のライブラリーを、次いで、ＡＧＴ融合タンパク質に転移させる。転移後は、１種又は複数の標的物質を含んでいる１種又は複数のＡＧＴ融合タンパク質は、１種又は複数の候補化合物で標識されている。ＡＧＴ融合タンパク質に連結させた候補化合物とＤＮＡ結合ドメイン又は活性化ドメインのいずれかに融合させた標的タンパク質を相互作用させることにより、機能的転写因子が形成される。活性化された転写因子は、次に、レポーターを発現させることができる。このレポーターは、該方法を細胞内で行う場合、レポーターの発現が細胞に選択有利性をもたらす場合には検出される。
特定の実施形態では、該方法は、１以上のさらなるステップ、例えば、検出ステップ、単離ステップ、１種若しくは複数の候補化合物を同定若しくは特性付けするステップ、又は、１種若しくは複数の標的物質を同定若しくは特性付けするステップなどを含み得る。
特定の例では、標識Ｌは、薬物であるか又は未だ同定されていないタンパク質Ｙに結合する生物学的に活性な小分子である。未知の標的タンパク質Ｙを発現することが期待される生物のcＤＮＡライブラリーを転写因子の活性化ドメインに融合させ、ＡＧＴを転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合させる。上記のような標識Ｌを含んでいる本発明のＡＧＴ基質を加えることにより、機能的転写因子が形成され、この小分子が、cＤＮＡライブラリー内に存在し且つ活性化ドメインに融合したその標的タンパク質Ｙに結合したときにのみ、遺伝子が発現する。遺伝子発現を選択有利性に結びつけると、該薬物又は生理活性分子の標的タンパク質Ｙをコードする遺伝子を有しているプラスミドを保持している対応する宿主を同定することができる。
さらに別の特定の例では、標識Ｌは、化学分子のライブラリーである。該ライブラリーは、インビボ条件下で既知の薬物標的タンパク質Ｙに結合する未だ同定されていない化合物を含んでいることが期待される。標的タンパク質Ｙを転写因子の活性化ドメインに融合させ、ＡＧＴを転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合させる。化学的化合物のライブラリーを含んでいる基質を添加することにより、機能的転写因子が形成され、該標識（即ち、該化学的ライブラリー内の化合物）が活性化ドメインに融合したその標的タンパク質Ｙに結合したときにのみ、遺伝子が発現する。遺伝子発現を選択有利性に結びつけると、宿主の成長をもたらすライブラリーの分子を同定することができる。
Ｌが、Ｒ４とＲ１を連結して環状基質を形成させる結合である場合、好ましい化合物は、Ｒ４からＲ１への結合が、リンカーＲ４を式２で定義されているアミノ基Ｒ６に連結させる結合である環状基質である。そのような好ましい環状基質において、Ｒ２は、好ましくは、オリゴヌクレオチド、即ち、上記で詳述した２〜９９のヌクレオチドの長さを有する一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドに組み入れられているβ−Ｄ−２’−デオキシリボシルである。このオリゴヌクレオチドは、検出され得ることで標識として機能するように、さらに化学的に修飾することができる。置換基のそのような化学的修飾は、標識Ｌについて上記で述べたのと同じ種類であり得る。
Ｌが、さらなる基−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である場合、該基質は二量体化合物であり、その結果、ＡＧＴ含有融合タンパク質と反応させると、二量体化融合タンパク質が得られる。残基−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２としてのサブユニットＬにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸの意味は、別の基Ｒ２−Ｒ１−Ｘ−ＣＨ２−Ｒ３−内の対応する意味と同一であり得る（ホモ二量体）か、又は、異なり得る（ヘテロ二量体）。
最も好ましいのは、スキームにおいて示され、及び、実施例において記載されている式１の化合物である。
新規基質及び中間体を製造する方法も、同様に、本発明の目的である。これらの方法は、概して当技術分野において知られており、また、本発明の好ましい基質が最もよく生成されるように選択され、また、下記において例示されている。特に、本発明は、式：Ｒ２−Ｒ１−Ｙ（ここで、Ｙは、反応性脱離基、例えば、アンモニウム塩などである）で表される化合物を、式：ＨＸ−ＣＨ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｌ又はその前駆物質で処理し、得られた化合物を、例えばリンカーＲ４を構築すること及び／又は標識Ｌを導入することにより、さらに操作する方法に関する。あるいは、式：Ｒ２−Ｒ１−ＸＨで表される化合物を、式：Ｙ−ＣＨ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｌ（ここで、Ｙは、脱離基、例えば、ハロゲンである）で表される化合物又はその前駆物質でアルキル化し、得られた化合物を、例えば、残基Ｒ３及び／若しくはリンカーＲ４を構築することにより、並びに／又は、標識Ｌを導入することにより、さらに操作する。
特に、本発明は、１以上の標識を有する新規基質を製造する方法に関する。該合成は、式：Ｒ２−Ｒ１−Ｘ−ＣＨ２−Ｒ３−Ｒ４（ここで、Ｒ４は、２以上の反応性求核基又は求電子基を有する多官能性残基である）で表されるコア化合物を介して進行させる。そのような基の例には、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、ハロ又はカルボキシなどがある。反応性基のさらなる例は、マイケルアクセプター（Michael acceptor）、例えば、マレイミド又はビニルスルホンなどである。さらに、付加環化反応に関与し得る官能基も挙げることができ、そのような官能基は、例えば、ジエン類又はジエノフィル類、アジド類、ニトロン類、ニトリルオキシド類、アセチレン類及びアルケン類などである。
適切な標識を結合させるために、残基Ｒ４上に、特に、分枝鎖残基の外圏に配置し得る特定の官能基は、それらが互いに反応し得るか又はそれらが本発明の基質を構築するのに使用される任意の化合物若しくは試薬と反応し得るということが想定されないという要件によってのみ制限される。従って、それらの選定は、望ましい基質を構築するために選択される特定の試薬に依存する。分枝鎖残基Ｒ４の外圏に配置することが可能な官能基の例には、フルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、カルボキシ、カルバモイル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルバルデヒド、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、炭素−炭素二重結合、及び、炭素−炭素三重結合などである。最も好ましい例としては、アミノ、ヒドロキシ、シアノ（潜在的なカルボキシ官能基）、カルバモイル、カルバルデヒド、又は、炭素−炭素二重結合などを挙げることができる。
特に、複数の標識Ｌを有している分枝鎖Ｒ４の好ましい合成は、オルソゴナルに保護されている（orthogonally protected）官能基を用いる。保護基をそのように選択することにより、別々に脱保護することが可能となり、それによって、遊離された各官能基を次に化学的にさらに操作して、それに標識を結合させることができるか、又は、リンカーＲ４のさらなる拡大が可能となる。当業者は、想定される官能性についての適切な保護基を選定することが可能であり、そのような保護基は、例えば、以下の文献に要約されている：Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ 及び Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１。
本発明による好ましい中間体は、式中のＲ１−Ｒ２が式２（ここで、Ｒ２は水素であり、Ｒ５は水素であり、Ｒ６は置換されていないアミノである）で表されるラジカルであり；Ｘが酸素であり；Ｒ３がトリアゾリル、テトラゾリル、イソオキサゾリル、チエニル、イソオキサゾリジニル又はアルキニルであり；Ｒ４がリンカーであり；及び、Ｌがアミノ又はアジド（特に、アミノ）である式１で表される化合物である。
本発明による好ましい別の中間体は、式中のＲ１−Ｒ２が式２（ここで、Ｒ２は水素であり、Ｒ５は水素であり、Ｒ６は置換されていないアミノである）で表されるラジカルであり；Ｘが酸素であり；Ｒ３は１，４−フェニレンであり；Ｒ４は場合によりオキソで置換されていてもよい１０〜４０の炭素原子を有する直鎖アルキレン基（ここで、１２以下の炭素原子は酸素で置き換えられており、０、１又は２の炭素原子は窒素で置き換えられている）であり；及び、Ｌがアミノ又はアジド（特に、アミノ）である式１で表される化合物である。
最も好ましい中間体は、スキーム及び実施例に記載されている中間体である。
式中のＲ３がテトラゾリル基、イソオキサゾリル基又はイソオキサゾリジニル基である式１の化合物の合成において有用な中間体の合成については、スキーム１及びスキーム２に要約してある。
アジド化合物７は、市販されているテトラエチレングリコール５から、メシル化（メタンスルホニルクロリド、トリエチルアミン）した後、エタノール中でアジ化ナトリウムと反応させることにより調製する。７を再度メシル化した後、Ｇａｂｒｉｅｌアミン合成に付すことにより、アジド−アミン９を得る（Ｃａｒｏｌａｙら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６：４３２６−４３２９，１９９１）。アジド９とアセチレン誘導体１０の間でＣｕ（Ｉ）を触媒として用いる１,３−双極付加環化（Ｇｒｉｆｆｉｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：４０７１−４０８３，２０００）を行うことにより、１，４−置換トリアゾール１１を得る。あるいは、アジド９とシアノ誘導体１２をルイス酸（ＺｎＢｒ２）の触媒作用下で反応させて、テトラゾール１３を形成させる（スキーム１）。
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アジド７をＳｗｅｒｎｓ酸化（塩化オキサリル、ＤＭＳＯ、トリエチルアミン）により中心的なビルディングブロック（アルデヒド１４）に変換する。１４をヒドロキシルアミン誘導体と反応させることにより、ニトロン１７が生成され、これをアセチレン誘導体１０と反応させることにより、イソオキサゾリジン類１８が形成される。アルデヒド１４から、オキシム１５が異性体の等モル混合物として形成される。次亜塩素酸ナトリウムで酸化することにより対応するニトリルオキシドがインシトゥで形成され、次いで、１０と反応させることにより、イソオキサゾール１６が生成する（スキーム２）。
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式中のＲ３がチエニル基である式１の化合物の合成において有用な中間体の合成については、スキーム３に要約してある。
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市販されているテトラエチレングリコール５を、強塩基条件下で１当量のヨウ化アリルと反応させることにより単官能化して２２を生成させ、これを、さらに、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）で保護して２３とする。この中間体は、パラジウムを触媒として使用するチオフェン誘導体２１とのスズキカップリングに付すことができ、それにより、完全に保護された化合物２５が得られる。
ＤＭＴ基をモノ脱保護した後、メシル化し（メタンスルホニルクロリド、トリエチルアミン）、その後、エタノール中でアジ化ナトリウムと反応させることにより、保護されたアジドを得る。これをＨＦ／ピリジンで脱保護することにより２６を得る。遊離ヒドロキシ基を活性化グアニン−カチオン２７とカップリングさせることにより、アジド−中間体が得られるが、これは、別の官能化方策のための前駆物質として使用することができる。最後に、前記アジドを還元してアミン２８とすることにより、標識単位Ｌを導入することが可能であるか、又は、別の表面に結合させることができる。
式中のＲ３がフェニレン基である式１の化合物の合成において有用な中間体の合成については、スキーム４に要約してある。
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式中のＲ１がグアニンであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ３が１，４−フェニレンであり、Ｒ４が２つのトリアゾリル−４−メトキシ単位とテトラエチレンオキシ単位から構成される単位であり、及び、Ｌが−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である式１の化合物は、スキーム５に示してあるようにして調製する。
Figure 0004976651
