JP2009544660A - 合成プローブによる融合タンパク質の標識化 - Google Patents
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Abstract
Description
in vitroまたはin vivo条件下に関心のあるタンパク質を単離および/または追跡するために関心のあるタンパク質を特異的に標識することを可能とする改良された標識化技術に対する要求が絶えずある。1つの具体的な方法は、WO02/083937に開示されており、これは、関心のあるタンパク質をO6−アルキルグアニン−DNAアルキルトランスフェラーゼ(AGT)に融合させ、そしてAGT融合タンパク質を、標識を有する特異的AGT基質と接触させ、それにより標識を融合タンパク質に移行させる、関心のあるタンパク質を検出および/または操作するための方法を記載している。次いでAGT融合タンパク質を検出しそして場合により標識を使用して更に操作する。野生型AGTのいくつかの突然変異体は、このような標識化方法において野生型AGTよりも良好に適当であることが示され(WO2004/031404; Juillerat, A. et al., Chem. Biol. 10:313-317, 2003; Gronemeyer, T. et al., Protein Eng. Des. Sel. 19:309-316, 2006)、そしてAGTおよびAGT突然変異体を含む融合タンパク質に標識を移行させるのに使用するための広範囲の置換されたベンジルグアニンおよび関連したヘテロアリールメチルグアニン化合物が記載されている(WO2004/031405)。
本発明は、O6−アルキルグアニン−DNAアルキルトランスフェラーゼに由来するアルキルシトシントランスフェラーゼ(ACTs)と呼ばれる新規なタンパク質、およびこれらのACTsに標識を特異的に移行させるACTsのための基質、およびこのようなACTを含む融合タンパク質に関する。本発明に従う基質は、式(I)
(式中、
R1は、芳香族もしくはヘテロ芳香族基であるか、またはOCH2−に連結された二重結合を有する、場合により置換されている不飽和アルキル、場合により置換されている不飽和シクロアルキルもしくは場合により置換されている不飽和ヘテロサイクリル基であり;
R2は、リンカーであり、そして
Lは、標識または複数の同じまたは異なる標識である)
の置換されたシトシンである。
本発明は、特に式(I)の基質からの標識の移行に適した、O6−アルキルグアニン−DNAアルキルトランスフェラーゼ(AGT)に由来するアルキルシトシントランスフェラーゼ(ACTs)と呼ばれる新規なタンパク質に関する。
(a)170〜220アミノ酸、好ましくは175〜190アミノ酸、最も好ましくは177〜185アミノ酸からなり;
(b)少なくとも1つのシステインを含み;
(c)O2−ベンジルシトシンと反応し、それによって同じ条件下にO6−ベンジルグアニンとの反応における場合と少なくとも同じに速く(b)のシステインのメルカプト基にベンジル置換基を移行させる、
タンパク質として同定される。
ACT1〜8のホモログでありそして位置114、131、135、148、157および159以外の位置において1、2または3個のアミノ酸がACT1〜8とは異なるACTs;および
ACT1〜10のホモログでありそして位置60、114、121、131、135、148、153、157および159以外の位置において1、2または3個のアミノ酸がACT1〜10とは異なるACTs;
である。
位置131のアミノ酸がN、S、TまたはVであり;
位置135のアミノ酸がD、NまたはTであり;
位置148のアミノ酸がD、EまたはQであり;
位置157のアミノ酸がA、G、L、T、PまたはWであり;そして
位置159のアミノ酸がE、F、M、RまたはSである、
ACT1(配列番号1)のアナログも考慮される。
位置114のアミノ酸がA、E、N、RまたはSであり;
位置121のアミノ酸がAまたはVであり;
位置131のアミノ酸がN、S、TまたはVであり;
位置135のアミノ酸がD、NまたはTであり;
位置148のアミノ酸がD、E、QまたはVであり;
位置153のアミノ酸がLまたはSであり;
位置157のアミノ酸がA、G、L、T、PまたはWであり;そして
位置159のアミノ酸がE、F、M、R、SまたはLである、
ACT10(配列番号12)のアナログが同様に考慮される。
に制限されない。
(式中、
R1は、芳香族もしくはヘテロ芳香族基であるか、またはOCH2−に連結された二重結合を有する、場合により置換されている不飽和アルキル、場合により置換されている不飽和シクロアルキルもしくは場合により置換されている不飽和ヘテロサイクリル基であり;
R2はリンカーであり、そして
Lは標識または複数の同じまたは異なる標識である)
で示される化合物に関する。
(a)1個以上の炭素原子が酸素により置き換えられている、特にすべての第3の炭素原子が酸素で置き換えられている、例えば1〜100のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基;