式中のＲ１がグアニンであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ３が１，４−フェニレンであり、Ｒ４がトリアゾリル−４−メトキシキをさらに有しているテトラエチレンオキシ単位であり、及び、Ｌが−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である式１の化合物は、スキーム６、スキーム７及びスキーム８に示してあるようにして調製する。
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式中のＲ１がグアニンであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ３が１，４−フェニレンであり、Ｒ４が６−アミノカプロイル基をさらに有するテトラエチレンオキシ単位であり、及び、Ｌが２種類の異なったアフィニティー標識の組合せを表している式１の化合物の合成については、スキーム９〜スキーム１１に例示してある。
トリ−オルソゴナル保護基戦略（tri-orthogonal protecting group strategy）のために、ジアゾ転移法（diazo transfer method）により、ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン４７を対応するα−アジド−ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン４８に変換する（Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．３：７８１−７８３，２００１）。α−アジド−ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシンを、標準的なペプチドカップリング条件下で、適切な官能化アミノ−ベンジルグアニン誘導体（例えば、４９）と縮合させることにより、完全に保護された分子骨格５０が得られる。水性１,４−ジオキサン中で、中性条件下、α−アジド基をトリメチルホスフィンで還元して対応するアミン５１とすることにより、種々の異なったビルディングブロック（例えばアフィニティー標識を含んでいるもの）と縮合させるのに適する化合物が得られる。例えば、Ｎ−（＋）−ビオチン−６−アミノ−カプロン酸Ｎ−スクシンイミジルエステルとカップリングさせることにより、５２が得られ、その後、ジエチルアミンでＦｍｏｃを除去することにより、遊離アミノ基を有する中間体５３が生成される。これを用いて、さらに別の標識を中心の単位にカップリングさせることができる。５３の前記遊離アミン基にジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルをカップリングさせることにより、二重に標識された基質５４が得られる（スキーム９）。
Figure 0004976651
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二重に標識された基質５４の別法による合成に関し、別のオルソゴナル保護戦略（orthogonal protection strategy）についてスキーム１０で説明する。α−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ε−Ｎ−Ｄｄｅ−リシン５５を、標準的なペプチドカップリング条件下、適切な官能化アミノ−ベンジルグアニン誘導体（例えば、４９）と縮合させることにより、完全に保護された分子骨格５６が得られる。ジエチルアミンでＦｍｏｃを除去した後、Ｎ−（＋）−ビオチン−６−アミノカプロン酸Ｎ−スクシンイミジルエステルとカップリングさせることにより、中間体５８が得られる。４％ヒドラジン溶液を用いて残留しているＤｄｅ保護基を切断することで第二のアミノ基を遊離させ、それにより、化合物５３が得られる。これは、さらに、誘導体化することができる。
Figure 0004976651
スキーム１１は、標識の異なった組合せを有しているベンジルグアニン誘導体のさらに２つの例の合成を示している（５９における２つのアフィニティー標識ビオチン及びジニトロフェニル、又は、６０における発蛍光団と組み合わせたアフィニティー標識）。５３から出発して（スキーム９を参照されたい）、２，４−ジニトロフルオロベンゼンを遊離アミノ基にカップリングさせることにより、５９が得られる。５３内の遊離アミノ基にフルオレセイン−５（６）−カルボキサミドカプロン酸Ｎ−スクシンイミジルエステルをカップリングさせることにより、６０が得られる。
式中のＲ１がグアニンであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ３が１，４−フェニレンであり、Ｒ４が尿素官能基を介して結合している二量体化テトラエチレンオキシ単位であり、及び、Ｌが−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である式１のさらに別の化合物は、スキーム１２に示されているように調製する。
Figure 0004976651
式中のＲ１がグアニンであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ３がプロパルギルであり、Ｒ４がさらに６−アミノカプロイル基を含んでいるテトラエチレンオキシ単位であり、及び、Ｌがビオチンである式１の化合物の合成は、スキーム１３及びスキーム１４に示されている。
Figure 0004976651
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別のタンパク質と相互作用可能な合成リガンドでの融合タンパク質の共有結合的な標識化に基づいて生細胞内でタンパク質の二量体化を誘導する小分子として作用する標識Ｌとしての酵素阻害薬を用いたベンジルグアニン誘導体の合成は、スキーム１５及びスキーム１６に示されている。特に、式中のＲ１がグアニンであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ３が１，４−フェニレンであり、Ｒ４がω−アミノ−ドデカノイルアミノ−メチル残基であるか又はグルタミン酸単位をさらに含んでいるテトラエチレンオキシ単位であり、及び、Ｌがメトトレキサートである式１の化合物の合成に関して記載されている。メトトレキサートは、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの強結合阻害剤であり、これらのヘテロ二量体構造は、いわゆる「二量体化誘発物質」（ＣＩＤ）と称されるよく知られている種類の化合物に属する。
Figure 0004976651
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式中のＲ１がグアニンであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ３が１，４−フェニレンであり、Ｒ４がブト−２−エン−１，４−ジオール誘導体であり、及び、Ｌが−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である式１の化合物は、スキーム１７及びスキーム１８に示されているように調製する。
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Ｏ６−ベンジルグアニン誘導体を溶解させるのに必要な極性溶媒は、オレフィン複分解触媒ベンジリデン−ビス（トリシクロヘキシルホスフィン）−ジクロロルテニウムとは適合しないと考えられる。従って、最初に、保護された対称性コア単位８１及び８５を構築し、脱保護した後、最終的なビス−ベンジルグアニン８２及び８６を合成する。
本発明の特に好ましい化合物は、スキーム１〜スキーム１８に示されている化合物及び実施例に記載されている化合物である。
実施例
実施例１：ＡＧＴ基質を共有結合により結合させるためのスライドガラスの調製、及び、それに続く、タンパク質マイクロアレイを調製するためのＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による固定化
市販されている顕微鏡スライドガラス（ＳｉＯ２）を、超音波浴内で、ジクロロメタン、アセトン、Ｈ２Ｏ２／Ｈ２ＳＯ４を用いて充分に清浄化し、さらに、２回蒸留させた蒸留水で充分に洗浄した。それを、公表されている手順に従い、エタノール／水（９５：５）の溶媒混合物中で３−アミノプロピルトリエトキシシランを用いて、１時間、アミノシリル化した後、ジスクシンイミジルグルタレート（１０mM）をジクロロメタン／ジイソプロピルエチルアミン（１００：１）に溶解させた溶液で、アルゴン下、室温で２時間処理すした。該表面を、ジクロロメタンで数回洗浄した。活性化カルボキシ官能基を保持しているガラス表面を、標識Ｌの代わりに遊離アミノ基を有している式１の化合物（例えば、化合物１１、化合物１３、化合物１６、化合物１８、化合物２８、化合物３４、化合物４９、化合物６８又は化合物７３）を１０mMの濃度でメタノールに溶解させトリエチルアミンを添加した溶液と一緒に、４時間インキュベーションした。スライドガラスをメタノールで３回以上洗浄することにより、対応するＡＧＴ−基質がアミド結合により共有結合的に結合した表面が得られた。得られたスライドガラスをさらに使用する際に副反応が起こるのを避けるために、全ての未反応スクシンイミジル基を、６−アミノヘキサノール（ＤＭＦ中１００mM）を添加することによりクエンチした。
実施例２：１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカノール（７）及び１，１１−ジアジド−３，６，９−トリオキサウンデカン（３６）
５０．０ｇ（２６０mM）のテトラエチレングリコールと５０mLのトリエチルアミンを２００mLの乾燥ジエチルエーテルに溶解させた溶液を、アルゴン雰囲気下、０℃に冷却し、１５．０ｇ（１３０mM）のメタンスルホニルクロリドを３時間かけて添加して室温で２０分間撹拌した。減圧下に溶媒を除去し、３００mLの９５％エタノール及び１８．０ｇ（２８０mM）のアジ化ナトリウムを添加した。得られた混合物を２４時間加熱還流し、室温まで冷却し、減圧下に濃縮した。残留した混合物を４００mLのジクロロメタンで希釈し、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。減圧下に濃縮した後、モノアジドとジアジドの粗混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル ３：１）で精製することにより、１５．０３ｇ（６８．５mmol，２６％）のモノアジド及び３．４６ｇ（１４．１８mmol，５．５％）のジアジドを得た。
実施例３：１−アジド−１１−フタルイミド−３，６，９−トリオキサウンデカン（８）
１．１７ｇ（５．３５mmol）の１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカノール（７）と１．２mLのトリエチルアミンを３５mLの塩化メチレンに溶解させた溶液を０℃に冷却し、シリンジを用いて０．５mL（６．４５mmol）のメタンスルホニルクロリドを２０分間かけて滴下して加えた。得られた混合物を室温まで昇温させ、１．５時間撹拌した。次いで、その混合物を、１０mLの飽和水性ＮａＨＣＯ３で２回洗浄し、５mLの水で３回洗浄した。有機層を減圧下に乾燥濃縮して、１．５ｇの８を黄色の油状物として得た。これは、それ以上精製することなく、使用した。
実施例４：４−ブロモテニル（bromothenyl）アルコール（２０）
５．０ｇ（２６．１７mmol）の４−ブロモチオフェン−２−カルボキシアルデヒド（１９）を７５mLのイソプロパノールに溶解させ、１．１１ｇ（２９．３１mmol）のＮａＢＨ４を一度に添加し、得られた混合物を２時間撹拌した。２０mLの飽和水性ＮＨ４Ｃｌを添加し、濾過により固体を除去し、得られた混合物を減圧下に濃縮した。生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル １０：１）により精製して、４．６４ｇの２０（２４．０７mmol，９２％）を無色の固体として得た。
実施例５：４，７，１０，１３−テトラオキサ−１−ペンタデセン−１５−オール（２２）
２．３ｇ（１９．５mmol）のカリウムｔ−ブトキシドを５００mLの乾燥ＴＨＦに溶解させ、７．１８ｇ（３７mmol）のテトラエチレングリコールを滴下して加えた。３０分間撹拌した後、３．３１ｇ（１９．７mmol）のヨウ化アリルを６０mLの乾燥ＴＨＦに溶解させた溶液を１時間かけて添加し、撹拌を２４時間継続した。得られた粗混合物をシリカゲルで濾過し、減圧下に溶媒を除去した。生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（勾配：石油エーテル／酢酸エチル １０：１ → 酢酸エチル）により精製して、２．４１ｇの２２（１０．３mmol，２７％）を無色の液体として得た。
実施例６：１−（２−アミノ−７Ｈ−プリン−６−イル）−１−メチル−ピロリジニウムクロリド（２７）
１．０ｇ（５．９mmol）の６−クロログアニンを４０℃で４０mLのＤＭＦに溶解させた。室温まで冷却した後、１．４mLの１−メチルピロリジン（１３．２mmol）を添加し、得られた反応混合物を１８時間撹拌した。２mLのアセトンを添加して、沈澱を完了させた。固体を濾過し、エーテルで洗浄し、減圧下に乾燥させて、１．０３ｇの２７（３．９mmol，６６％）を得た。
実施例７：Ｏ ６ −（４−アミノメチル−ベンジル）グアニン（３２）
（ａ）４−アミノメチル−ベンジルアルコール： ２．８３ｇのＬｉＡｌＨ４（７４．５mmol）を１５０mLの乾燥エーテルに懸濁させ、冷却しながら、１．９mLのＨ２ＳＯ４（１００％，３７．２mmol）を滴下して加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した後、１２mLのエーテル中の２．０ｇ（１２．４mmol）の４−シアノベンゾエートを滴下して加えた。２時間還流した後、２０mLの水とそれに続く６０mLの水中の７．４ｇのＮａＯＨにより反応物をクエンチした。有機層をデカントし、水層をエーテルと酢酸エチルで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、溶媒を除去し、生成物を減圧下に乾燥させて、０．９２ｇ（６．７mmol，５４％）を得た。
（ｂ）２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（４−ヒドロキシメチル−ベンジル）−アセトアミド： ８６６mg（６．３mmol）の４−アミノメチル−ベンジルアルコールと８８０μL（６．３mmol）のトリエチルアミンを１０mLの乾燥メタノールに溶解させた溶液に、９８０μL（８．２mmol）のトリフルオロ酢酸エチルエステルを滴下して加えた。得られた反応混合物を４５分間撹拌し、１０mLの酢酸エチルと１０mLの水で希釈した。水層を酢酸エチルで希釈し、有機層を合して飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。減圧下に溶媒を除去した後、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／シクロヘキサン １：２）で精製した。収量：１．３２ｇ（５．７mmol，９０％）。
（ｃ）Ｎ−［４−（２−アミノ−７Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−２，２，２−トリフルオロアセトアミド： ５９２mg（２．５４mmol）の２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（４−ヒドロキシメチル−ベンジル）アセトアミドを、アルゴン雰囲気下、乾燥ＤＭＦに溶解させ、５９９mg（５．３３mmol）のカリウムｔ−ブトキシドを添加した。次いで、３００mg（１．１８mmol）の１−（２−アミノ−７Ｈ−プリン−６−イル）−１−メチルピロリジニウムクロリド（２７）を添加し、この溶液を３時間撹拌した。減圧下に溶媒を除去した後、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（３００mL メタノール／ジクロロメタン １：５０，５００mL メタノール／ジクロロメタン １：１０）で精製した。収量：３８２mg（１．０４mmol，８８％）。
（ｄ）Ｏ６−（４−アミノメチル−ベンジル）グアニン（３２）： ３３５mg（０．９１mmol）のＮ−［４−（２−アミノ−７Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−２，２，２−トリフルオロアセトアミドを３４mLのメタノールと２mLの水に懸濁させた。６５６mg（４．７５mmol）のＫ２ＣＯ３を添加した後、得られた反応混合物を２時間還流した。減圧下に溶媒を除去し、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（メタノール／トリエチルアミン／ジクロロメタン １：０．０５：５）で精製した。収量：２０９mgの３２（０．７７mmol，８５％）。
実施例８：Ｏ ６ −（４−［プロプ−２−イニルオキシメチル］−ベンジル）グアニン（３５）
６６２mg（３．８mmol）の４−（プロプ−２−イニルオキシメチル）−ベンジルアルコール（３９）を３mLの乾燥ＤＭＳＯに溶解させ、６１mgのＮａＨを５分間かけて少量ずつ添加した。３００mg（１．２７mmol）の１−（２−アミノ−７Ｈ−プリン−６−イル）−１−メチルピロリジニウムクロリド（２７）を添加し、得られた混合物をさらに４時間撹拌した。反応物を０．２mLの酢酸でクエンチし、蒸発乾固させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配：ジクロロメタン／メタノール ５０：１ → １０：１）により精製して、１８８mgの３５（０．６１mmol，５３％）を得た。
実施例９：ホモ−Ｏ ６ −ベンジルグアニン−二量体３７
５０．０mg（０．１６２mmol）のＯ６−（４−［プロプ−２−イニルオキシメチル］−ベンジル）グアニン（３５）と１９．７mg（０．０８１mmol）の１，１１−ジアジド−３，６，９−トリオキサウンデカン（３６）を０．５mLのＤＭＦに溶解させた溶液に、１５．４３mg（０．０８１mmol）のＣｕ２Ｃｌ２を０．１５mLの水に懸濁させた懸濁液を添加した。得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。
実施例１０：４−（プロプ−２−イニルオキシメチル）ベンジルアルコール（３９）及び１，４−ビス−（プロプ−２−イニルオキシ−メチル）ベンゼン（４０）
２．５ｇ（１８．１mmol）の４−ヒドロキシメチルベンジルアルコール（３８）の溶液に、４７７．５mg（１９．９mmol）のＮａＨを２０分間かけて少量ずつ添加した。２．１５mLの臭化プロパルギル溶液（トルエン中８０％）を滴下して加え、１５時間撹拌した。得られた混合物に１００mLの水を添加し、生成物をジエチルエーテルで抽出した。相を合して乾燥させ、減圧下に溶媒を除去した。生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル ４：１）により分離して、１．０８ｇの３９（６．１７mmol，３４％）及び１．０５ｇの４０（４．９４mmol，２７％）を得た。
実施例１１：４−［（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル］ベンジルアルコール（４４）
８１０mg（３３．７７mmol）のＮａＨを室温で９０mLの乾燥ＴＨＦに懸濁させ、４．２ｇ（３０．３９mmol）の固形４−ヒドロキシメチル−ベンジルアルコール（３８）を３回に分けて５分間かけて添加した。得られた反応混合物を４５分間撹拌した。４．８３ｇ（３２．０８mmol）のｔ−ブチルジメチルシリルクロリドを３回に分けて５分間かけて添加し、さらに１．５時間撹拌した後、その混合物を水でクエンチし、次いで、１００mLの水と１００mLのジエチルエーテルで希釈した。有機相を分離し、水相をジエチルエーテルで抽出した。有機相を合してブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下に濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル １０：１）で精製して、３．０ｇの４４（１１．８８mmol，４０％）を得た。
実施例１２：１−［（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル］−４−（ヨードメチル）ベンゼン（４５）
９．１５ｇ（３４．８８mmol）のトリフェニルホスフィン及び３．２ｇ（４４．５mmol）のイミダゾールをジエチルエーテル／アセトニトリルの３：１混合物（３０mL）に溶解させた。黄色の懸濁液が形成されるまで、激しく撹拌しながら、８．８５ｇ（３４．９mmol）のヨウ素を添加した。６．１ｇ（２３．２５mmol）のモノ保護ベンジルアルコール４４を２０mLの上記と同一の溶媒混合物に溶解させた溶液を添加し、得られた混合物を２時間撹拌した。濾過により固体を除去し、濾液を１００mLのジエチルエーテルで希釈し、１００mLの重亜硫酸ナトリウム飽和溶液で洗浄した。この水溶液をジエチルエーテルで逆抽出し、有機相を合してＭｇＳＯ４で脱水し、減圧下に濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル ９５：５）に付すことにより、４．８ｇの４５（１３．２５mmol，５７％）を得た。
実施例１３：４−（１３−アジド−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−ベンジルアルコール（４６）
４．８ｇ（１３．２５mmol）の１−［（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル］−４−（ヨードメチル）ベンゼン（４５）をアルゴン下、７０mLの乾燥ＴＨＦに溶解させた。０．９５４ｇ（３９．７５mmol）のＮａＨを１０分間かけて少量ずつ添加した。３．２ｇ（１４．５８mmol）の１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカノール（７）を２０mLの乾燥ＴＨＦに溶解させた溶液を滴下して加え、得られた反応混合物を室温で１５時間撹拌した。２mLの水を添加して反応物をクエンチし、この混合物を減圧下に約５０％になるまで濃縮した。７０mLの水を添加し、反応混合物をジエチルエーテルで抽出した。有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、溶媒を除去した。シリカゲルクロマトグラフィー（勾配：石油エーテル／酢酸エチル １０：１ → ３：１）で精製して、３．８ｇ（８．３８mmol，６３％）のＴＢＤＭＳで保護された生成物を得た。これを、プラスチック製チューブ内で８０mLの乾燥ＴＨＦに溶解させ、０℃に冷却し、８mLのピリジン／ＨＦ（７０：３０）溶液を添加し、室温で３時間撹拌した。１００mLの水性飽和ＮａＨＣＯ３を添加し、有機相を分離し、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。溶媒を除去した後、生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル １：１）で精製して、１．２７ｇの４６（２．８７mmol，７４％）を得た。
実施例１４：Ｏ ６ −［４−（１３−アジド−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−ベンジル］グアニン（４１）
０．９７４ｇ（２．８７mmol）の４−（１３−アジド−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−ベンジルアルコール（４６）を５mLの乾燥ＤＭＦに溶解させ、１．３ｇ（１１．５mmol）のカリウムｔ−ブトキシドを添加した。０．７３１ｇ（２．８７mmol）の１−（２−アミノ−７Ｈ−プリン−６−イル）−１−メチル−ピロリジニウムクロリドを添加し、この溶液を２２時間撹拌した。減圧下に溶媒を除去した後、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン ５：９５）で精製した。収量：０．６７５ｇ（５０％）。
実施例１５：ヘテロ−Ｏ ６ −ベンジルグアニン−二量体４２
４５mg（０．０９mmol）のアジド４１と２９．５mg（０．０９mmol）のＯ６−（４−［プロプ−２−イニルオキシメチル］−ベンジル）グアニン（３５）を１mLの水／アセトニトリル（１：１）に溶解させた溶液に、９．８mgのＣｕＣｌ２を０．１mLの水に懸濁させた懸濁液を添加し、得られた反応混合物を室温で２４時間撹拌した。全ての不溶性物質を濾過し、減圧下に溶媒を蒸発させ、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン ５：１）で精製して、３．５mg（０．００４mmol，１０％）を得た。ＥＳＩ／ＭＳ：７８１．４４（Ｍ＋）。
実施例１６：ホモ−Ｏ ６ −ベンジルグアニン−二量体４３
アジド４１（１００mg，０．２１mmol）及び１，４−（ジプロプ−２−イニルオキシメチル）ベンゼン（４０）（２２．６mg，０．１０mmol）を、３００μLのエタノールと２００μLの水と５００μLのｔ−ブタノールからなる溶媒混合物に溶解させた。１０μLのＣｕＳＯ４溶液（４０mM）、５mgの銅線及び３mgのＣｕＩ２を添加し、得られた反応混合物を室温で４８時間撹拌した。全ての不溶性物質を濾過し、減圧下に溶媒を蒸発させ、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール ２０：１）で精製して、３４mg（２８％）の二量体４３を得た。ＥＳＩ／ＭＳ：１１５９．３７（Ｍ＋）。
実施例１７：１１−アミノ−１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン（９）