(b)1個以上の炭素原子が水素原子を有する窒素で置き換えられており、そして隣接炭素原子がオキソにより置換されており、アミド基−NH−CO−を示す;
(c)1個以上の炭素原子が酸素で置き換えられておりそして隣接炭素原子がオキソにより置換されて、エステル基−O−CO−を示す;
(d)2つの隣接炭素原子間の結合が二重結合または三重結合であり、−CH=CH−または−C≡C−を示す;
(e)1個以上の炭素原子がフェニレン、飽和もしくは不飽和シクロアルキレン、飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン、橋かけヘテロ芳香族または橋かけ飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン、橋かけヘテロ芳香族もしくは橋かけ飽和もしくは不飽和ヘテロサイクリル基で置き換えられている;
(f)2個の隣接炭素原子が、ジスルフィド結合−S−S−で置き換えられている、
1〜300個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキレン基、または2つ以上の、特に2つまたは3つのアルキレンおよび/または前記(a)〜(f)下に定義された改変されたアルキレン基の組み合わせであり、これらの基は場合により置換基を含有する。
他の特に好ましいリンカーR2は、3〜12個の炭素原子が酸素により置き換えられておりそして1個または2個の炭素原子が窒素により置き換えられており、場合により窒素の隣接したオキソにより置換されている、10〜40個の場合によりオキソにより置換されている炭素原子の直鎖アルキレン基である。
略号
BC=ベンジルシトシン
BG=ベンジルグアニン
DTT=ジチオトレイトール
DMF=ジメチルホルムアミド
MPLC=中圧液体クロマトグラフィー
PBS=リン酸緩衝化生理食塩水
RT=室温
TFA=トリフルオロ酢酸
TEA=トリエチルアミン
2,2,2−トリフルオロ−N−(4−ヒドロキシメチル−ベンジル)−アセトアミド760mg(3.25ミリモル)を乾燥したジメチルアセトアミド3mL中にアルゴン雰囲気下に溶解し、そしてNaH273mg(8.15ミリモル)を5分間にわたり加える。次いで2−クロロピリミジン−4−アミン211mg(1.63ミリモル)を加えそして溶液を一夜90℃で攪拌する。水1mLを注意深く加えてすべての過剰のNaHをクエンチし、そして混合物を0.5N HCl50ml中に注ぐ。粗生成物を酢酸エチルで抽出し、一緒にした有機相をブラインで洗浄しそしてMgSO4上で乾燥する。溶媒の蒸発後、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(勾配酢酸エチル:シクロヘキサン1:1〜3:1)により精製する。収率:350mg(52%)。ESI−MSm/z327[M+H]+。
N−(4−((4−アミノピリミジン−2−イルオキシ)メチル)ベンジル)−2,2,2−トリフルオロアセトアミド(1)150mg(0.46ミリモル)をメタノール2mL中に溶解しそしてメチルアミン(エタノール中の33%)5mLで処理する。反応混合物を室温で一夜攪拌しそしてすべての揮発分を真空中で除去する。生成物を次の工程で更なる精製をしないで使用する。ESI−MSm/z231[M+H]+。
2−(4−(アミノメチル)ベンジルオキシ)ピリミジン−4−アミン(2)(3.6mg、0.016ミリモル)および5(6)−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル(8.2mg、0.016ミリモル)をTEA2.4μLを有するDMF800μL中に溶解しそして31℃で一夜加熱する。溶媒を真空中で蒸発させそして化合物を、水:アセトニトリルの線状勾配(20分内に95:5から20:80まで、0.08%TFA)を使用してC18カラム上の逆相MPLC(中圧液体クロマトグラフィー)により単離する。MS(ESI)m/z643[M−Cl]+。
2−(4−(アミノメチル)ベンジルオキシ)ピリミジン−4−アミン(2)(3.9mg、0.017ミリモル)および5(6)−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(8.3mg、0.017ミリモル)をTEA2.6μLを有するDMF800μL中に溶解しそして31℃で一夜加熱する。溶媒を真空中で蒸発させそして生成物を、水:アセトニトリルの線状勾配(20分において95:5から20:80まで、0.08%TFA)を使用してC18カラム上の逆相MPLCにより単離する。MS(ESI)m/z589[M+H]+。精製方法に依存して、生成物は対応する異性体5−カルボキサミドも含有することもある。