１−アジド−１１−フタルイミド−３，６，９−トリオキサウンデカン（８，実施例３，２．０ｇ，５．７４mmol）を、５０mLの無水メタノール中で、１．０mLの５５％ヒドラジン水和物で処理し、２時間加熱還流した。室温まで冷却した後、得られた混合物を減圧下に濃縮し、５０mLの水で希釈し、５mLの濃ＨＣｌで処理した。全ての沈澱物を濾過し、水性濾液をＮａＯＨで中和し、減圧下に溶媒を除去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、３Ｎ ＮａＯＨ及び水で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、減圧下に濃縮して、０．６３ｇ（２．９mmol，５１％）の無色の油状物を得た。これは、それ以上精製することなく次のステップで使用した。
実施例１８：Ｏ ６ −（１−［１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデシル］−１，２，３−トリアゾリル−４−メチル）−グアニン（１１）
Ｏ６−プロパルギル−グアニン１０（７５mg，０．４mmol）及びアジド９（４４mg，２mmol）を、４００μLのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドと１００μLのアセトニトリルと１００μLの水からなる溶媒混合物に溶解させた。１０μLのＣｕＳＯ４溶液（４０mM）、銅線（５mg）及びＣｕＩ２（２mg）を添加し、得られた反応混合物を室温で４８時間撹拌した。全ての不溶性物質を濾過し、減圧下に溶媒を蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール ２０：１）に付すことにより、３５mgの１１（２１％）を得た。
実施例１９：α−アジド−ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン４８
１８mLのトリフリルアジド（６．３mmol，ジクロロメタン中２．３当量）を、２７mLの溶媒混合物（水／メタノール １：２）中のＣｕＳＯ４（８mg）及びε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン４７（１．１０ｇ，２．９８mmol）に添加した。ジイソプロピルエチルアミン（９７１μL，５．５８mmol）を添加し、得られた反応混合物を室温で一晩撹拌した。減圧下に有機溶媒を除去し、１００mLの水を添加した。６Ｎ ＨＣｌでｐＨを２．５に調節した。酢酸エチルで抽出した後、有機フラクションを合して水で洗浄し、脱水した（ＭｇＳＯ４）。溶媒を蒸発させることにより、粗生成物を黄色の油状物として得た。フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール ９７：３）に付すことにより、６７０mg（５９％）の白色の固体を得た。Ｒｆ＝０．３２（ジクロロメタン／メタノール ９５：５）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）３９５．２３［Ｍ＋Ｈ］＋（ＭＷ計算値＝３９４．３）。
実施例２０：Ｏ ６ −［４−（１３−アミノ−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−ベンジル］グアニン（４９）
Ｏ６−［４−（１３−アジド−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−ベンジル］グアニン（４１，０．２１ｇ，０．４４mmol）を加熱することにより８mLの乾燥メタノールに溶解させた。トリエチルアミン（４１０μL，２．２mmol）及び１，３−プロパンジチオール（２２５μL，２．２mmol）をアルゴン雰囲気下に添加した。得られた反応混合物を４０℃で加熱し、４８時間撹拌した。この溶液をデカントし、固体をメタノールで洗浄し、減圧下に溶媒を蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール ９５：５）で精製し、標題化合物を淡黄色の油状物として得た（１２０mg，０．２６mmol，６１％）。Ｒｆ＝０．０１（ジクロロメタン／メタノール ９：１）。
Figure 0004976651
実施例２１：Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−アジド−ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン５０
Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミン４９（７６mg，０．１７mmol）及びα−アジド−ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン４８（６７．２mg，０．１７mmol）を０．８mLの乾燥ＤＭＦに溶解させ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（３８０μL，０．３８mmol，１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中１Ｍ）を添加した。得られた混合物を４０℃で２時間撹拌し、２５mLのジエチルエーテル中に移し、粗生成物を沈澱させた。残渣をメタノールに溶解させ、ＳｉＯ２（０．２ｇ）に吸着させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール １０：１）で精製して、Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−アジド−ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン５０を淡黄色の油状物として得た（８１mg，０．０９８mmol，５７％）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）８２３．３［Ｍ＋Ｈ］＋（ＭＷ計算値＝８２２．９）。
実施例２２：Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン５１
Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−アジド−ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン５０（８１mg，０．０９８mmol）を４００μLの１，４−ジオキサン／１００μLの水に溶解させ、５９０μLのトリメチルホスフィン（ＴＨＦ中１Ｍ）を添加した。室温で２時間撹拌した後、生成物を２０mLのジエチルエーテル中で沈澱させ、減圧下で一晩乾燥させた。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）７９７．３５［Ｍ＋Ｈ］＋（ＭＷ計算値＝７９６．９）。この生成物は、それ以上精製することなく使用した。
実施例２３：Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン５２
Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン５１（７８．４mg，０．０９８mmol）及び３０μLのトリエチルアミンを０．５mLのＤＭＦに溶解させた。Ｎ−（＋）−ビオチン−６−アミノカプロン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（４９．２mg，０．１mmol）を０．５mLのＤＭＦに溶解させた。両方の溶液を合し、４０℃で２時間撹拌した。得られた反応混合物を３０mLのジエチルエーテル中に移して粗生成物を沈澱させた。残渣をメタノールに溶解させ、ＳｉＯ２（０．２ｇ）に吸着させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール １０：１）で精製して、８０mg（０．０７mmol，７１％）の無色の固体を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）１１３６．３８［Ｍ＋Ｈ］＋（ＭＷ計算値＝１１３５．３８）。
実施例２４：Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−リシン５３
Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−ε−Ｎ−Ｆｍｏｃ−リシン５２（１６mg，０．０１４mmol）及び５０μLのジエチルアミンを０．４mLのＤＭＦに溶解させ、室温で１時間撹拌した。２０mLのジエチルエーテルで生成物を沈澱させ、 減圧下に乾燥させた。
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）９１４．３８［Ｍ＋Ｈ］＋（ＭＷ計算値＝９１４．１３）。この生成物は、それ以上精製することなく次のステップで使用した。
実施例２５：Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−ε−Ｎ−［ジゴキシゲニン−３−オキシメチルカルボニル］−６−アミノカプロリル）−リシン５４
Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−リシン５３（６．９３mg，０．００７５mmol）及び１０μLのトリエチルアミンを０．４mLの乾燥ＤＭＦに溶解させた溶液に、（ジゴキシゲニン−３−オキシメチル−カルボニル）−６−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（５mg，０．００７５mmol）を添加し、得られた反応混合物を４０℃で２時間撹拌した。２０mLのジエチルエーテルで生成物を沈澱させ、減圧下に乾燥させ、クロロホルム中の５％メタノールから１５％メタノールまでの勾配を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、５mg（０．００３４mmol，４５％）の標題生成物を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）１４５８．７８［Ｍ＋Ｈ］＋（ＭＷ計算値＝１４５７．８２）。
実施例２６：Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ε−Ｎ−Ｄｄｅ−リシン５６
Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミン４９（５０mg，０．１１mmol）及びα−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ε−Ｎ−Ｄｄｅ−リシン５５（５８mg，０．１１mmol）をＤＭＦ（６００μL）に溶解させた。ＨＯＢＴ（ＮＭＰ中の１Ｍ溶液の２８０μL，０．２８mmol）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ，５４mg，０．２８mmol）を添加し、得られた反応物を室温で１時間撹拌した。この溶液にエチルエーテルを添加して生成物を沈澱させ、上清をピペットで除去した。残留している溶媒を減圧下に蒸発させた。生成物を、ジクロロメタン中の２％メタノールから５％メタノールまでの勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した（収率：６４％）。
実施例２７：Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−ε−Ｎ−Ｄｄｅ−リシン５７
Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ε−Ｎ−Ｄｄｅ−リシン５６（６６mg，６８．６μmol）をＤＭＦ（６００μL）に溶解させ、ジエチルアミン（７１μL，６８６μmol）を添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌し、減圧下に溶媒を除去した。この生成物は、それ以上精製することなく次のステップで使用した。
実施例２８：Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−ε−Ｎ−Ｄｄｅ−リシン５８
Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−ε−Ｎ−Ｄｄｅ−リシン５７及びＮ−（＋）−ビオチニル−６−アミノカプロン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（３１mg，６８．６μmol）をＤＭＦ（７００μL）に溶解させた。トリエチルアミン（３０μL）を添加し、得られた反応物を２時間撹拌した。この溶液にジエチルエーテルを添加して生成物を沈澱させ、上清をピペットで除去した。残留している溶媒を減圧下に蒸発させた。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した（クロロホルム中の２％メタノールから３％メタノールまでの勾配；収率：２ステップで３７％）。
実施例２９：Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−リシン５３
ＤＭＦ（２５０μL）中の２％ヒドラジンの溶液中で、Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−ε−Ｎ−Ｄｄｅ−リシン５８（２７mg，２５．０μmol）を２０分間撹拌した。得られた反応混合物にアセトンを添加し、その混合物をさらに３分間撹拌した。この溶液にエチルエーテルを添加して生成物を沈澱させ、上清をピペットで除去した。残留している溶媒を減圧下に蒸発させた。この生成物をそれ以上精製することなく実施例２４に準じて使用して、ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−ε−Ｎ−（［ジゴキシゲニン−３−オキシメチル−カルボニル］−６−アミノカプロイル）−リシン５４を調製した（収率：２ステップで４０％）。
実施例３０：Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−ε−Ｎ−（２，４−ジニトロベンゾイル）−リシン５９
Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−リシン５３（１６．９mg，１８．５ gmol）をＤＭＦ（４００μL）に溶解させ、２，４−ジニトロフルオロベンゼン（４．１mg，２２μmol）及びトリエチルアミン（４０μL）を添加した。得られた反応混合物を４５℃で２時間撹拌した。残留している溶媒を減圧下に蒸発させた。生成物を、クロロホルム中の０％メタノールから１５％メタノールまでの段階的な勾配を用いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した（収量：１５mg，７５％）。
実施例３１：Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−ε−Ｎ−（６−［フルオレセイン−５−カルボニル］−アミノカプロイル）−リシン６０
Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−リシン５３（８．５mg，０．９３ gmol）及び６−（フルオレセイン−５−カルボニル）−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルをトリエチルアミン（１０μL）と一緒に、２００μLのジメチルアセトアミド中で、４０℃で４時間撹拌した。８mLのジエチルエーテル中で生成物を沈澱させ、減圧下に乾燥させた。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）１３８５．３８［Ｍ＋Ｈ］＋（ＭＷ計算値＝１３８５．１３）。
実施例３２：ビス−Ｎ，Ｎ’−（Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ）−尿素６１
Ｏ６−［４−（１３−アミノ−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−ベンジル］−グアニン（４９，３０mg，６７μL）とＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネート（８．６mg，３３μL）を０．８mLの乾燥ＤＭＦに溶解させた溶液にトリエチルアミン（１５μL）を添加し、得られた反応混合物を室温で２４時間撹拌した。粗生成物をジエチルエーテル（１０mL）で沈澱させ、ＳｉＯ２に吸着させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン ５：１）で精製した。収量：８．５mg（９．２μmol，２７％）。ＥＳＩ／ＭＳ：９１９．７８［Ｍ＋Ｈ］＋，（ＭＷ計算値＝９１８．９９）。
実施例３３：１−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ブト−２−イン−４−オール（６３）
ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（８．０ｇ，５３mmol）を乾燥ジクロロメタンに溶解させ、２−ブチン−１，４−ジオール（１３．７１ｇ，１５９．２mmol，３当量）と４−ジメチル−アミノピリジン（１．２９ｇ，１０．６mmol，０．２当量）とトリエチルアミン（６．９mL）をジクロロメタン（２００mL）とＴＨＦ（１００mL）の溶媒混合物に溶解させた溶液に、滴下して加えた。得られた反応混合物を室温で１５時間撹拌し、水及び飽和塩化アンモニウムで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル １：１）に付すことにより、７．２ｇ（６７％）を得た。
実施例３４：１−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−４−ヨードブト−２−イン（６４）
Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，３３８９−３３６９，２０００）に従い、１００mLのジクロロメタン中で、１−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−ブト−２−イン−４−オール（６３，４．０ｇ，１９．９６mmol）、イミダゾール（１．８０ｇ，２６．４５mmol）、ヨウ素（６．５８ｇ，２５．９５mmol）及びトリフェニルホスフィン（６．８０ｇ，２５．９５mmol）を処理した。後処理に付すことにより、４．４２ｇ（７１％）の無色の油状物を得た。この生成物は、直接、次のステップで使用した。
実施例３５：４−（１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデシルオキシ）−１−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−２−ブチン（６５）
１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカノール（７，３．７９ｇ，１７．０２mmol）を乾燥ＴＨＦに溶解させ、水素化ナトリウム（１．０２ｇ，４２．４５mmol）を少量ずつ添加した。室温で４０分間撹拌した後、１−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−４−ヨードブト−２−イン（６４，４．４ｇ，１４．１８mmol）を添加し、得られた反応混合物をさらに１５時間撹拌した。この反応物を水でクエンチし、減圧下に溶媒の量を約３０％に低減させた。ジエチルエーテル（５０mL）を添加し、この混合物を水で洗浄し、有機相をＭｇＳＯ４で脱水した。溶媒を蒸発させた後、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル ４：１）で精製して、３．１２ｇ（５４％）を得た。
実施例３６：（１３−アジド−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−プロパルギルアルコール（６６）
ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル６５（１．５ｇ，３．３７mmol）を、０．２５mLの酢酸を含んでいる２５mLのＴＨＦに溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリド（４．１mL，ＴＨＦ中１Ｍ）で処理した。得られた反応混合物を２時間撹拌し、減圧下に溶媒の量を約３０％に低減させた。酢酸エチル（５０mL）を添加した後、有機相を飽和重炭酸ナトリウム（２０mL）及びブライン（３０mL）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。この生成物は、それ以上精製することなく次のステップで使用した。収量：０．７７４ｇ（８０％）。
実施例３７：Ｏ ６ −［（１３−アジド−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−プロパルギル］−グアニン（６７）
プロパルギルアルコール６６（７２４mg，２．５mmol）を乾燥ＤＭＦ（１mL）に溶解させ、水素化ナトリウム（１８１mg，７．５５mmol）を２回に分けて添加した。室温で３０分間撹拌した後、１−（２−アミノ−７Ｈ−プリン−６−イル）−１−メチル−ピロリジニウムクロリド（２７,６４１mg，２．５mmol）及び４−ジメチルアミノピリジン（１００mg，０．８１mmol）を添加した。撹拌を１５時間継続し、３０mLのジエチルエーテルを添加して生成物を沈澱させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール ９５：５）に付すことにより、４７０mg（４４％）の僅かに黄色い油状物を得た。ＥＳＩ／ＭＳ：４２１．２９［Ｍ＋Ｈ］＋。
実施例３８：Ｏ ６ −［（１３−アミノ−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−プロパルギル］−グアニン（６８）
アジド６７（４００mg，０．９５１mmol）及びトリフェニルホスフィン（７４８mg，２．８５mmol）を、溶媒混合物（６mLの１，４−ジオキサン／４００μLの水）中で、室温で１５時間撹拌した。減圧下に溶媒を除去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール １０：１）で精製して、３１２mg（８３％）を得た。
実施例３９：Ｏ ６ −［（１３−（ビオチニル−６−アミノカプロイル−アミノ）−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−プロパルギル］−グアニン（６９）
プロパルギルグアニン６８（２６．９mg，８８μmol）及び（＋）−ビオチニル−６−アミノヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（２０．０mg，４４ gmol）を１５μLのトリエチルアミンと一緒に、１mLのＤＭＦ中で、４０℃で３時間撹拌した。減圧下に溶媒を除去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール １０：１）で精製して、２０mg（６８％）を得た。
実施例４０：Ｏ ６ −［（１３−（ジゴキシゲニン−３−オキシメチルカルボニル−６−アミノカプロイル−アミノ）−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−プロパルギル］−グアニン７０
プロパルギルグアニン６８（１１．６mg，３７μmol）、ジゴキシゲニン−３−オキシメチルカルボニル−６−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（５mg，７．５μmol）及び１０μLのトリエチルアミンを４０℃で２時間撹拌した。２０mLのジエチルエーテルで生成物を沈澱させ、減圧下に乾燥させ、クロロホルム中の５％メタノールから１５％メタノールまでの勾配を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、３．２mgの標題化合物を得た（０．００３４mmol，４５％）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）９３９．７８［Ｍ＋Ｈ］＋（ＭＷ計算値＝９３８．１２）。
実施例４１：Ｏ ６ −［４−（１２−Ｆｍｏｃ−アミノ−ドデカノイル）アミノメチル］ベンジルグアニン７２
１２−Ｆｍｏｃ−アミノドデカン酸（１４７mg，０．３３mmol）及び１−ベンゾトリアゾリルオキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ，１９３mg，０．３７mmol）を１１mLのＤＭＦに溶解させた。室温で４５分間撹拌した後、５mLのＤＭＦ中のＯ６−４−アミノメチル−ベンジルグアニン（７１，１００mg，０．３７mmol）を添加した。得られた反応混合物を５０℃で５分間撹拌し、次いで、室温で１時間撹拌した。減圧下に溶媒を蒸発させた後、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配：メタノール／ジクロロメタン １：５０から１：１０まで）で精製して、１８５mg（０．２７mmol，７９％）の白色の固体生成物を得た。Ｒｆ＝０．３３（メタノール／ジクロロメタン １：１０）。
Figure 0004976651
実施例４２：Ｏ ６ −［４−１２−アミノドデカノイル）−アミノメチル］−ベンジルグアニン（７３）
Ｆｍｏｃで保護された誘導体７２（１８０mg，０．２６mmol）を、２０％（v／v，６．５mmol）のピペリジンを含んでいる３．２mLのＤＭＦに溶解させた。室温で３０分間撹拌した後、減圧下に溶媒を除去し、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配：メタノール／ジクロロメタン １：２０から１：５まで（１％トリエチルアミン含有））で精製して、９５mg（０．２０mmol，７８％）の淡黄色の固体を得た。Ｒｆ＝０．０５（メタノール／トリエチルアミン／ジクロロメタン ２０：１：１００）。
Figure 0004976651
実施例４３：Ｌ−２−｛４−［Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−メチルアミノ］−ベンゾイルアミノ｝−ペンタン二酸１−ベンジルエステル（７６）