2−(4−(アミノメチル)ベンジルオキシ)ピリミジン−4−アミン(2)(4.1mg、0.018ミリモル)および5(6)−カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル(10mg、0.018ミリモル)をTEA2.7μLを有するDMF800μL中に溶解しそして31℃で一夜加熱する。溶媒を真空下に蒸発させそして化合物を、水:アセトニトリルの線状勾配(20分において95:5から20:80まで、0.08%TFA)を使用してC18カラム上の逆相MPLCにより単離する。MS(ESI)m/z673[M+H]+。
2−(4−(アミノメチル)ベンジルオキシ)ピリミジン−4−アミン(2)(1.5mg、0.007ミリモル)およびDY−547−NHS(Dyomics染料)(5mg、0.007ミリモル)をTEA1.0μLを有するDMF500μL中に溶解しそして31℃で一夜加熱する。溶媒を真空下に蒸発させそして生成物を、水:アセトニトリルの線状勾配(20分において95:5から20:80まで、0.08%TFA)を使用してC18カラム上の逆相MPLCにより単離する。MS(ESI)m/z853[M−Na]−。
2−(4−(アミノメチル)ベンジルオキシ)ピリミジン−4−アミン(2)(1.5mg、0.007ミリモル)およびDY−547−NHS(Dyomics染料)(5mg、0.007ミリモル)をTEA1.0μLを有するDMF500μL中に溶解しそして31℃で一夜加熱する。溶媒を真空下に蒸発させそして生成物を、水:アセトニトリルの線状勾配(20分において95:5から20:80まで、0.08%TFA)を使用してC18カラム上の逆相MPLCにより単離する。MS(ESI)m/z827[M−Na]−。
2−(4−(アミノメチル)ベンジルオキシ)ピリミジン−4−アミン(2)(1.5mg、0.007ミリモル)およびCy5−NHS(GE healthcare染料)(5.4mg、0.007ミリモル)をTEA1.0μLを有するDMF500μL中に溶解しそして31℃で一夜加熱する。溶媒を真空下に蒸発させそして生成物を、水:アセトニトリルの線状勾配(20分において95:5から20:80まで、0.08%TFA)を使用してC18カラム上の逆相MPLCにより単離する。MS(ESI)m/z868[M−Na]−。
O6−4−アミノメチル−ベンジル−グアニン(1.9mg、0.007ミリモル)およびCy5−NHS((GE healthcare染料)(5.4mg、0.007ミリモル)をTEA1.0μLを有するDMF500μL中に溶解しそして31℃で一夜加熱する。溶媒を真空下に蒸発させそして生成物を、水:アセトニトリルの線状勾配(20分において95:5から20:80まで、0.08%TFA)を使用してC18カラム上の逆相MPLCにより単離する。MS(ESI)m/z908[M−Na]−。
実施例3と同様にして2−(4−(アミノメチル)ベンジルオキシ)ピリミジン−4−アミン(2)から下記の化合物を製造する。
式12のBC−ビオチン:
式13のBC−PEG−ビオチン
式14のBC−360
式15のBC−430
式16の化合物の混合物からなるBC−Oregon Green
式17の化合物の混合物からなるBC−Oregon Greenジピバロイルエステル
式18の化合物の混合物からなるBC−505
プライマー1〜5およびテンプレートとしてNAGT遺伝子(配列番号2)を使用するオーバーラップ伸長PCR(overlap extension PCR)は、NAGTの残基114、131、135、148、156、157および159を無作為化することを可能とした。NAGTは、最後の25アミノ酸が欠失しておりそして突然変異K32I、L33F、C62A、Q115S、Q116H、K125A、A127T、R128A、G131K、G132T、M134L、R135S、N150Q、I151G、N152D、G153L、A154D、N157GおよびS159Eを有するwtAGTの182アミノ酸突然変異体である(Gronemeyer et al., Protein Eng. Des. Sel. 19:309-316,2006)。プライマー1(N,AGT、配列番号3)およびプライマー2(C,AGT、配列番号4)はSfi1制限部位を含有し;プライマー3(配列番号5)は、位置114に無作為化のための無作為化された塩基を含有し;プライマー4(配列番号6)は、位置131および135に無作為化のための無作為化された塩基を含有し;プライマー5(配列番号7)は、位置148、156、157および159に無作為化のための無作為化された塩基を含有する。PCR生成物を、ファージディスプレイベクターpAK100にライゲーションしそして得られる構築物をE.coli XL1-blue(Stratagene, USA)にエレクトロポレーションした。これは約107クローンを含有するライブラリーをもたらした。