Ｌ−グルタミン酸１−ベンジルエステル（７５，１１４mg，０．４８mmol）及びＫ２ＣＯ３（６６．４mg，０．４８mmol）を３mLのＤＭＳＯに添加し、６０℃で１時間超音波処理に付した。この混合物を、４−（Ｎ−［２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル］−メチルアミノ）−安息香酸７４（１５０mg，０．４６mmol）とジイソプロピルエチルアミン（１１２μL，０．６５mmol）とＰｙＢＯＰ（２５０mg，０．４８mmol）を１．３mLの１時間撹拌しておいたＤＭＳＯに溶解させた溶液に添加した。この反応混合物を５０℃で１０分間撹拌し、次いで、室温で２．５時間撹拌した。０．５mLの１Ｍトリエチルアミンでクエンチした後、粗生成物を直線勾配（水／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：アセトニトリル／０．０８％ＴＦＡ １００：０から２０：８０まで）を用いるＨＰＬＣで精製した。この溶液をｐＨ７に調節し、減圧下に溶媒を除去して、５０mg（０．０９mmol，２０％）の橙色の固体を得た。
Figure 0004976651
実施例４４：Ｏ ６ −４−（［１２−Ｎ−（４−｛４−［Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−メチルアミノ］−ベンゾイルアミノ）−４−ベンジルオキシカルボニルブタノイル）−アミノドデカノイル］−アミノメチル）−ベンジルグアニン（７７）
（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ，１５２mg，０．２９mmol）を１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）の溶液（１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中の１Ｍ溶液の１４６μL，０．１５mmol）に溶解させ、ベンジルエステル７６（ＮＭＰ中の０．１５４Ｍ溶液の３８０μL，０．０６mmol）に添加した。得られた混合物を３０分間振盪し、次いで、ジイソプロピルエチルアミン（３０μL，０．１８mmol）及び２００μLのＮＭＰ中のアミノ−グアニン７３（２７．２mg，０．０６mmol）に添加した。この反応混合物を室温で２時間撹拌し、次いで、２００μLの１ＭのＴＦＡでクエンチした。減圧下に溶媒を除去した後、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配：メタノール／ジクロロメタン １：５０から１：５まで（２％酢酸含有））で精製した。１９mg（０．２mmol，３３％）の橙色の固体が得られた。Ｒｆ＝０．０８（メタノール／酢酸／ジクロロメタン ５：１：５０）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）９９４．９［Ｍ＋Ｈ］＋（ＭＷ計算値＝９９４．２）。
実施例４５：Ｏ ６ −４−（［１２−Ｎ−（４−｛４−［Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−メチルアミノ］−ベンゾイルアミノ｝−４−カルボキシブタノイル）−アミノドデカノイル］−アミノメチル）−ベンジルグアニン（７８）
ベンジルエステル７７（１３mg，０．０１mmol）を２mLのメタノール／水（１：１）に溶解させ、Ｋ２ＣＯ３（７８５μL メタノール／水（１：１）中の１Ｍ，０．７９mmol）を添加した。得られた混合物を室温で２．５時間振盪した後、７８５μL の１ＭのＴＦＡでクエンチした。粗生成物を、直線勾配（水／０．１％ＴＦＡ：アセトニトリル／０．０８％ＴＦＡ １００：０から２０：８０まで）を用いるＨＰＬＣで精製した。１０mg（０．０１mmol，８５％）の生成物が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）９０４．７［Ｍ＋Ｈ］＋（ＭＷ計算値＝９０４．０）。
実施例４６：Ｏ ６ −４−［１３−Ｎ−（４−｛４−［Ｎ−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニルメチル）−メチルアミノ］−ベンゾイルアミノ｝−４−カルボキシブタノイル）−アミノ−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル］−ベンジルグアニン（７９）
ＰｙＢＯＰ（２０１mg，０．３９mmol）及びＨＯＢＴ（ＮＭＰ中の１Ｍ溶液の１９４μL、０．１９mmol）をベンジルエステル７６（２１mg，０．０４mmol）に添加し、得られた混合物を室温で３０分間振盪した。Ｏ６−［４−（１３−アミノ−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）−ベンジルグアニン（４９，２１mg，０．０５mmol）及びジイソプロピルエチルアミン（２４μL，０．１４mmol）を４９０μLのＮＭＰに溶解させ、活性化させた７６の溶液に添加した。室温で３時間振盪した後、この反応混合物を１mLのアセトニトリル／２mLの１ＭのＴＦＡでクエンチした。粗生成物を、直線勾配（水／０．１％ＴＦＡ：アセトニトリル／０．０８％ＴＦＡ １００：０から２０：８０まで）を用いるＨＰＬＣで精製した。１．５ＭのＮａＯＨを用いてこの溶液のｐＨを１０に調節することにより、カルボキシ基を脱保護した。先のステップと同じ勾配を用いるＨＰＬＣで粗生成物を精製した後、１４mg（０．０２mmol，４０％）の標題化合物を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）８８３．４［Ｍ＋Ｈ］＋（ＭＷ計算値＝８８２．９）。
実施例４７：４−アリルオキシメチル−１−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル）−ベンゼン（８０）
４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル）−ベンジルアルコール４４（２．８５ｇ，１１．３１mmol）を１５mLの乾燥ＴＨＦに溶解させた溶液に、アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム（３２６mg，１３．５７mmol）を少量ずつ添加し、この反応混合物を室温で３０分間撹拌した。ヨウ化アリル（３．８０ｇ，２２．６２mmol）を５mLの乾燥ＴＨＦに溶解させた溶液を添加し、得られた混合物を１７時間撹拌した。この反応物を水でクエンチし、溶媒の容積を約３０％に低減させ、残渣を酢酸エチル（２０mLで３回）で抽出した。有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、減圧下に溶媒を除去し、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル １００：１）で精製して、１．８３ｇ（６．２５mmol，５９％）を得た。
実施例４８：１，４−ジ−［４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル）−ベンジルオキシ］−２−ブテン（８１）
４−アリルオキシメチル−１−（ｔ−ブチルジメチル−シリルオキシメチル）−ベンゼン（８０，１．０ｇ，３．２４mmol）を７０mLの乾燥ジクロロメタンに溶解させた溶液に、アルゴン雰囲気下、ベンジリデン−ビス（トリシクロヘキシルホスフィン）−ジクロロルテニウム（４２０mg，０．５１３mmol，１５mol％）を添加した。得られた反応混合物を室温で１５時間撹拌し、触媒（２００mg）を追加し、その反応混合物を５時間加熱還流した。減圧下に溶媒を除去し、生成物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル ５０：１）で精製して、５２０mg（０．９３mmol，５５％）の標題化合物を得た。
実施例４９：ビス−１，４−（Ｏ ６ −ベンジルグアニン−メトキシ）−２−ブテン８２
ＴＢＤＭＳ−二量体８１（３５１mg，０．６３mmol）を５mLの乾燥ＴＨＦに溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリド（３．７８mmol）及び酢酸（３．７８mmol）を添加した。得られた反応混合物を室温で１５時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、生成物を溶媒の勾配（石油エーテル／酢酸エチル １：１から１：３まで）を用いるカラムクロマトグラフィーで精製して、１５０mg（０．４５mmol，７３％）の無色の固体を得た。この脱保護した二量体（１００mg，０．３０mmol）を０．８mLの乾燥ＤＭＦに溶解させた溶液に、水素化ナトリウム（４４mg，１．８２mmol）を添加し、この反応混合物を３０分間撹拌した。１−（２−アミノ−７Ｈ−プリン−６−イル）−１−メチル−ピロリジニウムクロリド（２７，１８６mg，０．７３mmol）及びＤＭＡＰ（１１mg，０．０９mmol）を添加し、この反応混合物を室温でさらに３時間撹拌した。この反応物を水でクエンチし、減圧下に溶媒を除去した。残渣をメタノールに溶解させ、ＳｉＯ２に吸着させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール １０：１）で精製して、二量体８２を無色の固体として得た（３０mg，０．０５mmol，１６％）。
実施例５０：１１−アリルオキシ−３，６，９−トリオキサウンデカノール（８３）
カリウムｔ−ブトキシド（２．３ｇ，１９．５mmol）をＴＨＦ（５００mL）に溶解させた無水溶液に、室温で、テトラエチレングリコール（７．１８ｇ，３７．０mmol）を添加した。得られた混合物を３０分間撹拌し、ヨウ化アリル（３．３１ｇ，１９．７mmol）を乾燥ＴＨＦ（６０mL）に溶解させた溶液を、１時間かけて滴下して加えた。この反応混合物を３０時間撹拌し、酢酸エチル（８００mL）を用いてシリカプラグ（１０ｇ）を通して濾過して生成物を溶出させた。減圧下に溶媒を蒸発させた後、生成物を溶媒の勾配（石油エーテル／酢酸エチル １０：１から、酢酸エチル １００％まで）を用いるカラムクロマトグラフィー で精製して、無色の油状物を得た（２．４１ｇ，１０．３mmol，２７％）。
実施例５１：１−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル）−４−（１３−アリルオキシ−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル−ベンゼン（８４）
１１−アリルオキシ−３，６，９−トリオキサウンデカノール（８３，２．３３ｇ，９．９４mmol）を乾燥ＴＨＦ（４０mL）に溶解させた溶液に、アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム（０．９５ｇ，３９．８mmol）を数回に分けて添加した。得られた混合物を３０分間撹拌した。ヨード誘導体４５（３．０ｇ，８．２８mmol）を乾燥ＴＨＦ（１０mL）に溶解させた溶液を滴下して加え、この混合物を１５時間撹拌した。２mLの水を添加することにより反応物をクエンチし、減圧下に７０％の量のＴＨＦを蒸発させた。７０mLの水を添加してこの混合物を希釈し、得られた溶液を５０mLの酢酸エチルで５回抽出した。有機抽出物を合してＭｇＳＯ４で脱水し、減圧下に濃縮した。得られた黄色の油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配：石油エーテル／酢酸エチル １０：１から５：１まで）で精製して、標題生成物８４を淡黄色の油状物として得た（１．９６ｇ，４．２mmol，５１％）。
実施例５２：ＴＢＤＭＳで保護されたビス−１，４−（ベンジルアルコール−ＰＥＧ）−２−ブテン８５
ＴＢＤＭＳで保護されたアリルオキシ誘導体８４（１．０ｇ，２．１３mmol）を４０mLの乾燥ジクロロメタンに溶解させた溶液に、アルゴン雰囲気下、ベンジリデン−ビス（トリシクロヘキシルホスフィン）−ジクロロルテニウム（２６３mg，０．３２mmol，１５mol％）を添加した。得られた反応混合物を５時間加熱還流した。触媒（２００mg）を追加し、加熱を１５時間継続した。減圧下に溶媒を除去し、生成物を、溶媒の勾配（石油エーテル／酢酸エチル １：１から１：５まで）を用いるカラムクロマトグラフィーで精製して、５３０mg（０．５８mmol，５４％）の二量体８５を得た。
実施例５３：ビス−１，４−（Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ）−２−ブテン８６
ＴＢＤＭＳで保護された二量体８５（２００mg，０．２２mmol）を３mLの乾燥ＴＨＦに溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリド（２．５mmol）及び酢酸（２．５mmol）を添加した。得られた反応混合物を室温で１５時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、生成物を、溶媒の勾配（石油エーテル／酢酸エチル １：１から、酢酸エチル １００％まで）を用いるカラムクロマトグラフィーで精製して、８０mg（０．１１mmol，５０％）の無色の固体を得た。この脱保護された二量体（６１mg，０．０８９mmol）と１−（２−アミノ−７Ｈ−プリン−６−イル）−１−メチル−ピロリジニウムクロリド（２７，５４mg，０．２２mmol）とＤＭＡＰ（３．０mg，０．０２７mmol）を１．０mLの乾燥ＤＭＦに溶解させた溶液に、水素化ナトリウム（１３mg，０．５４mmol）を添加し、得られた反応混合物を２時間撹拌した。この反応物を水でクエンチし、減圧下に溶媒を除去した。残渣をメタノールに溶解させ、ＳｉＯ２に吸着させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール １０：１）で精製して、二量体８６を無色の固体として得た（３５mg，０．０３６mmol，４１％）。
実施例５４：式１の化合物とヒトＯ ６ −アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）融合タンパク質の反応性の実証
（ａ） Ｏ ６ −（１−［１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデシル］−１，２，３−トリアゾリル−４−メチル）−グアニン（１１）の反応性
総容積１５μLの５０mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中で、１８pmolのＰＧＥＡｈＡＧＴ−ＧＳＴ（Ａ．Ｊｕｉｌｌｅｒａｔら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０：３１３−３１７，２００３）をＤＭＳＯ中の１１の５ｍＭ溶液（０．２μL）と一緒に１時間インキュベーションした。１０pmolのビオチニル化Ｏ６−ベンジルグアニン−オリゴヌクレオチド（Ｒ．Ｄａｍｏｉｓｅａｕｘら，ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ ４：２８５−２８７，２００１）を添加し、さらに１５分間、反応を継続させた。対照として、総容積１５μLの５０mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中で、基質を含まない状態で、１８pmolのＰＧＥＡｈＡＧＴ−ＧＳＴを１０pmolの同一のビオチニル化オリゴヌクレオチドと一緒に１５分間インキュベーションした。ｈＡＧＴ−ＧＳＴとビオチニル化オリゴヌクレオチドの間のビオチニル化反応生成物は、ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させた抗ビオチンコンジュゲートを用いるウエスタンブロット法により検出した。図１Ａのレーン「Ｃ」は、ＰＧＥＡｈＡＧＴ−ＧＳＴとビオチニル化オリゴヌクレオチドの反応生成物を示していた。ＰＧＥＡｈＡＧＴ−ＧＳＴが最初に１１と反応する場合は、ビオチニル化オリゴヌクレオチドとのさらなる反応は観察されなかった（レーン１及びレーン２、図１Ａ）。これにより、Ｏ６−トリアゾリルメチルグアニンがｈＡＧＴに対する効果的な基質であることが証明された。
（ｂ） Ｏ ６ −ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノカプロイル）−ε−Ｎ−（６−［フルオレセイン−５−カルボニル］−アミノカプロイル）−リシン６０の反応性
総容積１５μLの５０mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中で、１８pmolのＰＧＥＡｈＡＧＴ−ＧＳＴを０．５nmolの６０と一緒にインキュベーションした。反応生成物は、ヤギ抗フルオレセイン抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）及びＨＲＰコンジュゲート抗ヤギ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いるウエスタンブロット法により検出した。これにより、２つの異なった標識を含んでいる化合物６０がｈＡＧＴに対する効果的な基質であることが証明された。
実施例５５：固相上におけるヒトＯ ６ −アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）融合タンパク質の固定化
８０μLのＰＧＥＡｈＡＧＴ−ＧＳＴ融合タンパク質溶液（ＨＢＳバッファー中２００μg／mL）を、Ｏ６−ベンジルグアニン−ＰＥＧ−アミノ−α−Ｎ−（ビオチニル−６−アミノ−カプロイル）−ε−Ｎ−（［ジゴキシゲニン−３−オキシメチルカルボニル］−６−アミノカプロイル）−リシン５４の０．４mM溶液（２０μL）と一緒に、室温で１０分間インキュベーションした。この溶液を、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ Ｂｉａｃｏｒｅ チップ上に、１μL／分の流速で３５分間通過させた。次いで、このチップを、同じ流速のバッファー（ＨＢＳＴ）で４０分間パージした。次に、ＧＳＴ抗体（１９８０μg／mL）を注入して該融合タンパク質の先の結合を明らかにし、次いで、再度、ＨＢＳＴで洗浄した。固定化実験は、表面プラズモン共鳴により評価した。表面プラズモン共鳴分析は、研究グレードのＳＡセンサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ １０００ 光学バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて行った。ＥＤＴＡを含まないＨＢＳ（１０mM ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０mM ＮａＣｌ，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）は、新たに調製し、２２μmの膜を通して濾過した。得られたセンソグラムは、図２に示してある。
実施例５６：ヒトＯ ６ −アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）の二量体化
（ａ） ＰＧＥＧ ｈＡＧＴと二量体化基質４３の反応
二量体化実験は、ＨＥＰＥＳバッファー（ＨＥＰＥＳ ５０mM，ｐＨ７．２，１mM ＤＴＴ，２００μg／mL ＢＳＡ）中の０．４μMの一定の濃度のＰＧＥＧｈＡＧＴ−ＧＳＴ（Ａ．Ｊｕｉｌｌｅｒａｔら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０：３１３−３１７，２００３）で、総容積４０μLで行った。０〜１００：１の基質：タンパク質の比率をカバーするように、化合物４３の濃度を変化させた。インキュベーション時間は、すべての実験に関して、４０分間とした。ウェスタンブロットは、抗ｈＡＧＴ抗体（ＰＢＳ中１：２０００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と第二の抗体としての抗マウス−ＨＲＰコンジュゲート（ＰＢＳ中１：２０００，Ｓｉｇｍａ）を用いて得た。結果は、図３Ａに示してある。
（ｂ） Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物中の二量体化基質６１とＨＡ− Ｗ１６０ ｈＡＧＴとの反応
実験は、ｈＡＧＴ変異体Ｇｌｙ１６０Ｔｒｐ（Ｗ１６０ｈＡＧＴ）（Ｍ．Ｘｕ−Ｗｅｌｌｉｖｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５８：１２７９−１２８５，１９９９）を用いて行った。ＨＡ−Ｗ１６０ｈＡＧＴは、ＬＢ培地中、２４℃で、ＩＰＴＧ（１mM）と種々の濃度（０μM、１０μM、２０μM、及び、５０μM）の基質６１を指数関数的に増殖する培養に添加した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１で２時間発現させた。遠心分離により細胞を回収した。各標識化実験について、抽出物の総容積は、約１mL（容積は、ＯＤ６００が一定となるように調節する）であった。得られたペレットを５０μLの１×ＳＤＳに再度懸濁させた後、Ｏ６−ベンジルグアニンを１mMの濃度となるまで添加した。９５℃に５分間加熱した後、サンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。ウェスタンブロットは、ヤギ抗ＭＧＭＴ（ＴＢＳＴ中１：１００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と第二の抗体としての抗ヤギＩｇＧ（ＴＢＳＴ中１：１０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて得た。結果は、図３Ｂに示してある。
実施例５７：ＧＳＴ− ３ＨＹ ｈＡＧＴに対する７８と７９の反応性
３ＨＹｈＡＧＴが７８及び７９に対して活性を有していることを実証するために、３ＨＹｈＡＧＴを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質（ＧＳＴ−３ＨＹｈＡＧＴ）として発現させ、その融合タンパク質を精製し、及び、その活性をインビトロアッセイで測定した。ＧＳＴ−３ＨＹｈＡＧＴを過剰量の７８又は７９と一緒にインキュベーションして反応させた後、抗メトトレキサート抗体を用いるウェスタンブロット法に付した。このアッセイにおいて、ＧＳＴ−３ＨＹｈＡＧＴは、７８との反応については約１５００秒−１Ｍ−１の二次反応速度定数を示し、７９との反応については約９００秒−１Ｍ−１の二次反応速度定数を示した。従って、７８の濃度１μMで、及び、３ＨＹｈＡＧＴに対して過剰な７８（擬一次条件）で、該タンパク質の５０％が１０分以内に標識された。
実施例５８：ｈＡＧＴ変異体
ｈＡＧＴ融合タンパク質を構築するために、好ましくは、変異体Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕを使用した。この変異体は、野生型ｈＡＧＴと比較して、１型のベンジルグアニン誘導体に対して、約２０倍の増大した活性を示した。以下の文献を参照されたい：Ａ．Ｊｕｉｌｌｅｒａｔら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０：３１３−３１７，２００３。以下に示すｈＡＧＴのさらなる変異体は、ｈＡＧＴのＤＮＡへの結合を分断するが、ベンジルグアニン誘導体に対する活性は有意には阻害しないことが示されている：Ｌｙｓ１２５Ａｌａ，Ａｌａ１２７Ｔｈｒ，及び，Ａｒｇ１２８Ａｌａ。以下の文献を参照されたい：Ａ．Ｌｉｍら，ＥＭＢＯ Ｊ．１５：４０５０−４０６０，１９９６，及び，Ｄ．Ｓ．Ｄａｎｉｅｌｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．１９：１７１９−１７３０，２０００。これらの変異体を導入する理論的根拠は、３ハイブリッド系におけるｈＡＧＴ融合タンパク質とＤＮＡの相互作用を最少にすることである。結果として得られた、上記の５つの変位を有しているｈＡＧＴ変異体は、３ＨＹｈＡＧＴと略記する。
実施例５９：酵母Ｌ４０株の増殖アッセイ
ＬｅｘＡ−３ＨＹｈＡＧＴ及びＢ４２−ＤＨＦＲ融合タンパク質をコード化するプラスミドの対を酵母株Ｌ４０内に形質転換し、機能的ＬｅｘＡ−Ｂ４２転写因子を再構築することにより、レポーター遺伝子ＨＩＳ３及びｌａｃＺが転写された。７８又は７９のいずれかの存在下において融合タンパク質の異なった組合せを発現させることにより酵母Ｌ４０のヒスチジン要求性が補完されるか否かについて試験した（表１）。ＬｅｘＡ−３ＨＹｈＡＧＴとＢ４２−ＤＨＦＲを同時に発現させることにより、酵母Ｌ４０はヒスチジンは含んでいないが７８又は７９のいずれかを含んでいるプレート上で増殖することが可能となった。このことは、ＨＩＳ３が転写されたことを示している。７８又は７９の非存在下では、増殖は観察されなかった。
Figure 0004976651
原則として、ベンジルグアニン７８及び７９を介した機能的転写因子の再構築は、どのリガンド結合性タンパク質がＬｅｘＡに融合するかとは関係がなく、また、どのリガンド結合性タンパク質がＢ４２に融合するかとは関係がない。このことを実証するために、ＬｅｘＡ−ＤＨＦＲとＢ４２−３ＨＹｈＡＧＴを同時に発現する酵母Ｌ４０の、ヒスチジンは含んでいないが７８又は７９のいずれかを含んでいるプレート上での増殖について調べた。予想されたとおり、化合物７８又は７９に依存する増殖が観察されるが、その増殖速度は、ＬｅｘＡ−３ＨＹｈＡＧＴとＢ４２−ＤＨＦＲを同時に発現する酵母で観察される増殖速度を下回った（表１）。
実施例６０：ＯＮＰＧを用いる定量的β−ガラクトシダーゼアッセイ
ＬｅｘＡ融合タンパク質とＢ４２融合タンパク質の別の組合せを発現する酵母株Ｌ４０における、ベンジルグアニンをベースとする化合物７８及び７９によるｌａｃＺレポーター遺伝子の転写の活性化について調べた（表２）。このアッセイにおいて、液体培養の細胞抽出物中の色素原基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）の加水分解速度を測定することにより、ｌａｃＺ遺伝子の産物であるβ−ガラクトシダーゼの活性を決定した。
Figure 0004976651
ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合した抗ビオチンコンジュゲートのウェスタンブロット。レーン１及び２：化合物１１（式中のＲ３がトリアゾリルメチルである式１の化合物）と反応させた後、ＡＧＴ基質として知られているビオチニル化Ｏ６−ベンジル−グアニンオリゴヌクレオチドと反応させた後のＰＧＥＡｈＡＧＴ−ＧＳＴ（ＡＧＴ融合タンパク質）。「Ｃ」の印が付いているレーン（対照）：ＰＧＥＡｈＡＧＴ−ＧＳＴとビオチニル化Ｏ６−ベンジルグアニンオリゴヌクレオチドの反応生成物。 ヤギ抗フルオレセイン抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）及びＨＲＰコンジュゲート抗ヤギ抗体（Ｓｉｇｍａ）のウェスタンブロット。レーン１及び２（２種類の異なった濃度）は、フルオレセイン標識とビオチン標識を有している化合物６０（式中のＬが複数の標識である式１の化合物）とＰＧＥＡｈＡＧＴ−ＧＳＴの反応生成物を示している。左側のレーンは、４７ｋＤａ及び７９ｋＤａの分子量マーカーを示している。 ストレプトアビジンＢｉａｃｏｒｅチップに適用した化合物５４（式中のＬがビオチンである式１の化合物）とＰＧＥＡｈＡＧＴ−ＧＳＴ（ＡＧＴ融合タンパク質）の反応生成物の表面プラズモン共鳴のセンソグラム。該チップを、αＧＳＴ抗体の溶液でさらに処理する。Ａ：化合物５４と一緒にプレインキュベーションしたＰＧＥＡｈＡＧＴ−ＧＳＴを添加。Ｂ：緩衝液（ＨＢＳＴ）を添加。Ｃ：αＧＳＴ抗体を添加。 抗ｈＡＧＴ抗体及び第二抗体としての抗マウスＨＲＰコンジュゲートを用いたウェスタンブロット。レーンの下に、化合物４３（式中のＬがさらなる−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２残基である式１の化合物、即ち、二量体化化合物）とＰＧＥＧｈＡＧＴ−ＧＳＴの比率を示してある。 抗ヤギｈＡＧＴ、及びＥ．ｃｏｌｉ中における二量体化化合物６１と融合タンパク質ＨＡ−Ｗ１６０ｈＡＧＴのインビボ反応生成物の抗ヤギＩｇＧを用いたウェスタンブロット。レーンの下に、６１（式中のＬが−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２残基である式１の化合物）の種々の濃度を示してある。 ｈＡＧＴをベースとする３ハイブリッド系の略図。融合タンパク質ＤＨＦＲ−Ｂ４２の存在下におけるｈＡＧＴ−ＬｅｘＡ融合タンパク質と式１（式中、Ｌはメトトレキサート（Ｍ）である）の化合物の反応において、ｈＡＧＴ−ＬｅｘＡとＤＨＦＲ−Ｂ４２をカップリングさせ、転写を開始させる。

Claims (16)

  1. 式１：
    Figure 0004976651
    ［式中、
    Ｒ１−Ｒ２は、式２：
    Figure 0004976651
    で表される基であり、ここで
    Ｒ２は、水素であり；
    Ｒ５は、水素であり；
    及び、
    Ｒ６は、置換されていないアミノであり、
    Ｘは、酸素であり；
    Ｒ３は、トリアゾリレン、テトラゾリレン、イソオキサゾリレン、チエニレン、イソオキサゾリジニレン、又は１−アルキニレンであり；
    Ｌがさらなる基−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である場合；Ｌがメトトレキサートである場合；又はＬが、同一であるか又は異なっている複数の標識である場合、Ｒ３はフェニレンであり；
    Ｒ４は、１〜３００個の炭素原子を有する、場合により置換されていてもよい直鎖又は分枝鎖のアルキレン基、又は多価分枝鎖のアルキル基であり、その際、場合により、
    （ａ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられており；
    （ｂ）１個以上の炭素原子が水素原子を有している窒素で置き換えられており、そして、それに隣接する炭素原子がオキソにより置換されていて、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を表し；
    （ｃ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられており、そして、それに隣接する炭素原子がオキソにより置換されていて、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
    （ｄ）隣接してる２つの炭素原子の間の結合が二重結合又は三重結合であって、官能基−ＣＨ＝ＣＨ−又は−Ｃ≡Ｃ−を表し；
    （ｅ）１個以上の炭素原子が、フェニレン、飽和若しくは不飽和のシクロアルキレン、飽和若しくは不飽和のビシクロアルキレン、トリアゾリレン、イソオキサゾリレン、イソオキサゾリジニレン、ピロリジンジイル、ピペリジンジイル、テトラヒドロフランジイル、ジオキサンジイル、モルホリンジイル、テトラヒドロチオフェンジイル、α−若しくはβ−フラノシル、又はα−若しくはβ−ピラノシルにより置き換えられており；
    及び／又は、
    （ｆ）隣接してる２個の炭素原子がジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−により置き換えられており；
    そして、
    Ｌは、発蛍光団；ビオチン、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニン；及びメトトレキサート部分；から選択される１つの標識であるか又は複数の同一であるか若しくは異なっている標識であるか、或いは
    Ｌは、さらなる基−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である］
    で表される化合物。
  2. Ｒ３が、トリアゾリレン、テトラゾリレン、イソオキサゾリレン、チエニレン、又は、イソオキサゾリジニレンである、請求項１に記載の式１で表される化合物。
  3. Ｒ３がチエニレンである、請求項２に記載の式１で表される化合物。
  4. Ｒ４が、場合により−ＣＨ＝ＣＨ−又は−Ｃ≡Ｃ−を介して基Ｒ３に結合している、２〜２５個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基、４〜１００のエチレンオキシ単位を有する直鎖ポリエチレングリコール基、又は２個以上の炭素原子がアミド官能基−ＮＨ−ＣＯで置き換えられている２〜２５個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である、請求項１に記載の式１で表される化合物。
  5. Ｒ４が、分枝鎖アルキレン基（ここで、該分枝鎖アルキレン基は、３〜６のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール基及び炭素原子がアミド結合で置き換えられているアルキレン基を含んでおり、さらに、置換されているアミノ官能基とヒドロキシ官能基を有している）である、請求項１に記載の式１で表される化合物。
  6. Ｒ４が、分枝鎖アルキレン基であって、ここで、
    （ａ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられており；
    （ｂ）１個以上の炭素原子が水素原子を有している窒素で置き換えられており、そして、それに隣接する炭素原子がオキソにより置換されていて、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を表す、請求項１に記載の式１で表される化合物。
  7. Ｒ３がフェニレンであり、そして、Ｌがさらなる基−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である、請求項１に記載の式１で表される化合物。
  8. Ｒ３が１，４−フェニレンであり、そして、リンカーＲ４が、１０〜４０個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基（ここで、３〜１２個の炭素原子は、酸素で置き換えられており、１又は２個の炭素原子は、１，４−トリアゾリデン単位で置き換えられており、及び、場合により、１の炭素原子は、１，４−フェニレン単位で置き換えられている）である、請求項１又は７に記載の式１で表される化合物。
  9. Ｒ３が１，４−フェニレンであり、そして、リンカーＲ４が、場合によりオキソで置換されていてもよい１０〜４０個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基（ここで、３〜１２個の炭素原子は、酸素で置き換えられており、及び、１若しくは２個の炭素原子は窒素で置き換えられている ）である、請求項１又は７に記載の式１で表される化合物。
  10. Ｒ３が１，４−フェニレンであり、そして、リンカーＲ４が、６〜４０の炭素原子を有する直鎖アルキレン基（ここで、２〜１２個の炭素原子は、酸素で置き換えられており、及び、隣接する炭素原子の間の１若しくは２つの結合は、二重結合である）である、請求項１又は７に記載の式１で表される化合物。
  11. Ｒ３がフェニレンであり、そして、Ｌがメトトレキサートである、請求項１に記載の式１で表される化合物。
  12. Ｒ３がフェニレンであり、そして、Ｌが、同一であるか又は異なっている複数の標識である、請求項１に記載の式１で表される化合物。
  13. Ｒ３がフェニレンであり、そして、Ｌが、異なっている２つの標識である、請求項１２に記載の式１で表される化合物。
  14. 式１：
    Figure 0004976651
    ［式中、
    Ｒ１−Ｒ２は、
    Figure 0004976651
    で表されるラジカルであり、その際、Ｒ２は水素であり、Ｒ５は水素であり、そして、Ｒ６は置換されていないアミノであり；
    Ｘは酸素であり；
    Ｒ３は、トリアゾリレン、テトラゾリレン、イソオキサゾリレン、チエニレン、イソオキサゾリジニレン又は１−アルキニレンであり；
    Ｒ４は、１〜３００個の炭素原子を有する、場合により置換されていてもよい直鎖又は分枝鎖のアルキレン基であり、その際、場合により、
    （ａ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられており；
    （ｂ）１個以上の炭素原子が水素原子を有している窒素で置き換えられており、そして、それに隣接する炭素原子がオキソにより置換されていて、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を表し；
    （ｃ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられており、そして、それに隣接する炭素原子がオキソにより置換されていて、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
    （ｄ）隣接してる２つの炭素原子の間の結合が二重結合又は三重結合であって、官能基−ＣＨ＝ＣＨ−又は−Ｃ≡Ｃ−を表し；
    （ｅ）１個以上の炭素原子が、フェニレン、飽和若しくは不飽和のシクロアルキレン、飽和若しくは不飽和のビシクロアルキレン、トリアゾリレン、イソオキサゾリレン、イソオキサゾリジニレン、ピロリジンジイル、ピペリジンジイル、テトラヒドロフランジイル、ジオキサンジイル、モルホリンジイル、テトラヒドロチオフェンジイル、α−若しくはβ−フラノシル、又はα−若しくはβ−ピラノシルにより置き換えられており；及び／又は、
    （ｆ）隣接してる２個の炭素原子がジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−により置き換えられており；
    Ｌは、アミノ又はアジドである］
    で表される化合物。
  15. 式１：
    Figure 0004976651
    ［式中、
    Ｒ１−Ｒ２は、
    Figure 0004976651
    で表されるラジカルであり、その際、Ｒ２は水素であり、Ｒ５は水素であり、そして、Ｒ６は置換されていないアミノであり；
    Ｘは酸素であり；
    Ｒ３は１，４−フェニレンであり；
    Ｒ４は、場合によりオキソで置換されていてもよい１０〜４０個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基（ここで、１２個以下の炭素原子は、酸素で置き換えられており、及び、０、１若しくは２個の炭素原子は窒素で置き換えられている）であり；及び、
    Ｌは、アミノ又はアジドである］
    で表される化合物。
  16. 目的とするタンパク質を検出及び操作する方法であって、ＡＧＴ融合タンパク質に組み入れた目的とする該タンパク質を標識を有しているＡＧＴ基質と接触させ、そして、該標識を認識又は処理するように設計されているシステム内で該標識を用いて、該ＡＧＴ融合タンパク質を検出し、そして、場合により、さらに操作することを特徴とし、ここで、標識を有しているＡＧＴ基質は、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の式１で表される化合物である、前記方法。
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