実施例9に従う選択の後に単離された突然変異体の遺伝子を、それぞれ、pGEX−2Tベクター(Amersham Bioscience, Otelfingen,Switzerland)へのその後のサブクローニングのためのBamH1およびEcoR1制限部位を含有するプライマー6(N,AGT、配列番号8)および7(C,AGT,配列番号9)を使用するPCRにより増幅させた。GST−ACT融合タンパク質としてのタンパク質の発現および精製を、AGT融合タンパク質について前に記載したとおりに行った(A.Juillerat, T.Gronemeyer, A. Keppler, S. Grendreizig, H. Pick, H. Vogel, K. Johnson, Chem. Biol. 10:313,2003)。BCFL(化合物5)およびフルオレセインを有するBG(BGFL、WO02/08397)による標識化の反応速度を、反応バッファー(50mM HEPES、pH7.2、1mMDTT、200μg/mLのBSA)中で対応するACTタンパク質(0.2〜0.4μM)を適切な蛍光源基質(fluorogenic substrate)(2〜20μM)と24℃でインキュベーションすることにより決定した。サンプルを異なる時間に採取し、そして標識反応を、4×SDSバッファー(8%SDS、10%β−メルカプトエタノール、240mM Tris pH6.8、40%グリセロール)の添加および95℃で5分間のインキュベーションによりクエンチした。反応の進行をSDS−PAGEゲルにおける蛍光染料で標識されたタンパク質の検出およびPharox FX(商標)分子イメージャーを使用する蛍光強度の定量により決定した。データは、擬一次反応モデルに適合した。次いで擬一次定数を蛍光源基質の濃度で割ることにより、二次速度定数を得た。
GST−ACT1と6×His−NAGTの等モル混合物(0.5μM最終濃度)を、BGFL(フルオレセインを有するベンジルグアニン、WO02/08397)、BGCy5(蛍光染料Cy5を有するベンジルグアニン、化合物11、実施例9)、BCFL(化合物5、実施例4)、BCCy5(化合物10、実施例8)(5μM)またはBGCy5/BCFLもしくBGFL/BCCy5の等モル混合物(各々5μM)と、反応バッファー(50mM HEPES、pH7.2、1mM DTT、200μg/mLのBSA)中で24℃にて60分間インキュベーションすることにより、in vitro二重標識化アッセイを行った。標識化反応を、4×SDSバッファー(8%SDS、10%β−メルカプトエタノール、240mM Tris pH6.8、40%グリセロール)の添加および95℃で5分間のインキュベーションによりクエンチした。蛍光染料で標識されたタンパク質混合物を、前記したとおりSDS−PAGEにより分析した。
哺乳動物細胞における融合タンパク質NAGT−NLS3、NAGT−βGal、ACT1−NLS3およびACT1βGalの発現のために、NAGTおよびACT1遺伝子を、プライマー8(N,AGT、配列番号10)およびプライマー9(C,AGT、配列番号11)を使用してPCR増幅させ、そして哺乳動物発現ベクターpECFP−Nuc(Clontech)またはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する哺乳動物発現プラスミドのNhel/BglII制限部位に挿入した。
Claims (30)
- R1が、フェニルである、請求項1に記載の式(I)の化合物。
- R1が、パラ−置換されたフェニルである、請求項2に記載の式(I)の化合物。
- R2が、1〜300個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキレン基であって、場合により
(a)1個以上の炭素原子が、酸素で置き換えられている、特に3番目毎の炭素原子が、酸素で置き換えられている、例えば1〜100のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基;
(b)1個以上の炭素原子が、水素原子を有する窒素で置き換えられており、そして隣接炭素原子が、オキソにより置換されており、アミド官能基−NH−CO−を示す;
(c)1個以上の炭素原子が、酸素で置き換えられておりそして隣接炭素原子がオキソにより置換されており、エステル官能基−O−CO−を示す;
(d)2つの隣接炭素原子間の結合が、二重結合または三重結合であり、官能基−CH=CH−または−C≡C−を示す;
(e)1個以上の炭素原子が、フェニレン、飽和もしくは不飽和シクロアルキレン、飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン、橋かけヘテロ芳香族または橋かけ飽和もしくは不飽和ヘテロサイクリル基で置き換えられている;
(f)2個の隣接炭素原子が、ジスルフィド結合−S−S−で置き換えられている;
1〜300個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキレン基、または2つ以上の、特に2つもしくは3つの、アルキレンおよび/または前記(a)〜(f)下に定義された改変されたアルキレン基の組み合わせであり、これらの基は場合により置換基を含有する、請求項1に記載の式(I)の化合物。 - R2が、炭素原子が場合によりアミド官能基−NH−CO−で置き換えられている、1〜25個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である、請求項4に記載の式(I)の化合物。
- Lが、分光学的プローブ、特異的結合ペアの1つの部分を表す分子、または固体支持体に共有結合により結合した分子である、請求項1に記載の式(I)の化合物。
- Lが、発蛍光団である、請求項6に記載の式(I)の化合物。
- 請求項7に記載の化合物N−[4−(4−アミノピリミジン−2−イルオキシメチル)−ベンジル]−テトラメチルローダミン−5−もしくは6−カルボキサミドまたはその混合物。
- 請求項7に記載の化合物N−[4−(4−アミノピリミジン−2−イルオキシメチル)−ベンジル]−フルオレセイン−5もしくは6−カルボキサミドまたはその混合物。
- 請求項7に記載の化合物N−[4−(4−アミノピリミジン−2−イルオキシメチル)−ベンジル]−ジアセチルフルオレセイン−5もしくは6−カルボキサミドまたはその混合物。
- (a)170〜220アミノ酸からなり;
(b)少なくとも1つのシステインを含み;
(c)O2−ベンジルシトシンと反応し、それによって同じ条件下にO6−ベンジルグアニンとの反応における場合と少なくとも同じに速く(b)のシステインのメルカプト官能基にベンジル置換基を移行させる、
タンパク質であるアキルシトシントランスフェラーゼ(ACT)。 - 177〜185アミノ酸を含む、請求項21に記載のアルキルシトシントランスフェラーゼ(ACT)。
- 配列番号1に記載のタンパク質;
下記の置換、
R114A、S131V、E148Q、G157WおよびM159R、
R114S、S131T、D135T、E148D、G157PおよびM159E、
R114N、S131N、G157AおよびM159S、
R114A、S131T、D135S、G157KおよびM159E、
R114E、S131R、D135A、G157EおよびM159E、
R114S、S131V、E148Q、G157LおよびM159R、
R114E、S131N、D135N、G157TおよびM159F、
により配列番号1とは異なるタンパク質;
および位置114、131、135、148、157および159以外の位置で1個、2個または3個のアミノ酸が異なるこのようなタンパク質;
からなる群より選ばれる、請求項21に記載のアキルシトシントランスフェラーゼ(ACT)。 - 配列番号1の請求項21に記載のタンパク質。
- 配列番号12に記載のタンパク質;
位置60のアミノ酸が、MまたはIであり、
位置114のアミノ酸が、A、E、N、RまたはSであり、
位置121のアミノ酸が、AまたはVであり、
位置131のアミノ酸が、N、S、TまたはVであり、
位置135のアミノ酸が、D、NまたはTであり、
位置148のアミノ酸が、D、E、QまたはVであり、
位置153のアミノ酸が、LまたはSであり、
位置157のアミノ酸が、A、G、L、T、PまたはWであり、そして
位置159のアミノ酸が、E、F、M、R、SまたはLである、
配列番号12のタンパク質;
および位置60、114、121、131、135、148、153、157および159以外の位置で1個、2個または3個のアミノ酸が異なるこのようなタンパク質;
からなる群より選ばれる、請求項21に記載のアキルシトシントランスフェラーゼ(ACT)。 - 配列番号12に記載のタンパク質および位置60、114、121、131、135、148、153、157および159以外の位置で1個のアミノ酸が異なるこのようなタンパク質からなる群より選ばれる、請求項25に記載のアキルシトシントランスフェラーゼ(ACT)。
- 配列番号12配列の請求項25に記載のタンパク質。
- O6−アルキルグアニン−DNAアルキルトランスフェラーゼ、O6−アルキルグアニン−DNAアルキルトランスフェラーゼ突然変異体またはアキルシトシントランスフェラーゼをコードするDNAを、10個までのアミノ酸位置において飽和突然変異誘発により無作為化し、得られたライブラリーを適当なファージミドにトランスフォーメーションし、標識を有するベンジルシトシンとの反応により所望のファージを選択し、次いで標識に対する抗体で被覆された磁性ビーズを使用して標識が移行されたファージを単離することを特徴とする、請求項21に記載のアキルシトシントランスフェラーゼ(ACT)を製造するための方法。
- 請求項1に記載の式(I)の化合物から、標識Lを、請求項21に記載のアルキルシトシントランスフェラーゼ、または請求項21に記載のアルキルシトシントランスフェラーゼを含む融合タンパク質に移行させる方法。
- 関心のあるタンパク質を請求項21に記載のアルキルシトシントランスフェラーゼを含む融合タンパク質に組み込み、該アルキルシトシントランスフェラーゼ融合タンパク質を請求項1に記載の式(I)の化合物と接触させ、そして標識Lを認識および/または処理するためにデザインされたシステムにおいて標識Lを使用して、前記アルキルシトシントランスフェラーゼ融合タンパク質を検出しそして場合により更に操作する、関心のあるタンパク質を検出および/または操作するための方法。
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